ES2968957T3 - 2,3,5-trimetil-6-nonilciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona para la supresión y el tratamiento de alfa-sinucleinopatías, taupatías y otros trastornos - Google Patents

Abstract

En el presente documento se describen métodos para tratar o suprimir un trastorno seleccionado del grupo que consiste en α-sinucleinopatías, tauopatías, ELA, lesión cerebral traumática y lesiones relacionadas con la reperfusión isquémica. un compuesto de fórmula: o su forma hidroquinona; o un solvato o hidrato del mismo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

2,3,5-trimetil-6-nonilcidohexa-2,5-dieno-1,4-diona para la supresión y el tratamiento de alfa-sinucleinopatías, taupatías y otros trastornos

ANTECEDENTES

[0001] En la publicación de EE. UU. n.° 2007/0072943 se describen ciertos compuestos de quinona y métodos para tratar ciertos trastornos mitocondriales. En la publicación de EE. UU. n.° 2010/0063161 se describe el compuesto 2,3,5-trimetil-6-nonilciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona y métodos para tratar trastornos generalizados del desarrollo y el trastorno por déficit de atención e hiperactividad (TDAH).

En el documento WO 2012/170773 se describe una terapia complementaria para el tratamiento de trastornos mitocondriales que comprende la administración de una o más quinonas o sus hidroquinonas en forma reducida y una o más naftoquinonas o sus naftohidroquinonas en forma reducida a un paciente que lo necesita.

En el documento WO 2018/191732 se describen compuestos, composiciones y métodos para el tratamiento o la profilaxis contra la inflamación y/o el estrés oxidativo.

[0002] Lo que se necesita son métodos mejorados para tratar o suprimir ciertos trastornos, incluidas las asinucleinopatías, las taupatías, la ELA, las lesiones cerebrales traumáticas y el daño por isquemia y reperfusión. Lo que se necesita además son compuestos que tengan una penetración cerebral superior y/o un reparto preferencial en el cerebro frente a otras áreas del cuerpo (como el plasma).

[0003] Además, lo que se necesita es un polimorfo estable de la 2,3,5-trimetil-6-nonilciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona y partículas de este que puedan usarse en composiciones farmacéuticas; la fabricación de composiciones farmacéuticas; y en métodos para tratar o suprimir trastornos, incluyendo para tratar o suprimir asinucleinopatías, taupatías, ELA, lesión cerebral traumática y daño por isquemia y reperfusión.

RESUMEN

[0004] En un aspecto de la invención, se trata de un compuesto que es una quinona con la fórmula:

o que es la forma hidroquinona de esta;

para usar en el tratamiento o supresión de un trastorno en un sujeto que lo necesite, donde dicho uso comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto, en donde el trastorno es esclerosis lateral amiotrófica (ELA), y en donde el compuesto no es un solvato o un hidrato.

[0005] En otro aspecto de la invención, el compuesto para usar es un polimorfo de la quinona con la fórmula

donde un patrón de difracción de rayos X en polvo para el polimorfo comprende picos característicos al menos en las siguientes posiciones angulares, donde las posiciones angulares pueden variar en ± 0,2: 4,10, 12,12 y 16,14; y donde las posiciones angulares se obtienen con una fuente de Cu Ka1 y una longitud de onda de 1,540598 A.

[0006] En otro aspecto de la invención, el compuesto para usar es un polimorfo de la quinona con la fórmula

que posee un termograma DSC con un único pico endotérmico entre aproximadamente 47 y aproximadamente 53 °C.

[0007] En otro aspecto de la invención, se trata de una composición que comprende el polimorfo para el uso mencionado anteriormente, en donde el polimorfo está presente como una pluralidad de partículas, en donde las partículas tienen una proporción de D90:D10 menor que aproximadamente 11:1.

[0008] En otro aspecto de la invención hay una composición que comprende el polimorfo para el uso mencionado anteriormente, en la que al menos aproximadamente el 95 % en mol del

de la composición es el polimorfo, excluyendo cualquier disolvente, vehículo o excipiente.

[0009] En otro aspecto de la invención, se trata de una composición farmacéutica que comprende (i) el polimorfo para el uso o la composición para el uso mencionado/a anteriormente, en donde la composición farmacéutica comprende además un disolvente, sustancia inerte o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Las formas de realización preferidas de la invención se exponen en el conjunto de reivindicaciones adjunto.

[0010] Uno cualquiera o más de los compuestos descritos en el presente documento, incluidos todos los compuestos anteriores, se pueden usar en una composición que comprende una sustancia inerte aceptable desde el punto de vista farmacéutico, un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico o un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico. En algunas formas de realización, la composición se formula para uso interno. Uno cualquiera o más de los compuestos descritos en el presente documento, incluidos todos los compuestos anteriores, se pueden formular en una formulación de dosis unitaria.

[0011] Para todos los compuestos, composiciones, formulaciones y usos descritos en el presente documento, cualquier compuesto en forma quinona también se puede utilizar en su forma reducida (hidroquinona) cuando se desee. Es decir, los compuestos mencionados en el presente documento como compuestos de ciclohexadienodiona (quinona oxidada) también se pueden usar en su forma bencenodiol (hidroquinona reducida) según se desee.

DESCRIPCIÓN GENERAL

[0012] Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos divulgados en el presente documento para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia o para diagnóstico.

[0013] Se divulga un método para tratar o suprimir un trastorno seleccionado del grupo que consiste en una asinucleinopatía, una taupatía, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), lesión cerebral traumática y daño por isquemia y reperfusión, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto con la fórmula:

o la forma hidroquinona de este; o un solvato o hidrato de este. En algunos aspectos, el compuesto no es un solvato ni un hidrato. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el compuesto está en forma quinona. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el compuesto está en forma hidroquinona. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el método es para tratar o suprimir una a-sinucleinopatía. En algunos aspectos, incluyendo cualquiera de los aspectos anteriores, la asinucleinopatía se selecciona del grupo que consiste en: Enfermedad de Parkinson, Enfermedad de Parkinson con demencia (EPD), atrofia multisistémica (AMS), demencia frontotemporal, demencia con cuerpos de Lewy (DCL), enfermedad de Gaucher (EG), neurodegeneración con acumulación de hierro cerebral (NACH) y distrofias neuroaxonales (neurodegeneración asociada a PLA2G6). En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, la enfermedad de Parkinson es genética. En algunos aspectos, incluyendo cualquiera de los aspectos anteriores, la enfermedad de Parkinson es idiopática. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el método para suprimir o tratar la enfermedad de Parkinson es aquel en el que el paciente tiene una mutación en uno o más de los siguientes genes:MAPT(proteína tau asociada a microtúbulos),PRKN(parkina),PINK1(PINK1), LRRK2 (quinasa 2 repetida rica en leucina),GBA(glucocerebrosidasa),SNCA(alfa sinucleína),PARK7(DJ-1), y/oUCHL1(ubiquitina carboxil-terminal esterasa L1).

[0014] En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el método es para tratar o suprimir una taupatía. En algunos aspectos, incluyendo cualquiera de los aspectos anteriores, la taupatía se selecciona del grupo que consiste en: enfermedad de Alzheimer, demencia pugilística, complejo parkinsonismo-demenciaesclerosis lateral amiotrófica de Guam (ELAPD), enfermedad de Pick, enfermedad argirofílica granulosa, Niemann-Pick de tipo C, panencefalitis esclerosante subaguda (PEES), parálisis supranuclear progresiva (PSP), atrofia multisistémica (AMS), degeneración corticobasal gangliónica, demencia frontotemporal con parkinsonismo-17 (DFTP-17), parkinsonismo postencefalítico (PPE) y parkinsonismo autosómico recesivo. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el método es para tratar o suprimir la enfermedad de Alzheimer. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el método es para tratar o suprimir la enfermedad de Parkinson. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el método es para tratar o suprimir una lesión cerebral traumática. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el método es para tratar o suprimir un daño por isquemia y reperfusión. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el método es para tratar o suprimir un accidente cerebrovascular. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el método es para tratar o suprimir la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). En algunos aspectos, incluyendo cualquiera de los aspectos anteriores, el método es para tratar el trastorno. En algunos aspectos, incluyendo cualquiera de los aspectos anteriores, el método es para suprimir el trastorno. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el compuesto se administra por vía oral. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el compuesto se administra por vía intravenosa.

[0015] También se divulga un método para tratar o suprimir un trastorno seleccionado del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, lesión cerebral traumática y daño por isquemia y reperfusión, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto con la fórmula:

o la forma hidroquinona de este; o un solvato o hidrato de este. En algunos aspectos, el compuesto es:

o la forma hidroquinona de este. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el compuesto está en forma quinona. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el compuesto está en forma hidroquinona. En algunos aspectos, el método sirve para suprimir o tratar la enfermedad de Alzheimer. En algunos aspectos, el método sirve para suprimir o tratar la enfermedad de Parkinson. En algunos aspectos, el método para suprimir o tratar la enfermedad de Parkinson incluye tratar o suprimir la enfermedad de Parkinson idiopática. En algunos aspectos, el método para suprimir o tratar la enfermedad de Parkinson incluye tratar o suprimir la enfermedad de Parkinson familiar (es decir, genética). En algunos aspectos, el método para suprimir o tratar la enfermedad de Parkinson es aquel en el que el paciente tiene una mutación en uno o más de los siguientes genes:MAPT(proteína tau asociada a microtúbulos),PRKN(parkina),PINK1(PINK1),LRRK2(quinasa 2 repetida rica en leucina),GBA(glucocerebrosidasa),SNCA(alfa sinucleína),PARK7(DJ-1), y/oUCHL1(ubiquitina carboxil-terminal esterasa L1). En algunos aspectos, el método es para suprimir o tratar una lesión cerebral traumática. En algunos aspectos, el método es para suprimir o tratar un daño por isquemia y reperfusión. En algunos aspectos, el daño por isquemia y reperfusión es un accidente cerebrovascular. En algunos aspectos, el daño por isquemia y reperfusión es una lesión retiniana por isquemia y reperfusión. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el compuesto se administra por vía oral. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el compuesto se administra mediante inyección. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el compuesto se administra por vía intravenosa. En algunos aspectos, incluyendo cualquiera de los aspectos anteriores, el método es un método para suprimir el trastorno. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el método es un método para tratar el trastorno.

[0016] También se describe un polimorfo de un anhidrato de 2,3,5-trimetil-6-nonilciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona, en el que un patrón de difracción de rayos X en polvo para el polimorfo comprende picos característicos al menos en las siguientes posiciones angulares, donde las posiciones angulares pueden variar en ± 0,2: 4,10, 12,12 y 16,14. En algunos aspectos, los datos se obtienen con una fuente de Cu Ka1, una longitud de onda de 1,540598 A y una temperatura de 23-25 °C. En algunos aspectos, el polimorfo comprende picos característicos al menos en las siguientes posiciones angulares, donde las posiciones angulares pueden variar en ± 0,2: 4,10, 11,77, 12,12 y 16,14. En algunos aspectos, el polimorfo comprende picos característicos al menos en las siguientes posiciones angulares, donde las posiciones angulares pueden variar en ± 0,2: 4,10, 11,77, 12,12, 16,14 y 22,41. En algunos o cualesquiera aspectos, un patrón de difracción de rayos X en polvo para el polimorfo comprende picos característicos al menos en una de las siguientes posiciones angulares, donde las posiciones angulares pueden variar en ± 0,2: 4,10, 11,77, 12,12, 16,14 y 22,41. En algunos o cualesquiera aspectos, un patrón de difracción de rayos X en polvo para el polimorfo comprende picos característicos al menos en dos de las siguientes posiciones angulares, donde las posiciones angulares pueden variar en ± 0,2: 4,10, 11,77, 12,12, 16,14 y 22,41. En algunos o cualesquiera aspectos, un patrón de difracción de rayos X en polvo para el polimorfo comprende picos característicos al menos en dos de las siguientes posiciones angulares, donde las posiciones angulares pueden variar en ± 0,2: 4,10, 11,77, 12,12 y 16,14. En algunos o cualesquiera aspectos, un patrón de difracción de rayos X en polvo para el polimorfo comprende picos característicos al menos en dos de las siguientes posiciones angulares, donde las posiciones angulares pueden variar en ± 0,2: 4,10, 12,12 y 16,14. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, las posiciones angulares pueden variar en ± 0,1. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, las posiciones angulares pueden variar en ± 0,05. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el polimorfo tiene un patrón de difracción de rayos X en polvo sustancialmente como se muestra en cualquiera de las Figuras 5, 11, 14 y 16. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el polimorfo tiene un termograma de calorimetría diferencial de barrido (DSC) sustancialmente como se muestra en la Figura 7. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, un termograma DSC tiene un único pico endotérmico de entre aproximadamente 47 °C y aproximadamente 53 °C. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, un termograma DSC tiene un único pico endotérmico de entre aproximadamente 49 °C y aproximadamente 53 °C. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, un termograma DSC tiene un único pico endotérmico de entre aproximadamente 50 °C y aproximadamente 52 °C. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, un termograma DSC tiene un único pico endotérmico a aproximadamente 50,5 °C. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el polimorfo tiene un termograma de análisis termogravimétrico (TGA) sustancialmente como se muestra en la Figura 8. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el polimorfo tiene un espectro de 1H-RMN sustancialmente como se muestra en la Figura 6. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, al menos aproximadamente el 95 % en mol del 2,3,5-trimetil-6-nonilciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona es el polimorfo, sin incluir disolventes, vehículos o excipientes. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, al menos aproximadamente el 99 % en mol de la 2,3,5-trimetil-6-nonilciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona es el polimorfo, excluyendo cualquier disolvente, vehículo o excipiente. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, al menos aproximadamente el 95 % a/a, medido por HPLC, de la composición es 2,3,5-trimetil-6-nonilciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona, excluyendo cualquier disolvente, vehículo o excipiente. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, al menos aproximadamente el 99 % a/a, medido por HPLC, de la composición es 2,3,5-trimetil-6-nonilciclohexa-2,5-dieno-1,4- diona, excluyendo cualquier disolvente, vehículo o excipiente. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, la potencia de la 2,3,5-trimetil-6-nonilciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona es de al menos aproximadamente el 95 %. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, la potencia de la 2,3,5-trimetil-6-nonilciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona es de al menos aproximadamente el 99 %. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el polimorfo está presente como una pluralidad de partículas, en donde las partículas tienen una proporción de D90:D10 menor que aproximadamente 11:1. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el polimorfo está presente como una pluralidad de partículas, en donde las partículas tienen una proporción de D90:D10 inferior a aproximadamente 7:1. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el polimorfo se recristalizó mediante un disolvente que comprendía aproximadamente un 75-85 % de IPA/agua. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el polimorfo se recristalizó mediante un disolvente que comprendía aproximadamente un 80-85 % de IPA/agua. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el polimorfo se recristalizó mediante un disolvente que comprendía aproximadamente un 85 % de IPA/agua.

[0017] También se divulga una composición farmacéutica que comprende el polimorfo como se describe en el presente documento, o una composición como se describe en el presente documento, y un disolvente, vehículo o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico, o una composición farmacéutica preparada con el polimorfo como se describe en el presente documento, o una composición como se describe en el presente documento y un disolvente, vehículo o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico.

[0018] También se describe un método para tratar o suprimir una a-sinucleinopatía, una taupatía, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), lesión cerebral traumática o daño por isquemia y reperfusión, que comprende administrar a un individuo que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz del polimorfo descrito en el presente documento, o una composición como se describe en el presente documento.

