ES2968913T3 - Anticuerpos anti CD3, moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen a CD3 y a CD20 y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona anticuerpos que se unen a CD3 y métodos para utilizarlos. Según determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención se unen a CD3 humano con alta afinidad e inducen la proliferación de células T humanas. La invención incluye anticuerpos que se unen a CD3 e inducen la destrucción de células tumorales mediada por células T. Según determinadas realizaciones, la presente invención proporciona moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano y una segunda molécula de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 humano. En determinadas realizaciones, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención son capaces de inhibir el crecimiento de tumores de células B que expresan CD20. Los anticuerpos y las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención son útiles para el tratamiento de enfermedades y trastornos en los que se desea y/o terapéuticamente beneficiosa una respuesta inmune dirigida inducida o regulada positivamente. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención son útiles para el tratamiento de diversos cánceres así como otras enfermedades y trastornos relacionados con CD20. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti CD3, moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen a CD3 y a CD20 y usos de los mismos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen a CD3 y CD20, y métodos de uso de las mismas.

Antecedentes

CD3 es un antígeno homodimérico o heterodimérico expresado en los linfocitos T en asociación con el complejo receptor de linfocitos T (TCR, por sus siglas en inglés) y es necesario para la activación de los linfocitos T. El CD3 funcional se forma a partir de la asociación dimérica de dos de cuatro cadenas diferentes: épsilon, zeta, delta y gamma. Las disposiciones diméricas de CD3 incluyen gamma/épsilon, delta/épsilon y zeta/zeta. Los anticuerpos contra CD3 han mostrado agrupar CD3 sobre los linfocitos T, produciendo así la activación de los linfocitos T de una manera similar a la participación de los TCR por las moléculas MHC cargadas de péptidos. Por lo tanto, se han propuesto anticuerpos anti CD3 con fines terapéuticos que implican la activación de linfocitos T. Adicionalmente, se han propuesto anticuerpos biespecíficos con capacidad de unión a CD3 y a un antígeno diana para usos terapéuticos que implican el direccionamiento de las respuestas inmunitarias de los linfocitos T a tejidos y células que expresan el antígeno diana.

CD20 es una fosfoproteína no glucosilada expresada en las membranas celulares de los linfocitos B maduros. CD20 se considera un antígeno asociado a tumores de linfocitos B porque se expresa en más del 95 % de los linfomas no Hodgkin (NHL, por sus siglas en inglés) de linfocitos B y otras neoplasias malignas de linfocitos B, pero está ausente en los linfocitos B precursores, las células dendríticas y las células plasmáticas. Se conocen en la técnica métodos para tratar el cáncer dirigiéndose a CD20. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal anti CD20 quimérico rituximab se ha usado o sugerido para su uso en el tratamiento de cánceres tales como NHL, leucemia linfocítica crónica (CLL, por sus siglas en inglés) y linfoma linfocítico pequeño (SLL, por sus siglas en inglés). Se cree que CD20 destruye las células tumorales que expresan CD20 mediante citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés) y/o inducción de apoptosis y sensibilización a la quimioterapia. Aunque las estrategias dirigidas a tumores anti CD20 se han mostrado muy prometedoras en entornos clínicos, no todos los pacientes responden a la terapia anti CD20, y se ha demostrado que algunos pacientes desarrollan resistencia o muestran respuestas incompletas a la terapia anti CD20 (por ejemplo, resistencia a rituximab).

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen tanto a CD3 como a un antígeno diana (tal como CD20) serían útiles en entornos terapéuticos en los que se desea un direccionamiento específico y una destrucción mediada por linfocitos T de células que expresan el antígeno diana.

El documento WO 2007/093630, el documento US 2010/331527, el documento WO 2005/040220 y el documento WO 2011/090762 describen cada uno moléculas de unión a antígeno multiespecíficas que se unen a, entre otros, CD3 y CD20.

Breve sumario de la invención

La presente invención proporciona moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen a CD3 y CD20. En el presente documento tales moléculas de unión a antígeno biespecíficas también se denominan "moléculas biespecíficas anti CD3/anti CD20". La parte anti CD20 de la molécula biespecífica anti CD3/anti CD20 es útil para dirigirse a las células tumorales que expresan CD20 (por ejemplo, tumores de linfocitos B), y la parte anti CD3 de la molécula biespecífica es útil para activar linfocitos T. La unión simultánea de CD20 en una célula tumoral y CD3 en un linfocito T facilita la destrucción dirigida (lisis celular) de la célula tumoral diana por parte del linfocito T activado. Por lo tanto, las moléculas biespecíficas anti CD3/anti CD20 de la invención son útiles, entre otras cosas, para tratar enfermedades y trastornos relacionados o causados por tumores que expresan CD20 (por ejemplo linfomas).

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano, y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20. Cada dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) emparejada con una región variable de cadena ligera (LCVR). En determinadas realizaciones de la invención, el dominio de unión a antígeno anti CD3 y el dominio de unión a antígeno anti CD20 comprenden cada uno HCVR diferentes y emparejados con una LCVR común. Por ejemplo, como se ilustra en el ejemplo 7 del presente documento, se construyeron anticuerpos biespecíficos que comprendían un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3, en donde el primer dominio de unión a antígeno comprende un par HCVR/LCVR derivado de un anticuerpo anti CD3; y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20, en donde el segundo dominio de unión a antígeno comprende una HCVR derivada de un anticuerpo anti CD20 emparejado con una LCVR derivada de un anticuerpo anti CD3 (por ejemplo, la misma LCVR que está incluida en el dominio de unión a antígeno anti CD3). En otras palabras, en las moléculas ilustrativas desveladas en el presente documento, el emparejamiento de una HCVR de un anticuerpo anti CD20 con una LCVR de un anticuerpo anti CD3 crea un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 (pero no se une a CD3). En dichas realizaciones, el primer y segundo dominios de unión a antígeno comprenden HCVR anti CD3 y anti CD20 distintas pero comparten una LCVR anti CD3 común.

Las moléculas biespecíficas anti CD3/anti CD20 de la invención comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3, en donde el primer dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende regiones determinantes de la complementariedad A1-HCDR1, A1-HCDR2 y A1-HCDR3 y una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende regiones determinantes de la complementariedad A1-LCDR1, A1-LCDR2 y A1-LCDR3, en donde las regiones determinantes de la complementariedad están contenidas dentro de un par HCVR/LCVR que comprende las secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEQ ID NO: 1250/1258, 1266/1274 o 1282/1290. La molécula de unión a antígeno biespecífica induce la proliferación de células mononucleares de sangre periférica de ser humano y de macaco cangrejeroin vitro.

Los métodos y técnicas para identificar CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR son bien conocidos en la técnica y pueden usarse para identificar CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y/o LCVR especificadas desveladas en el presente documento. Las convenciones ilustrativas que pueden usarse para identificar los límites de las CDR incluyen, por ejemplo, la definición de Kabat, la definición de Chotia y la definición de AbM. En términos generales, la definición de Kabat se basa en la variabilidad de secuencia, la definición de Chotia se basa en la ubicación de las regiones de bucle estructural y la definición de AbM es un compromiso entre los enfoques de Kabat y Chotia. Véanse, por ejemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); y Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). También hay disponibles bases de datos públicas para identificar secuencias de CDR dentro de un anticuerpo.

De acuerdo con determinadas realizaciones, la presente invención proporciona moléculas biespecíficas anti CD3/anti CD20, en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1250, 1266 y 1282 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia, incluyendo las CDR como se expone anteriormente.

La presente invención también proporciona moléculas biespecíficas anti CD3/anti CD20, en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1258, 1274 y 1290, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia, incluyendo las CDR como se expone anteriormente.

La presente divulgación también proporciona moléculas biespecíficas anti CD3/anti CD20, en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1250/1258, 1266/1274 y 1282/1290.

Determinadas moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti CD3/anti CD20 ilustrativas no limitantes de la invención incluyen un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 que comprende dominios HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectivamente, que tienen las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1252-1254-1256-1260-1262-1264 (por ejemplo, BS3/20-001); 1268-1270 1272-1276-1278-1280 (por ejemplo, BS3/20-002); y 1284-1286-1288-1292-1294-1296 (por ejemplo, BS3/20-003)

La presente invención también proporciona moléculas biespecíficas anti CD3/anti CD20, en donde el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1242, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.

La presente invención también proporciona moléculas biespecíficas anti CD3/anti CD20, en donde el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1258, 1274, 1290, 1306, 1322 y 1333, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.

La presente invención también proporciona moléculas biespecíficas anti CD3/anti CD20, en donde el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1242/1258, 1242/1274, 1242/1290, 1242/1306, 1242/1322 y 1242/1333.

La presente invención también proporciona moléculas biespecíficas anti CD3/anti CD20, en donde el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 comprende un dominio CDR3 de cadena pesada (HCDR3) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1248, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio CDR3 de cadena ligera (LCDR3) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1264, 1280, 1296, 1312, 1328 y 1336, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.

En determinadas realizaciones, el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1248/1264, 1248/1280, 1248/1296, 1248/1312, 1248/1328 y 1248/1336.

La presente invención también proporciona moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti CD3/anti CD20, en donde el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 comprende un dominio CDR1 de cadena pesada (HCDR1) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1244, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio CDR2 de cadena pesada (HCDR2) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1246, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio CDR1 de cadena ligera (LCDR1) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1260, 1276, 1292, 1308, 1324 y 1334, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio CDR2 de cadena ligera (LCDR2) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1262, 1278, 1294, 1310, 1326 y 1335, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.

Determinadas moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti CD3/anti CD20 ilustrativas no limitantes de la invención incluyen un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 que comprende dominios HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectivamente, que tienen las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1244-1246-1248-1260-1262-1264 (por ejemplo, BS3/20-001); 1244-1246-1248-1276-1278-1280 (por ejemplo, BS3/20-002); 1244-1246-1248-1292-1294-1296 (por ejemplo, BS3/20-003); 1244-1246-1248-1308-1310-1312 (por ejemplo, BS3/20-004); 1244-1246-1248-1324-1326-1328 (por ejemplo, BS3-20-005); y 1244-1246-1248-1334-1335-1336 (por ejemplo, BS3/20-007).

En una realización relacionada, la invención incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti CD3/anti CD20, en donde el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 comprende los dominios CDR de cadena pesada y ligera contenidos en las secuencias de región variable de cadena pesada y ligera (HCVR/LCVR) seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1242/1258, 1242/1274, 1242/1290, 1242/1306, 1242/1322 y 1242/1333.

Se describen en el presente documento moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de HCVR, LCVR o CDR de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti CD3/anti CD20 desveladas en el presente documento, incluyendo moléculas de ácido nucleico que comprenden las secuencias de polinucleótidos como se expone en las tablas 20 y 21 en el presente documento, así como moléculas de ácido nucleico que comprenden dos o más de las secuencias de polinucleótidos como se expone en las tablas 20 y 21 en cualquier combinación o disposición funcional de las mismas. Los vectores de expresión recombinante portadores de los ácidos nucleicos y las células hospedadoras en las que se han introducido dichos vectores, también se describen, así como los métodos para producir los anticuerpos mediante el cultivo de las células hospedadoras en condiciones que permitan la producción de los anticuerpos y la recuperación de los anticuerpos producidos.

La presente invención incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti CD3/anti CD20 en donde cualquiera de los dominios de unión a antígeno mencionados anteriormente que se unen específicamente a CD3 se combina, se conecta o se asocia con cualquiera de los dominios de unión a antígeno mencionados anteriormente que se unen específicamente a CD20 para formar una molécula de unión a antígeno biespecífica que se une a CD3 y CD20.

La presente invención incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti CD3/anti CD20 que tienen un patrón de glucosilación modificado. En algunas aplicaciones, puede ser útil la modificación para eliminar sitios de glucosilación no deseables, o un anticuerpo que carezca de un resto de fucosa presente en la cadena de oligosacárido, por ejemplo, para aumentar la función de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (véase Shieldet al.(2002) JBC 277:26733). En otras aplicaciones, puede hacerse una modificación de la galactosilación para modificar la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión a antígeno biespecífica anti CD3/anti CD20 como se desvela anteriormente y un portador farmacéuticamente aceptable. En un aspecto relacionado, la divulgación presenta una composición que es una combinación de una molécula de unión a antígeno biespecífica anti CD3/anti CD20 y un segundo agente terapéutico. En un caso, el segundo agente terapéutico es cualquier agente que se combine ventajosamente con una molécula de unión a antígeno biespecífica anti CD3/anti CD20. Los agentes ilustrativos que pueden combinarse ventajosamente con una molécula de unión a antígeno biespecífica anti CD3/anti CD20 se analizan en detalle en otras partes del presente documento.

En otro aspecto más, la invención proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica o la composición farmacéutica como se describe anteriormente para su uso en el tratamiento de un cáncer de linfocitos B en un sujeto. También se describen en el presente documento métodos terapéuticos para dirigirse a/destruir células tumorales que expresan CD20 usando una molécula de unión a antígeno biespecífica anti CD3/anti CD20 de la invención, en donde los métodos terapéuticos comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión a antígeno biespecífica anti CD3/anti CD20 de la invención a un sujeto que lo necesite. Sin embargo, los métodos terapéuticos no son en sí mismos parte de la invención reivindicada.

La presente divulgación también incluye el uso de una molécula de unión a antígeno biespecífica anti CD3/anti CD20 de la divulgación en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado o causado por la expresión de CD20.

Otros ejemplos resultarán evidentes al revisar la descripción detallada que figura a continuación.

Breve descripción de las figuras

Lafigura 1muestra el volumen tumoral (en mm3) en el tiempo en ratones NOD/SCID implantados por vía subcutánea con una mezcla de células tumorales Raji y PBMC después del implante del tumor y el tratamiento, comenzando el día del implante del tumor, con Fc humano (hFc, línea continua) o anticuerpo biespecífico CD3xCD20 (BS3/20-007, línea discontinua).

Lafigura 2muestra el volumen tumoral (en mm3) en el tiempo en ratones NOD/SCID implantados por vía subcutánea con una mezcla de células tumorales Raji y PBMC después del implante del tumor y el tratamiento, comenzando 7 días después del implante del tumor, con Fc humano (hFc, línea continua) o anticuerpo biespecífico CD3xCD20 (BS3/20-007, línea discontinua).

Lafigura 3muestra un gráfico del número de linfocitos B (x1000/pl) en el tiempo en muestras de sangre de macacos cangrejeros tratados con tres dosis diferentes de anticuerpo biespecífico BS3/20-001 (0,01, 0,1 o 1.0 mg/kg); anticuerpo de control anti CD20 en dosis baja (Control V, 0,01 mg/kg); o anticuerpo de control anti CD20 en dosis alta (Control III (1,0 mg/kg).

Lafigura 4muestra un gráfico del número de linfocitos T (x1000/pl) en el tiempo en muestras de sangre de macacos cangrejeros tratados con tres dosis diferentes de anticuerpo biespecífico BS3/20-001 (0,01, 0,1 o 1.0 mg/kg); anticuerpo de control anti CD20 en dosis baja (Control V, 0,01 mg/kg); o anticuerpo de control anti CD20 en dosis alta (Control III (1,0 mg/kg).

Las figuras 5A, 5B, 5Cy5Dmuestran los niveles previos y posteriores a la dosis (pg/ml) de IFN-gamma, IL-2, IL-6 y TNF-alfa, respectivamente, para macacos cangrejeros tratados con una sola dosis de BS3/20-001 (0,01, 0,1 o 1.0 mg/kg), anticuerpo de control anti CD20 en dosis baja (0,01 mg/kg de Control V) o anticuerpo de control anti CD20 en dosis alta (1,0 mg/kg de Control III).

Lafigura 6muestra el perfil de expresión de CD20 (expresado en términos de factor de cambio Log2 en la expresión) determinado a partir de muestras de sangre tomadas en diversos puntos temporales de macacos cangrejeros tratados con 0,01 mg/kg de Control V (anticuerpo anti CD20); 1,0 mg/kg de Control III (anticuerpo anti CD20); y 0,01 mg/kg, 0,1 mg/kg y 1,0 mg/kg de BS3/20-001 (anticuerpo biespecífico anti CD3xCD20).

Lafigura 7muestra la concentración sérica total (pg/ml) del anticuerpo biespecífico CD3xCD20 (BS3/20-001) en el tiempo en muestras de sangre de macacos cangrejeros tratados con 1,0 mg/kg (triángulos de color blanco), 0,1 mg/kg (cuadrados de color blanco) o 0,01 mg/kg (rombos de color blanco) de anticuerpo biespecífico CD3xCD20.

Descripción detallada

La información técnica que se expone más adelante puede, en algunos aspectos, ir más allá de la divulgación de la invención reivindicada, que se define de manera exclusiva por las reivindicaciones adjuntas. La información técnica adicional se proporciona para situar la invención reivindicada en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados. Dicha información técnica adicional que no se encuentre dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, no forma parte de la invención reivindicada. Antes de describir la presente divulgación, debe entenderse que la presente divulgación no se limita a métodos ni condiciones experimentales particulares descritos, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También se ha de entender que la terminología usada en el presente documento es para los fines de describir casos particulares únicamente y no pretende ser limitante, dado que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente un experto en la técnica a la que pertenece la presente divulgación. Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente", cuando se usa en referencia a un valor numérico indicado particular, significa que el valor puede variar con respecto al valor indicado en no más de un 1 %. Por ejemplo, como se usa en el presente documento, la expresión "aproximadamente 100" incluye 99 y 101 y todos los valores intermedios (por ejemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.).

Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a aquellos descritos en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente divulgación, a continuación se describen los métodos y materiales preferidos.

Definiciones

La expresión "CD3", como se usa en el presente documento, se refiere a un antígeno que se expresa en linfocitos T como parte del receptor multimolecular de linfocitos T (TCR) y que consiste en un homodímero o heterodímero formado a partir de la asociación de dos de las cuatro cadenas receptoras: CD3-épsilon, CD3-delta, CD3-zeta y CD3-gamma. CD3-épsilon humano comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO:1370; CD3-delta humano comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la s Eq ID NO:1371. Todas las referencias a proteínas, polipéptidos y fragmentos de proteína en el presente documento pretenden referirse a la versión humana de la proteína, polipéptido o fragmento de proteína respectiva a menos que se especifique explícitamente como de una especie no humana. Por lo tanto, la expresión "CD3" significa CD3 humano a menos que se especifique que proviene de una especie no humana, por ejemplo, "CD3 de ratón", "CD3 de mono", etc.

Como se usa en el presente documento, "un anticuerpo que se une a CD3" o un "anticuerpo anti CD3" incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que reconocen específicamente una subunidad<c>D3 única (por ejemplo, épsilon, delta, gamma o zeta), así como anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que reconocen específicamente un complejo dimérico de dos subunidades CD3 (por ejemplo, dímeros de CD3 gamma/épsilon, delta/épsilon y zeta/zeta). Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de la presente divulgación pueden unirse a CD3 soluble y/o CD3 expresado en la superficie celular. CD3 soluble incluye proteínas CD3 naturales, así como variantes de proteínas CD3 recombinantes como, por ejemplo, construcciones CD3 monoméricas y diméricas, que carecen de un dominio transmembrana o que no están asociadas con una membrana celular.

Como se usa en el presente documento, la expresión "CD3 expresado en la superficie celular" significa una o más proteínas CD3 que se expresan en la superficie de una célulain vitrooin vivo,de modo que al menos una parte de una proteína<c>D3 está expuesta al lado extracelular de la membrana celular y es accesible a una parte de unión a antígeno de un anticuerpo. "CD3 expresado en la superficie celular" incluye proteínas CD3 contenidas dentro del contexto de un receptor de linfocitos T funcional en la membrana de una célula. La expresión "CD3 expresada en la superficie celular" incluye la proteína CD3 expresada como parte de un homodímero o un heterodímero en la superficie de una célula (por ejemplo, dímeros de CD3 gamma/épsilon, delta/épsilon y zeta/zeta). La expresión, "CD3 expresado en la superficie celular" también incluye una cadena de CD3 (por ejemplo, CD3-épsilon, CD3-delta o CD3-gamma) que se expresa por sí misma, sin otros tipos de cadenas de CD3, en la superficie de una célula. Un "CD3 expresado en la superficie celular" puede comprender o consistir en una proteína CD3 expresada en la superficie de una célula que normalmente expresa la proteína CD3. Como alternativa, "CD3 expresado en la superficie celular" puede comprender o consistir en una proteína CD3 expresada en la superficie de una célula que normalmente no expresa CD3 humana en su superficie pero que se ha manipulado de manera artificial para expresar CD3 en su superficie.

Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo anti CD3" incluye tanto anticuerpos monovalentes con una sola especificidad, así como anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer brazo que se une a CD3 y un segundo brazo que se une a un segundo antígeno (diana), en donde el brazo anti CD3 comprende cualquiera de las secuencias de HCVR/LCVR o CDR como se expone en tabla 1 o las tablas 18/19 en el presente documento. Se describen en otras partes del presente documento ejemplos de anticuerpos biespecíficos anti CD3. La expresión "molécula de unión a antígeno" incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos.

