ES2941895T3

ES2941895T3 - Métodos y composiciones para radioetiquetado con 18F del dominio de fibronectina tipo (III)

Info

Publication number: ES2941895T3
Application number: ES15805711T
Authority: ES
Inventors: David Donnelly
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2014-11-25
Filing date: 2015-11-24
Publication date: 2023-05-26
Anticipated expiration: 2035-11-24
Also published as: CA2968961A1; JP6701217B2; EP4218832A2; MX385081B; JP7027480B2; EP3223866A2; US11229713B2; CN107207379B; EA034516B1; EA201791167A1; US20220184239A1; CN107207379A; WO2016086036A2; EP4218832A3; JP2020122007A; WO2016086036A3; US20180326098A1; BR112017010414A2; EP3223866B1; JP2018503679A

Abstract

La invención se refiere a grupos protésicos de 18 F solubles en agua y a la síntesis y uso de moléculas biológicas marcadas con 18 F que contienen los grupos protésicos de 18 F para obtener imágenes de varios procesos dentro del cuerpo, para detectar la ubicación de moléculas asociadas con la patología de la enfermedad, y para controlar la progresión de la enfermedad. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones para radioetiquetado con 18F del dominio de fibronectina tipo (III)

Campo de la Invención

La invención se refiere a grupos prostéticos de 18F y la síntesis y el uso de composiciones etiquetadas con 18F para formar imágenes de varios procesos dentro del cuerpo, para detectar la ubicación de moléculas asociadas a la patología de la enfermedad y para monitorear el progreso de la enfermedad.

Antecedentes de la Invención

La tomografía de emisión de positrón (PET, por sus siglas en inglés) es una técnica de formación de imagen no invasiva que ha llegado a ser uno de los métodos más ampliamente usados en la medicina de diagnóstico y desarrollo del fármaco, con alta sensibilidad (fmol) alta resolución (4-10 mm) y acrecentamiento del tejido que puede ser cuantificado. La información funcional in vivo valiosa acerca de los procesos biológicos en sujetos vivos proporcionado por la imagen de PET también proporciona una ventaja médica de transición única en que la misma herramienta puede ser usada tanto preclínicamente como clínicamente.

La PET depende del diseño y síntesis de moléculas etiquetadas con radioisótopos que emiten positrón que incluyen 18F, 64Cu, 11C, 15O, 13N, 66Ga, 68Ga, 76Br, 89Zr, 94mTc, 86Y e 124I. In vivo, estos radioindicadores o radioligandos emiten positrones a partir del núcleo del isótopo con diferentes energías dependiendo del isótopo usado. La energía del positrón expulsado controla la distancia promedio que viaja antes de que choque con un electrón resultando en la emisión de dos rayos gamma de 511 keV en direcciones opuestas. Los rayos gamma producidos por este evento de aniquilación de positrones son detectados por el escáner formador de imagen PET para producir imágenes planas y topográficas que revelan la distribución del radioindicador como una función de tiempo. Por consiguiente, los isótopos que son emisores de positrón puro con isótopos de baja energía de eyección son preferidos para la formación de imagen PET para minimizar la distancia viajada por el positrón antes de la aniquilación y problemas de dosimetría causados por otras emisiones tales como rayos gamma, partículas alfa o partículas beta.

En adición, la semivida del isótopo usado en la formación de imagen PET debe ser bastante larga para permitir la síntesis y análisis de la molécula radioindicadora, inyección en el paciente, localización in vivo, separación de los tejidos no objetivo y la producción de una imagen clara. El 18F (p+ 635 keV 97%, ti/2110 min) es uno de los PET más ampliamente usados que emiten isótopos debido a su baja energía de emisión de positrón, carencia de emisiones secundarias y semivida adecuada.

Tradicionalmente, el etiquetado de moléculas biológicas, tales como péptidos y proteínas, con 18F ha sido desafiante debido a las condiciones duras (altas temperaturas, solventes orgánicos y condiciones básicas fuertes) requeridas para etiquetado con este radionúclido. Un procedimiento para etiquetar proteínas con 18F es el uso de un grupo prostético el cual puede soportar condiciones de fluoración duras. Numerosos grupos prostéticos han sido reportados (por ejemplo, revisado en Nucl. Med. Bio. 34:5, 2007), pero muchos de estos grupos prostéticos etiquetados con 18F requieren solventes orgánicos y no son accesibles para etiquetar proteínas o moléculas similares a proteínas en medio acuoso o tener otras propiedades indeseables.

Por consiguiente, existe todavía una necesidad continua para métodos rápidos, simples, de porciones de objetivo etiquetadas con 18F, tales como proteínas y péptidos, para producir composiciones radioindicadoras las cuales retienen actividad y estabilidad específica suficiente para uso en metodologías de formación de imagen in vivo. Sumario

La invención se define por las reivindicaciones. Cualquier cuestión que esté fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona únicamente con fines de información.

La presente invención se basa al menos en parte en el descubrimiento de un grupo prostético etiquetado con 18F que contiene una nitro-piridina ligada a una porción de polietilenglicol (PEG, por sus siglas en inglés) y una azida terminal, en la cual el grupo prostético es soluble en agua y menos volátil que otros agentes usados para el etiquetado con 18F, y que reacciones que incorporan este grupo prostético etiquetado con 18F en moléculas biológicas (por ejemplo, péptidos y proteínas) pueden ser monitoreadas por UV. Estas características ventajosas proporcionan un método eficiente, rápido y reproducible para producir biomoléculas etiquetadas con 8F bajo condiciones las cuales retienen la actividad biológica de la biomolécula. En ciertas modalidades, las biomoléculas (por ejemplo, péptidos y proteínas) que contienen porciones de conjugación bifuncionales (por ejemplo, con grupos alquilo restringidos, tales como queladores bifuncionales) de enlaces covalentes con la azida terminal del grupo prostético etiquetado con 18F mediante una reacción bioortogonal “clic” para producir sondas radioetiquetadas que son estables bajo condiciones fisiológicas. La absorbancia UV del producto resultante proporciona además, un método práctico, sensible y analítico rápido para determinar la pureza radioquímica del producto.

La invención se refiere a una sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F que comprende un grupo prostético radioetiquetado con 18F, una porción de conjugación bifuncional (BFC) y una proteína con la estructura siguiente,

o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en donde

(a) el 18F es orto en el átomo de N y x es un número entero de 1 a 8;

(b) la porción BFC es un ciclooctino que comprende (i) un grupo reactivo que forma un enlace covalente con un grupo funcional amina, carboxilo, carbonilo o tiol en la proteína y (ii) un brazo espaciador de polietilenglicol (PEG)y, en donde y es un número entero de 1 a 8 y

(c) la proteína comprende un dominio de fibronectina tipo III (Fn3).

Una modalidad que no forma parte de la invención pero se proporciona en la presente un grupo prostético etiquetado con 18F con la siguiente estructura,

o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en donde x es un número entero desde 1 hasta 8. En algunas modalidades, x es un número entero desde 2 hasta 6. En algunas modalidades x es un número entero desde 3 hasta 5. En algunas modalidades, x es 4. En algunas modalidades, la porción [O(CH2)2]x está presente en la configuración 1-2, 1-3, o 1-4, con relación al nitrógeno en el anillo de piridina. 18F está unido a la orto piridina en el átomo de N. En algunas modalidades, la sal farmacéuticamente aceptable se selecciona a partir del grupo que consiste en sales de fluoro, bromo, cloro y yodo. En una modalidad, la sal es una sal de trifluorometansulfonato. En algunas modalidades, el grupo prostético radioetiquetado con 18F o sal farmacéuticamente aceptable es soluble en agua. En algunas modalidades, el grupo prostético radioetiquetado con 18F o sal farmacéuticamente aceptable es no volátil.

En algunas modalidades que no forman parte de la invención, el compuesto radioetiquetado con 18F tiene la estructura

o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en donde x es un número entero desde 1 hasta 8. En algunas modalidades, x es un número entero desde 2 hasta 6. En algunas modalidades x es un número entero desde 3 hasta 5. En algunas modalidades, x es 4. En algunas modalidades, la porción [O(CH2)2]x está presente en la configuración 1-2, 1-3, o 1-4, con relación al nitrógeno en el anillo de piridina. En algunas modalidades, la sal farmacéuticamente aceptable se selecciona a partir del grupo que consiste en sales de fluoro, bromo, cloro y yodo. En una modalidad, la sal es una sal de trifluorometansulfonato. En algunas modalidades, el grupo prostético radioetiquetado con 18F o sal farmacéuticamente aceptable es no volátil.

o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en donde x es un número entero desde 1 hasta 8. En algunas modalidades, x es un número entero desde 2 hasta 6. En algunas modalidades x es un número entero desde 3 hasta 5. En algunas modalidades, x es 4. En algunas modalidades, la sal farmacéuticamente aceptable se selecciona a partir del grupo que consiste en sales de fluoro, bromo, cloro y yodo. En una modalidad, la sal es una sal de trifluorometansulfonato. En algunas modalidades, el grupo prostético radioetiquetado con 18F o sal farmacéuticamente aceptable es no volátil.

o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

En ciertas modalidades proporcionadas en la presente pero que no forman parte de la invención, el anillo piridina del grupo prostético etiquetado con 18F contiene uno o más sustituyentes adicionales los cuales no interfieren con la fluoración de la molécula. En algunas modalidades, el sustituyente adicional es un alquilo C1-6, por ejemplo, metilo, etilo, o propilo.

La invención también se refiere a una sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F que comprende un grupo prostético radioetiquetado con 18F, una porción de conjugación bifuncional (BFC) y una proteína con la estructura siguiente

o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en donde

(a) "OPEG" es [O(CH2)2]x y x es un número entero de 1 a 8;

(c) la proteína comprende un dominio de fibronectina tipo III (Fn3).

En una modalidad relacionada que no forma parte de la invención, se proporciona en la presente un grupo prostético radioetiquetado con 18F que tiene la estructura

en donde OPEG es [O(CH2)2]x, y x es un número entero desde 1 hasta 8, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, x es un número entero desde 2 hasta 6. En algunas modalidades, x es un número entero desde 3 hasta 5. En una modalidad, x es 4. En algunas modalidades, el grupo prostético radioetiquetado con 18F o sal farmacéuticamente aceptable es no volátil.

La BFC es una ciclooctina que comprende un grupo reactivo que forma un enlace covalente con un grupo funcional amina, carboxilo, carbonilo o tiol en la proteína. En algunas modalidades, la ciclooctina se selecciona a partir del grupo que consiste en dibenzociclooctina (DIBO, por sus siglas en inglés), biarilazaciclooctinona (BARAC, por sus siglas en inglés), dimetoxiazaciclooctina (DIMAC, por sus siglas en inglés) y dibenzociclooctina (DBCO, por sus siglas en inglés). En algunas modalidades, la ciclooctina es DBCO.

La BFC comprende además, un polietilen glicol (PEG) y brazo espaciador, en donde y es un número entero desde 1 hasta 8. En algunas modalidades, y es un número entero desde 2 hasta 6. En algunas modalidades, y es 4 o 5.

En algunas modalidades, la BFC es DBCO-PEG4-NHS-Éster, DBCO-Sulfo-NHS-Éster, DBCO-PEG4-Ácido, DBCO-PEG4-Amina o DBCO-PEG4-Maleimida. En algunas modalidades, la BFC es DBCO-PEG4-Maleimida.

En ciertas modalidades que no forman parte de la invención, se proporciona en la presente una sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F con la siguiente estructura,

en donde el grupo maleimida de la BFC es covalentemente ligado al grupo tiol en un residuo de cisteína de la proteína. En algunas modalidades, el residuo de cisteína está en el C-terminal de la proteína.

La porción de proteína de la sonda comprende un andamiaje a base de fibronectina (FBS, por sus siglas en inglés). En modalidades relacionadas que no forman parte de la invención, la porción de proteína de la sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F se une a una molécula biológica asociada a una enfermedad. En algunas modalidades, la enfermedad se selecciona a partir del grupo que consiste en cánceres sólidos, cánceres hematopoyéticos, cánceres hematológicos, enfermedades autoinmunes, enfermedades neurodegenerativas, enfermedad cardiovascular e infecciones patogénicas. En ciertas modalidades, la sonda se une a un antígeno asociado al tumor. En ciertas modalidades, la sonda se une a una proteína presente en un organismo patogénico, por ejemplo, un virus, bacteria u hongo.

En ciertas modalidades que no forman parte de la invención, la sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F proporcionada en la presente puede estar en la forma de una composición farmacéutica.

En una modalidad relacionada que no forma parte de la invención, se proporciona en la presente un método para obtener una imagen de una sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F como se proporciona en la presente, el método incluye las etapas de (a) administrar la sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F a un sujeto; y (b) formar imagen in vivo de la distribución de la sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F por barrido de tomografía de emisión de positrón (PET). En algunas modalidades, la distribución de imagen de la sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F es indicativa de la presencia o ausencia de una enfermedad.

En otra modalidad, la invención se refiere a la sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F de acuerdo con la invención para su uso en un método para detectar la presencia de una enfermedad en un sujeto, el método incluye las etapas de (a) administrar a un sujeto que lo necesita la sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F la cual se une a una molécula objetivo asociada a la presencia de la enfermedad; y (b) obtener una radio-imagen de al menos una porción del sujeto para detectar la presencia o ausencia de la sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F; en donde la presencia y ubicación de la sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F arriba del antecedente es indicativo de la presencia y ubicación de la enfermedad.

En otra modalidad, la invención se refiere a la sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F de acuerdo con la invención para su uso en un método para monitorear el progreso de una enfermedad en un sujeto, el método incluye las etapas de (a) administrar a un sujeto que lo necesita la sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F la cual se une a una molécula objetivo asociada a la presencia de la enfermedad en un primer punto de tiempo y obtener una imagen de al menos una porción del sujeto para determinar la cantidad de las células o tejidos enfermos; y (b) administrar al sujeto la sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F en uno o más puntos de tiempo subsecuentes y obtener una imagen de al menos una porción del sujeto en cada punto de tiempo; en donde la dimensión y ubicación de las células o tejidos enfermos en cada punto de tiempo es indicativo del progreso de la enfermedad.

En otra modalidad, la invención se refiere a la sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F de acuerdo con la invención para su uso en un método para cuantificar células o tejidos enfermos en un sujeto, el método incluye las etapas de (a) administrar a un sujeto que tiene células o tejidos enfermos con la sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F la cual se une a una molécula objetivo localizada con las células o tejidos enfermos; y (b) detectar emisiones radioactivas del 18F en las células o tejidos enfermos, en donde el nivel y distribución de las emisiones radioactivas en las células o tejidos enfermos es una medida cuantitativa de las células o tejidos enfermos.

En una modalidad relacionada que no forma parte de la invención, se proporciona en la presente un método para seleccionar un agente para tratar una enfermedad que incluye las etapas de (a) poner en contacto células que expresan una proteína objetivo asociada a la enfermedad con una sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F como se proporciona en la presente la cual se une a la proteína objetivo en la presencia y ausencia de un agente candidato; y (b) formar en imagen las células en la presencia y ausencia del agente candidato usando tomografía de emisión de positrón (PET), en donde una disminución en la cantidad de emisiones radioactivas en la presencia del agente candidato es indicativo de que el agente se une a la proteína objetivo.

En algunas modalidades de estos métodos y usos, la enfermedad se selecciona a partir del grupo que consiste en cánceres sólidos, cánceres hematopoyéticos, cánceres hematológicos, enfermedades autoinmunes, enfermedad neurodegenerativa, enfermedad cardiovascular e infección patogénica (por ejemplo, infecciones virales, bacterianas o fúngicas).

En una modalidad relacionada que no forma parte de la invención, se proporciona en la presente un método para obtener una imagen cuantitativa de tejidos o células que expresan una proteína objetivo, el método incluye las etapas de poner en contacto las células o tejidos con una sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F como se proporciona en la presente la cual se une a la proteína objetivo, y detectar o cuantificar el tejido que expresa la proteína objetivo usando tomografía de emisión de positrón (PET).

En algunas modalidades de los métodos proporcionados en la presente (que no forman parte de la invención), la sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F comprende un ligando. En algunas modalidades, la sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En algunas modalidades, la sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F comprende un andamiaje a base de fibronectina (FBS, por sus siglas en inglés). En algunas modalidades, la sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F se une a un antígeno asociado al tumor. En todavía otras modalidades, la sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F se une a una proteína presente en un organismo patogénico (por ejemplo, un virus, bacteria u hongo).

También proporcionados en la presente pero sin formar parte de la invención están kits que contienen los precursores de reacción para producir las sondas a base de proteína radioetiquetadas con 18F proporcionadas en la presente (por ejemplo, un grupo prostético no radioetiquetado, sonda de proteína ligada a BFC y reactivos para llevar a cabo una reacción de clic ortogonal), e instrucciones para producir la sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F.

Por consiguiente, en una modalidad que no forma parte de la invención, se proporciona en la presente un método para producir un grupo prostético etiquetado con 18F que tiene la siguiente estructura,

en donde x es un número entero desde 1 hasta 8, el método incluye las etapas de (a) proporcionar una solución de un compuesto a con la siguiente estructura:

en donde x es un número entero desde 1 hasta 8, y R es NO2, Br, F o

y es orto en el átomo de N del anillo piridina; (b) proporcionar una mezcla de 18F en 18Oagua, 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabiciclo[8,8.8]hexacosano y una base débil; (c) secar la mezcla de la etapa (b) para formar un sólido; y (d) hacer reaccionar la solución de la etapa (a) con el sólido de la etapa (c) para formar el compuesto etiquetado con 18F.

En ciertas modalidades, dicho método produce un grupo prostético de piridina 18F con la siguiente estructura b

(donde 18F es orto en el átomo de N), e incluye las etapas de (a) proporcionar una solución del compuesto de la estructura

(donde X es orto en el átomo de N) donde X es NO2, Br o

(b) proporcionar una mezcla de 18F en 18Oagua, 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabiciclo[8,8.8]hexacosano y base débil; (c) secar la mezcla de la etapa (b) para formar un sólido; y (d) hacer reaccionar la solución de la etapa (a) con el sólido de la etapa (c) para formar el compuesto etiquetado con 18F.

En ciertas modalidades, el compuesto de partida de la etapa a) descrito anteriormente, X es NO2. En ciertas modalidades, X está unido al átomo de carbono en el átomo de N y la cadena lateral PEG-N3. En ciertas modalidades la base débil en la etapa b) es K2CO3, carbonato de cesio o hidróxido de tetrabutilamonio. En una modalidad, la base débil en la etapa b) es K2CO3.

En una realización relacionada que no forma parte de la invención, se proporciona un método para el etiquetado de 18F con una proteína, el cual incluye las etapas de acoplar el grupo prostético radioetiquetado con 18F de fórmula b con la proteína que será radioetiquetada en una “reacción clic” para formar la proteína radioetiquetada con 18F. En algunas modalidades, la reacción clic bioortogonal está libre de metal (por ejemplo, reacción clic libre de cobre). En algunas modalidades, la proteína comprende una porción de conjugación bifuncional (por ejemplo, un quelador bifuncional). En algunas modalidades, la proteína comprende una ciclooctina BFC. En algunas modalidades, la proteína comprende DBCO-PEG4-Maleimida o está covalentemente ligada a esta.

Otras características y ventajas de la presente descripción serán aparentes a partir de la siguiente descripción detallada y ejemplos.

Breve Descripción de las Figuras

La Figura 1 es una representación esquemática para la síntesis química de [18F]-E01-4PEG-DBCO-FPPEGA. La porción E01 de la molécula tiene la secuencia expuesta en la ^sE^qID NO: 1.

La Figura 2 es una gráfica de barras que representa la distribución de tejido del radioindicador 18F-A02 en ratones que portan injertos heterólogos bilaterales PD-L1(+) L2987 y PD-L1(-) HT-29 como se mide ex vivo por el contador gamma.

La Figura 3 es una imagen compuesta de distribución 18F-E01 en monos cinomólogos.

Las Figuras 4A y 4B representan imágenes de autorradiografías in vitro de 18F-A02 en injertos heterólogos y tejidos de pulmón humanos.

La Figura 5 es una representación esquemática para la producción de A02-PEG-DBCO-FPPEGA radioetiquetado con [18F] usando “química clic” libre de metal.

