ES2942850T3 - Producto lácteo tratado con enzimas, procedimiento para producirlo, composición y producto - Google Patents

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Abstract

Se proporcionan un producto lácteo tratado con enzimas, un método para producir el mismo, una composición del mismo que comprende una composición farmacéutica y un producto del mismo que comprende un producto farmacéutico. Un producto lácteo tratado con enzimas obtenido por un método para producir un producto lácteo tratado con enzimas que incluye un paso para poner la leche en contacto con la β-galactosidasa. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Producto lácteo tratado con enzimas, procedimiento para producirlo, composición y producto
CAMPO TÉCNICO
La presente invención se refiere a un producto lácteo tratado con enzimas, un procedimiento para preparar el mismo, una composición del mismo que comprende una composición farmacéutica, y un producto del mismo que comprende un producto farmacéutico.
ANTECEDENTES ARTÍSTICOS
El macrófago tiene una función de tratamiento de los productos de desecho en el cuerpo humano y una función defensiva contra los agentes patógenos, como los microbios y los virus, y las células tumorales. El macrófago también tiene una función como efector de la inmunidad celular mediante la presentación de un antígeno a la célula T y la producción de interleucina 1. En consecuencia, es importante activar el macrófago para el tratamiento y la prevención de un cáncer y una enfermedad infecciosa, y la activación del macrófago permite llevar a cabo el tratamiento y la prevención de un cáncer y una enfermedad infecciosa.
Un factor de activación de macrófagos es, por ejemplo, un interferón, y su aplicación clínica se ha llevado a cabo. Además, se sabe que cierto tipo de polisacáridos tiene una actividad inmunoestimulante, y se espera desarrollar algunos de ellos como agente antiviral y agente anticancerígeno (Documento de Patente 1 o 2).
La fatiga es una enfermedad que implica una variedad de síntomas que generalmente incluyen sensación de fatiga y malestar como síntomas principales y adicionalmente incluyen trastorno del sueño, pérdida de motivación y similares. Cada una de las sensaciones de fatiga y malestar es una de las señales de alarma importantes de que se produce una anomalía en el organismo, y una persona es consciente de tales sensaciones incluso en buen estado de salud, por ejemplo, cuando la persona practica ejercicio vigoroso o trabaja durante largas horas, o cuando la persona se encuentra en situaciones de estrés excesivo. Generalmente, una persona se recupera de tal fatiga fisiológica a la condición normal original por el descanso, y por lo tanto la fatiga no dura mucho tiempo. Según la "Encuesta sobre Actitudes Públicas hacia la Salud" realizada por la Oficina del Primer Ministro en 1985, algo más de aproximadamente el 60% de las personas se quejaban de fatiga, pero el 70% de las personas que se quejaban de fatiga respondían que "se recuperaban de la fatiga durmiendo toda la noche". Sin embargo, las personas de hoy en día suelen trabajar muchas horas y se encuentran en situaciones excesivamente estresantes, y también les resulta difícil descansar lo suficiente. Por ello, a menudo les resulta difícil recuperarse de la sensación de fatiga y malestar. Una encuesta epidemiológica realizada por el equipo de encuesta e investigación sobre la fatiga, del Ministerio de Sanidad y Bienestar, en 1999, informaba de lo siguiente: el porcentaje de personas que presentaban fatiga subjetiva era de aproximadamente el 60%, lo que no había cambiado, pero hasta el 60% de ellas presentaban fatiga durante 6 meses o más. En otras palabras, el número de personas que padecen fatiga crónica aumenta y, por tanto, la característica de la fatiga está cambiando (Documento no de patente 1). Recientemente, una enfermedad llamada síndrome de fatiga crónica (SFC) se ha convertido en un tópico como enfermedad intratable. Los pacientes con este síndrome presentan síntomas básicos que incluyen sensación de fatiga general, malestar, fiebre leve, inflamación de los ganglios linfáticos, dolor muscular, dolor articular y síntomas psiconeuróticos durante un periodo tan prolongado que dificultan la vida cotidiana. Además, la muerte por exceso de trabajo se ha convertido en un gran problema social. La muerte por exceso de trabajo se define como una muerte súbita debida a un exceso de trabajo excesivo durante un largo periodo de tiempo. Se reconoce que el problema de la muerte por exceso de trabajo es muy importante desde los puntos de vista médico, económico y social. A continuación, se han sugerido las denominadas "sustancias antifatiga", entre las que se incluyen sustancias que pueden atenuar la fatiga que se produce cuando una persona practica ejercicio vigoroso o trabaja durante largas horas o cuando una persona se encuentra en situaciones de estrés excesivo, y sustancias que permiten que una persona se recupere pronto de la fatiga a un estado normal. Por ejemplo, se ha informado de que un tipo de composición de aminoácidos (Documento de Patente 3), dipéptidos relacionados con la L-carnitina y la histidina (Documento de Patente 4), un extracto de espino blanco (Documento de Patente 5), y similares tienen los efectos de la fuerza física. También se ha demostrado que una composición de suplemento nutricional que incluye ácido ascórbico es útil para suministrar nutrición en el momento de, por ejemplo, agotamiento físico por ejercicio, etc., o fatiga (Documento de Patente 6) .
Recientemente, el número de pacientes con enfermedades causadas por alergia de tipo I, incluyendo fiebre del heno, rinitis alérgica, alergia alimentaria, dermatitis atópica y asma alérgica, tiende a aumentar en todo el mundo. Aunque la terapia farmacológica con un agente antihistamínico, un agente antialérgico, un esteroide o similar se lleva a cabo generalmente para el tratamiento de enfermedades alérgicas, la investigación y el desarrollo de alimentos funcionales y suplementos eficaces para la alergia como atención sanitaria alternativa también se ha llevado a cabo recientemente con entusiasmo desde el punto de vista de la medicina preventiva. Por ejemplo, las bacterias lácticas que actúan sobre la inmunidad intestinal atraen la atención porque se supone que son eficaces para la prevención y el tratamiento de enfermedades alérgicas (véanse, por ejemplo, los Documentos de Patente 7 a 9). La inmunidad intestinal es un mecanismo inmunitario que elimina los microorganismos patógenos y similares ingeridos por vía oral, y se considera que la supresión de la respuesta excesiva de la inmunidad intestinal contribuye a la prevención y el tratamiento de las enfermedades alérgicas.
La alopecia se refiere a una afección (síntoma) de pérdida de cabello debida a diversas causas, y entre sus ejemplos típicos se incluyen la alopecia de patrón masculino (calvicie), la alopecia seborreica, la alopecia pitiroide, la alopecia senil, la alopecia areata, la alopecia posparto, la alopecia mecánica (por presión) y la tricotilomanía. El uso de una sustancia que inhibe la actividad de la 5a-reductasa para suprimir así la producción de dihidrotestosterona (DHT) (Documento de Patente 10), por ejemplo, se ha sugerido para el tratamiento de estos tipos de alopecia, pero hay margen para mejorar su efecto.
