ES2928954T3 - Precipitación de la fracción I-IV-1 de inmunoglobulinas a partir de plasma - Google Patents

Abstract

Entre otros aspectos, la presente invención proporciona métodos para la fabricación de composiciones de proteínas sanguíneas a partir de plasma combinado. En una realización, la invención proporciona un esquema de fraccionamiento de alcohol que permite aumentos significativos en el rendimiento de proteínas sanguíneas purificadas a partir de la muestra de plasma inicial. En una realización específica, se proporciona un método para fraccionar plasma agrupado, comprendiendo el método una etapa inicial de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo. La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas de proteínas sanguíneas terapéuticas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Precipitación de la fracción I-IV-1 de inmunoglobulinas a partir de plasma

Referencias cruzadas a solicitudes

Esta solicitud reivindica prioridad sobre la solicitud de patente provisional estadounidense con n.° de serie 61/602.488 presentada el 23 de febrero de 2012.

Antecedentes de la invención

Los productos de inmunoglobulina a partir de plasma humano se usaron por primera vez en 1952 para tratar la inmunodeficiencia. Inicialmente, la administración intramuscular o subcutánea de inmunoglobulina isotipo G (IgG) aislada a partir de plasma fueron los métodos de elección. Sin embargo, estos métodos no permitieron la administración de mayores cantidades de IgG necesarias para el tratamiento eficaz de diversas enfermedades. Por consiguiente, se desarrollaron productos de IgG que podían administrarse por vía intravenosa. Habitualmente, la inmunoglobulina intravenosa (IVIG) contiene las inmunoglobulinas de inmunoglobulina G (IgG) agrupadas del plasma de más de mil donantes de sangre. Las preparaciones contienen habitualmente más del 95% de IgG no modificada, que tiene funciones efectoras dependientes de Fc intactas y sólo cantidades traza de inmunoglobulina A (IgA) e inmunoglobulina M (IgM). Normalmente, las IVIG se filtran en condiciones estériles y el procedimiento de fabricación contiene etapas para inactivar y/o eliminar virus. Estos productos de IgG purificados se usan principalmente para tratar tres categorías principales de afecciones médicas: (1) inmunodeficiencias: agammaglobulinemia ligada al cromosoma X, hipogammaglobulinemia (inmunodeficiencias primarias) y afecciones de inmunidad comprometida adquirida (inmunodeficiencias secundarias), que presentan niveles bajos de anticuerpos; (2) enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias; y (3) infecciones agudas.

Específicamente, muchas personas con trastornos de inmunodeficiencia primaria carecen de los anticuerpos necesarios para resistir la infección. En determinados casos, estas deficiencias pueden complementarse con la infusión de IgG purificada, habitualmente por vía intravenosa (es decir, terapia con IVIG). Varios trastornos de inmunodeficiencia primaria se tratan habitualmente de esta manera, incluyendo la agammaglobulinemia ligada al cromosoma X (XLA), la inmunodeficiencia variable común (CVID), el síndrome de hiper-IgM (HIM), la inmunodeficiencia combinada grave (SCID) y algunas deficiencias de subclases de IgG (Blaese y Winkelstein, J. Patient & Family Handbook for Primary Immunodeficiency Diseases. Towson, MD: Immune Deficiency Foundation; 2007).

Si bien el tratamiento con IgG puede ser muy eficaz para tratar los trastornos de inmunodeficiencia primaria, esta terapia es sólo un reemplazo temporal de los anticuerpos que no se producen en el cuerpo, en lugar de una cura para la enfermedad. Por consiguiente, los pacientes dependen de dosis repetidas de terapia con IgG, normalmente una vez al mes de por vida. Esta terapia impone una gran demanda en la producción continua de composiciones de IgG. Sin embargo, a diferencia de otros productos biológicos que se producen a través de la expresión in vitro de vectores de ADN recombinante, la IgG se fracciona a partir de donaciones de sangre y plasma humanos. Por tanto, el nivel de IgG comercialmente disponible está limitado por el suministro disponible de donaciones de sangre y plasma.

Varios factores impulsan la demanda de IgG, incluyendo la aceptación de los tratamientos con IgG, la identificación de indicaciones adicionales para las que la terapia con IgG es eficaz y el aumento del diagnóstico del paciente y la prescripción de IgG. En particular, la demanda mundial de IgG se cuadruplicó con creces entre 1990 y 2009, y sigue aumentando a una tasa anual de entre aproximadamente un 7% y un 10% (Robert P., Pharmaceutical Policy and Law, 11 (2009) 359-367). Por ejemplo, la Australian National Blood Authority informó que la demanda de IgG en Australia creció un 10,6% durante el año fiscal 2008-2009 (informe anual de la Australian National Blood Authority de 2008­ 2009).

Debido en parte a la creciente demanda mundial y a las fluctuaciones en el suministro disponible de productos de inmunoglobulina, varios países, incluyendo Australia e Inglaterra, han implementado programas de gestión de la demanda para proteger el suministro de estos productos para los pacientes con mayor demanda durante los periodos de escasez de productos.

Se ha informado que en 2007 se fraccionaron 26,5 millones de litros de plasma, generando 75,2 toneladas métricas de IgG, con un rendimiento de producción promedio de 2,8 gramos por litro (Robert P., citado anteriormente). Este mismo informe estimó que se espera que los rendimientos globales de IgG aumenten hasta aproximadamente 3,43 gramos por litro para el 2012. Sin embargo, debido al continuo crecimiento en la demanda global de IgG, proyectada entre aproximadamente un 7% y un 13% anual entre ahora y el 2015, adicionalmente será necesario mejorar el rendimiento general de IgG para satisfacer la demanda mundial.

Los proveedores comerciales de productos de IgG usan varios métodos de preparación de IgG. Un problema común con los métodos de producción de IgG actuales es la pérdida sustancial de IgG durante el procedimiento de purificación, estimada en al menos del 30% al 35% del contenido total de IgG del material de partida. Un desafío es mantener la calidad de la inactivación de virus y la eliminación de impurezas que pueden provocar reacciones adversas, mientras se mejora la eficiencia del procedimiento para aumentar el rendimiento de IgG. Con los niveles de producción actuales de IgG, lo que puede considerarse pequeños incrementos en el rendimiento son, de hecho, muy significativos. Por ejemplo, a los niveles de producción de 2007, un aumento del 2% en la eficiencia, equivalente a 56 miligramos adicionales por litro, generaría 1,5 toneladas métricas adicionales de IgG.

En la cuarta entrega de una serie de artículos fundamentales publicados sobre la preparación y las propiedades de proteínas séricas y plasmáticas, Cohn et al. (J. Am. Chem. Soc., 1946, 68(3): 459-475) describieron por primera vez un método para el fraccionamiento con alcohol de proteínas plasmáticas (método 6), que permite el aislamiento de una fracción enriquecida en IgG a partir de plasma humano. Varios años después, Oncley et al. (J. Am. Chem. Soc., 1949, 71(2): 541-550) ampliaron los métodos de Cohn al publicar un método (método 9) que dio como resultado el aislamiento de una preparación de IgG más pura.

Estos métodos, si bien sentaron las bases para toda una industria de proteínas sanguíneas derivadas de plasma, no pudieron proporcionar preparaciones de IgG con una pureza suficientemente alta para el tratamiento de varias enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario, incluyendo el síndrome de Kawasaki, la púrpura trombocitopénica inmunitaria y las deficiencias inmunitarias primarias. Como tal, se desarrollaron metodologías adicionales que emplean diversas técnicas, tales como la cromatografía de intercambio iónico, para proporcionar formulaciones de IgG de mayor pureza. Hoppe et al. (Munch Med Wochenschr 1967 (34): 1749-1752), Falksveden (patente sueca n.° 348942), y Falksveden y Lundblad (Methods of Plasma Protein Fractionation 1980) fueron de los primeros en emplear la cromatografía de intercambio iónico para este propósito.

Diversos métodos modernos para la purificación de inmunoglobulinas a partir de plasma emplean una etapa de precipitación, tal como precipitación con caprilato (Lebing et al., Vox Sang 2003 (84):193-201) y precipitación con etanol de la fracción (I+)M+MI de Cohn (Tanaka et al., Braz J Med Biol Res 2000 (33) 37-30) acoplada a cromatografía en columna. Más recientemente, Teschner et al. (Vox Sang, 2007 (92):42-55) han descrito un método para la producción de un producto de IgG al 10% en el que en primer lugar se retira el crioprecipitado del plasma agrupado y luego se realiza un fraccionamiento con etanol frío de Cohn-Oncley modificado, seguido de un tratamiento S/D del producto intermedio, cromatografía de intercambio iónico, nanofiltración y, opcionalmente, ultrafiltración/diafiltración.

A pesar de la pureza, la seguridad y el rendimiento que ofrecen estos métodos de aislamiento de IgG, todavía puede mejorarse el rendimiento de IgG recuperada del plasma. Por ejemplo, Teschner et al. informan que su método da como resultado un aumento en el rendimiento de IgG del 65% (Teschner et al., citado anteriormente). Tal como se informó durante diversas reuniones de productos de plasma, los rendimientos promedio para la preparación a gran escala de IgG, tal como de Baxter, CSL Behring, Upfront Technology, Cangene, Prometric BioTherapeutics y la Cruz Roja finlandesa, oscilan desde aproximadamente el 61% hasta aproximadamente el 65% en el recipiente final. Aunque es mejor que los métodos empleados anteriormente, esta cantidad de recuperación de IgG todavía representa una pérdida de al menos aproximadamente un tercio de la IgG presente en la fracción de plasma agrupado durante el procedimiento de aislamiento.

Debido al suministro limitado de plasma disponible para la fabricación de productos derivados de plasma, puede lograrse el aislamiento de varias proteínas sanguíneas a partir de un conjunto de plasma de partida común integrando las purificaciones en un único contexto. Por ejemplo, la IgG se enriquece habitualmente a través de la formación de un precipitado de la fracción II+III de Cohn o precipitado A de Kistler-Nitschmann, cuyos sobrenadantes correspondientes se usan luego para la fabricación de alfa-1-antitripsina (A1PI) y albúmina. De manera similar, se han descrito varios métodos para la fabricación de factor H a partir de subproductos formados durante la fabricación de inmunoglobulinas IgG, incluyendo los documentos WO 2008/113589 y WO 2011/011753.

El documento US 4476 109 A se refiere a un método para preparar globulina gamma adecuada para administración intravenosa que comprende una primera etapa de tratar un líquido de sobrenadante separado del plasma sanguíneo humano con etanol.

El documento WO 03/034982 A2 se refiere a la purificación de inmunoglobulinas a partir de plasma sanguíneo con un alto grado de eficiencia y una alta tasa de recuperación, en la que la fuente de inmunoglobulina es la fracción I+II+III o II+III de Cohn preparada a partir de plasma o productos intermedios de plasma por precipitación.

El documento WO 2011/149472 A1 se refiere a métodos para la fabricación de productos de IVIG usando una primera etapa de precipitación, con entre aproximadamente el 6% y aproximadamente el 10% de alcohol a un pH de entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 7,5.

Como tal, existe la necesidad de métodos mejorados y más eficientes para fabricar productos terapéuticos de IgG. Además, estos métodos también deberían permitir la fabricación de productos derivados de plasma adicionales a partir de una única fuente de plasma. La presente invención satisface estas y otras necesidades proporcionando métodos de aislamiento de IgG que producen rendimientos que son de aproximadamente un 20 a un 25% superiores a los que pueden conseguirse actualmente, así como composiciones de IgG proporcionadas a partir de los mismos. Ventajosamente, los métodos proporcionados en el presente documento permiten el aislamiento conjunto de otras proteínas derivadas de plasma terapéuticamente importantes, incluyendo alfa-1-antitripsina (A1PI), factor H, proteínas inhibidoras de inter-alfa (IaIp), complejos de protrombina, factor VII (FVII), factor VIII (FVIII), antitrombina III (ATIII), fibrinógeno, butirilcolinesterasa y otras.

Breve sumario de la invención

Los métodos actuales para la producción de IVIG y alfa-1-antitripsina (A1PI) se basan en múltiples etapas de precipitación de proteínas para separar la inmunoglobulina IgG y la A1PI de otros componentes que se encuentran en el plasma humano. Por ejemplo, muchos fabricantes usan una variación del método 6 de Cohn-Oncley, en el que se emplean tres etapas iniciales de precipitación con alcohol. La primera etapa de precipitación, denominada precipitación de la fracción I, se realiza a un pH alto (7,2) y una concentración baja de etanol (8-10% v/v) para precipitar proteínas tales como el fibrinógeno y el factor XIII de la IgG y la A1PI, que permanecen en el sobrenadante. A continuación, la IgG precipita del sobrenadante de la fracción I en una segunda reacción de precipitación, denominada precipitación de la fracción II+III, realizada a un pH moderado (6,8) y una concentración alta de etanol (20%-25%). La mayor parte de la A1PI permanece en el sobrenadante de la reacción de precipitación de la fracción II+III, ya que posteriormente se separa de la albúmina en una tercera reacción de precipitación inicial, denominada precipitación de la fracción I-IV-1, realizada a un pH bajo (5,2) y una concentración moderada de etanol (18%).

Desafortunadamente, debido a que el método de Cohn-Oncley descrito anteriormente, así como el procedimiento comparable de Kistler-Nitschmann que emplea cuatro precipitaciones iniciales para fraccionar IgG y A1P i, separan los componentes individuales en una serie intrincada de reacciones de precipitación, el fraccionamiento es ineficiente. Una pérdida significativa en el rendimiento de IgG y A1PI, en estas etapas iniciales de precipitación, puede atribuirse a la precipitación parcial en fracciones no objetivo, así como a la precipitación incompleta en las fracciones objetivo. Por ejemplo, la IgG coprecipita en cierta medida con el fibrinógeno y el factor XIII en el precipitado de la fracción I y parte de la IgG no precipita en la precipitación de la fracción II+III. Después de la clarificación de un precipitado de la fracción II+III disuelto, el rendimiento de IgG está normalmente entre el 75% y el 85% de la IgG presente en la agrupación de Cohn de partida. Por consiguiente, se pierde del 15% al 25% del contenido total de IgG del material de partida después de estas dos etapas de fraccionamiento.

La presente divulgación mejora la recuperación de IgG y A1PI del plasma agrupado al eliminar la necesidad de múltiples etapas de precipitación iniciales. Más bien, los métodos descritos en el presente documento se basan en una única etapa de precipitación inicial que captura todas las proteínas normalmente precipitadas en los precipitados de la fracción I, la fracción II+III y la fracción IV-1 combinados. Esta única etapa de precipitación se denomina en el presente documento “precipitación de la fracción I+II+III+IV-1”, “precipitación de la fracción I-IV-1” o “precipitación inicial con alto contenido de alcohol y pH bajo”. Ventajosamente, se halló que IgG y A1PI podían extraerse eficazmente del precipitado de la fracción I-IV-1 sin el uso de precipitaciones de proteínas posteriores. Además, se halló que el precipitado de la fracción I-IV-1 contenía casi todo el contenido de IgG y A1PI del plasma fuente, mientras que la albúmina permanece en el sobrenadante. En conjunto, estas ventajas dan como resultado un aumento significativo en la recuperación general de estos importantes productos comerciales.

Tal como se muestra en los ejemplos, el uso de una etapa de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo (precipitación de la fracción I-IV-1) como etapa inicial en la purificación de IgG a partir de plasma desprovisto de crioprecipitado, permite la producción de composiciones de IgG de calidad farmacéutica con rendimientos sin precedentes de 4,3-4,7 g de IgG/l de plasma fuente. Estos rendimientos representan un aumento aproximado del 20% al 25% en el rendimiento en comparación con los procedimientos de fabricación del estado de la técnica, tales como los que se usan para fabricar GAMMAGARD LIQUlD® (Baxter International; Deerfield, IL) a partir del mismo tipo de plasma.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un nuevo procedimiento de fraccionamiento de plasma tal como se define en las reivindicaciones que separa plasma o plasma desprovisto de crioprecipitado en una etapa inicial en un precipitado de la fracción I-IV-1 y un sobrenadante de la fracción I-IV-1. El precipitado de la fracción I-lV-1 contiene casi todas las inmunoglobulinas (por ejemplo, IgG, IgA e IgM) e inhibidor de elastasa alfa 1 (A1PI), mientras que el sobrenadante contiene principalmente albúmina.

La presente invención proporciona un método para preparar una composición de inmunoglobulina enriquecida a partir de una agrupación de Cohn, comprendiendo el método las etapas de: (a) coprecipitar inmunoglobulinas y alfa-1-antitripsina (A1PI) a partir de plasma desprovisto de crioprecipitado, en una primera etapa de precipitación tal como se define en las reivindicaciones, para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; (b) solubilizar inmunoglobulinas en el primer precipitado usando una disolución que tiene un pH de entre 4,0 y 4,9, para formar una primera suspensión que tiene una porción soluble que comprende inmunoglobulinas y una porción insoluble que comprende A1PI; (c) separar la porción soluble de la primera suspensión de la porción insoluble de la primera suspensión; y (d) recuperar la fracción soluble de la primera suspensión, formando de ese modo una composición de inmunoglobulina enriquecida.

En la invención, la primera etapa de precipitación es una etapa de precipitación con alcohol.

En la invención, la etapa de precipitación con alcohol comprende añadir etanol al plasma desprovisto de crioprecipitado para lograr una concentración final de desde el 20% hasta el 30% de etanol (v/v) a un pH de desde 5,0 hasta 6,0. En una realización de los métodos descritos anteriormente, la concentración final de etanol en la primera etapa de precipitación es del 25±4%. En una realización de los métodos descritos anteriormente, la concentración final de etanol es del 25±3%. En una realización de los métodos descritos anteriormente, la concentración final de etanol es del 25±2%. En una realización de los métodos descritos anteriormente, la concentración final de etanol es del 25±1%. En una realización de los métodos descritos anteriormente, la concentración final de etanol es del 25%.

En una realización de los métodos descritos anteriormente, el pH de la primera etapa de precipitación es de 5,5±0,4. En una realización de los métodos descritos anteriormente, el pH es de 5,5±0,3. En una realización de los métodos descritos anteriormente, el pH es de 5,5±0,2. En una realización de los métodos descritos anteriormente, el pH es de 5,5±0,1. En una realización de los métodos descritos anteriormente, el pH es de 5,5.

En una realización de los métodos descritos anteriormente, el pH se mantiene durante la primera etapa de precipitación.

En una realización de los métodos descritos anteriormente, la primera etapa de precipitación con alcohol comprende la adición del alcohol mediante pulverización.

En una realización de los métodos descritos anteriormente, la primera etapa de precipitación con alcohol comprende la adición del alcohol en un sitio adyacente a un impulsor. En otra realización, el alcohol se introduce en la disolución en más de un sitio. En una realización, el alcohol se introduce en la disolución en una pluralidad de pequeños puertos. En una realización específica, los múltiples sitios de adición de alcohol están ubicados en o cerca de un impulsor u otro elemento dispersivo. En otra realización, el alcohol se introduce en la disolución a través de un puerto difusor que comprende una pluralidad de aberturas. En una realización específica, una o más de las aberturas respectivas en la pluralidad de aberturas en el puerto del difusor están ubicadas en o próximas a un impulsor u otro elemento dispersivo. En una realización de los métodos descritos anteriormente, la primera etapa de precipitación se realiza a una temperatura de desde -3°C hasta -10°C. En una realización de los métodos descritos anteriormente, la primera etapa de precipitación se realiza a una temperatura de desde -5°C hasta -9°C.

En una realización de los métodos descritos anteriormente, el primer precipitado se suspende con de desde 4 l hasta 60 l de tampón por kg de precipitado. En una realización de los métodos descritos anteriormente, el primer precipitado se suspende con de desde 8 l hasta 15 l de tampón por kg de precipitado.

En una realización de los métodos descritos anteriormente, la primera suspensión tiene un pH de desde 4,0 hasta 4,9. En una realización de los métodos descritos anteriormente, la primera suspensión tiene un pH de desde 4,7 hasta 4,9. En una realización de los métodos descritos anteriormente, la primera suspensión tiene una conductividad de desde 0 mS/cm hasta 4 mS/cm. En una realización de los métodos descritos anteriormente, la primera suspensión tiene una conductividad de desde 0,5 mS/cm hasta 2 mS/cm.

En una realización de los métodos descritos anteriormente, el primer precipitado se suspende en un tampón que comprende acetato y/o fosfato.

En una realización de los métodos descritos anteriormente, la porción soluble de la primera suspensión se separa de la porción insoluble de la primera suspensión por centrifugación o filtración.

En una realización de los métodos descritos anteriormente, la etapa de separar la porción soluble de la primera suspensión de la porción insoluble de la primera suspensión comprende: (i) mezclar dióxido de silicio (SO2) finamente dividido con la primera suspensión; y (ii) separar el SiO2 de la suspensión.

En una realización de los métodos descritos anteriormente, el dióxido de silicio (SO2) finamente dividido tiene un área de superficie promedio de desde 350 m2/g hasta 410 m2/g.

En una realización de los métodos descritos anteriormente, el dióxido de silicio (SO2) finamente dividido se añade a la primera suspensión a una concentración final de desde 15 g/kg de primer precipitado hasta 80 g/kg de primer precipitado.

En una realización de los métodos descritos anteriormente, el método comprende las etapas de: (a) precipitar inmunoglobulinas a partir de plasma desprovisto de crioprecipitado, en una primera etapa de precipitación, con entre el 24% y el 26% de alcohol a un pH de entre 5,3 y 5,7 y una temperatura de entre -6°C y -8°C para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; (b) suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; (c) tratar la primera suspensión con dióxido de silicio (SO2) finamente dividido; (d) separar la fracción soluble de la primera suspensión a partir de la fracción insoluble de la primera suspensión; y (e) recuperar la fracción soluble de la primera suspensión, formando de ese modo una composición de inmunoglobulina enriquecida.

En una realización de los métodos descritos anteriormente, la composición de inmunoglobulina enriquecida contiene al menos el 90% del contenido de inmunoglobulina de IgG presente en la agrupación de Cohn usada en la etapa (a).

En una realización de los métodos descritos anteriormente, la composición de inmunoglobulina enriquecida contiene al menos el 95% del contenido de inmunoglobulina de IgG presente en la agrupación de Cohn usada en la etapa (a).

En una realización de los métodos descritos anteriormente, el método comprende además las etapas de (f) precipitar inmunoglobulinas a partir de la fracción soluble de la primera suspensión, en una segunda etapa de precipitación, para obtener un segundo precipitado y un segundo sobrenadante; (g) suspender el segundo precipitado para formar una segunda suspensión; y (h) recuperar la fracción soluble de la segunda suspensión, formando de ese modo una composición de inmunoglobulina enriquecida adicionalmente.

En una realización de los métodos descritos anteriormente, la segunda etapa de precipitación es una etapa de precipitación con alcohol.

En una realización de los métodos descritos anteriormente, la segunda etapa de precipitación con alcohol comprende añadir etanol a la fracción soluble de la primera suspensión para lograr una concentración final de entre el 22% y el 28% de etanol a un pH de entre 6,5 y 7,5.

En una realización de los métodos descritos anteriormente, la segunda etapa de precipitación con alcohol comprende la adición del alcohol mediante pulverización.

En una realización de los métodos descritos anteriormente, la segunda etapa de precipitación con alcohol comprende la adición del alcohol en un sitio adyacente a un impulsor. En otra realización, el alcohol se introduce en la disolución en más de un sitio. En una realización, el alcohol se introduce en la disolución en una pluralidad de pequeños puertos. En una realización específica, los múltiples sitios de adición de alcohol están ubicados en o cerca de un impulsor u otro elemento dispersivo. En otra realización, el alcohol se introduce en la disolución a través de un puerto difusor que comprende una pluralidad de aberturas. En una realización específica, una o más de las aberturas respectivas en la pluralidad de aberturas en el puerto del difusor están ubicadas en o próximas a un impulsor u otro elemento dispersivo.

En una realización de los métodos descritos anteriormente, la segunda etapa de precipitación se realiza a una temperatura de entre -3°C y -10°C.

En una realización de los métodos descritos anteriormente, la composición de inmunoglobulina enriquecida contiene al menos el 90% del contenido de IgG presente en el plasma desprovisto de crioprecipitado usado en la etapa (a).

En una realización de los métodos descritos anteriormente, la composición de inmunoglobulina enriquecida contiene al menos el 95% del contenido de IgG presente en el plasma desprovisto de crioprecipitado usado en la etapa (a).

En una realización de los métodos descritos anteriormente, el método comprende además una etapa de enriquecimiento por cromatografía de intercambio aniónico.

En una realización de los métodos descritos anteriormente, el método comprende además una etapa de enriquecimiento por cromatografía de intercambio catiónico.

En una realización de los métodos descritos anteriormente, el método comprende además una etapa de inactivación o eliminación de virus.

En una realización de los métodos descritos anteriormente, el método comprende una etapa de inactivación de virus con disolventes/detergentes (S/D).

En una realización de los métodos descritos anteriormente, el método comprende una etapa de nanofiltración.

En una realización de los métodos descritos anteriormente, el método comprende una etapa de incubar la composición a un pH de desde 4,0 hasta 5,0 y una temperatura de desde 20°C hasta 40°C durante al menos una semana.

En una realización de los métodos descritos anteriormente, la composición de IgG enriquecida final comprende al menos el 98% de IgG.

En una realización de los métodos descritos anteriormente, la composición de IgG enriquecida final comprende al menos el 99% de IgG.

En una realización de los métodos descritos anteriormente, el método produce al menos 4 g de IgG por l de plasma desprovisto de crioprecipitado usado en la etapa (a).

En una realización de los métodos descritos anteriormente, el método produce al menos 4,25 g de IgG por l de plasma desprovisto de crioprecipitado usado en la etapa (a).

En una realización de los métodos descritos anteriormente, el método produce al menos 4,5 g de IgG por l de plasma desprovisto de crioprecipitado usado en la etapa (a).

En los métodos descritos anteriormente, la alfa-1-antitripsina (A1PI) puede purificarse adicionalmente a partir de una fracción insoluble de la primera suspensión.

En los métodos descritos anteriormente, el fibrinógeno puede purificarse adicionalmente a partir de una fracción insoluble de la primera suspensión.

En los métodos descritos anteriormente, el factor H puede purificarse adicionalmente a partir de una fracción insoluble de la primera suspensión.

En los métodos descritos anteriormente, una proteína inhibidora de inter-alfa-tripsina (IaIp) puede purificarse adicionalmente a partir de una fracción insoluble de la primera suspensión.

En una realización de los métodos descritos anteriormente, la fracción insoluble de la primera suspensión se trata con dióxido de silicio (SO2) finamente dividido.

En los métodos descritos anteriormente, la albúmina puede purificarse adicionalmente a partir del primer sobrenadante.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para tratar una inmunodeficiencia, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria o una infección aguda en un individuo que lo necesita, comprendiendo el método administrar una composición de inmunoglobulina enriquecida tal como se describe en el presente documento al sujeto.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Diagrama de un esquema de fraccionamiento de plasma según una realización descrita en el presente documento.

Descripción detallada de la invención

I. Introducción

La presente invención proporciona un método más eficiente para el aislamiento de proteínas terapéuticas a partir de plasma agrupado, tal como se refleja en las reivindicaciones. Los métodos proporcionados en el presente documento para el fraccionamiento de plasma agrupado proporcionan mayores rendimientos de múltiples proteínas sanguíneas derivadas de plasma terapéuticamente importantes, incluyendo inmunoglobulinas y alfa-1-antitripsina (A1PI). La presente invención proporciona métodos tal como se reflejan en las reivindicaciones que aumentan significativamente el rendimiento de inmunoglobulina G (IgG) aislada del plasma, en comparación con los métodos del estado de la técnica usados para la fabricación de composiciones terapéuticas de IgG. Estos rendimientos mejorados se logran mediante la precipitación de inmunoglobulinas y AIP1 a partir de una muestra de plasma de partida (denominada en el presente documento “agrupación de Cohn”) en condiciones de alto contenido de alcohol y pH bajo. La etapa de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo da como resultado una captura masiva de la composición de inmunoglobulina de la agrupación de Cohn de partida. En comparación con los procedimientos de fabricación de inmunoglobulina del estado de la técnica, los métodos proporcionados en el presente documento reducen significativamente la cantidad de inmunoglobulina perdida durante el fraccionamiento anterior del plasma.

Los métodos de la invención reducen el número de etapas de precipitación de proteínas requeridas para el aislamiento de proteínas a partir del plasma humano a purezas suficientemente altas para administración terapéutica, mientras que aumentan simultáneamente el rendimiento de recuperación de proteínas sanguíneas terapéuticamente importantes tales como la inmunoglobulina G (IgG). Específicamente, los métodos eliminan la necesidad de una etapa de precipitación inicial con bajo contenido de alcohol y pH alto, habitualmente denominada precipitación de la fracción I, que se usa en los procedimientos de fabricación derivados de los esquemas de fraccionamiento de Cohn-Oncley, Kistler-Nitschmann y Deutsch. En su lugar, los métodos proporcionados en el presente documento emplean una etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol y pH bajo (denominada en el presente documento precipitación de la fracción I-IV-1) que reparte la mayor parte del contenido de IgG, IgA, IgM y alfa-1-antitripsina (A1PI) del plasma en el precipitado y la mayor parte de la albúmina en el sobrenadante. A continuación, la IgG se separa de la IgA, la IgM y la A1PI a través de diversos medios, lo que da como resultado composiciones de IgG de alto rendimiento. En comparación con los métodos que emplean una etapa de precipitación de la fracción I, la captura masiva de IgG en la etapa de precipitación inicial de la fracción I-IV-1 aumenta el rendimiento final del procedimiento de fabricación en al menos de un 10 a un 25%.

E. J. Cohn estableció por primera vez un método para el fraccionamiento de plasma usando etanol, en lugar de sales, en 1946. Desde entonces, la precipitación con etanol se ha convertido en el método de elección para la fabricación a gran escala de productos derivados de plasma, tales como IgG y A1PI. Normalmente, estos procedimientos de fabricación emplean una serie de etapas de fraccionamiento con etanol, lo que proporciona fracciones en bruto de diversas proteínas sanguíneas derivadas de plasma, que se enriquecen adicionalmente mediante diversos procedimientos/técnicas posteriores diferentes.

Los procedimientos de Cohn se desarrollaron inicialmente para obtener albúmina a una pureza relativamente alta (95%) mediante precipitación fraccionada con alcohol. Sin embargo, Oncley et al., Deutsch et al., y Kistler y Nitschmann se dieron cuenta rápidamente de que un precipitado de proteínas particular (fracción II+IN) del método número 6 de Cohn podía usarse como material de partida para la purificación de composiciones de inmunoglobulina altamente enriquecidas. Para lograr la mayor pureza y seguridad requeridas para la administración intravenosa de composiciones de IgG, se han añadido varias etapas de purificación y pulido (por ejemplo, adsorción en general o todas las diferentes técnicas cromatográficas, filtración de flujo cruzado, etc.) a los procedimientos de fabricación de IgG después de las etapas de fraccionamiento con alcohol.