[0019] También se describe un método para recristalizar 2,3,5-trimetil-6-nonilciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona a partir de una composición, que comprende: a) poner en contacto la composición con IPA y agua de manera que la relación resultante de IPA a agua sea de aproximadamente 75-87 % de isopropanol (IPA)/25-13 % de agua (v:v), a una temperatura de aproximadamente 40-45 °C; b) enfriar la mezcla a aproximadamente 32 °C; y c) filtrar la 2,3,5-trimetil-6-nonilciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona de la mezcla. En algunos aspectos, el paso (a) comprende: a1) poner en contacto la composición con IPA; a2) calentar la mezcla a aproximadamente 40-45 °C; y a3) añadir agua a la mezcla de modo que la proporción de IPA a agua sea aproximadamente 75-85 % de IPA: 25-15 % de agua (v:v). En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el paso (a) comprende agitar la composición para disolverla. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, la proporción de IPA:agua es aproximadamente 80-85 % de IPA:20-15 % de agua (v:v). En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, la proporción de IPA:agua es aproximadamente 85 % de IPA:15 % de agua (v:v). En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el paso (a3) comprende devolver la temperatura de la mezcla a aproximadamente 40-45 °C. En algunos aspectos, incluyendo cualquiera de los aspectos anteriores, el método comprende filtrar la mezcla después del paso (a). En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el paso (b) comprende enfriarla hasta aproximadamente 32 °C durante aproximadamente 2-10 horas. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el paso (b) comprende enfriarla hasta aproximadamente 32 °C durante aproximadamente 6 horas. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el método comprende un paso (b1) después del paso (b), que comprende mantener la mezcla a aproximadamente 32 °C durante aproximadamente 2-24 horas. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el método comprende un paso (b1) después del paso (b), que comprende mantener la mezcla a aproximadamente 32 °C durante aproximadamente 6 horas. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el método comprende un paso (b2) después del paso (b) o (b1), cuando está presente, que comprende enfriar la mezcla a aproximadamente 0 °C. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el paso (b2) comprende enfriar la mezcla a aproximadamente 0 °C durante aproximadamente 3-24 horas. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el paso (b2) comprende además mantener la mezcla a aproximadamente 0 °C durante aproximadamente una hora.

[0020] También se describe una composición que comprende 2,3,5-trimetil-6-nonilciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona preparada según el método del párrafo inmediatamente anterior.

[0021] También se describe un método para preparar una composición farmacéutica, que comprende convertir el polimorfo como se describe en cualquiera de los párrafos anteriores, o la composición de cualquiera de los párrafos anteriores, en una forma líquida o de emulsión. En algunos aspectos, la composición farmacéutica se proporciona como una solución oral, una cápsula llena de líquido o una solución inyectable. Se proporcionan composiciones farmacéuticas producidas según estos métodos.

[0022] También se describe una forma amorfa fundida metaestable de 2,3,5-trimetil-6-nonilciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona, que tiene un gráfico de XRPD sustancialmente como se muestra en la Figura 31.

[0023] También se divulga un método para tratar o suprimir un trastorno seleccionado del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, lesión cerebral traumática y daño por isquemia y reperfusión, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto con la fórmula:

o la forma hidroquinona de este; o un solvato o hidrato de este. En algunos aspectos, el compuesto es:

o la forma hidroquinona de este. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el compuesto está en forma quinona. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el compuesto está en forma hidroquinona. En algunos aspectos, el método sirve para suprimir o tratar la enfermedad de Alzheimer. En algunos aspectos, el método sirve para suprimir o tratar la enfermedad de Parkinson. En algunos aspectos, el método para suprimir o tratar la enfermedad de Parkinson incluye tratar o suprimir la enfermedad de Parkinson idiopática. En algunos aspectos, el método para suprimir o tratar la enfermedad de Parkinson incluye tratar o suprimir la enfermedad de Parkinson familiar (es decir, genética). En algunos aspectos, el método para suprimir o tratar la enfermedad de Parkinson es aquel en el que el paciente tiene una mutación en uno o más de los siguientes genes:MAPT(proteína tau asociada a microtúbulos),PRKN(parkina),PINK1(PINK1),LRRK2(quinasa 2 repetida rica en leucina),GBA(glucocerebrosidasa),SNCA(alfa sinucleína),PARK7(DJ-1),y/o UCHL1(ubiquitina carboxil-terminal esterasa L1). En algunos aspectos, el método es para suprimir o tratar una lesión cerebral traumática. En algunos aspectos, el método es para suprimir o tratar un daño por isquemia y reperfusión. En algunos aspectos, daño por isquemia y reperfusión es un accidente cerebrovascular. En algunos aspectos, el daño por isquemia y reperfusión es una lesión retiniana por isquemia y reperfusión. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el compuesto se administra por vía oral. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el compuesto se administra mediante inyección. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el compuesto se administra por vía intravenosa. En algunos aspectos, incluyendo cualquiera de los aspectos anteriores, el método es un método para suprimir el trastorno. En algunos aspectos, incluido cualquiera de los aspectos anteriores, el método es un método para tratar el trastorno.

[0024] Para todos los compuestos, composiciones y formulaciones descritos en el presente documento, y todos los métodos que utilizan un compuesto o composición o formulación descritos en el presente documento, los compuestos o composiciones pueden comprender los componentes o pasos enumerados, o pueden "consistir esencialmente en" los componentes o pasos enumerados, o pueden "consistir en" los componentes o pasos enumerados. Es decir, la frase de transición "que comprende" o "comprende" puede sustituirse por la frase de transición "que consiste esencialmente en" o "consiste esencialmente en". Alternativamente, la frase de transición "que comprende" o "comprende" se puede reemplazar, en algunas o cualesquiera formas de realización, por la frase de transición "que consiste en" o "consiste en". Cuando una composición se describe como "que consiste esencialmente en" los componentes enumerados, la composición contiene los componentes enumerados y puede contener otros componentes que no tienen un efecto sustancial en la afección que se está tratando, pero no contiene ningún otro componente que tenga un efecto sustancial en la afección que se está tratando aparte de los componentes expresamente enumerados; o, si la composición contiene componentes adicionales, distintos de los enumerados, que tienen un efecto sustancial en la afección que se está tratando, la composición no contiene una concentración o cantidad de los componentes adicionales suficiente para tener un efecto sustancial en la afección que se está tratando. Cuando un método se describe como "que consiste esencialmente en" los pasos enumerados, el método contiene los pasos enumerados y puede contener otros pasos que no tengan un efecto sustancial en la afección que se está tratando, pero el método no contiene ningún otro paso que tenga un efecto sustancial en la afección que se está tratando aparte de los pasos expresamente enumerados. Como ejemplo específico no limitante, cuando una composición se describe como "que consiste esencialmente” en un componente, la composición puede contener adicionalmente cualquier cantidad de vehículos, excipientes o diluyentes aceptables desde el punto de vista farmacéutico y otros componentes similares que no tengan un efecto sustancial en la afección que se está tratando.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0025]

La Figura 1A muestra la cinética de agregación de aSinucleína (aSyn) humana recombinante en presencia del compuesto 2,3,5-trimetil-6-nonilcidohexa-2,5-dieno-1,4-diona ("C9"), 2, 3,5-trimetil-6-octilciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona ("C8"), 2,3,5-trimetil-6-heptilciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona ("C7"), o vehículo únicamente, en una relación sub-estequiométrica.

La Figura 1B muestra el contenido de fibrillas de aSyn en ausencia (vehículo) o presencia de C9, C8 o C7 en t = 24 horas de fibrilización. El contenido de fibrillas se evaluó en función de la intensidad relativa de fluorescencia de ThT (el 100 % se configuró en el valor final en t = 45,5 h de la media de las muestras de aSyn tratadas con vehículo).

La Figura 2 muestra el efecto del tratamiento con vehículo, C9, C8 o C7 sobre el contenido de fibrillas preformadas de Tau después de 94 horas de incubación.

La Figura 3A muestra núcleos y aSinucleína agregada en células dopaminérgicas de rata N27 tratadas con RSL3 en ausencia o presencia de cotratamiento con C9, C8 o C7.

La Figura 3B muestra los efectos del tratamiento con C9, C8 o C7 sobre la agregación de aSinucleína inducida por RSL3 en células N27.

Las Figuras 4A y 4B muestran el efecto de la administración de C9 sobre la actividad vertical suprimida por 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) (número de erguidos generales y tiempo en vertical, respectivamente) en una prueba de actividad locomotora en campo abierto con ratones C57BL/6.

La Figura 5 muestra el difractograma XRPD del material tal cual se recibió (ID 1-1), patrón A, analizado mediante el método de escaneo largo.

La figura 6 muestra el espectro de 1H-RMN del material tal cual se recibió (ID 1-1) en MeOD.

La Figura 7 muestra el termograma DSC independiente del material tal cual se recibió (ID-1-1).

La Figura 8 muestra los termogramas TGA y DCS del material tal cual se recibió (ID-1-1).

La Figura 9A (donde se indica una escala de 100 |_im en la esquina inferior derecha) y 9B (donde se indica una escala de 20 |_im en la esquina inferior derecha) muestran imágenes de microscopía del material tal cual se recibió (ID-1-1) con un aumento de 100X y 400X, respectivamente.

La Figura 10 muestra un gráfico de isotermas DVS para el material tal cual se recibió (ID-1-1).

La Figura 11 muestra difractogramas XRPD del sólido recibido (ID-1-1), Patrón A (abajo), en comparación con el sólido después del ciclo de humidificación en el instrumento DVS (arriba).

La Figura 12 muestra el cromatograma de HPLC del material tal cual se recibió (ID-1-1).

La Figura 13 muestra el termograma DSC de ID-10-1 después del tratamiento térmico de ID 1-1.

La Figura 14 muestra difractogramas XRPD del material tal cual se recibió (ID-1-1), Patrón A (abajo), en comparación con el sólido recuperado del tratamiento térmico (ID 10-1) (arriba).

La Figura 15 muestra el cromatograma de HPLC de la muestra de estabilidad ID-4-1.

La Figura 16 muestra difractogramas XRPD de ID-1-1 tal como se recibió (abajo) en comparación con la muestra de estabilidad de forma sólida ID-4-1 (arriba) después de una semana a 75 % de<h>R y 40 °C. Las Figuras 17A (donde se indica una escala de 100 |_im en la esquina inferior derecha) y 17B (donde se indica una escala de 20 |_im en la esquina inferior derecha) muestran imágenes de microscopía de ID-4-1 con un aumento de 100X y 400X, respectivamente.

La Figura 18 muestra imágenes de microscopía de ID-38-1 con un aumento de 25X, donde se indica una escala de 500 |_im en la esquina inferior derecha.

La Figura 19 muestra imágenes de microscopía de ID-38-1 con un aumento de 100X, donde se indica una escala de 100 |_im en la esquina inferior derecha.

La Figura 20 muestra imágenes de microscopía de ID-38-1 con un aumento de 400X, donde se indica una escala de 20 |_im en la esquina inferior derecha.

La Figura 21 muestra imágenes de microscopía de ID-38-2 con un aumento de 25X, donde se indica una escala de 500 |_im en la esquina inferior derecha.

La Figura 22 muestra imágenes de microscopía de ID-38-2 con un aumento de 100X, donde se indica una escala de 100 |_im en la esquina inferior derecha.

Las Figuras 23A y 23B muestran imágenes de microscopía de ID-38-2 con un aumento de 400X, donde se indica una escala de 20 |_im en la esquina inferior derecha.

La Figura 24 muestra una microscopía que compara ambos lotes ID-38-1 (arriba) e ID-38-2 (abajo) con un aumento de 25X, donde se indica una escala de 500 |_im en la esquina inferior derecha.

La Figura 25 muestra una microscopía que compara ambos lotes ID-38-1 (arriba) e ID-38-2 (abajo) con un aumento de 100X, donde se indica una escala de 100 |_im en la esquina inferior derecha.

La Figura 26 muestra una microscopía que compara ambos lotes ID-38-1 (arriba) e ID-38-2 (abajo) con un aumento de 400X, donde se indica una escala de 20 |_im en la esquina inferior derecha.

Las Figuras 27 y 28 muestran la distribución del tamaño de partículas para un experimento representativo del material del Ejemplo 3A, preparaciones 1 y 2, respectivamente.

Las Figuras 29 y 30 muestran la distribución del tamaño de partículas para un experimento representativo del material del Ejemplo 3B, preparaciones 1 y 2, respectivamente.

La Figura 31 es un difractograma XRPD de C9 líquido enfriado a temperatura ambiente durante 5 minutos. La Figura 32 es un termograma DSC del experimento de ciclos de temperatura con condiciones menos estresantes.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0026] Se describen compuestos, composiciones, usos de dichos compuestos y composiciones y métodos para tratar o suprimir a-sinucleinopatías, taupatías, ELA, lesión cerebral traumática y daño por isquemia y reperfusión. Las alfa-sinucleinopatías son enfermedades neurodegenerativas caracterizadas por la acumulación anormal de agregados de proteína alfa-sinucleína en las neuronas, fibras nerviosas o células gliales. Las taupatías pertenecen a una clase de enfermedades neurodegenerativas asociadas con la agregación patológica de la proteína tau en ovillos neurofibrilares o gliofibrilares en el cerebro humano, como la enfermedad de Alzheimer (véase, por ejemplo, Cellular and Molecular Neurobiology (2018) 38:965-980). Como se muestra en los Ejemplos, un compuesto reivindicado ha demostrado eficacia en la reducción de agregados de proteína alfa-sinucleína y en la reducción de la agregación de la proteína tau. Sin ceñirse a ninguna teoría, para las enfermedades reivindicadas, puede ser beneficioso que el fármaco penetre en el cerebro y, además, puede ser beneficioso que el fármaco se reparta preferentemente en el cerebro frente a otros tejidos. Por ejemplo, esto puede reducir los efectos secundarios y no deseados. Los solicitantes han descubierto sorprendentemente que el compuesto descrito en el presente documento tiene una penetración cerebral superior y un reparto superior del compuesto en el cerebro en comparación con el plasma.

[0027] También se proporciona una forma sólida del compuesto 2,3,5-trimetil-6-nonilciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona, composiciones que comprenden la forma sólida con mayor pureza y con características preferidas tales como morfologías de partículas y distribución del tamaño de partículas más preferidas, y procesos para fabricarlas. Como se muestra con más detalle en la descripción detallada, la sección experimental y las figuras proporcionadas en el presente documento, las composiciones tienen propiedades beneficiosas tales como una pureza mejorada (por ejemplo, menor contenido de plata), características de manipulación mejoradas (por ejemplo, fluidez) y capacidad mejorada para formularse en productos farmacéuticos (por ejemplo, capacidad mejorada para ser molidas). Las partículas tienen buenas propiedades de flujo y morfología en comparación con un proceso anterior. El uso de las presentes partículas facilita la fabricación del producto farmacéutico, por ejemplo, el llenado de cápsulas. Además, al utilizar las presentes partículas puede ser posible reducir la cantidad de excipientes necesarios para la fabricación del producto farmacéutico, lo que ofrece ventajas en términos de coste, tiempo y eficiencia del proceso. De hecho, si una sustancia farmacológica es pegajosa o no fluye fácilmente, es posible que se necesiten más excipientes para mejorar la manipulación de dicha sustancia farmacológica. Además, si se necesita moler la sustancia farmacológica, el material pegajoso tendría pérdidas de rendimiento debido a pérdidas en las superficies del equipo de molienda, y también el producto molido formaría más aglomerados, o sería más difícil de romper. Estas características no son deseables en el procesamiento para la fabricación de productos farmacéuticos y se mejoran en el proceso descrito.

[0028] Las abreviaturas utilizadas en este documento tienen su significado convencional dentro de la química y la biología, a menos que se especifique lo contrario.

[0029] La referencia a “alrededor de" un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) variaciones que están dirigidas a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción que hace referencia a “alrededor de X" incluye la descripción de "X".

[0030] Como se usa en el presente documento, y a menos que se especifique lo contrario, los términos “alrededor de” y "aproximadamente", cuando se usan en relación con diversos términos tales como temperaturas, dosis, cantidades o porcentaje en peso de ingredientes de una composición o forma farmacéutica, significan, por ejemplo, una temperatura, dosis, cantidad o porcentaje en peso que los expertos en la técnica reconocen que proporciona un efecto equivalente al obtenido a partir de la temperatura, dosis, cantidad o porcentaje en peso especificados. Específicamente, los términos “alrededor de” y "aproximadamente", cuando se usan en este contexto, contemplan una temperatura, dosis, cantidad o porcentaje en peso, etc. dentro del 15 %, dentro del 10 %, dentro del 5 %, dentro del 4 %, dentro del 3 %, dentro del 2 %, dentro del 1 % o dentro del 0,5 % de la temperatura, dosis, cantidad o porcentaje en peso especificados, etc.

[0031] Los términos "un" o "una", tal como se utilizan en este documento, significan uno o más, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

[0032] Por "sujeto", "individuo" o "paciente" se entiende un organismo individual, preferiblemente un vertebrado, más preferiblemente un mamífero, de la manera más preferible un ser humano.

