RS65123B1

RS65123B1 - Bispecifični molekuli za vezivanje antigena, koji vezuju cd3 i cd20, i njihove upotrebe

Info

Publication number: RS65123B1
Application number: RS20240123A
Authority: RS
Inventors: Eric Smith; Nicholas J Papadopoulos
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 2012-09-21
Filing date: 2013-09-19
Publication date: 2024-02-29
Also published as: MX373931B; BR112015005380A2; TW201945398A; EP2897981B1; DK2897981T5; US20170320948A1; IL237301A0; KR20150046789A; TW201809007A; CN110041429B; DK3778641T3; HK1212996A1; KR102163136B1; PT2897981T; JP7727047B2; PL3778641T3; UY35042A; JP2019214591A; ES2948807T3; AU2013318059C1

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na bispecifične molekule za vezivanje antigena, koji vezuju CD3 i CD20, i njihove postupke upotrebe.

STANJE TEHNIKE

[0002] CD3 je homodimerni ili heterodimerni antigen koji je eksprimiran na T ćelijama zajedno sa receptorskim kompleksom T ćelije (TCR) i neophodan je za aktivaciju T ćelija. Funkcionalni CD3 je obrazovan iz dimernog udruživanja dva od četiri različita lanca: epsilon, zeta, delta i gama. Aranžmani dimera CD3 uključuju gama/epsilon, delta/epsilon i zeta/zeta. Pokazano je da antitela protiv CD3 grupišu CD3 na T ćelijama, time uzrokujući aktivaciju T ćelije na način koji je sličan angažovanju TCR od strane molekula MHC napunjenih peptidom. Prema tome, anti-CD3 antitela su predložena u terapeutske svrhe uključujući aktivaciju T ćelija. Dodatno, bispecifična antitela koja su sposobna za vezivanje CD3 i ciljnog antigena su predložena za terapeutske upotrebe uključujući ciljanje T ćelijskih imunskih odgovora na tkiva i ćelije koje eksprimiraju ciljni antigen.

[0003] CD20 je ne-glikozilovani fosfoprotein koji je eksprimiran na ćelijskim membrama zrelih B ćelija. CD20 se smatra antigenom koji je povezan sa tumorom B ćelija zbog toga što je eksprimiran od strane više od 95% B-ćelijskih ne-Hodčkinovih limfoma (NHLs) i maligniteta B-ćelija, ali je odsutan kod prekursorskih B-ćelija, dendritičnih ćelija i plazma ćelija. Postupci za lečenje kancera ciljanjem CD20 su dobro poznati u oblasti tehnike. Na primer, himerno anti-CD20 monoklonsko antitelo rituksimab je korišćeno ili je sugerisano za upotrebu u lečenju kancera kao što su NHL, hronična limfocitna leukemija (CLL) i mali limfocitni limfom (SLL). Veruje se da CD20 ubija ćelije tumora koje eksprimiraju CD20 citotoksičnošću koja zavisi od komplementa (CDC), citotoksičnošću koja je posredovana ćelijama koja zavisi od antitela (ADCC) i/ili indukcijom apoptoze i senzibilizacijom na hemioterapiju. Iako su se strategije anti-CD20 tumorskog ciljanja su se pokazale obećavajuće u kliničkom okruženju, nisu svi pacijenti reagovali na anti-CD20 terapiju, i pokazano je da neki pacijenti razvijaju otpornost na ili ispoljavaju nepotpune odgovore na anti-CD20 terapiju (npr., otpornosti na rituksimab).

[0004] Bispecifični molekuli za vezivanje antigena koji vezuju i CD3 i ciljni antigen (kao što je CD20) će biti od koristi u terapeutskom okruženju u kome je poželjno specifično ciljanje i ubijanje ćelija posredstvom T ćelija koje eksprimiraju željni antigen.

[0005] Svaki od WO 2007/093630, US 2010/331527, W02005/040220 i W0 2011/090762 opisuje molekule koji vezuju više specifične antigene, između ostalog CD3 i CD20.

KRATKO IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA

[0006] Ovaj pronalazak obezbeđuje bispecifične molekule za vezivanje antigena koji vežu CD3 i CD20. Takvi bispecifični molekuli za vezivanje antigena vežu CD3 i CD20; takvi bispecifični molekuli za vezivanje antigena su ovde takođe nazvani kao "anti-CD3/anti-CD20 bispecifični molekuli." Anti-CD20 deo anti-CD3/anti-CD20 bispecifičnog molekula je koristan za ciljanje tumorskih ćelija koje eksprimiraju CD20 (npr., tumori B-ćelija), i anti-CD3 deo bispecifičnog molekula je koristan za aktivaciju T-ćelija. Istovremeno vezivanje CD20 na ćelijama tumora i CD3 na T-ćeliji olakšava usmereno ubijanje (ćelijsku lizu) ciljne tumorske ćelije aktiviranom T-ćelijom. anti-CD3/anti-CD20 bispecifični molekuli iz pronalaska su prema tome korisni, između ostalog, za lečenje bolesti i poremećaja koji su srodni ili su uzrokovani sa tumorima koji eksprimiraju CD20 (npr., limfomima).

[0007] Bispecifični molekuli za vezivanje antigena prema ovom pronalasku iz ovog izlaganja sadrže prvi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani CD3, i drugi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje CD20. Svaki domen za vezivanje antigena sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR) uparen sa varijabilnim regionom lakog lanca (LCVR). U određenim primerima izvođenja pronalaska, anti-CD3 antigen-vezujući domen i anti-CD20 antigen vezujući domen svaki sadrži različite, drugačije HCVRs uparene sa zajedničkim LCVR. Na primer, kao što je ovde ilustrovano u Primeru 7, bispecifična antitela su konstruisana koja sadrže prvi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje CD3, pri čemu prvi domen za vezivanje antigena sadrži HCVR/LCVR par koji je dobijen od anti-CD3 antitela; i drugi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje CD20,pri čemu drugi domen za vezivanje antigena sadrži HCVR koji je dobijen od anti-CD20 antitela uparenog sa LCVR koji je dobijen od anti-CD3 antitela (npr., isti LCVR koji je uključen u anti-CD3 antigen-vezujućem domenu). Drugim rečima, u primerima ovde prikazanih molekula, uparivanje HCVR iz anti-CD20 antitela sa LCVR iz anti-CD3 antitela kreira domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje CD20 (ali ne veže CD3). U takvim izvođenjima, prvi i drugi domeni za vezivanje antigena sadrže drugačije anti-CD3 i anti-CD20 HCVR ali dele zajednički anti-CD3 LCVR.

[0008] Anti-CD3/anti-CD20 bispecifični molekuli prema pronalsku sadrže prvi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje CD3 gde prvi domen koji vezuje antigen obuhvata varjabilni region teškog lanca (HCVR) koji sadrži regione koje određuju komplementarnost A1-HCDR1, A1-HCDR2 i A1-HCDR3, i varjabilni region lakog lanca (LCVR) koji sadrži regione koje određuju komplementarnost A1-LCDR1, A1-LCDR2 i A1-LCDR3, gde regioni koji određuju komplementarnost se nalaze u okviru para HCVR/LCVR koji sadrži aminokiselinu sekvencu izabranu između SEQ ID NOs: 1250/1258, 1266/1274 ili 1282/1290. Bispecifični molekuli za vezivanje antigena koji izazivaju proliferaciju mononuklearnih ćelija periferne krvi čoveka i cinomolgusa in vitro.

[0009] Postupci i tehnike za identifikovanje CDR-ova u okviru HCVR i LCVR aminokiselinskih sekvenci su dobro poznati u stanju tehnike i mogu biti korišćeni za identifikovanje CDR-ova u okviru određenih ovde opisanih aminokiselinskih sekvenci HCVR i/ili LCVR . Primeri konvencija koje mogu biti korišćene da se identifikuju granice CDR-ova uključuju, npr., Kabatovu definiciju , Chothia definiciju, i AbM definiciju. U opštem smislu, Kabatova definicija je zasnovana na varjabilnosti sekvence, Chothia definicija je zasnovana na mestu stukturnih regiona petlje, i AbM definicija je kompromisna između prilaza Kabata i Chothia. Videti, npr., Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol.273:927-948 (1997); and Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). Javne baze podataka su takođe dostupne za identifikovanje CDR sekvencu u okiru antitela.

[0010] U skladu sa određenim izvođenjima, ovaj pronalazak obezbeđuje anti-CD3/anti-CD20 bispecifične molekule, u kojima prvi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje CD3 sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji ima sekvencu aminokiselina koja je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs:1250, 1266, i 1282, ili njihove suštinski slične sekvence koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci, uključujući gore navedene CDR-ove.

[0011] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje anti-CD3/anti-CD20 bispecifične molekule, pri čemu prvi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje CD3 sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) koji ima sekvencu aminokiselina koja je odabrana iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs:1258, 1274 i 1290, ili njene suštinski slične sekvence koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci, uključujući gore navedene CDR-ove.

[0012] Ovaj pronalazak izlaganje takođe obezbeđuje anti-CD3/anti-CD20 bispecifične molekule, pri čemu prvi domen za vezivanje antigena koji specifično veže CD3 sadrži par sekvenci aminokiselina HCVR i LCVR (HCVR/LCVR) odabran iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs:1250/1258, 1266/1274 i 1282/1290.

[0013] Određeni neograničavajući, primer anti-CD3/anti-CD20 bispecifičnih molekula za vezivanje antigena iz pronalaska uključuju prvi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje CD3 koji sadrži HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 domene, tim redom, koji ima sekvence aminokiselina koje su odabrane iz grupe koja se sastoji iz: SEQ ID NO: 1252-1254-1256-1260-1262-1264 (npr. BS3/20-001); 1268-1270-1272-1276-1278-1280 (npr. BS3/20-002); i 1284-1286-1288-1292-1294-1296 (npr. BS3/20-003)

[0014] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje anti-CD3/anti-CD20 bispecifične molekule, pri čemu drugi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje CD20 sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1242, ili u suštini njenu sličnu sekvencu koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.

[0015] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje anti-CD3/anti-CD20 bispecifične molekule, pri čemu drugi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje CD20 sadrži varijabilni region lakog lanca (LCVR) koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je izabrana iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs:1258, 1274, 1290, 1306, 1322 i 1333, ili njena suštinski slična sekvenca koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.

[0016] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje anti-CD3/anti-CD20 bispecifične molekule, pri čemu drugi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje CD20 sadrži par sekvenci aminokiselina HCVR i LCVR (HCVR/LCVR) koji je odabran iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 1242/1258, 1242/1274, 1242/1290, 1242/1306, 1242/1322 i 1242/1333.

[0017] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje anti-CD3/anti-CD20 bispecifične molekule, pri čemu drugi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje CD20 sadrži domen CDR3 (HCDR3) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1248, ili u suštini njenu sličnu sekvencu koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci; i domen CDR3 (LCDR3) lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je izabrana iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 1264, 1280, 1296, 1312, 1328 i 1336, ili njene suštinski slične sekvence koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.

[0018] U izvesnim izvođenjima, drugi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje CD20 sadrži par sekvenci aminokiselina HCDR3/LCDR3 koji je odabran iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 1248/1264, 1248/1280, 1248/1296, 1248/1312, 1248/1328 i 1248/1336.

[0019] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje anti-CD3/anti-CD20 bispecifične molekule za vezivanje antigena, pri čemu drugi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje CD20 sadrži domen CDR1 (HCDR1) teškog lanca koji ima sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:1244, ili njenu u suštini sličnu sekvencu koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci; domen CDR2 (HCDR2) teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1246, ili njenu u suštini sličnu sekvencu koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci; domen CDR1 (LCDR1) lakog lanca koji ima aminokiselinsu sekvencu koja je izabrana iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 1260, 1276, 1292, 1308, 1324 i 1334, ili njenu u suštini sličnu sekvencu koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci; i domen CDR2 (LCDR2) lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je izabrana iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 1262, 1278, 1294, 1310, 1326 i 1335, ili njenu u suštini sličnu sekvencu koja je bar 90%, bar 95%, bar 98% ili bar 99% identična u sekvenci.

[0020] Određeni neograničavajući, primer anti-CD3/anti-CD20 bispecifičnih molekula za vezivanje antigena iz ovog pronalaska uključuju drugi domen za vezivanje antigena koji specifično veže CD20 koji sadrži HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 domene, tim redom, koji imaju aminokiselinske sekvence koje su izabrane iz grupe koja se sastoji iz: SEQ ID NOs: 1244-1246-1248-1260-1262-1264 (npr. BS3/20-001); 1244-1246-1248-1276-1278-1280 (npr. BS3/20-002); 1244-1246-1248-1292-1294-1296 (npr. BS3/20-003); 1244-1246-1248-1308-1310-1312 (npr. BS3/20-004); 1244-1246-1248-1324-1326-1328 (npr. BS3-20-005); i 1244-1246-1248-1334-1335-1336 (npr. BS3/20-007).

[0021] U srodnom izvođenju, pronalazak uključuje anti-CD3/anti-CD20 bispecifične molekule za vezivanje antigena pri čemu drugi antigen vezujući domen koji specifično vezuje CD20 sadrži domene CDR teškog lanca koji se nalaze u sekvencama varijabilnog regiona (HCVR/LCVR) lakog lanca koje su izabrane iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NO: 1242/1258, 1242/1274, 1242/1290, 1242/1306, 1242/1322 i 1242/1333.

[0022] Ovde su opisani molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koju od sekvenci HCVR, LCVR ili CDR ovde prikazanih anti-CD3/anti-CD20 bispecifičnih molekula za vezivanje antigena, uključujući molekule nukleinskih kiselina koje sadrže sekvence polinukleotida kao što su ovde prikazane u Tabelama 20 i 21, kao i molekule nukleinskih kiselina koji sadrže dve ili više sekvenci polinukleotida kao što su ovde prikazane u Tabelama 20 i 21 u bilo kojoj njihovoj funkcionalnoj kombinaciji ili uređenju. Rekombinantni ekspresioni vektori koji nose nukleinske kiseline, i ćelije domaćina u koje su takvi vektori uvedeni, su takođe opisani, kao što su postupci za dobijanje antitela kultivisanjem ćelije domaćina pod uslovima koji dozvoljavaju proizvodnju antitela, i regenerisanje proizvedenih antitela.

[0023] Ovaj pronalazak uključuje anti-CD3/anti-CD20 bispecifične molekule za vezivanje antigena pri čemu bilo koji od prethodno pomenutih domena za vezivanje antigena koji specifično vezuje CD3 je kombinovan, spojen ili na drugi način povezan sa bilo kojim od prethodno pomenutih domena za vezivanje antigena koji specifično vezuje CD20 da bi se obrazovao bispecifični molekul za vezivanje antigena koji vezuje CD3 i CD20.

[0024] Ovaj pronalazak uključuje anti-CD3/anti-CD20 bispecifične molekule za vezivanje antigena sa modifikovanim obrascem glikozilacije. U nekim prijavama, modifikacija kojom bi se uklonila neželjena mesta glikozilacije može biti korisna, ili antitelo kome nedostaje fukozni ostatak koji se nalazi na lancu oligosaharida, na primer, da bi se povećala funkcija ćelijske citotoksičnosti koja zavisi od antitela (ADCC) (videti Shield et al. (2002) JBC 277:26733). U drugim prijavama, modifikacija galaktozilacije može se napraviti da bi se modifikovala citotoksičnost koja zavisi od komplementa (CDC).

[0025] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži anti-CD3/anti-CD20 bispecifični molekul za vezivanje antigena kao što je gore prikazano i farmaceutski prihvatljiv nosač. U srodnom aspektu, izlaganje sadrži kompoziciju koja je kombinacija anti-CD3/anti-CD20 bispecifičnog molekula za vezivanje antigena i drugog terapeutskog sredstva. U jednom slučaju, drugo terapeutsko sredstvo je bilo koje sredstvo koje je povoljno kombinovano sa anti-CD3/anti-CD20 bispecifičnim molekulom za vezivanje antigena. Primeri sredstava koja se mogu povoljno kombinovati sa anti-CD3/anti-CD20 bispecifičnim molekulom za vezivanje antigena su ovde detaljno razmatrana na drugom mestu.

[0026] U još drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje bispecifični molekul za vezivanje antigena ili farmaceutsku kompoziciju kako je gore opisano za upotrebu u lečenju kancera B-ćelija kod subjekta. Takođe ovde su opisani terapeutski postupci za ciljanje/ubijanje ćelija tumora koje eksprimiraju CD20 upotrebom anti-CD3/anti-CD20 bispecifičnog molekula za vezivanje antigena prema pronalasku, pri čemu terapeutski postupci sadrže davanje terapeutski efikasne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži anti-CD3/anti-CD20 bispecifični molekul za vezivanje antigena prema pronalasku subjektu kome je to potrebno. Međutim, terapeutski postupci nisu deo za sebe pronalaska za koji je zatražena zaštita.

[0027] Ovo izlaganje takođe uključuje upotrebu anti-CD3/anti-CD20 bispecifičnog molekula za vezivanje antigena iz izlaganja u dobijanju leka za lečenje bolesti ili poremećaja koja je srodana ili izazvana ekspresijom CD20.

[0028] Drugi slučajevi će biti očigledni iz pregleda detaljnog opisa koji sledi.

KRATAK OPIS NACRTA

[0029]

Slika 1 pokazuje zapreminu tumora (u mm<3>) tokom vremena kod NOD/SCID miševa kojima je subkutanozno implantirana mešavina Raji tumorskih ćelija i PBMC-a koju prati implantacija i lečenje tumora, počev od dana implantacije tumora, sa ili humanim Fc (hFc, čvrsta linija) ili CD3xCD20 bispecifičnim antitelom (BS3/20-007, isprekidana linija).

Slika 2 pokazuje zapreminu tumora (u mm<3>) tokom vremena kod NOD/SCID miševa kojima je subkutanozno implantirana mešavina Raji tumorskih ćelija i PBMC-a koju prati implantacija i lečenje tumora, počev od 7 dana nakon implantacije tumora, sa ili humanim Fc (hFc, čvrsta linija) ili CD3xCD20 bispecifičnim antitelom (BS3/20-007, isprekidana linija).

Slika 3 prikazuje grafikon broja B-ćelija (x1000/µL) tokom vremena u uzorcima krvi iz cinomolgus majmuna koji su tretirani sa tri različite doze bispecifičnog antitela BS3/20-001 (0.01, 0.1 ili 1.0 mg/kg); niskom dozom anti-CD20 kontrolnog antitela (Kontrola V, 0.01 mg/kg); ili visoka doza anti-CD20 kontrolnog antitela (Kontrola III (1.0 mg/kg).

Slika 4 prikazuje grafikon broja T-ćelija (x1000/µL) tokom vremena u uzorcima krvi iz cinomolgus majmuna koji su tretirani sa tri različite doze bispecifičnog antitela BS3/20-001 (0.01, 0.1 ili 1.0 mg/kg); niskom dozom anti-CD20 kontrolnog antitela (Kontrola V, 0.01 mg/kg); ili visoka doza anti-CD20 kontrolnog antitela (Kontrola III (1.0 mg/kg).

Slike 5A, 5B, 5C i 5D pokazuju nivoe pre doziranja i posle doziranja (pg/mL) IFN-gama, IL-2, IL-6, i TNF-alfa, tim redom, za cinomolgous majmune koji su tretirani sa pojedinačnom dozom BS3/20-001 (0.01, 0.1 ili 1.0 mg/kg), niskom dozom anti-CD20 kontrolnog antitela (0.01 mg/kg Kontrola V), ili visoka doza anti-CD20 kontrolnog antitela (1.0 mg/kg Kontrola III).

Slika 6 prikazuje profil ekspresije CD20 (koji je izražen u smislu Log2 stepena promene u ekspresiji) koji je određen iz uzoraka krvi koji su uzeti iz različitih vremenskih tačaka iz cinomolgus majmuna tretiranih sa 0.01 mg/kg Kontrolom V (anti-CD20 antitelo); 1.0 mg/kg Kontrola III (anti-CD20 antitelo); i 0.01 mg/kg, 0.1 mg/kg i 1.0 mg/kg BS3/20-001 (anti-CD3xCD20 bispecifično antitelo).

Slika 7 prikazuje ukupnu koncentraciju u serumu (µg/mL) CD3xCD20 bispecifičnog antitela (BS3/20-001) tokom vremena u uzorcima krvi iz cinomolgus majmuna koji su tretirani sa 1.0 mg/kg (otvoreni trouglovi), 0.1 mg/kg (otvoreni kvadrati) ili 0.01 mg/kg (otvoreni dijamanti) CD3xCD20 bispecifičnog antitela.

DETALJAN OPIS

[0030] Tehnička informacija koja je prikazana u tekstu ispod može u nekim aspektima ići izvan izlaganja pronalaska za koji je zatražena zaštita, koji je ekskluzivno definisan priloženim patentnim zahtevima. Dodatna tehnička informacija je obezbeđena da se pronalazak za koji je zatražena zaštita postavi u širi tehnički kontekst i da bi se ilustrovali mogući tehnički razvoji. Takva dodatna tehnička informacija koja ne ulazi u obim priloženih patentnih zahteva, nije deo pronalaska za koji je zatražena zaštita. Pre nego što je ovo izlaganje opisano, potrebno je razumeti da izlaganje nije ograničeno na određene opisane postupke i eksperimentalne uslove, jer takvi postupci i uslovi mogu da se razlikuju. Takođe treba razumeti da terminologija koja je ovde korišćena je za svrhu opisivanja samo određenih slučajeva, i nije namenjena da bude ograničavajuća, s obzirom na to da će obim ovog pronalaska biti ograničen samo priloženim patentnim zahtevima.

[0031] Osim ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji su ovde korišćeni imaju imaju uobičajeno značenje kao što to obično razume osoba koja je uobičajeno verzirana u oblast tehnike kojoj ovo izlaganje pripada. Kao što se ovde koristi, izraz "oko," kada se koristi u odnosu na određenu definisanu brojčanu vrednost, označava da se ta vrednost može razlikovati od navedene vrednosti za ne više od 1%. Na primer, kao što je ovde navedeno, izraz "oko 100" uključuje 99 i 101 i sve vrednosti koje se nalaze između (npr., 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, itd.).

[0032] Iako bilo koji postupci i materijali koji su slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani se mogu koristiti u praksi ili ispitivanju ovog izlaganja, poželjni postupci i materijali su opisani sada.

Definicije

[0033] Ekspresija "CD3," kao što je ovde korišćena, se odnosi na antigen koji je eksprimiran na T ćelijama kao delu multimolekulskog T ćelijskog receptora (TCR) i koji se sastoji iz homodimera ili heterodimera koji je obrazovan iz povezivanja dva o četiri lanca receptora: CD3-epsilon, CD3-delta, CD3-zeta, i CD3-gama. Humani CD3-epsilon sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO:1370; humanoi CD3-delta sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO:1371. Sve reference na proteine, polipeptide i proteinske fragmente su ovde namenjene da se odnose na humanu verziju odgovarajućeg proteina, polipeptida ili proteinskog fragmenta osim ukoliko nije eksplicitno naznačeno da je dobijeno iz nehumanih vrsta. Prema tome, ekspresija "CD3" označava humani CD3 osim ukoliko nije naznačeno da je iz nehumanih vrsta, npr., "mišji CD3," "CD3 majmuna," itd.

[0034] Kao što je ovde korišćeno, "antitelo koje vezuje CD3" ili "anti-CD3 antitelo" uključuje antitela i njihove fragmente za vezivanje antigena koji specifično prepoznaju jednu podjedinicu CD3 (npr., epsilon, delta, gama ili zeta), kao i antitela i njihove fragmente za vezivanje antigena koji specifično prepoznaju dimerni kompleks od dve podjedinice CD3 (npr., gama/epsilon, delta/epsilon, i zeta/zeta CD3 dimere). Antitela i fragmenti za vezivanje antigena iz ovog izlaganja mogu vezati solubilni CD3 i/ili CD3 eksprimiran na ćelijskoj površini. Solubilni CD3 uključuje prirodne proteine CD3 kao i rekombinantne varijante proteina CD3 kao što su, npr., monomerni i dimerni konstrukti CD3, kojima nedostaje transmembranski domen ili koji na drugi način nisu povezano sa ćelijskom membranom.

[0035] Kao što je ovde korišćeno, izraz "CD3 eksprimiran na ćelijskoj površini" označava jednog ili više CD3 protein(a) koji je/su eksprimirani na površini ćelije in vitro ili in vivo, tako da bar deo CD3 proteina je izložen na vanćelijskog strani ćelijske membrane i dostupan je delu za vezivanje antigena antitela. "CD3 koji je eksprimiran na ćelijskoj površini" uključuje proteine CD3 koji se nalaze u kontekstu funkcionalnog T ćelijskog receptora u membrane ćelije. Izraz "CD3 eksprimiran na ćelijskoj površini" uključuje CD3 protein koji je eksprimiran kao deo homodimera ili heterodimera na površini ćelije (npr., gama/epsilon, delta/epsilon, i zeta/zeta CD3 dimeri). Izraz, "CD3 eksprimiran na ćelijskoj površini" takođe uključuje CD3 lanac (npr., CD3-epsilon, CD3-delta ili CD3-gama) koji je eksprimiran sam po sebi, bez drugih tipova lanca CD3, na površini ćelije. "CD3 eksprimiran na ćelijskoj površini" može sadržati ili se sastojati iz CD3 proteina eksprimiranog na površini ćelije koja normalno eksprimira CD3 protein. Alternativno, "CD3 eksprimiran na ćelijskoj površini" može sadržati ili se sastojati iz CD3 proteina eksprimiranog na površini ćelije koja normalno ne eksprimira humani CD3 na njegovoj površini ali je veštački modifikovan da eksprimira CD3 na površini.

[0036] Kao što je ovde korišćeno, izraz "anti-CD3 antitelo" uključuje i monovalentna antitela sa jednom specifičnosti, kao i bispecifična antitela koja sadrže prvi krak koji veže CD3 i drugi krak koji vezije drugi (ciljni) antigen, pri čemu anti-CD3 krak sadrži bilo koju od HCVR/LCVR ili CDR sekvenci kao što su ovde predstavljene u Tabeli 1 ili Tabelama 18/19. Primeri anti-CD3 bispecifičnih antitela su ovde opisani na drugom mestu. Termin "molekul za vezivanje antigena" uključuje antitela i fragmenata antitela za vezivanje antigena, uključujući, npr., bispecifična antitela.

[0037] Termin "antitelo", kao što se ovde koristi, znači bilo koji molekul za vezivanje antigena ili molekulskog kompleksa koji sadrži bar jedan region za određivanje komplementarnoti (CDR) koji se specifično vezuje za ili interaguje sa određenim antigenom (npr., CD3). Izraz "antitelo" uključuje imunoglobulinske molekule koji sadrže četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama, kao i njihovim multimerima (npr., IgM). Svaki težak lanac sadrži varijabilni region teškog lanca (ovde skraćeno kao HCVR ili VH) i konstantni region teškog lanca. Konstantni region teškog lanca sadrži tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac sadrži varijabilni regiona lakog lanca (ovde skraćeno kao LCVR ili VL) i konstantni region lakog lanca. Konstantni region lakog lanca sadrži jedan domen (CL1). Regioni VHi VLmogu dalje biti podeljeni u regione hipervarijabilnosti, koji se nazivaju regioni za određivanje komplementarnosti (CDRs), koji su rasejani među regionima koji su konzervisaniji, poznati kao regioni okvira (FR). Svaki VHi VLse sastoji iz tri CDRs i četiri FRs, koji su uređeni od amino kraja prema karboksi kraju u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. U različitim slučajima ovog izlaganja, FRs od anti-CD3 antitela (ili njegove porcije za vezivanje antigena) mogu biti identični humanim germinativnim sekvencama, ili mogu bii prirodno ili veštački modifikovani. Aminokiselinska konsenzusna sekvenca se može definisati na osnovu paralelne analize dva ili više CDRs.