Normalmente, los fabricantes de IgG se basan en o bien un precipitado de la fracción II+III del método 6 de Cohn o bien un precipitado A de Kistler-Nitschmann como material de partida para el procesamiento posterior. Ambas fracciones se forman mediante un procedimiento de dos etapas en el que: i.) las proteínas tales como el fibrinógeno y el factor XIII se retiran mediante una etapa de precipitación inicial (precipitación de la fracción I) realizada a un pH alto (7,2) con una concentración baja de etanol (8-10% v/v); y ii.) la IgG se precipita del sobrenadante de la fracción I a pH 6,8 con etanol al 20-25% (v/v) (fracción II+III) o a pH 5,85 con etanol al 19% (v/v) (precipitado A), mientras que la albúmina y una porción significativa de A1PI permanecen en el sobrenadante. Sin embargo, el uso de un precipitado de la fracción II+III o precipitado A como material de partida para la fabricación de composiciones de IgG da como resultado la pérdida de IgG en varias etapas del procedimiento, tal como se describió anteriormente.

Para superar estos problemas, los inventores han desarrollado una etapa de purificación inicial que coprecipita inmunoglobulinas y A1PI para proporcionar un material de partida que contiene casi todo el contenido de IgG y A1PI del plasma fuente, mientras que la albúmina permanece en el sobrenadante. Esta etapa de fraccionamiento colapsa esencialmente las etapas de precipitación fraccionada I, II+III y IV-1 tal como describen Oncley et al. (citado anteriormente) en una única reacción de precipitación, denominada en el presente documento precipitación de la fracción I+II+III+IV-1 (o fracción I-IV-1).

En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento tal como se define en las reivindicaciones para fabricar una composición de inmunoglobulina de alto rendimiento para administración intravenosa, subcutánea o intramuscular usando un precipitado de la fracción I-IV-1 como material de partida. El método comprende además la separación de alfa-1-antitripsina (A1PI) en una fracción insoluble de una suspensión formada durante la extracción de inmunoglobulina a partir del precipitado de la fracción I-IV-1. La fracción insoluble separada puede usarse luego como material de partida para la fabricación de una composición de A1PI derivada de plasma.

La presente invención proporciona métodos para fabricar una composición terapéutica de inmunoglobulinas aisladas a partir de plasma agrupado tal como se define en las reivindicaciones. Estos métodos de fabricación incluyen una etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol (por ejemplo, etanol) y pH bajo que aumenta la recuperación de diversas proteínas sanguíneas, en comparación con los métodos tradicionales. Los métodos también son útiles para fabricar una o más composiciones terapéuticas que contienen albúmina, alfa-1-antitripsina (A1PI), butirilcolinesterasa, factor H o una proteína inhibidora de inter-alfa-tripsina (IaIp) aislada de sangre humana, plasma, o un derivado de los mismos.

II. Definiciones

Tal como se usa en el presente documento, el término “tratamiento con IgG” se refiere generalmente a un método terapéutico de administración intravenosa, subcutánea o intramuscular de una composición de inmunoglobulinas IgG a un paciente para tratar varias afecciones tales como inmunodeficiencias, enfermedades inflamatorias y enfermedades autoinmunitarias. Las inmunoglobulinas IgG normalmente se agrupan y preparan a partir de plasma. Pueden usarse anticuerpos completos o fragmentos. Las inmunoglobulinas IgG pueden formularse en concentraciones más altas (por ejemplo, superiores al 10%) para administración subcutánea, o formularse para administración intramuscular. Esto es particularmente habitual para preparaciones especiales de IgG que se preparan con títulos superiores al promedio para antígenos específicos (por ejemplo, factor Rho D, toxina pertúsica, toxina tetánica, toxina botulínica, rabia, etc.).

Tal como se usa en el presente documento, “plasma desprovisto de crioprecipitado” se refiere al sobrenadante creado después de la retirada del crioprecipitado formado descongelando plasma o plasma agrupado a temperaturas cercanas a la congelación, por ejemplo, a temperaturas inferiores a aproximadamente 10°C, preferiblemente a una temperatura no superior a aproximadamente 6°C. En el contexto de la presente invención, plasma puede referirse de manera intercambiable a plasma recuperado (es decir, plasma que se ha separado de sangre completa ex vivo) o plasma fuente (es decir, plasma recogido mediante plasmaféresis). La crioprecipitación se realiza habitualmente, por ejemplo, descongelando plasma agrupado previamente congelado, que ya se analizó por consideraciones de seguridad y calidad, aunque también puede usarse plasma fresco. Después de la descongelación completa del plasma congelado a baja temperatura, la separación de los crioprecipitados sólidos a partir del sobrenadante líquido se realiza en frío (por ejemplo, < 6°C) mediante centrifugación o filtración.

Tal como se usa en el presente documento, una “agrupación de Cohn” se refiere al material de partida usado para el fraccionamiento de una muestra de plasma o un conjunto de muestras de plasma. Las agrupaciones de Cohn, tal como se usan en el presente documento, se refieren a plasma completo o plasma desprovisto de crioprecipitado.

Tal como se usa en el presente documento, el término “composición enriquecida” se refiere a una composición de proteínas aislada a partir de una muestra de plasma, en la que la pureza de la proteína es mayor que la pureza de la proteína en la muestra de plasma de partida. En una realización, una proteína en una composición enriquecida es al menos un 25% más pura que en la muestra de plasma de partida. En otras realizaciones, una composición enriquecida es al menos el 50%, el 75%, el 100%, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces o más pura que la muestra de plasma de partida. Por ejemplo, una composición de IgG enriquecida en la que el 70% de la proteína total es IgG se enriquece 7 veces en comparación con una muestra de plasma de partida en la que el 10% de la proteína total es IgG.

Tal como se usa en el presente documento, el término “adición difusa” se refiere a un medio para añadir una sustancia a un sistema líquido de manera deslocalizada. La adición difusa puede lograrse, por ejemplo, pulverizando o rociando un líquido (por ejemplo, alcohol, agente modificador de pH, disolvente, detergente u otro líquido) en un sistema líquido (por ejemplo, fracción de plasma), introduciendo un líquido en un sistema en múltiples sitios, introduciendo un líquido en un sistema usando un puerto difusor, introduciendo un líquido en o cerca de un impulsor u otro elemento dispersivo, o distribuyendo un producto químico presente en estado sólido sobre un área expandida de un sistema líquido.

Tal como se usa en el presente documento, el término “pulverización” se refiere a un medio para administrar una sustancia líquida a un sistema, por ejemplo, durante una etapa de precipitación con alcohol, tal como una etapa de precipitación de la fracción I-IV-1, en forma de gotas finas o nebulización de la sustancia líquida. La pulverización puede lograrse con cualquier dispositivo presurizado, tal como un recipiente (por ejemplo, un frasco de pulverización), que tiene un cabezal de pulverización o una boquilla y se hace funcionar manual o automáticamente para generar una fina nebulización a partir de un líquido. Normalmente, la pulverización se realiza mientras el sistema que recibe la sustancia líquida se agita continuamente o se mezcla de otro modo para garantizar una distribución rápida y uniforme del líquido dentro del sistema.

Tal como se usa en el presente documento, el término “disolvente” abarca cualquier sustancia líquida capaz de disolver o dispersar una o más sustancias. Un disolvente puede ser de naturaleza inorgánica, tal como agua, o puede ser un líquido orgánico, tal como etanol, acetona, acetato de metilo, acetato de etilo, hexano, éter de petróleo, etc. Tal como se usa en el término “tratamiento con disolventes/detergentes”, disolvente indica un disolvente orgánico (por ejemplo, fosfato de tri-n-butilo), que forma parte de la mezcla de disolventes/detergentes usada para inactivar virus con envoltura lipídica en disolución.

Tal como se usa en el presente documento, el término “detergente” se usa en esta solicitud de manera intercambiable con el término “tensoactivo” o “agente de acción superficial”. Los tensioactivos son normalmente compuestos orgánicos que son anfífilos, es decir, que contienen tanto grupos hidrófobos (“colas”) como grupos hidrófilos (“cabezas”), que hacen que los tensioactivos sean solubles tanto en disolventes orgánicos como en agua. Un tensioactivo puede clasificarse por la presencia de grupos formalmente cargados en su cabeza. Un tensioactivo no iónico no tiene grupos de carga en su cabeza, mientras que un tensioactivo iónico lleva una carga neta en su cabeza. Un tensioactivo zwitteriónico contiene una cabeza con dos grupos con carga opuesta. Algunos ejemplos de tensioactivos habituales incluyen: aniónico (basado en aniones sulfato, sulfonato o carboxilato): perfluorooctanoato (PFOA o PFO), perfluorooctanosulfonato (PFOS), dodecilsulfato de sodio (SDS), laurilsulfato de amonio y otras sales de sulfatos de alquilo, lauril éter sulfato de sodio (también conocido como lauril éter sulfato sódico o SLES), alquilbencenosulfonato; catiónico (basado en cationes amonio cuaternario): bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), también conocido como bromuro de hexadeciltrimetilamonio, y otras sales de alquiltrimetilamonio, cloruro de cetilpiridinio (CPC), amina de sebo polietoxilada (POEA), cloruro de benzalconio (BAC), cloruro de bencetonio (BZT); ácidos grasos de cadena larga y sus sales: incluyendo caprilato, ácido caprílico, heptanoato, ácido hexanoico, ácido heptanoico, ácido nonanoico, ácido decanoico y similares; zwitteriónico (anfótero): dodecil betaína; cocamidopropil betaína; cocoanfoglicinato; no iónicos: poli(óxido de etileno) de alquilo, poli(óxido de etileno) de alquilfenol, copolímeros de poli(óxido de etileno) y poli(óxido de propileno) (conocidos comercialmente como Poloxamer o Poloxamine), alquilpoliglucósidos, incluyen octilglucósido, decilmaltósido, alcoholes grasos (por ejemplo, alcohol cetílico y alcohol oleílico), cocamida MEA, cocamida DEA, polisorbatos (Tween 20, Tween 80, etc.), detergentes Triton y óxido de dodecildimetilamina.

Por “cantidad o dosis terapéuticamente eficaz” o “cantidad o dosis suficiente/eficaz” se entiende una dosis que produce los efectos para los que se administra. La dosis exacta dependerá del propósito del tratamiento, y un experto en la técnica podrá determinarla usando técnicas conocidas (véase, por ejemplo, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vol. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); y Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edición, 2003, Gennaro, ed., Lippincott, Williams & Wilkins).

Tal como se usa en el presente documento, los términos “precipitación inicial con alto contenido de alcohol y pH bajo” y “precipitación de la fracción I-IV-1” se refieren de manera intercambiable a la precipitación de proteínas a partir de una agrupación de Cohn a una concentración final de alcohol (normalmente etanol) de desde el 20% hasta el 30% (v/v) y un pH de desde 5,0 hasta 6,0. En general, el precipitado de la fracción I-IV-1 resultante contiene al menos el 90% del contenido de inmunoglobulina de la agrupación de Cohn de partida, preferiblemente al menos el 95%, más preferiblemente al menos el 98%, lo más preferiblemente al menos el 99% del contenido de inmunoglobulina de la agrupación de Cohn de partida. En una realización preferida, las inmunoglobulinas comprenden inmunoglobulinas IgG. En otra realización preferida, se coprecipita alfa-1-antitripsina (A1PI) con las inmunoglobulinas en la precipitación de la fracción I-IV-1.

III. Fraccionamiento de plasma

La presente invención proporciona métodos tal como se definen en las reivindicaciones para fraccionar proteínas terapéuticas a partir de plasma agrupado empleando una etapa de precipitación inicial en la que se precipita la mayor parte del contenido de inmunoglobulina y alfa-1-antitripsina (A1PI) del plasma de partida y se retiene la mayor parte del contenido de albúmina del plasma de partida en el sobrenadante. A partir de esta etapa de precipitación inicial, pueden fabricarse varias proteínas sanguíneas terapéuticamente importantes con altos rendimientos de recuperación.

La presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para fraccionar proteínas sanguíneas en una muestra de plasma, comprendiendo el método precipitar inmunoglobulinas y A1PI a partir del plasma de partida en condiciones de alto contenido de alcohol y pH bajo. Esta etapa de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo da como resultado la formación de un precipitado (denominado en el presente documento precipitado de la fracción I-IV-1) y un sobrenadante (denominado en el presente documento sobrenadante de la fracción I-IV-1).

El sobrenadante de la fracción I-IV-1 contendrá al menos el 70%, preferiblemente al menos el 80%, lo más preferiblemente al menos el 90% del contenido de albúmina del plasma de partida. Por consiguiente, este sobrenadante puede usarse como material de partida para la fabricación de una composición farmacéutica de albúmina.

El precipitado de la fracción I-IV-1 contendrá al menos el 90%, preferiblemente al menos el 95%, más preferiblemente al menos el 98%, lo más preferiblemente al menos el 99% del contenido de inmunoglobulina del plasma de partida. En una realización específica, el precipitado de la fracción I-IV-1 contiene al menos el 98%, preferiblemente el 99% del contenido de IgG del plasma de partida. Por consiguiente, este precipitado puede usarse como material de partida para la fabricación de composiciones farmacéuticas de inmunoglobulina. En la invención, el precipitado de la fracción I-IV-1 se usa para la fabricación de una composición farmacéutica de IgG. En aún otra realización, el precipitado de la fracción I-IV-1 se usa como material de partida para la fabricación de una composición farmacéutica de inmunoglobulina que contiene más de un subtipo de inmunoglobulina.

Asimismo, el precipitado de la fracción I-IV-1 contendrá al menos el 90%, preferiblemente al menos el 95%, más preferiblemente al menos el 97%, lo más preferiblemente al menos el 98% del contenido de A1PI del plasma de partida. Por consiguiente, este precipitado puede usarse como material de partida para la fabricación de una composición farmacéutica de A1PI.

El precipitado de la fracción I-IV-1 también contendrá al menos el 70%, preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90%, lo más preferiblemente al menos el 95% del contenido de factor H del plasma de partida. Por consiguiente, este precipitado puede usarse como material de partida para la fabricación de una composición farmacéutica de factor H.

El precipitado de la fracción I-IV-1 también contendrá al menos el 70%, preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90%, lo más preferiblemente al menos el 95% del contenido de inhibidor de inter-alfa (IaIp) del plasma de partida. Por consiguiente, este precipitado puede usarse como material de partida para la fabricación de una composición farmacéutica de IaIp.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para separar inmunoglobulinas de A1PI que se encuentran en el precipitado de la fracción I-IV-1. El método comprende solubilizar inmunoglobulinas en una suspensión del precipitado de la fracción I-IV-1, mientras se retiene A1PI en la porción insoluble de la suspensión, y luego se separan las porciones soluble e insoluble, por ejemplo por filtración o centrifugación. En una realización, se ayuda a la separación tratando la suspensión de la fracción I-IV-1 con dióxido de silicio finamente dividido antes de separar las porciones soluble e insoluble. Sin estar ligado a la teoría, el dióxido de silicio puede unirse a A1PI que se solubiliza conjuntamente con las inmunoglobulinas, aumentando la cantidad de A1PI repartida en la porción insoluble de la suspensión.

Además, se sabe que el factor H e IaIp se unen a las partículas de dióxido de silicio en determinadas condiciones (véanse los documentos WO/2011/011753, WO/2012/012773 y WO/2011/150284). Por consiguiente, en una realización, la presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para separar inmunoglobulinas de A1PI, factor H e IaIp que se encuentran en un precipitado de la fracción I-IV-1, comprendiendo el método suspender un precipitado de la fracción I-IV-1 en agua o un tampón de baja conductividad suficiente para solubilizar las inmunoglobulinas; tratar la suspensión con dióxido de silicio; y separar la porción soluble de la suspensión de la porción insoluble, en el que la porción soluble contiene inmunoglobulinas y la porción insoluble contiene A1PI, factor H e IaIp.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, la porción soluble separada de la suspensión de la fracción I-IV-1 contiene al menos el 80% del contenido de IgG de la muestra de plasma de partida. En una realización preferida, la porción soluble separada de la suspensión de la fracción I-IV-1 contiene al menos el 90% del contenido de IgG de la muestra de plasma de partida. En una realización más preferida, la porción soluble separada de la suspensión de la fracción I-IV-1 contiene al menos el 95% del contenido de IgG de la muestra de plasma de partida. En aún otras realizaciones, la porción soluble de la suspensión de la fracción I-IV-1 contiene al menos el 80%, el 81%, el 82%, el 83%, el 84%, el 85%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más del contenido de IgG de la muestra de plasma de partida.

En una realización de los métodos proporcionados anteriormente, la porción insoluble separada de la suspensión de la fracción I-IV-1 contiene al menos el 70% del contenido de A1PI de la muestra de plasma de partida. En una realización preferida, la porción insoluble separada de la suspensión de la fracción I-IV-1 contiene al menos el 80% del contenido de A1PI de la muestra de plasma de partida. En una realización más preferida, la porción insoluble separada de la suspensión de la fracción I-IV-1 contiene al menos el 90% del contenido de A1PI de la muestra de plasma de partida. En una realización más preferida, la porción insoluble separada de la suspensión de la fracción I-IV-1 contiene al menos el 95% del contenido de A1PI de la muestra de plasma de partida. En aún otras realizaciones, la porción insoluble separada de la suspensión de la fracción I-IV-1 contiene al menos el 50%, el 51%, el 52%, el 53%, el 54%, el 55%, el 56%, el 57%, el 58%, el 59%, el 60%, el 61%, el 62%, el 63%, el 64%, el 65%, el 66%, el 67%, el 68%, el 69%, el 70%, el 71%, el 72%, el 73%, el 74%, el 75%, el 76%, el 77%, el 78%, el 79%, el 80%, el 81%, el 82%, el 83%, el 84%, el 85%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más del contenido de A1PI de la muestra de plasma de partida.

Las proteínas sanguíneas fraccionadas usando la etapa de precipitación en masa inicial (por ejemplo, precipitación de la fracción I-IV-1) pueden enriquecerse adicionalmente mediante procedimientos adecuados, por ejemplo, precipitación (por ejemplo, fraccionamiento con alcohol o fraccionamiento con polietilenglicol), métodos cromatográficos (cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía de inmunoafinidad, etc.), filtración (ultrafiltración/diafiltración, nanofiltración), ultracentrifugación, preparación electroforética, y similares.

A. Preparación de plasma desprovisto de crioprecipitado

El material de partida usado para la preparación de composiciones concentradas de IgG consiste generalmente en o bien plasma recuperado (es decir, plasma que se ha separado de sangre completa ex vivo) o bien plasma fuente (es decir, plasma recogido mediante plasmaféresis). El procedimiento de purificación generalmente comienza con la descongelación del plasma agrupado previamente congelado, que ya se analizó por consideraciones de seguridad y calidad. La descongelación se lleva a cabo normalmente a una temperatura no superior a 6°C. Después de la descongelación completa del plasma congelado a baja temperatura, se realiza una centrifugación en frío (por ejemplo, < 6°C) para separar los crioprecipitados sólidos del sobrenadante líquido. Alternativamente, la etapa de separación puede realizarse por filtración en lugar de centrifugación. El sobrenadante líquido (también conocido como “plasma desprovisto de crioprecipitado”, después de que las proteínas insolubles en frío se retiren por centrifugación del plasma recién descongelado) se procesa luego en la siguiente etapa. Pueden tomarse diversas etapas adicionales en este momento para el aislamiento de la actividad de corrección del inhibidor del factor ocho (FEIBA), el complejo del factor IX, el factor VII, la antitrombina III, los complejos de protrombina, etc.

B. Primer acontecimiento de precipitación - precipitación de la fracción I-IV-1

En una realización, la presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para fraccionar proteínas sanguíneas en una muestra de plasma, comprendiendo el método precipitar inmunoglobulinas y A1PI a partir del plasma de partida en una primera etapa de precipitación en condiciones de alto contenido de alcohol y pH bajo. Esta etapa de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo da como resultado la formación de un precipitado (precipitado de la fracción I-IV-1) y un sobrenadante (sobrenadante de la fracción I-IV-1).

La primera etapa de precipitación se realiza mezclando etanol con una agrupación de plasma de partida (la agrupación de Cohn) hasta una concentración final de desde el 20% hasta el 30% (v/v) a un pH de entre 5,0 y 6,0. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En otra realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±2% (v/v). En otra realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±1% (v/v). En otra realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25% (v/v). Asimismo, en una realización, la primera etapa de precipitación se realiza a un pH de 5,5±0,5. En otra realización, la primera etapa de precipitación se realiza a un pH de 5,5±0,4. En otra realización, la primera etapa de precipitación se realiza a un pH de 5,5±0,3. En otra realización, la primera etapa de precipitación se realiza a un pH de 5,5±0,2. En otra realización, la primera etapa de precipitación se realiza a un pH de 5,5±0,1. En otra realización, la primera etapa de precipitación se realiza a un pH de 5,5. En aún otras realizaciones, la concentración final de etanol y el pH de la primera etapa de precipitación se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7.

Tabla 1. Combinaciones de pH y concentración final de etanol útiles para la precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo de una agrupación de Cohn.

Tabla 2. Combinaciones de pH y concentración final de etanol útiles para la precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo de una agrupación de Cohn.

Tabla 3. Combinaciones de pH y concentración final de etanol útiles para la precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo de una agrupación de Cohn.

Tabla 4. Combinaciones de pH y concentración final de etanol útiles para la precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo de una agrupación de Cohn.

Tabla 5. Combinaciones de pH y concentración final de etanol útiles para la precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo de una agrupación de Cohn.

Tabla 6. Combinaciones de pH y concentración final de etanol útiles para la precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo de una agrupación de Cohn.

Tabla 7. Combinaciones de pH y concentración final de etanol útiles para la precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo de una agrupación de Cohn.

Tabla 8. Combinaciones de pH y concentración final de etanol útiles para la precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo de una agrupación de Cohn.

Por consiguiente, en una realización, la presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para fraccionar proteínas sanguíneas en una muestra de plasma, comprendiendo el método las etapas de: precipitar inmunoglobulinas y A1PI en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a una agrupación de Cohn hasta una concentración final de entre el 20% y el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; separar el primer precipitado del primer sobrenadante; en el que el primer sobrenadante contiene al menos el 75% del contenido de albúmina de la agrupación de Cohn. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v).

En una realización de los métodos proporcionados en el presente documento, al menos el 90% del contenido de inmunoglobulina de la agrupación de Cohn de partida se precipita en la reacción de precipitación inicial. En una realización preferida, al menos el 95% del contenido de inmunoglobulina de la agrupación de Cohn de partida se precipita en la reacción de precipitación inicial. En una realización más preferida, al menos el 99% del contenido de inmunoglobulina de la agrupación de Cohn de partida se precipita en la reacción de precipitación inicial. En determinadas realizaciones, al menos el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% 0 más del contenido de inmunoglobulina de la agrupación de Cohn de partida se precipita en la reacción de precipitación inicial. En una realización más específica, el contenido de inmunoglobulina de la agrupación de Cohn de partida se refiere al contenido de IgG, IgA e IgM de la agrupación de Cohn de partida. En una realización específica, el contenido de inmunoglobulina de la agrupación de Cohn de partida se refiere al contenido de IgG de la agrupación de Cohn de partida.

En una realización de los métodos proporcionados en el presente documento, al menos el 80% del contenido de alfa-1 -antitripsina (A1PI) de la agrupación de Cohn de partida se precipita en la reacción de precipitación inicial. En una realización preferida, al menos el 90% del contenido de A1PI de la agrupación de Cohn de partida se precipita en la reacción de precipitación inicial. En una realización más preferida, al menos el 95% del contenido de A1PI de la agrupación de Cohn de partida se precipita en la reacción de precipitación inicial. En determinadas realizaciones, al menos el 80%, el 81%, el 82%, el 83%, el 84%, el 85%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más del contenido de A1PI de la agrupación de Cohn de partida se precipita en la reacción de precipitación inicial.

En una realización de los métodos proporcionados en el presente documento, al menos el 70% del contenido de factor H de la agrupación de Cohn de partida se precipita en la reacción de precipitación inicial. En una realización preferida, al menos el 80% del contenido de factor H de la agrupación de Cohn de partida se precipita en la reacción de precipitación inicial. En una realización preferida, al menos el 90% del contenido de factor H de la agrupación de Cohn de partida se precipita en la reacción de precipitación inicial. En una realización más preferida, al menos el 95% del contenido de factor H de la agrupación de Cohn de partida se precipita en la reacción de precipitación inicial. En determinadas realizaciones, al menos el 70%, el 71%, el 72%, el 73%, el 74%, el 75%, el 76%, el 77%, el 78%, el 79%, el 80%, el 81%, el 82%, el 83%, el 84%, el 85%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más del contenido de factor H de la agrupación de Cohn de partida se precipita en la reacción de precipitación inicial.

En una realización de los métodos proporcionados en el presente documento, al menos el 70% del contenido de inhibidor de inter-alfa (IaIp) de la agrupación de Cohn de partida se precipita en la reacción de precipitación inicial. En una realización preferida, al menos el 80% del contenido de IaIp de la agrupación de Cohn de partida se precipita en la reacción de precipitación inicial. En una realización preferida, al menos el 90% del contenido de IaIp de la agrupación de Cohn de partida se precipita en la reacción de precipitación inicial. En una realización más preferida, al menos el 95% del contenido de IaIp de la agrupación de Cohn de partida se precipita en la reacción de precipitación inicial. En determinadas realizaciones, al menos el 70%, el 71%, el 72%, el 73%, el 74%, el 75%, el 76%, el 77%, el 78%, el 79%, el 80%, el 81%, el 82%, el 83%, el 84%, el 85%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más del contenido de IaIp de la agrupación de Cohn de partida se precipita en la reacción de precipitación inicial.

Por consiguiente, en una realización, la presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para fraccionar proteínas sanguíneas en una agrupación de Cohn, comprendiendo el método las etapas de: precipitar inmunoglobulinas, A1PI, factor H e IaIp en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a una agrupación de Cohn hasta una concentración final de entre el 20% y el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; separar el primer precipitado del primer sobrenadante; en el que el primer precipitado contiene i.) al menos el 95%, preferiblemente al menos el 97%, más preferiblemente al menos el 99% del contenido de IgG de la agrupación de Cohn de partida, ii.) al menos el 90%, preferiblemente al menos el 95%, lo más preferiblemente al menos el 97% del contenido de A1PI de la agrupación de Cohn de partida, iii.) al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95% del contenido de factor H de la agrupación de Cohn de partida, y iv.) al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95% del contenido de IaIp de la agrupación de Cohn de partida, y además en el que el primer sobrenadante contiene al menos el 70%, preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90% del contenido de albúmina de la agrupación de Cohn. En una realización, la primera etapa de precipitación se realiza mezclando etanol con una agrupación de plasma de partida (la agrupación de Cohn) hasta una concentración final de desde el 22% hasta el 28% (v/v) a un pH de entre 5,0 y 6,0. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En otra realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±2% (v/v). En otra realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±1% (v/v). En otra realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25% (v/v). Asimismo, en una realización, la primera etapa de precipitación se realiza a un pH de 5,5±0,5. En otra realización, la primera etapa de precipitación se realiza a un pH de 5,5±0,4. En otra realización, la primera etapa de precipitación se realiza a un pH de 5,5±0,3. En otra realización, la primera etapa de precipitación se realiza a un pH de 5,5±0,2. En otra realización, la primera etapa de precipitación se realiza a un pH de 5,5±0,1. En otra realización, la primera etapa de precipitación se realiza a un pH de 5,5. En aún otras realizaciones, la concentración final de etanol y el pH de la primera etapa de precipitación se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7.

IV. Preparación de composiciones de inmunoglobulina

En general, las preparaciones de inmunoglobulina según la presente invención se preparan a partir de cualquier material de plasma completo o plasma desprovisto de crioprecipitado adecuado, por ejemplo, plasma recuperado o plasma fuente. En un ejemplo típico, se extrae sangre o plasma de donantes sanos. Normalmente, la sangre se extrae de la misma especie de animal que el sujeto al que se administrará la preparación de inmunoglobulina (normalmente denominadas inmunoglobulinas “homólogas”). El plasma recuperado o fuente puede o no crioprecipitarse para proporcionar un plasma desprovisto de crioprecipitado. Además, el plasma o plasma desprovisto de crioprecipitado también puede tratarse para retirar uno o más factores sanguíneos por adsorción, cromatografía de intercambio iónico u otro método cromatográfico. A continuación, las inmunoglobulinas se precipitan a partir del material de partida de plasma o plasma desprovisto de crioprecipitado, denominado “agrupación de Cohn”, en condiciones de alto contenido de alcohol y pH bajo para formar un precipitado de la fracción I-IV-1.

Las inmunoglobulinas pueden enriquecerse adicionalmente a partir del precipitado de la fracción I-IV-1 mediante procedimientos adecuados, por ejemplo, precipitación (fraccionamiento con alcohol o fraccionamiento con polietilenglicol), métodos cromatográficos (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía de inmunoafinidad, etc.), filtración (ultrafiltración/diafiltración, nanofiltración), ultracentrifugación, preparación electroforética, y similares. (Véase, por ejemplo, Cohn et al., J. Am. Chem. Soc.

68:459-75 (1946); Oncley et al., J. Am. Chem. Soc. 71:541-50 (1949); Barundern et al., Vox Sang. 7:157-74 (1962); Koblet et al., Vox Sang. 13:93-102 (1967); las patentes estadounidenses n.os 5.122.373 y 5.177.194; los documentos WO/2011/149472 y WO/2011/150284.

A. Procesamiento anterior

Entre otros aspectos, la presente invención proporciona métodos tal como se definen en las reivindicaciones para fraccionar proteínas presentes en plasma agrupado realizando una etapa de precipitación inicial que precipita la mayor parte del contenido de inmunoglobulina y alfa-1-antitripsina del plasma de partida. Para aumentar adicionalmente la pureza de las proteínas plasmáticas individuales (por ejemplo, IgG, A1PI, factor H, IaIp, etc.) que se encuentran en el precipitado y el sobrenadante de la etapa de precipitación inicial, estas composiciones pueden enriquecerse adicionalmente por fraccionamiento (por ejemplo, por precipitación con alcohol, precipitación con PEG, precipitación por adición de sal, etc.), cromatografía, filtración u otro método. Aunque el uso de estas diversas técnicas para el enriquecimiento de una proteína derivada de plasma puede realizarse en cualquier orden, en una realización particular, el primer precipitado y/o sobrenadante se fraccionan en primer lugar (por ejemplo, por precipitación con etanol) y luego se enriquecen por técnicas de cromatografía y/o filtración. En el contexto de la presente invención, la reacción de precipitación inicial y el fraccionamiento subsiguiente se denominan en conjunto etapas de “procesamiento anterior”, mientras que las etapas de cromatografía y filtración se denominan en conjunto etapas de “procesamiento posterior”.