[0033] "Tratar" un trastorno con los compuestos y métodos mencionados en el presente documento se define como administrar uno o más de los compuestos mencionados en el presente documento, con o sin agentes terapéuticos adicionales, para reducir o eliminar el trastorno o uno o más síntomas del trastorno o para retardar la progresión del trastorno o de uno o más síntomas del trastorno, o para reducir la gravedad del trastorno o de uno o más síntomas del trastorno. "Supresión" de un trastorno con los compuestos y métodos mencionados en el presente documento se define como la administración de uno o más de los compuestos mencionados en el presente documento, con o sin agentes terapéuticos adicionales, con el fin de suprimir la manifestación clínica del trastorno, o para suprimir la manifestación de los síntomas adversos del trastorno. La distinción entre tratamiento y supresión es que el tratamiento ocurre después de que los síntomas adversos del trastorno se hayan manifestado en un sujeto, mientras que la supresión ocurre antes de que los síntomas adversos del trastorno se manifiesten en un sujeto. La supresión puede ser parcial, sustancialmente total o total. En algunas formas de realización, se puede utilizar el cribado genético para identificar pacientes con riesgo de padecer el trastorno. Los compuestos y métodos descritos en el presente documento pueden administrarse luego a pacientes asintomáticos con riesgo de desarrollar los síntomas clínicos del trastorno, con el fin de suprimir la aparición de cualquier síntoma adverso.

[0034] El "uso terapéutico" de los compuestos mencionados en el presente documento se define como el uso de uno o más de los compuestos mencionados en el presente documento para tratar o suprimir un trastorno, como se define en el presente documento. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un compuesto es una cantidad del compuesto que, cuando se administra a un sujeto, es suficiente para reducir o eliminar un trastorno o uno o más síntomas de un trastorno, o para retardar la progresión de un trastorno o de uno o más síntomas de un trastorno, o para reducir la gravedad de un trastorno o de uno o más síntomas de un trastorno, o para suprimir la manifestación clínica de un trastorno, o para suprimir la manifestación de síntomas adversos de un trastorno. Se puede administrar una cantidad terapéuticamente eficaz en una o más administraciones.

[0035] "2,3,5-trimetil-6-nonilciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona" y "C9" se usan indistintamente en el presente documento.

[0036] "2,3,5-trimetil-6-octilciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona" y "C8" se usan indistintamente en el presente documento.

[0037] "2,3,5-trimetil-6-heptilciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona" y "C7" se usan indistintamente en el presente documento.

[0038] "Forma hidroquinona" indica la forma del compuesto cuando se efectúa una reducción de dos electrones del anillo de quinona, proporcionando una conversión neta de los dos grupos oxo en dos grupos hidroxi. Por ejemplo, la forma hidroquinona del compuesto quinona:

es la siguiente:

"alfa-sinucleína" y "a-sinucleína" se utilizan indistintamente en el presente documento.

[0039] La descripción de los compuestos del presente documento también incluye todos los isotopólogos, en algunas formas de realización, análogos parcial o completamente deuterados o de todos los compuestos del presente documento.

[0040] El daño por isquemia y reperfusión incluye, entre otros, accidentes cerebrovasculares y daño en la retina por isquemia y reperfusión.

[0041] "Accidente cerebrovascular" incluye accidente cerebrovascular isquémico (los ejemplos no limitantes incluyen accidente cerebrovascular trombótico, accidente cerebrovascular embólico), accidente cerebrovascular hemorrágico (los ejemplos no limitantes incluyen hemorragia intracerebral, hemorragia subaracnoidea) y ataque isquémico transitorio. En algunas formas de realización, el accidente cerebrovascular es un accidente cerebrovascular isquémico. En algunas formas de realización, el accidente cerebrovascular es un accidente cerebrovascular hemorrágico. En algunas formas de realización, el accidente cerebrovascular es un ataque isquémico transitorio.

[0042] Para todos los datos de caracterización descritos en las reivindicaciones del presente documento (por ejemplo, picos de XRPD, DSC, TGA, distribución del tamaño de partículas, etc.), en algunas formas de realización los datos se obtienen mediante un método realizado sustancialmente como se describe en el presente documento (por ejemplo, para XRPD, DSC, y TGA, véase, por ejemplo, el Ejemplo 7 para conocer una metodología específica). "Sustancialmente como se describe en el presente documento" indica que un experto en la técnica usaría un método reconocido por los expertos en la técnica para proporcionar un resultado sustancialmente equivalente al obtenido con el método especificado.

Formulaciones farmacéuticas

[0043] Para la forma cristalina reivindicada, los disolventes residuales están dentro de los límites permisibles, lo que los hace muy adecuados para la formulación en composiciones farmacéuticas. Una forma en estado sólido también permite una fácil purificación mediante técnicas de cristalización. La forma cristalina reivindicada no es higroscópica ni es un hidrato/solvato, lo que significa que no requiere manipulación especial en cuanto a exposición a la humedad. Además, la morfología mejorada resultante del proceso de recristalización permite un manejo más fácil durante la fabricación (como se describe con más detalle en el presente documento). Los compuestos descritos en el presente documento se pueden formular como composiciones farmacéuticas mediante formulación con aditivos tales como excipientes aceptables desde el punto de vista farmacéutico, vehículos aceptables desde el punto de vista farmacéutico y vehículos aceptables desde el punto de vista farmacéutico. Los excipientes, sustancias inertes y vehículos aceptables desde el punto de vista farmacéutico adecuados incluyen agentes de procesamiento y modificadores y potenciadores de la administración de fármacos, tales como, en algunas formas de realización, fosfato cálcico, estearato de magnesio, talco, monosacáridos, disacáridos, almidón, gelatina, celulosa, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, dextrosa, hidroxipropil-p-ciclodextrina, polivinilpirrolidona, ceras de bajo punto de fusión, resinas de intercambio iónico y similares, así como combinaciones de dos o más de los mismos. Otros excipientes aceptables desde el punto de vista farmacéutico adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Pub. Co., Nueva Jersey (1991), y "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, 20.a edición (2003) y 21a edición (2005).

[0044] Una composición farmacéutica puede comprender una formulación en dosis unitaria, donde la dosis unitaria es una dosis suficiente para tener un efecto terapéutico.

[0045] Las composiciones farmacéuticas que contienen los compuestos de la invención pueden estar en cualquier forma adecuada para el método de administración previsto, incluyendo, en algunas formas de realización, una solución, una suspensión o una emulsión. Los vehículos líquidos se utilizan normalmente para preparar soluciones, suspensiones y emulsiones. Los vehículos líquidos contemplados para su uso en la práctica de la presente invención incluyen, en algunas formas de realización, agua, solución salina, disolvente(s) orgánico(s) aceptable(s) desde el punto de vista farmacéutico, aceites o grasas aceptables desde el punto de vista farmacéutico y similares, así como mezclas de dos o más de estos. El vehículo líquido puede contener otros aditivos aceptables desde el punto de vista farmacéutico adecuados tales como solubilizantes, emulsionantes, nutrientes, tampones, conservantes, agentes de suspensión, agentes espesantes, reguladores de viscosidad, estabilizadores y similares. Los disolventes orgánicos adecuados incluyen, en algunas formas de realización, alcoholes monohídricos, como etanol, y alcoholes polihídricos, como glicoles. Los aceites adecuados incluyen, en algunas formas de realización, aceite de sésamo, aceite de soja, aceite de coco, aceite de oliva, aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón y similares. Para la administración parenteral, el vehículo también puede ser un éster oleoso tal como oleato de etilo, miristato de isopropilo y similares. Las composiciones de la presente invención también pueden estar en forma de micropartículas, microcápsulas, encapsulados liposomales y similares, así como combinaciones de dos o más de estos.

[0046] Se pueden usar sistemas de liberación sostenida o de liberación controlada, tales como un sistema de matriz controlada por difusión o un sistema erosionable, como se describe por ejemplo en: Lee, "Diffusion-Controlled Matrix Systems", pp. 155-198 y en Ron & Langer, "Erodible Systems", pp. 199-224, en "Treatise on Controlled Drug Delivery", A. Kydonieus Ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York 1992. La matriz puede ser, en algunas formas de realización, un material biodegradable que puede degradarse espontáneamentein situein vivo,en algunas formas de realización, mediante hidrólisis o escisión enzimática, por ejemplo, mediante proteasas. El sistema de administración puede ser, en algunas formas de realización, un polímero o copolímero de origen natural o sintético, en algunas formas de realización, en forma de hidrogel. Los polímeros ejemplares con enlaces escindibles incluyen poliésteres, poliortoésteres, polianhídridos, polisacáridos, poli(fosfoésteres), poliamidas, poliuretanos, poli(imidocarbonatos) y poli(fosfacenos).

[0047] Los compuestos de la invención se pueden administrar por vía enteral, oral, parenteral, sublingual, por inhalación (por ejemplo, como nieblas o aerosoles), por vía rectal o tópica en formulaciones de dosis unitaria que contienen sustancias inertes, adyuvantes y vehículos aceptables desde el punto de vista farmacéutico no tóxicos convencionales, según se desee. En algunas formas de realización, las vías de administración adecuadas incluyen oral, subcutánea, transdérmica, transmucosa, iontoforética, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intraperitoneal, intranasal (por ejemplo, a través de la mucosa nasal), subdural, rectal, gastrointestinal y similares, y directamente en un lugar específico. o órgano o tejido afectado. Las formulaciones para administración tópica pueden incluir lociones, tinturas, cremas, emulsiones, ungüentos, aerosoles, geles y similares, y pueden formularse además en otras formulaciones adecuadas tales como protectores solares, lociones y cremas hidratantes, geles y cremas faciales, etc. En estas composiciones, el producto activo se mezcla con uno o más excipientes inertes que incluyen, por ejemplo, agua, acetona, etanol, etilenglicol, propilenglicol, butano 1,3 diol, miristato de isopropilo, palmitato de isopropilo, aceite mineral y mezclas de estos. La administración tópica también puede implicar el uso de administración transdérmica, tal como parches transdérmicos o dispositivos de iontoforesis. El término parenteral tal como se utiliza en el presente documento incluye técnicas de inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular e intraesternal. Los compuestos se mezclan con sustancias inertes, adyuvantes y vehículos aceptables desde el punto de vista farmacéutico apropiados para la vía de administración deseada. La administración oral es una vía de administración preferida, y las formulaciones adecuadas para la administración oral son formulaciones preferidas. La administración tópica es otra vía de administración preferida, y las formulaciones adecuadas para la administración tópica son formulaciones preferidas. Los compuestos descritos para su uso en el presente documento se pueden administrar en forma sólida, en forma líquida, en forma de aerosol, o en forma de comprimidos, pastillas, mezclas en polvo, cápsulas, gránulos, inyectables, cremas, soluciones, supositorios, enemas, irrigaciones colónicas, emulsiones, dispersiones, premezclas alimentarias y en otras formas adecuadas. Los compuestos también se pueden administrar en formulaciones de liposomas. En la técnica se conocen métodos de administración adicionales.

[0048] Las composiciones para administración tópica pueden ser emulsiones o soluciones estériles. Se puede utilizar, como disolvente o vehículo, propilenglicol, un polietilenglicol, aceites vegetales, en particular aceite de oliva, o ésteres orgánicos inyectables, en determinadas formas de realización, oleato de etilo. Estas composiciones también pueden contener adyuvantes, en particular agentes humectantes, isotonizantes, emulsionantes, dispersantes y estabilizantes. La esterilización se puede realizar de varias formas, en determinadas formas de realización, mediante un filtro bacteriológico, por radiación o por calentamiento. También se pueden preparar en forma de composiciones sólidas estériles que se pueden disolver en el momento de su uso en agua estéril o cualquier otro medio estéril inyectable.

[0049] Las preparaciones inyectables, en algunas formas de realización, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles, pueden formularse según la técnica conocida usando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico aceptable para vía parenteral, en algunas formas de realización, como una solución en propilenglicol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse se encuentran el agua, la solución de Ringer y la solución isotónica de cloruro de sodio. Además, convencionalmente se emplean aceites fijos estériles como disolvente o medio de suspensión. Para este fin se puede emplear cualquier aceite fijo suave, incluidos monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos como el ácido oleico encuentran un uso en la preparación de inyectables.

[0050] Las formas farmacéuticas sólidas para administración oral pueden incluir cápsulas, comprimidos, pastillas, polvos y gránulos. En tales formas farmacéuticas sólidas, el compuesto activo se puede mezclar con al menos un diluyente inerte tal como sacarosa, lactosa o almidón. Dichas formas farmacéuticas también pueden comprender sustancias adicionales distintas de los diluyentes inertes, por ejemplo, agentes lubricantes tales como estearato de magnesio. En el caso de cápsulas, comprimidos y pastillas, las formas farmacéuticas también pueden comprender reguladores del pH. Además, se pueden preparar comprimidos y pastillas con recubrimientos entéricos.

[0051] Las formas farmacéuticas líquidas para administración oral pueden incluir emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires aceptables desde el punto de vista farmacéutico que contienen diluyentes inertes comúnmente utilizados en la técnica, tales como agua. Tales composiciones también pueden comprender adyuvantes, tales como humectantes, emulsionantes y agentes de suspensión, ciclodextrinas y edulcorantes, aromatizantes y perfumantes.

[0052] Los compuestos de la presente invención también se pueden administrar en forma de liposomas. Como se sabe en la técnica, los liposomas generalmente derivan de fosfolípidos u otras sustancias lipídicas. Los liposomas están formados por cristales líquidos hidratados mono o multilamelares que se encuentran dispersos en un medio acuoso. Se puede utilizar cualquier lípido no tóxico, aceptable desde el punto de vista fisiológico y metabolizable capaz de formar liposomas. Las presentes composiciones en forma de liposomas pueden contener, además de un compuesto de la presente invención, estabilizadores, conservantes, excipientes y similares. Los lípidos preferidos son los fosfolípidos y las fosfatidilcolinas (lecitinas), tanto naturales como sintéticos. Los métodos para formar liposomas se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volumen XIV, Academic Press, Nueva York, N.W., p. 33 y ss. (1976).

[0053] Las formulaciones de la presente invención pueden comprender dos o más compuestos o composiciones como se describe en el presente documento.

[0054] También se describen artículos de fabricación y kits que comprenden uno cualquiera o más de los compuestos de la invención, para su uso en cualquiera de los métodos descritos en el presente documento.

[0055] La cantidad de principio activo que se puede combinar con los materiales portadores para producir una forma farmacéutica única variará dependiendo del huésped al que se administre el principio activo y el modo particular de administración. Se entenderá, sin embargo, que la cantidad de la dosis específica para cualquier individuo en particular dependerá de una variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso corporal, el área corporal, el índice de masa corporal (IMC), la salud general, el sexo y la dieta del paciente; el tiempo de administración, la vía de administración, la tasa de excreción o combinación de fármacos; y el tipo, progresión y gravedad de la enfermedad o afección particular. La dosis unitaria farmacéutica elegida puede fabricarse y administrarse de modo que proporcione una concentración final definida de fármaco en una zona concreta del cuerpo. La cantidad terapéuticamente eficaz para una situación dada puede determinarse fácilmente mediante experimentación rutinaria y está dentro de la habilidad y el juicio de cualquier médico.

[0056] Las dosis únicas o múltiples que se pueden usar incluyen una cantidad seleccionada independientemente de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 600 mg/kg de peso corporal, o aproximadamente 1,0 mg/kg a aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal, o aproximadamente 1,0 mg/kg a aproximadamente 400 mg/kg de peso corporal, o de aproximadamente 1,0 mg/kg a aproximadamente 300 mg/kg de peso corporal, o de aproximadamente 1,0 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg de peso corporal, o de aproximadamente 1,0 mg/kg a aproximadamente 100 mg/ kg de peso corporal, o de aproximadamente 1,0 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, o de aproximadamente 1,0 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal, o de aproximadamente 1,0 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, o aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 600 mg/kg de peso corporal, o aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal, o aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 400 mg/kg de peso corporal, o aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 300 mg/kg de peso corporal, o de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg de peso corporal, o de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, o de aproximadamente 50 mg/kg a aproximadamente 150 mg/ kg de peso corporal, o de aproximadamente 100 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg de peso corporal, o de aproximadamente 150 mg/kg a aproximadamente 250 mg/kg de peso corporal, o de aproximadamente 200 mg/kg a aproximadamente 300 mg/kg de peso corporal, o aproximadamente 250 mg/kg a aproximadamente 350 mg/kg de peso corporal, o aproximadamente 200 mg/kg a aproximadamente 400 mg/kg de peso corporal, o aproximadamente 300 mg/kg a aproximadamente 400 mg/kg de peso corporal, o aproximadamente 250 mg/kg a aproximadamente 300 mg/kg de peso corporal, o aproximadamente 300 mg/kg de peso corporal. Los compuestos de la presente invención se pueden administrar en una única dosis diaria, o la dosis diaria total se puede administrar en dosis divididas de dos, tres o cuatro veces al día.