El color de la piel humana depende de varios factores, como la actividad de los melanocitos que producen el pigmento melanina, la distribución vascular, el grosor de la piel y la presencia o ausencia de pigmentos contenidos, como carotenoides y bilirrubina. Entre ellos, el grado de formación de melanina (pigmento negro), que se produce en los melanocitos mediante enzimas como la tirosinasa, es uno de los factores más importantes de los que depende el color de la piel. La melanina presente en la piel tiene la importante función de proteger al organismo de los rayos ultravioleta y similares. Sin embargo, se sabe que cuando la melanina está presente en exceso, no sólo causa pigmentación cutánea como manchas, pecas y lunares, sino que también funciona como un factor que acelera el envejecimiento de la piel hasta inducir el carcinoma cutáneo. Se han utilizado diversas sustancias con efectos blanqueadores de la piel, como el ácido kójico, el ácido ascórbico, la arbutina, la hidroquinona, el glutatión y sus derivados, para tratar o atenuar la pigmentación de la piel debida a la producción excesiva de melanina (por ejemplo, Documento de Patente 11), pero presentan diversos problemas en cuanto a eficacia, seguridad, facilidad de formulación, estabilidad y similares. La piel está directamente expuesta a la luz y, por tanto, es la parte más vulnerable a los rayos ultravioleta. Según el grado de exposición, la piel expuesta a los rayos ultravioleta muestra una respuesta biológica que incluye lesiones por quemaduras, pigmentación, daños en el ADN, cambios en el tejido conjuntivo y cancerización. Además, la exposición repetida a los rayos ultravioleta acelera el envejecimiento de la piel, y dicho envejecimiento cutáneo provoca además la formación de arrugas, pigmentación, mutación del tejido conjuntivo, cambio en el grosor de las células epidérmicas, etc. El tejido conjuntivo de la piel está formado principalmente por colágeno y elastina. Dado que el colágeno y la elastina confieren elasticidad a la piel, ésta se daña fácilmente con la edad cuando se debilitan. La enzima implicada en la descomposición del colágeno es la MMP (Matrix-Metalloproteinase). A medida que avanza el envejecimiento de la piel, aumenta la expresión de MMP y, por tanto, el aumento de MMP descompone el colágeno de la piel. La repetición de este mecanismo da lugar a la formación de arrugas en la piel y a la progresión precoz del envejecimiento. Para que el tejido cutáneo retenga la humedad, es necesario aumentar el factor de hidratación natural de la piel. Los principales componentes del factor hidratante natural son los aminoácidos, por lo que garantizar su suministro permite a la piel mantener la retención de humedad.
El Documento de Patente 12 describe que un suero sanguíneo humano tratado con una enzima (p-galactosidasa, o p-galactosidasa y sialidasa) tiene una actividad de activación de macrófagos.
El documento ES 2 183 711 A1 divulga un procedimiento para producir una leche líquida de origen animal con un contenido reducido de lactosa que comprende una etapa de adición de p-galactosidasa a una leche líquida.
El documento WO 2007/088324 A1 divulga el uso de p-galactosidasa como enzima para producir una mezcla de oligosacáridos que se utiliza en productos lácteos, bebidas y medicamentos, y puede estar en forma de líquido, polvo seco, etc.
El documento WO 2008/037839 A1 divulga un procedimiento para producir un producto a base de leche que contiene una mezcla de galactooligosacáridos.
El documento US 2013/243880 A1 divulga un procedimiento de preparación de una composición farmacéutica que comprende un suero humano tratado con enzimas .
El documento EP 2 530 148 A1 describe una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene la actividad de una beta-galactosidasa que puede utilizarse en una composición alimentaria, una composición cosmética o una composición farmacéutica.
El documento US 2014/227393 A1 divulga un proceso para preparar un producto lácteo fermentado funcional que comprende tratar materiales lácteos con una lactasa (por ejemplo, p-galactosidasa) para proporcionar materiales lácteos enzimáticamente hidrolizados, tratar los materiales lácteos enzimáticamente hidrolizados con Bifidobacterium para proporcionar materiales lácteos fermentados, y tratar adicionalmente los materiales lácteos fermentados para proporcionar un producto lácteo fermentado funcional.
DOCUMENTO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Documento de patente
Documento de patente 1: JP H05-097695 A
Documento de patente 2: JP H06-099314 B
Documento de patente 3: JP H09-124473 A
Documento de Patente 4: JP 2001-046021 A
Documento de Patente 5: JP H08-047381 A
Documento de patente 6: JP H06-327435 A
Documento de patente 7: JP H10-309178 A
Documento de patente 8: JP 2000-095697 A
Documento de Patente 9: JP 2005-139160 A
Documento de Patente 10: JP H07-033673 A
Documento de patente 11: JP H11-510820 A
Documento de patente 12: WO 2013/038997
Documento no de patente
Documento no de patente 1: "FATIGUE SCIENCE", pp. 222-228, Editores: Masayasu INOUE, Hirohiko KURATUNE, & Yasuyoshi WATANABE; Kodansha Co., Ltd.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN PROBLEMA QUE DEBE RESOLVER LA INVENCIÓN
Un objeto de la presente invención es proporcionar un producto lácteo tratado con enzimas que sea útil para el tratamiento, la prevención y la mejora de enfermedades como el cáncer y las enfermedades infecciosas, las enfermedades asociadas a la fatiga, las enfermedades alérgicas (en particular las causadas por la alergia de tipo I) y la alopecia, así como para la mejora de la piel, y un procedimiento de preparación del mismo. Además, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden el producto lácteo tratado con enzimas, productos farmacéuticos y productos que los comprenden.
MEDIOS PARA RESOLVER EL PROBLEMA
Los presentes inventores han realizado estudios intensivos y, como resultado, han descubierto que cuando una leche de mamífero se somete a tratamiento con enzimas poniendo la leche en contacto con una enzima específica, es decir p-galactosidasa, o p-galactosidasa y sialidasa, el producto lácteo tratado muestra excelentes actividades de tratamiento, prevención o mejora contra enfermedades tales como un cáncer y una enfermedad infecciosa, una enfermedad asociada a la fatiga, enfermedades alérgicas (particularmente causadas por la alergia de tipo I), y una alopecia, así como una mejora de la piel. Los presentes inventores han realizado estudios adicionales y han completado la presente invención.
A saber, la presente invención se refiere a:
[1] un procedimiento de preparación de un producto lácteo tratado con enzimas que comprende una etapa de puesta en contacto de una leche con p-galactosidasa, y una etapa de condensación, o de desquesado de la leche, antes del tratamiento con enzimas,
[2] el procedimiento de preparación según el anterior [1], que comprende además una etapa de puesta en contacto de la leche con sialidasa,
[3] el procedimiento de preparación según los anteriores [1] o [2], que comprende además una etapa de condensación, o de desquesado de la leche, antes del tratamiento con enzimas,
[4] un producto lácteo tratado con enzimas obtenido por el procedimiento de preparación según uno cualquiera de los anteriores [1] a [3],
[5] una composición farmacéutica que comprenda el producto lácteo tratado con enzimas según lo anterior [4], [6] un medicamento que comprenda la composición farmacéutica según lo anterior [5],
[7] una composición para alimentos o bebidas, que comprende el producto lácteo tratado con enzimas según lo anterior [4],
[8] un alimento o bebida que comprenda la composición para alimentos o bebidas según lo anterior [7].
EFECTOS DE LA INVENCIÓN
El producto lácteo tratado con enzimas de la presente invención es útil para el tratamiento, la prevención y la mejora del cáncer y de enfermedades infecciosas, enfermedades alérgicas (en particular, una enfermedad alérgica causada por reacciones alérgicas de tipo I) y alopecia, así como para la mejora de la piel. Por lo tanto, el producto lácteo tratado con enzimas de la presente invención puede utilizarse como medicamento, cuasifármaco o alimento o bebida para la prevención, la mejora y el mantenimiento de la remisión de las enfermedades mencionadas.
Además, el producto lácteo tratado con enzimas según la presente invención tiene ventajas como su fácil preparación y bajo coste, ya que puede prepararse tratando una leche con p-galactosidasa, o p-galactosidasa y sialidasa.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Fig. 1 es una fotografía utilizada en lugar de un dibujo, que muestra el estado de los macrófagos sometidos a la tinción de Giemsa.
La Fig. 2 es una fotografía utilizada en lugar de un dibujo, que muestra los resultados de la electroforesis del producto lácteo tratado con enzimas (4) .
La Fig. 3 es una fotografía utilizada en lugar de un dibujo, que muestra los resultados de la electroforesis del producto lácteo tratado con enzimas (4) .