La Figura 6 es una representación esquemática del módulo de síntesis GE TRACERlab FX2 N para la síntesis automatizada de [18F]-FPPEGA.

La Figura 7 es una representación esquemática del módulo de Síntesis Synthera (IBA) para la síntesis automatizada de [18F]-FPPEGA.

Descripción Detallada de la Invención

Descritos en la presente pero sin formar parte de la invención están grupos prostéticos 18F y métodos para producir los grupos prostéticos 18F. También se describen en la presente pero no forman parte de la invención composiciones radioetiquetadas que contienen los grupos prostéticos 18F y el uso de estas composiciones radioetiquetadas para diagnosticar, localizar, monitorear y/o evaluar células y/o tejidos enfermos, y condiciones biológicas relacionadas. Definiciones

Con el fin de que la presente descripción pueda ser más fácilmente entendida, ciertos términos son primero definidos. Las definiciones adicionales son expuestas a través de la descripción detallada. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente, tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por uno de habilidad ordinaria en la técnica, y métodos convencionales de espectroscopia de masas, RMN, HPLC, química de proteína, bioquímica, técnicas de ADN recombinante y farmacología, son empleadas.

Como se usa en la presente, las formas singulares “un”, “uno” y “el” incluyen referentes plurales a menos que el contexto lo dicte claramente de otro modo. El uso de “o” u “y” significa “y/o”, a menos que se declare de otro modo. Además, el uso del término “que incluye”, así como también otras formas, tales como “incluyen, “incluye”, e “incluido”, no es limitante.

Como se usa en la presente, “aproximadamente” significa dentro de más o menos diez por ciento de un número. Por ejemplo, “aproximadamente 100” podría referirse a cualquier número entre 90 y 110.

Como se usa en la presente, “formación de imagen médica” se refiere a las técnicas y procesos usados para crear imágenes del cuerpo del sujeto (o partes del mismo) para propósitos clínicos (los procedimientos técnicos parecen revelar, diagnosticar o monitorear la enfermedad) o ciencias médicas (que incluyen el estudio de anatomía y fisiología normal).

Como se usa en la presente, “tomografía de emisión de positrón” o “PET”, se refiere a una técnica de medicina nuclear no invasiva, que produce una imagen tridimensional de una ubicación indicadora en el cuerpo. El método detecta pares de rayos gamma emitidos indirectamente por un radionúclido que emite positrón (indicador), el cual es introducido en el cuerpo en una molécula biológicamente activa. Las herramientas de formación de imagen PET tienen una amplia variedad de usos y ayudan en el desarrollo del fármaco tanto preclínicamente como clínicamente. Aplicaciones a modo de ejemplo incluyen visualización directa de saturación in vivo de objetivos; monitorear la captación en tejidos normales para anticipar la toxicidad o variación paciente a paciente; cuantificar el tejido enfermo; metástasis del tumor; y monitorear la eficacia del fármaco con el tiempo, o resistencia con el tiempo.

El término “química bioortogonal” se refiere a cualquier reacción química que puede ocurrir dentro de sistemas vivos sin interferir con los procesos bioquímicos nativos. El término incluye reacciones químicas que son reacciones químicas que ocurren in vitro a pH fisiológico en, o en la presencia de agua. Para ser consideradas bioortogonales, las reacciones son selectivas y evitan reacciones secundarias con otros grupos funcionales encontrados en los compuestos de partida. En adición, el enlace covalente resultante entre los patrones de reacción debe ser fuerte y químicamente inerte a reacciones biológicas y no debe afectar la actividad biológica de la molécula deseada.

El término “química clic o química rápida” se refiere a una serie de reacciones bioortogonales confiables y selectivas para la síntesis rápida de nuevos compuestos y bibliotecas combinatoriales. Las propiedades para las reacciones clic incluyen molaridad, amplitud en alcance, alto rendimiento, estereoespecificidad, y aislamiento de producto simple (separación de subproductos inertes por métodos no cromatográficos) para producir compuestos que son estables bajo condiciones fisiológicas. En radioquímica y radiofarmacia, la química clic es un término genérico para una serie de reacciones de etiquetado las cuales hacen uso de bloques de construcción modular y selectivo y permiten las ligaciones quimioselectivas a compuestos biológicamente relevantes radioetiquetados en la ausencia de catalizadores. Una “reacción clic” puede ser con cobre, o puede ser una reacción clic libre de cobre.

El término “grupo prostético” o “agente de etiquetado bifuncional” se refiere a una molécula orgánica pequeña que contiene un radionúclido (por ejemplo, 18F) que es capaz de ser ligado a péptidos o proteínas.

El término “ligando quelador” como se usa en la presente con respecto a la química radiofarmacéutica se refiere a un quelador bifuncional o una porción de conjugación (BFC) (usados intercambiablemente en la presente, que se unen covalentemente a un grupo prostético radioetiquetado a una molécula de objetivo biológicamente activa (por ejemplo, péptido o proteína). Las BFCs utilizan grupos funcionales tales como ácidos carboxílicos o ésteres activados para acoplamientos de amida, isotiocianatos para acoplamientos de tiourea y maleimidas para acoplamientos tiol.

Como se usa en la presente, “objetivo” como una referencia general a un “objetivo biológico”, se refiere a una célula, tejido (por ejemplo, cáncer, o tumor), un microorganismo patogénico (por ejemplo, bacteria, virus, hongo, planta, prión, protozoario o porción del mismo) u otra molécula asociada a una trayectoria biológica, o un fenómeno biológico, tal como inflamación del tejido, formación de placa, etc.

El término “ligando de objetivo”, “agente de objetivo” o “molécula de objetivo”, son usados intercambiablemente para referirse a una molécula, tal como péptido, proteína, glicoproteína, etc., que se une a otra molécula. En ciertas modalidades, un agente de objetivo está unido al grupo proestético 18F con el fin de “dirigir” una molécula asociada a una célula, tejido, patógeno o trayectoria biológica particular.

“Polipéptido” como se usa en la presente se refiere a cualquier secuencia de dos o más aminoácidos, con respecto de la longitud, modificación post-traducción, o función. “Polipéptido, “péptido”, y “proteína”, son usados intercambiablemente en la presente. Los polipéptidos pueden incluir aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales tales como aquellos descritos en la Patente Estadounidense No. 6.559.126. Los polipéptidos también pueden ser modificados en cualquiera de varias formas químicas estándares (por ejemplo, un aminoácido puede ser modificado con un grupo protector; el aminoácido carboxi-terminal puede ser elaborado en un grupo amida terminal; el residuo amino-terminal puede ser modificado con grupos para, por ejemplo, modificar la lipofilicidad; o el polipéptido puede ser químicamente glicosilado o de otro modo modificado para incrementar la estabilidad o semivida in vivo). Las modificaciones de polipéptido pueden incluir unión de otra estructura tal como un compuesto cíclico u otra molécula al polipéptido y también pueden incluir polipéptidos que contienen uno o más aminoácidos en una configuración alterada (es decir, R o S; o, L o D).

Un polipéptido “aislado” es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que podrían interferir con usos de diagnóstico o terapéuticos para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En modalidades preferidas, el polipéptido será purificado (a) a más de 95% en peso del polipéptido como se determina por el método Lowey, y muy preferiblemente más de 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos residuos de secuencia de aminoácido interno o N-terminal por el uso de secuenciador de copa giratoria, o (3) a homogeneidad por SDS-PAGE bajo condición de reducción o no reducción usando azul Coomassie o, preferiblemente, teñido de plata. El polipéptido aislado incluye el polipéptido in situ dentro de células recombinantes puesto que a menos un componente del ambiente natural del polipéptido no estará presente. De manera ordinaria, sin embargo, el polipéptido aislado se preparará por al menos una etapa de purificación.

Los términos “se une específicamente, “unión específica”, “unión selectiva”, y “se une selectivamente”, son usados de manera intercambiable en la presente para referirse a un péptido o polipéptido que presenta afinidad para un objetivo biológico, pero no se une significantemente (por ejemplo, menos de aproximadamente 10% de unión) a otras moléculas como se mide por una técnica disponible en el arte tal como, pero no limitada a, análisis Scatchard y/o ensayos de unión competitiva (por ejemplo, ELISA de competición, ensayo BIACORE).

El término “se une preferiblemente” como se usa en la presente, se refiere a la situación en la cual un péptido o proteína se une a un objetivo biológico seleccionado al menos aproximadamente 20% mayor que lo que se une a un diferente objetivo biológico como se mide por una técnica disponible en el arte, tal como, pero no limitado a, análisis Scatchard y/o ensayos de unión competitiva (por ejemplo, ELISA de competición, ensayo BIACORE).

El término “K^d”, como se usa en la presente, está propuesto para referirse a la constante de equilibrio de disociación de una interacción de proteína-proteína (por ejemplo, molécula objetivo de sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F) o la afinidad de una sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F para una proteína objetivo, como se mide usando un ensayo de resonancia de plasmón de superficie o un ensayo de unión celular. Una “K^ddeseada”, como se usa en la presente, se refiere a una K^dde una sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F que es suficiente para los propósitos contemplados. Por ejemplo, una K^ddeseada puede referirse a la K^dde una sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F requerida para provocar un efecto funcional en un ensayo formador de imagen in vitro, por ejemplo, un ensayo de luciferasa a base de célula.

El término “ka”, como se usa en la presente, está propuesto para referirse la constante de velocidad de asociación para la asociación de una sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F en el complejo de proteína objetivo/sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F.

El término “kd”, como se usa en la presente, está propuesto para referirse a la constante de velocidad de disociación para la disociación de una sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F a partir del complejo de proteína objetivo/sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F.

El término “IC50”, como se usa en la presente, se refiere a la concentración de una sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F que inhibe una respuesta, ya sea un ensayo in vitro o in vivo, a un nivel que es 50% de la respuesta inhibidora máxima, es decir, la mitad entre la respuesta inhibidora máxima y la respuesta no tratada. El término “PK” es un acrónimo para “farmacocinética” y abarca propiedades de un compuesto que incluye, por medio del ejemplo, absorción, distribución, metabolismo, y eliminación por un sujeto. Una “proteína de modulación PK” o “porción PK” como se usa en la presente se refiere a cualquier proteína, péptido, o porción que afecta las propiedades de farmacocinética de una molécula biológicamente activa cuando se fusiona a, o administra junto con la molécula biológicamente activa. Ejemplos de una proteína de modulación PK o porción PK incluyen PEG, enlazadores de albúmina de suero humana (HSA, por sus siglas en inglés) (como se describe en las Publicaciones Estadounidenses Nos. 2005/0287153 y 2007/0003549, Publicaciones PCT Nos. WO 2009/083804 y WO 2009/133208), albúmina de suero humana y variantes de las mismas, transferrina y variantes de las mismas, Fc o fragmentos Fc y variantes de los mismos, y azúcares (por ejemplo, ácido siálico).

La “semivida” de una proteína o compuesto puede en general, ser definida como el tiempo tomado para que la concentración en suero del polipéptido se reduzca por 50 %, in vivo, por ejemplo, debido a la degradación de la secuencia o compuesto y/o separación o secuestro de la secuencia o compuesto por mecanismos naturales. La semivida puede ser determinada en cualquier manera conocida per se, tal como por análisis de farmacocinética. Las técnicas adecuadas serán claras para la persona experta en la técnica, y pueden, por ejemplo, en general, involucrar las etapas de administrar adecuadamente a un sujeto una dosis adecuada de la secuencia de aminoácido o compuesto descritos en la presente; recolectar muestras de sangre u otras muestras de tal sujeto a intervalos regulares; determinar el nivel o concentración de la secuencia de aminoácido o compuesto descrito en la presente en tal muestra de sangre; y calcular, a partir de los datos (una gráfica de) de este modo obtenidos, el tiempo útil hasta que el nivel o concentración de la secuencia de aminoácido o compuesto descrito en la presente se ha reducido por 50 % comparado con el nivel inicial después de la dosificación. Se hace referencia, por ejemplo, a los textos estándares, tales como Kenneth, A. et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists y en Peters et al., Pharmacokinete Analysis: A Practical Approach (1996). Se hace referencia también a Gibaldi, M. et al., Pharmacokinetics, 2nd Rev. Edition, Marcel Dekker (1982).

La semivida puede ser expresada usando parámetros tales como la t-i/2-alfa, t-i/2-beta, HL_Lambda_z, y el área bajo la curva (AUC). En la presente especificación, un “incremento en la semivida” se refiere a un incremento en cualquiera de estos parámetros, cualquiera dos de estos parámetros, o en todos los tres parámetros. Un “incremento en la semivida” en particular, se refiere a un incremento en la t-i/2 beta, y/o HL_Lambda_z, ya sea con o sin un incremento en la t-i/2-alfa y/o el AUC o ambas.

Como se usa en la presente, el término “ligado” se refiere a la asociación de dos o más moléculas. El enlace puede ser covalente o no covalente. El enlace también puede ser genético (es decir, recombinantemente fusionado). Tales enlaces se pueden lograr usando una amplia variedad de técnicas reconocidas en el arte, tales como conjugación química y producción de proteína recombinante.

Los términos “diagnosis” o “detección” pueden ser usados de manera intercambiable. Mientras la diagnosis se refiere usualmente a definir un estado histológico específico del tejido, la detección reconoce y localiza un tejido, lesión u organismo que contiene un objetivo detectable particular.

El término “detectable” se refiere a la capacidad para detectar una señal sobre la señal antecedente. El término “señal detectable” es una señal derivada de técnicas de formación de imagen no invasivas tales como, pero no limitadas a, tomografía de emisión de positrón (PET). La señal detectable es detectable y distinguible de otras señales antecedentes que pueden ser generadas a partir del sujeto. En otras palabras, existe una diferencia medible y estadísticamente significante (por ejemplo, una diferencia estadísticamente significante es suficiente de una diferencia para distinguir entre la señal detectable y el antecedente, tal como aproximadamente 0,1 %, 1 %, 3%, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, o 40 % o más diferencia entre la señal detectable y el antecedente) entre la señal detectable y el antecedente. Los estándares y/o curvas de calibración pueden ser usados para determinar la intensidad relativa de la señal detectable y/o el antecedente.

Una “cantidad detectablemente efectiva” de una composición que comprende un agente que forma imagen descrito en la presente se define como una cantidad suficiente para proporcionar una imagen detectable usando equipo que está disponible para uso clínico. Una cantidad detectablemente efectiva de un agente que forma imagen proporcionado en la presente puede ser administrada en más de una inyección. La cantidad detectablemente efectiva puede variar de conformidad con factores tales como el grado de susceptibilidad del individuo, la edad, sexo, y peso del individuo, respuestas idiosincráticas del individuo, y similares. Cantidades detectablemente efectivas de composiciones que forman imagen también pueden variar de conformidad con el instrumento y metodologías usadas

Como se usa en la presente, “administrar”, como se usa en el contexto de agentes que forman imagen se refiere a la introducción física de una composición que comprende un agente que forma imagen a un sujeto, usando cualquiera de los varios métodos y sistemas de suministro conocidos por aquellos expertos en la técnica. Las rutas preferidas de administración para los agentes que forman imagen descritos en la presente incluyen, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, espinal u otras rutas parenterales de administración, por ejemplo, por inyección o infusión. La frase “administración parenteral” como se usa en la presente, significa modos de administración distintos de administración entérica y tópica, usualmente por inyección, e incluyen, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intratecal, intralinfática, intralesional, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradermal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal, epidural e intrasternal, así como también electroporación in vivo. Alternativamente, un agente que forma imagen descrito en la presente, puede ser administrado mediante una ruta no parenteral, tal como una ruta de administración tópica, epidermal o mucosal, por ejemplo, intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópicamente. La administración también puede ser realizada, por ejemplo, una vez, una pluralidad de veces, y/o durante uno o más periodos extendidos.

Los términos “co-administración” o similares, como se usan en la presente, están significando abarcar la administración de los agentes farmacéuticos seleccionados a un paciente único, y están propuestos para incluir regímenes en los cuales los agentes son administrados por la misma o diferente ruta de administración o en el mismo o diferente tiempo.

Los términos “paciente” y “sujeto”, se refieren a cualquier animal humano o no humano que recibe una composición que comprende un agente que forma imagen descrito en la presente. Para aplicaciones in vitro, tal como aplicaciones de investigación y diagnóstico in vitro, los fluidos corporales y muestras celulares de los sujetos anteriores, serán adecuadas para uso, tales como muestra de sangre, orina, o tejido.

El término “muestra” puede referirse a una muestra de tejido, muestra de célula, una muestra de fluido, y similares. La muestra puede ser tomada de un sujeto. La muestra de tejido puede incluir cabello (que incluye raíces), hisopos bucales, sangre, saliva, semen, músculo, o de cualquiera de los órganos internos. El fluido puede ser, pero no se limita a, orina, sangre, ascitos, fluido pleural, fluido espinal, y similares. El tejido corporal puede incluir, pero no se limita a, piel, músculo, tejido endometrial, uterino y cervical.

El término “isotópicamente puro” significa que el elemento, compuesto, o composición, contiene una proporción mayor de un isótopo con relación a otros isótopos. En ciertas modalidades, el elemento, compuesto, o composición es mayor de aproximadamente 40 %, 50 %, o 60 % isotópicamente puro.

Como se usa en la presente, una molécula etiquetada es “purificada” cuando la molécula etiquetada es parcial o completamente separada de moléculas no etiquetada, de manera que la fracción de moléculas etiquetadas es enriquecida comparada con la mezcla de partida. Una molécula etiquetada “purificada” puede comprender una mezcla de moléculas etiquetadas y no etiquetadas en casi cualquier relación, que incluyen, pero no se limitan a aproximadamente 5:95; 10:90; 15:85; 20:80; 25:75; 30:70; 40:60; 50:50; 60:40; 70:30; 75:25; 80:20; 85:15; 90:10; 95:5; 97:3; 98:2; 99:1 o 100:0.

El grupo “OTf” se refiere a triflato que tiene la fórmula CF3SO3 o trifluorometansulfato.

El término “halo” o, alternativamente, “halógeno”, o “haluro”, significa fluoro, cloro, bromo o yodo.

A través de la especificación, grupos y sustituyentes de los mismos pueden ser elegidos por un experto en el campo para proporcionar porciones y compuestos estables y compuestos útiles como compuestos y/o compuestos intermediarios farmacéuticamente aceptables útiles en la elaboración de compuestos farmacéuticamente aceptables. Varios aspectos descritos en la presente son descritos además en detalle en las siguientes subsecciones.

I. Grupos Prostéticos Radioetiquetados con 18F (no forman parte de la invención)

En un aspecto, se proporciona en la presente un compuesto radioetiquetado con 18F que contiene un grupo prostético para uso en una reacción bioortogonal que involucra cicloadición 1,3-dipolar entre una azida y una ciclooctina la cual procede selectivamente bajo condiciones tolerantes al agua. Los grupos prostéticos radioetiquetados con 18F de la invención, son solubles en 100% acuoso, y no son necesarios para una fase orgánica para ligar el grupo prostético a una molécula de proteína o péptido. Esta característica es particularmente ventajosa ya que muchos productos biológicos (por ejemplo, péptidos o proteínas), no pueden soportar aún cantidades pequeñas de solventes orgánicos, con problemas de degradación y agregación.

Adicionalmente, distinto de los grupos prostéticos alifáticos, con el presente grupo prostético, la reacción de fluoración con 18F puede ser monitoreada con UV. Los grupos prostéticos radioetiquetados con 18F descritos en la presente son no volátiles. Sin embargo, los grupos prostéticos radioetiquetados con 18F proporcionados, pueden ser incorporados en productos biológicos usando una química clic libre de cobre, por ejemplo, como se describe en los Ejemplos, de este modo evitando los problemas de estabilidad observados en algunos productos biológicos cuando se usa química clic mediada por cobre.

En un aspecto, se proporciona en la presente una piridina 18F PEGilada unida covalentemente a una azida con la siguiente estructura,

o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en donde x es un número entero desde 1 hasta 8. En algunas modalidades, x es un número entero desde 2 hasta 6. En algunas modalidades x es un número entero desde 3 hasta 5. En algunas modalidades, x es 4. En modalidades relacionadas, 18F está unido a la orto piridina en el átomo de N. En algunas modalidades, la porción [O(CH2)2]x está presente en la configuración 1-3 con relación al nitrógeno en el anillo de piridina. En algunas modalidades, la porción [O(CH2)2]x está presente en la configuración 1-2 con relación al nitrógeno en el anillo de piridina. En otras modalidades, la porción [O(CH2)2]x está presente en la configuración 1-4 con relación al nitrógeno en el anillo de piridina.