[0057] Se pueden administrar dosis únicas o múltiples. En algunas formas de realización, la dosis se administra una, dos, tres, cuatro, cinco o seis veces. En algunas formas de realización, la dosis se administra una vez al día, dos veces al día, tres veces al día o cuatro veces al día. En algunas formas de realización, la dosis se administra cada hora, cada dos horas, cada tres horas, cada cuatro horas, cada 6 horas, cada 12 horas o cada 24 horas.

[0058] Si bien los compuestos de la invención se pueden administrar como único principio activo, también se pueden usar en combinación con uno o más agentes usados en el tratamiento o la supresión de los trastornos descritos en este documento. En algunas formas de realización, los compuestos de la invención se administran como el único principio activo que está presente en una cantidad terapéuticamente eficaz.

[0059] Cuando se usan principios activos adicionales en combinación con los compuestos de la presente invención, los principios activos adicionales generalmente se pueden emplear en cantidades terapéuticas como se indica en Physicians' Desk Reference (PDR) (PDR), 53a edición (1999), o en cantidades terapéuticamente útiles que conocería un experto en la materia.

[0060] Los compuestos de la invención y los otros agentes terapéuticamente activos o agentes profilácticamente eficaces se pueden administrar en la dosis clínica máxima recomendada o en dosis más bajas. La cantidad de las dosis de los compuestos activos en las composiciones de la invención pueden variarse para obtener una respuesta deseada dependiendo de la vía de administración, la gravedad del trastorno y la respuesta del individuo. Cuando se administran en combinación con otros agentes terapéuticos o profilácticos, los agentes terapéuticos o profilácticos se pueden formular como composiciones separadas que se administran al mismo tiempo o en diferentes momentos, o los agentes terapéuticos o profilácticos se pueden administrar como una única composición.

Preparación de Compuestos de la Invención

[0061] Los compuestos de esta invención se pueden preparar a partir de materiales de partida que se pueden obtener fácilmente usando métodos y procedimientos generales que serán evidentes para un experto en la técnica en vista de la divulgación proporcionada en el presente documento. Se apreciará que, cuando se dan condiciones de proceso típicas o preferidas (es decir, temperaturas de reacción, tiempos, relaciones molares de reactivos, disolventes, presiones, etc.), también se pueden usar otras condiciones de proceso a menos que se indique lo contrario. Las condiciones de reacción óptimas pueden variar con los reactivos o disolventes particulares utilizados, pero un experto en la técnica puede determinar dichas condiciones mediante procedimientos de optimización rutinarios. Las soluciones de C9 son sensibles a la luz; lo ideal es filtrar la iluminación de la habitación para eliminar longitudes de onda <450 nm (filtros de luz ámbar). Si no se dispone de iluminación ámbar, se deben utilizar controles adecuados para minimizar las soluciones a la exposición a la luz, por ejemplo, papel de aluminio, cristalería de color ámbar.

[0062] Para todos los compuestos y métodos descritos en el presente documento, la forma quinona también se puede utilizar en su forma reducida (hidroquinona) cuando se desee. Asimismo, la forma hidroquinona también se puede utilizar en su forma oxidada (quinona) cuando se desee. La forma reducida (hidroquinona) se puede convertir fácilmente en la forma oxidada (quinona) usando métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, aire, sílice, en Miller et al PCT Intl Appl 20061307757/12/2006. La forma oxidada (quinona) se puede convertir fácilmente en la forma hidroquinona reducida usando métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Zn, AcOH en Fuchs et al EJOC 6 (2009) 833-40.

[0063] La invención se describe con más detalle mediante los siguientes ejemplos y formas de realización no limitantes.

[0064]Recristalización.Como se muestra en los Ejemplos 1A y 3A, los métodos sintéticos para preparar C9 dieron como resultado un producto que tenía una o más características no deseadas, tales como alto contenido de plata, pegajosidad del producto y tamaños y distribución de partículas no deseados. Generalmente, para usos farmacéuticos, se prefiere un producto sólido con una distribución de tamaño de partícula estrecha. La pegajosidad del producto en el Ejemplo 3A hizo que el producto fuera difícil de manipular, incluso dificultando la molienda e impidiendo el tamizado.

[0065] La recristalización puede dar como resultado propiedades mejoradas, por ejemplo, la eliminación de impurezas del producto sólido y la producción de material de tamaño y distribución más homogéneos para mejorar el rendimiento del producto durante la formulación posterior. Como se muestra en los Ejemplos, se descubrió un procedimiento de recristalización que dio como resultado una mejora de la calidad del producto sólido, incluyendo, por ejemplo: pureza mejorada, punto de fusión más alto, menor contenido de plata, mejor fluidez, menos pegajosidad y tamaño y distribución de partículas más homogéneos. Además, el método de recristalización no requirió cristales simiente ni hubo problemas con la formación de aceite del C9.

[0066] El procedimiento de recristalización generalmente comprende disolver C9 en un disolvente, calentar la mezcla a aproximadamente 40-45 °C para disolver el C9, enfriar la mezcla a aproximadamente 32 °C, punto en el que se produce la cristalización, y filtrar el producto.

[0067] En algunas formas de realización, el disolvente de recristalización es aproximadamente un 75-85 % de IPA/agua. En algunas formas de realización, el disolvente de recristalización es aproximadamente un 80-85 % de IPA/agua. En algunas formas de realización, el disolvente de recristalización es aproximadamente un 80-87 % de IPA/agua. En algunas formas de realización, el disolvente de recristalización es aproximadamente un 83-87 % de IPA/agua. En algunas formas de realización, el disolvente de recristalización es aproximadamente un 85 % de IPA/agua. En algunas formas de realización, la relación se mide como (v:v). En algunas formas de realización, la relación se mide como (peso:peso). En algunas formas de realización, el disolvente de recristalización es una combinación de metanol y agua. En algunas formas de realización, el disolvente de recristalización es una combinación de metanol y heptano.

[0068] Cuando el disolvente de recristalización es IPA/agua, en algunas formas de realización el método comprende disolver el C9 en IPA (por ejemplo, calentando la mezcla a aproximadamente 40-45 °C) y luego añadir agua. Después de la adición del agua, la temperatura de la mezcla puede volver a aproximadamente 40 45 °C. En otras formas de realización, el método comprende disolver el C9 en la mezcla de IPA/agua.

[0069] En algunas formas de realización, la mezcla que contiene C9 se pasa por filtro abrillantador. El filtrado abrillantador se puede realizar a aproximadamente 40-45 °C, o a una temperatura necesaria para mantener el C9 en solución.

[0070] El enfriamiento de la mezcla a aproximadamente 32 °C en algunas formas de realización ocurre durante varias horas, por ejemplo, aproximadamente 2-10 horas, o aproximadamente 4-8 horas, o aproximadamente 6 horas. En algunas formas de realización, luego la mezcla se mantiene a aproximadamente 32 °C durante varias horas para permitir que el C9 cristalice, por ejemplo, aproximadamente 2-24 horas, o aproximadamente 4-8 horas, o aproximadamente 6 horas.

[0071] En algunas formas de realización, luego la mezcla se enfría más. En algunas formas de realización, la temperatura se puede enfriar hasta aproximadamente de -5 °C a aproximadamente 5 °C, o aproximadamente 0 °C. El enfriamiento puede ocurrir en un solo paso o en múltiples pasos (por ejemplo, se enfría hasta aproximadamente 24 °C, luego hasta aproximadamente 16 °C, luego hasta aproximadamente 0 °C). En algunas formas de realización, la mezcla se enfría durante un período de tiempo de aproximadamente 3 a 24 horas. En algunas formas de realización, la mezcla se mantiene a aproximadamente 0 °C, por ejemplo durante al menos una hora, o durante aproximadamente una hora.

[0072] El procedimiento de recristalización dio como resultado una pureza mejorada del producto C9. En diversas formas de realización, el producto comprende al menos aproximadamente un 95 % a/a, o al menos aproximadamente un 96 % a/a, o al menos aproximadamente un 97 % a/a, o al menos aproximadamente un 98 % a/a, o al menos aproximadamente un 99 % a/a, o al menos aproximadamente un 99,5 % a/a, medido por HPLC, del C9, excluyendo cualquier disolvente, vehículo o excipiente.

[0073] El procedimiento también puede dar como resultado una alta pureza del polimorfo reivindicado. En diversas formas de realización, al menos aproximadamente un 95 % en mol, o al menos aproximadamente un 96 % en mol, o al menos aproximadamente un 97 % en mol, o al menos aproximadamente un 98 % en mol, o al menos aproximadamente un 99 % en mol, o al menos aproximadamente un 95 % en mol, o al menos aproximadamente un 98 % en mol, o al menos aproximadamente un 99 % en mol al menos aproximadamente 99,5 % en mol de la 2,3,5-trimetil-6-nonilciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona es el polimorfo, excluyendo cualquier disolvente, vehículo o excipiente.

[0074] El procedimiento también puede resultar en una alta potencia de C9. Potencia = (100 % - impurezas totales por HPLC) x (100 % - % de contenido de agua - % de disolvente residual total - % de residuo de ignición). La potencia se puede calcular de la siguiente manera (% de pureza del área por HPLC/100) * (100 - % peso/peso de contenido de agua (KF) - % peso/peso de disolventes residuales - % peso/peso = residuo de ignición (ROI)). En diversas formas de realización, la potencia de la 2,3,5-trimetil-6-nonilciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona es de al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 %, o al menos aproximadamente el 99,5 %.

[0075] El procedimiento también puede dar como resultado una distribución más reducida de tamaños de partículas. D10 representa el diámetro de partícula correspondiente a un 10 % acumulativo (de 0 a 100 %) de distribución de tamaño de partícula con tamaños por debajo (es decir, el porcentaje de partículas más pequeñas que D10 es del 10 %). D90 representa el diámetro de partícula correspondiente al 90 % acumulativo (de 0 a 100 %) de distribución de tamaño de partícula con tamaños por debajo (es decir, el porcentaje de partículas más pequeñas que D90 es 90 %. En algunas formas de realización, las partículas tienen una proporción de D90:D10 menor que aproximadamente 11:1. En algunas formas de realización, las partículas tienen una proporción de D90:D10 menor que aproximadamente 10:1. En algunas formas de realización, las partículas tienen una proporción de D90:D10 menor que aproximadamente 9:1. En algunas formas de realización, las partículas tienen una proporción de D90:D10 menor que aproximadamente 8:1. En algunas formas de realización, las partículas tienen una proporción de D90:D10 menor que aproximadamente 7:1. En algunas formas de realización, las partículas tienen una proporción de D90:D10 menor que aproximadamente 6: 1. En algunas formas de realización, las partículas tienen una proporción de D90:D10 menor que aproximadamente 5:1. En algunas formas de realización, las partículas tienen una proporción de D90:D10 menor que aproximadamente 4:1.

EJEMPLOS

[0076]

Ejemplo 1A. Síntesis de 2,3,5-trimetil-6-nonilcidohexa-2,5-dieno-1,4-diona (3)

[0077]

[0078] En un reactor de 50 litros con un termómetro y un agitador se añadió 2,3,5-trimetilbenceno-1,4-diol. (1) (l,39 kg, 9,1 moles) y éter (15 l) a 23 °C. Se convirtió en una solución transparente después de agitar durante 30 minutos. Se añadió gota a gota una solución de cloruro férrico (5,6 kg, 34,5 mol) en agua (20 l) durante 3 h. La mezcla de reacción se agitó durante otras 2 horas a esta temperatura. Se separó la fase orgánica. La capa acuosa drenada se extrajo con éter (3 x 5 litros). Las fases orgánicas combinadas se secaron con sulfato de sodio y se concentraron. El residuo se diluyó con diclorometano (DCM) (1 l) y se purificó con cromatografía en gel de sílice (una columna) para dar el producto 2 deseado (1,27 kilogramos, 95 %). TLC (éter de petróleo (PE)/acetato de etilo (EA) = 30/1). Rf (Compuesto 1) = 0,2. Rf (Producto 2) = 0,6.

[0079] En un reactor de 50 litros con un termómetro y un agitador se añadieron 2,3,5-trimetil-[1,4]benzoquinona (2) (780 g, 5,2 mol, 1,0 eq), ácido decanoico (895 g, 5,2 mol, 1,0 eq) y acetonitrilo (15 l). Se convirtió en una solución transparente después de agitar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se añadió en una porción nitrato de plata (882 g, 5,2 mol, 1,0 eq). La mezcla de reacción se calentó hasta 75 °C. Se añadió gota a gota una solución de persulfato de potasio (1,54 kg, 5,7 mol, 1,1 eq) en agua (30 l) durante 2 horas. Después de la adición, la reacción se agitó durante 3 horas más a 75 °C. La solución se enfrió a temperatura ambiente. La capa acuosa se drenó en 15 litros de agua, que se extrajeron con acetato de etilo (3 x 5 litros). Las fases orgánicas combinadas se secaron con sulfato de sodio y se filtraron. El filtrado se concentró para dar un residuo amarillo, que se cristalizó con metanol caliente (800 ml). El sólido se filtró y se lavó con una pequeña cantidad de metanol y éter, y se secó al vacío para proporcionar 2,3,5-trimetil-6-nonilciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona (3) (447 g) como un aglomerado de cristales amarillos. El filtrado se concentró y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en columna (éter de petróleo:acetato de etilo, 100:1) para proporcionar 155 g adicionales de 2,3,5-trimetil-6-nonilciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona (3) (cantidad total: 602 g, 42 %). TLC (éter de petróleo/acetato de etilo (PE/EA) = 30/1). Rf (Compuesto 2) = 0,5. Rf (Producto 3) = 0,6. 1H-RMN (400 MHz, CDCh) 52,46 (s, 2H), 2,02 2,01 (m, 9H), 1,35-1,26 (m, 22H), 0,88-0,86 (m, 5H). Ag = 45 ppm. Punto de fusión 49,9.

[0080] El producto tenía un alto contenido de plata y, debido a la combinación de dos aislamientos, uno procedente de la trituración de MeOH y el otro de la cromatografía en columna, el producto era una mezcla no homogénea que comprendía partículas finas así como grandes trozos de compuesto.

Ejemplo 1B. Recristalización de 2,3,5-trimetil-6-nonilcidohexa-2,5-dieno-1,4-diona (C9)

[0081]Resumen.El producto se preparó, después del pretratamiento con NaCl, mediante recristalización en 2-propanol (IPA)/agua (H2O) seguido de digestión, recolección y secado mediante aire y vacío. El material de partida (C9 preparado en el Ejemplo 1A, 99,9 g) tenía un alto contenido de Ag (45 ppm), por lo que se realizaron un lavado con salmuera y dos lavados con agua en una solución de metil tert-butil éter (MTBE) del compuesto C9 antes del secado y recristalización. La solución MTBE de C9 se filtró a través de un filtro de 2,7 |_im para eliminar cualquier partícula presente después del lavado con cloruro de sodio (NaCl). Durante el intercambio de disolvente de MTBE al disolvente de recristalización IPA, se formó un sólido marrón en solución que requirió una filtración en caliente para eliminarlo. El sólido color marrón probablemente resultó de la exposición a la luz de la solución de quinona y no se analizó más a fondo. La solución de color amarillo chillón filtrada se protegió luego de la luz, se concentró y

se disolvió en IPA al 85 %/H2O (486 g/98 g) a 40 °C. Se retiró el calor y se formaron cristales a 35 °C. La suspensión se dejó agitar durante 48 h a 16 °C, se enfrió a 0 °C y los sólidos se recogieron, se lavaron y se secaron hasta un peso constante bajo aire y vacío (-125 mmHg) para dar 82,1 g (82,1 %) de agujas finas amarillas. El material se analizó mediante R<m>N, UPLC, LCMS, IR y MP.

