ES2934808T3 - Células madre musculoesqueléticas novedosas - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a una nueva célula madre musculoesquelética (MSSC) diferenciada de una célula madre embrionaria (ESC) o una célula madre pluripotente inducida (iPSC). La célula madre musculoesquelética de la presente invención se puede derivar fácilmente de células madre embrionarias humanas o células madre pluripotentes inducidas por humanos y diferenciarse eficazmente en cartílagos, tendones y músculos, así como en huesos, encontrando así aplicaciones útiles en la prevención o el tratamiento de diversas enfermedades musculoesqueléticas. enfermedades. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Células madre musculoesqueléticas novedosas
[Campo técnico]
La presente divulgación se refiere a una novedosa composición de medio para inducir la diferenciación en una célula madre musculoesquelética capaz de diferenciarse en un tejido musculoesquelético y un método para preparar la célula madre musculoesquelética.
[Técnica anterior]
La enfermedad del sistema musculoesquelético formado por músculos, huesos, articulaciones, etc. provoca una limitación severa de la actividad, dolor corporal, etc. La degeneración de las funciones de los músculos, huesos y articulaciones con el envejecimiento es una consecuencia inevitable. Las enfermedades que ocurren con frecuencia como resultado de la degeneración de la función del sistema musculoesquelético incluyen artritis degenerativa, tendinitis, fractura ósea, esguince, sarcopenia, etc. Debido a que la esperanza de vida aumenta recientemente debido a la mejora en la atención médica, el número de pacientes que sufren de enfermedades musculoesqueléticas también está aumentando. Sin embargo, la calidad de vida se ve agravada porque no se logra un envejecimiento saludable con un sistema musculoesquelético sano.
La osificación es el proceso de formación de hueso. Hay dos procesos de formación ósea: osificación intramembranosa y osificación endocondral. La osificación intramembranosa es la conversión directa de tejido mesenquimatoso en hueso y ocurre dentro del cráneo, mientras que la osificación endocondral implica la formación de tejido cartilaginoso a partir de células mesenquimales agregadas seguida de la conversión del tejido cartilaginoso en hueso. Este proceso de osificación es fundamental sobre todo en la formación ósea de los vertebrados.
Las células madre embrionarias humanas (hESC) son células pluripotentes que pueden crecer sin limitación y pueden diferenciarse en cualquier tipo de célula. Las hESC son herramientas útiles para el estudio del desarrollo embrionario a nivel celular y para la terapia de reemplazo celular. Las hESC pueden diferenciarse en tejidos específicos que incluyen tejidos esqueléticos como huesos y cartílagos y, por lo tanto, pueden usarse para la restauración de tejidos esqueléticos.
Las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) se conocen como células madre pluripotentes que pueden diferenciarse en cualquier tipo de células. Las hiPSC son útiles para el estudio del desarrollo embrionario a nivel celular y están llamando la atención como agentes terapéuticos celulares. Debido a que estas células se pueden diferenciar en tejido esquelético, por ejemplo, hueso o cartílago, mediante trasplante, se pueden usar de manera útil para la restauración y el tratamiento de tejido esquelético dañado.
Las células madre mesenquimales (MSC) son las células que pueden autorrenovarse y diferenciarse en células de origen mesenquimatoso, tales como osteoblastos, adipocitos y células de cartílago. Las MSC se utilizan en ensayos clínicos en diversas condiciones y se intentan para traumatismos, enfermedades esqueléticas, enfermedad de injerto contra huésped tras la recepción de un trasplante de médula ósea, enfermedades cardiovasculares, enfermedades autoinmunes, enfermedades hepáticas, etc. Sin embargo, es muy difícil alcanzar las MSC en una cantidad suficiente para la aplicación terapéutica. Además, las células madre mesenquimales no pueden diferenciarse directamente en estos tejidos del cuerpo en ausencia del proceso de prediferenciación in vitro de diferenciarse en cartílago óseo o grasa utilizando factores de crecimiento, vitaminas, etc. Se sabe que las células madre mesenquimales facilitan indirectamente la regeneración de los tejidos dañados al estimular las células madre intrínsecas mediante la secreción de varios biofactores, en lugar de participar directamente en la diferenciación en tejidos mesenquimales, incluidos los tejidos musculoesqueléticos (Células madre Transl Med. 6(6):1445-1451, 2017).
Bipasha y Sudheer describen la inducción de MSC de ratones sin miostatina en células madre pluripotentes sin factores de reprogramación.Stem Cell Rev and Rep, 2016, 12:73-89) y Quattrocelli et al. divulgan protocolos para promover las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) para diferenciarse hacia el músculo cardíaco o esquelético (The Journal of Clinical Investigation, 2015, 12: 4463-4482). El documento WO2017/026878A1 se refiere a un medio que comprende un activador de señalización FGF2 (Factor de crecimiento de fibroblastos 2), un inhibidor de señalización TGF beta/activina/ nodal, un activador de señal Wnt, un inhibidor de señal extracelular y un factor inhibidor de leucemia (LIF), para inducir diferenciación de células madre a una célula progenitora musculoesquelética.
En consecuencia, está aumentando la necesidad de investigaciones sobre células que puedan superar las limitaciones de las células madre mesenquimales y que puedan diferenciarse directamente en hueso, cartílago, ligamentos y músculos en el cuerpo.
Lo anterior pretende simplemente ayudar en la comprensión de los antecedentes de la presente divulgación y no pretende significar que la presente divulgación se encuentre dentro del ámbito de la técnica relacionada que ya es conocida por los expertos en la materia.
[Divulgación]
[Problema técnico]
Los inventores de la presente divulgación han identificado que una célula madre musculoesquelética (hMSSC) puede derivarse de una célula madre embrionaria humana (hESC) o una célula madre pluripotente derivada de humanos (hiPSC) y que la célula madre musculoesquelética puede diferenciarse en hueso a través de osificación endocondral así como en tejidos musculoesqueléticos tales como cartílago, tendón, músculo, etc., completando así la presente divulgación.
La invención se define en el conjunto de reivindicaciones adjunto.
La presente divulgación está dirigida a proporcionar una composición de medio para inducir la diferenciación en una célula madre musculoesquelética.
La presente divulgación también está dirigida a proporcionar un método para preparar una célula madre musculoesquelética, que incluye una etapa de cultivo de una ESC o una iPSC en el medio.
La presente divulgación también está dirigida a proporcionar una célula madre musculoesquelética diferenciada de una ESC o una iPSC.
La presente divulgación también describe una composición farmacéutica para prevenir o tratar una enfermedad musculoesquelética, que contiene la célula madre musculoesquelética, y
un método para examinar las células madre musculoesqueléticas que no forman parte de la presente invención. Otros objetos y ventajas de la presente divulgación serán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, reivindicaciones y dibujos.
[Solución técnica]
La presente divulgación proporciona una composición de medio para inducir la diferenciación en una célula madre musculoesquelética (MSSC), que contiene nogina, LIF (factor inhibidor de la leucemia), bFGF (factor de crecimiento de fibroblastos básico), activador de señalización Wnt, ERK (quinasa regulada por señal extracelular) inhibidor de señalización e inhibidor de señalización TGF-p/activina/nodal.
Los inventores de la presente divulgación han identificado una composición de medio óptima capaz de inducir una célula madre musculoesquelética (hMSSC) a partir de una célula madre embrionaria humana o una célula madre pluripotente derivada de humanos y que la célula madre musculoesquelética puede diferenciarse en hueso a través de la osificación endocondral así como como en tejidos musculoesqueléticos tales como cartílago, tendón, músculo, etc., completando así la presente divulgación.
En la presente divulgación, el término “célula madre” se refiere a una célula indiferenciada capaz de diferenciarse en diversos tejidos corporales. Las células madre pueden clasificarse en células madre totipotentes, células madre pluripotentes, células madre multipotentes, etc. El término célula madre puede usarse indistintamente con los términos célula precursora, célula progenitora, etc. En la presente divulgación, la célula madre puede ser una célula madre embrionaria (ESC), una célula madre pluripotente inducida (iPSC) o una célula madre mesenquimal (MSC). Por consiguiente, la composición del medio de la presente divulgación puede usarse para inducir la diferenciación de una célula madre embrionaria, una célula madre pluripotente inducida, etc., en una célula madre musculoesquelética. La célula madre embrionaria es una célula pluripotente derivada de las tres capas germinales, con capacidad de proliferación ilimitada sin transformación y autorrenovación, aunque sin limitarse a ello.
En la presente divulgación, el término “célula madre musculoesquelética” se refiere a una célula que puede diferenciarse en hueso, cartílago, tendón, ligamento o músculo sin limitación.
El término “diferenciación” se refiere al proceso en el que la estructura o función de una célula se especializa mientras la célula crece a través de la división y proliferación, es decir, el proceso en el que la forma o función cambia para realizar la tarea asignada a la célula, tejido, etc. de un organismo. En general, se refiere a un fenómeno en el que un sistema relativamente simple se divide en dos o más subsistemas cualitativamente diferentes. Es decir, la diferenciación se refiere a la variación de las partes de un sistema biológico inicialmente sustancialmente homogéneo o la división a partes o subsistemas cualitativamente diferentes como resultado de ello, por ejemplo, la división de cabeza, cuerpo, etc. huevo homogéneo durante la ontogenia.
La célula madre embrionaria o la célula madre pluripotente inducida utilizada en la presente divulgación se deriva de humanos, vacas, caballos, cabras, ovejas, perros, gatos, ratones, ratas y aves.
Específicamente, el activador de señalización Wnt de la presente divulgación es SB216763 (3-(2,4-diclorofenil)-4-(1-metil-1H-indol-3-il)-1 H-pirrol-2,5-diona), SB415286 (3-[(3-cloro-4-hidroxifenil)amino]-4-(2-nitrofenil)-1H-pirrol-2,5-diona), kenpaulona (9-bromo-7,12-dihidro-indolo[3,2-d]-[1]benzazepin-6(5H)-ona), CHIR99021 (9-bromo-7,12-dihidropirido[3',2':2,3]azepino[4,5-b]indol-6(5H)-ona), CP21R7 (3-(3-amino-fenil)-4-(1-metiMH-indol-3-il)-pirrol-2,5-diona), SB203580 (4-(4-fluorofenil)-2-(4-metilsulfinilfenil)-5-(4-piridil)-1H-imidazol), H-89 (5-isoquinolinasulfonamida), purmorfamina (2-(1-naftoxi)-6-(4-morfolinoanilino)-9-ciclohexilpurina) o IQ-1 (2-(4-acetil-fenilazo)-2-[3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-(1E)-ilideno]-acetamida), aunque sin limitarse a ellos.