En algunas modalidades, el compuesto radioetiquetado con 18F tiene la estructura

una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en donde x es un número entero desde 1 hasta 8. En algunas modalidades, x es un número entero desde 2 hasta 6. En algunas modalidades x es un número entero desde 3 hasta 5. En algunas modalidades, x es 4. En algunas modalidades, la porción [O(CH2)2]x está presente en la configuración 1-3 con relación al nitrógeno en el anillo de piridina. En algunas modalidades, la porción [O(CH2)2]x está presente en la configuración 1-2 con relación al nitrógeno en el anillo de piridina. En otras modalidades, la porción [O(CH2)2]x está presente en la configuración 1-4 con relación al nitrógeno en el anillo de piridina.

en donde x es un número entero desde 1 hasta 8. En algunas modalidades, x es un número entero desde 2 hasta 6. En algunas modalidades x es un número entero desde 3 hasta 5. En algunas modalidades, x es 4.

En algunas modalidades, el compuesto radioetiquetado con 18F es [18F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2 fluoropiridina (18F-FPPEGA) y tiene la estructura

En modalidades alternativas, el grupo prostético radioetiquetado con 18F puede contener grupos adicionales en el anillo piridina los cuales no interfieren con la reacción de fluoración. En ciertas modalidades, adiciones al anillo piridina incluyen grupos alquilo C1-6, por ejemplo, metilo, etilo y propilo.

En todavía otras modalidades, el grupo prostético radioetiquetado con 18F es un sistema de anillo fusionado con la siguiente estructura:

en donde “OPEG” es [O(CH2)2]x, y x es un número entero desde 1 hasta 8. En algunas modalidades, x es un número entero desde 2 hasta 6. En algunas modalidades x es un número entero desde 3 hasta 5. En algunas modalidades, x es 4.

En un aspecto relacionado, se proporciona en la presente un método para preparar una piridina 18F PEGilada unida covalentemente a una azida con la siguiente estructura,

en donde x es un número entero desde 1 hasta 8, el método comprende las etapas de

(a) proporcionar una solución de un compuesto a con la siguiente estructura:

a

en donde x es un número entero desde 1 hasta 8, y R es NO2, Br, F o

y es orto al átomo de N del anillo piridina;

(b) proporcionar una mezcla de 18F en 18Oagua, 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabiciclo[8,8.8]hexacosano y una base débil;

(c) secar la mezcla de la etapa (b) para formar un sólido; y

(d) hacer reaccionar la solución de la etapa (a) con el sólido de la etapa (c) para formar el compuesto etiquetado con 18F.

En ciertas modalidades, el método produce un grupo prostético de piridina 18F con la siguiente estructura b

(donde 18F es orto en el átomo de N), e incluye las etapas de

(a) proporcionar una solución del compuesto de la estructura

(donde X es orto en el átomo de N) donde X es NO2, Br o

(b) proporcionar una mezcla de 18F en 18Oagua, 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabiciclo[8,8.8]hexacosano y base débil, tal como K2CO3;

(c) secar la mezcla de la etapa (b) para formar un sólido; y

En ciertas modalidades, el método comprende además, la etapa de producir un compuesto con la siguiente estructura a

de conformidad con el Esquema de reacción I abajo:

En ciertas modalidades, el método comprende producir el grupo prostético de piridina 18F [18F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina (18F-FPPEGA), e, a partir de d, de conformidad con las siguientes condiciones de reacción:

II. Sondas Biológicas Radioetiquetadas con 18F

En ciertos aspectos, la presente invención se refiere a agentes o sondas radioetiquetados con 18F con la siguiente estructura,

en donde x

(a) el 18F es orto en el átomo de N y x es un número entero desde 1 hasta 8; en algunas modalidades, x es un número entero desde 2 hasta 6; en algunas modalidades x es un número entero desde 3 hasta 5; en algunas modalidades, x es 4;

(b) la porción BFC es un ciclooctino que comprende (i) un grupo reactivo que forma un enlace covalente con un grupo funcional amina, carboxilo, carbonilo o tiol en la proteína y (ii) un brazo espaciador de polietilenglicol (PEG)y, en donde y es un número entero desde 1 hasta 8 y

(c) la proteína comprende un dominio de fibronectina tipo III (Fn3).

BFC

Las porciones de conjugación o queladores bifuncionales (BFC), las cuales pueden ser usadas en las composiciones radioetiquetadas descritas en la presente, son comercialmente disponibles (por ejemplo, Sigma Aldrich; Click Chemistry Tools), o pueden ser sintetizadas de conformidad con reacciones químicas bien conocidas.

En ciertas modalidades, la BFC se selecciona a partir de agentes quelantes a base de ciclooctina (por ejemplo, DBCO, DIBO), DFO, DOTA y sus derivados (CB-DO2A, 3p-C-DEPA, TCMC, Oxo-DO3A), TE2A, CB-TE2A, CB-TE1A1P, CB-TE2P, MM-TE2A, DM-TE2A, diamsar y derivados, NODASA, NODAGA, NOTA, NETA, TACN-TM, DTPA, 1B4M-DTPA, CHX-A''-DTPA, TRAP (PRP9), NOPO, AAZTA y derivados (DATA), H2dedpa, H4octapa, gazapa, Hadecapa, Hafospa, HBED, SHBED, BPCA, CP256, PCTA, HEHA, PEPA, EDTA, TETA, y agentes quelantes a base de TRITA, y análogos cercanos y derivados de los mismos. Las combinaciones adecuadas de agentes quelantes y radionúclidos son extensivamente descritas en Price et al., Chem Soc Rev 2014;43:260-90. De acuerdo con la invención, la BFC es una ciclooctina que comprende un grupo reactivo que forma un enlace covalente con un grupo funcional amina, carboxilo, carbonilo o tiol en la proteína o péptido de objetivo. Los grupos reactivos en la ciclooctina incluyen ésteres, ácidos, grupos hidroxilo, grupos aminooxi, malaiemidas, ahalogencetonas y a-halogenacetamidas.

En ciertas modalidades, la BFC es una ciclooctina es dibenzociclooctina (DIBO), biarilazaciclooctinona (BARAC), dimetoxiazaciclooctina (DIMAC) y dibenzociclooctina (DBCO). En ciertas modalidades, la ciclooctina es DBCO. De acuerdo con la invención, la ciclooctina comprende además un brazo espaciador de polietilenglicol hidrofílico (PEG)y, en donde y es un número entero desde 1 hasta 8. En ciertas modalidades, y es un número entero desde 2 hasta 6. En ciertas modalidades, y es 4 o 5.

En ciertas modalidades, la BFC es DBCO-PEG4-NHS-Éster o DBCO-Sulfo-NHS-Éster el cual reacciona específica y eficientemente con una amina primaria (por ejemplo, cadena lateral de residuos lisina o superficies recubiertas con aminosilano). En ciertas modalidades, la BFC es DBCO-PEG4-Ácido con ácido carboxílico terminal (-COOH) que puede hacerse reaccionar con grupos amina primarios o secundarios en presencia de activadores (por ejemplo, EDC) formando un enlace amida estable. En ciertas modalidades, la BFC es DBCO-PEG4-Amina la cual reacciona con grupos carboxilo en la presencia de activadores (por ejemplo, EDC, o DCC) o con ésteres activados (por ejemplo, ésteres de NHS) formando enlaces de amida estables.

En ciertas modalidades, la BFC es DBCO-PEG4-Maleimida la cual reacciona con grupos sulfhidrilo en residuos de cisteína, por ejemplo, en o cerca del C-terminal del polipéptido.

En ciertas modalidades divulgadas en la presente, para etiquetar una proteína, la proteína es primero modificada para incorporar una cisteína para unión al grupo prostético. Por ejemplo, una cisteína puede ser agregada al C-terminal de la proteína. En la presente invención dicha proteína es un dominio de fibronectina tipo III (Fn3). En ciertas modalidades divulgadas en la presente, PxCy, en donde P es prolina, C es cisteína, x es un número entero que es al menos 0 (por ejemplo, 0, 1 o 2) y n es un número entero que es al menos 1, se agregan al C-terminal de la proteína. Los métodos para elaborar tales modificaciones son bien conocidos en la técnica.

En ciertas modalidades divulgadas en la presente, el agente o sonda radioetiquetado con 18F tiene la siguiente estructura a,

en donde la BFC está conjugada a la proteína en un residuo de cisteína. En la presente invención la proteína es un dominio de fibronectina tipo III (Fn3).

Los agentes de objetivo radioetiquetados con 18F descritos en la presente, son producidos usando química clic libre de metal, bioortogonales, en medio adecuado para uso directo in vivo (por ejemplo, salina) de conformidad con los procedimientos descritos en la presente.

III. Moléculas de Objetivo de Péptido/Proteína (solamente el dominio de fibronectina tipo III (Fn3) forma parte de la invención)

Los grupos prostéticos de 18F proporcionados en la presente pero que no forman parte de la invención, pueden ser unidos a virtualmente cualquier molécula de objetivo, tan pronto como contenga un grupo derivatizable que puede ser modificado sin afectar la interacción entre la molécula objetivo y el objetivo biológico in vivo (por ejemplo, célula o tejido).

En algunas modalidades divulgadas en la presente pero que no forman parte de la invención, la molécula de objetivo es un péptido o proteína, que incluye, pero no se limita a, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, moléculas a base de fibronectina y ligandos (por ejemplo, hormonas, factores de crecimiento, citocinas, quimiocinas, interleucinas y factores angiogénicos). En algunas modalidades, la molécula de objetivo comprenderá uno o más sitios de unión para un objetivo asociad a una enfermedad o condición, tal como un antígeno autoinmune o asociado al tumor, o una proteína desplegada por un organismo patogénico tal como un virus, bacteria, hongo o protozoario. La molécula diana de acuerdo con la invención es una proteína que comprende un dominio de fibronectina tipo III (Fn3).

En algunas modalidades divulgadas en la presente pero que no forman parte de la invención, los péptidos o proteínas etiquetadas con 18F pueden ser seleccionados para unirse directamente a una célula, tejido, organismo patogénico de objetivo u otro objetivo para formación de imagen y/o detección. En otras modalidades, los péptidos o proteínas etiquetados con 18F puede ser seleccionado para unirse directa o indirectamente a la molécula objetivo in vivo. Por ejemplo, una primera proteína o péptido puede ser administrado al sujeto, seguido por una segunda molécula etiquetada con 18F, la cual se une a la primera.

Péptidos (no forman parte de la invención)

Los péptidos que tienen tan poco como dos residuos de aminoácido, preferiblemente dos a diez residuos, pueden ser usados y también pueden ser acoplados a otras porciones. El constructo de objetivo también puede comprender aminoácidos no naturales, por ejemplo, D-aminoácidos, en la estructura de armazón para incrementar la estabilidad del péptido in vivo. Como alternativa, otras estructuras de armazón tales como aquellas construidas a partir de aminoácidos no naturales o peptoides, pueden ser usadas.

Los péptidos los cuales pueden ser usados incluyen ligandos, vacunas peptídicas, y epítopos. Los péptidos usados como constructos de objetivo son convenientemente sintetizados en un sintetizador peptídico automatizado usando un soporte de fase sólida y técnicas estándares de desprotección y acoplamiento ortogonal repetitivo. Los residuos N-terminales pueden ser acetilados para incrementar la estabilidad en suero. Tales grupos protectores serán conocidos por el experto en la técnica. Véase Greene and Wuts Protective Groups in Organic Synthesis, 1999 (John Wiley and Sons, N.Y.).

Anticuerpos (no forman parte de la invención)

La molécula de objetivo usada en la composición radioindicadora descrita en la presente puede ser un anticuerpo. El término “anticuerpo” como se usa en la presente, puede incluir anticuerpos complejos y cualquiera de los fragmentos de unión al antígeno (es decir, “porciones de unión al antígeno”) o cadenas únicas de los mismos. Por medio del ejemplo, “anticuerpo” puede referirse a anticuerpos tanto que se originan naturalmente como que no se originan naturalmente; anticuerpos monoclonales y policlonales; anticuerpos quiméricos y humanizados; anticuerpos humanos y no humanos; anticuerpos biespecíficos; anticuerpos completamente sintéticos; y anticuerpos de cadena única. Como se usa en la presente, el término “antígeno” se refiere a cualquier sustancia inmunogénica sintética o natural, tal como una proteína, péptido o hapteno.

Las moléculas de objetivo descritas en la presente pueden incorporar cualquier anticuerpo o fragmento conocido en la técnica que tiene especificidad de unión para un antígeno objetivo asociad a un estado de enfermedad o condición. Los anticuerpos útiles como moléculas de objetivo pueden ser comercialmente obtenidos a partir de una amplia variedad de fuentes (por ejemplo, ATTC, Manassas, VA), y/o tienen secuencias de región variable publicadas, las cuales pueden ser producidas de conformidad con las técnicas recombinantes conocidas en el arte. Los anticuerpos a modo de ejemplo para uso en los presentes métodos incluyen un anticuerpo anti-CTLA-4, un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PDL-1, un anticuerpo anti-OX40 (también conocido como CD134, TNFRSF4, ACT35 y/o TXGP1L), o un anticuerpo anti-LAG-3.

Los anticuerpos usados en las composiciones y métodos descritos en la presente pueden ser producidos usando varias técnicas conocidas. Los protocolos y técnicas de inmunización para aislamiento de esplenocitos inmunizados, son bien establecidos en el arte. La producción de anticuerpos monoclonales usando la técnica de hibridización de células somáticas estándares descrita por Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975), así como también transformación viral u oncogénica de linfocitos B, técnica de despliegue de fago usando bibliotecas de genes de anticuerpo humano, también son de rutina. En adición, las tecnologías estándares para la producción de anticuerpos quiméricos y humanizados son fácilmente disponibles (véase, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 4,816,567 por Cabilly et al.; Patente Estadounidense No. 5,225.539 por Winter, y Patentes Estadounidenses Nos. 5,530.101; 5,585.089; 5,693.762 y 6,180.370 por Queen et al.).

La molécula de objetivo usada en la composición radioindicadora puede ser un fragmento de unión al antígeno. Como se usa en la presente, la “porción de unión al antígeno” de un anticuerpo se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad para unirse específicamente a un antígeno. Ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término “porción de unión al antígeno” de un anticuerpo incluyen, (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios V^l, V^h, C^ly CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios V^hy CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios V^ly V^hde una rama única de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), el cual consiste de un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad aislada (CDR) o (vii) una combinación de dos o más CDRs aisladas las cuales puede opcionalmente, ser unidas por un enlazador sintético. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, V^ly V^h, son codificados por genes separados, pueden ser unidos, usando métodos recombinantes, por un enlazador sintético que les permite ser elaborados como una cadena de proteína única en la cual, las regiones V^ly V^hse aparean para formar moléculas monovalentes conocidas como Fv de cadena única (scFv); véase por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Tales anticuerpos de cadena única también son propuestos para ser abarcados dentro del término “porción de unión al antígeno” de un anticuerpo. Estos y otros constructos potenciales son descritos en Chan & Carter (2010) Nat. Rev. Immunol.10:301. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por aquellos expertos en el arte, y los fragmentos son seleccionados para utilidad en la misma manera como están intactos los anticuerpos. Las porciones de unión al antígeno pueden ser producidas por técnicas de ADN recombinante, o por desdoblamiento enzimático o químico de inmunoglobulinas intactas.

El anticuerpo usado puede ser modificado para modular, por ejemplo, reducir la semivida del anticuerpo o separación rápida para uso en los métodos de formación de imagen médica descritos en la presente. Modificaciones tales como I253A (Hornick et al. (2000) J. Nucl. Med.41:355) y H435A/R I253A o H310A (Kim et al. (2000) Eur. J. Immunol.29:2819) en Fc de IgG1 humana pueden reducir la unión a FcRN. Véase también, Kenanova et al. (2005) Cancer Res.65:622. Otros medios para mejorar la separación incluyen, formatear los dominios de unión al antígeno ya que los fragmentos de anticuerpo carecen de la capacidad para unirse a FcRn, tal como fragmentos Fab. Tal modificación puede reducir la semivida de circulación de un anticuerpo desde un par de semanas hasta cuestión de horas. La PEGilación selectiva de fragmentos de anticuerpo puede entonces ser usada para afinar (incremento en incrementos) la semivida de los fragmentos de anticuerpo si es necesario. Chapman et al. (1999) Nat. Biotechnol.17:780.

Las composiciones radioindicadoras que contienen un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de las mismas, pueden ser ensayadas para retención de especificidad de unión in vitro y/o in vivo. Los métodos para analizar la afinidad de unión, reactividad cruzada, y cinéticas de unión de varias composiciones de anticuerpo incluyen, ensayos estándares conocidos en el arte, por ejemplo, ELISA, Manchado Western, citometría de flujo, y análisis de resonancia de plasmón de superficie (SPR) BIACORE® usando un instrumento BIACORE® 2000 SPR (Biacore AB, Uppsala, Sweden).

Proteínas a modo de ejemplo para uso en las sondas radioetiquetadas descritas en la presente incluyen, cualquiera de la proteína de andamiaje alternativa o anticuerpo conocido, tal como Adnectinas, que se unen específicamente a un objetivo, y no reaccionan significantemente cruzado con objetivos no relacionados.

Proteína a Base de Fibronectina (FBS)

De acuerdo con la invención, la molécula de objetivo usada en las composiciones radioindicadoras descritas en la presente es una proteína FBS, en particular un dominio de fibronectiva tipo III (Fn3). En general, las moléculas de proteína FBS tienen inherentemente, rápidas velocidades de separación en sangre, lo cual puede ser ventajoso para uso con 18F en las tecnologías de formación de imagen minimizando la cantidad de tiempo necesario para que la sonda de fondo señale un tejido no relevante. Las sondas de separación rápida también permiten ser recolectadas imágenes de alto contraste el mismo día que la sonda es inyectada, y de manera muy importante, también pueden servir para reducir la exposición a la radiación total al sujeto.

Como se usa en la presente, un “andamiaje a base de fibronectina” o proteína o porción “FBS”, se refiere a proteínas o porciones que se basan en una repetición tipo III de fibronectina (“Fn3”). Fn3 es un dominio pequeño (aproximadamente 10 kDa) que tiene la estructura de un pliegue de inmunoglobulina (Ig) (es decir, una estructura pintercalada similar a Ig, que consiste en siete hebras-p y seis bucles). La fibronectina tiene 18 repeticiones Fn3, y mientras la homología de secuencia entre las repeticiones es baja, todas comparten una alta similitud en la estructura terciaria. Los dominios Fn3 también están presentes en muchas proteínas distintas de la fibronectina, tales como moléculas de adhesión, moléculas de la superficie celular, por ejemplo, receptores de citocina, y dominios de unión a carbohidratos. Para revisiones, véase Bork et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89(19):8990-8994 (1992); Bork et al., J. Mol. Biol., 242(4):309-320 (1994); Campbell et al., Structure, 2(5):333-337 (1994); Harpez et al., J. Mol. Biol., 238(4):528-539 (1994)). Los términos proteína o porción “FBS” está propuesto para incluir andamiajes a base de dominios Fn3 a partir de estas otras proteínas (es decir, moléculas no fibronectinas).

Un dominio Fn3 es pequeño, monomérico, soluble y estable. Carece de enlaces disulfuro y, por lo tanto, es estable bajo condiciones de reducción. Los dominios Fn3 comprenden, en orden de N-terminal a C-terminal, una hebra beta o similar a beta, A; un bucle, AB; una hebra beta o similar a beta, B; un bucle, BC; una hebra beta o similar a beta, C; un bucle, CD; una hebra beta o similar a beta, D; un bucle, DE; una hebra beta o similar a beta, E; un bucle, EF; una hebra beta o similar a beta, F; un bucle, FG; y una hebra beta o similar a beta, G. Las siete hebras-p antiparalelas están arregladas como dos láminas beta que forman un núcleo estable, mientras crean dos “caras” compuestas de los bucles que conectan las hebras beta o similares a beta. Los bucles AB, CD y EF, están localizados en una cara (“el polo sur”) y los bucles BC, DE, y FG, están localizados en la cara contraria (“el polo norte”). Existen al menos 15 diferentes moléculas Fn3 en la Fibronectina humana, y mientras la homología de secuencia entre las moléculas es baja, también portan una alta similitud en la estructura terciaria.

