ES2969155T3 - Composiciones estables del hexapéptido Foxy-5 con alta solubilidad que comprenden una base nitrogenada - Google Patents

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Abstract

La presente divulgación se refiere a composiciones nuevas y altamente solubles del hexapéptido Wnt Foxy-5. La presente divulgación se refiere además a métodos para la producción de dichas composiciones y evaluaciones de estabilidad de las mismas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones estables del hexapéptido Foxy-5 con alta solubilidad que comprenden una base nitrogenada
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente divulgación se refiere a nuevas composiciones altamente solubles del hexapéptido de Wnt Foxy-5. La presente divulgación se refiere además a métodos para la producción de dichas composiciones y a evaluaciones de estabilidad de las mismas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Foxy-5 es un hexapéptido formilado derivado de WNT5A y mimético de WNT5A con posible actividad antimetastásica actualmente en desarrollo como un candidato a fármaco para la prevención de la diseminación y la reaparición tumoral en varias formas comunes de cáncer. Foxy-5 tiene la fórmulaFor-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH(SEQ_NO 1, Figura 1).
Tras la administración intravenosa, Foxy-5 se une a receptores de WNT5A y los activa, predominantemente de la familia Frizzled, que activa la señalización mediada por WNT5A.
Se prevé que Foxy-5 compense la deficiencia de proteína WNT5A en tejidos tumorales observada en pacientes con tipos de cáncer donde el ligando de WNT5A actúa de supresor del cáncer, para reducir el riesgo de metástasis. Un subanálisis de un reciente estudio retrospectivo de pacientes con cáncer colorrectal en estadio III muestra que la proporción de pacientes con baja expresión de WNT5A es significativamente superior a la observada en estudios previos en pacientes con cáncer colorrectal (CCR) de estadio II. Los pacientes con tumores de CCR de estadio III se diferencian del estadio II principalmente por la presencia de células tumorales en ganglios linfáticos adyacentes al tumor primario, siendo así más agresivos y de progreso más rápido. Se ha observado un bajo nivel de WNT5A en casi el 70 por ciento de los pacientes en estadio III, en comparación con aproximadamente el 45 por ciento de pacientes con estadio de tumor menos avanzado. Se han hecho hallazgos similares en tejidos de cáncer de mama, donde se ha observado la ausencia o un bajo nivel de WNT5A en el 70 % de los cánceres de mama triple negativo agresivos en comparación con aproximadamente el 45 % en tipos de cáncer de mama menos agresivos. En varios tipos de cáncer, que incluyen cáncer de mama, colon, próstata y hepatocelular, se ha demostrado que una falta o un bajo nivel de WNT5A en el tumor primario está asociado con una reaparición más rápida cuando se compara con tumor con expresión normal o casi normal de la proteína WNT5A. Esto apoya la hipótesis de que el nivel de WNT5A influye significativamente en el transcurso de la enfermedad.
Basándose en un estudio finalizado de fase 1b con Foxy-5 que pretende documentar el perfil de seguridad de candidatos a fármaco, la farmacocinética y la determinación de dosis para la fase 2, Foxy-5 está ahora sometiéndose a un estudio de ensayo clínico de fase 2, el estudio NeoFox, que incluye pacientes con cáncer de colon de estadio II / III, que en el diagnóstico se considera que tienen un alto riesgo de reaparición después de que el tumor primario haya sido extirpado quirúrgicamente. La evaluación del riesgo de reaparición se realiza según criterios de evaluación establecidos. El objetivo del estudio es demostrar que Foxy-5 reduce el riesgo de recaída, principalmente en pacientes con baja expresión de WNT5A. El estudio está actualmente en curso en 28 hospitales en España (16) y Hungría (12).
Foxy-5 por sí mismo y un método de fase sólida clásico (SPSS) para su preparación se describen en la publicación de patente internacional n.° WO 2006/130082 (A PEPTIDE LIGAND TO IMPAIR CANCER CELL MIGRATION). El principio activo farmacéutico active (API) para los estudios preclínicos y clínicos tempranos se ha producido por esta vía. Las vías de la fase de disolución para Foxy-5 desarrolladas por el solicitante se desvelan en la publicación de patente internacional n.° WO 2020/038878 (Solution phase routes for Wnt hexapeptides) y el documento de patente WO 2020/120198 (Linear solution phase synthesis for Wnt hexapeptides).
El actual proceso de fabricación de Foxy-5 se aplica a la concentración de producto para la liofilización final de solo 3 g/l debido a la solubilidad limitada de la sustancia farmacéutica (DS) sin sal en agua. Esto presenta un cuello de botella que limita gravemente el rendimiento de producción de la fabricación comercial de Foxy-5.
Intentos iniciales por vencer este problema produjeron el desarrollo de un proceso de liofilización alternativo usando una disolución acuosa al 30 % de acetonitrilo (en lugar de agua pura) como disolvente. Se demostró en experimentos a pequeña escala y se verificó en una escala de 35 g que el proceso desarrollado es aplicable para concentraciones de DS de hasta 7 g/l, es decir, un aumento >100 % en la productividad. Aunque este logro es impresionante, sin embargo, sigue siendo problemático producir Foxy-5 a escala comercial cuando la etapa final requiere dicha alta dilución.
Por consiguiente, se propuso un aumento de tamaño de lote por otras técnicas de solubilización distintas de los ajustes de polaridad del disolvente. A partir de estudios de formulación de medicamentos (DP) se sabía que un cambio de la forma sin sal de Foxy-5 a la sal de sodio aumentaría la solubilidad de DS hasta niveles de al menos 20 g/l.
Se observa en este contexto que Foxy-5 contiene tres restos ácido carboxílico y ningún grupo amino libre, ya que el grupo amino terminal está formilado (Figura 1). Por lo tanto, solo es posible preparar sales de Foxy-5 con compuestos básicos/alcalinos. Se observa que algunos proveedores de químicos finos ofrecen un compuesto comercializado como la "sal trifluoroacética de Foxy-5", que en realidad es solo un liofilizado que contiene ácido trifluoroacético libre.
El solicitante investigó la conversión de Foxy-5 en su sal de sodio. Como Foxy-5 contiene tres grupos carboxílicos (Asp2, Glu5, y los ácidos carboxílicos carboxiterminales), se generaron las sales de mono-, di- y trisodio tratando suspensiones acuosas de Foxy-5 (25 g/l) con 1 eq., 2 eq. y 3 eq. de hidróxido sódico. Como material de partida, se usó un lote de ácido libre de Foxy-5 que contenía cantidades muy bajas de las impurezas conocidas, la aspartimida (< 0,1 %) y el dímero (< 0,1 %) (estructuras, véase la Figura 2).
La sal de mono-sodio de Foxy-5 no pudo disolverse completamente, y poco después de la adición de NaOH (1 eq., pH = 3,84), se observó la formación de gel.
La sal de di-sodio pudo disolverse completamente en 10 minutos después de la adición, de NaOH (2 eq., pH = 4,57). El análisis de HPLC de la disolución mostró un aumento del contenido de la impureza de aspartimida, mientras que la formación de dímero solo se detectó a un nivel despreciable. Después de la liofilización, se detectaron 0,07 % de dímero y 0,79 % de aspartimida.
La sal de tri-sodio se disolvió en 5 minutos después de la adición de NaOH (3 eq., pH = 6,76) con aumento mínimo de la impureza de aspartimida, pero se observó el aumento de la formación del dímero. Después de la liofilización, se detectaron 0,41 % de dímero y 0,17 % de aspartimida.
De las tres sales, se descubrió que la sal de trisodio tenía la mayor solubilidad, > 100 g/l, y así inicialmente pareció que era un nuevo candidato a sustancia farmacéutica prometedor.
Sin embargo, tras la prueba de estabilidad a 40 °C, se descubrió por espectrometría de masas que la sal de trisodio de Foxy-5 desarrolló rápidamente cantidades significativas de las impurezas anteriormente tratadas (Figura 3), alcanzando un nivel de entre 15-20 % después de 4 semanas a 40 °C.
Estudios adicionales de disoluciones acuosas de Foxy-5 a diferentes valores de pH revelaron que a pH 9 el contenido de la aspartimida disminuye significativamente directamente después de la disolución completa. Después de agitar la disolución de Foxy-5 durante 2 horas a pH 9 (véase la Figura 4), desapareció completamente el pico de aspartimida en el cromatograma de HPLC (< LOD). Se sabe que la abertura de anillo de las aspartimidas ocurre a pH alto, que conduce a la formación de o el compuesto parental o los derivados de p-Asp y D-Asp. Sin embargo, se observó una formación significativa de dímero (2,5 % después de 2 horas a pH = 9). La identificación del dímero en el cromatograma se confirmó por coelución con material de referencia sintetizado por separado. Además de las dos impurezas conocidas (la aspartimida y el dímero), se identificó sorprendentemente una tercera impureza en la sal de tri-sodio como el análogo desulfurizado de Cys ^Alade Foxy-5 (véanse la Figura 2 y 3 ), aunque en bajas cantidades.