[0038] Termin "antitelo", kao što se ovde koristi, takođe uključuje fragmente za vezivanje antigena punih molekula antitela. Termini "deo za vezivanje antigena" antitela, "fragment za vezivanje antigena" antitela, i slično, kao što se ovde koristi, uključuje bilo koji prirodni, koji se može dobiti enzimski, sintetički, ili genski modifikovani polipeptid ili glikoprotein koji specifično vezuje antigen da bi se obrazovao kompleks. Fragmenti antitela za vezivnje antigena se mogu dobiti, npr., iz potpunih molekula antitela korišćenjem bilo kojih standardnih postupaka kao što je proteolitička digestija ili postupci rekombinantnog genetičkog inženjeringa koji uključuje manipulaciju i ekspresiju DNK koja kodira varijabilne i po potrebi konstantne domene antitela. Takva DNK je poznata i/ili je odma dostupna iz, npr., komercijalnih izvora, biblioteka DNK (uključujući, npr., fag-antitelo biblioteke), ili se mogu sintetisati. DNK može biti sekvencirana i hemijski manipulisana ili korišćenjem molekularno bioloških postupaka, na primer, da bi se složio jedan ili više varijabilnih i/ili konstantnih domena u pogodnoj konfiguraciji, ili da bi se uveli kodoni, kreirali cisteinski ostaci, modikovale, dodale ili obrisale aminokiseline, itd.

[0039] Neograničavajući primeri fragmenata za vezivanje antigena uključuju: (i) Fab fragmente; (ii) F(ab’)2 fragmente; (iii) Fd fragmente; (iv) Fv fragmente; (v) jednolančane Fv (scFv) molekule; (vi) dAb fragmente; i (vii) minimalne jedinice prepoznavanja koje se sastoje iz aminokiselinskih ostataka koji imitiraju hipervarijabilni region antitela (npr., izolovani region za određivanje komplementarnosti (CDR) kao što je CDR3 peptid), ili ograničeni FR3-CDR3-FR4 peptid. Drugi modifikovani molekuli, kao što su antitela sa specifičnim domenom, antitela sa jednim domenom, antitela sa obrisanim domenom, himerna antitela, anitela sa prenetim CDR, diatela, triatela, tetratela, minitela, nanotela (npr. monovalentna nanotela, bivalentna nanotela, itd.), mali modularni imunofarmaceutici (SMIPs), i varijabilni IgNAR domeni ajkule, su takođe obuhvaćeni izrazom "fragment za vezivanje antigena" kao što se koristi ovde.

[0040] Fragment antitela za vezivanje antigena će obično sadržati bar jedan varijabilni domen. Varijabilni domen može biti bilo koje veličine aminokiselinkog sastava i generalno će sadržati bar jedan CDR koji se nalazi neposredno u blizini ili u okviru sa jednim ili više sekvenci regiona okvira. U fragmentima za vezivanje antigena koji imaju VHdomen koji je povezan sa domenom VL, domeni VHi VLdomeni mogu biti locirani jedan prema drugom u bilo kom pogodnom rasporedu. Na primer, varijabilni region može biti dimerni i sadržati dimere VH-VH, VH-VLili VL-VL. Alternativno, fragment antitela koji vezuje antigen može sadržati monomerni VHili VLdomen.

[0041] U određenim slučajima, fragment antitela koji vezuje antigen može sadržati bar jedan varijabilni domen koji je kovalentno u vezi sa bar jednim konstantnim domenom. Neograničavajući, primeri konfiguracija varijabilnih i konstantnih domena koji se mogu naći unutar fragment antitela koji vezuje antigen iz ovog izlaganja obuhvata: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; i (xiv) VL-CL. U bilo kojoj konfiguraciji varijabilnih i konstantnih domena, uključujući bilo koju od primera konfiguracija koje su gore navedene, varijabilni i konstantni domeni mogu biti ili direktno spojeni jedan sa drugiim ili mogu biti spojeni punim ili parcijalnim regionom zgloba ili linkera. Zglobni region se može sastojati iz bar 2 (npr., 5, 10, 15, 20, 40, 60 ili više) aminokiselina koje rezultuju u fleksibilnoj ili polu-fleksibilnoj vezi između susednih varijabilnih i/ili konstantnih domena u jednom polipeptidnom molekulu. Moreover, fragment antitela koji vezuje antigenof Ovo izlaganje može sadržati homo-dimer ili hetero-dimer (ili drugi multimer) bilo koje od konfiguracija varijabilnog i konstantnog domena koji su gore navedeni u nekovalentnom povezivanju jedan sa drugim i/ili sa jednim ili više monomernih VHili VLdomena (npr., disulfidnom vez(ama)om.

[0042] Kao sa punim molekulima antitela, fragmenti koji vezuju antigen mogu biti monospecifični ili multispecifični (npr., bispecifični). Multispecifični fragment antitela koji vezuje antigen će obično sadržati bar dva različita varijabilna domena, pri čemu je svaki varijabilni domen sposoban za specifično vezivanje za odvojeni antigen ili za različit epitop na istom antigenu. Bilo koji format multispecifičnog antitela, uključujući ovde prikazane primere formata bispecifičnih antitela, mogu se podesiti za upotrebu u kontekstu fragmenta antitela koji vezuje antigen iz ovog izlaganja korišćenjem rutinskih postupaka poznatih u oblasti tehnike.

[0043] Antitela iz ovog izlaganja mogu funkcionisati preko citotoksičnosti koja je zavisna od komplementa (CDC) ili ćelijski posredovane citotoksičnosti koja zavisi od antitela (ADCC). "Citotoksičnost koja je posredovana komplementom" (CDC) odnosi se na lizu ćelija koje eksprimiraju antigen antitelom iz izlaganja u prisustvu komplementa. "Ćelijski posredovana citotoksičnost koja zavisi od antitela" (ADCC) odnosi se na reakciju posredovanu ćelijama u kojoj nespecifične citotoksične ćelije koje eksprimiraju receptore Fc (FcRs) (npr., ćelije prirodne ubice (NK), neutrofili, i makrofagi) prepoznaju vezano antitelo na ciljnoj ćeliji i prema tome dovode do lize ciljne ćelije. CDC i ADCC se može izmeriti korišćenjem testova koji su dobro poznati i dostupni u oblasti tehnike. (Videti, npr., U.S. Patent br-e 5,500,362 i 5,821,337, i Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656). Konstantan region antitela je važan za sposobnost antitela da fiksira komplement i posreduje u ćelijsku zavisnoj citotoksičnosti. Prema tome, izotip antitela može biti odabran na osnovu toga da li je poželjan za antitelo koje poreduje u citotoksičnosti.

[0044] U određenim slučajima izlaganja, anti-CD3 antitela izlaganja (monospecifična ili bispecifična) su humana antitela. Termin "humano antitelo", kao što je ovde korišćen, je namenjen da uključi antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione dobijene iz humanih germinativnih imunoglobulinskih sekvenci. Humana antitela iz izlaganja mogu uključiti ostatke aminokiselina koji nisu kodirani humanim germinativnim imunoglobulinskim sekvencama (npr., mutacije uvdedene nasumičnom ili mutagenezom specifičnom za mesto in vitro ili somatska mutacija in vivo), na primer u CDR-a i naročito CDR3. Međutim, termin "humano antitelo", kao što se ovde koristi, nije namenjen da obuhvati antitela u kojima su sekvence CDR izvedene iz germinativnih sekvenci drugih vrsta sisara, kao što je miš, koje su prenete na sekvence u humanom regionu okvira.

[0045] Antitela izlaganja mogu, u nekim slučajevima, biti rekombinantna humana antitela. Termin "rekombinantno humano antitelo", kako se ovde koristi, treba da obuhvati sva humana antitela koja su pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana rekombinantnim sredstvima, kao što su antitela eksprimirana korišćenjem rekombinantnog ekspresionog vektora transfektovanog u ćeliju domaćina. (opisano dalje u nastavku), antitela izolovana iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke humanih antitela (opisana dalje u nastavku), antitela izolovana od životinje (npr., miš) koja su transgena za humane imunoglobulinske gene (videti npr., Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) ili antitela pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana na bilo koji drugi način koji uključuje spajanje sekvenci gena humanog imunoglobulina sa drugim sekvencama DNK. Takva rekombinantna humana antitela imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz germinativnih sekvenci humanog imunoglobulina. U određenim slučajevima, međutim, takva rekombinantna ljudska antitela su podvrgnuta in vitro mutagenezi (ili, kada se koristi životinja transgena za humane Ig sekvence, in vivo somatskoj mutagenezi), a prema tome i aminokiselinskim sekvencama VHi VLregiona rekombinantnog antitela su sekvence koje, iako su izvedene i srodne sa VHi VLsekvencama humane germinativne linije, možda prirodno ne postoje unutar germinativnog repertoara humanih antitela in vivo.

[0046] Humana antitela mogu postojati u dva oblika koja su povezana sa zglobnom heterogenošću. U jednom obliku, molekul imunoglobulina sadrži stabilnu četvorolančanu konstrukciju od približno 150-160 kDa u kojoj se dimeri drže zajedno disulfidnom vezom između teškog lanca. U drugom obliku, dimeri nisu povezani preko međulančanih disulfidnih veza i formira se molekul od oko 75-80 kDa sastavljen od kovalentno kuplovanog lakog i teškog lanca (polu-antitelo). Bilo je izuzetno teško razdvojiti ove oblike, čak i nakon afinitetnog prečišćavanja.

[0047] Učestalost pojavljivanja drugog oblika kod različitih intaktnih IgG izotipova je usled, ali nije ograničena na, strukturne razlike povezane sa zglobnim regionom izotipa antitela. Jedna supstitucija aminokiselina u zglobnom regionu humanog zgloba IgG4 može značajno smanjiti pojavu drugog oblika (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) na nivoe koji se uobičajeno primećuju korišćenjem zgloba humanog IgG1. Ovo izlaganje obuhvata antitela koja imaju jednu ili više mutacija u zglobnom, CH2 ili CH3 regionu koje mogu biti poželjne, na primer, u proizvodnji, da bi se poboljšao prinos željenog oblika antitela.

[0048] Antitela iz izlaganja mogu biti izolovana antitela. "Izolovano antitelo," kao što je ovde korišćeno, znači da je antitelo identifikovano i razdvojeno i/ili regenerisano iz bar jedne komponente u njegovom prirodnom okruženju. Na primer, antitelo koje je razdvojeno ili uklonjeno iz bar jedne komponente organizma, ili iz tkiva ili ćelije u kome antitelo prirodno postoji ili je prirodno proizvedeno, je "izolovano antitelo" za svrhe ovog izlaganja. Izolovano antitelo takođe uključuje antitelo in situ unutar rekombinantne ćelije. Izolovana antitela su antitela koja su podvrgnuta bar jednom koraku prečišćavanja ili izolovanja. Prema određenim slučajima, izolovano antitelo može biti suštinski slobodno od ćelijskog materijala i/ili hemikalija.

[0049] Ovo izlaganje takođe uključuje jednakokraka antitela koja vezuju CD3. Kao što je ovde korišćeno, "jednakokrako antitelo" označava molekul koji vezuje antigen koji sadrži jedan težak lanac antitela i jedan laki lanac antitela. Jednakokraka antitela iz ovog izlaganja mogu sadržati HCVR/LCVR ili CDR aminokiselinske sekvence kao što je ovde prikazano u Tabeli 1 ili Tabelama 18/19.

[0050] Anti-CD3 antitela koja su ovde otkrivena mogu da sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, insercija i/ili delecija u okvirima i/ili CDR regionima varijabilnih domena teškog i lakog lanca u poređenju sa odgovarajućim germinativnim sekvencama iz kojih su antitela izvedena. Takve mutacije se mogu lako utvrditi upoređivanjem sekvenci aminokiselina koje su ovde otkrivene sa germinativnim sekvencama koje su dostupne iz, na primer, javnih baza podataka sekvenci antitela. Ovo izlaganje uključuje antitela i njihove fragmente koji se vezuju za antigen, koji su izvedeni iz bilo koje od sekvenci aminokiselina koje su ovde otkrivene, pri čemu su jedna ili više aminokiselina unutar jednog ili više okvira i/ili CDR regiona mutirane u odgovarajući ostatak(e) germinativne sekvence iz koje je antitelo izvedeno, ili odgovarajućeg ostatka(a) druge humane germinativne sekvence, ili konzervativne aminokiselinske supstitucije odgovarajućeg(ih) ostatka(a) germinativnih (takve promene sekvence se ovde zajednički nazivaju "germinativne mutacije"). Osoba koja je uobičajeno verzirana u stanje tehnike, počevši od ovde otkrivenih sekvenci varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, može lako proizvesti brojna antitela i fragmente koji se vezuju za antigen koji sadrže jednu ili više pojedinačnih germinativnih mutacija ili njihovih kombinacija. U određenim slučajevima, svi ostaci okvira i/ili CDR unutar VHi/ili VLdomena su mutirani nazad u ostatke pronađene u originalnoj germinativnoj sekvenci iz koje je antitelo izvedeno. U drugim slučajevima, samo određeni ostaci su mutirani nazad u originalnu germinativnu sekvencu, npr., samo mutirani ostaci pronađeni u prvih 8 aminokiselina FR1 ili u poslednjih 8 aminokiselina FR4, ili samo mutirani ostaci koji se nalaze u CDR1, CDR2 ili CDR3. U drugim slučajevima, jedan ili više ostataka i/ili CDR ostataka su mutirani u odgovarajući ostatak(e) različite germinativne sekvence (tj. germinativna sekvenca koja se razlikuje od germinativne sekvence od koje je antitelo bilo prvobitno izveden). Osim toga, antitela iz ovog izlaganja mogu sadržati bilo koju kombinaciju dve ili više germinativnij mutacija unutar okvira i/ili CDR regiona, npr., pri čemu su određeni pojedinačni ostaci mutirani u odgovarajući ostatak određene germinativne sekvence, dok su neki drugi ostaci koji se razlikuju iz originalne germinativne sekvence se održavaju ili mutiraju u odgovarajući ostatak druge germinativne sekvence. Jednom dobijena, antitela i fragmenti koji se vezuju za antigen koji sadrže jednu ili više germinativnih mutacija mogu se lako testirati na jedno ili više željenih svojstava kao što su poboljšana specifičnost vezivanja, povećan afinitet vezivanja, poboljšana ili poboljšana antagonistička ili agonistička biološka svojstva (kao što su slučaj može biti), smanjena imunogenost, itd. Antitela i fragmenti koji se vezuju za antigen dobijeni na ovaj opšti način su obuhvaćeni ovim otkrićem.

[0051] Ovo izlaganje takođe uključuje anti-CD3 antitela koja sadrže varijante prema bilo kojoj od HCVR, LCVR, i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci koje su ovde prikazane koje imaju jednu ili više konzervativnih supstitucija. Na primer, ovo izlaganje uključuje anti-CD3 antitela koja imaju HCVR, LCVR, i/ili CDR aminokiselinske sekvence sa, npr., 10 ili manje, 8 ili manje, 6 ili manje, 4 ili manje, itd. konzervativnih aminokiselinskih supstitucija u odnosu na bilo koju od HCVR, LCVR, i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci koje su ovde prikazane u Tabeli 1.

[0052] Termin "epitop" se odnosi na antigensku determinantu koja interaguje sa specifičnim mestom vezivanja antigena u varijabilnom regionu molekula antitela koji je poznat kao paratop. Pojedinačni antigen može imati više od jednog epitopa. Prema tome, različita antitela se mogu vezati za različite površine na antigenu i mogu imati različite biološke efekte. Epitopi mogu biti ili konformacioni ili linearni. Konformacioni epitop je proizveden prostornim suprostavljanjem aminokiselinama iz različitih segmenata linearnog polipeptidnog lanca. Linearni epitop je onaj koji je proizveden susednim aminokiselinskim ostacima u polipeptidnom lancu. U određenoj okolnosti, epitop može uključiti ostatke saharida, fosforil grupa, ili sulfonil grupa na antigenu.

[0053] Termin "suštinski identitet" ili "suštiski identično," kada se odnosi na nukleinsku kiselinu ili njen fragment, označava da, kada je optimalno poravnat sa odgovarajućim insercijama nukleotida ili delecijama sa drugim nukleinskim kiselinama (ili njihovim komplementarnim lancem), postoji identitet u sekvenci nukleotida u bar oko 95%, i poželjnije bar oko 96%, 97%, 98% ili 99% baza nukleotida, kao što je mereno bilo kojim dobro poznatim algoritmom za identitet sekvence, kao što je FASTA, BLAST ili Gap, kao što je razmatrano u tekstu ispod. Molekul nukleinske kiseline koji je suštinski identičan referentnom molekulu nukleinske kiseline može, u određenim slučajima, kodirati za polipeptid koji ima istu ili u suštini sličnu sekvencu aminokiselina kao polipeptid koji je kodiran referentnim molekulom nukleinske kiseline.

[0054] Kako se primenjuje na polipeptide, termin "suštinska sličnost" ili "suštinski sličan" znači da dve peptidne sekvence, kada su optimalno poravnate, kao što je program GAP ili BESTFIT koristeći podrazumevane “gap” težine, dele najmanje 95% identiteta sekvence, čak i poželjnije najmanje 98% ili 99% identičnosti sekvence. Poželjno, pozicije ostataka koji nisu identični razlikuju se konzervativnim supstitucijama amino kiselina. "Konzervativna aminokiselinska supstitucija" je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak supstituisan drugim amino kiselinskim ostatkom koji ima bočni lanac (R grupa) sa sličnim hemijskim svojstvima (npr., naelektrisanje ili hidrofobnost). Generalno, konzervativna supstitucija aminokiselina neće bitno promeniti funkcionalna svojstva proteina. U slučajevima kada se dve ili više sekvenci aminokiselina razlikuju jedna od druge konzervativnim supstitucijama, procenat identiteta sekvence ili stepen sličnosti se može podesiti naviše da bi se korigovala konzervativna priroda supstitucije. Sredstva za ovo podešavanje su dobro poznata stručnjacima. Vidi, npr., Pearson (1994) Methods Mol. Biol.24: 307-331. Primeri grupa amino kiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim svojstvima uključuju (1) alifatične bočne lance: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; (2) alifatično-hidroksilni bočni lanci: serin i treonin; (3) bočni lanci koji sadrže amid: asparagin i glutamin; (4) aromatični bočni lanci: fenilalanin, tirozin i triptofan; (5) osnovni bočni lanci: lizin, arginin i histidin; (6) kiseli bočni lanci: aspartat i glutamat, i (7) bočni lanci koji sadrže sumpor su cistein i metionin. Poželjne konzervativne supstitucione grupe aminokiselina su: valin-leucin-izoleucin, fenilalanintirozin, lizin-arginin, alanin-valin, glutamat-aspartat i asparagin-glutamin. Alternativno, konzervativna zamena je svaka promena koja ima pozitivnu vrednost u matrici log-verovatnoće PAM250 otkrivenoj u Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. „Umereno konzervativna“ zamena je svaka promena koja ima nenegativnu vrednost u matrici logaritamske verovatnoće PAM250.

[0055] Sličnost sekvenci za polipeptide, koja se takođe naziva i identitet sekvence, obično se meri korišćenjem softvera za analizu sekvence. Softver za analizu proteina poklapa slične sekvence koristeći mere sličnosti dodeljene različitim supstitucijama, delecijama i drugim modifikacijama, uključujući konzervativne supstitucije aminokiselina. Na primer, GCG softver sadrži programe kao što su Gap i Bestfit koji se mogu koristiti sa podrazumevanim parametrima za određivanje homologije sekvence ili identiteta sekvence između blisko povezanih polipeptida, kao što su homologni polipeptidi iz različitih vrsta organizama ili između proteina divljeg tipa i njegovog muteina. Videti, npr., GCG verzija 6.1. Polipeptidne sekvence se takođe mogu uporediti korišćenjem FASTA upotrebom podrazumevanih ili preporučenih parametara, program u GCG verziji 6.1. FASTA (npr., FASTA2 i FASTA3) obezbeđuje poravnanja i procentualni identitet sekvenci regiona najboljeg preklapanja između sekvenci koja se ispituje i pretrage (Pearson (2000) supra). Drugi poželjni algoritam kada se poredi sekvenca iz ovog izlaganja sa bazom podataka koja sadrži veliki broj sekvenci iz različitih organizama je kompjuterski program BLAST, posebno BLASTP ili TBLASTN, upotrebom podrazumevanih parametara. Videti, npr., Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.215:403-410 i Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res.25:3389-402.

Bispecifični molekuli za vezivanje antigena

[0056] Antitela iz ovog izlaganja mogu biti monospecifična, bi-specifična, ili multispecifična. Multispecifična antitela mogu biti specifična za različite epitope jednog ciljnog polipeptida ili mogu sadržati domene za vezivanje antigena specifične za više od jednog ciljnog polipeptida. Videti, npr., Tutt et al., 1991, J. Immunol.147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol.22:238-244. Anti-CD3 antitela iz ovog izlaganja mogu biti spojena ili zajedno eksprimirana sa drugim funkcionalnim molekulima, npr., drugim peptidom ili proteinom. Na primer, antitelo ili njegov fragment mogu biti fukcionalno spojeni (npr., hemijskim kuplovanjem, genskom fuzijom, nekovalentim povezivanjem ili drugačije) za jedan ili više drugih molekulskih entiteta, kao što je drugo antitelo ili fragment antitela da bi se proizvelo bispecifično ili multispecifično antitelo sa drugom specifičnosti vezivanja.

[0057] Upotreba izraza "anti-CD3 antitelo" ovde je namenjena da uključi i monospecifična anti-CD3 antitela kao i bispecifična antitela koja sadrže CD3-vezujući krak i drugi krak koji vezuje ciljni antigen. Prema tome, ovo izlaganje uključuje bispecifična antitela u kojima jedan krak imunoglobulina vezuje humani CD3, i dugi krak imunoglobulina vezuje ciljni antigen. Ciljni antigen koji vezuje drugi krak CD3 bispecifičnog antitela može biti bilo koji antigen koji je eksprimiran ili je u blizini ćelije, tkiva, organa, mikroorganizma ili virusa, protiv kojeg je poželjan ciljani imunski odgovor. CD3-vezujući krak može sadržati bilo koju od HCVR/LCVR ili CDR aminokiselinskih sekvenci kao što su ovde predstavljene u Tabeli 1 ili Tabelama 18/19. U određenim slučajima, CD3-vezujući krak veže humani CD3 i indukuje proliferaciju humanih T ćelija.

[0058] U kontekstu bispecifičnih antitela iz ovog izlaganja gde jedan krak antitela vezuje CD3 i drugi krak vezuje ciljni antigen, ciljni antigen može biti antigen koji je povezan sa tumorom. Neograničavajući primeri specifičih antigena povezanih sa tumorom uključuje, npr., AFP, ALK, BAGE proteini, β-katenin, brc-abl, BRCA1, BORIS, CA9, karbonatna dehidrataza IX, kaspaza-8, CCR5, CD19, CD20, CD30, CD40, CDK4, CEA, CTLA4, ciklin-B1, CYP1B1, EGFR, EGFRvlll, ErbB2/Her2, ErbB3, ErbB4, ETV6-AML, EpCAM, EphA2, Fra-1, FOLR1, GAGE proteini (npr., GAGE-1, -2), GD2, GD3, GloboH, glipikan-3, GM3, gp100, Her2, HLA/B-raf, HLA/k-ras, HLA/MAGE-A3, hTERT, LMP2, MAGE proteini (npr., MAGE-1, -2, -3, -4, -6, i -12), MART-1, mezotelin, ML-IAP, Muc1, Muc2, Muc3, Muc4, Muc5, Muc16 (CA-125), MUM1, NA17, NY-BR1, NY-BR62, NY-BR85, NY-ESO1, OX40, p15, p53, PAP, PAX3, PAX5, PCTA-1, PLAC1, PRLR, PRAME, PSMA (FOLH1), RAGE proteini, Ras, RGS5, Rho, SART-1, SART-3, Steap-1, Steap-2, survivin, TAG-72, TGF-β, TMPRSS2, Tn, TRP-1, TRP-2, tirozinaza, i uroplakin-3. Međutim, samo bispecifični molekul za vezivanje antigena koji sadrži prvi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani CD3, i drugi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani CD20 kako je definisano u patentnim zahtevima, je u okviru obima pronalaska za koji je zatražena zaštita .

[0059] U kontekstu bispecifičnih antitela iz ovog izlaganja u kojima jedan krak antitela vezuje CD3 a drugi krak vezuje ciljni antigen, ciljni antigen može biti antigen koji je povezan sa bolešću. Neograničavajući primeri antigena koji su povezani sa infektivnom bolesti uključuju, npr., antigen koji je eksprimiran na površini virusne čestice, ili preferencijalno eksprimiran na ćeliji koja je inficirana virusom, pri čemu je virus odabran iz grupe koja se sastoji iz HIV-a, hepatitisa (A, B ili C), herpes virusa (npr., HSV-1, HSV-2, CMV, HAV-6, VZV, Epštajn Barovog virusa), adenovirusa, virusa influence, flavivirusa, echovirusa, rinovirusa, virusa koksaki, koronavirusa, respiratornog sincicijalnog virusa, virusa zauški, rotavirusa, virusa boginja, rubela virusa, parvovirusa, vakcinija virusa, HTLV, denga virusa, papilomavirusa, molluscum virusa, poliovirusa, virusa besnila, JC virusa, i virusa arbovirusnog encefalitisa. Alternativno, ciljni antigen može biti antigen koji je eksprimiran na površini bakterije, ili preferencijalno eksprimiran na ćeliji koja je inficirana bakterijom, pri čemu je bakterija odabrana iz grupe koja se sastoji chlamydia, rickettsia, mycobacteria, staphylococci, streptococci, pneumonococci, meningococci, gonococci, klebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, legionella, diphtheria, salmonella, bacilli, cholera, tetanus, botulism, anthrax, plague, leptospira, i bakterije koja uzrokuje lajmsku bolest. U određenim slučajima, ciljni antigen je antigen koji je eksprimiran na površini gljivice, ili preferencijalno eksprimiran na ćeliji koja je inficirana gljivicom, pri čemu je gljivica odabrana iz grupe koja se sastoji iz Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, itd.), Crytococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger, itd.), Mucorales (mucor, absidia, rhizopus, itd.), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis, i Histoplasma capsulatum. U određenim slučajima, ciljni antigen je antigen koji je eksprimiran na površini parazita, ili je preferencijalno eksprimiran na ćeliji koja je inficirana parazitom, pri čemu je parazit odabran iz grupe koja se sastoji iz Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondii, Nippostrongylus brasiliensis, Taenia crassiceps, i Brugia malayi. Neograničavajući primeri specifičnih antigena koji su povezani sa patogenom uključuju, npr., HIV gp120, HIV CD4, hepatitis B glukoprotein L, hepatitis B glucoprotein M, hepatitis B glucoprotein S, hepatitis C E1, hepatitis C E2, protein specifičan za hepatocite, gB herpeks simpleks virua, citomegalovirusni gB, i protein omotača HTLV.