Los bucles en las moléculas Fn3 son estructuralmente similares a regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de anticuerpos, y cuando son alterados, pueden ser involucrados en la unión de la molécula Fn3 a un objetivo, por ejemplo, una proteína objetivo. Otras regiones de las moléculas Fn3, tales como las hebras beta o similares a beta y regiones N-terminales o C-terminales, cuando se alteran, pueden también estar involucradas en la unión a un objetivo. Cualquiera o todos los bucules de AB, BC, CD, DE, EF y FG pueden participar en la unión a un objetivo. Cualquiera de las hebras beta o similares a beta puede ser involucrada en la unión a un objetivo. Los dominios Fn3 pueden también unirse a un objetivo a través de uno o más bucles y una o más hebras beta o similares a beta. La unión también puede requerir regiones N-terminales o C-terminales. Un dominio FBS para uso en una proteína puede comprender todos los bucles, todas las hebras beta o similares a beta, o solamente una porción de ellos, en donde ciertos bucles y/o hebras beta o similares a beta y/o regiones N- o C-terminales son modificados (o alterados), siempre que el dominio FBS se una preferiblemente de manera específica a un objetivo. Por ejemplo, un dominio FBS puede comprender 1, 2, 3, 4, 5 o 6 bucles, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, o 8 hebras beta, y opcionalmente una región N-terminal y/o C-terminal, en donde uno o más bucles, una o más hebras beta, la región N-terminal y/o las regiones C-terminales, son modificadas con relación al dominio FBS de tipo silvestre.

Un ejemplo de proteínas FBS que se basan en dominios 10Fn3 humanos son adnectinas (Adnexus, una subsidiaria completamente propiedad de Bristol-Myers Squibb). Las adnectinas son moléculas de 10Fn3 en las cuales las regiones de bucle similar a CDR, hebras-p, regiones N-terminal y/o C-terminal de un dominio 10Fn3, han sido modificadas para envolver una proteína capaz de unirse a un compuesto de interés. Por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 7,115,396 describe proteínas de dominio 10Fn3 en donde las alteraciones a los bucles BC, DE, y FG resultan en aglutinantes de TNFa de alta afinidad. La Patente Estadounidense No. 7,858.739 describe proteínas del dominio 10Fn3 en donde las alteraciones al bucle BC, DE, y FG, resultan en aglutinantes de VEGFR2 de alta afinidad.

En ciertas modalidades, una porción FBS se basa en una repetición de Fn3 distinta de la 10ma. repetición del dominio de fibronectina de tipo III, por ejemplo, fibronectina humana. Por ejemplo, una porción FBS puede ser similar a cualquiera de las otras repeticiones de tipo III de fibronectina, por ejemplo, las repeticiones Fn3 1ra, 2da, 3era, 4ta, 5ta,

6ta, 7ma, 8ava, 9na, 11aava, 12ava, 13ava, 14ava, 15ava, 16ava, 17ava, y I8ava. En aún otras modalidades, una puede ser desde una molécula distinta de fibronectina. Las porciones FBS a modo de ejemplo pueden ser derivadas de tenascina, una proteína que está compuesta de 15 dominios Fn3 con similitudes de secuencia similares entre sí como se encuentra en fibronectina. Estas repeticiones se describen, por ejemplo, en Jacobs et al., Protein Engineering, Design & Selection, 25:107 (2012). Con base en la homología de las repeticiones en la molécula de fibronectina y aquellas en las moléculas de tenascina, han sido creadas moléculas artificiales a base de estas homologías. Las proteínas que comprenden una secuencia de aminoácido consenso con base en la homología de los dominios en la molécula de fibronectina, son referidas como Fibcon y FibconB (WO 2010/093627 y Jacobs et al.

(2012) supra.) y aquellas con base en la homología de los dominios en la molécula tenascina son referidas como Tencon (WO 2010/051274, WO 2010/051310 y WO 2011/137319). Una porción Fibcon, FibconB o Tencon, o variantes de unión de objetivo de las mismas, sean por sí mismas o ligadas a una porción heteróloga, pueden ser fusionadas como se describe en la presente. Los dominios Fn3 de otras proteínas, por ejemplo, receptores de citocina y hormona de la superficie celular, chaperoninas, y dominios de unión a carbohidratos, pueden ser conjugados como se describe en la presente.

Las proteínas FBS específicas para cualquier molécula objetivo deseada pueden ser generadas y probadas usando métodos reconocidos en el arte. Los métodos para probar las propiedades de unión de las proteínas FBS también son bien conocidos. Por ejemplo, una forma para hacer y probar rápidamente dominios Fn3 con propiedades de unión específicas, es la tecnología de fusión de proteína-ácido nucleico de Adnexus, una Compañía de Bristol-Myers Squibb R&D. Esta descripción utiliza la tecnología de etiquetado y expresión in vitro, llamada “PROfusión”, la cual explota fusiones de proteína-ácido nucleico (fusiones de ARN- y ADN de proteína) para identificar nuevos polipéptidos y porciones de aminoácido que son importantes para la unión a proteínas. La tecnología de fusión de proteína-ácido nucleico es una tecnología que acopla covalentemente una proteína a su información genética codificante. Para una descripción detallada de la tecnología de fusión de proteína-ARN y métodos de selección de biblioteca de proteína de andamiaje a base de fibronectina, véase Szostak et al., Patentes Estadounidenses Nos.

6,258,558, 6,261,804, 6,214,553, 6,281,344, 6,207,446, 6,518,018 y 6,818,418; Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1997;94:12297-12302; y Kurz et al., Molecules, 2000;5:1259-64.

Proteínas o porciones de FBS a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a aquellas las cuales se unen a mesoteliano, glipicanos, TL1A, CD8, miostatina, receptores L^pA1, TNF-alfa, VEGFR2, PCSK9, IL-23, EGFR o

IGF1R y aquellos los cuales son descritos, por ejemplo, en los documentos WO 2010/093627, WO 2011/130324,

WO 2009/083804, WO 2009/133208, WO 02/04523, WO 2012/016245, WO 2009/023184, WO 2010/051310, WO 2011/020033, WO 2011/051333, WO 2011/051466, WO 2011/092233, WO 2011/100700, WO 2011/130324, WO 2011/130328, WO 2011/137319, WO 2010/051274, WO 2009/086116, WO 09/058379, WO2013/067029 y WO2012/016245: cualquiera de las proteínas o porciones FBS descritas en estas publicaciones, pueden ser usadas como se describe en la presente.

En algunas modalidades, las proteínas FBS se unen a PDL-1. En algunas modalidades, la proteína FBS comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

En ciertas modalidades divulgadas en la presente pero que no forman parte de la invención, un agente que forma imagen, por ejemplo, que comprende una proteína FBS, está ligado a una porción que modula, por ejemplo, incrementa, su PK en sangre por incrementos pequeños para mejorar el contraste de imagen o incrementar la avidez del agente de objetivo etiquetado con 18F. En algunas modalidades, la velocidad de separación del polipéptido en un mamífero (por ejemplo, ratón, rata o humano), es, o se incrementa por más de dos veces, más de tres veces, más de cuatro veces, o más de cinco veces con relación a la proteína FBS no modificada. Las porciones que muestran separación de una proteína a partir de la sangre, en la presente referidas como “porciones PK”, incluyen porciones de polioxialquileno (por ejemplo, polietilenglicol), azúcares (por ejemplo, ácido siálico), y porciones de proteína bien toleradas (por ejemplo, Fc y fragmentos y variantes de las mismas, transferrina, o albúmina de suero). La proteína FBS también puede ser fusionada a albúmina o un fragmento (porción) o variante de albúmina como se describe en la Publicación Estadounidense No. 2007/0048282, o puede ser fusionada a una o más proteínas FBS que se unen a albúmina de suero, como se describe en la presente.

Otras proteínas PK que pueden ser usadas en la invención incluyen aquellas descritas en Kontermann et al., (Current Opinión in Biotechnology 2011;22:868-76). Tales porciones PK incluyen, pero no se limitan a, fusiones de albúmina de suero humano, conjugados de albúmina de suero humano, aglutinantes de albúmina de suero humano

(por ejemplo, Adnectina PKE, AlbudAb, ABD), fusiones XTEN, fusiones PAS (es decir, miméticos de PEG recombinante basados en los tres aminoácidos prolina, alanina y serina), conjugados de carbohidratos (por ejemplo, hidroxietile almidón (HES)), glicosilación, conjugados de ácido polisiálico, y conjugados de ácido graso.

En algunas modalidades, la invención proporciona proteínas FBS etiquetadas con 18F fusionadas a una porción PK que es un azúcar polimérico. En algunas modalidades, la porción PK es una porción de polietilenglicol. El PEG es un polímero soluble en agua, bien conocido, que es comercialmente disponible o puede ser preparado por polimerización de apertura de anillo de etilenglicol de conformidad con métodos bien conocidos en el arte (Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol.3, paginas 138-161).

El término “PEG” es usado ampliamente para abarcar algunas moléculas de polietilenglicol, sin considerar el tamaño o modificación en un extremo del PEG, y pueden ser representados por la fórmula: X—O(CH2CH2O)n-1CH2CH2OH, donde n es 20 hasta 2300 y X es H o una modificación terminal, por ejemplo, un alquilo C1-4. El PEG puede contener grupos químicos adicionales los cuales son necesarios para reacciones de unión, los cuales resultan de la síntesis química de la molécula; o los cuales actúan como un espaciador para distancia óptima de partes de la molécula. En adición, tal PEG puede consistir en una o más cadenas secundarias de PEG las cuales están ligadas en conjunto. Los PEGs con más de una cadena PEG son llamados PEG ramificados o de ramas múltiples. Los PEGs ramificados son descritos en, por ejemplo, la Solicitud Publicada Europea No. 473084A y Patente Estadounidense No.

5,932.462.

Una o más moléculas de PEG pueden ser unidas a diferentes posiciones en la proteína, y tal unión puede lograrse por reacción con aminas, tioles u otros grupos reactivos adecuados. La porción amina puede ser, por ejemplo, una amina primaria encontrada en el N-terminal de un polipéptido o un grupo amina presente en un aminoácido, tal como lisina o arginina. En algunas modalidades, la porción de PEG está unida a una posición en el polipéptido seleccionado a partir del grupo que consiste en: a) el N-terminal; b) entre el N-terminal y la hebra beta más N-terminal o hebra similar a beta; c) un bucle posicionado en una cara del polipéptido contraria al sitio de unión objetivo; d) entre el C-terminal y la hebra beta más C-terminal o hebra similar a beta; y e) en el C-terminal.

La PEGilación se puede lograr por PEGilación de sitio dirigido, en donde un grupo reactivo adecuado es introducido en la proteína para crear un sitio donde ocurre preferiblemente la PEGilación. En algunas modalidades, la proteína es modificada para introducir un residuo de cisteína en una posición deseada, permitiendo la PEGilación de sitio dirigido en la cisteína. Las mutaciones pueden ser introducidas en una secuencia codificante de proteína para generar residuos de cisteína. Esto se podría lograr, por ejemplo, por mutación de uno o más residuos de aminoácido a cisteína. Aminoácidos preferidos para mutación a un residuo de cisteína incluyen serina, treonina, alanina y otros residuos hidrofílicos. Preferiblemente, el residuo que será mutado a cisteína es un residuo expuesto en la superficie. Los algoritmos son bien conocidos en la técnica para predecir accesibilidad de superficie de residuos a base de una secuencia primaria o una proteína. Alternativamente, los residuos de superficie pueden ser predichos comparando las secuencias de aminoácido de polipéptidos de unión, dado que la estructura cristalina de la red, con base en lo cual los polipéptidos de unión son designados y desprendidos, han sido resueltos (véase Himanen et al., Nature 2001;414:933-8) y de este modo, identificados los residuos expuestos en la superficie. La PEGilación de residuos de cisteína se puede llevar a cabo usando, por ejemplo, PEG-maleimida, PEG-vinilsulfona, PEG-yodoacetamida, o PEG-ortopiridil disulfuro.

El PEG es normalmente activado con un grupo de activación adecuado apropiado para acoplar a un sitio deseado en el polipéptido. Los métodos de PEGilación son bien conocidos en la técnica y se describen además en Zalipsky, S., et al., “Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides” in Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, New York (1992), y en Zalipsky (1995) Advanced Drug Reviews 16: 157-182.

El PEG puede variar ampliamente en peso molecular y puede ser ramificado o lineal. Normalmente, el peso molecular promedio ponderado de PEG es desde aproximadamente 100 Daltons hasta aproximadamente 150,000 Daltons. Pesos moleculares promedio ponderados a modo de ejemplo para PEG incluyen aproximadamente 5,000 Daltons, aproximadamente 10,000 Daltons, aproximadamente 20,000 Daltons, aproximadamente 40,000 Daltons, aproximadamente 60,000 Daltons y aproximadamente 80,000 Daltons. En ciertas modalidades, el peso molecular de PEG es 5,000 Daltons. Versiones ramificadas de PEG que tiene un peso molecular total de cualquiera de los mencionados anteriormente también pueden ser usadas. En algunas modalidades, el PEG tiene dos ramificaciones. En algunas modalidades, el PEG tiene cuatro ramificaciones. En algunas modalidades, el PEG es un bis-PEG (NOF Corporation, DE-200MA).

Similar a los anticuerpos, la PEGilación selectiva de adnectinas puede ser usada para afinar (incremento en incrementos) la semivida de las adnectinas si es necesario.

Las técnicas de purificación y separación convencionales conocidas en el arte pueden ser usadas para purificar proteínas FBS PEGiladas, tales como exclusión de tamaño (por ejemplo, filtración en gel) y cromatografía de intercambio iónico. Los productos también pueden ser separados usando SDS-PAGE. Los productos que pueden ser separados incluyen Adnectinas mono-, di-, tri-, poli- y no-PEGiladas, así como también PEG libres. El porcentaje de conjugados de mono-PEG puede ser controlado combinando fracciones más amplias alrededor del pico de elución para incrementar el porcentaje de mono-PEG en la composición. Aproximadamente 90% de conjugados mono-PEG representan un buen equilibrio de rendimiento y actividad.

IV. Objetivos

Moléculas objetivo in vivo a modo de ejemplo las cuales se unen a las sondas etiquetadas con 18F descritas en la presente, son aquellas asociadas a varias enfermedades o condiciones, tales como una enfermedad maligna, una enfermedad cardiovascular, una enfermedad infecciosa, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmune, o una enfermedad neurológica.

Proporcionados en la presente (pero sin formar parte de la invención) están agentes que forman imagen etiquetados con 18F, por ejemplo, [18F]-porción-4PEG-DBCO-FPPEGA, en donde la porción se une específicamente a una molécula objetivo, tal como una proteína objetivo en la superficie de células humanas. La porción puede ser un péptido; un anticuerpo, o una porción del mismo de unión al antígeno o una variante de un anticuerpo; o un andamiaje alternativo, tal como un dominio Fn3 (por ejemplo, un Fn3 humano), tal como un FBS, por ejemplo, un dominio 10Fn3 humano. La porción en las sondas a base de proteína radioetiquetadas con 18F de la invención es una proteína que comprende un dominio de fibronectina tipo III (Fn3). En ciertas modalidades, la porción se une a una molécula de la superficie celular, por ejemplo, una molécula de la superficie celular en una célula tumoral o una célula en el tumor, por ejemplo, un linfocito de infiltración de tumor que está localizado en el tumor. En ciertas modalidades, la porción se une a una molécula de la superficie celular en una célula inmune, por ejemplo, una célula T (por ejemplo, una célula Treg), una célula Teff, una célula B, un macrófago, una célula dendrítica, una célula NK o células Langerhans.

En ciertas modalidades, un agente que forma imagen etiquetado con 18F comprende una porción que se une específicamente a un objetivo inmuno-oncológico (receptor o ligando), tal como un receptor co-estimulador en una célula inmune (por ejemplo, célula T o célula NK) o un inhibidor en una célula inmune (por ejemplo, una célula T o célula NK), la cual dirige las respuestas inmunes moduladas. En una modalidad, la porción se une a una de las siguientes moléculas o ligando o receptor de la misma: un miembro de la super familia de inmunoglobulina (IgSF); un miembro de la familia B7, el cual incluye B7-1, B7-2, B7-H1 (PD-L1), B7-DC (PD-L2), B7-H2 (ICOS-L), B7-H3, B7-H4, B7-H5 (VISTA), y B7-H6; un miembro de la superfamilia del receptor TNF o su ligando, por ejemplo, CD40, CD40L, OX-40, OX-40L, CD70, CD27L, CD30, CD30L, 4-1BBL, CD137, GITR, TRAIL/Apo2-L, TRAILR1/DR4, TRAILR2/DR5, TRAILR3, TRAILR4, OPG, RANK, RANKL, TWEAKR/Fn14, TWEAK, BAFFR, EDAR, XEDAR, TACI, APRIL, BCMA, LTpR, LIGHT, DcR3, HVEM, VEGI/TL1A, TRAMP/DR3, EDAR, EDA1, XEDAR, EDA2, TNFR1, Linfotoxina a/TNFp, TNFR2, TNFa, LTpR, Linfotoxina a ip2, FAS, FASL, RELT, DR6, TROY, NGFR (véase, por ejemplo, Tansey (2009) Drug Discovery Today 00:1); una proteína que inhibe una célula inmune (por ejemplo, inhibidores de punto de comprobación inmune), tales como ^cT^lA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, y LAG-3, TIM-3, Galectina 9, CEACAM-1, BTLA, CD69, Galectina-1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, 2B4, CD48, GARP, CD73, PD1H, LAIR1, TIM-1,TIM-4, CD39; una proteína que estimula una respuesta inmune, tal como B7-1, B7-2, CD28, 4-1BB (CD137), 4-1BBL, GITR, GITRL, ICOS, ICOS-L, OX40, OX40L, CD70, CD27, CD40, DR3 y CD28H; cualquiera de las siguientes moléculas de la superficie celular: KIR, receptores de citocina o interleucina, IL-6, IL-10, TGF-13, VEGF, CSF-1R, CD25 e IDO.

En algunas modalidades, la molécula de objetivo se une a un antígeno o receptor de un patógeno, que incluye pero no se limita a hongo, virus, parásitos y bacterias. Ejemplos de virus patogénicos detectables por los métodos descritos en la presente incluyen HIV, hepatitis (A, B, o C), virus del herpes (por ejemplo, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II, y CMV, virus Epstein Barr), adenovirus, virus de la influenza, flavivirus, ecovirus, rinovirus, virus coxsackie, coronavirus, virus sincitial respiratorio, virus de las paperas, rotavirus, virus del sarampión, virus de la rubiola, parvovirus, virus vaccinia, virus HTLV, virus del dengue, virus del papiloma, virus del molusco, poliovirus, virus de la rabia, virus JC y virus de encefalitis arboviral, virus de inmunodeficiencia humana (HIV, por sus siglas en inglés), virus del herpes, citomegalovirus, virus de la rabia, virus de la influenza, virus de la hepatitis B, virus Sendai, virus de leucemia felina, virus Reo, virus de la polio, virus similar al parvo- en suero humano, virus de simio 40, virus sincitial respiratorio, virus de tumor mamario de ratón, virus de la Varicela-Zoster, virus del Dengue, virus de la rubiola, virus de las paperas, adenovirus, virus de leucemia de células T, virus Epstein-Barr, virus de leucemia murina, virus del sarampión, virus de estomatitis vesicular, virus Sindbis, virus coriomeningitis linfocítica, virus de la verruga, virus de la lengua azul. Ejemplos de bacterias y hongos incluyen, Streptococcus agalactiae, Legionella pneumophilia, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pneumococcus, Hemophilis influenzae B, Treponema pallidum, espiroquetas de la enfermedad de Lyme, Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium leprae, Brucella abortus, Mycobacterium tuberculosis y Chlostridium tetani.

Algunos ejemplos de bacterias patogénicas que causan infecciones detectables por métodos descritos en la presente incluyen clamidias, bacteria rickettsial, micobacteria, estafilococos, estreptococos, neumococos, meningococos, y gonococcos, klebsiella, proteus serratia, pseudomonas, legionela, difteria, salmonela, bacilos, cólera, tétano, botulismo, ántrax, plaga, leptospirosis, y bacterias de la enfermedad de Lyme.