REALIZACIÓN PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN
<Leche>
La leche utilizada en la presente invención se refiere a una secreción del cuerpo de la madre de mamífero para proporcionar a los bebés nutrición para crecer. Ejemplos preferidos de mamíferos incluyen vacas, caballos, ovejas, cabras, cerdos, humanos, búfalos, yaks, camellos, burros, renos y ciervos. La leche incluye el llamado calostro, que sólo se segrega durante un cierto número de días después del parto, pero no incluye el calostro de vaca (leche segregada por una vaca madre en los 10 días siguientes al parto). La leche puede someterse a un pretratamiento antes del tratamiento con enzimas. Entre los ejemplos de pretratamiento se incluye la condensación para reducir el contenido de agua, así como la eliminación de los componentes (por ejemplo, caseína, grasa) que se solidifican como queso cuando se elabora queso a partir de una leche (tratamiento de desquesado). En lo sucesivo, la leche obtenida por concentración también se denominará "leche condensada" y la leche obtenida por desquesado también se denominará "leche de ingredientes desquesados" (suero).
<Enzima>
En la presente invención se utiliza beta-galactosidasa, y puede utilizarse cualquier tipo de p-galactosidasa conocida. Algunos ejemplos son el derivado de Escherichia coli, el derivado de hígado bovino y similares. Ejemplos de pgalactosidasas disponibles comercialmente son el catálogo n° 072-04141 de Wako Pure Chemical Industries, Ltd., G1875 de SIGMA-ALDRICH, y similares.
En la presente invención, las p-galactosidasas pueden utilizarse solas o en combinación de dos o más de ellas.
En la presente invención se utiliza sialidasa, y puede utilizarse cualquier tipo de sialidasa conocida. Algunos ejemplos son el derivado de Clostridium perfringens, el derivado de Streptococcus 6646K, el derivado de Vibrio cholerae, el derivado de Arthrobacter ureafaciens y similares. Ejemplos de sialidasas disponibles comercialmente son los productos Sigma n° N2876, N2133, N2904, N3001 y N5631 de SIGMA-ALDRICH, el código n° 120052 de SEIKAGAKU BIOBUSINESS CORPORATION, el catálogo n° P0720L y P0720S de BioLabs, y similares.
En la presente invención, las sialidasas pueden utilizarse solas o en combinación de dos o más de ellas.
<Tratamiento con Enzimas>
En la presente invención, es preferible que la leche se ponga en contacto con p-galactosidasa o sialidasa (tratamiento con enzimas) mediante el uso de una cantidad suficiente de enzima durante un periodo de tiempo suficiente hasta tal punto que la reacción enzimática ya no se produzca sustancialmente. Para ello, aunque la cantidad y el tiempo de tratamiento dependen del tipo de enzima, por ejemplo, cuando el Catálogo n° 072-04141 de Wako Pure Chemical Industries, Ltd., se utiliza como p-galactosidasa basta con utilizar la enzima en una cantidad de 65 mU en 100 pl de leche. Además, por ejemplo, cuando se utiliza el producto n° N2876 de SIGMA-ALDRICH como sialidasa, basta con utilizar la enzima en una cantidad de 65 mU en 100 pl de leche. En este caso, basta con realizar el tratamiento con enzimas durante tres horas.
El tratamiento con enzimas puede llevarse a cabo en un recipiente de libre elección añadiendo estas enzimas a una leche y, si se desea, puede añadirse a la misma una solución tampón utilizada habitualmente en este campo para ajustar una concentración total de proteínas en la leche. Ejemplos de este tipo de solución tamponadora son la solución salina, la solución salina tamponada con fosfato (SPB), la solución de Ringer y similares.
La temperatura de tratamiento de la enzima no está limitada particularmente en la medida en que la enzima muestra su actividad, y es una temperatura alrededor de 37°C donde la enzima suele mostrar una alta actividad.
El tratamiento con enzimas se termina por calentamiento (tratamiento térmico), inactivando así la enzima. Dicho tratamiento térmico no está limitado particularmente en cuanto a que la enzima pueda ser inactivada, y por ejemplo, puede llevarse a cabo calentando a una temperatura de alrededor de 60°C durante unos 10 minutos.
La muestra después del tratamiento térmico puede someterse a condensación si se desea. La condensación puede realizarse utilizando equipos disponibles en el mercado, por ejemplo, un espesador centrífugo (por ejemplo, 10000MWCO YM-10 de MILLIPORE CORPORATION).
El tratamiento con enzimas puede realizarse también utilizando una enzima fijada a una fase sólida (enzima inmovilizada). Por ejemplo, la p-galactosidasa y/o la sialidasa pueden fijarse a perlas de agarosa utilizando un agente de acoplamiento como el bromuro de cianógeno. Ejemplos de tales enzimas inmovilizadas disponibles comercialmente son la p-galactosidasa G3M inmovilizada (#A3102, MoBiTec), la agarosa neuraminidasa derivada de Clostridium perfringens (bacilo de Welch) (Producto n° N5254 disponible en SIGMA-ALDRICH), y similares. Una ventaja del uso de una enzima inmovilizada es que una enzima puede ser recuperada sin ser inactivada por tratamiento térmico después del tratamiento con enzimas, y como resultado de tal recuperación, los contaminantes (proteínas como la enzima inactivada por tratamiento térmico, y similares) pueden disminuir.
<Producto lácteo tratado con enzimas>
El producto lácteo tratado con enzimas así obtenido de la presente invención puede convertirse en un sólido o un polvo mediante liofilización. Este producto lácteo tratado con enzimas es una composición novedosa.
El producto lácteo tratado con enzimas así obtenido puede utilizarse para preparar una composición farmacéutica o un producto farmacéutico, una composición para un cuasifármaco o un cuasifármaco, así como una composición para alimentos o bebidas, o alimentos y bebidas que los contengan.
<Productos Farmacéuticos>
El producto lácteo tratado con enzimas de la presente invención puede utilizarse como composición farmacéutica tal cual, o mezclándole opcionalmente auxiliares farmacéuticamente aceptables (portadores). Cualquiera de los auxiliares utilizados habitualmente en este campo puede emplearse como auxiliar farmacéuticamente aceptable, y ejemplos de ello incluyen un diluyente, un estabilizador, un conservante, un agente tampón, un excipiente, un agente aglutinante, un agente antiséptico, un desintegrante, un lubricante, una sustancia aromatizante y similares. Estos auxiliares se mezclan opcionalmente en función de una forma de dosificación de la composición farmacéutica.
La composición farmacéutica de la presente invención se puede convertir en productos farmacéuticos preparándola en una forma de dosificación adecuada. Esta forma farmacéutica puede ser oral o parenteral. Los ejemplos de preparación parenteral incluyen un agente de inyección, un agente de infusión, gotas nasales, gotas para los oídos, un supositorio, un nutriente enteral, y similares. Entre los ejemplos del agente inyectable se incluyen los administrados por inyección intravenosa, inyección hipodérmica, inyección intradérmica, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal y similares, y entre ellos se prefiere la inyección intramuscular. Mientras tanto, ejemplos de la preparación oral incluyen un polvo, un gránulo, una tableta (incluyendo una tableta sublingual), una cápsula, una píldora, un fármaco de recubrimiento entérico, un líquido para uso interno (incluyendo un agente de suspensión, una emulsión, un jarabe, y similares), un inhalante, y similares.
