ES2988612T3 - Agentes de ARNi para la infección por el virus de la hepatitis B - Google Patents

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Abstract

Se describen composiciones y métodos para la inhibición de la expresión génica del virus de la hepatitis B. Se describen agentes de interferencia de ARN (ARNi) para inhibir la expresión del gen del virus de la hepatitis B. Los agentes de ARNi del VHB descritos en el presente documento pueden dirigirse a células, como por ejemplo hepatocitos, mediante el uso de ligandos de direccionamiento conjugados. También se describen composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más agentes de ARNi del VHB opcionalmente con uno o más agentes terapéuticos adicionales. La administración de los agentes de ARNi del VHB descritos al hígado infectado in vivo proporciona la inhibición de la expresión génica del VHB y el tratamiento de enfermedades y afecciones asociadas con la infección por VHB. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Agentes de ARNi para la infección por el virus de la hepatitis B
Campo de la invención
En el presente documento se describen agentes de ARN de interferencia (ARNi) para la inhibición de la expresión génica del virus de la hepatitis B, composiciones que incluyen agentes de ARNi del VHB, y métodos de uso de los mismos.
Antecedentes
El virus de la hepatitis B (VHB) es un virus hepatotropo estricto que contiene ADN bicatenario. Aunque el ADN es el material genético, el ciclo de replicación implica un paso de transcripción inversa para copiar un ARN pregenómico en ADN. El virus de la hepatitis B está clasificado como uno de los miembros de los Hepadnavirus y pertenece a la familia de los Hepadnaviridae. La infección primaria del ser humano adulto por el virus de la hepatitis B provoca una hepatitis aguda con síntomas de inflamación de los órganos, fiebre, ictericia y aumento de las transaminasas hepáticas en sangre. Los pacientes que no son capaces de superar la infección vírica sufren una progresión crónica de la enfermedad durante muchos años, con un mayor riesgo de desarrollar cirrosis hepática o cáncer de hígado. La transmisión perinatal de madres infectadas por el virus de la hepatitis B a recién nacidos también provoca hepatitis crónica.
Tras su absorción por los hepatocitos, la nucleocápside se transfiere al núcleo y se libera el ADN. Allí, se completa la síntesis de la cadena de ADN y se reparan las lagunas para dar lugar al ADN circular cerrado covalentemente (ccc) superenrollado de 3,2 kb. El ADNccc sirve de molde para la transcripción de cinco ARNm virales principales, que tienen una longitud de 3,5, 3,5, 2,4, 2,1 y 0,7 kb. Todos los ARNm tienen un capuchón 5' y están poliadenilados en el extremo 3'. Existe un solapamiento de secuencias en el extremo 3' entre los cinco ARNm.
Un ARNm de 3,5 kb sirve de molde para la producción de la proteína central y la polimerasa. Además, el mismo transcrito sirve de intermediario de replicación pregenómica y permite a la polimerasa viral iniciar la retrotranscripción en ADN. La proteína central es necesaria para la formación de la nucleocápside. El otro ARNm de 3,5 kb codifica la proteína pre central, el antígeno e secretable (HBeAg). En ausencia de inhibidores de la replicación, la abundancia de antígeno e en sangre se correlaciona con la replicación del virus de la hepatitis B en el hígado y sirve como importante marcador diagnóstico para controlar la progresión de la enfermedad.
Los ARNm de 2,4 y 2,1 kb portan los marcos abiertos de lectura ("ORF") pre-S1, pre-S2 y S para la expresión del antígeno de superficie viral grande, mediano y pequeño. El antígeno s está asociado a partículas infecciosas completas. Además, la sangre de los pacientes infectados también contiene partículas no infecciosas derivadas únicamente del antígeno s, libre de ADN genómico o polimerasa. La función de estas partículas no se conoce del todo. La eliminación completa y duradera del antígeno s detectable en sangre se considera un indicador fiable de la eliminación del virus de la hepatitis B.
El ARNm de 0,7 kb codifica la proteína X. Este producto génico es importante para la transcripción eficaz de los genes virales y también actúa como transactivador de la expresión génica del hospedador. Esta última actividad parece ser importante para la transformación de los hepatocitos durante el desarrollo del cáncer de hígado.
Los pacientes con antígeno s, antígeno e y/o ADN viral detectables en sangre durante más de 6 meses se consideran infectados crónicos. Los análogos de nucleósidos como inhibidores de la actividad de la transcriptasa inversa suelen ser la primera opción de tratamiento para muchos pacientes. Se ha demostrado que la administración de lamivudina, tenofovir y/o entecavir suprime la replicación del virus de la hepatitis B, a veces hasta niveles indetectables, observándose como beneficios más importantes habitualmente la mejora de la función hepática y la reducción de la inflamación del hígado. No obstante, solo unos pocos pacientes logran una remisión completa y duradera tras finalizar el tratamiento. Además, el virus de la hepatitis B desarrolla resistencia a los medicamentos con el aumento de la duración del tratamiento. Esto es especialmente difícil para los pacientes coinfectados por la hepatitis B y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Ambos virus son sensibles a los fármacos análogos de los nucleósidos y pueden desarrollar resistencia conjuntamente.
Una segunda opción de tratamiento es la administración de interferón alfa. En este caso, los pacientes reciben altas dosis de interferón alfa durante un periodo de 6 meses. El genotipo asiático B ofrece tasas de respuesta muy bajas. Se ha demostrado que la coinfección con el virus de la hepatitis D (VHD) o el virus de la inmunodeficiencia humana hace que el tratamiento con interferón alfa sea completamente ineficaz. Los pacientes con un daño hepático importante y un estado fibrótico grave no son aptos para el tratamiento con interferón-alfa.
Se ha demostrado previamente que ciertos agentes de interferencia de ARN (ARNi) específicos del virus de la hepatitis B inhiben la expresión del gen del VHB. Por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de EE.UU. n.° 2013/0005793, concedida a Chinet al.,divulga ciertas moléculas de ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para inhibir la expresión del gen del virus de la hepatitis B.
El documento WO 2013/003520 divulga ácidos ribonucleicos bicatenarios (ARNbc) para inhibir la expresión de un gen del virus de la hepatitis B.
El documento WO 2016/077349 divulga agentes de ARNi, p. ej., agentes de ARNi bicatenarios, dirigidos al genoma del virus de la hepatitis D (VHD), y métodos de uso de dichos agentes de ARNi para inhibir la expresión de uno o más genes del VHB.
El documento US 2016/152973 divulga moléculas de ácido nucleico bicatenario que incluyen pequeñas moléculas de ácido nucleico, como el ácido nucleico de interferencia pequeño (ANip), ARN de interferencia pequeño (ARNip), ARN bicatenario (ARNbc), moléculas de microARN (miARN) y ARN de horquilla corta (ARNhc) capaces de mediar en la interferencia del ARN (ARNi) contra la expresión génica.
El documento WO 2015/050871 divulga composiciones que comprenden un agente de ARNi del VHB.
El número de acceso GSN:BCR34362 del EBI divulga un ANip multifuncional del virus de la hepatitis B (VHB).
Sumario
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
La presente invención proporciona una composición que comprende un agente de ARNi del VHB, en donde el agente de ARNi del VHB comprende una hebra sentido que comprende una secuencia de nucleobases de SEQ ID NO: 302 o 319 y una hebra antisentido al menos parcialmente complementaria a la hebra sentido, y en donde al menos un nucleótido de la hebra sentido y/o al menos un nucleótido de la hebra antisentido del agente de ARNi es un nucleótido modificado y/o tiene un enlace internucleosídico modificado.
La presente invención también proporciona una composición de la invención para su uso en el tratamiento terapéutico de una infección crónica por v Hb .
Existe la necesidad de nuevos agentes de ARN de interferencia (ARNi) específicos para el virus de la hepatitis B (VHB) (también denominados en el presente documento agente de ARNi, activador de a Rní o activador) que sean capaces de inhibir de forma selectiva y eficaz la expresión de un gen del virus de la hepatitis B (VHB). Además, existe la necesidad de combinaciones de nuevos agentes de ARNi específicos del VHB para el tratamiento de la infección por el VHB y la prevención de enfermedades asociadas al VHB.
En el presente documento se describen agentes de ARNi específicos del gen del VHB capaces de disminuir de forma selectiva y eficiente la expresión de un gen del VHB. Los agentes de ARNi del VHB descritos pueden utilizarse en métodos para el tratamiento terapéutico y/o la prevención de síntomas y enfermedades asociados a la infección por el VHB, incluidas, entre otras, las enfermedades/trastornos hepáticos crónicos, inflamación, afecciones fibróticas, trastornos proliferativos (incluidos cánceres, como carcinoma hepatocelular), infección por el virus de la hepatitis D (VHD) e infección aguda por el VHB. En algunas realizaciones, los agentes de ARNi del VHB pueden utilizarse en métodos para el tratamiento terapéutico y/o la prevención de síntomas y enfermedades asociados a la infección crónica por el VHB y/o la infección por el VHD. Dichos métodos comprenden la administración de uno o más agentes de ARNi del VHB como se describe en el presente documento a un sujeto, p. ej., un sujeto humano o animal.
Adicionalmente, en el presente documento se describen composiciones que comprenden uno o más de los agentes de ARNi del VHB que pueden reducir de manera selectiva y eficiente la expresión de un gen del VHB. Las composiciones que comprenden uno o más agentes de ARNi del VHB pueden administrarse a un sujeto, tal como un sujeto humano o animal, para el tratamiento y/o prevención de los síntomas y enfermedades asociados a la infección por el VHB.
Cada agente de ARNi del VHB divulgado en el presente documento incluye al menos una hebra sentido y una hebra antisentido. La hebra sentido y la hebra antisentido pueden ser parcial, sustancial o totalmente complementarias entre sí. La longitud de las hebras sentido y antisentido del agente de ARNi descritas en el presente documento puede ser de 16 a 30 nucleótidos cada una. En algunas realizaciones, las hebras sentido y antisentido tienen una longitud independiente de 17 a 26 nucleótidos. En algunas realizaciones, las hebras sentido y antisentido tienen una longitud independiente de 19 a 26 nucleótidos. En algunas realizaciones, las hebras sentido y antisentido tienen una longitud independiente de 21 a 26 nucleótidos. En algunas realizaciones, las hebras sentido y antisentido tienen una longitud independiente de 21 a 24 nucleótidos. Las hebras sentido y antisentido pueden tener la misma longitud o longitudes diferentes. Los agentes de ARNi del VHB descritos en el presente documento se han diseñado para incluir secuencias de hebra antisentido que son al menos parcialmente complementarias a una secuencia del genoma del VHB que se conserva en la mayoría de los serotipos conocidos del VHB. Los agentes de ARNi descritos en el presente documento, tras su administración a una célula que exprese el VHB, inhiben la expresión de uno o más genes del VHBin vivooin vitro.
Un agente de ARNi del VHB incluye una hebra sentido (también denominada hebra pasajera) que incluye una primera secuencia, y una hebra antisentido (también denominada hebra guía) que incluye una segunda secuencia. Una hebra sentido de los agentes de ARNi del VHB descritos en el presente documento incluye un tramo central que tiene al menos aproximadamente un 85 % de identidad con una secuencia de nucleótidos de al menos 16 nucleótidos consecutivos en un ARNm del VHB. En algunas realizaciones, el tramo de nucleótidos del núcleo de la hebra sentido que tiene al menos un 85 % de identidad con una secuencia de un ARNm del VHB tiene 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 nucleótidos de longitud. Una hebra antisentido de un agente de ARNi del VHB comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente un 85 % de complementariedad en un tramo central de al menos 16 nucleótidos consecutivos con una secuencia en un ARNm del VHB y la hebra sentido correspondiente. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos del núcleo de la hebra antisentido tiene al menos un 85 % de complementariedad con una secuencia de un ARNm del VHB o la hebra sentido correspondiente tiene 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 nucleótidos de longitud.
En las tablas 3 y 4 se proporcionan ejemplos de hebras codificantes y hebras no codificantes de agentes de ARNi del VHB que pueden utilizarse en agentes de ARNi del VHB. En la tabla 5 se ofrecen ejemplos de dúplex de agentes de ARNi del VHB. Algunos ejemplos de secuencias del tramo central de 19 nucleótidos que consisten o están incluidas en las hebras sentido y antisentido de los agentes de ARNi del VHB divulgados en el presente documento, se proporcionan en la tabla 2.
En algunas realizaciones, uno o más agentes de ARNi del VHB se administran a las células o tejidos diana utilizando cualquier tecnología de administración de oligonucleótidos conocida en la técnica. Algunos métodos de administración de ácidos nucleicos incluyen, pero sin limitación, mediante encapsulación en liposomas, por iontoforesis o por incorporación en otros vehículos, tales como hidrogeles, ciclodextrinas, nanocápsulas biodegradables y microesferas bioadhesivas, vectores proteínicos o policonjugados dinámicos (DPC) (véanse, por ejemplo, los documentos WO 2000/053722, WO 2008/0022309, WO 2011/104169 y WO 2012/083185). En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB se administra a células o tejidos diana mediante la unión covalente del agente de ARNi a un grupo de direccionamiento. En algunas realizaciones, el grupo de direccionamiento puede incluir un ligando de receptor celular, tal como un ligando del receptor de asialoglicoproteína (ASGPr). En algunas realizaciones, un ligando de ASGPr incluye o consiste en un grupo de derivados de galactosa. En algunas realizaciones, un grupo de derivados de la galactosa incluye un trímero de N-acetil-galactosamina o un tetrámero de N-acetil-galactosamina. En algunas realizaciones, un grupo de derivados de la galactosa es un trímero de N-acetil-galactosamina o un tetrámero de N-acetil-galactosamina.
Un grupo de direccionamiento puede unirse al extremo 3' o 5' de una hebra sentido o una hebra antisentido de un agente de ARNi del VHB. En algunas realizaciones, se une un grupo de direccionamiento al extremo 3' o 5' de la hebra sentido. En algunas realizaciones, se enlaza un grupo de direccionamiento al extremo 5' de la hebra sentido. En algunas realizaciones, un grupo de direccionamiento está unido al agente de ARNi mediante un enlazador.
Un grupo de direccionamiento, con o sin un enlazador, puede unirse al extremo 5' o 3' de cualquiera de las hebras sentido y/o antisentido descritas en las tablas 2, 3 y 4. Un enlazador, con o sin un grupo de direccionamiento, puede unirse al extremo 5' o 3' de cualquiera de las hebras sentido y/o antisentido descritas en las tablas 2, 3 y 4.
En algunas realizaciones, en el presente documento se describen composiciones que incluyen uno o más agentes de ARNi del VHB que tienen las secuencias dúplex divulgadas en la tabla 5.
En algunas realizaciones, en el presente documento se describen composiciones que incluyen una combinación o cóctel de al menos dos agentes de ARNi del VHB que tienen diferentes secuencias de nucleótidos. En algunas realizaciones, los dos o más agentes diferentes de ARNi del VHB están cada uno unidos por separado e independientemente a grupos diana. En algunas realizaciones, los dos o más agentes diferentes de ARNi del VHB están cada uno unidos a grupos diana compuestos por N-acetil-galactosaminas. En algunas realizaciones, cuando se incluyen dos o más agentes de ARNi en una composición, cada uno de los agentes de ARNi está unido al mismo grupo de direccionamiento. En algunas realizaciones, cuando se incluyen dos o más agentes de ARNi en una composición, cada uno de los agentes de ARNi está unido a diferentes grupos de direccionamiento, como grupos diana con estructuras químicas diferentes.
En algunas realizaciones, se unen a los agentes de ARNi del VHB sin utilizar un enlazador adicional. En algunas realizaciones, el grupo de direccionamiento está diseñado con un enlazador fácilmente presente para facilitar la unión a un agente de ARNi del VHB. En algunas realizaciones, cuando se incluyen dos o más agentes de ARNi en una composición, los dos o más agentes de ARNi pueden unirse a los grupos diana utilizando los mismos enlazadores. En algunas realizaciones, cuando se incluyen dos o más agentes de ARNi en una composición, los dos o más agentes de ARNi se unen a los grupos diana utilizando diferentes enlazadores.
En algunas realizaciones, en el presente documento se describen composiciones que incluyen una combinación de al menos dos agentes de ARNi del VHB que tienen diferentes secuencias en donde cada agente de ARNi del VHB se dirige a una localización diferente o a una región diferente de un gen del VHB. En algunas realizaciones, en el presente documento se describen composiciones que incluyen una combinación de al menos dos agentes de ARNi del VHB, en donde cada agente de ARNi del VHB está diseñado para dirigirse a un transcrito diferente del VHB (por ejemplo, una composición que incluye dos agentes de ARNi del VHB, en donde el primer agente de ARNi del VHB incluye una hebra antisentido que es al menos parcialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos localizada en el ORF S de un gen del VHB, mientras que el segundo agente de ARNi del VHB incluye una hebra antisentido que es al menos parcialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos localizada en el ORF X de un gen del VHB). Como se usa en el presente documento, un agente de ARNi que incluye una hebra antisentido al menos parcialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos localizada en el ORF S se dirige a una porción del genoma del VHB de SEQ ID NO: 1 entre las posiciones 1-1307 y 3185-3221. Como se usa en el presente documento, un agente de ARNi que incluye una hebra antisentido al menos parcialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos localizada en el ORF X se dirige a una porción del genoma del VHB de SEQ ID NO: 1 entre las posiciones 1308-1930.