Algunos ejemplos de hongos patogénicos que causan infecciones detectables por métodos descritos en la presente incluyen Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, etc.), Cryptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger, etc.), Genus Mucorales (mucor, absidia, rhizopus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis e Histoplasma capsulatum.

Algunos ejemplos de parásitos patogénicos que causan infecciones detectables por métodos descritos en la presente incluyen Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondii, Nippostrongylus brasiliensis.

V. Caracterización Biofísica y Bioquímica

La unión de las moléculas de objetivo de proteína descrita en la presente a una molécula de objetivo, se puede evaluar en términos de constantes de equilibrio (por ejemplo, disociación, Kd) y en términos de constantes de cinética (por ejemplo, contante de asociación activada kasoc. y constante de asociación desactivada, kdisoc.). Una molécula de objetivo de proteína en general, se unirá a una molécula objetivo con una K^dde menos de 500 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 200 pM o 100 pM, a pesar de que los altos valores de K^dpueden ser tolerados en donde la kdisoc. es suficientemente menor o la kasoc., es suficientemente alta

Ensayos a modo de ejemplo para determinar la afinidad de unión de una Adnectina anti-PD-L1 incluyen, pero no se limitan a, métodos de fase de solución, tal como el ensayo de exclusión de cinética (KinEx A)(Blake et al., JBC 1996: 271:27677-85; Drake et al., Anal Biochem 2004; 328:35-43), resonancia de plasmón de superficie (SPR) con el sistema Biacore (Uppsala, Suecia)(Welford et al., Opt. Quant, Elect 1991; 231:1; Morton and Myska, Methods in Enzymology 1998: 195:268) y ensayos de fluorescencia resueltos con tiempo homogéneos (HTRF) (Newton et al., J Biomol Screen 2008; 13:674-82; Patel et al., Assay Drug Dev Technol 2008; 6:55-68).

En ciertas modalidades, las interacciones biomoleculares pueden ser monitoreadas en tiempo real con el sistema Biacore, el cual usa SPR para detectar cambios en el ángulo de resonancia de luz en la superficie de una película de oro delgada en un soporte de vidrio debido a cambios en el índice refractivo de la superficie hasta por 300 nm separados. El análisis Biacore genera constantes de velocidad de asociación, constantes de velocidad de disociación, constantes de disociación en equilibrio y constantes de afinidad. La afinidad de unión se obtiene evaluando las constantes de velocidad de asociación y disociación usando un sistema de resonancia de plasmón de superficie Biacore (Biacore, Inc). Un chip biosensor es activado por acoplamiento covalente del objetivo. El objetivo es entonces diluido e inyectado sobre el chip para obtener una señal en unidades de respuesta de material inmovilizado. Ya que la señal en las unidades de resonancia (RU) es proporcional a la masa de material inmovilizado, esto representa un intervalo de densidades de objetivo inmovilizado en la matriz. Los datos de asociación y disociación se fijan simultáneamente en un análisis global para resolver la expresión de velocidad neta para una interacción biomolecular 1:1, proporcionando mejores valores de ajuste para kasoc., kdisoc. y Rmáx (respuesta máxima a saturación). Las constantes de disociación en equilibrio para unión, las Kd son calculadas de las mediciones SPR como kdisoc./kasoc.

En algunas modalidades, las moléculas de objetivo de proteína descritas en la presente presentan una Kd en el ensayo de afinidad SPR de 500 nM o menos, 400 nM o menos, 300 nM o menos, 200 nM o menos, 150 nM o menos, 100 nM o menos, 90 nM o menos, 80 nM o menos, 70 nM o menos, 60 nM o menos, 50 nM o menos, 40 nM o menos, 30 nM o menos, 20 nM o menos, 15 nM o menos, 10 nM o menos, 5 nM o menos, o 1 nM o menos.

Se debe entender que los ensayos descritos en la presente anteriormente son a modo de ejemplo, y que algunos métodos conocidos en la técnica para determinar la afinidad de unión entre proteínas (por ejemplo, transferencia a base de fluorescencia (FRET), ensayo inmunosorbente ligado a la enzima, y ensayos de unión competitiva (por ejemplo, radioinmunoensayos)) pueden ser usados para evaluar las afinidades de unión de las moléculas de objetivo de proteína descritas en la presente.

IV. Formulaciones

Proporcionadas en la presente están composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticas, que contienen una o una combinación de agentes de objetivo etiquetados con 18F, descritos en la presente, formulados junto con un portador farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones pueden incluir una o una combinación de (por ejemplo, dos o más diferentes) agentes descritos en la presente. Por ejemplo, una composición farmacéutica descrita en la presente puede comprender una combinación de agente de objetivo etiquetado con 18F y un fármaco.

Como se usa en la presente, “portador farmacéuticamente aceptable” incluye cualquiera y todos los solventes, medio de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes retardantes de la absorción e isotónicos, y similares, que son fisiológicamente compatibles. Preferiblemente, el portador es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidermal (por ejemplo, por inyección o infusión). Dependiendo de la ruta de administración, el agente de objetivo etiquetado con 18F puede ser recubierto en un material para proteger el compuesto de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.

Los compuestos farmacéuticos descritos en la presente pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una “sal farmacéuticamente aceptable” se refiere a una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto precursor y no imparte algunos efectos toxicológicos indeseados (véase, por ejemplo, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Ejemplos de tales sales incluyen sales de adición de ácido y sales de adición de base. Las sales de adición de ácido incluyen aquellas derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como ácido clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso y similares, así como también de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos mono y di-carboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos fenilo sustituidos, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos y similares. Sales de adición de base incluyen aquellas derivadas de metales alcalinotérreos tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, así como también de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N,N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína y similares.

Una composición farmacéutica descrita en la presente, también puede incluir un anti-oxidante farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en agua, tales como ascorbil palmitato, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, propil galato, alfa-tocoferol, y similares; y (3) agentes quelantes de metal, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminatetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, y similares. Ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados que pueden ser empleados en las composiciones farmacéuticas descritas en la presente incluyen, agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, por el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerida en el caso de dispersiones, y por el uso de tensioactivos.

Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservadores, agentes humectantes, agentes emulsificantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos se puede asegurar tanto por procedimientos de esterilización, supra, como por la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol sórbico, y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos tales como azúcares, cloruro de sodio y similares en las composiciones. En adición, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede ser llevada provocada por la inclusión de agentes los cuales retardan la absorción tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de tal medio y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce en la técnica. Excepto en cuando a cualquier medio o agente convencional que es compatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones farmacéuticas descritas en la presente. Los compuestos activos complementarios también pueden ser incorporados en las composiciones.

Las composiciones farmacéuticas normalmente deben ser estériles y estables bajo condiciones de manufactura y almacenamiento. Las composiciones pueden ser formuladas como una solución, microemulsión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada a la alta concentración del fármaco. El portador puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de tensioactivos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede provocar incluyendo en la composición, un agente que retarda la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles pueden ser preparadas incorporando el agente de objetivo etiquetado con 18F en la cantidad requerida en un solvente apropiado con una o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, como se requiere, seguido por microfiltración por esterilización. En general, las dispersiones son preparadas incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos a partir de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado a vacío y secado por congelamiento (liofilización) que proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución previamente filtrada estéril de la misma.

La cantidad de agente de objetivo etiquetado con 18F la cual puede ser combinada con un material portador para producir una forma de dosificación única, variará dependiendo del sujeto que es tratado, y el modo particular de administración. La cantidad de agente de objetivo etiquetado con 18F la cual puede ser combinada con un material portador para producir una forma de dosificación única, en general, será aquella cantidad de la composición la cual produce un efecto detectable. En general, del cien por ciento, esta cantidad variará desde aproximadamente 0,01 por ciento hasta aproximadamente noventa y nueve por ciento del ingrediente activo, preferiblemente desde aproximadamente 0,1 por ciento hasta aproximadamente 70 por ciento, muy preferiblemente desde aproximadamente 1 por ciento hasta aproximadamente 30 por ciento del ingrediente activo en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.

VII. Administración y obtención de imágenes

Los agentes de objetivo etiquetados con 18F descritos en la presente, son útiles en varias aplicaciones de formación de imagen in vivo (por ejemplo, para formación de imagen de cuerpo completo o tejido). En ciertas modalidades, el agente de objetivo etiquetado con 18F puede ser usado para imagen de células o tejidos positivos al objetivo, por ejemplo, tumores que expresan el tumor. Por ejemplo, el agente de objetivo etiquetado con 18F es administrado a un sujeto en una cantidad suficiente para captar el agente de objetivo etiquetado con 18F en el tejido de interés. El sujeto es entonces formado en imagen usando un sistema que forma imagen tal como PET por una cantidad de tiempo apropiada para el radionúclido de 18F. El agente de objetivo etiquetado con 18F unido a las células o tejidos que expresan el agente de objetivo, son entonces detectados por el sistema que forma imagen.

Normalmente, para propósitos de formación de imagen, es deseable proporcionar el recipiente con una dosificación de proteína o péptido que está en el intervalo desde aproximadamente 1 mg hasta 200 mg como una infusión intravenosa única, aunque dosificaciones superiores o inferiores también pueden ser administradas como lo dicten las circunstancias. Normalmente, es deseable proporcionar el recipiente con una dosificación que está en el intervalo desde aproximadamente 1 mg hasta 10 mg por metro cuadrado de área de superficie corporal de la proteína o péptido para el adulto típico, aunque una dosificación inferior o superior también puede ser administrada como lo dicten las circunstancias. Ejemplos de proteínas o péptidos de dosificaciones que pueden ser administrados a un sujeto humano para propósitos de formación de imagen son aproximadamente 1 hasta 200 mg, aproximadamente 1 hasta 70 mg, aproximadamente 1 hasta 20 mg, y aproximadamente 1 hasta 10 mg, aunque dosis inferior o superior pueden ser usadas.

En ciertas modalidades, la administración ocurre en una cantidad de proteína radioetiquetada con 18F de entre aproximadamente 0,005 pg/kg de peso corporal hasta aproximadamente 50 pg/kg de peso corporal por día, usualmente entre 0,02 pg/kg de peso corporal hasta aproximadamente 3 pg/kg de peso corporal. La masa asociada a un indicador de PET está en la forma del isótopo natural, es decir, 19F para un indicador de PET 18F. Una dosificación analítica particular para la presente composición incluye desde aproximadamente 0,5 pg hasta aproximadamente 100 pg de una proteína radioetiquetada. La dosificación usualmente será desde aproximadamente 1 pg hasta aproximadamente 50 pg de una proteína radioetiquetada con 18F.

Los regímenes de dosificación son ajustados para proporcionar la cantidad óptima detectable para obtener una imagen clara del tejido o células las cuales captan el agente de objetivo etiquetado con 18F. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosificación unitaria por facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma de dosificación unitaria como se usa en la presente, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a los cuales el agente de objetivo etiquetado con 18F está siendo administrado. La especificación para las formas de dosificación unitaria descritas en la presente es dictada mediante y directamente dependiente de (a) las características únicas de la porción de objetivo del agente de objetivo etiquetado con 18F; (b) el tejido o células que serán objetivo; (c) las limitaciones inherentes en la tecnología de formación de imagen usada.

Para administración del agente de objetivo etiquetado con 18F, la dosificación usada dependerá del tipo de enfermedad, compuesto objetivo usado, la edad, condición física, y género del sujeto, el grado de la enfermedad, el sitio que será examinado, y otros. En particular, se tiene que tomar suficiente cuidado acerca de las exposiciones de dosis a un sujeto. Preferiblemente, una dosis de saturación de 18F se administra al paciente. Por ejemplo, la cantidad de radioactividad de agente de objetivo etiquetado con 18F usualmente varía desde 3,7 megabecquereles hasta 3,7 gigabecquereles, y preferiblemente desde 18 megabecquereles hasta 740 megabecquereles. Alternativamente, la dosificación puede ser medida por milicurieres, por ejemplo. En algunas modalidades, la cantidad de 18F que forma imagen administrada para estudios de formación de imagen es 5 a 10 mCi. En algunas modalidades, una cantidad efectiva será la cantidad de compuesto suficiente para producir emisiones en el intervalo desde aproximadamente 1 5 mCi.

Los niveles de dosificación de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas descritas en la presente pueden ser variados para así obtener una cantidad del ingrediente activo el cual es efectivo para lograr la captación deseada del agente de objetivo etiquetado con 18F en las células o tejidos de un paciente, composición, y modo de administración particular, sin ser tóxico al paciente. Se entenderá, sin embargo, que el empleo diario total del agente de objetivo etiquetado con 18F de la presente descripción, se decidirá por el especialista que atiendo u otro profesional que atiende dentro del alcance del juicio médico sano. El nivel de dosis efectiva específica para cualquier sujeto particular dependerá de varios factores, que incluyen por ejemplo, la actividad de la composición específica empleada; la composición específica empleada; la edad, peso corporal, salud general, sexo, y dieta del hospedero; el tiempo de administración; la ruta de administración; la velocidad de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; otros fármacos; compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historial médico previo del paciente siendo tratado, y factores similares bien conocidos en las artes médicas. En ciertas modalidades, la cantidad de sonda radioetiquetada con 18F administrada en un sujeto humano requerida para formación de imagen será determinada por el especialista que prescribe con la dosificación en general variando de conformidad con la cantidad de emisión a partir del radionúclido de 18F.

Una composición descrita en la presente puede ser administrada mediante una o más rutas de administración usando una o más de varios métodos conocidos en la técnica. Como se apreciará por el experto en la técnica, la ruta y/o modo de administración, variarán dependiendo de los resultados deseados. Las rutas de administración preferidas para el agente de objetivo etiquetado con 18F descrito en la presente incluyen rutas de administración intravenosa, intramuscular, intradermal, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras rutas parenterales, por ejemplo, por inyección o infusión. La frase “administración parenteral” como se usa en la presente significa modos de administración distintos de la administración entérica y tópica, usualmente por inyección, e incluye, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradermal, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal, epidural e intrasternal. En ciertas modalidades, el compuesto de objetivo radioetiquetado con 18F es administrado intravenosamente.

Alternativamente, un agente de objetivo etiquetado con 18F descrito en la presente puede ser administrado mediante una ruta no parenteral, tal como una ruta de administración tópica, epidermal o mucosal, por ejemplo, intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópicamente.

En ciertas modalidades, el agente de objetivo etiquetado con 18F descrito en la presente puede ser formulado para asegurar la distribución apropiada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrofílicos. Los agentes pueden cruzar la BBB formulándolos, por ejemplo, en liposomas. Para métodos de manufacturación de liposomas, véase, por ejemplo, Patentes Estadounidenses 4,522.811; 5,374.548; y 5,399.331. Los liposomas pueden comprender una o más porciones las cuales son selectivamente transportadas en células u órganos específicos, de este modo mejorando el suministro de fármaco objetivo (véase, por ejemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Porciones de objetivo a modo de ejemplo incluyen folato o biotina (véase, por ejemplo, Patente Estadounidense 5,416.016 por Low et al.); manósidos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); anticuerpos (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor de la proteína A de la superficie (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); véase también K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett.346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994).

El siguiente procedimiento ilustrativo puede ser utilizado cuando se realizan estudios de formación de imagen de PET en pacientes en la clínica. El paciente es premedicado con proteína no etiquetada algún tiempo previo al día del experimento y es ayunado por al menos 12 horas permitiendo la absorción de agua a albedrío. Se insertó un catéter venoso de 5,08 cm (2 pulgadas) de 20G en la vena ulnar contralateral para administración del radioindicador.

El paciente es posicionado en la cámara PET y una dosis indicadora del indicador PET de sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F tal como [18F] compuesto del Ejemplo 9 (<20 mCi) es administrada mediante catéter i.v. Cualquiera de las muestras de sangre venosa o arteriales se toman a aproximadamente 15 intervalos de tiempo a través del barrido de PET con el fin de analizar y cuantificar la fracción de indicador PET no metabolizado de [18F]-compuesto del Ejemplo 2 en plasma. Las imágenes son adquiridas por hasta 120 minutos. Dentro de diez minutos de la inyección del radioindicador y al término de la sesión de formación de imagen, se obtuvieron muestras de sangre de 1 ml para determinar la concentración en plasma de algunas proteínas no etiquetadas las cuales pueden haber sido administradas antes del indicador de PET.

Las imágenes tomográficas se obtienen a través de la reconstrucción de imágenes. Para determinar la distribución del radioindicador, las regiones de interés (ROIs, por sus siglas en inglés) son extraídas en la imagen reconstruida que incluyen, pero no se limitan a, los pulmones, hígado, corazón, riñón, piel, u otros órganos y tejidos. Las captaciones del radioindicador con el tiempo en estas regiones, son usadas para regenerar las curvas de actividad del tiempo (TAC, por sus siglas en inglés) obtenida en la ausencia de alguna intervención o en la presencia de la proteína no etiquetada en los varios paradigmas de dosificación examinados. Los datos son expresados como radioactividad por unidad de tiempo por unidad de volumen (dosis inyectada pci/cc/mCi). Los datos de TAC son procesados con varios métodos bien conocidos en el campo para proporcionar parámetros cuantitativos, tales como Potencial de Unión (BP) o Distribución de Volumen (V^t), que son proporcionales a la densidad del tejido positivo objetivo no ocupado.

VIII. Kits y Artículos de fabricación

También se proporcionan kits para producir las composiciones de objetivo radioetiquetadas con 18F descritas en la presente, e instrucciones para uso. Los kits normalmente incluyen una combinación envasada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones y una etiqueta que indica el uso propuesto de los contenidos del kit.

El término etiqueta incluye cualquier escritura, o material grabado suministrado en, o con el kit, o el cual de otro modo, acompaña al kit.

Por ejemplo, en algunas modalidades, el kit contiene los reactivos necesarios para el grupo prostético en condición para ser fluorado en el sitio con 18F, y después enlazar el grupo prostético radioetiquetado a la molécula de objetivo ligada a BFC (por ejemplo, proteína o péptido), previo a la administración.

En ciertas modalidades, un kit comprende uno o más reactivos necesarios para formar un agente de imagen in vivo de adnectina anti-PD-L1 marcada con 18F, tal como una PD-L1 Adnectina-PEG4-DBC9-18F, como se describe más adelante en la presente. Por ejemplo, un kit puede comprender un primer vial que comprende una Adnectina-PEG-4-DBCO anti-PD-L1 y un segundo vial que comprende [18F]FPPEGa . Un kit puede comprender un primer vial que comprende Adnectina-PEG-4-DBCO anti-PD-L1, un segundo vial que comprende 4-PEG-tosil-azida y un tercer vial que comprende 18F en agua O18. Los kits pueden además comprender viales, soluciones y opcionalmente reactivos adicionales necesarios para la manufactura de PD-L1 Adnectina-PEG4-DBC9-18F.

En algunas modalidades, el kit puede contener además, al menos un reactivo adicional (por ejemplo, portador farmacéuticamente aceptable). En algunas modalidades, el kit incluye los precursores de reacción que serán usados para generar la sonda etiquetada de conformidad con los métodos descritos en la presente. Los componentes del kit pueden ser ajustados a la condición biológica particular que será monitoreada como se describe en la presente. El kit puede incluir, además, amortiguadores apropiados y reactivos conocidos en la técnica para administrar varias combinaciones de los componentes listados anteriormente a la célula hospedera u organismo hospedero. El agente que forma imagen y portador, pueden ser proporcionados en solución o en forma liofilizada. Cuando el agente que forma imagen y el portador del kit están en forma liofilizada, el kit puede contener opcionalmente un medio de reconstitución fisiológicamente aceptable tal como agua, salina, salina amortiguada y similares. Los contenedores adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, y tubos de ensayo. Los contenedores pueden ser formados de varios materiales tales como vidrio o plástico. Puede incluir además, otros materiales deseables a partir de un punto de vista del usuario y comercial, que incluyen otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, e insertos de envase con instrucciones para uso.