Específicamente, el inhibidor de señalización ERK de la presente divulgación es AS703026 (N-[(2S)-2,3-dihidroxipropil]-3-[(2-fluoro-4-yodofenil)amino]-isonicotinamida), AZD6244 (6-(4-bromo-2-cloroanilino)-7-fluoro-N-(2-hidroxietoxi)-3-metilbencimidazol-5-carboxamida), PD0325901 (N-[(2R)-2,3-dihidroxipropoxi]-3,4-difluoro-2-[(2-fluoro-4-yodofenil)amino]-benzamida), ARRY-438162 (5-[(4-bromo-2-fluorofenil)amino]-4-fluoro-N-(2-hidroxietoxi)-1-metil-1H-bencimidazol-6-carboxamida), RDEA119 ((S)-N-(3,4-difluoro-2-((2-fluoro-4-yodofenil)amino)-6-metoxifenil)-1-(2,3-dihidroxipropil)ciclopropano-1-sulfonamida), GDC0973 ([3,4-difluoro-2-(2-fluoro-4-yodoanilino)fenil]-3-hidroxi-3-[(2S)-piperidin-2-il]-azetidin-1-il-metanona), TAK-733 ((R)-3-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-5-(2-fluoro-4-yodofenilamino)-8-metilpirido[2,3-d]pirimidina-4,7(3H,8H)-diona), RO5126766 (3-[[3-fluoro-2-(metilsulfamoilamino)-4-piridil]metil]-4-metilpirimidin-2-iloxicromen-2-ona) o XL-518 ([3,4-difluoro-2-[(2-fluoro-4-yodofenil)amino]fenil][3-hidroxi-3-[(2S)-2-piperidinil]-1-azetidinil]metanona), aunque sin limitarse a ellos.
Específicamente, el Inhibidor de señalización TGF-p/activina nodal de la presente divulgación es E-616452 (2-[3-(6-metil-2-piridinil)-1H-pirazol-4-il]-1,5-naftiridina), A-83-01 (3-(6-metil-2-piridinil)-N-fenil-4-(4-quinolinil)-1H-pirazol-1-carbotioamida) o SB431542 (4-[4-(1,3-benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1H-imidazol-2-il]benzamida), aunque sin limitarse a ellos.
En un ejemplo de la presente divulgación, se comparó la capacidad de diferenciación para medios en los que uno de los ingredientes constitucionales nogina, LIF (factor inhibidor de leucemia), bFGF (factor de crecimiento de fibroblastos básico), activador de señalización Wnt, inhibidor de señalización ERK (quinasa regulada por señal extracelular) e Inhibidor de señalización TGF-p/activina nodal, estaba ausente con un medio que contenía todos los ingredientes constitucionales. Como resultado, se confirmó que la diferenciación en cartílago (azul Alcián) o hueso (ALP y rojo de alizarina S) no se lograba bien cuando alguno de los ingredientes constitucionales era deficiente (figura 7, Tabla 3).
Además, cuando el medio se reemplazó por uno al cual se agregó un medio acondicionado (un sobrenadante de cultivo obtenido después de cultivar fibroblastos embrionarios de ratón CF1 con un medio obtenido al reemplazar DMEM/F12 en un medio completo con DMEM knockout (suplementado con un 20 % de reemplazo de suero knockout) Invitrogen, EE. UU.), glutamina 1 mM, aminoácidos no esenciales al 1 % (Invitrogen, EE. UU.), p-mercaptoetanol 0.1 mM, penicilina-estreptomicina al 0.1 % y albúmina sérica bovina 5 mg/ml)) en lugar de nogina y se comparó la capacidad diferenciación, se confirmó que la composición del medio de la presente divulgación usando nogina aumentó la tendencia a la diferenciación osteogénica 10 veces o más y aumentó la velocidad de diferenciación en 1­ 2 semanas (Tablas 1 y 2).
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método para preparar una célula madre musculoesquelética, que incluye una etapa de cultivo de una ESC (célula madre embrionaria) o una iPS (célula madre pluripotente inducida) en la composición del medio para inducir la diferenciación en una célula madre musculoesquelética.
El cultivo puede realizarse durante 5 pases o más, específicamente entre 5 y 25 pases, más específicamente entre 7 y 18 pases, sin cambios en la composición del medio.
En un ejemplo de la presente divulgación, se confirmó que las células madre musculoesqueléticas se diferenciaron cultivando células madre embrionarias humanas o células madre pluripotentes derivadas de humanos durante 7 pases o más utilizando el medio para inducir la diferenciación en una célula madre musculoesquelética de acuerdo con el método anterior fue establemente idéntico. Ellas crecieron con morfologías similares durante 10 pases o más, desde el pase 7 al 17, y mostraron una respuesta positiva a la tinción con el marcador de envejecimiento p-galactosidasa desde el pase 19, lo que sugiere que el envejecimiento progresó (figura 1A).
En otro aspecto únicamente con fines ilustrativos, la presente divulgación proporciona una célula madre musculoesquelética preparada usando la composición del medio para inducir la diferenciación en una célula madre musculoesquelética.
En otro aspecto únicamente con fines ilustrativos, la presente divulgación proporciona una célula madre musculoesquelética (MSSC) diferenciada de una ESC (célula madre embrionaria) o una iPSC (célula madre pluripotente inducida).
En una realización ejemplar específica de la presente divulgación que no forma parte de la presente invención, la célula madre musculoesquelética de la presente divulgación tiene las siguientes características:
a) positivo para el marcador ectodérmico nestina (NES);
b) positivo para el marcador satélite miogénico Pax7;
c) positivo para el marcador mesodérmico a-SMA;
d) negativo para el marcador de pluripotencia LIN28; y
f) negativo para el marcador de células madre mesenquimales CD90.
En una realización ejemplar específica de la presente divulgación que no forma parte de la presente invención, la célula madre musculoesquelética de la presente divulgación tiene además la siguiente característica: negativo para el marcador de células madre mesenquimales CD271.
En una realización ejemplar específica de la presente divulgación que no forma parte de la presente invención, la célula madre musculoesquelética de la presente divulgación tiene además la siguiente característica: positivo para el marcador de pluripotencia DPPA4.
En una realización ejemplar específica de la presente divulgación que no forma parte de la presente invención, la célula madre musculoesquelética de la presente divulgación tiene además la siguiente característica: negativo para los marcadores mesodérmicos T y nodal.
En una realización ejemplar específica de la presente divulgación que no forma parte de la presente invención, la célula madre musculoesquelética de la presente divulgación tiene la siguiente característica: positivo para el marcador neuroectodérmico Pax6.
En una realización ejemplar específica de la presente divulgación que no forma parte de la presente invención, la célula madre musculoesquelética de la presente divulgación tiene la siguiente característica: positiva para el marcador de células madre intestinales LGR5.
En una realización ejemplar específica de la presente divulgación que no forma parte de la presente invención, la célula madre musculoesquelética de la presente divulgación tiene la siguiente característica: negativo para el marcador de condrocitos SOX9.
En una realización ejemplar específica de la presente divulgación que no forma parte de la presente invención, la célula madre musculoesquelética de la presente divulgación tiene la siguiente característica: negativa para el marcador de mioblastos MyoD.
En una realización ejemplar específica de la presente divulgación que no forma parte de la presente invención, la célula madre musculoesquelética de la presente divulgación es positiva para CD10, CD44, CD105, CD146 y/o CD166.
En un ejemplo de la presente divulgación que no forma parte de la presente invención, no se observó la expresión de la mayoría de los marcadores de pluripotencia en las células madre musculoesqueléticas de la presente divulgación, pero se observó la expresión de DPPA4 y las células dieron positivo para el marcador ectodérmico. NES. Además, fueron positivos para la mayoría de los marcadores mesodérmicos excepto DES y los marcadores mesodérmicos tempranos T y nodales y negativos para la mayoría de los marcadores endodérmicos (figura 1C). Además, cuando se investigó la expresión de antígenos de superficie celular específicos de células madre mesenquimales para hMSSC, entre los marcadores de células madre mesenquimales, CD44, CD51, CD73, CD105, CD146 y CD166 se expresaron en hMSSC pero CD90 y CD271 no se expresaron en el hMSSC. Además, mientras que los marcadores de superficie de células vasculares CD2, CD3, CD7, CD8, CD11b, CD14, CD19, CD20, CD31, CD34 y CD56 no se expresaron, se expresó el marcador de células pre-B CD10 (figura 1D). Además, cuando se investigó la expresión de diversos marcadores específicos de tejido, se expresaron el marcador mesodérmico alfa actina de músculo liso (a-SMA), el marcador neuroectodérmico Pax6, el marcador satélite miogénico Pax7, el marcador de células madre intestinales LGR5, etc. el marcador de condrocitos SOX9, el marcador de mioblastos MyoD, etc. no se expresaron (figura 1F).
En una realización ejemplar específica de la presente divulgación, la célula madre musculoesquelética se diferencia en el mesodermo pero no se diferencia en el ectodermo o el endodermo.
En una realización ejemplar específica de la presente divulgación, la célula madre musculoesquelética se diferencia en músculo, hueso, cartílago, un tendón o un ligamento.
En un ejemplo de la presente divulgación, cuando las células madre musculoesqueléticas de las presentes divulgaciones se cultivaron en un medio para cultivar una célula madre mesenquimal (p. ej., MSCGM, MSCGM-CD, etc.) y se trasplantaron a la cápsula renal o hipodermo, la formación típica de músculo, grasa, tendón, hueso y cartílago se observó en el riñón o hipodermo (figura 3). Todos los músculos musculares diferenciados se diferenciaron en músculo esquelético, no en músculo liso. También se confirmó en el experimento in vivo que podían diferenciarse en grasa, aunque la diferenciación en grasa no se observó en el experimento in vitro.
En una realización ejemplar específica de la presente divulgación, la célula madre musculoesquelética no se diferencia en un nervio.
En un ejemplo de la presente divulgación, cuando las células madre musculoesqueléticas se diferenciaron en células nerviosas en un medio para inducir la diferenciación en un nervio y se investigaron usando un marcador de células nerviosas, se confirmó que la célula madre musculoesquelética no tiene el potencial para diferenciarse en una célula nerviosa (figura 2F).
En una realización ejemplar específica de la presente divulgación, la célula madre musculoesquelética no se diferencia en una célula endotelial.
En un ejemplo de la presente divulgación, cuando las células madre musculoesqueléticas se diferenciaron en células endoteliales en un medio para inducir la diferenciación en un EC (medio de crecimiento endotelial) y se investigaron usando un marcador de células endoteliales, se confirmó que la célula madre musculoesquelética no tienen el potencial de diferenciarse en una célula endotelial (FIGS. 2C y 2D).