[0082]Eliminación de Ag mediante lavado con NaCl.Se disolvió C9 crudo (99,9 g, preparado en el Ejemplo 1A) como un conglomerado amarillo de polvo mixto y cristales en 500 ml de metil tert-butil éter (MTBE) y el líquido amarillo turbio con pequeñas motas negras (1-2 mm) se lavó con salmuera (100 ml, 20 % en peso de NaCl en H<2>O). Se retuvo la capa superior orgánica amarilla turbia, se desecharon la capa fragmentada(rag layer)y las fases acuosas claras e incoloras. La fase orgánica se lavó con agua (2 x 100 ml) y se secó con sulfato de sodio anhidro (Na<2>SO<4>, 35 g). La solución amarilla transparente se filtró a través de un filtro Whatman Tipo 3 de 55 mm (6 |_im) apilado sobre un filtro Whatman GF/D de 55 mm (2,7 |_im) y los vasos se enjuagaron con MTBE (2 x 20 ml). Se añadió IPA (100 ml) y se concentró mediante rotovapor (125-90 mmHg, baño de 40-25 °C) para dar una suspensión de color amarillo chillón (180 g). Se añadió iPa (348 g) y la suspensión se calentó hasta la transparencia (35 °C, 120 mmHg) durante 20 min, luego se redujo la presión a 60 mmHg y se redujo el volumen hasta que comenzaron a formarse cristales (~45 min). No había olor a MTBE en la suspensión resultante. La suspensión se concentró a 35 °C hasta un peso de 182 g, se añadió IPA (404 g), se calentó a 40 °C hasta que se disolvió y se concentró hasta dar un sólido amarillo (35 mmHg). Se añadió IPA (500 ml) y se dejó en agitación durante la noche.

[0083]Filtración para eliminar sólidos marrones.Se observaron motas marrones en la solución de IPA y se eliminaron mediante filtración en caliente (~40 °C) a través de un filtro Whatman tipo 3 (8 |_im) y Whatman GF/D (2,7 |_im) apilados de 55 mm. Un residuo marrón pegajoso quedó atrapado en el filtro y la solución transparente de color amarillo chillón se concentró hasta obtener un sólido amarillo mediante rotovapor.

[0084]Recristalización.Al sólido amarillo se le añadió IPA (486 g), el recipiente se calentó a 40 °C y se añadió agua (98 g) a la solución amarilla transparente. El calor se redujo a 21 °C durante 2 h para dar una suspensión de agujas de color amarillo chillón. La suspensión se agitó durante 48 h a 16 °C, se enfrió a 0 °C y la suspensión espesa de color amarillo se filtró (Whatman #54, Buchner de 150 mm). Las agujas amarillas finas se enjuagaron con IPA/H2O (2 x 250 ml, 0 °C) e IPA (100 ml, 0 °C) al 85 % muy frías. Los sólidos se dejaron bajo succión durante 1 h, se instaló una barrera de nitrilo en el embudo Buchner y se mantuvo bajo vacío centralizado (-100 mmHg) durante la noche. Los cristales amarillos (88,9 g) todavía tenían olor a IPA, por lo que se retiraron a un nuevo filtro/Buchner (el embudo se había tapado con residuo de C9) y se mantuvieron al vacío (100 mmHg, 6 h) hasta un peso constante (82,1 g, 82,1 %). Se transfirieron a una botella Schott-Duran ámbar tipo I de 500 ml a temperatura ambiente para su almacenamiento. ~280 ml de volumen de cristales (82,1 g).

[0085] Análisis CoA por métodos calificados: Contenido de agua (KF) = 0,05 %; Contenido de disolvente = 0,23 %; Pureza por Hp LC = 100 % AUC; Punto de fusión por DSC = 53,0 °C; Contenido de Ag <2,00 ppm; Residuo de ignición = 0,02 %; Potencia (calculada) = 99,71 %, forma cristalina concordante con el patrón A.

La potencia se calcula como sigue (% de pureza de área por HPLC/100) * (100 - % en peso de contenido de agua (KF) - % en peso de disolventes residuales - % en peso = residuo de ignición (ROI)).

Ejemplo 2. Análisis de recristalización

[0086] Como se muestra en los Ejemplos 1A y 3A, los métodos sintéticos para preparar C9 dieron como resultado un producto que tenía una o más características no deseadas, tales como un alto contenido de plata, pegajosidad del producto y tamaños y distribución de partículas no deseados. Como se ha analizado anteriormente, la recristalización puede mejorar las propiedades del producto. En consecuencia, se analizaron diversos disolventes para determinar su idoneidad para recristalizar C9.

[0087] Se colocaron 100 mg de C9 en tubos de ensayo y se añadió disolvente y se anotó cualquier cambio. Luego se calentaron brevemente las muestras con una pistola de calor (a aproximadamente 45-50 °C), se anotó la solubilidad, se dejaron enfriar a temperatura ambiente y se anotó la solubilidad, luego se enfriaron a 0 °C y se anotó la solubilidad. Los resultados se encuentran en la siguiente tabla.

T l 1. An li i i lv n r l r ri liz i n

[0088] Los siguientes disolventes se descartaron como inadecuados porque el C9 era demasiado soluble a bajas temperaturas: MeCN, THF.

[0089] Los siguientes disolventes se descartaron como inadecuados porque el C9 no era suficientemente disolvente a temperaturas más altas: agua.

[0090] Los siguientes disolventes se descartaron como inadecuados porque el material C9 se fundió antes de la disolución: EtOH al 80 %. Esto es desfavorable, ya que se formará un aceite suspendido en la solución. Al enfriarse puede cristalizar, pero los cristales generalmente no serán homogéneos ni aumentarán en pureza.

[0091] El EtOH al 95 % se descartó por considerarlo inadecuado porque contiene MeOH y acetona, lo que puede resultar problemático para los productos farmacéuticos.

[0092] El metanol y el etanol fueron menos preferidos debido a sus bajos puntos de ebullición. Además, las agujas largas de MeOH fueron menos preferidas porque los cristales de agujas largas son más difíciles de transferir y filtrar que las partículas más compactas.

[0093] Se observó que el etanol producía material casi completamente soluble cuando estaba caliente y parcialmente soluble cuando estaba frío. El IPA también mostró un comportamiento similar, pero fue soluble a temperatura alta a razón de 100 mg/ml y parcialmente soluble a temperatura ambiente/frío. Las mezclas de etanol/agua se examinaron inicialmente para determinar sus propiedades de solubilidad, pero se rechazaron porque el compuesto C9 se volvió aceitoso a >40 °C. Dado que el IPA tenía una solubilidad ligeramente mejor sin engrasarse a temperaturas más altas antes de la disolución completa, y el IPA era miscible con un buen antisolvente (H<2>O), se analizó después de que el etanol resultara inadecuado. El IPA/H<2>O al 70 % provocó problemas de fusión y de formación de aceite, mientras que el IPA al 100 % no fue idealmente insoluble a temperaturas frías. En consecuencia, se probaron concentraciones de IPA entre el 70 y el 100 %.

[0094] Las soluciones de prueba en una escala de 1 g determinaron que IPA/agua al 75-85 % daban buena solubilidad (~10:1 vol:p), cristales finos que eran filtrables y soluciones que podían calentarse y enfriarse para producir una fusión/cristalización predecible. La siembra no pareció ser necesaria. Se requirió una filtración en caliente, ya que se formó un material marrón durante la cristalización cuando la solución se dejó expuesta a la luz ambiental durante> 1 h. Esto sólo se observó cuando la solución estuvo expuesta a la luz. La recuperación fue del 92,7 % de las agujas finas y el análisis UHPLC del sobrenadante fue del 91 % a/a frente al 99 % para el sólido, lo que indica que el sobrenadante estaba eliminando impurezas. Se obtuvieron agujas finas amarillas, que se filtraron y lavaron fácilmente con buena recuperación. La UHPLC mostró una mejora en el % del área de UHPLC y todos los cristales fueron de tamaño similar y fluían fácilmente una vez secos.

Ejemplo 3A. Síntesis de 2,3,5-trimetil-6-nonilcidohexa-2,5-dieno-1,4-diona

[0095]

[0096] La solución agitada del compuesto 1 (2,0 kg, 13,15 moles, 1,0 eq) en diclorometano (20 l) se agitó a 23 °C durante 30 min. Se añadió gota a gota una solución de cloruro férrico (5,33 kg, 32,88 mol, 2,5 eq) en agua (19,04 l) durante 22 h. La mezcla de reacción se agitó durante otras 2 horas a esta temperatura. La HPLC mostró el compuesto 1 estaba completamente consumido. Se separó la fase orgánica. La capa acuosa drenada se extrajo con diclorometano (2 x 10 l). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua (2 x 20 l), salmuera (2 x 10 l) y se secaron con sulfato de sodio (aproximadamente 5 kg) y se concentraron para dar el compuesto crudo 2 (1,95 kg, crudo), que se usó directamente en el siguiente paso sin purificación adicional.

[0097] Una mezcla de compuesto 2 (1,25 kg, 8,33 mol, 1,0 eq) y ácido decanoico (1,44 kg, 8,33 mol, 1,0 eq) en acetonitrilo (25 l) se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se añadió nitrato de plata en una porción (353,9 g, 2,08 mol, 0,25 eq.). La mezcla de reacción se calentó hasta los 75 °C. Se añadió gota a gota una solución de persulfato de potasio (2,48 kg, 9,17 mol, 1,1 eq.) en agua (100 l). Después de la adición, la reacción se agitó durante 3,5 horas más a 75 °C. La HPLC mostró que el compuesto 2 estaba completamente consumido. La solución se enfrió a temperatura ambiente. La capa acuosa se drenó en 50 litros de agua, que se extrajo con acetato de etilo (3 x 10 litros). La fase orgánica combinada se lavó con cloruro sódico acuoso (5 l), se secó con sulfato sódico (aproximadamente 5 kg) y se filtró. El filtrado se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (PE, PE/EA, 50/1) para dar un producto crudo. El producto se obtuvo en forma de aceite después de cromatografía en columna ultrarrápida (FCC) (se solidificó después de reposar). Se cargó rápidamente en un matraz de tres bocas antes de solidificarse. El aceite se agitó y se formó un sólido con agitación. El sólido se trituró con metanol (2 volúmenes, añadidos gota a gota, como cantidad de producto crudo después de la purificación en columna) durante la noche (~15 horas) a temperatura ambiente (20-30 °C) y se filtró. La torta obtenida se lavó con metanol (500 ml) y se secó al vacío; El sólido se cargó en un rotavapor de 20 L con bomba de vacío (0,5 mmHg) en un baño de agua (<30 °C), durante 7 días, 8 horas/día, para eliminar los disolventes residuales: acetonitrilo, metanol, diclorometano y acetato de etilo) para producir C9 (1,28 kg, 56 %) como un cristal amarillo. El producto se extendió en un recipiente de acero inoxidable y se machacó con un mortero para obtener un tamaño similar. El proceso de molienda se repitió varias veces. Se intentó tamizar el sólido. Sin embargo, el sólido no se pudo tamizar porque el producto se pegó al tamiz (malla de 100). Debido a que la molienda de este material es difícil, las partículas derivadas son grandes y serán difíciles de formular.

[0098] TLC (PE/EA = 30/1). Rf (Compuesto 2) = 0,5. Rf (C9) = 0,8. LC-MS: n/a.

[0099] 1H-RMN (400 MHz, CDCla) 52,45-2,42 (t,j= 7,4 Hz, 2H), 1,99-1,94 (m, 9H), 1,24 (m, 16H).

[0100] Ensayo = HPLC 92,2 % p/p frente al estándar de referencia.

Ejemplo 3B. Recristalización de 2,3,5-trimetil-6-nonilcidohexa-2,5-dieno-1,4-diona

[0101]Resumen.En este ejemplo se resume la recristalización de C9 en un lote de ingeniería de 10 g y la recristalización posterior de 2,4 kg de C9 (ambas muestras proporcionadas en el Ejemplo 3A). Disolución del material en 2-propanol a 40 °C, seguida de la adición de agua para lograr una solución turbia que se pasó por un filtro abrillantador con camisa a 40 °C. La solución transparente resultante se enfrió lentamente a 32 °C, después de lo cual el producto cristalizó espontáneamente en forma de agujas amarillas finas. Un enfriamiento adicional por etapas a 16 °C y luego a 0 °C proporcionó una suspensión que se recogió mediante filtración y se enjuagó con 2-propanol al 85 % en agua. El sólido resultante se secó al vacío a 25 °C hasta peso constante para dar el producto (1,975 kg) con una recuperación del 82 %. El sólido aislado fue probado y pasado por DSC, IR y 1H-RMN.

Comentarios

[0102] Las ventajas del procesamiento descrito en este documento son: permite la formación controlada de un sólido verdaderamente cristalino, sin formación de aceite; no hay necesidad de cristales simiente; un aumento en el ensayo/pureza; falta de pegajosidad con buenas propiedades de fluidez; una distribución del tamaño de partículas más ajustada; y partículas de forma regular que son más fáciles de aislar y secar. Si es necesaria, se espera que la molienda de este material sea sencilla.

[0103] El análisis por LCMS del C9 suministrado (preparado según el Ejemplo 3A, 92,2 % puro) mostró una impureza importante mediante el recuento total de iones (TIC) que no era visible en UV254 o mediante el detector de dispersión de luz evaporativa (ELSD). La impureza se purgó eficientemente en el producto recristalizado con una alta recuperación de la impureza en las aguas madre.

[0104] El protocolo de enfriamiento implementado produjo cristales sin formación de aceite o sin requerir el uso de cristales simiente, la cristalización se produjo a 32 °C.

[0105] El aislamiento del producto final proporcionó una torta húmeda que se transfirió a un horno de secado a 25 °C sin el uso de una barrera de nitrilo.

Recristalización (2,4 kg).

[0106] A un reactor con camisa de 50 litros equipado con un agitador mecánico superior, toma de argón y una sonda de temperatura recubierta de teflón se le añadieron C9 (2400 g) y 2-propanol (15,6 litros, Fisher A416). La mezcla se agitó a 75 r.p.m. en una atmósfera de argón y el reactor se cubrió con papel de aluminio. La camisa del reactor se calentó a 41 °C (temperatura interna 40 °C) y se agitó durante 60 minutos para hasta convertirla en una solución transparente.

[0107] A la reacción se le añadió agua desionizada (2,5 l, Ricca 9150-5) y la solución se agitó durante 90 minutos. La solución se pasó por filtro abrillantador a través de un embudo con camisa de vidrio sinterizado P4 (10-16 um) a 40 °C usando presión positiva de argón (8 psi) y se recogió en un garrafón de vidrio de 20 litros.

[0108] El reactor de 50 litros se enjuagó con 2-propanol (2 litros, Fisher A416) y se drenó hasta obtener residuos orgánicos.

[0109] El sobrenadante transparente (36 °C) se devolvió al reactor con camisa de 50 litros equipado con un agitador mecánico superior, toma de argón y una sonda de temperatura recubierta de teflón, y se volvió a calentar a 40 °C. La solución se agitó a 75 r.p.m. y se enfrió a 32 °C durante 6 horas y luego se mantuvo a 32 °C durante 6 horas más. Se habían formado cristales. La suspensión se enfrió a 24 °C durante 1 hora y se enfrió adicionalmente a 16 °C durante 1 hora y se enfrió a 0 °C durante 1 hora.

[0110] El sólido se recogió en un embudo de vidrio sinterizado P4 (10-16 um) usando presión positiva de argón (8 psi). La torta de filtración se enjuagó con 2-propanol/agua (85/15 v/v, 2x6 l) y se secó en una corriente de argón durante 2 horas para dar 3450 g de un sólido amarillo. El sólido se transfirió a una estufa de vacío y se secó al vacío a 25 °C durante 240 horas. El peso se comprobó a intervalos de aproximadamente 24 horas hasta que se alcanzó un peso constante para dar el producto final C9 (1975 g, rendimiento del 82,2 %) como un sólido cristalino amarillo que fluye libremente. El análisis DSC del sólido mostró un inicio de fusión a 48,66 °C y un punto de fusión de 50,13 °C. El ensayo por HPLC mostró una pureza a/a del 99,4 %.