Se sabe que el ARNm del VHB es policistrónico, lo que da lugar a la traducción de múltiples polipéptidos y los ARNm separados se solapan en la secuencia del ARN, por lo que un único agente de ARNi dirigido a un gen del VHB puede provocar la inhibición de la mayoría o de todos los transcritos del VHB. No obstante, aunque sin desear quedar ligados a teoría alguna, se plantea la hipótesis de que una composición que incluya dos o más agentes de ARNi del VHB dirigidos a diferentes localizaciones o regiones de un gen del VHB (y, en particular, dos o más agentes de ARNi del VHB en donde un agente de ARNi del VHB se dirige al ORF S y un segundo agente de ARNi del VHB se dirige al ORF X) pueden proporcionar ventajas adicionales sobre una composición que incluya un único agente de ARNi del VHB, como (a) garantizar que todos los transcritos virales del VHB son el objetivo (es decir, 3,5 kb de ARN pregenómico; ARNm de la proteína pre central de 3,5 kb; ARNm de pre-S1 de 2,4 kb; ARNm de pre-S2/S de 2,1 kb; ARNm de X de 0,7 kb; así como cualquier ARNm que exprese antígeno S producido a partir de ADN del VHB integrado); (b) servir para ampliar la cobertura del genotipo para dirigirse potencialmente a una población de pacientes más amplia; y/o (c) disminuir potencialmente la resistencia viral debido a mutaciones en el sitio de unión del ARNip.
En algunas realizaciones, en el presente documento se describen composiciones que incluyen una combinación de un agente de ARNi del VHB que se dirige al ORF S de un ARN del VHB (es decir, que tiene una hebra antisentido que se dirige a los transcritos S (S, pre-S1 y pre-S2), el ARN pregenómico (proteína central y polimerasa) y los transcritos de la proteína pre central (HBeAg) de un genoma del VHB), y un agente de ARNi del VHB que se dirige al ORF X de un a Rn del v Hb (es decir, que tiene una hebra antisentido que se dirige al transcrito X de un genoma del VHB, los transcritos S (S, pre-S1 y pre-S2), el ARN pregenómico (proteína central y polimerasa) y los transcritos de la proteína pre central (HBeAg) de un genoma del v Hb ). En algunas realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento incluyen al menos un agente de ARNi del VHB que contiene una secuencia dirigida al ORF S de un gen del VHB, y un segundo agente de ARNi del VHB que contiene una secuencia dirigida al ORF X de un gen del VHB.
En el presente documento se describen métodos para inhibir la expresión de un gen del VHB, comprendiendo el método la administración de uno o más agentes de ARNi del VHB que tengan una hebra antisentido que comprenda la secuencia de cualquiera de las secuencias de la tabla 3.
En el presente documento se describen métodos para inhibir la expresión de un gen del VHB, comprendiendo el método la administración de uno o más agentes de ARNi del VHB que tengan una hebra sentido que comprenda la secuencia de cualquiera de las secuencias de la tabla 4.
En el presente documento se describen métodos para inhibir la expresión de un gen del VHB, comprendiendo el método la administración de uno o más agentes de ARNi del VHB que tengan una hebra antisentido que comprenda la secuencia de cualquiera de las secuencias de la tabla 3, y una hebra sentido que comprenda la secuencia de cualquiera de las secuencias de la tabla 4 que sea al menos parcialmente complementaria a la hebra antisentido.
En el presente documento se describen métodos para inhibir la expresión de un gen del VHB, comprendiendo el método la administración de uno o más agentes de ARNi del VHB que tengan una hebra antisentido que consista en la secuencia de cualquiera de las secuencias de la tabla 3, y una hebra sentido que consista en la secuencia de cualquiera de las secuencias de la tabla 4 que sea al menos parcialmente complementaria a la hebra antisentido.
En el presente documento se describen métodos para inhibir la expresión de un gen del VHB en una célula, comprendiendo el método la administración de uno o más agentes de ARNi del VHB que tengan la estructura dúplex de la tabla 5.
En el presente documento se describen métodos de tratamiento de una infección por el VHB o de prevención de enfermedades o síntomas causados por una infección por el VHB, comprendiendo el método la administración de uno o más agentes de ARNi del VHB que tengan una hebra antisentido que comprenda la secuencia de cualquiera de las secuencias de la tabla 3.
En el presente documento se describen métodos de tratamiento de una infección por el VHB o de prevención de enfermedades o síntomas causados por una infección por el VHB, comprendiendo el método la administración de uno o más agentes de ARNi del VHB que tengan una hebra sentido que comprenda la secuencia de cualquiera de las secuencias de la tabla 4.
En el presente documento se describen métodos de tratamiento de una infección por el VHB o de prevención de enfermedades o síntomas causados por una infección por el VHB, comprendiendo el método la administración de uno o más agentes de ARNi del VHB que tengan una hebra antisentido que comprenda la secuencia de cualquiera de las secuencias de la tabla 3, y una hebra sentido que comprenda la secuencia de cualquiera de las secuencias de la tabla 4 que sea al menos parcialmente complementaria a la hebra antisentido.
En el presente documento se describen métodos de tratamiento de una infección por el VHB o de prevención de enfermedades o síntomas causados por una infección por el VHB, comprendiendo el método la administración de uno o más agentes de ARNi del VHB que tengan una hebra antisentido que consista en la secuencia de cualquiera de las secuencias de la tabla 3, y una hebra sentido que consista en la secuencia de cualquiera de las secuencias de la tabla 4 que sea al menos parcialmente complementaria a la hebra antisentido.
En el presente documento se describen métodos de tratamiento de una infección por el VHB o de prevención de enfermedades o síntomas causados por una infección por el VHB, comprendiendo el método la administración de uno o más agentes de ARNi del VHB que tengan la estructura dúplex de la tabla 5.
En el presente documento se describen métodos para inhibir la expresión de un gen del VHB, comprendiendo el método la administración de (i) un agente de ARNi del VHB que tenga una hebra antisentido que comprenda o consista en la secuencia de cualquiera de las secuencias de la tabla 2 o la tabla 3, y (ii) un segundo agente de ARNi del VHB que tenga una hebra antisentido que comprenda o consista en la secuencia de cualquiera de las secuencias de la tabla 2 o la tabla 3.
En el presente documento se describen métodos de tratamiento de una infección por el VHB o de prevención de enfermedades o síntomas causados por una infección por el VHB, comprendiendo el método la administración de (i) un agente de ARNi del VHB que tenga una hebra antisentido que comprenda o consista en la secuencia de cualquiera de las secuencias de la tabla 2 o la tabla 3, y (ii) un segundo agente de ARNi del VHB que tenga una hebra antisentido que comprenda o consista en la secuencia de cualquiera de las secuencias de la tabla 2 o la tabla 3.
En el presente documento se describen métodos para inhibir la expresión de un gen del VHB, comprendiendo el método la administración de (i) un primer agente de ARNi del VHB que tenga una hebra antisentido que comprenda o consista en la secuencia de cualquiera de las secuencias de la tabla 2 o la tabla 3 y una hebra sentido que comprenda o consista en la secuencia de cualquiera de las secuencias de la tabla 2 o la tabla 4 que sea al menos parcialmente complementaria a la hebra antisentido del primer agente de ARNi del VHB, y (ii) un segundo agente de ARNi del VHB que tenga una hebra antisentido que comprenda o consista en la secuencia de cualquiera de las secuencias de la tabla 2 o la tabla 3 y una hebra sentido que comprenda o consista en la secuencia de cualquiera de las secuencias de la tabla 2 o la tabla 4 que sea al menos parcialmente complementaria a la hebra antisentido del segundo agente de ARNi del VHB.
En el presente documento se describen métodos de tratamiento de una infección por el VHB o de prevención de enfermedades o síntomas causados por una infección por el VHB, comprendiendo el método la administración de (i) un primer agente de ARNi del VHB que tenga una hebra antisentido que comprenda o consista en la secuencia de cualquiera de las secuencias de la tabla 2 o la tabla 3 y una hebra sentido que comprenda o consista en la secuencia de cualquiera de las secuencias de la tabla 2 o la tabla 4 que sea al menos parcialmente complementaria a la hebra antisentido del primer agente de ARNi del VHB, y (ii) un segundo agente de ARNi del VHB que tenga una hebra antisentido que comprenda o consista en la secuencia de cualquiera de las secuencias de la tabla 2 o la tabla 3 y una hebra sentido que comprenda o consista en la secuencia de cualquiera de las secuencias de la tabla 2 o la tabla 4 que sea al menos parcialmente complementaria a la hebra antisentido del segundo agente de ARNi del VHB.
En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB divulgado en el presente documento comprende:
a. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') AUUGAGA<g>A<a>GUCCACCAC (SEQ ID NO: 7), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') GUGGUGGACUUCUCUCAAU (SEQ ID NO: 34); o
b. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') UUUGAGAGAAGUCCACCAC (SEQ ID NO: 8), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') GUGGUGGACUUCUCUCAAA (SEQ ID NO: 35); o
c. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') AAUUGAGAGAAGUCCACCA (SEQ ID NO: 12), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') UGGUGGACUUCUCUCAAUU (SEQ ID NO: 39); o
d. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UAUUGAGAGAAGUCCACCA (SEQ ID NO: 13), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') UGGUGGACUUCUCUCAAUA (SEQ ID NO: 40); o
e. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') AGA<a>A<a>UUGAGAGAAGUCC (SEQ ID NO: 17), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') GGACUUCUCUCAAUUUUCU (SEQ ID NO: 44); o
f. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UGa Aa AUu Ga GAGAAGUCC (SEQ ID NO: 18), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') GGACUUCUCUCAAUUUUCA (SEQ ID NO: 45); o
g. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') ACCAAUUUAUGCCUACAGC (SEQ ID NO: 22), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') GCUGUAGGCAUAAAUUGGU (SEQ ID NO: 49); o
h. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UCCAAUUUAUGCCUACAGC (SEQ ID NO: 23), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') GCUGUAGGCAUAAAUUGGA (SEQ ID NO: 50); o
i. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') GACCAAUUUAUGCCUACAG (SEQ ID NO: 27), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') CUGUAGGCAUAAAUUGGUC (SEQ ID NO: 54); o
j. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') AACCAAUUUAUGCCUACAG (SEQ ID NO: 28), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') CUGUAGGCAUAAAUUGGUU (SEQ ID NO: 55); o
k. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UACCAAUUUAUGCCUACAG (SEQ ID NO: 29), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') CUGUAGGCAUAAAUUGGUA (SEQ ID NO: 56).
En algunas realizaciones, se describen en el presente documento composiciones para inhibir la expresión de un gen del VHB en una célula, comprendiendo la composición un agente de ARNi del VHB.
En algunas realizaciones, se describen en el presente documento composiciones para inhibir la expresión de un gen del VHB en una célula, comprendiendo la composición dos o más agentes de ARNi del VHB, en donde un primer agente de ARNi del VHB comprende:
i) una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') AAUUGAGAGAAGUCCACCA (SEQ ID NO: 12), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') UGGUGGACUUCUCUCAAUU (SEQ ID NO: 39); o
ii) una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UAUUGAGAGAAGUCCACCA (SEQ ID NO: 13), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') UGGUGGACUUCUCUCAAUA (SEQ ID NO: 40);
y en donde un segundo agente de ARNi del VHB comprende:
i) una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') GACCAAUUUAUGCCUACAG (SEQ ID NO: 27), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') CUGUAGGCAUAAAUUGGUC (SEQ ID NO: 54); o
ii) una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') AACCAAUUUAUGCCUACAG (SEQ ID NO: 28), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') CUGUAGGCAUAAAUUGGUU (SEQ ID NO: 55); o
iii) una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UACCAAUUUAUGCCUACAG (SEQ ID NO: 29), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') CUGUAGGCAUAAAUUGGUA (SEQ ID NO: 56).
En algunas realizaciones, se describen en el presente documento composiciones para inhibir la expresión de un gen del VHB en una célula, comprendiendo la composición dos o más agentes de ARNi del VHB, en donde un primer agente de ARNi del VHB comprende:
i) una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') AGAAAAUUGAGAGAAGUCC (SEQ ID NO: 17), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') GGACUUCUCUCAAUUUUCU (SEQ ID NO: 44); o
ii) una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UGAAAAUUGAGAGAAGUCC (SEQ ID NO: 18), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') GGACUUCUCUCAAUUUUCA (SEQ ID NO: 45);
y en donde un segundo agente de ARNi del VHB comprende:
i) una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') GAc Ca AUu Ua UGCCUACAG (SEQ ID NO: 27), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') CUGUAGGCAUAAAUUGGUC (SEQ ID NO: 54); o
ii) una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') AACCAAUUUAUGCCUACAG (SEQ ID NO: 28), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') CUGUAGGCAUAAAUUGGUU (SEQ ID NO: 55); o
iii) una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UACCAAUUUAUGCCUACAG (SEQ ID NO: 29), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') CUGUAGGCAUAAAUUGGUA (SEQ ID NO: 56).
En algunas realizaciones, se describen en el presente documento composiciones para inhibir la expresión de un gen del VHB en una célula, comprendiendo la composición dos o más agentes de ARNi del VHB, en donde un primer agente de ARNi del VHB comprende:
i) una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') AAu Ug AGa Ga AGUCCACCA (SEQ ID NO: 12), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') UGGUGGACUUCUCUCAAUU (SEQ ID NO: 39); o
ii) una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UAUUGAGAGAAGUCCACCA (SEQ ID NO: 13), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') UGGUGGACUUCUCUCAAUA (SEQ ID NO: 40);
y en donde un segundo agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que tiene una secuencia que es al menos parcialmente complementaria a una porción del ORF X de un ARNm del VHB.
En algunas realizaciones, se describen en el presente documento composiciones para inhibir la expresión de un gen del VHB en una célula, comprendiendo la composición dos o más agentes de ARNi del VHB, en donde un primer agente de ARNi del VHB comprende:
i) una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') AGAAAAUUGAGAGAAGUCC (SEQ ID NO: 17), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') GGACUUCUCUCAAUUUUCU (SEQ ID NO: 44); o
ii) una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UGAAAAUUGAGAGAAGUCC (SEQ ID NO: 18), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') GGACUUCUCUCAAUUUUCA (SEQ ID NO: 45);
y en donde un segundo agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que tiene una secuencia que es al menos parcialmente complementaria a una porción del ORF X de un ARNm del VHB:
En algunas realizaciones, se describen en el presente documento composiciones para inhibir la expresión de un gen del VHB en una célula, comprendiendo la composición dos o más agentes de ARNi del VHB, en donde un primer agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que tiene una secuencia que es al menos parcialmente complementaria a una porción del ORF S de un ARNm del VHB, y en donde un segundo agente de ARNi del VHB comprende:
i) una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') GACCAAUUUAUGCCUACAG (SEQ ID NO: 27), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') CUGUAGGCAUAAAUUGGUC (SEQ ID NO: 54); o
ii) una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') AACCAAUUUAUGCCUACAG (SEQ ID NO: 28), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') CUGUAGGCAUAAAUUGGUU (SEQ ID NO: 55); o
iii) una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UACCAAUUUAUGCCUACAG (SEQ ID NO: 29), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') CUGUAGGCAUAAAUUGGUA (SEQ ID NO: 56).
En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB divulgado en el presente documento comprende:
a. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UACCAAUUUAUGCCUACAGGCCUUAU (SEQ ID NO: 149); o
b. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UACCAAUUUAUGCCUACAGGCCU (SEQ ID NO: 150); o
c. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UACCAAUUUAUGCCUACAGGC (SEQ ID NO: 151); o
d. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UGAAAAUUGAGAGAAGUCCUU (SEQ ID NO: 152); o
e. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UACCAAUUUAUGCCUACAGUU (SEQ ID NO: 154); o
f. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UAUUGAGAGAAGUCCACCACG (SEQ ID NO: 160); o
g. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UACCAAUUUAUGCCUACAGCC (SEQ ID NO: 162); o
h. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UACCAAUUUAUGCCUACAGCCUU (SEQ ID NO: 163); o
i. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UAUUGAGAGAAGUCCACCACGA (SEQ ID NO: 170); o
j. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') AGAAAAUUGAGAGAAGUCCAC (SEQ ID NO: 171); o
k. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UACCAAUUUAUGCCUACAGCUU (SEQ ID NO: 172); o
l. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UACCAAUUUAUGCCUACAGCCU (SEQ ID NO: 173); o
m. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UAUUGAGAGAAGUCCACCAUU (SEQ ID NO: 174); o
n. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UAUUGAGAGAAGUCCACCACUU (SEQ ID NO: 175); o
o. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') AGAAAAUUGAGAGAAGUCCUU (SEQ ID NO: 178); o
p. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') AGAAAAUUGAGAGAAGUCCACUU (SEQ ID NO: 179); o
q. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') AGAAAAUUGAGAGAAGUCCACC (SEQ ID NO: 180); o
r. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UGAAAAUUGAGAGAAGUCCAC (SEQ ID NO: 181); o
s. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') ACCAAUUUAUGCCUACAGCUU (SEQ ID NO: 182); o
t. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') ACCAAUUUAUGCCUACAGCCUU (SEQ ID NO: 183); o
u. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') ACCAAUUUAUGCCUACAGCCUC (SEQ ID NO: 184); o
v. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UCCAAUUUAUGCCUACAGCUU (SEQ ID NO: 185); o
w. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UCCAAUUUAUGCCUACAGCCUU (SEQ ID NO: 186); o
x. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UACCAAUUUAUGCCUACAGCU (SEQ ID NO: 187); o
y. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UACCAAUUUAUGCCUACAGCG (SEQ ID NO: 188); o
z. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') AACCAAUUUAUGCCUACAGCC (SEQ ID NO: 189); o
aa. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') ACCAAUUUAUGCCUACAGCCU (SEQ ID NO: 190); o
bb. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UCCAAUUUAUGCCUACAGCCU (SEQ ID NO: 191); o
cc. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') ACCAAUUUAUGCCUACAGCCG (SEQ ID NO: 192); o
dd. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UCCAAUUUAUGCCUACAGCCG (SEQ ID NO: 193); o
ee. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UACCAAUUUAUGCCUACAGGG (SEQ ID NO: 194);
y en donde el agente de ARNi del VHB comprende además una hebra sentido al menos parcialmente complementaria a la respectiva hebra antisentido.