El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, significa cualquier molécula de unión a antígeno o complejo molecular que comprende al menos una región determinante de complementariedad (CDR) que se une específicamente a o interacciona con un antígeno particular (por ejemplo, CD3). El término "anticuerpo" incluye moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, así como multímeros de las mismas (por ejemplo, IgM). Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como HCVR o V<h>) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, C<h>1, C<h>2 y C<h>3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como LCVR o V<l>) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio (Ci_1). Las regiones V<h>y V<l>pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada V<h>y V<l>está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. En diferentes casos de la divulgación, las FR del anticuerpo anti CD3 (o porción de unión a antígeno del mismo) pueden ser idénticas a las secuencias de la línea germinal humana o pueden estar modificadas de forma natural o artificial. Una secuencia de aminoácidos consenso puede definirse basándose en un análisis en paralelo de dos o más CDR.

El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, también incluye fragmentos de unión a antígeno de moléculas de anticuerpo completas. Las expresiones "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo y similares, como se usan en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína de origen natural, obtenible enzimáticamente, sintética o genomanipulada que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Pueden obtenerse fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo, por ejemplo, a partir de moléculas de anticuerpo completas, mediante cualquier técnica convencional adecuada tal como digestión proteolítica o técnicas recombinantes de ingeniería genética que implican la manipulación y expresión de ADN que codifica los dominios variables y, opcionalmente, los constantes, de un anticuerpo. Dicho ADN se conoce y/o se puede adquirir fácilmente en, por ejemplo, fuentes comerciales, bibliotecas de ADN (incluyendo, por ejemplo, fagotecas de anticuerpos) o puede sintetizarse. El ADN puede secuenciarse y manipularse químicamente o mediante técnicas de biología molecular, por ejemplo, para disponer uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, crear residuos de cisteína, modificar, añadir o eliminar aminoácidos, etc.

Los ejemplos no limitantes de fragmentos de unión a antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv monocatenarias (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimo que consisten en los residuos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (por ejemplo, una región determinante de complementariedad (CDR) aislada, tal como un péptido CDR3) o un péptido FR3-CDR3-FR4 restringido. Otras moléculas manipuladas, tales como anticuerpos específicos de dominio, anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos de dominio eliminado, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (por ejemplo, nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), agentes inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP, por sus siglas en inglés) y dominios IgNAR variables de tiburón, también se incluyen dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno", como se usa en el presente documento.

Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo típicamente comprenderá al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y generalmente comprenderá al menos una CDR que está adyacente a o en fase con una o más secuencias marco. En fragmentos de unión a antígeno que tienen un dominio V<h>asociado con un dominio V<l>, los dominios V<h>y V<l>pueden situarse uno con respecto al otro en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener los dímeros V<h>-V<h>, V<h>-V<l>o V<l>-V<l>. Como alternativa, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio V<h>o V<l>monomérico.

En determinados casos, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable unido covalentemente al menos a un dominio constante. Las configuraciones no limitantes, ilustrativas, de dominios variables y constantes que pueden encontrarse dentro de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente divulgación incluyen: (i) V<h>-C<h>1; (ii) V<h>-C<h>2; (iii) V<h>-C<h>3; (iv) V<h>-C<h>1-C<h>2; (v) V<h>-C<h>1-C<h>2-C<h>3; (vi) V<h>-C<h>2-C<h>3; (vii) V<h>-C<l>; (viii) V<l>-C<h>1; (ix) V<l>-C<h>2; (x) V<l>-C<h>3; (xi) V<l>-C<h>1-C<h>2; (xii) V<l>-C<h>1-C<h>2-C<h>3; (xiii) V<l>-C<h>2-C<h>3; y (xiv) V<l>-C<l>. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, incluyendo cualquiera de las configuraciones ilustrativas enumeradas anteriormente, los dominios variables y constantes pueden estar unidos directamente entre sí o pueden estar unidos mediante una región bisagra o enlazadora completa o parcial. Una región bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos que dan como resultado una unión flexible o semiflexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una única molécula polipeptídica. Además, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un homodímero o heterodímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominio variable y constante enumeradas anteriormente en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios VH o V<l>monoméricos (por ejemplo, mediante uno o más enlaces disulfuro).

Como ocurre con las moléculas de anticuerpo completas, los fragmentos de unión a antígeno pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos). Un fragmento de unión a antígeno multiespecífico de un anticuerpo típicamente comprenderá al menos dos dominios variables diferentes, en donde cada dominio variable es capaz de unirse específicamente a un antígeno diferente o a un epítopo distinto en el mismo antígeno. Cualquier formato de anticuerpo multiespecífico, incluyendo los formatos de anticuerpo biespecífico ilustrativos que se desvelan en el presente documento, puede adaptarse para su uso en el contexto de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente divulgación mediante técnicas habituales disponibles en la técnica.

Los anticuerpos de la presente divulgación pueden actuar mediante citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (CCDA). "Citotoxicidad dependiente del complemento" (CDC) se refiere a la lisis de células que expresan antígeno por un anticuerpo de la divulgación en presencia del complemento. "Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" (ADCC) se refiere a una reacción mediada por células en la que las células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fc (FcR) (por ejemplo, linfocitos citolíticos naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido en una célula diana y de ese modo da lugar a la lisis de la célula diana. La CDC y la ADCC se pueden medir usando ensayos que se conocen bien y están disponibles en la técnica. (Véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 5.500.362 y 5.821.337, y Clyneset al.(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656). La región constante de un anticuerpo es importante en la capacidad de un anticuerpo de fijar el complemento y mediar la citotoxicidad dependiente de células. Por lo tanto, el isotipo de un anticuerpo puede seleccionarse basándose en si se desea que el anticuerpo medie la citotoxicidad.

En determinados casos de la divulgación, los anticuerpos anti CD3 de la divulgación (monoespecíficos o biespecíficos) son anticuerpos humanos. La expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la divulgación pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por las secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitioin vitroo por mutación somáticain vivo),por ejemplo, en las CDR y en particular CDR3. Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que secuencias de CDR procedentes de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se han injertado en secuencias marco humanas.

Los anticuerpos de la divulgación pueden, en algunos casos, ser anticuerpos humanos recombinantes. La expresión "anticuerpo humano recombinante", como se usa en el presente documento, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante introducido por transfección en una célula hospedadora (que se describe en más detalle a continuación), anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatorios y recombinante (que se describe con más detalle posteriormente), anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Tayloret al.(1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. En determinados casos, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes están sujetos a mutagénesisin vitro(o, cuando se usa un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somáticain vivo)y, por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones V<h>y V<l>de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque proceden de, y están relacionadas con, secuencias de V<h>y V<l>de la línea germinal humana, no pueden existir de forma natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanosin vivo.

Los anticuerpos humanos pueden existir en dos formas que se asocian a la heterogeneidad de bisagra. En una forma, una molécula de inmunoglobulina comprende una construcción de cuatro cadenas estable de aproximadamente 150 160 kDa en la que los dímeros se mantienen juntos mediante un enlace disulfuro intercatenario de cadena pesada. En una segunda forma, los dímeros no están unidos a través de enlaces disulfuro intercatenarios y se forma una molécula de aproximadamente 75-80 kDa compuesta por una cadena ligera y pesada acopladas covalentemente (semianticuerpo). Estas formas han sido extremadamente difíciles de separar, incluso después de la purificación por afinidad.

La frecuencia de aparición de la segunda forma en diversos isotipos de IgG intactos se debe, pero sin limitación, a diferencias estructurales asociadas al isotipo de la región bisagra del anticuerpo. Una única sustitución de aminoácidos en la región bisagra de la bisagra de IgG4 humana puede reducir significativamente la aparición de la segunda forma (Angalet al.(1993) Molecular Immunology 30:105) hasta los niveles típicamente observados usando una bisagra de IgG1 humana. La presente divulgación abarca anticuerpos que tienen una o más mutaciones en la región bisagra, C<h>2 0 C<h>3, que pueden ser deseables, por ejemplo, en la producción, para mejorar el rendimiento de la forma de anticuerpo deseada.

Los anticuerpos de la divulgación pueden ser anticuerpos aislados. Un "anticuerpo aislado", como se usa en el presente documento, significa un anticuerpo que se ha identificado y separado y/o recuperado de al menos un componente de su entorno natural. Por ejemplo, un anticuerpo que se ha separado o eliminado de al menos un componente de un organismo, o de un tejido o célula en donde el anticuerpo existe de forma natural o se produce de forma natural, es un "anticuerpo aislado" para los fines de la presente divulgación. Un anticuerpo aislado también incluye un anticuerpoin situdentro de una célula recombinante. Los anticuerpos aislados son anticuerpos que se han sometido al menos a una etapa de purificación o aislamiento. De acuerdo con determinados casos, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o agentes químicos.

La presente divulgación también incluye anticuerpos de un brazo que se unen a CD3. Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo de un brazo" significa una molécula de unión a antígeno que comprende una única cadena pesada de anticuerpo y una única cadena ligera de anticuerpo. Los anticuerpos de un brazo de la presente divulgación pueden comprender cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR o CDR como se expone en la tabla 1 o las tablas 18/19 en el presente documento.

Los anticuerpos anti CD3 desvelados en el presente documento pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos en las regiones marco y/o CDR de los dominios variables de cadena pesada y ligera en comparación con las secuencias de la línea germinal correspondientes de las que derivan los anticuerpos. Dichas mutaciones pueden determinarse fácilmente comparando las secuencias de aminoácidos que se desvelan en el presente documento con secuencias de la línea germinal disponibles en, por ejemplo, bases de datos de secuencias de anticuerpos públicas. La presente divulgación incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que proceden de cualquiera de las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento, en donde uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones marco y/o CDR están mutados en el residuo o residuos correspondientes de la secuencia de la línea germinal de la que se obtiene el anticuerpo, o en el residuo o residuos correspondientes de otra secuencia de la línea germinal humana, o en una sustitución de aminoácidos conservativa del residuo o residuos de la línea germinal correspondientes (dichos cambios de secuencia se denominan en el presente documento colectivamente "mutaciones de la línea germinal"). Un experto en la técnica, partiendo de las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera desveladas en el presente documento, puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que comprendan una o más mutaciones individuales de la línea germinal o combinaciones de las mismas. En determinados casos, todos los residuos de marco y/o CDR dentro de los dominios V<h>y/o V<l>retromutan en los residuos encontrados en la secuencia de la línea germinal original de la que se obtuvo el anticuerpo. En otros casos, únicamente determinados residuos se retromutan en la secuencia de línea germinal original, por ejemplo, únicamente los residuos mutados encontrados dentro de los 8 primeros aminoácidos de FR1 o dentro de los 8 últimos aminoácidos de FR4, o únicamente los residuos mutados encontrados dentro de CDR1, CDR2 o CDR3. En otros casos, uno o más del residuo o residuos del marco y/o CDR están mutados en el residuo o residuos correspondientes de una secuencia de línea germinal diferente (es decir, una secuencia de línea germinal que es diferente de la secuencia de línea germinal de la cual se obtuvo originalmente el anticuerpo). Además, los anticuerpos de la presente divulgación pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de la línea germinal dentro de las regiones marco y/o CDR, por ejemplo, en donde determinados residuos individuales se mutan en el residuo correspondiente de una secuencia de línea germinal particular mientras que otros residuos determinados que difieren de la secuencia de línea germinal original se mantienen o se mutan en el residuo correspondiente de una secuencia de línea germinal distinta. Una vez obtenidos, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de la línea germinal pueden ensayarse fácilmente con respecto a una o más propiedades deseadas tales como, especificidad de unión mejorada, mayor afinidad de unión, propiedades biológicas antagonistas o agonistas mejoradas o potenciadas (según sea el caso), inmunogenicidad reducida, etc. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno obtenidos de esta manera general están abarcados en la presente divulgación.

La presente divulgación también incluye anticuerpos anti CD3 que comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR, y/o CDR desveladas en el presente documento que tienen una o más sustituciones conservadoras. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos anti CD3 que tienen secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR con, por ejemplo, 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc. sustituciones conservadoras de aminoácidos respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR, y/o CDR expuestas en la tabla 1 en el presente documento.

El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico que interactúa con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como parátopo. Un único antígeno puede tener más de un epítopo. Por lo tanto, diferentes anticuerpos pueden unirse a distintas zonas en un antígeno y pueden tener diferentes efectos biológicos. Los epítopos pueden ser conformacionales o lineales. Un epítopo conformacional se produce mediante aminoácidos yuxtapuestos espacialmente de diferentes segmentos de la cadena polipeptídica lineal. Un epítopo lineal es uno producido por residuos de aminoácidos adyacentes en una cadena polipeptídica. En una determinada circunstancia, un epítopo puede incluir fracciones de sacáridos, grupos fosforilo o grupos sulfonilo en el antígeno.

La expresión "identidad sustancial" o "sustancialmente idéntico", cuando hace referencia a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinean de forma óptima con inserciones o deleciones de nucleótidos adecuadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), existe identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente el 95 % y, más preferentemente, en al menos aproximadamente el 96 %, 97 %, 98 % o el 99 % de las bases nucleotídicas, según se mide mediante cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencia, tal como FASTA, BLAST o Gap, como se analiza a continuación. Una molécula de ácido nucleico que tiene identidad sustancial con una molécula de ácido nucleico de referencia puede, en determinados casos, codificar un polipéptido que tenga la misma secuencia de aminoácidos o una sustancialmente similar que el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de referencia.

Según lo aplicado a los polipéptidos, la expresión "similitud sustancial" o "sustancialmente similar" significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean de forma óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando ponderaciones de hueco predeterminadas, comparten al menos un 95 % de identidad de secuencia, incluso más preferentemente al menos un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de los residuos que no son idénticas difieren en sustituciones de aminoácidos conservadoras. Una "sustitución de aminoácidos conservadora" es aquella en la que un residuo de aminoácidos está sustituido por otro residuo de aminoácidos que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácido conservadora no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos donde dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí en sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia o grado de similitud puede ajustarse positivamente para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Los medios para hacer este ajuste se conocen bien por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen (1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadenas laterales de hidroxilo-alifáticas: serina y treonina; (3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; (4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; (5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y (7) cadenas laterales que contienen azufre que son cisteína y metionina. Son grupos de sustituciones de aminoácidos conservadoras preferidos: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. Como alternativa, un reemplazo conservador es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 desvelada en Gonnetet al.(1992) Science 256: 1443-1445. Un reemplazo "moderadamente conservador" es cualquier cambio que tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.

La similitud de secuencia para polipéptidos, que también se denomina identidad de secuencia, se mide típicamente con un software de análisis de secuencias. El software de análisis de proteínas empareja secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diferentes sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones de aminoácidos conservadoras. Por ejemplo, el software GCG contiene programas tales como Gap y Bestfit, que pueden usarse con los parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos estrechamente relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo natural y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1. Las secuencias polipeptídicas también pueden compararse usando FASTA usando parámetros por defecto o recomendados, un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson (2000) anteriormente). Otro algoritmo preferido al comparar una secuencia de la divulgación con una base de datos que contiene una gran cantidad de secuencias de diferentes organismos es el software BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, usando parámetros por defecto. Véase, por ejemplo, Altschulet al.(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 y Altschulet al.(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402.

Moléculas de unión a antígeno biespecíficas

Los anticuerpos de la presente divulgación pueden ser monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para más de un polipéptido diana. Véanse, por ejemplo, Tuttet al.,1991, J. Immunol. 147:60-69; Kuferet al.,2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Los anticuerpos anti CD3 de la presente divulgación pueden unirse o coexpresarse con otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo puede unirse de forma funcional (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares diferentes, tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo para producir un anticuerpo biespecífico o multiespecífico con una segunda especificidad de unión.

El uso de la expresión "anticuerpo anti CD3" en el presente documento pretende incluir tanto anticuerpos anti CD3 monoespecíficos como anticuerpos biespecíficos que comprenden un brazo de unión a CD3 y un segundo brazo que se une a un antígeno diana. Por lo tanto, la presente divulgación incluye anticuerpos biespecíficos en donde un brazo de una inmunoglobulina se une al CD3 humano y el otro brazo de la inmunoglobulina es específico para un antígeno diana. El antígeno diana al que se une el otro grupo del anticuerpo biespecífico CD3 puede ser cualquier antígeno expresado en o cerca de una célula, tejido, órgano, microorganismo o virus, contra el cual se desea una respuesta inmunitaria dirigida. El brazo de unión a CD3 puede comprender cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR o CDR como se expone en la tabla 1 o las tablas 18/19 en el presente documento. En determinados casos, el brazo de unión a CD3 se une a CD3 humano e induce la proliferación de linfocitos T humanos.

En el contexto de anticuerpos biespecíficos de la presente divulgación, en donde un grupo del anticuerpo se une a CD3 y el otro grupo se une a un antígeno diana, el antígeno diana puede ser un antígeno asociado a tumor. Los ejemplos no limitantes de antígenos específicos asociados a tumores incluyen, por ejemplo, AFP, ALK, proteínas BAGE, p-catenina, brc-abl, BRCA1, BORIS, CA9, anhidrasa carbónica IX, caspasa-8, CCR5, CD19, CD20, CD30, CD40, CDK4, CEA, CTLA4, ciclina-B1, CYP1B1, EGFR, EGFRvlll, ErbB2/Her2, ErbB3, ErbB4, ETV6-AML, EpCAM, EphA2, Fra-1, FOLR1, proteínas GAGE (por ejemplo, GAGE-1, -2), GD2, GD3, GloboH, glipicano-3, GM3, gp100, Her2, HLA/B-raf, HLA/k-ras, HLA/MAGE-A3, hTERT, LMP2, proteínas MAGE (por ejemplo, MAGE-1, -2, -3, -4, -6 y -12), MART-1, mesotelina, ML-IAP, Muc1, Muc2, Muc3, Muc4, Muc5, Muc16 (CA-125), MUM1, NA17, NY-BR1, NY-BR62, NY-BR85, NY-ESO1, OX40, p15, p53, PAP, PAX3, PAX5, PCTA-1, PLAC1, PRLR, PRAMA, PSMA (FOLH1), proteínas RAGE, Ras, RGS5, Rho, SART-1, SART-3, Steap-1, Steap-2, survivina, TAG-72, TGF-p, TMPRSS2, Tn, TRP-1, TRP-2, tirosinasa y uroplaquina-3. Sin embargo, solo una molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humana y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 humana como se define en las reivindicaciones está dentro del alcance de la invención reivindicada.

En el contexto de anticuerpos biespecíficos de la presente divulgación, en donde un grupo del anticuerpo se une a CD3 y el otro grupo se une a un antígeno diana, el antígeno diana puede ser un antígeno asociado a una enfermedad infecciosa. Los ejemplos no limitantes de antígenos asociados a enfermedades infecciosas incluyen, por ejemplo, un antígeno que se expresa en la superficie de una partícula viral, o se expresa preferentemente en una célula infectada con un virus, en donde el virus se selecciona del grupo que consiste en VIH, hepatitis (A, B o C), virus del herpes (por ejemplo, VHS-1, VHS-2, CMV, HAV-6, VVZ, virus Epstein Barr), adenovirus, virus de la gripe, flavivirus, ecovirus, rinovirus, virus coxsackie, coronavirus, virus respiratorio sincitial, virus de las paperas, rotavirus, virus del sarampión, virus de la rubeola, parvovirus, virus vaccinia, VLHT, virus del dengue, virus del papiloma, virus del molusco, poliovirus, virus de la rabia, virus JC, y virus de la encefalitis arboviral. Como alternativa, el antígeno diana puede ser un antígeno que se expresa en la superficie de una bacteria, o se expresa preferentemente en una célula que está infectada con una bacteria, en donde la bacteria se selecciona del grupo que consiste en clamidia, rickettsia, micobacterias, estafilococos, estreptococos, neumonococos, meningococos, gonococos, klebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, legionella, difteria, salmonela, bacilos, cólera, tétanos, botulismo, ántrax, peste, leptospira, y bacterias de la enfermedad de Lyme. En determinados casos, el antígeno diana es un antígeno que se expresa en la superficie de un hongo, o se expresa preferentemente en una célula que está infectada con un hongo, en donde el hongo se selecciona del grupo que consiste en Candida(albicans, krusei, glabrata, tropicalis,etc.),Crytococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger,etc.), Mucorales(mucor, absidia, rhizopus,etc.),Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitiseHistoplasma capsulatum.En determinados casos, el antígeno diana es un antígeno que se expresa en la superficie de un parásito, o se expresa preferentemente en una célula que está infectada con un parásito, en donde el parásito se selecciona del grupo que consiste enEntamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoebasp.,Giardia lambia, Cryptosporidiumsp.,Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondii, Nippostrongylus brasiliensis, Taenia crassicepsyBrugia malayi.Los ejemplos no limitantes de antígenos asociados a patógenos específicos incluyen, por ejemplo, gp120 del VIH, CD4 del VIH, glucoproteína L de hepatitis B, glucoproteína M de hepatitis B, glucoproteína S de hepatitis B, E1 de hepatitis C, E2 de hepatitis C, proteína específica de hepatocitos, gB del virus del herpes simple, gB de citomegalovirus y proteína de envoltura del VLHT.