La célula madre musculoesquelética se depositó en el Korean Cell Line Bank el 10 de octubre de 2018 y se le otorgó el número de acceso KCLr F-BP-00460.
En otro aspecto que no forma parte de la presente invención, la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica para prevenir o tratar una enfermedad musculoesquelética, que contiene la célula madre musculoesquelética.
En otro aspecto que no forma parte de la presente invención, la presente divulgación proporciona un agente terapéutico celular que contiene la célula madre musculoesquelética.
En otro aspecto que no forma parte de la presente invención, la presente divulgación proporciona el uso de una composición farmacéutica para prevenir o tratar una enfermedad musculoesquelética, que contiene la célula madre musculoesquelética.
La enfermedad musculoesquelética de la presente divulgación puede ser específicamente una o más enfermedades seleccionadas de un grupo que consiste en osteoporosis, osteomalacia, osteogénesis imperfecta, osteopetrosis, osteosclerosis, enfermedad de Paget, cáncer de huesos, artritis, raquitismo, fractura, enfermedad periodontal, defecto óseo segmentario, enfermedad ósea osteolítica, hiperparatiroidismo primario y secundario, hiperostosis, artritis degenerativa, enfermedad degenerativa de la articulación de la rodilla, enfermedad degenerativa de la articulación de la cadera, enfermedad degenerativa de la articulación del pie, enfermedad degenerativa de la articulación de la mano, enfermedad degenerativa de la articulación del hombro, enfermedad degenerativa de la articulación del codo, condromalacia rotuliana, artritis simple de rodilla, osteocondritis disecante, epicondilitis lateral, epicondilitis medial, nódulos de Heberden, nódulos de Bouchard, artrosis degenerativa CM del pulgar, lesión de menisco, enfermedad degenerativa del disco, lesión del ligamento cruzado, lesión del músculo bíceps braquial, lesión del ligamento, lesión del tendón, hombro congelado, desgarro del manguito rotador, tendinitis calcificada es decir, síndrome de pinzamiento del hombro, luxación recurrente, luxación habitual, sarcopenia senil y distrofia muscular, aunque sin limitarse a ellos.
La composición farmacéutica de la presente divulgación que no forma parte de la presente invención puede contener un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo farmacéuticamente aceptable contenido en la composición puede ser uno de uso común para la preparación, que incluye lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidón, goma arábiga, fosfato de calcio, alginato, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua, jarabe, metilcelulosa, hidroxibenzoato de metilo, hidroxibenzoato de propilo, talco, estearato de magnesio, aceite mineral, etc., aunque sin limitarse a ellos. La composición farmacéutica puede contener además un lubricante, un humectante, un edulcorante, un aromatizante, un emulsionante, un agente de suspensión, un conservante, etc., además de los ingredientes anteriores.
La composición farmacéutica de la presente divulgación que no forma parte de la presente invención puede administrarse por vía oral o parenteral. Para la administración parenteral, puede administrarse mediante inyección intravenosa, inyección subcutánea, inyección intramuscular, inyección intraarticular, infusión intraósea, inyección intraperitoneal, administración endotelial, administración tópica, administración intranasal, administración intrapulmonar, administración intrarrectal, etc. Además, la composición puede ser administrada por cualquier dispositivo capaz de entregar el ingrediente activo a una célula diana.
Se puede determinar una dosis de administración apropiada de la composición farmacéutica de la presente divulgación que no forma parte de la presente invención considerando varios factores tales como el método de formulación, el modo de administración, la edad, el peso corporal y el sexo del paciente, la condición patológica, la dieta, tiempo de administración, vía de administración, tasa de excreción y sensibilidad de respuesta. Específicamente, la dosis de administración apropiada de la composición puede ser de 102-1010 células/kg para un adulto. El término cantidad farmacéuticamente eficaz se refiere a una cantidad suficiente para prevenir o tratar una enfermedad musculoesquelética.
La composición de la presente divulgación que no forma parte de la presente invención se puede preparar en una formulación unitaria de dosis única o múltiple usando un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable de acuerdo con un método que puede ser llevado a cabo fácilmente por los expertos en la técnica. La formulación puede presentarse en forma de solución en medio oleoso o acuoso, suspensión, jarabe, emulsión, extracto, polvo, gránulo, tableta o cápsula y puede contener además un dispersante o un estabilizador. Además, la composición se puede administrar de forma independiente o en combinación con otro(s) agente(s) terapéutico(s) y se pueden administrar de forma secuencial o simultánea. Además, puede administrarse como una dosis única o repetidamente según se desee.
En la presente divulgación que no forma parte de la presente invención, el término “agente terapéutico celular” se refiere a un medicamento utilizado con fines terapéuticos, diagnósticos y preventivos, que contiene una célula o tejido aislado de humanos y cultivado y preparado mediante una operación especial (según lo dispuesto por la USFDA). Este es un medicamento utilizado con fines terapéuticos, diagnósticos y preventivos mediante una serie de acciones de multiplicación y tamizaje in vitro de células vivas autólogas, alogénicas y xenogénicas o cambio de las características biológicas de las células por otros medios para recuperar las funciones de las células o tejidos.
En la presente divulgación, el término “prevención” se refiere a cualquier acción de inhibir una enfermedad musculoesquelética o retrasar su progresión mediante la administración de la composición o agente terapéutico celular de la presente divulgación que no forma parte de la presente invención.
En la presente divulgación, el término “tratamiento” se refiere a cualquier acción de mejorar o cambiar favorablemente una enfermedad musculoesquelética mediante la administración de la composición o agente terapéutico celular de la presente divulgación que no forma parte de la presente invención.
La composición farmacéutica o el agente terapéutico celular de la presente divulgación que no forma parte de la presente invención puede usarse para humanos o animales.
La composición farmacéutica o el agente terapéutico celular de la presente divulgación que no forma parte de la presente invención puede usarse solo o en combinación con cirugía, radioterapia, terapia hormonal, quimioterapia, un modificador de la respuesta biológica, implantación, inserción de una articulación artificial, cartílago artificial, etc., terapia de regeneración, etc., para la prevención y el tratamiento de una enfermedad musculoesquelética.
En otro aspecto que no forma parte de la presente invención, la presente divulgación proporciona un método para seleccionar una célula madre musculoesquelética.
En una realización ejemplar específica de la presente divulgación que no forma parte de la presente invención, el método incluye una etapa de cribado de una célula que tiene las siguientes características:
a) positivo para el marcador ectodérmico nestina (NES);
b) positivo para el marcador satélite miogénico Pax7;
c) positivo para el marcador mesodérmico a-SMA;
d) negativo para el marcador de pluripotencialidad LIN28; y
f) negativo para el marcador de células madre mesenquimales CD90.
En una realización ejemplar específica de la presente divulgación que no forma parte de la presente invención, el método incluye además una etapa de cribado de una célula que tiene la siguiente característica: negativo para el marcador de células madre mesenquimales CD271.
En una realización ejemplar específica de la presente divulgación que no forma parte de la presente invención, el método incluye además una etapa de cribado de una célula que tiene la siguiente característica: positivo para el marcador de pluripotencia DPPA4.
En una realización ejemplar específica de la presente divulgación que no forma parte de la presente invención, el método incluye además una etapa de cribado de una célula que tiene la siguiente característica: negativo para los marcadores mesodérmicos T y nodal.
En una realización ejemplar específica de la presente divulgación que no forma parte de la presente invención, el método incluye además una etapa de cribado de una célula que tiene la siguiente característica: positivo para el marcador neuroectodérmico Pax6.
En una realización ejemplar específica de la presente divulgación que no forma parte de la presente invención, el método incluye además una etapa de cribado de una célula que tiene la siguiente característica: positivo para el marcador de células madre intestinales LGR5.
En una realización ejemplar específica de la presente divulgación que no forma parte de la presente invención, el método incluye además una etapa de cribado de una célula que tiene la siguiente característica: negativo para el marcador de condrocitos SOX9.
En una realización ejemplar específica de la presente divulgación que no forma parte de la presente invención, el método incluye además una etapa de cribado de una célula que tiene la siguiente característica: negativo para el marcador de mioblastos MyoD.
En una realización ejemplar específica de la presente divulgación que no forma parte de la presente invención, el método incluye además una etapa de cribado de una célula positiva para CD10, CD44, CD105, CD146 y/o CD166.
Usando el método de selección de la presente divulgación que no forma parte de la presente invención, una célula madre musculoesquelética capaz de diferenciarse eficazmente en hueso, cartílago, tendón, ligamento, músculo, etc. puede tamizarse fácilmente.
[Efectos ventajosos]
Las características y ventajas de la presente divulgación pueden resumirse como sigue.
(i) La presente divulgación proporciona una célula madre musculoesquelética derivada de un ESC o un iPSC.
(ii) Además, la presente divulgación proporciona un método para preparar una célula madre musculoesquelética, que incluye una etapa de cultivo de una Es C o una iPS en un medio que contiene nogina, LIF, bFGF, etc.
(iii) La célula madre musculoesquelética de la presente divulgación se puede inducir fácilmente a partir de una célula madre embrionaria humana o una célula madre pluripotente derivada de un ser humano y se puede diferenciar eficazmente en hueso, cartílago, tendón o músculo. Por lo tanto, puede usarse de manera útil para la prevención o el tratamiento de diversas enfermedades musculoesqueléticas.
[Breve descripción de los dibujos]
Las figuras 1A-1F muestran las características de hMSSC diferenciadas de hESC. La Figura 1A muestra el cambio en la morfología celular de hESC subcultivadas con un medio para inducir la diferenciación en una célula madre musculoesquelética, del pase 7 al pase 19. La Figura 1B muestra un resultado de observar la expresión de los marcadores de pluripotencialidad OCT4, NANOG, SOX2 y LIN28 en hMSSC por inmunocitoquímica. La Figura 1C muestra un resultado de confirmar la expresión de marcadores de pluripotencia, ectodérmicos, mesodérmicos y endodérmicos en hESC, hMSC y hMSSC en los pases 7 y 17 mediante secuenciación de ARN, dos veces respectivamente. La Figura 1D muestra un resultado de medir la expresión de antígenos de la superficie celular mediante citometría de flujo para la caracterización de hMSSC. La Figura 1F muestra un resultado del análisis de la expresión de diversos marcadores específicos de células mediante inmunocitoquímica para la caracterización de hMSSC. En la figura, DAPI representa núcleos teñidos y el triángulo azul indica una célula positiva para pgalactosidasa.