[0060] Ovaj pronalazak odnosi se na molekule koji vezuju bispecifični, koji specifično vezuju CD3 i CD20. Takvi molekuli mogu ovde biti označeni kao, npr., "anti-CD3/anti-CD20," ili "anti-CD3xCD20" ili "CD3xCD20" bispecifični molekuli, ili drugom sličnom terminologijom.

[0061] Termin "CD20," kao što se ovde koristi, se odnosi na humani CD20 protein osim ukoliko nije naznačeno da je poreklom iz nehumanih vrsta (npr., "mišji CD20," "majmunski CD20," itd.). Humani CD20 protein ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:1369.

[0062] Kao što se ovde koristi, izraz "antigen-vezujući molekul" označava protein, polipeptid ili molekulski kompleks koji sadrži ili se sastoji iz bar jednog regiona koji određuje komplementarnost (CDR) koji zasebno, ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih CDR i/ili regionima okvira (FR), specifično vezuje ciljni antigen. U određenim slučajima, antigen vezujući molekul je antitelo ili fragment antitela, kao što su ti termini ovde definisani na drugom mestu.

[0063] Kao što se ovde koristi, izraz "bispecifični molekul za vezivanje antigena" označava protein, polipeptid ili molekulski kompleks koji sadrži bar prvi domen za vezivanje antigena i drugi domen za vezivanje antigena. Svaki domen za vezivanje antigena u bispecifičnom molekulu za vezivanje antigena sadrži bar jedan CDR koji se sam, ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih CDR i/ili FR, specifično vezuje za određeni antigen. U kontekstu ovog izlaganja, prvi domen za vezivanje antigena specifično vezuje prvi antigen (CD3), i drugi domen za vezivanje antigena specifično vezuje drugi, različiti antigen (CD20).

[0064] U određenim primerima slučaja iz ovog izlaganja, bispecifični molekul koji vezuje antigen je bispecifično antitelo. Svaki domen koji vezuje antigen bispecifičnog antitela sadrži varijabilni domen teškog lanca (HCVR) i varijabilni domen lakog lanca (LCVR). U kontekstu bispecifičnog molekula koji vezuje antigen koji sadrži prvi i drugi domen za vezivanje antigena (npr., bispecifično antitelo), CDR prvog domena za vezivanje antigena mogu biti označeni sa prefiksnom "A1" i CDR-i iz drugog domena za vezivanje antigena mogu biti označeni sa prefiksom "A2". Prema tome, CDR-i prvog domena za vezivanje antigena može ovde biti označen sa A1-HCDR1, A1-HCDR2, i A1-HCDR3; i CDR drugog domena za vezivanje antigena mogu ovde biti označeni sa A2-HCDR1, A2-HCDR2, i A2-HCDR3.

[0065] Prvi domen za vezivanje antigena i drugi domen za vezivanje antigena mogu biti direktno ili indirektno povezani jedan sa drugim da se obrazuje bispecifični molekul za vezivanje antigena iz ovog izlaganja. Alternativno, prvi domen za vezivanje antigena i drugi domen za vezivanje antigena mogu svaki biti povezani u odvojeni domen za multimerizaciju. Povezivanje jednog domena za multimerizaciju sa drugim domenom za multimerizaciju olakšava povezivanje između dva domena za vezivanje antigena, time obrazujući bispecifični molekul za vezivanje antigena. Kao što je ovde korišćeno, "multimerizirajući domen" je bilo koji makromolekul, protein, polipeptid, peptid, ili aminokiselina koja ima sposobnost da se povezuje sa drugim multimerizujućim domenom iste ili slične strukture ili konstitucije. Na primer, multimerizujući domen može biti polipeptid koji sadrži CH3 domen imunoglobulina. Neograničavajući primer multimerizujuće komponente je Fc deo imunoglobulina (koji sadrži CH2-CH3 domen), npr., Fc domen IgG koji je odabran iz izotipova IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4, kao i bilo koji alotip unutar svake grupe izotipa.

[0066] Bispecifični molekuli koji vezuju antigen iz ovog izlaganja će se se obično sastojati iz dva multimerizujuća domena, npr., dva domena Fc koja su svaki individualno deo odvojenog teškog lanca antitela. Prvi i drugi multimerizujući domeni mogu biti istog izotipa IgG kao što je, npr., IgG1/IgG1, IgG2/IgG2, IgG4/IgG4. Alternativno, prvi i drugi multimerizujući domeni mogu biti različitih izotipova IgG kao što su, npr., IgG1/IgG2, IgG1/IgG4, IgG2/IgG4, itd.

[0067] U određenim slučajima, domen multimerizacije je fragment Fc ili aminokiselinska sekvenca od 1 do oko 200 aminokiselina dužine koja sadrži bar jedan ostatak cisteina. U drugim slučajevima, multimerizujući domen je ostatak cisteina, ili kratak peptid koji sadrži cistein. Drugi multimerizujući domeni obuhvataju peptide ili polipeptida koji sadrže ili se sastoje iz leucinskog zatvarača, motiva zavojnica-petlja, ili motiva navoja-zavojnice.

[0068] Bilo koji format ili tehnologija bispecifičnog antitela može biti korišćen za dobijanje bispecifičnih molekula koji vezuju antigen iz ovog izlaganja. Na primer, antitelo ili njegov fragment koji ima prvu specifičnost za vezivanje antigena može biti funkcionalno povezan (npr., hemijskim kuplovanjem, genskom fuzijom, nekovalentno povezivanje ili drugo) za jedan ili više drugih molekulskih entiteta, kao što je drugo antitelo ili fragment antitela koji ima drugu specifičnost za vezivanje antigena da bi se proizveo bispecifični molekul koji vezuje antigen. Specifični primer bispecifičnih formata koji se mogu koristiti u kontekstu iz ovog pronalaska uključuju, bez ograničenja, npr., scFv-zasnovano ili diatelo bispecifične formate, IgG-scFv fuzije, dualni varijabilni domen (DVD)-lg, Qvadrom, “knobs-into-holes”, zajednički laki lanac (npr., zajednički laki lanac sa dugme-u-rupi, itd.), CrossMab, CrossFab, (SEED)telo, leucinski zatvarač, Duobody, IgG1/IgG2, Fab sa dualnim dejstvom (DAF)-lgG, i Mab<2>bispecifični formati (videti, npr., Klein et al.2012, mAbs 4:6, 1-11, i reference koje su navedene, za pregled gorenavedenih formata).

[0069] U kontekstu bispecifičnih molekula koji vezuju antigen iz ovog izlaganja, domeni za multimerizaciju, npr., Fc domeni, mogu sadržati jednu ili više aminokiselinskih izmena (npr., insercije, delecije ili supstitucije) u poređenju sa, verzijom domena Fc koji se pojavljuje u prirodi. Na primer, izlaganje uključuje bispecifične molekule za vezivanje antigena koji sadrže jednu ili više modifikacija u Fc domenu koji rezultuje u modifikovanom domenu Fc koji ima modifikovanu interakciju vezivanja (npr., pojačan ili umanjen) između Fc i FcRn. U jednom slučaju, bispecifičan molekul koji vezuje antigen sadrži modifikaciju u CH2 ili CH3 regionu, gde modifikacija povećava afinitet domena Fc za FcRn u kiselinskom okruženju (npr., u endozomu gde je pH u opsegu od oko 5.5 do 6.0). Neograničavajući primeri takvih modifikacija Fc uključuju, npr., modifikaciju u poziciji 250 (npr., E ili Q); 250 i 428 (npr.,L ili F);252 (npr., L/Y/F/W ili T), 254 (npr.,S ili T), i 256(npr., S/R/Q/E/D ili T); ili modifikaciju u poziciji 428 i/ili 433 (npr., L/R/S/P/Q ili K) i/ili 434 (npr., H/F ili Y); ili modifikaciju u poziciji 250 i/ili 428; ili ili modifikaciju u poziciji 307 ili 308 (npr., 308F, V308F), i 434. U jednom slučaju, modifikacija sadrži 428L (npr., M428L) i 434S (npr., N434S) modifikaciju; 428L, 259I (npr., V259I), i 308F (npr., V308F) modifikaciju; 433K (npr., H433K) i 434 (npr., 434Y) modifikaciju; 252, 254, i 256 (npr., 252Y, 254T, i 256E) modifikaciju; 250Q i 428L modifikaciju (npr., T250Q i M428L); i 307 i/ili 308 modifikaciju (npr., 308F ili 308P).

[0070] Ovo izlaganje takođe uključuje bispecifične molekule koji vezuju antigene koji sadrže prvi CH3 domen i drugi Ig CH3 domen, pri čemu prvi i drugi Ig CH3 domeni se razlikuju jedan od drugog za najmanje jednu aminokiselinu, i pri čemu razlika u najmanje jednoj aminokiselini smanjuje vezivanje bispecifičnog antitela za Protein A u poređenju sa bi-specifičnim antitelom kome nedostaje razlika u aminokiselini. U jednom slučaju, prvi Ig CH3 domen veže Protein A i drugi Ig CH3 domen sadrži mutaciju koja smanjuje ili ukida vezivanje Proteina A kao što je modifikacija H95R (sa IMGT numerisanjem egzona; H435R sa EU numerisanjem). Drugi CH3 može dalje sadržati modifikaciju Y96F (sa IMGT; Y436F sa EU). Ostale modifikacije koje se mogu naći u drugom CH3 sadrže: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, i V82I (sa IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, i V422I od EU) u slučaju IgG1 antitela; N44S, K52N, i V82I (IMGT; N384S, K392N, i V422I od EU) u slučaju IgG2 antitela; i Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, i V82I (od strane IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, i V422I od EU) u slučaju IgG4 antitela.

[0071] U određenim slučajima, domen Fc može biti himerni, kombinovanjem sekvenci Fc koje su dobijene iz više od jednog izotipa imunoglobulina. Na primer, himerni domen Fc može sadržati deo ili svaku od CH2 sekvence koja je dobijena iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4 CH2 regiona, i dela ili svake od CH3 sekvence koja je dobijena iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4. Himerni domen Fc može takođe sadržati himerni zglobni region. Na primer, himerni zglob može sadržati sekvencu "gornjeg zgloba", koja je dobijena iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4 zglobnog regiona, u kombinaciji sa sekvencom "donjeg zgloba", koja je izvedena iz humanog IgG1, huamnog IgG2 ili humanog IgG4 zglobnog regiona. Poseban primer himernog zglobnog regionaFc koji može biti uključen u bilo koji od antigen vezujućih molekula koji su ovde prikazani sadrži, od N-prema C-terminusu: [IgG4 CH1] -[IgG4 gornji zglob] -[IgG2 donji zglob] -[IgG4 CH2] -[lgG4 CH3]. Drugi primer himernog domena Fc koji može biti uključen u bilo koji od antigen-vezujućih molekuka koji su ovde predstavljeni sadrži, od N-prema C-terminusu: [IgG1 CH1]-[IgG1 gornji zglob] -[IgG2 donji zglbo] -[IgG4 CH2] -[IgG1 CH3]. Ovi i drugi primeri himernih domena Fc koji mogu biti uključeni u bilo koji od antigen vezujućih molekula iz ovog izlaganja su opisani u US provizionoj prijavi br.61/759,578, koja je podneta 1 februara, 2013. Himerni domeni Fc koji imaju ove generalne strukturalne aranžmane, i njihove varijante, mogu imati izmenjeno vezivanje Fc receptora, koji sa druge strane utiče na efektorsku funkciju Fc.

Varijante sekvenci

[0072] Antitela i bispecifični molekuli koji vezuju antigen iz ovog izlaganja mogu sadržati jednu ili više aminokiselinskih suptitucija, insercija i/ili delecija u regionu okvira i/ili regionima CDR varijabilnih domena teškog i lakog lanca u poređenju sa odgovarajućim germinativnim sekvencama iz kojih su dobijeni pojedinačni domeni za vezivanje antigena. Takve mutacije se mogu lako utvrditi poređenjem aminokiselinskih sekvenci koje su ovde izložene sa germinativnim sekvencama koje su dostupne iz, na primer, javne baze podataka sekvenci antitela. Molekuli za vezivanje antigena iz ovog izlaganja mogu sadržati domene za vezivanje antigena koji su izvedeni iz bilo koje od primera ovde izloženih aminokiselinskih sekvenci, gde jedna ili više aminokiselina u jednom ili više region okvira i/ili regionima CDR su mutirane u odgovarajući ostatak(e) germinativne sekvence iz koje je antitelo dobijeno, ili u odgovarajući ostatak(e) druge humane germinativne sekvence, ili u konzervativnu aminokiselinsku supstituciju odgovarajućih germinativnih ostatak(a) (takve promene u sekvenci se ovde kolektivno nazivaju "germinativne mutacije"). Osoba koja je uobičajeno verzirana u stanje tehnike, počev od ovde prikazanih sekvenci varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, može lako proizvesti brojna antitela i antigen vezujuće fragmente koji sadrže jednu ili više pojedinačnih germinativnih mutacija ili njihovih kombinacija. U određenim slučajima, svaki od regiona okvira i/ili ostataka CDR unutar domena VHi/ili VLsu mutirani povratno do ostataka koji su nađeni u originalnog germlinativnog sekvenci iz koje je antigen vezujući domen originalno dobijen. U drugim slučajevima, samo određeni ostaci su povratno mutirani do originalne germinativne sekvence, npr., samo mutirani ostaci se mogu naći u prvih 8 aminokiselina FR1 ili unutar poslednjih 8 aminokiselina FR4, ili samo mutirani ostaci koji se mogu naći u CDR1, CDR2 ili CDR3. U drugim slučajevima, jedan ili više regiona okvira i/ili CDR ostatak(a) su mutirani do odgovarajućih ostatak(a) različite germinativne sekvence (tj., germinativna sekvenca koja je različita od germinativne sekvence iz koje je antigen vezujući domen originalno dobijen). Dalje, antigen vezujući domeni mogu sadržati bilo koju kombinaciju dve ili više germinativnih mutacija uutr regiona okvira i/ili CDR regiona, npr., pri čemu određeni pojedinačni ostaci su mutirani do odgovarajućeg ostatka određene germinativne sekvence dok su određeni drugi ostaci koji se razlikuju od originalne germinativne sekvence održavani ili su mutirani u odgovarajući ostatak različite germinativne sekvence. Jednom dobijeni, antigen-vezujući domeni koji sadrže jednu ili više germinativnih mutacija se mogu lako testirati za jednu ili više željenih osobina kao što su, poboljšana specifičnost vezivanja, povećan afinitet vezivanja, unapređene ili pojačane antagonističke ili agonističke biološke osobine (kao što slučaj može biti), smanjena imunogenost, itd. Bispecifični molekuli koji vezuju antigene sadrže jedan ili više antigen-vezujućih domena dobijenih na ovaj opšti način su obuhvaćeni ovim izlaganjem. Međutim, samo bispecifični molekul za vezivanje antigena koji sadrži prvi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani CD3, i drugi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani CD20, gde prvi domen koji vezuje antigen obuhvata varjabilni region teškog lanca (HCVR) koji sadrži regione koji određuju komplementarnost A1-HCDR1, A1-HCDR2 i A1-HCDR3, i varjabilni region lakog lanca (LCVR) koji sadrži regione koji određuju komplementarnost A1-LCDR1, A1-LCDR2 i A1-LCDR3, gde regioni koji određuju komplementarnost se nalaze u okviru para HCVR/LCVR koji sadrži aminokiselinske sekvence iz SEQ ID NOs: 1250/1258, 1266/1274 ili 1282/1290, gde bispecifični molekul za vezivanje antigena izaziva proliferaciju mononuklearnih ćelija periferne krvi čoveka i cinomolgusa in vitro, kao što je definisano u patentnim zahtevima, je obuhvaćena obimom antitela pronalaska za koji je zatražena zaštita.

[0073] Ovo izlaganje takođe uključuje antigen-vezujuće molekule pri čemu jedan ili oba domena za vezivanje antigena sadrže varijante bilo koje od HCVR, LCVR, i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci koje su ovde izložene koje imaju jednu ili više konzervativnih supstitucija. Na primer, ovo izlaganje uključuje antigen-vezujuće molekule koji sadrže domen za vezivanje antigena koji ima HCVR, LCVR, i/ili sekvence aminokiselina CDR, npr., 10 ili manje, 8 ili manje, 6 ili manje, 4 ili manje, itd. konzervativnih aminokiselinskih supstitucija u odnosu na bilo koju od HCVR, LCVR, i/ili sekvenci CDR aminokiselina koje su ovde prikazane. "Konzervativna aminokiselinska supstitucija" je ona u kojoj je ostatak aminokiseline zamenjen sa drugim ostatakom aminokiseline koji ima bočni lanac (R grupu) sa sličnim hemijskim osobinama (npr., naelektrisanjem ili hidrofobnosti). Generalno, konzervativna aminokiselinska supstitucija neće suštinski izmeniti funkcionalne osobine proteina. Primeri grupa aminokiselna koji imaju bočne lance sa sličnim hemijskim osobinama uključuju (1) alifatične bočne lance: glicin, alanin, valin, leucine i izoleucin; (2) alifatični-hidroksil bočni lanci: serin i treonin; (3) bočni lanci koji sadrže amin: asparagin i glutamin; (4) aromatični bočni lanci: fenilalanin, tirozin, i triptofan; (5) bazni bočni lanci: lizin, arginin, i histidin; (6) kiselinski bočni lanci: aspartate i glutamat, i (7) bočni lanci koji sadrže sumpor su cistein i metionin. Poželjne konzervativne aminokiselinske supstitucione grupe su: valin-leucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alanin-valin, glutamat-aspartat, i asparagin-glutamin. Alternativno, konzevativna zamena je bilo koja izmena koja ima pozitivnu vrednost u PAM250 log-matrici verovatnoće koja je prikazana u Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. "Umereno konzervativna" zamena je bilo koja izmena koja ima nenegativnu vrednost u PAM250 log-matrici verovatnoće.

[0074] Ovo izlaganje takođe uključuje antigen-vezujuće molekule koji sadrže domen za vezivanje antigena sa HCVR, LCVR, i/ili CDR aminokiselinskom sekvencom koja je u suštini identična bilo kojoj od HCVR, LCVR, i/ili CDR aminokiselinkih sekvenci koje su ovde prikazane. Izraz "suštinski identitet" ili "suštinski identična," kada se odnosi na aminokiselinsku sekvencu znači da su dve sekvence aminokiselina, kada su optimalno poravnate, kao što je koriščenjem programa GAP ili BESTFIT korišenjem podrazumevanih gap težina, dele najmanje 95% identitet sekvenci, još poželjnije najmanje 98% ili 99% identitet sekvenci. Poželjno, položaji ostataka koji nisu identični razlikuju se u konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama. U slučajima gde se dve ili više sekvenci aminokiselina razlikuju jedna od druge konzervativnim supstitucijama, procenat identiteta u sekvenci ili stepen sličnosti može se podesiti naviše da bi se ispravila konzervativna priroda supstitucije. Načini za ostvarivanje ovog podešavanja su dobro poznati u stručnjacima iz oblasti tehnike. Videti, npr., Pearson (1994) Methods Mol. Biol.24: 307-331.

[0075] Sličnost u sekvenci za polipeptide, koja je takođe nazvana identitet sekvence, je obično merena upotrebom softvera za analizu sekvenci. Softver za analizu proteina poklapa slične sekvence korišćenjem mera sličnosti koje su dodeljene različitim supstitucijama, delecijama i drugim modifikacijama, uključujući konzervativne aminokiselinske supstitucije. Na primer, GCG softver sadrži programe kao što su Gap i Bestfit koji se mogu koristiti sa podrazumevanim parametrima da bi se odredila homologija u sekvenci ili identitet u sekvenci između blisko srodnih polipeptida, kao što su homologni polipeptidi iz različitih vrsta organizama ili između proteina divljeg tipa i njegovog muteina. Videti, npr., GCG Verzija 6.1. Polipeptidne sekvence takođe mogu biti upoređene upotrebom FASTA korišćenjem podrazumevanih ili preporučenih parametara, program u GCG Verziji 6.1. FASTA (npr., FASTA2 i FASTA3) obezbeđuje poravnanja i procenat identiteta u sekvenci u regionima najboljeg poklapanja između ispitivane i sekvence pretrage (Pearson (2000) supra). Drugi poželjni algoritam kada se upopredi sekvenca iz izlaganja sa bazom podataka koja sadrži veliki broj sekvenci iz različitih organizama je kompjuterski program BLAST, naročito BLASTP ili TBLASTN, korišćenjem podrazumevanih parametara. Videti, npr., Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.215:403-410 and Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res.25:3389-402.

Vezivanje koje zavisi od pH

[0076] Ovaj pronalazak uključuje anti-CD3/anti-CD20 bispecifične antigen-vezujuće molekule, sa osobinama vezivnja koje zavise od pH. Na primer, anti-CD3 antitelo iz ovog izlaganja može ispoljiti smanjeno vezivanje za CD3 na kiseloj pH u poređenju sa neutralnom pH. Alternativno, anti-CD3 antitela iz izlaganja mogu ispoljiti pojačano vezivanje za CD3 na kiseloj pH u poređenju sa neutralnom pH. Izraz "kisela pH" obuhvata vrednosti pH manje od oko 6.2, npr., oko 6.0, 5.95, 5,9, 5.85, 5.8, 5.75, 5.7, 5.65, 5.6, 5.55, 5.5,5.45, 5.4, 5.35, 5.3, 5.25, 5.2, 5.15, 5.1, 5.05, 5.0, ili manje. Kao što je ovde korišćeno, izraz "neutralna pH"označava pH od oko 7.0 do oko 7.4. Izraz "neutralna pH" uključuje vrednosti pH od oko 7.0, 7.05, 7.1, 7.15, 7.2, 7.25, 7.3, 7.35, i 7.4.

[0077] U određenim slučajima, "smanjeno vezivanje ... na kiseloj pH u poređenju sa neutralnom pH" je izraženo u terminima odnosa vrednosti KDvezivanja antitela za njegov antigen na pH u odnosu na KDvrednost vezivanja antitela za njegov antigen na neutralnoj pH (ili obrnuto). Na primer, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena mogu se posmatrati da ispoljavaju "smanjeno vezivanje za CD3 na kiseloj pH u poređenju sa neutralnom pH" za svrhe ovog izlaganja ukoliko antitelo ili njegov fragment za vezivnje antigena ispoljava kiselinski/neutralni KDodnos od oko 3.0 ili veći. U određenim primerima slučaja, kiselinski/neutralni KDodnos za antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena iz ovog izlaganja može biti oko 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5, 15.0, 20.0.25.0, 30.0, 40.0, 50.0, 60.0, 70.0, 100.0 ili veći.

[0078] Mogu se dobiti antitela sa osobinama vezivanja koje zavise od pH, npr., skriningom populacije antitela za smanjeno (ili pojačano) vezivanje za određeni antigen na kiseloj pH u poređenju sa neutralnom pH. Dodatno, modifikacije domena za vezivanje antigena na aminokiselinskom nivou dati prinos anitela sa osobinama koje zavise od pH. Na primer, supstituisanjem jedne ili više aminokiselina domena za vezivanje antigena (npr., u CDR) sa ostatkom histidina, antitelo sa smanjenim vezivanjem antigena na kiseloj pH u odnosu na neutralnu pH se može dobiti.

Antitela koja sadrže varijante Fc

[0079] U skladu sa određenim slučajima iz ovog izlaganja, obezbeđeni su anti-CD3 antitela, i anti-CD3/anti-CD20 bispecifični antigen vezujući molekuli, koji sadrže domen Fc koji sadrži jednu ili više mutacija koja pojačava ili ukida vezivanje antitela za FcRn receptor, npr., na kiseloj pH u poređenju sa neutralnom pH. Na primer, ovo izlaganje uključuje antitela koja sadrže mutaciju u CH2 ili CH3 regionu domena Fc, pri čemu mutacija(e) povećava afinitet domena Fc za FcRn u kiselinskom okruženu (npr., u endozomu u kome su opsezi pH od oko 5.5 do oko 6.0). Takve mutacije mogu rezultovati u povećanju polu-života antitela u serumu kada se daje životinji. Neograničavajući primeri takvih modifikacija Fc uključuju, npr., modifikaciju na poziciji 250 (npr., E ili Q); 250 i 428 (npr., L ili F); 252 (npr., L/Y/F/W ili T), 254 (npr., S ili T), i 256 (npr., S/R/Q/E/D or T); ili modifikacija na poziciji 428 i/ili 433 (npr., H/L/R/S/P/Q ili K) i/ili 434 (npr., H/F ili Y); ili modifikacija na poziciji 250 i/ili 428; ili modifikacija na poziciji 307 ili 308 (npr., 308F, V308F), i 434. U jednom slučaju, modifikacija obuhvata 428L (npr., M428L) i 434S (npr., N434S) modifikaciju; 428L, 259I (npr., V259I), i 308F (npr., V308F) modifikaciju; 433K (npr., H433K) i 434 (npr., 434Y) modifikaciju; 252, 254, i 256 (npr., 252Y, 254T, i 256E) modifikaciju; 250Q i 428L modifikaciju (npr., T250Q i M428L); i 307 i/ili 308 modifikaciju (npr., 308F ili 308P).

[0080] Na primer, ovo izlaganje uključuje anti-CD3 antitela, i anti-CD3/anti-CD20 bispecifične antigen vezujuće molekule, koji sadrži domen Fc koji se sastoji iz jednog ili više para ili grupa mutacija odabranih iz grupe koja se sastoji iz: 250Q i 248L (npr., T250Q i M248L); 252Y, 254T i 256E (npr., M252Y, S254T i T256E); 428L i 434S (npr., M428L i N434S); i 433K i 434F (npr., H433K i N434F). Sve moguće kombinacije gorenavedenih mutacija domena Fc, i druge mutacije u ovde prikazanim varijabilnim domenima antitela, su razmatrane unutar obima ovog izlaganja.

Biološke karakteristike antitela i bispecifičnih molekula koji vezuju antigene

[0081] Ovo izlaganje uključuje antitela i njihove fragmente za vezivanje antigena koji vežu humani CD3 i indukuju proliferaciju T ćelija. Na primer, ovo izlaganje uključuje anti-CD3 antitela koja indukuju proliferaciju humanih T ćelija sa vrednosti EC50koja je manja od oko 0.33 pM, kao što je mereno sa in vitro testom proliferacije T ćelija, npr., upotrebom formata testa kao što je ovde definisano u Primeru 4 (npr., procenjivanjem proliferacije Jurkatovih ćelija ili humanih PBMC u prisustvu anti-CD3 antitela), ili u suštini sličnim testom. U određenim slučajima, antitela ili njihovi fragmenti za vezivanje antigena iz ovog izlaganja indukuju proliferaciju humanih T ćelija (npr., proliferacija Jurkatovih ćelija i/ili proliferacija PBMC) sa vrednosti EC50manjom od oko 0.32 pM, manjom od oko 0.31 pM, manjom od oko 0.30 pM, manjom od oko 0.28 pM, manjom od oko 0.26 pM, manjom od oko 0.24 pM, manjom od oko 0.22 pM, ili manjom od oko 0.20 pM, kao što je mereno sa in vitro testom proliferacije T ćelija, npr., upotrebom formata testa kao što je ovde definisano u Primeru 4, ili suštinski sličnim testom.