La presente invención se refiere a moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen específicamente a CD3 y CD20. En el presente documento dichas moléculas pueden denominarse, por ejemplo, moléculas biespecíficas "anti CD3/anti CD20", o "anti CD3xCD20" o "CD3xCD20", u otra terminología similar.

El término "CD20", como se usa en el presente documento, se refiere a la proteína CD20 humana a menos que se especifique que proviene de una especie no humana (por ejemplo, "CD20 de ratón", "CD20 de mono", etc.). La proteína<c>D20 humana tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:1369.

Como se usa en el presente documento, la expresión "molécula de unión a antígeno" significa una proteína, polipéptido o complejo molecular que comprende o que consiste en al menos una región determinante de complementariedad (CDR) que sola, o en combinación con una o más CDR y/o regiones marco (FR) adicionales, se une específicamente a un antígeno particular. En determinados casos, una molécula de unión a antígeno es un anticuerpo o un fragmento de un anticuerpo, como se definen esos términos en otras partes en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, la expresión "molécula de unión a antígeno biespecífica" significa una proteína, polipéptido o complejo molecular que comprende al menos un primer dominio de unión a antígeno y un segundo dominio de unión a antígeno. Cada dominio de unión a antígeno dentro de la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende al menos una CDR que sola, o en combinación con una o más CDR y/o FR adicionales, se une específicamente a un antígeno particular. En el contexto de la presente divulgación, el primer dominio de unión a antígeno se une específicamente a un primer antígeno (CD3), y el segundo dominio de unión a antígeno se une específicamente a un segundo antígeno distinto (CD20).

En determinados casos ilustrativos de la presente divulgación, la molécula de unión a antígeno biespecífica es un anticuerpo biespecífico. Cada dominio de unión a antígeno de un anticuerpo biespecífico comprende un dominio variable de cadena pesada (HCVR) y un dominio variable de cadena ligera (LCVR). En el contexto de una molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende un primer y un segundo dominios de unión a antígeno (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico), las c Dr del primer dominio de unión a antígeno pueden designarse con el prefijo "A1" y las CDR del segundo dominio de unión a antígeno pueden designarse con el prefijo "A2". Por lo tanto, en el presente documento las CDR del primer dominio de unión a antígeno pueden denominarse A1-HCDR1, A1-HCDR2 y A1-HCDR3; y las CDR del segundo dominio de unión a antígeno pueden denominarse en el presente documento A2-HCDR1, A2-HCDR2 y A2-HCDR3.

El primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno pueden estar conectados directa o indirectamente entre sí para formar una molécula de unión a antígeno biespecífica de la presente divulgación. Como alternativa, el primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno pueden estar unidos a un dominio de multimerización separado. La asociación de un dominio de multimerización con otro dominio de multimerización facilita la asociación entre los dos dominios de unión a antígeno, formando así una molécula de unión a antígeno biespecífica. Como se usa en el presente documento, un "dominio de multimerización" es cualquier macromolécula, proteína, polipéptido, péptido o aminoácido que tiene la capacidad de asociarse con un segundo dominio de multimerización de la misma estructura o constitución o similar. Por ejemplo, un dominio de multimerización puede ser un polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina C<h>3. Un ejemplo no limitante de un componente de multimerización es una porción Fc de una inmunoglobulina (que comprende un dominio C<h>2-C<h>3), por ejemplo, un dominio Fc de una IgG seleccionada de los isotipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, así como cualquier alotipo dentro de cada grupo de isotipo.

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente divulgación comprenderán típicamente dos dominios de multimerización, por ejemplo, dos dominios Fc que son cada uno de manera individual parte de una cadena pesada de anticuerpo separada. El primer y segundo dominios de multimerización pueden ser del mismo isotipo de IgG tal como, por ejemplo, IgG1/IgG1, IgG2/IgG2, IgG4/IgG4. Como alternativa, el primer y segundo dominios de multimerización pueden ser de diferentes isotipos de IgG tales como, por ejemplo, IgG1/IgG2, IgG1/IgG4, IgG2/IgG4, etc.

En determinados casos, el dominio de multimerización es un fragmento Fc o una secuencia de aminoácidos de 1 a aproximadamente 200 aminoácidos de longitud que contiene al menos un residuo de cisteína. En otros casos, el dominio de multimerización es un residuo de cisteína o un péptido corto que contiene cisteína. Otros dominios de multimerización incluyen péptidos o polipéptidos que comprenden o consisten en una cremallera de leucina, un motivo de hélice-bucle o un motivo de hélice superenrollada.

Puede usarse cualquier formato o tecnología de anticuerpo biespecífico para preparar las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente divulgación. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo que tiene una primera especificidad de unión a antígeno puede unirse funcionalmente (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares diferentes, tal como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene una segunda especificidad de unión a antígeno para producir una molécula de unión a antígeno biespecífica. Otros formatos biespecíficos ilustrativos específicos que se pueden usar en el contexto de la presente divulgación incluyen, sin limitación, por ejemplo, formatos biespecíficos basados en scFv o de diacuerpo, fusiones IgG-scFv, dominio variable doble (DVD)-lg, cuadroma, botones en ojal, cadena ligera común (por ejemplo, cadena ligera común con "botón en ojal", etc.), CrossMab, CrossFab, (SEED)cuerpo, cremallera de leucina, Duocuerpo, IgG1/IgG2, Fab de acción doble (DAF)-IgG y formatos biespecíficos de Mab2 (véase, por ejemplo, Kleinet al.,2012, mAbs 4:6, 1-11, y referencias mencionados en el mismo, para una revisión de los formatos anteriores).

En el contexto de moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente divulgación, los dominios de multimerización, por ejemplo, dominios Fc, pueden comprender uno o más cambios de aminoácidos (por ejemplo, inserciones, deleciones o sustituciones) en comparación con la versión de origen natural de tipo natural del dominio Fc. Por ejemplo, la divulgación incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden una o más modificaciones en el dominio Fc que dan como resultado un dominio Fc modificado que tiene una interacción de unión modificada (por ejemplo, mejorada o disminuida) entre Fc y FcRn. En un caso, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende una modificación en una región C<h>2 o C<h>3, en donde la modificación aumenta la afinidad del dominio Fc a FcRn en un entorno ácido (por ejemplo, en un endosoma donde el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0). Los ejemplos no limitantes de dichas modificaciones de Fc incluyen, por ejemplo, una modificación en la posición 250 (por ejemplo, E o Q); 250 y 428 (por ejemplo, L o F); 252 (por ejemplo, l/y /F/W o T), 254 (por ejemplo, S o T) y 256 (por ejemplo, S/R/Q/E/D o T); o una modificación en la posición 428 y/o 433 (por ejemplo,<l>/<r>/S/P/Q o K) y/o 434 (por ejemplo, H/F o Y); o una modificación en la posición 250 y/o 428; o una modificación en la posición 307 o 308 (por ejemplo, 308F, V308F) y 434. En un caso, la modificación comprende una modificación en 428L (por ejemplo, M428L) y 434S (por ejemplo, N434S); una modificación en 428L, 259I (por ejemplo, V259I) y 308F (por ejemplo, V308F); una modificación en 433K (por ejemplo, H433K) y 434 (por ejemplo, 434Y); una modificación en 252, 254 y 256 (por ejemplo, 252Y, 254T y 256e ); una modificación en 250Q y 428L (por ejemplo, T250Q y M428L); y una modificación en 307 y/o 308 (por ejemplo, 308F o 308P).

La presente divulgación incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden un primer dominio C<h>3 y un segundo dominio C<h>3 de Ig, en donde el primer y el segundo dominios C<h>3 de Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido, y en donde al menos una diferencia de aminoácidos reduce la unión del anticuerpo biespecífico a la proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácido. En un caso, el primer dominio C<h>3 de Ig se une a la proteína A y el segundo dominio C<h>3 de Ig contiene una mutación que reduce o anula la unión a la proteína A tal como una modificación en H95R (por numeración de exones IMGT; H435R por numeración EU). El segundo C<h>3 puede comprender además una modificación en Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Otras modificaciones adicionales que pueden encontrarse dentro del segundo C<h>3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG1; N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG4.

En determinados casos, el dominio Fc puede ser quimérico, que combina secuencias de Fc procedentes de más de un isotipo de inmunoglobulina. Por ejemplo, un dominio Fc quimérico puede comprender parte o la totalidad de una secuencia C<h>2 derivada de una región C<h>2 de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana, y parte o la totalidad de una secuencia C<h>3 derivada de una IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana. Un dominio Fc quimérico también puede contener una región bisagra quimérica. Por ejemplo, una bisagra quimérica puede comprender una secuencia de "bisagra superior", derivada de una región bisagra de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana, junto con una secuencia de "bisagra inferior", derivada de una región bisagra de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana. Un ejemplo particular de un dominio Fc quimérico que se puede incluir en cualquiera de las moléculas de unión a antígeno expuestas en el presente documento comprende, desde el extremo N al extremo C: [C<h>1 de IgG4] - [Bisagra superior de IgG4] - [bisagra inferior de IgG2] - [CH2 de IgG4] - [CH3 de lgG4]. Otro ejemplo de un dominio Fc quimérico que se puede incluir en cualquiera de las moléculas de unión a antígeno establecidas en el presente documento comprende, desde el extremo N al extremo C: [C<h>1 de IgG1] - [Bisagra superior de IgG1] - [Bisagra inferior de IgG2] - [C<h>2 de IgG4] - [C<h>3 de IgG1]. Estos y otros ejemplos de dominios Fc quiméricos que pueden incluirse en cualquiera de las moléculas de unión a antígeno de la presente divulgación se describen en la Solicitud Provisional de EE.UU. N.° 61/759.578, presentada el 1 de febrero de 2013. Los dominios Fc quiméricos que tienen estas disposiciones estructurales generales y variantes de los mismos, pueden tener alterada la unión al receptor de Fc, que a su vez afecta la función efectora de Fc.

Variantes de secuencia

Los anticuerpos y moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente divulgación pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos en las regiones marco y/o CDR de los dominios variables de cadena pesada y ligera en comparación con las secuencias de la línea germinal correspondientes de las que se obtuvieron los dominios de unión a antígeno individuales. Dichas mutaciones pueden determinarse fácilmente comparando las secuencias de aminoácidos que se desvelan en el presente documento con secuencias de la línea germinal disponibles en, por ejemplo, bases de datos de secuencias de anticuerpos públicas. Las moléculas de unión a antígeno de la presente divulgación pueden comprender dominios de unión a antígeno que se obtienen de cualquiera de las secuencias de aminoácidos ilustrativas desveladas en el presente documento, en donde uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones marco y/o CDR están mutados en el residuo o residuos correspondientes de la secuencia de la línea germinal de la que se obtiene el anticuerpo, o en el residuo o residuos correspondientes de otra secuencia de la línea germinal humana, o en una sustitución de aminoácidos conservativa del residuo o residuos de la línea germinal correspondientes (dichos cambios de secuencia se denominan en el presente documento colectivamente "mutaciones de la línea germinal"). Un experto en la técnica, partiendo de las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera desveladas en el presente documento, puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que comprendan una o más mutaciones individuales de la línea germinal o combinaciones de las mismas. En determinados casos, todos los residuos de marco y/o CDR dentro de los dominios V<h>y/o V<l>se vuelven a mutar con respecto a los residuos encontrados en la secuencia original de la línea germinal de la cual se derivó originalmente el dominio de unión a antígeno. En otros casos, únicamente determinados residuos se retromutan en la secuencia de línea germinal original, por ejemplo, únicamente los residuos mutados encontrados dentro de los 8 primeros aminoácidos de FR1 o dentro de los 8 últimos aminoácidos de FR4, o únicamente los residuos mutados encontrados dentro de CDR1, CDR2 o CDR3. En otros casos, uno o más del residuo o residuos de marco y/o CDR están mutados en el residuo o residuos correspondientes de una secuencia de línea germinal diferente (es decir, una secuencia de línea germinal que es diferente de la secuencia de línea germinal de la que obtuvo originalmente el dominio de unión a antígeno). Además, los dominios de unión a antígeno pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de línea germinal dentro de las regiones marco y/o CDR, por ejemplo, en donde determinados residuos individuales se mutan en el residuo correspondiente de una secuencia de línea germinal particular mientras que otros residuos determinados que difieren de la secuencia de línea germinal original se mantienen o se mutan en el residuo correspondiente de una secuencia de línea germinal distinta. Una vez obtenidos, los dominios de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de línea germinal pueden analizarse fácilmente para una o más propiedades deseadas tales como, especificidad de unión mejorada, mayor afinidad de unión, propiedades biológicas antagonistas o agonistas mejoradas o potenciadas (según sea el caso), inmunogenicidad reducida, etc. En la presente divulgación se incluyen moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden uno o más dominios de unión a antígeno obtenidos de esta manera general. Sin embargo, solo una molécula de unión a antígeno que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humana y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 humana, en donde el primer dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende regiones determinantes de la complementariedad A1-HCDR1, A1-HCDR2 y A1-HCDR3 y una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende regiones determinantes de la complementariedad Al-LCDR1, A1-LCDR2 y A1-LCDR3, en donde las regiones determinantes de la complementariedad están contenidas dentro de un par HCVR/LCVR que comprende las secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEQ ID NO: 1250/1258, 1266/1274 o 1282/1290, en donde la molécula de unión a antígeno biespecífica induce la proliferación de células mononucleares de sangre periférica de ser humano y de macaco cangrejeroin vitro,como se define en las reivindicaciones, está dentro del alcance de los anticuerpos de la invención reivindicada.

La presente divulgación también incluye moléculas de unión a antígeno en donde uno o ambos dominios de unión a antígeno comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR desveladas en el presente documento que tienen una o más sustituciones conservadoras. Por ejemplo, la presente divulgación incluye moléculas de unión a antígeno que comprenden un dominio de unión a antígeno que tiene secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR con, por ejemplo, 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc., sustituciones conservadoras de aminoácidos con respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR que se divulgan en el presente documento. Una "sustitución de aminoácidos conservadora" es aquella en la que un residuo de aminoácidos está sustituido por otro residuo de aminoácidos que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácido conservadora no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen (1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadenas laterales de hidroxilo-alifáticas: serina y treonina; (3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; (4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; (5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y (7) cadenas laterales que contienen azufre que son cisteína y metionina. Son grupos de sustituciones de aminoácidos conservadoras preferidos: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparaginaglutamina. Como alternativa, un reemplazo conservador es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 desvelada en Gonnetet al.(1992) Science 256: 1443-1445. Un reemplazo "moderadamente conservador" es cualquier cambio que tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.

La presente divulgación también incluye moléculas de unión a antígeno que comprenden un dominio de unión a antígeno con una secuencia de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR que es sustancialmente idéntica a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR desveladas en el presente documento. La expresión "identidad sustancial" o "sustancialmente idéntico", cuando se hace referencia a una secuencia de aminoácidos significa que dos secuencias de aminoácidos, cuando se alinean de forma óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando ponderaciones de hueco predeterminadas, comparten al menos un 95 % de identidad de secuencia, incluso más preferentemente al menos un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de los residuos que no son idénticas difieren en sustituciones de aminoácidos conservadoras. En los casos donde dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí en sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia o grado de similitud puede ajustarse positivamente para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Los medios para hacer este ajuste se conocen bien por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331.

La similitud de secuencia para polipéptidos, que también se denomina identidad de secuencia, se mide típicamente con un software de análisis de secuencias. El software de análisis de proteínas empareja secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diferentes sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones de aminoácidos conservadoras. Por ejemplo, el software GCG contiene programas tales como Gap y Bestfit, que pueden usarse con los parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos estrechamente relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo natural y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1. Las secuencias polipeptídicas también pueden compararse usando FASTA usando parámetros por defecto o recomendados, un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson (2000) anteriormente). Otro algoritmo preferido al comparar una secuencia de la divulgación con una base de datos que contiene una gran cantidad de secuencias de diferentes organismos es el software BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, usando parámetros por defecto. Véase, por ejemplo, Altschulet al.(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 y Altschulet al.(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402.

Unión dependiente del pH

La presente invención incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti CD3/anti CD20, con características de unión dependientes del pH. Por ejemplo, un anticuerpo anti CD3 de la presente divulgación puede exhibir una unión reducida a CD3 a pH ácido en comparación con pH neutro. Como alternativa, los anticuerpos anti CD3 de la divulgación pueden exhibir una unión mejorada a CD3 a pH ácido en comparación con pH neutro. La expresión "pH ácido" incluye valores de pH inferiores a aproximadamente 6,2, por ejemplo, aproximadamente 6,0, 5,95, 5,9, 5,85, 5,8, 5,75, 5,7, 5,65, 5,6, 5,55, 5,5, 5,45, 5,4, 5,35, 5,3, 5,25, 5,2, 5,15, 5,1,5,05, 5,0 o inferior. Como se usa en el presente documento, la expresión "pH neutro" significa un pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,4. La expresión "pH neutro" incluye valores de pH de aproximadamente 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35 y 7,4.

En determinados casos, "unión reducida... a pH ácido en comparación con un pH neutro" se expresa en términos de una relación del valor de K<d>del anticuerpo que se une a su antígeno a pH ácido con respecto al valor de K<d>del anticuerpo que se une a su antígeno a pH neutro (o viceversa). Por ejemplo, puede considerarse que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo presenta "unión reducida a CD3 a pH ácido en comparación con pH neutro" para fines de la presente divulgación si el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo presenta una relación de K<d>ácido/neutro de aproximadamente 3,0 o superior. En determinados casos ilustrativos, la relación de K<d>ácido/neutro para un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente divulgación puede ser aproximadamente 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 20,0. 25,0, 30,0, 40,0, 50,0, 60,0, 70,0, 100,0 o superior.

Se pueden obtener anticuerpos con características de unión dependientes del pH, por ejemplo, cribando una población de anticuerpos para determinar la unión reducida (o mejorada) a un antígeno particular a pH ácido en comparación con pH neutro. Adicionalmente, las modificaciones del dominio de unión a antígeno a nivel de aminoácidos pueden producir anticuerpos con características dependientes del pH. Por ejemplo, mediante la sustitución de uno o más aminoácidos de un dominio de unión a antígeno (por ejemplo, dentro de una CDR) con un residuo de histidina, puede obtenerse un anticuerpo con unión a antígeno reducida a pH ácido en relación con el pH neutro.

Anticuerpos que comprenden variantes Fc

De acuerdo con determinados casos de la presente divulgación, se proporcionan anticuerpos anti CD3 y moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti CD3/anti CD20 que comprenden un dominio Fc que comprende una o más mutaciones que potencian o disminuyen la unión del anticuerpo al receptor FcRn, por ejemplo, a pH ácido en comparación con pH neutro. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos que comprenden una mutación en la región C<h>2 o C<h>3 del dominio Fc, en donde la mutación o mutaciones aumentan la afinidad del dominio Fc por FcRn en un entorno ácido (por ejemplo, en un endosoma donde el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0). Dichas mutaciones pueden dar como resultado un aumento de la semivida en suero del anticuerpo cuando se administran a un animal. Los ejemplos no limitantes de dichas modificaciones de Fc incluyen, por ejemplo, una modificación en la posición 250 (por ejemplo, E o Q); 250 y 428 (por ejemplo, L o F); 252 (por ejemplo, L/Y/F/W o T), 254 (por ejemplo, S o T) y 256 (por ejemplo, S/R/Q/E/D o T); o una modificación en la posición 428 y/o 433 (por ejemplo, H/L/r /s /P/Q o K) y/o 434 (por ejemplo, H/F o Y); o una modificación en la posición 250 y/o 428; o una modificación en la posición 307 o 308 (por ejemplo, 308F, V308F) y 434. En un caso, la modificación comprende una modificación en 428L (por ejemplo, m 428L) y 434S (por ejemplo, N434S); una modificación en 428L, 259I (por ejemplo, V259I) y 308F (por ejemplo, V308F); una modificación en 433K (por ejemplo, H433K) y 434 (por ejemplo, 434Y); una modificación en 252, 254 y 256 (por ejemplo, 252Y, 254T y 256E); una modificación en 250Q y 428L (por ejemplo, T250Q y M428L); y una modificación en 307 y/o 308 (por ejemplo, 308F o 308P).

Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos anti CD3 y moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti CD3/anti CD20, que comprenden un dominio Fc que comprende uno o más pares o grupos de mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en: 250Q y 248L (por ejemplo, T250Q y M248L); 252Y, 254T y 256E (por ejemplo, M252Y, S254T y T256E); 428L y 434S (por ejemplo, M428L y N434S); y 433K y 434F (por ejemplo, H433K y N434F). Todas las posibles combinaciones de las mutaciones del dominio Fc anteriores y otras mutaciones dentro de los dominios variables de los anticuerpos desvelados en el presente documento se contemplan dentro del alcance de la presente divulgación.