Las figuras 2A-2F muestran un resultado de comparar la capacidad de diferenciación in vitro de hMSSC con otros tipos de células. La Figura 2A muestra un resultado de comparar la capacidad de diferenciación el in vitro de hueso, cartílago y grasa de hMSC y hMSSC. La Figura 2B muestra un resultado de confirmar que hMSSC tiene el potencial de diferenciarse en músculo esquelético mediante inmunocitoquímica para el marcador específico de células de músculo esquelético MYH9. C2C12 se usó como grupo de control positivo para la célula del músculo esquelético. Las figuras 2C y 2D muestran un resultado de confirmar que hMSSC carece del potencial para diferenciarse en una célula endotelial mediante inmunocitoquímica para los marcadores específicos de células endoteliales CD31 y VE-cadherina. La Figura 2F muestra un resultado de confirmar que hMSSC carece del potencial para diferenciarse en una célula nerviosa mediante inmunocitoquímica para el marcador específico de células nerviosas MAP2. Como grupo de control positivo se utilizaron células madre neurales diferenciadas de H9 hESC.
Las figuras 3A-3C muestran un resultado de medir la diferenciabilidad de hMSSC in vivo. La Figura 3A-a muestra que se formaron músculo, grasa y tendón cuando se trasplantó hMSSC en el riñón, como se confirmó mediante tinción con H&E. La Figura 3A-b muestra un resultado de confirmar la diferenciación de hMSSC trasplantada en el riñón en células de músculo, grasa y tendón mediante inmunohistoquímica para el marcador específico de músculo pMLC, el marcador específico de grasa PPARgamma (PPAr) y el marcador específico de ligamento Scx. hLA es un marcador específico de células humanas. El resultado de la tinción muestra que la célula se deriva de humanos. La Figura 3B-a muestra un resultado de exploración por micro-CT que muestra que se formó hueso en el sitio donde se trasplantó hMSSC al riñón. Las figuras 3B-b y 3B-c muestran el resultado de confirmar la formación de hueso mediante tinción inmunohistoquímica con H&E y pentacromo. La Figura 3B-d muestra un resultado de confirmar la expresión del marcador celular humano hLA (antígeno leucocitario humano), los marcadores óseos Osx (osterix), Runx2, DMP1 y OCN (osteocalina) y el marcador vascular vWF en las células del tejido osteoblástico por inmunohistoquímica. La Figura 3C muestra el resultado de confirmar que el cartílago se formó como resultado de la diferenciación de hMSSC trasplantadas en el hipodermo en células de cartílago mediante H&E y tinción inmunohistoquímica con azul de toluidina. La expresión del marcador de cartílago ColII (colágeno II) también fue confirmada por inmunohistoquímica.
Las figuras 4A-4B muestran un resultado de confirmar el efecto de hMSSC en la recuperación de la fractura. La Figura 4A muestra que, cuando se trasplantó hMSC en el lugar de la fractura, las células del propio ratón formaron hueso, no las hMSC. La Figura 4A-a muestra imágenes de micro-CT obtenidas 2, 4 y 6 semanas después del trasplante de hMSC en el sitio de la fractura. La Figura 4A-b muestra un resultado de inmunohistoquímica H&E del fémur que contiene el sitio de fractura en el que se trasplantó hMSC. La Figura 4A-c muestra el resultado de ampliar la parte del cuadrado rojo de 4A-b. La Figura 4A-d muestra un resultado de confirmar que la hMSC trasplantada no se diferenció en células óseas mediante inmunohistoquímica para el marcador de células óseas Runx2 y el marcador de células humanas hLA. La Figura 4B muestra que, a diferencia de la hMSC, se formó hueso a medida que se diferenciaba la hMSSC trasplantada. La Figura 4B-a muestra imágenes de micro-CT obtenidas 2, 4 y 6 semanas después del trasplante de hMSSC en el sitio de la fractura. La Figura 4B-b muestra un resultado de inmunohistoquímica H&E del fémur que contiene el sitio de fractura en el que se trasplantó hMSSC. La Figura 4B-c muestra el resultado de ampliar la porción del cuadrado rojo de 4B-b. La Figura 4B-d muestra un resultado de confirmar que la hMSSC trasplantada se diferenció en células óseas mediante inmunohistoquímica para el marcador de células óseas Runx2 y el marcador de células humanas hLA.
Las figuras 5A-5D muestran un resultado de investigar si hiPSC también se diferencia en hMSSC como hESC. La Figura 5A muestra un resultado de confirmar el nivel de expresión de los marcadores de pluripotencia Oct4, Nanog, Sox2 y Lin28 en hMSSC diferenciadas de hiPS por inmunocitoquímica. La Figura 5B muestra un resultado de investigar la expresión de antígenos de superficie celular específicos en hMSSC diferenciados de hiPS por citometría de flujo. La Figura 5C muestra un resultado de confirmar la capacidad de diferenciación de hueso, cartílago y grasa in vitro de hMSSC diferenciada de hiPS. La Figura 5D muestra un resultado de la diferenciación de hMSSC diferenciada de hiPS en músculos esqueléticos en un medio para inducir la diferenciación en músculo esquelético y luego realizar inmunocitoquímica para el marcador de músculo esquelético MYH9.
La Figura 6 muestra un resultado de comparar el nivel de expresión de CD44 en un medio CM y en hMSSC diferenciado usando un medio para inducir la diferenciación en hMSSC por citometría de flujo.
La Figura 7 muestra un resultado de la tinción con azul alcián para confirmar la diferenciación en cartílago y tinción con ALP y rojo S de alizarina para confirmar la diferenciación en hueso con el fin de investigar la tendencia a la diferenciación en cartílago o hueso cuando algunos ingredientes están ausentes en un medio para inducir la diferenciación en hMSSC.
[Modo de invención]
A continuación, la presente divulgación se describirá en detalle a través de ejemplos. Sin embargo, los siguientes ejemplos son ilustrativos y será evidente para los expertos en la técnica que el alcance de la presente divulgación no está limitado por los ejemplos.
Ejemplos
Materiales y métodos experimentales.
Ejemplo 1. animales de experimentación
Se compraron ratones sin pelo Balb/c de 7 a 10 semanas de edad (con un peso de 20 a 24 g) de Orient Bio (Seongnam, Corea). Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las pautas del Comité de uso y cuidado de animales de la Universidad de Chonbuk. Los animales se alojaron en ambientes de temperatura controlada (21­ 24 °C) y ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h y se les dio libre acceso al agua y al alimento.
Ejemplo 2.1. Inducción de la diferenciación de hESC en hMSSC (Ejemplo de referencia)
Las hESC H9 (células madre embrionarias humanas) se compraron de WiCell (Madison, MI, EE. UU.). Las hESC se cultivaron en células alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) CF1 cuya división celular fue bloqueada por el tratamiento con mitomicina C. Se preparó un medio de cultivo hESC como DMEM/F12 (Invitrogen, EE. UU.) suplementado con reemplazo de suero knockout al 20% (KSR; Invitrogen, EE. UU.), glutamina 1 mM (Invitrogen, EE. UU.), aminoácidos no esenciales al 1 % (Invitrogen, EE. UU.), p-mercaptoetanol 0.1 mM (Invitrogen, EE. UU.), penicilina/estreptomicina al 0.1 % (Invitrogen, EE. UU.) y bFGF 15 ng/ml (R&D Systems, EE. UU.).
Se indujo a las hESC a diferenciarse en hMSSC (células madre musculoesqueléticas humanas) usando un medio para inducir la diferenciación en MSSC (en adelante, denominado “medio MSSC”) de la siguiente composición:
1) Nogina humana de 250 ng/ml (KOMA Biotech, Corea),
2) LIF humana de 20 ng/ml (KOMA Biotech, Corea),
3) 15 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico (FGF) (R&D Systems, EE. UU.) (activador de señalización de FGF2),
4) 3 |jM CHIR99021 (Caimán, EE. UU.) (activador de señalización Wnt),
5) 1 j M PD0325901 (Caimán, EE. UU.) (inhibidor de señalización ERK (quinasa regulada por señal extracelular)), 6) 10 j M SB431542 (Tocris, Reino Unido) (Inhibidor de señalización TGF-p/activina nodal) y
7) 10 % de reemplazo de suero knockout (Invitrogen, EE. UU.), 1 % de suplemento de N2 (Gibco, EE. UU.), 2 % de suplemento de b27 (Gibco, EE. UU.), 1 % de aminoácidos no esenciales (Gibco, EE. UU.), 43 % de DMEM/F12 (Gibco, EE. UU.), 43% Neurobasal (Gibco, EE. UU.), 1 mM glutamina, 0.1 mM p-mercaptoetanol, 0.1% penicilinaestreptomicina y 5 mg/ml albúmina sérica bovina (Gibco, EE. UU.).
Después de tratar las hESC con inhibidor de ROCK (quinasa en espiral asociada a Rho) (Y-27632, 10 j M, Calbiochem, Alemania) e inhibidor de PKC (proteína quinasa C) (Go6983, 2.5 j M, Sigma, EE. UU.) durante 24 horas con el fin de mejorar la capacidad de supervivencia y la tripsinización de las hESC mediante el tratamiento con TrypLE (Life Technologies, EE. UU.), ellas fueron inducidas a diferenciarse en hMSSC mediante el cultivo con el medio MSSC en una placa de cultivo recubierta con vitronectina y gelatina (1 ng/ml, Sigma, EE. UU.) hasta el pase 7. Se identificó que las células MSSC diferenciadas eran establemente idénticas desde el pase 5 y las células cultivadas durante 10 pases se depositaron en el Korean Cell Line Bank el 10 de octubre de 2018 y se les dio el número de acceso KCLRF-BP-00460.
Ejemplo 2.2. Inducción de la diferenciación de hiPSC en hMSSC
Las hiPSC (células madre pluripotentes inducidas humanas) se obtuvieron introduciendo los genes OCT4, KLF4, SOX2 y cmYc en fibroblastos Bj (ATCC®CRL2522™) utilizando el virus Sendai según el método desarrollado por Hasegawa et al. (Fusaki et al., 2009, PNAS 85, 348-362). Las hiPSC se cultivaron en células alimentadoras de fibroblastos embrionarios (MEF) de ratón CF1 cuya división celular fue bloqueada por el tratamiento con mitomicina C. Se preparó un medio de cultivo hiPSC como DMEM/F12 (Invitrogen, EE. u U.) complementado con 20% de reemplazo de suero knockout (KSR; Invitrogen, EE. UU.), glutamina 1 mM (Invitrogen, EE. UU.), 1 % de aminoácidos no esenciales (Invitrogen, EE. UU.), p-mercaptoetanol 0.1 mM (Invitrogen, EE. UU.), penicilina/estreptomicina al 0.1 % (Invitrogen, EE. UU.) y bFGF 15 ng/ml (R&D Systems, EE. UU.).
