ES2987531T3 - Composición para el tratamiento de enfermedad intestinal inflamatoria - Google Patents
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Abstract
Una composición de polinucleótidos, particularmente de polidesoxirribonucleótidos (PDRN) extraídos de fuentes naturales, para su uso en el tratamiento terapéutico de la enfermedad inflamatoria intestinal en un sujeto humano. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Composición para el tratamiento de enfermedad intestinal inflamatoria
La presente invención se refiere a un nuevo uso terapéutico de polidesoxirribonucleótidos (PDRN) para el tratamiento de enfermedad intestinal inflamatoria, particularmente enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa.
La enfermedad intestinal inflamatoria (EII), tal como enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, es un grupo de síndromes crónicos del tracto gastrointestinal caracterizados por la inflamación de la pared intestinal, dolor abdominal, diarrea, hemorragia e hipoabsorción. Aún se desconoce la etiología de estas enfermedades, aunque cada vez hay más evidencias de que la EII se origina a partir de factores inmunológicos, genéticos y ambientales alterados.
Un creciente conjunto de datos indica que los radicales libres derivados del oxígeno y del nitrógeno, tales como superóxido, radicales hidroxilo y óxido nítrico, están implicados en la patogenia de la EII. Se conoce bien el papel proinflamatorio de estas especies reactivas, incluyendo el reclutamiento de neutrófilos en el sitio de inflamación, la peroxidación lipídica y la liberación de citocinas y factores quimiotácticos. Durante la inflamación, las ROS representan una importante señal para la activación de NF-kB, que a su vez provoca modificaciones adaptativas de las células dañadas, tales como la expresión de genes para mediadores proinflamatorios y la muerte celular programada.
Las terapias convencionales para la EII incluyen fármacos antiinflamatorios, tales como aminosalicilatos, corticosteroides, tiopurinas, metotrexato y agentes anti-factor de necrosis tumoral. Sin embargo, el uso prolongado de los fármacos mencionados anteriormente puede provocar graves efectos secundarios, con un impacto negativo en la calidad de vida. Por este motivo, existe la necesidad de buscar nuevos enfoques eficaces con menos efectos secundarios.
Estudios previos han mostrado que la estimulación del receptor de adenosina es importante para disminuir la inflamación. Los diferentes subtipos de receptores (A<1>, A<2>A, A<2>B, A<3>) se expresan en células inmunitarias/inflamatorias, tales como linfocitos, neutrófilos, monocitos y macrófagos. También se demostró que A<2>A es el principal receptor responsable del efecto inhibidor de adenosina sobre la producción de citocinas proinflamatorias en diferentes modelos de enfermedad experimentales, incluyendo asma, isquemia, artritis y septicemia. Todos estos hallazgos alientan la búsqueda de nuevos fármacos adecuados para el tratamiento de EII, a través de la activación farmacológica de los receptores A<2>A.
E. Rijcken, GUT, vol. 51, n.° 4, 1 de octubre de 2002, PÁGINAS 529-535, da a conocer el uso de oligonucleótidos antisentido contra ICAM-1 y VICAM-1 como posibles candidatos para el tratamiento de enfermedades intestinales inflamatorias; estos tienen generalmente una longitud de cadena de desde 15 hasta 25 bases.
Hidetoshiet al.,BIOSCIENCE INFORMATION SERVICE, Filadelfia, PA, mayo de 2011, dan a conocer la posibilidad de usar el complejo SPG/MIF antisentido en el tratamiento de enfermedad intestinal inflamatoria. SPG/MIF antisentido es un complejo formado por el oligonucleótido antisentido contra el factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF) con el polisacárido esquizofilano (SPG).
El documento WO99/22741 da a conocer el uso de un desoxirribonucleósido, desoxirribonucleótido (monómero de ADN) u oligodesoxirribonucleótido (ADN de longitud corta) para mejorar la reparación del ADN de la piel o la mucosa.
El documento WO01/79487 se refiere al uso de polidesoxirribonucleótidos como oligonucleótidos que constituyen una triple hélice con al menos una secuencia de ácido nucleico específica para la región de transcripción o la región promotora del gen ICAM-1, donde el polidesoxirribonucleótido tiene al menos tres bases consecutivas de purina o pirimidina, en el tratamiento de enfermedad asociada a ICAM, entre las que se encuentra la enfermedad de Crohn; dichos oligonucleótidos comprenden desde 10 hasta 35 nucleótidos.