1. Precipitación de inmunoglobulina en masa

Tal como se describe en el presente documento, los inventores han descubierto un método mejorado para fraccionar plasma humano con el fin de purificar proteínas sanguíneas terapéuticamente beneficiosas, tales como inmunoglobulinas, alfa-1-antitripsina (A1PI), factor H, proteínas inhibidoras de inter-alfa (IaIp), albúmina, fibrinógeno, etc. Este método incorpora una etapa de purificación inicial en la que la mayor parte del contenido de inmunoglobulina, A1PI, factor H, IaIp y fibrinógeno de la agrupación de Cohn de partida (es decir, sangre, plasma y/o plasma pretratado) se precipita y la mayor parte del contenido de albúmina de la agrupación de Cohn de partida permanece en el sobrenadante. Ventajosamente, los inventores han desarrollado un método para separar inmunoglobulinas de A1PI, factor H e IaIp extrayendo las inmunoglobulinas, pero no las otras proteínas, del precipitado inicial. En particular, los inventores han descubierto que el tratamiento de una suspensión del precipitado inicial con dióxido de silicio (SO2) finamente dividido mejora la retención de A1PI, factor H e IaIp en la fracción insoluble. Sin estar ligado a la teoría, los inventores creen que, en determinadas condiciones, A1PI, factor H e IaIp, que pueden extraerse inicialmente del precipitado, se unen al dióxido de silicio finamente dividido, que posteriormente se retira con la porción insoluble de la suspensión. La separación del sobrenadante resultante (es decir, la fracción soluble de la suspensión) proporciona una disolución enriquecida que contiene la mayor parte del contenido de inmunoglobulina de la fracción de Cohn de partida.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para preparar una composición de inmunoglobulina enriquecida a partir de una agrupación de Cohn, comprendiendo el método las etapas de: coprecipitar inmunoglobulinas y alfa-1-antitripsina (A1PI) a partir de una agrupación de Cohn, en una primera etapa de precipitación, para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; retirar A1PI de la suspensión; y recuperar la fracción soluble de la primera suspensión, formando de ese modo una composición de inmunoglobulina enriquecida. En general, puede usarse cualquier medio químico para la precipitación de inmunoglobulinas y A1PI, incluyendo, pero sin limitarse a, precipitación con alcohol (por ejemplo, usando etanol o metanol), precipitación con polímeros solubles en agua (por ejemplo, PEG o dextrano) y precipitación por adición de sal (por ejemplo, usando fosfato de amonio, sulfato de amonio, citrato de sodio, etc.). En la invención, la precipitación es precipitación con etanol. La composición de inmunoglobulina enriquecida es una composición de IgG.

La primera etapa de precipitación se realiza mezclando etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final de desde el 20% hasta el 30% (v/v) a un pH de entre 5,0 y 6,0. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En otra realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±2% (v/v). En otra realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±1% (v/v). En otra realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25% (v/v). Asimismo, en una realización, la primera etapa de precipitación se realiza a un pH de 5,5±0,5. En otra realización, la primera etapa de precipitación se realiza a un pH de 5,5±0,4. En otra realización, la primera etapa de precipitación se realiza a un pH de 5,5±0,3. En otra realización, la primera etapa de precipitación se realiza a un pH de 5,5±0,2. En otra realización, la primera etapa de precipitación se realiza a un pH de 5,5±0,1. En otra realización, la primera etapa de precipitación se realiza a un pH de 5,5. En aún otras realizaciones, la concentración final de etanol y el pH de la primera etapa de precipitación se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. en una realización, la composición de inmunoglobulina enriquecida es una composición de IgG.

Los métodos proporcionados en el presente documento proporcionan rendimientos significativamente más altos de recuperación de inmunoglobulina en el producto final enriquecido debido a la precipitación de la mayor parte del contenido de inmunoglobulina de la agrupación de Cohn de partida en la reacción de precipitación inicial, en comparación con los procedimientos de purificación del estado de la técnica que se basan en etapas iniciales de precipitación con bajo contenido de alcohol (es decir, precipitación de la fracción I).

Por consiguiente, en una realización de los métodos proporcionados en el presente documento, al menos el 90% del contenido de inmunoglobulina de la agrupación de Cohn de partida se precipita en la reacción de precipitación inicial. En una realización preferida, al menos el 95% del contenido de inmunoglobulina de la agrupación de Cohn de partida se precipita en la reacción de precipitación inicial. En una realización más preferida, al menos el 99% del contenido de inmunoglobulina de la agrupación de Cohn de partida se precipita en la reacción de precipitación inicial. En determinadas realizaciones, al menos el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más del contenido de inmunoglobulina de la agrupación de Cohn de partida se precipita en la reacción de precipitación inicial. En una realización específica, el contenido de inmunoglobulina de la agrupación de Cohn de partida se refiere al contenido de IgG de la agrupación de Cohn de partida.

Tal como se muestra en los ejemplos proporcionados en el presente documento, el uso de una etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol y pH bajo (es decir, precipitación de la fracción I-IV-1) da como resultado la precipitación de al menos el 99% del contenido de IgG de la agrupación de Cohn de partida. Por consiguiente, en una realización, la presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para preparar una composición de inmunoglobulina enriquecida, comprendiendo el método las etapas de: precipitar desde el 99% hasta el 100% del contenido de IgG a partir de una agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de entre el 20% y el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; separar el primer precipitado del primer sobrenadante; y recuperar IgG del primer precipitado, formando de ese modo una composición de inmunoglobulina enriquecida. En una realización, la IgG recuperada a partir del primer precipitado se enriquece adicionalmente. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la etapa de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización, la composición de inmunoglobulina enriquecida es una composición de IgG. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v).

Tal como demuestran los datos presentados en la tabla 15 y la tabla 31, más del 97% del contenido de alfa-1-antitripsina (A1PI) de una agrupación de Cohn también se precipita mediante una etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol y pH bajo. Por consiguiente, en una realización, la presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para preparar una composición de inmunoglobulina enriquecida, comprendiendo el método las etapas de: precipitar desde el 95% hasta el 100% del contenido de IgG y A1PI a partir de una agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de entre el 20% y el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; retirar A1PI de la suspensión; y recuperar la fracción soluble de la primera suspensión, formando de ese modo una composición de inmunoglobulina enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, la IgG recuperada a partir del primer precipitado se enriquece adicionalmente. En otra realización, la A1PI retirada de la suspensión se enriquece adicionalmente. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la etapa de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización preferida, desde el 99% hasta el 100% del contenido de IgG de la agrupación de Cohn se precipita en la primera etapa de precipitación. En una realización, la composición de inmunoglobulina enriquecida es una composición de IgG.

Además, se halló que más del 90% del contenido de albúmina de una agrupación de Cohn no se precipita mediante una etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol y pH bajo (tabla 33) y, por tanto, puede recuperarse del sobrenadante. Por consiguiente, en una realización, la presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para preparar una composición de inmunoglobulina enriquecida, comprendiendo el método las etapas de: precipitar desde el 95% hasta el 100% del contenido de IgG y A1PI a partir de una agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de desde el 20% hasta el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; retirar A1PI de la suspensión; y recuperar la fracción soluble de la primera suspensión, en el que desde el 80% hasta el 100% del contenido de albúmina de la agrupación de Cohn está presente en el primer sobrenadante, formando de ese modo una composición de inmunoglobulina enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, la IgG recuperada a partir del primer precipitado se enriquece adicionalmente. En otra realización, la A1PI retirada de la suspensión se enriquece adicionalmente. En aún otra realización, la albúmina que se encuentra en el primer sobrenadante se enriquece adicionalmente. En una realización preferida, desde el 99% hasta el 100% del contenido de IgG de la agrupación de Cohn se precipita en la primera etapa de precipitación. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la etapa de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización, la composición de inmunoglobulina enriquecida es una composición de IgG.

2. Extracción y separación de inmunoglobulinas

En comparación con un precipitado de la fracción II+NI de Cohn o precipitado A de Kistler-Nitschmann, el precipitado inicial formado por los métodos proporcionados en el presente documento contiene niveles sustancialmente más altos de proteínas que no son inmunoglobulinas, incluyendo A1PI y fibrinógeno. Por ejemplo, tal como se muestra en la tabla 30, casi el 100% del contenido de fibrinógeno de la agrupación de Cohn de partida se coprecipita con inmunoglobulinas en una reacción de precipitación inicial con alto contenido de alcohol y pH bajo. Esto contrasta con los esquemas de purificación de Cohn-Oncley y Kistler-Nitschmann, en los que la mayor parte del fibrinógeno se retira en una etapa de precipitación inicial con bajo contenido de alcohol (precipitación de la fracción I). Del mismo modo, tal como se muestra en la tabla 15 y la tabla 31, más del 97% del contenido de alfa-1-antitripsina (A1PI) de la agrupación de Cohn de partida se coprecipita con inmunoglobulinas en una reacción de precipitación inicial con alto contenido de alcohol y pH bajo. Por el contrario, la mayor parte de A1PI no se coprecipita con inmunoglobulinas en los esquemas de purificación de Cohn-Oncley y Kistler-Nitschmann. Más bien, A1PI se encuentra en el sobrenadante de la fracción II+III o en el sobrenadante A.

Por consiguiente, con el fin de proporcionar composiciones de inmunoglobulina de calidad farmacéutica, es necesario retirar de la composición de inmunoglobulina contaminantes tales como A1PI y fibrinógeno presentes en el precipitado inicial. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante un fraccionamiento adicional del primer precipitado (por ejemplo, mediante precipitación diferencial usando alcohol, polímeros hidrófilos no iónicos o precipitación por adición de sal), metodologías cromatográficas o metodologías de filtración.

En una realización, el primer precipitado se suspende en agua para inyección (WFI) o un tampón de baja fuerza iónica que tiene un pH de entre 4,0 y 4,9 adecuado para extraer inmunoglobulinas a partir del precipitado. En determinadas realizaciones, la suspensión se trata luego con dióxido de silicio (SO2) finamente dividido, y la porción soluble de la suspensión que contiene las inmunoglobulinas se separa de la porción insoluble de la suspensión que contiene la mayor parte de A1PI y fibrinógeno.

Las disoluciones adecuadas para la extracción del primer precipitado tendrán generalmente un pH de entre 4,0 y 5,5. En la invención, la disolución tendrá un pH de entre 4,0 y 4,9, por ejemplo, la disolución de extracción tendrá un pH de aproximadamente 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9. En una realización preferida, el pH del tampón de extracción es de 4,7±0,1. En otra realización preferida, el pH del tampón de extracción es de 4,8±0,1. En otra realización preferida, el pH del tampón de extracción es de 4,9. En general, estos requisitos de pH pueden cumplirse usando un agente de tamponamiento seleccionado de, por ejemplo, acetato, citrato, fosfato monobásico, fosfato dibásico, mezclas de los mismos, y similares. Las concentraciones de tampón adecuadas normalmente varían desde 5 hasta 100 mM, o desde 10 hasta 50 mM, o 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ó 100 mM de agente de tamponamiento.

El tampón de extracción tendrá preferiblemente una conductividad de desde 0,5 mS/cm hasta 2,0 mS/cm. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, la conductividad del tampón de extracción será de 0,5±0,1 mS/cm, o de 0,6±0,1, 0,7±0,1, 0,8±0,1, 0,9±0,1, 1,0±0,1, 1,1±0,1, 1,2±0,1, 1,3±0,1, 1,4±0,1, 1,5±0,1, 1,6±0,1, 1,7±0,1, 1,8±0,1, 1,9±0,1 ó 2,0±0,1 mS/cm. Un experto habitual en la técnica sabrá cómo generar tampones de extracción que tengan una conductividad apropiada. En una realización particular, el tampón de extracción contiene fosfato de sodio monobásico 5 mM y acetato 5 mM a un pH de 4,8 y una conductividad de desde 0,7 hasta 0,9 mS/cm.

En una realización, se mezcla dióxido de silicio finamente dividido con la suspensión de la fracción I-IV-1 antes de la filtración. En una realización, esta etapa de pretratamiento comprende la adición de partículas de dióxido de silicio finamente dividido (por ejemplo, sílice pirogénica; Aerosil®) seguido de un periodo de incubación de 40 a 80 minutos durante el cual la suspensión se mezcla constantemente. En determinadas realizaciones, el periodo de incubación será de entre aproximadamente 50 minutos y aproximadamente 70 minutos, o de aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o más minutos. En general, el tratamiento se realizará a entre 0°C y 10°C, o entre 2°C y 8°C. En determinadas realizaciones, el tratamiento puede realizarse a aproximadamente 0°C, 1°C, 2°C, 3°C, 4°C, 5°C, 6°C, 7°C, 8°C, 9°C o 10°C. En una realización particular, el tratamiento se realiza a entre 2°C y 10°C. En una realización preferida, el tratamiento se realiza a entre 5°C y 10°C.

En una realización, se añade sílice pirogénica a una concentración de entre 20 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1 y 100 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1. En otra realización, se añade sílice pirogénica a una concentración de entre 30 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1 y 80 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1. En determinadas realizaciones, la sílice pirogénica puede añadirse a una concentración de aproximadamente 20 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1, o de aproximadamente 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ó 100 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1. En una realización específica, se añade sílice pirogénica (por ejemplo, Aerosil 380 o equivalente) a la suspensión de la fracción I-IV-1 hasta una concentración final de 40±20 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1. En otra realización específica, se añade sílice pirogénica a la suspensión de la fracción I-IV-1 hasta una concentración final de 40±10 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1. El mezclado tiene lugar a de 2°C y 8°C durante al menos de 50 a 70 minutos.

En determinadas realizaciones, se añade SiO2 a una composición de inmunoglobulina a una concentración de desde 0,01 g/g de proteína total hasta 10 g/g de proteína total. En otra realización, se añade SO2 a una composición de inmunoglobulina a una concentración de desde 0,01 g/g de proteína total hasta 5 g/g de proteína total. En otra realización, se añade SO2 a una composición de inmunoglobulina a una concentración de desde 0,02 g/g de proteína total hasta 4 g/g de proteína total. En una realización, se añade SO2 a una concentración final de al menos 0,1 g por gramo de proteína total. En otra realización específica, se añade sílice pirogénica a una concentración de al menos 0,2 g por gramo de proteína total. En otra realización específica, se añade sílice pirogénica a una concentración de al menos 0,25 g por gramo de proteína total. En otras realizaciones específicas, se añade sílice pirogénica a una concentración de al menos 1 g por gramo de proteína total. En otra realización específica, se añade sílice pirogénica a una concentración de al menos 2 g por gramo de proteína total. En otra realización específica, se añade sílice pirogénica a una concentración de al menos 2,5 g por gramo de proteína total. En aún otras realizaciones específicas, se añade dióxido de silicio finamente dividido a una concentración de al menos 0,01 g/g de proteína total o al menos 0,02 g, 0,03 g, 0,04 g, 0,05 g, 0,06 g, 0,07 g, 0,08 g, 0,09 g, 0,1 g, 0,2 g, 0,3 g, 0,4 g, 0,5 g, 0,6 g, 0,7 g, 0,8 g, 0,9 g, 1,0 g, 1,5 g, 2,0 g, 2,5 g, 3,0 g, 3,5 g, 4,0 g, 4,5 g, 5,0 g, 5,5 g, 6,0 g, 6,5 g, 7,0 g, 7,5 g, 8,0 g, 8,5 g, 9,0 g, 9,5 g, 10,0 g o más por gramo de proteína total.

Por consiguiente, en una realización, la presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para preparar una composición de inmunoglobulina enriquecida, comprendiendo el método las etapas de: precipitar desde el 95% hasta el 100% del contenido de IgG y A1PI a partir de una agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de entre el 20% y el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; tratar la primera suspensión con dióxido de silicio finamente dividido; y separar la porción soluble de la suspensión de la porción insoluble de la suspensión, en el que la porción soluble de la suspensión contiene inmunoglobulinas y la porción insoluble de la suspensión contiene A1PI, fibrinógeno, factor H e IaIp, formando de ese modo una composición de inmunoglobulina enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, la IgG recuperada a partir del primer precipitado se enriquece adicionalmente. En otra realización, la A1PI retirada de la suspensión se enriquece adicionalmente. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la etapa de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización preferida, desde el 99% hasta el 100% del contenido de IgG de la agrupación de Cohn se precipita en la primera etapa de precipitación. En una realización específica, las porciones soluble e insoluble de la primera suspensión se separan por filtración. En una realización, la composición de inmunoglobulina enriquecida es una composición de IgG.

Además, se halló que más del 90% del contenido de albúmina de una agrupación de Cohn no se precipita mediante una etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol y pH bajo (tabla 33) y, por tanto, puede recuperarse del sobrenadante. Por consiguiente, en una realización, la presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para preparar una composición de inmunoglobulina enriquecida, comprendiendo el método las etapas de: precipitar desde el 95% hasta el 100% del contenido de IgG y A1PI a partir de una agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de desde el 20% hasta el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; tratar la primera suspensión con dióxido de silicio finamente dividido; y separar la porción soluble de la suspensión de la porción insoluble de la suspensión, en el que la porción soluble de la suspensión contiene inmunoglobulinas y la porción insoluble de la suspensión contiene A1PI, fibrinógeno, factor H e IaIp, y además en el que desde el 80% hasta el 100% del contenido de albúmina de la agrupación de Cohn está presente en el primer sobrenadante, formando de ese modo una composición de inmunoglobulina enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, la IgG presente en la porción soluble de la suspensión se enriquece adicionalmente. En otra realización, la A1PI presente en la porción insoluble de la suspensión se enriquece adicionalmente. En otra realización, el fibrinógeno presente en la porción insoluble de la suspensión se enriquece adicionalmente. En otra realización, el factor H presente en la porción insoluble de la suspensión se enriquece adicionalmente. En otra realización, la IaIp presente en la porción insoluble de la suspensión se enriquece adicionalmente. En aún otra realización, la albúmina que se encuentra en el primer sobrenadante se enriquece adicionalmente. En una realización preferida, desde el 99% hasta el 100% del contenido de IgG de la agrupación de Cohn se precipita en la primera etapa de precipitación. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la etapa de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización específica, las porciones soluble e insoluble de la primera suspensión se separan por filtración. En una realización, la composición de inmunoglobulina enriquecida es una composición de IgG.

3. Fraccionamiento

En una realización, las inmunoglobulinas recuperadas a partir de la porción soluble de la primera suspensión (suspensión de pasta I-IV-1) se enriquecen adicionalmente por fraccionamiento. En general, puede usarse cualquier método de fraccionamiento (por ejemplo, precipitación con alcohol o polímero, precipitación por adición de sal, etc.). En una realización preferida, las inmunoglobulinas se enriquecen adicionalmente fraccionando la porción soluble de la primera suspensión por precipitación con etanol. En una realización, las inmunoglobulinas se enriquecen mediante la adición de etanol a la porción soluble de la primera suspensión a una concentración final y un pH adecuados para precipitar las inmunoglobulinas, mientras que al menos un contaminante no precipita. En otra realización, las inmunoglobulinas se enriquecen mediante la adición de etanol a la porción soluble de la primera suspensión a una concentración final y un pH adecuados para precipitar al menos un contaminante, mientras que las inmunoglobulinas no precipitan.

El fraccionamiento adicional del material recuperado a partir de la etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol y pH bajo es opcional. En determinadas realizaciones, la composición de inmunoglobulina recuperada a partir de la etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol y pH bajo puede enriquecerse adicionalmente usando una o más de las diversas etapas de procesamiento posterior descritas en el presente documento. En otras realizaciones, la composición recuperada a partir de la etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol y pH bajo puede procesarse adicionalmente mediante el uso de una o más etapas de precipitación adicionales. En determinadas realizaciones, puede usarse una etapa de precipitación de inmunoglobulina adicional para concentrar una composición de inmunoglobulina, preparar una inmunoglobulina para almacenamiento y/o preparar una composición de inmunoglobulina para transporte.

En una realización, la presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para preparar una composición de inmunoglobulina enriquecida a partir de una agrupación de Cohn, comprendiendo el método las etapas de: coprecipitar inmunoglobulinas y alfa-1-antitripsina (A1PI) a partir de una agrupación de Cohn, en una primera etapa de precipitación, para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; retirar A1PI de la suspensión; precipitar inmunoglobulinas a partir de la primera suspensión en una segunda etapa de precipitación, para formar un segundo precipitado que comprende inmunoglobulinas y un segundo sobrenadante que comprende al menos un contaminante; y recuperar inmunoglobulinas a partir del segundo precipitado, formando de ese modo una composición de inmunoglobulina enriquecida. En una realización, la IgG recuperada a partir del segundo precipitado se enriquece adicionalmente. En otra realización, la A1PI retirada de la primera suspensión se enriquece adicionalmente. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la primera etapa de precipitación se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización, la composición de inmunoglobulina enriquecida es una composición de IgG.

En una realización a modo de ejemplo, la segunda etapa de precipitación se realiza mezclando etanol con la porción soluble de la segunda suspensión (por ejemplo, un filtrado o sobrenadante de la suspensión formada después de la filtración o centrifugación) a una concentración final de desde el 22% hasta el 28% (v/v) a un pH de entre 6,5 y 7,5. En una realización, se mezcla etanol hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En otra realización, se mezcla etanol hasta una concentración final del 25±2% (v/v). En otra realización, se mezcla etanol hasta una concentración final del 25±1% (v/v). En otra realización, se mezcla etanol hasta una concentración final del 25% (v/v). Asimismo, en una realización, la segunda etapa de precipitación se realiza a un pH de 7,0±0,5. En otra realización, la segunda etapa de precipitación se realiza a un pH de 7,0±0,4. En otra realización, la segunda etapa de precipitación se realiza a un pH de 7,0±0,3. En otra realización, la segunda etapa de precipitación se realiza a un pH de 7,0±0,2. En otra realización, la segunda etapa de precipitación se realiza a un pH de 7,0±0,1. En otra realización, la segunda etapa de precipitación se realiza a un pH de 7,0. En una realización particular, la segunda etapa de precipitación se realiza usando una concentración final de etanol del 25±3% (v/v) a un pH de 7,0±0,3.

En una realización preferida, la primera suspensión o la fracción soluble de la misma se trata con un detergente antes de realizar la segunda etapa de precipitación. En una realización, la primera suspensión o la fracción soluble de la misma se trata adicionalmente con citrato antes de realizar la segunda etapa de precipitación. En una realización particular, se añade polisorbato 80 a la primera suspensión o a la fracción soluble de la misma y se incuba la composición durante al menos 30 minutos. En otra realización particular, se añade además citrato de sodio dihidratado a la primera suspensión o a la fracción soluble de la misma y se incuba la composición durante al menos 30 minutos adicionales. En una realización, se añade polisorbato 80 a una concentración final de aproximadamente el 0,2% (p/v). En una realización, luego se mezcla citrato de sodio dihidratado en la disolución a una concentración final de aproximadamente 8 g/l. En una realización particular, las incubaciones se realizan a una temperatura de entre aproximadamente 2 y 8°C con agitación continua.

En una realización particular, el método comprende las etapas de: precipitar desde el 99% hasta el 100% del contenido de IgG a partir de un plasma de agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de entre el 20% y el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6.0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; separar el primer precipitado del primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; precipitar inmunoglobulinas a partir de la primera suspensión en una segunda etapa de precipitación, para formar un segundo precipitado que comprende inmunoglobulinas y un segundo sobrenadante que comprende al menos un contaminante; y recuperar inmunoglobulinas a partir del segundo precipitado, formando de ese modo una composición de inmunoglobulina enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, la IgG recuperada a partir del segundo precipitado se enriquece adicionalmente. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la primera etapa de precipitación se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización, la composición de inmunoglobulina enriquecida es una composición de IgG.

En una realización específica, el método comprende las etapas de: precipitar desde el 99% hasta el 100% del contenido de IgG a partir de un plasma de la agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de entre el 20% y el 30% a un pH de desde 5.0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; separar el primer precipitado del primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; precipitar inmunoglobulinas a partir de la primera suspensión en una segunda etapa de precipitación mezclando etanol con la primera suspensión a una concentración final del 25±3% (v/v) a un pH de 7,0±0,3, para formar un segundo precipitado que comprende inmunoglobulinas y un segundo sobrenadante que comprende al menos un contaminante; y recuperar inmunoglobulinas a partir del segundo precipitado, formando de ese modo una composición de inmunoglobulina enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, la IgG recuperada a partir del segundo precipitado se enriquece adicionalmente. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la primera etapa de precipitación se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización, la composición de inmunoglobulina enriquecida es una composición de IgG.

En una realización, el método comprende las etapas de: precipitar desde el 95% hasta el 100% del contenido de IgG y A1PI a partir de un agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de entre el 20% y el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; retirar A1PI de la suspensión; recuperar la fracción soluble de la primera suspensión; precipitar inmunoglobulinas a partir de la primera suspensión en una segunda etapa de precipitación, para formar un segundo precipitado que comprende inmunoglobulinas y un segundo sobrenadante que comprende al menos un contaminante; y recuperar inmunoglobulinas a partir del segundo precipitado, formando de ese modo una composición de inmunoglobulina enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, la IgG recuperada a partir del segundo precipitado se enriquece adicionalmente. En una realización, la A1PI separada de la primera suspensión se enriquece adicionalmente. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la primera etapa de precipitación se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización preferida, entre el 99% y el 100% del contenido de IgG de la agrupación de Cohn se precipita en la primera etapa de precipitación. En una realización, la composición de inmunoglobulina enriquecida es una composición de IgG.

En una realización específica, el método comprende las etapas de: precipitar desde el 95% hasta el 100% del contenido de IgG y A1PI a partir de una agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de entre el 20% y el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; retirar A1PI de la suspensión; recuperar la fracción soluble de la primera suspensión; precipitar inmunoglobulinas a partir de la primera suspensión en una segunda etapa de precipitación mezclando etanol con la primera suspensión a una concentración final de desde el 25±3% (v/v) a un pH de 7,0±0,3, para formar un segundo precipitado que comprende inmunoglobulinas y un segundo sobrenadante que comprende al menos un contaminante; y recuperar inmunoglobulinas a partir del segundo precipitado, formando de ese modo una composición de inmunoglobulina enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, la IgG recuperada a partir del segundo precipitado se enriquece adicionalmente. En una realización, la A1PI separada de la primera suspensión se enriquece adicionalmente. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la primera etapa de precipitación se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización preferida, entre el 99% y el 100% del contenido de IgG de la agrupación de Cohn se precipita en la primera etapa de precipitación. En una realización, la composición de inmunoglobulina enriquecida es una composición de IgG.

En otra realización, el método comprende las etapas de: precipitar desde el 99% hasta el 100% del contenido de IgG y A1PI a partir de un agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de desde el 20% hasta el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; retirar A1PI de la suspensión; recuperar la porción soluble de la primera suspensión; precipitar inmunoglobulinas a partir de la porción soluble de la primera suspensión en una segunda etapa de precipitación, para formar un segundo precipitado que comprende inmunoglobulinas y un segundo sobrenadante que comprende al menos un contaminante; y recuperar inmunoglobulinas a partir del segundo precipitado, en el que desde el 80% hasta el 100% del contenido de albúmina de la agrupación de Cohn está presente en el primer sobrenadante, formando de ese modo una composición de inmunoglobulina enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, la IgG recuperada a partir del segundo precipitado se enriquece adicionalmente. En una realización, la A1PI separada de la primera suspensión se enriquece adicionalmente. En otra realización, la albúmina presente en el primer sobrenadante se enriquece adicionalmente. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la primera etapa de precipitación se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización preferida, entre el 99% y el 100% del contenido de IgG de la agrupación de Cohn se precipita en la primera etapa de precipitación. En una realización preferida, entre el 90% y el 100% del contenido de albúmina de la agrupación de Cohn está presente en el primer sobrenadante. En una realización, la composición de inmunoglobulina enriquecida es una composición de IgG.

En otra realización, el método comprende las etapas de: precipitar desde el 99% hasta el 100% del contenido de IgG y A1PI a partir de un agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de desde el 20% hasta el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; retirar A1PI de la suspensión; recuperar la porción soluble de la primera suspensión; precipitar inmunoglobulinas a partir de la porción soluble de la primera suspensión en una segunda etapa de precipitación mezclando etanol con la porción soluble de la primera suspensión a una concentración final del 25±3% (v/v) a un pH de 7,0±0,3, para formar un segundo precipitado que comprende inmunoglobulinas y un segundo sobrenadante que comprende al menos un contaminante; y recuperar inmunoglobulinas a partir del segundo precipitado, en el que desde el 80% hasta el 100% del contenido de albúmina de la agrupación de Cohn está presente en el primer sobrenadante, formando de ese modo una composición de inmunoglobulina enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, la IgG recuperada a partir del segundo precipitado se enriquece adicionalmente. En una realización, la A1PI separada de la primera suspensión se enriquece adicionalmente. En otra realización, la albúmina presente en el primer sobrenadante se enriquece adicionalmente. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la primera etapa de precipitación se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización preferida, entre el 99% y el 100% del contenido de IgG de la agrupación de Cohn se precipita en la primera etapa de precipitación. En una realización preferida, entre el 90% y el 100% del contenido de albúmina de la agrupación de Cohn está presente en el primer sobrenadante. En una realización, la composición de inmunoglobulina enriquecida es una composición de IgG.

En una realización, la presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para preparar una composición de inmunoglobulina enriquecida, comprendiendo el método las etapas de: precipitar desde el 95% hasta el 100% del contenido de IgG y A1PI a partir de una agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de entre el 20% y el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; tratar la primera suspensión con dióxido de silicio finamente dividido; y separar la porción soluble de la suspensión de la porción insoluble de la suspensión, en el que la porción soluble de la suspensión contiene inmunoglobulinas y la porción insoluble de la suspensión contiene A1PI, fibrinógeno, factor H e IaIp, recuperando la porción soluble a partir de la primera suspensión; precipitar inmunoglobulinas a partir de la porción soluble de la primera suspensión en una segunda etapa de precipitación, para formar un segundo precipitado que comprende inmunoglobulinas y un segundo sobrenadante que comprende al menos un contaminante; y recuperar inmunoglobulinas a partir del segundo precipitado, formando de ese modo una composición de inmunoglobulina enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, la IgG recuperada a partir del primer precipitado se enriquece adicionalmente. En otra realización, la A1PI retirada de la suspensión se enriquece adicionalmente. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la primera etapa de precipitación se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización preferida, desde el 99% hasta el 100% del contenido de IgG de la agrupación de Cohn se precipita en la primera etapa de precipitación. En una realización específica, las porciones soluble e insoluble de la primera suspensión se separan por filtración. En una realización, la composición de inmunoglobulina enriquecida es una composición de IgG.