En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB divulgado en el presente documento comprende:
a. una hebra antisentido que consiste en la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UACCAAUUUAUGCCUACAGGCCUUAU (SEQ ID NO: 149); o
b. una hebra antisentido que consiste en la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UACCAAUUUAUGCCUACAGGCCU (SEQ ID NO: 150); o
c. una hebra antisentido que consiste en la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UACCAAUUUAUGCCUACAGGC (SEQ ID NO: 151); o
d. una hebra antisentido que consiste en la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UGAAAAUUGAGAGAAGUCCUU (SEQ ID NO: 152); o
e. una hebra antisentido que consiste en la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UACCAAUUUAUGCCUACAGUU (SEQ ID NO: 154); o
f. una hebra antisentido que consiste en la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UAUUGAGAGAAGUCCACCACG (SEQ ID NO: 160); o
g. una hebra antisentido que consiste en la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UACCAAUUUAUGCCUACAGCC (SEQ ID NO: 162); o
h. una hebra antisentido formada por la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UACCAAUUUAUGCCUACAGCCUU (SEQ ID NO: 163); o
i. una hebra antisentido formada por la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UAUUGAGAGAAGUCCACCACGA (SEQ ID NO: 170); o
j. una hebra antisentido que consiste en la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') AGAAAAUUGAGAGAAGUCCAC (SEQ ID NO: 171); o
k. una hebra antisentido que consiste en la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UACCAAUUUAUGCCUACAGCUU (SEQ ID NO: 172); o
l. una hebra antisentido formada por la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UACCAAUUUAUGCCUACAGCCU (SEQ ID NO: 173); o
m. una hebra antisentido que consiste en la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UAUUGAGAGAAGUCCACCAUU (SEQ ID NO: 174); o
n. una hebra antisentido formada por la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UAUUGAGAGAAGUCCACCACUU (SEQ ID NO: 175); o
o. una hebra antisentido que consiste en la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') AGAAAAUUGAGAGAAGUCCUU (SEQ ID NO: 178); o
p. una hebra antisentido que consiste en la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') AGAAAAUUGAGAGAAGUCCACUU (SEQ ID NO: 179); o
q. una hebra antisentido que consiste en la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') AGAAAAUUGAGAGAAGUCCACC (SEQ ID NO: 180); o
r. una hebra antisentido que consiste en la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UGAAAAUUGAGAGAAGUCCAC (SEQ ID NO: 181); o
s. una hebra antisentido que consiste en la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') ACCAAUUUAUGCCUACAGCUU (SEQ ID NO: 182); o
t. una hebra antisentido que consiste en la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') ACCAAUUUAUGCCUACAGCCUU (SEQ ID NO: 183); o
u. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') ACCAAUUUAUGCCUACAGCCUC (SEQ ID NO: 184); o
v. una hebra antisentido formada por la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UCCAAUUUAUGCCUACAGCUU (SEQ ID NO: 185); o
w. una hebra antisentido que consiste en la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UCCAAUUUAUGCCUACAGCCUU (SEQ ID NO: 186); o
x. una hebra antisentido que consiste en la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UACCAAUUUAUGCCUACAGCU (SEQ ID NO: 187); o
y. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UACCAAUUUAUGCCUACAGCG (SEQ ID NO: 188); o
z. una hebra antisentido que consiste en la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') AACCAAUUUAUGCCUACAGCC (SEQ ID NO: 189); o
aa. una hebra antisentido que consiste en la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') ACCAAUUUAUGCCUACAGCCU (SEQ ID NO: 190); o
bb. una hebra antisentido que consiste en la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UCCAAUUUAUGCCUACAGCCU (SEQ ID NO: 191); o
cc. una hebra antisentido que consiste en la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') ACCAAUUUAUGCCUACAGCCG (SEQ ID NO: 192); o
dd. una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UCCAAUUUAUGCCUACAGCCG (SEQ ID NO: 193); o
ee. una hebra antisentido que consiste en la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UACCAAUUUAUGCCUACAGGG (SEQ ID NO: 194);
y en donde el agente de ARNi del VHB comprende además una hebra sentido al menos parcialmente complementaria a la respectiva hebra antisentido.
En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB divulgado en el presente documento comprende:
i. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5'^-3') usAfscCfaAfuUfuAfuGfcCfuAfcAfgGfccsusuAu (SEQ<i>D NO: 61); o
ii. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5'^-3') usAfscCfaAfuUfuAfuGfcCfuAfcAfgGfcscsu (SEQ ID n O: 62); o
iii. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5'^-3') usAfscsCfaAfuUfuAfuGfcCfuAfcAfgGfccsu (SEQ ID NO: 63); o
iv. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5'^-3') usAfscsCfaAfuUfuAfuGfcCfuAfcAfgGfsc (SEQ ID NO: 64); o
v. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5'^-3') usAfscsCfaAfuUfuAfuGfcCfuAfcAfgusu (SEQ ID NO: 68); o
vi. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5'^-3') usAfscscaauUfuAfuGfcCfuacagcsc (SEQ ID NO: 85); o
vii. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5'^-3') usAfsusugagAfgAfaGfuCfcaccacsg (SEQ ID NO: 94); o
viii. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5'^-3') usAfsusUfgAfgAfgAfaGfuCfcAfcCfaCfgsa (SEQ ID NO: 98); o
ix. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5'^-3') usAfscsCfaAfuuuauGfcCfuAfcAfgcsc (SEQ ID NO: 102); o
x. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5'^-3') usAfscsCfaAfuuuauGfcCfuAfcAfgcusu (SEQ ID NO: 103); o
xi. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5'^-3') usAfscsCfaAfuuuauGfcCfuAfcAfgccsu (SEQ ID NO: 104); o
xii. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5'^-3') usAfscsCfaAfuuuauGfcCfuAfcAfgccusu (SEQ ID NO: 105); o
xiii. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5'^-3') cPrpusAfscsCfaAfuUfuAfuGfcCfuAfcAfgusu (SEQ ID n O: 107); o
xiv. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5'^-3') cPrpusAfsusUfgAfgAfgAfaGfuCfcAfcCfaCfsg (SEQ ID NO: 108); o
xv. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5'^-3') usAfsusUfgAfgagaaGfuCfcAfcCfausu (SEQ ID NO: 109); o
xvi. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5'^-3') usAfsusUfgAfgagaaGfuCfcAfcCfacsg (SEQ ID NO: 110); o
xvii. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5'^-3') usAfsusUfgAfgagaaGfuCfcAfcCfacsusu (SEQ ID NO: 111); o
xviii. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5'^-3') usAfsusUfgAfgagaaGfuCfcAfcCfacsgsa (SEQ ID n O: 112); o
xix. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5'^-3') usAfsusUfgAfgagaaGfuCfcAfcCfacusu (SEQ ID NO: 120); o
xx. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5'^-3') asGfsasAfaAfuUfgAfgAfgAfaGfuCfcusu (SEQ ID NO: 125);
xxi. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5'^-3') asGfsasAfaAfuUfgAfgAfgAfaGfuCfcasc (SEQ ID NO: 126); o
xxii. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5 '^3 ') asGfsasAfaAfuUfgAfgAfgAfaGfuCfcacusu (SEQ ID NO: 127); o
xxiii. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5 '^3 ') asGfsasAfaAfuUfgAfgAfgAfaGfuCfcacsc (SEQ ID NO: 128); o
xxiv. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5 '^3 ') usGfsasAfaAfuUfgAfgAfgAfaGfuCfcusu (SEQ ID NO: 129); o
xxv. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5 '^3 ') usGfsasAfaAfuUfgAfgAfgAfaGfuCfcasc (SEQ ID NO: 130); o
xxvi. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5 '^3 ') asCfscsAfaUfuUfaUfgCfcUfaCfaGfcusu (SEQ ID NO: 131); o
xxvii. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5 '^3 ') asCfscsAfaUfuUfaUfgCfcUfaCfaGfccusu (SEQ ID NO: 132); o
xxviii. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5 '^3 ') asCfscsAfaUfuUfaUfgCfcUfaCfaGfccusc (SEQ ID NO: 133); o
xxix. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5 '^3 ') usCfscsAfaUfuUfaUfgCfcUfaCfaGfcusu (SEQ ID NO: 134); o
xxx. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5 '^3 ') usCfscsAfaUfuUfaUfgCfcUfaCfaGfccusu (SEQ ID NO: 135); o
xxxi. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5 '^3 ') cPrpusAfscsCfaAfuUfuAfuGfcCfuAfcAfgcsc (SEQ ID NO: 136); o
xxxii. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5 '^3 ') usAfscsCfaAfuUfuAfuGfcCfuAfcAfgscsc (SEQ ID NO: 137); o
xxxiii. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5 '^3 ') cPrpusAfscsCfaAfuUfuAfuGfcCfuAfcAfgscsc (SEQ<i>D NO: 138); o
xxxiv. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5 '^3 ') u sAfs csCfaAfuUfuAfu GfcCfuAfcAfg csu (SEQ ID NO: 139); o
xxxv. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5 '^3 ') u sAfs csCfaAfuUfuAfu GfcCfuAfcAfg csg (SEQ ID NO: 140); o
xxxvi. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5 '^3 ') asAfscsCfaAfuUfuAfuGfcCfuAfcAfgcsc (SEQ ID NO: 141); o
xxxvii. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5 '^3 ') usAfscsCfaAfuUfUfAfuGfcCfuAfcAfgusu (SEQ ID NO: 142); o
xxxviii. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5 '^3 ') u sAfs csCfaAfuUfuAfu GfcCfuAfcAfgCfsc (SEQ ID NO: 143); o
xxxix. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5 '^3 ') asCfscAfaUfuUfaUfgCfcUfaCfaGfcCfsu (SEQ ID NO: 144); o
xl. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5'^-3') usCfscAfaUfuUfaUfgCfcUfaCfaGfcCfsu (SEQ ID NO: 145); o
xli. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5'^-3') asCfscAfaUfuUfaUfgCfcUfaCfaGfccsg (SEQ ID NO: 146); o
xlii. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5'^-3') usCfscAfaUfuUfaUfgCfcUfaCfaGfccsg (SEQ ID NO: 147); o
xliii. una hebra antisentido que comprende la secuencia que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleótidos de la secuencia (5 '^3 ') u sAfs csCfaAfuUfuAfu GfcCfuAfcAfg gsg (SEQ ID NO: 148);
en donde a, g, c y u son nucleótidos modificados con 2'-O-metilo (2'-OMe); Af, Cf, Gf y Uf son nucleótidos modificados con 2'-fluoro; s es un enlace fosforotioato internucleosídico y los restantes monómeros de nucleótidos están unidos por enlaces fosfodiéster; y cPrpu es un nucleótido modificado con 5'-ciclopropil fosfonato-2'-O-metilo; y en donde el agente de ARNi del VHB comprende además una hebra sentido al menos parcialmente complementaria a la respectiva hebra antisentido.
En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB divulgado en el presente documento comprende:
i. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5 '^3 ') usAfscCfaAfuUfuAfuGfcCfuAfcAfgGfccsusuAu (SEQ ID NO: 61); o
ii. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5'^-3') usAfscCfaAfuUfuAfuGfcCfuAfcAfgGfcscsu (SEQ ID NO: 62); o
iii. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5'^-3') usAfscsCfaAfuUfuAfuGfcCfuAfcAfgGfccsu (SEQ ID NO: 63); o
iv. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5'^-3') usAfscsCfaAfuUfuAfuGfcCfuAfcAfgGfsc (SEQ ID NO: 64); o
v. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5 '^3 ') usAfscsCfaAfuUfuAfuGfcCfuAfcAfgusu (SEQ ID NO: 68); o
vi. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5'^-3') usAfscscaauUfuAfuGfcCfuacagcsc (SEQ ID NO: 85); o
vii. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5 '^3 ') usAfsusugagAfgAfaGfuCfcaccacsg (SEQ ID NO: 94); o
viii. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5'^-3') usAfsusUfgAfgAfgAfaGfuCfcAfcCfaCfgsa (SEQ ID NO: 98); o
ix. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5'^-3') usAfscsCfaAfuuuauGfcCfuAfcAfgcsc (SEQ ID NO: 102) ; o
x. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5 '^3 ') usAfscsCfaAfuuuauGfcCfuAfcAfgcusu (SEQ ID NO: 103) ; o
xi. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5'^-3') usAfscsCfaAfuuuauGfcCfuAfcAfgccsu (SEQ ID NO: 104) ; o
xii. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5'^-3') usAfscsCfaAfuuuauGfcCfuAfcAfgccusu (SEQ ID NO: 105); o
xiii. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5'^-3') cPrpusAfscsCfaAfuUfuAfuGfcCfuAfcAfgusu (SEQ ID NO: 107); o
xiv. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5'^-3') cPrpusAfsusUfgAfgAfgAfaGfuCfcAfcCfaCfsg (SEQ ID NO: 108); o
xv. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5 '^3 ') usAfsusUfgAfgagaaGfuCfcAfcCfausu (SEQ ID NO: 109) ; o
xvi. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5 '^3 ') usAfsusUfgAfgagaaGfuCfcAfcCfacsg (SEQ ID NO: 110) ; o
xvii. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5 '^3 ') usAfsusUfgAfgagaaGfuCfcAfcCfacsusu (SEQ ID NO: 111); o
xviii. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5'^-3') usAfsusUfgAfgagaaGfuCfcAfcCfacsgsa (SEQ ID NO: 112); o
xix. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5 '^3 ') usAfsusUfgAfgagaaGfuCfcAfcCfacusu (SEQ ID NO: 120); o
xx. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5 '^3 ') asGfsasAfaAfuUfgAfgAfgAfaGfuCfcusu (SEQ ID NO: 125);
xxi. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5 '^3 ') asGfsasAfaAfuUfgAfgAfgAfaGfuCfcasc (SEQ ID NO: 126); o
xxii. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5'^-3') asGfsasAfaAfuUfgAfgAfgAfaGfuCfcacusu (SEQ ID NO: 127); o
xxiii. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5 '^3 ') asGfsasAfaAfuUfgAfgAfgAfaGfuCfcacsc (SEQ ID NO: 128); o
xxiv. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5 '^3 ') usGfsasAfaAfuUfgAfgAfgAfaGfuCfcusu (SEQ ID NO: 129); o
xxv. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5'^-3') usGfsasAfaAfuUfgAfgAfgAfaGfuCfcasc (SEQ ID NO: 130); o
xxvi. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5 '^3 ') asCfscsAfaUfuUfaUfgCfcUfaCfaGfcusu (SEQ ID NO: 131); o
xxvii. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5'^-3') asCfscsAfaUfuUfaUfgCfcUfaCfaGfccusu (SEQ ID NO: 132); o
xxviii. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5'^-3') asCfscsAfaUfuUfaUfgCfcUfaCfaGfccusc (SEQ ID NO: 133); o
xxix. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5 '^3 ') usCfscsAfaUfuUfaUfgCfcUfaCfaGfcusu (SEQ ID NO: 134); o
xxx. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5'^-3') usCfscsAfaUfuUfaUfgCfcUfaCfaGfccusu (SEQ ID NO: 135); o
xxxi. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5'^-3') cPrpusAfscsCfaAfuUfuAfuGfcCfuAfcAfgcsc (SEQ ID NO: 136); o
xxxii. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5 '^3 ') usAfscsCfaAfuUfuAfuGfcCfuAfcAfgscsc (SEQ ID NO: 137); o
xxxiii. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5 '^3 ') cPrpusAfscsCfaAfuUfuAfuGfcCfuAfcAfgscsc (SEQ ID NO: 138); o
xxxiv. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5'^-3') usAfscsCfaAfuUfuAfuGfcCfuAfcAfgcsu (SEQ ID NO: 139); o
xxxv. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5'^-3') usAfscsCfaAfuUfuAfuGfcCfuAfcAfgcsg (SEQ ID NO: 140); o
xxxvi. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5'^-3') asAfscsCfaAfuUfuAfuGfcCfuAfcAfgcsc (SEQ ID NO: 141); o
xxxvii. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5 '^3 ') usAfscsCfaAfuUfUfAfuGfcCfuAfcAfgusu (SEQ ID NO: 142); o
xxxviii. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5'^-3') usAfscsCfaAfuUfuAfuGfcCfuAfcAfgCfsc (SEQ ID NO: 143); o
xxxix. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5 '^3 ') asCfscAfaUfuUfaUfgCfcUfaCfaGfcCfsu (SEQ ID NO: 144); o
xl. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5 '^3 ') usCfscAfaUfuUfaUfgCfcUfaCfaGfcCfsu (SEQ ID NO: 145); o
xli. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5 '^3 ') asCfscAfaUfuUfaUfgCfcUfaCfaGfccsg (SEQ ID NO: 146); o
xlii. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5'^-3') usCfscAfaUfuUfaUfgCfcUfaCfaGfccsg (SEQ ID NO: 147); o
xliii. una hebra antisentido que consiste en la secuencia (5'^-3') usAfscsCfaAfuUfuAfuGfcCfuAfcAfggsg (SEQ ID NO: 148);
en donde a, g, c y u son nucleótidos modificados con 2'-O-metilo (2'-OMe); Af, Cf, Gf y Uf son nucleótidos modificados con 2'-fluoro; s es un enlace fosforotioato intemucleosídico y los restantes monómeros de nucleótidos están unidos por enlaces fosfodiéster; y cPrpu es un nucleótido modificado con 5'-ciclopropil fosfonato-2'-O-metilo; y en donde el agente de ARNi del VHB comprende además una hebra sentido al menos parcialmente complementaria a la respectiva hebra antisentido.