Características biológicas de los anticuerpos y las moléculas de unión a antígeno biespecíficas

La presente divulgación incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a CD3 humano e inducen la proliferación de linfocitos T. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos anti CD3 que inducen la proliferación de linfocitos T humanos con un valor de CE50 inferior a aproximadamente 0,33 pM, según lo medido por un ensayo de proliferación de linfocitos Tin vitro,por ejemplo, usando el formato de ensayo como se define en el ejemplo 4 en el presente documento (por ejemplo, evaluando la proliferación de células Jurkat o PBMC humanas en presencia de anticuerpos anti -CD3), o un ensayo sustancialmente similar. En determinados casos, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente divulgación inducen la proliferación de linfocitos T humanos (por ejemplo, la proliferación de células Jurkat y/o la proliferación de PBMC) con un valor de CE50 inferior a aproximadamente 0,32 pM, inferior a aproximadamente 0,31 pM, inferior a aproximadamente 0,30 pM, inferior a aproximadamente 0,28 pM, inferior a aproximadamente 0,26 pM, inferior a aproximadamente 0,24 pM, inferior a aproximadamente 0,22 pM o inferior a aproximadamente 0,20 pM, según lo medido por un ensayo de proliferación de linfocitos Tin vitro,por ejemplo, usando el formato de ensayo como se define en el ejemplo 4 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar.

La presente divulgación también incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a CD3 humano e inducen la destrucción de células tumorales mediada por linfocitos T. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos anti CD3 que inducen la destrucción de células tumorales mediada por linfocitos T con una CE50 inferior a aproximadamente 2,3 pM, según lo medido en un ensayo de destrucción de células tumoralesin vitromediado por linfocitos T, por ejemplo, usando el formato de ensayo como se define en el ejemplo 6 en el presente documento (por ejemplo, evaluando el alcance de la destrucción de células tumorales U937 por PBMC humanas en presencia de anticuerpos anti CD3), o un ensayo sustancialmente similar. En determinados casos, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente divulgación inducen la destrucción de células tumorales mediada por linfocitos T (por ejemplo, la destrucción de células de U937 mediada por PBMC) con un valor CE50 inferior a aproximadamente 2,3 pM, inferior a aproximadamente 2,2 pM, inferior a aproximadamente 2,1 pM, inferior a aproximadamente 2,0 pM, inferior a aproximadamente 1,8 pM, inferior a aproximadamente 1,6 pM, inferior a aproximadamente 1,4 pM, inferior a aproximadamente 1,2 pM, inferior a aproximadamente 1,0 pM, inferior a aproximadamente 0,8 pM, inferior a aproximadamente 0,6 pM o inferior a aproximadamente 0,5 pM, según lo medido por un ensayo de destrucción de células tumoralesin vitromediado por linfocitos T, por ejemplo, usando el formato de ensayo como se define en el ejemplo 6 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar.

La presente divulgación incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a CD3 humano con alta afinidad. La presente divulgación también incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a CD3 humano con afinidad media o baja, dependiendo del contexto terapéutico y las propiedades de direccionamiento particulares que se deseen. Por ejemplo, en el contexto de una molécula de unión a antígeno biespecífica, en donde un brazo se une a CD3 y otro brazo se une a un antígeno diana (por ejemplo, CD20), puede ser deseable que el brazo de unión a antígeno diana se una al antígeno diana con alta afinidad mientras que el brazo anti CD3 se une a CD3 solo con afinidad moderada o baja. De esta manera, puede conseguirse un direccionamiento preferente de la molécula de unión a antígeno a células que expresan el antígeno diana mientras se evita la unión de CD3 general/no dirigida y los consiguientes efectos secundarios adversos asociados con la misma.

De acuerdo con determinados casos, la presente divulgación incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos que se unen a CD3 humano (por ejemplo, a 25 °C) con una K<d>inferior a aproximadamente 15 nM según lo medido por resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, usando formato de ensayo como el definido en el ejemplo 3 en el presente documento. En determinados casos, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente divulgación se unen a CD3 con una K<d>inferior a aproximadamente 5 nM, inferior a aproximadamente 2 nM, inferior a aproximadamente 1 nM, inferior a aproximadamente 800 pM, inferior a aproximadamente 600 pM, inferior a aproximadamente 500 pM, inferior a aproximadamente 400 pM, inferior a aproximadamente 300 pM, inferior a aproximadamente 200 pM, inferior a aproximadamente 180 pM, inferior a aproximadamente 160 pM, inferior a aproximadamente 140 pM, inferior a aproximadamente 120 pM, inferior a aproximadamente 100 pM, inferior a aproximadamente 80 pM, inferior a aproximadamente 60 pM, inferior a aproximadamente 40 pM, inferior a aproximadamente 20 pM o inferior a aproximadamente 10 pM, según lo medido por resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, usando un formato de ensayo como se define en el ejemplo 3 en el presente documento (por ejemplo, formato de captura de mAb o captura de antígeno), o un ensayo sustancialmente similar.

La presente divulgación también incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a CD3 con una semivida disociativa (t1^ ) superior a aproximadamente 10 minutos, según lo medido por resonancia de plasmón superficial a 25 °C o 37 °C, por ejemplo, usando un formato de ensayo como se define en el ejemplo 3 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar. En determinados casos, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente divulgación se unen a CD3 con una t1^ superior a aproximadamente 20 minutos, superior a aproximadamente 30 minutos, superior a aproximadamente 40 minutos, superior a aproximadamente

50 minutos, superior a aproximadamente 60 minutos, superior a aproximadamente 70 minutos, superior a aproximadamente 80 minutos, superior a aproximadamente 90 minutos, superior a aproximadamente 100 minutos, superior a aproximadamente 200 minutos, superior a aproximadamente 300 minutos, superior a aproximadamente

400 minutos, superior a aproximadamente 500 minutos, superior a aproximadamente 600 minutos, superior a aproximadamente 700 minutos, superior a aproximadamente 800 minutos, superior a aproximadamente 900 minutos, superior a aproximadamente 1000 minutos o superior a aproximadamente 1200 minutos, según lo medido por resonancia de plasmón superficial a 25 °C o 37 °C, por ejemplo, usando un formato de ensayo como se define en el ejemplo 3 en el presente documento (por ejemplo, formato de captura de mAb o captura de antígeno), o un ensayo sustancialmente similar.

La presente invención se refiere a moléculas de unión a antígeno biespecíficas (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) que pueden unirse simultáneamente a CD3 humano y CD20 humano. De acuerdo con determinadas realizaciones, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención interactúan específicamente con las células que expresan CD3 y/o CD20. El grado en que una molécula de unión a antígeno biespecífica se une a células que expresan CD3 y/o CD20 puede evaluarse mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), como se ilustra en el ejemplo 8 en el presente documento. Por ejemplo, la presente invención incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen específicamente a líneas de linfocitos T humanos que expresan CD3 pero no CD20 (por ejemplo, Jurkat), líneas de linfocitos B humanos que expresan CD20 pero no CD3 (por ejemplo, Raji), y/o linfocitos T de primate (por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica [PBMC] de macaco cangrejero). La presente invención incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen a cualquiera de las células y líneas celulares mencionadas anteriormente con un valor de CE50de aproximadamente 9,0x10-6 a aproximadamente 2,0x10-9, o menos, como se determina usando un ensayo FACS como se expone en el ejemplo 8 o un ensayo sustancialmente similar.

La presente invención también incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti CD3/anti CD20 que se unen a linfocitos T humanos que expresan CD3 (por ejemplo, Jurkat) con un valor de CE50 de entre 1,0 pM y 1000 nM. En determinadas realizaciones, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti CD3/anti CD20 se unen a linfocitos

T humanos que expresan CD3 con un valor de CE50 de entre 1 nM y 60 nM. Por ejemplo, la presente invención incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti CD3/anti CD20 que se unen a linfocitos T humanos que expresan CD3 (por ejemplo, Jurkat) con un valor de CE50 de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 10 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 2 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 20 nM, aproximadamente 30 nM, aproximadamente 40 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 60 nM, aproximadamente 70 nM, aproximadamente 80 nM, aproximadamente 90 nM, aproximadamente 100 nM, aproximadamente 200 nM, aproximadamente 300 nM, aproximadamente 500 nM, aproximadamente 800 nM, aproximadamente 1000 nM o más.

La presente invención también incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti CD3/anti CD20 que presentan una o más características seleccionadas del grupo que consiste en: (a) inducir la proliferación de PBMCin vitro(véase, por ejemplo, el ejemplo 9 en el presente documento); (b) activar los linfocitos T, inducir la liberación de IFN-gamma y la regulación positiva de CD25 en sangre completa humana (véase, por ejemplo, el ejemplo 10 en el presente documento); (c) inducir la citotoxicidad mediada por linfocitos T en líneas celulares resistentes a anti CD20 (véase, por ejemplo, el ejemplo 11 en el presente documento); (d) inducir la citotoxicidad en linfocitos B humanos (por ejemplo, Raji; véase, por ejemplo, el ejemplo 13 en el presente documento); (e) agotar los linfocitos B (por ejemplo, linfocitos B CD19+) en ratones reconstituidos con células inmunitarias humanas (véase, por ejemplo, el ejemplo 14 en el presente documento); y (f) disminuir el volumen de tumor de linfocitos B (por ejemplo, volumen de tumor Raji) en xenoinjertos de ratón (véase, por ejemplo, ejemplo 15).

La presente invención incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti CD3/anti CD20 que pueden agotar los linfocitos B en un sujeto (véase, por ejemplo, ejemplo 16). Por ejemplo, de acuerdo con determinadas realizaciones, se proporcionan moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti CD3/anti CD20, en donde una administración única de la molécula de unión a antígeno biespecífica a un sujeto (por ejemplo, a una dosis de aproximadamente 0,1 mg/kg, aproximadamente 0,08 mg/kg, aproximadamente 0,06 mg/kg, aproximadamente 0,04 mg/kg, aproximadamente 0,04 mg/kg, aproximadamente 0,02 mg/kg, aproximadamente 0,01 mg/kg o menos) provoca una reducción del número de linfocitos B en el sujeto (por ejemplo, en una muestra de sangre tomada del sujeto) por debajo de los niveles detectables. En determinadas realizaciones, una administración única de la molécula de unión al antígeno biespecífico anti CD3/anti CD20 a una dosis de aproximadamente 0,1 mg/kg provoca una reducción del número de linfocitos B en el sujeto por debajo de los niveles detectables aproximadamente el día 7, aproximadamente el día 6, aproximadamente el día 5, aproximadamente el día 4, aproximadamente el día 3, aproximadamente el día 2 o aproximadamente el día 1 después de la administración de la molécula de unión a antígeno biespecífica al sujeto. De acuerdo con determinadas realizaciones, una administración única de una molécula de unión a antígeno biespecífica anti CD3/anti CD20 de la invención, a una dosis de aproximadamente 0,01 mg/kg, hace que el número de linfocitos B permanezca por debajo de niveles detectables hasta al menos aproximadamente 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 15 días, 16 días, 17 días o más, después de la administración. Como se usa en el presente documento, la expresión "por debajo de los niveles detectables" significa que no pueden detectarse linfocitos B directa o indirectamente en una muestra de sangre extraída de un sujeto usando ensayos estándar de detección de linfocitos B, por ejemplo, un ensayo FACS para marcadores de linfocitos B, como se expone en el ejemplo 16, en el presente documento.

En realizaciones relacionadas, se proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica anti CD3/anti CD20, en donde el número de linfocitos B por microlitro de sangre extraída de un sujeto desde aproximadamente el día 1 hasta aproximadamente el día 28 después de la administración de una dosis única de aproximadamente 0,01 mg/kg de la molécula de unión al antígeno al sujeto es inferior al 25 % del número de linfocitos B por microlitro de sangre extraída del sujeto antes de la administración. En determinadas realizaciones diferentes, se proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica anti CD3/anti CD20, en donde el número de linfocitos B por microlitro de sangre extraída de un sujeto desde aproximadamente el día 1 hasta aproximadamente el día 56 después de la administración de una dosis única de aproximadamente 0,01 mg/kg de la molécula de unión al antígeno al sujeto es inferior al 50 % del número de linfocitos B por microlitro de sangre extraída del sujeto antes de la administración.

La presente invención también proporciona moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti CD3/anti CD20 que, cuando se administran a un sujeto, no provocan más que una disminución transitoria de linfocitos T. Por ejemplo, se proporcionan moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti CD3/anti CD20 que, cuando se administran a un sujeto a una dosis de aproximadamente 0,01 mg/kg, provocan que el número de linfocitos T disminuya el día 1 después de la administración, pero en donde el número de linfocitos T por microlitro de sangre repunta en puntos temporales posteriores (por ejemplo, aproximadamente el día 2, día 7, día 14, día 28, día 42, día 56 o posterior a la administración). Por ejemplo, la presente invención proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica anti CD3/anti CD20, en donde el número de linfocitos T por microlitro de sangre extraída del sujeto desde aproximadamente el día 14 hasta aproximadamente el día 56 después de la administración de la molécula de unión a antígeno al sujeto a una dosis de aproximadamente 0,01 mg/kg es igual o superior al número de linfocitos T por microlitro de sangre extraída del sujeto antes de la administración de la molécula de unión a antígeno biespecífica.

Mapeo de epítopos y tecnologías relacionadas

El epítopo en CD3 al que se unen las moléculas de unión a antígeno de la presente divulgación puede consistir en una única secuencia contigua de 3 o más (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más) aminoácidos de una proteína CD3. Como alternativa, el epítopo puede consistir en una pluralidad de aminoácidos no contiguos (o secuencias de aminoácidos) de CD3. Los anticuerpos de la divulgación pueden interactuar con aminoácidos contenidos dentro de una sola cadena de CD3 (por ejemplo, CD3-épsilon, CD3-delta o CD3-gamma), o pueden interactuar con aminoácidos en dos o más cadenas de CD3 diferentes. El término "epítopo", como se usa en el presente documento, se refiere a un determinante antigénico que interactúa con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como parátopo. Un único antígeno puede tener más de un epítopo. Por lo tanto, diferentes anticuerpos pueden unirse a distintas zonas en un antígeno y pueden tener diferentes efectos biológicos. Los epítopos pueden ser conformacionales o lineales. Un epítopo conformacional se produce mediante aminoácidos yuxtapuestos espacialmente de diferentes segmentos de la cadena polipeptídica lineal. Un epítopo lineal es uno producido por residuos de aminoácidos adyacentes en una cadena polipeptídica. En una determinada circunstancia, un epítopo puede incluir fracciones de sacáridos, grupos fosforilo o grupos sulfonilo en el antígeno.

Para determinar si un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo "interactúa con uno o más aminoácidos" dentro de un polipéptido o proteína se pueden usar diversas técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Las técnicas ilustrativas incluyen, por ejemplo, ensayo de bloqueo cruzado de rutina tal como el descrito en Antibodies, Harlow y Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY), análisis mutacional de rastreo con alanina, análisis de transferencias de péptidos (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463) y análisis de escisión de péptidos. Adicionalmente, se pueden emplear métodos tales como escisión de epítopos, extracción de epítopos y modificación química de antígenos (Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496). Otro método que puede usarse para identificar los aminoácidos dentro de un polipéptido con el que interactúa un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo es el intercambio de hidrógeno/deuterio detectado por espectrometría de masas. En términos generales, el método de intercambio de hidrógeno/deuterio implica el marcaje con deuterio de la proteína de interés, seguido de la unión del anticuerpo a la proteína marcada con deuterio. A continuación, el complejo de proteína/anticuerpo se transfiere a agua para permitir que tenga lugar el intercambio de hidrógeno-deuterio en todos los residuos, excepto en los residuos protegidos por el anticuerpo (que permanecen marcados con deuterio). Después de la disociación del anticuerpo, la proteína diana es sometida a escisión por proteasas y análisis de espectrometría de masas, revelando de esta manera los residuos marcados con deuterio que corresponden a los aminoácidos específicos con los que interactúa el anticuerpo. Véase, por ejemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen y Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A. Para fines de mapeo de epítopos también puede usarse cristalografía de rayos X del complejo antígeno/anticuerpo.

La presente divulgación incluye además anticuerpos anti CD3 que se unen al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos ilustrativos específicos descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos que comprenden cualquiera de las secuencias de aminoácidos como se expone en la tabla 1 en el presente documento). Análogamente, la presente divulgación también incluye anticuerpos anti CD3 que compiten por unirse a CD3 con cualquiera de los anticuerpos ilustrativos específicos descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos que comprenden cualquiera de las secuencias de aminoácidos como se expone en la tabla 1 en el presente documento). Sin embargo, solo una molécula de unión a antígeno biespecífica que tiene las CDR como se define en las reivindicaciones está dentro del alcance de la invención reivindicada. La presente divulgación también incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano, y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 humano, en donde el primer dominio de unión a antígeno se une al mismo epítopo en CD3 que cualquiera de los dominios de unión a antígeno específicos de CD3 ilustrativos descritos en el presente documento, y/o en donde el segundo dominio de unión a antígeno se une al mismo epítopo en CD20 que cualquiera de los dominios de unión a antígeno específicos de CD20 ilustrativos descritos en el presente documento.

Análogamente, la presente divulgación también incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano, y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 humano, en donde el primer dominio de unión a antígeno compite por unirse a CD3 con cualquiera de los dominios de unión a antígeno específicos de CD3 ilustrativos descritos en el presente documento, y/o en donde el segundo dominio de unión a antígeno compite por unirse a CD20 con cualquiera de los dominios de unión a antígeno específicos de CD20 ilustrativos descritos en el presente documento.

Se puede determinar fácilmente si una molécula de unión a antígeno particular (por ejemplo, un anticuerpo) o un dominio de unión a antígeno de la misma se une al mismo epítopo que, o si compite por unirse a, una molécula de unión a antígeno de referencia de la presente divulgación usando métodos de rutina conocidos en la técnica. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo de prueba se une al mismo epítopo en CD3 (o CD20) como una molécula de unión a antígeno biespecífica de referencia de la presente divulgación, primero se permite la unión de una molécula biespecífica de referencia a una proteína CD3 (o proteína CD20). A continuación, se evalúa la capacidad de un anticuerpo de prueba para unirse a la molécula CD3 (o CD20). Si el anticuerpo de ensayo puede unirse a CD3 (o CD20) después de unión de saturación con la molécula de unión a antígeno biespecífica de referencia, puede concluirse que el anticuerpo de prueba se une a un epítopo diferente de CD3 (o CD20) que la molécula de unión a antígeno biespecífica de referencia. Por otro lado, si el anticuerpo de prueba no puede unirse a la molécula CD3 (o CD20) después de unión de saturación con la molécula de unión a antígeno biespecífica de referencia, entonces el anticuerpo de ensayo puede unirse al mismo epítopo de CD3 (o CD20) que el epítopo unido por la molécula de unión a antígeno biespecífica de referencia de la divulgación. Después puede realizarse una experimentación de rutina adicional (por ejemplo, análisis de mutación de péptidos y unión peptídica) para confirmar si la falta observada de unión del anticuerpo de ensayo se debe realmente a la unión al mismo epítopo que la molécula de unión a antígeno biespecífica de referencia o si el bloqueo estérico (u otro fenómeno) es responsable de la falta de unión observada. Los experimentos de este tipo pueden realizarse usando ELISA, RIA, Biacore, citometría de flujo o cualquier otro ensayo cuantitativo o cualitativo de unión de anticuerpos disponible en la técnica. De acuerdo con determinados casos de la presente divulgación, dos proteínas de unión a antígeno se unen al mismo epítopo (o solapante) si, por ejemplo, un exceso en un factor de 1, 5, 10, 20 o 100 veces de una proteína de unión a antígeno inhibe la unión de la otra en al menos el 50 %, pero preferentemente el 75 %, 90 % o incluso el 99 %, según lo medido en un ensayo de unión competitiva (véase, por ejemplo, Junghanset al.,Cancer Res. 1990:50:1495-1502). Como alternativa, se considera que dos proteínas de unión a antígeno se unen al mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácidos en el antígeno que reducen o eliminan la unión de una proteína de unión a antígeno reducen o eliminan la unión de la otra. Se considera que dos proteínas de unión a antígeno tienen "epítopos solapantes" si solo un subconjunto de las mutaciones de aminoácidos que reducen o eliminan la unión de una proteína de unión a antígeno reduce o elimina la unión de la otra.