En una realización específica, la presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para preparar una composición de inmunoglobulina enriquecida, comprendiendo el método las etapas de: precipitar desde el 95% hasta el 100% del contenido de IgG y A1PI a partir de una agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de entre el 20% y el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; tratar la primera suspensión con dióxido de silicio finamente dividido; y separar la porción soluble de la suspensión de la porción insoluble de la suspensión, en el que la porción soluble de la suspensión contiene inmunoglobulinas y la porción insoluble de la suspensión contiene A1PI, fibrinógeno, factor H e IaIp, recuperando la porción soluble a partir de la primera suspensión; precipitar inmunoglobulinas a partir de la porción soluble de la primera suspensión en una segunda etapa de precipitación mezclando etanol con la porción soluble de la primera suspensión a una concentración final del 25±3% (v/v) a un pH de 7,0±0,3, para formar un segundo precipitado que comprende inmunoglobulinas y un segundo sobrenadante que comprende al menos un contaminante; y recuperar inmunoglobulinas a partir del segundo precipitado, formando de ese modo una composición de inmunoglobulina enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, la IgG recuperada a partir del primer precipitado se enriquece adicionalmente. En otra realización, la A1PI retirada de la suspensión se enriquece adicionalmente. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la primera etapa de precipitación se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización preferida, desde el 99% hasta el 100% del contenido de IgG de la agrupación de Cohn se precipita en la primera etapa de precipitación. En una realización específica, las porciones soluble e insoluble de la primera suspensión se separan por filtración. En una realización, la composición de inmunoglobulina enriquecida es una composición de IgG.

En una realización, la presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para preparar una composición de inmunoglobulina enriquecida, comprendiendo el método las etapas de: precipitar desde el 95% hasta el 100% del contenido de IgG y A1PI a partir de una agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de desde el 20% hasta el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; tratar la primera suspensión con dióxido de silicio finamente dividido; y separar la porción soluble de la suspensión de la porción insoluble de la suspensión, en el que la porción soluble de la suspensión contiene inmunoglobulinas y la porción insoluble de la suspensión contiene A1PI, fibrinógeno, factor H e IaIp; precipitar inmunoglobulinas a partir de la porción soluble de la primera suspensión en una segunda etapa de precipitación, para formar un segundo precipitado que comprende inmunoglobulinas y un segundo sobrenadante que comprende al menos un contaminante; y recuperar inmunoglobulinas a partir del segundo precipitado, en el que desde el 80% hasta el 100% del contenido de albúmina de la agrupación de Cohn está presente en el primer sobrenadante, formando de ese modo una composición de inmunoglobulina enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, la IgG presente en la porción soluble de la suspensión se enriquece adicionalmente. En otra realización, la A1PI presente en la porción insoluble de la suspensión se enriquece adicionalmente. En otra realización, el fibrinógeno presente en la porción insoluble de la suspensión se enriquece adicionalmente. En otra realización, el factor H presente en la porción insoluble de la suspensión se enriquece adicionalmente. En otra realización, la IaIp presente en la porción insoluble de la suspensión se enriquece adicionalmente. En aún otra realización, la albúmina que se encuentra en el primer sobrenadante se enriquece adicionalmente. En una realización preferida, desde el 99% hasta el 100% del contenido de IgG de la agrupación de Cohn se precipita en la primera etapa de precipitación. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la primera etapa de precipitación se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización específica, las porciones soluble e insoluble de la primera suspensión se separan por filtración. En una realización, la composición de inmunoglobulina enriquecida es una composición de IgG.

En una realización, la presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para preparar una composición de inmunoglobulina enriquecida, comprendiendo el método las etapas de: precipitar desde el 95% hasta el 100% del contenido de IgG y A1P ⁱ a partir de una agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de desde el 20% hasta el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; tratar la primera suspensión con dióxido de silicio finamente dividido; y separar la porción soluble de la suspensión de la porción insoluble de la suspensión, en el que la porción soluble de la suspensión contiene inmunoglobulinas y la porción insoluble de la suspensión contiene A1PI, fibrinógeno, factor H e IaIp; precipitar inmunoglobulinas a partir de la porción soluble de la primera suspensión en una segunda etapa de precipitación mezclando etanol con la porción soluble de la primera suspensión a una concentración final del 25±3% (v/v) a un pH de 7,0±0,3, para formar un segundo precipitado que comprende inmunoglobulinas y un segundo sobrenadante que comprende al menos un contaminante; y recuperar inmunoglobulinas a partir del segundo precipitado, en el que desde el 80% hasta el 100% del contenido de albúmina de la agrupación de Cohn está presente en el primer sobrenadante, formando de ese modo una composición de inmunoglobulina enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, la IgG presente en la porción soluble de la suspensión se enriquece adicionalmente. En otra realización, la A1PI presente en la porción insoluble de la suspensión se enriquece adicionalmente. En otra realización, el fibrinógeno presente en la porción insoluble de la suspensión se enriquece adicionalmente. En otra realización, el factor H presente en la porción insoluble de la suspensión se enriquece adicionalmente. En otra realización, la IaIp presente en la porción insoluble de la suspensión se enriquece adicionalmente. En aún otra realización, la albúmina que se encuentra en el primer sobrenadante se enriquece adicionalmente. En una realización preferida, desde el 99% hasta el 100% del contenido de IgG de la agrupación de Cohn se precipita en la primera etapa de precipitación. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la primera etapa de precipitación se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización específica, las porciones soluble e insoluble de la primera suspensión se separan por filtración. En una realización, la composición de inmunoglobulina enriquecida es una composición de IgG.

En una realización, las inmunoglobulinas se recuperan a partir del segundo precipitado suspendiendo el precipitado con un tampón de extracción frío. Por ejemplo, el segundo precipitado se suspende a una razón de 1 parte de precipitado por 2-15 partes de agua para inyección (WFI) o tampón de baja conductividad. En una realización preferida, el segundo precipitado se suspende a una razón de 1 parte de precipitado por 4-5 partes, preferiblemente 3,5 partes, de WFI. En una realización, la etapa de suspensión se realiza a una temperatura de entre 0°C y 8°C. En una realización, el pH final de la disolución se ajusta a desde 4,5 hasta 5,6, preferiblemente a 5,2±0,2. En una realización, este ajuste de pH se realiza con ácido acético. En una realización, la conductividad de la suspensión aumenta hasta entre 2,5 y 6,0 mS/cm para aumentar la solubilidad de las inmunoglobulinas. En una realización, la conductividad aumenta mediante la adición de cloruro de sodio.

Las disoluciones adecuadas para la extracción del segundo precipitado incluyen WFI y tampones de baja conductividad. En una realización, un tampón de baja conductividad tiene una conductividad de menos de aproximadamente 10 mS/cm. En otras realizaciones, el tampón de baja conductividad tiene una conductividad de menos de aproximadamente 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 mS/cm. En una realización preferida, el tampón de baja conductividad tiene una conductividad de menos de aproximadamente 6 mS/cm. En otra realización preferida, el tampón de baja conductividad tiene una conductividad de menos de aproximadamente 4 mS/cm. En otra realización preferida, el tampón de baja conductividad tiene una conductividad de menos de aproximadamente 2 mS/cm.

En una realización, la porción soluble de la suspensión, que contiene inmunoglobulinas, se separa de la porción insoluble. En una realización, esto se realiza filtrando la suspensión con un filtro de profundidad que tiene un tamaño de poro nominal de desde 0,1 |im y 0,4 |im. En una realización, el tamaño de poro nominal del filtro de profundidad es de 0,2 |im (por ejemplo, filtro Cuno VR06 o equivalente). En una realización, el filtro se lava con WFI o un tampón adecuado después de la filtración para recuperar inmunoglobulina adicional y el lavado posterior se añade al filtrado. En una realización preferida, el lavado posterior del filtro se realiza usando una disolución de cloruro de sodio con una conductividad de entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 6,0 mS/cm. En otra realización, la segunda suspensión se centrifuga para recuperar la porción soluble.

B. Procesamiento posterior

Las fracciones de inmunoglobulina obtenidas después del fraccionamiento usando una etapa de precipitación inicial que precipita las inmunoglobulinas y la alfa-1-antitripsina (A1PI), pero no la albúmina, pueden enriquecerse adicionalmente según métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo, sin limitación: cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), cromatografía de hidroxiapatita (HAP), cromatografía de afinidad con proteína A, cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía de exclusión molecular, etc.); filtración (por ejemplo, ultrafiltración y/o diafiltración); y una o más etapas de reducción de virus (por ejemplo, nanofiltración, tratamiento con disolventes y detergentes, irradiación UV, tratamiento térmico, incubación a pH bajo, etc.).

En una realización, la presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para preparar una composición de inmunoglobulina enriquecida a partir de una agrupación de Cohn que comprende una etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol y pH bajo y al menos una etapa de procesamiento posterior (por ejemplo, cromatografía). En determinadas realizaciones, el método comprende además una segunda etapa de precipitación antes de la al menos una etapa de procesamiento posterior (por ejemplo, una etapa de precipitación de PptG). La segunda precipitación es opcional, ya que una suspensión del precipitado inicial de alto contenido de alcohol y pH bajo puede usarse directamente para la purificación posterior.

En una realización, las inmunoglobulinas presentes en una composición derivada de plasma preparada usando una etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol y pH bajo se enriquecen adicionalmente realizando al menos una etapa cromatográfica. En una realización, la etapa cromatográfica se selecciona de cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), cromatografía de hidroxiapatita (HAP), cromatografía de afinidad con proteína A, cromatografía de inmunoafinidad y cromatografía de exclusión molecular. En una realización particular, las inmunoglobulinas se enriquecen realizando una cromatografía de intercambio aniónico. En otra realización, las inmunoglobulinas se enriquecen adicionalmente realizando una cromatografía de intercambio catiónico. En una realización específica, las inmunoglobulinas se enriquecen adicionalmente realizando cromatografía de intercambio tanto catiónico como aniónico.

En una realización particular, la presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para preparar una composición de inmunoglobulina enriquecida, comprendiendo el método las etapas de: precipitar desde el 95% hasta el 100% del contenido de IgG y A1PI a partir de una agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de entre el 20% y el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; tratar la primera suspensión con dióxido de silicio finamente dividido; y separar la porción soluble de la suspensión de la porción insoluble de la suspensión, en el que la porción soluble de la suspensión contiene inmunoglobulinas y la porción insoluble de la suspensión contiene A1PI, fibrinógeno, factor H e IaIp, uniendo las inmunoglobulinas a una resina de intercambio catiónico; eluir las inmunoglobulinas del intercambio catiónico para formar un eluato de intercambio catiónico; poner en contacto el eluato de intercambio catiónico con una resina de intercambio aniónico; y recuperar inmunoglobulinas que no se unen a la resina, formando de ese modo una composición de inmunoglobulina enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, la IgG recuperada a partir de la etapa cromatográfica de intercambio aniónico se enriquece adicionalmente. En otra realización, la A1PI retirada de la suspensión se enriquece adicionalmente. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la etapa de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización preferida, desde el 99% hasta el 100% del contenido de IgG de la agrupación de Cohn se precipita en la primera etapa de precipitación. En otra realización, entre el 80% y el 100%, preferiblemente entre el 90% y el 100%, del contenido de albúmina de la agrupación de Cohn está presente en el primer sobrenadante. En una realización específica, las porciones soluble e insoluble de la primera suspensión se separan por filtración. En una realización, el método comprende además al menos una etapa de reducción/inactivación de virus. En una realización preferida, el método comprende además al menos dos etapas de reducción/inactivación de virus. En una realización más preferida, el método comprende además al menos tres etapas de reducción/inactivación de virus. En una realización, la composición de inmunoglobulina enriquecida es una composición de IgG.

En una realización particular, la presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para preparar una composición de inmunoglobulina enriquecida, comprendiendo el método las etapas de: precipitar desde el 95% hasta el 100% del contenido de IgG y A1PI a partir de una agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de entre el 20% y el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; tratar la primera suspensión con dióxido de silicio finamente dividido; y separar la porción soluble de la suspensión de la porción insoluble de la suspensión, en el que la porción soluble de la suspensión contiene inmunoglobulinas y la porción insoluble de la suspensión contiene A1PI, fibrinógeno, factor H e IaIp, recuperando la porción soluble a partir de la primera suspensión; precipitar inmunoglobulinas a partir de la porción soluble de la primera suspensión en una segunda etapa de precipitación mezclando etanol con la porción soluble de la primera suspensión a una concentración final del 25±3% (v/v) a un pH de 7,0±0,3, para formar un segundo precipitado que comprende inmunoglobulinas y un segundo sobrenadante que comprende al menos un contaminante; recuperar inmunoglobulinas a partir del segundo precipitado; unir las inmunoglobulinas a una resina de intercambio catiónico; eluir las inmunoglobulinas del intercambio catiónico para formar un eluato de intercambio catiónico; poner en contacto el eluato de intercambio catiónico con una resina de intercambio aniónico; y recuperar inmunoglobulinas que no se unen a la resina, formando de ese modo una composición de inmunoglobulina enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, la IgG recuperada a partir de la etapa cromatográfica de intercambio aniónico se enriquece adicionalmente. En otra realización, la A1PI retirada de la suspensión se enriquece adicionalmente. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la etapa de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización preferida, desde el 99% hasta el 100% del contenido de IgG de la agrupación de Cohn se precipita en la primera etapa de precipitación. En otra realización, entre el 80% y el 100%, preferiblemente entre el 90% y el 100%, del contenido de albúmina de la agrupación de Cohn está presente en el primer sobrenadante. En una realización específica, las porciones soluble e insoluble de la primera suspensión se separan por filtración. En una realización, el método comprende además al menos una etapa de reducción/inactivación de virus. En una realización preferida, el método comprende además al menos dos etapas de reducción/inactivación de virus. En una realización más preferida, el método comprende además al menos tres etapas de reducción/inactivación de virus. En una realización, la composición de inmunoglobulina enriquecida es una composición de IgG.

En una realización particular, la presente divulgación proporciona un método para preparar una composición de inmunoglobulina enriquecida, comprendiendo el método las etapas de: precipitar inmunoglobulinas y A1PI a partir de una agrupación de Cohn en una etapa de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo; separar las inmunoglobulinas precipitadas y A1PI; enriquecer la composición de inmunoglobulina realizando una cromatografía de intercambio catiónico; y enriquecer adicionalmente la composición de inmunoglobulina realizando una cromatografía de intercambio aniónico. En una realización, la concentración final de etanol y el pH usados en la etapa de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización, el método comprende además al menos una etapa de reducción/inactivación de virus. En una realización preferida, el método comprende además al menos dos etapas de reducción/inactivación de virus. En una realización más preferida, el método comprende además al menos tres etapas de reducción/inactivación de virus. En una realización, la composición de inmunoglobulina enriquecida es una composición de IgG.

En otra realización particular, la presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para preparar una composición de inmunoglobulina enriquecida, comprendiendo el método las etapas de: precipitar inmunoglobulinas y A1PI a partir de una agrupación de Cohn en una etapa de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo; separar las inmunoglobulinas precipitadas y A1PI; precipitar las inmunoglobulinas separadas en una segunda etapa de precipitación; enriquecer la composición de inmunoglobulina realizando una cromatografía de intercambio catiónico; y enriquecer adicionalmente la composición de inmunoglobulina realizando una cromatografía de intercambio aniónico. En una realización, la concentración final de etanol y el pH usados en la etapa de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización, el método comprende además al menos una etapa de reducción/inactivación de virus. En una realización preferida, el método comprende además al menos dos etapas de reducción/inactivación de virus. En una realización más preferida, el método comprende además al menos tres etapas de reducción/inactivación de virus. En una realización, la composición de inmunoglobulina enriquecida es una composición de IgG.

En otra realización particular, la presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para preparar una composición de inmunoglobulina enriquecida, comprendiendo el método las etapas de: precipitar inmunoglobulinas y A1PI a partir de una agrupación de Cohn en una etapa de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo; separar las inmunoglobulinas precipitadas y A1PI; precipitar las inmunoglobulinas separadas en una segunda etapa de precipitación; tratar la composición de inmunoglobulina con un disolvente y detergente para inactivar virus; enriquecer la composición de inmunoglobulina realizando cromatografía de intercambio catiónico; enriquecer adicionalmente la composición de inmunoglobulina realizando cromatografía de intercambio aniónico; y nanofiltrar la composición de inmunoglobulina para eliminar virus. En una realización, la concentración final de etanol y el pH usados en la etapa de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización, el método comprende además concentrar la composición de inmunoglobulina mediante ultrafiltración/diafiltración hasta una concentración final de proteína de desde 5 g/l hasta 25 g/l. En una realización particular, la concentración final de la composición de inmunoglobulina enriquecida es del 5±1% (p/v). En otra realización particular, la concentración final de la composición de inmunoglobulina enriquecida es del 10±1% (p/v). En otra realización particular, la concentración final de la composición de inmunoglobulina enriquecida es del 15±1% (p/v). En otra realización particular, la concentración final de la composición de inmunoglobulina enriquecida es del 20±2% (p/v). En otra realización particular, la concentración final de la composición de inmunoglobulina enriquecida es del 25±2% (p/v). En una realización, la composición de inmunoglobulina enriquecida es una composición de IgG.

C. Enriquecimiento a modo de ejemplo de IgG a partir del precipitado de la fracción I-IV-1

1. Extracción del precipitado de la fracción I-IV-1

Con el fin de solubilizar el contenido de IgG del precipitado de la fracción I-IV-1, se usa un tampón de extracción frío para volver a suspender el precipitado del fraccionamiento II+NI a una razón típica de 1 parte de precipitado por 15 partes de tampón de extracción. Pueden usarse otras razones de resuspensión adecuadas, por ejemplo, desde 1:8 hasta 1:30, o desde 1:10 hasta 1:20, o desde 1:12 hasta 1:18, o desde 1:13 hasta 1:17, o desde 1:14 hasta 1:16. En determinadas realizaciones, la razón de resuspensión puede ser de 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, o superior.

Las disoluciones adecuadas para la extracción del primer precipitado tendrán generalmente un pH de entre 4,0 y 5,5. En la invención, la disolución tendrá un pH de entre 4,0 y 4,9, por ejemplo, la disolución de extracción tendrá un pH de aproximadamente 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9. En una realización preferida, el pH del tampón de extracción es de 4,7±0,1. En otra realización preferida, el pH del tampón de extracción es de 4,8±0,1. En otra realización preferida, el pH del tampón de extracción es de 4,9. En general, estos requisitos de pH pueden cumplirse usando un agente de tamponamiento seleccionado, por ejemplo, de acetato, citrato, fosfato monobásico, fosfato dibásico, mezclas de los mismos y similares. Las concentraciones de tampón adecuadas oscilan normalmente de desde 5 hasta 100 mM, o desde 10 hasta 50 mM, o de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ó 100 mM de agente de tamponamiento.

El tampón de extracción tendrá preferiblemente una conductividad de desde 0,5 mS/cm a 2,0 mS/cm. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, la conductividad del tampón de extracción será de 0,5±0,1 mS/cm, o de aproximadamente 0,6±0,1, 0,7±0,1, 0,8±0,1, 0,9±0,1, 1,0±0,1, 1,1±0,1, 1,2± 0,1, 1,3±0,1, 1,4±0,1, 1,5±0,1, 1,6±0,1, 1,7±0,1, 1,8±0,1, 1,9±0,1 o 2,0±0,1 mS/cm. Un experto habitual en la técnica sabrá cómo generar tampones de extracción que tengan una conductividad apropiada.

En una realización a modo de ejemplo, el precipitado de la fracción I-IV-1 se extrae con una razón de pasta con respecto a tampón de 1:15 usando un tampón de extracción que contiene fosfato de sodio monobásico 5 mM y acetato 5 mM, cuyo pH se ajusta a 4,8±0,2 con ácido acético. En una realización, el pH de la disolución se mantiene a un pH de 4,8±0,3 durante la duración del procedimiento de extracción. En una realización específica, el pH de la disolución se mantiene a un pH de 4,8±0,2 durante la duración del procedimiento de extracción.

Generalmente, la extracción se realiza a una temperatura de entre 0°C y 10°C, o entre 2°C y 8°C. En determinadas realizaciones, la extracción puede realizarse a 0±1°C, 1±1°C, 2±1°C, 3±1°C, 4±1°C, 5±1°C, 6±1°C C, 7±1°C, 8±1°C, 9±1°C o 10±1°C. En una realización particular, la extracción se realiza a entre 2°C y 10°C. Normalmente, el procedimiento de extracción durará entre 60 y 300 minutos, o entre 120 y 240 minutos, o entre 150 y 210 minutos, mientras la suspensión se agita continuamente. En determinadas realizaciones, el procedimiento de extracción continuará durante aproximadamente 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300 minutos o más. En una realización preferida, el procedimiento de extracción continuará durante al menos 160 minutos con agitación continua.

2. Tratamiento con dióxido de silicio (SO2)

En comparación con las purificaciones de Cohn-Oncley y Kistler-Nitschmann, los precipitados iniciales que contienen inmunoglobulina formados por los métodos proporcionados en el presente documento contienen niveles sustancialmente más altos de proteínas que no son inmunoglobulinas, que incluyen A1PI, fibrinógeno, factor H e IaIp. Se sabe que el factor H e IaIp pueden unirse a, y posteriormente eluirse de, dióxido de silicio finamente dividido (véanse los documentos WO 2011/011753 y WO/2012/012773). Ventajosamente, se encontró que la inclusión de una etapa de tratamiento con SO2 después de la extracción del precipitado de la fracción I-IV-1 y antes de la filtración de la suspensión de la fracción I-IV-1 ayuda en la separación de A1PI, fibrinógeno, factor H e IaIp en la torta de filtración insoluble formada durante la filtración de la suspensión de la fracción I-IV-1.

Por consiguiente, en una realización, se mezcla dióxido de silicio finamente dividido con la suspensión de la fracción I-IV-1 antes de la filtración. En una realización, esta etapa de pretratamiento comprende la adición de partículas de dióxido de silicio finamente dividido (por ejemplo, sílice pirogénica; Aerosil®) seguido de un periodo de incubación de 40 a 80 minutos durante el cual la suspensión se mezcla constantemente. En determinadas realizaciones, el periodo de incubación estará entre aproximadamente 50 minutos y aproximadamente 70 minutos, o aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o más minutos. Generalmente, el tratamiento se realizará a entre 0°C y 10°C, o entre 2°C y 8°C. En determinadas realizaciones, el tratamiento puede realizarse a aproximadamente 0°C, 1°C, 2°C, 3°C, 4°C, 5°C, 6°C, 7°C, 8°C, 9°C o 10°C. En una realización particular, el tratamiento se realiza a entre 2°C y 10°C. En una realización preferida, el tratamiento se realiza entre 5°C y 10°C.

En determinadas realizaciones, se añade sílice pirogénica a una concentración de entre 20 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1 y 100 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1. En determinadas realizaciones, la sílice pirogénica puede añadirse a una concentración de aproximadamente 20 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1, o aproximadamente 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ó 100 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1. En una realización específica, se añade sílice pirogénica (por ejemplo, Aerosil 380 o equivalente) a la suspensión de la fracción I-IV-1 hasta una concentración final de 40±10 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1. El mezclado tiene lugar a de 2°C a 8°C durante al menos de 50 a 70 minutos.

En determinadas realizaciones, se añade SiO2 a una composición de IgG a una concentración de desde 0,01 g/g de proteína total hasta 10 g/g de proteína total. En otra realización, se añade SO2 a una composición de IgG a una concentración de desde 0,01 g/g de proteína total hasta 5 g/g de proteína total. En otra realización, se añade SO2 a una composición de IgG a una concentración de desde 0,02 g/g de proteína total hasta 4 g/g de proteína total. En una realización, se añade SO2 a una concentración final de al menos 0,1 g por gramo de proteína total. En otra realización específica, se añade sílice pirogénica a una concentración de al menos 0,2 g por gramo de proteína total. En otra realización específica, se añade sílice pirogénica a una concentración de al menos 0,25 g por gramo de proteína total. En otras realizaciones específicas, se añade sílice pirogénica a una concentración de al menos 1 g por gramo de proteína total. En otra realización específica, se añade sílice pirogénica a una concentración de al menos 2 g por gramo de proteína total. En otra realización específica, se añade sílice pirogénica a una concentración de al menos 2.5 g por gramo de proteína total. En aún otras realizaciones específicas, se añade dióxido de silicio finamente dividido a una concentración de al menos 0,01 g/g de proteína total o al menos 0,02 g, 0,03 g, 0,04 g, 0,05 g, 0,06 g, 0,07 g, 0,08 g, 0,09 g, 0,1 g, 0,2 g, 0,3 g, 0,4 g, 0,5 g, 0,6 g, 0,7 g, 0,8 g, 0,9 g, 1,0 g, 1,5 g, 2,0 g, 2,5 g, 3,0 g, 3,5 g, 4,0 g, 4.5 g, 5,0 g, 5,5 g, 6,0 g, 6,5 g, 7,0 g, 7,5 g, 8,0 g, 8,5 g, 9,0 g, 9,5 g, 10,0 g o más por gramo de proteína total.

3. Filtración de la suspensión de la fracción I-IV-1

Con el fin de separar la porción soluble de la suspensión de la fracción I-IV-1 que contiene inmunoglobulinas de la porción insoluble que contiene fibrinógeno, A1PI, factor H e IaIp, la suspensión se filtra, normalmente usando filtración en profundidad. Los filtros de profundidad que pueden emplearse en los métodos proporcionados en el presente documento incluyen filtros de profundidad metálicos, de vidrio, cerámicos, orgánicos (tales como de tierra de diatomeas) y similares. Los ejemplos de filtros adecuados incluyen, sin limitación, los filtros Cuno 50SA, Cuno 90SA y Cuno VR06 (3M). Alternativamente, la etapa de separación puede realizarse por centrifugación en lugar de filtración.

En determinadas realizaciones, se añade a la suspensión un auxiliar de filtración, por ejemplo, Celpure C300 (Advanced Minerals) o Hyflo-Super-Cel (World Minerals), después del tratamiento con dióxido de silicio para facilitar la filtración en profundidad. El auxiliar de filtración se añade a una concentración final de desde 0,1 kg/kg de precipitado de la fracción I-IV-1 hasta 1,0 kg/kg de precipitado de la fracción I-IV-1, o desde 0,2 kg/kg de precipitado de la fracción I-IV-1 hasta 0,8 kg. /kg de precipitado de la fracción I-IV-1, o desde 0,3 kg/kg de precipitado de la fracción I-IV-1 hasta 0,7 kg/kg de precipitado de la fracción I-IV-1. En otras realizaciones, el auxiliar de filtración puede añadirse a una concentración final de desde 0,1 kg/kg de precipitado de la fracción I-IV-1 hasta 0,7 kg/kg de precipitado de la fracción I-IV-1, o desde 0,2 kg/kg de precipitado de la fracción I-IV-1 hasta 0,6 kg/kg de precipitado de la fracción I-IV-1, o desde aproximadamente 0,3 kg/kg de precipitado de la fracción I-IV-1 hasta aproximadamente 0,05 kg/kg de precipitado de la fracción I-IV-1. En determinadas realizaciones, el auxiliar de filtración se añadirá a una concentración final de aproximadamente 0,01 kg/kg de precipitado de la fracción I-IV-1, o de aproximadamente 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ó 1,0 kg/kg de precipitado de la fracción I-IV-1.

Con el fin de minimizar la pérdida de inmunoglobulinas durante la filtración, la torta de filtración formada debe lavarse con al menos un volumen muerto, preferiblemente al menos dos volúmenes muertos, más preferiblemente al menos tres volúmenes muertos, de tampón de suspensión o un tampón similar al mismo, que no es suficiente para solubilizar las proteínas que no son inmunoglobulinas presentes en la torta de filtración. En una realización, el filtro y la torta de filtración se lavan posteriormente con al menos 3,0 volúmenes muertos de tampón. En otra realización, el filtro y la torta de filtración se lavan posteriormente con al menos 3,6 volúmenes muertos de tampón. En otra realización, el filtro y la torta de filtración se lavan posteriormente con al menos el 50% del volumen de la suspensión filtrado, usando un tampón adecuado. En otra realización, el filtro y la torta de filtración se lavan posteriormente con al menos el 75% del volumen de la suspensión filtrado, usando un tampón adecuado. En otra realización, el filtro y la torta de filtración se lavan posteriormente con al menos el 100% del volumen de la suspensión filtrado, usando un tampón adecuado. Normalmente, no debe usarse más del 200% del volumen de la suspensión filtrado para lavar el filtro y la torta de filtración.

En una realización específica, el tampón de lavado es el tampón de disolución que contiene desde 90 hasta 150 ml de ácido acético glacial por 1000 l. En una realización, el pH del tampón de extracción de lavado posterior está entre aproximadamente 4,6 y aproximadamente 5,3. En una realización preferida, el pH del tampón de lavado posterior está entre aproximadamente 4,7 y aproximadamente 5,2. En otra realización preferida, el pH del tampón de lavado posterior está entre aproximadamente 4,8 y aproximadamente 5,1. En aún otra realización preferida, el pH del tampón de lavado posterior está entre aproximadamente 4,9 y aproximadamente 5,0.

4. Tratamiento con detergente

Para retirar contaminantes adicionales del filtrado de la fracción I-IV-1, la muestra se somete a continuación a un tratamiento con detergente. Los métodos para el tratamiento con detergente de fracciones derivadas de plasma son bien conocidos en la técnica. En general, puede usarse cualquier tratamiento convencional con detergente no iónico junto con los métodos proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, a continuación se proporciona un protocolo a modo de ejemplo para un tratamiento con detergente.

Se añade polisorbato-80 al filtrado de la fracción I-IV-1 a una concentración final de aproximadamente el 0,2% (p/v) con agitación y la muestra se incuba durante al menos 30 minutos a una temperatura de entre aproximadamente 2 y 8°C. Luego se mezcla citrato de sodio dihidratado en la disolución a una concentración final de aproximadamente 8 g/l y la muestra se incuba durante 30 minutos adicionales, con agitación continua a una temperatura de entre aproximadamente 2 y 8°C.

En determinadas realizaciones, puede usarse cualquier detergente no iónico adecuado. Los ejemplos de detergentes no iónicos adecuados incluyen, sin limitación, octilglucósido, digitonina, C12E8, Lubrol, Triton X-100, Nonidet P-40, Tween-20 (es decir, polisorbato-20), Tween-80 (es decir, polisorbato-80), un poli(óxido de etileno) de alquilo, un detergente Brij, un poli(óxido de etileno) de alquilfenol, un Poloxamer, octilglucósido, decilmaltósido y similares.