En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB divulgado en el presente documento comprende:
a. una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UUGCCUGUAGGCAUAAAUUGGUAUT (SEQ ID NO: 275); o
b. una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UAUAUGCCUGUAGGCAUAAAUUGGUA (SEQ ID NO: 276); o
c. una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') CUGUAGGCAUAAAUUGGUAUU (SEQ ID NO: 278); o
d. una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') CGUGGUGGACUUCUCUCAAUU (SEQ ID NO: 285); o
e. una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') CGUGGUGGACUUCUCUCAAUA (SEQ ID NO: 289); o
f. una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') CUGUAGGCAUAAAUUGGUA (SEQ ID NO: 292); o
g. una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') GGCUGUAGGCAUAAAUUGGUA (SEQ ID NO: 294); o
h. una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UCGUGGUGGACUUCUCUCAAUU (SEQ ID NO: 300); o
i. una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') GUGGACUUCUCUCAAUUUUCU (SEQ ID NO: 302); o
j. una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') GCUGUAGGCAUAAAUUGGUAUU (SEQ ID NO: 303); o
k. una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') GGCUGUAGGCAUAAAUUGGUAUU (SEQ ID NO: 304); o
l. una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UGGUGGACUUCUCUCAAUAUU (SEQ ID NO: 306); o
m. una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') GUGGUGGACUUCUCUCAAUAUU (SEQ ID NO: 307); o
n. una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') AAUGGUGGACUUCUCUCAAUAUU (SEQ ID NO: 308); o
o. una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') GGACUUCUCUCAAUUUUCU (SEQ ID NO: 318); o
p. una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') GGUGGACUUCUCUCAAUUUUCU (SEQ ID NO: 319); o
q. una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') GGACUUCUCUCAAUUUUCA (SEQ ID NO: 320); o
r. una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') GUGGACUUCUCUCAAUUUUCA (SEQ ID NO: 321); o
s. una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') GCUGUAGGCAUAAAUUGGU (SEQ ID NO: 322); o
t. una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') GGCUGUAGGCAUAAAUUGGU (SEQ ID NO: 323); o
u. una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') GAGGCUGUAGGCAUAAAUUGGU (SEQ ID NO: 324); o
v. una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') GCUGUAGGCAUAAAUUGGA (SEQ ID NO: 325); o
w. una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') GGCUGUAGGCAUAAAUUGGA (SEQ ID NO: 326); o
x. una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') AGCUGUAGGCAUAAAUUGGUA (SEQ ID NO: 327); o
y. una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') CGCUGUAGGCAUAAAUUGGUA (SEQ ID NO: 328); o
z. una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') GGCUGUAGGCAUAAAUUGGUU (SEQ ID NO: 329); o
aa. una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1 2 o 3 nucleobases de secuencia (5 '^3 ') AGGCUGUAGGCAUAAAUUGGU (SEQ ID NO: 330); o
bb. una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1 2 o 3 nucleobases de secuencia (5 '^3 ') AGGCUGUAGGCAUAAAUUGGA (SEQ ID NO: 331); o
cc. una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1 2 o 3 nucleobases de secuencia (5 '^3 ') CGGCUGUAGGCAUAAAUUGGU (SEQ ID NO: 332); o
dd. una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1 2 o 3 nucleobases de secuencia (5 '^3 ') CGGCUGUAGGCAUAAAUUGGA (SEQ ID NO: 333); o
ee. una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1 2 o 3 nucleobases de secuencia (5 '^3 ') CCCUGUAGGCAUAAAUUGGUA (SEQ ID NO: 334);
y en donde el agente de ARNi del VHB comprende además una hebra antisentido al menos parcialmente complementaria a la respectiva hebra antisentido.
En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB divulgado en el presente documento comprende:
a. una hebra sentido formada por la secuencia de nucleobases (5 '^3 ') UUGCCUGUAGGCAUAAAUUGGUAUT (SEQ ID NO: 275); o
b. una hebra sentido formada por la secuencia de nucleobases (5 '^3 ') UAUAUGCCUGUAGGCAUAAAUUGGUA (SEQ ID NO: 276); o
c. una hebra sentido formada por la secuencia de nucleobases (5'^-3') CUGUAGGCAUAAAUUGGUAUU (SEQ ID NO: 278); o
d. una hebra sentido formada por la secuencia de nucleobases (5 '^3 ') CGUGGUGGACUUCUCUCAAUU (SEQ ID NO: 285); o
e. una hebra sentido formada por la secuencia de nucleobases (5 '^3 ') CGUGGUGGACUUCUCUCAAUA (SEQ ID NO: 289); o
f. una hebra sentido formada por la secuencia de nucleobases (5'^-3') CUGUAGGCAUAAAUUGGUA (SEQ ID NO: 292); o
g. una hebra sentido formada por la secuencia de nucleobases (5 '^3 ') GGCUGUAGGCAUAAAUUGGUA (SEQ ID NO: 294); o
h. una hebra sentido formada por la secuencia de nucleobases (5 '^3 ') UCGUGGUGGACUUCUCUCAAUU (SEQ ID NO: 300); o
i. una hebra sentido formada por la secuencia de nucleobases (5'^-3') GUGGACUUCUCUCAAUUUUCU (SEQ ID NO: 302); o
j. una hebra sentido formada por la secuencia de nucleobases (5'^-3') GCUGUAGGCAUAAAUUGGUAUU (SEQ ID NO: 303); o
k. una hebra sentido formada por la secuencia de nucleobases (5'^-3') GGCUGUAGGCAUAAAUUGGUAUU (SEQ ID NO: 304); o
l. una hebra sentido formada por la secuencia de nucleobases (5'^-3') UGGUGGACUUCUCUCAAUAUU (SEQ ID NO: 306); o
m. una hebra sentido formada por la secuencia de nucleobases (5 '^3 ') GUGGUGGACUUCUCUCAAUAUU (SEQ ID NO: 307); o
n. una hebra sentido formada por la secuencia de nucleobases (5'^-3') AAUGGUGGACUUCUCUCAAUAUU (SEQ ID NO: 308); o
o. una hebra sentido formada por la secuencia de nucleobases (5 '^3 ') GGACUUCUCUCAAUUUUCU (SEQ ID NO: 318); o
p. una hebra sentido formada por la secuencia de nucleobases (5'^-3') GGUGGACUUCUCUCAAUUUUCU (SEQ ID NO: 319); o
q. una hebra sentido formada por la secuencia de nucleobases (5'^-3') GGACUUCUCUCAAUUUUCA (SEQ ID NO: 320); o
r. una hebra sentido formada por la secuencia de nucleobases (5 '^3 ') GUGGACUUCUCUCAAUUUUCA (SEQ ID NO: 321); o
s. una hebra sentido formada por la secuencia de nucleobases (5 '^3 ') GCUGUAGGCAUAAAUUGGU (SEQ ID NO: 322); o
t. una hebra sentido formada por la secuencia de nucleobases (5 '^3 ') GGCUGUAGGCAUAAAUUGGU (SEQ ID NO: 323); o
u. una hebra sentido formada por la secuencia de nucleobases (5 '^3 ') GAGGCUGUAGGCAUAAAUUGGU (SEQ ID NO: 324); o
v. una hebra sentido formada por la secuencia de nucleobases (5'^-3') GCUGUAGGCAUAAAUUGGA (SEQ ID NO: 325); o
w. una hebra sentido formada por la secuencia de nucleobases (5 '^3 ') GGCUGUAGGCAUAAAUUGGA (SEQ ID NO: 326); o
x. una hebra sentido formada por la secuencia de nucleobases (5'^-3') AGCUGUAGGCAUAAAUUGGUA (SEQ ID NO: 327); o
y. una hebra sentido formada por la secuencia de nucleobases (5 '^3 ') CGCUGUAGGCAUAAAUUGGUA (SEQ ID NO: 328); o
z. una hebra sentido formada por la secuencia de nucleobases (5 '^3 ') GGCUGUAGGCAUAAAUUGGUU (SEQ ID NO: 329); o
aa. una hebra antisentido formada por la secuencia de nucleobases (5 '^3 ') AGGCUGUAGGCAUAAAUUGGU (SEQ ID NO: 330); o
bb. una hebra sentido formada por la secuencia de nucleobases (5 '^3 ') AGGCUGUAGGCAUAAAUUGGA (SEQ ID NO: 331); o
cc. una hebra sentido formada por la secuencia de nucleobases (5 '^3 ') CGGCUGUAGGCAUAAAUUGGU (SEQ ID NO: 332); o
dd. una hebra sentido formada por la secuencia de nucleobases (5 '^3 ') CGGCUGUAGGCAUAAAUUGGA (SEQ ID NO: 333); o
ee. una hebra sentido formada por la secuencia de nucleobases (5 '^3 ') CCCUGUAGGCAUAAAUUGGUA (SEQ ID NO: 334);
y en donde el agente de ARNi del VHB comprende además una hebra antisentido al menos parcialmente complementaria a la respectiva hebra antisentido.
En algunas realizaciones, se describen en el presente documento composiciones para inhibir la expresión de un gen del VHB en una célula, comprendiendo la composición dos agentes de ARNi del VHB, en donde un primer agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UAUUGAGAGAAGUCCACCACUU (SEQ ID NO: 175), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') GUGGUGGACUUCUCUCAAUAUU (SEQ ID NO: 307); y en donde un segundo agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') UACCAAUUUAUGCCUACAGUU (SEQ ID NO: 154), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') CUGUAGGCAUAAAUUGGUA (SEQ ID NO: 292).
En algunas realizaciones, se describen en el presente documento composiciones para inhibir la expresión de un gen del VHB en una célula, comprendiendo la composición dos agentes de ARNi del VHB, en donde un primer agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que consiste en la secuencia de nucleobases (5'^-3') UAUUGAGAGAAGUCCACCACUU (SEQ ID NO: 175), y una hebra sentido que consiste en la secuencia de nucleobases (5 '^3 ') GUGGUGGACUUCUCUCAAUAUU (SEQ ID NO: 307); y en donde un segundo agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que consiste en la secuencia de nucleobases (5'^-3') UACCAAUUUAUGCCUACAGUU (SEQ ID NO: 154), y una hebra sentido que consiste en la secuencia de nucleobases (5 '^3 ') CUGUAGGCAUAAAUUGGUA (SEQ ID NO: 292).
En algunas realizaciones, se describen en el presente documento composiciones para inhibir la expresión de un gen del VHB en una célula, comprendiendo la composición dos agentes de ARNi del VHB, en donde un primer agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') AGAAAAUUGAg Ag AAGUCCAC (SEQ ID NO: 171), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') GUGGACUUCUCUCAAUUUUCU (SEQ ID NO: 302); y en donde un segundo agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UACCAAUUUAUGCCUACAGCG (SEQ ID NO: 188), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') CGCUGUAGGCAUAAAUUGGUA (SEQ ID NO: 328).
En algunas realizaciones, se describen en el presente documento composiciones para inhibir la expresión de un gen del VHB en una célula, comprendiendo la composición dos agentes de ARNi del VHB, en donde un primer agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que consiste en la secuencia de nucleobases (5'^-3') AGAAAAUUGAGAGAAGUCCAC (SEQ ID NO: 171), y una hebra sentido que consiste en la secuencia de nucleobases (5 '^3 ') GUGGACUUCUCUCAAUUUUCU (SEQ ID NO: 302); y en donde un segundo agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que consiste en la secuencia de nucleobases (5'^-3') UACCAAUUUAUGCCUACAGCG (SEQ ID NO: 188), y una hebra sentido que consiste en la secuencia de nucleobases (5 '^3 ') CGCUGUAGGCAUAAAUUGGUA (SEQ ID NO: 328).
En algunas realizaciones, se describen en el presente documento composiciones para inhibir la expresión de un gen del VHB en una célula, comprendiendo la composición dos agentes de ARNi del VHB, en donde un primer agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') AGAAAAUUGAGAGAAGUCCAC (SEQ ID NO: 171), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') GUGGACUUCUCUCAAUUUUCU (SEQ ID NO: 302); y en donde un segundo agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') UACCAAUUUAUGCCUACAGCC (SEQ ID NO: 162), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') GGCUGUAGGCAUAAAUUGGUA (SEQ ID NO: 294).
En algunas realizaciones, se describen en el presente documento composiciones para inhibir la expresión de un gen del VHB en una célula, comprendiendo la composición dos agentes de ARNi del VHB, en donde un primer agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que consiste en la secuencia de nucleobases (5'^-3') AGAAAAUUGAGAGAAGUCCAC (SEQ ID NO: 171), y una hebra sentido que consiste en la secuencia de nucleobases (5 '^3 ') GUGGACUUCUCUCAAUUUUCU (SEQ ID NO: 302); y en donde un segundo agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que consiste en la secuencia de nucleobases (5'^-3') UACCAAUUUAUGCCUACAGCC (SEQ ID NO: 162), y una hebra sentido que consiste en la secuencia de nucleobases (5 '^3 ') GGCUGUAGGCAUAAAUUGGUA (SEQ ID NO: 294).
En algunas realizaciones, se describen en el presente documento composiciones para inhibir la expresión de un gen del VHB en una célula, comprendiendo la composición dos agentes de ARNi del VHB, en donde un primer agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') AGAAAAUUGAGAGAAGUCCAC (SEQ ID NO: 171), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') GUGGACUUCUCUCAAUUUUCU (SEQ ID NO: 302); y en donde un segundo agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') UACCAAUUUAUGCCUACAGCC (SEQ ID NO: 162), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') GUGGUGGACUUCUCUCAAUAUU (SEQ ID NO: 307).
En algunas realizaciones, se describen en el presente documento composiciones para inhibir la expresión de un gen del VHB en una célula, comprendiendo la composición dos agentes de ARNi del VHB, en donde un primer agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que consiste en la secuencia de nucleobases (5'^-3') AGAAAAUUGAGAGAAGUCCAC (SEQ ID NO: 171), y una hebra sentido que consiste en la secuencia de nucleobases (5 '^3 ') GUGGACUUCUCUCAAUUUUCU (SEQ ID NO: 302); y en donde un segundo agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que consiste en la secuencia de nucleobases (5'^-3') UACCAAUUUAUGCCUACAGCC (SEQ ID NO: 162), y una hebra sentido que consiste en la secuencia de nucleobases (5 '^3 ') GUGGUGGACUUCUCUCAAUAUU (SEQ ID NO: 307).
En algunas realizaciones, se describen en el presente documento composiciones para inhibir la expresión de un gen del VHB en una célula, comprendiendo la composición dos agentes de ARNi del VHB, en donde todos o sustancialmente todos los nucleótidos de la hebra sentido están modificados y/o todos o sustancialmente todos los nucleótidos de la hebra antisentido en el primer y/o segundo agente de ARNi del VHB son nucleótidos modificados, y en donde el primer agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UAUUg Ag AGAAGUCCACCACUU (SEQ ID NO: 175), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') GUGGUGGACUUCUCUCAAUAUU (SEQ ID NO: 307); y en donde el segundo agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UACCAAUUUAUGCCUACAGUU (SEQ ID NO: 154), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') CUGUAGGCAUAAAUUGGUA (SEQ ID NO: 292).
En algunas realizaciones, se describen en el presente documento composiciones para inhibir la expresión de un gen del VHB en una célula, comprendiendo la composición dos agentes de ARNi del VHB, en donde todos o sustancialmente todos los nucleótidos de la hebra sentido están modificados y/o todos o sustancialmente todos los nucleótidos de la hebra antisentido en el primer y/o segundo agente de ARNi del VHB son nucleótidos modificados, y en donde el primer agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') AGAAAAUUGA<g>A<g>AAGUCCAC (SEQ ID NO: 171), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') GUGGACUUCUCUCAAUUUUCU (SEQ ID NO: 302); y en donde el segundo agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UACCAAUUUAUGCCUACAGCG (SEQ ID NO: 188), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') CGCUGUAGGCAUAAAUUGGUA (SEQ ID NO: 328).