[0111] Las aguas madre se concentraron a presión reducida para dar 400 g de un aceite rojo. El análisis del aceite mostró algo de producto, con un pico de impureza importante por TIC que no parecía tener una absorbancia apreciable a 254 nm. El peso molecular de la impureza parecía ser de 373 (M+H = 374 uma).

[0112] Análisis de CoA por métodos calificados: Contenido de agua (KF) = 0,06 %; Contenido de disolvente = 0,24 %; Pureza por HPLC = 100 % AUC; Punto de fusión por DSC = 53,0 °C; Contenido de Ag <2,00 ppm; Residuo de ignición = <0,01 %; Potencia (calculada) = 99,69 %, forma cristalina concordante con la forma A.Ejemplo 4. Polimorfo de 2,3,5-trimetil-6-nonilcidohexa-2,5-dieno-1,4-diona

RESUMEN

[0113] A continuación se proporciona un resumen del Patrón A tal como se recibió y su fusión.

CARACTERIZACIÓN

[0114] El sólido tal como se recibió (ID 1-1, producido según los Ejemplos 1A y 1B) era un polvo amarillo ligeramente pegajoso. El recipiente se almacenó en refrigeración a 5 °C. Como el material era sensible a la luz, el recipiente y todos los viales de muestra se protegieron de la exposición a la luz con viales de color ámbar o cubiertos con papel de aluminio. El análisis XRPD del material (ID 1-1) mostró que el material era cristalino y tenía picos de alta intensidad a 4, 12 y 16 °20, así como varios otros picos de menor intensidad; este patrón fue designado como Patrón A (Figura 5). En la Tabla 2 se muestra una lista de picos con espaciado d e intensidad.

T l 2. Li i XRPD r m ri l ID 1-1. r i r n i n in n i r l iv >

[0115] El material (ID 1-1) se disolvió en MeOD y se analizó mediante 1H-RMN (Figura 6). El espectro de RMN fue coherente con la estructura de 2,3,5-trimetil-6-nonilcidohexa-2,5-dieno-1,4-diona. También es coherente con que sea anhidro y no un solvato.

[0116] La DSC del material (ID 1-1) mostró un inicio de fusión a 48,70 °C (Figura 7). La TGA/DSC simultánea mostró un inicio de fusión que coincidía con la DSC, con un paso asociado para la pérdida de peso del 0,26 % (Figura 8). El resumen de los datos de DSC, incluidos los detalles del método, se muestra en la Tabla 3.

T l . Li i r rm r m D m ri l ID 1-1*.

[0117] Se capturaron imágenes de microscopía del material tal cual se recibió (ID 1-1) con un aumento de 100X (Figura 9A) y 400X (Figura 9B). El material mostró una morfología rectangular en forma de placa.

[0118] La valoración Karl Fischer (KF) para determinar el contenido de agua se realizó con dos muestras de material tal cual se recibió (ID 1-1), la primera con 24 mg y la segunda con 43 mg; sin embargo, ninguna de las muestras proporcionó una medición realizada por el titulador. Esto indicó que el contenido de agua del material estaba por debajo del límite de detección del instrumento (> 1 ppm). Este resultado es coherente con que el material sea anhidro (ppm).

[0119] El material tal cual se recibió (ID 1-1) se sometió a ciclos de humidificación mediante un instrumento de sorción dinámica de vapor (DVS). El material experimentó un cambio de masa del 0,01 % en el rango de humedad relativa del 15 al 75 %, y un cambio de masa del 0,08 % en el rango completo de humedad relativa del 2 al 95 %. El gráfico de isotermas se muestra en la Figura 10. Después del ciclo de humidificación, el sólido se analizó mediante XRPD. El patrón observado no cambió con respecto al sólido recibido (ID 1-1), Patrón A; Los datos de XRPD se muestran en la Figura 11. Estos resultados demuestran que el material no es higroscópico.

[0120] Una muestra del sólido recibido se disolvió a una concentración de 0,5 mg/ml y se inyectó mediante HPLC para analizar la pureza. No se observaron impurezas. El cromatograma se muestra en la Figura 12.

Tratamiento térmico

[0121] Se pesaron 15 mg de material tal cual se recibió (ID-1-1) en un recipiente DSC y se sometieron a tratamiento térmico en el instrumento DSC independiente con un método que calentaba a 60 °C a 10 °C/min y luego enfriaba a 10 °C a razón de 2 °C/min. El material resultante se recuperó del recipiente y se sembró para análisis XRPD (ID-10-1). El material se fundió con un inicio exotérmico de 48,74 °C y recristalizó con un inicio exotérmico de 22,58 °C. El material recuperado mostró el Patrón A por XRPD. El termograma del tratamiento DSC se muestra en la Figura 13. Los datos XRPD se muestran en la Figura 14.

Microscopía de platina caliente

[0122] Se empleó un sistema de platina caliente Linkam para capturar imágenes del sólido recibido (ID-1-1) durante la fusión. Se colocó una pequeña cantidad de material en un portaobjetos de microscopio dentro de la platina caliente y se empleó un método de rampa de temperatura para pasar de 30 °C a 55 °C a una velocidad de 1 °C/min. Se capturó una serie de imágenes con un aumento de 200X durante la rampa. No se observaron cambios morfológicos hasta la fusión (datos no mostrados). Después de la fusión, la platina caliente se enfrió de nuevo a temperatura ambiente de forma natural y el material se controló con un aumento de 200X para detectar recristalización, pero no se observaron sólidos; la muestra apareció como un cristal. El material se manipuló con una aguja de calibre 21 para intentar la nucleación del cristal. Luego se retiró el portaobjetos de la platina caliente y se capturó una imagen con un aumento de 200X; el material resultante apareció sin cambios (datos no mostrados). Esto muestra que el compuesto puede existir como forma líquida fundida (amorfa) a temperatura ambiente.

Estabilidad en forma sólida.

[0123] La estabilidad en forma sólida del material se evaluó durante una semana. Se colocaron 49,0 mg de ID-1-1 dentro de un vial de 4 ml cubierto con papel de aluminio, que se cubrió con una toallita KimWipe. Este vial se colocó dentro de un vial de 20 ml que contenía cloruro de sodio acuoso saturado. El vial se colocó en una placa caliente a 40 °C durante 7 días, creando una atmósfera de 75 % de humedad relativa en el sistema. Después de 7 días, se tomaron muestras del sólido para HPLC (ID-4-1).

[0124] El cromatograma resultante no mostró ninguna impureza en la muestra de estabilidad. El cromatograma se muestra en la Figura 15. Se sembró una muestra del material sometido a estrés y se analizó mediante XRPD; el patrón observado fue el Patrón A. Los datos de XRPD se muestran en la Figura 16. Se capturaron imágenes de microscopía de ID-4-1 con un aumento de 100X y 400X. Las imágenes se muestran en la Figura 17A (100X) y la Figura 17B (400X).

[0125] Una muestra de la forma sólida se calentó a 55 °C hasta que se fundió, luego se enfrió a temperatura ambiente durante 5 minutos y un difractograma XRPD mostró que era amorfa (Figura 31). A 20 °C, la masa fundida finalmente se solidificó en el Patrón A, como se ve en un experimento de DSC con ciclos de temperatura (Figura 32). Esto indica que la forma líquida amorfa es metaestable y se convierte al Patrón A.

Solubilidad en agua y fluidos simulados.

[0126] La solubilidad del patrón A y del sólido fundido se evaluó en fluido gástrico simulado en estado de ayunas (FaSSGF), fluido intestinal simulado en estado de alimentación (FeSSIF) y fluido intestinal simulado en estado de ayunas (FaSSIF), agua y metilcelulosa al 0,5 % Tween80 al 2 % en agua. Se prepararon cinco viales de 4 ml cubiertos con papel de aluminio con 11-13 mg de material tal cual se recibió (ID-1-1), se incluyeron barras agitadoras de 10 mm. Se fundieron cinco viales de 4 ml cubiertos con papel de aluminio que contenían entre 11 y 13 mg de C9 en una placa caliente a 70 °C durante 10 minutos y se enfriaron a temperatura ambiente durante 5 minutos; se incluyeron barras agitadoras de 10 mm.

[0127] Se prepararon suspensiones con el material ID-1-1 tal como se recibió (Patrón A) y C9 fundido, cada uno en 2,5 ml de fluidos simulados (incluyendo metilcelulosa al 0,5 % Tween80 al 2 % en agua), o agua. Las muestras que contenían el principio activo (PA) fundido se sonicaron brevemente, ya que parecían contener grumos de material. Tanto el pH como la solubilidad se evaluaron a los 30 minutos y 24 horas. Para el análisis de solubilidad, se pipeteó 1 ml de cada muestra en un filtro de jeringa, los primeros 0,5 ml se filtraron nuevamente al vial original y los 0,5 ml restantes se filtraron en viales de HPLC con insertos de bajo volumen.

[0128] El factor de respuesta calculado con los puntos de calibración se utilizó para determinar las concentraciones de PA en los fluidos y el agua simulados. Las muestras de calibración se prepararon con material tal cual se recibió (ID-1-1) en ACN. Se trazaron las concentraciones y las áreas de los picos para cada punto de calibración y se calculó un factor de respuesta para la evaluación de la solubilidad.

[0129] El diseño experimental y los datos resultantes se muestran en la Tabla 5. El resto de cada suspensión se filtró y se sembró en placas para análisis XRPD. Todos los patrones observados fueron el Patrón A (datos no mostrados).

Tabla 5. Diseño ex erimental datos resultantes de la solubilidad en fluidos simulados a ua

[0130] Debido a las altas presiones observadas con la columna UPLC, se empleó una columna diferente y un método modificado para puntos de datos de 24 h con metilcelulosa al 0,5 % Tween80 al 2 % en agua y 24 h en agua (ID-30-4, ID- 30-9 e ID-30-10). Las muestras de HPLC de ID-30-4 y 30-9 (aquellas que contenían la mezcla de metilcelulosa/Tween80) se diluyeron 10 veces con ACN. Se analizaron estas muestras más un nuevo conjunto de inyecciones de los puntos de calibración, se determinó un nuevo factor de respuesta y se calculó la solubilidad de las muestras restantes (factor de respuesta: 8084,7908; R2: 0,9989).

Ejemplo 5. Morfología cristalina de C9 de los Ejemplos 3A y 3B

Resumen.

[0131] El material de los lotes descritos en los Ejemplos 3A y 3B eran sólidos cristalinos visualmente amarillos.

[0132] Se tomaron múltiples imágenes de microscopía para cada lote con 3 aumentos diferentes (25X, 10X, 400X) para evitar sesgos al capturar imágenes. El primer lote, ID-38-1 (Ejemplo 3B), mostró partículas en su mayoría más grandes mediante microscopía, que oscilaban entre aproximadamente 100 |_im y más de 600 |_im. En general, las partículas tenían forma regular, rectangular y algo plana, y demostraron una buena birrefringencia.

[0133] El segundo lote, ID-38-2 (Ejemplo 3A), mostró partículas significativamente más pequeñas en general en comparación con el primer lote. Se observó una gama de partículas de entre aproximadamente 50 y 350 |_im, y estas partículas tendían a tener una forma más granular o irregular. También hubo una notable aglomeración de partículas más pequeñas adheridas a las partículas más grandes, a diferencia del primer lote en el que se observaron de manera constante partículas individuales.

Resultados.

[0134] Se llevó a cabo una microscopía de ID-38-1 (Ejemplo 3B) con 3 aumentos diferentes: 25X, 100X y 400X. Este lote particular de C9 demostró una amplia gama de tamaños de partículas mediante microscopía.

[0135] En la Figura 18, con un aumento de 25X, fue posible ver la variación en los tamaños y formas de las partículas. Predominantemente se observaron placas rectangulares; sin embargo, también había algunas formas bidimensionales irregulares. Con un aumento de 100X, Figura 19, las longitudes oscilaron entre aproximadamente 100 |_im y 600 |_im; se observó birrefringencia. Con un aumento de 400X, las partículas eran demasiado grandes para caber dentro del marco, pero las formas birrefringentes rectangulares suaves se observaron bien (Figura 20).

[0136] Se llevó a cabo una microscopía de ID-38-2 (Ejemplo 3A) con 3 aumentos diferentes: 25X, 100X y 400X. Este lote particular de C9 mostró partículas más pequeñas en general en comparación con ID-38-1 (Ejemplo 3B), menos birrefringencia y más partículas aglomeradas pequeñas "pegadas" a algunas de las partículas más grandes observadas.

[0137] En la Figura 21, se observaron pequeñas partículas aglomeradas con un aumento de 25X. Con un aumento de 100X, Figura 22, las partículas de forma granular se volvieron más visibles en un rango de aproximadamente 50 |_im a 350 |_im. También se observaron varias partículas aglomeradas más pequeñas. Con un aumento de 400X, Figuras 23a y 23B, las partículas se observaron dentro del marco, a diferencia de ID-38-1 (Ejemplo 3B). Se observaron partículas translúcidas con forma esférica y también se observó birrefringencia en muchas de las partículas. Se capturaron múltiples imágenes con este aumento para demostrar la gran variedad de tamaños de partículas observados, así como para ver las partículas más pequeñas que estaban aglomeradas en algunos de los sólidos más grandes.

Comparación de Lotes.

[0138] A continuación se proporciona una comparación directa de ID-38-1 (Ejemplo 3B) e ID-38-2 (Ejemplo 3A). Con un aumento de 25X, se observó rápidamente la diferencia en morfología y tamaño entre los dos lotes, Figura 24. En la Figura 25, con un aumento de 100X se observaron más partículas individuales para ID-38-1 en comparación con ID-38-02, en el que se observaron partículas pequeñas aglomeradas sobre las más grandes. Con un aumento de 400X, Figura 26, las partículas eran demasiado grandes para caber en el marco de ID-38-1 (Ejemplo 3B), pero se observó claramente la morfología suave en forma de placa, mientras que una vez más se observaron pequeñas partículas aglomeradas en sólidos más grandes para ID-38-2 (Ejemplo 3A).

Microscopía

[0139] La microscopía óptica se realizó utilizando un microscopio de imágenes digitales Zeiss AxioScope A1 equipado con polarizador y objetivos de 2,5X, 10X, 20X y 40X. Las imágenes se capturaron a través de una cámara digital Axiocam 105 incorporada y se procesaron utilizando el software ZEN 2 (edición azul) proporcionado por Zeiss.

Ejemplo 6. Distribución del tamaño de partículas de C9 de los ejemplos 3A y 3B

[0140]Resumen.La distribución del tamaño de partículas para C9 del Ejemplo 3A (crudo) y 3B (recristalizado) se determinó usando un Mastersizer 3000 de Malvern.

[0141]Ejemplo 3A, Preparación 1.Se pesaron 24,4 mg de muestra de C9 en un vial. Se agregaron aproximadamente 20 ml de agua. Se añadieron al vial 20 gotas de octilfenoxipolietoxietanol (IGEPAL) al 5 % en una solución acuosa. La solución se tapó y se mezcló suavemente.

[0142]Ejemplo 3A, Preparación 2.Se pesaron 25,2 mg de muestra de C9 en un vial. Se agregaron aproximadamente 20 ml de agua. Se agregaron al vial 20 gotas de IGEPAL al 5 % en solución acuosa. La solución se tapó y se mezcló suavemente.

[0143]Ejemplo 3B, Preparación 1.Se pesaron 24,7 mg de muestra de C9 en un vial. Se agregaron aproximadamente 20 ml de agua. Se agregaron al vial 20 gotas de IGEPAL al 5 % en solución acuosa. La solución se tapó y se mezcló suavemente.

[0144]Ejemplo 3B, Preparación 2.Se pesaron 25,2 mg de muestra de C9 en un vial. Se agregaron aproximadamente 20 ml de agua. Se agregaron al vial 20 gotas de IGEPAL al 5 % en solución acuosa. La solución se tapó y se mezcló suavemente.

Observaciones visuales de muestras de PSD.