En resumen, aunque la solubilidad en agua se puede aumentar convirtiendo Foxy-5 en una sal de trisodio, este compuesto es demasiado inestable para cumplir los requisitos como sustancia farmacéutica. Por lo tanto, sigue existiendo una necesidad de una forma de DS diferente de Foxy-5 que tenga solubilidad y estabilidad satisfactorias, tanto para suministro para ensayo clínico adicional como para futuros fines comerciales.
DEFINICIONES
Como se usa en el presente documento, el término "base nitrogenada" debe significar un compuesto básico que comprende al menos un átomo de nitrógeno.
Como se usa en el presente documento, el término "monosal" o "mono-sal" debe significar una composición que comprende un equivalente de Foxy-5 y 0,5-1,45 equivalentes de una base nitrogenada, como se define en el presente documento. Como se usa en el presente documento, el término "disal" o "di-sal" debe significar una composición que comprende un equivalente de Foxy-5 y 1,50 - 2,49 equivalentes de una base nitrogenada, como se define en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, el término "trisal" o "tri-sal" debe significar una composición que comprende un equivalente de Foxy-5 y 2,5 - 3,1 equivalentes de una base nitrogenada, como se define en el presente documento.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Foxy-5 es como se ha mencionado un hexapéptido formilado de la fórmulaFor-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OHque contiene tres grupos ácido carboxílico: Asp2, Glu5 y los grupos ácidos carboxílicos carboxiterminales, y así puede formar mono-, di- y tri-sales con compuestos básicos. Ahora se ha descubierto que Foxy-5 forma composiciones altamente solubles con diversas bases nitrogenadas (definidas en el presente documento como compuestos básicos que contienen al menos un átomo de nitrógeno) en las relaciones aproximadas 1:1, 1:2 y 1:3 (Foxy-5 : base). Estas composiciones se denominan por comodidad en lo sucesivo mono- di- y tri-sales de Foxy-5, aún cuando las composiciones —que se aíslan como liofilizados amorfos— no se han caracterizado apropiadamente (estequiométricamente) como sales.
Sorprendentemente, se ha descubierto que las estabilidades de estas composiciones variaban considerablemente cuando se medían a 40 °C, que se tratará a continuación. Una visión general de todas las composiciones según la invención y sus perfiles de impurezas se facilita en la Figura 10.
En un primer aspecto, la presente invención proporciona una composición sólida que comprendeFor-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH(SEQ_NO 1, Foxy-5) y una base nitrogenada seleccionada de amoniaco, hidróxidos de amonio cuaternario, guanidinas alquiladas, aminoácidos y aminas primarias y secundarias.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método de producción de una composición según el primer aspecto, que comprende las siguientes etapas:
a) Mezclar la forma de ácido libre deFor-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH(SEQ_NO 1, Foxy-5), como
i. una suspensión en un disolvente, o
ii. como un polvo puro,
con o
iii. 0,5 - 1,49 equivalentes de una base nitrogenada para preparar una mono-sal de Foxy-5, o
iv. 1,50 - 2,49 equivalentes de una base nitrogenada para preparar una di-sal de Foxy-5, o
v. 2,5 - 3,1 equivalentes de una base nitrogenada para preparar una tri-sal de Foxy-5,
b) Agitar la mezcla de reacción hasta que se obtiene una disolución transparente, y
c) Liofilizar o secar por pulverización la disolución,
en donde la base nitrogenada es un compuesto seleccionado de amoniaco, hidróxidos de amonio cuaternario, guanidinas alquiladas, aminoácidos y aminas primarias y secundarias, y en donde todas las etapas a-c se realizan opcionalmente en una atmósfera inerte.
BREVE DESCRIPCIÓN DE DIBUJOS
Figura 1
La figura muestra la estructura química de Foxy-5 (SEQ_NO 1). Foxy-5 es un péptido lineal que consiste en seis aminoácidos con un extremo N formilado. Todos los residuos de aminoácidos ópticamente activos están en la configuración L. La fórmula molecular de Foxy-5 es C<26>H<42>N<6>O<12>S<2>y la masa molecular es 694,8 g/mol (masa promedio).
Figura 2
La figura muestra la estructura química de las tres impurezas principales en Foxy-5:
A) El derivado de aspartimida de Foxy-5
B) El derivado de dímero de Cys-Cys de Foxy-5
C) Análogo de Cys^-Alade Foxy-5
Figura 3
La figura muestra los valores de pureza (% de área de HPLC) a las 0, 2 y 4 semanas de almacenamiento a 40 °C de tres impurezas conocidas en la sal de trisodio: la "Aspartimida", el "Dímero" y el "análogo de Ala". Para detalles, véase la descripción detallada.
Figura 4
La figura muestra el seguimiento del tratamiento a pH alto de Foxy-5 por HPLC: material de partida (trazado inferior), después de la disolución (trazado medio) y después de 2 h a pH 9 (trazado superior). Los trazados de HPLC se han desplazado en la dirección y para fines de comparación.
Figura 5
La figura muestra los valores de pureza (% de área de HPLC) a las 0, 2 y 4 semanas de almacenamiento a 40 °C de las tri-sales (figura superior) y las di-sales (inferior) de la invención. Como se puede apreciar, existe una mayor variabilidad en la estabilidad a las 4 semanas para las tri-sales que para las di-sales.
Figura 6
La figura superior compara los valores de pureza (% de área de HPLC) a las 0, 2 y 4 semanas de almacenamiento a 40 °C de las tri-sales producidas con aminoácidos (es decir, Lys, Arg e His) frente a otros formadores de sales (es decir, colina, dietilamina, amoniaco, N-Me-glucamina y trometamina). La figura inferior muestra una comparación similar para las di sales. Como se puede apreciar, existe una tendencia general a que las sales producidas con aminoácidos tengan una mayor estabilidad que las sales producidas con otros formadores de sales.
Figura 7
La figura muestra los valores de pureza (% de área de HPLC) a las 0, 2 y 4 semanas de almacenamiento a 40 °C de una selección de sales según la invención que tienen una pureza de al menos el 90 % por HPLC (% de área) después de 4 semanas almacenamiento a 40 °C.
Figura 8
La figura muestra los valores de pureza (% de área de HPLC) de las sales recién liofilizadas de tri-amonio (NH3), tritrometamina (TRO) y tri-N-metil-glucamina (NMG) de Foxy-5 preparadas por o 1) adición lenta de base a una suspensión acuosa de Foxy-5, manteniendo el pH <6 durante todo el procedimiento, o por 2) adición de la cantidad completa de base en una porción. Como se puede apreciar, la pureza de la sal de tri-amonio está bastante fuertemente influida por el modo de adición, mientras que la pureza de las sales de tri-TRO y tri-NMG está relativamente poco afectada.
Figura 9
La figura muestra los difractogramas de rayos X de polvo (PXRD) de liofilizados de sales tri-valentes de Foxy-5 (abajo a arriba): tri-sal de amoniaco, tri-sal de N-metil-D-glucamina, tri-sal de trometamina y tri-sal de histidina. Los difractogramas se han desplazado en la dirección y para fines de comparación.
Figura 10
La figura es un cuadro sinóptico de todos los experimentos realizados dando como resultado composiciones sólidas aisladas según la invención, divididas en "di-sales" y "tri-sales". La tabla demuestra el desarrollo en el perfil de impurezas con el tiempo (0, 2 y 4 semanas de almacenamiento a 40 °C) para cada composición y para el material de partida (ácido sin Foxy-5).
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Como se ha mencionado en el sumario anteriormente en este documento, se ha publicado un método de fabricación en fase de disolución lineal para el hexapéptido Foxy-5 (denominado en lo sucesivo "Foxy-5") en la solicitud de patente internacional WO 2020/120198 del solicitante que implica una concentración de producto de solo 3 g/l para la liofilización final debido a la solubilidad limitada de la sustancia farmacéutica (DS) sin sal en agua. Como se ha mencionado adicionalmente, una estrategia inicial para vencer este problema produjo la producción de la sal de tri-sodio de Foxy-5, que se descubrió que tenía buena solubilidad acuosa, pero una estabilidad extremadamente mala que hizo que la sal de tri-sodio fuera inutilizable como un nuevo candidato a sustancia farmacéutica.