Beloet al,GUT, BRITISH MEDICAL ASSOCIATION, Londres, Reino Unido, vol. 55, n.° 2, 1 de febrero de 2008, páginas 165-171, sugieren el posible uso de nucleótidos (NT) para el tratamiento de afecciones ulcerosas del intestino.
El objeto de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento terapéutico de enfermedad intestinal inflamatoria, que esté sustancialmente libre de efectos secundarios, incluso a largo plazo.
Por tanto, la invención se basa en el hallazgo de que la administración de polinucleótidos, particularmente polidesoxirribonucleótidos (PDRN), en un modelo animal de colitis experimental (en ratas) produce una mejora significativa en todos los desenlaces patológicos asociados con la colitis inflamatoria.
Por tanto, un objeto de la invención es una composición de polinucleótidos para su uso en el tratamiento terapéutico de enfermedad intestinal inflamatoria en un individuo que padece esta enfermedad, tal como se define en las reivindicaciones que siguen.
Se pretende que el término polinucleótidos, y particularmente polidesoxirribonucleótidos, signifique una composición o mezcla de cadenas poliméricas con longitudes de cadena generalmente de desde 50 hasta 2000 pares de bases, que representan una fuente de purina, pirimidina, nucleósidos y nucleótidos.
Dicha composición comprende polidesoxirribonucleótidos con diferentes pesos moleculares y tiene una distribución de peso molecular de las cadenas poliméricas de desoxirribonucleótidos de desde 0,5 kDalton hasta 3000 kDalton, más preferiblemente desde 30 kDalton hasta 2000 kDalton, con un peso molecular promedio en número de desde 250 hasta 400 kDalton, más preferiblemente de aproximadamente 350 kDalton. Dicho resto de cadena polimérica de ADN se obtiene mediante extracción a partir de esperma de pescado o plantas, por medio de un procedimiento que comprende una etapa de fragmentación parcial de las cadenas de ADN, con el fin de reducir los pesos moleculares de las mismas, y una etapa de despurinización, al menos parcial, del ADN para eliminar la capacidad informacional del mismo.
El porcentaje preferido de despurinización del ADN es preferiblemente de desde el 1 % hasta el 5 % de bases de purina eliminadas (es decir, sitios sin purina), basado en el total de las bases de purina originalmente presentes. Siendo preferido un porcentaje de despurinización de entre el 2 y el 3 %.
Por tanto, la mezcla de PDRN usada está desprovista de capacidad informacional como resultado de la despurinización y se somete a técnicas de esterilización para virus y embriones y a un método de purificación que preferiblemente da como resultado una pureza en seco superior al 95 %, normalmente de aproximadamente el 98 %, con cantidades de proteína de menos del 0,5 %.
Las composiciones de polinucleótidos o PDRN para su uso mediante administración intramuscular o subcutánea están disponibles comercialmente con los nombres comerciales Placentex® (intacto) y Placentex® al 50 %. Este fármaco tiene un nivel de toxicidad no detectable a la dosis administrable más alta; estudios de toxicidad aguda en ratas y ratones no lograron identificar la DL<50>, que era más alta que la dosis administrable más alta (30 ml/kg de Placentex® intacto). Estudios de toxicidad crónica por la vía sistémica basados en 1 ml/kg/día de la misma preparación no mostraron muertes ni enfermedades evidentes en los órganos individuales estudiados a nivel macroscópico y microscópico, ni siquiera trastornos de salud general.
Se evaluó la actividad de la composición de polinucleótidos en el uso terapéutico según la invención por medio de las siguientes pruebas experimentales llevadas a cabo en modelos de colitis experimentales.