IX. Usos

Los métodos de formación de imagen usando agentes de objetivo etiquetados con 18F son proporcionados en la presente. Los indicadores de tomografía de emisión de positrón (PET) tales como las presentes sondas de PET a base de proteína radioetiquetada con 18F, pueden ser usados con tecnología PET actualmente disponible para uso en aplicaciones de formación de imagen de diagnóstico y exploratoria in vitro e in vivo. Las técnicas y equipo de formación de imagen para formación de imagen de 18F por barrido de PET, son bien conocidas en el arte (véase, por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 6,358,489; 6,953,567; Page et al., Nuclear Medicine and Biology, 21:911-919, 1994; Choi et al., Cancer Research 55:5323-5329, 1995; Zalutsky et al., J. Nuclear Med., 33:575-582, 1992) y algunas de tales técnicas o aparatos que forman imagen PET conocidas, pueden ser utilizados.

Las aplicaciones in vivo de los métodos que forman imagen proporcionados en la presente incluyen, diagnóstico de enfermedad, monitoreo del progreso de la enfermedad, pronóstico, determinación de la probabilidad de un sujeto para responder a un tratamiento, determinar la elegibilidad a un tratamiento, monitorear la respuesta clínica a terapia, evaluación clínica y selección de dosis de compuestos terapéuticos, estudios preclínicos de candidatos fármacos potenciales en modelos animales, y el estudio de distribución regional y concentración de moléculas objetivo en tejidos y órganos. Las aplicaciones in vitro incluyen selección de candidatos fármaco en ensayos celulares (por ejemplo, ensayos de competición, ensayos de afinidad, etc.).

En algunas modalidades, los agentes de objetivo etiquetados con 18F pueden ser usados para determinar la relación entre el nivel de ocupación del tejido por los compuestos terapéuticos candidatos y la eficacia clínica en los pacientes; para determinar la selección de dosis para ensayos clínicos de candidatos fármacos previo al inicio de los estudios clínicos a largo plazo; y comparar las potencias de diferentes candidatos fármacos.

En algunas modalidades, el compuesto de objetivo radioetiquetado con 18F se usa en un método para tejidos y/u órganos de tejidos enfermos o normales que forman imagen in vivo (por ejemplo, pulmones, corazón, riñones, hígado, y piel. Por ejemplo, el compuesto de objetivo radioetiquetado con 18F es administrado a un sujeto en una cantidad efectiva para resultar en la captación del compuesto de objetivo radioetiquetado con 18F en las células o tejidos de interés. El sujeto es entonces introducido a un sistema de formación de imagen apropiado (por ejemplo, sistema PET) por una cantidad de tiempo suficiente para permitir la detección del compuesto de objetivo radioetiquetado con 18F. La ubicación de la señal detectada a partir del compuesto de objetivo radioetiquetado con 18F puede ser correlacionada con la ubicación de las células o tejidos de interés. En algunas modalidades, las dimensiones de la ubicación pueden ser determinadas también. La formación de imagen in vivo se describe en la presente. Véase también, Patentes Estadounidenses Nos. 6,126.916; 6,077.499; 6,010.680; 5,776.095; 5,776.094; 5,776.093; 5,772.981; 5,753.206; 5,746.996; 5,697.902; 5,328.679; 5,128.119; 5,101.827 y 4,735.210.

Por consiguiente, en ciertos aspectos, se proporciona una sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F para su uso en un método para obtener una imagen de una sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F, el método comprende administrar la sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F a un sujeto, y formar imagen in vivo de la distribución de la sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F por PET.

En ciertas modalidades, el sujeto es un mamífero, por ejemplo, un humano, perro, gato, simio, mono, ratón o rata. En ciertos aspectos, se proporciona una sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F para su uso en un método para diagnosticar la presencia de una enfermedad en un sujeto, el método comprende administrar a un sujeto que lo necesita una sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F la cual se une a una molécula objetivo asociada a la presencia de la enfermedad, y obtener una radio-imagen de al menos una porción del sujeto para detectar la presencia o ausencia de la sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F.

En algunas modalidades, la enfermedad es un cáncer sólido, cáncer hematopoyético, cáncer hematológico, enfermedad autoinmune, enfermedad neurodegenerativa, enfermedad cardiovascular o infección patogénica.

La formación de imagen PET con un compuesto de objetivo radioetiquetado con 18F puede ser usada para detectar cualitativa o cuantitativamente el compuesto de objetivo. U agente que forma imagen de compuesto de objetivo radioetiquetado con 18F puede ser usado como un biomarcador, y la presencia o ausencia de una señal positiva en un sujeto puede ser indicativa que, por ejemplo, el sujeto podría ser sensible a una terapia dada, por ejemplo, una terapia de cáncer, o que el sujeto está respondiendo o no a una terapia.

En algunas modalidades, las etapas de este método pueden ser repetidas a intervalos determinados de manera que la ubicación y/o tamaño de la enfermedad puede ser monitoreado como una función de tiempo y/o tratamiento. En ciertas modalidades, el compuesto de objetivo radioetiquetado con 18F puede ser usado en un sujeto que se somete a tratamiento (por ejemplo, quimioterapia, etc.), para ayudar en la visualización de la respuesta al tratamiento. Por ejemplo, el compuesto de objetivo radioetiquetado con 18F es normalmente visualizado y dimensionado para tratamiento, y periódicamente (por ejemplo, diariamente, semanalmente, mensualmente, intervalos entre estos, y similares) durante el tratamiento para monitorear el progreso o regresión de la enfermedad en el paciente.

Por consiguiente, en ciertos aspectos, se proporciona una sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F para su uso en un método para monitorear el progreso de una enfermedad en un sujeto que lo necesita, el método comprende administrar al sujeto una sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F la cual se une a una molécula objetivo asociada a la presencia de la enfermedad en un primer punto de tiempo y obtener una imagen de al menos una porción del sujeto para determinar la cantidad de células o tejidos muertos, y administrar al sujeto la sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F en uno o más puntos de tiempo subsecuentes y obtener una imagen de al menos una porción del sujeto en cada punto de tiempo subsecuente (por ejemplo, misma porción como el primer punto de tiempo).

En ciertas modalidades, el tamaño de un tumor puede ser monitoreado en un sujeto que sufre de terapia de cáncer (por ejemplo, quimioterapia, radioterapia) y la extensión de la regresión del tumor puede ser monitoreada en tiempo real con base en la detección del objetivo del tumor radioetiquetado con 18F.

En algunas modalidades, los métodos de la presente son usados para evaluar la respuesta del paciente a terapia. En algunas modalidades, los métodos son usados para seleccionar o modificar la dosificación de los compuestos terapéuticos. En algunas modalidades, los métodos son usados para monitorear la captación del compuesto de objetivo radioetiquetado con 18F en tejidos normales para analizar la toxicidad o variación paciente a paciente. En algunas modalidades, los métodos son usados para monitorear la eficacia o para detectar la resistencia al fármaco. En algunas modalidades, los compuestos radioetiquetados son administrados a mamíferos, preferiblemente humanos, en una composición farmacéutica, ya sea sola o en combinación con portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables de conformidad con la práctica farmacéutica estándar. Tales composiciones pueden ser administradas oral o parenteralmente, que incluyen las rutas de administración intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, rectal y tópica. En ciertas modalidades, la administración es intravenosa. En ciertas modalidades el compuesto radioetiquetado es administrado mediante inyección intravenosa dentro de menos de una hora de síntesis.

En algunas modalidades, la actividad biológica del agente de objetivo radioetiquetado con 18F in vivo puede ser medida en términos de captación específica del órgano por estudios de biodistribución y estudios de formación de imagen dinámica de PET de animal pequeño en un modelo de animal apropiado. Por ejemplo, para estudios de biodistribución, un grupo de animales son inyectados con el agente de objetivo radioetiquetado con 18F y las subseries de animales son sacrificadas en uno o más intervalos de tiempo (por ejemplo, 5 min., 10 min., 30 min., 60 min., 2 h). Los órganos y tejidos de interés son rápidamente escindidos y pesados, y se determina la radioactividad. La radioactividad acumulada en órganos y tejidos seleccionados se calcula como el porcentaje de dosis inyectada (% ID).

En algunas modalidades, el agente de objetivo radioetiquetado con 18F proporcionado en la presente, se usa in vivo como una herramienta de selección para seleccionar compuestos para uso en el tratamiento de tejidos o células. Por ejemplo, en algunas modalidades, las células enfermas son incubadas con el compuesto de objetivo radioetiquetado con 18F durante o después de la exposición a uno o más fármacos candidato. La capacidad del fármaco candidato para afectar la enfermedad puede ser formada en imagen con el tiempo usando el compuesto de objetivo radioetiquetado con 18F.

Por ejemplo, la integridad de la actividad biológica del agente de objetivo radioetiquetado con 18F in vitro en términos de unión específica a la molécula objetivo seleccionada y captación de la composición radioetiquetada, es sometida a ensayo en una línea de células que expresa la molécula objetivo. Para ensayos de unión y asociación celular, las células están incubadas a 4 °C o 37 °C por un tiempo apropiado con la composición de objetivo radioetiquetada con 18F. Se determinó la unión no específica por la adición de un exceso de agente de objetivo no etiquetado. La extensión de la unión específica se calcula sustrayendo la unión no específica de la unión total. La captación es expresada como un porcentaje de la dosis agregada total del agente de objetivo a las células por microgramo de proteína (%de ID/ |jg de proteína celular).

En un aspecto relacionado, la presente invención proporciona una composición de diagnóstico o radiofarmacéutica para in vivo o in vitro, la cual incluye una sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F, y un portador farmacéuticamente aceptable.

La invención es ahora descrita por referencia a los siguientes ejemplos, los cuales son solamente ilustrativos. Mientras la invención ha sido descrita en detalle y con referencia a modalidades específicas de la misma, será aparente para uno de habilidad en la técnica, que se pueden hacer varios cambios y modificaciones.

EJEMPLO 1

Preparación de 2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etil 4-metilbencensulfonato

Una mezcla de ((oxibis(etan-2,1 -diil))bis(oxi))bis(etan-2,1-diil) bis(4-metilbencensulfonato) (5 g, 9,95 mmol) y AZIDA DE SODIO (0,647 g, 9,95 mmol) se disolvieron en etanol (50 ml) y la reacción se sometió a reflujo a 90 °C durante un periodo de 17 horas. El solvente se removió usando vacío parcial y después se cargó en un cartucho de sílice 40 gramos y se purificó usando cromatografía instantánea (IscoCombiFlash - se eluyó usando un método de gradiente lineal partiendo desde 10% acetato de etilo en hexanos yendo a un 90% de acetato de etilo en hexanos durante un periodo de 45 minutos. Las fracciones combinadas se verificaron por TLC y se combinaron para dar 4-metilbencensulfonato de 2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etilo como un aceite incoloro. Debido a la naturaleza reactiva del producto 4-metilbencensulfonato de 2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etil este material se usó “como está” sin cualquiera de las caracterizaciones adicionales.

EJEMPLO 2

Preparación de 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina

A la suspensión de hidruro de sodio (0,129 g, 3,21 mmol) en DMF (10 ml) a 0 °C se agregó por goteo a una solución agitada de 2-fluoropiridin-3-ol (0,363 g, 3,21 mmol) en DMF (5 ml), después seguido por la adición por goteo de la solución de 4-metilbencensulfonato de 2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etilo (1,00 g, 2,68 mmol) en DMF (5 ml). La suspensión se mantuvo a 0 °C por 10 min, después se llevó a temperatura ambiente por 1 hora, seguido por adición de calentamiento a 60 °C por 4 horas. El solvente se removió in vacuo. Se agregó 100 ml de acetato de etilo seguido por 3 extracciones de lavado por separado con solución de salmuera por separado. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró. El material crudo se purificó usando cromatografía instantánea (IscoCombiFlash - se eluyó con 10 - 50% EtOAc en Hex) para dar un aceite incoloro. Se aisló 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina (702 mg, 2,233 mmol, 83 % rendimiento) como un aceite claro. 1H ^rMⁿ(400 MHz, CLOROFORMO-d) 57,75 (dt, J=4,9, 1,6 Hz, 1H), 7,33 (ddd, J=10,0, 8,1, 1,5 Hz, 1H), 7,10 (ddd, J=7,9, 4,9, 0,7 Hz, 1H), 4,30 - 4,16 (m, 2H), 3,95 - 3,83 (m, 2H), 3,80 - 3,61 (m, 10H), 3,38 (t, J=5,1 Hz, 2H) 13C RMN (101 MHz, CLOROFORMO-d) D 142,3, 137,7, 137,5, 123,4, 123,4, 121,7, 121,6, 77,3, 76,7, 70,9, 70,7, 70,6, 70,0, 69,4, 69,0, 50,619F RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5 -83,55. HRMS (ESI) Teórico: C13H20FN4O4+ m/z 315,464; encontrado 315,1463

EJEMPLO 3

Preparación de 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-nitropiridina

Se disolvió hidruro de sodio (0,121 g, 3,01 mmol) (60% suspensión en aceite) en DMF (7,0 ml) y la suspensión resultante se enfrió a 0 °C. Una solución de 2-nitropiridin-3-ol (0,384 g, 2,74 mmol) en DMF (1,5 ml) se agregó lentamente, seguido por la adición por goteo de 4-metilbencensulfonato de 2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etilo (1,023 g, 2,74 mmol) en DMF (1,5 ml). La suspensión se mantuvo a 0 °C por 10 minutos, después se llevó a temperatura ambiente por 2 horas seguido por calentamiento 60 °C por un periodo de 72 horas. La reacción se apagó con 10 ml de agua DI, seguido por extracción de acetato de etilo (3 x 10 ml). Se lavaron los extractos de EtOAc con una solución de salmuera por separado (10 ml), se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y evaporaron bajo presión reducida para dar un aceite amarillo ligero. Lo crudo se purificó por cromatografía instantánea. 24 g cartucho de gel de sílice, 25 ml/min, partiendo desde 10% acetato de etilo en hexanos, seguido por un cambio lineal a 50% acetato de etilo en hexanos durante un periodo de 25 minutos. Después de este tiempo, el gradiente se mantuvo en esta composición de solvente por 10 minutos después cambión a 100% acetato de etilo durante un periodo de 10 minutos. Se eluyó 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-nitropiridina entre 30-40 minutos, la porción del cromatograma y las fracciones combinadas se evaporaron bajo presión reducida, después bajo vacío por 2 horas para dar 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-nitropiridina (687 mg, 1,973 mmol, 72,0 % rendimiento) como un aceite amarillo ligero. 1H RMN (400 MHz, CLoRoFORMo-d) 58,11 (dt, J=4,9, 1,6 Hz, 1H), 7,60 (ddd, J=10,0, 8,1, 1,5 Hz, 1H), 7,52 (ddd, J=7,9, 4,9, 0,7 Hz, 1H), 4,30 -4,16 (m, 2H), 3,95- 3,83 (m, 2H), 3,80 3,61 (m, 10H), 3,38 (t, J=5,1 Hz, 2H) 13C RMN (101 MHz, CLOROFORMO-d) d 147,3, 139,5, 128,4, 124,4,71,1, 70,7, 70,6,70,0, 69,9, 69,3, 50,7. HRMS (ESI) Teórico: C13H20N5O6+ m/z 342,1408; encontrado 342,1409

EJEMPLO 4

Síntesis de 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-bromopiridina

A la suspensión de hidruro de sodio (NaH, 25,7 mg, 0,643 mmol) en dimetilformamida (DMF, 5 ml) a 0 °C se agregó por goteo una solución de 2-bromopiridin-3-ol (112 mg, 0,643 mmol) en DMF (1 ml), seguido por la adición por goteo de la solución de 4-metilbencensulfonato de 2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etilo (200 mg, 0,536 mmol) en DMF (1 ml). La suspensión se mantuvo a 0 °C por 10 minutos, después se llevó a temperatura ambiente y se mantuvo por 1 hora, seguido por calentamiento a 60 °C por 4 horas. Después del término del calentamiento, el solvente de la mezcla cruda se removió in vacuo. La reacción cruda se reconstituyó en 50 ml de acetato de etilo, se lavó con 2 x 50 ml de una solución de salmuera acuosa y la capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se concentró in vacuo. La reacción cruda se purificó usando HPLC de fase inversa para dar 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-bromopiridina, TFA (112 mg, 0,229 mmol, 42,7 % rendimiento) como un aceite amarillo ligero. HRMS ESI m/z (M+H), Teórico C13H20BrN4O4375,0664 encontrado 375,0662 ; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 87,97 (dd, J=4,6, 1,5 Hz, 1H), 7,54 (dd, J=8,2, 1,6 Hz, 1H), 7,40 (dd, J=8,1, 4,6 Hz, 1H), 4,24 (dd, J=5,3, 3,9 Hz, 2H), 3,85 -3,78 (m, 2H), 3,68 - 3,62 (m, 2H), 3,62 - 3,52 (m, 8H), 3,42 - 3,34 (m, 2H).

EJEMPLO 5

Esquema de reacción para síntesis del compuesto de trimetilanilio

3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-N,N,N

trimetilpiridin-2-ammio

EJEMPLO 6

Síntesis de 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-N,N-dimetilpiridin-2-amina

3-(2-(2-(2-(2-azidoetox¡)etox¡)etox¡)etoxi)-N,N-dimetilpiridin-2-amina

3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-N,N-dimetilpiridin-2-amina

Una mezcla de 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina (160 mg, 0,509 mmol), carbonato de potasio (K2CO3, 84 mg, 0,611 mmol) y dimetilamina (40% en agua, 0,097 ml, 0,764 mmol) en dimetilsulfóxido (DMSO, 2,5 ml) se calentaron en un recipiente sellado a presión a 110 °C por 14 horas. Después del término del calentamiento, el solvente de la mezcla cruda se removió in vacuo. La reacción cruda se reconstituyó en 50 ml de acetato de etilo, se lavó con 2 x 50 ml de una solución de salmuera acuosa y la capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se concentró in vacuo. La reacción cruda se purificó usando cromatografía de fase normal para dar 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-N,N-dimetilpiridin-2-amina (140 mg, 0,413 mmol, 81 % rendimiento) como un aceite incoloro. 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 57,86 (dd, J=4,9, 1,5 Hz, 1H), 7,02 (dd, J=7,8, 1,5 Hz, 1H), 6,73 (dd, J=7,8, 4,9 Hz, 1H), 4,20 - 4,07 (m, 2H), 3,98 - 3,86 (m, 2H), 3,81 - 3,61 (m, 9H), 3,38 (t, J=5,1 Hz, 2H), 3,13 - 2,94 (m, 6H), 1,69 (s, 2H). HRMS (ESI) Teórico: C15H26N5O4+ m/z 340,1980; encontrado 340,1979.

EJEMPLO 7

Síntesis de 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-N,N,N-trimetilpiridin-2-aminio

3-{2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etox¡)

N,N,N-tnmetilpiridin-2-amino

3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)

N,N,N-trimetilpiridin-2-amimo

Se agregó trifluorometansulfonato de metilo (0,065 ml, 0,589 mmol) a la solución de 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-N,N-dimetilpiridin-2-amina (40 mg, 0,118 mmol) en tolueno (1,5 ml) en un contenedor sellado bajo un flujo constante de nitrógeno. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante un periodo de 14 horas. El solvente se removió y el residuo resultante se lavó con 2x 10 ml de éter, se secó azeotrópicamente con 2 x 1 ml de diclorometano y se secó bajo vacío a alta presión durante la noche para dar sal de trifluorometansulfonato de 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-N,N,N-trimetilpiridin-2-aminio, en rendimiento cuantitativo como un aceite incoloro espeso.

LCMS m/z 354,33; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 58,24- 8,17 (m, 1H), 7,98 (d, J=8,3 Hz, 1H), 7,75 (ddd, J=8,2, 4,6, 3,2 Hz, 1H), 4,44 (br. s., 2H), 3,88 (d, J=3,9 Hz, 2H), 3,69 - 3,45 (m, 21H).