Ahora se ha descubierto que Foxy-5 forma composiciones altamente solubles con diversas bases nitrogenadas. Sorprendentemente, muchas de estas composiciones son significativamente más estables que la sal de tri-sodio de Foxy-5, que posiblemente permite un aumento sustancial en el rendimiento de producción para la fabricación comercial de Foxy-5.
Este hallazgo se hizo cuando se realizaba un cribado de sales de Foxy-5 usando los siguientes posibles "formadores de sales": hidróxido de amonio, L-arginina, hidróxido de calcio, hidróxido de colina, dietilamina, L-lisina, L-histidina, hidróxido de magnesio, N-metil-D-glucamina y trometamina. En vista de los problemas conocidos asociados a las sales de sodio de Foxy-5, se creyó que esta selección de formadores de sales proporcionaba una anchura suficiente de candidatos químicamente diferentes que con el tiempo también cumplirían las disposiciones reglamentarias para componentes y excipientes farmacéuticos. Por lo tanto, los "formadores de sales" elegidos se seleccionan de compuestos con autorización GRAS y/o designación de clase 1 o 2 de Stahl (véase P. H. Stahl and C. G. Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, segunda edición, Wiley-VCH: Zúrich (2011)).
Como se ha mencionado anteriormente en este documento, las composiciones resultantes del estudio de cribado de sales se denominan por comodidad en lo sucesivo mono-, di- y tri-sales de Foxy-5, aún cuando las composiciones —que se aíslan como liofilizados amorfos— no se han caracterizado apropiadamente (estequiométricamente) como sales.
Las tri-sales de Foxy-5 se produjeron añadiendo aproximadamente tres equivalentes de base a una suspensión acuosa de 20-30 mg/ml del ácido sin Foxy-5 usando dos enfoques diferentes: añadir la cantidad calculada de base en una porción a la suspensión acuosa del ácido sin Foxy-5, o por valoración de la base relevante lentamente, manteniendo el pH de la suspensión < 6,0 durante todo el procedimiento.
Se obtuvieron disoluciones transparentes para todas las sales, excepto las de calcio y magnesio, que siguieron siendo suspensiones, que indica que, para todas las sales, excepto las de calcio y magnesio, se obtuvo una solubilidad de al menos 20 g/l. Las disoluciones transparentes se liofilizaron y los liofilizados sólidos se caracterizaron por PXRD y HPLC (véase Sección experimental y Figura 10 para una visión general de todas las composiciones). Se descubrió que todas eran amorfas (véase la Figura 9 para diagramas de PXRD a modo de ejemplo). Para algunos formadores de sales se hicieron intentos satisfactorios de preparación de tri-sales con una solubilidad de ~50 g/l, y para algunas tri-sales se alcanzó una solubilidad de >100 g/l.
También se generó la sal de tri-sodio altamente soluble previamente estudiada (véase la sección Antecedentes) para una comparación.
También se prepararon di-sales con todos los formadores de sales que condujeron a disoluciones transparentes en los experimentos de sales trivalentes, concretamente, hidróxido de amonio, L-arginina, hidróxido de colina, dietilamina, L-lisina, L-histidina, N-metil-D-glucamina y trometamina. Nuevamente, se obtuvieron disoluciones transparentes en todos los casos, que indica que también las di-sales de Foxy-5 tuvieron una solubilidad en agua que era igual a o supera 20 mg/ml. Las disoluciones se liofilizaron y los liofilizados sólidos se caracterizaron por PXRD y HPLC (véase Sección experimental). Se descubrió que todos eran amorfos. Para algunos formadores de sales se hicieron intentos satisfactorios de preparación de di-sales con una solubilidad de ~50 g/l. Las mono-sales se prepararon de un modo similar.
Los liofilizados resultantes fueron todos sólidos amorfos como se demuestra por análisis de PXRD. En muchos casos, los sólidos fueron ligeramente higroscópicos.
En un primer aspecto, la presente invención proporciona una composición sólida que comprende For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH (SEQ_NO 1, Foxy-5) y una base nitrogenada, en donde la base nitrogenada es un compuesto seleccionado de amoniaco, hidróxidos de amonio cuaternario, guanidinas alquiladas, aminoácidos y aminas primarias y secundarias.
En una realización del primer aspecto, la composición sólida contiene 0,5 - 3,1 equivalentes de una base nitrogenada seleccionada de amoniaco, hidróxidos de amonio cuaternario, guanidinas alquiladas, aminoácidos y aminas primarias y secundarias.
En una realización preferida del primer aspecto, la presente invención proporciona una "tri-sal" que comprende Foxy-5 (For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH, SEQ_NO 1) y 2,5 - 3,1 equivalentes de una base nitrogenada seleccionada de amoniaco, hidróxidos de amonio cuaternario, guanidinas alquiladas, aminoácidos y aminas primarias y secundarias.
En otra realización preferida del primer aspecto, la presente invención proporciona una "di-sal" que comprende Foxy-5 (For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH, SEQ_N<o>1) y 1,50 - 2,49 equivalentes de una base nitrogenada seleccionada de amoniaco, hidróxidos de amonio cuaternario, guanidinas alquiladas, aminoácidos y aminas primarias y secundarias.
En otra realización del primer aspecto, la presente invención proporciona una "mono-sal" que comprende Foxy-5 (For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH, SEQ_NO 1) y 0,5 - 1,49 equivalentes de una base nitrogenada seleccionada de amoniaco, hidróxidos de amonio cuaternario, guanidinas alquiladas, aminoácidos y aminas primarias y secundarias.
Como se ha mencionado en la sección Antecedentes, la sal de tri-sodio de Foxy-5 tuvo una alta solubilidad acuosa, pero se descubrió que era sorprendentemente inestable en comparación con la forma de ácido libre. Se descubrió que las principales impurezas en las sales de sodio eran (véase la Figura 2):
• el disulfuro deCys(dímero) de Foxy 5,
• la sustitución deCys ^ Ala, es decir, el derivado desulfurizado de Foxy 5, y
• el derivado de aspartimida deAsp.
El análisis de estabilidad de las composiciones según el primer aspecto de la presente invención ha demostrado que estas composiciones contienen las mismas impurezas que las sales de sodio conocidas, aunque en cantidades variables. El desarrollo de dichas impurezas con el tiempo también varía considerablemente entre las composiciones.
Se realizó un estudio de estabilidad de las composiciones según el primer aspecto (y la sal de trisodio previamente preparada) a 40 °C durante dos y cuatro semanas. Se descubrieron algunas tendencias generales. Como es evidente de la Figura 5, se descubrió que la pureza absoluta de las composiciones cuando se analizaron inmediatamente después de la liofilización (0 semanas) y se monitorizaron a 40 °C durante dos y cuatro semanas, se difirió sustancialmente. La pureza de las tri-sales varió más que la pureza de las di-sales (pureza de HPLC 78-95 % a las 4 semanas para las tri-sales frente a 87-96 % a las 4 semanas para las di-sales). Además, como es evidente de la Figura 6, la pureza absoluta de las composiciones que comprenden aminoácidos fue, en general, superior después de 4 semanas a 40 °C cuando se comparó con composiciones que comprenden otros formadores de sales (valor a las 4 semanas: ~90 % frente a ~85 % para tri-sales y ~95 % frente a ~90 % para di-sales).
En una realización la presente invención proporciona una composición que comprende Foxy-5 y 2,5 - 3,1 equivalentes de un aminoácido, tal como 2,8 - 3,05 equivalentes de un aminoácido, tal como 2,9 - 3,02 equivalentes de un aminoácido, tal como 2,95 - 3,01 equivalentes de un aminoácido, tal como 3,0 equivalentes de un aminoácido.
En otra realización, la invención proporciona una composición que comprende Foxy-5 y 1,50 - 2,49 equivalentes de un aminoácido, tal como 1,7 - 2,1 equivalentes de un aminoácido, tal como 1,8 - 2,05 equivalentes de un aminoácido, tal como 1,9 - 2,03 equivalentes de un aminoácido, tal como 1,95 - 2,01 equivalentes de un aminoácido, tal como 2,0 equivalentes de un aminoácido.
En realizaciones preferidas, la presente invención proporciona una composición que comprende Foxy-5 y un aminoácido seleccionado de lisina, arginina o histidina.
La mayoría de las composiciones de la presente invención son como se ha mencionado higroscópicas hasta cierto grado y se descubrió que muchas se volvían pegajosas cuando se sometían a aire húmedo. Sin embargo, los análisis de ensayo en combinación con el análisis elemental revelaron que algunas de las composiciones de la presente invención se podrían caracterizar como sales que han formado hidratos no pegajosos, tales como di- y tetrahidratos (véase Sección experimental). Como las composiciones de la presente invención se aislaron como sólidos amorfos secados por congelación (liofilizados), dichos hidratos no se pueden definir con tanta precisión como hidratos cristalinos, pero, sin embargo, se ha encontrado que muchas de las composiciones están bastante bien definidas, tales como sales con una relación aproximada de 1:2 ("di-sales") o 1:3 ("tri-sales") entre Foxy-5 y la base formadora de sal.