En algunas realizaciones, se describen en el presente documento composiciones para inhibir la expresión de un gen del VHB en una célula, comprendiendo la composición dos agentes de ARNi del VHB, en donde todos o sustancialmente todos los nucleótidos de la hebra sentido están modificados y/o todos o sustancialmente todos los nucleótidos de la hebra antisentido en el primer y/o segundo agente de ARNi del VHB son nucleótidos modificados, y en donde el primer agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') AGAAAAUUGAg Ag AAGUCCAC (SEQ ID NO: 171), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') GUGGACUUCUCUCAAUUUUCU (SEQ ID NO: 302); y en donde el segundo agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') UACCAAUUUAUGCCUACAGCC (SEQ ID NO: 162), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') GGCUGUAGGCAUAAAUUGGUA (SEQ ID NO: 294).
En algunas realizaciones, se describen en el presente documento composiciones para inhibir la expresión de un gen del VHB en una célula, comprendiendo la composición dos agentes de ARNi del VHB, en donde todos o sustancialmente todos los nucleótidos de la hebra sentido están modificados y/o todos o sustancialmente todos los nucleótidos de la hebra antisentido en el primer y/o segundo agente de ARNi del VHB son nucleótidos modificados, y en donde el primer agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') AGAAAAUUGAg Ag AAGUCCAC (SEQ ID NO: 171), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') GUGGACUUCUCUCAAUUUUCU (SEQ ID NO: 302); y en donde el segundo agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') UACCAAUUUAUGCCUACAGCC (SEQ ID NO: 162), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') GUGGUGGACUUCUCUCAAUAUU (SEQ ID NO: 307).
En algunas realizaciones, se describen en el presente documento composiciones para inhibir la expresión de un gen del VHB en una célula, comprendiendo la composición dos agentes de ARNi del VHB, en donde todos o sustancialmente todos los nucleótidos de la hebra sentido están modificados y/o todos o sustancialmente todos los nucleótidos de la hebra antisentido en el primer y/o segundo agente de ARNi del VHB son nucleótidos modificados, y en donde el primer agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UAUUg Ag AGAAGUCCACCACUU (SEQ ID NO: 175), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') GUGGu Gg ACu Uc UCUCAAUAUU (SEQ ID NO: 307); y en donde el segundo agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UACCAAUUUA<u>G<c>CUACAGUU (SEQ ID NO: 154), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') CUGUAGGCAUAAAUUGGUA (SEQ ID NO: 292), y en donde la hebra sentido del primer agente de ARNi del VHB y el segundo agente de ARNi del VHB se conjugan con un ligando de direccionamiento que comprende N-acetilgalactosamina.
En algunas realizaciones, se describen en el presente documento composiciones para inhibir la expresión de un gen del VHB en una célula, comprendiendo la composición dos agentes de ARNi del VHB, en donde todos o sustancialmente todos los nucleótidos de la hebra sentido están modificados y/o todos o sustancialmente todos los nucleótidos de la hebra antisentido en el primer y/o segundo agente de ARNi del VHB son nucleótidos modificados, y en donde el primer agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') AGAAAAUUGAg Ag AAGUCCAC (SEQ ID NO: 171), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') GUGGACUUCUCUCAAUUUUCU (SEQ ID NO: 302); y en donde el segundo agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') UACCAAUUUAUGCCUACAGCG (SEQ ID NO: 188), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') CGCUGUAGGCAUAAAUUGGUA (SEQ ID NO: 328), y en donde la hebra sentido del primer agente de ARNi del VHB y el segundo agente de ARNi del VHB se conjugan con un ligando de direccionamiento que comprende N-acetilgalactosamina.
En algunas realizaciones, se describen en el presente documento composiciones para inhibir la expresión de un gen del VHB en una célula, comprendiendo la composición dos agentes de ARNi del VHB, en donde todos o sustancialmente todos los nucleótidos de la hebra sentido están modificados y/o todos o sustancialmente todos los nucleótidos de la hebra antisentido en el primer y/o segundo agente de ARNi del VHB son nucleótidos modificados, y en donde el primer agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') AGAAAAUUGAg Ag AAGUCCAC (SEQ ID NO: 171), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') GUGGACUUCUCUCAAUUUUCU (SEQ ID NO: 302); y en donde el segundo agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') UACCAAUUUAUGCCUACAGCC (SEQ ID NO: 162), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3')<GGCUGUAGGCAUAAAUUGGUA (SEQ ID n>O:<294), y en donde la hebra sentido del primer agente de ARNi para el>VHB y el segundo agente de ARNi para el VHB se conjugan con un ligando de direccionamiento que comprende N-acetil-galactosamina.
En algunas realizaciones, se describen en el presente documento composiciones para inhibir la expresión de un gen del VHB en una célula, comprendiendo la composición dos agentes de ARNi del VHB, en donde todos o sustancialmente todos los nucleótidos de la hebra sentido están modificados y/o todos o sustancialmente todos los nucleótidos de la hebra antisentido en el primer y/o segundo agente de ARNi del VHB son nucleótidos modificados, y en donde el primer agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') AGAAAAUUGA<g>A<g>AAGUCCAC (SEQ ID NO: 171), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1,2 o 3 nucleobases de la secuencia (5 '^3 ') GUGGACUUCUCUCAAUUUUCU (SEQ ID NO: 302); y en donde el segundo agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') UACCAAUUUAUGCCUACAGCC (SEQ ID NO: 162), y una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleobases que difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleobases de la secuencia (5'^-3') GUGGUGGACUUCUCUCAAUAUU (SEQ ID NO: 307), y en donde la hebra sentido del primer agente de ARNi del VHB y el segundo agente de ARNi del VHB se conjugan con un ligando de direccionamiento que comprende N-acetilgalactosamina.
En algunas realizaciones, en el presente documento se describen métodos de tratamiento de una infección por el VHB o de prevención de enfermedades o síntomas causados por una infección por el VHB que comprenden la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad eficaz de AD04872 y una cantidad eficaz de AD05070. En algunas realizaciones, la proporción entre AD04872 y AD05070 administrada a un sujeto que lo necesite es de aproximadamente 2:1. En algunas realizaciones, la proporción entre AD04872 y AD05070 administrada a un sujeto que lo necesite es de aproximadamente 3:1. En algunas realizaciones, la proporción entre AD04872 y AD05070 administrada a un sujeto que lo necesite es de aproximadamente 1:1. En algunas realizaciones, la proporción entre AD04872 y AD05070 administrada a un sujeto que lo necesite es de aproximadamente 4:1. En algunas realizaciones, la proporción entre AD04872 y AD05070 administrada a un sujeto que lo necesite es de aproximadamente 5:1. En algunas realizaciones, la proporción entre AD04872 y AD05070 administrada a un sujeto que lo necesite es de aproximadamente 1:2.
En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 1 mg/kg (mpk) de AD04872 y aproximadamente 1 mg/kg de AD05070 a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 1,5 mg/kg de AD04872 y aproximadamente 1,5 mg/kg de AD05070 a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 2,0 mg/kg de AD04872 y aproximadamente 1,0 mg/kg de AD05070 a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 3,0 mg/kg de AD04872 y aproximadamente 1,0 mg/kg de AD05070 a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 3,2 mg/kg de AD04872 y aproximadamente 0,8 mg/kg de AD05070 a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 2,7 mg/kg de AD04872 y aproximadamente 1,3 mg/kg de AD05070 a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 4,0 mg/kg de AD04872 y aproximadamente 1,0 mg/kg de AD05070 a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 3,3 mg/kg de AD04872 y aproximadamente 1,7 mg/kg de AD05070 a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, se administran entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 5 mg/kg de AD04872 y entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 5 mg/kg de AD05070 a un sujeto que lo necesita. En algunas realizaciones, aproximadamente AD04872 y aproximadamente AD05070 se administran por separado (p. ej., en inyecciones separadas). En algunas realizaciones, la dosis respectiva de AD04872 y la dosis respectiva de AD05070 se administran juntas (p. ej., en la misma inyección). En algunas realizaciones, la dosis respectiva de AD04872 y la dosis respectiva de AD05070 se preparan en una única composición farmacéutica.
En algunas realizaciones, se describen en el presente documento métodos de tratamiento de una infección por el VHB o de prevención de enfermedades o síntomas causados por una infección por el VHB que comprenden la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad eficaz de AD04872 y una cantidad eficaz de AD04776. En algunas realizaciones, la proporción entre AD04872 y AD04776 administrada a un sujeto que lo necesite es de aproximadamente 2:1. En algunas realizaciones, la proporción entre AD04872 y AD04776 administrada a un sujeto que lo necesite es de aproximadamente 3:1. En algunas realizaciones, la proporción entre AD04872 y AD04776 administrada a un sujeto que lo necesite es de aproximadamente 4:1. En algunas realizaciones, la proporción entre AD04872 y AD04776 administrada a un sujeto que lo necesite es de aproximadamente 1:1. En algunas realizaciones, la proporción entre AD04872 y AD04776 administrada a un sujeto que lo necesite es de 5:1. En algunas realizaciones, la proporción entre AD04872 y AD04776 administrada a un sujeto que lo necesite es de 1:2.
En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 1 mg/kg (mpk) de AD04872 y aproximadamente 1 mg/kg de AD04776 a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 1,5 mg/kg de AD04872 y aproximadamente 1,5 mg/kg de AD04776 a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 2,0 mg/kg de AD04872 y aproximadamente 1,0 mg/kg de AD04776 a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 3,0 mg/kg de AD04872 y aproximadamente 1.0 mg/kg de AD04776 a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 3.2 mg/kg de AD04872 y aproximadamente 0,8 mg/kg de AD04776 a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 2,7 mg/kg de AD04872 y aproximadamente 1,3 mg/kg de AD04776 a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 4,0 mg/kg de AD04872 y aproximadamente 1,0 mg/kg de AD04776 a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 3,3 mg/kg de AD04872 y aproximadamente 1,7 mg/kg de AD04776 a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, se administran entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 5 mg/kg de AD04872 y entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 5 mg/kg de AD04776 a un sujeto que lo necesita. En algunas realizaciones, las dosis respectivas de AD04872 y AD04776 se administran por separado (p. ej., en inyecciones separadas). En algunas realizaciones, las dosis respectivas de AD04872 y AD04776 se administran juntas (p. ej., en la misma inyección). En algunas realizaciones, las dosis respectivas de AD04872 y AD04776 se preparan en una única composición farmacéutica.
En algunas realizaciones, en el presente documento se describen métodos de tratamiento de una infección por el VHB o de prevención de enfermedades o síntomas causados por una infección por el VHB que comprenden la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad eficaz de AD04872 y una cantidad eficaz de AD04982.
En algunas realizaciones, la proporción entre AD04872 y AD04982 administrada a un sujeto que lo necesite es de aproximadamente 2:1. En algunas realizaciones, la proporción entre AD04872 y AD04982 administrada a un sujeto que lo necesite es de aproximadamente 3:1. En algunas realizaciones, la proporción entre AD04872 y AD04982 administrada a un sujeto que lo necesite es de aproximadamente 4:1. En algunas realizaciones, la proporción entre AD04872 y AD04982 administrada a un sujeto que lo necesite es de aproximadamente 1:1. En algunas realizaciones, la proporción entre AD04872 y AD04982 administrada a un sujeto que lo necesite es de aproximadamente 5:1. En algunas realizaciones, la proporción entre AD04872 y AD04982 administrada a un sujeto que lo necesite es de 1:2.
En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 1 mg/kg (mpk) de AD04872 y aproximadamente 1 mg/kg de AD04982 a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 1,5 mg/kg de AD04872 y aproximadamente 1,5 mg/kg de AD04982 a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 2,0 mg/kg de AD04872 y aproximadamente 1,0 mg/kg de AD04982 a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 3,0 mg/kg de AD04872 y aproximadamente 1.0 mg/kg de AD04982 a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 3.2 mg/kg de AD04872 y aproximadamente 0,8 mg/kg de AD04982 a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 2,7 mg/kg de AD04872 y aproximadamente 1,3 mg/kg de AD04982 a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 4,0 mg/kg de AD04872 y aproximadamente 1,0 mg/kg de AD04982 a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 3,3 mg/kg de AD04872 y aproximadamente 1,7 mg/kg de AD04982 a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, se administran entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 5 mg/kg de AD04872 y entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 5 mg/kg de AD04982 a un sujeto que lo necesita. En algunas realizaciones, las dosis respectivas de AD04872 y AD04982 se administran por separado (p. ej., en inyecciones separadas). En algunas realizaciones, las dosis respectivas de AD04872 y AD04982 se administran juntas (p. ej., en la misma inyección). En algunas realizaciones, las dosis respectivas de AD04872 y AD04982 se preparan en una única composición farmacéutica.
En algunas realizaciones, en el presente documento se describen métodos de tratamiento de una infección por el VHB o de prevención de enfermedades o síntomas causados por una infección por el VHB que comprenden la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad eficaz de AD04580 y una cantidad eficaz de AD04585. En algunas realizaciones, la proporción entre AD04580 y AD04585 administrada a un sujeto que lo necesite es de aproximadamente 2:1. En algunas realizaciones, la proporción entre AD04580 y AD04585 administrada a un sujeto que lo necesite es de aproximadamente 3:1. En algunas realizaciones, la proporción entre AD04580 y AD04585 administrada a un sujeto que lo necesite es de aproximadamente 4:1. En algunas realizaciones, la proporción entre AD04580 y AD04585 administrada a un sujeto que lo necesite es de aproximadamente 5:1. En algunas realizaciones, la proporción entre AD04580 y AD04585 administrada a un sujeto que lo necesite es de aproximadamente 1:1. En algunas realizaciones, la proporción entre AD04580 y AD04585 administrada a un sujeto que lo necesite es de aproximadamente 1:2. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 1 mg/kg (mpk) de AD04580 y aproximadamente 1 mg/kg de AD04585 a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, se administran aproximadamente 1,5 mg/kg de AD04580 y aproximadamente 1,5 mg/kg de AD04585 a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, se administran entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 5 mg/kg de AD04580 y entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 5 mg/kg de AD04585 a un sujeto que lo necesita.
En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB divulgado en el presente documento consiste o comprende AD05070 unido a (NAG37)s que se muestra como una sal de sodio que tiene la estructura representada por lo siguiente:
Ċ
22
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En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB divulgado en el presente documento consiste o comprende AD05070 unido a (NAG25)s que se muestra como una sal de sodio que tiene la estructura representada por lo siguiente:
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En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB divulgado en el presente documento consiste en o comprende AD05070 unido a (NAG37)s mostrado como un ácido libre que tiene la estructura representada por lo siguiente:
Ċ
30
Ċ
31
Ċ
32
En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB divulgado en el presente documento consiste o comprende AD04580 unido a (NAG31)s que se muestra como una sal de sodio que tiene la estructura representada por lo siguiente:
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En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB divulgado en el presente documento consiste o comprende AD04585 unido a (NAG25)s que se muestra como una sal de sodio que tiene la estructura representada por lo siguiente:
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Ċ
40
Ċ
41
En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB divulgado en el presente documento consiste o comprende AD04872 unido a (NAG37)s que se muestra como una sal de sodio que tiene la estructura representada por lo siguiente:
Ċ
43
Ċ
44
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En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB divulgado en el presente documento consiste o comprende AD04872 unido a (NAG25)s que se muestra como una sal de sodio que tiene la estructura representada por lo siguiente:
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��
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En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB divulgado en el presente documento consiste en o comprende AD04872 unido a (NAG37)s mostrado como un ácido libre que tiene la estructura representada por lo siguiente:
Ċ
50
Ċ
51
Ċ
52
Ċ
53
En algunas realizaciones, el agente o agentes de ARNi del VHB descritos se combinan opcionalmente con una o más terapias adicionales (es decir, una segunda, tercera, etc.). Un segundo agente terapéutico puede ser otro agente de ARNi del VHB (p. ej., un agente de ARNi del VHB dirigido a una secuencia diferente dentro del genoma del VHB). Una terapia adicional también puede ser un fármaco de molécula pequeña, anticuerpo, fragmento de anticuerpo y/o vacuna. Los agentes de ARNi del VHB, con o sin una o más terapias adicionales, pueden combinarse con uno o más excipientes para formar composiciones farmacéuticas.
En algunas realizaciones, el agente o agentes de ARNi del VHB descritos se combinan opcionalmente con uno o más agentes terapéuticos adicionales, en donde el agente terapéutico adicional es un inhibidor nucleosídico o un inhibidor nucleotídico. En algunas realizaciones, el agente o agentes de ARNi del VHB descritos se combinan opcionalmente con uno o más agentes terapéuticos adicionales, en donde el agente terapéutico adicional es entecavir, tenofovir, tenofovir alafenamida, tenofovir disoproxilo, lamivudina u otro tratamiento antivírico. En algunas realizaciones, el agente o agentes de ARNi del VHB descritos se combinan opcionalmente con uno o más agentes terapéuticos adicionales, en donde el agente terapéutico adicional es un interferón. En algunas realizaciones, el agente o agentes de ARNi del VHB descritos se combinan opcionalmente con uno o más agentes terapéuticos adicionales, en donde el agente terapéutico adicional es interferón alfa. En algunas realizaciones, el agente o agentes de ARNi del VHB descritos se combinan opcionalmente con uno o más agentes terapéuticos adicionales contra el VHB, en donde el agente terapéutico adicional es una vacuna contra el VHB.