En los dibujos adjuntos:
- figura 1: tejidos colónicos del grupo de simulación (A), vehículo de DNBS (B), vehículo de DNBS+fármaco (C), DNBS+PDRN (D), DNBS+DMPX+PDRN (E), junto con el gráfico que representa las puntuaciones de daño macroscópico (F). Los valores obtenidos de siete animales por grupo se expresan como media y EEM.*p<0,0001 frente a grupo de vehículo de DNBS+fármaco, #p<0,0001 frente a grupo de simulación;
- figura 2: ingesta de alimentos y peso corporal evaluados durante el periodo experimental.
Los valores se obtuvieron de siete animales por grupo y se expresan como media y DE. Ingesta de alimentos en animales DNBS (A) *p<0,0001 frente a grupo de vehículo de DNBS+fármaco p<0,0001 frente a grupo de simulación.
Pérdida de peso en animales DNBS (B) §p<0,05 frente a vehículo de DNBS+fármaco, *p<0,0001 frente a grupo de vehículo de DNBS+fármaco, *p<0,0001 frente a grupo de simulación.
Ingesta de alimentos en animales DSS (C) **p<0,0001 frente a grupo de vehículo de DSS+fármaco, °p<0,0001 frente a grupo de simulación, Ap<0,0001 frente a grupo de simulación.
Pérdida de peso en animales DSS (D) §§p<0,05 frente a grupo de vehículo de DSS+fármaco, **p<0,0001 frente a grupo de vehículo de DSS+fármaco, °p<0,001 frente a grupo de simulación, Ap<0,0001 frente a grupo de simulación;
- figura 3: evaluaciones histológicas (tinción con H&E, aumento original de x10) del grupo de simulación (A), vehículo de DNBS (B), vehículo de DNBS+fármaco (C), DNBS+PDRN (D), DNBS+DMPX+PDRN (E). Los gráficos representan la puntuación de daño microscópico (F), los valores se expresan como media y EEM de siete animales. *p<0,0001 frente a grupo de vehículo de DNBS+fármaco, #p<0,0001 frente a grupo de simulación;
- figura 4: evaluaciones histológicas (tinción con H&E, aumento original de x10) del grupo de simulación (A), vehículo de DSS+fármaco (B), DSS+PDRN (C), DSS+DMTX+PDRN (D). El gráfico representa la puntuación de daño microscópico (E), los valores se expresan como media y EEM de siete animales. **p<0,0001 frente a grupo de vehículo de DSS+fármaco, Ap<0,0001 frente a grupo de simulación;
- figura 5: evaluación inmunohistoquímica de Bax (aumento de x10) del grupo de simulación (A), vehículo de DNBS (B), DNBS+PDRN (C), Dn Bs DMPX+PDRN (D). Las flechas en los puntos A y C señalan la ligera positividad. Las figuras en B y D muestran una tinción difusa del factor apoptótico;
- figura 6: evaluaciones inmunohistoquímicas de Bcl-2 (aumento de x10) del grupo de simulación (A), vehículo de DNBS (B), DNBS+PDRN (C), DNBS+DMPX+PDRN (d ). La imagen en A y C muestra una tinción difusa para Bcl-2, mientras que las flechas en B y D señalan la tinción residual de Bcl-2 en la capa mucosa;
- figura 7: evaluación inmunohistoquímica de Bax (aumento de x10) del grupo de simulación (A), vehículo de DSS+fármaco (B), DSS+PDRN (C), DSS+DMPX+PDRN (D). Las flechas en A y C señalan la ligera positividad. Las figuras B y D muestran una tinción difusa del factor apoptótico;
- figura 8: evaluaciones inmunohistoquímicas de Bcl-2 (aumento de x10) del grupo de simulación (A), vehículo de DSS+fármaco (B), DSS+PDRN (C), D<s>S+DMPX+PDRN (D). La imagen en A y C muestra una tinción difusa para Bcl-2, mientras que las flechas en B y D señalan la tinción residual de Bcl-2 en la capa mucosa;
- figura 9: efectos de PDRN sobre los niveles de malondialdehído (A) y la actividad de mieloperoxidasa (B) en animales DNBS. *p<0,0001 frente a grupo de vehículo de DNBS+fármaco, #p<0,0001 frente a grupo de simulación. Efectos de PDRN sobre los niveles de malondialdehído (C) y la actividad de mieloperoxidasa (D) en animales DSS. **P<0,0001 frente a grupo de vehículo de DSS+fármaco, *p<0,0001 frente a grupo de simulación. Los valores se expresan como media y DE de siete animales;
- figura 10: niveles de IL -ip (A y C) y TNF-a (B y D) en el suero de animales tratados con DNBS y DSS. Los valores se expresan como media y D<e>de siete animales. #p<0,0001 frente a grupo de simulación, *p<0,0001 frente a grupo de vehículo de DNBS+fármaco. Ap<0,0001 frente a grupo de simulación, ***p<0,01 frente a grupo de vehículo de DSS+fármaco.