EJEMPLO 8

La síntesis de la [18F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina usando sal de trifluorometansulfonato de 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-N,N,N-trimetilpiridin-2-aminio

Una solución de [18F]-Fluoruro acuosa (2,0 ml, 33,3 GBq/ 900 mCi) se adquirió de P.E.T. Net® Pharmaceuticals in West Point PA y se transfirió directamente a una luz Sep-Pak QMA [El cartucho QMA de luz Sep-Pak se preacondicionó secuencialmente con 5 ml de bicarbonato de potasio, 5 ml de agua desionizada, y 5 ml de MeCN antes del uso]. Después del término de esta transferencia, el [18F] fluoruro acuoso se liberó del QMA Sep-Pak por la adición secuencial de carbonato de potasio (15mg/ml; 0,1 ml) seguido por una mezcla de carbonato de potasio (30 mg/ml, 0,1 ml), 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabiciclo[8,8.8]hexacosano (15 mg, 0,04 mmol) y 1,2 ml de MeCN. El solvente se evaporó bajo una corriente suave de nitrógeno a 90 °C y vacío. Lo azeotrópico seco se repitió dos veces con porciones 1 ml de acetonitrilo para generar el complejo K.2,2.2/K[18F]F anhidro. Se disolvió sal de trifluorometansulfonato de 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-N,N,N-trimetilpiridin-2-aminio, (2 mg, 5,6 jmol) en 500 microlitros de DMSO y se agregó al criptado seco. Esta solución se calentó a 120 °C por 10 minutos. Después de este tiempo la mezcla de reacción cruda se diluyó con 3 ml de agua DI. Los contenidos completos de la mezcla cruda después se transfirieron, se cargaron y purificaron usando HPLC de fase inversa y las siguientes condiciones: Columna HPLC: Luna C18250 x 10 Solvente A: 0,1 % TFA en agua DI; solvente B: 0,1 % TFA en acetonitrilo a una velocidad de flujo de 4,6 ml/minuto usando método isocrático 32% B mientras la UV se monitoreó a 280 nm. [18F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina se aisló en la marca de 24 minutos del cromatograma, y se recolectó durante un periodo de 2 minutos. Este producto se recolectó en un matraz de 100 ml que contiene 10 ml de agua DI y los contenidos completos se suministraron a un paquete sep Sep-Pak Vac tC186 cc de 1g de Waters.6,1 GBq/164 mCi de [18F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina aislado de esta reacción. Esto se liberó del sep-pak usando 3 ml de etanol y esta solución se redujo con una fuente de calor a 98 C, una corriente suave de nitrógeno, y vacío durante un periodo de 15 minutos hasta que solamente permaneció una película en este vial. El producto final se reconstituyó en 100% 1x de Amortiguador PBS y es estable en este medio durante 1 hora a 37° C.

La [18F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina se puede usar para generar productos biológicos etiquetados con 18F tomando ventaja de la reacción “clic” de azido-alquino con el biológico apropiado que contiene alquinos.

EJEMPLO 9

Producción de proteínas radioetiquetadas con 18F usando “Química clic”

En este ejemplo, [18F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina se usó para radioetiquetar una proteína objetivo como se ilustra en la Figura 1 y 5.

A. Fluoración del Precursor 4-PEG-tosil-azida para Formar [18F]-FPPEGA

Se transfirió directamente 900 mCi de 18F en actividad de 18O agua (3 ml) (adquirido de IBA Molecular) en un microvial (no QMA) que contiene 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabiciclo[8,8.8]hexacosano (2,8 mg, 7,44 jmol) y carbonato de potasio (1,7 mg, 0,012 mmol). Se transfirió 2,0 ml adicional de acetonitrilo en esta mezcla de reacción cruda y la mezcla completa se secó azeotrópicamente. Esto se completó por evaporación de la solución usando un baño de aceite a 98 °C, y aplicando una corriente suave de N2 y vacío parcial. El volumen de la solución se redujo a aproximadamente 2 ml. Se agregó 2 ml de acetonitrilo adicional y el proceso se repitió 3 veces durante un periodo de 40 minutos. Cuando el volumen del líquido se redujo a menos de 0,3 ml, se agregó una alícuota de 0,7 ml de acetonitrilo y la solución se redujo por destilación azeotrópica adicional hasta que el volumen fue ~0,1 ml. Se agregó 0,9 ml de acetonitrilo adicional y este proceso se completó hasta se formó un sólido blanco. Este proceso tomó ~55 minutos. Durante el procedimiento final, el vial se removió del baño de aceite antes que la solución se haya ido a sequedad, y el residuo en el vial se colocó bajo vacío completo (no flujo de N2) a temperatura ambiente por 20 minutos. El tiempo total para la transferencia y secado de la mezcla criptada de [18F]-FPPEGA fue 65 min.

A la mezcla criptada de [18F]-FPPEGA seca se agregó 3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-nitropiridina (2 mg, 5,86 |jmol) disuelta en 500 microlitros de DMSO y esta mezcla se calentó 120 °C por 10 minutos. Después de este tiempo la mezcla de reacción cruda se diluyó con 3 ml de agua DI y los contenidos completos después se transfirieron y cargaron en la siguiente columna HPLC y condiciones: Columna HPLC: Luna C18250 x 10 mm; Solvente A: 0,1 % TFA en agua DI; Solvente B: 0,1 % TFA en acetonitrilo; velocidad de flujo 4,6 ml/min; presión 127,96 kgf/cm2 (1820 PSI); método isocrático 32% B; UV - 280 nm. El producto de la [18F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina ([18F]-FPPEGA) se aisló en la marca del minuto 24 del cromatograma y se recolectó durante un periodo de 2 minutos. Este producto se recolectó en un matraz de 100 ml que contiene 15 ml de agua DI y los contenidos completos se suministraron a un paquete sep Sep PakVac tC186 cc de 1g. PN WAT036795. El [18F]-FPPEGA se liberó del Sep Pak usando 2,5 ml de etanol y esta solución se redujo con 98 °C de N2 y vacío durante un periodo de 15 minutos hasta sequedad. Este compuesto se disolvió en 0,1 ml de 1 X PBS (salina amortiguada de fosfato). Este producto se analizó usando una Columna Luna C18 Varian HPLC (2) 4,6 x 150 mm de Solvente A: 0,1 % TFA en agua DI; Solvente B: 0,1 % TFA en acetonitrilo; velocidad de flujo 1,0 ml/min; se aisló el método gradiente 0 min 90% A 10% B; 15 min 30% A 70% B; 17 min 30% A 70% B; 18 min 90% A 10% B; 20 min 90% A 10% B; UV - 280 nm. 220 mCi de [18F]-FPPEGA.

B. Preparación de E01-4PEG-DBCO

Se usó una proteína FBS, Adnectina E01 con la siguiente secuencia de aminoácido;

GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRAQLSPSFYYRITYGETGGNSPVQEFT VPNDVMTATISGLKPGVDYTITVYAVTTHGVYFYSPISINYRTPC (E01; SEQ ID NO: 1) que contiene los aminoácidos PC C-terminal.

Se usó como química de maleimida para enlazar la proteína objetivo a PEG4-DBCO, la Adnectina E01 primero se modificó agregando una prolina seguido por una cisteína en su C-terminal usando las técnicas recombinantes de rutina. Se disolvió 4 veces un exceso de Maleimida-PEG4-DBCO (Click Chemistry Tools) en DMSO y se agregó a Adnectina E01 modificada en la presencia de TCEP 1 mM. Las concentraciones de DMSO finales no exceden 5% en las mezclas de conjugación. La mezcla de conjugación se dejó a temperatura ambiente por una hora antes del análisis de espec de masa. Después de la confirmación de conjugación Ms , la muestra se purificó por cromatografía de exclusión de tamaño usando una columna HiLoad 26/60 Superdex 75 (GE Healthcare) equilibrado en PBS pH 7,2.

C. Acoplamiento de Í18F1-FPPEGA a Adnectina

Se incubó 0,2 ml de una solución 5,4 mg/ml de la solución de Adnectina E01-4PEG-DBCO (preparada como se describe en la Sección B) con 200 mCi de 0,1 ml de [18F]-FPPEGA (Ejemplo 1) en 1 x de amortiguador PBS. La solución se mezcló suavemente pipeteando la reacción cruda hacia arriba y hacia abajo varias veces y se incubaron juntas por 45 minutos a 45 °C o temperatura ambiente. Los contenidos de esta mezcla de reacción cruda se purificaron usando una columna SEC. Superdex 200 0,5 ml/min 1 X de amortiguador PBS y el producto [18F]-E01-4PEG-DBCO-FPPEGA se aisló en la marca de 37 min del cromatograma sobre un periodo de 2 minutos.

Se analizó [18F]-E01-4PEG-DBCO-FPPEGA mediante SEC con co-inyección de RP HPLC, estándar no radioactivo usando una columna PLRPS y electroforesis en gel.

Se realizó la Cromatografía de Exclusión por Tamaño (SEC) con los siguientes parámetros:

Columna Superdex 200; Solvente 100% 1X de amortiguador PBS; 0,5 ml/min 280 UV;

HPLC de fase inversa

Columna: PLRPS 8 micras 1000 A 4,6 x 250 mm

Solvente A: 0,1% ácido fórmico en agua DI

Solvente B: Acetonitrilo

Velocidad de flujo: 1 ml/min

Presión: 94,98 kgf/cm2(1351 PSI)

Gradiente:

0 min 90% A 10% B

30 min 45 %A 55% B

32 min 25% A 75% B

36 min 25% A 75% B

50 min 90% A 10% B

Se aisló 15 mCi de [18F]-E01-4PEG-DBCO-FPPEGA con una pureza radioquímica (RCP) de >99% mediante ambos cálculos HPLC SEC como RP, y con una actividad específica de 0,6 mCi/nmol, cuando la reacción se condujo a 45 °C. Cuando se condujo la reacción a temperatura ambiente, se obtuvo 5,72 mCi. La actividad específica del [18F]-FPPEGA fue 0,512 mCi/nmol y RCP de 85,7% 3 horas después del final de su síntesis, cuando se conduce la reacción a 45 °C o a temperatura ambiente, respectivamente. Se midió la actividad específica mediante Nanodrop (véase www.nanodrop.com). El producto coeluido con el estándar no radioactivo en tanto SEC como PLRPS. La electroforesis en gel confirmó un producto 18F consistente con un estándar de peso molecular de 11 kDa.

El E01-4PEG-DBCO radioetiquetado con 18F puede ser usado en varias aplicaciones de formación de imagen in vitro y/o in vivo, que incluyen formación de imagen de diagnóstico, investigación básica, y aplicaciones radioterapéuticas. Ejemplos específicos de posible formación de imagen de diagnóstico y aplicaciones radioterapéuticas, incluye determinar la ubicación, la actividad relativa y/o cuantificación de tumores positivos PD-L1, radioinmunoensayo de tumores positivos PD-L1, y autorradiografía para determinar la distribución de tumores positivos PD-L1 en un mamífero o un órgano o muestra de tejido del mismo.

En particular, el E01-4PEG-DBCO radioetiquetado con 18F es útil para formación de imagen tomográfico de emisión del positrón (PET) de tumores positivos PD-L1 en el pulmón, corazón, riñones, hígado y piel y otros órganos de humanos y animales experimentales. La formación de imagen PET usando el E01-4PEG-DBCO radioetiquetado con 18F puede ser usado para obtener la siguiente información: relación entre el nivel de ocupación de tejido por medicamentos para el tratamiento de tumor PD-L1 candidatos y eficacia clínica en pacientes; selección de dosis para ensayos clínicos de medicamentos para el tratamiento del tumor PD-L1 antes del inicio de estudios clínicos a largo plazo; potencias comparativas de medicamentos para el tratamiento de PD-L1 estructuralmente nuevos; investigando la influencia de medicamentos para el tratamiento de tumor PD-L1 en afinidad y densidad del transportador in vivo durante el tratamiento de objetivos clínicos con medicamentos para el tratamiento de tumores positivos PD-L1; cambios en la densidad y distribución de tumores positivos PD-L1 durante el tratamiento efectivo e no efectivo.

Por ejemplo, la inhibición de PD-L1 se puede calcular con base a la carga de BO o Vt por análisis de equilibrio en la presencia del medicamento para el tratamiento de tumor PD-L1 en varios paradigmas de dosificación comparado al BO o Vt en estado sin medicamentos. Las curvas de inhibición son generadas graficando los datos anteriores contra la dosis (concentración) del medicamento para el tratamiento de tumor P-L1. La inhibición de tumor positivos PD-L1 después se calcula con base a la máxima reducción de radioligandos Vt o BP de PET que pueden ser logrados bloqueando el fármaco a Emáx, Tmáx o Tmin y el cambio de su volumen de distribución no específico (V^nd) y el BO en la presencia de medicamentos para el tratamiento de tumor PD-L1 en varios paradigmas de dosificación comprado a BP o Vt en el estado sin medicamento. Los valores ID50 se obtienen por la curva ajustando las curvas de relación dosis/inhibición.

E JE M P L O 10

^{D ife re n c ia c ió n} in vitro ^{d e c é lu la s P D -L I-p o s it iv a s d e c é lu la s P D -L I-n e g a tiv a s con un a g e n te q u e fo rm a}im ag e n d e A d n e c tin a an ti-P D -L 1

En este experimento, se probó el E01-4PEG-DBCO radioetiquetado con 18F por su estabilidad para discriminar entre las células PD-L1 positivas y células PD-L1 negativas in vitro.

1*106 de células de carcinoma de pulmón humano L2987 hPD-L1-positivas o células de adenocarcinoma de pulmón humanas HT-29 hPD-L1-negativas se colocaron en tubos para cultivo de 5 ml (tubos por condición n=3). La solución de E01-4PEG-DBCO radioetiquetadas con 18F se preparó en PBS 0,5% BSA a una concentración de 300 nCi/200 |jl. Las porciones de esta solución se complementaron con ya sea Adnectina E01 fría (no etiquetada) o Adnectina fría (no unida) (control) a una concentración final de 450 nM. Las muestras celulares se centrifugaron por 5 minutos a 200*g y después se resuspendieron en 200 j l de la solución de E01-4PEG-DBCO radioetiquetada con 18F apropiada y se incubó en hielo por 1 hora. Después del periodo de incubación, las muestras celulares se centrifugaron a 200*g y el sobrenadante se desechó. Las pelotillas celulares se resuspendieron en 1 ml de PBS 0,5 % de BSA y el procedimiento de lavado se repitió por un total de 3 lavados. Después del lavado final, las células se centrifugaron nuevamente a 200*g y lo sobrenadante se desechó. La radioactividad de las pelotillas celulares restantes después se midió por contador gamma.

Los resultados indican que el etiquetado ell fue específico, como es evidente por la asociación diferencial de E01-4PEG-DBCO radioetiquetado con 18F con células L2987 de PD-L1 positivas comparada con células HT-29 de PD-L1 negativo (la radioactividad asociada a la célula fue 44,6x mayor en las células L2987 de PD-L1 positivo). La especificidad fue además confirmada como evidencia por una reducción marcada en E01-4PEG-DBCO radioetiquetada con 18F asociada a la célula cuando se co-incuba con exceso de Adnectina E01 (no etiquetada) fría 450 nM (99,6 % de reducción). El 18F-E01 asociad a la célula fue principalmente reducida (9,9 % de reducción, no significante) cuando las células se co-incubaron con adnectina no unida a PD-L1 (no etiquetada) fría 450 nM.

Tomados juntos estos resultados demuestran la capacidad de E01-4PEG-DBCO radioetiquetada con 18F para diferenciar las células PD-L1(+) contra PD-L1(-) in vitro.

E J E M P L O 11

T u m o re s PD-L1 p o s itivo s d is tin tiv o s d e tu m o re s PD-L1 n e g a tiv o s co n un a g e n te q u e fo rm a im ag e n d e A d n e c tin a an ti-P D -L 1

En este experimento, la Adnectina PD-L1 radioetiquetada con 18F con la siguiente secuencia de aminoácido:

EV V AATPTSLLIS W S YDGPIDRY YRITY GETGGNSP V OEFTVPPDOKT ATISGLKPGV

DYTITVYAVRLEEAHYNREFPISINYRTPC (A02; SEQ ID NO:2)

Se produjo como se describe en el Ejemplo 9, se probó por la capacidad para discriminar entre los tumores PD-L1 positivo y PD-L1 negativo en ratones.

Los ratones que portan injerto heterólogo bilateral se produjeron introduciendo 1x106 células de carcinoma de pulmón humano hPD-L1(+) y 1,5x106 células de carcinoma de colon humano hPD-L1(-) subcutáneamente en lados opuestos del ratón. Una vez que los tumores alcanzaron aproximadamente 300 mm3 (aproximadamente 2-3 semanas después del implante celular), los animales se seleccionaron para formación de imagen. Para la formación de imagen, los animales se colocaron bajo anestesia con 2% de isoflurano y se instalaron catéteres en la vena de la cola. Los ratones después se colocaron en alojamiento para animal habitual con capacidad para 4 animales, donde se mantuvieron bajo anestesia por la duración del estudio. El alojamiento animal se transfirió al escáner microPET® F120TM (Siemens Preclinical Solutions, Knoxville, TN). El campo axial de este instrumento es 7,6 cm. Con esta limitación, los animales se colocaron de manera tal que la región de barrido fue inmediatamente al frente de los ojos hasta aproximadamente la base de la cola.

A 10 minutos, primero se adquirió la transmisión de imagen usando una fuente de punto 57Co para el propósito de corrección de atenuación de las imágenes PET finales. Después del barrido de transmisión, se administraron soluciones de radioindicador mediante los catéteres de la vena de la cola previamente instalados y se adquirió emisión de imagen por 2 horas. Las soluciones radioindicadoras inyectadas consisten en ya sea aproximadamente 200 |jC¡ de A02 radioetiquetada con 18F o 200 jC i A02 radioetiquetada con 8F o 200 jC i de A02 radioetiquetada con 18F complementada con 3 mg/kg de concentración final de Adnectina A02 no etiquetada, fría (con base en el peso del animal individual). Todas las inyecciones se formularon en 200 j l de salina antes de la inyección. Las dosis inyectadas exactas se calcularon tomando mediciones directas de la dosis formulada y sustrayendo el resto de la jeringa y el catéter de la vena de la cola.

Las imágenes se reconstruyeron usando un algoritmo máximo a posteriori (MAP) con corrección atenuante usando las imágenes de transmisión recolectadas y corregidas por radioisótopo deteriorado. En las imágenes finales, las regiones de interés (ROIs) se dibujaron al rededor del límite del tumor usando el software ASIPro (Siemens Preclinical Solutions). Se calcularon las curvas de tiempo-actividad para cada ROI para proporcionar una vista cuantitativa del radioindicador dentro del volumen del tumor sobre el curso de emisión de imagen de 2 horas. Para comparación final, se normalizaron las curvas de tiempo-actividad individual con base a la dosis de radioindicador inyectado para cada animal específico. El radioindicador absorbido se comparó a través de los tumores usando los 10 minutos finales para cada curva tiempo-actividad (1 hora 50 minutos - 2 h después de la inyección de radioindicador). Usando esta metodología, el radioindicador absorbido en injertos heterólogos L2987 de PD-L1(+) fue 3,05x que los injertos heterólogos HT-29 PD-L1(-) vistos en animales que recibieron solamente el radioindicador 64Cu-A02. En animales co-inyectados con el radioindicador A02 radioetiquetado con 18F y 3 mg/kg de Adnectina A02 no etiquetada absorbida en los injertos heterólogos L2987 de D-L1(+) fue solamente 1,04x que en injertos heterólogos HT-29 PD-L1(-) observados.

Para algunos estudios, los animales se sacrificaron mediante dislocación cervical inmediatamente después de la formación de imagen. Después se realizó la necropsia en los animales, y los tejidos individuales se recolectaron (sangre, corazón, pulmón, hígado, bazo, riñón, músculo, estómago, hueso, tumor L2987, y tumor HT-29) en tubos prepesados. Todos los tejidos después se pesaron nuevamente para determinar el peso de cada tejido. La radioactividad en cada tejido después se midió directamente ex vivo usando un contador gamma Wizard3 Perkin-Elmer. Para todos los tejidos, los valores medidos en conteos por minuto (CPM) se normalizaron a la dosis radioactiva inyectada por los animales individuales y se corrigió para desintegración radioactiva. Estos resultados son entonces graficados para mostrar la biodistribución del radioindicador como se muestra en la Figura 2.

Estos resultados demuestran la absorción diferencial clara del radioindicador en injertos heterólogos L2987 de PD-L1(+) comparados a injertos heterólogos HT-29 de PD-L1(-). Además, el único tejido con absorción de PD-L1 mayor fue el riñón, el cual se espera como la separación de la adnectina A02-4PEG-DBCO radioetiquetada con 18F se espera ser mediante filtración de riñón con base al peso molecular de la molécula.