[0082] Ovo izlaganje takođe uključuje antitela i njihove fragmente za vezivanje antigena koji vežu humani CD3 i indukuju ubijanje tumorskih ćelija posredstvom T ćelija. Na primer, ovo izlaganje uključuje anti-CD3 antitela koja indukuju ubijanje tumorskih ćelija posredstvom T ćelija sa EC50manjom od oko 2.3 pM, kao što je mereno u in vitro testu ubijanja tumorskih ćelija posredstvom T ćelija, npr., upotrebom formata testa kao što je ovde definisano u Primeru 6 (npr., procenom obima ubijanja U937 ćelija tumora od strane PBMCs u prisustvu anti-CD3 antitela), ili suštinski sličnim testom. U određenim slučajima, antitela ili njihovi fragmenti za vezivanje antigena iz ovog izlaganja indukuju ubijanje ćelija tumora posredstvom T ćelija (npr., PBMC-posredovano ubijanje U937 ćelija) sa vrednosto EC50manjom od oko 2.3 pM, manjom od oko 2.2 pM, manjom od oko 2.1 pM, manjom od oko 2.0 pM, manjom od oko 1.8 pM, manjom od oko 1.6 pM, manjom od oko 1.4 pM, manjom od oko 1.2 pM, manjom od oko 1.0 pM, manjom od oko 0.8 pM, manjom od oko 0.6 pM, ili manjom od oko 0.5 pM, kao što je mereno sa in vitro testom ubijanja ćelija tumora posredstvom T ćelija, npr., upotebom formata testa kao što je ovde definisano u Primeru 6, ili suštinski sličnim testom.

[0083] Ovo izlaganje uključuje antitela i njihove fragmente za vezivanje antigena koji vežu humani CD3 sa visokim afinitetom. Ovo izlaganje takođe uključuje antitela i njihove fragmente za vezivanje antigena koji vežu humani CD3 sa srednjim ili niskim afinitetom, u zavisnosti od terapijskog konteksta i određenih ciljnih osobina koje su željne. Na primer, u kontekstu bispecifičnih molekula koji vezuju anitgen, pri čemu jedan krak veže CD3 i drugi krak vezuje ciljni antigen (npr., CD20), može biti oželjno za krak koji se vezuje za ciljni antigen da se veže za ciljni antigen sa visokim afinitetom dok anti-CD3 krak veže CD3 samo sa umerenim ili niskim afinitetom. Na ovaj način, preferencijalno ciljanje antigen vezujućeg molekula na ćelije koje eksprimiraju ciljni antigen može se postići dok se izbegava opšte/neciljano vezivanje CD3 i posledične neželjene nuspojave koje su sa njima povezane.

[0084] Prema određenim slučajima, ovo izlaganje uključuje antitela i fragmente antitela za vezivanje antigena koji vežu humani CD3 (npr., na 25°C) sa KDmanjom od oko 15 nM kao što je mereno površinskom plazmonskom rezonancom, npr., upotrebom formata testa kao što je ovde definisano u Primeru 3. U određenim slučajima, antitela ili fragmenti za vezivanje antigena iz ovog izlaganja vežu CD3 sa KDmanjom od oko 5 nM, manjom od oko 2 nM, manjom od oko 1 nM, manjom od oko 800 pM, manjom od oko 600 pM, manjom od oko 500 pM, manjom od oko 400 pM, manjom od oko 300 pM, manjom od oko 200 pM, manjom od oko 180 pM, manjom od oko 160 pM, manjom od oko 140 pM, manjom od oko 120 pM, manjom od oko 100 pM, manjom od oko 80 pM, manjom od oko 60 pM, manjom od oko 40 pM, manjom od oko 20 pM, ili manjom od oko 10 pM, kako je mereno površinskom plazmonskom rezonancom, npr., upotrebom formata testa kao što je ovde definisano u Primeru 3 (pr., format mAt-hvatanje ili hvatanja antigena), ili suštinski sličnim testom.

[0085] Ovaj opis takođe uključuje antitela i njihove fragmente za vezivanje antigena koji vežu CD3 sa disocijativnim polu-životom (t<1>/2) većim od oko 10 minuta kao što je mereno površinskom plazmonskom rezonancom na 25°C ili 37°C, npr., korišćenjem formata testa kao što je ovde definisano u Primeru 3, ili suštinski sličnom testu. U određenim slučajima, antitela ili fragmenti za vezivanje antigena iz ovog izlaganja vežu CD3 sa t<1>/2većim od oko 20 minuta, većim od oko 30 minuta, većim od oko 40 minuta, većim od oko 50 minuta, većim od oko 60 minuta, većim od oko 70 minuta, većim od oko 80 minuta, većim od oko 90 minuta, većim od oko 100 minuta, većim od oko 200 minuta, većim od oko 300 minuta, većim od oko 400 minuta, većim od oko 500 minuta, većim od oko 600 minuta, većim od oko 700 minuta, većim od oko 800 minuta, većim od oko 900 minuta, većim od oko 1000 minuta, ili većim od oko 1200 minuta, kao što je mereno površinskom plazmonskom rezonancom 25°C ili 37°C, npr., upotrebom formata testa kao što je ovde definisano u Primeru 3 (npr., mAt-hvatanje ili format hvatanja antigena), ili suštinski sličnim testom.

[0086] Ovaj pronalazak se odnosi na bispecifične molekule za vezivanje antigena (npr. bispecifična antitela) koji su sposobni da istovremeno vezuju humani CD3 i humani CD20. Prema izvesnim izvođenjima, bispecifični molekuli koji se vezuju za antigen prema pronalasku specifično stupaju u interakciju sa ćelijama koje eksprimiraju CD3 i/ili CD20. Stepen do kojeg bispecifični molekul koji vezuje antigen vezuje ćelije koje eksprimiraju CD3 i/ili CD20 može se proceniti sortiranjem ćelija aktiviranim fluorescencijom (FACS), kao što je ovde ilustrovano u Primeru 8. Na primer, ovaj pronalazak uključuje bispecifične molekule za vezivanje antigena koji specifično vezuju humane T-ćelijske linije koje eksprimiraju CD3, ali ne i CD20 (npr. Jurkat), humane B-ćelijske linije koje eksprimiraju CD20, ali ne i CD3 (npr. Raji), i/ ili T-ćelije primata (npr. mononuklearne ćelije periferne krvi cinomolgusa [PBMCs]). Ovaj pronalazak uključuje bispecifične molekule za vezivanje antigena koji vezuju bilo koju od gore navedenih ćelija i ćelijskih linija sa EC50vrednošću od oko 9,0x10<-6>do oko 2,0x10<-9>, ili manje, kao što je određeno korišćenjem FACS testa kao što je navedeno u Primeru 8 ili suštinski sličnom testu.

[0087] Ovaj pronalazak takođe uključuje anti-CD3/anti-CD20 bispecifične molekule koji vezuju antigen koji se vezuju za humane T-ćelije koje eksprimiraju CD3 (npr. Jurkat) sa EC50vrednošću između 1,0 pM i 1000 nM. U određenim izvođenjima, anti-CD3/anti-CD20 bispecifični molekuli koji vezuju antigen vezuju se za humane T-ćelije koje eksprimiraju CD3 sa vrednošću EC50između 1 nM i 60 nM. Na primer, ovaj pronalazak uključuje anti-CD3/anti-CD20 bispecifične molekule koji vezuju antigen koji se vezuju za humane T-ćelije koje eksprimiraju CD3 (npr. Jurkat) sa EC50vrednošću od oko 1 pM. oko 10 pM, oko 100 pM, oko 500 pM, oko 1 nM, oko 2 nM, oko 5 nM, oko 10 nM, oko 20 nM, oko 30 nM, oko 40 nM, oko 50 nM oko 60 nM, oko 70 nM, oko 80 nM, oko 90 nM, oko 100 nM, oko 200 nM, oko 300 nM, oko 500 nM, oko 800 nM, oko 1000 nM, ili više.

[0088] Ovaj pronalazak takođe uključuje anti-CD3/anti-CD20 bispecifične molekule koji vezuju antigen koji pokazuju jednu ili više karakteristika izabranih iz grupe koju čine: (a) indukovanje proliferacije PBMC in vitro (videti, npr., Primer 9 ovde); (b) aktiviranje T-ćelija, izazivanje oslobađanja IFN-gama i povećanje CD25 u punoj krvi čoveka (videti, npr., Primer 10); (c) izazivanje citotoksičnosti posredovane T-ćelijama na anti-CD20 rezistentnim ćelijskim linijama (videti, npr., Primer 11); (d) izazivanje citotoksičnosti na humane B-ćelije (npr. Raji; videti, npr., Primer 13); (e) iscrpljivanje B-ćelija (npr., CD19+ B-ćelije) kod miševa rekonstituisanih sa humanim imunim ćelijama (videti, npr., Primer 14); i (f) smanjenje zapremine tumora B-ćelija (npr., Raji zapremina tumora) u mišjim ksenograftima (videti, npr., Primer 15).

[0089] Ovaj pronalazak uključuje anti-CD3/anti-CD20 bispecifične molekule za vezivanje antigena koji su sposobni da iscrpe B ćelije kod subjekta (videti npr. Primer 16). Na primer, prema određenim izvođenjima, obezbeđuju se anti-CD3/anti-CD20 bispecifični molekuli koji vezuju antigen, pri čemu pojedinačna primena bispecifičnog molekula koji vezuje antigen subjektu (npr. u dozi od oko 0,1 mg/kg oko 0,08 mg/kg, oko 0,06 mg/kg oko 0,04 mg/kg, oko 0,04 mg/kg, oko 0,02 mg/kg, oko 0,01 mg/kg ili manje) izaziva smanjenje broja B ćelija kod subjekta (npr. u uzorku krvi uzetom od subjekta) ispod nivoa koji se mogu detektovati. U određenim izvođenjima, jednokratna primena anti-CD3/anti-CD20 bispecifičnog molekula koji vezuje antigen u dozi od oko 0,1 mg/kg izaziva smanjenje broja B ćelija kod subjekta ispod nivoa koji se može detektovati do oko 7. dana, oko 6. dana, oko 5. dana, oko 4. dana, oko 3. dana, oko 2. dana ili oko 1. dana nakon primene bispecifičnog molekula koji vezuje antigen subjektu. Prema određenim izvođenjima, jednokratno davanje anti-CD3/anti-CD20 bispecifičnog molekula koji vezuje antigen prema pronalasku, u dozi od oko 0,01 mg/kg, uzrokuje da broj B-ćelija ostane ispod nivoa koji se može detektovati do najmanje oko 7 dana, 8 dana, 9 dana, 10 dana, 11 dana, 12 dana, 13 dana, 14 dana, 15 dana, 16 dana, 17 dana ili više, nakon primene. Kao što se ovde koristi, izraz „ispod detektabilnih nivoa“ znači da se nijedna B ćelija ne može direktno ili indirektno detektovati u uzorku krvi uzetog od subjekta koristeći standardne testove za detekciju B-ćelija, npr., FACS test za markere B-ćelija, kao što je ovde navedeno u Primeru 16.

[0090] U srodnim izvođenjima po mikrolitru krvi uzet od subjekta od oko 1. do oko 28. dana nakon primene jedne doze oko 0,01 mg/kg antigen-vezujućeg molekula za subjekta je manje od 25% broja B-ćelija po mikrolitru krvi uzete od subjekta pre davanja. U nekim drugim izvođenjima, obezbeđen je anti-CD3/anti-CD20 bispecifični molekul koji vezuje antigen, pri čemu je broj B-ćelija po mikrolitru krvi uzet od subjekta od oko 1. do oko 56. dana nakon primene jedne doze od oko 0,01 mg/kg molekula koji vezuje antigen za subjekta je manji od 50% broja B-ćelija po mikrolitru krvi uzete od subjekta pre primene.

[0091] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje anti-CD3/anti-CD20 bispecifične molekule za vezivanje antigena koji, kada se daju subjektu, uzrokuje samo prolazno smanjenje u T ćelijama. Na primer, obezbeđeni su anti-CD3/anti-CD20 bispecifični molekuli za vezivanje antigena koji, kada se daju subjektu u dozi od oko 0.01 mg/kg uzrokuju smanjenja broja T ćelija prvog dana nakon primene, ali pri čemu se broj T ćelija po mikrolitru krvi vraća u vremenske tačke nakon toga (npr. oko 2. dana, 7.,14., 28., 42. dana, dana 56 ili kasnije nakon primene). Na primer, ovaj pronalazak obezbeđuje anti-CD3/anti-CD20 bispecifični molekul koji vezuje antigen, pri čemu je broj T ćelija po mikrolitru krvi uzet od subjekta od oko 14. do oko 56. dana nakon primene molekula koji vezuje antigen subjektu u dozi od oko 0,01 mg/kg jednak je ili veći od broja T ćelija po mikrolitru krvi uzete od subjekta pre davanja bispecifičnog molekula koji vezuje antigen.

Mapiranje epitopa i srodne tehnologije

[0092] Epitop na CD3 za koji se vezuju antigen-vezujući molekuli iz ovog izlaganja može se sastojati od jedne neprekidne sekvence od 3 ili više (npr., 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više) aminokiselina CD3 proteina. Alternativno, epitop se može sastojati od mnoštva nesusednih amino kiselina (ili sekvenci aminokiselina) CD3. Antitela iz ovog izlaganja mogu da stupaju u interakciju sa aminokiselinama sadržanim u jednom CD3 lancu (npr., CD3-epsilon, CD3-delta ili CD3-gama), ili mogu interagovati sa aminokiselinama na dva ili više različitih CD3 lanaca. Termin "epitop", kako se ovde koristi, odnosi se na antigensku determinantu koja stupa u interakciju sa specifičnim mestom vezivanja antigena u promenljivom regionu molekula antitela poznatog kao paratop. Jedan antigen može imati više od jednog epitopa. Dakle, različita antitela se mogu vezati za različite oblasti na antigenu i mogu imati različite biološke efekte. Epitopi mogu biti ili konformacioni ili linearni. Konformacioni epitop se proizvodi od prostorno suprostavljenih aminokiselina iz različitih segmenata linearnog polipeptidnog lanca. Linearni epitop je onaj koji proizvode susedni aminokiselinski ostaci u polipeptidnom lancu. U određenim okolnostima, epitop može sadržati ostatke saharida, fosforilnih grupa ili sulfonilnih grupa na antigenu.

[0093] Različiti postupci poznati osobama koje su uobičajeno verzirane u stanje tehnike mogu se koristiti da bi se utvrdilo da li domen antitela koji se vezuje za antigen "interaguje sa jednom ili više aminokiselina" unutar polipeptida ili proteina. Primeri postupaka uključuju, npr., rutinski test unakrsnog blokiranja kao što je opisano Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY), analiza mutacije skeniranjem alanina, analiza blotova peptida (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463), i analiza cepanja peptida. Pored toga, mogu se koristiti postupci kao što su ekscizija epitopa, ekstrakcija epitopa i hemijska modifikacija antigena (Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496). Drugi postupak koji se može koristiti za identifikaciju aminokiselina unutar polipeptida sa kojima je u interakciji domen antitela koji vezuje antigen je razmena vodonika/deuterijumom detektovana masenom spektrometrijom. Uopšteno govoreći, postupak razmene vodonika/deuterijumom obuhvata obeležavanje deuterijumom proteina od interesa, nakon čega sledi vezivanje antitela za protein obeležen deuterijumom. Zatim, kompleks protein/antitelo se prenosi u vodu kako bi se omogućila razmena vodonik-deuterijum na svim ostacima osim za ostatke zaštićene antitelom (koji ostaju obeleženi deuterijumom). Nakon disocijacije antitela, ciljni protein se podvrgava cepanju proteazom i analizi masene spektrometrije, čime se otkrivaju ostaci obeleženi deuterijumom koji odgovaraju specifičnim aminokiselinama sa kojima antitelo stupa u interakciju. Videti, npr., Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem.73:256A-265A. Rendgenska kristalografija kompleksa antigen/antitelo se takođe može koristiti u svrhe mapiranja epitopa.

[0094] Ovo izlaganje dalje uključuje anti-CD3 antitela koja se vezuju za isti epitop kao bilo koje od specifičnih primera ovde opisanih antitela (npr. antitela koja sadrže bilo koju od aminokiselinskih sekvenci koje se ovde navode u Tabeli 1). Slično tome, ovo izlaganje takođe uključuje anti-CD3 antitela koja se nalaze u kompeticiji za vezivanje za CD3 sa bilo kojim od specifičnih primera antitela koja se ovde opisuju (npr. antitela koja sadrže bilo koju od sekvenci aminokiselina kao što je ovde navedeno u Tabeli 1). Međutim, bispecifični molekul koji vezuje antigen koji ima CDR-ove, kako je definisano u zahtevima, spada u obim pronalaska za koji je zatražena zaštita.Ovo izlaganje takođe uključuje bispecifične molekule koji vezuju antigen koji sadrže prvi domen koji vezuje antigen koji specifično vezuje humani CD3, i drugi domen za vezivanje antigena koji se specifično vezuje za humani CD20, pri čemu se prvi domen koji vezuje za antigen vezuje za isti epitop na CD3 kao bilo koji od specifičnih primera CD3-specifičnih domena za vezivanje antigena opisanih ovde, i/ili gde se drugi antigenvezujući domen vezujući domen se vezuje za isti epitop na CD20 kao bilo koji od specifičnih primera CD20-specifičnih antigen-vezujućih domena opisanih ovde.

[0095] Slično tome, ovo izlaganje takođe uključuje bispecifične molekule koji vezuju antigen koji sadrže prvi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani CD3, i drugi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani CD20, pri čemu je prvi domen za vezivanje antigena u kompeticiji za vezivanje za CD3 sa bilo kojim od specifičnih primera ovde opisanih CD3-specifičnih domena za vezivanje antigena, i/ili pri čemu je drugi domen za vezivanje antigena u kompeticiji za vezivanje za CD20 sa bilo kojim od specifičnih ovde opisanih CD20-specifičnih domena za vezivanje antigena.

[0096] Može se lako utvrditi da li se određeni molekul koji vezuje za antigen (npr., antitelo) ili njegov antigen-vezujući domen vezuje za isti epitop kao ili se takmiči za vezivanje sa referentnim antigenvezujućim molekulom Ovo izlaganje korišćenjem rutinskih poznatih metoda u umetnosti. Na primer, da bi se utvrdilo da li se test antitelo vezuje za isti epitop na CD3 (ili CD20) kao referentni bispecifični molekul koji se vezuje za antigen iz ovog otkrića, referentnom bispecifičnom molekulu je prvo dozvoljeno da se veže za CD3 protein (ili CD20 protein). Zatim se procenjuje sposobnost test antitela da se veže za molekul CD3 (ili CD20). Ako je test antitelo u stanju da se veže za CD3 (ili CD20) nakon vezivanja zasićenja sa referentnim bispecifičnim molekulom koji vezuje antigen, može se zaključiti da se test antitelo vezuje za drugačiji epitop CD3 (ili CD20) od referentnog bispecifičnog antigen -vezujućeg molekula. S druge strane, ako test antitelo nije u stanju da se veže za molekul CD3 (ili CD20) nakon vezivanja zasićenja sa referentnim bispecifičnim molekulom koji vezuje antigen, onda se test antitelo može vezati za isti epitop CD3 (ili CD20) kao epitop vezan referentnim bispecifičnim antigenvezujućim molekulom prema pronalasku. Dodatni rutinski eksperimenti (npr. mutacija peptida i analize vezivanja) se zatim mogu sprovesti da bi se potvrdilo da li je uočeni nedostatak vezivanja test antitela u stvari posledica vezivanja za isti epitop kao referentni bispecifični molekul koji vezuje antigen ili ako sterično blokiranje (ili neki drugi fenomen) je odgovorno za nedostatak uočenog vezivanja. Eksperimenti ove vrste se mogu izvesti korišćenjem ELISA, RIA, Biacore, protočne citometrije ili bilo kog drugog kvantitativnog ili kvalitativnog testa vezivanja antitela koji je dostupan u tehnici. U skladu sa određenim primerima ovog otkrića, dva proteina koji vezuju antigen vezuju se za isti (ili preklapajući) epitop ako, npr., 1-, 5-, 10-, 20- ili 100-struki višak jednog antigena vezujući protein inhibira vezivanje drugog za najmanje 50%, ali poželjno 75%, 90% ili čak 99% izmereno u kompetitivnom testu vezivanja (videti, npr., Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495- 1502). Alternativno, smatra se da se dva proteina koji vezuju za antigen vezuju za isti epitop ako u suštini sve mutacije aminokiselina u antigenu koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog proteina za vezivanje antigena smanjuju ili eliminišu vezivanje drugog. Smatra se da dva proteina koji vezuju antigen imaju "preklapajuće epitope" ako samo podskup mutacija aminokiselina koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog proteina koji vezuje antigen smanjuje ili eliminiše vezivanje drugog.

[0097] Da bi se utvrdilo da li se antitelo ili njegov domen koji se vezuje za antigen takmiči za vezivanje sa referentnim molekulom koji vezuje antigen, gore opisana metodologija vezivanja se izvodi u dve orijentacije: U prvoj orijentaciji, referentnom molekulu koji vezuje antigen je dozvoljeno da se veže za CD3 protein (ili CD20 protein) u uslovima zasićenja nakon čega sledi procena vezivanja test antitela za molekul CD3 (ili CD20). U drugoj orijentaciji, test antitelu je dozvoljeno da se veže za CD3 (ili CD20) molekul pod uslovima zasićenja, nakon čega sledi procena vezivanja referentnog molekula koji vezuje antigen za molekul CD3 (ili CD20). Ako je, u obe orijentacije, samo prvi (zasićeni) molekul koji vezuje antigen sposoban da se veže za CD3 (ili CD20) molekul, onda se zaključuje da se ispitivano antitelo i referentni molekul koji vezuje antigen takmiče za vezivanje za CD3 (ili CD20). Kao što će proceniti osoba koja je uobičajeno verzirana u oblast tehnike, antitelo koje se nalazi u kompeticiji za vezivanje sa referentnim molekulom koji vezuje antigen ne mora nužno da se veže za isti epitop kao referentno antitelo, ali može sterički da blokira vezivanje referentnog antitela pomoću vezivanja preklapajućeg ili susednog epitopa.

Priprema domena za vezivanje antigena i konstrukcija bispecifičnih molekula

[0098] Domeni za vezivanje antigena specifični za određene antigene mogu se pripremiti bilo kojom tehnologijom za generisanje antitela koja je poznata u tehnici. Jednom dobijena, dva različita domena za vezivanje antigena, specifična za dva različita antigena (npr., CD3 i CD20), mogu se na odgovarajući način rasporediti jedan u odnosu na drugi kako bi se proizveo bispecifičan antigen-vezujući molekul iz ovog izlaganja upotrebom rutinskih postupaka. (Razmatranje primera formata bispecifičnih antitela koji se mogu koristiti za konstruisanje bispecifičnih molekula za vezivanje antigena iz ovog izlaganja je ovde obezbeđeno na drugom mestu). U određenim slučajevima, jedna ili više pojedinačnih komponenti (npr. teški i laki lanci) multispecifičnih molekula koji se vezuju za antigen iz pronalaska su izvedeni iz himernih, humanizovanih ili potpuno humanih antitela. Postupci za dobijanje takvih antitela su dobro poznati u tehnici. Na primer, jedan ili više teških i/ili lakih lanaca bispecifičnih molekula koji vezuju antigen iz ovog izlaganja može se pripremiti korišćenjem VELOCIMMUNE™ tehnologije. Koristeći VELOCIMMUNE™ tehnologije (ili bilo koje druge tehnologije za generisanje humanih antitela), himerna antitela visokog afiniteta na određeni antigen (npr., CD3 ili CD20) se inicijalno izoluju sa humanim varijabilnim regionom i mišjim konstantnim regionom. Antitela su okarakterisana i odabrana prema poželjnim karakteristikama, uključujući afinitet, selektivnost, epitop, itd. Konstantni regioni miša se zamenjuju željenim humanim konstantnim regionom da bi se generisali potpuno humani teški i/ili laki lanci koji se mogu ugraditi u bispecifične molekule koji vezuju antigen prema ovom izlaganju.

[0099] Genetički modifikovane životinje se mogu koristiti za pravljenje humanih bispecifičnih molekula za vezivanje antigena. Na primer, može se koristiti genetički modifikovani miš koji nije u stanju da rearanžira i eksprimira varijabilnu sekvencu lakog lanca endogenog mišjeg imunoglobulina, pri čemu miš eksprimira samo jedan ili dva humane varijabilna domena lakog lanca kodirani sekvencama humanog imunoglobulina koje su operativno povezani sa konstantnim genom kapa miša na endogenom kapa lokusu miša. Takvi genetički modifikovani miševi mogu se koristiti za proizvodnju potpuno humanih bispecifičnih molekula za vezivanje antigena koji sadrže dva različita teška lanca koji se povezuju sa identičnim lakim lancem koji sadrži varijabilni domen izveden iz jednog od dva različita segmenta gena varijabilnog regiona lakog lanca čoveka. (Videti, npr., US 2011/0195454 za detaljnu diskusiju o takvim modifikovanim miševima i njihovoj upotrebi za proizvodnju bispecifičnih molekula koji vezuju antigen).

Bioekvivalenti

[0100] Ovo izlaganje obuhvata molekule koji se vezuju za antigen koji imaju sekvence aminokiselina koje se razlikuju od onih primera molekula koji su ovde otkriveni, ali koji zadržavaju sposobnost da vezuju CD3 i/ili CD20. Takvi varijantni molekuli mogu sadržati jedan ili više dodataka, delecija ili supstitucija aminokiselina u poređenju sa roditeljskom sekvencom, ali pokazuju biološku aktivnost koja je suštinski ekvivalentna onoj opisanih bispecifičnih molekula koji vezuju antigen. Međutim, samo bispecifični molekul za vezivanje antigena, kako je definisano u zahtevima, spada u obim prema pronalasku za koji se traži zaštita.

[0101] Ovo izlaganje uključuje molekule koji vezuju antigen koji su bioekvivalentni bilo kom od primera molekula koji vezuju antigen koji su ovde navedeni. Dva proteina koja vezuju antigen, ili antitela, smatraju se bioekvivalentnima ako su, na primer, farmaceutski ekvivalenti ili farmaceutske alternative čija brzina i obim apsorpcije ne pokazuju značajnu razliku kada se primenjuju u istoj molarnoj dozi pod sličnim eksperimentalnim uslovima, bilo pojedinačno radi ili višestruka doza. Neki proteini koji vezuju antigen će se smatrati ekvivalentima ili farmaceutskim alternativama ako su ekvivalentni po obimu svoje apsorpcije, ali ne i po stopi apsorpcije, a ipak se mogu smatrati bioekvivalentnim jer su takve razlike u brzini apsorpcije namerno i odražavaju se na obeležavanje, nisu od suštinskog značaja za postizanje efektivne telesne koncentracije leka u, npr., hroničnoj upotrebi, i smatraju se medicinski beznačajnim za određeni lek koji se proučava. Međutim, samo bispecifični molekul za vezivanje antigena, kako je definisano u zahtevima, spada u obim prema pronalasku za koji se traži zaštita.