Para determinar si un anticuerpo o dominio de unión a antígeno del mismo compite por unirse con una molécula de unión a antígeno de referencia, se realiza la metodología de unión descrita anteriormente en dos orientaciones: En una primera orientación, se permite que la molécula de unión a antígeno de referencia se una a una proteína CD3 (o proteína CD20) en condiciones de saturación, seguido de evaluación de la unión del anticuerpo de ensayo a la molécula CD3 (o CD20). En una segunda orientación, se permite que el anticuerpo de prueba se una a una molécula CD3 (o CD20) en condiciones de saturación seguido de una evaluación de la unión de la molécula de unión al antígeno de referencia a la molécula CD3 (o CD20). Si, en ambas orientaciones, solo la primera molécula de unión al antígeno (saturante) es capaz de unirse a la molécula CD3 (o CD20), entonces se concluye que el anticuerpo de ensayo y la molécula de unión a antígeno de referencia compiten por unirse al CD3 (o CD20). Como se apreciará por un experto en la técnica, un anticuerpo que compite por unirse con una molécula de unión a antígeno de referencia no necesariamente se une al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia, sino que puede bloquear estéricamente la unión del anticuerpo de referencia mediante la unión a un epítopo solapante o adyacente.

Preparación de dominios de unión a antígeno y construcción de moléculas biespecíficas

Los dominios de unión a antígeno específicos para antígenos particulares se pueden preparar mediante cualquier tecnología generadora de anticuerpos conocida en la técnica. Una vez obtenidos, dos dominios de unión a antígeno diferentes, específicos para dos antígenos diferentes (por ejemplo, CD3 y CD20), pueden disponerse apropiadamente uno con respecto al otro para producir una molécula de unión a antígeno biespecífica de la presente divulgación usando métodos de rutina. (En otras partes del presente documento, se proporciona un análisis de formatos de anticuerpos biespecíficos ilustrativos que pueden usarse para construir las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente divulgación). En determinados casos, uno o más de los componentes individuales (por ejemplo, cadenas pesadas y ligeras) de las moléculas de unión a antígeno multiespecíficas de la divulgación se obtienen de anticuerpos quiméricos, humanizados o completamente humanos. Los métodos para fabricar tales anticuerpos se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, una o más de las cadenas pesadas y/o ligeras de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente divulgación se pueden preparar usando la tecnología VELOCIMMUNE™. Usando la tecnología VELOCIMMUNE™ (o cualquier otra tecnología de generación de anticuerpos humanos), los anticuerpos quiméricos de alta afinidad contra un antígeno particular (por ejemplo, CD3 o CD20) se aíslan inicialmente con una región variable humana y una región constante de ratón. Los anticuerpos se caracterizan y se seleccionan por características deseables, incluyendo afinidad, selectividad, epítopo, etc. Las regiones constantes de ratón se reemplazan por una región constante humana deseada para generar cadenas pesadas y/o ligeras completamente humanas que pueden incorporarse en las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente divulgación.

Pueden usarse animales genomanipulados para hacer moléculas de unión a antígeno biespecíficas humanas. Por ejemplo, puede usarse un ratón genomanipulado que es incapaz de reorganizar y expresar una secuencia variable de cadena ligera de inmunoglobulina endógena de ratón, en donde el ratón expresa solo uno o dos dominios variables de cadena ligera humana codificados por secuencias de inmunoglobulina humana unidas operativamente al gen constante kappa de ratón en el locus kappa de ratón endógeno. Dichos ratones genomanipulados pueden usarse para producir moléculas de unión a antígeno biespecíficas completamente humanas que comprendan dos cadenas pesadas diferentes que se asocien con una cadena ligera idéntica que comprenda un dominio variable procedente de uno de dos segmentos génicos de región variable de cadena ligera humana diferentes. (Véase, por ejemplo, el documento US 2011/0195454 para un análisis detallado de dichos ratones manipulados y el uso de los mismos para producir moléculas de unión a antígeno biespecíficas).

Bioequivalentes

La presente divulgación abarca moléculas de unión a antígeno que tienen secuencias de aminoácidos que varían de las de las moléculas ilustrativas desveladas en el presente documento pero que conservan la capacidad de unirse a CD3 y/o CD20. Dichas moléculas variantes pueden comprender una o más adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos cuando se comparan con la secuencia precursora, pero presentan actividad biológica que es esencialmente equivalente a la de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas descritas. Sin embargo, solo una molécula de unión a antígeno biespecífica como se define en las reivindicaciones está dentro del alcance de la invención reivindicada.

La presente divulgación incluye moléculas de unión a antígeno que son bioequivalentes a cualquiera de las moléculas de unión a antígeno ilustrativas expuestas en el presente documento. Dos proteínas de unión a antígeno, o anticuerpos, se consideran bioequivalentes si, por ejemplo, son equivalentes farmacéuticos o alternativas farmacéuticas cuya velocidad y grado de absorción no muestran una diferencia significativa cuando se administran a la misma dosis molar en condiciones experimentales similares, ya sea en una única dosis o en múltiples dosis. Algunas proteínas de unión a antígeno se considerarán equivalentes o alternativas farmacéuticas si son equivalentes en el grado de su absorción, pero no en su velocidad de absorción y, sin embargo, pueden considerarse bioequivalentes porque tales diferencias en la velocidad de absorción son intencionales y se reflejan en el mareaje, no son esenciales para obtener las concentraciones eficaces del fármaco en el organismo en, por ejemplo, el uso crónico, y se consideran médicamente irrelevantes para el fármaco estudiado en concreto. Sin embargo, solo una molécula de unión a antígeno biespecífica como se define en las reivindicaciones está dentro del alcance de la invención reivindicada.

En un caso, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si no hay diferencias clínicamente significativas en su seguridad, pureza y potencia.

En un caso, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si un paciente puede cambiar una o más veces entre el producto de referencia y el producto biológico sin un aumento esperado en el riesgo de efectos adversos, incluyendo un cambio clínicamente significativo en la inmunogenicidad o eficacia disminuida, en comparación con la terapia continuada sin dicho cambio.

En un caso, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si ambas actúan mediante un mecanismo o mecanismos de acción comunes para la afección o afecciones de uso, en la medida en que se conozcan dichos mecanismos.

La bioequivalencia puede demostrarse por métodosin vivoein vitro.Las medidas de bioequivalencia incluyen, por ejemplo, (a) una pruebain vivoen seres humanos u otros mamíferos, en la que se mide la concentración del anticuerpo o sus metabolitos en sangre, plasma, suero u otro fluido biológico en función del tiempo; (b) una pruebain vitroque se ha correlacionado con y es razonablemente predictiva de datos de biodisponibilidadin vivoen seres humanos; (c) un ensayoin vivoen seres humanos u otros mamíferos en el que se mide el efecto farmacológico agudo adecuado del anticuerpo (o su diana) en función del tiempo; y (d) en un ensayo clínico bien controlado que establece la seguridad, eficacia, biodisponibilidad o bioequivalencia de una proteína de unión a antígeno.

Las variantes bioequivalentes de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas ilustrativas expuestas en el presente documento pueden construirse mediante, por ejemplo, la generación de diferentes sustituciones de residuos o secuencias o la deleción de secuencias o residuos terminales o internos no necesarios para la actividad biológica. Por ejemplo, pueden eliminarse residuos de cisteína no esenciales para la actividad biológica, o reemplazarse por otros aminoácidos, para evitar la formación de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos tras la renaturalización. En otros contextos, las proteínas de unión a antígeno bioequivalentes pueden incluir variantes de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas ilustrativas expuestas en el presente documento que comprenden cambios de aminoácidos que modifican las características de glucosilación de las moléculas, por ejemplo, mutaciones que eliminan o retiran la glucosilación.

Selectividad de especies y reactividad cruzada de especies

De acuerdo con determinados casos de la divulgación, se proporcionan moléculas de unión a antígeno que se unen a CD3 humano pero no a CD3 de otras especies. También se proporcionan moléculas de unión a antígeno que se unen a CD20 humano pero no a CD20 de otras especies. La presente divulgación también incluye moléculas de unión a antígeno que se unen a CD3 humano y a CD3 de una o más especies no humanas; y/o moléculas de unión a antígeno que se unen a CD20 humano y a CD20 de una o más especies no humanas.

De acuerdo con determinados casos ilustrativos de la divulgación, se proporcionan moléculas de unión a antígeno que se unen a CD3 humano y/o CD20 humano y pueden unirse o no, según sea el caso, a uno o más de CD3 y/o CD20 de ratón, rata, cobaya, hámster, jerbo, cerdo, gato, perro, conejo, cabra, oveja, vaca, caballo, camello, macaco cangrejero, tití, macaco de la India o chimpancé. Por ejemplo, en un caso ilustrativo particular de la presente divulgación, se proporcionan moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une a CD3 humano y CD3 de macaco cangrejero, y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 humano.

Inmunoconjugados

La presente divulgación incluye moléculas de unión a antígeno conjugadas con un resto terapéutico ("inmunoconjugado"), tal como una citotoxina, un fármaco quimioterapéutico, un inmunodepresor o un radioisótopo. Los agentes citotóxicos incluyen cualquier agente que sea perjudicial para las células. En la técnica se conocen ejemplos de agentes citotóxicos y agentes quimioterapéuticos adecuados para formar inmunoconjugados, (véase, por ejemplo, el documento WO 05/l03081).

Formulación terapéutica y administración

La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas de unión a antígeno de la presente invención. Las composiciones farmacéuticas de la divulgación se formulan con portadores, excipientes y otros agentes adecuados que proporcionan una mejor transferencia, suministro, tolerancia y similares. Puede encontrarse una multitud de formulaciones adecuadas en el formulario conocido para todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o amónicos) (tales como LIPOFECTIN™, Life Technologies, Carlsbad, CA), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones de Carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen Carbowax. Véase también Powellet al."Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.

La dosis de la molécula de unión a antígeno administrada a un paciente puede variar según la edad y la talla del paciente, la enfermedad diana, las afecciones, la vía de administración y similares. La dosis preferida típicamente se calcula de acuerdo con el peso o la superficie corporales. Cuando una molécula de unión a antígeno biespecífica de la presente divulgación se usa con fines terapéuticos en un paciente adulto, puede ser ventajoso administrar por vía intravenosa la molécula de unión a antígeno biespecífica de la presente divulgación normalmente a una dosis única de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, más preferentemente de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 7, de aproximadamente 0,03 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal. Dependiendo de la gravedad de la afección, pueden ajustarse la frecuencia y la duración del tratamiento. Las dosis eficaces y los programas para administrar una molécula de unión a antígeno biespecífica pueden determinarse empíricamente; por ejemplo, puede controlarse el progreso del paciente mediante evaluación periódica, y ajustarse la dosis en consecuencia. Además, pueden realizarse aumentos de escala de las dosificaciones entre especies usando métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, Mordentiet al.,1991, Pharmaceut. Res. 8:1351).

Se conocen diferentes sistemas de suministro y se pueden usar para administrar la composición farmacéutica de la divulgación, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar los virus mutantes, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wuet al.,1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Los métodos de introducción incluyen, pero sin limitación, las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. La composición puede administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en bolo, mediante absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.

Una composición farmacéutica de la presente divulgación puede suministrarse por vía subcutánea o intravenosa con una aguja y jeringa estándar. Adicionalmente, con respecto al suministro subcutáneo, un dispositivo inyector de pluma tiene aplicaciones fácilmente en el suministro de una composición farmacéutica de la presente divulgación. Dicho dispositivo inyector de pluma puede ser reutilizable o desechable. Un dispositivo inyector de pluma reutilizable utiliza generalmente un cartucho reemplazable que contiene una composición farmacéutica. Una vez que se ha administrado toda la composición farmacéutica del cartucho y que el cartucho está vacío, el cartucho vacío puede desecharse fácilmente y sustituirse por un nuevo cartucho que contenga la composición farmacéutica. El dispositivo inyector de pluma puede entonces reutilizarse. En un dispositivo inyector de pluma desechable, no hay cartucho sustituible. Más bien, el dispositivo inyector de pluma desechable viene precargado con la composición farmacéutica mantenida en un depósito dentro del dispositivo. Una vez que el depósito se vacía de la composición farmacéutica, se desecha todo el dispositivo.

Numerosos dispositivos inyectores de pluma y autoinyectores reutilizables tienen aplicaciones en el suministro subcutáneo de una composición farmacéutica de la presente divulgación. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, RU), pluma DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Suiza), pluma HUMALOG MIX 75/25™, pluma HUMALOG™, pluma HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly y Co., Indianápolis, IN), NOVOPEN™ I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), pluma BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ y OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Alemania), por nombrar solo algunos. Los ejemplos de dispositivos inyectores de pluma desechables que tienen aplicaciones en el suministro subcutáneo de una composición farmacéutica de la presente divulgación incluyen, pero sin limitación, la pluma SOLOSTAR™ (sanofiaventis), la pluma FLEXPEN™ (Novo Nordisk) y la pluma KWIKPEN™ (Eli Lilly), el inyector SURECLICK™ (Amgen, Thousand Oaks, CA), la pluma Pe NLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Alemania), la pluma EPIPEN (Dey, L.P.) y la pluma HUMIRA™ (Abbott Labs, Abbott Park IL), por nombrar solo algunos.

En determinadas situaciones, la composición farmacéutica se puede suministrar en un sistema de liberación controlada. En un caso, puede usarse una bomba (véase Langer, anteriormente; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). En otro caso, se pueden usar materiales poliméricos; véase, Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), 1974, c Rc Pres., Boca Raton, Florida. En otro caso más, puede colocarse en las proximidades de la diana de la composición un sistema de liberación controlada, siendo necesaria, por tanto, solo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, 1984, en Medical Applications of Controlled Release, anteriormente, vol. 2, págs. 115-138). Se analizan otros sistemas de liberación controlada en la revisión de Langer, 1990, Science 249:1527-1533.

Las preparaciones inyectables pueden incluir formas farmacéuticas para inyecciones intravenosas, subcutáneas, intracutáneas e intramusculares, infusiones por goteo, etc. Estas preparaciones inyectables pueden prepararse mediante métodos conocidos por el público en general. Por ejemplo, las preparaciones inyectables pueden prepararse, por ejemplo, mediante disolución, suspensión o emulsión del anticuerpo o su sal descrita anteriormente en un medio acuoso estéril o un medio oleoso usado convencionalmente para inyecciones. Como medio acuoso para inyecciones, existen, por ejemplo, solución salina fisiológica, una solución isotónica que contiene glucosa y otros agentes auxiliares, etc., que pueden usarse junto con un agente solubilizante apropiado, tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol), un tensioactivo no iónico [por ejemplo, polisorbato 80, HCO-50 (aducto de polioxietileno (50 mol) de aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como medio oleoso, se emplean, por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de soja, etc., que pueden usarse en combinación con un agente solubilizante tal como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección así preparada se carga preferentemente en una ampolla apropiada.

Ventajosamente, las composiciones farmacéuticas para su uso oral o parenteral descritas anteriormente se preparan en formas farmacéuticas en una dosis unitaria adecuada para ajustarse a una dosis de los principios activos. Dichas formas farmacéuticas en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, píldoras, cápsulas, inyecciones (ampollas), supositorios, etc. La cantidad del anticuerpo mencionado anteriormente contenida es generalmente de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg por forma farmacéutica en una dosis unitaria; especialmente en forma de inyección, se prefiere que el anticuerpo anteriormente mencionado esté contenido en aproximadamente 5 a aproximadamente 100 mg y en aproximadamente 10 a aproximadamente 250 mg para las demás formas farmacéuticas.

Usos terapéuticos de las moléculas de unión a antígeno

La presente divulgación incluye métodos que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una composición terapéutica que comprende un anticuerpo anti CD3 o una molécula de unión a antígeno biespecífica que se une específicamente a CD3 y un antígeno diana (por ejemplo, CD20). La composición terapéutica puede comprender cualquiera de los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas desveladas en el presente documento y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, la expresión "un sujeto que lo necesite" se refiere a un ser humano o animal no humano que presenta uno o más síntomas o indicios de cáncer (por ejemplo, un sujeto que expresa un tumor o padece cualquiera de los cánceres mencionados a continuación) o que, de otro modo, se beneficiaría de una inhibición o reducción de la actividad de CD20 o de un agotamiento de los linfocitos B CD20+. Sin embargo, los métodos terapéuticos en sí mismos no forman parte de la invención reivindicada.

Los anticuerpos y las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la divulgación (y composiciones terapéuticas que los comprenden) son útiles, entre otras cosas, para tratar cualquier enfermedad o trastorno en el que la estimulación, activación y/o direccionamiento de una respuesta inmunitaria sería beneficiosa. En particular, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti CD3/anti CD20 de la presente divulgación pueden usarse para el tratamiento, prevención y/o mejora de cualquier enfermedad o trastorno asociado o mediado por la expresión o actividad de CD20 o la proliferación de linfocitos B CD20+. El mecanismo de acción mediante el cual se logran los métodos terapéuticos de la divulgación incluyen destrucción de células que expresan CD20 en presencia de células efectoras, por ejemplo, mediante CDC, apoptosis, CCDA, fagocitosis, o por una combinación de dos o más de estos mecanismos. Las células que expresan CD20 que pueden inhibirse o destruirse usando las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la divulgación incluyen, por ejemplo, linfocitos B tumorigénicos.

Las moléculas de unión a antígeno de la presente divulgación pueden usarse para tratar, por ejemplo, tumores primarios y/o metastásicos que surgen en el cerebro y las meninges, orofaringe, árbol pulmonar y bronquial, tracto gastrointestinal, sistema reproductor masculino y femenino, músculo, hueso, piel y anejos cutáneos, tejido conectivo, bazo, sistema inmunitario, células que forman la sangre y la médula ósea, el hígado y el sistema urinario, y órganos sensoriales especiales tales como el ojo. En determinados casos, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la divulgación se usan para tratar uno o más de los siguientes cánceres: carcinoma de células renales, carcinoma de páncreas, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de próstata, gliomas malignos, osteosarcoma, cáncer colorrectal, cáncer gástrico (por ejemplo, cáncer gástrico con amplificación MET), mesotelioma maligno, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, sarcoma sinovial, cáncer de tiroides o melanoma. De acuerdo con determinados casos ilustrativos, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente divulgación se usan para tratar un cáncer de linfocitos B (por ejemplo, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin [NHL], leucemia/linfoma linfoblástico de linfocitos B precursores, neoplasias de linfocitos B maduros, leucemia linfocítica crónica de linfocitos B/linfoma microlinfocítico, leucemia prolinfocítica de linfocitos B, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de células del manto, linfoma folicular, linfoma cutáneo del centro folicular, linfoma de linfocitos B de zona marginal, tricoleucemia, linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma de Burkitt, plasmacitoma, mieloma de células plasmáticas, trastorno linfoproliferativo posterior a trasplante, macroglobulinemia de Waldenstrom y linfoma anaplásico macrocelular).

De acuerdo con determinados casos de la presente divulgación, las moléculas de unión a antígeno son útiles para tratar a un paciente afectado por un linfoma de linfocitos B (por ejemplo, NHL) que es resistente o responde de manera incompleta a la terapia anti CD20 sola (por ejemplo, resistente a la terapia con rituximab). De acuerdo con otros casos relacionados de la divulgación, se proporcionan métodos que comprenden administrar una molécula de unión a antígeno biespecífica anti CD3/anti C<d>20 como se desvela en el presente documento a un paciente que padece un linterna de linfocitos B (por ejemplo, NHL) que es refractario a la terapia anti CD20 (por ejemplo, un paciente con un tumor refractario a rituximab o con linterna de linfocitos B recidivante o refractario). Pueden usarse métodos analíticos/diagnósticos conocidos en la técnica, tales como exploración tumoral, etc., para determinar si un paciente alberga un tumor resistente a, que responde de forma incompleta o es refractario al tratamiento anti CD20 solo.

La presente divulgación también incluye métodos para tratar el cáncer residual en un sujeto. Como se usa en el presente documento, la expresión "cáncer residual" significa la existencia o persistencia de una o más células cancerosas en un sujeto después de tratamiento con una terapia contra el cáncer.

De acuerdo con determinados aspectos, la presente divulgación proporciona métodos para tratar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión de CD20 (por ejemplo, linfoma de linfocitos B) que comprenden administrar a un sujeto una o más de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas descritas en otras partes en el presente documento después de que el sujeto haya recibido monoterapia anti CD20 (por ejemplo, después de la administración de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti c D20 tal como rituximab). Por ejemplo, la presente divulgación incluye métodos para tratar el linfoma de linfocitos B que comprenden administrar una molécula de unión a antígeno biespecífica anti CD3/anti CD20 a un paciente 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas o 4 semanas, 2 meses, 4 meses, 6 meses, 8 meses, 1 año o más después de que el sujeto haya recibido monoterapia anti CD20 (por ejemplo, tratamiento con rituximab o un tratamiento equivalente del mismo). En otros aspectos, una molécula de unión a antígeno biespecífica de la divulgación (una molécula de unión a antígeno biespecífica anti CD3/anti CD20) que comprende un dominio Fc de IgG4 se administra inicialmente a un sujeto en uno o más puntos temporales (por ejemplo, para proporcionar un agotamiento inicial sólido de linfocitos B), seguido de la administración de una molécula de unión a antígeno biespecífica equivalente que comprende un dominio de IgG diferente, tal como un dominio Fc de IgG1, en puntos temporales posteriores.