En una realización, se realiza una mejora del procedimiento mediante la adición de los reactivos detergentes (por ejemplo, polisorbato-80 y citrato de sodio deshidratado) por adición difusa. La adición difusa de estos reactivos minimiza las fluctuaciones locales de la concentración de alcohol y el pH en comparación con la adición en un único punto de entrada. En una realización, la adición difusa comprende la pulverización, en lugar de la adición fluida. En otra realización, la adición difusa comprende la adición de un reactivo desde múltiples puertos. En una realización, la adición difusa comprende la adición de un reactivo desde un puerto difusor. En determinadas realizaciones, al menos un puerto usado para introducir un reactivo en el sistema está ubicado en o cerca de un impulsor u otro elemento dispersivo. En otras realizaciones, los reactivos detergentes pueden añadirse como sólidos al filtrado de la fracción II+III modificada mientras se mezcla la muestra para asegurar una distribución rápida de los aditivos. En determinadas realizaciones, es preferible añadir reactivos sólidos pulverizando los sólidos sobre un área de superficie deslocalizada del filtrado de modo que no se produzca una sobreconcentración local, tal como una adición fluida.

5. Segundo acontecimiento de precipitación - Precipitación G

Con el fin de retirar las impurezas residuales, se realiza una segunda precipitación a pH de 6,5 a 7,5 con alcohol al 25%. Brevemente, la extracción de la fracción I-IV-1 se ajusta a un pH de desde 6,5 hasta 7,5, preferiblemente de desde 6,8 hasta 7,2, más preferiblemente de desde 6,9 hasta 7,1, lo más preferiblemente 7,0 con una disolución modificadora de pH adecuada (por ejemplo, hidróxido de sodio o ácido acético). A continuación, se añade alcohol frío a la disolución hasta una concentración final de aproximadamente el 25% (v/v) y la mezcla se incuba mientras se agita entre aproximadamente -6°C y aproximadamente -10°C durante al menos 1 hora para formar un segundo precipitado (es decir, precipitado G). En una realización, la mezcla se incuba durante al menos 2 horas, o al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o más horas. En una realización preferida, la mezcla se incuba durante al menos 2 horas. En una realización más preferida, la mezcla se incuba durante al menos 4 horas. En una realización incluso más preferida, la mezcla se incuba durante al menos 8 horas.

En determinadas realizaciones, puede precipitarse un mayor porcentaje de IgG a partir de la extracción I-IV-1 ajustando el pH de la disolución durante y/o después de la adición de alcohol a la reacción de precipitación. Asimismo, debido a las fluctuaciones en el pH de la disolución durante el procedimiento de precipitación, el pH de la mezcla de reacción puede monitorizarse y/o ajustarse durante toda la incubación. En otra realización, la mejora en el rendimiento de IgG se logra mediante la adición del alcohol precipitante y/o la disolución usada para ajustar el pH de la mezcla mediante la adición difusa del alcohol o el agente modificador del pH. La adición difusa de estos reactivos minimiza las fluctuaciones locales de la concentración de alcohol y el pH en comparación con la adición en un único punto de entrada. En una realización, la adición difusa comprende la pulverización, en lugar de la adición fluida. En otra realización, la adición difusa comprende la adición de un reactivo desde múltiples puertos. En una realización, la adición difusa comprende la adición de un reactivo desde un puerto difusor. En determinadas realizaciones, al menos un puerto usado para introducir un reactivo en el sistema está ubicado en o cerca de un impulsor u otro elemento dispersivo.

6. Suspensión y filtración de precipitado G (Ppt G)

Con el fin de solubilizar el contenido de IgG del precipitado G, se usa un tampón de extracción frío para resuspender el PptG. Brevemente, el precipitado G se disuelve a una razón de 1 parte de precipitado por 2-5 partes de agua para inyección (WFI) o tampón de baja conductividad. En una realización preferida, el precipitado G se disuelve a una razón de 1 parte de precipitado por 1-15 partes, preferiblemente 3,5 partes, de WFI. La etapa de suspensión generalmente se realiza a una temperatura de entre 0°C y 8°C para lograr un valor de UA280-320 de desde 40 hasta 95. El pH final de la disolución, que se agita durante al menos 2 horas, se ajusta luego a desde 4,5 hasta 5,6, preferiblemente a 5,2±0,2. En una realización, este ajuste de pH se realiza con ácido acético. Para aumentar la solubilidad de IgG, la conductividad de la suspensión se aumenta hasta entre 2,5 y 6,0 mS/cm. En una realización, la conductividad se aumenta mediante la adición de cloruro de sodio.

Las disoluciones adecuadas para la extracción del precipitado G incluyen WFI y tampones de baja conductividad. En una realización, un tampón de baja conductividad tiene una conductividad de menos de aproximadamente 10 mS/cm. En otras realizaciones, el tampón de baja conductividad tiene una conductividad de menos de aproximadamente 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 mS/cm. En una realización preferida, el tampón de baja conductividad tiene una conductividad de menos de aproximadamente 6 mS/cm. En otra realización preferida, el tampón de baja conductividad tiene una conductividad de menos de aproximadamente 4 mS/cm. En otra realización preferida, el tampón de baja conductividad tiene una conductividad de menos de aproximadamente 2 mS/cm.

Luego la disolución de PptG suspendida se filtra con un filtro de profundidad adecuado que tiene un tamaño de poro nominal de entre 0,1 ^m y 0,4 |im con el fin de retirar cualquier partícula no disuelta. En una realización, el tamaño de poro nominal del filtro de profundidad es de aproximadamente 0,2 |im (por ejemplo, filtro Cuno VR06 o equivalente). En otra realización, la disolución de PptG suspendida se centrifuga para recuperar un sobrenadante clarificado. El filtro se lava con WFI o un tampón adecuado después de la filtración para recuperar IgG adicional y el lavado posterior se añade al filtrado. En una realización preferida, el lavado posterior del filtro se realiza usando una disolución de cloruro de sodio con una conductividad de entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 6,0 mS/cm.

7. Tratamiento con disolvente y detergente (S/D)

Con el fin de inactivar diversos contaminantes virales presentes en los productos derivados de plasma, el filtrado de PptG clarificado se somete a continuación a un tratamiento con disolvente y detergente (S/D). Los métodos para el tratamiento con detergente de fracciones derivadas de plasma son bien conocidos en la técnica (para revisión véase, Pelletier JP et al., Best Pract Res Clin Haematol. 2006;19(1):205-42). En general, puede usarse cualquier tratamiento S/D convencional junto con los métodos proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, a continuación se proporciona un protocolo a modo de ejemplo para un tratamiento S/D.

Se añaden Triton X-100, Tween-20 y tri(n-butil)fosfato (TNBP) al filtrado de PptG clarificado a concentraciones finales de aproximadamente el 1,0%, el 0,3% y el 0,3%, respectivamente. Luego se agita la mezcla a una temperatura de entre 18°C y 25°C durante al menos una hora.

En una realización, los reactivos S/D (por ejemplo, Triton X-100, Tween-20 y TNBP) se añaden por adición difusa. En una realización específica, los reactivos S/D se añaden mediante pulverización en lugar de una adición fluida. En otra realización, los reactivos detergentes se añaden como sólidos al filtrado de PptG clarificado, que se mezcla para asegurar una distribución rápida de los componentes S/D. En determinadas realizaciones, es preferible añadir reactivos sólidos pulverizando los sólidos sobre un área de superficie deslocalizada del filtrado de modo que no se produzca una sobreconcentración local, tal como una adición fluida.

8. Cromatografía de intercambio iónico

Con el fin de purificar y concentrar adicionalmente la IgG, puede emplearse cromatografía de intercambio catiónico y/o de intercambio aniónico. Los métodos para purificar y concentrar IgG usando cromatografía de intercambio iónico son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.886.154 describe un método en el que se extrae un precipitado de la fracción II+NI a pH bajo (entre aproximadamente 3,8 y 4,5), seguido de la precipitación de IgG usando ácido caprílico y, finalmente, la implementación de dos etapas de cromatografía de intercambio aniónico. La patente estadounidense n.° 6.069.236 describe un esquema cromatográfico de purificación de IgG que no depende en absoluto de la precipitación con alcohol. La publicación PCT n.°WO 2005/073252 describe un método de purificación de IgG que implica la extracción de un precipitado de la fracción II+III, tratamiento con ácido caprílico, tratamiento con PEG y una sola etapa de cromatografía de intercambio aniónico. La patente estadounidense n.° 7.186.410 describe un método de purificación de IgG que implica la extracción de un precipitado de la fracción I+II+III o fracción II seguido de una única etapa de intercambio aniónico realizado a un pH alcalino. La patente estadounidense n.° 7.553.938 describe un método que implica la extracción de un precipitado de la fracción I+II+III o fracción II+III, tratamiento con caprilato y uno o dos etapas de cromatografía de intercambio aniónico. La patente estadounidense n.° 6.093.324 describe un método de purificación que comprende el uso de una resina de intercambio aniónico macroporosa que se hace funcionar a un pH de entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 6,6. La patente estadounidense n.° 6.835.379 describe un método de purificación que se basa en la cromatografía de intercambio catiónico en ausencia de fraccionamiento con alcohol.

En una realización, el filtrado de PptG tratado con S/D puede someterse tanto a cromatografía de intercambio catiónico como a cromatografía de intercambio aniónico. Por ejemplo, en una realización, el filtrado de PptG tratado con S/D se pone en contacto con una resina de intercambio catiónico en condiciones adecuadas para unir la IgG a la resina. Luego pueden retirarse los reactivos S/D por lavado de la IgG adsorbida, que posteriormente se eluye de la resina con un tampón de elución adecuado. De esta manera, la etapa de cromatografía de intercambio catiónico puede usarse para retirar los reactivos S/D de la preparación, concentrar la disolución que contiene IgG y/o retirar las impurezas de la composición.

En una realización, la IgG se eluye de la resina de intercambio catiónico usando un tampón de elución que tiene un pH de entre aproximadamente 8,0 y 9,0. En determinadas realizaciones, el tampón de elución de pH puede tener un pH de entre aproximadamente 8,2 y aproximadamente 8,8, o entre aproximadamente 8,4 y aproximadamente 8,6, o un pH de aproximadamente 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9 ó 9,0. En una realización preferida, el pH del tampón de elución es de aproximadamente 8,5±0,1.

Asimismo, la cromatografía de intercambio aniónico puede usarse para reducir las impurezas en la composición de IgG. En una realización, la cromatografía de intercambio aniónico se realiza en condiciones de disolución en las que una o más impurezas se unen a la resina de intercambio aniónico pero la IgG no. En una realización específica, la cromatografía de intercambio aniónico se realiza en condiciones ligeramente ácidas, es decir, a un pH de entre 5,0 y 7,0, preferiblemente entre 5,5 y 6,5, a una fuerza iónica baja adecuada para la unión de contaminantes pero no de IgG a la resina de intercambio aniónico.

En una realización específica, el eluato de la columna de intercambio catiónico puede ajustarse a un pH más bajo, por ejemplo de entre aproximadamente 5,5 y aproximadamente 6,5, y diluirse con un tampón apropiado de modo que se reduzca la conductividad de la disolución. En determinadas realizaciones, el pH del eluato de intercambio catiónico puede ajustarse a un pH de entre aproximadamente 5,7 y aproximadamente 6,7, o entre aproximadamente 5,9 y aproximadamente 6,5, o un pH de aproximadamente 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1., 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6 ó 6,7. En una realización preferida, el pH del eluato se ajusta a un pH de aproximadamente 6,4±0,1. Luego se carga el eluato en una columna de intercambio aniónico, que se une a varios contaminantes que se encuentran en la preparación. El flujo a través de la columna, que contiene la fracción de IgG, se recoge durante la carga y el lavado de la columna. En determinadas realizaciones, las etapas cromatográficas de intercambio iónico usadas en la presente invención pueden realizarse en modo de columna, modo discontinuo o en una combinación de los dos. En una realización, la disolución usada para ajustar el pH de la composición de IgG antes de la cromatografía de intercambio aniónico se añade por adición difusa. En una realización específica, la disolución se añade por pulverización, en lugar de una adición fluida.

9. Nanofiltración

Con el fin de reducir la carga viral de una composición de IgG proporcionada en el presente documento, la composición puede someterse a nanofiltración usando un dispositivo de nanofiltración adecuado. En determinadas realizaciones, el dispositivo de nanofiltración tendrá un tamaño medio de poro de entre aproximadamente 15 nm y aproximadamente 200 nm. Los ejemplos de nanofiltros adecuados para este uso incluyen, sin limitación, DVD, DV 50, DV 20 (Pall), Viresolve NFP, Viresolve NFR (Millipore), Planova 15N, 20N, 35N y 75N (Planova). En una realización específica, el nanofiltro puede tener un tamaño medio de poro de entre aproximadamente 15 nm y aproximadamente 72 nm, o entre aproximadamente 19 nm y aproximadamente 35 nm, o de aproximadamente 15 nm, 19 nm, 35 nm o 72 nm. En una realización preferida, el nanofiltro tendrá un tamaño medio de poro de aproximadamente 35 nm, tal como un filtro Asahi PLANOVA 35N o equivalente. En una realización particular, la composición de IgG recuperada a partir de la etapa de intercambio aniónico se somete a nanofiltración usando un nanofiltro que tiene un tamaño de poro entre 30 nm y 40 nm, preferiblemente 35±2 nm. En otra realización preferida, el nanofiltro tendrá un tamaño medio de poro de aproximadamente 19 ó 20 nm, tal como un filtro Asahi PLANOVA 20N (19±2 nm) o equivalente del mismo. En una realización particular, la composición de IgG recuperada a partir de la etapa de intercambio aniónico se somete a nanofiltración usando un nanofiltro que tiene un tamaño de poro entre 15 nm y 25 nm, preferiblemente 19±2 nm.

10. Ultra/diafiltración (UF/DF)

Puede realizarse ultrafiltración/diafiltración para concentrar la composición de IgG en cualquier etapa durante el procedimiento de purificación. En una realización, el nanofiltrado se concentra mediante UF/DF. En una realización, el nanofiltrado puede concentrarse mediante ultrafiltración hasta una concentración de proteína de entre aproximadamente el 2% y aproximadamente el 10% (p/v). En determinadas realizaciones, la ultrafiltración se lleva a cabo en un casete con un tamiz de canal abierto y la membrana de ultrafiltración tiene un límite de peso molecular nominal (NMWCO) de menos de aproximadamente 100 kDa o menos de aproximadamente 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 o menos kDa. En una realización preferida, la membrana de ultrafiltración tiene un NMWCO de no más de 50 kDa.

En una realización, se usa una membrana de canal abierto con un lavado posterior y una formulación diseñados específicamente cerca del final del procedimiento de producción para hacer que las composiciones de IgG resultantes tengan una concentración de proteína aproximadamente dos veces mayor (200 mg/ml) en comparación con el estado de la técnica IVIG (por ejemplo, GAMMAGARD® LIQUID, 10% de IgG) sin afectar el rendimiento y la estabilidad de almacenamiento. Con la mayoría de las membranas de ultrafiltración comercialmente disponibles, no puede alcanzarse una concentración de 200 mg/ml de IgG sin grandes pérdidas de proteínas. Estas membranas se bloquean temprano y, por tanto, es difícil lograr un lavado posterior adecuado. Por tanto, deben usarse configuraciones de membrana de canal abierto. Incluso con membranas de canal abierto, debe usarse un procedimiento de lavado posterior diseñado específicamente para obtener la concentración requerida sin una pérdida significativa de proteínas (menos del 2% de pérdida). Incluso más sorprendente es el hecho de que la mayor concentración de proteína de 200 mg/ml no reduce la capacidad de inactivación de virus de una etapa de almacenamiento de pH bajo.

Tras la finalización de la etapa de ultrafiltración, el concentrado puede concentrarse adicionalmente mediante diafiltración frente a una disolución adecuada para administración intravenosa o intramuscular. En determinadas realizaciones, la disolución de diafiltración puede comprender un agente estabilizante y/o de tamponamiento. En una realización preferida, el agente estabilizante y de tamponamiento es glicina a una concentración apropiada, por ejemplo, de entre aproximadamente 0,20 M y aproximadamente 0,30 M, o entre aproximadamente 0,22 M y aproximadamente 0,28 M, o entre aproximadamente 0,24 M y aproximadamente 0,26 M, o en una concentración de 0,20±0,01 M, 0,21±0,01 M, 0,22±0,01 M, 0,23±0,01 M, 0,24±0,01 M, 0,25±0,01 M, 0,26±0,01 M, 0,27±0,01 M, 0,28±0,01 M, 0,29± 0,01 M o 0,3±0,01 M. En una realización preferida, el tampón de diafiltración contiene glicina 0,25±0,01 M.

Normalmente, el volumen de intercambio mínimo para la diafiltración es al menos aproximadamente 3 veces el volumen de concentrado original o al menos aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más veces el volumen de concentrado original. La disolución de IgG puede concentrarse hasta una concentración de proteína final de entre aproximadamente el 5% y aproximadamente el 25% (p/v), o entre aproximadamente el 6% y aproximadamente el 18% (p/v), o entre aproximadamente el 7% y aproximadamente el 16% (p/v), o entre aproximadamente el 8% y aproximadamente el 14% (p/v), o entre aproximadamente el 9% y aproximadamente el 12%, o hasta una concentración final de aproximadamente el 5%, o el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 11%, el 12%, el 13%, el 14%, el 15%, el 16%, el 17%, el 18%, el 19%, el 20%, el 21%, el 22%, el 23%, el 24%, el 25% o más alto. En una realización, se logra una concentración de proteína final de al menos aproximadamente el 23% sin añadir la fracción de lavado posterior a la disolución concentrada. En otra realización, se logra una concentración de proteína final de al menos aproximadamente el 24% sin añadir la fracción de lavado posterior a la disolución concentrada. En otra realización, se logra una concentración de proteína final de al menos aproximadamente el 24% sin añadir la fracción de lavado posterior a la disolución concentrada. En una realización, el pH de la disolución será de desde 4,6 hasta 5,1 después de la diafiltración.

En una realización a modo de ejemplo, el pH de la composición de IgG se ajusta a aproximadamente 4,5 antes de la ultrafiltración. La disolución se concentra hasta una concentración de proteína del 5±2% p/v mediante ultrafiltración. La membrana de UF tiene un límite de peso molecular nominal (NMWCO) de 50.000 Dalton o menos (por ejemplo, membrana de sulfona de poliéter Millipore Pellicon). Luego el concentrado se somete a diafiltración frente a diez volúmenes de disolución de glicina 0,25 M, pH 4,5±0,2. A lo largo de la operación de ultradiafiltración, la disolución se mantiene a una temperatura de entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 8°C. Después de la diafiltración, la disolución se concentra hasta una concentración de proteína de al menos el 11% (p/v).

11. Formulación

Tras la finalización de la etapa de diafiltración, la concentración de proteína de la disolución se ajusta con el tampón de diafiltración hasta una concentración final de entre aproximadamente el 5% y aproximadamente el 20% (p/v), o entre aproximadamente el 6% y aproximadamente el 18% (p/v), o entre aproximadamente el 7% y aproximadamente el 16% (p/v), o entre aproximadamente el 8% y aproximadamente el 14% (p/v), o entre aproximadamente el 9% y aproximadamente el 12%, o hasta una concentración final de aproximadamente el 5%, o el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 11%, el 12%, el 13%, el 14%, el 15%, el 16%, el 17%, el 18%, el 19%, el 20%, el 21%, el 22%, el 23%, el 24% o el 25%. En una realización, la concentración de proteína final de la disolución está entre aproximadamente el 9% y aproximadamente el 11%, más preferiblemente de aproximadamente el 10%.

La disolución a granel formulada se esteriliza adicionalmente filtrando a través de un filtro de membrana con un tamaño de poro absoluto de no más de aproximadamente 0,22 micrómetros, por ejemplo, de aproximadamente 0,2 micrómetros. Luego, la disolución se distribuye asépticamente en los recipientes finales para un sellado adecuado, y se toman muestras para someterlas a prueba.

En una realización, la composición de IgG se ajusta adicionalmente hasta una concentración del 10,2±0,2% (p/v) con tampón de diafiltración. En otra realización, la composición de IgG se ajusta hasta una concentración del 15±1% (p/v). En otra realización, la composición de IgG se ajusta hasta una concentración del 20±1% (p/v). En otra realización, la composición de IgG se ajusta hasta una concentración del 25±1% (p/v). El pH se ajusta hasta aproximadamente de 4,4 a aproximadamente 4,9 si es necesario. Finalmente, la disolución se esteriliza por filtración y se incuba durante tres semanas a, o a aproximadamente, 30°C.

D. Inmunoglobulina G (IgG)

La presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para preparar una composición de inmunoglobulina G (IgG) enriquecida a partir de una agrupación de Cohn, comprendiendo el método las etapas de: coprecipitar IgG y alfa-1-antitripsina (A1PI) a partir de una agrupación de Cohn, en una primera etapa de precipitación, para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; retirar la A1PI de la suspensión; y recuperar la fracción soluble de la primera suspensión que contiene IgG, formando de ese modo una composición de IgG enriquecida. En general, puede usarse cualquier medio químico para la precipitación de inmunoglobulinas y A1PI, incluyendo, pero sin limitarse a, precipitación con alcohol (por ejemplo, usando etanol o metanol), precipitación usando polímeros solubles en agua (por ejemplo, PEG o dextrano) y precipitación por adición de sal (por ejemplo, usando fosfato de amonio, sulfato de amonio, citrato de sodio, etc.). En una realización preferida, la precipitación es precipitación con alcohol, preferiblemente precipitación con etanol.

En una realización, la presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para preparar una composición de inmunoglobulina G (IgG) enriquecida mediante la precipitación de IgG a partir de plasma desprovisto de crioprecipitado en una etapa de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo. En una realización específica, el método comprende las etapas de: precipitar IgG a partir de plasma desprovisto de crioprecipitado en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol al plasma desprovisto de crioprecipitado hasta una concentración final de entre el 20% y el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; separar el primer precipitado del primer sobrenadante; y recuperar IgG del primer precipitado, formando de ese modo una composición de IgG enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, la IgG recuperada del primer precipitado se enriquece adicionalmente.

En una realización, el método comprende las etapas de: precipitar IgG a partir de plasma desprovisto de crioprecipitado en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol al plasma desprovisto de crioprecipitado hasta una concentración final y un pH seleccionados de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7, para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; separar el primer precipitado del primer sobrenadante; y recuperar IgG del primer precipitado, formando de ese modo una composición de IgG enriquecida. En una realización, la IgG recuperada del primer precipitado se enriquece adicionalmente.

La primera etapa de precipitación se realiza mezclando etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final de desde el 20% hasta el 30% (v/v) a un pH de entre 5,0 y 6,0. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En otra realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±2% (v/v). En otra realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±1% (v/v). En otra realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25% (v/v). Asimismo, en una realización, la primera etapa de precipitación se realiza a un pH de 5,5±0,5. En otra realización, la primera etapa de precipitación se realiza a un pH de 5,5±0,4. En otra realización, la primera etapa de precipitación se realiza a un pH de 5,5±0,3. En otra realización, la primera etapa de precipitación se realiza a un pH de 5,5±0,2. En otra realización, la primera etapa de precipitación se realiza a un pH de 5,5±0,1. En otra realización, la primera etapa de precipitación se realiza a un pH de 5,5. En aún otras realizaciones, la concentración final de etanol y el pH de la primera etapa de precipitación se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7.

Los métodos proporcionados en el presente documento proporcionan rendimientos significativamente más altos de recuperación de IgG en el producto final enriquecido debido a la precipitación de la mayor parte del contenido de inmunoglobulina de la agrupación de Cohn de partida en la reacción de precipitación inicial, en comparación con los procedimientos de purificación del estado de la técnica que se basan en etapas iniciales de precipitación con bajo contenido de alcohol (es decir, precipitación de la fracción I).

Por consiguiente, en una realización de los métodos proporcionados en el presente documento, al menos el 90% del contenido de IgG de la agrupación de Cohn de partida se precipita en la reacción de precipitación inicial. En una realización preferida, al menos el 95% del contenido de IgG de la agrupación de Cohn de partida se precipita en la reacción de precipitación inicial. En una realización más preferida, al menos el 99% del contenido de IgG de la agrupación de Cohn de partida se precipita en la reacción de precipitación inicial. En determinadas realizaciones, al menos el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más del contenido de IgG de la agrupación de Cohn de partida se precipita en la reacción de precipitación inicial.

Tal como se muestra en los ejemplos proporcionados en el presente documento, el uso de una etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol y pH bajo (es decir, precipitación de la fracción I-IV-1) da como resultado la precipitación de al menos el 99% del contenido de IgG de la agrupación de Cohn de partida. Por consiguiente, en una realización, la presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para preparar una composición de IgG enriquecida, comprendiendo el método las etapas de: precipitar del 99% al 100% del contenido de IgG de una agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de entre el 20% y el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; separar el primer precipitado del primer sobrenadante; y recuperar IgG del primer precipitado, formando de ese modo una composición de inmunoglobulina enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, la IgG recuperada del primer precipitado se enriquece adicionalmente. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la etapa de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7.

En una realización, la presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para preparar una composición de IgG enriquecida, comprendiendo el método las etapas de: precipitar del 95% al 100% del contenido de IgG y A1PI a partir de una agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de entre el 20% y el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; retirar la A1PI de la suspensión; y recuperar la fracción soluble de la primera suspensión, formando de ese modo una composición de IgG enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, la IgG recuperada del primer precipitado se enriquece adicionalmente. En otra realización, la A1PI retirada de la suspensión se enriquece adicionalmente. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la etapa de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización preferida, del 99% al 100% del contenido de IgG de la agrupación de Cohn se precipita en la primera etapa de precipitación.

En una realización, la presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para preparar una composición de IgG enriquecida, comprendiendo el método las etapas de: precipitar del 95% al 100% del contenido de IgG y A1PI a partir de una agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de desde el 20% hasta el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; retirar la A1P i de la suspensión; y recuperar la fracción soluble de la primera suspensión, en el que del 80% al 100% del contenido de albúmina de la agrupación de Cohn está presente en el primer sobrenadante, formando de ese modo una composición de IgG enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, la IgG recuperada del primer precipitado se enriquece adicionalmente. En otra realización, la A1PI retirada de la suspensión se enriquece adicionalmente. En aún otra realización, la albúmina que se encuentra en el primer sobrenadante se enriquece adicionalmente. En una realización preferida, del 99% al 100% del contenido de IgG de la agrupación de Cohn se precipita en la primera etapa de precipitación. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la etapa de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7.

Con el fin de proporcionar composiciones de IgG de calidad farmacéutica, es necesario retirar contaminantes tales como A1PI y fibrinógeno presentes en el precipitado inicial a partir de la composición de inmunoglobulina. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante un fraccionamiento adicional del primer precipitado (por ejemplo, mediante precipitación diferencial usando alcohol, polímeros hidrófilos no iónicos o precipitación por adición de sal), metodologías cromatográficas o metodologías de filtración.

En una realización, el primer precipitado se suspende en agua para inyección (WFI) o un tampón de baja fuerza iónica adecuado para extraer IgG a partir del precipitado, luego se trata la suspensión con dióxido de silicio (SiO2) finamente dividido, y se separa la porción soluble de la suspensión que contiene la IgG a partir de la porción insoluble de la suspensión que contiene la mayor parte de la A1PI y el fibrinógeno.

Las disoluciones adecuadas para la extracción del primer precipitado tendrán generalmente un pH de entre 4,0 y 5,5. En la invención, la disolución tendrá un pH de entre 4,0 y 4,9, por ejemplo, la disolución de extracción tendrá un pH de aproximadamente 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9. En una realización preferida, el pH del tampón de extracción es de 4,7±0,1. En otra realización preferida, el pH del tampón de extracción es de 4,8±0,1. En otra realización preferida, el pH del tampón de extracción es de 4,9. En general, estos requisitos de pH pueden cumplirse usando un agente de tamponamiento seleccionado de, por ejemplo, acetato, citrato, fosfato monobásico, fosfato dibásico, mezclas de los mismos, y similares. Las concentraciones de tampón adecuadas oscilan normalmente de desde 5 hasta 100 mM, o de desde 10 hasta 50 mM, o 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ó 100 mM de agente de tamponamiento.

El tampón de extracción tendrá preferiblemente una conductividad de desde 0,5 mS/cm hasta 2,0 mS/cm. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, la conductividad del tampón de extracción será de 0,5±0,1 mS/cm, o 0,6±0,1, 0,7±0,1, 0,8±0,1, 0,9±0,1, 1,0±0,1, 1,1±0,1, 1,2±0,1, 1,3±0,1, 1,4±0,1, 1,5±0,1, 1,6±0,1, 1,7±0,1, 1,8±0,1, 1,9±0,1 ó 2,0±0,1 mS/cm. Un experto habitual en la técnica sabrá cómo generar tampones de extracción que tengan una conductividad apropiada. En una realización particular, el tampón de extracción contiene fosfato de sodio monobásico 5 mM y acetato 5 mM a un pH de 4,8 y una conductividad de desde 0,7 hasta 0,9 mS/cm.

En una realización, se añade sílice pirogénica antes de la separación (por ejemplo, filtración o centrifugación) a una concentración de entre 20 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1 y 100 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1. En otra realización, se añade sílice pirogénica a una concentración de entre 30 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1 y 80 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1. En determinadas realizaciones, la sílice pirogénica puede añadirse a una concentración de aproximadamente 20 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1, o de aproximadamente 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ó 100 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1. En una realización específica, se añade sílice pirogénica (por ejemplo, Aerosil 380 o equivalente) a la suspensión de la fracción I-IV-1 hasta una concentración final de 40±20 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1. En otra realización específica, se añade sílice pirogénica a la suspensión de la fracción I-IV-1 hasta una concentración final de 40±10 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1. El mezclado tiene lugar a de 2°C a 8°C durante al menos de 50 a 70 minutos.

Por consiguiente, en una realización, la presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para preparar una composición de IgG enriquecida, comprendiendo el método las etapas de: precipitar del 95% al l0o% del contenido de IgG y A1PI a partir de una agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de entre el 20% y el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; tratar la primera suspensión con dióxido de silicio finamente dividido; y separar la porción soluble de la suspensión de la porción insoluble de la suspensión, en el que la porción soluble de la suspensión contiene IgG y la porción insoluble de la suspensión contiene A1PI, fibrinógeno, factor H e IaIp, formando de ese modo una composición de IgG enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, la IgG recuperada del primer precipitado se enriquece adicionalmente. En otra realización, la A1PI retirada de la suspensión se enriquece adicionalmente. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la etapa de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización preferida, del 99% al 100% del contenido de IgG de la agrupación de Cohn se precipita en la primera etapa de precipitación. En una realización específica, las porciones soluble e insoluble de la primera suspensión se separan por filtración. En una realización, se añade SO2 a una concentración final de 40±10 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1.