Finalmente, la Figura 7 muestra las composiciones que tienen una pureza medida por HPLC (% de área) de al menos 90 % después de 4 semanas de almacenamiento a 40 °C. Como se puede apreciar, las composiciones de la presente invención con alta estabilidad no se limitan a una forma de sal particular.
Por lo tanto, en otra realización del primer aspecto, la presente invención proporciona una composición en donde la base nitrogenada es un compuesto seleccionado de aminoácidos, amoniaco y aminas primarias y secundarias.
En realizaciones preferidas del primer aspecto, la base nitrogenada empleada se selecciona de amoniaco, L-lisina, L-histidina, N-metil-D-glucamina y trometamina.
En otras realizaciones preferidas, la presente invención proporciona una composición que comprende Foxy-5 y 1,50 - 2,49 equivalentes, tal como 1,7 - 2,1 equivalentes, tal como 1,9 - 2,03 equivalentes, tal como 1,95 - 2,01 equivalentes, tal como 2,0 equivalentes de una base nitrogenada seleccionada de amoniaco, L-lisina, L-histidina y trometamina.
En otras realizaciones preferidas, la presente invención proporciona una composición que comprende Foxy-5 y 2,5 - 3,1 equivalentes, tal como 2,9 - 3,03 equivalentes, tal como 2,95 - 3,01 equivalentes, tal como 3,0 equivalentes, de una base nitrogenada seleccionada de L-histidina y N-metil-D-glucamina.
En otras realizaciones preferidas, la presente invención proporciona una composición que comprende la sal de di-amonio, la sal de di-histidina, la sal de tri-histidina, la sal de di-lisina, la sal de di-N-metil-D-glucamina, la sal de tri-N-metil-D-glucamina y la sal de di-trometamina de Foxy-5, comprendiendo dichas sales opcionalmente entre 0 - 5 equivalentes de agua calculada en relación con Foxy-5.
En una realización particularmente preferida, la presente invención proporciona una composición que comprende Foxy-5 y L-histidina, tal como entre 1,5 - 3,1 equivalentes de L-histidina, tal como entre 1,7 - 2,49 equivalentes de L-histidina, tal como 1,7 - 2,1 equivalentes de L-histidina o tal como entre 2,5 - 3,1 equivalentes de L-histidina, comprendiendo dichas composiciones opcionalmente entre 0 - 5 equivalentes de agua calculada en relación con Foxy-5.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método de producción de una composición según el primer aspecto, que comprende las siguientes etapas:
a) Mezclar la forma de ácido libre de For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH (SEQ_NO 1, Foxy-5), ya sea como
i. una suspensión en un disolvente, o
ii. como un polvo puro,
con cualquiera de
iii. 0,5 - 1,49 equivalentes de una base nitrogenada para preparar una mono-sal de Foxy-5, o
iv. 1,50 - 2,49 equivalentes de una base nitrogenada para preparar una di-sal de Foxy-5, o
v. 2,5 - 3,1 equivalentes de una base nitrogenada para preparar una tri-sal de Foxy-5,
b) Agitar la mezcla de reacción hasta que se obtiene una disolución transparente, y
c) Liofilizar o secar por pulverización la disolución, en donde la base nitrogenada es un compuesto seleccionado de amoniaco, hidróxidos de amonio cuaternario, guanidinas alquiladas, aminoácidos y aminas primarias y secundarias, y en donde todas las etapas a) - c) se realizan opcionalmente en una atmósfera inerte.
En realizaciones preferidas del segundo aspecto, la base nitrogenada empleada para la formación de sal en la etapa iii), iv) o v) se selecciona de amoniaco, L-lisina, L-histidina, N-metil-D-glucamina y trometamina.
En realizaciones preferidas, la concentración de Foxy-5 en la etapa i) es aproximadamente 20-30 mg/ml en agua. En otras realizaciones preferidas, la base nitrogenada empleada para la formación de sal en la etapa vi) es 1,50 - 2,49 equivalentes, tal como 1,7 - 2,1 equivalentes, tal como 1,9 - 2,03 equivalentes, tal como 1,95 - 2,01 equivalentes, tal como 2,0 equivalentes, de una base nitrogenada seleccionada de amoniaco, L-lisina, L-histidina y trometamina.
En otras realizaciones preferidas, la base nitrogenada empleada para la formación de sal en la etapa v) es 2,5 - 3,1 equivalentes, tales como 2,9 - 3,03 equivalentes, tal como 2,95 - 3,01 equivalentes, tal como 3,0 equivalentes, de una base nitrogenada seleccionada de L-histidina y N-metil-D-glucamina.
Como se ha mencionado anteriormente en este documento, se usaron dos enfoques diferentes en la preparación de las composiciones según el primer aspecto: añadir la cantidad calculada de base en una porción a la suspensión acuosa del ácido sin Foxy-5, o valorar la base relevante lentamente, manteniendo el pH de la mezcla de reacción < 6,0 durante todo el procedimiento.
Tras el análisis de HPLC de las composiciones recién liofilizadas, se descubrió que la valoración "lenta" produjo una composición que contenía un menor nivel de impurezas que las composiciones preparadas usando el enfoque "rápido", véase la Figura 8. Como se puede apreciar, el efecto es mayor para la "tri-sal" de amoniaco, donde la pureza disminuye desde aproximadamente el 98 % hasta el 95 % (adición lenta ^ adición rápida). En comparación, las purezas de las "trisales" de trometamina y tri-N-metil-glucamina son solo ligeramente menores cuando estas sales se forman por adición rápida. Sin desear quedar ligado a teoría, los inventores creen que este fenómeno se puede relacionar con el valor de pKa de la base formadora de sal: el hidróxido de amonio es el más fuerte de las tres bases, con un pKa de 9,3, mientras que tanto la trometamina como la N-metil-glucamina tienen un pKa de 8,0.
En realizaciones del segundo aspecto, la base nitrogenada empleada para la formación de sal en la etapa b) se añade en una porción a la suspensión acuosa del ácido sin Foxy-5. En otras realizaciones del segundo aspecto, la base nitrogenada empleada para la formación de sal en la etapa b) se añade gradualmente a la suspensión acuosa del ácido sin Foxy-5, manteniendo el pH de la mezcla de reacción < 6,0 durante todo el procedimiento.
En aún otras realizaciones del segundo aspecto, la disolución transparente final en la etapa 2 se liofiliza para proporcionar una composición amorfa de la presente invención.
PARTE EXPERIMENTAL
Determinación de los valores de pKa de Foxy-5
Se midieron los valores de pKa del ácido sin Foxy-5 (lote: 1058263) por valoración potenciométrica a 25 °C usando un instrumento Sirius T3 equipado con el software SiriusT3Control Vers. 2.0.0.0. Se usó un método de valoración acuosa automática con valores iniciales de 1,0 mg de API sólido disuelto en 1,5 ml de agua ISA y tres valoraciones secuenciales en la misma muestra. En las tres valoraciones, la disolución de muestra se ajustó con KOH 0,5 M a un pH inicial de 12 y se valoró lentamente con HCl 0,5 M hasta un pH final de 2.
Se ajustó cada curva de valoración usando el software SiriusT3Control Vers. 2.0.0.0, y se calcularon los valores de pKa correspondientes. Se observaron los valores de pKa para los cuatro sitios ácidos teóricamente predichos en el intervalo experimentalmente accesible con un RMSD de 0,071. Los resultados del ajuste se resumen en la siguiente Tabla 1.
También se calcularon valores de pKa teóricos con ACD/Percepta 14.51.0 (versión 3382) usando tanto los modos clásicos como de GALAS y el paquete ACD_Prediction Vers. 2.0.0.0 dentro del software Sirius T3 Vers. 2.0.0.0, siendo el último el programa usado para medir el pKa. Las asignaciones de los valores calculados a sitios específicos en la molécula se hicieron por el software. Como muestra la Tabla 1, los tres métodos de predicción dieron valores que concordaron entre sí dentro de 0,1 a 0,5 unidades. Los valores experimentales están razonablemente próximos a los predichos con los valores medidos para el tiol del grupo cisteína y el ácido carboxílico del ácido L-aspártico que se encuentran esencialmente en el centro de los intervalos predichos correspondientes y el ácido carboxílico terminal y el ácido carboxílico del grupo ácido L-glutámico que está justamente fuera del extremo superior del intervalo predicho No estuvieron presentes errores de concentración, que indica que la muestra de péptido era probablemente bastante pura.