Pruebas experimentales
Animales y tratamientos
Todos los procedimientos con animales se realizaron según los Principios para el Cuidado de Animales de Laboratorio (publicación del NIH n.° 85/23, revisada en 1985) y estaban de acuerdo con las pautas ARRIVE. Se adquirieron un total de 63 ratas Sprague Dawley macho (250-300 g) de Charles River Laboratories (Calco, Milán, Italia). Los animales se mantuvieron en jaulas de plástico en condiciones medioambientales convencionales y se alimentaron a voluntad en la instalación para animales de la Universidad de Messina. Se permitió que los animales se aclimataran durante 1 semana antes del comienzo de los experimentos.
Se indujo colitis por DNBS en ratas en ayunas bajo leve anestesia por medio de una única instilación intracolónica de ácido 2,4-dinitrobencenosulfónico (DNBS; Sigma-Aldrich, 25 mg, 0,8 ml y etanol al 50 %) mediante un catéter que se insertó en el colon a través del ano hasta el ángulo esplénico, 8 cm desde el ano. Luego se mantuvieron los animales durante 15 minutos en la posición de Trendelenburg para evitar el reflujo y, después de 6 horas, se dividieron aleatoriamente para recibir, por vía i.p., el vehículo de fármaco (1 ml/kg; n=7), PDRN (8 mg/kg; n=7) o PDRN (8 mg/kg; n=7) 3,7-dimetil-1-propargilxantina (DMPX; 10 mg/kg; n=7), un antagonista del receptor A<2>A.
Los animales del grupo de simulación (n=7) o del grupo de vehículo de DNBS (n=7) recibieron una única instilación intracolónica de 0,8 ml de solución salina o etanol al 50 %, respectivamente. Los animales se observaron para detectar síntomas de colitis, tales como diarrea y apetito, durante 7 días y luego se sacrificaron y se recogieron tejido intestinal y muestras de sangre para su análisis.
En una segunda serie de experimentos, se indujo colitis en 21 ratas mediante la administración oral de DSS al 8 % (MP Biomedicals) en el agua para beber desde el día 0 hasta el día 5. Se monitorizaron diariamente el peso corporal, la consistencia de las heces y la sangre en las heces para determinar el grado de colitis. Después de 24 horas, los animales se dividieron aleatoriamente tal como se notificó previamente. Los animales del grupo de simulación (n=7) recibieron agua para beber convencional a voluntad.
El día del sacrificio, se abrió el abdomen a través de una incisión en la línea media y se extrajo el colon descendente, se abrió a lo largo del borde antimesentérico, se enjuagó y se cortó en dos partes iguales, una para el examen histológico y la otra para análisis de marcadores bioquímicos, y también se recogieron muestras de sangre del corazón para evaluar los niveles de citocinas proinflamatorias.
La composición de PDRN usada fue una composición correspondiente al producto comercial Placentex® (intacto) de Mastelli S.r.l., recién preparada, disponible en viales de 3 ml que contienen 5,6 mg de PDRN, según la indicación de peso molecular previamente notificada en una disolución acuosa que contiene cloruro de sodio al 0,9 %. El fármaco se administró desde las 6 horas o 24 horas de tratamiento con DNBS o DSS, respectivamente. Las dosis y las vías de administración se seleccionaron de acuerdo con lo que se indica en la publicación de Bitto A,et al.en Arthritis Rheum, 2011; 63:3364-3371.
Evaluaciones de peso corporal e ingesta de alimentos
El peso corporal y la ingesta de alimentos se registraron diariamente entre las 9 a.m. y las 10 a.m. desde el día de la inducción de colitis hasta el final del experimento. Los resultados de peso corporal se expresaron como datos sin procesar y se compararon con la ingesta de alimentos usando la siguiente fórmula: ingesta de alimentos dividida entre peso corporal en gramos y multiplicado por 100.