[0102] U jednom slučaju, dva proteina koji vezuju antigen su bioekvivalentna ako ne postoje klinički značajne razlike u njihovoj bezbednosti, čistoći i potenciji.

[0103] U jednom slučaju, dva proteina koji vezuju antigen su bioekvivalentna ako se pacijent može jednom ili više puta prebaciti između referentnog proizvoda i biološkog proizvoda bez očekivanog povećanja rizika od neželjenih efekata, uključujući klinički značajnu promenu imunogenosti, ili smanjenje efikasnost, u poređenju sa nastavkom terapije bez takve promene prebacivanja.

[0104] U jednom slučaju, dva proteina koji vezuju antigen su bioekvivalentna ako oba deluju zajedničkim mehanizmom ili mehanizmima delovanja za stanje ili uslove upotrebe, u meri u kojoj su takvi mehanizmi poznati.

[0105] Bioekvivalencija se može dokazati in vivo i in vitro postupcima. Mere bioekvivalencije obuhvataju npr.,

(a) in vivo test kod ljudi ili drugih sisara, u kome se koncentracija antitela ili njegovih metabolita meri u krvi, plazmi, serumu ili drugoj biološkoj tečnosti kao funkcija vremena; (b) in vitro test koji je u korelaciji sa podacima o bioraspoloživosti in vivo kod ljudi i koji razumno predviđa; (c) in vivo test na ljudima ili drugim sisarima u kome se odgovarajući akutni farmakološki efekat antitela (ili njegove mete) meri kao funkcija vremena; i

(d) u dobro kontrolisanom kliničkom ispitivanju koje utvrđuje bezbednost, efikasnost ili biodostupnost ili bioekvivalentnost proteina koji vezuje antigen.

[0106] Bioekvivalentne varijante primera bispecifičnih molekula koji vezuju antigen koji su ovde izloženi mogu se konstruisati, na primer, pravljenjem različitih supstitucija ostataka ili sekvenci ili delecijom terminalnih ili unutrašnjih ostataka ili sekvenci koje nisu potrebne za biološku aktivnost. Na primer, cisteinski ostaci koji nisu neophodni za biološku aktivnost mogu biti deletirani ili zamenjeni drugim aminokiselinama da bi se sprečilo stvaranje nepotrebnih ili netačnih intramolekularnih disulfidnih mostova nakon renaturacije. U drugim kontekstima, bioekvivalentni proteini za vezivanje antigena mogu uključivati varijante ovde izloženih primera bispecifičnih molekula za vezivanje antigena koji sadrže promene aminokiselina koje modifikuju karakteristike glikozilacije molekula, npr., mutacije koje eliminišu ili uklanjaju glikozilaciju.

Selektivnost vrsta i unakrsna reaktivnost vrsta

[0107] Prema određenim slučajevima iz izlaganja, obezbeđeni su molekuli koji vezuju antigen koji se vezuju za humani CD3, ali ne i za CD3 drugih vrsta. Takođe su obezbeđeni molekuli koji vezuju antigen koji se vezuju za humani CD20, ali ne i za CD20 drugih vrsta. Ovo izlaganje takođe uključuje molekule koji vezuju antigen koji se vezuju za humani CD3 i CD3 iz jedne ili više nehumanih vrsta; i/ili molekule koji se vezuju za antigen koji se vezuju za humani CD20 i za CD20 iz jedne ili više nehumanih vrsta.

[0108] Prema određenim slučajuma iz ovog izlaganja, obezbeđeni su molekuli koji se vezuju za antigen koji se vezuju za humani CD3 i/ili humani CD20 i mogu da se vežu ili ne vezuju, u zavisnosti od slučaja, za jednog ili više miševa, pacova, zamoraca, hrčak, gerbil, svinja, mačka, pas, zec, koza, ovca, krava, konj, kamila, cinomolgus, marmozet, rezus ili šimpanza CD3 i/ili CD20. Na primer, u posebnom primeru iz ovog izlaganja obezbeđeni su bispecifični molekuli za vezivanje antigena koji sadrže prvi domen koji vezuje antigen koji vezuje humani CD3 i CD3 cinomolgusa, i drugi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani CD20.

Imunokonjugati

[0109] Ovo izlaganje obuhvata molekule koji vezuju antigen konjugovane sa terapijskim delom („imunokonjugat“), kao što je citotoksin, hemoterapeutski lek, imunosupresiv ili radioizotop. Citotoksični agensi uključuju bilo koji agens koji je štetan za ćelije. Primeri pogodnih citotoksičnih agenasa i hemoterapeutskih agenasa za formiranje imunokonjugata su poznati u tehnici (videti na primer, WO 05/103081).

Terapeutska formulacija i davanje

[0110] Ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže molekule koji vezuju antigen prema ovom pronalasku. Farmaceutske kompozicije prema pronalasku su formulisane sa pogodnim nosačima, ekscipijensima i drugim agensima koji obezbeđuju poboljšani transfer, isporuku, toleranciju i slično. Mnoštvo odgovarajućih formulacija može se naći u formularu poznatom svim farmaceutskim hemičarima: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Ove formulacije uključuju, na primer, praškove, paste, masti, žele, voskove, ulja, lipide, lipide (katjonske ili anjonske) koje sadrže vezikule (kao što je LIPOFECTIN™, Life Technologies, Carlsbad, CA), DNK konjugate, paste za bezvodnu apsorpciju, emulzije ulje u vodi i voda u ulju, emulzije ugljeni vosak (polietilen glikoli različite molekulske težine), polučvrsti gelovi i polučvrste mešavine koje sadrže ugljeni vosak. Videti takođe Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.

[0111] Doza molekula za vezivanje antigena primenjena pacijentu može da varira u zavisnosti od starosti i veličine pacijenta, ciljne bolesti, stanja, načina primene i slično. Poželjna doza se obično izračunava prema telesnoj težini ili površini tela. Kada se bispecifični molekul koji vezuje antigen iz ovog izlaganja koristi u terapeutske svrhe kod odraslog pacijenta, može biti korisno da se intravenozno primeni bispecifični molekul koji vezuje antigen iz ovog izlaganja normalno u jednoj dozi od oko 0,01 do oko 20 mg/kg telesne težine, poželjnije oko 0,02 do oko 7, oko 0,03 do oko 5, ili oko 0,05 do oko 3 mg/kg telesne težine. U zavisnosti od težine stanja, učestalost i trajanje lečenja mogu se podesiti. Efikasne doze i rasporedi za davanje bispecifičnog molekula koji vezuje antigen mogu se odrediti empirijski; na primer, napredak pacijenta se može pratiti periodičnom procenom, a doza se prilagođava u skladu sa tim. Osim toga, skaliranje doza između vrsta može se izvršiti korišćenjem dobro poznatih postupaka u oblasti tehnike (npr. Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res.8:1351).

[0112] Poznati su različiti sistemi isporuke i mogu se koristiti za davanje farmaceutske komozicije iz ovog izlaganja, npr., inkapsulacija u lipozomima, mikročesticama, mikrokapsulama, rekombinantnim ćelijama sposobnim za ekspresiju mutiranih virusa, endocitoze posredovane receptorom (videti, npr., Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Postupci uvođenja uključuju, ali nisu ograničeni na, intradermalne, intramuskularne, intraperitonealne, intravenozne, subkutanozne, intranazalne, epiduralne, i oralne načine davanja. Kompozicija se može dаvati bilo kojim pogodnim načinom, na primer infuzijom ili bolusnom injekcijom, apsorpcijom kroz epitelne ili mukokutanozne ovojnice (npr., oralna mukoza, rektalna ili intestinalna mukoza, itd.) i mogu se davati zajedno sa drugim biološki aktivnim sredstvima. Davanje može biti sistemsko ili lokalno.

[0113] Farmaceutska kompozicija iz ovog izlaganja može se uneti subkutano ili intravenozno sa standardnom iglom i špricem. Pored toga, u pogledu subkutane isporuke, uređaj za isporuku olovke lako ima primenu u isporuci farmaceutske kompozicije prema ovom pronalasku. Takav uređaj olovke za isporuku može biti za višekratnu ili jednokratnu upotrebu. Uređaj olovke za isporuku za višekratnu upotrebu generalno koristi zamenljivi kertridž koji sadrži farmaceutsku kompoziciju. Kada se cela farmaceutska kompozicija unutar kertridža primeni i kertridž je prazan, prazan kertridž se može lako odbaciti i zameniti novim kertridžom koji sadrži farmaceutsku kompoziciju. Uređaj olovke za isporuku se tada može ponovo koristiti. U uređaju za isporuku olovke za jednokratnu upotrebu ne postoji zamenljivi kertridž. Umesto toga, uređaj za isporuku olovke za jednokratnu upotrebu dolazi prethodno napunjen farmaceutskom kompozicijom koja se nalazi u rezervoaru unutar uređaja. Kada se rezervoar isprazni od farmaceutskog sastava, ceo uređaj se odbacuje.

[0114] Brojni uređaji za isporuku olovke i autoinjektora za višekratnu upotrebu imaju primenu u subkutanom davanju farmaceutske kompozicije prema ovom izlaganju. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na AUTOPEN™ (Oven Mumford, Inc., Voodstock, UK), DISETRONIC™ olovku (Disetronic Medical Sistems, Bergdorf, Švajcarska), HUMALOG MIX 75/25™ olovku, HUMALOG™ olovku, HUMALIN 70/ 30™ olovku (Eli Lilli and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II i III (Novo Nordisk, Kopenhagen, Danska), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Kopenhagen, Danska), BD™ olovku (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ i OPTICLIK™ (sanofiaventis, Frankfurt, Nemačka), da navedemo samo neke. Primeri uređaja za isporuku olovke za jednokratnu upotrebu koji imaju primenu u subkutanoj isporuci farmaceutske kompozicije iz ovog izlaganja uključuju, ali nisu ograničeni na SOLOSTAR™ olovku (sanofi-aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) i KWIKPEN™ (Eli Lilly ), SURECLICK™ Autoinjektor (Amgen, Thousand Oaks, CA), PENLET™ (Haselmeier, Štutgart, Nemačka), EPIPEN (Dey, L.P.) i HUMIRA™ olovku (Abbott Labs, Abbott Park IL), da navedemo samo nekoliko.

[0115] U određenim situacijama, farmaceutska kompozicija se može isporučiti u sistemu sa kontrolisanim oslobađanjem. U jednom slučaju, može se koristiti pumpa (videti Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). U drugom slučaju, mogu se koristiti polimerni materijali; videti, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida. U još jednom slučaju, sistem kontrolisanog oslobađanja može biti postavljen u blizini cilja kompozicije, tako da zahteva samo deo sistemske doze (videti, npr., Goodson, 1984, u Medical Applications of Controlled Release, supra, tom 2, str. 115-138). Drugi sistemi kontrolisanog oslobađanja su razmatrani u pregledu Langer, 1990, Science 249:1527-1533.

[0116] Preparati za injekcije mogu uključivati dozne oblike za intravenske, subkutane, intrakutane i intramuskularne injekcije, infuzije koje se daju ukapavanjem, itd. Ovi preparati za injekcije mogu biti pripremljeni postupcima koji su javno poznati. Na primer, preparati za injekcije mogu se pripremiti, npr., rastvaranjem, suspendovanjem ili emulgovanjem antitela ili njegove soli opisane gore u sterilnom vodenom medijumu ili uljanom medijumu koji se uobičajeno koristi za injekcije. Kao vodeni medijum za injekcije, postoje, na primer, fiziološki rastvor, izotonični rastvor koji sadrži glukozu i druge pomoćne agense, itd., koji se mogu koristiti u kombinaciji sa odgovarajućim sredstvom za rastvaranje kao što je alkohol (npr. etanol), polialkohol (npr. propilen glikol, polietilen glikol), nejonski surfaktant [npr. polisorbat 80, HCO-50 (polioksietilen (50 mol) adukt hidrogenizovanog ricinusovog ulja)], itd. Kao uljani medijum su korišćeni, npr., susamovo ulje, sojino ulje, itd., koje se može koristiti u kombinaciji sa sredstvom za rastvaranje kao što je benzil benzoat, benzil alkohol, itd. Injekcija koja je na taj način pripremljena se poželjno puni u odgovarajuću ampulu.

[0117] Prednost je da se gore opisane farmaceutske kompozicije za oralnu ili parenteralnu upotrebu pripremaju u doznim oblicima u jediničnoj dozi koja odgovara dozi aktivnih sastojaka. Takvi dozni oblici u jediničnoj dozi obuhvataju, na primer, tablete, pilule, kapsule, injekcije (ampule), supozitorije, itd. Količina prethodno pomenutog antitela je generalno oko 5 do oko 500 mg po doznom obliku u jedinici. doza; posebno u obliku injekcije, poželjno je da se prethodno pomenuto antitelo sadrži u oko 5 do oko 100 mg i u oko 10 do oko 250 mg za druge dozne oblike.

Terapeutske upotrebe molekula koji vezuju antigen

[0118] Ovo izlaganje obuhvata postupke koje obuhvataju davanje subjektu kome je to potrebno terapeutske kompozicije koja sadrži anti-CD3 antitelo ili bispecifični molekul koji vezuje antigen koji specifično vezuje CD3 i ciljni antigen (npr., CD20). Terapeutska kompozicija može da sadrži bilo koje od antitela ili bispecifičnih molekula koji vezuju antigen kako je ovde otkriveno i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač. Kako se ovde koristi, izraz "subjekat kome je to potrebno" označava čoveka ili životinju koja nije čovek koja pokazuje jedan ili više simptoma ili indicija kancera (npr. subjekt koji ima tumor ili pati od bilo kog od navedenih kancera koji su ovde pomenuti nastavku), ili koji bi inače imali koristi od inhibicije ili smanjenja aktivnosti CD20 ili smanjenja CD20+ B ćelija. Međutim, terapeutski postupci nisu per se deo pronalaska za koji se traži zaštita.

[0119] Antitela i bispecifični molekuli koji vezuju antigen prema pronalasku (i terapeutske kompozicije koje ih sadrže) su korisni, između ostalog, za lečenje bilo koje bolesti ili poremećaja kod kojih bi stimulacija, aktivacija i/ili ciljanje imunog odgovora bili korisni. Konkretno, anti-CD3/anti-CD20 bispecifični molekuli koji vezuju antigen iz ovog izlaganja mogu se koristiti za lečenje, prevenciju i/ili poboljšanje bilo koje bolesti ili poremećaja povezanog ili posredovanog ekspresijom ili aktivnošću CD20 ili proliferacijom CD20+ B ćelije. Mehanizam delovanja kojim se postižu terapeutske metode otkrivanja obuhvataju ubijanje ćelija koje eksprimiraju CD20 u prisustvu efektorskih ćelija, na primer, CDC, apoptozom, ADCC, fagocitozom, ili kombinacijom dva ili više ovih mehanizama. Ćelije koje eksprimiraju CD20 koje se mogu inhibirati ili ubiti upotrebom bispecifičnih molekula koji vezuju antigen prema pronalasku uključuju, na primer, tumorogene B ćelije.

[0120] Molekuli ovog izlaganja koji vezuju antigen mogu se koristiti za lečenje, npr., primarnih i/ili metastatskih tumora koji nastaju u mozgu i moždanim ovojnicama, orofarinksu, plućima i bronhijalnom stablu, gastrointestinalnom traktu, muškom i ženskom reproduktivnom traktu, mišićima, kostima, koža i dodaci, vezivno tkivo, slezina, imunski sistem, ćelije koje stvaraju krv i koštana srž, jetra i urinarni trakt, i posebni čulni organi kao što je oko. U određenim slučajevima, bispecifični molekuli koji vezuju antigen iz izlaganja se koriste za lečenje jednog ili više od sledećih kancera: kancera bubrežnih ćelija, kancera pankreasa, kancera dojke, kancera glave i vrata, kancera prostate, malignih glioma, osteosarkoma, kolorektalni kancer, kancer želuca (npr. kancer želuca sa MET amplifikacijom), maligni mezoteliom, multipli mijelom, kancer jajnika, kancer malih ćelija pluća, kancer ne-malih ćelija pluća, sinovijalni sarkom, kancer štitne žlezde ili melanom. U skladu sa određenim primerima, bispecifični molekuli koji vezuju antigen iz ovog izlaganja se koriste za lečenje kancera B ćelija (npr. Hočkinov limfom, ne-Hočkinov limfom [NHL], prekursorska B ćelijska limfoblastna leukemija/limfom B ćelija, zreli neoplazmi , B ćelijska hronična limfocitna leukemija/mali limfocitni limfom, B ćelijska prolimfocitna leukemija, limfoplazmacitni limfom, limfom mantle ćelija, folikularni limfom, limfom centra kožnog folikula, limfom B ćelija periferne zone, leukemija dlakaste ćelije, difuzni limfom velikih B ćelija, Burkitov limfom, plazmacitom, mijelom plazma ćelija, limfoproliferativni poremećaj nakon transplantacije, Valdenstromova makroglobulinemija i anaplastični limfom velikih ćelija).

[0121] U skladu sa određenim slučajevima iz ovog izlaganja, molekuli koji vezuju antigen su korisni za lečenje pacijenta obolelog od B-ćelijskog limfoma (npr., NHL) koji je otporan na, ili nepotpuno reaguje na samu terapiju protiv CD20 (anti-CD20 terapiju) (npr., otporan na terapiju rituksimabom). U skladu sa drugim srodnim slučajevima iz ovog izlaganja, obezbeđuju se postupci koji obuhvataju davanje anti-CD3/anti-CD20 bispecifičnog molekula koji vezuje antigen kako je ovde otkriveno pacijentu koji je oboleo od B-ćelijskog limfoma (npr., NHL) tj. otporan na anti-CD20 terapiju (npr. pacijent sa tumorom otpornim na rituksimab ili sa relapsom ili refraktornim B-ćelijskim limfomom). Analitički/dijagnostički postupci koji su poznati u oblasti tehnike, kao što je skeniranje tumora, itd., mogu se koristiti da bi se utvrdilo da li pacijent ima tumor koji je rezistentan, nepotpuno reaguje na, ili refraktoran na samu terapiju koja je usmerena protiv CD20.

[0122] Ovo izlaganje takođe obuhvata postupke za lečenje rezidualnog kancera kod subjekta. Kako se ovde koristi, izraz "rezidualni kancer" označava postojanje ili postojanost jedne ili više ćelija kancera kod subjekta nakon tretmana terapijom protiv kancera.

[0123] Prema određenim aspektima, ovo izlaganje obezbeđuje postupke za lečenje bolesti ili poremećaja povezanih sa ekspresijom CD20 (npr., limfom B ćelija) koji sadrži davanje jednog ili više bispecifičnih molekula za vezivanje antigena koji se ovde na drugom mestu opisuje subjektu nakon što je subjekt primio anti-CD20 mono-terapiju (npr., nakon davanja farmaceutske kompozicije koja sadrži anti-CD20 antitelo kao što je rituksimab). Na primer, ovo izlaganje uključuje postupke za lečenje limfoma B ćelija koji sadrži davanje anti-CD3/anti-CD20 bispecifičnih molekula za vezivanje antigena pacijentu 1 dana, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, 1 nedelje, 2 nedelje, 3 nedelje ili 4 nedelje, 2 meseca, 4 meseci, 6 meseci, 8 meseci, 1 godinu, ili više nakon što je subjekt primio anti-CD20 monoterapiju (npr., tretman rituksimabom ili njegov ekvivalentni tretman). U drugim aspektima, bispecifičnog molekula za vezivanje antigena iz izlaganja (anti-CD3/anti-CD20 bispecifični molekul za vezivanje antigena) sadrži IgG4 Fc domen koji se inicijalno daje subjektu u jednoj ili više vremenskih tačaka (npr., da se obezbedi snažna početna deplecija B ćelija), zatim sledi davanje ekvivalenta bispecifičnog molekula za vezivanje antigena koji sadrži različiti domen IgG, kao što je domen Fc IgG1 Fc, u sledećim vremenskim tačkama.

Kombinovane terapije i formulacije

[0124] Farmaceutske kompozicije koje sadrže bilo koje od primera antitela i ovde opisanog bispecifičnog molekula za vezivanje antigena mogu biti davane u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa. Primeri dodatnih terapeutskih agenasa koji se mogu kombinovati sa ili primeniti u kombinaciji sa antigen-vezujućim molekulom iz ovog izlaganja uključuju, npr., antagonist EGFR (npr., anti-EGFR antitelo [npr., cetuksimab ili panitumumab] ili mali molekul inhibitor EGFR [npr., gefitinib ili erlotinib]), antagonist drugog člana familije EGFR kao što je Her2/ErbB2, ErbB3 ili ErbB4 (npr., anti-ErbB2, anti-ErbB3 ili anti-ErbB4 antitelo ili mali molekul inhibitor aktivnosti ErbB2, ErbB3 ili ErbB4), antagonist EGFRvIII (npr., anitelo koje specifično vezuje EGFRvlll), antagonist cMET (npr., anticMET antitelo), antagonist IGF1R (npr., anti-IGF1R antitelo), B-raf inhibitor (npr., vemurafenib, sorafenib, GDC-0879, PLX-4720), inhibitor PDGFR-α (npr., anti-PDGFR-α antitelo), PDGFR-β inhibitor (npr., anti-PDGFR-β antitelo), VEGF antagonist (npr., VEGF-Trap, videti, npr., US 7,087,411 (ovde takođe nazvan kao "VEGF-inhibitorni fuzioni protein"), anti-VEGF antitelo (npr., bevacizumab), mali molekul inhibitor kinase receptora VEGF (npr., sunitinib, sorafenib ili pazopanib)), antagonist DLL4 (npr., anti-DLL4 antitelo prikazano u US 2009/0142354 kao što je REGN421), antagonist Ang2 (npr., anti-Ang2 antitelo prikazano u US 2011/0027286 kao što je H1H685P), antagonist FOLH1 (npr., anti-FOLH1 antitelo), antagonist PRLR (npr., anti-PRLR antitelo), STEAP1 ili STEAP2 antagonist (npr., anti-STEAP1 antitelo ili anti-STEAP2 antitelo), TMPRSS2 antagonist (npr., anti-TMPRSS2 antitelo), MSLN antagonist (npr., anti-MSLN antitelo), CA9 antagonist (npr., anti-CA9 antitelo), antagonist uroplakina (npr., anti-uroplakin antitelo), antagonist monovalentnog CD20 (npr., monovalentno anti-CD20 antitelo kao što je rituksimab), itd. Drugi agensi koji se mogu kao benefit primeniti u kombinaciji sa antigen vezujućim molekulima iz izlaganja uključuju inhibitore citokina, uključujući male molekule inhibitore citokina i antitela koja se vežu za cytokine kao što su IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, ili za njihove odgovarajuće receptore. Farmaceutske kompozicije iz ovog izlaganja (npr., farmaceutske kompozicije koje sadrže anti-CD3/anti-CD20 bispecifični antigen vezujući molekul kao što je ovde opisano) može se takođe primeniti kao deo terapijskog režima koji sadrži jednu ili više terapeutskih kombinacija koje su izabrane i odabrane su od "ICE": ifosfamid (npr., Ifex<®>), karboplatin (npr., Paraplatin<®>), etoposid (npr., Etopophos<®>, Toposar<®>, VePesid<®>, VP-16); "DHAP": deksametazon (npr., Decadron<®>), citarabin (npr., Cytosar-U<®>, citozin arabinozid, ara-C), cisplatin (npr., Platinol<®>-AQ); i "ESHAP": etoposid (npr., Etopophos<®>, Toposar<®>, VePesid<®>, VP-16), metilprednizolon (npr., Medrol<®>), citarabin u visokoj dozi, cisplatin (npr., Platinol<®>-AQ).

[0125] Ovo izlaganje takođe uključuje terapeutske kombinacije koje sadrže bilo koji od antigenvezujućih molekula koji su ovde pomenuti i inhibitor jednog ili više od VEGF, Ang2, DLL4, EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EGFRvlll, cMet, IGF1R, B-raf, PDGFR-α, PDGFR-β, FOLH1, PRLR, STEAP1, STEAP2, TMPRSS2, MSLN, CA9, uroplakina, ili bilo koji od prethodno pomenutih citokina, pri čemu je inhibitor aptamer, antisens molekul, ribozim, siRNK, peptitelo, nanotelo ili fragment antitela (npr., Fab fragment; F(ab’)2fragment; Fd fragment; Fv fragment; scFv; dAt fragment; ili drugi modifikovani molekuli, kao što su diatela, triatela, tetratela, minitela i minimalne jedinice za prepoznavanje). Molekuli za vezivanje antigena iz izlaganja takođe se mogu primeniti i/ili zajedno formulisati u kombinaciji sa antivireticima, antibioticima, analgeticima, kortikosterioidima i/ili NSAIDs. Antigen vezujući molekuli iz izlaganja se takođe mogu primeniti kao deo režima tretmana koji takođe uključuje tretman zračenjem i/ili uobičajenu hemioterapiju.

[0126] Dodatne terapeutski aktivne komponenta(a) se mogu davati neposredo pred, istovremeno sa, ili ubrzo nakon davanja antigen vezujućeg molekula iz ovog izlaganja; (za svrhe ovog izlaganja, takvi režimi primene su smatrani davanjem antigen vezujućeg molekula "u kombinaciji sa" dodatnom terapeutski aktivnom komponentom).

[0127] Ovo izlaganje uključuje farmaceutske kompozicije u kojima je antigen vezujući molekul iz ovog izlaganja zajedno formulisan sa jednim ili više od dodatnih terapeutskih aktivnih komponenta(i) kao što je ovde na drugom mestu opisano.

Režimi davanja

[0128] U skladu sa određenim slučajima iz ovog izlaganja, višestruke doze antigen-vezujućeg molekula (npr., anti-CD3 antitela ili bispecifičnog molekula koji vezuje antigen koji specifično veže CD20 i CD3) mogu se davati subjektu u toku određenog vremenskog perioda. Postupci prema ovom aspektu iz izlaganja obuhvataju uzastopno davanje subjektu višestrukih doza antigen vezujućeg molekula iz izlaganja. Kao što se ovde koristi, "uzastopno davanje" znači da svaka doza antigen vezujućeg molekula je davana subjektu u različitoj tački u vremenu, npr., u različitim danima razdvojenim sa prethodno definisanim intervalima (npr., satima, danima, nedeljama ili mesecima). Ovo izlaganje uključujue postupke koji obuhvataju uzastopno davanje pacijentu pojedinačne početne doze antigen vezujućeg molekula, koju prati jedna ili više sekundarnih doza antigen vezujućeg molekula, i opciono prati jedna ili više tercijernih doza antigen vezujućeg molekula.

[0129] Termini "inicijalna doza" "sekundarne doze," i "tercijerne doze," se odnose na vremensku sekvencu davanja antigen vezujućeg molekula iz izlaganja. Prema tome, "inicijalna doza" je doza koja je davana na početku režima tretmana (takođe je označena sa "osnovna doza"); "sekudarne doze" su doze koje su davane nakon početne doze; i "tercijerne doze" su doze koje su davane posle sekundarnih doza. Početna, sekundarna, i tercijerne doze mogu sve sadržati istu količinu antigen vezujućeg molekula, ali se uopšteno mogu razlikovati jedna od druge u pogledu učestalosti davanja. U određenim slučajima, međutim, količina antigen-vezujućeg molekula koji se nalazi u inicijalnim, sekundarnim i/ili tercijernim dozama se razlikuju jedna od druge (npe., prilagođene su naviše ili niže kako odgovara) tokom trajanja tretmana. U određenim slučajima, dve ili više (npr., 2, 3, 4, ili 5) doza su davane na početku režima tretmana kao "doze opterećenja" praćene sledećim dozama koje su davane u manje učestaloj osnovi (npr., "doze za održavanje").