Tabla 1^Valores de pKa medidos y calculados para Foxy-5______________________________________________
pKa pKa [calculado] Sitio predicho (tipo)
[medido] ACD Labs a) ACD Labs b) Sinus T3 c)
9,01 9,2 ± 0,1 8,7 ± 0,5 9,16 CYS tiol (ácido)
4,79 4,4 ± 0,1 4,7 ± 0,4 4,45 GLU ácido carboxílico (ácido)
3,98 4,1 ± 0,1 3,9 ± 0,5 4,19 ASP ácido carboxílico (ácido) 3,39 3,3 ± 0,1 3,2 ± 0,4 3,34 ácido carboxílico terminal (ácido) a) Estos valores se calcularon usando el enfoque clásico ACD/Percepta 14.51.0 (versión 3382).
b) Estos valores se calcularon usando el enfoque de GALAS en ACD/Percepta 14.51.0 (versión 3382). c) Estos valores se calcularon usando el paquete ACD_Prediction Vers. 2.0.0.0 dentro del software Sirius T3 Vers. 2.0.0.0 . No se proporcionó barra de error por el software._________________________
A continuación, se facilita una descripción detallada para cada composición producida según la presente invención, dividida en "tri-sales", es decir, composiciones de Foxy-5 que contienen aproximadamente tres equivalentes de una base nitrogenada, "di-sales", es decir, composiciones de Foxy-5 que contienen aproximadamente dos equivalentes de una base nitrogenada y "mono-sales", es decir, composiciones de Foxy-5 que contienen aproximadamente un equivalente de una base nitrogenada.
Los datos de la prueba de estabilidad para todas las composiciones formadas y el material de partida en sí (ácido sin Foxy-5) se midieron a las 0, 2 y 4 semanas de almacenamiento a 40 °C y se incluyen en la Figura 10.
Condiciones analíticas para las mediciones de estabilidad
Los siguientes parámetros para el método de UPLC específico de sustancia se emplearon para las mediciones de pureza de las muestras de estabilidad:
Formación de "tri-sales"
Las tri-sales de Foxy-5 se preparan, en general, añadiendo la base relevante a una suspensión de Foxy-5 en agua u otro disolvente adecuado. La base se puede añadir pura o en disolución, y o en una porción o gradualmente, manteniendo el pH <6 durante el procedimiento.
Tri-sal de arainina
EXPERIMENTO ARG-P1
Se pesaron 89,7 mg (0,129 mmoles) de hexapéptido Foxy-5 en un vial Supelco de 4 ml; se añadieron 3 ml de agua ultrapura desgasificada (resistividad > 18,2 MQ cm) => se obtuvo una suspensión blanca vítrea; se añadieron 67,7 mg (3 equiv.) de L-arginina bajo una purga de N2 => se obtuvo una disolución transparente incolora con pH 7,31; se dejó con agitación a durante 2 h => se obtuvo una disolución transparente incolora con pH 7,27; se filtró a través de un filtro de jeringa (diámetro de 13 mm, PVDF de 0,2 pm) en un matraz redondo de 10 ml; la disolución resultante se congeló en nieve carbónica; se liofilizó durante 18 h 15 min ^ se obtuvo un sólido blanco; se caracterizó por PXRD; se almacenó en el congelador y se caracterizó por duplicado por HPLC 14 d después. La PXRD confirma que la muestra es amorfa; la HPLC muestra purezas del 96,47 % de área y 96,40 % de área para las dos inyecciones.
Tri-sal de calcio
EXPERIMENTO Ca-P1
Se pesaron 89,6 mg (0,129 mmoles) de hexapéptido Foxy-5 en un vial Supelco de 4 ml; se añadieron 3 ml de agua ultrapura desgasificada (resistividad > 18,2 MQ cm) => se obtuvo suspensión blanca vítrea; se añadieron 28,8 mg (3 equiv.) de Ca(OH)<2>=> se obtuvo una suspensión blanca diluida con pH 12,36; se dejó con agitación a t.a. durante 2 h => se obtuvo una suspensión blanca diluida con pH 12,34; se dejó con agitación a t.a. durante la noche => se obtuvo una suspensión blanca; el experimento terminó debido a que no se alcanzó solubilidad mínima.
Tri-sal de colina
EXPERIMENTO CHO-P1
Se pesaron 89,6 mg (0,129 mmoles) de hexapéptido Foxy-5 en un vial Supelco de 4 ml; se añadieron 3 ml de agua ultrapura desgasificada (resistividad > 18,2 MQ cm) ^ se obtuvo una suspensión blanca; se añadieron 95,4 pl (3 equiv.) de 46 % de hidróxido de colina (ac.) (dens. = 1,073 g ml'1) bajo N2 ^ se obtuvo una disolución beis con pH 8,51; se dejó con agitación a t.a. durante 2 h ^ se obtuvo una disolución beis con pH 8,43; se filtró a través de un filtro de jeringa de PVDF de 0,2 pm en un matraz redondo de 10 ml; se congeló y liofilizó la disolución ^ se obtuvo un sólido beis; se caracterizó por PXRD; se caracterizó por duplicado por HPLC. La PXRD confirma que la muestra es amorfa; la HPLC muestra purezas del 92,14 % de área y 92,08 % de área para las dos inyecciones.
Tri-sal de dietilamina
EXPERIMENTO DEA-P1
Se pesaron 90,5 mg (0,130 mmoles) de hexapéptido Foxy-5 en un vial Supelco de 4 ml; se añadieron 3 ml de agua ultrapura desgasificada (resistividad > 18,2 MQ cm) => se obtuvo una suspensión blanca vítrea; se añadieron 40,2 pl (3 equiv.) de dietilamina (dens. = 0,707 g ml-1) bajo una purga de N2 => se obtuvo una disolución transparente incolora con pH 5,43; se dejó con agitación a t.a. durante 2 h => se obtuvo una disolución incolora transparente con pH 5,45; se filtró a través de un filtro de jeringa (diámetro de 13 mm, 0,2 pm de PVDF) en un matraz redondo de 10 ml; la disolución resultante se congeló en nieve carbónica; se liofilizó durante 18 h 15 min => se obtuvo un sólido blanco; se caracterizó por PXRD; se almacenó en el congelador y se caracterizó por duplicado por HPLC 14 d después; se almacenaron alícuotas de esta muestra en recipientes cerrados a 40 °C durante 2 semanas y 4 semanas y se examinaron por HPLC; se observó que tenían un aspecto vitreo después de tanto 2 como 4 semanas de almacenamiento a 40 °C. La PXRD confirma que la muestra es amorfa; la HPLC muestra purezas del 97,26 % de área y 97,22 % de área para las dos inyecciones.
Tri-sal de lisina
EXPERIMENTO LYS-P1
Se pesaron 90,3 mg (0,130 mmoles) de hexapéptido Foxy-5 en un vial Supelco de 4 ml; se añadieron 3 ml de agua ultrapura desgasificada (resistividad > 18,2 MQ cm) ^ se obtuvo una suspensión blanca vitrea; se añadieron 56,8 mg (3 equiv.) de L-lisina bajo una purga de N2 ^ se obtuvo una disolución incolora transparente con pH 6,39; se dejó con agitación a t.a. durante 2 h ^ se obtuvo una disolución incolora transparente con pH 6,46; se filtró a través de un filtro de jeringa (diámetro de 13 mm, 0,2 pm de PVDF) en un matraz redondo de 10 ml; se congeló la disolución resultante en nieve carbónica; se liofilizó durante 18 h 15 min => se obtuvo un sólido blanco; se caracterizó por PXRD; se almacenó en el congelador y se caracterizó por HPLC 14 d después; se almacenaron alícuotas de esta muestra en recipientes cerrados a 40 °C durante 2 semanas y 4 semanas y se caracterizaron por duplicado por HPLC. La PXRD confirma que la muestra es amorfa; la HPLC muestra purezas del 97,44 % de área y 97,39 % de área para las dos inyecciones.
Tri-sal de magnesio
EXPERIMENTO Mg-P1
Se pesaron 89,6 mg (0,129 mmoles) de hexapéptido Foxy-5 en un vial Supelco de 4 ml; se añadieron 3 ml de agua ultrapura desgasificada (resistividad > 18,2 MQ cm) ^ se obtuvo una suspensión blanca vítrea; se añadieron 22,7 mg (3 equiv.) de Mg(OH)<2>^ se obtuvo una suspensión blanca densa (demasiado densa para medir el pH); se dejó con agitación a t.a. durante 2 h => se obtuvo una suspensión blanca con pH 9,06; se dejó con agitación a t.a. durante la noche => se obtuvo una suspensión blanca; se terminó el experimento debido a que no se alcanzó solubilidad mínima. Puesto que no se obtuvo sal con una solubilidad superior a 30 g M, no se llevó a cabo caracterización.