Puntuación de daño macroscópico
El daño al colon se evaluó por dos observadores independientes según los siguientes criterios: 0 (sin daño), 1 (hiperemia localizada sin úlceras), 2 (úlceras lineales sin inflamación significativa), 3 (úlceras lineales con inflamación en un sitio), 4 (dos o más sitios principales de inflamación y ulceración que se extiende 1 cm a lo largo de la longitud del colon) y 5-8 (se añade un punto por cada centímetro de ulceración además de los 2 cm iniciales).
Puntuación de daño microscópico
Para la microscopía óptica, los tejidos se extrajeron rápidamente del colon y se fijaron en formalina tamponada al 10 %. Posteriormente, las muestras se incrustaron en parafina, se cortaron hasta un grosor de 5 |im y se tiñeron con hematoxilina y eosina y se observaron bajo un microscopio Leica.
La evaluación de los cambios tisulares se llevó a cabo por dos observadores con enmascaramiento en cuanto al protocolo experimental. Se consideraron los siguientes criterios morfológicos: puntuación 0 (sin daño), puntuación 1 (edema epitelial necrótico focal leve), puntuación 2 (hinchazón difusa moderada y necrosis de las vellosidades), puntuación 3 (necrosis grave con presencia de infiltración de neutrófilos en la submucosa), puntuación 4 (necrosis difusa muy grave con infiltración masiva de neutrófilos y hemorragia).
Evaluación inmunohistológica de Bax y Bcl-2
Se cortaron los tejidos incrustados en parafina (5 |im), se rehidrataron y se llevó a cabo la recuperación de antígenos usando tampón citrato de sodio 0,05 M (pH 6,0). Los tejidos se trataron con peróxido de hidrógeno al 1 %, para bloquear la actividad de peroxidasa exógena, y con suero equino normal (Vector Laboratories), para impedir la tinción inespecífica. Se usó un anticuerpo primario contra Bax y Bcl-2 (Abcam) (Cell Signaling Technologies) y se mantuvo durante la noche a 4 °C en un recipiente húmedo. Después de lavar en PBS, se usó un anticuerpo secundario (Vector Laboratories) y se visualizó la posición de la reacción con tetraclorhidrato de diaminobencidina (Sigma-Aldrich). Los cubreobjetos se contratiñeron con hematoxilina, se deshidrataron y se montaron sobre portaobjetos. Como parte de la evaluación histológica, un patólogo examinó todos los portaobjetos sin tener conocimiento del tratamiento previo usando portaobjetos enmascarados con un aumento de desde 5x hasta 40x bajo un microscopio Leica.
Mediciones de actividad de mieloperoxidasa
La actividad de mieloperoxidasa (MPO), un indicador de la acumulación de leucocitos polimorfonucleares, se determinó tal como se describe en la bibliografía (Mullaneet al.,J. Pharmacol Methods, 1985; 14:157-67). Se homogeneizaron cantidades iguales de tejido colónico en una disolución que contenía bromuro de hexadeciltrimetilamonio al 0,5 % disuelto en tampón fosfato de potasio 10 mM (pH 7,0). Luego se centrifugaron los lisados durante 30 minutos a 15000 rpm a 4 °C. Se hizo reaccionar una alícuota del sobrenadante con una disolución de tetrametilbencidina 1,6 mM y H<2>O<2>0,1 mM. Se midió la tasa de cambio de absorbancia mediante espectrofotometría a 650 nm. La actividad de MPO se definió como la cantidad de enzima que degrade un |imol de peróxido de hidrógeno/minuto a 37 °C y se expresó como unidades por g de tejido.