La dosificación del producto lácteo tratado con enzimas de la presente invención varía en función de la edad, el sexo, el peso corporal y los síntomas de un paciente, una vía de administración y similares. Según la invención, la dosificación para una dosis es tal que una cantidad total de proteínas contenidas en el producto lácteo tratado con enzimas por una (1) dosis para adultos no es inferior a 0,02 |jg, preferentemente no inferior a 0,2 |jg, más preferentemente no inferior a 2 jg , más preferentemente no inferior a 20 jg , más preferentemente no inferior a 50 jg , y no superior a 40 mg, preferentemente no superior a 20 mg, más preferentemente no superior a 13 mg, más preferentemente no superior a 10 mg, más preferentemente no superior a 2 mg. La dosificación está dentro de un intervalo de 0,02 jg a 40 mg, preferentemente de 0,2 jg a 40 mg, más preferentemente de 2 jg a 40 mg, más preferentemente de 20 ug a 40 mg, más preferentemente de 50 jg a 40 mg, más preferentemente de 50 jg a 40 mg, más preferentemente de 50 jg a 20 mg, más preferentemente de 50 ug a 13 mg, más preferentemente de 50 jg a 10 mg, más preferentemente de 50 jg a 2 mg. En este caso, la cantidad de proteína se calcula a partir de una concentración de proteína determinada sobre la base de una absorbancia a una longitud de onda de 570 nm.
Con respecto al intervalo de dosificación y al número de dosis, en caso de dosificar el producto lácteo tratado con enzimas de la presente invención con la dosificación antes mencionada por una dosis, el número representativo de dosis es de 1 a 2 veces al día. La dosis y el intervalo de dosificación pueden modificarse opcionalmente, utilizando como índice la cantidad total de proteínas contenidas en la composición farmacéutica, siempre que la cantidad total de proteínas a dosificar sea igual.
La dosificación para la prevención de las enfermedades puede ser la misma dosis o la mitad de la dosis en el caso del tratamiento o mejora de las enfermedades.
El producto lácteo tratado con enzimas de la presente invención puede utilizarse en combinación con otros medicamentos para la prevención, el tratamiento o la mejora de las enfermedades. En el caso de uso combinado, la dosificación del producto lácteo tratado con enzimas de la presente invención se ajusta adecuadamente teniendo en cuenta la indicación, el efecto y la dosificación de los otros medicamentos.
<Cuasi-Fármaco>
El producto lácteo tratado con enzimas de la presente invención puede prepararse como una composición para cuasifármaco mediante la mezcla de los auxiliares antes mencionados y similares según sea necesario, y la composición para cuasifármaco así obtenida puede utilizarse para preparar cuasifármaco contenido en la misma.
La composición para el cuasifármaco o el cuasifármaco se puede formar en una solución, una suspensión, un jarabe, un gránulo, una crema, una pasta, una gelatina y similares, y se le puede dar la forma deseada si es necesario.
La preparación de la composición para cuasifármaco o cuasifármaco puede realizarse por el procedimiento habitual.
La cantidad del producto lácteo tratado con enzimas de la presente invención cuando se utiliza como una composición de cuasifármaco, o un cuasifármaco se ajusta a la dosis en el caso de los productos farmacéuticos antes mencionados.
<Comida o bebida>
El producto lácteo tratado con enzimas de la presente invención puede convertirse en una composición para alimentos y bebidas mezclando opcionalmente los auxiliares antes mencionados y varios tipos de aditivos como edulcorantes, especias, condimentos, agentes antisépticos, conservantes, desinfectantes y antioxidantes que se utilizan normalmente para alimentos o bebidas, y también puede convertirse en un alimento o bebida que comprenda la composición para alimentos o bebidas mediante el procesamiento posterior de la composición. La composición para alimentos o bebidas o los alimentos o bebidas pueden adoptar diversas formas, como una solución, una suspensión, un jarabe, un gránulo, una crema, una pasta, una gelatina y similares, y pueden adoptar la forma deseada si es necesario. Además, los alimentos o bebidas pueden adoptar diversas formas, como pan, fideos, dulces, bebidas, sopas y alimentos manufacturados. La preparación de la composición para alimentos o bebidas y de los alimentos o bebidas puede llevarse a cabo por el procedimiento habitual.
La cantidad del producto lácteo tratado con enzimas de la presente invención cuando se utiliza como composición para alimentos o bebidas, o como alimento o bebida, se ajusta a la dosis en el caso de los productos farmacéuticos antes mencionados.
El alimento o bebida de la presente invención puede ser un alimento ingerible por vía oral de los denominados alimentos saludables, bebidas saludables, alimentos funcionales, alimentos con función nutricional, suplementos dietéticos, alimentos suplementarios nutricionales (suplementos), alimentos para usos dietéticos especiales, alimentos para usos sanitarios específicos y alimentos para animales que no sean seres humanos, como animales de trabajo, perros de caza, caballos de carreras, animales de compañía y similares.
Los productos farmacéuticos, los cuasifármacos y los alimentos o bebidas de la presente invención mencionados anteriormente se presentan preferentemente en una forma tal que permite que el producto lácteo tratado con enzimas que es un ingrediente activo se absorba a través de un tracto digestivo, preferentemente a través de una cavidad oral o un intestino (por ejemplo, en forma de un comprimido sublingual o un fármaco de recubrimiento entérico como se ha mencionado anteriormente).
<Síntomas de aplicación>
(Cánceres, Enfermedades Infecciosas)
Los cánceres incluyen cualquiera de los carcinomas, sarcomas y tumores malignos, por ejemplo, carcinoma cutáneo, carcinoma bronquial, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de lengua, cáncer de faringe, carcinoma de esófago, cáncer gástrico, cáncer de intestinum tenue, cáncer intestinum crassum, cáncer de recto, cáncer de colon, cáncer hepático, cáncer de páncreas, cáncer renal, carcinoma de células renales, cáncer vesical, cáncer prostático, cáncer uterino, cáncer cervical, tumor de Wilms, carcinoma melanótico, meningioma, neuroblastoma, osteosarcoma, sarcoma de Kaposi, linfoma, leucemia y similares. Además, en el presente documento, el término "cáncer" incluye estos tumores malignos y sus metástasis.
Además, ejemplos de enfermedades infecciosas son enfermedades infecciosas virales y enfermedades infecciosas bacterianas, y por ejemplo, se ejemplifican enfermedades infecciosas VIH, SIDA, y además, hepatitis b, hepatitis c, herpes, gripe, neumonía, tuberculosis, infección por virus EB, y similares.
La composición farmacéutica de la presente invención tiene una acción activadora de macrófagos y, por lo tanto, puede utilizarse como agente terapéutico o profiláctico para enfermedades como cánceres y enfermedades infecciosas.
(Fatiga)
La fatiga se refiere a una condición desarrollada como una disminución temporal del rendimiento físico y/o mental cuando se da continuamente una carga física o mental. Por disminución del rendimiento se entiende una disminución cualitativa o cuantitativa de la capacidad de trabajo física y/o mental. El término "fatiga" de la presente invención también abarca la fatiga crónica, así como la fatiga del síndrome de fatiga crónica y la fatiga que conduce a una muerte por exceso de trabajo.
"Efectos de mejora o tratamiento de la fatiga" en la presente invención se refiere al efecto de atenuación de la fatiga y al efecto de recuperación de la fatiga descritos anteriormente, y se refiere específicamente a la prolongación de la duración de la actividad de un lugar de ejercicio o acción (incluido el cerebro); supresión del aumento de las sustancias fatigantes en comparación con las debidas a la misma cantidad de ejercicio o actividad (mejora de la resistencia física y aumento de la fuerza física); mejora de la condición en la que el cerebro, el nervio y similares perciben la fatiga aunque el lugar de ejercicio o acción no esté fatigado; y el efecto de acelerar la recuperación del lugar de ejercicio o acción desde una condición de fatiga a una condición normal. "Efecto preventivo sobre la fatiga" en la presente invención se refiere al efecto de inhibir llegar a estar en la condición de fatiga antes mencionada.
El síndrome de fatiga crónica, cuya definición no está definitivamente establecida, se refiere a un síndrome que presenta debilidad o fatiga continuas a un nivel tal que dificulta la vida diaria y el síndrome implica síntomas físicos inespecíficos que duran más de seis meses y no están causados por otros factores (Diccionario médico Stedman, sexta edicion).