En una realización, la presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para preparar una composición de IgG enriquecida, comprendiendo el método las etapas de: precipitar del 95% al 100% del contenido de IgG y A1PI a partir de una agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de desde el 20% hasta el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; tratar la primera suspensión con dióxido de silicio finamente dividido; y separar la porción soluble de la suspensión de la porción insoluble de la suspensión, en el que la porción soluble de la suspensión contiene IgG y la porción insoluble de la suspensión contiene A1PI, fibrinógeno, factor H e IaIp, y además en el que del 80% al 100% del contenido de albúmina de la agrupación de Cohn está presente en el primer sobrenadante, formando de ese modo una composición de IgG enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, la IgG presente en la porción soluble de la suspensión se enriquece adicionalmente. En otra realización, la A1PI presente en la porción insoluble de la suspensión se enriquece adicionalmente. En otra realización, el fibrinógeno presente en la porción insoluble de la suspensión se enriquece adicionalmente. En otra realización, el factor H presente en la porción insoluble de la suspensión se enriquece adicionalmente. En otra realización, la IaIp presente en la porción insoluble de la suspensión se enriquece adicionalmente. En aún otra realización, la albúmina que se encuentra en el primer sobrenadante se enriquece adicionalmente. En una realización preferida, del 99% al 100% del contenido de IgG de la agrupación de Cohn se precipita en la primera etapa de precipitación. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la etapa de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización específica, las porciones soluble e insoluble de la primera suspensión se separan por filtración. En una realización, se añade SO2 a una concentración final de 40±10 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1.

En una realización, la IgG recuperada de la porción soluble de la primera suspensión se enriquece adicionalmente por fraccionamiento. En general, puede usarse cualquier método de fraccionamiento (por ejemplo, precipitación con alcohol o polímero, precipitación por adición de sal, etc.). En una realización preferida, la IgG se enriquece adicionalmente mediante el fraccionamiento de la porción soluble de la primera suspensión mediante precipitación con etanol. En una realización, la IgG se enriquece mediante la adición de etanol a la porción soluble de la primera suspensión a una concentración final y un pH adecuados para precipitar la IgG, mientras que al menos un contaminante no precipita. En otra realización, la IgG se enriquece mediante la adición de etanol a la porción soluble de la primera suspensión a una concentración final y un pH adecuados para precipitar al menos un contaminante, mientras que la IgG no precipita.

En una realización, la presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para preparar una composición de IgG enriquecida a partir de una agrupación de Cohn, comprendiendo el método las etapas de: coprecipitar IgG y alfa-1 -antitripsina (A1PI) a partir de una agrupación de Cohn, en una primera etapa de precipitación, para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; retirar A1PI de la suspensión; precipitar IgG de la primera suspensión en una segunda etapa de precipitación, para formar un segundo precipitado que comprende IgG y un segundo sobrenadante que comprende al menos un contaminante; y recuperar IgG del segundo precipitado, formando de ese modo una composición de IgG enriquecida. En una realización, la IgG recuperada del segundo precipitado se enriquece adicionalmente. En otra realización, la A1PI retirada de la primera suspensión se enriquece adicionalmente. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la primera etapa de precipitación se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7.

En una realización a modo de ejemplo, la segunda etapa de precipitación se realiza mezclando etanol con la porción soluble de la segunda suspensión (por ejemplo, un filtrado o sobrenadante de la suspensión formada después de la filtración o centrifugación) a una concentración final de desde el 22% hasta el 28% (v/v) a un pH de entre 6,5 y 7,5. En una realización, se mezcla etanol hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En otra realización, se mezcla etanol hasta una concentración final del 25±2% (v/v). En otra realización, se mezcla etanol hasta una concentración final del 25±1% (v/v). En otra realización, se mezcla etanol hasta una concentración final del 25% (v/v). Asimismo, en una realización, la segunda etapa de precipitación se realiza a un pH de 7,0±0,5. En otra realización, la segunda etapa de precipitación se realiza a un pH de 7,0±0,4. En otra realización, la segunda etapa de precipitación se realiza a un pH de 7,0±0,3. En otra realización, la segunda etapa de precipitación se realiza a un pH de 7,0±0,2. En otra realización, la segunda etapa de precipitación se realiza a un pH de 7,0±0,1. En otra realización, la segunda etapa de precipitación se realiza a un pH de 7,0. En una realización particular, la segunda etapa de precipitación se realiza usando una concentración final de etanol del 25±3% (v/v) a un pH de 7,0±0,3.

En una realización particular, el método comprende las etapas de: precipitar del 99% al 100% del contenido de IgG a partir de un plasma de agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de entre el 20% y el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; separar el primer precipitado del primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; precipitar IgG de la primera suspensión en una segunda etapa de precipitación, para formar un segundo precipitado que comprende IgG y un segundo sobrenadante que comprende al menos un contaminante; y recuperar IgG del segundo precipitado, formando de ese modo una composición de IgG enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, la IgG recuperada del segundo precipitado se enriquece adicionalmente. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la primera etapa de precipitación se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7.

En una realización específica, el método comprende las etapas de: precipitar del 99% al 100% del contenido de IgG de un plasma de agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de entre el 20% y el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; separar el primer precipitado del primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; precipitar IgG de la primera suspensión en una segunda etapa de precipitación mezclando etanol con la primera suspensión a una concentración final del 25±3% (v/v) a un pH de 7,0±0,3, para formar un segundo precipitado que comprende IgG y un segundo sobrenadante que comprende al menos un contaminante; y recuperar IgG del segundo precipitado, formando de ese modo una composición de IgG enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, la IgG recuperada del segundo precipitado se enriquece adicionalmente. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la primera etapa de precipitación se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7.

En una realización, el método comprende las etapas de: precipitar del 95% al 100% del contenido de IgG y A1PI a partir de una agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de entre el 20% y el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; retirar A1PI de la suspensión; recuperar la fracción soluble de la primera suspensión; precipitar IgG de la primera suspensión en una segunda etapa de precipitación, para formar un segundo precipitado que comprende IgG y un segundo sobrenadante que comprende al menos un contaminante; y recuperar IgG del segundo precipitado, formando de ese modo una composición de IgG enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, la IgG recuperada del segundo precipitado se enriquece adicionalmente. En una realización, la A1PI separada de la primera suspensión se enriquece adicionalmente. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la primera etapa de precipitación se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización preferida, entre el 99% y el 100% del contenido de IgG de la agrupación de Cohn se precipita en la primera etapa de precipitación.

En una realización específica, el método comprende las etapas de: precipitar del 95% al 100% del contenido de IgG y A1PI a partir de una agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de entre el 20% y el 30% % a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; retirar A1PI de la suspensión; recuperar la fracción soluble de la primera suspensión; precipitar IgG de la primera suspensión en una segunda etapa de precipitación mezclando etanol con la primera suspensión a una concentración final del 25±3% (v/v) a un pH de 7,0±0,3, para formar un segundo precipitado que comprende IgG y un segundo sobrenadante que comprende al menos un contaminante; y recuperar IgG del segundo precipitado, formando de ese modo una composición de IgG enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, la IgG recuperada del segundo precipitado se enriquece adicionalmente. En una realización, la A1PI separada de la primera suspensión se enriquece adicionalmente. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la primera etapa de precipitación se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización preferida, entre el 99% y el 100% del contenido de IgG de la agrupación de Cohn se precipita en la primera etapa de precipitación.

En otra realización, el método comprende las etapas de: precipitar del 99% al 100% del contenido de IgG y A1PI a partir de una agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de desde el 20% hasta el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; retirar la A1PI de la suspensión; recuperar la porción soluble de la primera suspensión; precipitar IgG a partir de la porción soluble de la primera suspensión en una segunda etapa de precipitación, para formar un segundo precipitado que comprende IgG y un segundo sobrenadante que comprende al menos un contaminante; y recuperar IgG del segundo precipitado, en el que del 80% al 100% del contenido de albúmina de la agrupación de Cohn está presente en el primer sobrenadante, formando de ese modo una composición de IgG enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, la IgG recuperada del segundo precipitado se enriquece adicionalmente. En una realización, la A1PI separada de la primera suspensión se enriquece adicionalmente. En otra realización, la albúmina presente en el primer sobrenadante se enriquece adicionalmente. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la primera etapa de precipitación se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización preferida, entre el 99% y el 100% del contenido de IgG de la agrupación de Cohn se precipita en la primera etapa de precipitación. En una realización preferida, entre el 90% y el 100% del contenido de albúmina de la agrupación de Cohn está presente en el primer sobrenadante.

En otra realización, el método comprende las etapas de: precipitar del 99% al 100% del contenido de IgG y A1PI a partir de una agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de desde el 20% hasta el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; retirar la A1PI de la suspensión; recuperar la porción soluble de la primera suspensión; precipitar IgG a partir de la porción soluble de la primera suspensión en una segunda etapa de precipitación mezclando etanol con la porción soluble de la primera suspensión a una concentración final del 25±3% (v/v) a un pH de 7,0±0,3, para formar un segundo precipitado que comprende IgG y un segundo sobrenadante que comprende al menos un contaminante; y recuperar IgG del segundo precipitado, en el que del 80% al 100% del contenido de albúmina de la agrupación de Cohn está presente en el primer sobrenadante, formando de ese modo una composición de IgG enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, la IgG recuperada del segundo precipitado se enriquece adicionalmente. En una realización, la A1PI separada de la primera suspensión se enriquece adicionalmente. En otra realización, la albúmina presente en el primer sobrenadante se enriquece adicionalmente. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la primera etapa de precipitación se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización preferida, entre el 99% y el 100% del contenido de IgG de la agrupación de Cohn se precipita en la primera etapa de precipitación. En una realización preferida, entre el 90% y el 100% del contenido de albúmina de la agrupación de Cohn está presente en el primer sobrenadante.

En una realización, la presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para preparar una composición de IgG enriquecida, comprendiendo el método las etapas de: precipitar del 95% al 100% del contenido de IgG y A1PI a partir de una agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de entre el 20% y el 30% a un pH de desde 5.0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; tratar la primera suspensión con dióxido de silicio finamente dividido; y separar la porción soluble de la suspensión de la porción insoluble de la suspensión, en el que la porción soluble de la suspensión contiene IgG y la porción insoluble de la suspensión contiene A1PI, fibrinógeno, factor H e IaIp, recuperando la porción soluble de la primera suspensión; precipitar IgG a partir de la porción soluble de la primera suspensión en una segunda etapa de precipitación, para formar un segundo precipitado que comprende IgG y un segundo sobrenadante que comprende al menos un contaminante; y recuperar IgG del segundo precipitado, formando de ese modo una composición de IgG enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, la IgG recuperada del primer precipitado se enriquece adicionalmente. En otra realización, la A1PI retirada de la suspensión se enriquece adicionalmente. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la primera etapa de precipitación se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización preferida, del 99% al 100% del contenido de IgG de la agrupación de Cohn se precipita en la primera etapa de precipitación. En una realización específica, las porciones soluble e insoluble de la primera suspensión se separan por filtración. En una realización, se añade SiO2 a una concentración final de 40±10 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1.

En una realización específica, la presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para preparar una composición de IgG enriquecida, comprendiendo el método las etapas de: precipitar del 95% al 100% del contenido de IgG y A1PI a partir de una agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de entre el 20% y el 30% a un pH de desde 5.0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; tratar la primera suspensión con dióxido de silicio finamente dividido; y separar la porción soluble de la suspensión de la porción insoluble de la suspensión, en el que la porción soluble de la suspensión contiene IgG y la porción insoluble de la suspensión contiene A1PI, fibrinógeno, factor H e IaIp, recuperando la porción soluble de la primera suspensión; precipitar IgG a partir de la porción soluble de la primera suspensión en una segunda etapa de precipitación mezclando etanol con la porción soluble de la primera suspensión a una concentración final del 25±3% (v/v) a un pH de 7,0±0,3, para formar un segundo precipitado que comprende IgG y un segundo sobrenadante que comprende al menos un contaminante; y recuperar IgG del segundo precipitado, formando de ese modo una composición de IgG enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, la IgG recuperada del primer precipitado se enriquece adicionalmente. En otra realización, la A1PI retirada de la suspensión se enriquece adicionalmente. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la primera etapa de precipitación se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización preferida, del 99% al 100% del contenido de IgG de la agrupación de Cohn se precipita en la primera etapa de precipitación. En una realización específica, las porciones soluble e insoluble de la primera suspensión se separan por filtración. En una realización, se añade SiO2 a una concentración final de 40±10 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1.

En una realización, la presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para preparar una composición de IgG enriquecida, comprendiendo el método las etapas de: precipitar del 95% al 100% del contenido de IgG y A1PI a partir de una agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de desde el 20% hasta el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; tratar la primera suspensión con dióxido de silicio finamente dividido; y separar la porción soluble de la suspensión de la porción insoluble de la suspensión, en el que la porción soluble de la suspensión contiene IgG y la porción insoluble de la suspensión contiene A1PI, fibrinógeno, factor H e IaIp; precipitar IgG a partir de la porción soluble de la primera suspensión en una segunda etapa de precipitación, para formar un segundo precipitado que comprende IgG y un segundo sobrenadante que comprende al menos un contaminante; y recuperar IgG del segundo precipitado, en el que del 80% al 100% del contenido de albúmina de la agrupación de Cohn está presente en el primer sobrenadante, formando de ese modo una composición de IgG enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, la IgG recuperada del segundo precipitado se enriquece adicionalmente. En otra realización, la A1PI presente en la porción insoluble de la suspensión se enriquece adicionalmente. En otra realización, el fibrinógeno presente en la porción insoluble de la suspensión se enriquece adicionalmente. En otra realización, el factor H presente en la porción insoluble de la suspensión se enriquece adicionalmente. En otra realización, la IaIp presente en la porción insoluble de la suspensión se enriquece adicionalmente. En aún otra realización, la albúmina que se encuentra en el primer sobrenadante se enriquece adicionalmente. En una realización preferida, del 99% al 100% del contenido de IgG de la agrupación de Cohn se precipita en la primera etapa de precipitación. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la primera etapa de precipitación se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización específica, las porciones soluble e insoluble de la primera suspensión se separan por filtración. En una realización, se añade SiO2 a una concentración final de 40±10 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1.

En una realización, la presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para preparar una composición de IgG enriquecida, comprendiendo el método las etapas de: precipitar del 95% al 100% del contenido de IgG y A1PI a partir de una agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de desde el 20% hasta el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; tratar la primera suspensión con dióxido de silicio finamente dividido; y separar la porción soluble de la suspensión de la porción insoluble de la suspensión, en el que la porción soluble de la suspensión contiene IgG y la porción insoluble de la suspensión contiene A1PI, fibrinógeno, factor H e IaIp; precipitar IgG a partir de la porción soluble de la primera suspensión en una segunda etapa de precipitación mezclando etanol con la porción soluble de la primera suspensión a una concentración final del 25±3% (v/v) a un pH de 7,0±0,3, para formar un segundo precipitado que comprende IgG y un segundo sobrenadante que comprende al menos un contaminante; y recuperar IgG del segundo precipitado, en el que del 80% al 100% del contenido de albúmina de la agrupación de Cohn está presente en el primer sobrenadante, formando de ese modo una composición de IgG enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, la IgG recuperada del segundo precipitado se enriquece adicionalmente. En otra realización, la A1PI presente en la porción insoluble de la suspensión se enriquece adicionalmente. En otra realización, el fibrinógeno presente en la porción insoluble de la suspensión se enriquece adicionalmente. En otra realización, el factor H presente en la porción insoluble de la suspensión se enriquece adicionalmente. En otra realización, la IaIp presente en la porción insoluble de la suspensión se enriquece adicionalmente. En aún otra realización, la albúmina que se encuentra en el primer sobrenadante se enriquece adicionalmente. En una realización preferida, del 99% al 100% del contenido de IgG de la agrupación de Cohn se precipita en la primera etapa de precipitación. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la primera etapa de precipitación se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización específica, las porciones soluble e insoluble de la primera suspensión se separan por filtración. En una realización, se añade SiO2 a una concentración final de 40±10 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1.

En una realización, las IgG se recuperan del segundo precipitado suspendiendo el precipitado con un tampón de extracción frío. Por ejemplo, el segundo precipitado se suspende en una razón de 1 parte de precipitado con respecto a 2-5 partes de agua para inyección (WFI) o tampón de baja conductividad. En una realización preferida, el segundo precipitado se suspende en una razón de 1 parte de precipitado con respecto a 4-5 partes, preferiblemente 3,5 partes, de WFI. En una realización, la etapa de suspensión se realiza a una temperatura de entre 0°C y 8°C. En una realización, el pH final de la disolución se ajusta a de 4,8 a 5,6, preferiblemente a 5,2±0,2. En una realización, este ajuste de pH se realiza con ácido acético. En una realización, la conductividad de la suspensión aumenta hasta entre 2,5 y 6,0 mS/cm para aumentar la solubilidad de la IgG. En una realización, la conductividad aumenta mediante la adición de cloruro de sodio.

Las disoluciones adecuadas para la extracción del segundo precipitado incluyen WFI y tampones de baja conductividad. En una realización, un tampón de baja conductividad tiene una conductividad de menos de aproximadamente 10 mS/cm. En otras realizaciones, el tampón de baja conductividad tiene una conductividad de menos de aproximadamente 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 mS/cm. En una realización preferida, el tampón de baja conductividad tiene una conductividad de menos de aproximadamente 6 mS/cm. En otra realización preferida, el tampón de baja conductividad tiene una conductividad de menos de aproximadamente 4 mS/cm. En otra realización preferida, el tampón de baja conductividad tiene una conductividad de menos de aproximadamente 2 mS/cm.

En una realización, la porción soluble de la primera suspensión, que contiene IgG, se separa de la porción insoluble. En una realización, esto se realiza filtrando la suspensión con un filtro de profundidad que tiene un tamaño de poro nominal de desde 0,1 |im hasta 0,4 |im. En una realización, el tamaño de poro nominal del filtro de profundidad es de 0,2 |im (por ejemplo, filtro Cuno VR06 o equivalente). En una realización, el filtro se lava con WFI o un tampón adecuado después de la filtración para recuperar IgG adicional y el lavado posterior se añade al filtrado. En una realización preferida, el lavado posterior del filtro se realiza usando una disolución de cloruro de sodio con una conductividad de entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 6,0 mS/cm. En otra realización, la segunda suspensión se centrifuga para recuperar la porción soluble.

En un aspecto de la presente invención, los métodos tal como se definen en las reivindicaciones proporcionados para preparar una composición de IgG enriquecida comprenden además purificar al menos un factor sanguíneo adicional a partir de la misma agrupación de Cohn. En una realización, los métodos comprenden además purificar al menos dos proteínas sanguíneas adicionales a partir de la misma agrupación de Cohn. En otra realización, los métodos comprenden además purificar al menos tres proteínas sanguíneas adicionales a partir de la misma agrupación de Cohn. En aún otras realizaciones, los métodos comprenden además purificar al menos cuatro, cinco, seis o más proteínas sanguíneas adicionales a partir de la misma agrupación de Cohn. Las proteínas sanguíneas a modo de ejemplo que pueden copurificarse a partir de la misma agrupación de Cohn que la IgG incluyen, sin limitación, albúmina, alfa-1-antitripsina (A1PI), factor H, proteínas inhibidoras inter-alfa (IaIp), complejos de protrombina, factor VII (FVII), factor VIII (FVIII), antitrombina III (ATIII), fibrinógeno, butirilcolinesterasa, y otras.

En una realización, la alfa-1-antitripsina (A1PI) se purifica adicionalmente a partir de la misma agrupación de Cohn que la IgG. En una realización específica, la A1PI se purifica a partir de la fracción insoluble de la primera suspensión.

En otra realización, el fibrinógeno se purifica adicionalmente a partir de la misma agrupación de Cohn que la IgG. En una realización específica, el fibrinógeno se purifica a partir de la fracción insoluble de la primera suspensión. En otra realización específica, tanto A1PI como fibrinógeno se purifican a partir de la fracción insoluble de la primera suspensión.

En otra realización, el factor H se purifica adicionalmente a partir de la misma agrupación de Cohn que la IgG. En una realización específica, el factor H se purifica a partir de la fracción insoluble de la primera suspensión. En otra realización específica, tanto A1PI como factor H se purifican a partir de la fracción insoluble de la primera suspensión.

En otra realización, las proteínas inhibidoras inter-alfa (IaIp) se purifican adicionalmente a partir de la misma agrupación de Cohn que la IgG. En una realización específica, la IaIp se purifica a partir de la fracción insoluble de la primera suspensión. En otra realización específica, tanto A1PI como IaIp se purifican a partir de la fracción insoluble de la primera suspensión.

En otra realización, la albúmina se purifica adicionalmente a partir de la misma agrupación de Cohn que la IgG. En una realización específica, la albúmina se purifica a partir del primer sobrenadante formado. En una realización específica, la albúmina se purifica a partir del primer sobrenadante formado, mientras que al menos un factor sanguíneo adicional se purifica a partir de la porción insoluble de la primera suspensión formada.

En una realización, las inmunoglobulinas recuperadas a partir de una etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol y pH bajo se enriquecen adicionalmente según un fraccionamiento de Kistler-Nitschmann o Deutsch et al. posterior. Por ejemplo, una composición de inmunoglobulina recuperada puede someterse a una etapa similar a una precipitación de Kistler-Nitschmann B o precipitación de p-globulina de Deutsch et al. Las condiciones usadas en estas etapas dan como resultado la precipitación de globulina a y p, mientras que la inmunoglobulina G permanece en el sobrenadante.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención proporciona un método tal como se define en las reivindicaciones para preparar una composición de inmunoglobulina G (IgG) enriquecida que comprende las etapas de (i) coprecipitar inmunoglobulinas y alfa-1-antitripsina (A1PI) a partir de una agrupación de Cohn en una precipitación inicial con alto contenido de alcohol y pH bajo; (ii) recuperar inmunoglobulinas del precipitado; (iii) precipitar al menos una proteína distinta de gamma-globulina a partir de la composición de inmunoglobulina recuperada del primer precipitado; y (iv) recuperar el sobrenadante de la segunda etapa de precipitación. En determinadas realizaciones, estos métodos pueden comprender además etapas de precipitación adicionales (por ejemplo, una precipitación de precipitado G), una etapa de intercambio aniónico y/o catiónico, una o más etapas de ultrafiltración/diafiltración y una o más etapas de reducción o inactivación de virus (por ejemplo, tratamiento S/D, nanofiltración, incubación a pH bajo, etc.).

V. Preparación de composiciones de alfa-1-antitripsina (A1PI)

Los métodos modernos para fabricar proteínas sanguíneas a partir de plasma donado derivan de los primeros trabajos realizados en las décadas de 1940 y 1950. Dado que este trabajo se centró principalmente en la purificación de albúmina e inmunoglobulinas gamma (IgG), los esquemas de fraccionamiento desarrollados no estaban optimizados para la recuperación de proteínas sanguíneas adicionales, que son cada vez más importantes desde el punto de vista terapéutico. Por ejemplo, el uso de una precipitación inicial con bajo contenido de alcohol y pH alto de plasma (por ejemplo, precipitación de la fracción I) da como resultado la pérdida parcial de factor H, IaIp y, en cierta medida, inmunoglobulinas en el precipitado de la fracción I. Además, la separación de inmunoglobulinas y A1PI lograda por etapas de precipitación posteriores (por ejemplo, la precipitación de la fracción II+NI o precipitación A) es incompleta, con pérdida de inmunoglobulinas en el sobrenadante debido a una precipitación incompleta y pérdida de A1PI en el precipitado debido a una precipitación parcial. Por consiguiente, son necesarios métodos de fraccionamiento actualizados que proporcionen mayores rendimientos de múltiples proteínas sanguíneas.

La presente invención proporciona métodos tal como se definen en las reivindicaciones que satisfacen estos requisitos mediante el uso de una etapa de precipitación inicial que fracciona inmunoglobulinas, A1PI y otras proteínas sanguíneas en un precipitado inicial y albúmina en un sobrenadante inicial. Esta precipitación inicial se realiza en condiciones de alto contenido de alcohol y pH bajo.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para la fabricación de alfa-1-antitripsina (A1PI) a partir de plasma combinado usando una etapa inicial que precipita la mayor parte del contenido de inmunoglobulina y A1PI a partir de una agrupación de Cohn. En una realización particular, esta etapa inicial es una etapa de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo. Tal como se muestra en los ejemplos proporcionados en el presente documento, se precipita más del 95% del contenido de A1PI de la agrupación de Cohn de partida en estas condiciones. Además, la presente divulgación proporciona métodos para separar eficazmente A1PI e inmunoglobulinas en esta precipitación inicial.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para preparar una composición de alfa-1-antitripsina (A1PI) enriquecida a partir de una agrupación de Cohn, comprendiendo el método las etapas de: coprecipitar inmunoglobulinas y A1PI a partir de una agrupación de Cohn, en una primera etapa de precipitación, para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; solubilizar las inmunoglobulinas presentes en el primer precipitado, para formar una primera suspensión que tiene una porción soluble que comprende inmunoglobulinas y una porción insoluble que comprende A1PI; separar las porciones soluble e insoluble de la primera suspensión; y recuperar A1PI de la porción insoluble de la primera suspensión, formando de ese modo una composición de A1PI enriquecida. En general, puede usarse cualquier medio químico para la precipitación de inmunoglobulinas y A1PI, incluyendo, pero sin limitarse a, precipitación con alcohol (por ejemplo, usando etanol o metanol), precipitación usando polímeros solubles en agua (por ejemplo, PEG o dextrano) y precipitación por adición de sal (por ejemplo, usando fosfato de amonio, sulfato de amonio, citrato de sodio, etc.). En una realización preferida, la precipitación es precipitación con alcohol, preferiblemente precipitación con etanol.

En una realización, la presente divulgación proporciona un método para preparar una composición de A1PI enriquecida mediante la precipitación de A1PI a partir de plasma desprovisto de crioprecipitado en una etapa de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo. En una realización específica, el método comprende las etapas de: precipitar A1PI a partir de plasma desprovisto de crioprecipitado en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol al plasma desprovisto de crioprecipitado hasta una concentración final de entre el 20% y el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; separar el primer precipitado del primer sobrenadante; y recuperar A1PI del primer precipitado, formando de ese modo una composición de A1PI enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, la A1PI recuperada del primer precipitado se enriquece adicionalmente.

En una realización, el método comprende las etapas de: precipitar A1PI a partir de una agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn a una concentración final y un pH seleccionados de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7, para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; separar el primer precipitado del primer sobrenadante; y recuperar A1PI del primer precipitado, formando de ese modo una composición de A1PI enriquecida. En una realización, la A1PI recuperada del primer precipitado se enriquece adicionalmente.

En una realización, la primera etapa de precipitación se realiza mezclando etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final de desde el 22% hasta el 28% (v/v) a un pH de entre 5,0 y 6,0. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En otra realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±2% (v/v). En otra realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±1% (v/v). En otra realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25% (v/v). Asimismo, en una realización, la primera etapa de precipitación se realiza a un pH de 5,5±0,5. En otra realización, la primera etapa de precipitación se realiza a un pH de 5,5±0,4. En otra realización, la primera etapa de precipitación se realiza a un pH de 5,5±0,3. En otra realización, la primera etapa de precipitación se realiza a un pH de 5,5±0,2. En otra realización, la primera etapa de precipitación se realiza a un pH de 5,5±0,1. En otra realización, la primera etapa de precipitación se realiza a un pH de 5,5. En aún otras realizaciones, la concentración final de etanol y el pH de la primera etapa de precipitación se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7.

Los métodos divulgados en el presente documento proporcionan rendimientos significativamente más altos de recuperación de A1PI en el producto enriquecido final debido a la precipitación de la mayor parte del contenido de A1PI de la agrupación de Cohn de partida en la reacción de precipitación inicial, en comparación con los procedimientos de purificación del estado de la técnica que se basan en etapas iniciales de precipitación con bajo contenido de alcohol (es decir, precipitación de la fracción I).

Por consiguiente, en una realización de los métodos divulgados en el presente documento, al menos el 80% del contenido de alfa-1-antitripsina (A1PI) de la agrupación de Cohn de partida se precipita en la reacción de precipitación inicial. En una realización preferida, al menos el 90% del contenido de A1PI de la agrupación de Cohn de partida se precipita en la reacción de precipitación inicial. En una realización más preferida, al menos el 95% del contenido de A1PI de la agrupación de Cohn de partida se precipita en la reacción de precipitación inicial. En una realización más preferida, al menos el 97% del contenido de A1PI de la agrupación de Cohn de partida se precipita en la reacción de precipitación inicial. En determinadas realizaciones, al menos el 80%, el 81%, el 82%, el 83%, el 84%, el 85%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más del contenido de A1PI de la agrupación de Cohn de partida se precipita en la reacción de precipitación inicial.

Tal como se muestra en los ejemplos proporcionados en el presente documento, el uso de una etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol y pH bajo (es decir, precipitación de la fracción I-IV-1) da como resultado la precipitación de al menos el 95% del contenido de A1PI de la agrupación de Cohn de partida. Por consiguiente, en una realización, la presente divulgación proporciona un método para preparar una composición de A1PI enriquecida, comprendiendo el método las etapas de: precipitar del 95% al 100% del contenido de A1PI a partir de una agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de entre el 20% y el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; separar el primer precipitado del primer sobrenadante; y recuperar A1PI del primer precipitado, formando de ese modo una composición de A1PI enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, la A1PI recuperada del primer precipitado se enriquece adicionalmente. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la etapa de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7.

En una realización, la presente divulgación proporciona un método para preparar una composición de A1PI enriquecida, comprendiendo el método las etapas de: precipitar del 95% al 100% del contenido de inmunoglobulina y A1PI a partir de una agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de entre el 20% y el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; solubilizar las inmunoglobulinas presentes en el primer precipitado, para formar una primera suspensión que tiene una porción soluble que comprende inmunoglobulinas y una porción insoluble que comprende A1PI; separar las porciones soluble e insoluble de la primera suspensión; y recuperar A1PI de la porción insoluble de la primera suspensión, formando de ese modo una composición de A1PI enriquecida. En una realización, las inmunoglobulinas recuperadas de la porción soluble de la primera suspensión se enriquecen adicionalmente. En otra realización, la A1PI retirada de la fracción insoluble de la primera suspensión se enriquece adicionalmente. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la etapa de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización preferida, del 99% al 100% del contenido de inmunoglobulina de la agrupación de Cohn se precipita en la primera etapa de precipitación.