Medición de malondialdehído
Los niveles de malondialdehído (MDA) en el colon se determinaron como indicador de la peroxidación lipídica. Se homogeneizaron cantidades iguales de tejidos colónicos en disoluciones de KCl al 1,5 %, se añadió una alícuota de 0,1 ml del homogeneizado a una mezcla de reacción que contenía 0,2 ml de SDS al 8,1 %, 1,5 ml de ácido acético al 20 %, 1,5 ml de ácido tiobarbitúrico al 0,8 % y 700 ml de agua destilada. Se sometieron las muestras a ebullición durante 1 hora a 95 °C y se centrifugaron a 3000 g durante 10 minutos. Se midió la absorbancia del sobrenadante mediante un espectrofotómetro a 650 nm.
Evaluación de IL-1 p y TNF-a en suero
Las muestras se sometieron a prueba usando un kit de ELISA disponible comercialmente para IL-1 p y TNF-a (Abcam). Los resultados se obtuvieron interpolando las absorbancias con curvas de calibración y se expresaron en pg/ml en ambos casos.
Análisis estadístico
Todos los datos cuantitativos se expresan como media ± DE o media ± EEM para cada grupo y se comparan usando un ANOVA unilateral o bilateral para variables no paramétricas con pruebaa posterioride Tukey para las comparaciones entre grupos. La significación estadística se estableció en p<0,05. Los gráficos se diseñaron usando el software GraphPad Prism, versión 5.0 para Windows.
Resultados
Efectos de los PDRN sobre el peso corporal, la ingesta de alimentos y el daño macroscópico
La colitis se indujo con éxito en ratas tras el tratamiento intracolónico con DNBS, tal como se demuestra por la aparición de diarrea después de tan sólo 6 horas y por una pérdida de peso corporal significativa al final del experimento (p<0,0001 frente a grupo de simulación).
El tratamiento con PDRN dio como resultado un aumento de peso y la aparición de heces sólidas después del día 3 de tratamiento. 7 días después de la inducción de colitis, en una observación macroscópica, la mucosa colónica de los animales en el grupo de vehículo de DNBS más fármaco y en el grupo de DNBS tenía un aspecto ulcerado, edematoso e hiperémico en comparación con el grupo de simulación (p<0,0001, figuras 1A-C). En el grupo tratado con PDRN hubo una reducción significativa en el grado y la gravedad del daño al colon (p<0,0001 frente al grupo de vehículo de DNBS+fármaco). Además, el efecto de la administración de PDRN sobre el daño macroscópico se atenuó por el antagonista del receptor A<2>A (figuras 1D-E-F).
En el modelo de DNBS, se registraron la ingesta de alimentos y el peso corporal en el nivel inicial (día 0) y diariamente durante todo el periodo de experimentación. La ingesta de alimentos se muestra en la figura 2A y los datos de peso corporal se notifican en la figura 2B. El tratamiento con PDRN provocó un aumento del peso y de la ingesta de alimentos durante el periodo de tratamiento (p<0,0001 frente al grupo de vehículo de DNBS+fármaco al final del experimento; figuras 2A-B). DMPX eliminó el efecto positivo de los PDRN sobre la ingesta de alimentos y el peso corporal.
Los animales a los que se les administró DSS mostraron diarrea y hemorragia rectal después de 24 horas, mientras que se observó una pérdida de peso desde el día 3 (p<0,0001 al final del experimento frente a grupo de simulación). El tratamiento con PDRN dio como resultado una reducción de la hemorragia y un aumento de la ingesta de alimentos y del peso corporal (p<0,0001 frente al grupo de vehículo de DSS+fármaco al final del experimento). Los efectos positivos de los PDRN se atenuaron por la administración concomitante del antagonista de A<2>A, DMPX (figuras 2C y 2D).
Los PDRN reducen el daño histológico
El grupo de simulación (figura 3A) mostró un aspecto normal de la mucosa colónica con epitelio intacto. En el grupo de vehículo de DNBS (figura 3B), el análisis histológico llevado a cabo 7 días después de la inducción de colitis mostró daño a la mucosa con alteraciones en la estructura del tejido intestinal y signos de inflamación. El daño a la mucosa inducido por la administración de DNBS estaba caracterizado por necrosis del epitelio e infiltración masiva de neutrófilos y macrófagos en las capas mucosa y submucosa, engrosamiento de la pared colónica, necrosis transmural, pérdida de células caliciformes y edema (figura 3C). La administración de PDRN redujo significativamente el grado y la gravedad de la alteración histológica asociada con la administración de DNBS, estimulando la regeneración del epitelio con conservación de las vellosidades, las criptas y las células caliciformes (figura 3D). El bloqueo de los receptores A<2>A con DMPX contrarrestó el efecto beneficioso de los PDRN en animales con colitis por DNBS (figura 3E). La puntuación de daño microscópico del grupo de DNBS+PDRN se redujo significativamente en comparación con el grupo de vehículo de DNBS+fármaco (p<0,0001; figura 3F).