[0130] U jednom primeru slučaja iz ovog pronalaska, svaka sekundarno i/ili tercijerna doza je davana 1 do 26 (npr., 1, 1<1>/2, 2, 2<1>/2, 3, 3<1>/2, 4, 4<1>/2, 5, 5<1>/2, 6, 6<1>/2, 7, 7<1>/2, 8, 8<1>/2, 9, 9<1>/2, 10, 10<1>/2, 11, 11<1>/2, 12, 12<1>/2, 13, 13<1>/2, 14, 14<1>/2, 15, 15<1>/2, 16, 16<1>/2, 17, 17<1>/2, 18, 18<1>/2, 19, 19<1>/2, 20, 20<1>/2, 21, 21<1>/2, 22, 22<1>/2, 23, 23<1>/2, 24, 24<1>/2, 25, 25<1>/2, 26, 26<1>/2, ili više) nedelja neposredno nakon prethodne doze. Izraz "neposredno nakon prethodne doze," kao što je ovde korišćen, označava, u redosledu višestrukih davanja, dozu molekula za vezivanje antigena koja je davana pacijentu pre davanja sledeće doze u redosledu bez interventnih doza.

[0131] Postupci u skladu sa ovim aspektom izlaganja mogu obuhvatiti davanje pacijentu bilo kog broja sekundarnih i/ili tercijernih doza molekula za vezivanje antigena (npr., anti-CD3 antitela ili bispecifičnog molekula za vezivanje antigena koji specifično vezuje CD20 i CD3). Na primer, u određenim slučajima, samo jedna pojedinačna doza je davana pacijentu. U drugim slučajevima, dve ili više (npr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više) sekundarnih doza su davane pacijentu. Slično tome, u određenim slučajima, samo jedna tercijerna doza je davana pacijentu. U drugim slučajevima, dve ili više (npr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više) tercijernih doza su davane pacijentu.

[0132] U slučajevima koji uključuju višestruke sekundarne doze, svaka sekundarna doza se može davati u istoj učestalosti kao i druge sekundarne doze. Na primer, svaka sekundarna doza se može davati pacijentu 1 do 2 nedelja neposredno nakon prethodne doze. Slično tome, u slučajevima koji uključuju višestruke sekundarne doze, svaka tercijerna doza se može davati u istoj učestalosti kao i druge tercijerne doze. Na primer, svaka tercijerna doza se može davati pacijentu 2 do 4 nedelje neposredno nakon prethodne doze. Alternativno, učestalost na kojo su sekundarne i/ili tercijerne doze davane pacijentu se može razlikovati tokom trajanja režima tretmana. Učestalost davanja se takođe može prilagoditi tokom trajanja tretmana od strane nadležnog lekara u zavisnosti od potreba pojedinačnog pacijenta nakon kliničkog pregleda.

Dijagnostičke upotrebe antitela

[0133] Anti-CD3 antitela iz ovog izlaganja mogu se takođe koristiti za detekciju i/ili merenje CD3, ili ćelija koje eksprimuju CD3 u uzorku, npr., za dijagnostičke svrhe. Na primr, anti-CD3 antitelo, ili njegov fragment, mogu se koristiti za dijagnostikovanje stanja ili bolesti koja se karakteriše aberantnom ekspresijom (npr., prekomernom ekspresijom, nedovoljnom ekspresijom, nedostatkom ekspresije, itd.) CD3. Primeri dijagnostičkih testova za CD3 mogu sadržati, npr., dovođenje u kontakt uzroka, dobijenog iz pacijenta, sa anti-CD3 antitelom iz izlaganja, pri čemu je anti-CD3 antitelo obeleženo sa detaktabilnim obeleživačem ili reporterskim molekulom. Alternativno, neobeleženo anti-CD3 antitelo se može koristiti u dijagnostičkim primenama u kombinaciji sa sekundarnim antitelom koje samo obeleženo za detekciju. Detektabilni obeleživač ili reporterski molekul može biti radioizotop, kao što je<3>H,<14>C,<32>P,<35>S, ili<125>I; fluorescentni ili hemiluminiscentni ostatak kao što je fluorescein izotiocijanat, ili rodamin; ili enzim kao što je alkalna fosfataza, beta-galaktozidaza, peroksidaza rena, ili luciferaza. Specifični primeri testova koji se mogu koristiti za detekciju ili merenje CD3 u uzorku uključuju enzimski vezani imunosorbentni test (ELISA), radioimunotest (RIA), i sortiranje ćelija aktiviranih fluorescencijom (FACS). Uzorci koji se mogu koristiti u CD3 dijagnostičkim testovima u skladu sa ovim izlaganjem uključuju bilo koje tkivo ili uzorak tečnosti dobijen iz pacijenta koji sadrži detektabilne količine proteina CD3, ili njihove fragmente, u normalnim ili patološkim uslovima. Generalno, nivoi CD3 u određenom uzorku dobijenom iz zdravog pacijenta (npr., pacijenta koji nije razvio bolest ili stanje koje je povezano sa abnormalnim nivoima CD3 ili aktivnošću) će se meriti da bi se na početku uspostavila osnovna linija, ili standard, nivoa CD3. Ovaj osnovni nivo CD3 se nakon toga može uporediti protiv nivoa CD3 merenih u uzorcima koji su dobijeni od individua za koje se sumnja da imaju bolest ili stanje koje je povezano sa CD3.

PRIMERI

[0134] Primeri koji slede su predstavljeni tako da obezbede osobi koja je uobičajeno verzirana u stanje tehnike potpuno izlaganje i opis kako napraviti i koristiti postupke i kompozicije iz izlaganja. Uloženi su napori da se osigura tačnost u odnosu na korišćene brojeve (npr., količine, temperaturu, itd.) ali neke eksperimentalne greške i devijacije treba uzeti u obzir. Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, delovi su delovi u odnosu na težinu, molekulska težina je srednja molekulska težina, temperatura je u stepenima Celzijusa, i pritisak je na ili blizu atmosferskom.

Primer 1. Dobijanje Anti-CD3 antitela

[0135] Anti-CD3 antitela su dobijena imunizovanjem VELOCIMMUNE<®>miša (tj., modifikovanog miša koji sadrži DNK koja kodira varijabilne regione teškog i kapa lakog lanca humanog imunoglobulina) sa ćelijama koje eksprimiraju CD3 ili sa DNK koja kodira CD3. Imunski odgovor antitela je praćen CD3-specifičnim imunskim testom. Kada je postignut željeni imunski odogovr splenociti su sakupljeni i spojeni sa ćelijama mišjeg mijeloma da bi se sačuvala njihova vijabilnost i obrazovale ćelijske linije hibridoma. Ćelijske linije hibridoma su pretražene i odabrane za to identifikovanje ćelijskih linija koje proizvode CD3-specifična antitela. Korišćenjem ovog postupka nekoliko anti-CD3 himernih antitela (tj., antitela koja sadrže humane varijabilne domene i mišje konstante domene) su dobijena. Dodatno, nekoliko potpuno humanih anti-CD3 antitela su direktno izolovana iz antigen-pozitivnih B ćelija bez spajanja sa ćelijama mijeloma, kao što je opisano u US 2007/0280945A1.

[0136] Određene biloške osobine primera anti-CD3 antitela dobijenih u skladu sa postupcima iz ovog primera su opisani detaljni u primerima koji su prikazanu u tekstu ispod.

Primer 2. Aminokiselinske i nukleotidne sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca [0137] Tabela 1 prikazuje identifikatore sekvenci aminokiselina varijabilnih regiona i CDR-a teškog i lakog lanca odabranih anti-CD3 antitela iz izlaganja. Odgovarajući identifikatori sekvenci nukleinskih kiselina su prikazani u Tabeli 2.

Tabela 1: Identifikatori aminokiselinske sekvence

(nastavak)

Tabela 2: Identifikatori sekvenci nukleinskih kiselina

(nastavak)

[0138] Antitela su ovde obično nazivana prema sledećoj nomenklaturi: Fc prefiks (npr. “H1H“, “H1M“, “H2M“ itd.), praćen numeričkim identifikatorom (npr. “2712“, “2692“ itd., kao što je prikazano u Tabeli 1), nakon čega sledi sufiks „P“, „N“ ili „B“. Dakle, prema ovoj nomenklaturi, antitelo se ovde može nazvati kao, npr., "H1H2712N", "H1M2692N", "H2M2689N," itd. H1H, H1M i H2M prefiksi na oznakama antitela koje se ovde koriste ukazuju na određeni Fc region izotipa antitela. Na primer, "H1H" antitelo ima humani IgG1 Fc, "H1M" antitelo ima mišji IgG1 Fc, a "H2M" antitelo ima mišji IgG2 Fc, (svi varijabilni regioni su potpuno humani kao što je označeno prvim 'H' u oznaci antitela). Kao što će proceniti osoba koja je uobičajeno verzirana u stanje tehnike, antitelo koje ima određeni Fc izotip može se konvertovati u antitelo sa različitim Fc izotipom (npr., antitelo sa mišjim IgG1 Fc može se konvertovati u antitelo sa humanim IgG4, itd.), ali u svakom slučaju, varijabilni domeni (uključujući CDR) – koji su označeni numeričkim identifikatorima prikazanim u Tabeli 1 – će ostati isti, a očekuje se da će svojstva vezivanja biti identična ili suštinski slična bez obzira na prirodu domena Fc.

Kontrolni konstrukti koji su korišćeni u sledećim primerima

[0139] Različiti kontrolni konstrukti (anti-CD3 antitela) su uključeni u sledeće eksperimente za uporedne svrhe: "OKT-3", mišje monoklonsko antitelo protiv površinskih antigena T-ćelija, dostupno iz Američke kolekcije tipskih kultura (ATCC) pod kataloškim br. CRL-8001; i "SP34", komercijalno dostupno mišje monoklonsko antitelo dobijeno od Biolegend, San Dijego, Kalifornija (kat. br.302914), reaktivno protiv epsilon lanca T3 kompleksa na ćelijama humanih T limfocita.

Primer 3. Afiniteti vezivanja i kinetičke konstante humanih monoklonskih anti-CD3 antitela izvedene površinskom plazmonskom rezonancom

[0140] Afiniteti vezivanja i kinetičke konstante humanih monoklonskih anti-CD3 antitela su određene površinskom plazmonskom rezonancom na 25°C korišćenjem formata za hvatanje antitela (Tabele 3, 5 i 7) ili formata za hvatanje antigena (Tabele 4, 6 i 8 ). Merenja su sprovedena na T200 Biacore instrumentu.

[0141] U formatu za hvatanje antitela, površina senzora Biacore je derivatizovana zečjim anti-mišjim Fc za hvatanje hibridoma (prefiks antitela H1M ili H2M) ili mišjim anti-humanim Fc površinom za humana IgG formatirana antitela (prefiks antitela H1H). Rastvorljivi heterodimerni CD3 protein (hCD3-epsilon/hCD3-delta; SEQ ID NO:1370/1371) sa ili sa humanom Fc oznakom (hFcΔAdp/hFc; SEK ID NOs:1372/1373) ili Fc oznakom miša (mFcΔAdp; SEQ ID NOs:1374/1375) je ubrizgan preko površine uhvaćene antitelom i zabeležen je odgovor vezivanja. Heterodimerni CD3 protein je prečišćen korišćenjem metode opisane u Davis et al. (US2010/0331527).

[0142] U formatu za hvatanje antigena, heterodimerni CD3 protein je uhvaćen korišćenjem zečjeg anti-mišjeg Fc ili mišjeg anti-humanog Fc i odgovarajuća antitela su ubrizgana preko uhvaćenog antigena.

[0143] Antitela su analizirana u njihovom konvencionalnom dvovalentnom formatu (Tabele 3 do 6) ili u monovalentnoj 1-krakoj konfiguraciji (Tabele 7 i 8) u kojoj je drugi Fab iz antitela uklonjen i samo je Fc deo (CH2-CH3) bio izražen.

[0144] Konstante brzine kinetičke asocijacije (ka) i disocijacije (kd) određene su obradom i uklapanjem podataka u model vezivanja 1:1 korišćenjem softvera za podešavanje krive Scrubber 2.0. Ravnotežne konstante disocijacije vezivanja (KD) i disocijativni poluživot (t1/2) su izračunati iz konstanti kinetičke brzine kao: KD(M) = kd/ ka; i t1/2(min) = (In2/(60*kd). NT = nije testirano; NB = nije uočeno vezivanje.

Tabela 3: Biacore afiniteti vezivanja mAt-a hibridoma (H1M i H2M)

(nastavak)

Tabela 4: Biacore afiniteti vezivanja mAt-a hibridoma (H1M i H2M)

(nastavak)

Tabela 5: Biacore afiniteti vezivanja humanih Fc mAt-a (H1H)

Tabela 6: Biacore afiniteti vezivanja humanih Fc mAt-a (H1H)

Tabela 7: Biacore afiniteti vezivanja monovalentnih 1-krakih mAt-a

(nastavak)

Tabela 8: Biacore afiniteti vezivanja monovalentnih 1-krakih mAt-a

(nastavak)

[0145] Kao što je prikazano u Tabelama 3-8, nekoliko anti-CD3 antitela iz ovog izlaganja vezuje CD3, ili u formatima za hvatanje antitela ili hvatanje antigena, sa visokim afinitetom.

Primer 4. Anti-CD3 Antitela vezuju i proliferišu humane T-ćelije

[0146] Anti-CD3 antitela iz ovog izlaganja su testirana za njihovu sposobnost da se vežu za humane T-ćelije i indukuju njihovu proliferaciju. Vezivanje je ispitivano korišćenjem Jurkat-ovih ćelija (CD3+ humana T-ćelijska linija), dok je proliferacija mononuklearnih ćelija iz periferne krvi (PBMC) procenjena upotrebom ATP katalizovane kvantifikacije (CellTiter Glo<®>). Anti-CD3 antitelo OKT3 deluje kao pozitivna kontrola i irelevantna antitela koja se podudaraju sa izotipom koja služe kao negativne kontrole.

[0147] FACS podaci su prikupljeni korišćnjem sledećeg protokola: Ćelije od 2X10<5>po bunariću su inkubirane sa serijski razblaženim antitelima u trajanju od 30 min na ledu. Nakon inkubacije, ćelije su isprane i sekundarno antitelo je dodato i inkubirano dodatnih 30 minuta. Nakon inkubacije, ćelije su isprane, re-suspendovane u hladnom PBS-u koji sadrži 1% BSA i analizirane su protočnim citometrom sa vijabilnim Jurkat-ovim ćelijama koje su ograničene bočnim i prednjim rasejanjima. EC50vrednosti titracije ćelijskog vezivanja su određivane korišćenjem Prism softvera sa vrednostima izračunatim uporebom 4 parametarske nelinearne regresione analize.

[0148] Podaci o proliferaciji su dobijeni korišćenjem sledećeg protokola: Humane PBMC (5X10<4>/ bunariću) su inkubirane upotrebom 3-strukog serijskog razblaženja anti-CD3 i fiksnom koncentracijom komercijalnog anti-CD28 antitela (200ng/ml) u pločama sa 96 bunarića u trajanju od 72h na 37°C. Nakon inkubacije, CellTiter Glo<®>je dodat i luminiscencija je merena korišćenjem VICTOR X5 čitača ploče sa višestrukim obeležavanjem (PerkinElmer). EC50ćelijske vijabilnosti (ATP katalizovana kvantifikacija) je izračunata korišćenjem 4-parametarske nelinearne regresione analize u GraphPad Prism.

[0149] Rezultati vezivanja i eksperimenti proliferacije su sumirani u Tabelama 9-11.

Tabela 9: Hibridom Anti-CD3 mAt-a vezuje & proliferiše humane T-ćelije

(nastavak)

Tabela 10: Humana Fc Anti-CD3 mAt-a vezuju & proliferišu humane T-ćelije

(nastavak)

Tabela 11: Monovalentna 1-krak Anti-CD3 mAt-a vezuju & proliferišu humane T-ćelije

[0150] Kao što je prikazano u Tabelama 7-9, velika većina anti-CD3 antitela iz izlaganja veže humane T-ćelije i indukuje proliferaciju T-ćelija.

Primer 5. Anti-CD3 Antitela vezuju i proliferišu T-ćelije majmuna

[0151] Podset anti-CD3 antitela iz izlaganja je ispitan za sposobnost da se veže za i izazove proliferaciju majmunskih T-ćelija.

[0152] FACS podaci su dobijeni korišćenjem sledećeg protokola: Ćelije na 2x10<5>po bunarčiću su inkubirane sa serijski razblaženim antitelima 30 minuta na ledu. Posle inkubacije, ćelije su isprane i dodata su sekundarna antitela i inkubirana dodatnih 30 minuta. Posle inkubacije, ćelije su isprane, ponovo suspendovane u hladnom PBS-u koji sadrži 1% BSA i analizirane protočnom citometrijom. CD4+ T ćelije majmuna su ograničene bočnim i prednjim rasejanjem, i na CD2+CD4+CD20-populaciji.

EC50 za titraciju vezivanja ćelija izračunate su korišćenjem 4-parametarske nelinearne regresione analize u GraphPad Prism.

[0153] Podaci o proliferaciji su dobijeni korišćenjem sledećeg protokola: Sveže izolovani PBMC dobijeni od majmuna cinomolgusa (5x10<4>/ bunarčiću) su inkubirani sa trostrukim serijskim razblaženjem anti-CD3 antitela i fiksnom koncentracijom komercijalnog anti-CD28 antitela (500 ng/ml) antitelo u pločama sa 96 bunarčića tokom 72 h na 37°C. Posle inkubacije, dodat je CellTiter Glo® i merena je luminiscencija korišćenjem VICTOR X5 čitača ploča sa više obeleživača (PerkinElmer). EC50vijabilnosti ćelija (kvantifikacija katalizovana ATP-om) je izračunata korišćenjem 4-parametarske nelinearne regresione analize u GraphPad Prism.

[0154] Rezultati eksperimenata vezivanja i proliferacije su prikazani u Tablelama 12 i 13.

Tabela 12: Anti-CD3 mAt-a vezuju & proliferišu PBMC majmuna

(nastavak)

Tabela 13: Monovalentna 1-kraka Anti-CD3 mAt-a vezuju & proliferišu PBMC majmuna

[0155] Kao što je prikazano u Tabelama 12 i 13, nekoliko anti-CD3 antitela iz izlaganja vezuju CD2+CD4+ majmunske T-ćelije i izazivaju njihovu proliferaciju. OKT3 nije pokrenuo proliferaciju majmunskih PBMC, dok je SP34 bio aktivan protiv majmunskih PBMC.

Primer 6. Anti-CD3 mAt-a podržavaju ubijanje tumorskih ćelija posredstvom T-ćelija

[0156] Sposobnost anti-CD3 antitela da preusmere ubijanje posredovano T-ćelijama putem Fc/FcR interakcija proučavana je korišćenjem testa ubijanja U937 zasnovanog na kalceinu. Ukratko, humani PBMC su izolovani preko Ficoll-Paque-a i aktivirani tokom nekoliko dana sa medijumom koji sadrži humani IL-2 (30 U/ml) i zrnca za aktivaciju T-ćelija (anti-CD3/CD28). U937 ćelije su obeležene kalceinom, a zatim inkubirane sa aktiviranim T-ćelijama u odnosu efektor: meta 10:1 korišćenjem trostrukih serijskih razblaženja antitela tokom 3 sata na 37°C. Nakon inkubacije, ploče su centrifugirane i supernatanti su prebačeni u providnu crnu ploču sa prozirnim dnom za analizu fluorescencije. EC50vrednosti, definisane kao molarna koncentracija CD3 antitela koje indukuje 50% citotoksičnosti, izračunate su korišćenjem 4-parametarske nelinearne regresione analize u GraphPad Prism. Rezultati korišćenjem antitela hibridoma, humanih Fc antitela i monovalentnih jednokrakih antitela prikazani su redom, u Tabelama 14, 15 i 16.

Tabela 14: Hibridom Anti-CD3 mAt-a preusmerava ubijanje T-ćelijama na U937 ćelije

(nastavak)

Tabela 15: Humana Fc formatirana Anti-CD3 mAt-a preusmeravaju ubijanje T-ćelijama na U937 ćelije

(nastavak)

Tabela 16: Monovalentna 1-kraka Anti-CD3 mAt-a preusmerava ubijanje T-ćelija na U937 ćelije

Kao što je prikazano u Tabelama 14-16, većina anti-CD3 antitela, kao i OKT3, podržavaju preusmereno ubijanje posredovano T ćelijama u ovom sistemu testa. Uočeno ubijanje, za koje se veruje da zavisi od angažovanja Fc antitela sa Fc receptorom na U937 ćelijama koje dovodi do grupisanja CD3 na susednim T-ćelijama, ugušeno je dodavanjem nespecifičnog humanog IgG (podaci nisu prikazani).

Primer 7. Dobijanje bispecifičnih antitela koja vezuju CD3 i CD20

[0157] Bispecifična antitela koja sadrže anti-CD3-specifični vezujući domen i anti-CD20-specifični vezujući domen su konstruisana upotrebom standardnih postupaka u kojima su težak lanac i laki lanac iz anti-CD3 antitela kombinovani sa teškim lancem iz anti-CD20 antitela. Anti-CD3 antitela koja su korišćena za pravljenje bispecifičnih antitela iz ovog primera su dobijena imunizovanjem VelocImmune<®>miša sa ćelijama koje eksprimiraju CD3 ili sa DNK koja kodira CD3, ili u slučaju BS3/20-007 i -009, iz poznatog anti-CD3 antitela (tj., anti-CD3 antitelo "L2K" kao što je prikazano u WO2004/106380). Anti-CD20 antitela koja su korišćena za pravljenje bispecifičnih antitela iz ovog primera su prikazana u US 7,879,984.

[0158] Bispecifična antitela koja su dobijena u skladu sa ovim primerom sadrže dva odvojena domena za vezivanje antigena (tj., vezujuće krake). Prvi domen za vezivanje antigena sadrži varijabilni region teškog lanca koji je dobijen iz anti-CD20 antitela ("CD20-VH"), uparen sa varijabilnim regionom lakog lanca koji je dobijen iz anti-CD3 antitela ("CD3-VL"). Uparivanjem CD20-VH/CD3-VL dobija se domen za vezivanje antigena koji specifično prepoznaje CD20. Drugi domen za vezivanje antigena sadrži varijabilni region teškog lanca koji je dobijen iz anti-CD3 antitela ("CD3-VH"), uparen sa varijabilnim regionom lakog lanca koji je dobijen iz anti-CD3 antitela ("CD3-VL"). Uparivanjem CD3-VH/CD3-VL dobija se domen za vezivanje antigena koji specifično prepoznaje CD3. Isti CD20-VH je korišćen u svim bispecifičnim antitelima koja su dobijena u ovom primeru i označena "CD20-VH-A" (izuzev BS3/20-009, koji je koristio različit CD20-VH označen sa "CD20-VH-B"). Međutim, nekoliko različitih CD3-VH i CD3-VL komponenti (označenih "CD3-VH-A, CD3-VH-B, itd. i CD3-VL-A, CD3-VL-B, itd., koje su dobijene iz različitih anti-CD3 antitela) su korišćeni u različitim bispecifičnim antitelima iz sledećih primera.

[0159] Pregled delova kompnenti antigen vezujućih domena različitih bispecifičnih antitela je napravljen u skladu sa ovim Primerom i prikazan je u Tabeli 17.

Tabela 17

[0160] Tabele 18 i 19 prikazuju identifikatore aminokiselinskih sekvenci za različite varijabilne regione teškog lanca (Tabela 18) i varijabilne regione lakog lanca (Tabela 19), i njihove odgovarajuće CDR, bispecifičnih antitela iz ovog primera.

Tabela 18 (Aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca)

Tabela 19 (Aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca)

[0161] Dodatno, Table 20 i 21 prikazuju identifikatore sekvenci za nukelotidne sekvence koje kodiraju varijabilne regione teškog lanca (Tabela 20) i varijabilne regione lakog lanca (Tabela 21), i njihove odgovarajuće CDRs, bispecifičnih antitela iz ovog Primera.

Tabela 20 (Sekvence nukleotida koje kodiraju sekvence varijabilnog regiona teškog lanca)

Tabela 21 (Sekvence nukleotida koje kodiraju sekvence varijabilnog regiona lakog lanca)

[0162] Pored gore opisanih bispecifičnih antitela, sledeća kontrolna antitela su takođe korišćena u određenim eksperimentima koji su prikazani u primerima koji slede:

Kontrola I: Monoklonalno antitelo "OKT-3" protiv površinskih antigena humane T-ćelije kao što je predstavljeno u US 4,361,549 i dostupno iz hibridoma CRL-8001 (American Type Culture Collection, Manassas, VA).

Kontrola II: Antitelo "SP34" reaktivno protiv epsilon lanca T3 kompleksa na humanim ćelijama T limfocita, koja je dostupna iz BD Pharmagen, Kat# 55052.

Kontrola III: anti-CD20 terapeutsko antitelo, sa sekvencama teškog i lakog lanca Rituksana (Rituskimab) kao što je prikazano u US 5,736,137.

Kontrola IV: Monoklonalno anti-CD20 antitelo koje je označeno sa "3B9-10" kao što je prikazano u US 7,879,984, i ovde prikazano kao antitelo koje sadrži par sekvenci aminokiselina HCVR/LCVR SEQ ID NOs: 1242/1346 i HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 1244-1246-1248-1348-1350-1352.

Kontrola V: Monoklonalno anti-CD20 antitelo koje je označeno sa "10F2-13" kao što je prikazano u US 7,879,984, and set forth herein as an antibody comprising the HCVR/LCVR amino acid sequence pair of SEQ ID NOs: 1354/1362 and HCDR1HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1356-1358-1360-1364-1366-1368.

Primer 8. CD20 x CD3 Bispecifična antitela selektivno vezuju Jurkat, Raji i T-ćelije majmuna

[0163] CD20 x CD3 bispecifična antitela i kontrolni konstrukti, kao što je ovde prikazano u Primeru 1, su ispitani pomoću FACS za njihovu sposobnost vezivanja za Jurkat (CD3+, CD20 -humana T-ćelijska linija), Raji (CD3-, CD20+ Humana B-ćelijska linija), ili PBMC cinomolgusa ("mkT ćelije").

[0164] FACS podaci su dobijeni korišenjem sledećeg protokola: Ćelije u koncentraciji od 2x10<5>po bunariću su inkubirane sa serijski razblaženim antitelima u trajanju od 30 min na ledu. Nakon inkubacije, ćelije su isprane i odgovarajuća sekundarna (Jurkat, RAJI ćelije) ili koktel sekundarnih antitela (za cino PBMC) je dodat i inkubacija je nastavljena dodatnih 30 minuta. Nakon inkubacije, ćelije su isprane, re-suspendovane u hladnom PBS-u koji sadrži 1% BSA i analizirane su protočnim citometrom na BD FACS Canto II. Jurkat i Raji ćelije su ograničene bočnim i prednjim rasejanjima, dok su T ćelije cinomolgusa takođe ograničene na CD2+CD4+ populaciju. EC50za titraciju ćelijskog vezivanja su određivane korišćenjem Prism softvera sa vrednostima koje su izračunate korišćenjem 4-parametarske nelinearne regresione analize. Rezultati su prikazani u Tabeli 22.