En una realización, la presente divulgación proporciona un método para preparar una composición de A1PI enriquecida, comprendiendo el método las etapas de: precipitar del 95% al 100% del contenido de inmunoglobulina y A1PI a partir de una agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de desde el 20% hasta el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; solubilizar las inmunoglobulinas presentes en el primer precipitado, para formar una primera suspensión que tiene una porción soluble que comprende inmunoglobulinas y una porción insoluble que comprende A1PI; separar las porciones soluble e insoluble de la primera suspensión; y recuperar A1PI de la porción insoluble de la primera suspensión, en el que del 80% al 100% del contenido de albúmina de la agrupación de Cohn está presente en el primer sobrenadante, formando de ese modo una composición de A1PI enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, las inmunoglobulinas recuperadas de la porción soluble de la primera suspensión se enriquecen adicionalmente. En otra realización, la A1P i retirada de la porción insoluble de la primera suspensión se enriquece adicionalmente. En aún otra realización, la albúmina que se encuentra en el primer sobrenadante se enriquece adicionalmente. En una realización preferida, del 99% al 100% del contenido de inmunoglobulina de la agrupación de Cohn se precipita en la primera etapa de precipitación. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la etapa de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7.

En una realización, el primer precipitado se suspende en agua para inyección (WFI) o un tampón de baja fuerza iónica adecuado para extraer inmunoglobulinas del precipitado, luego se trata la suspensión con dióxido de silicio (SO2) finamente dividido, y se separa la porción soluble de la suspensión que contiene las inmunoglobulinas de la porción insoluble de la suspensión que contiene la mayor parte del contenido de A1PI.

Las disoluciones adecuadas para la extracción de inmunoglobulinas a partir del primer precipitado tendrán generalmente un pH de entre 4,0 y 5,5. En determinadas realizaciones, la disolución tendrá un pH de entre 4,5 y 5,0, en otras realizaciones, la disolución de extracción tendrá un pH de aproximadamente 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4 ó 5,5. En una realización preferida, el pH del tampón de extracción es de 4,7±0,1. En otra realización preferida, el pH del tampón de extracción es de 4,8±0,1. En otra realización preferida, el pH del tampón de extracción es de 4,9±0,1. En general, estos requisitos de pH pueden cumplirse usando un agente de tamponamiento seleccionado de, por ejemplo, acetato, citrato, fosfato monobásico, fosfato dibásico, mezclas de los mismos, y similares. Las concentraciones de tampón adecuadas oscilan normalmente de desde 5 hasta 100 mM, o de desde 10 hasta 50 mM, o 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ó 100 mM de agente de tamponamiento.

El tampón de extracción tendrá preferiblemente una conductividad de desde 0,5 mS/cm hasta 2,0 mS/cm. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, la conductividad del tampón de extracción será de 0,5±0,1 mS/cm, o 0,6±0,1, 0,7±0,1, 0,8±0,1, 0,9±0,1, 1,0±0,1, 1,1±0,1, 1,2±0,1, 1,3±0,1, 1,4±0,1, 1,5±0,1, 1,6±0,1, 1,7±0,1, 1,8±0,1, 1,9±0,1 ó 2,0±0,1 mS/cm. Un experto habitual en la técnica sabrá cómo generar tampones de extracción que tengan una conductividad apropiada. En una realización particular, el tampón de extracción contiene fosfato de sodio monobásico 5 mM y acetato 5 mM a un pH de 4,8±0,2 y una conductividad de desde 0,7 hasta 0,9 mS/cm.

En una realización, se añade sílice pirogénica antes de la separación (por ejemplo, filtración o centrifugación) a una concentración de entre 20 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1 y 100 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1. En otra realización, se añade sílice pirogénica a una concentración de entre 30 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1 y 80 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1. En determinadas realizaciones, la sílice pirogénica puede añadirse a una concentración de aproximadamente 20 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1, o de aproximadamente 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ó 100 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1. En una realización específica, se añade sílice pirogénica (por ejemplo, Aerosil 380 o equivalente) a la suspensión de la fracción I-IV-1 hasta una concentración final de 40±20 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1. En otra realización específica, se añade sílice pirogénica a la suspensión de la fracción I-IV-1 hasta una concentración final de 40±10 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1. El mezclado tiene lugar a de 2°C a 8°C durante al menos de 50 a 70 minutos.

Por consiguiente, en una realización, la presente divulgación proporciona un método para preparar una composición de A1PI enriquecida, comprendiendo el método las etapas de: precipitar del 95% al 100% del contenido de inmunoglobulina y A1PI a partir de una agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn a una concentración final de entre el 20% y el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; tratar la primera suspensión con dióxido de silicio finamente dividido; y separar la porción soluble de la suspensión de la porción insoluble de la suspensión, en el que la porción soluble de la suspensión contiene inmunoglobulinas y la porción insoluble de la suspensión contiene A1PI; y recuperar A1PI de la porción insoluble de la primera suspensión, formando de ese modo una composición de A1PI enriquecida. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, las inmunoglobulinas recuperadas del primer precipitado se enriquecen adicionalmente. En otra realización, la A1PI retirada de la suspensión se enriquece adicionalmente. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la etapa de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización preferida, del 99% al 100% del contenido de inmunoglobulina de la agrupación de Cohn se precipita en la primera etapa de precipitación. En una realización específica, las porciones soluble e insoluble de la primera suspensión se separan por filtración. En una realización, se añade S Ó a una concentración final de 40±10 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1.

En una realización, la presente divulgación proporciona un método para preparar una composición de A1PI enriquecida, comprendiendo el método las etapas de: precipitar del 95% al 100% del contenido de inmunoglobulina y A1PI a partir de una agrupación de Cohn en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol a la agrupación de Cohn hasta una concentración final de desde el 20% hasta el 30% a un pH de desde 5,0 hasta 6,0 para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; tratar la primera suspensión con dióxido de silicio finamente dividido; y separar la porción soluble de la suspensión de la porción insoluble de la suspensión, en el que la porción soluble de la suspensión contiene inmunoglobulinas y la porción insoluble de la suspensión contiene A1PI, fibrinógeno, factor H e IaIp, y además en el que del 80% al 100% del contenido de albúmina de la agrupación de Cohn está presente en el primer sobrenadante. En una realización, se mezcla etanol con la agrupación de Cohn hasta una concentración final del 25±3% (v/v). En una realización, las inmunoglobulinas presentes en la porción soluble de la suspensión se enriquecen adicionalmente. En otra realización, la A1PI presente en la porción insoluble de la suspensión se enriquece adicionalmente. En otra realización, el fibrinógeno presente en la porción insoluble de la suspensión se enriquece adicionalmente. En otra realización, el factor H presente en la porción insoluble de la suspensión se enriquece adicionalmente. En otra realización, la IaIp presente en la porción insoluble de la suspensión se enriquece adicionalmente. En aún otra realización, la albúmina que se encuentra en el primer sobrenadante se enriquece adicionalmente. En una realización preferida, del 99% al 100% del contenido de inmunoglobulina de la agrupación de Cohn se precipita en la primera etapa de precipitación. En determinadas realizaciones, la concentración final de etanol y el pH usados en la etapa de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo se seleccionan de las variaciones 1 a 2166, tal como se enumeran en la tabla 1, la tabla 2, la tabla 3, la tabla 4, la tabla 5, la tabla 6 y la tabla 7. En una realización específica, las porciones soluble e insoluble de la primera suspensión se separan por filtración. En una realización, se añade SiÜ2 a una concentración final de 40±10 g/kg de precipitado de la fracción I-IV-1.

En una realización, la porción soluble de la primera suspensión, que contiene IgG, se separa de la porción insoluble, que contiene A1PI, filtrando la suspensión con un filtro de profundidad que tiene un tamaño de poro nominal de desde 0,1 |im hasta 0,4 |im. En una realización, el tamaño de poro nominal del filtro de profundidad es de 0,2 |im (por ejemplo, filtro Cuno VR06 o equivalente). En una realización, el filtro se lava con WFI o un tampón adecuado después de la filtración para recuperar IgG adicional y el lavado posterior se añade al filtrado. En otra realización, la primera suspensión se centrifuga para separar las porciones soluble e insoluble.

En una realización, la A1PI se recupera a partir de la porción insoluble separada suspendiendo la porción insoluble en un tampón de extracción de A1PI. Por ejemplo, en una realización, la porción insoluble separada se suspende en una razón de 1 parte de material insoluble con respecto a 2-15 partes de agua para inyección (WFI) o tampón de baja conductividad, para formar una segunda suspensión. En otra realización, la porción insoluble separada se suspende en una razón de 1 parte de material insoluble con respecto a 2-10 partes de agua para inyección (WFI) o tampón de baja conductividad. En otra realización, la porción insoluble separada se suspende en una razón de 1 parte de material insoluble con respecto a 3-7 partes de agua para inyección (WFI) o tampón de baja conductividad. En aún otras realizaciones, la porción insoluble separada se suspende en una razón de 1 parte de material insoluble con respecto a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más partes de agua para inyección (WFI) o tampón de baja conductividad. En una realización, la extracción se agita durante al menos 2 horas. En otra realización, la extracción se agita durante al menos 4 horas. En otra realización, la extracción se agita durante al menos 8 horas. En otra realización, la extracción se agita durante de 6 a 12 horas. En una realización, la extracción se realiza a desde 10°C hasta 25°C. En otra realización, la extracción se realiza a 17±5°C. En otra realización, la extracción se realiza a 17±4°C. En otra realización, la extracción se realiza a 17±3°C. En otra realización, la extracción se realiza a 17±2°C. En otra realización, la extracción se realiza a 17±1°C. En una realización, la porción soluble que contiene A1PI se separa de la porción insoluble por filtración, por ejemplo, filtración profunda. En otra realización, la porción soluble que contiene A1PI se separa de la porción insoluble por centrifugación.

Las disoluciones adecuadas para la extracción de A1PI incluyen WFI y tampones de baja conductividad. En una realización, un tampón de baja conductividad tiene una conductividad de menos de aproximadamente 10 mS/cm. En otras realizaciones, el tampón de baja conductividad tiene una conductividad de menos de aproximadamente 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 mS/cm. En una realización preferida, el tampón de baja conductividad tiene una conductividad de menos de aproximadamente 6 mS/cm. En otra realización preferida, el tampón de baja conductividad tiene una conductividad de menos de aproximadamente 4 mS/cm. En otra realización preferida, el tampón de baja conductividad tiene una conductividad de menos de aproximadamente 2 mS/cm. En una realización, el WFI o tampón de baja conductividad tiene un pH de entre 8,0 y 9,5. En una realización particular, el pH del tampón de extracción de A1PI es de 8,8±0,5. En una realización específica, el pH del tampón de extracción de A1PI es 8,8±0,4. En una realización específica, el pH del tampón de extracción de A1PI es 8,8±0,3. En una realización específica, el pH del tampón de extracción de A1PI es 8,8±0,2. En una realización específica, el pH del tampón de extracción de A1PI es 8,8±0,1. En aún otras realizaciones, el pH del tampón de extracción de A1pI es de 8,0±0,2, 8,1±0,2, 8,2±0,2, 8,3±0,2, 8,4±0,2, 8,5±0,2, 8,6±0,2, 8,7±0,2, 8,8±0,2, 8,9 ±0,2, 9,0±0,2, 9,1±0,2, 9,2±0,2, 9,3±0,2, 9,4±0,2 ó 9,5±0,2.

En una realización, la porción insoluble separada de la primera suspensión se suspende en WFI o un tampón de baja fuerza iónica que no es adecuado para extraer A1PI para formar una suspensión intermedia, antes de la extracción usando un tampón de A1PI. En esta realización, el método comprende suspender la porción insoluble en WFI o un tampón de baja fuerza iónica a un pH de no más de 7,0; separar las porciones soluble e insoluble de la suspensión intermedia; y recuperar A1PI en la porción insoluble de la suspensión intermedia. En una realización, la suspensión intermedia se forma suspendiendo el material insoluble a una razón de 1 parte de material insoluble con respecto a 2­ 15 partes de WFI o tampón. En una realización, el WFI o tampón de baja fuerza iónica tiene un pH de desde 4,5 hasta 6,5. En otra realización, el tampón de baja fuerza iónica tiene un pH de 5,5±0,4. En otra realización, el tampón de baja fuerza iónica tiene un pH de 5,5±0,3. En otra realización, el tampón de baja fuerza iónica tiene un pH de 5,5±0,2. En otra realización, el tampón de baja fuerza iónica tiene un pH de 5,5±0,1. En aún otras realizaciones, el tampón de baja fuerza iónica tiene un pH de 4,5±0,2, 4,6±0,2, 4,7±0,2, 4,8±0,2, 4,9±0,2, 5,0±0,2, 5,1±0,2, 5,2±0,2, 5,3±0,2, 5,4±0,2, 5,5±0,2, 5,6±0,2, 5,7±0,2, 5,8±0,2, 5,9±0,2, 6,0±0,2, 6,1±0,2, 6,2±0,2, 6,3±0,2, 6,4±0,2 ó 6,5±0,2. En una realización, la porción soluble se separa de la porción insoluble que contiene A1PI por filtración, por ejemplo, filtración profunda. En otra realización, la porción soluble se separa de la porción insoluble que contiene A1PI por centrifugación.

En una realización, la A1PI extraída a partir de la porción insoluble de la primera suspensión se enriquece adicionalmente según métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo, sin limitación: cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), cromatografía de hidroxiapatita (HAP), cromatografía de afinidad con proteína A, cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía de exclusión molecular, etc.); filtración (por ejemplo, ultrafiltración y/o diafiltración); y una o más etapas de reducción de virus (por ejemplo, nanofiltración, tratamiento con disolventes y detergentes, irradiación UV, tratamiento térmico, incubación a pH bajo, etc.).

En una realización, la A1PI extraída a partir de la porción insoluble de la primera suspensión se enriquece adicionalmente por fraccionamiento. En general, puede usarse cualquier método de fraccionamiento (por ejemplo, precipitación con alcohol o polímero, precipitación por adición de sal, etc.). En una realización preferida, la composición se enriquece adicionalmente precipitando A1PI a partir de la disolución extraída clarificada usando un catión divalente, preferiblemente zinc. En una realización, se añade cloruro de zinc a la disolución hasta una concentración final de desde 1 mM hasta 15 mM. En una realización específica, se añade cloruro de zinc a la disolución hasta una concentración final de desde 1 mM hasta 4 mM. En una realización más específica, se añade cloruro de zinc a la disolución hasta una concentración final de desde 2,0 mM hasta 3,0 mM.

En determinadas realizaciones, la A1PI se enriquece adicionalmente según métodos de purificación conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos en el documento WO 1995/35306, el documento WO 1998/00154 y las patentes estadounidenses n.os 5.981.715; 7.807.435; y 7.879.800.

VI. Composiciones farmacéuticas

La invención proporciona una composición obtenida directamente mediante un método tal como se reivindica.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona composiciones de proteínas derivadas de plasma que se preparan según cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. En determinadas realizaciones, estas composiciones se formularán para administración farmacéutica (es decir, composiciones farmacéuticas).

En una realización, la presente divulgación proporciona una composición de proteínas derivadas de plasma preparada mediante un método que comprende las etapas de: coprecipitar inmunoglobulinas y alfa-1-antitripsina (A1PI) a partir de una agrupación de Cohn, en una primera etapa de precipitación, para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; solubilizar inmunoglobulinas de la primera suspensión para formar una porción soluble de la suspensión que comprende inmunoglobulinas y una porción insoluble de la suspensión que comprende A1PI, fibrinógeno, factor H e IaIp; y separar la porción soluble de la suspensión de la porción insoluble de la suspensión. En determinadas realizaciones, la composición comprende una proteína derivada de plasma que se selecciona de una inmunoglobulina (Ig), albúmina, alfa-1-antitripsina (A1PI), butirilcolinesterasa, factor H, una proteína del sistema del complemento y una proteína inhibidora de inter-alfa-tripsina (IaI).

En general, puede usarse cualquier medio químico para la precipitación de inmunoglobulinas y A1PI, incluyendo, pero sin limitarse a, precipitación con alcohol (por ejemplo, usando etanol o metanol), precipitación usando polímeros solubles en agua (por ejemplo, PEG o dextrano) y precipitación por adición de sal (por ejemplo, usando fosfato de amonio, sulfato de amonio, citrato de sodio, etc.). En una realización preferida, la precipitación es precipitación con alcohol, preferiblemente precipitación con etanol.

En una realización, la composición se formula para administración farmacéutica. En una realización específica, la composición se formula para administración intravenosa. En otra realización específica, la composición se formula para administración intramuscular. En otra realización, la composición se formula para administración subcutánea. En aún otra realización, la composición se formula para administración intraocular.

En una realización, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento se preparan mediante la formulación de una composición de proteínas derivadas de plasma aislada usando un método proporcionado en el presente documento. En general, la composición formulada se habrá sometido a al menos una, preferiblemente al menos dos, lo más preferiblemente al menos tres, etapas de inactivación o eliminación de virus. Los ejemplos no limitativos de etapas de inactivación o eliminación de virus que pueden emplearse con los métodos proporcionados en el presente documento incluyen tratamiento con disolventes y detergentes (Horowitz et al., Blood Coagul fibrinogenolysis 1994 (5 Supl 3):S21-S28 y Kreil et al., Transfusion 2003 (43):1023-1028), nanofiltración (Hamamoto et al., Vox Sang 1989 (56) 230-236 y Yuasa et al., J Gen Virol. 1991 (72 (parte 8)): 2021-2024) e incubación a pH bajo y altas temperaturas (Kempf et al., Transfusion 1991 (31) 423-427 y Louie et al., Biologicals 1994 (22): 13-19). En determinadas realizaciones, la composición comprende una proteína derivada de plasma que se selecciona de una inmunoglobulina (Ig), albúmina, alfa-1-antitripsina (A1PI), butirilcolinesterasa, factor H, una proteína del sistema del complemento y una proteína inhibidora de inter-alfa-tripsina (IaI).

En una realización, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento comprenderán uno o más agentes de tamponamiento o agentes estabilizantes del pH adecuados para administración intravenosa, subcutánea, intramuscular y/o intraocular. Los ejemplos no limitativos de agentes de tamponamiento adecuados para formular una composición de proteínas derivadas de plasma proporcionada en el presente documento incluyen glicina, citrato, fosfato, acetato, glutamato, tartrato, benzoato, lactato, histidina u otros aminoácidos, gluconato, malato, succinato, formiato, propionato., carbonato o cualquier combinación de los mismos ajustados a un pH apropiado. En general, el agente de tamponamiento será suficiente para mantener un pH adecuado en la formulación durante un periodo de tiempo prolongado. En una realización preferida, el agente de tamponamiento es glicina. En determinadas realizaciones, la composición comprende una proteína derivada de plasma que se selecciona de una inmunoglobulina (Ig), albúmina, alfa-1-antitripsina (A1PI), butirilcolinesterasa, factor H, una proteína del sistema del complemento y una proteína inhibidora de inter-alfa-tripsina (IaI).

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento pueden comprender además opcionalmente un agente para ajustar la osmolaridad de la composición. Los ejemplos no limitativos de agentes de ajuste de la osmolaridad incluyen manitol, sorbitol, glicerol, sacarosa, glucosa, dextrosa, levulosa, fructosa, lactosa, polietilenglicoles, fosfatos, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, gluconoglucoheptonato de calcio, dimetilsulfona, y similares.

Normalmente, las formulaciones proporcionadas en el presente documento tendrán osmolaridades que son comparables a la osmolaridad fisiológica, de aproximadamente 285 a 295 mOsmol/kg (Lacy et al., Drug Information Handbook - Lexi-Comp 1999:1254). En determinadas realizaciones, la osmolaridad de la formulación estará entre aproximadamente 200 mOsmol/kg y aproximadamente 350 mOsmol/kg, preferiblemente entre aproximadamente 240 y aproximadamente 300 mOsmol/kg. En realizaciones particulares, la osmolaridad de la formulación será de aproximadamente 200 mOsmol/kg, o de 210 mOsmol/kg, 220 mOsmol/kg, 230 mOsmol/kg, 240 mOsmol/kg, 245 mOsmol/kg, 250 mOsmol/kg, 255 mOsmol/kg, 260 mOsmol/kg, 265 mOsmol/kg, 270 mOsmol/kg, 275 mOsmol/kg, 280 mOsmol/kg, 285 mOsmol/kg, 290 mOsmol/kg, 295 mOsmol/kg, 300 mOsmol/kg, 310 mOsmol/kg, 320 mOsmol/kg, 330 mOsmol/kg, 340 mOsmol/kg, 340 mOsmol/kg o 350 mOsmol/kg.

Las formulaciones derivadas de plasma proporcionadas en el presente documento son generalmente estables en forma líquida durante un periodo de tiempo prolongado. En determinadas realizaciones, las formulaciones son estables durante al menos aproximadamente 3 meses a temperatura ambiente, o al menos aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23 ó 24 meses a temperatura ambiente. La formulación también será generalmente estable durante 6 o al menos aproximadamente 18 meses en condiciones de refrigeración (normalmente entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 8°C), o durante al menos aproximadamente 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42 ó 45 meses en condiciones de refrigeración.

VII. Método de tratamiento

En un aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para tratar una enfermedad o un trastorno asociado con una deficiencia o disfunción de proteínas sanguíneas en un sujeto que lo necesita mediante la administración de una dosis terapéuticamente eficaz de una proteína derivada de plasma preparada según un método proporcionado en el presente documento. En determinadas realizaciones, la composición comprende una proteína derivada de plasma que se selecciona de una inmunoglobulina (Ig), albúmina, alfa-1-antitripsina (A1PI), butirilcolinesterasa, factor H, una proteína del sistema del complemento y una proteína inhibidora de inter-alfa-tripsina (IaI).

En un aspecto, la presente divulgación proporciona el uso de una composición de proteínas derivadas de plasma preparada según un método proporcionado en el presente documento para la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de una afección asociada con una deficiencia o disfunción de proteínas sanguíneas. En determinadas realizaciones, la proteína derivada de plasma se selecciona de una inmunoglobulina (Ig), albúmina, alfa-1 -antitripsina (A1PI), butirilcolinesterasa, factor H, una proteína del sistema del complemento y una proteína inhibidora de inter-alfa-tripsina (IaI).

En una realización, la composición de proteínas derivadas de plasma se prepara mediante un método que comprende las etapas de: coprecipitar inmunoglobulinas y alfa-1-antitripsina (A1PI) a partir de una agrupación de Cohn, en una primera etapa de precipitación, para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante; suspender el primer precipitado para formar una primera suspensión; solubilizar inmunoglobulinas de la primera suspensión para formar una porción soluble de la suspensión que comprende inmunoglobulinas y una porción insoluble de la suspensión que comprende A1PI, fibrinógeno, factor H e IaIp; y separar la porción soluble de la suspensión de la porción insoluble de la suspensión. En determinadas realizaciones, la composición comprende una proteína derivada de plasma que se selecciona de una inmunoglobulina (Ig), albúmina, alfa-1-antitripsina (A1PI), butirilcolinesterasa, factor H, una proteína del sistema del complemento y una proteína inhibidora de inter-alfa-tripsina (IaI).

VIII. Ejemplos

Ejemplo 1 - NG2 C91

Las composiciones de inmunoglobulina G (IgG) se fabrican comercialmente mediante el fraccionamiento de plasma a través de una serie de reacciones de precipitación. En una metodología habitual, las impurezas se eliminan por precipitación de un plasma desprovisto de crioprecipitado que contiene inmunoglobulina en una primera etapa de precipitación con alcohol. A continuación, las inmunoglobulinas IgG se precipitan a partir del sobrenadante resultante y posteriormente se enriquecen adicionalmente. En un intento por aumentar el rendimiento de IgG recuperada del plasma humano durante el fraccionamiento con alcohol, se sometieron a prueba valores de pH de desde 5,5 hasta 7,0 y concentraciones de etanol de desde el 20% hasta el 25% en las reacciones de precipitación de IgG.

Brevemente, el sobrenadante de la fracción I, se formó un producto intermedio usado en la fabricación comercial de inmunoglobulina G (IgG) derivada de plasma, alfa-1-antitripsina (A1PI) y productos de albúmina mezclando etanol a una concentración final del 8% (v/v) con plasma desprovisto de crioprecipitado a pH 7,2±0,2, incubando la mezcla a 0°C y separando el precipitado formado (fracción I) del sobrenadante (sobrenadante de la fracción I). A continuación, se dividió el sobrenadante de la fracción I resultante en alícuotas para dar muestras de 600 g. Se ajustó el pH de las muestras individuales a desde 5,5 hasta 7,0 y se mezcló etanol hasta una concentración final de desde el 20% hasta el 25%, tal como se muestra en la tabla 9.

Tal como se indica en la tabla 9, condiciones similares a las usadas para preparar un precipitado de fracción II+III de Cohn tradicional (etanol al 25%; pH 6,8) y el precipitado de fracción II+III modificado usado en la fabricación de GAMMAGARD LIQUID® (Baxter International; Deerfield, IL) dan como resultado una pérdida del 2,9% y del 6,7% de IgG total en el sobrenadante, debido a una precipitación incompleta. Sin embargo, se halló que reduciendo el pH de la reacción hasta 6,0 o menos y usando una concentración final de etanol de al menos el 22,5%, la pérdida de IgG se reduce significativamente. Por ejemplo, el uso de alcohol al 22,5% a pH 5,5 dio como resultado la pérdida de sólo el 0,4% de IgG total en el sobrenadante. De manera similar, el uso de alcohol al 25% a pH 6,0 ó 5,5 dio como resultado la pérdida de sólo el 0,5% y el 0,1% de IgG total en el sobrenadante. Tal como se indica en la tabla 10, esto equivale a un aumento de más de 300 mg de IgG/l de plasma y 125 mg de IgG/l de plasma en el precipitado en comparación con los precipitados de fracción II+III tradicionales y modificados, respectivamente.

Tabla 9. Rendimiento de proteínas en el sobrenadante de precipitación, expresado como porcentaje del contenido de proteínas del material de partida (sobrenadante de la fracción I).

Tabla 10. Rendimiento de proteínas en el sobrenadante de precipitación, expresado como g/l de plasma.

Ejemplo 2 - NG2 C96

Se llevó a cabo una comparación experimental de los esquemas de purificación de IgG realizados con y sin una precipitación inicial con etanol al 8% para determinar si pueden obtenerse aumentos adicionales en la recuperación de IgG usando una precipitación con alto contenido de etanol (25%) y pH bajo (5,5), tal como se describe en el ejemplo 1.

Brevemente, se procesaron 100 kg de plasma desprovisto de crioprecipitado con (NG2C96/1) o sin (NG2C96/2) una etapa de precipitación inicial (fracción I) realizada usando una concentración final de etanol al 8% (v/v) a pH 7,4 y 0°C. Se ajustó el pH del plasma desprovisto de crioprecipitado (NG2C96/1) o del sobrenadante de la fracción I (NG2C96/2) a pH 5,5±0,1 y se mezcló etanol hasta una concentración final del 25% (v/v). Luego se incubaron las mezclas a -5±2°C durante 5 horas para permitir la precipitación de proteínas. Los precipitados resultantes (precipitado (I)+M+MI) y los sobrenadantes (sobrenadante (I)+N+NI) se separaron por centrifugación. Debido al tamaño de las reacciones de precipitación, se requirieron dos centrifugaciones para cada reacción. Los precipitados resultantes de cada centrifugación se procesaron por separado.

Los precipitados se suspendieron en tampón que contenía fosfato de monosodio 5 mM, acetato de sodio 5 mM y ácido acético glacial 600 mg/l a una razón de 1 parte de precipitado con respecto a 15 partes de tampón, se ajustó el pH a 4,8±0,2 y se agitó para extraer las proteínas durante 2 horas a entre 4°C y 8°C. Después de la incubación de extracción, se mezclaron 40 g de sílice pirogénica (SiO2)/kg de precipitado (I)+N+NI en las reacciones y se agitó durante 50 minutos a entre 4°C y 8°C. Luego se mezclaron 400 g de auxiliar de filtración Cellpure/kg de precipitado (I)+N+NI y se filtraron las reacciones a través de membranas Cuno 50SA para retirar el material insoluble, formando un filtrado (I)+M+MI y una torta de filtración. La torta de filtración se lavó con tampón que contenía fosfato de monosodio 5 mM, acetato de sodio 5 mM y ácido acético glacial 150 mg/l, cuyo filtrado se añadió al filtrado (I)+N+IN.

Se añadió polisorbato 80 a los filtrados hasta una concentración final del 0,2% (p/p) y se incubaron las disoluciones durante 30 minutos. Luego se añadió citrato de sodio dihidratado a las disoluciones hasta una concentración final del 0,8% (p/p) y se incubó la disolución durante 30 minutos adicionales. Después de la segunda incubación, se ajustó el pH de la disolución a 7,0 usando hidróxido de sodio y se mezcló con etanol hasta una concentración final del 25%. Se redujo la temperatura hasta entre 0°C y -10°C para permitir la precipitación. El precipitado (PptG) y el sobrenadante (sobrenadante de PptG) se separaron por centrifugación.

Se determinó el contenido de inmunoglobulinas IgG, IgA e IgM de cada subetapa de las reacciones de purificación. Tal como se muestra en la tabla 11, la eliminación de la etapa de precipitación inicial de la fracción I dio como resultado un rendimiento significativamente más alto de IgG en la composición final (compárese NG2C96/2 disuelto en PptG (sin precipitación de la fracción I) con NG2C96/1 (con precipitación de la fracción I). Asimismo, el contenido de IgA (tabla 12) e IgM (tabla 13) de la fracción de PptG disuelto se formó sin la etapa de precipitación inicial de la fracción I.

En particular, la etapa de precipitación de la fracción I se usa en parte para retirar el fibrinógeno de las composiciones que contienen inmunoglobulina. Aunque el contenido final de fibrinógeno de la fracción de PptG disuelto formada sin la etapa de precipitación inicial de la fracción I es aproximadamente 6 veces mayor que el contenido de la fracción de PptG formada con la etapa de precipitación inicial de la fracción I, el esquema de fraccionamiento retira más del 99% del contenido de fibrinógeno presente en el material de partida de plasma desprovisto de crioprecipitado (tabla 14). Tabla 11. Contenido de IgG, expresado como g/l de plasma de partida, de las diversas fracciones formadas durante el fraccionamiento del plasma usando una reacción de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo con y sin una etapa de precipitación inicial de la fracción I con etanol al 8%.

Tabla 12. Contenido de IgA, expresado como g/l de plasma de partida, de las diversas fracciones formadas durante el fraccionamiento del plasma usando una reacción de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo con y sin una etapa de precipitación inicial de la fracción I con etanol al 8%.