[0145] Se observó que las muestras del Ejemplo 3A eran sólidos muy no uniformes. Se observaron muchas partículas grandes en las muestras. Ambas preparaciones contenían una falta de uniformidad similar.

[0146] Se observaron cristales muy grandes en las muestras del Ejemplo 3B. La observación visual ha indicado cristales muy pequeños o cristales más grandes en ambas preparaciones de muestras. La preparación de la muestra 2 contenía visualmente más partículas más pequeñas/finas que la preparación de la muestra 1.

Distribución de tamaño de partícula.

[0147] La distribución del tamaño de partícula se determinó mediante difracción láser, utilizando un Mastersizer 3000 de Malvern. Los ajustes se muestran en la Tabla 6. Se utilizaron los mismos ajustes para las otras muestras. Los resultados se muestran en la Tabla 7.

Tabla 6. nfi r i n l in r m n M lv rn r l m l A r ración 1

T l 7. Di ri i n l m ñ rí l r m r .

[0148] Como se muestra en la Tabla 7, ambos ejemplos se componen de partículas bastante grandes, pero de media 3B es bastante más grande: d medio (v, 0,5 um) = 278 |_im para 3A y 433 |_im para 3B. Sin embargo, 3A tiene una distribución de tamaño más amplia, probablemente debido al fresado parcial (d(v, 0,1 a 0,9) = ~60 |_im a 925 |_im para 3A frente a d(v, 0,1 a 0,9 = ~133 a 878 |_im) para 3B. Un ejemplo representativo de cada análisis se muestra en las Figuras 27 y 28 (Ejemplo 3A preparaciones 1 y 2 y en las Figuras 29 y 30 (Ejemplo 3B preparaciones 1 y 2). Como se ve en las Figuras 27 y 29, las muestras del Ejemplo 3A tienen una distribución de tamaño de partícula más amplia y también una característica bimodal en comparación con las muestras del Ejemplo 3B (recristalizadas). Hay un rango de distribución más reducido entre D90 y D10 en las muestras del Ejemplo 3B (una proporción de 6,6:1), en comparación con las muestras del Ejemplo 3A (proporción de 15,5:1). D10 representa el diámetro de partícula correspondiente al 10 % acumulativo (de 0 a 100 %) de distribución de tamaño de partícula con tamaños por debajo (es decir, el porcentaje de partículas más pequeñas que D10 es del 10 %). D90 representa el diámetro de partícula correspondiente al 90 % acumulativo (de 0 a 100 %) de distribución de tamaño de partícula con tamaños por debajo (es decir, el porcentaje de partículas más pequeñas que D90 es del 90 %). En las Figuras 27 a 30 se muestran ejemplos representativos de cada preparación (Ejemplo 3A preparación 1, Ejemplo 3A preparación 2, Ejemplo 3B preparación 1, Ejemplo 3B preparación 2, respectivamente). Como se ve en las Figuras 27-30, las muestras del Ejemplo 3A tienen una distribución de tamaño de partículas más amplia que las muestras del Ejemplo 3B (recristalizadas).

Ejemplo de referencia 7. Análisis de compuestos en fibroblastos dérmicos humanos de pacientes con enfermedad de Parkinson (EP) y enfermedad de Alzheimer (EA)

[0149] Se realizó una evaluación inicial para identificar la efectividad de los compuestos para mejorar la EP y la EA. Se analizó la capacidad de las muestras de prueba y los controles de disolvente para rescatar fibroblastos de EP y EA sometidos a estrés mediante la adición de L-butionina-(S,R)-sulfoximina (BSO, un inhibidor específico de la GSH sintetasa) más hierro (por ejemplo, citrato de hierro), de manera similar a la descrita en Jauslin et al., Hum. Mol. Genet. 11(24):3055 (2002)), Jauslin et al., FASEB J. 17:1972-4 (2003), y en la solicitud internacional de patente WO 2004/003565. Esta muerte celular específica mediada por BSO se evitó o mejoró mediante la administración de los compuestos descritos en el presente documento.

[0150] Los experimentos para la EA se realizaron de la siguiente manera. Los experimentos para la EP se realizaron de manera similar; algunas condiciones específicas se indican a continuación en la Tabla 1A.

[0151] Se adquirieron MEM (un medio enriquecido en aminoácidos y vitaminas) y Medium 199 (M199) con sales equilibradas de Earle (EBS), sin rojo de fenol, en Invitrogen. El suero fetal de ternera se obtuvo en Corning. El factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) y el factor de crecimiento epidérmico (EGF) se adquirieron en PeproTech. La mezcla de penicilina, estreptomicina y glutamina, L-butionina (S,R)-sulfoximina, citrato de hierro e insulina de páncreas bovino se adquirieron en Sigma. Se compró Calcein AM en Anaspec. El medio de cultivo celular se preparó combinando 450 ml de MEM, 50 ml de suero fetal bovino, 100 U/ml de penicilina y 100 microgramos/ml de estreptomicina. El medio de ensayo se preparó combinando 125 ml de M199, 50 ml de suero fetal bovino, 100 U/ml de penicilina, 100 microgramos/ml de estreptomicina, 2 mM de glutamina, 10 microgramos/ml de insulina, 10 ng/ml de EGF y 10 ng/ml de bFGF. Se añadió MEM para completar el volumen hasta 500 ml. Se prepararon soluciones de BSO 10 mM y citrato de hierro 10 mM en agua con posterior esterilización por filtración y se almacenaron a -20 °C.

[0152] Las muestras de prueba se suministraron en viales de vidrio o de polipropileno de 1,5 ml. Los compuestos se diluyeron con DMSO para dar como resultado una solución madre 1 mM. Una vez disueltos, se almacenaron a -20 °C.

[0153] Las muestras de prueba se analizaron de acuerdo con el siguiente protocolo:

Se inició un cultivo de fibroblastos derivados de pacientes con EA o EP a partir de un vial con aproximadamente 500000 células almacenadas en nitrógeno líquido. Las células se propagaron en medio de cultivo celular, con subcultivo cada tres días mediante tripsinización en una proporción de 1:3. Una vez confluentes, los fibroblastos se recolectaron mediante tripsinización, se resuspendieron en medio de ensayo y se sembraron a una densidad celular final de 2500 células/0,1 ml por pocillo de una placa de cultivo de tejidos estándar de 96 pocillos. Las placas se incubaron 5 horas a 37 °C en una atmósfera con 95 % de humedad y 5 % de CO<2>para permitir la unión de las células a la placa de cultivo, luego se añadió solución de citrato de hierro (en agua) hasta la concentración final deseada.

[0154] Las muestras de prueba (1 mM en DMSO) se diluyeron en una solución de DMSO al 10 %:agua hasta una concentración final de 5 microM, luego se diluyeron en serie en DMSO al 10 % hasta alcanzar las concentraciones deseadas. Luego, las células se trataron con las diversas diluciones de compuestos, lo que dio como resultado una concentración final de DMSO del 1 %, y luego se incubaron a 37 °C en una atmósfera con 95 % de humedad y 5 % de CO<2>durante 18 horas.

[0155] Al día siguiente, se añadió solución de BSO a los pocillos para dar como resultado la concentración final deseada. Cuarenta y ocho horas después, se descartó el medio y se eliminó el líquido restante golpeando suavemente la placa invertida sobre una toalla de papel. Las placas se lavaron una vez con 100 microlitros por pocillo de PBS que contenía calcio y magnesio (+Ca Mg).

[0156] Luego se agregaron a cada pocillo 100 microlitros de Calceína AM (1 microM) en PBS Ca Mg. Las placas se incubaron durante 30 minutos a 37 °C. Después de ese tiempo, se leyó la fluorescencia (longitudes de onda de excitación/emisión de 485 nm y 525 nm, respectivamente) en un lector de fluorescencia Spectramax. Los datos se analizaron utilizando algoritmos estándar de ajuste de curvas de cuatro parámetros (XLFit o Prism) para determinar la concentración CE<50>de cada compuesto.

[0157] Los disolventes (DMSO, agua) no tuvieron un efecto perjudicial sobre la viabilidad de las células no tratadas con BSO ni tuvieron una influencia beneficiosa sobre los fibroblastos tratados con BSO más hierro, incluso en la concentración más alta probada (1 %).

[0158] Se descubrió que las muestras de prueba descritas en este documento rescatan células de fibroblastos de pacientes con enfermedad de Parkinson y Alzheimer de BSO más estrés oxidativo inducido por hierro.

Tabla 8. Rescate de fibroblastos de pacientes con EP a partir de estrés oxidativo inducido por BSO (125<j>M) más hi rr 12 M

Tabla 9. Rescate de fibroblastos de pacientes con EA del estrés oxidativo inducido por hierro BSO-Plus mediante

C9

[0159] Como se observa en la Tabla 8, el compuesto C9 (2,3,5-trimetil-6-nonilciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona) tenía mayor potencia que los análogos C6 y C8 para rescatar fibroblastos EP de BSO, además de estrés oxidativo mediado por hierro.

[0160] El compuesto C9 también demostró actividad para rescatar células de fibroblastos de pacientes con EA del estrés oxidativo (Tabla 9).

Ejemplo 8. Análisis de compuestos para la inhibición de la agregación de a-sinucleína

[0161]Resumen:El compuesto 2,3,5-trimetil-6-nonilciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona ("C9"), y sus análogos C8 (2,3,5-trimetil-6-octilciclohexa-2,5 -dieno-1,4-diona) y C7 (2,3,5-trimetil-6-heptilciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona) se analizaron para determinar su función como inhibidores de la agregación de aSinucleína, según se midió por la presencia y extensión de una fase de retraso en la cinética de agregación de proteínas. Se siguieron los cambios en la intensidad de la fluorescencia por el fluoróforo de unión a agregados, tioflavina T, para informar sobre la agregación de proteínas en función del tiempo.

[0162]Métodos experimentales:Se realizaron ensayos de agregación de aSinucleína circulante con 200 pM de aSinucleína humana recombinante (Proteos, Inc.) en presencia de 100 pM de compuesto (a partir de soluciones madre 10 mM en DMSO) o en DMSO al 1 % (v/v) como vehículo. Todas las soluciones se prepararon en solución salina con pH regulado con fosfato (DPBS) de Dulbecco (pH 7,4) con NaN3 al 0,03 % (v/v) y tioflavina T (ThT) 5 pM, preparada como mezcla maestra antes de la adición de la proteína o los compuestos. Luego se preparó una mezcla maestra de proteínas y se separó en 4 tubos (1 por condición). En paralelo, se creó una mezcla maestra para mediciones de fondo, en condiciones idénticas excepto en que no se agregó proteína a la solución. Se cargaron compuestos o DMSO en cada muestra, se agitaron durante 10 segundos y se centrifugaron durante 3 segundos.

[0163] Luego se cargaron la solución de proteína /- compuesto y muestras de fondo en pocillos de una placa de 96 pocillos ópticamente transparente con paredes negras (Corning Costar), que se selló con un LightCycler® 480 seal (Roche Life Science), se incubó a 37 °C durante 15 minutos para equilibrar, después de lo cual se inició la recolección de datos. Se utilizó un espectrómetro Tecan M1000 para recopilar puntos de datos sobre la fluorescencia de ThT (ex/em 450/490 nm) cada 30 minutos. La placa se agitó entre las lecturas de fluorescencia.

[0164]Análisis de datos y resultados:Se recopilaron datos de intensidad de fluorescencia en todas las muestras a lo largo del tiempo. El valor de la unidad de intensidad de fluorescencia (FIU) del punto final de la media de las muestras de aSyn tratadas con vehículo se estableció en un 100 %, y todos los demás valores de FIU se normalizaron en relación con este (véase la Figura 1A). Los resultados finales se representaron como fluorescencia de ThT normalizada (%) con respecto al tiempo.

[0165] Se utilizaron valores de fluorescencia de ThT normalizados (% FIU) en t = 24 horas para comparar muestras (véase la Figura 1B). Se utilizaron al menos 2 réplicas técnicas por condición. El análisis estadístico de las muestras se realizó mediante análisis ANOVA unidireccional ordinario. La prueba de comparaciones múltiples de Tukey se realizó en todas las muestras que contenían proteínas, la cual mostró significación estadística entre el vehículo y las muestras tratadas con C9 (p = 0,0041), las muestras tratadas con C9 frente a las tratadas con C7 (p=0,0085) y las muestras tratadas con C9 frente a las tratadas con C8 (p=0,0437). Todas las demás comparaciones no fueron estadísticamente significativas (es decir, ns), con p > 0,05.

[0166] Como se muestra en las Figuras 1A y 1B, el compuesto C9 tiene un efecto de inhibición significativo sobre la agregación de aSinucleína y muestra una mayor inhibición que los análogos C7 o C8.

Ejemplo 9. Potencia de 2,3,5-trimetil-6-nonilcidohexa-2,5-dieno-1,4-diona (C9) y sus análogos estructurales en la desagregación de fibrillas preformadas Tau K18 WT

[0167]Resumen:Se analizaron los compuestos 2,3,5-trimetil-6-nonilciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona (C9), 2,3,5-trimetil-6-octilciclohexa-2,5-dieno-1,4- diona (C8) y 2,3,5-trimetil-6-heptilciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona (C7) para determinar su capacidad para desagregar fibrillas preformadas (FPF) de fragmento tipo Tau K18 humano de tipo salvaje, medida por la disminución de la intensidad de fluorescencia del fluoróforo de unión al agregado, tioflavina T, a lo largo del tiempo.

[0168]Metodos experimentales:Se generaron fibrillas preformadas (FPF) del fragmento Tau K18 WT recombinante humano incubando el monómero Tau K18 (Bio-Techne®) con heparina sódica en una proporción de 1:1 en presencia de un exceso (50x) de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) como agente reductor en solución salina con pH regulado con fosfato de Dulbecco (DPBS) (pH 7,4). La mezcla se incubó durante 4 días a 37 °C sin agitación para producir FPF en una concentración final de 100 pM.

[0169] Los ensayos de desagregación de Tau circulante se configuraron con 10 pM de FPF de Tau en presencia de 30 pM de compuesto (de soluciones madre de 10 mM en DMSO) o en DMSO al 0,3 % (v/v) como vehículo. Todas las soluciones se prepararon en solución reguladora del pH DPBS (pH 7,4) con NaN3 al 0,03 % (v/v) y tioflavina T (ThT) 5 pM, preparada como mezcla maestra antes de la adición de la proteína o los compuestos. Primero se preparó una mezcla maestra de proteínas el día antes del ensayo para preequilibrar las FPF de Tau a 10 |jM a temperatura y atmósfera ambiente. Al día siguiente, la solución de proteína premezclada se separó en 4 tubos (1 por condición). Se cargaron compuestos o DMSO en cada muestra, se agitaron durante 10 segundos y se centrifugaron durante 3 segundos, seguido de una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente. Paralelamente, se creó una mezcla maestra para mediciones de fondo, en condiciones idénticas, excepto en que no se añadió proteína.

[0170] Luego se cargaron la solución FPF de Tau /- compuesto y muestras de fondo en pocillos de una placa de 96 pocillos ópticamente transparente con paredes negras, que se selló con un LightCycler® 480 (Roche Life Science), se incubó a 37 °C durante 15 minutos para equilibrarla y se inició la recolección de datos. Se usó un espectrómetro Tecan M1000 para recopilar puntos de datos sobre la fluorescencia de ThT (ex/em 450/490 nm) cada 30 minutos sin agitación.

[0171]Análisis de datos y resultados:El valor máximo de la unidad de intensidad de fluorescencia (FIU) de las muestras de Tau tratadas con vehículo se estableció en el 100 %, al cual todos los demás valores de FIU se normalizaron relativamente. Se utilizaron al menos 2 réplicas técnicas por condición. Se registraron los valores finales del contenido de fibrillas de todas las muestras 94 horas después del inicio del ensayo (Figura 2).

[0172] El análisis estadístico de las muestras se realizó mediante análisis ANOVA unidireccional ordinario. La prueba de comparaciones múltiples de Dunnett se realizó entre muestras de FPF de Tau tratadas con vehículo y tratadas con compuesto, que mostró una significación estadística entre las muestras tratadas con vehículo y C9 (p = 0,0478).