Tri-sal de sodio
EXPERIMENTO Na-P1
Se pesaron 90,5 mg (0,130 mmoles) de hexapéptido Foxy-5 en un vial Supelco de 4 ml; se añadieron 3 ml de agua ultrapura desgasificada (resistividad > 18,2 MQ cm) ^ se obtuvo una suspensión blanca vítrea; se añadieron 388,6 pl (3 equiv.) de NaOH 1 M (ac) bajo una purga de N2 ^ se obtuvo una disolución incolora transparente con pH 8,23; se dejó con agitación a t.a. durante 2 h ^ se obtuvo una disolución incolora transparente con pH 8,17; se filtró a través de un filtro de jeringa (diámetro de 13 mm, 0,45 pm de PVDF) en un matraz redondo de 10 ml; se congeló la disolución resultante en nieve carbónica; se liofilizó durante 24 h 05 min ^ se obtuvo un sólido blanco; se almacenó en el congelador y se caracterizó por HPLC 5 d después; la muestra fue difícil de pesar debido a que era muy higroscópica; se almacenaron alícuotas de esta muestra en recipientes cerrados a 40 °C durante 2 semanas y 4 semanas y examinaron por duplicado por HPLC; la muestra de 4 semanas fue difícil de pesar debido a la higroscopicidad. La PXR<d>confirma que la muestra es amorfa; están posiblemente presentes trazas de NaCl; la HPLC muestra purezas del 95,11 % de área para ambas inyecciones.
Tri-sal de amoniaco
EXPERIMENTO NH3-P8
Se pesaron 100,3 mg (0,144 mmoles) de hexapéptido Foxy-5 en un vial Supelco de 15 ml; se añadieron 3,333 ml de agua ultrapura (resistividad > 18,2 MQ cm) bajo una purga de N2 => suspensión vítrea. La suspensión se agitó a 500 rpm y se insertó un electrodo de pH. Se administró 0,1 M de NH<4>OH (ac) a 0,05 ml min-1, pausando para medir el pH periódicamente. A los 15 min, se habían añadido 0,50 ml de base y el pH era 3,84; a los 45 min, se había añadido un total de 1,34 ml de base y el pH era 4,09; a 1 h 06 min, se había añadido un total de 2,37 ml de base y el pH era 4,42; a 1 h 14 min, se había añadido un total de 2,74 ml de base y el pH era 4,64; se obtuvo una disolución incolora transparente; a 1 h 45 min, se había añadido un total de 3,74 ml de base (igual a 2,59 equivalentes) y el pH era 5,81; se pausó la dosificación; a 3 h 40 min, el pH era 6,00; no se añadieron los 0,58 ml de base restantes; el experimento se terminó. La disolución incolora transparente se dispuso en un matraz redondo de 20 ml, se congeló en una mezcla de nieve carbónica e isopropanol, y se liofilizó. Se llevaron a cabo análisis de HPLC (por duplicado) y elementales. La HPLC muestra purezas del 98,08 % de área y 98,05 % de área para las dos inyecciones y valores de ensayo correspondientes del 68,76 % y 68,71 %, respectivamente. La relación entre el contenido de nitrógeno y azufre no se ajusta del todo a una tri-sal, pero esto no es sorprendente debido a que la cantidad añadida (basada en cálculos gravimétricos) fue solo de 2,59 equivalentes. El análisis elemental (C, H, N, O y S) del producto (a continuación) concuerda bien con una sal que comprende 2,6 equivalentes de amoniaco y 2 equivalentes de agua.
Tri-sal de N-metil-D-alucamina
EXPERIMENTO NMG-P5
Se pesaron 90,3 mg (0,130 mmoles) de hexapéptido Foxy-5 en un vial Supelco de 7 ml; se añadieron 3 ml de agua ultrapura desgasificada (resistividad > 18,2 MQ cm). Se insertó el pH-metro y se midió el pH de 2,66. Se aplicó una purga de N2 y la agitación se estableció a 700 rpm. Se añadió lentamente 0,78 ml de una disolución acuosa 0,5 M de N-metil-D-glucamina (4,8803 g en 50 ml de agua) con un dosímetro y el pH se midió en diferentes momentos de tiempo. Después de la adición de 0,25 ml de NMG (ac) 0,5 M, se observó una disolución turbia con algo de material en el fondo del reactor. El pH fue 4,01. Se obtuvo una disolución transparente después de la adición de 0,70 ml de la disolución 0,5 M de N-metil-D-glucamina; el pH fue 5,51. Se añadió un total de 0,74 ml de disolución 0,5 M de N-metil-D-glucamina (iguales a 2,85 eq); el pH fue 5,99. Después de 2 h de agitación, el pH de la disolución fue 6,01. La disolución incolora transparente se dispuso en un matraz redondo de 20 ml, se congeló en nieve carbónica; y se liofilizó durante la noche. Se obtuvo un sólido blanco y se caracterizó por PXRD y HPLC. La PXRD confirma que la muestra es amorfa; la HPLC muestra purezas del 96,90 % de área y 96,69 % de área para las dos inyecciones.
Tri-sal de trometamina
EXPERIMENTO TRO-P3
Se pesaron 90,0 mg (0,1295 mmoles) de hexapéptido Foxy-5 en un vial Supelco de 7 ml; se añadieron 3 ml de agua ultrapura desgasificada (resistividad > 18,2 MQ cm). Se insertó el pH-metro y se midió el pH de 2,69. Se aplicó una purga de N2 y la agitación se estableció a 700 rpm. Se observó una suspensión. Se añadieron lentamente 0,39 ml de una disolución acuosa 0,5 M de trometamina (1,2115 g en 20 ml de agua) con un dosímetro durante 30 minutos y el pH se midió en diferentes momentos de tiempo. Después de la adición de 0,29 ml (1,12 eq) de TRO 0,5 M (ac), casi todo el sólido se disolvió y el pH fue 4,04. Se obtuvo una disolución transparente después de la adición de 0,59 ml de la disolución 0,5 M de TRO (2,28 eq); el pH fue 4,99. Se añadió un total de 0,71 ml de disolución 0,5 M de TRO (igual a 2,74 eq); el pH fue 5,95. Después de 2 h de agitación, el pH de la disolución fue 5,97. La disolución incolora transparente se dispuso en un matraz redondo de 20 ml; se congeló en el congelador; y se liofilizó durante la noche. Se obtuvo un sólido blanco y se caracterizó por PXRD. La muestra se almacenó entonces en el congelador y se caracterizó por duplicado por HPLC 5 d después. La HPLC muestra purezas del 98,34 % de área y 98,35 % de área para las dos inyecciones.
Tri-sal de histidina
EXPERIMENTO HIS-P2
Se pesaron 100,4 mg (0,145 mmoles) de hexapéptido Foxy-5 en un vial Supelco de 7 ml; se añadieron 3,33 ml de agua ultrapura (resistividad > 18,2 MQ cm) bajo una purga de N2 ^ se observó suspensión de sólido blanco de tipo gel; se agitó a 500 rpm y se insertó un electrodo para medir un pH de 2,64; se administró 0,0985 M de L-histidina (ac) a 0,1 ml min_1, pausando para medir el pH; a los 2 min, se habían añadido 0,30 ml de base y el pH era 3,50; a los 9 min, se había añadido un total de 1,00 ml de base y el pH era 3,50; a los 19 min, se había añadido un total de 2,00 ml de base y el pH era 4,23; se observó una disolución principalmente transparente con algunos grumos de sólido de tipo gel; a los 29 min, se había añadido un total de 3,00 ml y el pH era 4,61; a los 39 min, se había añadido un total de 4,00 ml de base y el pH era 5,11; se observó una disolución incolora transparente; a los 43 min, se había añadido un total de 4,38 ml de base y el pH era 5,29; se dejó con agitación durante varias horas; a las 3 h 23 min después del inicio de la dosificación, se midió que el pH era 5,27 y el experimento se terminó; la disolución incolora transparente se dispuso en un matraz redondo de 20 ml, se congeló la disolución resultante en nieve carbónica y se liofilizó durante 19 h 05 min y dio un sólido blanco esponjoso; se llevaron a cabo análisis por HPLC (por duplicado) y elementales. La PXRD confirma que la muestra es amorfa (Figura 8). La HPLC muestra purezas del 98,25 % de área y 98,21 % de área para las dos inyecciones y valores de ensayo correspondientes del 62,12 % y 61,95 %, respectivamente. El análisis elemental (C, H, N, O y S) del producto (a continuación) concuerda bien con el producto amorfo que es una tri-sal tetrahidratada.