En algunas realizaciones, el agente o agentes de ARNi del VHB descritos se combinan opcionalmente con uno o más tratamientos adicionales en una única forma farmacéutica (es decir, un cóctel incluido en una única inyección). En algunas realizaciones, el agente o agentes de ARNi del VHB descritos pueden administrarse por separado de uno o más agentes terapéuticos adicionales opcionales. En algunas realizaciones, el agente o agentes de ARNi del VHB descritos se administran a un sujeto que los necesite mediante inyección subcutánea, y los uno o más agentes terapéuticos adicionales opcionales se administran por vía oral, que en conjunto proporcionan un régimen de tratamiento para enfermedades y afecciones asociadas a la infección por el VHB. En algunas realizaciones, el agente o agentes de ARNi del VHB descritos se administran a un sujeto que los necesite mediante inyección subcutánea, y los uno o más agentes terapéuticos adicionales opcionales se administran mediante una inyección subcutánea separada.
En algunas realizaciones, en el presente documento se describen composiciones para administrar un agente de ARNi del VHB a una célula hepáticain vivo,incluyendo la composición un agente ARNi del VHB conjugado o unido a un grupo de direccionamiento. En algunas realizaciones, el grupo de direccionamiento es un ligando del receptor de asialoglicoproteína. En algunas realizaciones, se describen composiciones para administrar un agente de ARNi del VHB a una célula hepáticain vivo,incluyendo la composición un agente de ARNi del VHB unido a un ligando de N-acetil-galactosamina.
En algunas realizaciones, uno o más de los agentes de ARNi del VHB descritos se administran a un mamífero en un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el mamífero es un ser humano.
El uso de agente(s) de ARNi del virus de la hepatitis B proporciona métodos para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de enfermedades/trastornos que están asociados con la infección por el VHB. Los agentes de ARNi del VHB descritos median la interferencia del ARN para inhibir la expresión de uno o más genes necesarios para la replicación y/o patogénesis del virus de la hepatitis B. En particular, por ejemplo, los agentes de ARNi del VHB pueden inhibir la polimerasa viral, la proteína central, los antígenos de superficie, el antígeno e y/o la proteína X, en una célula, tejido o mamífero. Los agentes de ARNi del VHB pueden utilizarse para tratar la infección por el VHB. Los agentes de ARNi del VHB también pueden utilizarse para tratar o prevenir enfermedades/trastornos hepáticos crónicos, inflamación, afecciones fibróticas y trastornos proliferativos, como cánceres, asociados con la infección por el VHB. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además el tratamiento del virus de la hepatitis D (VHD) en el sujeto. Dichos métodos comprenden la administración del agente de ARNi del VHB a un ser humano o animal infectado por el VHB. Además, se describen composiciones para la administración de agentes de ARNi del VHB a células hepáticasin vivo.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más agentes de ARNi del VHB pueden administrarse de varias maneras dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistémico. La administración puede ser, aunque no de forma limitativa, intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal, subdérmica (p. ej., a través de un dispositivo implantado) y administración intraparenquimatosa. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se administran mediante inyección subcutánea.
Los agentes y/o composiciones de ARNi del VHB descritos pueden utilizarse en métodos para el tratamiento terapéutico de la infección por el VHB o de enfermedades o afecciones causadas por la infección por el VHB. Dichos métodos incluyen la administración a un sujeto de un agente de ARNi del VHB como se describe en el presente documento, p. ej., un sujeto humano o animal.
Como se usa en el presente documento, los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" se refieren a un polímero de nucleósidos enlazados, cada uno de los cuales puede estar independientemente modificado o sin modificar.
Como se usa en el presente documento, un "agente de ARNi" o "activador de ARNi" es una composición que contiene una molécula de oligonucleótido de ARN o similar al ARN (p. ej., ARN modificado químicamente) capaz de degradar o inhibir la traducción de los transcritos de ARN mensajero (ARNm) de un ARNm diana de una manera específica de secuencia. Como se usa en el presente documento, los agentes de ARNi pueden actuar a través del mecanismo de ARN de interferencia (es decir, induciendo ARN de interferencia a través de la interacción con la maquinaria de la vía de ARN de interferencia (complejo de silenciamiento inducido por ARN o RISC) de las células de mamífero), o por cualquier mecanismo o vía alternativos. Aunque se cree que los agentes de ARNi, tal como se utiliza ese término en el presente documento, actúan principalmente a través del mecanismo de interferencia del ARN, los agentes de ARNi divulgados no están vinculados ni limitados a ninguna vía o mecanismo de acción en particular. Los agentes de ARNi divulgados en el presente documento se componen de una hebra sentido y una hebra antisentido, e incluyen, pero sin limitación: ARN de interferencia pequeños (ARNpi), ARN bicatenarios (ARNbc), microARN (miARN), ARN de horquilla corta (ARNhc) y sustratos dicer. La hebra antisentido de los agentes de ARNi descritos en el presente documento es, al menos parcialmente, complementaria al ARNm diana. Los agentes de ARNi pueden estar compuestos por nucleótidos modificados y/o uno o más enlaces no fosfodiéster.
Como se usa en el presente documento, los términos "silenciar' "reducir", "inhibir", "reprimir" o "atenuar' cuando se refieren a la expresión de un gen determinado, significan que la expresión del gen medida por la cantidad de ARN transcrito a partir del gen o la cantidad de polipéptido, proteína o subunidad proteica traducida a partir del ARNm en una célula, grupo de células, tejido, órgano o sujeto en el que se transcribe el gen, se reduce cuando la célula, grupo de células, tejido, órgano o sujeto se trata con compuestos oligoméricos, tales como agentes de ARNi, descrito en el presente documento en comparación con una segunda célula, grupo de células, tejido, órgano o sujeto que no ha sido tratado así.
Como se usa en el presente documento, el término "secuencia" o la expresión "secuencia de nucleótidos" significa una sucesión u orden de nucleobases o nucleótidos, descrita con una sucesión de letras utilizando una nomenclatura estándar.
Como se usa en el presente documento, una "base nucleotídica" o "nucleobase" es un compuesto heterocíclico de pirimidina o purina, que es un constituyente estándar de todos los ácidos nucleicos, e incluye las bases que forman los nucleótidos adenina (A), guanina (G), citosina (C), timina (T) y uracilo (U). Una nucleobase puede modificarse además para incluir, sin limitación, las bases universales, bases hidrófobas, bases promiscuas, bases de tamaño expandido y bases fluoradas.
Como se usa en el presente documento, y salvo que se indique lo contrario, el término "complementario", cuando se utiliza para describir una primera secuencia de nucleótidos (p. ej., hebra sentido del agente de ARNi o ARNm diana) en relación con una segunda secuencia de nucleótidos (p. ej., hebra antisentido del agente de ARNi o un oligonucleótido antisentido monocatenario), significa la capacidad de un oligonucleótido o polinucleótido que incluye la primera secuencia de nucleótidos para hibridarse (formar puentes de hidrógeno de pares de bases en las condiciones fisiológicas de los mamíferos (o condiciones similaresin vitro))y formar una estructura dúplex o de doble hélice en determinadas condiciones con un oligonucleótido o polinucleótido que incluye la segunda secuencia de nucleótidos. Las secuencias complementarias incluyen pares de bases de Watson-Crick o pares de bases no Watson-Crick e incluyen nucleótidos naturales o modificados o miméticos de nucleótidos, al menos en la medida en que se cumplan los requisitos de hibridación mencionados. La identidad o complementariedad de secuencias es independiente de la modificación. Por ejemplo, a y Af son complementarias de U (o T) e idénticos a A a efectos de determinar la identidad o la complementariedad.
Como se usa en el presente documento, "perfectamente complementario" o "totalmente complementario" significa que todas (100 %) las bases de una secuencia contigua de un primer polinucleótido hibridarán con el mismo número de bases de una secuencia contigua de un segundo polinucleótido. La secuencia contigua puede comprender la totalidad o parte de una primera o segunda secuencia de nucleótidos.
Como se usa en el presente documento, "parcialmente complementario" significa que en un par hibridado de secuencias de nucleobases, al menos un 70 %, pero no todas, de las bases en una secuencia contigua de un primer polinucleótido hibridará con el mismo número de bases en una secuencia contigua de un segundo polinucleótido.
Como se usa en el presente documento, "sustancialmente complementario" significa que en un par hibridado de secuencias de nucleobases, al menos aproximadamente el 85 %, pero no todas, de las bases en una secuencia contigua de un primer polinucleótido hibridará con el mismo número de bases en una secuencia contigua de un segundo polinucleótido. Las expresiones "complementario", "totalmente complementario", y "sustancialmente complementario" en el presente documento pueden utilizarse con respecto a la coincidencia de bases entre la hebra sentido y la hebra antisentido de un agente de ARNi bicatenario, entre la hebra antisentido de un agente de ARNi y una secuencia de un ARNm diana, o entre un oligonucleótido antisentido monocatenario y una secuencia de un ARNm diana.
Como se usa en el presente documento, la expresión "sustancialmente idéntica" o "identidad sustancial" aplicada a una secuencia de ácido nucleico significa que una secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia o más, preferentemente al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 99 %, en comparación con una secuencia de referencia. El "porcentaje de identidad de secuencia" se determina al comparar dos secuencias alineadas de manera óptima a lo largo de una ventana de comparación. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que aparecen las bases de ácido nucleico idénticas en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. Las invenciones divulgadas en el presente documento abarcan secuencias de nucleótidos sustancialmente idénticas a las divulgadas en el presente documento, p. ej., en las tablas 2, 3 y 4. En algunas realizaciones, las secuencias divulgadas en el presente documento son exactamente idénticas, o son al menos en un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % por ciento idénticas a las divulgadas en el presente documento, p. ej., en las tablas 1, 2, 3 y 4.
Como se usa en el presente documento, los términos "tratar", "tratamiento", y similares, significan los métodos o medidas adoptados para aliviar o paliar el número, la gravedad y/o la frecuencia de uno o más síntomas de una enfermedad o afección en un sujeto.
Como se usa en el presente documento, la expresión "introducir en una célula", cuando se refiere a un compuesto oligomérico, significa introducir funcionalmente el compuesto oligomérico en una célula. La expresión "suministro funcional" significa el suministro del compuesto oligomérico a la célula de una manera que permita que el compuesto oligomérico tenga la actividad biológica esperada, p. ej., inhibición específica de la secuencia de expresión génica.
Salvo que se indique lo contrario, el uso del símbolo
tal y como se utiliza en el presente documento, significa que cualquier grupo o grupos pueden estar vinculados al mismo de acuerdo con el alcance de las invenciones descritas en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, el término "isómeros" se refiere a compuestos que tienen fórmulas moleculares idénticas, pero que difieren en la naturaleza o la secuencia de enlace de sus átomos o en la disposición de sus átomos en el espacio. Los isómeros que difieren en la disposición de sus átomos en el espacio se denominan "estereoisómeros". Los estereoisómeros que no son imágenes especulares entre sí se denominan "diaestereoisómeros", y los estereoisómeros que son imágenes especulares no superponibles se denominan "enantiómeros" o a veces isómeros ópticos. Un átomo de carbono unido a cuatro sustituyentes no idénticos se denomina "centro quiral".
Como se usa en el presente documento, a menos que se identifique específicamente en una estructura que tiene una conformación particular, para cada estructura en la que estén presentes centros asimétricos y, por tanto, den lugar a enantiómeros, diastereómeros u otras configuraciones estereoisoméricas, cada estructura divulgada en el presente documento pretende representar todos los isómeros posibles, incluidas sus formas ópticamente puras y racémicas. Por ejemplo, las estructuras divulgadas en el presente documento abarcan tanto las mezclas de diastereómeros como los estereoisómeros individuales.
Tal como se usa en una reivindicación del presente documento, la expresión "que consiste en" excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente no especificado en la reivindicación. Cuando se utiliza en una reivindicación en el presente documento, la expresión "que consiste esencialmente en" limita el alcance de una reivindicación a los materiales o etapas especificados y aquellos que no afectan materialmente a la característica o características básicas y novedosas de la invención reivindicada.
Un experto habitual en la materia comprendería y apreciaría fácilmente que los compuestos y composiciones divulgados en el presente documento pueden tener ciertos átomos (p. ej., átomos de N, O o S) en estado protonado o desprotonado, dependiendo del entorno en el que se encuentre el compuesto o la composición. Por consiguiente, como se usan en el presente documento, las estructuras divulgadas en el presente documento prevén que determinados grupos funcionales, tal como, por ejemplo, OH, SH o NH, puedan estar protonados o desprotonados. La divulgación en el presente documento pretende cubrir los compuestos y composiciones divulgados independientemente de su estado de protonación basado en el medio ambiente (como el pH), como entendería fácilmente el experto en la materia.
A menos que se definan de otro modo, todos los términos y expresiones técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende normalmente un experto en la materia. Aunque en la práctica o el ensayo de la presente invención se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluidas las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son únicamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.
Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y a partir de las reivindicaciones.
Descripción detallada
En el presente documento se describen agentes de ARNi para inhibir la expresión del virus de la hepatitis B (VHB) (denominados en el presente documento agentes de ARNi del VHB o activadores de ARNi del VHB). Cada agente de ARNi del VHB comprende una hebra sentido y una hebra antisentido. La hebra sentido y la hebra antisentido pueden tener entre 16 y 30 nucleótidos de longitud cada una. En algunas realizaciones, las hebras sentido y antisentido pueden tener entre 17 y 26 nucleótidos de longitud cada una. Las hebras sentido y antisentido pueden ser de la misma longitud o de longitudes diferentes. En algunas realizaciones, las hebras sentido y antisentido tienen cada una de ellas una longitud independiente de 17 a 26 nucleótidos. En algunas realizaciones, las hebras sentido y antisentido tienen cada una de ellas una longitud independiente de 17-21 nucleótidos. En algunas realizaciones, tanto la hebra sentido como la hebra antisentido tienen una longitud de 21-26 nucleótidos cada una. En algunas realizaciones, la hebra sentido tiene una longitud aproximada de 19 nucleótidos, mientras que la hebra antisentido tiene una longitud aproximada de 21 nucleótidos. En algunas realizaciones, la hebra sentido tiene una longitud aproximada de 21 nucleótidos, mientras que la hebra antisentido tiene una longitud aproximada de 23 nucleótidos. En algunas realizaciones, tanto la hebra sentido como la antisentido tienen 26 nucleótidos de longitud cada una. En algunas realizaciones, las hebras sentido y antisentido del agente de ARNi tienen cada una independientemente 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25 o 26 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un agente de ARNi bicatenario tiene una longitud dúplex de aproximadamente 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 nucleótidos. Esta región de complementariedad perfecta o sustancial entre la hebra sentido y la hebra antisentido suele ser de 15-25 (p. ej., 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25) nucleótidos de longitud y ocurre en o cerca del extremo 5' de la hebra antisentido (p. ej., esta región puede estar separada del extremo 5' de la hebra antisentido por 0, 1, 2, 3, o 4 nucleótidos que no son perfecta o sustancialmente complementarios).
La hebra sentido y la hebra antisentido contienen cada una un tramo de secuencia central de 16 a 23 nucleobases de longitud. Una secuencia del tramo central de la hebra antisentido es 100 % (perfectamente) complementaria o al menos aproximadamente el 85 % (sustancialmente) complementaria a una secuencia de nucleótidos (en ocasiones denominada, p. ej., secuencia diana) presente en el ARNm diana del VHB. Una secuencia de tramo central de la hebra sentido es 100 % (perfectamente) complementaria o al menos aproximadamente 85 % (sustancialmente) complementaria a una secuencia de tramo central en la hebra antisentido, y por lo tanto la secuencia de tramo central de la hebra sentido es perfectamente idéntica o al menos aproximadamente 85 % idéntica a una secuencia de nucleótidos (secuencia diana) presente en la diana de ARNm del VHB. Una secuencia del tramo central de la hebra sentido puede tener la misma longitud que una secuencia central antisentido correspondiente o puede tener una longitud diferente. En algunas realizaciones, la secuencia del tramo central de la hebra antisentido tiene 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la secuencia del tramo central de la hebra sentido tiene 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 nucleótidos de longitud.
En las tablas 3 y 4 se proporcionan ejemplos de secuencias de nucleótidos de las hebras sentido y antisentido utilizadas en la formación de agentes de ARNi del VHB. Algunos ejemplos de dúplex de agentes de ARNi, que incluyen las secuencias de nucleótidos de las tablas 3 y 4, se proporcionan en la tabla 5.