Se indujo a las hESC a diferenciarse en hMSSC (células madre musculoesqueléticas humanas) usando un medio para inducir la diferenciación en MSSC (en adelante, denominado “medio MSSC”) de la siguiente composición:
1) 250 ng/ml de nogina humana (KOMA Biotech, Corea),
2) 20 ng/m de LIF humana (KOMA Biotech, Corea),
3) 15 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico (FGF) (R&D Systems, EE. UU.) (activador de señalización de FGF2),
4) 3 j M de CHIR99021 (Caimán, EE. UU.) (activador de señalización Wnt),
5) 1 j M de PD0325901 (Caimán, EE. UU.) (inhibidor de señalización ERK (quinasa regulada por señal extracelular)), 6) 10 j M de SB431542 (Tocris, Reino Unido) (Inhibidor de señalización TGF-p/activina nodal) y
7) 10 % de reemplazo de suero knockout (Invitrogen, EE. UU.), 1 % de suplemento de N2 (Gibco, EE. UU.), 2 % de suplemento de b27 (Gibco, EE. UU.), 1 % de aminoácidos no esenciales (Gibco, EE. UU.), 43 % de DMEM/F12 (Gibco, EE. UU.), 43 % de Neurobasal (Gibco, EE. UU.), 1 mM de glutamina, 0.1 mM de p-mercaptoetanol, 0.1 % de penicilinaestreptomicina y 5 mg/ml de albúmina sérica bovina (Gibco, EE. UU.).
Después de tratar las hiPSC con el inhibidor ROCK (quinasa de espiral enrollada asociada a Rho) (Y-27632, 10 j M, Calbiochem, Alemania) y el inhibidor de PKC (protein kinase C) (Go6983, 2.5 j M, Sigma, EE. UU.) durante 24 horas con el fin de mejorar la capacidad de supervivencia y la tripsinización de las hiPSC mediante el tratamiento con TrypLE (Life Technologies, EE. UU.), se las indujo a diferenciarse en hMSSC mediante el cultivo con el medio MSSC en una placa de cultivo recubierta con vitronectina y gelatina (1 ng/ml, Sigma, EE. UU.) hasta el pase 7. Se identificó que las células MSSC diferenciadas eran establemente idénticas desde el pase 5.
Ejemplo 3. inmunohistoquímica
Las muestras obtenidas inyectando las hMSSC diferenciadas en el Ejemplo 2.1 en la hipodermis y el riñón de Balb/cdesnudo como se describe en los Ejemplos 10.1 y 10.2 se fijaron durante la noche a 4 °C en 2 % de paraformaldehído (PFA; Wako, Japón). Para investigar la diferenciación en hueso de una muestra, se llevó a cabo la descalcificación a 4 °C durante 2 semanas en PBS (pH 7.2) usando EDTA 0.4 M. Luego, las muestras fueron deshidratadas usando etanol y xileno secuencialmente, embebidas en parafina y cortadas a 5 j M de espesor. La superficie cortada se tiñó con H&E y se modificó con pentacromo de Movat (Cosmobio, Japón).
Ejemplo 4. secuenciación de ARN (Ejemplo de referencia)
Los ARN se extrajeron de hESC H9, células madre mesenquimales humanas (hMSC; Lonza, Suiza) y las hMSSC del Ejemplo 2.1 utilizando reactivo Trizol (Invitrogen, EE. UU.). La calidad del ARN se evaluó con el bioanalizador Agilent 2100 y el RNA 6000 Nano Chip (Agilent Technologies, EE. UU.) y la cuantificación se realizó con el espectrofotómetro ND-2000 (Thermo Inc., EE. u U.). Se estableció una biblioteca de ARN para secuenciación de ARN utilizando el kit de preparación de biblioteca SENSE 3' mRNA-Seq (Lexogen Inc., Australia). La secuenciación del ARN se realizó con NextSeq 500 (Illumina Inc., EE. UU.). Las lecturas de la secuencia de ARNm en sentido 3' se alinearon usando Bowtie2 versión 2.1.0. La diferencia en la expresión génica se determinó utilizando Bioconductor R versión 3.2.2 con EdgeR. Los datos de recuento de lectura se procesaron con Genowiz versión 4.0.5.6 (Ocium Biosolutions, EE. UU.).
Ejemplo 5. inmunoquímica
La “ inmunocitoquímica” se realizó de acuerdo con el siguiente método.
Para la tinción de inmunofluorescencia, las células se fijaron en al 4 % de paraformaldehído, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0.5 % y luego se bloquearon con suero de cabra normal al 10 %, conejo normal o bovino fetal en solución salina tamponada con fosfato (PBS). La muestra se tiñó durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra Tuj1 (Covance, EE. UU.), músculo liso a (a-SMA, Sigma, EE. UU.), Nanog (Santa Cruz, EE. Uu .) y Oct3/4 (Santa Cruz, EE. UU.), Sox2 (Santa Cruz, EE. UU.), CD31 (DAKO, Japón), cadherina endotelial vascular (R&D, EE. UU.), MYH9 (Santa Cruz, EE. UU.), HNK-1 (Santa Cruz, EE. UU.) y MAP- 2 (Santa Cruz, EE. UU.). Luego, las células se tiñeron con los anticuerpos secundarios IgG antiratón de cabra 488 Alexa Fluor, IgG anticonejo de burro 594 Alexa Fluor, IgG anticonejo de burro 488 Alexa Fluor e IgG antiratón de burro 594 Alexa Fluor (Invitrogen, EE. UU.). Luego, los núcleos celulares se tiñeron con DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol). Luego, las imágenes se obtuvieron utilizando el microscopio óptico Olympus IX71 y el software MetaMorph (Molecular Devices, EE. UU.).
La “ inmunohistoquímica” se realizó de acuerdo con el siguiente método.
Los tejidos se fijaron durante la noche a 4 °C con PFA al 4 % (Wako, Japón) en PBS. Todas las muestras fueron descalcificadas con solución de Morse. Las muestras se deshidrataron secuencialmente con etanol y xileno, se incluyeron en parafina (Leica Biosystems, Alemania) y luego se cortaron a 5 j M de espesor. Después de bloquear la superficie cortada durante 15 minutos en peróxido de hidrógeno al 3 %, las muestras se incubaron a 4 °C durante la noche con anticuerpos primarios. Los anticuerpos primarios tratados en la superficie de corte son los siguientes: anticuerpo monoclonal de ratón contra HLA clase I (Abcam, Reino Unido), anticuerpo policlonal de cabra contra colágeno tipo II (Santacruz, EE. UU.), anticuerpo policlonal de conejo contra osteocalcina (Santacruz, EE. UU.), osterix (Abcam, EE. UU.), cadena ligera de fosfomiosina (pMLC) (Abcam, EE. UU.), escleraxis (Antibodies Online, EE. UU.), PPARgamma (PPAr) (Santacruz, EE. UU.) Runx2 (Novus, EE. UU.), DMP1 (Santacruz, EE. UU.), vWF (Santacruz, EE. UU.) y esclerostina (Santacruz, EE. UU.). Los anticuerpos secundarios utilizados fueron IgG Alexa 555 (Invitrogen, EE. UU.) y Alexa 488 (Invitrogen, EE. UU.). La superficie de corte inmunoteñida se contrastó con TO-PRO3 (Invitrogen, EE. UU.) para visualizar los núcleos. Se tomaron imágenes de la superficie de corte marcada con fluorescencia con el microscopio Leica DM 5000 (Leica Microsystems, Alemania) o un microscopio confocal (LSM510; Carl Zeiss, Alemania) y se analizó con el software Zen.
Ejemplo 6. Citometría de flujo
Después de separar las hMSSC de los Ejemplos 2.1 y 2.2 en una suspensión de una sola célula mediante el tratamiento con tripsina/EDTA y unión no específica de bloqueo con 2 % BSA en PBS, las células se hicieron reaccionar con anticuerpos monoclonales contra Sca, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD10, CD11b, CD14, CD19, CD20, CD31, CD34, CD44, CD45, CD51, CD56, CD73, CD90, CD105, CD146, CD166, CD235a y CD271 (BD Biosciences, EE. UU.) en una solución tampón [1xPBS, 1 % BSA y azida sódica al 0.01%] y luego se lavó. Las células se hicieron reaccionar con IgG de ratón secundari 488 de Alexa Fluor (Invitrogen, EE. UU.), se lavaron y luego se analizaron con un citómetro de flujo (FACStar Plus Flowcytometer, BD Biosciences, EE. UU.). Se usaron IgG de ratón normal (BD Biosciences, EE. UU.) como grupo de control negativo.
Ejemplo 7.1. Diferenciación de células madre mesenquimales humanas (hMSC) y hMSSC en osteoblastos in vitro
Para diferenciar las hMSSC de los Ejemplos 2.1 y 2.2 en osteoblastos, las células se cultivaron en un medio de diferenciación osteogénica (StemPro® kit de diferenciación osteogénica, Life Technologies, EE. UU.) en condiciones de 37 °C y 5 % de CO2 durante 14 días. Se realizaron tinciones con fosfatasa alcalina (Roche, Suiza) y con rojo de alizarina S (Sigma, EE. UU.) para observar la osteogénesis. La diferenciación de hMSC (Lonza, Suiza) en osteoblastos también se comparó de la misma manera.
Ejemplo 7.2. Diferenciación de células madre mesenquimales humanas (hMSC) y hMSSC en adipocitos in vitro
Para diferenciar las hMSSC de los ejemplos 2.1 y 2.2 en adipocitos, las células se cultivaron en un medio de diferenciación adipogénico ((StemPro® adipogenic differentiation kit, Life Technologies, EE. UU.) en condiciones de 37 °C y 5% de CO2 durante 14 días. Se realizó tinción con aceite rojo O (Sigma, EE. UU.) para observar la adipogénesis. La diferenciación de hMSC (Lonza, Suiza) en adipocitos también se comparó de la misma manera.
Ejemplo 7.3. Diferenciación de células madre mesenquimales humanas (hMSC) y hMSSC en células de cartílago in vitro
Para diferenciar las hMSSC de los Ejemplos 2.1 y 2.2 en células de cartílago, las células se resuspendieron en un medio de diferenciación condrogénica (StemPro® chondrogenic differentiation kit, Life Technologies, EE. UU.) y luego se centrifuga. Para la formación de micromasa, los gránulos formados se resuspendieron en un medio de diferenciación a 1x105/|jl y luego se dejaron caer 5 pl de la solución celular en el centro de una placa de 96 pocillos. Después de incubar la micromasa durante 2 horas en condiciones de alta humedad y agregar un medio de diferenciación condrogénico calentado, se realizó la incubación en una incubadora en condiciones de 5 % de CO2 y 37 °C. El medio de cultivo se realimentó con intervalos de 3 a 4 días. 14 días después, los gránulos condrogénicos se tiñeron con azul alcián. La diferenciación de hMSC (Lonza, Suiza) en células de cartílago también se comparó de la misma manera.