Determinación de la solubilidad para la tri-sal de histidina
Se redisolvió cuidadosamente 12,9 mg de la anteriormente sal de histidina producida en agua a una tasa de agitación de 500 rpm y una tasa de dosificación de agua de 0,01 ml/min. Se observó disolución completa después de la adición, de un total de 0,08 ml de agua, correspondiente a una solubilidad de al menos 161 g/l.
Formación de "di-sales"
Se preparan, en general, di-sales de Foxy-5 añadiendo la base relevante a una suspensión de Foxy-5 en agua u otro disolvente adecuado. La base se puede añadir pura o en disolución, y ya sea en una porción o gradualmente, manteniendo el pH <6 durante el procedimiento.
Di-sal de arginina
EXPERIMENTO ARG-P2
Se pesaron 90,5 mg (0,130 mmoles) de hexapéptido Foxy-5 en un vial Supelco de 4 ml; se añadieron 3 ml de agua ultrapura desgasificada (resistividad > 18,2 MQ cm) ^ se obtuvo una suspensión blanca vitrea; se añadieron 45,1 mg (2 equiv.) de L-arginina bajo una purga de N2 ^ se obtuvo una disolución incolora transparente con pH 4,57; se dejó con agitación a t.a. durante 2 h ^ se obtuvo una disolución incolora transparente con pH 4,55; se filtró a través de un filtro de jeringa (diámetro de 13 mm, 0,2 pm de PVDF) en un matraz redondo de 10 ml; se congeló la disolución resultante en nieve carbónica; se liofilizó durante 19 h 30 min ^ se obtuvo un sólido blanco; se caracterizó por PXRD; se almacenó en el congelador y se caracterizó por duplicado por HPLC 6 d después. La PXRD confirma que la muestra es amorfa; la HPLC muestra purezas del 97,70 % de área y 97,67 % de área para las dos inyecciones.
Di-sal de colina
EXPERIMENTO CHO-P2
Se pesaron 89,1 mg (0,128 mmoles) de hexapéptido Foxy-5 en un vial Supelco de 4 ml; se añadieron 3 ml de agua ultrapura desgasificada (resistividad > 18,2 MQ cm) => se obtuvo una suspensión blanca vitrea; se añadieron 63,6 pl (2 equiv.) de 46 % de hidróxido de colina (ac) (dens. = 1,073 g ml'1) bajo una purga de N2 => se obtuvo una disolución beis con pH 4,78; se dejó con agitación a t.a. durante 2 h => se obtuvo una disolución beis con pH 4,78; se filtró a través de un filtro de jeringa (diámetro de 13 mm, 0,2 pm de PVDF) en un matraz redondo de 10 ml; se congeló la disolución resultante en nieve carbónica; se liofilizó durante 19 h 30 min => se obtuvo un sólido blanco; se caracterizó por PXRD; y se caracterizó por duplicado por HPLC. La PXRD confirma que la muestra es amorfa; la HPLC muestra purezas del 94,42 % de área y 94,27 % de área para las dos inyecciones.
Di-sal de dietilamina
EXPERIMENTO DEA-P2
Se pesaron 90,1 mg (0,130 mmoles) de hexapéptido Foxy-5 en un vial Supelco de 4 ml; se añadieron 3 ml de agua ultrapura desgasificada (resistividad > 18,2 MQ cm) ^ se obtuvo una suspensión blanca vitrea; se añadieron 26,8 pl (2 equiv.) de dietilamina (dens. = 0,707 g ml-1) bajo una purga de N2 ^ se obtuvo una suspensión blanca diluida con pH 4,68; se dejó con agitación a t.a. durante 2 h => se obtuvo una disolución incolora transparente con pH 4,54; se filtró a través de un filtro de jeringa (diámetro de 13 mm, 0,2 nm de PVDF) en un matraz redondo de 10 ml; se congeló la disolución resultante en nieve carbónica; se liofilizó durante 19 h 30 min => se obtuvo un sólido blanco; se caracterizó por PXRD; se almacenó en el congelador y se caracterizó por HPLC 6 d después; se almacenaron alícuotas de esta muestra en recipientes cerrados a 40 °C durante 2 semanas y 4 semanas y se examinaron por duplicado por HPLC. La PXRD confirma que la muestra es amorfa; la HPLC muestra purezas del 97,30 % de área y 97,41 % de área para las dos inyecciones.
Di-sal de lisina
EXPERIMENTO LYS-P2
Se pesaron 89,6 mg (0,129 mmoles) de hexapéptido Foxy-5 en un vial Supelco de 4 ml; se añadieron 3 ml de agua ultrapura desgasificada (resistividad > 18,2 MQ cm) ^ se obtuvo una suspensión blanca vítrea; se añadieron 37,0 mg (2 equiv.) de L-lisina bajo una purga de N2 => se obtuvo una disolución incolora transparente con pH 4,53; se dejó con agitación a t.a. durante 2 h => se obtuvo una disolución incolora transparente con pH 4,52; se filtró a través de un filtro de jeringa (diámetro de 13 mm, 0,2 pm de PVDF) en un matraz redondo de 10 ml; se congeló la disolución resultante en nieve carbónica; se liofilizó durante 19 h 30 min => se obtuvo un sólido blanco; se caracterizó por PXRD; se almacenó en el congelador y se caracterizó por HPLC 6 d después; se almacenaron alícuotas de esta muestra en recipientes cerrados a 40 °C durante 2 semanas y 4 semanas y se examinaron por duplicado por HPLC. La PXRD confirma que la muestra es amorfa; la HPLC muestra purezas del 97,69 % de área y 97,73 % de área para las dos inyecciones.
Di-sal de amoniaco
EXPERIMENTO NH3-P6
Se pesaron 100,7 mg (0,145 mmoles) de hexapéptido Foxy-5 en un vial Sulpeco de 7 ml; se añadieron 3,33 ml de agua ultrapura (resistividad > 18,2 MQ cm) bajo una purga de N2 ^ se observó un suspensión blanca de tipo gel; se agitó a 500 rpm y se insertó en un electrodo para medir un pH de 2,63; se administró 1 M de NH<4>OH (ac) a 0,05 ml min-1, pausando para medir el pH; a los 2 min, se habían añadido 0,10 ml de base y el pH era 3,19; a los 4 min, se había añadido un total de 0,20 ml de base y el pH era 3,11; se observó una disolución incolora encima de la suspensión blanca; a los 5 min, se habían añadido 0,29 ml de base (la estequiometría de di-sal) y el pH era 3,18; a los 7 min, el pH era 5,49 y la disolución era casi transparente; a los 12 min, el pH era 4,60 y la disolución era transparente; a las 2 h 12 min, se midió que el pH era 4,56, y el experimento se terminó; la disolución incolora transparente se dispuso en un matraz redondo de 20 ml, se congeló la disolución resultante en nieve carbónica y se almacenó en el frigorífico durante 5 d; entonces se liofilizó durante 27 h 35 min y dio un sólido blanco; la HPLC (por duplicado) y los análisis elementales se llevaron a cabo. La PXRD confirma que la muestra es amorfa. La HPLC muestra purezas del 97,62 % de área y 97,66 % de área para las dos inyecciones y valores de ensayo correspondientes de 89,32 % y 89,08 %, respectivamente. El análisis elemental (C, H, N, O y S) del producto (a continuación) concuerda bien con el producto amorfo que es una di-sal dihidratada.
Di-sal de N-metil-D-alucamina
EXPERIMENTO NMG-P6
Se pesaron 90,2 mg (0,130 mmoles) de hexapéptido Foxy-5 en un vial Supelco de 7 ml; se añadieron 3 ml de agua ultrapura desgasificada (resistividad > 18,2 MQ cm). Se insertó el pH-metro y se midió el pH de 2,67. Se aplicó una puga de N2 al espacio de cabeza (atmósfera de N2) y la agitación se estableció a 700 rpm. Se observó una suspensión. Se añadieron lentamente 0,52 ml de una disolución acuosa 0,5 M de N-metil-D-glucamina (4,8803 g en 50 ml de agua) con un dosímetro y el pH se midió en diferentes momentos de tiempo. Después de la adición de 0,35 ml de 0,5 M NMG (ac), se disolvió casi todo el sólido y se observó una disolución con algunos aglomerados. El pH fue 4,13. Se obtuvo una disolución transparente después de la adición de 0,50 ml de disolución 0,5 M de N-metil-D-glucamina; el pH fue 4,57. Se añadió un total de 0,52 ml de disolución 0,5 M de N-metil-D-glucamina (corresponde a 2,0 eq); el pH fue 4,64. Después de 2 h de agitación, el pH de la disolución fue 4,63. Se dispuso la disolución incolora transparente en un matraz redondo de 20 ml; se congeló la disolución resultante en nieve carbónica y se liofilizó durante la noche. Se obtuvo un sólido blanco y se caracterizó por PXRD y HPLC. Se almacenaron alícuotas de esta muestra en recipientes cerrados a 40 °C durante 2 semanas y 4 semanas y se examinaron por duplicado por HPLC; se observó que tenían un aspecto pegajoso y vítreo después de 2 semanas de almacenamiento a 40 °C. La PXRD confirma que la muestra es amorfa; HPLC muestra purezas del 96,64 % de área y 96,58 % de área para las dos inyecciones.