Terapias y formulaciones de combinación

Una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los anticuerpos ilustrativos y moléculas de unión a antígeno biespecíficas descritas en el presente documento puede administrarse junto con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Los agentes terapéuticos adicionales ilustrativos que pueden combinarse o administrarse junto con una molécula de unión a antígeno de la presente divulgación incluyen, por ejemplo, un antagonista de EGFR (por ejemplo, un anticuerpo anti EGFR [por ejemplo, cetuximab o panitumumab] o inhibidor de molécula pequeña de EGFR [por ejemplo, gefitinib o erlotinib]), un antagonista de otro miembro de la familia EGFR tal como Her2/ErbB2, ErbB3 o ErbB4 (por ejemplo, anticuerpo anti ErbB2, anti ErbB3 o anti ErbB4 o inhibidor de molécula pequeña de la actividad de ErbB2, ErbB3 o ErbB4), un antagonista de EGFRvIII (por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a EGFRvlll), un antagonista de cMET (por ejemplo, un anticuerpo anti cMET), un antagonista de IGF1R (por ejemplo, un anticuerpo anti IGF1R), un inhibidor de B-raf (por ejemplo, vemurafenib, sorafenib, GDC-0879, PLX-4720), un inhibidor de PDGFR-a (por ejemplo, un anticuerpo anti PDGFR-a), un inhibidor de PDGFR-p (por ejemplo, un anticuerpo anti PDGFR-p), un antagonista de VEGF (por ejemplo, una trampa de VEGF, véase, por ejemplo, el documento US 7.087.411 (también denominado en el presente documento "proteína de fusión inhibidora de VEGF"), anticuerpo anti VEGF (por ejemplo, bevacizumab), un inhibidor de cinasa de molécula pequeña del receptor de VEGF (por ejemplo, sunitinib, sorafenib o pazopanib)), un antagonista de DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo anti DLL4 desvelado en el documento US 2009/0142354, tal como REGN421), un antagonista de Ang2 (por ejemplo, un anticuerpo anti Ang2 desvelado en el documento US 2011/0027286 tal como H1H685P), un antagonista de FOLH1 (por ejemplo, un anticuerpo anti FOLH1), un antagonista de PRLR (por ejemplo, un anticuerpo anti PRLR), un antagonista de STEAP1 o STEAP2 (por ejemplo, un anticuerpo anti STEAP1 o un anticuerpo anti STEAP2), un antagonista de TMPRSS2 (por ejemplo, un anticuerpo anti TMPRSS2), un antagonista de MSLN (por ejemplo, un anticuerpo anti MSLN), un antagonista de CA9 (por ejemplo, un anticuerpo anti CA9), un antagonista de uroplaquina (por ejemplo, un anticuerpo anti uroplaquina), un antagonista monovalente de CD20 (por ejemplo, un anticuerpo anti CD20 monovalente tal como rituximab), etc. Otros agentes que pueden administrarse beneficiosamente junto con las moléculas de unión a antígeno de la divulgación incluyen inhibidores de citocinas, incluyendo inhibidores de citocina de molécula pequeña y anticuerpos que se unen a citocinas tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18 o a sus receptores respectivos. Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación (por ejemplo, composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula de unión a antígeno biespecífica anti cD3/anti CD20 como se desvela en el presente documento) también pueden administrarse como parte de un régimen terapéutico que comprende una o más combinaciones terapéuticas seleccionadas de "ICE ": ifosfamida (por ejemplo, Ifex®), carboplatino (por ejemplo, Paraplatin®), etopósido (por ejemplo, Etopophos®, Toposar®, VePesid®, VP-16); "DHAP": dexametasona (por ejemplo, Decadron®), citarabina (por ejemplo, Cytosar-U®, arabinósido de citosina, ara-C), cisplatino (por ejemplo, Platinol®-AQ); y "ESHAP": etopósido (por ejemplo, Etopophos®, Toposar®, VePesid®, VP-16), metilprednisolona (por ejemplo, Medrol®), citarabina en dosis altas, cisplatino (por ejemplo, Platinol®-AQ).

La presente divulgación también incluye combinaciones terapéuticas que comprenden cualquiera de las moléculas de unión a antígeno mencionadas en el presente documento y un inhibidor de uno o más de VEGF, Ang2, DLL4, EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EGFRvlll, cMet, IGF1R, B-raf, PDGFR-a, PDGFR-p, FOLH1, PRLR, STEAP1, STEAP2, TMPRSS2, MSLN, CA9, uroplaquina o cualquiera de las citocinas mencionadas anteriormente, en donde el inhibidor es un aptámero, una molécula no codificante, una ribozima, un ARNip, un pepticuerpo, un nanocuerpo o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, fragmento Fab; fragmento F(ab')2; fragmento Fd; fragmento Fv; scFv; fragmento dAb; u otras moléculas manipuladas, tales como diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos y unidades de reconocimiento mínimas). Las moléculas de unión a antígeno de la divulgación también pueden administrarse y/o formularse junto con antivíricos, antibióticos, analgésicos, corticosteroides y/o AINE. Las moléculas de unión a antígeno de la divulgación también pueden administrarse como parte de una pauta de tratamiento que también incluye tratamiento con radiación y/o quimioterapia convencional.

El uno o más componentes terapéuticamente activos adicionales pueden administrarse justo antes, de manera simultánea o poco después de la administración de una molécula de unión a antígeno de la presente divulgación; (para los fines de la presente divulgación, dichas pautas de administración se consideran la administración de una molécula de unión a antígeno "junto con" un componente terapéuticamente activo adicional).

La presente divulgación incluye composiciones farmacéuticas en donde una molécula de unión a antígeno de la presente divulgación se formula junto con uno o más de los componentes terapéuticamente activos adicionales como se describe en otra parte del presente documento.

Pautas de administración

De acuerdo con determinados casos de la presente divulgación, pueden administrarse a un sujeto dosis múltiples de una molécula de unión a antígeno (por ejemplo, un anticuerpo anti CD3 o una molécula de unión a antígeno biespecífica que se une específicamente a CD20 y CD3) durante un período de tiempo definido. Los métodos según este aspecto de la divulgación comprenden administrar secuencialmente a un sujeto múltiples dosis de una molécula de unión a antígeno de la divulgación. Como se usa en el presente documento, "administrar de manera secuencial" significa que cada dosis de una molécula de unión a antígeno se administra al sujeto en un momento diferente, por ejemplo, en días diferentes separados por un intervalo predeterminado (por ejemplo, horas, días, semanas o meses). La presente divulgación incluye métodos que comprenden administrar secuencialmente al paciente una dosis inicial única de una molécula de unión a antígeno, seguido de una o más dosis secundarias de la molécula de unión a antígeno, y opcionalmente seguido de una o más dosis terciarias de la molécula de unión a antígeno.

Las expresiones "dosis inicial", "dosis secundarias", y "dosis terciarias", se refieren a la secuencia temporal de administración de la molécula de unión a antígeno de la divulgación. Por lo tanto, la "dosis inicial" es la dosis que se administra al inicio de la pauta de tratamiento (también denominada "dosis de referencia"); las "dosis secundarias" son las dosis que se administran después de la dosis inicial; y las "dosis terciarias" son las dosis que se administran después de las dosis secundarias. Las dosis inicial, secundaria y terciaria pueden contener la misma cantidad de la molécula de unión a antígeno, pero generalmente pueden diferir entre sí en términos de frecuencia de administración. En determinados casos, sin embargo, la cantidad de una molécula de unión a antígeno contenida en las dosis inicial, secundaria y/o terciaria varían entre sí (por ejemplo, ajustadas hacia arriba o hacia abajo según corresponda) durante el curso del tratamiento. En determinados casos, se administran dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) dosis al comienzo de la pauta de tratamiento como "dosis de carga" seguidas de dosis posteriores que se administran con menos frecuencia (por ejemplo, "dosis de mantenimiento").

En un caso ilustrativo de la presente divulgación, cada dosis secundaria y/o terciaria se administra de 1 a 26 (por ejemplo, 1, 1 / , 2, 2 / 3, 3 / 4, 41/ 25, 51/ 26, 61/ 27, 71/ 28, 81/ 29, 91/ 210, 101/ 211, 11 /, 12, 121/ 213, 131/ 214, 141/ 215, 151/ 2, 16, 16 /, 17, 17 /, 18, 18 /, 19, 19 /, 20, 20 /, 21, 21 /, 22, 22 /, 23, 23 /, 24, 24 /, 25, 25 /, 26, 26 / o más) semanas después de la dosis inmediatamente anterior. La expresión "la dosis inmediatamente anterior", como se usa en el presente documento, significa, en una secuencia de administraciones múltiples, la dosis de la molécula de unión a antígeno que se administra a un paciente antes de la administración de la siguiente dosis en la secuencia sin dosis intermedias.

Los métodos de acuerdo con este aspecto de la divulgación pueden comprender la administración a un paciente de cualquier número de dosis secundarias y/o terciarias de una molécula de unión a antígeno (por ejemplo, un anticuerpo anti CD3 o una molécula de unión a antígeno biespecífica que se une específicamente a CD20 y CD3). Por ejemplo, en determinados casos, solo se administra una dosis secundaria única al paciente. En otros casos, se administran al paciente dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis secundarias. Análogamente, en determinados casos, solo se administra al paciente una dosis terciaria única. En otros casos, se administran al paciente dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis terciarias.

En casos que implican múltiples dosis secundarias, cada dosis secundaria puede administrarse a la misma frecuencia que las otras dosis secundarias. Por ejemplo, cada dosis secundaria puede administrarse al paciente de 1 a 2 semanas después de la dosis inmediatamente anterior. De manera similar, en casos que implican múltiples dosis terciarias, cada dosis terciaria puede administrarse a la misma frecuencia que las otras dosis terciarias. Por ejemplo, cada dosis terciaria puede administrarse al paciente de 2 a 4 semanas después de la dosis inmediatamente anterior. Como alternativa, la frecuencia a la que se administran las dosis secundarias y/o terciarias a un paciente puede variar en el transcurso de la pauta de tratamiento. La frecuencia de administración también puede ajustarla un médico durante el transcurso del tratamiento, dependiendo de las necesidades del paciente individual después del examen clínico.

Usos diagnósticos de los anticuerpos

Los anticuerpos anti CD3 de la presente divulgación también pueden usarse para detectar y/o medir CD3, o células que expresan CD3 en una muestra, por ejemplo, con fines diagnósticos. Por ejemplo, un anticuerpos anti CD3, o fragmento del mismo, puede usarse para diagnosticar una afección o enfermedad caracterizada por la expresión anómala (por ejemplo, sobreexpresión, subexpresión, ausencia de expresión, etc.) de CD3. Los ensayos de diagnóstico ilustrativos para CD3 pueden comprender, por ejemplo, poner en contacto una muestra, obtenida de un paciente, con un anticuerpo anti c D3 de la divulgación, en donde el anticuerpo anti CD3 está marcado con un marcador detectable o una molécula indicadora. Como alternativa, se puede usar un anticuerpo anti CD3 no marcado en aplicaciones de diagnóstico en combinación con un anticuerpo secundario que está marcado de forma detectable por sí mismo. El marcador detectable o molécula indicadora puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S o 125I; un resto fluorescente o quimioluminiscente tal como isotiocianato de fluoresceína o rodamina; o una enzima tal como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, peroxidasa de rábano picante o luciferasa. Los ensayos ilustrativos específicos que pueden usarse para detectar o medir CD3 en una muestra incluyen el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA, por sus siglas en inglés) y clasificación de células activada por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés). Las muestras que se pueden usar en los ensayos de diagnóstico de CD3 de acuerdo con la presente divulgación incluyen cualquier muestra de tejido o fluido que se pueda obtener de un paciente que contenga cantidades detectables de la proteína CD3, o fragmentos de la misma, en condiciones normales o patológicas. Generalmente, los niveles de CD3 en una muestra particular obtenida de un paciente sano (por ejemplo, un paciente no afectado por una enfermedad o afección asociada con niveles o actividad de CD3 anómalos) se medirán para establecer inicialmente un nivel de referencia o estándar de CD3. A continuación, este nivel de referencia de CD3 puede compararse con los niveles de CD3 medidos en muestras obtenidas de individuos de los que se sospecha que tienen un trastorno o afección relacionado con CD3.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la técnica una divulgación y descripción completas de cómo hacer y usar los métodos y composiciones de la divulgación. Se ha intentado garantizar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados y la presión es atmosférica o cercana a la atmosférica.

Ejemplo 1. Generación de anticuerpos anti CD3

Los anticuerpos anti CD3 se obtuvieron mediante la inmunización de un ratón VELOCIMMUNE® (es decir, un ratón manipulado comprendía ADN que codifica regiones variables de cadena ligera y pesada kappa de inmunoglobulina humana) con células que expresaban CD3 o con ADN que codificaba CD3. La respuesta inmunitaria de los anticuerpos se controló mediante un inmunoensayo específico de CD3. Cuando se logró una respuesta inmunitaria deseada, se recogieron los esplenocitos y se fusionaron con células de mieloma de ratón para conservar su viabilidad y formar líneas celulares de hibridoma. Las líneas celulares de hibridoma se cribaron y se seleccionaron para identificar líneas celulares que producían anticuerpos específicos de CD3. Usando esta técnica se obtuvieron varios anticuerpos quiméricos anti CD3 (es decir, anticuerpos que poseían dominios variables humanos y dominios constantes de ratón). Adicionalmente, se aislaron varios anticuerpos anti CD3 completamente humanos directamente de linfocitos B positivos para antígeno sin fusión con células de mieloma, como se describe en el documento US 2007/0280945A1.

Determinadas propiedades biológicas de los anticuerpos anti CD3 ilustrativos generados de acuerdo con los métodos de este ejemplo se describen en detalle en los ejemplos expuestos a continuación.

Ejemplo 2. Secuencias de aminoácidos y ácido nucleico de región variable de cadena pesada y ligera

La tabla 1 expone los identificadores de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera y las CDR de los anticuerpos anti CD3 seleccionados de la divulgación. Los identificadores de secuencia de ácido nucleico correspondientes se exponen en la tabla 2.

Tabla 1: Identificadores de las secuencias de aminoácidos

continuación

Tabla 2: Identificadores de las secuencias de ácidos nucleicos

continuación

Los anticuerpos se denominan típicamente en el presente documento de acuerdo con la siguiente nomenclatura: Prefijo Fc (por ejemplo, "H1H", "H1M", "H2M", etc.), seguido de un identificador numérico (por ejemplo, "2712", "2692", etc., como se muestra en la tabla 1), seguido de un sufijo "P", "N" o "B". Por lo tanto, de acuerdo con esta nomenclatura, un anticuerpo puede denominarse en el presente documento, por ejemplo, "H1H2712N", "H1M2692N", "H2M2689N", etc. Los prefijos H1H, H1M y H2M en las denominaciones de anticuerpo usadas en el presente documento indican el isotipo de la región Fc particular del anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo "H1H" tiene un Fc de IgG1 humana, un anticuerpo "H1M" tiene un Fc de IgG1 de ratón, y un anticuerpo "H2M" tiene un Fc de IgG2 de ratón, (todas las regiones variables son completamente humanas, como se indica con la primera "H" en la denominación del anticuerpo). Como se apreciará por un experto en la técnica, un anticuerpo que tiene un isotipo de Fc particular se puede convertir en un anticuerpo con un isotipo de Fc diferente (por ejemplo, un anticuerpo con un Fc de IgG1 de ratón se puede convertir en un anticuerpo con una IgG4 humana, etc.), pero en cualquier caso, los dominios variables (incluyendo las CDR), que se indican mediante los identificadores numéricos que se muestran en la tabla 1, seguirán siendo los mismos, y se espera que las propiedades de unión sean idénticas o sustancialmente similares independientemente de la naturaleza del dominio Fc.

Construcciones de control usadas en los siguientes ejemplos

Se incluyeron diversas construcciones de control (anticuerpos anti CD3) en los siguientes experimentos con fines comparativos: "OKT-3", un anticuerpo monoclonal de ratón contra antígenos de superficie de linfocitos T humanos disponible en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) con el n.° de catálogo CRL-8001; y "SP34", un anticuerpo monoclonal de ratón disponible comercialmente obtenido en Biolegend, San Diego, CA (Cat. N.° 302914), reactivo contra la cadena épsilon del complejo T3 en linfocitos T humanos.

Ejemplo 3. Afinidades de unión y constantes cinéticas obtenidas por resonancia de plasmón superficial de anticuerpos anti CD3 monoclonales humanos

Las afinidades de unión y las constantes cinéticas de los anticuerpos anti CD3 monoclonales humanos se determinaron mediante resonancia de plasmón superficial a 25 °C usando un formato de captura de anticuerpo (tablas 3, 5 y 7) o un formato de captura de antígeno (tablas 4, 6 y 8). Las mediciones se realizaron en un instrumento T200 Biacore.

En el formato de captura de anticuerpo, la superficie del sensor Biacore se derivatizó con un Fc anti ratón de conejo para la captura de hibridoma (prefijo de anticuerpo H1M o H2M) o una superficie de Fc anti humano de ratón para anticuerpos humanos en formato IgG (prefijo de anticuerpo H1H). La proteína CD3 heterodimérica soluble (hCD3-épsilon/hCD3-delta; SEQ ID NO:1370/1371) con un marcador Fc humano (hFcAAdp/hFc; SEQ ID NO: 1372/1373) o un marcador Fc de ratón (mFcAAdp/mFc; SEQ ID NO:1374/1375) se inyectó sobre la superficie capturada del anticuerpo y se registró la respuesta de unión. La proteína CD3 heterodimérica se purificó mediante el método descrito en Daviset al.(documento US2010/0331527).

En el formato de captura de antígeno, se capturó la proteína CD3 heterodimérica usando un Fc anti ratón de conejo o un Fc anti humano de ratón y se inyectaron los anticuerpos respectivos sobre el antígeno capturado.

Los anticuerpos se analizaron en su formato divalente convencional (tablas 3 a 6) o en una configuración monovalente de 1 brazo (tablas 7 y 8) en la que se eliminó el segundo Fab del anticuerpo y solo se expresó la porción Fc (CH2-CH3).

Las constantes de velocidad de asociación (ka) y disociación (kd) cinéticas se determinaron procesando y ajustando los datos a un modelo de unión 1:1 usando el software de ajuste de curvas Scrubber 2.0. Las constantes en equilibrio de disociación de unión (K<d>) y las semividas disociativas (t i/2) se calcularon a partir de las constantes de velocidad cinéticas como: K<d>(M) = kd/ka; y t1/2 (min) = (In2/(60*kd). NE = No ensayado; SU = sin unión observada.

Ta l : Afini ni n r Bi r mA hi ri m H1M H2M)

continuación

Ta M)

continuación

T l : Afini ni n r Bi r mA F h m n H1H )

continuación

Ta l : Afini ni n r Bi r mA F h m n H1H)

bla 7: Afinidades de unión or Biacore de mAb monovalentes de 1 brazo

continuación

Ta azo

continuación

Como se muestra en las tablas 3-8, varios anticuerpos anti CD3 de la presente divulgación se unen a CD3, en formatos de captura de anticuerpo o de captura de antígeno, con alta afinidad.

Ejemplo 4. Los anticuerpos anti CD3 se unen a los linfocitos T humanos e inducen su proliferación

Los anticuerpos anti CD3 de la presente divulgación se ensayaron para determinar su capacidad para unirse a los linfocitos T humanos e inducir su proliferación. La unión se evaluó usando células Jurkat (una línea de linfocitos T humanos CD3+), mientras que la proliferación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se evaluó usando cuantificación catalizada por ATP (CellTiter Glo®). El anticuerpo anti CD3 OKT3 actuó como control positivo y los anticuerpos emparejados de isotipo irrelevantes sirvieron como controles negativos.

Los datos de FACS se adquirieron usando el siguiente protocolo: Se incubaron células a razón de 2x105 por pocillo con anticuerpos diluidos en serie durante 30 min en hielo. Después de la incubación, las células se lavaron, y se añadió anticuerpo secundario y se incubó durante 30 minutos más. Después de la incubación, las células se lavaron, se volvieron a suspender en PBS frío que contenía BSA al 1 % y se analizaron por citometría de flujo con células Jurkat viables separadas por dispersión lateral y frontal. Las CE50para la valoración de unión celular se determinaron usando el software Prism con valores calculados usando un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros.

Se adquirieron los datos de proliferación usando el siguiente protocolo: Se incubaron PBMC humanas (5x104/pocillo) con una dilución en serie triple de anti CD3 y una concentración fija de un anticuerpo anti CD28 comercial (200 ng/ml) en placas de 96 pocillos durante 72 h a 37 °C. Tras la incubación, se añadió CellTiter Glo® y se midió la luminiscencia usando un lector de placas multietiqueta VICTOR X5 (PerkinElmer). La CE50de la viabilidad celular (cuantificación catalizada por ATP) se calculó mediante un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros en GraphPad Prism.

Los resultados de los experimentos de unión y proliferación se resumen en las tablas 9-11.