[0173] Como se muestra en la Figura 2, la muestra tratada con C9 tuvo una reducción significativa en el contenido de fibrillas de Tau a las 94 h. Por el contrario, las muestras tratadas con C7 y C8 no tuvieron una reducción significativa en el contenido de fibrillas a las 94 h.

Ejemplo 10. Inhibición de la agregación de aSinucleína inducida por RSL3

[0174] Se transformaron células dopaminérgicas de rata N27 (compradas en EMD Millipore, SCC048) para sobreexpresar de manera estable a-sinucleína truncada fusionada con proteína verde fluorescente (GFP) con una construcción de plásmido obtenida de Origene (RG221446). Las células se mantuvieron en medios de selección que consistían en medios RPMI 1640 suplementados con suero bovino fetal al 10 % (v/v) (Millipore, ES-009-B), Penicilina-Estreptomicina al 1 % (v/v) (Gibco, 15140-122), 1 % (v/v) de L-Glutamina (Gibco, 25030 081) y 500 jg/mL de G418 (Gibco, 10131-027).

[0175] Se mantuvieron células dopaminérgicas de rata N27 que sobreexpresan una proteína de fusión aSinucleína-GFP humana truncada (112 aminoácidos), como se ha descrito anteriormente, en condiciones de cultivo normales como se ha descrito anteriormente. El día antes del experimento, las células se sembraron en placas de 96 pocillos con fondo óptico y paredes negras a razón de 3000 células/pocillo y se mantuvieron a 37 °C durante 24 h. El experimento se inició cotratando las células con (1S,3R)-metil 2-(2-cloroacetil)-1-(4-(metoxicarbonil)fenil)-2,3,4,9-tetrahidro-1H-pirido[3,4-b]indol-3-carboxilato (1S,3R-RSL3, descrito por Yang et al., Cell 156:317-331 (2014)) (60 nM) y los compuestos 70 nM (2,3,5-trimetil-6-nonilciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona (C9), 2,3,5-trimetil-6-octilciclohexa-2 ,5-dieno-1,4-diona (C8) o 2,3,5-trimetil-6-heptilciclohexa-2,5-dieno-1,4-diona (C7)) usando una impresora compuesta D300e (Tecan), y se volvieron a colocar en la incubadora a 37 °C durante 24 horas. Las células se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 15 minutos a temperatura ambiente, se lavaron 3 veces con solución salina con pH regulado con fosfato de Dulbecco (DPBS) y luego se incubaron a temperatura ambiente durante 48 horas con solución Triton-X 100 al 1 % (en DPBS) para permitir el marcaje selectivo de aSinucleína agregada. Luego se lavaron las células y se emplearon métodos estándar de inmunocitoquímica (ICC) para marcar la aSinucleína total (anti-aSinucleína de ratón, 1:250, BD Biosciences). Las células se incubaron con anticuerpo primario durante la noche a 4 °C y luego se lavaron con DPBS 3 veces al día siguiente. Luego, las células se incubaron a temperatura ambiente con un anticuerpo secundario conjugado fluorescente (anti-ratón de cabra Alexa 647, Invitrogen) durante 2 horas a temperatura ambiente. También se añadió Hoechst 10 nM para marcar los núcleos y se tomaron imágenes de las células en una plataforma de adquisición de imágenes de alto contenido (ThermoFisher, HSC Cellomics Arrayscan) para cuantificar la aSinucleína agregada total (véase la Figura 3A).

[0176] La Figura 3B muestra la inhibición de la agregación de aSinucleína inducida por RSL3 por los compuestos C7, C8 y C9. El análisis estadístico de las muestras se realizó mediante un análisis ANOVA unidireccional ordinario con la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett, comparando células tratadas únicamente con RSL3 con células tratadas con RSL3 más compuesto. C7 no mostró ninguna inhibición de la agregación de aSinucleína (p>0,05). C8 y C9 mostraron una inhibición significativa de la agregación de aSinucleína (valores de p de 0,01 y 0,0003, respectivamente, y C9 mostró un nivel aproximadamente 5,45 veces mayor de inhibición de la agregación que C8.

Ejemplo de referencia 11. Eficacia de la 2,3,5-trimetil-6-nonilcidohexa-2,5-dieno-1,4-diona en un modelo MPTP de ratón de la enfermedad de Parkinson

RESUMEN

[0177] El tratamiento de animales con (1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina) (MPTP) (60 mg/kg) produjo un agotamiento significativo (~74 %) de dopamina en el cuerpo estriado, en línea con la literatura y estudios de validación interna.

[0178] La administración de C9 (300 mg/kg) produjo efectos significativos de los tratamientos sobre la actividad vertical (número de erguidos y tiempo, como se muestra en las Figuras 4A y 4B).

INTRODUCCIÓN

[0179] La MPTP es una neurotoxina dopaminérgica nigroestriatal potente y selectiva que produce muchas de las características neuropatológicas de la enfermedad de Parkinson (EP) en humanos, primates no humanos y ratones. En ratones, la MPTP produce degeneración dopaminérgica nigroestriatal. Los agentes farmacológicos que aumentan la función dopaminérgica o que bloquean la neurotoxicidad de la MPTP también atenúan la disfunción locomotora asociada a la MPTP y han sido útiles en la clínica para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. Además, la toxicidad mediada por MPTP puede tener una relación con los mecanismos asociados con la pérdida dopaminérgica en la enfermedad, lo que indica que este modelo también puede ser potencialmente útil para identificar agentes que retardan o reducen la pérdida dopaminérgica nigroestriatal.

[0180] En este estudio, se probó C9 en el modelo de EP inducido por MPTP. Los criterios de valoración del estudio fueron los parámetros de actividad locomotora en una prueba de campo abierto.

PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES

[0181]Animales.Especie: Ratón. Cepa: C57Bl/6. Origen de los animales: Charles River. Edad: de 6 a 7 semanas. Sexo: masculino. Aleatorización: los animales se asignaron de manera aleatoria a los grupos de tratamiento. Enmascaramiento del estudio: los experimentadores no conocían los tratamientos experimentales.

[0182]Alojamiento y Alimentación.Aclimatación/Acondicionamiento: No menos de tres días. Alojamiento: Los ratones se alojaron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas (luces encendidas a las 6:00 a. m.) No más de 4 ratones por jaula. Sistema de jaula ventilada. Dieta: Comida estándar para roedores y aguaad libitum.

[0183]Parámetros de diseño.Vía(s) de administración: PO. Volumen de dosis: VO: 5 mL/kg. Formulación(es): formulada por Melior según las instrucciones de BioElectron. Vehículo: aceite de sésamo (Spectrum Chemical, catálogo NF #SE130, CAS#8008-74-0). Niveles de dosis: 300 mg/kg. Frecuencia de dosis: QD a partir del día -2 (MPTP = día 0) y hasta el día 7. Duración del estudio: 11 días. Tiempo de pretratamiento (hasta 2 horas): Para el día 0 (día MPTP): 30 min. Tiempo de pretratamiento para ensayo de campo abierto/ensayo de actividad locomotora (OFA/LMA): 1 hora. Número de grupos: 3. Número de animales por grupo: 10. Número total de animales: 30 (en el estudio), 42 animales en total (para garantizar un análisis de potencia adecuado de al menos 10 animales/grupo, para todos los grupos que recibían MPTP, se añadieron 4 animales adicionales para mitigar los impactos del estudio si había muertes inducidas por MPTP).

[0184]Tratamiento con MPTP.MPTP se formuló en solución salina con pH regulado con fosfato y se administró a los ratones tres veces a una dosis de 20 mg/kg (1 mg/ml administrado a 20 ml/kg) en intervalos de dos horas (dosis final de MPTP = 60 mg/kg).

[0185]Actividad locomotora.Un día antes (inicio del estudio) y el día 7 después de la administración de MPTP (día (-1) y día 7), se monitoreó a los ratones para detectar diversos aspectos de la función locomotora utilizando un aparato de campo abierto totalmente automatizado (Med-Associates, Inc). El aparato consistía en un campo de 10,75" x 10,75" encerrado en una caja insonorizada, equipado con un ventilador y una luz doméstica. El campo está equipado con tres conjuntos de infrarrojos de 16 haces ubicados en los ejes X e Y para el seguimiento posicional y en el eje Z para la detección de la posición erguida sobre las patas traseras.

[0186] A todos los ratones se les administró la dosis final de C9 o vehículo-aceite de sésamo 1 hora antes del ensayo de campo abierto de acuerdo con el programa de dosificación. Los parámetros locomotores clave que están asociados con las deficiencias dopaminérgicas incluyeron el comportamiento de erguidos sobre las patas traseras (número de erguidos sobre las patas traseras/sesión de 15 minutos) y la distancia total recorrida (por 15 minutos).

[0187]Análisis de los datos.Los datos se promediaron y se expresan como la media ± EEM. Los datos se analizaron mediante ANOVA unidireccional seguido de pruebaspost hoc.Los valores de p inferiores a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos a partir del control.

RESULTADOS

[0188]Efecto de los tratamientos sobre el ensayo locomotor en campo abierto (número de erguidos).Se midió la actividad en el aparato de campo abierto(número de erguidos)en animales tratados con solución salina vehículo, MPTP vehículo o MPTP C9. Los animales recibieron tratamientos como se ha indicado anteriormente. Como se muestra en la Figura 4A, en comparación con los animales tratados con solución salina vehículo, los números de erguidos disminuyeron en los animales tratados con MPTP vehículo (p = 0,06). El tratamiento con C9 de animales tratados con MPTP restauró los números de erguidos a los observados en los animales de control con solución salina vehículo (MPTP vehículo frente a MPTP C9, p<0,01; solución salina vehículo frente a MPTP C9, p=0,312). Los datos se presentan como media EEM, n=12-14 en cada grupo. Análisis estadístico: ANOVA unidireccional con prueba de Tukey post hoc para comparaciones múltiples; **p<0,01; ns, no estadísticamente significativo (p>0,05).

[0189]Efecto de los tratamientos sobre el ensayo locomotor en campo abierto (tiempo en vertical).Se midió la actividad en el aparato de campo abierto (tiempo en vertical) en animales tratados con solución salina vehículo, MPTP vehículo o MPTP C9. Los animales recibieron tratamientos como se ha indicado anteriormente. Como se muestra en la Figura 4B, en comparación con los animales tratados con solución salina vehículo, el tiempo en vertical disminuyó en los animales tratados con MPTP vehículo (p<0,05). El tratamiento con C9 de animales expuestos a MPTP restableció el tiempo en vertical a los observados en los animales de control con solución salina vehículo (MPTP vehículo frente a MPTP C9, p<0,001; solución salina vehículo frente a MPTP C9, p=0,315). Los datos se presentan como media EEM, n=12-14 en cada grupo. Análisis estadístico: ANOVA unidireccional con prueba de Tukey post hoc para comparaciones múltiples; *,p<0,05; ***,p<0,001; ns, no estadísticamente significativo (p>0,05).

[0190] La administración de C9 en el modelo de ratón MPTP de EP demostró una mejora significativa en la actividad locomotora medida por recuentos y tiempo de movimientos verticales, dos métricas de comportamiento que reflejan la función dopaminérgica en el cuerpo estriado (Meredith y Rademacher, J Parkinsons Dis. 1(1):19-33 (2012)) y referencias incluidas).

Ejemplo 12. Perfiles farmacocinéticos de C9 después de la administración oral aguda a ratones macho C57

[0191] Se administró una dosis de 300 mg/kg de C9 como una solución de aceite de sésamo mediante sonda oral a cuatro ratones C57BL/6. Ocho horas después de la administración del compuesto, se midió la exposición en el plasma y en el cerebro (Tabla 10).

T l 1 . Ex i i n r r l l m i n r n l mini r i n r l

[0192] Otros aspectos de la divulgación se describen en los siguientes párrafos numerados.

[0193] Apartado 1. Un método para tratar o suprimir un trastorno seleccionado del grupo que consiste en la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, una lesión cerebral traumática y un daño por isquemia y reperfusión, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto con la fórmula:

o la forma hidroquinona de este; o un solvato o hidrato de este.

[0194] Párrafo 2. El método del Párrafo 1, en el que el compuesto no es un solvato ni un hidrato.

[0195] Párrafo 3. El método del Párrafo 1 o 2, en el que el compuesto está en forma quinona.

[0196] Párrafo 4. El método del Párrafo 1 o 2, en el que el compuesto está en forma hidroquinona.

[0197] Párrafo 5. El método de cualquiera de los Párrafos 1 a 4, en el que el método es para tratar o suprimir la enfermedad de Alzheimer.

[0198] Párrafo 6. El método de cualquiera de los Párrafos 1 a 4, en el que el método es para tratar o suprimir la enfermedad de Parkinson.

[0199] Párrafo 7. El método de cualquiera de los Párrafos 1 a 4, en el que el método es para tratar o suprimir una lesión cerebral traumática.

[0200] Párrafo 8. El método de cualquiera de los Párrafos 1 a 4, en el que el método es para tratar o suprimir un daño por isquemia y reperfusión.

[0201] Párrafo 9. El método de cualquiera de los Párrafos 1 a 4, en el que el método es para tratar o suprimir un accidente cerebrovascular.

[0202] Párrafo 10. El método de cualquiera de los Párrafos 1 a 9, en el que el método es para tratar el trastorno.

[0203] Párrafo 11. El método de cualquiera de los Párrafos 1 a 9, en el que el método es para suprimir el trastorno.

[0204] Párrafo 12. El método de cualquiera de los Párrafos 1-11, en el que el compuesto se administra por vía oral.

[0205] Párrafo 13. El método de cualquiera de los Párrafos 1-11, en el que el compuesto se administra por vía intravenosa.

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES 1. Compuesto, que es una quinona con la fórmula:

   para usar en el tratamiento o la supresión de un trastorno en un sujeto que lo necesite, donde dicho uso comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto, en donde el trastorno es esclerosis lateral amiotrófica (ELA), y en donde el compuesto no es un solvato o hidrato.
2. 2. Compuesto para el uso según la reivindicación 1, para su uso en el tratamiento del trastorno.
3. 3. Compuesto para el uso según la reivindicación 1, para su uso en la supresión del trastorno.
4. 4. Compuesto para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el compuesto se administra por vía oral.
5. 5. Compuesto para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el compuesto se administra por vía intravenosa.
6. 6. Compuesto para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el compuesto está en forma quinona.
7. 7. Compuesto para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el compuesto está en forma hidroquinona.
8. 8. Compuesto para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el compuesto es un polimorfo de la quinona con la fórmula

   donde un patrón de difracción de rayos X en polvo para el polimorfo comprende picos característicos al menos en las siguientes posiciones angulares, donde las posiciones angulares pueden variar en ± 0,2: 4,10, 12,12 y 16,14; y donde las posiciones angulares se obtienen con una fuente de Cu Ka1 y una longitud de onda de I , 540598 A.
9. 9. Compuesto para el uso según la reivindicación 8, donde el polimorfo comprende picos característicos al menos en las siguientes posiciones angulares, donde las posiciones angulares pueden variar en ± 0,2: 4,10, I I , 77, 12,12 y 16,14.
10. 10. Compuesto para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 8-9, donde las posiciones angulares pueden variar en ± 0,1.
11. 11. Compuesto para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el compuesto es un polimorfo de la quinona con la fórmula

    que muestra un termograma DSC con un único pico endotérmico entre aproximadamente 47 y aproximadamente 53 °C.
12. 12. Composición que comprende el polimorfo de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el polimorfo está presente como una pluralidad de partículas, donde las partículas tienen una proporción de D90:D10 menor que aproximadamente 11:1.
13. 13. Composición que comprende el polimorfo según cualquiera de las reivindicaciones 8-11, o composición según la reivindicación 12, para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde al menos aproximadamente el 95 % en mol del

    de la composición es el polimorfo, excluyendo cualquier disolvente, vehículo o excipiente.
14. 14. Composición farmacéutica que comprende (i) el polimorfo según cualquiera de las reivindicaciones 8-11, o (ii) la composición según cualquiera de las reivindicaciones 12-13, para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-6; donde la composición farmacéutica comprende además un disolvente, vehículo o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
15. 15. Compuesto para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o composición para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, donde dicho uso comprende administrar el compuesto como único principio activo.
16. 16. Compuesto para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o composición para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, donde dicho uso comprende administrar el compuesto como el único principio activo que trata la ELA.