Una muerte por exceso de trabajo se refiere a la siguiente condición: aunque una persona está en condiciones de exceso de trabajo demasiado severas para mantener la vitalidad física, la persona no puede sentir la fatiga suficiente, y como resultado, la persona desarrolla una enfermedad vascular cerebral o una enfermedad del corazón para así resultar en una incapacidad permanente de trabajo o la muerte.
El producto lácteo tratado con enzimas de acuerdo con la presente invención puede tratar dicho síndrome de fatiga crónica, específicamente, puede aliviar varios síntomas del síndrome de fatiga crónica para llevar así a un sujeto a una condición normal, y también puede prevenir una muerte por exceso de trabajo.
(Enfermedades alérgicas)
Las enfermedades alérgicas se refieren aquí a enfermedades alérgicas causadas por al menos alergia de tipo I, y la alergia de tipo I se define aquí por la clasificación de Coombs. Por lo tanto, entre los ejemplos de "enfermedades alérgicas causadas por al menos una alergia de tipo I" se incluyen la fiebre del heno, la rinitis alérgica, el asma bronquial, la urticaria, la dermatitis atópica, la alergia alimentaria, la neumonía eosinofílica, la alergia alimentaria y el shock anafiláctico. Entre ellas, son preferibles la fiebre del heno y la dermatitis atópica.
El producto tratado con enzimas según la presente invención puede tratar, prevenir o mejorar estas enfermedades alérgicas.
(Alopecia)
La alopecia se refiere a la condición (síntoma) de pérdida de cabello debida a diversas causas. Algunos ejemplos típicos son la alopecia de patrón masculino (calvicie), la alopecia seborreica, la alopecia pitiroide, la alopecia senil, la alopecia areata, la alopecia posparto, la alopecia mecánica (por presión) y la tricotilomanía (enfermedad mental). Entre ellas, es preferible la alopecia areata.
El producto lácteo tratado con enzimas según la presente invención exhibe un excelente efecto de promoción de la restauración capilar y el crecimiento del cabello y, por lo tanto, puede prevenir, tratar o mejorar la alopecia.
(Mejora de la piel)
La mejora de la piel se refiere al blanqueamiento de la piel, la supresión o la mejora de la pigmentación (por ejemplo, manchas, pecas, opacidad de la piel, manchas de pigmentación senil, lunares, nevos y ojeras), la promoción de la eliminación de la queratina o el cambio de la queratina, el antienvejecimiento, la supresión o la mejora de las arrugas, la hidratación o la regeneración. Entre ellos, son preferibles el blanqueamiento de la piel, la supresión o mejora de la pigmentación y la supresión o mejora de las arrugas.
El producto lácteo tratado con enzimas según la presente invención exhibe un efecto en la mejora de la piel anteriormente descrito.
EJEMPLO
La presente invención se explica en detalle mediante Ejemplos.
1. Preparación del producto lácteo tratado con enzimas (1)
Se disolvió 1 mg de leche bovina sólida en 1 ml de 1 * PBS, y a 100 pl de esta solución se añadieron 6,5 pl de pgalactosidasa (10 mU/pl, N° de catálogo 072-04141 disponible en Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 6,5 pl de sialidasa (10 mU/ul, N2876 disponible en SIGMA-ALDRICH) y 87 pl de SPB 100mM (15,601 g de NaH2PO4-2H2O y 35,814 g de Na2HPO4-12H2O se disolvieron en 500 ml de agua destilada para preparar 200mM SPB (pH 7,0), seguido de una dilución en SPB 100mM), seguido de una incubación de 3 horas a 37°C. Tras la incubación, se añadieron 200 pl de SPB 100mM y se sometió la solución a un tratamiento térmico de 10 minutos a 60°C. Tras el tratamiento térmico, la solución se condensó con un MICROCON (10000MWCO YM-10, MILLIPORE CORPORATION), y se determinó la concentración de proteínas a partir de una absorbancia a una longitud de onda de 570 nm (utilizando una curva de calibración realizada con respecto a la BSA (albúmina sérica bovina, SIGMA, A4503)). De este modo se determinó la concentración de proteínas (pg/pl) de la solución. (Muestra 1).
La Muestra 1 fue diluida usando SPB 100mM para preparar muestras, cada una con concentraciones de proteína de 1 ng/10 pl (Muestra 1-1), 10 ng/10 pl (Muestra 1-2), y 100 ng/10 pl (Muestra 1-3), respectivamente.
Mientras tanto, se determinó una concentración de proteína de la leche antes del tratamiento con enzimas (Muestra comparativa 1) de la misma manera que en el caso anterior. La Muestra de Comparación 1 se diluyó utilizando SPB 100mM para preparar muestras, cada una con concentraciones de proteína de 1 ng/10 pl (Muestra de Comparación 1-1), 10 ng/10 pl (Muestra de Comparación 1-2), y 100 ng/10 pl (Muestra de Comparación 1-3), respectivamente.
<Actividad fagocítica de macrófagos (1)> (Actividad fagocítica de macrófagos intraabdominales de ratón mediante el uso de SRBC opsonizados)
Se hizo que un ratón (ratón hembra ICR) sufriera una dislocación cervical, se peló un tegumento de su abdomen y se inyectaron 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS que contiene 0,01 M de fosfato sódico, 0,9% NaCl y 5 unidades/ml de heparina) en su cavidad abdominal sin lesionar las vísceras. Tras golpear el abdomen durante aproximadamente un minuto, se recuperó un líquido intraabdominal para recoger células peritoneales. Tras someter el líquido intraabdominal recuperado a centrifugación (1500 rpm, 4°C, 15 minutos), se desechó un sobrenadante y se añadió un medio de cultivo RpMI, tras lo cual se pipeteó. El número de células se midió con un hemocitómetro Burker-Turk y se añadió medio de cultivo RPMI para ajustar el número de células a 1,0 *10® células/ml. El medio de cultivo RPMI se preparó como se indica a continuación. A saber, tras disolver un medio de cultivo en polvo (N° de catálogo 856846 disponible en GIBCO) en 900 ml de agua purificada, se disolvieron en él 2 g deNaHCO3 en un banco limpio. Tras ajustar el pH de la mezcla a 7,2 con HCl 1N, se ajustó la cantidad total de la mezcla a 1000 ml con agua purificada. La solución así obtenida se sometió a filtración con un filtro (SLGVJ13SL de MILLIPORE) para obtener un medio de cultivo RPMI que se almacenó a 4°C antes de su utilización.
La solución de macrófagos obtenida anteriormente se dispensó en cada uno de los pocillos de una placa de 24 pocillos (TPP, 92024) en una cantidad de 500 pl/pocillo (5,0 *105 células/pocillo), en la que se colocaron tres cubreobjetos esterilizados (Micro cubreobjetos n.° 1 de Matsunami Glass Ind., Ltd.) en cada uno de los pocillos. Además, se añadió un medio de cultivo RPMI en una cantidad de 500 pl/pocillo para ser en total 1 ml/pocillo. Tras someter la placa a una incubación de 1 hora a 37°C, se eliminaron las soluciones de cada uno de los pocillos y se lavó cada pocillo con 1 ml de medio de cultivo RPMI dos veces. Tras el lavado, se añadió 1 ml de un medio de cultivo RPMI en cada uno de los pocillos, seguido de una incubación de 15 horas a 37°C.