Las hebras sentido y antisentido del agente de ARNi del VHB se unen para formar un dúplex. Una hebra sentido y una hebra antisentido de un agente ARNi del VHB pueden ser parcial, sustancial o totalmente complementarias entre sí. Dentro de la región dúplex complementaria, la secuencia del tramo central de la hebra sentido es al menos aproximadamente un 85 % complementaria o 100 % complementaria a la secuencia del tramo central antisentido. En algunas realizaciones, la secuencia del tramo central de la hebra sentido contiene una secuencia de al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, o al menos 21 nucleótidos que es al menos aproximadamente un 85 % o un 100 % complementaria a una secuencia correspondiente de 16, 17, 18, 19, 20 o 21 nucleótidos de la secuencia del tramo central de la hebra antisentido (es decir, las secuencias del tramo central de la hebra sentido y antisentido de un agente de ARNi del VHB tienen una región de al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, o al menos 21 nucleótidos que están emparejados al menos en un 85 % de bases o en un 100 % de bases).
En algunas realizaciones, la hebra antisentido de un agente de ARNi del VHB divulgado en el presente documento difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleótidos de cualquiera de las secuencias de la hebra antisentido de la tabla 2 o la tabla 3. En algunas realizaciones, la hebra sentido de un agente de ARNi del VHB divulgado en el presente documento difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleótidos de cualquiera de las secuencias de la hebra sentido de la tabla 2 o la tabla 4.
La longitud de las hebras sentido y antisentido del agente de ARNi del VHB descritas en el presente documento son independientemente de 16 a 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, las hebras sentido y antisentido tienen una longitud independiente de 17 a 26 nucleótidos. En algunas realizaciones, las hebras sentido y antisentido tienen una longitud de 19-26 nucleótidos. En algunas realizaciones, las hebras sentido y antisentido del agente de ARNi descritas tienen independientemente 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25 o 26 nucleótidos de longitud. Las hebras sentido y antisentido pueden ser de la misma longitud o de longitudes diferentes. En algunas realizaciones, una hebra sentido y una hebra antisentido tienen 26 nucleótidos de longitud cada una. En algunas realizaciones, una hebra sentido tiene 23 nucleótidos de longitud y una hebra antisentido tiene 21 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, una hebra sentido tiene 22 nucleótidos de longitud y una hebra antisentido tiene 21 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, una hebra sentido tiene 21 nucleótidos de longitud y una hebra antisentido tiene 21 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, una hebra sentido tiene 19 nucleótidos de longitud y una hebra antisentido tiene 21 nucleótidos de longitud.
La hebra sentido y/o la hebra antisentido pueden contener opcional e independientemente 1, 2, 3, 4, 5 o 6 nucleótidos adicionales (extensión) en el extremo 3', el extremo 5' o los extremos tanto 3' como 5' de las secuencias centrales. Los nucleótidos adicionales de la hebra antisentido, si están presentes, pueden o no ser complementarios a la secuencia correspondiente en un ARNm del VHB. Los nucleótidos adicionales de la hebra sentido, si están presentes, pueden o no ser idénticos a la secuencia correspondiente en un ARNm del VHB. Los nucleótidos adicionales de la hebra antisentido, si están presentes, pueden o no ser complementarios a los nucleótidos adicionales de la hebra sentido correspondiente, si están presentes.
Como se usa en el presente documento, una extensión comprende 1,2, 3, 4, 5 o 6 nucleótidos en el extremo 5' y/o 3' de la secuencia del tramo central de la hebra sentido y/o de la secuencia del tramo central de la hebra antisentido. Los nucleótidos de extensión de una hebra sentido pueden o no ser nucleótidos complementarios, nucleótidos de la secuencia del tramo central o nucleótidos de extensión, en la hebra antisentido correspondiente. En cambio, los nucleótidos de extensión en una hebra antisentido pueden o no ser nucleótidos complementarios, nucleótidos de la secuencia del tramo central o nucleótidos de extensión, en la hebra sentido correspondiente. En algunas realizaciones, tanto la hebra sentido como la hebra antisentido de un agente de ARNi contienen extensiones 3' y 5'. En algunas realizaciones, uno o más de los nucleótidos de extensión 3' de una hebra forman pares de bases con uno o más nucleótidos de extensión 5' de la otra hebra. En otras realizaciones, uno o más nucleótidos de extensión 3' de una hebra no se emparejan con uno o más nucleótidos de extensión 5' de la otra hebra. En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB tiene una hebra antisentido con una extensión 3' y una hebra sentido con una extensión 5'.
En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que tiene una extensión 3' de 1, 2, 3, 4, 5 o 6 nucleótidos de longitud. En otras realizaciones, un agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que tiene una extensión 3' de 1,2 o 3 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, uno o más de los nucleótidos de extensión de la hebra antisentido comprenden nucleótidos de uracilo o timidina o nucleótidos que son complementarios a una secuencia de ARNm del VHB correspondiente. En algunas realizaciones, una extensión de cadena 3' antisentido incluye o consiste en, aunque no de forma limitativa, AUA, UGCUU, CUG, UG, UGCC, CUGCC, CGU, CUU, UGCCUA, CUGCCU, UGCCU, UGAUU, GCCUAU, T, TT, U, UU (cada uno enumerado de 5' a 3').
En algunas realizaciones, el extremo 3' de la hebra antisentido puede incluir nucleósidos abásicos (Ab) adicionales. En algunas realizaciones, se puede añadir Ab o AbAb al extremo 3' de la hebra antisentido.
En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que tiene una extensión 5' de 1, 2, 3, 4 o 5 nucleótidos de longitud. En otras realizaciones, un agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido que tiene una extensión 5' de 1 o 2 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, uno o más de los nucleótidos de extensión de la hebra antisentido comprende nucleótidos de uracilo o timidina o nucleótidos que son complementarios a una secuencia de ARNm del VHB correspondiente. En algunas realizaciones, la extensión de la hebra 5' antisentido incluye o consiste en, aunque no de forma limitativa, UA, TU, U, T, UU, TT, CUC (cada uno enumerado de 5' a 3'). Una hebra antisentido puede tener cualquiera de las extensiones 3' descritas anteriormente en combinación con cualquiera de las extensiones 5' de la hebra antisentido descritas, si están presentes.
En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB comprende una hebra sentido que tiene una extensión 3' de 1, 2, 3, 4 o 5 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, uno o más de los nucleótidos de extensión de la hebra sentido comprende nucleótidos de adenosina, uracilo o timidina, dinucleótidos de AT o nucleótidos que corresponden a los nucleótidos en la secuencia de ARNm del VHB. En algunas realizaciones, la extensión 3' de la hebra sentido incluye o consiste en, aunque no de forma limitativa, T, UT, TT, UU, UUT, TTT o TTTT (cada uno presentado de 5' a 3').
En algunas realizaciones, el extremo 3' de la hebra sentido puede incluir nucleósidos abásicos adicionales. En algunas realizaciones, pueden añadirse UUAb, UAb o Ab al extremo 3' de la hebra sentido. En algunas realizaciones, los uno o más nucleósidos abásicos añadidos al extremo 3' de la hebra sentido pueden estar invertidos (invAb). En algunas realizaciones, uno o más nucleósidos abásicos invertidos pueden insertarse entre el ligando de direccionamiento y la secuencia de nucleobases de la hebra sentido del agente de ARNi. En algunas realizaciones, la inclusión de uno o más nucleósidos abásicos invertidos en o cerca del extremo o extremos terminales de la hebra sentido de un agente de ARNi puede permitir una mayor actividad u otras propiedades deseadas de un agente de ARNi.
En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB comprende una hebra sentido que tiene una extensión 5' de 1, 2, 3, 4, 5 o 6 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, uno o más de los nucleótidos de extensión de la hebra sentido comprenden nucleótidos de uracilo o adenosina o nucleótidos que corresponden a nucleótidos de la secuencia del ARNm del VHB. En algunas realizaciones, la extensión 5' de la hebra sentido puede ser, aunque no de forma limitativa, CA, AUAGGC, AUAGG, AUAG, AUA, A, AA, AC, GCA, GGCA, GGC, UAUCA, UAUC, UCA, UAU, U, UU (cada uno enumerado de 5' a 3'). Una hebra sentido puede tener una extensión 3' y/o una extensión 5'.
En algunas realizaciones, el extremo 5' de la hebra sentido puede incluir un nucleósido (Ab) o nucleósidos (AbAb) abásicos adicionales. En algunas realizaciones, los uno o más nucleósidos abásicos añadidos al extremo 5' de la hebra sentido pueden estar invertidos (invAb). En algunas realizaciones, uno o más nucleósidos abásicos invertidos pueden insertarse entre el ligando de direccionamiento y la secuencia de nucleobases de la hebra sentido del agente de ARNi. En algunas realizaciones, la inclusión de uno o más nucleósidos abásicos invertidos en o cerca del extremo o extremos terminales de la hebra sentido de un agente de ARNi puede permitir una mayor actividad u otras propiedades deseadas de un agente de ARNi.
En las tablas 3 y 4 se ofrecen ejemplos de secuencias de nucleótidos utilizadas en la formación de agentes de ARNi del VHB. En algunas realizaciones, una hebra antisentido del agente de ARNi del VHB incluye una secuencia de nucleótidos de cualquiera de las secuencias de la tabla 3. En algunas realizaciones, una hebra antisentido del agente de ARNi del VHB incluye la secuencia de nucleótidos 1-17, 2-15, 2-17, 1-18, 2-18, 1-19, 2-19, 1-20, 2-20, 1-21, 2-21, 1-22, 2-22, 1-23, 2-23, 1-24, 2-24, 1-25, 2-25, 1-26 o 2-26 de cualquiera de las secuencias de la tabla 3. En algunas realizaciones, una hebra sentido del agente de ARNi del VHB incluye la secuencia nucleotídica de cualquiera de las secuencias de la tabla 4. En algunas realizaciones, una hebra sentido del agente de ARNi del VHB incluye la secuencia de nucleótidos 1-18, 1-19, 1-20, 1-21, 1-22, 1-23, 1-24, 1-25, 1-26, 2-19, 2-20, 2-21, 2-22, 2-23, 2-24, 2-25, 2-26, 3 20, 3-21, 3-22, 3-23, 3-24, 3-25, 3-26, 4-21, 4-22, 4-23, 4-24, 4-25, 4-26, 5-22, 5-23, 5-24, 5-25, 5-26, 6-23, 6-24, 6 25, 6-26, 7-24, 7-25, 7-25, 8-25, 8-26 de cualquiera de las secuencias de la tabla 4.
En algunas realizaciones, las hebras sentido y antisentido de los agentes de ARNi descritos en el presente documento contienen el mismo número de nucleótidos. En algunas realizaciones, las hebras sentido y antisentido de los agentes de ARNi descritos en el presente documento contienen diferentes números de nucleótidos. En algunas realizaciones, el extremo 5' de la hebra sentido y el extremo 3' de la hebra antisentido de un agente de ARNi forman un extremo romo. En algunas realizaciones, el extremo 3' de la hebra sentido y el extremo 5' de la hebra antisentido de un agente de ARNi forman un extremo romo. En algunas realizaciones, ambos extremos de un agente de ARNi forman extremos romos. En algunas realizaciones, ninguno de los extremos de un agente de ARNi es romo. Tal y como se utiliza en el presente documento, un extremo romo se refiere a un extremo de un agente de ARNi bicatenario en el que los nucleótidos terminales de las dos hebras hibridadas son complementarios (forman un par de bases complementario). En algunas realizaciones, el extremo 5' de la hebra sentido y el extremo 3' de la hebra antisentido de un agente de ARNi forman un extremo deshilachado. En algunas realizaciones, el extremo 3' de la hebra sentido y el extremo 5' de la hebra antisentido de un agente de ARNi forman un extremo deshilachado. En algunas realizaciones, ambos extremos de un agente de ARNi forman un extremo deshilachado. En algunas realizaciones, ninguno de los extremos de un agente de ARNi es un extremo deshilachado. Tal como se utiliza en el presente documento, un extremo deshilachado se refiere a un extremo de un agente de ARNi bicatenario en el que los nucleótidos terminales de las dos hebras hibridadas de un par (es decir, no forman un saliente) pero no son complementarios (es decir, forman un par no complementario). Como se usa en el presente documento, un saliente es un tramo de uno o más nucleótidos no apareados al final de una cadena de un agente de ARNi bicatenario. Los nucleótidos no apareados pueden estar en la hebra sentido o en la hebra antisentido, creando salientes 3' o 5'. En algunas realizaciones, el agente de ARNi contiene: un extremo romo y un extremo deshilachado, un extremo romo y un extremo saliente 5', un extremo romo y un extremo saliente 3', un extremo deshilachado y un extremo saliente 5', un extremo deshilachado y un extremo saliente 3', dos extremos salientes 5', dos extremos salientes 3', un extremo saliente 5' y un extremo saliente 3', dos extremos deshilachados, o dos extremos romos.
Una base nucleotídica (o nucleobase) es un compuesto heterocíclico de pirimidina o purina que forma parte de todos los ácidos nucleicos e incluye adenina (A), guanina (G), citosina (C), timina (T) y uracilo (U). Como se usa en el presente documento, el término "nucleótido" puede incluir un nucleótido modificado (tal como, por ejemplo, un mimético de nucleótidos, un sitio abásico (Ab), o un supuesto resto sustitutivo). Los nucleótidos modificados, cuando se utilizan en diversas construcciones de polinucleótidos u oligonucleótidos, puede preservar la actividad del compuesto en las células y, al mismo tiempo, aumentar la estabilidad sérica de estos compuestos, y también puede minimizar la posibilidad de activar la actividad del interferón en humanos al administrar la construcción de polinucleótidos u oligonucleótidos.
En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB se prepara o se proporciona como una sal, sal mixta, o un ácido libre. En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB se prepara como sal sódica. Dichas formas están dentro del ámbito de las invenciones divulgadas en el presente documento.
Nucleótidos modificados
En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB contiene uno o más nucleótidos modificados. Como se usa en el presente documento, un "nucleótido modificado" es un nucleótido distinto de un ribonucleótido (nucleótido de 2'-hidroxilo). En algunas realizaciones, al menos un 50 % (p. ej., al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 %) de los nucleótidos son nucleótidos modificados. Como se usa en el presente documento, los nucleótidos modificados incluyen, pero sin limitación, desoxirribonucleótidos, miméticos de nucleótidos, nucleótidos abásicos (representados en el presente documento como Ab), nucleótidos modificados en 2', nucleótidos con enlaces 3' a 3' (invertidos) (representados en el presente como invdN, invN, invn, invAb), nucleótidos que comprenden bases no naturales, nucleótidos puenteados, ácidos peptidonucleicos (APN), miméticos de 2',3'-seco nucleótidos (análogos de nucleobase desbloqueados, representados en el presente documento como N<una>o NUNA), nucleótidos bloqueados (representados en el presente documento como NLNA o NLNA), nucleótidos de 3'-O-metoxi (con enlace internucleosídico 2') (representados en el presente documento como 3'-OMen), nucleótidos de 2'-F-Arabino (representados en el presente documento como NfANA o N<ana>), 5'-Me, nucleótidos de 2'-fluoro (representados en el presente documento como 5Me-Nf), nucleótidos de morfolino, desoxirribonucleótidos de fosfonato de vinilo (representados en el presente documento como vpdN), nucleótidos que contienen fosfonato de vinilo y nucleótidos que contienen fosfonato de ciclopropilo (cPrpN). Los nucleótidos modificados en 2' (es decir, un nucleótido con un grupo distinto de un grupo hidroxilo en la posición 2' del anillo de azúcar de cinco miembros) incluyen, pero sin limitación, nucleótidos de 2'-O-metilo (representados en el presente documento como una letra "n" minúscula en una secuencia de nucleótidos), nucleótidos de 2'-desoxi-2'-fluoro (representados en el presente documento como Nf, también representados en el presente documento como nucleótidos de 2'-fluoro), nucleótidos de 2'-desoxi (representados en el presente documento como dN), nucleótidos de 2'-metoxietilo (2'-O-2-metiloxietilo) (representados en el presente documento como NM o 2'-MOE), nucleósidos de 2'-amino y nucleótidos de 2'-alquilo. No es necesario que todas las posiciones de un compuesto determinado se modifiquen de manera uniforme. En cambio, puede incorporarse más de una modificación en un único agente de ARNi del VHB o incluso en un único nucleótido del mismo. Las hebras sentido y antisentido del agente de ARNi del VHB pueden sintetizarse y/o modificarse por métodos conocidos en la técnica. La modificación de un nucleótido es independiente de la modificación de otro nucleótido.
Las nucleobases modificadas incluyen nucleobases sintéticas y naturales, tales como pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y O-6 sustituidas, (p. ej., 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo o 5-propinilcitosina), 5- metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil-citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, derivados de 6-alquilo (p. ej., 6- metil, 6-etil, 6-isopropil o 6-n-butil) de la adenina y la guanina, derivados de 2-alquilo (p. ej., 2-metil, 2-etil, 2-isopropil o 2-n-butil) y otros alquilos de la adenina y la guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina, 2-tiocitosina, 5-halouracilo, citosina, 5-propinil uracilo, 5-propinil citosina, 6-azo uracilo, 6-azocitosina, 6-azotimina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-sulfhidrilo, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo (p. ej., 5-bromo), 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina, 7-desazaadenina, 3-desazaguanina y 3-desazaadenina.