En el modelo de DSS, el análisis histológico llevado a cabo después de 5 días mostró un aplanamiento de las vellosidades con una presencia reducida de glándulas mucosas, infiltrado inflamatorio masivo y edema en la capa submucosa, sin signos obvios de apoptosis (figura 4B), en comparación con los animales de simulación (figura 4A). El tratamiento con PDRN redujo significativamente el grado y la gravedad de la alteración histológica asociada con la administración de DSS, estimulando la regeneración del epitelio de las vellosidades, las criptas y las células caliciformes (figura 4C). La administración de DMPX eliminó los efectos protectores de los PDRN sobre las puntuaciones histológicas (figura 4D). La puntuación de daño microscópico del grupo de DSS+PDRN se redujo significativamente en comparación con el grupo de vehículo de DSS+fármaco (p<0,0001; figura 4E). Efectos de los PDRN sobre las evaluaciones inmunohistoquímicas de Bax y Bcl-2.
Se recogieron muestras colónicas 7 días después de la administración de DNBS con el fin de determinar la tinción inmunohistológica para Bax y Bcl-2. Los tejidos obtenidos de ratas de simulación mostraron una tinción muy baja para Bax (figura 5A), mientras que los cortes colónicos obtenidos del grupo de vehículo de DNBS (no mostrado) y del grupo de vehículo de DNBS+fármaco mostraron una tinción positiva para Bax (figura 5B). Los PDRN redujeron notablemente el grado de tinción positiva para Bax en el colon de ratas a las que se les administró DNBS (figura 5C), mientras que la coadministración de DMPX eliminó el efecto de los PDRN (figura 5D). Además, la tinción de Bcl-2 en el corte colónico del grupo de simulación fue altamente positiva (figura 6A); mientras que el grupo de vehículo de DNBS (no mostrado) y el grupo de vehículo de DNBS+fármaco fueron ligeramente positivos para el agente anti-factor apoptótico (figura 6B). El tratamiento con PDRN restableció la presencia de Bcl-2 (figura 6C). El efecto de los PDRN contrastó notablemente mediante la administración concomitante de DMPX (figura 6D). En el modelo de DSS, el inmunomarcaje, realizado después de 5 días, mostró una ligera tinción para Bax en el grupo de simulación (figura 7A). DSS indujo la expresión de Bax (figura 7B), que se redujo mediante el tratamiento con PDRN hasta los niveles iniciales (figura 7C). La coadministración de DMPX atenuó los efectos de los PDRN y la expresión de Bax (figura 7D). Los animales de simulación fueron altamente positivos para Bcl-2 (figura 8A), mientras que se observó una reducción significativa en el grupo de DSS (figura 8B). Los animales tratados con PDRN mostraron una positividad renovada para Bcl-2 (figura 8C), y este efecto fue eliminado por el antagonista de A<2>A (figura 8D).
Efectos de los PDRN sobre la peroxidación lipídica y la infiltración de neutrófilos
Se aumentaron los niveles de MDA tal como se esperaba tanto en el grupo de vehículo de DNBS como en el grupo de vehículo de DNBS+fármaco (p<0,0001 frente a simulación), mientras que el tratamiento con PDRN disminuyó la peroxidación lipídica (p<0,0o01 frente a vehículo de DNBS+fármaco). Además, la acumulación de granulocitos polimorfonucleares, determinada por la actividad de mieloperoxidasa, se aumentó en el grupo de vehículo de DNBS y en el grupo de vehículo de DNBS+fármaco (p<0,000l frente a simulación).
El tratamiento con PDRN redujo significativamente los niveles de MPO y MDA (p<0,0001 frente a vehículo de DNBS+fármaco) y la coadministración de DMPX redujo este efecto positivo (figuras 9A-B).