Tras la incubación, se añadieron en cada pocillo 10 pl de cada una de las Muestras 1-1 a 1-3 y de las Muestras comparativas 1-1 a 1-3 preparadas anteriormente, seguido de una incubación de 3 horas a 37°C para estimular los macrófagos. Tras la incubación, se desecharon las soluciones de cada pocillo y se añadió 1 ml de SRBC opsonizado al 0,5% (glóbulos rojos de oveja de Nippon Bio-Supp. Center), seguida de una incubación de 90 minutos a 37°C para que los macrófagos fagocitaran los SRBC. Tras la fagocitosis, los cubreobjetos se lavaron con 1/5 * PBS, 1 * p Bs y 1 * PBS en orden, seguido de un secado al aire durante unos 30 minutos. Tras el secado al aire, cada cubreobjetos se sumergió en metanol (25183-2B de KANTO CHEMICAL CO., INC.) durante aproximadamente un minuto para fijar el metanol al cubreobjetos. Tras la fijación, el cubreobjetos se sometió de nuevo a un secado al aire de unos 30 minutos y, a continuación, se realizó la tinción con una solución de Giemsa (A1327 de SIGMA) diluida 20 veces con PBS durante una hora. Tras la tinción, el cubreobjetos se lavó con agua del grifo por su cara posterior y se secó al aire durante la noche.
Tras el secado al aire, la superficie posterior del cubreobjetos se pegó a una lámina ed vidrio (micro lámina de vidrio S2215 de Matsunami Glass Ind., Ltd.). Se tomaron fotografías en 9 puntos por un cubreobjetos con un microscopio óptico (ECLIPSE E200 de Nikon Corporation). Se contó el número de macrófagos, el número de SRBC fagocitados y el número de macrófagos fagocitadores que se observaron totalmente y se sumaron los respectivos números totales en 9 puntos. Se calculó un índice de ingestión multiplicando una proporción de macrófagos que habían fagocitado SBRC por el total de macrófagos contados por un número medio de ingestiones de un macrófago. Como referencia, la Fig. 1 es una fotografía después de la tinción de Giemsa, que muestra los estados de "macrófagos fagocitadores" y "SRBC fagocitados". Mediante la tinción de Giemsa, los macrófagos se observan como esferas púrpuras y los SRBC como esferas transparentes. El índice de ingestión se calculó sobre la base de que los SRBC en contacto con macrófagos se consideraron SRBC fagocitados y los macrófagos en contacto con SRBC se consideraron macrófagos fagocitadores.
Para cada una de las muestras, se calcularon dos o tres índices de ingestión en los respectivos cubreobjetos y se obtuvo una media de los mismos. Con respecto a un control, las operaciones correspondientes se llevaron a cabo del mismo modo que en el caso anterior, utilizando medios de cultivo RPMI en lugar de las muestras o muestras comparativas.
(Resultados)
Cada Muestra muestra los excelentes índices de ingestión en comparación con los del Control y las Muestras Comparativas.
<Actividad fagocítica de los macrófagos intestinales>
(Preparación de cada muestra)
Se preparó una muestra de leche diluyendo la leche bovina no tratada a 100 pg/ml con 100mM PBS (pH=7,0).
Se preparó una muestra de producto lácteo tratado con enzimas diluyendo el producto lácteo bovino tratado con enzimas a 100 ug/ml con 100mM PBS (pH=7,0).
(Preparación del medio)
A 17 ml de un cultivo RPMI se disolvieron 2 ml de colagenasa D (Roche, 11088858001) y 1 ml de DNasa I (Roche 11284932001), y se calentaron a 37°C para preparar un medio de colagenasa.
(Medición de la actividad fagocítica)
En una cavidad abdominal de un ratón hembra C57BL/6 (de 7 semanas de edad) se administraron 400 pl de hidrato de cloral (Sigma, A2374) para anestesiarlo. Se disecó el abdomen derecho del ratón para exponer el intestino y, tras la administración de cada muestra (1 mg/kg), se cerró el abdomen. Una hora después de la administración, se disecó de nuevo el abdomen para exponer el intestino, se administró una proteína OVA no marcada (SIGMA, A5503-1G) y una proteína OVA marcada con AF488 (Life Technologies, 034781), y se cerró el abdomen. Una hora después de la administración, se hizo que el ratón sufriera una dislocación cervical y se le extrajo el intestino. La grasa y el parche de Payer se extrajeron y limpiaron con PBS con cuidado de no lesionar el intestino extraído. El intestino se cortó en unos 2 cm y se vertió en 50 ml de una solución tampón FACS (preparada añadiendo 5 ml de FBS (inactivado) (disponible en GIBCO, 10437), 1 ml de EDTA (disponible en Nacalai Tesque, Inc, 15111-45, 500 mM), 1 ml de HEPES (disponible en MP, 1688449, 1M), 500 pl de piruvato sódico (disponible en GIMCO, 11360-070, 100 mM), 20 pl de sulfato de polimixina B (disponible en GIMCO, 21850-029, 25 mg/ml) y 500 pl de penicilina/estreptomicina (disponible en GIMCO, 15140-122, 10.000 U/ml) en 4198 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS que contiene 0,01 M de fosfato sódico, 0,9% de NaCl y 5 unidades/ml de heparina)) calentada a 37°C, seguida de 20 minutos de agitación (a unas 250 rpm) con un agitador en una incubadora a 37°C.
Tras la agitación, se extrajo el intestino y se lavó tres veces con 30 ml de PBS. El intestino se colocó en una placa de 10 cm de diámetro con un cultivo de FBS/RPMI al 10%. se pusieron 4 ml de un medio de colagenasa en la placa y se cortó el intestino. Además, se pusieron 11 ml de un medio de colagenasa en la placa y se dejó reposar. Las burbujas flotantes y las grasas se eliminaron con un aspirador. El tejido de un vial se transfirió a un matraz. Después de lavar el vial con 5 ml de un medio de colagenasa, se introdujo el líquido de lavado en el matraz. El matraz se colocó en una incubadora a 37°C y el contenido se sometió a agitación durante una hora. Tras la agitación, se añadieron 400 pl de EDTA 0,5 M (obtenido a partir de PBS con un pH de 8,0) y se agitó durante 5 minutos más. Tras la agitación, se transfirió el sobrenadante a un tubo tapado con un colador celular (FALCON, 352360) . Mientras tanto, se añadieron al tejido 10 ml de la solución tampón FACS calentada a 37°C, y se sometió a suspensión. Se pasó toda la suspensión por el colador celular y se exprimieron los restos que quedaban en la parte superior del colador. La suspensión se sometió a 10 minutos de centrifugación a 20°C a 1.800 rpm. Tras el centrifugado, se eliminó el sobrenadante y se dispersó el tejido. El tejido se sometió a suspensión con 10 ml de percoll al 40%, se transfirió la suspensión al tubo y se introdujeron 5 ml de percoll al 75% en el fondo del tubo con un capilar, tras lo cual se centrifugó el tubo durante 20 minutos a 20°C a 2.000 rpm. Tras el centrifugado, se extrajeron con un aspirador unos 7 ml del 40% de percoll de la parte superior del tubo. Después de la extracción, se añadieron unos 6 ml de la solución tampón FACS al tubo que contenía 5 ml de la solución tampón FACS, y además se añadió el percoll al 40%, de modo que la cantidad total de la solución tampón FACS llegó a 14 ml, seguido de 10 minutos de centrifugación del tubo a 20°C a 1.800 rpm. Tras el centrifugado, se eliminó el sobrenadante y se introdujeron 2 ml de la solución tampón FACS en el tubo para la suspensión, y 1 ml de la solución se transfirió a otro tubo, seguido de un centrifugado de 3 minutos del tubo a 20°C a 1.500 rpm.
Tras el centrifugado, se eliminó el sobrenadante y se añadieron al tubo 2 ml de la solución tampón FACS, y a continuación se añadieron el anticuerpo Pacific® anti-ratón F4/80 (Biolegend, 123124), el anticuerpo PE/cy7 antiratón/humano CD11b (Biolegend, 101216) y el anticuerpo CD16/32 (BD, 553141), seguido de una reacción a 4°C. Quince minutos después, se eliminó el sobrenadante y se añadieron 2 ml de tampón de lavado, tras lo cual se centrifugó durante 3 minutos a 20°C a 1.500 rpm. Tras el centrifugado, se añadieron 200 pl de una solución de 1 pg/ml de 7-aminoactinomicina D (Sigma, A9400) y se determinó la actividad fagocitótica de los macrófagos intestinales.