Tabla 9: L oliferación

continuación

Tabla 10: L mA ni D F h m n n n l linf i T h m n in n roliferación

continuación

Tabla 11: Los mAb anti CD3 monovalentes de 1 brazo se unen a los linfocitos T humanos e inducen su roliferación

Como se muestra en las tablas 7-9, la gran mayoría de los anticuerpos anti CD3 de la divulgación se unieron a linfocitos T humanos e indujeron la proliferación de linfocitos T.

Ejemplo 5. Los anticuerpos anti CD3 se unen a los linfocitos T de mono e inducen su proliferación

Se ensayó un subconjunto de anticuerpos anti CD3 de la divulgación para determinar la capacidad de unirse a linfocitos T de mono e inducir su proliferación.

Los datos de FACS se adquirieron usando el siguiente protocolo: Se incubaron células a razón de 2x105 por pocillo con anticuerpos diluidos en serie durante 30 min en hielo. Después de la incubación, las células se lavaron, y se añadieron anticuerpos secundarios y se incubaron durante 30 minutos más. Después de la incubación, las células se lavaron, se suspendieron de nuevo en PBS frío que contenía BSA al 1 % y se analizaron por citometría de flujo. Los linfocitos T de mono CD4+ se seleccionaron por dispersión lateral y frontal, y en la población CD2+CD4+CD20-. Las CE50de la valoración de unión celular se calcularon mediante un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros en GraphPad Prism.

Se adquirieron los datos de proliferación usando el siguiente protocolo: Se incubaron PBMC de macaco cangrejero recién aisladas (5x104/pocillo) con una dilución en serie triple de anticuerpo anti CD3 y una concentración fija de un anticuerpo anti CD28 comercial (500 ng/ml) en placas de 96 pocillos durante 72 h a 37 °C. Tras la incubación, se añadió CellTiter Glo® y se midió la luminiscencia usando un lector de placas multietiqueta VICTOR X5 (PerkinElmer). La CE50de la viabilidad celular (cuantificación catalizada por ATP) se calculó mediante un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros en GraphPad Prism.

Los resultados de los experimentos de unión y proliferación se resumen en las tablas 12 y 13.

T l 12: L mA ni D nn PBM m n in n r lif r i n

Tabla 13: Los mAb anti CD3 monovalentes de 1 brazo se unen a PBMC de mono e inducen su proliferación

Como se muestra en las tablas 12 y 13, varios anticuerpos anti CD3 de la divulgación se unieron a los linfocitos T de mono CD2+CD4+ e indujeron su proliferación. OKT3 no impulsó la proliferación de PBMC de mono, mientras que SP34 fue activo frente a las PBMC de mono.

Ejemplo 6. Los mAb anti CD3 favorecen la destrucción de células tumorales mediada por linfocitos TSe estudió la capacidad de los anticuerpos anti CD3 para redirigir la destrucción mediada por linfocitos T mediante interacciones Fc/FcR usando un ensayo de destrucción de U937 a base de calceína. Brevemente, las PBMC humanas se aislaron con Ficoll-Paque y se activaron durante un período de varios días con medios que contenían IL-2 humana (30 U/ml) y perlas de activación de linfocitos T (anti CD3/CD28). Las células U937 se marcaron con calceína y a continuación se incubaron con linfocitos T activados en una relación de 10:1 de efector: diana usando diluciones triples en serie de anticuerpos durante un período de 3 horas a 37 °C. Tras la incubación, las placas se centrifugaron y los sobrenadantes se transfirieron a una placa de fondo transparente de color negro translúcido para el análisis de fluorescencia. Los valores de CE50, definidos como la concentración molar de anticuerpo CD3 que induce un 50 % de citotoxicidad, se calcularon usando un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros en GraphPad Prism. Los resultados usando anticuerpos de hibridoma, anticuerpos Fc humanos y anticuerpos monovalentes de un brazo se muestran en las tablas 14, 15 y 16, respectivamente.

Tabla 14: Los mAb anti CD3 de hibridoma rediri en la destrucción de linfocitos T a las células U937

Tabla 15: Los mAb anti CD3 con formato Fc humano redirigen la destrucción de linfocitos T a las células

U937

Tabla 16: Los mAb anti CD3 monovalentes de 1 brazo redirigen la destrucción de linfocitos T a las células

U937

continuación

Como se muestra en las tablas 14-16, la mayoría de los anticuerpos anti CD3, así como OKT3, apoyaron la destrucción mediada por linfocitos T redirigidos en este sistema de ensayo. La destrucción observada, que se cree que depende del acoplamiento de Fc del anticuerpo con el receptor Fc en las células U937, lo que conduce a la agrupación de CD3 en los linfocitos T adyacentes, se suprimió mediante la adición de IgG humana no específica (datos no mostrados).

Ejemplo 7. Generación de anticuerpos biespecíficos que se unen a CD3 y CD20

Los anticuerpos biespecíficos que comprenden un dominio de unión específico anti CD3 y un dominio de unión específico anti CD20 se construyeron usando metodologías estándar en donde una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo anti CD3 se combinaron con una cadena pesada de un anticuerpo anti CD20. Los anticuerpos anti CD3 usados para construir los anticuerpos biespecíficos de este ejemplo se obtuvieron inmunizando un ratón VelocImmune® con células que expresaban CD3 o con ADN que codificaba CD3, o en el caso de BS3/20-007 y -009, de un anticuerpo anti CD3 conocido (es decir, el anticuerpo anti CD3 "L2K" como se expone en el documento WO2004/106380). Los anticuerpos anti CD20 usados para construir los anticuerpos biespecíficos de este ejemplo son los expuestos en el documento US 7.879.984.

Los anticuerpos biespecíficos creados de acuerdo con el presente ejemplo comprenden dos dominios de unión a antígeno separados (es decir, brazos de unión). El primer dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada derivada de un anticuerpo anti CD20 ("CD20-VH"), emparejada con una región variable de cadena ligera derivada de un anticuerpo anti CD3 ("CD3-VL"). El emparejamiento CD20-VH/CD3-VL crea un dominio de unión a antígeno que reconoce específicamente CD20. El segundo dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada derivada de un anticuerpo anti CD3 ("CD3-VH"), emparejada con una región variable de cadena ligera derivada de un anticuerpo anti CD3 ("CD3-VL"). El emparejamiento CD3-VH/CD3-VL crea un dominio de unión a antígeno que reconoce específicamente CD3. Se usó la misma CD20-VH en todos los anticuerpos biespecíficos creados en este ejemplo y se denomina "CD20-VH-A" (excepto para BS3/20-009, que usó una CD20-VH diferente denominada "CD20-VH-B"). Sin embargo, varios componentes diferentes de CD3-VH y CD3-VL (designados "CD3-VH-A, CD3-VH-B, etc. y CD3-VL-A, CD3-VL-B, etc., derivados de diferentes anticuerpos anti CD3) se usaron en los diferentes anticuerpos biespecíficos de los siguientes ejemplos.

En la tabla 17 se expone un resumen de las partes componentes de los dominios de unión a antígeno de los diversos anticuerpos biespecíficos preparados de acuerdo con este ejemplo.

Tabla 17

continuación

Las tablas 18 y 19 exponen los identificadores de secuencias de aminoácidos para las diversas regiones variables de cadena pesada (tabla 18) y regiones variables de cadena ligera (tabla 19), y sus correspondientes CDR, de los anticuerpos biespecíficos de este ejemplo.

Tabl 1 n i min i r i n v ri l n ada)

T abla 19 Secuencias de aminoácidos de re ión variable de cadena ljgera)

Adicionalmente, las tablas 20 y 21 exponen los identificadores de secuencia para las secuencias de nucleótidos que codifican las regiones variables de cadena pesada (tabla 20) y las regiones variables de cadena ligera (tabla 21) y sus correspondientes CDR, de los anticuerpos biespecíficos de este ejemplo.

Tabla 20 (Secuencias de nucleótidos ue codifican secuencias de re ión variable de cadena pesada)

Tabla 21 (Secuencias de nucleótidos ue codifican secuencias de re ión variable de cadena ligera)

Además de los anticuerpos biespecíficos descritos anteriormente, los siguientes anticuerpos de control también se usaron en algunos de los experimentos expuestos en los siguientes ejemplos:

Control I: Anticuerpo monoclonal "OKT-3" contra antígenos de superficie de linfocitos T humanos como se expone en el documento US 4.361.549 y disponible en el hibridoma CRL-8001 (Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, VA).

Control II: Anticuerpo "SP34" reactivo contra la cadena épsilon del complejo T3 en linfocitos T humanos, disponible en BD Pharmagen, n.° de cat. 55052.

Control III: Anticuerpo terapéutico anti CD20, con secuencias de cadena pesada y ligera de Rituxan (Rituximab) como se desvela en el documento US 5.736.137.

Control IV: Anticuerpo anti CD20 monoclonal denominado "3B9-10" como se desvela en el documento US 7.879.984, y expuesto en el presente documento como un anticuerpo que comprende el par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR de las SEQ ID NO: 1242/1346 y secuencias de aminoácidos de HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 de las SEQ ID NO: 1244-1246-1248-1348-1350-1352.

Control V: Anticuerpo anti CD20 monoclonal denominado "10F2-13" como se desvela en el documento US 7.879.984, y expuesto en el presente documento como un anticuerpo que comprende el par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR de las SEQ ID NO: 1354/1362 y secuencias de aminoácidos de HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 de las SEQ ID NO: 1356-1358-1360-1364-1366-1368.

Ejemplo 8. Los anticuerpos biespecíficos CD20 x CD3 se unen selectivamente a linfocitos T Jurkat, Raji y de mono

Los anticuerpos biespecíficos CD20 x CD3 y las construcciones de control, como se expone en el ejemplo 1, se ensayaron a través de FACS para determinar su capacidad para unirse a Jurkat (línea de linfocitos T humanos CD3+, CD20-), Raji (linfocitos B humanos CD3-, CD20+) o PBMC de macaco cangrejero ("células mkT").

Los datos de FACS se adquirieron usando el siguiente protocolo: Se incubaron células a razón de 2x105 por pocillo con anticuerpos diluidos en serie durante 30 min en hielo. Después de la incubación, las células se lavaron, se añadieron los anticuerpos secundarios apropiados (células Jurkat, RAJI) o un cóctel de anticuerpos secundarios (para PBMC de macaco cangrejero) y se incubaron durante 30 minutos más. Después de la incubación, las células se lavaron, se suspendieron de nuevo en PBS frío que contenía BSA al 1 % y se analizaron por citometría de flujo en un BD FACS Canto II. Las células Jurkat y Raji se seleccionaron mediante dispersiones laterales y directas, mientras que los linfocitos T de macaco cangrejero también se seleccionaron en una población CD2+CD4+. Las CE50para la valoración de unión celular se determinaron usando el software Prism con valores calculados usando un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros. Los resultados se muestran en la tabla 22.

Tabla 22. Valores de unión de CE50 molar ara anticuer os bies ecíficos CD3XCD20

Como se muestra en la tabla 22, el panel de anticuerpos ensayados mostró un rango de afinidades de unión en las diferentes líneas celulares, dependiendo de sus especificidades. Los anticuerpos biespecíficos (BS3/20-001, -002, -003, -004 y -005) mostraron la capacidad de unirse a ambas líneas diana humanas. Un subconjunto de anticuerpos también mostró la capacidad de unirse a las células de macaco cangrejero (Control II, BS3/20-001 y BS3/20-003). Control I Anti CD3 (OKT3), Control II anti CD3 (SP34) y Control IV anti CD20 unidos a Jurkat, linfocitos T de macaco cangrejero y RAJI, respectivamente.

E je m p lo 9. Los an tic u e rp o s b ie s p e c ífic o s C D 20 x C D 3 in d u cen la p ro life rac ió n d e P B M C in vitro

La capacidad de los anticuerpos biespecíficos CD20 x CD3 seleccionados y las construcciones de control para estimular las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) e inducir la proliferación se evaluó usando cuantificación catalizada por ATP (CellTiter Glo®). La activación de las PBMC da como resultado la liberación de citocinas, que activan la proliferación celular.

Se adquirieron los datos de proliferación usando el siguiente protocolo: Se incubaron PBMC obtenidas de ser humano o de macaco cangrejero (5 x 105/pocillo) con una dilución en serie triple de anticuerpo anti CD3xCD20 o de control en placas de 96 pocillos durante 72 h a 37 °C. Después de la incubación, se añadió CellTiter Glo® y se midió la luminiscencia usando un lector de placas multietiqueta VICTOR X5 (PerkinElmer). La CE50de viabilidad celular (cuantificación catalizada por ATP) se determinó usando el software Prism. Los valores se calcularon usando un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros y se muestran en la tabla 23.

T a b la 23. C E<50>para la p ro life rac ió n d e P B M C h u m a n a s y d e m a ca co c a n g re je ro in d u c id a p o r an tic u e rp o s b ie s e c ífic o s an ti C D 20 C D 3

Como se muestra en la tabla 23, todos los anticuerpos biespecíficos CD20 x CD3 de la divulgación eran activadores de PBMC humanas o de macaco cangrejero. En general, los anticuerpos parentales bivalentes monoespecíficos anti CD3 (Controles I y II) eran 2-10 veces más potentes que los homólogos biespecíficos. El Control I (OKT3) no activó la proliferación de PBMC de mono, mientras que el Control II (SP34) fue activo contra las PBMC tanto humanas como de mono.

E je m p lo 10. Los an tic u e rp o s b ie s p e c ífic o s C D 20 x C D 3 ac tivan los lin fo c ito s T e ind u cen la lib e rac ió n d e IFN -g a m m a y la re g u lac ió n p o s itiv a d e C D 25 en s a n g re c o m p le ta h u m a n a

Se ensayaron anticuerpos biespecíficos CD20 x CD3 seleccionados para determinar su capacidad para activar linfocitos T en sangre completa humana. El grado de activación de los linfocitos T se determinó midiendo la secreción de interferón-gamma (IFNy), así como la regulación positiva de CD25 en los linfocitos T CD8+.

La secreción de interferón-gamma (IFN<y>) se cuantificó combinando sangre completa heparinizada con diluciones en serie quíntuples de anticuerpos biespecíficos en placas de 96 pocillos. Después de 20 horas, las placas se centrifugaron durante 5 minutos y se extrajo plasma para el análisis ELISA para determinar los niveles de IFNy. Las concentraciones de IFN<y>extrapoladas se representaron frente a la concentración de anticuerpos y los valores de CE50se calcularon usando un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros mediante el software Prism.

Para el análisis de la expresión de CD25 en linfocitos T CD8+, después de la incubación con anticuerpos y la eliminación del plasma, se transfirieron 150 pl de sangre a una placa de pocillos profundos y se lisaron durante 15 minutos con 1,5 ml de tampón de lisis de r Bc . Las células se lavaron dos veces, se bloquearon durante 10 minutos a temperatura ambiente con el reactivo de bloqueo de hFcR y a continuación se incubaron durante 30 minutos a 4 °C con anticuerpos conjugados directamente con CD2, CD19, CD4, CD8 y CD25. A continuación, las células se lavaron dos veces antes del análisis con un citómetro FACSCanto y el software FlowJo.

El porcentaje de linfocitos T CD2+CD8+ que expresaban el marcador de activación CD25 se representó frente a la concentración de anticuerpos, y los valores de CE50se calcularon usando un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros usando el software Prism. Los resultados se muestran en la tabla 24.

Tabla 24: Valores de CE50 de la relación positiva mediada por anticuerpos biespecíficos de la producción de CD25 e IFN mediada en san re com leta

Como se muestra en la tabla 24, los anticuerpos biespecíficos CD20 x CD3 mediaron en la regulación positiva de CD25 en linfocitos T CD8+ en sangre completa con valores de CE50que variaban entre 130-290 pM con valores de CE50correspondientes para IFN<y>que fueron ligeramente que variaban de 390 pM a 2 nM. BS3/20-004 fue menos potente que BS3/20-001 y BS3/20-003 en la mediación de la regulación positiva de CD25 y la producción de IFNy según lo determinado por CE50, sin embargo, BS3/20-004 podría inducir mayores niveles de IFN<y>en cultivos de sangre completa.

Ejemplo 11. Los anticuerpos biespecíficos CD20 x CD3 inducen citotoxicidad mediada por linfocitos T en líneas celulares resistentes a rituximab

Se evaluó la capacidad de los anticuerpos biespecíficos CD20 x CD3 seleccionados y las construcciones de control para mediar en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y la citotoxicidad mediada por linfocitos T usando células Raji parentales y líneas Raji SCID. Las últimas (líneas Raji SCID) se obtuvieron de tumores resistentes a anti CD20 individuales aislados de ratones inmunodeficientes inyectados por vía subcutánea con células Raji después del tratamiento con el mAb anti CD20 Rituximab. En este ejemplo se usaron cuatro líneas (Raji SCID 1-4).

La expresión de CD20 y las moléculas inhibidoras del complemento CD55 y CD59 en líneas celulares Raji se determinó mediante FACS. Brevemente, se incubaron 1x106 células en tubos individuales durante 30 minutos con anticuerpos directamente conjugados con CD20, CD55 y CD59. Las células se lavaron dos veces antes de la adquisición de FACS con un citómetro FACSCanto y se analizaron con el software FlowJo.

Para determinar la capacidad de los anticuerpos anti CD20 y anti CD3xCD20 para mediar en la destrucción dirigida por linfocitos T de líneas celulares Raji, se incubaron células Raji marcadas con calceína durante 2 horas a 37 °C con linfocitos T preactivados (PBMC humanas aisladas con ficoll activadas con rhlL-2 (30 U/ml) y perlas de activación anti CD3/CD28) y diluciones en serie triples de anticuerpos a partir de 2 nM. Después de la incubación, las placas se centrifugaron y los sobrenadantes se transfirieron a una placa de fondo transparente de color negro translúcida para la detección de fluorescencia de 530 nm a una emisión de 485 nm. El porcentaje de citotoxicidad se determinó basándose en los valores de liberación espontánea (células diana solas) y máxima (células diana lisadas con detergente). Los valores de CE50 se calcularon usando un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros usando el software Prism.

Para determinar la actividad de los anticuerpos para mediar en la CDC, se incubaron líneas celulares Raji con complemento de suero humano normal al 5 % y diluciones en serie triples de anticuerpos a partir de 100 nM. Después de la incubación durante 4,5 horas a 37 °C, se determinó la muerte celular usando CellTiter Glo®. El porcentaje de citotoxicidad se determinó basándose en los valores de liberación espontánea (células diana solas) y máxima (células diana lisadas con detergente). Los valores de CE50se calcularon usando un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros usando el software Prism.

Los resultados se muestran en la tabla 25.

T l 2 . V l r E r l D m i r n i r l i xi i m i r linf i T

continuación

En comparación con las células Raji precursoras, 2 de 4 líneas Raji SCID mostraron una expresión reducida de CD20 (tabla 25; líneas Raji SCID 1 y 3), con un porcentaje significativamente mayor de células que expresan las moléculas inhibidoras del complemento CD55 y CD59. La sensibilidad de las células Raji SCID a CDC mediada por anticuerpos anti CD20 o anti CD20 x CD3 dependía del porcentaje de células que expresaban CD55/CD59, pero no de los niveles de CD20, de modo que el aumento de la expresión de CD55/CD59 en las células diana inhibieron la CDC.

Los anticuerpos anti CD20 (Control IV y Control III [Rituximab]) fueron más potentes que los anti CD20 x CD3 (BS3/20-007) en la mediación de la CDC, ya que el biespecífico es monovalente para CD20. Sin embargo, a diferencia de la CDC, la citotoxicidad mediada por linfocitos T no dependía de los niveles de CD20 o CD55/CD59, ya que todas las líneas celulares eran igualmente susceptibles a la muerte celular por linfocitos T activadas en presencia de anticuerpos biespecíficos anti CD20 x CD3. Adicionalmente, el anticuerpo biespecífico fue 100-1000 veces más potente en la mediación de la destrucción de células Raji dependiente de linfocitos T que el anticuerpo anti CD20 en el ensayo CDC.

Ejemplo 12. La regulación positiva de CD25 en linfocitos T CD8+ depende de la concentración de CD20 en presencia de anticuerpos biespecíficos CD20 x CD3

Para evaluar si concentraciones más altas de células diana (linfomas CD20+) conducirían a un aumento de la potencia de los anticuerpos biespecíficos CD20 x CD3, se cocultivaron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) en presencia de una línea celular derivada de linfoma de Burkitt, es decir, Raji.

La regulación positiva de CD25 en linfocitos T CD8+ se determinó usando el siguiente protocolo: Las PBMC humanas (5x105/ml), aisladas mediante centrifugación de sangre derivada de leucoféresis enriquecida con células mononucleares sobre Ficoll, se incubaron en presencia (1x105/ml) o ausencia de células Raji, a 37 °C en placas de fondo plano de 96 pocillos con diluciones en serie quíntuples de los anticuerpos biespecíficos. Después de 48 horas, las células se lavaron 2 veces, se bloquearon durante 10 minutos a temperatura ambiente con el reactivo de bloqueo de hFcR y a continuación se incubaron durante 30 minutos a 4 °C con anticuerpos conjugados directamente contra CD2, CD19, CD4, CD8 y CD25. Después de la tinción, las células se lavaron dos veces antes de la adquisición de FACS con un citómetro FACSCanto y se analizaron con el software FlowJo. El porcentaje de linfocitos T CD2+CD8+ activados que expresaban CD25 se representó frente a la concentración de anticuerpos, y los valores de CE50se calcularon usando un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros usando el software Prism. Los resultados se muestran en la tabla 26.