Se aumentaron los niveles de MDA (p<0,0001 frente a simulación) en el grupo de vehículo de DSS+fármaco. La administración de PDRN disminuyó la peroxidación lipídica (p<0,0001). La acumulación de neutrófilos, determinada por MPO, se aumentó en el grupo de vehículo de DSS+fármaco (p<0,0001 frente a simulación). Los PDRN redujeron significativamente la actividad de MPO (p<0,0001 frente a grupo de vehículo de DSS+fármaco). DMPX eliminó los efectos positivos de los PDRN tanto sobre el nivel de MDA como sobre la actividad de MPO (figuras 9C-D).
Efectos de los PDRN sobre IL-ip y TNF-a
Se midieron los niveles en circulación de las citocinas proinflamatorias IL-1 p y TNF-a 7 días después de la administración de DNBS. Tal como se muestra en las figuras 10A y 10B, se observó un aumento significativo tanto de IL-1 p como de TNF-a en el suero tanto del grupo de vehículo de DNBS como del grupo de vehículo de DNBS más fármaco en comparación con animales de control (p<0,0001 frente a simulación). Como resultado de la estimulación de A<2>A por PDRN, los niveles séricos de IL-1 p y TNF-a se redujeron significativamente (p<0,0001 frente a grupo de vehículo de DNBS+fármaco). Los PDRN no lograron provocar un efecto inhibidor sobre los niveles de citocinas en presencia de DMPX (figuras 10A-B). En el modelo de DSS, las mismas citocinas mostraron un comportamiento muy similar (figuras 10C-D) y los PDRN disminuyeron la expresión de las mismas. Los resultados de las pruebas experimentales permiten predecir el uso de composiciones de PDRN para el tratamiento terapéutico de enfermedad intestinal inflamatoria, particularmente enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, en un paciente que padece estas enfermedades mediante la administración de una cantidad eficaz de dicha composición.
En particular, el tratamiento terapéutico comprende la administración de composiciones de polinucleótidos o PDRN por vía intramuscular. Para este propósito, pueden usarse las composiciones de PDRN previamente descritas que están disponibles comercialmente con el nombre comercial Placentex® intacto, por ejemplo, mediante la administración diaria de desde 1 hasta 3 viales del producto comercial.
Otras formas de administración del fármaco pueden comprender formulaciones de gel o espuma rectal, así como administraciones orales, preferiblemente en forma de comprimidos gastrorresistentes. Para estas formas de administración, junto con el principio activo pueden usarse portadores farmacéuticamente aceptables que están disponibles comercialmente.
Claims (9)
1. Composición que comprende una mezcla de polidesoxirribonudeótidos (PDRN) extraídos a partir de esperma de pescado o plantas, para su uso en el tratamiento terapéutico de enfermedad intestinal inflamatoria en un sujeto humano, en la que dicha mezcla de PDRN está desprovista de capacidad informacional como resultado del tratamiento previo mediante despurinización al menos parcial y es una mezcla de cadenas poliméricas de PDRN con pesos moleculares diferentes con longitudes de cadena de desde 50 hasta 2000 pares de bases y comprende una mezcla de cadenas poliméricas que tiene una distribución de pesos moleculares entre 0,5 kD y 3000 kD.
2. Composición para su uso según la reivindicación 1, para el tratamiento terapéutico de enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa, mediante administración parenteral, oral o rectal.
3. Composición para su uso según la reivindicación 1 ó 2, en la que dichos polidesoxirribonudeótidos están despurinizados en un porcentaje comprendido entre el 1 y el 5 % de bases de purina eliminadas, basado en el total de las bases de purina originalmente presentes.
4. Composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha mezcla de polidesoxirribonudeótidos tiene un peso molecular promedio en número de desde 250 hasta 400 kD.
5. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende un portador farmacéuticamente aceptable.
6. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la forma de un gel o una espuma rectal.
7. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la forma de un comprimido recubierto para administración oral.
8. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la forma de una disolución para inyección que comprende PDRN en una solución salina acuosa.
9. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicha composición se administra en una cantidad eficaz para reducir los síntomas de dicha enfermedad intestinal inflamatoria.
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