Tabela 22. EC50 vrednosti vezivanja (molarne) za CD3XCD20 bispecifična antitela

[0165] Kao što je prikazano u Tabeli 22, panel ispitivanih antitela pokazao je opseg afiniteta vezivanja na različitim ćelijskim linijama, u zavisnosti od njihovih specifičnosti. Bispecifična antitela (BS3/20-001, -002, -003, -004 i -005) pokazala su sposobnost da se vežu za obe humane ciljne linije. Podset antitela takođe je pokazao sposobnost da se veže za ćelije cinomolgusa (Kontrola II, BS3/20-001 i BS3/20-003). Anti-CD3 Kontrola I (OKT3), anti-CD3 Kontrola II (SP34), i anti-CD20 Kontrola IV vezana za Jurkat, T ćelije cinomolgusa, i RAJI, tim redom.

Primer 9. CD20 x CD3 bispecifična antitela izazivaju in vitro proliferaciju PBMC

[0166] Sposobnost odabranih CD20 x CD3 bispecifičnih antitela i kontrolnih konstrukata da stimulišu mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i indukuju proliferaciju je procenjena korišćenjem kvantifikacije katalizovane ATP (CellTiter Glo®). Aktivacija PBMC dovodi do oslobađanja citokina, koji pokreću ćelijsku proliferaciju.

[0167] Podaci o proliferaciji su dobijeni korišćenjem sledećeg protokola: PBMC dobijeni od ljudi ili majmuna cinomolgusa (5x10<5>/bunariću) su inkubirani sa trostrukim serijskim razblaženjem anti-CD3kCD20 ili kontrolnog antitela u pločama sa 96 bunarčića tokom 72 h na 37°C. Posle inkubacije, dodat je CellTiter Glo® i merena je luminiscencija korišćenjem VICTOR Ks5 čitača ploča sa više oznaka (PerkinElmer). EC50 vitalnosti ćelije (kvantifikacija katalizovana ATP-om) je određen korišćenjem Prism softvera. Vrednosti su izračunate korišćenjem 4-parametarske nelinearne regresione analize i prikazane su u Tabeli 23.

Tabela 23. EC50za proliferaciju humanih i PBMC cinomolgusa indukovanu sa anti-CD20 x CD3 bispecifičnim antitelima

[0168] Kao što je prikazano u Tabeli 23, sva CD20 x CD3 bispecifična antitela iz izlaganja bila su aktivatori humanih ili PBMC cinomolgusa. Generalno, anti-CD3 mono specifična bivalentna parentalna antitela (Kontrole I i II) bila su 2-10 puta potentniji od bispecifičnih pandana. Kontrola I (OKT3) nije pokrenula proliferaciju majmunskih PBMC, dok je Kontrola II (SP34) bila aktivna protiv oba, humanih i PBMC majmuna.

Primer 10. CD20 x CD3 Bispecifična antitela aktiviraju T-ćelije i indukuju oslobađanje IFN-gama i pojačanu regulaciju CD25 u punoj humanoj krvi

[0169] Odabrana CD20 x CD3 bispecifična antitela su testirana za njihovu sposobnost da aktiviraju T-ćelije u punoj humanoj krvi. Obim T-ćelijske aktivacije je određen merenjem lučenja interferona-gama (IFNγ) kao i pojačanom regulacijom CD25 na CD8+ T ćelijama.

[0170] Lučenje interferona-gama (IFNγ) je kvantifikovano kombinovanjem heparinizirane pune krvi sa 5-strukim serijskim razblaženjima bispecifičnih antitela u pločama sa 96-bunarčića. Nakon 20 h, ploče su centrifugirane u trajanju od 5 minuta i plazma je uklonjena za analizu ELISA da bi se odredili nivoi IFNγ. Ekstrapolirane koncentracije IFNγ prikazane su u odnosu na koncentraciju antitela, i vrednosti EC50su izračunate korišćenjem 4-parametarske nelinearne regresione analize korišćenjem softvera Prism.

[0171] Za analizu ekspresije CD25 na CD8+ T-ćelijama, nakon inkubacije sa antitelima i uklanjanja plazme, 150 µl krvi je preneto na ploču sa dubokim bunarčićem i lizirano tokom 15 minuta sa 1.5 mL RBC pufera za liziranje. Ćelije su isprane dva puta, blokirane tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi sa hFcR blokirajućim reagensom, i zatim su inkubirani tokom 30 min na 4°C sa antitelima direktno konjugovanim za CD2, CD19, CD4, CD8, i CD25. Sledeće, ćelije su isprane dva puta pre analize sa FACSCanto citometrom i softverom FlowJo.

[0172] Procenat CD2+CD8+ T ćelija koje eksprimiraju aktivacioni marker CD25 predstavljen je u odnosu na koncentraciju antitela, i vrednosti EC50su izračunate upotrebom 4-parametarske nelinearne regresione analize korišćenjem softvera Prism. Rezultati su prikazani u Tabeli 24.

Tabela 24: EC50vrednosti bispecifičnih antitela koja posreduju pojačanoj regulaciji CD25 i proizvodnju IFN<γ>u punoj krvi

[0173] Kao što je prikazano u Tabeli 24, CD20 x CD3 bispecifična antitela su posredovala u pojačanoj regulaciji CD25 na CD8+ T ćelijama u punoj krvi sa vrednostima EC50u rasponu od 130-290 pM sa odgovarajućim vrednostima EC50za IFNγ koje su bile nešto veće u rasponu od 390 pM do 2 nM. BS3/20-004 je bio manje potentan od BS3/20-001 i BS3/20-003 u posredovanju u povećanju regulacije CD25 i proizvodnje IFNγ kako je utvrđeno EC50, međutim BS3/20-004 bi mogao da izazove veće nivoe IFNγ u kulturama pune krvi.

Primer 11. CD20 x CD3 Bispecifična antitela indukuju citotoksičnost posredovanu T-ćelijama na ćelijskim linijama rezistentnim na Rituksimab

[0174] Sposobnost odabranih CD20 x CD3 bispecifičnih antitela i kontrolnih konstrukata da posreduju u citotoksičnosti zavisnoj od komplementa (CDC) i citotoksičnosti posredovanoj T ćelijama je procenjena korišćenjem roditeljskih Raji ćelija i Raji SCID linija. Poslednje (Raji SCID linije) su izvedene iz pojedinačnih tumora otpornih na CD20 izolovanih od imunodeficijentnih miševa kojima su subkutanozno ubrizgane Raji ćelije nakon tretmana sa anti-CD20 mAt Rituksimabom. Četiri linije (Raji SCID 1-4) su korišćene u ovom primeru.

[0175] Ekspresija CD20 i molekula inhibicije komplementa CD55 i CD59 na Raji ćelijskim linijama određena je pomoću FACS. Ukratko, 1x10<6>ćelija je inkubirano u pojedinačnim epruvetama 30 minuta sa antitelima direktno konjugovanim na CD20, CD55 i CD59. Ćelije su isprane dva puta pre FACS akvizicije pomoću FACSCanto citometra i analize pomoću softvera FlowJo.

[0176] Da bi se utvrdila sposobnost anti-CD20 i anti-CD3xCD20 antitela da posreduju u ubijanju Raji ćelijskih linija usmerenim na T ćelije, Raji ćelije obeležene kalceinom su inkubirane 2 h na 37°C sa prethodno aktiviranim T ćelijama (fikol-izolovane humane PBMC aktivirane sa rhlL-2 (30U/mL) i anti-CD3/CD28 aktivacionim zrncima) i trostrukim serijskim razblaženjima antitela počev od 2 nM. Nakon inkubacije, ploče su centrifugirane i supernatanti su prebačeni u providnu crnu prozirnu donju ploču za detekciju fluorescencije od 530 nm pri emisiji od 485 nm. Procenat citotoksičnosti je određen na osnovu spontanih (samo ciljne ćelije) i maksimalnog oslobađanja (ciljne ćelije lizirane deterdžentom). Vrednosti EC50su izračunate korišćenjem 4-parametarske nelinearne regresione analize pomoću Prism softvera.

[0177] Da bi se odredila aktivnost antitela za posredovanje CDC-a, Raji ćelijske linije su inkubirane sa 5% normalnog humanog serumskog komplementa i 3-strukim serijskim razblaženjima antitela počev od 100 nM. Posle inkubacije od 4,5 h na 37°C, ćelijska smrt je određena korišćenjem CellTiter Glo®. Procenat citotoksičnosti je određen na osnovu spontanih (samo ciljne ćelije) i maksimalnog oslobađanja (ciljne ćelije lizirane deterdžentom). Vrednosti EC50su izračunate korišćenjem 4-parametarske nelinearne regresione analize pomoću Prism softvera.

[0178] Rezultati su prikazani u Tabeli 25.

Tabela 25. EC50 vrednosti za CDC posredovanu antitelima i citotoksičnost posredovanu T-ćelijama

(nastavak)

[0179] U poređenju sa roditeljskim Raji ćelijama, 2 od 4 Raji SCID linije su pokazale smanjenu ekspresiju CD20 (Tabela 25; linije Raji SCID 1 i 3), sa značajno većim procentom ćelija koje eksprimiraju molekule inhibicije komplementa CD55 i CD59. Osetljivost ćelija Raji SCID na CDC posredovana bilo anti-CD20 ili anti-CD20 x CD3 antitelima zavisila je od procenta ćelija koje eksprimiraju CD55/CD59, ali ne i od nivoa CD20, tako da je povećana ekspresija CD55/CD59 na ciljnim ćelijama inhibirao CDC.

[0180] Anti-CD20 antitela (Kontrola IV & Kontrola III [Rituksimab]) su bila snažnija od anti-CD20 x CD3 (BS3/20-007) u posredovanju CDC, pošto je bispecifična monovalentna za CD20. Međutim, za razliku od CDC-a, citotoksičnost posredovana T ćelijama nije zavisila od nivoa CD20 ili CD55/CD59, pošto su sve ćelijske linije bile podjednako podložne ćelijskoj smrti aktiviranim T-ćelijama u prisustvu anti-CD20 x CD3 bispecifičnog antitela. Pored toga, bispecifično antitelo je bilo 100-1000 puta snažnije u posredovanju u ubijanju Raji ćelija zavisno od T ćelija nego anti-CD20 antitelo u CDC testu.

Primer 12. Povećana regulacija CD25 na CD8+ T-ćelijama zavisi od koncentracije CD20 u prisustvu CD20 x CD3 bispecifičnih antitela

[0181] Da bi se procenilo da li bi veće koncentracije ciljnih ćelija (CD20+ limfomi) dovele do povećane potencije CD20 x CD3 bispecifičnih antitela, mononuklearne ćelije humane periferne krvi (PBMC) su zajedno kultivisane u prisustvu ćelijske linije iz Burkitovog limfoma, tj., Raji.

[0182] Povećana regulacija CD25 na CD8+ T-ćelijama određena je korišćenjem sledećeg protokola: Humani PBMC (5x10<5>/mL), izolovani centrifugiranjem krvi dobijene leukafarezom obogaćene mononuklearnim ćelijama preko Ficoll-a, inkubirani su u prisustvu (1x10<5>/mL) ili u odsustvu Raji ćelije, na 37°C u pločama sa ravnim dnom sa 96 bunarčića sa 5-strukim serijskim razblaženjima bispecifičnih antitela. Posle 48 sati, ćelije su isprane 2x, blokirane 10 minuta na sobnoj temperaturi reagensom za blokiranje hFcR, a zatim inkubirane 30 minuta na 4°C sa direktno konjugovanim antitelima na CD2, CD19, CD4, CD8 i CD25. Posle bojenja, ćelije su isprane dva puta preuzimanjem FACS citometra FACSCanto i analize pomoću softvera FlowJo. Procenat aktiviranih CD2+CD8+ T ćelija koje eksprimiraju CD25 je prikazan u odnosu na koncentraciju antitela, a vrednosti EC50su izračunate korišćenjem 4-parametarske nelinearne regresione analize korišćenjem Prism softvera. Rezultati su prikazani u Tabeli 26.

Tabela 26. Povećana regulacija CD25 na CD8+ T-ćelijama nakon inkubacije humanih PBMC sa CD20 x CD3 bispecifičnim antitelima plus ili minus Raji ćelije

[0183] Kao što je prikazano u Tabeli 26, aktivirane T-ćelije kada su kultivisane u prisustvu Raji (ciljnih) ćelija pokazale su povećanu regulaciju CD25 i naknadno 100-struko smanjenje njihovih EC50vrednosti.

Primer 13. CD20 x CD3 bispecifična antitela izazivaju citotoksičnost na Raji ćelije u prisustvu aktiviranih T-ćelija

[0184] Sposobnost CD20 x CD3 bispecifičnih antitela da preusmere ubijanje posredovano T ćelijama na Raji ćelije koje eksprimiraju CD20 testirana je u in vitro testu citotoksičnosti. Pored toga, proučavana je i sposobnost i bispecifičnih i roditeljskih anti-CD3 antitela da ubijaju ćelije U937 putem Fc/FcR interakcija.

[0185] Testovi ubijanja kalceina su sprovedeni korišćenjem sledećeg protokola: PBMC čoveka i cinomolgusa su izolovani preko Ficoll-Plaque-om ili putem limfolit medijuma za odvajanje ćelija sisara, tim redom. Izolovani PBMC su aktivirani tokom nekoliko dana sa medijumom koji sadrži rekombinantni humani IL-2 (30U/ml) i zrnca za aktivaciju T-ćelija (anti-CD3/CD28 za humani PBMC, anti-CD2/CD3/CD28 za cinomolgus PBMC).

[0186] Ciljne ćelije (Raji za ubijanje posredovano CD20 i U937 za ubijanje posredovano FcR) su obeležene kalceinom i inkubirane sa aktiviranim T-ćelijama u odnosu efektor: cilj 10:1 korišćenjem trostrukih serijskih razblaženja antitela tokom 3 h na 37°C. Nakon inkubacije, ploče su centrifugirane i supernatanti su prebačeni u providnu crnu ploču sa prozirnim dnom za fluorescentnu analizu. EC50definisane kao molarna koncentracija bispecifičnog antitela koje indukuje 50% citotoksičnosti je određena korišćenjem Prism-a. Vrednosti su izračunate korišćenjem 4-parametarske nelinearne regresione analize. Rezultati su sumirani u Tabeli 27.

Tabela 27. EC50vrednosti za CD20 x CD3-indukovanu citotoksičnost na Raji i U937 ćelije

[0187] Kao što je prikazano u Tabeli 27, bispecifična CD20 x CD3 antitela koja sadrže humane specifične ili humane/cinomolgus unakrsno reaktivne anti-CD3 krakove su bila u stanju da specifično preusmere citotoksičnost na Raji ćelije u prisustvu aktiviranih humanih T ćelija. U prisustvu aktiviranih cinomolgus T ćelija, Raji su ubijeni kada su inkubirani sa BS3/20-001 ili BS3/20-003, bispecifičnim antitelima koja imaju anti-CD3 krakove koji aktiviraju T-ćelije majmuna. Sva bispecifična antitela, kao i Kontrola I, anti-CD3 mAt, pokazali su aktivnost u testu ubijanja koji zavisi od U937 Fc/FcR. Ova aktivnost se može blokirati dodavanjem blokirajućeg nespecifičnog humanog IgG u reakciju (Podaci nisu prikazani).

Primer 14. CD3 x CD20 bispecifična antitela mogu da unište CD19+ B-ćelije kod miševa rekonstituisanih sa humanim imunim ćelijama

[0188] Da bi se utvrdila in vivo potentnost primene bispecifičnog antitela CD3xCD20, promene u nivoima CD19+ B-ćelija i CD2+ T-ćelija su ispitane putem FACS-a nakon primene 10 µg ili 0,1 µg anti-CD3xCD20 bispecifičnog antitela kod miševa, koji su rekonstituisani humanim imunskim ćelijama.

[0189] Ukratko, novorođeni BALB/Rag2<null>/gc<null>miševi su ozračeni sa 2x150 Rada i rekonstituisani sa 4x105 humanih CD34+ hematopojetskih progenitorskih ćelija putem intrahepatične injekcije. Nakon 12 nedelja, protočnom citometrijom određen je sastav rekonstituisanog humanog imunog sistema u perifernoj krvi. Obično do tri meseca nakon rekonstitucije, između 10%-60% procenata perifernih belih krvnih zrnaca su humani CD45+, od kojih su 40%-70% B ćelije, 15%-40% su T-ćelije, a preostale su male populacije. prirodnih ćelija ubica i dendritičnih ćelija.

[0190] Pet meseci nakon rekonstitucije, miševima je intraperitonealno ubrizgano 10 µg ili 0,1 µg anti-CD3xCD20 bispecifičnog antitela BS3/20-007, 10 µg monovalentnog jednokrakog CD3 antitela (BS3/20-009, videti Tabelu 1) ili 10 µg irelevantne kontrole izotipa hlgG. Jedan, osam i dvadeset pet dana nakon injekcije, miševima je retro-orbitalno uzeta krv, a populacije imunskih ćelija u perifernoj krvi su određene protočnom citometrijom (FACS).

[0191] Za FACS analizu, 100 µl krvi je inkubirano sa 1.5 ml pufera za lizu eritrocita u Ependorfovim epruvetama tri minuta. Ćelije su centrifugirane pet minuta na 0,4kg, isprane 2x sa FACS ispiranjem (PBS+3%FBS), i blokirane 10 minuta na sobnoj temperaturi sa mišjim Fc reagensom za blokiranje. Ćelije su zatim inkubirane 30 minuta na 4°C sa direktno konjugovanim antitelima na CD2, CD3, CD19, CD4, CD8, hCD45, hHLA-DR i mCD45. Posle bojenja, ćelije su isprane dva puta pre uzimanja FACS citometra FACSCanto i analize pomoću softvera FlowJo. Rezultati su prikazani u Tabeli 28.

Tabela 28: Procenat cirkulišućih CD45, CD19 i CD2 pozitivnih ćelija kod miševa rekonstituisanih sa humanim imunskim ćelijama

[0192] Kao što je prikazano u Tabeli 28, pojedinačna doza od 10 µg anti-CD3xCD20 bispecifičnog antitela BS3/20-007 dovela je do nestanka cirkulišućih hCD45+ ćelija kod 2 od 2 lečena miša koji se nisu oporavili tokom trajanja eksperimenta. Jedna doza od 0,1 µg BS3/20-007 smanjila je cirkulišuće hCD45+ ćelije, uključujući CD19+ B-ćelije i CD2+ T-ćelije 24 sata nakon injekcije kod 2 od 3 tretirana miša. Jednom iscrpljen, procenat hCD45+ ćelija se nije značajno oporavio kod miševa koji su reagovali na terapiju sa 0,1 µg BS3/20-007. Međutim, ćelije koje su ostale kod ovih miševa bile su pretežno hCD2+ T-ćelije, a CD19+ B ćelije nisu bile prisutne kod miševa koji su reagovali čak ni 25 dana nakon tretmana. Jedna doza od 10 µg monovalentnog CD3 antitela sa 1 krakom (BS3/20-009) je takođe rezultirala upornim, ali umerenim smanjenjem CD45+ ćelija, naročito CD2+ T-ćelija, kod 2 od 2 lečena miša. Jedna doza od 10 µg irelevantne h!gG1 kontrole nije imala značajan uticaj na procenat cirkulišućih hCD45+, hCD19+ ili hCD2+ ćelija.

Primer 15. Tretman sa CD20 x CD3 bispecifičnim antitelom smanjuje volumen Raji tumora kod NOD/SCID miševa

[0193] Da bi se procenila efikasnost odabranih anti-CD3xCD20 bispecifičnih antitela u smanjenju rasta Raji tumora, NOD/SCID miševima (Taconic) je implantirano subkutanozno mešavina od 2x10<6>Raji tumorskih ćelija i 8x10<6>humanih PBMC. Miševi su tretirani tri puta nedeljno, počevši od dana implantacije tumora, bilo humanim Fc (hFc) ili CD3xCD20 bispecifičnim antitelom (BS3/20-007) u dozi od 1 µg po mišu (N=20 miševa po grupi tretmana). Reagensi su dostavljeni intraperitonealnom (i.p.) injekcijom. Veličina tumora je merena tri puta nedeljno korišćenjem kalipera, a zapremina tumora izračunata je kao zapremina = (dužina x širina<2>)/2. Rezultati su prikazani na slici 1.

[0194] U drugom eksperimentu, NOD/SCID miševima je implantirano subkutanozno mešavina od 2x10<6>Raji tumorskih ćelija i 4x10<6>humanih PBMC. Tretman CD3xCD20 bispecifičnim antitelom (BS3/20-007) ili kontrolnim reagensom (hFc) počeo je 7 dana nakon implantacije tumora kako bi se omogućilo da tumori postanu opipljivi. Miševi su tretirani dva puta nedeljno dozom od 1 µg po mišu (N=6 miševa po grupi tretmana). Reagensi su ubrizgani subkutanozno, dalje od mesta implantacije tumora. Veličina tumora je merena dva puta nedeljno korišćenjem kalipera, a zapremina tumora izračunata je kao zapremina = (dužina x širina<2>)/2. Rezultati su prikazani na slici 2.

[0195] Ovaj primer pokazuje da je tretman sa CD3xCD20 bispecifičnim antitelom BS3/20-007 bio efikasan u inhibiciji rasta tumora i u vreme implantacije tumora i kada su tumori uspostavljeni. Volumen tumora kod miševa je smanjen 25 dana nakon implantacije u obe studije, u odnosu na kontrolu.

Primer 16. CD20 x CD3 bispecifična antitela iscrpljuju populaciju B-ćelija kod majmuna Cinomolgus i imaju farmakokinetički profil tipičan za monoklonalna antitela

[0196] Pilot ne-GLP toksikološka i farmakološka studija je sprovedena na cinomolgus majmunima (Macaca fascicularis) da bi se utvrdila sposobnost CD3xCD20 bispecifičnih antitela da iscrpe populaciju B-ćelija kod ovih životinja. Muške životinje su organizovane u tri kohorte. Kohorta 1 je primila bispecifično antitelo BS3/20-001 i uključivala je tri različite grupe za doziranje (0,01, 0,10 i 1,00 mg/kg) sa 3-4 životinje po grupi za doziranje. Kohorta 2 je bila kohorta od dve životinje koja je primila nisku dozu anti-CD20 kontrolnog antitela (kontrola V; 0,01 mg/kg). Kohorta 3 je bila kohorta od četiri životinje koja je primila visoku dozu anti-CD20 kontrolnog antitela (Kontrola III; 1,0 mg/kg). Krv je uzeta na dan -7 i neposredno pre doziranja da bi se utvrdili osnovni nivoi za band T ćelije kod ovih životinja. Doze leka od 0,01, 0,10 ili 1,00 mg/kg davane su i.v. infuzija i krv su uzete 5 minuta, 5 sati i 1, 4, 7 i 14 dana nakon doziranja. Posle 14. dana nakon doze, krv je vađena svake dve nedelje do završetka studije. Uzorci krvi su analizirani pomoću FACS za markere Band T ćelija i određen je apsolutni broj ovih tipova ćelija. Uzorci seruma su takođe analizirani na nivoe citokina (IFNγ, IL-2, IL-6 i TNFα) korišćenjem standardnih analitičkih metoda. Rezultati su prikazani na Slici 3 (B-ćelije), Slici 4 (T-ćelije) i Slikama 5A-5D (citokini).

[0197] Kao što je prikazano u ovom primeru, primena CD3xCD20 bispecifičnog antitela je dovela do iscrpljivanja cirkulišućih B-ćelija na osnovne nivoe do prve merene vremenske tačke (1. dan). Ovo iscrpljivanje nije primećeno u kohorti kontrolnih životinja. Smanjenje B-ćelija u bispecifičnoj kohorti je održano do dve nedelje nakon doziranja, a u kohortama doze od 0,01 i 0,10 mg/kg praćeno je postepenim oporavkom nivoa B-ćelija sve dok eksperiment nije završen oko 11 nedelja nakon doziranja. U kohorti od 1,0 mg/kg, međutim, nije primećen oporavak nivoa B-ćelija tokom trajanja eksperimenta (11 nedelja). Nivoi T-ćelija su takođe praćeni u ovom eksperimentu. Prolazni gubitak cirkulišućih T-ćelija primećen je prvog dana nakon doze u bispecifičnim kohortama. Nivoi T-ćelija su se vratili na početne nivoe u ovim kohortama do vremenske tačke 4. dana i zadržali se na tim osnovnim nivoima do kraja eksperimenta. Pored toga, nivoi citokina u serumu za BS3/20-001 na 5 sati su pokazali odgovor zavisan od doze i vremena koji je u skladu sa aktivacijom T-ćelija (videti slike 5A-5D).

[0198] Nivoi ekspresije gena u perifernoj krvi su takođe analizirani tokom ovog eksperimenta. Uzorci krvi su dobijeni od životinja u dve vremenske tačke pre doze (7. dan pre doze i neposredno pre doze) i 5, 24, 72, 96 i 168 sati nakon doziranja. RNK je izolovana iz ovih uzoraka i analizirana mikročipom. U poređenju sa nivoima pre doze i nivoima ekspresije gena iz kontrolne grupe, primećeno je značajno smanjenje genske ekspresije markera B-ćelija kod životinja tretiranih bispecifičnim antitelom; ovaj efekat je bio sličan efektu primećenom u uzorcima dobijenim od životinja tretiranih sa 1,0 mg/kg Kontrola III (anti-CD20 antitelo koje odgovara rituksimabu). Uočena promena u ekspresiji markera B-ćelija odgovara gubitku B-ćelija otkrivenih u krvi tretiranih životinja. Ekspresija gena markera T-ćelija u uzorcima životinja tretiranih CD3xCD20 bispecifičnim antitelom pokazala je početno smanjenje praćeno povratkom na normalne nivoe do vremenske tačke od 24 sata. Pored toga, geni povezani sa inflamatornim odgovorom pokazali su početnu regulaciju kod životinja u bispecifičnoj kohorti, ali su se vratili na normalne ili ispod normalne nivoe nakon 24 sata. Konačno, ispitivanje sirovog intenziteta signala ekspresije CD20 gena sugeriše da veće iscrpljivanje B-ćelija proizilazi iz tretmana životinja sa CD3xCD20 bispecifičnim antitelom nego sa kontrolnim anti-CD20 antitelima. (Pogledajte sliku 6 i tabelu 29).

Tabela 29. Nivoi ekspresije gena CD20 u danu 7

(nastavak)

[0199] Kao što je prikazano u Tabeli 29, nekoliko dana posle doziranja neobrađen intenzitet CD20 signala je ostao u pozadinskim nivoima u svim osim jednog od CD3xCD20 životinja dok su 3 od 4 životinje tretirane sa 1 mg/kg Kontrole III pokazale ili marginalne ili detektabilne nivoe CD20 signala.

[0200] U istom eksperimentu farmakokinetički profil bispecifičnog antitela (Slika 7) je procenjen uzimanjem uzoraka krvi pre doze i 0,083, 5, 24, 48, 72, 168, 336, 504 i 840 h. Dobijeni uzorci seruma su analizirani direktnim enzimski povezanim imunosorbentnim testom (ELISA) da bi se odredila koncentracija ukupnog bispecifičnog antitela. Podaci o ukupnoj bispecifičnoj koncentraciji u serumu (BS3/20-001) analizirani su ne-kompartmentalnom analizom (Phoenix WinNonLin) da bi se odredili farmakokinetički parametri. Rezultati su prikazani u Tabeli 30 (AUC = površina ispod krive u odnosu na vreme; Cmax= maksimalna koncentracija jedinjenja posmatranog u matrici od interesa).