Tabla 26. Regulación positiva de CD25 en linfocitos T CD8+ después de la incubación de PBMC humanas n n i r i ífi D2 x D m m n l l R i

Como se muestra en la tabla 26, los linfocitos T activados cuando se cultivaron en presencia de células Raji (diana) mostraron una regulación positiva de CD25 y una disminución posterior de 100 veces en sus valores de CE50.

Ejemplo 13. Los anticuerpos biespecíficos CD20 x CD3 inducen citotoxicidad a las células Raji en presencia de linfocitos T activados

La capacidad de los anticuerpos biespecíficos CD20 x CD3 para redirigir la destrucción mediada por linfocitos T a células de Raji que expresaban CD20 se ensayó en un ensayo de citotoxicidadin vitro.Adicionalmente, también se estudió la capacidad de los anticuerpos anti<c>D3 biespecíficos y parentales para destruir las células U937 mediante interacciones Fc/FcR.

Los ensayos de destrucción de calceína se realizaron usando el siguiente protocolo: Se aislaron PBMC humanas y de macaco cangrejero sobre placa de ficoll o con medios de separación de células de mamífero Lympholyte, respectivamente. Las PBMC aisladas se activaron durante un período de varios días con medios que contenían IL-2 humana recombinante (30 U/ml) y perlas de activación de linfocitos T (anti CD3/CD28 para PBMc humanas, anti CD2/CD3/CD28 para PBMC de macaco cangrejero).

Las células diana (Raji para la destrucción mediada por CD20 y U937 para la destrucción mediada por FcR) se marcaron con calceína y se incubaron con linfocitos T activados en una relación de 10:1 de efector:diana usando diluciones en serie triples de anticuerpos durante un período de 3 horas a 37 °C. Después de la incubación, las placas se centrifugaron y los sobrenadantes se transfirieron a una placa de fondo transparente de color negro translúcido para el análisis de fluorescencia. La CE50definida como la concentración molar de anticuerpo biespecífico que induce una citotoxicidad del 50 % se determinó usando Prism. Los valores se calcularon usando un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros. Los resultados se resumen en la tabla 27.

Como se muestra en la tabla 27, los anticuerpos biespecíficos CD20 x CD3 que contenían brazos anti CD3 específicos humanos o humanos/de macaco cangrejero de reacción cruzada fueron capaces de redirigir específicamente la citotoxicidad a las células Raji en presencia de linfocitos T humanos activados. En presencia de linfocitos T activados de macaco cangrejero, las Raji se destruyeron cuando se incubaron con BS3/20-001 o BS3/20-003, anticuerpos biespecíficos que tienen brazos anti CD3 que activan los linfocitos T de mono. Todos los anticuerpos biespecíficos, así como el Control I, un mAb anti CD3, mostraron actividad en el ensayo de destrucción dependiente de U937 Fc/FcR. Esta actividad podría bloquearse mediante la adición de bloqueo de IgG humana no específica a la reacción (datos no mostrados).

Ejemplo 14. Los anticuerpos biespecíficos CD3 x CD20 pueden agotar los linfocitos B CD19+ en ratones reconstituidos con células inmunitarias humanas

Para determinar la potenciain vivode la administración del anticuerpo biespecífico CD3xCD20, se examinaron los cambios en los niveles de linfocitos B CD19+ y linfocitos T CD2+ mediante FACS después de la administración de 10 |jg o 0,1 |jg de anticuerpo biespecífico anti CD3xCD20 en ratones, que se reconstituyeron con células inmunitarias humanas.

Brevemente, se irradiaron ratones BALB/Rag2null/YcnuN recién nacidos con 2 x 150 Rad y se reconstituyeron con 4x105 células progenitoras hematopoyéticas CD34+ humanas mediante inyección intrahepática. Después de 12 semanas, la composición del sistema inmunitario humano reconstituido en sangre periférica se determinó mediante citometría de flujo. Típicamente, tres meses después de la reconstitución, entre el 10 %-60 % de los glóbulos blancos periféricos son CD45+ humanos, de los cuales el 40 %-70 % son linfocitos B, el 15 %-40 % son linfocitos T y el resto son pequeñas poblaciones de linfocitos citolíticos naturales y células dendríticas.

Cinco meses después de la reconstitución, a los ratones se les inyectaron por vía intraperitoneal 10 jg o 0,1 jg de anticuerpo biespecífico anti CD3xCD20 BS3/20-007, 10 jg de un anticuerpo monovalente CD3 de 1 brazo (BS3/20-009, véase la tabla 1) o 10 jg de un control de isotipo hlgG irrelevante. Uno, ocho y veinticinco días después de la inyección, se extrajo sangre de los ratones por vía retroorbital y se determinaron las poblaciones de células inmunitarias en la sangre periférica mediante citometría de flujo (FACS).

Para el análisis FACS, se incubaron 100 j l de sangre con 1,5 ml de tampón de lisis de RBC en tubos Eppendorf durante tres minutos. Las células se centrifugaron durante cinco minutos a 0,4xg, se lavaron 2 veces con lavado FACS (PBS+FBS al 3 %) y se bloquearon durante 10 minutos a temperatura ambiente con reactivo de bloqueo de Fc de ratón. A continuación, las células se incubaron durante 30 minutos a 4 °C con anticuerpos directamente conjugados contra CD2, CD3, CD19, CD4, CD8, hCD45, hHLA-DR y mCD45. Después de la tinción, las células se lavaron dos veces antes de la adquisición de FACS mediante un citómetro FACSCanto y se analizaron con el software FlowJo. Los resultados se muestran en la tabla 28.

Tabla 28: Porcentaje de células CD45, CD19 y CD2 positivas circulantes en ratones reconstituidos con células inmunitarias humanas

Como se muestra en la tabla 28, una sola dosis de 10 |jg de anticuerpo biespecífico anti CD3xCD20 BS3/20-007 dio como resultado la desaparición de células hCD45+ circulantes en 2 de 2 ratones tratados que no se recuperaron durante la duración del experimento. Una dosis única de 0,1 jg de BS3/20-007 redujo las células hCD45+ circulantes, incluyendo los linfocitos B CD19+ y los linfocitos T CD2+, 24 horas después de la inyección en 2 de 3 ratones tratados. Una vez agotado, el porcentaje de células hCD45+ no se recuperó significativamente en los ratones que respondieron tratados con 0,1 jg de BS3/20-007. Sin embargo, las células que quedaron en estos ratones fueron predominantemente linfocitos T hCD2+, y los linfocitos B CD19+ no estaban presentes en los ratones que respondieron ni siquiera 25 días después del tratamiento. Una dosis única de 10 jg de un anticuerpo CD3 monovalente de 1 brazo (BS3/20-009) también dio como resultado una reducción persistente pero modesta en las células CD45+, en particular, los linfocitos T CD2+, en 2 de 2 ratones tratados. Una dosis única de 10 jg de un control de hIgG1 irrelevante no tuvo un efecto significativo sobre el porcentaje de células hCD45+, hCD19+ o hCD2+ circulantes.

Ejemplo 15. El tratamiento con anticuerpo biespecífico CD20 x CD3 reduce el volumen del tumor Raji en ratones NOD/SCID

Para evaluar la eficacia de determinados anticuerpos biespecíficos anti CD3xCD20 en la reducción del crecimiento tumoral Raji, a ratones NOD/SCID (Taconic) se les implantó una mezcla de 2x106 células de tumor Raji y 8x106 PBMC humanas. Los ratones se trataron tres veces por semana, comenzando el día del implante del tumor, con Fc humano (hFc) o anticuerpo biespecífico CD3xCD20 (BS3/20-007) a una dosis de 1 jg por ratón (N = 20 ratones por grupo de tratamiento). Los reactivos se suministraron mediante inyección intraperitoneal (i.p.). El tamaño del tumor se midió tres veces por semana usando calibradores y el volumen tumoral se calculó como Volumen = (longitud x anchura2)/2. Los resultados se muestran en la figura 1.

En un segundo experimento, a ratones NOD/SCID se les implantó una mezcla de 2x106 células de tumor Raji y 4x106 PBMC humanas. El tratamiento con anticuerpo biespecífico CD3xCD20 (BS3/20-007) o reactivo de control (hFc) comenzó 7 días después del implante del tumor para permitir que los tumores se hicieran palpables. Los ratones se trataron dos veces a la semana con una dosis de 1 jg por ratón (N = 6 ratones por grupo de tratamiento). Los reactivos se inyectaron por vía subcutánea, lejos del sitio de implante del tumor. El tamaño del tumor se midió dos veces por semana usando calibradores y el volumen tumoral se calculó como Volumen = (longitud x anchura2)/2. Los resultados se muestran en la figura 2.

Este ejemplo demuestra que el tratamiento con el anticuerpo biespecífico CD3xCD20 BS3/20-007 fue eficaz para inhibir el crecimiento tumoral tanto en el momento del implante del tumor como una vez que se establecieron los tumores. El volumen tumoral en los ratones disminuyó 25 días después del implante en ambos estudios, en relación con el control.

Ejemplo 16. Los anticuerpos biespecíficos CD20 x CD3 agotan las poblaciones de linfocitos B en macacos cangrejeros y tienen un perfil farmacocinético típico de los anticuerpos monoclonales

Se realizó un estudio piloto de farmacología y toxicología no GLP en macacos cangrejeros(Macaca fascicularis)para determinar la capacidad de los anticuerpos biespecíficos CD3xCD20 para agotar las poblaciones de linfocitos B en estos animales. Los animales macho se organizaron en tres cohortes. La cohorte 1 recibió el anticuerpo biespecífico BS3/20-001 e incluyó tres grupos de dosificación diferentes (0,01, 0,10 y 1,00 mg/kg) con 3-4 animales por grupo de dosificación. La cohorte 2 fue una cohorte de dos animales que recibió una dosis baja de anticuerpo de control anti CD20 (Control V; 0,01 mg/kg). La cohorte 3 fue una cohorte de cuatro animales que recibió una dosis alta de anticuerpo de control anti CD20 (Control III; 1,0 mg/kg). Se extrajo sangre el día -7 e inmediatamente antes de la dosificación para establecer los niveles de referencia para los linfocitos T Band en estos animales. Se administraron dosis de fármaco a razón de 0,01, 0,10 o 1,00 mg/kg mediante infusión i.v. y se extrajo sangre a los 5 minutos, 5 horas y 1, 4, 7 y 14 días posteriores a la dosificación. Después del día 14 posterior a la dosis, se extrajo sangre cada dos semanas hasta la conclusión del estudio. Las muestras de sangre se analizaron mediante FACS para marcadores de linfocitos T Band y se determinó el número absoluto de estos tipos de células. Las muestras de suero también se analizaron para determinar los niveles de citocinas (IFNy, IL-2, IL-6 y TNFa) usando métodos analíticos estándar. Los resultados se muestran en la figura 3 (linfocitos B), figura 4 (linfocitos T) y figuras 5A-5D (citocinas).

Como se muestra en este ejemplo, la administración del anticuerpo biespecífico CD3xCD20 dio como resultado el agotamiento de los linfocitos B circulantes hasta los niveles de referencia en el primer punto temporal medido (día 1). Este agotamiento no se observó en la cohorte de animales de control. El agotamiento de linfocitos B en la cohorte biespecífica se mantuvo hasta dos semanas después de la dosificación y en las cohortes de dosis de 0,01 y 0,10 mg/kg fue seguida de una recuperación gradual de los niveles de linfocitos B hasta que el experimento concluyó aproximadamente 11 semanas posteriores a la dosificación. En la cohorte de 1,0 mg/kg, sin embargo, no se observó recuperación de los niveles de linfocitos B durante la duración del experimento (11 semanas). Los niveles de linfocitos T también se monitorizaron en este experimento. Se observó una pérdida transitoria de linfocitos T circulantes el día 1 posterior a la dosis en las cohortes biespecíficas. Los niveles de linfocitos T volvieron a los niveles de referencia en estas cohortes en el punto temporal del día 4 y se mantuvieron en esos niveles de referencia hasta el final del experimento. Adicionalmente, los niveles de citocinas séricas para BS3/20-001 a las 5 horas exhibieron una respuesta dependiente de la dosis y el tiempo que es consistente con la activación de los linfocitos T (véanse las figuras 5A-5D).

Los niveles de expresión génica en la sangre periférica también se analizaron durante este experimento. Se obtuvieron muestras de sangre de los animales en dos puntos temporales previos a la dosis (día 7 antes de la dosis e inmediatamente antes de la dosis) y a las 5, 24, 72, 96 y 168 horas posteriores a la dosis. Se aisló el ARN de estas muestras y se analizó mediante micromatriz. Cuando se comparó con los niveles previos a la dosis y los niveles de expresión génica del grupo de control, se observó una disminución notable en la expresión génica de los marcadores de linfocitos B en animales tratados con el anticuerpo biespecífico; este efecto fue similar al efecto observado en muestras obtenidas de animales tratados con 1,0 mg/kg de Control III (anticuerpo anti CD20 correspondiente a Rituximab). El cambio observado en la expresión de marcadores de linfocitos B corresponde a la pérdida de linfocitos B detectada en la sangre de los animales tratados. La expresión de genes marcadores de linfocitos T en muestras de animales tratados con el anticuerpo biespecífico CD3xCD20 mostró una disminución inicial seguida de un retorno a los niveles normales a las 24 horas. Adicionalmente, los genes asociados con una respuesta inflamatoria mostraron una regulación positiva inicial en los animales de la cohorte biespecífica, pero volvieron a niveles normales o por debajo de lo normal después de 24 horas. Finalmente, el examen de la intensidad bruta de la señal de expresión del gen CD20 sugiere que surge un mayor agotamiento de los linfocitos B del tratamiento de animales con el anticuerpo biespecífico CD3xCD20 que con los anticuerpos anti CD20 de control. (Véanse la figura 6 y la tabla 29).

Tabla 29. Niveles de ex resión énica de CD20 el día 7

Como se muestra en la tabla 29, siete días posteriores a la dosificación, la intensidad bruta de la señal de CD20 permaneció en los niveles de fondo en todos menos uno de los animales CD3xCD20, mientras que 3 de 4 animales tratados con 1 mg/kg de Control III mostraron niveles de señal de CD20 marginales o detectables.

En el mismo experimento se evaluó el perfil farmacocinético del anticuerpo biespecífico (figura 7) obteniendo muestras de sangre antes de la dosis y a las 0,083, 5, 24, 48, 72, 168, 336, 504 y 840 horas. Las muestras de suero resultantes se analizaron mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) directo para determinar la concentración de anticuerpo biespecífico total. Los datos de concentración sérica biespecífica total (BS3/20-001) se analizaron mediante análisis no compartimental (Phoenix WinNonLin) para determinar los parámetros farmacocinéticos. Los resultados se muestran en la tabla 30 (AUC = área bajo la curva frente al tiempo; Cmáx = concentración máxima de compuesto observada en la matriz de interés).

T l : P r m r f rm in i B 2 - 1 n m n r r

Después de una dosis intravenosa única de 0,01, 0,10 o 1,0 mg/kg de BS3/20-001 en macacos cangrejeros, se observaron concentraciones máximas medias (Cmáx) de 0,261, 2,32 y 33,4 pg/ml, respectivamente, el primer punto temporal de muestreo (0,083 h). Se observaron valores medios de AUCall de 4,42, 289 y 4940 pg*h/ml a dosis de 0,01, 0,1 y 1,0 mg/kg. Los valores de AUC normalizados por dosis (AUCall/dosis) de 442, 2890 y 4940 pg*h/ml por mg/kg indican que la exposición plasmática (AUCall) aumenta con el aumento de la dosis de forma no lineal. Se observó un aumento mayor que proporcional en la exposición al fármaco en plasma con una mayor dosis de anticuerpo, lo que sugiere que BS3/20-001 puede estar experimentando una eliminación mediada por la diana. El perfil farmacocinético general de BS3/20-001 es típico de los anticuerpos monoclonales dosificados en macacos cangrejeros.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CE3 humana, y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 humana, en donde el primer dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende regiones determinantes de la complementariedad A1-HCDR1, A1-HCDR2 y A1-HCDR3 y una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende regiones determinantes de la complementariedad A1-LCDR1, A1-LCDR2 y A1-LCDR3, en donde las regiones determinantes de la complementariedad están contenidas dentro de un par HCVR/LCVR que comprende las secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEQ ID NO: 1250/1258, 1266/1274 o 1282/1290, en donde la molécula de unión a antígeno biespecífica induce la proliferación de células mononucleares de sangre periférica de ser humano y de macaco cangrejeroin vitro.

2. La molécula de unión a antígeno biespecífica de la reivindicación 1, en donde el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 humana comprende una HCVR que comprende regiones determinantes de la complementariedad A2-HCDR1, A2-HCDR2 y A2-Hc Dr 3 contenidas dentro de una HCVR que comprende SEQ ID NO: 1242 y una LCVR que comprende regiones determinantes de la complementariedad A2-LCDR1, A2-LCDR2 y A2-LCDR3 contenidas dentro de una LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1258, 1274 o 1290.

3. La molécula de unión a antígeno biespecífica de la reivindicación 2, en donde:

A1-HCDR1, A1-HCDR2 y A1-HCDR3 comprenden las secuencias de aminoácidos, respectivamente, de SEQ ID NO: 1268, 1270 y 1272;

A1-LCDR1, A1-LCDR2 y A1-LCDR3 comprenden las secuencias de aminoácidos, respectivamente, de SEQ ID NO: 1276, 1278 y 1280;

A2-HCDR1, A2-HCDR2 y A2-HCDR3 comprenden las secuencias de aminoácidos, respectivamente, de SEQ ID NO: 1244, 1246 y 1248; y

A2-LCDR1, A2-LCDR2 y A2-LCDR3 comprenden las secuencias de aminoácidos, respectivamente, de SEQ ID NO: 1276, 1278 y 1280.

4. La molécula de unión a antígeno biespecífica de la reivindicación 2, en donde:

A1-HCDR1, A1-HCDR2 y A1-HCDR3 comprenden las secuencias de aminoácidos, respectivamente, de SEQ ID NO: 1284, 1286 y 1288;

A1-LCDR1, A1-LCDR2 y A1-LCDR3 comprenden las secuencias de aminoácidos, respectivamente, de SEQ ID NO: 1292, 1294 y 1296;

A2-HCDR1, A2-HCDR2 y A2-HCDR3 comprenden las secuencias de aminoácidos, respectivamente, de SEQ ID NO: 1244, 1246 y 1248; y

A2-LCDR1, A2-LCDR2 y A2-LCDR3 comprenden las secuencias de aminoácidos, respectivamente, de SEQ ID NO: 1292, 1294 y 1296.

5. La molécula de unión a antígeno biespecífica de la reivindicación 2, en donde el primer dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1250 y una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1258; y en donde el segundo dominio de unión a antígeno comprende una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1242 y una LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1258.

6. La molécula de unión a antígeno biespecífica de la reivindicación 2, en donde el primer dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1266 y una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1274; y en donde el segundo dominio de unión a antígeno comprende una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1242 y una LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1274.

7. La molécula de unión a antígeno biespecífica de la reivindicación 2, en donde el primer dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1282 y una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1290; y en donde el segundo dominio de unión a antígeno comprende una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1242 y una LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1290.

8. La molécula de unión a antígeno biespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que es un anticuerpo biespecífico.

9. La molécula de unión a antígeno biespecífica de la reivindicación 8 que comprende una región constante de cadena pesada de isotipo IgG1 o IgG4.

10. Una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión a antígeno biespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptables.

11. La molécula de unión a antígeno biespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o la composición farmacéutica de la reivindicación 10, para su uso en el tratamiento de un cáncer de linfocitos B en un sujeto.

12. La molécula de unión a antígeno biespecífica o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el cáncer de linfocitos B se selecciona del grupo que consiste en: linfoma folicular, leucemia linfocítica crónica de linfocitos B, linfoma linfoblástico de linfocitos B, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma de la zona marginal, linfoma de células del manto, tricoleucemia y linfoma de Burkitt.

13. La molécula de unión a antígeno biespecífica o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en donde el sujeto está afligido por un tumor que es resistente a, o responde de forma incompleta a terapia sola monoespecífica anti-CD20.

14. La molécula de unión a antígeno biespecífica o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en donde el sujeto ha recibido una terapia de anticuerpo monoespecífico anti-CD20 al menos 1 día a 1 año antes de la administración de la molécula de unión a antígeno biespecífica o la composición farmacéutica.

15. La molécula de unión a antígeno biespecífica o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la terapia monoespecífica anti-CD20 comprende o consiste en un anticuerpo monoespecífico anti-CD20.

16. La molécula de unión a antígeno biespecífica o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el anticuerpo monoespecífico anti-CD20 es rituximab.