Tomados juntos, estos resultados proporcionan visualización directa de diferenciación de tumores de injerto heterólogo PD-L1(+) contra PD-L1(-) in vivo. La especificidad se demostró además por co-inyección de 3 mg/kg de Adnectina A02anti-PD-L1 no etiquetado, resultando en una reducción de radioindicador absorbido en tumores PD-L1(+) al nivel de injertos heterólogos PD-L1(-). Se obtuvo una relación de absorción de radioindicador máximo de 3,53:1 en injertos heterólogos L2987 hPD-L1(+) contra injertos heterólogos HT-29 hPD-L1(-) usando el radioindicador de Adnectina 18F-A02. Esto además valida el uso de adnectinas anti-PD-L1 por visualización de PD-L1 en la expresión del tejido usando formación de imagen PET. Se condujeron experimentos similares usando 18F como el radionúclido en ratones, y se obtuvieron resultados similares, alcanzando.

E J E M P L O 12

^{F o rm ac ió n d e Im ag en} in vivo ^{en M o no s C in o m ó lo g o s}

Los agentes que forman imagen E01 radioetiquetados con 18F también muestran resultados similares cuando se realizan en monos cinomólogos. En estos estudios, la anti-PD-L1 18F-E01, producida como se describe en el Ejemplo 9, se probó por su capacidad para producir imágenes de alto contraste en monos cinomólogos. Las Adnectinas anti-PD-L1 descritas en la presente mantienen alta afinidad para PD-L1 cinomólogos (pero tienen baja afinidad para PD-L1 de roedor). Además, ya que los monos cinomólogos no contienen tumores p D-L1(+) como en modelos de ratón, se valoró la actuación de formación de imagen principalmente en los niveles antecedentes medidos en las imágenes en el contexto de expresión PD-L1 endógeno (con bajo antecedente permitiendo el potencial para la detección de tejidos PD-L1(+) de alta sensibilidad). En estos estudios, los niveles antecedentes en las imágenes PET resultantes son muy bajas, con acumulación de radioindicador notable se nota principalmente en los riñones, bazo y vejiga.

Los monos cinomólogos machos con un puerto de acceso vascular previamente instalado (VAP) se anestesiaron con 0,02 mg/kg de atropina, 5 mg/kg de Telazol y 0,01 mg/kg de buprenorfina I.M. (todos llevados en una jeringa única). Después se colocó un catéter i.v. en el recipiente cefálico para administración de fluido durante el procedimiento de formación de imagen para mantener la hidratación. Los animales se incubaron con un tubo endotraqueal - usualmente 3,0 mm y se transfirió al lecho de formación de imagen de un instrumento PET microPET® F220TM (Siemens Preclinical Solutions, Knoxville, TN). La anestesia se mantuvo con isoflurano y oxígeno, y se administraron fluidos I.V. (LRS) a una velocidad de 6 ml/kg/h durante el procedimiento de formación de imagen. Ya que el campo axial de la vista del instrumento microPET® F220TM es solamente imágenes de 7,6 cm sobre 5 distintas posiciones del lecho se adquirieron para crear una imagen compuesta de los animales justo arriba del corazón a través de aproximadamente la pelvis.

Para cada campo de vista, primero se adquirió una transmisión de imagen de 10 minutos usando una fuente de punto 57Co para el propósito de corrección por atenuación de las imágenes PET finales. Una vez que las imágenes de transmisión se adquirieron para todas las posiciones de lecho, aproximadamente 1,5 mCi (aproximadamente 0,015 mg/kg) del 18F-E01 se administró mediante el VAP instalado. Los barridos de emisión con duración de 5 minutos después se adquirieron secuencialmente para cada posición del lecho, iniciando en la posición 1 centrado aproximadamente en el corazón y moviéndose hacia la pelvis del animal. Una vez que las imágenes se adquirieron en cada posición (1 hasta 5), el lecho de formación de imagen se movió hacia atrás a la posición del lecho 1 y el proceso se repitió. Usando este procedimiento, se adquirieron un total de 5 imágenes distintas para cada posición del lecho durante la duración del estudio de formación de imagen.

Las imágenes individuales se reconstruyeron usando un algoritmo de retro proyección filtrado (FBP) con corrección de atenuación usando las imágenes de transmisión recolectadas y corregidas para decaimiento de radioisótopos. Las imágenes compuestas finales son entonces producidas por imágenes de alineación desde todas las 5 posiciones de lecho obtenidas de un paso único (es decir, una imagen compuesta única se produjo de cada juego de imágenes secuenciales de las posiciones de lecho 1 hasta 5) cubriendo la duración del estudio de formación de imagen (Figura 5). Las imágenes finales son visualmente inspeccionadas para hacer notar las áreas de absorción del radioindicador visible (es decir, bazo, riñón, vejiga) y tejido antecedente (músculo). La acumulación antecedente de 18F-E01 fue muy baja, con poca señal visible en tejidos antecedentes tal como músculo. Adicionalmente, la absorción se verificó en el bazo, lo cual se cree ser PD-L1(+) con base en expresión de ARNm. Por lo tanto, estudios en monos cinomólogos demuestran el potencial para formación de imagen PD-L1 de alta sensibilidad en el contexto de PD-L1 endógeno.

Además, en estudio PET en roedores y monos cinomólogos muestran que las proteínas etiquetadas con 18F se producen de conformidad con los métodos descritos en la presente proporcionando sondas fuertes y específicas para etiquetado in vivo de tejidos positivos objetivo con el potencial para detección de alta sensibilidad de tejidos con bajo nivel de expresión del objetivo.

E J E M P L O 13

^{A u to rra d io g ra fía} in vitro ^{co n A d n e c tin a a n ti-P D -L I [18F ]-A 02}

Se empaparon tejidos de tumor de pulmón humano en OCT y se enfriaron en 2-metilbutano por 2-5 minutos hasta congelamiento. Las muestras se almacenaron en congelador a -80 °C hasta el uso. Los tejidos de injerto heterólogo humano también se incluyeron en el ensayo. Loa ratones que portan injertos heterólogos bilaterales se produjeron introduciendo 4*106 células L2987 PD-L1(+) y 1,5*106 de células t hT-29 PD-L1(-) subcutáneamente en flancos opuestos de ratones nu/nu. Una vez que los tumores de injertos heterólogos resultantes alcanzaron un tamaño apropiado (aprox. 200-300 mm3), los ratones se anestesiaron con 2% de isoflurano y se sacrificaron mediante dislocación cervical. Se cortaron tejidos de tumor recientes, se sumergieron en OCT y se enfriaron en 2-metilbutano por 2-5 minutos hasta congelamiento. Los tejidos después se envolvieron en una bolsa de aluminio/ZIPLOC® y se almacenaron a -80 °C hasta el uso. Para todos los tejidos (tumor de pulmón humano e injertos heterólogos) secciones de 5 pm de espesor como 2 secciones/portaobjeto) se cortaron usando un criostato, se congeló montado en portaobjetos de vidrio para microscopio, y todos se dejaron secar al aire por aproximadamente 30 minutos.

Se condujeron estudios de bloqueo con Adnectina A02 fría (no etiquetada) a 0,025 nM, 0,25 nM, 2,5 nM y 25 nM respectivamente y 25 nM de Adnectina no unida a PD-L1 usando las siguientes condiciones. Los portaobjetos individuales, 1 portaobjeto por concentración, se colocaron en casete de portaobjeto de plástico y se preincubaron en solución de bloqueo de proteína libre de suero Dako por 30 minutos. Los portaobjetos después se transfirieron a cámaras de incubación de portaobjeto de vidrio para incubación adicional. Por separado, se produjo una solución base de Adnectina 18F/A02 0,25 nM diluyendo 10,6 pl de la solución de radioligando base original (7064nM en el momento del experimento) con 300 ml de PBS 0,5 % BSA. De esta solución base, se agregó 40 ml a cada cámara de incubación. Una vez que estas cámaras contienen solamente la solución amortiguadora de radioligando, la cual es referida como la sección de unión total. Otras cámaras de incubación recibieron 40 ml de esta solución base junto con la concentración relevante del compuesto de bloqueo (Adnectina A02 no etiquetada a 0,025 nM, 0,25 nM, 2,5nM, o 25nM o Adnectina no etiquetada a 25nM). Los portaobjetos se incubaron en las soluciones amortiguadoras individuales por 1 hora a temperatura ambiente para alcanzar unión máxima. Después de la incubación, los portaobjetos de cada grupo de tratamiento se removieron de las soluciones de incubación y se colocaron en un amortiguador de lavado enfriado con hielo ((PBS 0,5 % BSA) por 3 minutos y se enjuagó 4 veces por separado. Los portaobjetos después se secaron bajo una corriente de aire frío por aproximadamente 30 minutos. Los portaobjetos secados con aire se expusieron colocando los portaobjetos en una placa formadora de imagen (BAS-SR 3545S) durante la noche a temperatura ambiente. Las placas de formación de imagen se barrieron usando el analizador de bioformación de imagen (Analizador de Imagen Fluorescente Fujifilm, FLA-9000). El tamaño de pixel de las imágenes de autorradiograma fue 100 pm. El análisis de imagen se realizó usando el software Multi-Gauge. Las regiones de interés (ROIs) se trajeron al rededor del tejido de tumor completo en todos los grupos de estudio. La señal de autogradiografía de la radioactividad asociada al tejido se cuantificó de estas ROIs.

El desplazamiento aparente del radioligando de Adnectina 18F-A02 cuando se compara con las secciones de unión total se determinó por 4 diferentes concentraciones (0,025nM, 0,25nM, 2,5 nM y 25nM) de Adnectina A02 no etiquetada tanto en secciones de tumor del pulmón humano, así como también en secciones de injerto heterólogo humanos. Una dosis dependiente del desplazamiento de 18F-A02 se observa en todas las secciones del tejido con la adición de Adnectina A02 no etiquetada, mientras la Adnectina no unida a PD-L1 25 nM muestra bloqueo mínimo en todos los tejidos comparados a una unión total (Figura 4A).

Secciones de tejido de 5 pm en serie de cada tejido se sometieron a un procedimiento inmunohistoquímico PD-L1 anti-humano para verificar el niel de expresión del antígeno PD-L1 en las muestras (Figura 4B).

Tomados juntos estos resultados proporcionan visualización directa de PD-L1 tanto en muestras de tumor de pulmón humano, así como también en tejidos de injerto heterólogo humano. El nivel de unión de radioligando en los tejidos individuales corresponde con la intensidad de teñido PD-L1 de secciones congeladas por IHC. Además, el bloqueo dependiente de la dosis del receptor con Adnectina A02 anti-PD-L1 no etiquetada (y carece de bloqueo con Adnectina no unida a PD-L1 no etiquetada), además valida el uso de 18F-A02 para validar el uso de 18F-A02 para visualización de la expresión del tejido PD-L1 usando formación de imagen PET.

EJEMPLO 14

Preparación automatizada de [18F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina de conformidad con el procedimiento general para radiosíntesis usando la unidad de síntesis GE TRACERlab FX2 N comercial

_{ñ o}2 r" o ...DMSO... " ^,8f , ^{" o}

o 120 °C O

10 mín

ⁿ3 ; ⁿ3

Procedimiento:

La síntesis automatizada de [18F]-3-(2-(2-(2-(2-

azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina se llevó a cabo usando un módulo de Síntesis GE TRACERlab FX2 N tipo no casete. El ajuste de la unidad de síntesis se resume en la Tabla 1 y Figura 6. La solución de [18F]-Fluoro acuosa (2,0 ml, 29,6 GBq/ 800 mCi) se suministró a un QMA ligero Sep-Pak [El cartucho QMA ligero Sep-Pak se pre-acondicionó secuencialmente con 5 ml de bicarbonato de potasio 0,5 M, 5 ml de agua desionizada y 5 ml de acetonitrilo antes del uso]. Después que se completó la transferencia, el [18F]fluoro acuoso se liberó del QMA Sep-Pak por la adición de la mezcla de elución (de “V1”) en el reactor. El solvente se evaporó bajo una corriente suave de nitrógeno y vacío. La solución del precursor (de “V3”) se agregó al residuo criptado secó y esta mezcla de reacción se calentó a 120 °C por 10 minutos. Después se agregó 4 ml de agua destilada (de “V4”) a la mezcla de reacción cruda en el reactor y la mezcla se transfirió al bucle de inyección de muestra 5 ml de la HPLC semipreparativa mediante sensor líquido el cual controla el final de la carga. La mezcla se cargó en la columna de HPLC semipreparativa (Luna C18(2).250x10 mm, Phenomenex). Una mezcla de 35% de acetonitrilo en una solución de ácido trifluoroacético 0,1 % acuosa se lavó a chorro a través de la columna a una velocidad de 4,6 ml por minuto. El producto se recolectó de esta columna HPLC en el matraz de dilución el cual contiene 15 ml de agua destilada y sus contenidos completos se transfirieron a un cartucho de extracción de fase sólida tC18 1 gramo. Se liberó 352 mCi (13 GBq) de [18F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina de este cartucho (de ”V14”) con 3 ml de etanol y puede ser usado para generar los productos biológicos etiquetados con 18F tomando ventajas de la reacción azida-alquino “clic” con el biológico apropiado que contiene alquinos.

Tabla 1

EJEMPLO 15

Preparación automatizada de [18F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina de conformidad con el procedimiento general para la radiosíntesis en unidad de síntesis IBA Synthera

o 120 °C ó

^{1 0}min

n 3

Procedimiento:

La síntesis automatizada de [18F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina se llevó a cabo usando un módulo de Síntesis IBA Synthera tipo casete y un kit del procesador fluídico integrados apropiadamente ensamblado. El kit del procesador fluídico integrador (IFP) se cargó con precursores apropiados para esta síntesis y se resumen en la Tabla 2. La purificación se realizó en una unidad de HPLC Varian. El relleno del bucle de inyección de la HPLC se controló por una corriente lista de nitrógeno en la unidad de HPLC. El ajuste de ambos automatizados se resume en la Tabla 2. La solución de [18F]-fluoruro acuosa (2,0 ml, 29,6 GBq/ 800 mCi) se liberaron a un QMA ligero Sep-Pal [El cartucho QMA ligero Sep-Pak se pre-acondicionó secuencialmente con 5 ml de bicarbonato de potasio 0,5 M de agua desionizada, y 5ml de acetonitrilo antes del uso]. Después de completar la transferencia, el [18F]fluoruro acuoso se liberó del Sep-Pak QMA por la adición de la mezcla de elución (de “V1”) en el reactor. El solvente se evaporó bajo corriente suave de nitrógeno y vacío. La solución del precursor (de “V2”) se agregó al residuo criptado seco y esta mezcla de reacción se calentó a 120 °C por 10 minutos. Después 3ml de agua destilada (de “V4”) se agregó a la mezcla de reacción cruda en el reactor y la mezcla se transfirió al bucle de inyección de 5 ml de la HLC semipreparativa mediante un sensor líquido el cual controla el final de la carga. La mezcla se cargó en la columna HPLC semi-preparativa (Luna C18(2).250x10 mm, Phenomenex). Una mezcla de 35% acetonitrilo En una solución de ácido trifluoroacético acuosa 0,1% se lavó a chorro a través de la columna a una velocidad de 4,6 ml por minuto. El producto se recolectó de esta columna HPLC en un matraz de dilución el cual contiene 15 ml de agua destilada y sus contenidos completos se transfirieron a u cartucho de extracción de fase sólida tC18 1 gramo. Se liberó 325 mCi (12 GBq) de [18F]-3-(2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etoxi)-2-fluoropiridina de este cartucho con 3 ml de etanol y se puede usar para generar productos biológicos etiquetados con 18F tomando ventaja de la reacción azida-alquino “clic” con el contenido biológico apropiado que contiene alquinos.

Tabla 2

continuación

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F, que comprende un grupo prostético radioetiquetado con 18F, una porción de conjugación bifuncional (BFC) y una proteína con la siguiente estructura,

o una sal de la misma farmacéuticamente aceptable, en la que

(a) el 18F es orto en el átomo de N y x es un número entero de 1 a 8;

(c) la proteína comprende un dominio de fibronectina tipo III (Fn3).

2. La sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F de la reivindicación 1, en donde el dominio Fn3 es un dominio 910Fn3 humano.

3. La sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, en donde la porción [O(CH2)2]x está presente en la configuración 1-3 con relación al nitrógeno en el anillo de piridina, en la configuración 1-2 con relación al nitrógeno en el anillo de piridina o en la configuración 1-4 con relación al nitrógeno en el anillo de piridina.

4. La sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde x es un número entero desde 2 hasta 6, x es un número entero desde 3 hasta 5 o x es 4.

5. La sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el grupo prostético radioetiquetado con 18F tiene la estructura

6. Una sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F, que comprende un grupo prostético radioetiquetado con 18F, una porción de conjugación bifuncional (BFC) y una proteína con la siguiente estructura

o una sal de la misma farmacéuticamente aceptable, en la que

(a) "OPEG" es [O(CH2)2]x y x es un número entero de 1 a 8;

(c) la proteína comprende un dominio de fibronectina tipo III (Fn3).

7. La sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F de conformidad con la reivindicación 6, en donde el dominio Fn3 es un dominio 10Fn3 humano.

8. La sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F de conformidad con las reivindicaciones 6 o 7, en donde x es un número entero desde 2 hasta 6, x es un número entero desde 3 hasta 5 o x es 4.

9. La sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la ciclooctina se selecciona a partir del grupo que consiste en dibenzociclooctina (DIBO), biarilazaciclooctinona (BARAC), dimetoxiazaciclooctina (DIMAC) y dibenzociclooctina (DBCO).

10. La sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la BFC es DBCO-PEG4-NHS-Éster, DBCO-Sulfo-NHS-Éster, DBCO-PEG4-Ácido, DBCO-PEG4-Amina o DBCO-PEG4-Maleimida.

11. La sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F de conformidad con la reivindicación 1, que tiene la siguiente estructura,

en la que el grupo maleimida de la BFC está covalentemente ligado al grupo tiol en un residuo de cisteína de la proteína, preferiblemente el residuo cisteína está en la posición C-terminal de la proteína.

12. La sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde la porción de proteína de la sonda se une a una molécula biológica asociada a una enfermedad seleccionada a partir del grupo que consiste en cánceres sólidos, cánceres hematopoyéticos, cánceres hematológicos, enfermedades autoinmunes, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades cardiovasculares e infección patogénica.

13. La sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde la sonda se une a un antígeno asociado al tumor o a una proteína presente en un organismo patogénico.

14. La sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F de conformidad con las reivindicaciones 12 o 13 para su uso en un método de detección de la presencia de una enfermedad en un sujeto, comprendiendo el método (a) administrar a un sujeto que lo necesita, la sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F la cual se une a una molécula objetivo asociada a la presencia de la enfermedad; y

(b) obtener una radio-imagen de al menos una porción del sujeto para detectar la presencia o la ausencia de la sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F;

en donde la presencia y la ubicación de la sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F más allá del fondo es indicativo de la presencia y la ubicación de la enfermedad.

15. La sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F de conformidad con las reivindicaciones 12 o 13 para su uso en un método para monitorear el progreso de una enfermedad en un sujeto, que comprende

(a) administrar a un sujeto que lo necesita la sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F la cual se une a una molécula objetivo asociada a la presencia de la enfermedad en un primer punto de tiempo y obtener una imagen de al menos una porción del sujeto para determinar la cantidad de las células o tejidos enfermos; y (b) administrar al sujeto la sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F en uno o más puntos de tiempo posteriores y obtener una imagen de al menos una porción del sujeto en cada punto de tiempo; en donde la dimensión y la ubicación de las células o de tejidos enfermos en cada punto de tiempo es indicativo del progreso de la enfermedad.

16. La sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F de conformidad con las reivindicaciones 12 o 13 para su uso en un método para cuantificar células o tejidos enfermos en un sujeto, comprendiendo el método

(a) administrar a un sujeto que tiene células o tejidos enfermos la sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F la cual se une a una molécula objetivo localizada con las células o tejidos enfermos; y

(b) detectar emisiones radioactivas el 18F en las células o los tejidos enfermos, en donde el nivel y la distribución de las emisiones radioactivas en las células o los tejidos enfermos es una medida cuantitativa de las células o de los tejidos enfermos.

17. Una composición farmacéutica que comprende la sonda a base de proteína radioetiquetada con 18F de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.