Tabla 13. Contenido de IgM, expresado como g/l de plasma de partida, de las diversas fracciones formadas durante el fraccionamiento del plasma usando una reacción de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo con y sin una etapa de precipitación inicial de la fracción I con etanol al 8%.

Tabla 14. Contenido de fibrinógeno, expresado como g/l de plasma de partida, de las diversas fracciones formadas durante el fraccionamiento del plasma usando una reacción de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo con y sin una etapa de precipitación inicial de la fracción I con etanol al 8%.

Ejemplo 3 - NG2 C99

Para explorar adicionalmente el uso de una precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo en lugar de las etapas tradicionales de fracción de alcohol de Cohn-Oncley y Kistler-Nitschmann previas (es decir, fracción I y II de Cohn; fracción I y II+IN de Cohn; o etanol al 8-10% de Kistler Nitschmann, precipitado A y precipitado B), se combinaron los precipitados PptG NG2C96/2 y NG2C96/2B y se enriquecieron adicionalmente con inmunoglobulinas IgG.

Brevemente, los precipitados PptG NG2C96/2 y NG2C96/2B combinados se suspendieron en agua para inyección (WFI) ajustada a pH 4,75±0,75 con ácido acético y una conductividad de 4,5±1,5 mS/cm con cloruro de sodio. Se añadió auxiliar de filtración y se filtró la suspensión a través de membranas Cuno VR06 para formar un filtrado de PptG clarificado (VR06). A continuación, se trató el filtrado clarificado con disolventes y detergentes (tratamiento S/D) según procedimientos convencionales.

El filtrado sometido a tratamiento S/D se cargó en una columna CM Sepharose equilibrada con tampón que contenía acetato de sodio 10 mM (pH 5,0) y se recogió la fracción no retenida (CM D/N). A continuación, se lavó la columna con tampón que contenía acetato de sodio 10 mM (pH 5,5) y se recogió el lavado (CM W). Las inmunoglobulinas se eluyeron de la columna usando un tampón de elución que contenía fosfato de monosodio 55 mM y TRIS 10 mM (pH 8,5). El eluato se recogió en tres fracciones: fracción 1 (CM E-VL) que incluye la primera porción del eluato que tiene una DO280 de menos de 100 mUA; fracción 2 (CM E) que incluye el pico del eluato que tiene una DO280 de más de 100 mUA en el lado adelantado del pico de elución y una DO280 de más de 400 mUA en el lado atrasado del pico de elución; y fracción 3 (CM E-NL) que incluye la porción del eluato en el lado atrasado del pico que tiene una DO280 de menos de 400 mUA.

El pH y la conductividad del eluato de la fracción 2 se ajustaron a 6,4 y 2,3 mS/cm usando ácido acético glacial y agua para inyección (WFI), respectivamente. El eluato de la fracción 2 se cargó luego en una resina de intercambio aniónico de flujo rápido ANX Sepharose equilibrada con tampón que contenía fosfato de monosodio 15 mM (pH 6,4) a una concentración de carga de 100 mg de proteína/ml de resina. Se recogió la fracción no retenida de intercambio aniónico que contenía la mayor parte de las IgG (ANX D/N). La proteína que se une a la resina de intercambio aniónico se eluyó de la columna usando una disolución que contenía cloruro de sodio 2 M (ANX NaCl 2 M).

Se añadió glicina a la fracción no retenida de intercambio aniónico y se sometió a ultrafiltración y diafiltración (UF/DF) la muestra usando un dispositivo Pellicon® 2 Mini (Millipore) frente a disolución que contenía glicina 0,25 M (pH 5,2) hasta lograr una concentración de proteína del 5%. La disolución de inmunoglobulina se concentró adicionalmente hasta una concentración final de proteína del 10% y el pH se ajustó a 4,5 (diaconcentrado). A continuación, la disolución de inmunoglobulina al 10% se filtró en condiciones estériles usando un dispositivo Millipak 20 (Millipore) para formar la composición final de inmunoglobulina (recipiente final).

Se determinó el perfil bioquímico para cada subetapa de la reacción de purificación (tabla 15 y tabla 16). Tal como se muestra en los datos, la composición final contenía sólo niveles bajos de proteínas distintas de IgG, dentro de los parámetros aceptables para administración farmacéutica.

Tabla 15. Caracterización bioquímica de las diversas fracciones formadas durante el fraccionamiento del plasma usando una reacción de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo sin una etapa de precipitación inicial de la fracción I con etanol al 8%.

Tabla 16. Caracterización bioquímica adicional de las diversas fracciones formadas durante el fraccionamiento del plasma usando una reacción de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo sin una etapa de precipitación inicial de la fracción I con etanol al 8%.

Ejemplo 4 - NG2 C100

Para validar el uso de una precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo sin una etapa de precipitación inicial con bajo contenido de alcohol para retirar el fibrinógeno, se fraccionaron y enriquecieron 200 kg de plasma desprovisto de crioprecipitado tal como se describe para la muestra NG2C96/2 en los ejemplos 2 y 3, con un par de alteraciones en el procedimiento. En primer lugar, se realizó la etapa de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo (precipitación de I-IV1) usando etanol al 25% a pH 5,1, en lugar de 5,5. En segundo lugar, el precipitado de I-IV1 suspendido se trató con 33 g de sílice pirogénica (SiO2)/kg precipitado de I-IV1, en lugar de 40 g de SiO2/kg de precipitado. En tercer lugar, el eluato de intercambio catiónico CM se cargó en la resina de intercambio aniónico ANX a una concentración de 150 mg de proteína/ml de resina ANX, en lugar de 100 mg/ml de resina ANX. Finalmente, la fracción no retenida de intercambio aniónico filtrado a través de Cuno VR06 se hizo pasar a través de un dispositivo PLANOVA® 35N (Asahi Kasei Medical Co., Ltd.; Tokio, Japón) para realizar una etapa de nanofiltración antes de la ultra/diafiltración.

Se determinó el contenido de IgG de cada etapa de la purificación y los resultados se proporcionan en la tabla 17. En comparación con el rendimiento promedio de IgG para el procedimiento de fabricación de GAMMAGARD LIQUID® (3,7 g de IgG/l de plasma fuente), el método de purificación usado en este ejemplo da como resultado un rendimiento significativamente más alto de 4,4 g de IgG/l de plasma fuente. Esto representa casi un 20% de aumento en el rendimiento de IgG. La caracterización bioquímica de la composición final de IgG se notifica en la tabla 10. Tal como se observa en la tabla, la composición final de IgG tiene una pureza superior al 99% y el contenido de monómero/dímero de IgG es superior al 99,8%. El recipiente final contiene sólo trazas de impurezas, cuyos niveles están dentro de las normas regulatorias.

Tabla 17. Contenido de IgG de las fracciones formadas durante el enriquecimiento a partir de plasma desprovisto de crioprecipitado usando una etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol y pH bajo.

Tabla 18. Caracterización bioquímica de la composición final de IgG enriquecida a partir de 200 l de plasma desprovisto de crioprecipitado usando una etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol y pH bajo.

Ejemplo 5 - P02910NG2

Para comparar el efecto de hacer pasar el eluato de intercambio catiónico CM a través de una columna de intercambio aniónico ANX a concentraciones de carga de 100 g de proteína/ml de resina ANX y 150 g de proteína/ml de resina ANX, se fraccionaron 200 l de plasma desprovisto de crioprecipitado mediante una etapa de precipitación con alto contenido de alcohol (25%) y bajo pH (5,4) y se procesaron para formar un precipitado de PptG tal como se describe para la muestra NG2C96/2 en los ejemplos 2 y 3. Se determinó el contenido de IgG, IgA e IgM de las fracciones anteriores formadas, y se notifican en la tabla 19, la tabla 20 y la tabla 21, respectivamente.

El precipitado de PptG resultante se dividió en dos muestras de 1,8 kg, que se enriquecieron hasta el recipiente final tal como se describe para la muestra NG2C96/2 en los ejemplos 2 y 3, excepto que una muestra se hizo pasar a través de la resina de intercambio aniónico ANX a una concentración de carga de 100 mg de proteína/ml de resina ANX (P03010NG2) y la otra se hizo pasar a través de la resina de intercambio aniónico ANX a una concentración de carga de 150 mg de proteína/ml de resina ANX (P03110NG2).

Se determinó el contenido de IgG de cada etapa de enriquecimiento posterior de las purificaciones y los resultados se proporcionan en la tabla 22 y la tabla 23. En comparación con el rendimiento promedio de IgG para el procedimiento de fabricación de GAMMAGARD LIQUID® (3,7 g de IgG/l de plasma fuente), los métodos de purificación usados en este ejemplo dan como resultado rendimientos significativamente más altos de 4,3 g de IgG/l de plasma fuente. Esto representa un aumento del 16% en el rendimiento de IgG. Las caracterizaciones bioquímicas de las composiciones finales de IgG se notifican en la tabla 16 y la tabla 17. Tal como se observa en las tablas, las composiciones finales de IgG tienen una pureza superior al 99% y los contenidos de monómero/dímero de IgG son superiores al 99,8%. El recipiente final contiene sólo trazas de impurezas, cuyos niveles están dentro de las normas regulatorias.

Tabla 19. Contenido de IgG de las fracciones anteriores formadas durante el fraccionamiento del plasma usando una reacción de precipitación inicial con alto contenido de alcohol (etanol al 25%) y pH bajo (5,4).

ELISA

Tabla 20. Contenido de IgA de las fracciones anteriores formadas durante el fraccionamiento del plasma usando una reacción de precipitación inicial con alto contenido de alcohol (etanol al 25%) y pH bajo (5,4).

Tabla 21. Contenido de IgM de las fracciones anteriores formadas durante el fraccionamiento del plasma usando una reacción de precipitación inicial con alto contenido de alcohol (etanol al 25%) y pH bajo (5,4).

Tabla 22. Contenido de IgG de las fracciones posteriores formadas durante el fraccionamiento del plasma usando una reacción de precipitación inicial con alto contenido de alcohol (etanol al 25%) y pH bajo (5,4) y una concentración de carga de intercambio aniónico ANX de 100 mg/ml de resina a Nx (P03010NG2).

Tabla 23. Contenido de IgG de las fracciones posteriores formadas durante el fraccionamiento del plasma usando una reacción de precipitación inicial con alto contenido de alcohol (etanol al 25%) y pH bajo (5,4) y una concentración de carga de intercambio aniónico ANX de 150 mg/ml de resina ^a N^x (P03110NG2).

Tabla 24. Caracterización bioquímica de la composición final de IgG enriquecida a partir de plasma desprovisto de crioprecipitado usando una reacción de precipitación inicial con alto contenido de alcohol (etanol al 25%) y pH bajo (5,4) y una concentración de carga de intercambio aniónico ANX de 100 mg/ml de resina ANX (P03010NG2).

Tabla 25. Caracterización bioquímica de la composición final de IgG enriquecida a partir de plasma desprovisto de crioprecipitado usando una reacción de precipitación inicial con alto contenido de alcohol (etanol al 25%) y pH bajo (5,4) y una concentración de carga de intercambio aniónico ANX de 150 mg/ml de resina ANX (P03110NG2).

Ejemplo 6 - NG2 C107B

Se investigó la viabilidad de extraer alfa-1 -antitripsina (A1PI) a partir de la porción insoluble de un precipitado con alto contenido de alcohol y pH bajo usado en la fabricación de inmunoglobulinas IgG. Brevemente, en primer lugar se suspendieron dos muestras de 500 kg (n.° 1 y n.° 3) de la torta de filtración insoluble formada durante la filtración del precipitado de la fracción I-IV-1 extraído en 2,8 partes de agua (p/p) a 7±2°C y se ajustó el pH de las muestras a 5,5±0,1. Las suspensiones se filtraron a través de una membrana CUNO 10CP, formándose filtrados (1.Filtrado) y segundas tortas de filtración. A continuación, las segundas tortas de filtración se suspendieron en 5 partes de agua (p/p), la temperatura de las suspensiones se ajustó a 17±2°C, el pH de las muestras se ajustó a 8,8±0,2 y luego se agitaron las muestras durante 8 horas mientras se mantenía la temperatura y el pH para extraer A1PI a partir del material insoluble.

Después de la incubación, se añadieron a las muestras 10 mmol de Tris y 150 mmol de cloruro de sodio por kg de suspensión y se ajustó el pH a 8,0±0,1. Se añadieron a las muestras 176 g de PEG 3350 por kg de suspensión, que se incubaron a 17±2°C durante 1 hora. A continuación, las suspensiones se filtraron para retirar el material insoluble del sobrenadante (2.Filtrado) que contenía la A1PI extraída.

A continuación, se precipitó A1PI en bruto a partir del segundo filtrado mediante la adición de o bien 0,35 g de cloruro de zinc/kg de filtrado (ZnCh 2,5 mM; muestra n.° 1) o bien 0,54 g/kg de cloruro de zinc/kg de filtrado (ZnCh 4,0 mM; muestra n.° 3), ajustando el pH a 7,5±0,2 e incubando las muestras a 7±2°C durante 3 horas. El precipitado de cloruro de zinc se recuperó por centrifugación (ZnCh cent.). Se extrajo A1PI a partir del precipitado de cloruro de zinc con EDTA de sodio 50 mM (Zn-EDTA-conc.).

El contenido y la actividad de A1PI (a1A) se determinaron para cada etapa del procedimiento de enriquecimiento y se presentan en la tabla 26. Se recuperaron aproximadamente 400 mg de A1PI activa/l de plasma fuente en la etapa de extracción con EDTA. En particular, cuando se extrajo A1PI a 38±2°C y un pH de aproximadamente 9,2, se recuperaron aproximadamente 600 mg de A1PI activa/l de plasma fuente.

Tabla 26. Contenido de alfa-1-antitripsina de las fracciones posteriores formadas durante el fraccionamiento del plasma usando una reacción de precipitación inicial con alto contenido de alcohol (etanol al 25%) y pH bajo (5,4) y precipitación con zinc.

Ejemplo 7 - P03410NG2A y B

Se investigó el efecto del pH sobre la recuperación de IgG a partir de una precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo de plasma desprovisto de crioprecipitado. Brevemente, se fraccionaron por precipitación 100 l de plasma desprovisto de crioprecipitado, que se había tratado para retirar el factor IX, el factor VII y la antitrombina III (^a T ⁱ II) por adsorción, usando etanol al 25% a un pH de 5,4 (muestra A; P03410NG2A) o 5,6 (muestra B; P03410NG2B). Luego se procesaron las muestras para formar un precipitado de precipitado G (precipitado de PptG) y un sobrenadante (sobrenadante de PptG) tal como se describe en el ejemplo 2, excepto que se mezclaron 50 g de S O /kg de precipitado de I-IV-1 con la suspensión de precipitado de I-IV-1, en lugar de 40 g/kg de precipitado.

Se determinó el contenido de IgG, IgA e IgM de las fracciones formadas y se presentan en la tabla 27, la tabla 28 y la tabla 29, respectivamente. En particular, aproximadamente el 90% del contenido de IgG del plasma fuente se recupera en el filtrado a través de CUNO de la fracción I-IV-1 cuando la precipitación inicial se realiza a pH 5,4 (93,8%) o pH 5,6 (88,8%). De manera similar, casi todo el contenido de IgA e IgM del plasma fuente se recupera en la suspensión de la fracción I-IV-1.

Tabla 27. Contenido de IgG de las fracciones anteriores formadas durante el fraccionamiento del plasma usando una etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol (25%) y pH bajo (A = 5,4; B = 5,6).

ELISA

Nef. PPD/PS de IgG

Tabla 28. Contenido de IgA de las fracciones anteriores formadas durante el fraccionamiento del plasma usando una etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol (25%) y pH bajo (A = 5,4; B = 5,6).

Tabla 29. Contenido de IgM de las fracciones anteriores formadas durante el fraccionamiento del plasma usando una etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol (25%) y pH bajo (A = 5,4; B = 5,6).

Para caracterizar adicionalmente el esquema de fraccionamiento, se determinó el contenido de fibrinógeno (tabla 30), A1PI (tabla 31), alfa-2-macroglobulina (tabla 32), albúmina (tabla 33), transferrina (tabla 34) y C3 (tabla 35) para diversas fracciones anteriores.

Tabla 30. Contenido de fibrinógeno de las fracciones anteriores formadas durante el fraccionamiento del plasma usando una etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol (25%) y pH bajo (A = 5,4; B = 5,6).

Tabla 31. Contenido de alfa-1-antitripsina de las fracciones anteriores formadas durante el fraccionamiento del plasma usando una etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol (25%) y pH bajo (A = 5,4; B = 5,6).

Tabla 32. Contenido de alfa-2-macroglobulina de las fracciones anteriores formadas durante el fraccionamiento del plasma usando una etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol (25%) y pH bajo (A = 5,4; B = 5,6).

Tabla 33. Contenido de albúmina de las fracciones anteriores formadas durante el fraccionamiento del plasma usando una etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol (25%) y pH bajo (A = 5,4; B = 5,6).

ELISA de albúmina

Tabla 34. Contenido de transferrina de las fracciones anteriores formadas durante el fraccionamiento del plasma usando una etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol (25%) y pH bajo (A = 5,4; B = 5,6).

Tabla 35. Contenido del componente 3 del complemento (C3) de las fracciones anteriores formadas durante el fraccionamiento del plasma usando una etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol (25%) y pH bajo (A = 5,4; B = 5,6).

Ejemplo 8 - P03510NG2 y P03610NG2

Se investigó adicionalmente el efecto de hacer pasar el eluato de intercambio catiónico CM a través de una columna de intercambio aniónico ANX a concentraciones de carga de 100 g de proteína/ml de resina ANX y 150 g de proteína/ml de resina ANX durante el procesamiento posterior de un precipitado de PptG formado usando una etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol y pH bajo. Brevemente, se procesaron 2 kg de precipitado de PptG de P03410NG2A tal como se describe en el ejemplo 4, con una primera muestra (P03510NG2) cargada en la resina de intercambio aniónico ANX a una concentración de 157 mg de proteína/ml de resina ANX y una segunda muestra (P03610NG2) cargada en la resina de intercambio aniónico ANX a una concentración de 106 mg de proteína/ml de resina ANX.

Se determinó el contenido de IgG de cada etapa posterior de las purificaciones y los resultados se proporcionan en la tabla 22 y la tabla 23. En comparación con el rendimiento promedio de IgG para el procedimiento de fabricación de GAMMAGARD LIQUID® (3,7 g de IgG/l de plasma fuente), los métodos de purificación usados en este ejemplo dan como resultado rendimientos significativamente más altos de 4,72 g de IgG y 4,67 g de IgG por l de plasma fuente. Esto representa más de un 25% de aumento en el rendimiento de IgG. La caracterización bioquímica de las composiciones finales de IgG se notifica en la tabla 38 y la tabla 39. Tal como se observa en las tablas, las composiciones finales de IgG tienen una pureza superior al 99% y el contenido de monómero/dímero de IgG es superior al 99,8%. El recipiente final contiene sólo trazas de impurezas, cuyos niveles están dentro de las normas regulatorias.

Tabla 36. Contenido de IgG de las fracciones anteriores formadas durante el fraccionamiento del plasma usando una etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol (25%) y pH bajo (5,4) y una concentración de carga de intercambio aniónico de 157 mg/ml de resina ANX (P03510NG2).

Tabla 37. Contenido de IgG de las fracciones anteriores formadas durante el fraccionamiento del plasma usando una etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol (25%) y pH bajo (5,4) y una concentración de carga de intercambio aniónico de 106 mg/ml de resina ANX (P03610NG2).

Tabla 38. Caracterización bioquímica de la composición final de IgG enriquecida a partir de plasma desprovisto de crioprecipitado usando una etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol (25%) y pH bajo (5,4) y una concentración de carga de intercambio aniónico de 157 mg/ml de resina ANX (P03510NG2).

Tabla 39. Caracterización bioquímica de la composición final de IgG enriquecida a partir de plasma desprovisto de crioprecipitado usando una etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol (25%) y pH bajo (5,4) y una concentración de carga de intercambio aniónico de 106 mg/ml de resina ANX (P03610NG2).

Ejemplo 9 - Caracterización adicional de productos de fraccionamiento

El rendimiento y la pureza de la inmunoglobulina G logrados usando métodos de purificación que incluyen una precipitación inicial con alto contenido de alcohol y pH bajo se compararon con los logrados usando los productos intermedios de precipitación I y precipitación N+III de Cohn tradicionales.

El rendimiento y la pureza de tres purificaciones de IgG a gran escala empleando una precipitación inicial con alto contenido de alcohol y pH bajo, lote 3010 tal como se describe en el ejemplo 5 (“P03010NG2”); lote 3610 tal como se describe en el ejemplo 8 (“P03610NG2”); y un tercer lote 1111 preparado de manera similar a los lotes 3010 y 3610, se compararon con el rendimiento promedio de GAMMAGARD LIQUID (infusión de inmunoglobulina (humana) al 10%), Baxter International) preparado en una única planta de fabricación en 2010. El procedimiento de purificación de GAMMAGARD LIQUID fue sustancialmente similar a los procedimientos usados para preparar los lotes 3010, 3610 y 1111, excepto que el procedimiento de GAMMAGARD LIQUID procedió a través de los productos intermedios de la fracción I de Cohn y la fracción II+III de Cohn, en lugar de una precipitación inicial con alto contenido de alcohol y pH bajo. En la tabla 40 se muestra la caracterización de los productos de precipitado G formados durante la preparación de los lotes experimentales y promediados para GAMMAGARD LIQUID.

Tabla 40. Caracterización bioquímica de producto intermedio de precipitado G (PptG) formado durante la preparación de los lotes experimentales de IgG 3010, 3610 y 1111, procediendo a través de una etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol y pH bajo, y promediado para la preparación de GAMMAGARD LIQUID como una única planta de fabricación en el año 2010, procediendo a través de las etapas de precipitación de la fracción I y II+III de Cohn.

Tal como se observa en la tabla 40, el uso de una etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol y pH bajo dio como resultado un aumento significativo en la recuperación de IgG en la etapa de producto intermedio de precipitado G en comparación con el método de purificación de GAMMAGARD LIQUID procediendo a través de las etapas de precipitación de la fracción I y II+III de Cohn (88,9-96,6% de recuperación de IgG para la etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol y pH bajo frente al 82,9% para las etapas de precipitación de la fracción I y II+III de Cohn).

Los productos intermedios de precipitado G de IgG formados en los lotes experimentales 3010, 3610 y 1111 tienen una pureza ligeramente menor que el producto intermedio de precipitado G de GAMMAGARD LIQUID promedio, tal como lo demuestran los niveles más altos del componente 3 del complemento (C3) y fibrinógeno, aunque el contenido de fibrinógeno de estos productos intermedios todavía está dentro del intervalo de valores observados para la fabricación de GAMMAGARD LIQUID. Sin embargo, cuando los lotes experimentales se procesaron adicionalmente tal como se describió anteriormente, el producto final de IgG cumplió todas las especificaciones de fabricación sometidas a prueba, tal como se muestra en la tabla 41.

Tabla 41. Caracterización bioquímica de las composiciones finales de IgG humana agrupadas para los lotes experimentales 3010, 3610 y 1111, procediendo a través de una etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol y pH bajo.

Ejemplo 10 - Caracterización de composiciones de albúmina

Para validar adicionalmente que los nuevos procedimientos de fabricación de inmunoglobulina G descritos en el presente documento (por ejemplo, aquellos que procedieron a través de una etapa de precipitación inicial con alto contenido de alcohol y pH bajo) podrían respaldar la fabricación de subproductos de proteínas plasmáticas, la albúmina se purificó a partir de un sobrenadante con alto contenido de alcohol y pH bajo.

Los métodos para purificar la albúmina a partir de los sobrenadantes de las fracciones IV-1 y IV-4 de Cohn se conocen bien en la técnica. Normalmente, los sobrenadantes de las fracciones IV-1 y IV-4 de Cohn se forman en un procedimiento que procede a través de etapas intermedias de precipitación con alcohol, tales como las precipitaciones de la fracción I de Cohn y la fracción II+NI de Cohn. En el presente ejemplo, se preparó albúmina según métodos convencionales, excepto que se usó el sobrenadante de una precipitación inicial con alto contenido de alcohol y pH bajo en lugar de un sobrenadante de la fracción IV-1. Tal como se muestra en la tabla 42, la purificación a partir de un sobrenadante con alto contenido de alcohol y pH bajo dio como resultado un alto rendimiento de albúmina (18,92 g/l de plasma), que cumplió todos los requisitos de control de calidad sometidos a prueba.

Tabla 42. Caracterización bioquímica de una composición de albúmina preparada a partir de un sobrenadante de precipitación con alto contenido de alcohol y pH bajo a gran escala, tal como se describió anteriormente.

Claims (25)

REIVINDICACIONES

1. Método para fabricar una composición de inmunoglobulina enriquecida a partir de plasma completo o plasma desprovisto de crioprecipitado, comprendiendo el método las etapas de:

(a) coprecipitar inmunoglobulinas y alfa-1-antitripsina (A1PI) a partir de plasma completo o plasma desprovisto de crioprecipitado, en una primera etapa de precipitación mediante la adición de etanol al plasma completo o plasma desprovisto de crioprecipitado a una concentración final de desde el 20% hasta el 30% (v/v) a un pH de desde 5,0 hasta 6,0, para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante;

(b) solubilizar inmunoglobulinas en el primer precipitado usando una disolución que tiene un pH de entre 4,0 y 4,9, para formar una primera suspensión que tiene una porción soluble que comprende inmunoglobulinas y una porción insoluble que comprende A1PI;

(c) separar la porción soluble de la primera suspensión de la porción insoluble de la primera suspensión; y (d) recuperar la fracción soluble de la primera suspensión, formando de ese modo una composición de inmunoglobulina enriquecida,

en el que las inmunoglobulinas precipitadas en la etapa (a) son inmunoglobulinas IgG.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el método comprende las etapas de:

(a) coprecipitar inmunoglobulinas y A1PI a partir de plasma completo o plasma desprovisto de crioprecipitado, en una primera etapa de precipitación, con entre el 24% y el 26% (v/v) de etanol a un pH de entre 5,3 y 5,7 y una temperatura de entre -6°C y -8°C para formar un primer precipitado y un primer sobrenadante;

(b) solubilizar inmunoglobulinas en el primer precipitado usando una disolución que tiene un pH de entre 4,0 y 4,9, para formar una primera suspensión que tiene una porción soluble que comprende inmunoglobulinas y una porción insoluble que comprende A1PI;

(b1) tratar la primera suspensión con dióxido de silicio (SO2) finamente dividido;

(c) separar la fracción soluble de la primera suspensión de la fracción insoluble de la primera suspensión; y (d) recuperar la fracción soluble de la primera suspensión, formando de ese modo una composición de inmunoglobulina enriquecida.

3. Método según la reivindicación 1, en el que:

(a) la concentración final de etanol es del 25±4%;

(b) la concentración final de etanol es del 25±3%;

(c) la concentración final de etanol es del 25±2%; o

(d) la concentración final de etanol es del 25±1%.

4. Método según la reivindicación 2 ó 3, en el que la concentración final de etanol es del 25%.

5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3 a 4, en el que en la etapa (a):

(a) el pH es de 5,5±0,4;

(b) el pH es de 5,5±0,3;

(c) el pH es de 5,5±0,2; o

(d) el pH es de 5,5±0,1.

6. Método según la reivindicación 2 ó 5, en el que el pH es de 5,5.

7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el pH se mantiene durante la duración de la primera etapa de precipitación.

8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3 a 7, en el que la primera etapa de precipitación se realiza a una temperatura de desde -5°C hasta -9°C.

9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la disolución usada en la etapa (b) tiene un pH de 4,7, 4,8 ó 4,9.

10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la primera suspensión tiene una conductividad de desde 0,5 mS/cm hasta 2 mS/cm, y en el que la etapa (b) se realiza a una temperatura de entre 0°C y 10°C.

11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el primer precipitado se suspende en un tampón que comprende acetato y/o fosfato.

12. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la etapa de separar la porción soluble de la primera suspensión de la porción insoluble de la primera suspensión comprende:

(i) mezclar dióxido de silicio (SO2) finamente dividido con la primera suspensión; y

(ii) separar el SO2 de la suspensión.

13. Método según la reivindicación 12, en el que el dióxido de silicio (SO2) finamente dividido tiene un área de superficie promedio de desde 350 m2/g hasta 410 m2/g.

14. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 12 a 13, en el que el dióxido de silicio (SO2) finamente dividido se añade a la primera suspensión a una concentración final de desde 15 g/kg de primer precipitado hasta 80 g/kg de primer precipitado.

15. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que la composición de inmunoglobulina enriquecida contiene al menos el 95% del contenido de IgG presente en el plasma completo o plasma desprovisto de crioprecipitado usado en la etapa (a).

16. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que el método comprende además las etapas de

precipitar inmunoglobulinas a partir de la fracción soluble de la primera suspensión, en una segunda etapa de precipitación, para obtener un segundo precipitado y un segundo sobrenadante;

suspender el segundo precipitado para formar una segunda suspensión; y

recuperar la fracción soluble de la segunda suspensión, formando de ese modo una composición de inmunoglobulina enriquecida adicionalmente.

17. Método según la reivindicación 16, en el que la segunda etapa de precipitación es una etapa de precipitación con alcohol que comprende añadir etanol a la fracción soluble de la primera suspensión para lograr una concentración final de entre el 22% y el 28% de etanol a un pH de entre 6,5 y 7,5.

18. Método según la reivindicación 16 ó 17, en el que la segunda etapa de precipitación se realiza a una temperatura de entre -3°C y -10°C.

19. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en el que la composición de inmunoglobulina enriquecida contiene al menos el 95% del contenido de inmunoglobulina G presente en el plasma completo o plasma desprovisto de crioprecipitado usado en la etapa (a).

20. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el que el método comprende además una etapa de enriquecimiento por cromatografía de intercambio catiónico.

21. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que el método comprende además una etapa de enriquecimiento por cromatografía de intercambio aniónico.

22. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que el método comprende además una etapa de inactivación y/o eliminación de virus.

23. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que:

(a) el método produce al menos 4 g de IgG por l de plasma completo o plasma desprovisto de crioprecipitado usado en la etapa (a);

(b) el método produce al menos 4,25 g de IgG por l de plasma completo o plasma desprovisto de crioprecipitado usado en la etapa (a); o

(c) el método produce al menos 4,5 g de IgG por l de plasma completo o plasma desprovisto de crioprecipitado usado en la etapa (a).

24. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en el que el plasma completo o plasma desprovisto de crioprecipitado es plasma desprovisto de crioprecipitado del que se han eliminado uno o más factores sanguíneos en una etapa de procesamiento previo por adsorción en una fase sólida.

25. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en el que la porción insoluble separada de la primera suspensión contiene al menos el 80% del contenido de A1PI de la muestra de plasma de partida.