Ejemplo 8.1. Capacidad de diferenciación de hMSSC en la célula endotelial in vitro
Se investigó si las hMSSC del Ejemplo 2.1 se diferencian en células endoteliales (EC). Las hMSSC se diferenciaron mediante cultivo con un medio para inducir la diferenciación en un EC (endothelial growth medium(EGM)-2 (Lonza, Walkersville, MD, USA.) suplementado con 50 ng/ml de VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular: ProSpec, Rehovot, Israel) y 10 ng/ml de bFGF (factor básico de crecimiento de fibroblastos; ProSpec, Rehovot, Israel) durante 6 días. La diferenciación se confirmó por inmunocitoquímica.
Ejemplo 8.2. Capacidad de diferenciación de hMSSC en células de músculo esquelético in vitro
Se investigó si las hMSSC de los Ejemplos 2.1 y 2.2 se diferencian en células de músculo esquelético. Las hMSSC se diferenciaron mediante cultivo con un medio de diferenciación de músculo esquelético (DMEM suplementado con B27 al 2 %) durante 2 semanas en un cubreobjetos recubierto con Matrigel. La diferenciación se confirmó por inmunocitoquímica.
Ejemplo 9. Inducción de diferenciación de hMSSC a célula nerviosa in vitro
Para la diferenciación en células nerviosas, las hMSSC del ejemplo 2.1 se sembraron en placas de cultivo recubiertas con poliornitina y laminina. 2 días más tarde, el medio de cultivo se intercambió con un medio para inducir la diferenciación en un nervio (medio neurobasal que contenía B27 al 2 %, GlutaMAX 2 mM y antibióticos). A partir del día 7, se añadió dibutil cAMP 0.5 mM (Sigma, EE. UU.) todos los días durante 3 días. Como grupo de control, las células madre neurales humanas diferenciadas de H9 hESC (Gibco, EE. UU.) se diferenciaron en células nerviosas de la misma manera. La diferenciación se confirmó por inmunocitoquímica.
Ejemplo 10.1. Capacidad de diferenciación de hMSSC en riñón de ratón
Para medir la capacidad de diferenciación de las hMSSC del Ejemplo 2.1 en riñón de ratón, las hMSSC se cultivaron con un medio MSCGM-CD (Lonza, Suiza) durante 2-5 pases y las hMSSC (2x105 células) se cultivaron en un pocillo de gel de agarosa con DMEM 20 % FBS durante 2 días para formar agregados celulares, que se trasplantaron a la cápsula renal del ratón desnudo Balb/c. La inmunohistoquímica y la tinción inmunohistoquímica se realizaron 4 semanas después del trasplante.
Ejemplo 10.2. Capacidad de diferenciación de hMSSC en hipodermo de ratón
Para medir la capacidad de diferenciación de las hMSSC del Ejemplo 2.1 en hipodermo de ratón, las hMSSC se cultivaron con un medio MSCGM-CD (Lonza, Suiza) durante 2-5 pases y las hMSSC (2x105 células) se cargaron en pegamento de fibrina (Greenplast®, Green Cross, Corea) al que se le añadió 1 pg/ml de ácido hialurónico (Sigma, EE. UU.) y luego se trasplantó en el hipodermo del ratón desnudo Balb/c. La inmunohistoquímica y la tinción inmunohistoquímica se realizaron 4 semanas después del trasplante.
Ejemplo 11.1. Prueba de osteogénesis usando hMSC
Para el análisis de la osteogénesis de hMSC en un modelo de fractura de fémur, se cultivaron hMSC (Lonza, Suiza) con un medio MSCGM-CD (Lonza, Suiza) durante 7 pases y luego se absorbieron en una membrana de colágeno (SK Bioland, Corea) cortada en un tamaño de 1 mM * 1 mM. Después de perforar una tibia de un ratón desnudo Balb/c de 6 semanas de edad de aproximadamente 1 mM con un taladro (Bosch Professional, Alemania), las hMSC absorbidas en la membrana de colágeno se insertaron en el lugar de la fractura del ratón. Cada dos semanas, el ratón fue anestesiado y se obtuvieron imágenes de micro-CT (Skyscan 1076, Antwerp, Bélgica) para el sitio de la fractura. La inmunohistoquímica y la tinción inmunohistoquímica se realizaron 6 semanas después.
Ejemplo 11.2. Prueba de osteogénesis usando hMSSC
Para el análisis de la osteogénesis de hMSSC en un modelo de fractura de fémur, las hMSSC del Ejemplo 2.1 se cultivaron con un medio MSCGM-CD (Lonza, Suiza) durante 2-5 pases y luego se absorbieron en una membrana de colágeno (SK Bioland, Corea) cortada para un tamaño de 1 mM * 1 mM. Después de perforar una tibia de un ratón desnudo Balb/c de 6 semanas de edad aproximadamente 1 mM con un taladro (Bosch Professional, Alemania), las hMSSC absorbidas en la membrana de colágeno se insertaron en el lugar de la fractura del ratón. Cada dos semanas, el ratón fue anestesiado y se obtuvieron imágenes de micro-CT (Skyscan 1076, Antwerp, Bélgica) para el sitio de la fractura. La inmunohistoquímica y la tinción inmunohistoquímica se realizaron 6 semanas después.
Ejemplo 12. Micro-CT
El hueso formado en el riñón en el que se trasplantaron las hMSSC en el Ejemplo 10.1 se escaneó mediante micro-CT (Skyscan 1076, Antwerp, Bélgica) para obtener imágenes CT (tomografía computarizada) 3D. Luego, los datos se digitalizaron con un capturador de fotogramas y las imágenes resultantes se transmitieron a un ordenador utilizando el software de reconstrucción topográfica Comprehensive TeX Archive Network (CTAN).
Ejemplo 13. Medición de los niveles de expresión de ARNm de scx, Runx2 y MYH9
Los ARN se extrajeron del trasplante de las hMSSC del Ejemplo 2.1 en el riñón usando 500 pl de Trizol (Life Technologies, EE. UU.) según el protocolo del fabricante. Después de tratar el trasplante de las hMSSC en el riñón con ADNasa (RQ1 DNasa, Promega, EE. UU.), se transcribieron inversamente 500 ng de ARN a ADNc utilizando oligo-d(T) y hexámeros aleatorios según el protocolo de síntesis de ADNc de primera cadena Superscript III RT (Life Technologies, EE. UU.). El qRT-PCR se realizó en el ciclador de PCR StepOne Plus (Applied Biosystems) utilizando SYBR green (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los datos de expresión de ARNm se analizaron mediante el método AACT y se normalizaron con gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) para la detección de genes. Los cebadores necesarios para qRT-PCR se adquirieron de Qiagen (EE. UU.). Como grupo de control, se extrajeron los ARN de hMSSC y se realizó qRT-PCR de la misma manera.
Resultados experimentales
Ejemplo de prueba 1. Confirmación de la inducción de diferenciación de hMSSC derivada de hESC
Marcador de envejecimiento
Se indujo la diferenciación de hESC a hMSSC como se describe en el ejemplo 2 y se observó el cambio morfológico de las hMSSC inducidas. El resultado se muestra en la Figura 1A. Como se ve en la Figura 1A, se confirmó que las hESC H9 individuales indiferenciadas se diferenciaron en células con morfología de fibroblastos en 7 pases. Ellas crecieron con morfologías similares durante 10 pases o más, desde el pase 7 al 17, y mostraron una respuesta positiva a la tinción con el marcador de envejecimiento p-galactosidasa desde el pase 19, lo que sugiere que el envejecimiento progresó.
Confirmación de marcador de pluripotencia por método de inmunofluorescencia
La expresión de marcadores de pluripotencia en las hMSSC después de 7 pases o más desde que se observó la inducción de las hESC mediante el método de inmunofluorescencia. El resultado se muestra en la Figura 1B. A modo de comparación, se investigó la expresión de marcadores de pluripotencia en hESC H9 mediante el método de inmunofluorescencia.
Como se ve en la Figura 1B, las hESC H9 fueron positivas para todos los OCT4, NANOG, SOX2 y LIN28, lo que sugiere que tienen pluripotencia. Por el contrario, las hMSSC inducidas a partir de las hESC H9 fueron negativas para OCT4, NANOG, SOX2 y LIN28.
Confirmación de marcadores de pluripotencia ectodérmicos, mesodérmicos y endodérmicos mediante secuenciación de ARN
La expresión de marcadores de pluripotencia, ectodérmicos, mesodérmicos y endodérmicos en hESC, hMSC y hMSSC en los pases 7 y 17 se investigó mediante secuenciación de ARN. El resultado se muestra en la Figura 1C. Se confirmó la expresión de los mRNAs de los marcadores de pluripotencia TDGF, NANOG, POU5F1, SOX2, DPPA4, LEFTY1, GDF3, etc., en las hESCs H9 (hESC-1, hESC-2). Por el contrario, para las hMSSC inducidas a partir de las hESC H9, se observó la expresión del marcador de pluripotencia DPPA4 pero no se observó la expresión de los marcadores de pluripotencia TDGF, NANOG, POU5F1, LEFTY1 y GDF3. El nivel de expresión de DPPA4 fue comparable al de las hESC H9.
La expresión de DPPA4 no se observó en las células madre mesenquimales humanas. Además, las hMSSC fueron positivas para el marcador ectodérmico NES, fueron positivas para la mayoría de los marcadores mesodérmicos excepto DES y los marcadores mesodérmicos tempranos T y nodales y fueron negativas para la mayoría de los marcadores endodérmicos. En particular, NES no se expresó en las células madre mesenquimales.
Confirmación de marcadores de células madre mesenquimales a través de la expresión de antígenos de superficie celular
La expresión de antígenos en la superficie de hMSSC se midió como se ve en la Figura 1D. Cuando se investigó la expresión de antígenos de superficie celular específicos de células madre mesenquimales, se observó la expresión de los marcadores de células madre mesenquimales CD44, CD51, CD73, CD105, CD146 y CD166 en las hMSSC, pero la expresión de los marcadores de células madre mesenquimales CD90 y CD271 no se observó. Además, no se observó la expresión de los marcadores de superficie de células vasculares CD2, CD3, CD7, CD8, CD11b, CD14, CD19, CD20, CD31, CD34 y CD56 pero se observó la expresión del marcador de células pre-B CD10.