(Resultados)
En el producto lácteo tratado con enzimas, la actividad fagocítica de los macrófagos positivos a la ovoalbúmina (OVA) en un intestino aumentó más en comparación con la leche no tratada con enzimas.
2. Preparación del producto lácteo tratado con enzimas (2)
Cada una de las muestras con concentraciones proteicas de 10 ng/10 |jl (Muestra 2-1) y 100 ng/10 |jl (Muestra 2-2), respectivamente, se preparó tratándola de la misma manera que en la "Preparación del producto lácteo tratado con enzimas (1)", excepto que no se utilizó sialidasa.
<Actividad fagocítica de macrófagos (2)> (Actividad fagocítica de macrófagos intraabdominales de ratón mediante el uso de SRBC opsonizados)
Los índices de ingestión se obtuvieron de la misma manera que en "Actividad Fagocitótica de los Macrófagos (1)" utilizando las muestras anteriores, y como resultados, cada Muestra muestra muestra los excelentes índices de ingestión en comparación con la de Control.
3. Preparación del producto lácteo tratado con enzimas (3)
Se disuelve 1 g de leche bovina (sólida) en 100 ml de SPB 50mM (se disolvieron 15,601 g de NaH2PO4-2H2O y 35,814 g de Na2HPO4-12H2O en 500 ml de agua destilada para preparar SPB 200mM (pH 7,0), seguido de dilución en SPB 50mM) agitando para preparar una solución al 1%. La solución se somete a centrifugación a 8000 rpm y 4°C durante 1 hora. El sobrenadante se somete a filtración a través de una membrana G2 y de membranas de 8 jm , 5 jm , 1,2 jm y 0,2 jm (MILLIPORE, filtros de nitrocelulosa) en este orden. El filtrado se somete a diálisis a través de una membrana de fibra hueca (Asahi Kasei Chemicals Corporation, módulo tipo lápiz SEP-0013).
Se añade p-galactosidasa (N° de catálogo 072-04141 disponible en Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) inmovilizada con una resina de formilo (TOYOPEARL, AF-Formy-650M) en una cantidad de 1 U por miligramo de leche, seguida de una incubación de 1 hora a 37°C. Tras la incubación, la solución de reacción se filtra a través de una membrana G2 para eliminar la enzima inmovilizada en la solución de reacción. El filtrado se somete a filtración a través de un filtro de 0,2 jm . La concentración de proteínas del filtrado tras la filtración se determina a partir de una absorbancia a una longitud de onda de 570 nm (utilizando una curva de calibración realizada con respecto a la BSA (albúmina sérica bovina, SIGMA, A4503)). De este modo se determina la cantidad de proteína recuperada a partir de 1 g de leche.
El filtrado después de la filtración anterior se congela rápidamente utilizando metanol frío y luego se deja reposar a -80°C para que se congele completamente. El producto resultante se seca al vacío para pulverizarlo y obtener así un producto lácteo tratado con enzimas (3). Una parte del mismo se reconstituye, y la concentración de proteínas del resultante se determina basándose en una absorbancia a una longitud de onda de 570 nm (utilizando una curva de calibración realizada con respecto a la BSA (albúmina sérica bovina, SIGMA, A4503)). De este modo se determina la cantidad de proteína de 1 g de leche.
Se preparó una cápsula entérica en la que la cantidad de proteína contenida se ajustó a 1,0 mg utilizando producto lácteo tratado con enzimas (3) según un procedimiento habitual. La cápsula entérica se administró a un sujeto dos veces al día, concretamente, por la mañana y por la noche.
(Síndrome de fatiga crónica)
Cuando se administra la cápsula a un paciente con síndrome de fatiga crónica durante cinco meses, la sensación de fatiga y la pérdida de motivación mejoran mucho.
(Enfermedades alérgicas causadas por al menos una alergia de tipo I)
Cuando la cápsula se administra a un paciente con dermatitis atópica durante tres meses, la condición de la piel se calma, y la hinchazón, el enrojecimiento y la picazón disminuyen, lo que resulta en una piel suave y tersa. Cuando se administra la cápsula a un paciente con fiebre del heno durante un mes, mejora el picor de ojos y desaparecen síntomas como la mucosidad nasal y los estornudos.
(Alopecia)
Cuando se administra la cápsula a un paciente con alopecia areata durante un mes, salen nuevos cabellos.
(Manchas, pecas o arrugas)
Cuando se administra la cápsula a un paciente que tiene manchas, pecas o arrugas, las manchas y pecas se atenúan y la piel se alisa. Además, la textura de la piel se vuelve fina.
4. Preparación del producto lácteo tratado con enzimas (4)
Una leche cruda de ingredientes desquesados obtenida a través del procesamiento de desquesado. (suero disponible en el centro lácteo Zao) se sometió a centrifugación a 8000 rpm y 4°C durante 1 hora, y el sobrenadante se recuperó con cuidado sobre el precipitado. Se le añadió agua destilada (de grado Mill-Q; en lo sucesivo se utilizó agua destilada del mismo grado a menos que se indique lo contrario) en la misma cantidad que la del sobrenadante recuperado, y el resultante se sometió a diálisis a través de una membrana UF de módulo tipo lápiz (Funakoshi Co., Ltd., AIP-0013D).
En este momento, se continuó la diálisis hasta que la cantidad de filtrado alcanzó la cantidad igual a la de agua destilada añadida, obteniéndose así un ingrediente lácteo desquesado (suero). La concentración de proteínas se determinó a partir de una absorbancia a una longitud de onda de 570 nm (utilizando una curva de calibración realizada con respecto a la BSA (albúmina sérica bovina, SIGMA, A4503)).
La leche de ingredientes desquesados obtenida anteriormente se dosificó de modo que la cantidad de proteína fuera de 6 g, y se añadió p-galactosidasa (disponible en Oriental Yeast Co., ltd.; derivada de E. coli) inmovilizada con una resina de formilo (TOYOPEARL, Formy-650M) a la leche de ingredientes desquesados en una cantidad de 4 g/ 6000 U, seguida de una incubación de 1 hora a 37°C. Tras la incubación, la solución de reacción se filtró a través de un filtro de vidrio para separar la resina de formilo. La resina de formilo se lavó con agua destilada y se almacenó para su uso repetido. El filtrado se esterilizó por filtración con LABO DISC (Advantec Toyo Kaisha, Ltd.; 50CP020AS). El filtrado esterilizado se liofilizó para pulverizarlo y obtener así el producto lácteo tratado con enzimas (4) en forma de polvo conservable.
<Actividad fagocítica de macrófagos (3)> (Actividad fagocítica de macrófagos intraabdominales de ratón mediante el uso de SRBC opsonizados)
Cada una de las muestras con concentraciones proteicas de 10 ng/10 pl (Muestra 4-1) y 100 ng/10 pl (Muestra 4-2), respectivamente, se preparó utilizando el producto lácteo en polvo tratado con enzimas obtenido anteriormente. Cada una de las muestras comparativas con concentraciones de proteína de 10 ng/10 pl (Muestra comparativa 4-1) y 100 ng/10 pl (Muestra comparativa 4-2), respectivamente, se preparó a partir de la leche de ingrediente desquesado antes del tratamiento con enzimas, diluyendo con 100 mM PBS, si fuera necesario.
Además, se preparó una muestra con LPS (Lipopolisacárido, de Escherichia coli, SIGMA, L2755) de 1 pg/10 pl como control positivo.
La concentración de proteínas se determinó a partir de una absorbancia a una longitud de onda de 570 nm (utilizando una curva de calibración realizada con respecto a la BSA (albúmina de suero bovino, SIGMA, A4503)).
Los índices de ingestión se obtuvieron de la misma manera que en "Actividad fagocítica de los macrófagos (1)" utilizando las muestras anteriores (n=3). Los resultados figuran en la Tabla 1.