Tabela 30: Farmakokinetički parametri BS3/20-001 u cynomolgus majmunu

[0201] Nakon pojedinačne intravenske doze od 0,01, 0,10 ili 1,0 mg/kg BS3/20-001 kod cinomolgus majmuna, uočene su srednji maksimumi koncentracije (Cmax) od 0,261, 2,32 i 33,4 µg/mL, tim redom, u trenutku prvog uzorkovanja (0,083 h). Srednje vrednosti AUCallod 4,42, 289 i 4940 µg*hr/mL primećene su pri dozama od 0,01, 0,1 i 1,0 mg/kg. Vrednosti AUC normalizovane doze (AUCall/Dozi) od 442, 2890 i 4940 µg*hr/mL po mg/kg pokazuju da se izloženost plazmi (AUCall) povećava sa povećanjem doze na nelinearan način. Uočeno je veće nego proporcionalno povećanje izloženosti leku u plazmi sa povećanom dozom antitela, što sugeriše da BS3/20-001 možda prolazi kroz ciljno posredovanje klirensa. Ukupni farmakokinetički profil BS3/20-001 je uobičajen za monoklonska antitela dozirana kod cinomolgus majmuna.

Claims

Patentni zahtevi 1. Bispecifični molekul za vezivanje antigena koji obuhvata prvi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani CD3, i drugi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani CD20, gde prvi domen za vezivanje antigena obuhvata varjabilni region teškog lanca (HCVR) koji sadrži regione koji određuju komplementarnost A1-HCDR1, A1-HCDR2 i A1-HCDR3, i varjabilni region lakog lanca (LCVR) koji sadrži regione koje određuju komplementarnost A1-LCDR1, A1-LCDR2 i A1-LCDR3, gde regioni koji određuju komplementarnost se nalaze u okviru para HCVR/LCVR koji čine aminokiselinske sekvence izabrane iz SEQ ID NOs: 1250/1258, 1266/1274 ili 1282/1290, gde bispecifični molekul za vezivanje antigena izaziva proliferaciju mononukleranih ćelija periferne krvi čoveka i cinomolgusa in vitro.
2. Bispecifični molekul koji vezuje antigen prema zahtevu 1, gde drugi domen za vezivanje antigena koji specifično vezuje humani CD20 obuhvata HCVR koji čine regioni koji određuju komplementarnost A2-HCDR1, A2-HCDR2 i A2-HCDR3 koji se nalaze u okviru HCVR koji sadrži SEQ ID NO:1242, i LCVR koji čine regioni koji određuju komplementarnost A2-LCDR1, A2-LCDR2 i A2-LCDR3 koji se nalaze u okviru LCVR koji sadrži aminokiselinska sekvence SEQ ID NO: 1258, 1274 ili 1290.
3. Bispecifični molekul za vezivanje antigena prema zahtevu 2, gde: A1-HCDR1, A1-HCDR2 i A1-HCDR3 sadrže aminokiselinske sekvence, tim redom, SEQ ID NOs: 1268, 1270 i 1272; A1-LCDR1, A1-LCDR2 i A1-LCDR3 sadrže aminokiselinske sekvence, tim redom, SEQ ID NOs: 1276, 1278 i 1280; A2-HCDR1, A2-HCDR2 i A2-HCDR3 sadrže aminokiselinske sekvence, tim redom, SEQ ID NOs: 1244, 1246 i 1248; i A2-LCDR1, A2-LCDR2 i A2-LCDR3 sadrže aminokiselinske sekvence, tim redom, SEQ ID NOs: 1276, 1278 i 1280.
4. Bispecifični molekul za vezivanje antigena prema zahtevu 2, gde: A1-HCDR1, A1-HCDR2 i A1-HCDR3 sadrže aminokiselinske sekvence, tim redom, SEQ ID NOs: 1284, 1286 i 1288; A1-LCDR1, A1-LCDR2 i A1-LCDR3 sadrže aminokiselinske sekvence, tim redom, SEQ ID NOs: 1292, 1294 i 1296; A2-HCDR1, A2-HCDR2 i A2-HCDR3 sadrže aminokiselinske sekvence, tim redom, SEQ ID NOs: 1244, 1246 i 1248; i A2-LCDR1, A2-LCDR2 i A2-LCDR3 sadrže aminokiselinske sekvence, tim redom, SEQ ID NOs: 1292, 1294 i 1296.
5. Bispecifični molekul za vezivanje antigena prema zahtevu 2, gde prvi domen za vezivanje antigena obuhvata varjabilni region teškog lanca (HCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1250, i varjabilni region teškog lanca (LCVR) koji sadrži aminokiselinu sekvencu SEQ ID NO:1258; i gde drugi domen za vezivanje antigena obuhvata HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1242, i LCVR sadrži aminokiselinu sekvencu SEQ ID NO:1258.
6. Bispecifični molekul za vezivanje antigena prema zahtevu 2, gde prvi domen za vezivanje antigena obuhvata varjabilni region teškog lanca (HCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1266, i varjabilni region lakog lanca (LCVR) koji sadrži aminokiselinu sekvencu SEQ ID NO:1274; i gde drugi domen za vezivanje antigena obuhvata HCVR koji sadrži aminokiselinu sekvencu SEQ ID NO:1242, i LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1274.
7. Bispecifični molekul za vezivanje antigena prema zahtevu 2, gde prvi domen koji vezuje antigen obuhvata varjabilni region teškog lanca (HCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1282, i varjabilni region lakog lanca (LCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1290; i gde drugi domen za vezivanje antigena obuhvata HCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1242, i LCVR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1290.
8. Bispecifični molekul za vezivanje antigena prema bilo kom od zahteva 1 do 7 koji je bispecifično antitelo.
9. Bispecifični molekul za vezivanje antigena prema zahtevu 8 koji obuhvata konstantni region teškog lanca izotipa IgG1 ili IgG4.
10. Farmaceutska kompozicija koja sadrži bispecifični molekul za vezivanje antigena prema bilo kom od zahteva 1 do 9 i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.
11. Bispecifični molekul za vezivanje antigena prema bilo kom od zahteva 1 do 9, ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 10, za upotrebu u lečenju kancera B-ćelija subjekta.
12. Bispecifični molekul za vezivanje antigena ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 11, gde kancer B-ćelija je izabran iz grupe koju čine: folikularni limfom, B ćelijska hronična limfocitna leukemija. B ćelijski limfoblasni limfom, Hodžkinov limfom, ne-Hodžkinov limfom, difuzni limfom velikih B ćelija, limfom marginalne zone, limfom mantle ćelija, leukemija dlakastih ćelija i Burkitov limfom.
13. Bispecifični molekul za vezivanje antigena ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 11 ili zahtevu 12, pr čemu je subjekat pogođen tumorom koji je rezistentan na, ili nepotpuno reaguje na samu anti-CD20 monospecifičnu terapiju.
14. Bispecifični molekul za vezivanje antigena ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 11 do 13, gde je subjekat primio terapiju anti-CD20 monospecifičnog antitela bar 1 dan do 1 godine pre davanja bispecifičnog molekula za vezivanje antigena ili farmaceutske kompozicije.
15. Bispecifični molekul za vezivanje antigena ili farmaceutska kompozcija za upotrebu prema zahtevu 14, gde anti-CD20 monospecifična terapija sadrži ili se sastoji od anti-CD20 mono-specifičnih antitela.
16. Bispecifični molekul za vezivanje antigena ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 15, gde je anti-CD20 mono-specifično antitelo rituksimab.

<223> Synthetic 79 <400> 2

<210> 6 80 <211> 8

<211> 107 <212> PRT 81 <213> Artificial Sequence

<400> 13 82 ggtgcatcc 9

agtggctacg gctattacta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360 accgtctcct ca 372 83

<211> 24 <212> DNA 84 <213> Artificial Sequence

<223> Synthetic 85 <400> 25

Gln Ser Val Ser Ser Asn

<213> Artificial Sequence 87 <220>

<213> Artificial Sequence

1 5 10 15

cagagcatta gcagctat 18 90 <210> 44

<220> <223> Synthetic 91

<213> Artificial Sequence 92 <220>

<210> 56 93 <211> 17

94 <210> 59

<220> <223> Synthetic 95

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 96 Ala Lys Asp Met Ser Gly Tyr Ala His Tyr Phe Tyr Tyr Gly Met Asp

<210> 71 97 <211> 51

20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 98 Leu Leu Ile 35 40 45

<400> 78 99 Ala Ala Ser

<400> 82 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 10 P0ro Gly Arg 1 5 10 15

<211> 8 <212> PRT 101 <213> Artificial Sequence

<211> 108 <212> PRT 102 <213> Artificial Sequence

<400> 93 103 gctgcatcc 9

gggcatgact atggtggtac ctttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360 tca 363 104

<211> 24 <212> DNA 105 <213> Artificial Sequence

<400> 105 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtagg 1a0g6a cagagtcacc 60 atcacttgcc aggcgagtca ggacattaac aactatttaa attggtatca gcagaaacca 120

107 <210> 109

<220> <223> Synthetic 108

<220> <223> Synthetic 109

<210> 121 110 <211> 321

<212> PRT <213> Artificial Sequence 111

Gln His Tyr Ile Asn Trp Pro Leu Thr

<400> 131 113 ggattcacct ttgatgatta tacc 24

<213> Artificial Sequence 114 <220>

<220> 115 <223> Synthetic

<210> 144 <211> 9 116 <212> PRT

<210> 147 117 <211> 24

<223> Synthetic 118 <400> 151

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Asn 20 25 30 119 Leu Ala Trp Tyr Gln Xaa Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

<223> Synthetic 120 <400> 158

<400> 162 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 12 P1ro Gly Arg 1 5 10 15

<211> 8 <212> PRT 122 <213> Artificial Sequence

<213> Artificial Sequence 123 <220>

ggtgcatcc 9 124 <210> 174

<210> 178 <211> 118 125 <212> PRT

<220> 126 <223> Synthetic

ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccggcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatca 1g2c7ag cctgcagtct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tataataact ggcctctcac tttcggcgga 300

<211> 9 <212> DNA 128 <213> Artificial Sequence

<400> 193 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctggg 12a9ggtc cctgagactc 60 tcctgtattg cgtctggatt taccttcaga agttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120

Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr Gly

<213> Artificial Sequence 131 <220>

<223> Synthetic 132 <400> 204

<210> 209 <211> 354 133 <212> DNA

<211> 8 <212> PRT 134 <213> Artificial Sequence

<400> 216 Ala Arg Gly Pro Gly Tyr Asn Trp Leu Asp Pro 135 1 5 10

cagagtatta gcaggaac 18 136 <210> 220

<220> <223> Synthetic 137

<220> 138 <223> Synthetic

<210> 232 <211> 11 139 <212> PRT

50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 14 L0eu Gln Ser 65 70 75 80

141 <210> 239

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 142 Ala Met Ile Tyr Phe Asp Gly Lys Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

<223> Synthetic 143 <400> 246

<400> 250 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val 1 S44er Pro Gly 1 5 10 15

<213> Artificial Sequence 145 <220>

<220> <223> Synthetic 146

atatattttg atggaaaaaa taaa 24 147 <210> 262

<210> 266 <211> 107 148 <212> PRT

<223> Synthetic 149 <400> 269

ctgcaaatga acagtctgag agccgaagac acggctatgt atttctgtgc gcgagggcct 300 gggtacaact ggctcgaccc ctggggccag ggaaccctgg tcac 1t5g0tctc ctca 354

<211> 24 <212> DNA 151 <213> Artificial Sequence

<400> 281 gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagg 15g2ga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagaattagc agcaacttgg cctggtacca gcaaaaacct 120

153 <210> 285

<220> <223> Synthetic 154

<223> Synthetic 155 <400> 292

<210> 297 <211> 321 156 <212> DNA

<213> Artificial Sequence 157 <220>

1 5

ggtttcacct tcagaagttt tggc 24 159 <210> 308

<220> <223> Synthetic 160

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Glu Ile Lys 100 105 161

<213> Artificial Sequence 162 <220>

65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala V 1a63l Tyr Phe Cys 85 90 95

164 <210> 327

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 165 Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

<400> 334 Gly Ala Ser 166 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 167 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

<212> PRT <213> Artificial Sequence 168

<212> PRT <213> Artificial Sequence 169

<400> 349 ggtgcatcc 9 170

gtctcctca 369 171 <210> 354

<212> DNA <213> Artificial Sequence 172

gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaata 1a7g3aa ctacttagct 120 tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180

1 5 10

<220> 175 <223> Synthetic

<220> 176 <223> Synthetic

177 <210> 377

<211> 6 <212> PRT 178 <213> Artificial Sequence

<400> 384 Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr 179 1 5

<220> 180 <223> Synthetic

<210> 392 <211> 11 181 <212> PRT

<211> 18 <212> DNA 182 <213> Artificial Sequence

<400> 399 caacaatata gtaactggcc tctcact 18237

Leu Val Thr Val Ser Ser

<213> Artificial Sequence 185 <220>

65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Phe Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn A 1s86n Arg Pro Leu 85 90 95

<210> 415 <211> 27 187 <212> DNA

Ala Met Ile Tyr Phe Asp Gly Lys Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 188 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

<400> 422 Ile Tyr Phe Asp Gly Lys Asn Lys 189 1 5

1 5 10 15 Glu Arg Val Ile Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile 1 S9e0r Arg Asn 20 25 30

<220> <223> Synthetic 191

<400> 434 192 Gln Val His Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

<210> 438 <211> 8 193 <212> PRT

<212> PRT <213> Artificial Sequence 194

<400> 445 gctgcatcc 9 195

accgtctcct ca 372 196 <210> 450

<212> DNA <213> Artificial Sequence 197

<400> 457 198 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

1 5

<220> 200 <223> Synthetic

<220> 201 <223> Synthetic

Val

<210> 476 203 <211> 6

<223> Synthetic 204 <400> 480

<220> 205 <223> Synthetic

<210> 488 <211> 16 206 <212> PRT

<211> 18 <212> DNA 207 <213> Artificial Sequence

<400> 495 caacagagct acagtaaccc tccgatcacc 208 30

100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Ile Val Ser Ser 209 115 120

<212> DNA <213> Artificial Sequence 210

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 211 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro

<210> 511 212

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 213 Ser Asp Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

<223> Synthetic 214 <400> 518

<223> Synthetic 215 <400> 522

<211> 3 <212> PRT 216 <213> Artificial Sequence

<212> PRT <213> Artificial Sequence 217

<223> Synthetic 218 <400> 533

gggaaagccc ctaaactcct gatctatgct gcttccagtt tgcaaagtgg ggtcccgtca 180 aggttcagtg gcagtggttc tgggacagat ttcactctca ccatcag 2c1a9g tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctctcaacag agttacagtt tcccgtggac gttcggccaa 300

<211> 9 <212> DNA 220 <213> Artificial Sequence

<400> 545 caggtgcagc tggtggagtc ggggggaggc gtggtccagc ctgg 2g21aggtc cctgagaccc 60 tcctgtgcag cgtctggatt tagtttcagg gactatggca tgcactgggt ccgccaggct 120

<400> 548 Gly Phe Ser Phe Arg Asp Tyr Gly 222 1 5

<212> DNA <213> Artificial Sequence 223

<220> <223> Synthetic 224

<210> 561 225 <211> 384

<210> 564 226 <211> 8

<223> Synthetic 227 <400> 568

<400> 571 228 caggggatta gcagctgg 18

<213> Artificial Sequence 229 <220>

<211> 24 <212> DNA 230 <213> Artificial Sequence

<400> 583 gtaaaagata atagtggcta cgcatcctac tactacggta tggacg 2t3c1 48

232 <210> 587

<220> <223> Synthetic 233

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 234 Ala Lys Gly Pro Met Phe Arg Gly Val Pro Tyr Asn His Tyr Tyr Gly

<210> 599 235 <211> 57

20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 23 A6rg Leu Ile 35 40 45

<400> 606 237 Ala Ala Ser

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 238 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Pro Phe Ser Arg Tyr

<212> PRT <213> Artificial Sequence 239

<220> 240 <223> Synthetic

<210> 622 241 <211> 3

<210> 626 <211> 126 242 <212> PRT

<220> 243 <223> Synthetic

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggt 2a4t4ca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagcgcct aatctatgct gcatccattt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

<210> 637 245 <211> 9

<223> Synthetic 246 <400> 641

<223> Synthetic 247 <400> 644

248 <210> 649

<211> 6 <212> PRT 249 <213> Artificial Sequence

<400> 656 Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr 250 1 5

<223> Synthetic 251 <400> 659

<212> PRT <213> Artificial Sequence 252

<211> 18 <212> DNA 253 <213> Artificial Sequence

<400> 671 ctacagcata atagttaccc gtacact 25247

100 105 110 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 25 S5er 115 120 125

<212> DNA <213> Artificial Sequence 256

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 257 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

1

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe 20 25 30 259 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

<220> 260 <223> Synthetic

<220> 261 <223> Synthetic

<210> 702 262 <211> 3

<210> 706 <211> 123 263 <212> PRT

<220> 264 <223> Synthetic

cctggccagg ctcccaggct cctcatccat ggtgcgtcca ccagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtcagggaca gacttcactc tcacc 2a6t5cag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagttta ttactgtcag cagcgtgctc actcaccgta cacttttggc 300

<211> 9 <212> DNA 266 <213> Artificial Sequence

<400> 721 gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggc 2a67ggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggctt cagctttgat aattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120

<400> 724 Gly Phe Ser Phe Asp Asn Tyr Ala 268 1 5

<212> DNA <213> Artificial Sequence 269

<220> <223> Synthetic 270

<210> 737 271 <211> 369

<210> 740 272 <211> 8

<223> Synthetic 273 <400> 744

<400> 747 274 cagagtatta gaaacatcta t 21

<213> Artificial Sequence 275 <220>

<211> 24 <212> DNA 276 <213> Artificial Sequence

<400> 759 gcaaaagata agagtggcta cggctcctac tactacggta tggac 2g77tc 48

278 <210> 763

<220> <223> Synthetic 279

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 280 Val Lys Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Arg Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val

<210> 775 281 <211> 48

35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg 2 P82he Ser Gly 50 55 60

Gly Ala Ser

1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr P 2h8e4 Asp Asp Tyr 20 25 30

<213> Artificial Sequence 285 <220>

<220> <223> Synthetic 286

<210> 798 <211> 3 287 <212> PRT

<211> 123 <212> PRT 288 <213> Artificial Sequence

<220> <223> Synthetic 289

gacaggttca gtggcagtgg gtcggggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcacttta ttactgtcac cagcgtgtta gttcaccgta 29 c0acttttggc 300 caggggacca agctggagat caaa 324

<212> DNA <213> Artificial Sequence 291

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactggg 2t92 ccggcaagct 120 ccaggaaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atagtggtag taaagactat 180

Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala

<213> Artificial Sequence 294 <220>

<223> Synthetic 295 <400> 828

<210> 833 <211> 372 296 <212> DNA

<210> 836 <211> 8 297 <212> PRT

<400> 840 298 Ala Lys Glu Gly Gly Thr Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp

<220> 299 <223> Synthetic

<210> 848 <211> 9 300 <212> PRT

<210> 851 301 <211> 24

<223> Synthetic 302 <400> 855

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 303

<213> Artificial Sequence 304 <220>

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 305 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Phe Tyr Cys

1 5

20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 30 L7eu Leu Ile 35 40 45

<400> 878 308 Gly Ala Ser

<400> 882 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 30 P9ro Gly Arg 1 5 10 15

<210> 886 310 <211> 8

gggaccaagg tggagatcaa acga 324 311 <210> 890

<220> 312 <223> Synthetic

cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg attaacccta aaagtggtgt cacaaattat 180 gcacagaagt ttcaggacag agtcgccatg accagggaca cgtc 3c13atcag cacagcctac 240 atggaactga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagaatgggg 300

<210> 901 314 <211> 24

<223> Synthetic 315 <400> 905

Gln Arg Ile Ser Ser Phe

<213> Artificial Sequence 317 <220>

<213> Artificial Sequence 318 <220>

1 5 10 15

cagaggatta gcagcttt 18 320 <210> 924

<220> <223> Synthetic 321

<220> 322 <223> Synthetic

<210> 936 <211> 11 323 <212> PRT

<211> 18 <212> DNA 324 <213> Artificial Sequence

<400> 943 caacagagtt acaatacccc gctcact 32527

Leu Val Thr Val Ser Ser

<213> Artificial Sequence 327 <220>

65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ar 3g28 Thr Pro Leu 85 90 95

<210> 959 <211> 27 329 <212> DNA

Gly Trp Ile Asn Pro Lys Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 330 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

<400> 966 Ile Asn Pro Lys Ser Gly Gly Thr 331 1 5

1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile S 33e2r Ser Tyr 20 25 30

<220> <223> Synthetic 333

<400> 978 334 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

<210> 982 <211> 8 335 <212> PRT

<212> PRT <213> Artificial Sequence 336

<400> 989 gttgcatcc 9 337

accacggtca ccgtctcctc a 381 338 <210> 994

<212> DNA <213> Artificial Sequence 339

<223> Synthetic 340 <400> 1001

Gln Arg Ile Ser Ser Tyr

<213> Artificial Sequence 342 <220>

<220> 343 <223> Synthetic

344 <210> 1017

<211> 6 <212> PRT 345 <213> Artificial Sequence

<400> 1024 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr 346 1 5

<223> Synthetic 347 <400> 1027

<212> PRT <213> Artificial Sequence 348

<211> 18 <212> DNA 349 <213> Artificial Sequence

<400> 1039 caacagagtt acaatacccc gctcact 35027

100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 351 115 120

<212> DNA <213> Artificial Sequence 352

35 40 45 Ser Asp Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Ala Tyr Ala A 35s3p Ser Val 50 55 60

<400> 1054 354 Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile

<223> Synthetic 355 <400> 1058

<210> 1062 356 <211> 8

accgtctcct ca 372 357 <210> 1066

<212> DNA <213> Artificial Sequence 358

<400> 1073 359 gaggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60

<400> 1076 360 Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr Thr

<210> 1081 361 <211> 372

<210> 1084 362 <211> 8

<223> Synthetic 363 <400> 1088

<212> DNA <213> Artificial Sequence 364

gcaaaagata aaagtggcta cggccacttc tactactacg ctatggacgt c 51 365 <210> 1096

Ala Lys Asp Gly Ser Gly Tyr Gly Arg Phe His Phe Tyr Ala Ile Asp 100 105 110 366 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

<211> 51 <212> DNA 367 <213> Artificial Sequence

Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 368 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Lys Asp Tyr Ala Asp Ser Val

<223> Synthetic 369 <400> 1110

<220> <223> Synthetic 370

attagttgga atagtggtag catg 24 371 <210> 1118

agtggctacg ggaaatacca cttctacgct atggacgtct ggggccaagg gaccctggtc 360 accgtctcct ca 372 372

<211> 24 <212> DNA 373 <213> Artificial Sequence

<223> Synthetic 374 <400> 1129

<223> Synthetic 375 <400> 1132

376 <210> 1137

ggattcacct ttgctgatta tacc 24 377 <210> 1140

<220> <223> Synthetic 378

<211> 24 <212> DNA 379 <213> Artificial Sequence

<400> 1151 gtaaaggata aaagtggcta cgggaaattc caatacggtt tggac 3g8t0c 48

100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 381 115 120

<212> DNA <213> Artificial Sequence 382

50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys As 3n83 Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Ile Gly Trp Asn Ser Asn Thr Lys

1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr P 3h8e5 Ala Asp Tyr 20 25 30

<213> Artificial Sequence 386 <220>

<220> 387 <223> Synthetic

<400> 1181 attggttgga atagtaacac tata 23488

gtctcctca 369 389 <210> 1186

<212> DNA <213> Artificial Sequence 390

caggtgcaac tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caagtttgat gattatacca tgcactggg 39t1 ccggcaaggt 120 ccagggaagg gcctggagtg ggtctcagac attagttgga gtggtggtag catagactat 180

Gly Phe Lys Phe Asp Asp Tyr Thr

<213> Artificial Sequence 393 <220>

<220> 394 <223> Synthetic

395 <210> 1209

gggtttacat tcgacgatta cagc 24 396 <210> 1212

<220> <223> Synthetic 397

<211> 24 <212> DNA 398 <213> Artificial Sequence

<400> 1223 gccaaagatg ggtctggtta cggttatttt tactactatg gaatggac 3g9t9 t 51

85 90 95 Ala Lys Asp Gly Ser Gly Tyr Gly Lys Phe Tyr Tyr Ty 4r0 G0ly Met Asp 100 105 110

<210> 1231 <211> 51 401 <212> DNA

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 402 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

<400> 1238 Ala Ala Ser 403 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 404 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr

<212> PRT <213> Artificial Sequence 405

<210> 1250 <211> 123 406 <212> PRT

<220> 407 <223> Synthetic

ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatca 4g0c8ag cctgcagtct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcac tatattaact ggcctctcac tttcggcgga 300

<211> 9 <212> DNA 409 <213> Artificial Sequence

<400> 1265 gaagtgcaac tggtggagtc tgggggaggc ttagtacagc ctggc 4g10ggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag ccactggatt cacctttgat gattttacca tgcactgggt ccggcaagct 120

<400> 1268 Gly Phe Thr Phe Asp Asp Phe Thr 411 1 5

<212> DNA <213> Artificial Sequence 412

<220> <223> Synthetic 413

<210> 1281 414 <211> 369

<210> 1284 415 <211> 8

<223> Synthetic 416 <400> 1288

<400> 1291 417 cagagtgtta gcagcaac 18

<213> Artificial Sequence 418 <220>

<212> DNA <213> Artificial Sequence 419

gcgcgagggc ctgggtacaa ctggctcgac ccc 33 420 <210> 1304

<210> 1307 421 <211> 18

<223> Synthetic 422 <400> 1311

Ala Arg Gly Pro Gly Tyr Asn Trp Leu Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 423 Leu Val Thr Val Ser Ser

<211> 33 <212> DNA 424 <213> Artificial Sequence

50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Se 4r2 L5eu Gln Ser 65 70 75 80

426 <210> 1327

<212> PRT <213> Artificial Sequence 427

65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser As 4n28 Pro Leu Thr 85 90 95

gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttttat gattatgcca tgcactggg 4t2 c9cggcaagct 120 ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagctgga atagtgatac cataggctat 180

Gly Phe Thr Phe Tyr Asp Tyr Ala

<213> Artificial Sequence 431 <220>

<223> Synthetic 432 <400> 1348

<210> 1353 <211> 379 433 <212> DNA

<210> 1356 <211> 8 434 <212> PRT

<400> 1360 435 Ala Lys Asp Pro Ser Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr His Ser Tyr Tyr Gly

<223> Synthetic 436 <400> 1363

<212> PRT <213> Artificial Sequence 437

275 280 285 Ser Pro Ile Glu Asn Asp Ser Ser Pro 438 290 295

<220> 439 <223> hFc-delta-Adp

65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 44 L0eu Asn Gly 85 90 95

180 185 190 Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Gl 4u41 Arg Asn Ser 195 200 205

Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Kneginje Ljubice 5, 11000 Beograd