Di-sal de trometamina
EXPERIMENTO TRO-P2
Se pesaron 90,1 mg (0,130 mmoles) de hexapéptido Foxy-5 en un vial Supelco de 4 ml; se añadieron 3 ml de agua ultrapura desgasificada (resistividad > 18,2 MQ cm) ^ se obtuvo una suspensión blanca vítrea; se añadieron 31,4 mg (2 equiv.) de trometamina bajo una purga de N2 => se obtuvo una disolución incolora transparente con pH 4,88; se dejó con agitación a t.a. durante 2 h => se obtuvo una disolución incolora transparente con pH 4,86; se filtró a través de un filtro de jeringa (diámetro de 13 mm, 0,2-pm PVDF) en un matraz redondo de 10 ml; se congeló la disolución resultante en nieve carbónica; se liofilizó durante 19 h 30 min => se obtuvo un sólido blanco; se caracterizó por PXRD; se almacenó en el congelador y se caracterizaron por duplicado por HPLC 6 d después. PXRD confirma que la muestra es amorfa; HPLC muestra purezas del 97,77 % de área y 97,78 % de área para las dos inyecciones.
Di-sal de histidina
EXPERIMENTO HIS-P3
Se pesaron 99,2 mg (0,143 mmoles) de hexapéptido Foxy-5 en un vial Supelco de 7 ml; se añadieron 3,33 ml (es decir, 30 mg/ml) de agua ultrapura (resistividad > 18,2 MQ cm) bajo una purga de N2 ^ se observó una suspensión de sólido blanco de tipo gel; se agitó a 500 rpm y se insertó un electrodo para medir un pH de 2,65; se dosificaron 0,0985 M de L-histidina (ac) a 0,1 ml min-1, pausando para medir el pH; a 1 min, se habían añadido 0,17 ml de base y el pH era 3,10; a los 10 min, se había añadido un total de 1,00 ml de base y el pH era 3,90; a los 20 min, se había añadido un total de 2,00 ml de base y el pH era 4,40; se observó una disolución principalmente transparente con algunos grumos de sólido de tipo gel; a los 28 min, se había añadido un total de 2,82 ml y el pH era 4,73; a la 1 h 10 min, se observó una disolución incolora transparente; a las 2 h 28 min después del comienzo de la dosificación, se midió que el pH era 4,50 y se terminó el experimento; se dispuso la disolución incolora transparente en un matraz redondo de 20 ml, se congeló la disolución resultante en nieve carbónica y se liofilizó durante 19 h 05 min y dio un sólido blanco esponjoso; se llevaron a cabo HPLC y análisis elementales; se almacenaron alícuotas de esta muestra en recipientes cerrados a 40 °C durante 2 semanas y 4 semanas y se examinaron por HPLC; se observó que la muestra siguió siendo un sólido blanco esponjoso después de 2 y 4 semanas de almacenamiento a 40 °C. La HPLC muestra purezas del 98,02 % de área y 98,00 % de área para las dos inyecciones y valores de ensayo correspondientes del 67,88 % y 67,86 %, respectivamente. El análisis elemental (C, H, N, O y S, a continuación) del producto concuerda bien con el producto amorfo que es una di-sal dihidratada.
Determinación de solubilidad para la di-sal de histidina
El experimento anterior se repitió usando la mitad de la cantidad de agua (60 mg/ml) para la suspensión inicial del hexapéptido Foxy-5. Se logró una concentración final de 31,6 g l-1 para la di-sal de histidina a un pH de 5,82. El experimento también se repitió satisfactoriamente añadiendo la disolución de histidina al hexapéptido Foxy-5 puro (sólido) que produjo una concentración final de 49,3 g L'1 a un pH de 5,78. En ambos casos, las disoluciones finales se congelaron y se liofilizaron durante 25 h dando un sólido blanco esponjoso.
Formación de "mono-sales"
Se preparan mono-sales de Foxy-5, en general, añadiendo la base relevante a una suspensión de Foxy-5 en agua u otro disolvente adecuado. La base se puede añadir pura o en disolución, y o en una porción o gradualmente, manteniendo el pH <6 durante el procedimiento. La mezcla de reacción se agita entonces hasta que el material de partida se ha disuelto. La disolución final de la mono-sal se filtra opcionalmente, seguido de liofilización o secado por pulverización.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una composición sólida que comprende For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH (SEQ_NO 1, Foxy-5) y una base nitrogenada, en donde la base nitrogenada es un compuesto seleccionado de amoniaco, hidróxidos de amonio cuaternario, guanidinas alquiladas, aminoácidos y aminas primarias y secundarias, y en donde dicha composición sólida comprende opcionalmente agua.
2. La composición sólida según la reivindicación 1 que contiene 0,5 - 3,1 equivalentes molares de dicha base nitrogenada, calculada en relación con Foxy-5.
3. La composición sólida según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la base nitrogenada es un compuesto seleccionado de aminoácidos, amoniaco y aminas primarias y secundarias.
4. La composición sólida según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la base nitrogenada se selecciona de amoniaco, L-lisina, L-histidina, N-metil-D-glucamina y trometamina.
5. La composición sólida según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que comprende Foxy-5 y 1,50 - 2,49 equivalentes, tal como 1,7 - 2,1 equivalentes, tal como 1,9 - 2,03 equivalentes, tal como 1,95 - 2,01 equivalentes, tal como 2,0 equivalentes de una base nitrogenada seleccionada de amoniaco, L-lisina, L-histidina y trometamina.
6. La composición sólida según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que comprende Foxy-5 y 2,5 - 3,1 equivalentes, tal como 2,9 - 3,03 equivalentes, tal como 2,95 - 3,01 equivalentes, tal como 3,0 equivalentes, de una base nitrogenada seleccionada de L-histidina y N-metil-D-glucamina.
7. La composición sólida según la reivindicación 1 seleccionada de la sal de di-amonio, la sal de di-L-histidina, la sal de tri-L-histidina, la sal de di-L-lisina, la sal de di-N-metil-D-glucamina, la sal de tri-N-metil-D-glucamina y la sal de ditrometamina de Foxy-5, siendo dichas sales amorfas y comprendiendo opcionalmente entre 0-5 equivalentes de agua calculada en relación con Foxy-5.
8. La composición sólida según la reivindicación 2, en donde la base nitrogenada es L-histidina.
9. La composición sólida según la reivindicación 8 que comprende Foxy-5 y entre 1,50 - 2,49 equivalentes de L-histidina, tal como 1,7 - 2,1 equivalentes de L-histidina.
10. La composición sólida según la reivindicación 8 que comprende Foxy-5 y entre 2,5 - 3,1 equivalentes de L-histidina.
11. Un método de producción de una composición sólida según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende las siguientes etapas:
a) mezclar la forma de ácido libre de For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH (SEQ_NO 1, Foxy-5), ya sea como
i. una suspensión en un disolvente, o
ii. como un polvo puro,
con o
iii. 0,5 - 1,49 equivalentes de una base nitrogenada para preparar una mono-sal de Foxy-5, o
iv. 1,50 - 2,49 equivalentes de una base nitrogenada para preparar una di-sal de Foxy-5, o
v. 2,5 - 3,1 equivalentes de una base nitrogenada para preparar una tri-sal de Foxy-5,
b) agitar la mezcla de reacción hasta que se obtiene una disolución transparente, y
c) liofilizar o secar por pulverización la disolución,
en donde la base nitrogenada es un compuesto seleccionado de amoniaco, hidróxidos de amonio cuaternario, guanidinas alquiladas, aminoácidos, y aminas primarias y secundarias, y en donde todas las etapas a) - c) se realizan opcionalmente en una atmósfera inerte.
12. Un método de producción de una composición sólida según la reivindicación 11, en donde se emplea agua como disolvente.
13. Un método de producción de una composición sólida según una cualquiera de las reivindicaciones 11-12, en donde la base nitrogenada se añade gradualmente a Foxy-5 mientras se mantiene el pH de la mezcla de reacción por debajo de 6,0.
14. Un método de producción de una composición sólida según una cualquiera de las reivindicaciones 11-12, en donde se liofiliza la disolución transparente resultante de la etapa b).
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