El producto lácteo tratado con enzimas aumentó más la actividad fagocítica de los macrófagos intraabdominales de ratón en comparación con la leche no tratada.
TABLA 1
Figure imgf000012_0001
5. Transferencia Western (1) para el producto lácteo tratado con enzimas (4) y el ingrediente lácteo des­ quesado. (Utilizando WAF como anticuerpo primario)
(Preparación de la muestra)
Como marcador se utilizó WIDE-VIEW TM Prestained Protein Size Marker III (disponible en Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 230-02461).
Se utilizó una leche de ingrediente desquesado diluida a 1 mg/ml con 100 mM PBS (pH=7,0) como leche de ingrediente desquesado.
Como producto lácteo tratado con enzimas se utilizó un producto lácteo diluido a 1 mg/ml con 100 mM PBS (pH=7,0).
Cada una de las muestras anteriores se diluyó a 1 pg/pl con agua destilada, y 5 pl de cada muestra se mezclaron con 5 pl de un tampón de muestra (preparado añadiendo 50 pl de 2-mercaptoetanol (disponible en SIGMA, A2029) a 950 pl de tampón de muestra Laemmli (disponible en BIO-RAD, 161-0737), seguido de un tratamiento térmico de 10 minutos a 100°C para obtener una muestra para electroforesis.
Se colocó un gel de electroforesis (XV PANTERA GEL, DRC, NXV-381D20) en una cámara de electroforesis (ERICA-MP, DRC, XVE-0MPC), y se llenó la cámara de electroforesis con un tampón de electroforesis (preparado disolviendo un tampón de electroforesis SDS-PAGE de alta velocidad (disponible en DRC, NXV-BUFPTG) con 1.000 ml de agua destilada). Cada una de las muestras para electroforesis se aplicó a cada pocillo de los geles establecidos, seguido de electroforesis a 300 V. Las cantidades de muestras aplicadas para la electroforesis fueron de 5 j l en un carril 1, 5 |jl en los carriles 2 y 5 j l en el carril 3. Una vez finalizada la electroforesis, se cortó la parte superior del gel y se colocó en un dispositivo de transferencia (MINICA-MP, DRC, XVE-0MPB). Se colocó sobre el gel una película de PVDF (BIO-RAD, 162-0177) sumergida durante un minuto en metanol (Kanto Chemical Industry Co., Ltd., 25183-2B), y la transferencia se realizó a 47 V durante 30 minutos.
Después de la transferencia, la película se lavó tres veces durante 10 minutos con TBS-T (preparado disolviendo 8,0 g de NaCl, 0,2 g de KCL y 3,0 g de H2NC(CH2OH)3 con 1.000 ml de agua destilada para ajustar el pH a 7,4 y añadiendo 1 ml de monolaurato de sorbitán polioxietilenado (20) (disponible en Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 167-11515)). La película se sumergió en una solución de bloqueo (preparada disolviendo 100 mg de BSA (albúmina de suero bovino, SIGMA, A4503) con 10 ml de TBS-T), seguida de una agitación de una hora a temperatura ambiente. La película se lavó tres veces durante 10 minutos con TBS-T y se sumergió en un anticuerpo primario WFA (5 j l ) [preparado a partir de 2 mg de lectina WFA (lectina de Wisteria floribunda, conjugado de biotina, polvo liofilizado, disponible en Funakoshi Co., Ltd., B-1355) diluido con 1 ml de SPB 100 mM (pH=7,0)) diluyendo con 10 ml de TBS-T], seguido de agitación durante una hora a temperatura ambiente. La película se lavó tres veces durante 10 minutos con TBS-T y se sumergió en anticuerpo secundario estreptavidina (preparado diluyendo 2 j l de estreptavidina (disponible en GE Healthcare, RPN-1231) con 10 ml de TBS-T), seguido de una hora de agitación a temperatura ambiente. La película se lavó tres veces durante 10 minutos con TBS-T.
La película se sometió a reacción con una solución ECL (preparada añadiendo 1 ml de un reactivo de detección 2 (ECL Reactivo de Detección de Transferencia Western , disponible en GE Healthcare, RPN2106V2) a 1 ml de un reactivo de detección 1 (ECL Reactivo de Detección de Transferencia Western, disponible en GE Healthcare, RPN2106V1)) durante un minuto en un recipiente de plástico, y se tomaron imágenes con LumiCube (Liponics, Inc, 5003). Una vez tomadas las imágenes, la película se lavó tres veces durante 10 minutos con TBS-T y se sumergió en un líquido colorante CBB (PAGE Blue 83, COSMO BIO CO., LTD., 423406) durante diez minutos, observándose bandas de proteínas (FIG. 2).
En la fig. 2, el peso molecular de las bandas positivas de WFA en la leche tratada con enzimas (4) se identificaron con 24,5 kDa, 26,8 kDa, 30,6 kDa, 34,8 kDa, 41,5 kDa, 51,7 kDa, 66,6 kDa, 80,2 kDa, y 84,8 kDa, respectivamente.
El WAF como anticuerpo primario es el anticuerpo que reconoce el GalNAc.
6. Transferencia Western (2) para la leche tratada con enzimas (4) y la leche de ingrediente desquesado. (Utilizando anticuerpo anti-proteína de unión a vitamina D como anticuerpo primario)
La Transferencia Western se realizó de la misma manera que se describe en la "transferencia Western (1)" anterior, utilizando anticuerpo contra la proteína de unión a la vitamina D [preparado a partir de 10 j l de anticuerpo contra la proteína de unión a la vitamina D (Bioss Co., bs-3915R) diluyendo con 10 ml de TBS-T] como anticuerpo primario, en lugar de WFA, y utilizando además IgG Anti-conejo [preparado a partir de 1 j l de IgG Anti-conejo (molécula entera) 1 ML (SIGMA, A6154-1 ML) diluyendo con 10 ml de t Bs -T], en lugar de estreptavidina.
Los resultados se muestran en la Fig. 3. En la fig. 3, el peso molecular de las bandas positivas en la leche tratada con enzimas (4) se identificó con 29,3 kDa, 31,9 kDa, 48,4 kDa, 57,8 kDa, 79,1 kDa y 96,2 kDa, respectivamente.
El Anticuerpo Anti-Proteína de Unión a la Vitamina D como anticuerpo primario es el anticuerpo que reconoce la proteína de unión a la vitamina D.
APLICABILIDAD INDUSTRIAL
Según la presente invención, es posible proporcionar un producto lácteo tratado con enzimas que es útil para el tratamiento, la prevención y la mejora de enfermedades tales como el cáncer y las enfermedades infecciosas, las enfermedades asociadas con la fatiga, las enfermedades alérgicas (particularmente causadas por la alergia de tipo I) y la alopecia, así como para la mejora de la piel, y un procedimiento de preparación del mismo.
Además, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden el producto lácteo tratado con enzimas, productos farmacéuticos y productos que los comprenden.
EXPLICACIÓN DE LOS SÍMBOLOS
1: Macrófago fagocitador
2: SRBC fagocitados
3: Macrófagos

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento de preparación de un producto lácteo tratado con enzimas que comprende una etapa de puesta en contacto de la leche con la p-galactosidasa, y una etapa de condensación, o desquesado de la leche, antes del tratamiento con enzimas.
2. El procedimiento de preparación según la reivindicación 1 comprende además una etapa de puesta en contacto de la leche con la sialidasa.
3. Producto lácteo tratado con enzimas obtenido por el procedimiento de preparación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.
4. Una composición farmacéutica que comprende el producto lácteo tratado con enzimas según la reivindicación 3.
5. Un producto medicinal que comprende la composición farmacéutica según la reivindicación 4.
6. Una composición para alimentos o bebidas que comprende el producto lácteo tratado con enzimas según la reivindicación 3.
7. Un alimento o bebida que comprende la composición para alimentos o bebidas según la reivindicación 6.
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