Confirmación de otros marcadores específicos de células
Se analizó la expresión de diversos marcadores específicos de tejido para investigar las características de las hMSSC como se muestra en la Figura 1F. Se expresaron el marcador mesodérmico alfa actina de músculo liso (a-SMA), el marcador neuroectodérmico Pax6, el marcador satélite miogénico Pax7, el marcador de células madre intestinales LGR5, etc., mientras que no se expresó el marcador de condrocitos SOX9, el marcador de mioblastos MyoD, etc. Esto sugiere que las hMSSC son células progenitoras antes de la diferenciación en células de cartílago y células musculares.
Ejemplo de prueba 2. Capacidad de diferenciación de hMSSC in vitro
La osteogénesis, condrogénesis y adipogénesis in-vitro se ensayaron, para hMSC y hMSSC del Ejemplo 2.1 (Ejemplo 7) y el resultado se muestra en la Figura 2A. De la Figura 2A, se confirmó que las hMSC podían diferenciarse en hueso, cartílago y grasa in vitro. Mientras tanto, las hMSSC se diferenciaron en hueso y cartílago, pero apenas se diferenciaron en grasa en las mismas condiciones in vitro. Es decir, se encontró que las células eran funcionalmente diferentes de las células madre mesenquimales.
Diferenciabilidad en músculo esquelético
Se investigó si las hMSSC del Ejemplo de prueba 1 tienen el potencial de diferenciarse en músculo esquelético.
Las hMSSC se cultivaron durante 2 semanas en un medio para inducir la diferenciación en músculo esquelético (DMEM que contenía B27 al 2 %) en un cubreobjetos recubierto con Matrigel y luego se realizó un ensayo de inmunofluorescencia para el marcador de músculo esquelético MYH9. El resultado se muestra en la Figura 2b. Las células C2C12 se usaron como grupo de control. Como se ve en la Figura 2B, se confirmó que el marcador específico de músculo esquelético MYH9 se expresó cuando las hMSSC se cultivaron en el medio de diferenciación de músculo esquelético, lo que sugiere que las hMSSC tienen el potencial de diferenciarse en músculo esquelético.
Diferenciabilidad en células endoteliales
Se investigó si las hMSSC del Ejemplo de prueba 1 tienen el potencial de diferenciarse en células endoteliales.
Las hMSSC se cultivaron durante 6 días en un medio para inducir la diferenciación en un EC (medio de crecimiento endotelial (EGM)-2 (Lonza, Walkersville, MD)) suplementado con 50 ng/ml de VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular: ProSpec, Rehovot, Israel) y 10 ng/ml de bFGF (factor básico de crecimiento de fibroblastos; ProSpec) y luego se realizó un ensayo de inmunofluorescencia para los marcadores de células endoteliales CD31 y VE-cadherina. El resultado se muestra en las figuras 2C y 2D. Las HUVEC se utilizaron como grupo de control positivo para la diferenciación de células endoteliales. Como se ve en la Figura 2C y la figura. 2D, la expresión de CD31 y VE-cadherina no se observó en las hMSSC, lo que sugiere que las hMSSC carecen del potencial para diferenciarse en células endoteliales. Por el contrario, la expresión de los marcadores se observó en el grupo de control HUVEC.
Diferenciabilidad en célula nerviosa
Las hMSSC se incubaron durante 7 días en un medio para inducir la diferenciación en un nervio (medio neurobasal que contenía B27 al 2 %, GlutaMAX 2 mM y antibióticos) y luego se cultivaron durante 3 días mientras se agregaba dibutil cAMP (Sigma) 0.5 mM todos los días. Luego, se realizó un ensayo de inmunofluorescencia para el marcador de diferenciación de células nerviosas MAP2. El resultado se muestra en la Figura 2f. Las NSC (células madre neuronales) se utilizaron como grupo de control positivo para la diferenciación de las células nerviosas. Como se ve en la Figura 2F, la morfología celular de las NSC se cambió a la de las células nerviosas y se observó la expresión del marcador específico de células nerviosas MAP2, lo que sugiere que las células se diferenciaron en células nerviosas. Por el contrario, las hMSSC no mostraron cambios en la morfología celular y no se observó la expresión de MAP2, lo que sugiere que carecen del potencial para diferenciarse en células nerviosas.
Aunque las hMSSC fueron positivas para el marcador ectodérmico NES como se confirmó en el Ejemplo de prueba 1, ellas no se diferenciaron en células nerviosas. Se confirmó que la hMSSC se puede diferenciar en mesodermo, más particularmente en hueso, cartílago y músculo.
Ejemplo de prueba 3. Confirmación de la diferenciación de hMSSC en hueso, cartílago, músculo, grasa y tendón en vivo
Para medir la diferenciabilidad de las hMSSC inducidas de la misma manera que en el Ejemplo 2 in vivo, las hMSSC se trasplantaron al riñón (Ejemplo 10.1) y al hipodermo (Ejemplo 10.2) de un ratón inmunodeficiente. Después de trasplantar las hMSSC en riñón de ratón y teñir tejidos con H&E 3-4 semanas después, se realizó tinción de inmunofluorescencia para marcadores específicos de hueso, músculo, grasa y tendón y los núcleos celulares se contratiñeron con TO-PRO3. El resultado se muestra en la Figura 3A y la Figura 3B.
La Figura 3A muestra imágenes obtenidas 4 semanas después de cultivar las hMSSC en un medio MSCGM-CD (Lonza, Suiza) durante 2-5 pases y trasplantarlas al riñón. El resultado de la tinción H&E muestra que el músculo, la grasa y el tendón se formaron bien en el riñón (figura 3A-a). Cuando se analizaron los tejidos musculares diferenciados, se observó la diferenciación en músculo esquelético pero no se observó la diferenciación en músculo liso. Por el contrario, cuando se trasplantaron MSC humanas en las mismas condiciones, no se formó en absoluto músculo, grasa, tendón, etc. (datos no mostrados). Cuando se realizó el ensayo inmunohistoquímico, se confirmó que cada tejido diferenciado era positivo para el marcador muscular de cadena ligera de fosfomiosina (pMLC), el marcador adiposo PPARgamma (PPAr), el marcador de tendón sleraxis (Scx), etc., y también fue positivo para el marcador celular humano hLA (antígeno leucocitario humano). A partir de esto, se puede ver que las hMSSC trasplantadas se diferenciaron en células de músculo, grasa y tendón (esto es contrario al resultado de la prueba in vitro que no muestra diferenciación en grasa) (figura 3A-b).
La Figura 3B-a muestra un resultado de exploración por micro-CT que muestra que se formó tejido duro, o hueso, en el sitio donde se trasplantó la hMSSC al riñón.
Las figuras 3B-b y 3B-c muestran el resultado de confirmar la formación de hueso mediante tinción con H&E y pentacromo. Puede verse que las hMSSC trasplantadas se diferenciaron en hueso en la cápsula renal.
La Figura 3B-d muestra el ensayo inmunohistoquímico en el sitio trasplantado. Se confirmó que las células del tejido eran positivas para el marcador celular humano hLA (antígeno leucocitario humano), los marcadores óseos Osx (osterix), Runx2, DMP1, OCN (osteocalina), etc., y el marcador vascular vWF, lo que sugiere que el hueso se confirmó. Por lo tanto, puede verse que las hMSSC trasplantadas se diferenciaron en hueso.
La Figura 3C muestra que las hMSSC trasplantadas en hipodermo de ratón mediante la carga de pegamento de fibrina a la que se añadió ácido hialurónico se diferenciaron en células de cartílago. La formación de cartílago se confirmó mediante tinción con H&E y azul de toluidina.
En conjunto, se confirmó que las hMSSC de la presente divulgación pueden diferenciarse en cartílago, músculo, tendón y hueso en el sitio trasplantado y tienen una capacidad de diferenciación superior.
Ejemplo de prueba 5. Confirmación del efecto de recuperación de fracturas de hMSSC
Para confirmar la recuperación de la fractura de las hMSSC inducidas de la misma manera que en el Ejemplo 2, se realizó una prueba de osteogénesis como en el Ejemplo 11. El resultado se muestra en las figuras 4A-4B.
Se confirmó que, cuando las hMSC se trasplantaron en un sitio de fractura en un modelo de fractura de fémur, se formó hueso aproximadamente 6 semanas más tarde en el sitio de fractura. Sin embargo, debido a que el sitio osteogénico fue positivo para el marcador óseo Runx2 pero negativo para el marcador de células humanas hLA, se estimó que la osteogénesis no fue por las hMSC trasplantadas sino por las células de ratón (figura 4A). Por el contrario, cuando se trasplantaron hMSSC en las mismas condiciones, se formó hueso unas 6 semanas más tarde en el sitio de la fractura, siendo el sitio osteogénico positivo para Runx2 y positivo para el marcador celular humano hLA. Esto sugiere que la formación de hueso se debió a la diferenciación de las hMSSC (figura 4B).
Ejemplo de prueba 6. Inducción de la diferenciación de hiPSC en hMSSC y caracterización de hiPSC inducida
Se prepararon hiPSC (células madre pluripotentes inducidas humanas) mediante la reprogramación de fibroblastos IMR90 embrionarios mediante la sobreexpresión de OCT4, KLF4, SOX2 y MYC utilizando el virus Sendai según el método desarrollado por Hasegawa et al. (Fusaki et al., 2009).
Las iPS-hMSSC se obtuvieron induciendo hMSSC a partir de hiPSC de la misma manera que en el Ejemplo 2. El nivel de expresión de los marcadores de pluripotencia Oct4, Nanog, Sox2 y Lin28 en las iPS-hMSSC se investigó mediante ensayo de inmunofluorescencia y RT-PCr . El resultado se muestra en la Figura 5A.
Como se ve en la Figura 5A, las células iPS fueron positivas para OCT4, NANOG, SOX2 y LIN28, lo que sugiere que las células tienen pluripotencia. Por el contrario, las iPS-hMSSC fueron negativas para los marcadores de pluripotencia OCT4, NANOG, SOX2 y LIN28.
La Figura 5B muestra un resultado de medir la expresión de antígenos de superficie para las iPS-hMSSC. Cuando se investigó la expresión de antígenos de superficie celular específicos de células madre mesenquimales, se confirmó que, entre los marcadores de células madre mesenquimales, CD44, CD51, CD73, CD105, CD146 y CD166 se expresaron en las iPS-hMSSC, pero CD90 y CD271 no se expresaron en las iPS-hMSSC. Además, se expresó el marcador de células pre-B CD10 mientras que los marcadores de superficie de células vasculares CD2, CD3, CD7, CD8, CD14, CD20 y Cd 56 no se expresaron.
Además, se evaluaron la osteogénesis, la condrogénesis y la adipogénesis de las iPS-hMSSC de la misma manera que en el Ejemplo de prueba 2. El resultado se muestra en la Figura 5C. Como se ve en la Figura 5C, se confirmó que las hMSSC inducidas a partir de las hiPSC se diferenciaron en hueso y cartílago in vitro pero apenas se diferenciaron en grasa.
Además, las iPS-hMSSC se cultivaron durante 2 semanas en un medio para inducir la diferenciación en músculo esquelético (DMEM que contenía B27 al 2 %) en un cubreobjetos recubierto con Matrigel y luego se realizó un ensayo de inmunofluorescencia para el marcador de músculo esquelético MYH9. El resultado se muestra en la Figura 5D. Las células C2C12 se usaron como grupo de control. Como se ve en la Figura 5D, se confirmó que las hMSSC inducidas a partir de las hiPSC tienen el potencial de diferenciarse en músculo esquelético.
En conjunto, se confirmó que las hMSSC inducidas a partir de hiPSC tienen las mismas características que las hMSSC inducidas a partir de hECS, lo que sugiere que las hMSSC se pueden obtener utilizando hiPSC en lugar de hECS.
Ejemplo de prueba 7. Diferenciabilidad de hMSSC inducida de hiPSC in vivo
Trasplante en riñón
Después de trasplantar las hMSSC del Ejemplo de prueba 6 en riñón de ratón, el tejido se tiñó con H&E 3-4 semanas más tarde. Se confirmó que en el riñón se formaron músculo, grasa y tendón. El resultado del ensayo inmunohistoquímico para el sitio trasplantado fue positivo para el marcador muscular de cadena ligera de fosfo-miosina (pMLC), el marcador adiposo PPARgamma (PPAr), el marcador de tendón sleraxis (Scx), etc., y también positivo para el marcador celular humano hLA (antígeno leucocitario humano). Además, el resultado fue positivo para los marcadores óseos Osx (osterix), Runx2, DMP1, OCN (osteocalina), etc. A través de esto, se confirmó que las hMSSC inducidas a partir de las iPSC se pueden diferenciar en músculo, grasa, tendón y hueso.
Trasplante en hipodermo
Cuando las hMSSC del Ejemplo de prueba 6 se trasplantaron en hipodermo de ratón cargándolas con pegamento de fibrina al que se añadió ácido hialurónico, se confirmó mediante tinción con H&E y azul de toluidina que las hMSSC se pueden diferenciar en cartílago.
Ejemplo comparativo 1. Comparación de la capacidad de diferenciación del medio MSSC que contiene nogina y el medio CM que contiene medio acondicionado
La capacidad de diferenciación de un medio (en adelante, “medio CM”) obtenida al reemplazar la nogina humana (Life Technologies), es decir, el ingrediente constitucional 1) de los siete ingredientes constitucionales del medio MSSC del ejemplo 2, por un medio condicionado (un sobrenadante de cultivo obtenido después de cultivar células CF1 con un medio obtenido reemplazando DMEM/F12 en un medio completo con DMEM knockout (suplementado con 20 % de reemplazo de suero knockout (Invitrogen, EE. UU.), glutamina 1 mM, 1 % de aminoácidos no esenciales (Invitrogen, EE. Uu .), p-mercaptoetanol 0.1 mM, penicilina-estreptomicina al 0.1 % y albúmina de suero bovino 5 mg/ml)) (los ingredientes constitucionales restantes 2)-7) son idénticos) se comparó con el del medio MSSC.
La nogina se usa generalmente para mantener las características de hESC durante el cultivo (Chaturvedi G, Simone PD, Ain R, Soares MJ, Wolfe m W. Noggin maintains pluripotency of human embryonic stem cells grown on Matrigel. Cell Prolif. 2009 Aug; 42(4): 425-33). Contrariamente al mecanismo previamente conocido, aumentó significativamente la tendencia hacia el mesodermo. Como puede verse en la Tabla 1, la tendencia a la diferenciación osteogénica aumentó 10 veces o más cuando se contenía nogina, en comparación con cuando se utilizó el medio CM.
[Tabla 1] Tendencia de diferenciación del medio MSSC frente al medio CM (número de observaciones de 20 diferenciaciones)
Figure imgf000017_0001
Además, se comparó el nivel de expresión de CD44 para los dos medios. Después de inducir la diferenciación utilizando el medio que contiene CM (medio CM) y el medio que contiene nogina (medio MSSC), se midió el nivel de expresión de CD44 de la misma manera que en el Ejemplo 6. Como resultado, se confirmó que el nivel de expresión de CD44 aumentó notablemente cuando se usó el medio MSSC que contenía nogina en comparación con cuando se usó el medio CM (figura 6).
Durante la diferenciación osteogénica, la formación de hueso endocondral ocurre solo después de la condrogénesis. Se sabe que CD44 juega un papel esencial en la condrogénesis (Wu SC, Chen CH, Chang JK, Fu YC, Wang CK, Eswaramoorthy R, Lin YS, Wang YH, Lin SY, Wang GJ, Ho ML: Hyaluronan initiates chondrogenesis mainly via cd44 in human adiposederived stem cells. J Appl Physiol (1985) 2013; 114: 1610-1618). A partir de los resultados anteriores, puede verse que el uso del medio MSSC en lugar del medio CM es adecuado para la diferenciación osteogénica.
Cuando las hMSSC se trasplantaron al riñón, las células diferenciadas por el medio hMMSC mostraron una diferenciación de 1 a 2 semanas más rápida en comparación con las células diferenciadas por el medio CM. La diferencia en la velocidad de diferenciación cuando se usó el medio CM y cuando se usó el medio hMMSC se muestra en la Tabla 2.
[Tabla 2] Velocidad de diferenciación del medio MSSC frente al medio CM (nivel de ARNm aumentado en comparación con antes del trasplante de hMSSC)
Figure imgf000017_0002
Ejemplo comparativo 2. Comparación del efecto sinérgico de combinaciones de ingredientes constitucionales del medio MSSC
La capacidad de diferenciación del medio MSSC del Ejemplo 2 que no contiene uno de los ingredientes constitucionales 1)-6) se comparó con la del medio MSSC. Como resultado, se confirmó que la diferenciación en cartílago (azul alcián) o hueso (ALP y rojo alizarina S) no se lograba bien cuando uno de los ingredientes constitucionales 1)-6) estaba ausente (figura 7, Tabla 3).
Figure imgf000018_0001
Los expertos en la técnica apreciarán que las concepciones y realizaciones específicas divulgadas en la descripción anterior pueden utilizarse fácilmente como base para modificar o diseñar otras realizaciones para llevar a cabo los mismos propósitos de la presente divulgación.

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Una composición de medio para inducir la diferenciación en una célula madre musculoesquelética (MSSC), que comprende nogina, LIF (factor inhibidor de la leucemia), bFGF (factor de crecimiento de fibroblastos básico), activador de señalización Wnt, inhibidor de señalización ERK (quinasa regulada por señal extracelular) e inhibidor de señalización TGF-p/activina/nodal.
2. Una composición de medio para inducir la diferenciación según la reivindicación 1, en la que el activador de la señalización de Wnt es SB216763 (3-(2,4-diclorofenil)-4-(1-metiMH-indol-3-il)-1H-pirrol-2,5-diona), SB415286 (3-[(3-cloro-4-hidroxifenil)amino]-4-(2-nitrofenil)-1H-pirrol-2,5-diona), kenpaulona (9-bromo-7,12-dihidro-indolo[3,2-d]-[1]benzazepin-6(5H)-ona), CHIR99021 (9-bromo-7,12-dihidro-pirido[3',2':2,3]azepino[4,5-b]indol-6(5H)-ona), CP21R7 (3-(3-amino-fenil)-4-(1-metil-1H-indol-3-il)-pirrol-2,5-diona), SB203580 (4-(4-fluorofenil)-2-(4-metilsulfinilfenil)-5-(4-piridil)-1H-imidazol), H-89 (5-isoquinolinasulfonamida), purmorfamina (2-(1-naftoxi)-6-(4-morfolinoanilino)-9-ciclohexilpurina) o IQ-1 (2-(4-acetil-fenilazo)-2-[3,3-dimetil-3,4-dihidro-2H-isoquinolin-(1E)-ilideno]-acetamida).
3. Una composición de medio para inducir la diferenciación según la reivindicación 1, en la que el inhibidor de la señalización de ERK (quinasa regulada por señal extracelular) es AS703026 (N-[(2S)-2,3-dihidroxipropil]-3-[(2-fluoro-4-yodofenil)amino]-isonicotinamida), AZD6244 (6-(4-bromo-2-cloroanilino)-7-fluoro-N-(2-hidroxietoxi)-3-metilbencimidazol-5-carboxamida), PD0325901 (N-[(2R)-2,3-dihidroxipropoxi]-3,4-difluoro-2-[(2-fluoro-4-yodofenil)amino]-benzamida), ARRY-438162 (5-[(4-bromo-2-fluorofenil)amino]-4-fluoro-N-(2-hidroxietoxi)-1-metil-1H-bencimidazol-6-carboxamida), RDEA119 ((S)-N-(3,4-difluoro-2-((2-fluoro-4-yodofenil)amino)-6-metoxifenil)-1-(2,3-dihidroxipropil)ciclopropano-1-sulfonamida), GDC0973 ([3,4-difluoro-2-(2-fluoro-4-yodoanilino)fenil]-3-hidroxi-3-[(2S)-piperidin-2-il]-azetidin-1-il-metanona), TAK-733 ((R)-3-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-5-(2-fluoro-4-yodofenilamino)-8-metilpirido[2,3-d]pirimidina-4,7(3H,8H)-diona), RO5126766 (3-[[3-fluoro-2-(metilsulfamoilamino)-4-piridil]metil]-4-metil-7-pirimidin-2-iloxicromen-2-ona) o XL-518 ([3,4-difluoro-2-[(2-fluoro-4-yodofenil)amino]fenil][3-hidroxi-3-[(2S)-2-piperidinil]-1-azetidinil]metanona).
4. Una composición de medio para inducir la diferenciación según la reivindicación 1, en la que el Inhibidor de señalización TGF-p/activina/nodal es E-616452 (2-[3-(6-metil-2-piridinil)-1H-pirazol-4-il]-1,5-naftiridina), A-83-01 (3-(6-metil-2-piridinil)-N-fenil-4-(4-quinolinil)-1H-pirazol-1-carbotioamida) o SB431542 (4-[4-(1,3-benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1H-imidazol-2-il]benzamida).
5. Un método para preparar una célula madre musculoesquelética, que comprende una etapa de cultivo de una ESC (célula madre embrionaria) o una iPS (célula madre pluripotente inducida) en la composición del medio para inducir la diferenciación en una célula madre musculoesquelética según la reivindicación 1.
6. El método para preparar una célula madre musculoesquelética según la reivindicación 5, en el que el cultivo se realiza durante 5 pases o más sin cambiar la composición del medio.
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