En algunas realizaciones, todos o sustancialmente todos los nucleótidos de un agente de ARNi son nucleótidos modificados. Como se usa en el presente documento, un agente de ARNi en donde sustancialmente todos los nucleótidos presentes son nucleótidos modificados es un agente de ARNi que tiene cuatro o menos (es decir, 0, 1, 2, 3 o 4) nucleótidos tanto en la hebra sentido como en la hebra antisentido que son ribonucleótidos. Como se usa en el presente documento, una hebra sentido en donde sustancialmente todos los nucleótidos presentes son nucleótidos modificados es una hebra sentido que tiene dos o menos (es decir, 0, 1 o 2) nucleótidos en la hebra sentido que son ribonucleótidos. Como se usa en el presente documento, una hebra sentido antisentido en donde prácticamente todos los nucleótidos presentes son nucleótidos modificados es una hebra sentido antisentido que tiene dos o menos (es decir, 0, 1 o 2) nucleótidos en la hebra sentido que son ribonucleótidos. En algunas realizaciones, uno o más nucleótidos de un agente de ARNi es un ribonucleótido.
Enlaces internucleosídicos modificados
En algunas realizaciones, uno o más nucleótidos de un agente de ARNi del VHB están unidos por enlaces o cadenas principales no estándar (es decir, enlaces internucleosídicos modificados o cadenas principales modificadas). En algunas realizaciones, un enlace internucleosídico modificado es un enlace internucleosídico covalente que no contiene fosfato. Los enlaces internucleosídicos o cadenas principales modificados incluyen, pero sin limitación, grupos 5'-fosforotioato (representados en el presente documento como una "s" minúscula), fosforotioatos quirales, tiofosfatos, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, alquilfosfonatos (p. ej., fosfonatos de metilo o fosfonatos de 3'-alquileno), fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos (p. ej., 3'-aminofosforamidato, aminoalquilfosforamidatos o tionofosforamidatos), tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, enlaces morfolino, boranofosfatos con enlaces 3'-5' normales, análogos con enlaces 2'-5' de boranofosfatos o boranofosfatos que tienen una polaridad invertida, en donde los pares adyacentes de unidades de nucleósidos están enlazados de 3'-5' a 5'-3' o de 2'-5' a 5'-2'. En algunas realizaciones, un enlace internucleosídico o cadena principal modificado carece de un átomo de fósforo. Los enlaces internucleosídicos modificados que carecen de un átomo de fósforo incluyen, pero sin limitación, enlaces entre azúcares de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces internucleosídicos de heteroátomos mixtos y de alquilo o cicloalquilo o uno o más enlaces entre azúcares heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. En algunas realizaciones, las cadenas principales internucleosídicas modificadas incluyen, pero sin limitación, cadenas principales de siloxano, cadenas principales de sulfuro, cadenas principales de sulfóxido, cadenas principales de sulfona, cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo, cadenas principales de metilen formacetilo y tioformacetilo, cadenas principales que contienen alqueno, cadenas principales de sulfamato, cadenas principales de metilenimino y metilenhidrazino, cadenas principales de sulfonato y sulfonamida, cadenas principales de amida y otras cadenas principales que tienen componentes de N, O, S y CH<2>mixtos.
En algunas realizaciones, una hebra sentido de un agente de ARNi del VHB puede contener 1, 2, 3, 4, 5 o 6 enlaces fosforotioato, una hebra antisentido de un agente de ARNi del VHB puede contener 1, 2, 3, 4, 5 o 6 enlaces fosforotioato, o tanto la hebra sentido como la hebra antisentido pueden contener independientemente 1, 2, 3, 4, 5 o 6 enlaces fosforotioato. En algunas realizaciones, una hebra sentido de un agente de ARNi del VHB puede contener 1, 2, 3 o 4 enlaces fosforotioato, una hebra antisentido de un agente de ARNi del VHB puede contener 1, 2, 3 o 4 enlaces fosforotioato, o tanto la hebra sentido como la hebra antisentido pueden contener independientemente 1,2, 3 o 4 enlaces fosforotioato.
En algunas realizaciones, una hebra sentido del agente de ARNi del VHB contiene al menos dos enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En algunas realizaciones, los al menos dos enlaces internucleosídicos de fosforotioato se encuentran entre los nucleótidos en las posiciones 1-3 del extremo 3' de la hebra sentido. En algunas realizaciones, los al menos dos enlaces internucleosídicos de fosforotioato se encuentran entre los nucleótidos en las posiciones 1-3, 2-4, 3-5, 4-6, 4-5 o 6-8 del extremo 5' de la hebra sentido. En algunas realizaciones, una hebra antisentido del agente de ARNi del VHB contiene cuatro enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En algunas realizaciones, los cuatro enlaces internucleosídicos de fosforotioato están entre los nucleótidos en las posiciones 1-3 desde el extremo 5' de la hebra sentido y entre los nucleótidos en las posiciones 19-21,20-22, 21-23, 22-24, 23-25, o 24-26 desde el extremo 5'. En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB contiene al menos dos enlaces internucleosídicos de fosforotioato en la hebra sentido y tres o cuatro enlaces internucleosídicos de fosforotioato en la hebra antisentido.
En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB contiene uno o más nucleótidos modificados y uno o más enlaces internucleosídicos modificados. En algunas realizaciones, un nucleósido 2'-modificado se combina con un enlace internucleosídico modificado.
Agentes ARNi del VHB
En algunas realizaciones, los agentes de ARNi del VHB divulgados en el presente documento se dirigen a un gen del VHB en las posiciones del genoma del VHB o cerca de ellas que se muestran en la tabla 1 a continuación. En algunas realizaciones, la hebra antisentido de un agente de ARNi del VHB divulgado en el presente documento incluye una secuencia de tramo central que es completamente, sustancial o al menos parcialmente complementaria a una secuencia diana de 19-mero del VHB descrita en la tabla 1.
Tabla 1. Ejemplo de secuencias diana de ADNc de 19-mero del VHB para agentes de ARNi del VHB (tomadas del virus de la hepatitis B (subtipo ADW2), genotipo A, genoma completo GenBank AM282986.1 (SEQ ID NO: 1)).
En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB incluye una hebra antisentido en donde la posición 19 de la hebra antisentido (5 '^3 ') es capaz de formar un par de bases con la posición 1 de una secuencia diana de 19-mero divulgada en la tabla 1. En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB incluye una hebra antisentido en donde la posición 1 de la hebra antisentido (5' ^ 3') es capaz de formar un par de bases con la posición 19 de la secuencia diana de 19-mero divulgada en la tabla 1.
En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB incluye una hebra antisentido en donde la posición 2 de la hebra antisentido (5' ^ 3') es capaz de formar un par de bases con la posición 18 de la secuencia diana de 19-mero divulgada en la tabla 1. En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB incluye una hebra antisentido en donde las posiciones 2 a 18 de la hebra antisentido (5' ^ 3') son capaces de formar pares de bases con cada una de las bases complementarias respectivas situadas en las posiciones 18 a 2 de la secuencia diana de 19-mero divulgada en la tabla 1.
En algunas realizaciones, los agentes de ARNi del VHB incluyen secuencias nucleotídicas de 19-mero centrales que se muestran en la siguiente tabla 2.
Tabla 2.Secuencias del tramo central de la hebra antisentido y de la hebra sentido del agente de ARNi del VHB (N = cualquier nucleótido).
Las hebras sentido y antisentido del agente de ARNi del VHB que comprenden o consisten en las secuencias de nucleótidos de la tabla 2 pueden ser nucleótidos modificados o nucleótidos no modificados. En algunas realizaciones, los agentes de ARNi del VHB que tienen las secuencias de las hebras sentido y antisentido que comprenden o consisten en las secuencias de nucleótidos de la tabla 2 son todos o sustancialmente todos nucleótidos modificados.
En algunas realizaciones, la hebra antisentido de un agente de ARNi del VHB divulgado en el presente documento difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleótidos de cualquiera de las secuencias de la hebra antisentido de la tabla 2. En algunas realizaciones, la hebra sentido de un agente de ARNi del VHB divulgado en el presente documento difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleótidos de cualquiera de las secuencias de la hebra sentido de la tabla 2.
Las secuencias modificadas de la hebra antisentido del agente de ARNi del VHB, así como sus secuencias subyacentes no modificadas, se proporcionan en la tabla 3. Las hebras codificantes del agente de ARNi del VHB, así como sus secuencias subyacentes no modificadas, se proporcionan en la tabla 4. En la formación de los agentes de ARNi del VHB, cada uno de los nucleótidos de cada una de las secuencias no modificadas enumeradas en las tablas 3 y 4 puede ser un nucleótido modificado.
Tal y como se utiliza en el presente documento (incluidas las tablas 3 y 4), se emplean las siguientes notaciones para indicar los nucleótidos modificados, grupos de direccionamiento y grupos enlazadores. Como comprendería fácilmente cualquier persona normalmente versada en la materia, salvo que la secuencia indique lo contrario, que cuando está presente en un oligonucleótido, los monómeros están unidos entre sí por enlaces 5'-3'-fosfodiéster:
A = adenosina-3'-fosfato;
C = citidina-3'-fosfato;
G = guanosina-3'-fosfato;
U = uridina-3'-fosfato
n = cualquier nucleótido modificado con 2'-OMe
a = 2'-O-metiladenosina-3'-fosfato
as = 2'-O-metiladenosina-3'-fosforotioato
c = 2'-O-metilcitidina-3'-fosfato
cs = 2'-O-metilcitidina-3'-fosforotioato
g = 2'-O-metilguanosina-3'-fosfato
gs = 2'-O-metilguanosina-3'-fosforotioato
t = 2'-O-metil-5-metiluridina-3'-fosfato
ts = 2'-O-metil-5-metiluridina-3'-fosforotioato
u = 2'-O-metiluridina-3'-fosfato
us = 2'-O-metiluridina-3'-fosforotioato
Nf = cualquier nucleótido con 2'-fluoro
Af = 2'-fluoroadenosina-3'-fosfato
Afs = 2'-fluoroadenosina-3'-fosforotioato
Cf = 2'-fluorocitidina-3'-fosfato
Cfs = 2'-fluorocitidina-3'-fosforotioato
Gf = 2'-fluoroguanosina-3'-fosfato
Gfs = 2'-fluoroguanosina-3'-fosforotioato
Tf = 2'-fluoro-5-metiluridina-3'-fosfato
Tfs = 2'-fluoro-5-metiluridina-3'-fosforotioato
Uf = 2'-fluorouridina-3'-fosfato
Ufs = 2'-fluorouridina -3'-fosforotioato
dN = cualquier 2'-desoxirribonucleótido
dT = 2'-desoxitimidina-3'-fosfato
Nurra = miméticos de 2',3'-seco nucleótidos (análogos de nucleobase desbloqueados)
N<lna>= nucleótido bloqueado
NfANA = 2'-F-Arabino nucleótido
NM = nucleótido de 2'-metoxietilo
AM = 2'-metoxietiladenosina-3'-fosfato
AMs = 2'-metoxietiladenosina-3'-fosforotioato
TM = 2'-metoxietiltimidina-3'-fosfato
TMs = 2'-metoxietiltimidina-3'-fosforotioato
R = ribitol
(invdN) = cualquier desoxirribonucleótido invertido (nucleótido enlazado en 3'-3')
(invAb) = desoxirribonucleótido abásico invertido (enlazado en 3'-3'), véase la tabla 6
(invAb)s = desoxirribonucleótido-5'-fosforotioato abásico invertido (enlazado en 3'-3'), véase la tabla 6
(invn) = cualquier nucleótido 2'-OMe invertido (nucleótido enlazado en 3'-3')
s = enlace fosforotioato
vpdN = desoxirribonucleótido de fosfonato de vinilo
(5Me-Nf) = 5'-Me, nucleótido de 2'-fluoro
cPrp = fosfonato de ciclopropilo, véase la tabla 6
epTcPr = véase la tabla 6
epTM = véase la tabla 6
Un experto habitual en la materia entenderá fácilmente que el nucleótido terminal en el extremo 3' de una secuencia nucleotídica dada normalmente tendrá un grupo hidroxilo (-OH) en la posición 3' respectiva del monómero concreto en lugar de un resto fosfatoex vivo.Por tanto, por ejemplo, como se ha mostrado anteriormente en la representación de la estructura de AD05070 anterior, el nucleótido modificado "g" en el extremo 3' terminal de la hebra antisentido de AM06606-AS tiene un grupo hidroxilo situado en su posición 3'. Salvo que se indique expresamente lo contrario en el presente documento, dichas interpretaciones de la persona normalmente versada en la materia se usan cuando se describen los agentes de ARNi del VHB y las composiciones de ARNi del VHB divulgadas en el presente documento.
Los grupos de direccionamiento y los grupos enlazadores incluyen los siguientes, cuyas estructuras químicas figuran en la tabla 6: (PAZ), (NAG13), (NAG13)s, (NAG18), (NAG18)s, (NAG24), (NAG24)s, (NAG25), (NAG25)s, (NAG26), (NAG26)s, (NAG27), (NAG27)s, (NAG28), (NAG28)s, (NAG29), (NAG29)s, (NAG30), (NAG30)s, (NAG31), (NAG31)s, (NAG32), (NAG32)s, (NAG33), (NAG33)s, (NAG34), (NAG34)s, (NAG35), (NAG35)s, (NAG36), (NAG36)s, (NAG37), (NAG37)s, (NAG38), (NAG38)s, (NAG39), (NAG39)s. Cada hebra sentido y/o hebra antisentido puede tener cualquiera de los grupos diana o grupos enlazadores enumerados anteriormente, así como otros grupos de direccionamiento o enlazadores, conjugados con el extremo 5' o 3' de la secuencia.
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Los agentes ARNi del VHB descritos en el presente documento se forman hibridando una hebra antisentido con una hebra sentido. Una hebra sentido que contenga una secuencia de las enumeradas en la tabla 4 puede hibridarse con cualquier hebra antisentido que contenga una secuencia de las enumeradas en la tabla 3, siempre que las dos secuencias tengan una región de al menos un 85 % de complementariedad en una secuencia contigua de 16, 17, 18, 19, 20 o 21 nucleótidos.
En algunas realizaciones, la hebra antisentido de un agente de ARNi del VHB divulgado en el presente documento difiere en 0, 1, 2 o 3 nucleótidos de cualquiera de las secuencias de la hebra antisentido de la tabla 3. En algunas realizaciones, la hebra sentido de un agente de ARNi del VHB divulgado en el presente documento difiere en 0, 1, 2 0 3 nucleótidos de cualquiera de las secuencias de la hebra sentido de la tabla 4.
En algunas realizaciones, una hebra antisentido del agente de ARNi del VHB comprende una secuencia de nucleótidos de cualquiera de las secuencias de la tabla 3. En algunas realizaciones, una hebra antisentido del agente de ARNi del VHB comprende la secuencia de nucleótidos (desde el extremo 5' ^ extremo 3') 1-17, 2-17, 1-18, 2-18, 1-19, 2-19, 1 20, 2-20, 1-21, 2-21, 1-22, 2-22, 1-23, 2-23, 1-24, 2-24, 1-25, 2-25, 1-26, o 2-26 de cualquiera de las secuencias de la tabla 3.
En algunas realizaciones, una hebra sentido del agente de ARNi del VHB comprende la secuencia nucleotídica de cualquiera de las secuencias de la tabla 4. En algunas realizaciones, una hebra sentido del agente de ARNi del VHB comprende la secuencia de nucleótidos (desde el extremo 5' ^ extremo 3') 1-17, 2-17, 3-17, 4-17, 1-18, 2-18, 3-18, 4-18, 1-19, 2-19, 3-19, 4-19, 1-20, 2-20, 3-20, 4-20, 1-21, 2-21, 3-21,4-21, 1-22, 2-22, 3-22, 4-22, 1-23, 2-23, 3-23, 4 23, 1-24, 2-24, 3-24, 4-24, 1-25, 2-25, 3-25, 4-25, 1-26, 2-26, 3-26 o 4-26 de cualquiera de las secuencias de la tabla 4.
Para los agentes de ARNi del VHB divulgados en el presente documento, el nucleótido en la posición 1 de la hebra antisentido (desde el extremo 5' ^ extremo 3') puede ser perfectamente complementario a un gen del VHB, o puede ser no complementario a un gen del VHB. En algunas realizaciones, el nucleótido en la posición 1 de la hebra antisentido (desde el extremo 5' ^ extremo 3') es un U, A o dT. En algunas realizaciones, el nucleótido en la posición 1 de la hebra antisentido (desde el extremo 5' ^ extremo 3') forma un par de bases A:U o U:A con la hebra sentido.
En algunas realizaciones, una hebra antisentido del agente de ARNi del VHB comprende la secuencia de nucleótidos (desde el extremo 5' ^ extremo 3') 2-18 o 2-19 de cualquiera de las secuencias de la hebra antisentido de la tabla 3. En algunas realizaciones, una hebra sentido de ARNi del VHB comprende la secuencia de nucleótidos (desde el extremo 5' ^ extremo 3') 1-17 o 1-18 de cualquiera de las secuencias de la hebra sentido de la tabla 4.
En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB incluye (i) una hebra antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos (desde el extremo 5' ^ extremo 3') 2-18 o 2-19 de cualquiera de las secuencias de la hebra antisentido de la tabla 3, y (ii) una hebra sentido que comprende la secuencia de nucleótidos (desde el extremo 5' ^ extremo 3') 1-17 o 1-18 de cualquiera de las secuencias de la hebra sentido de la tabla 4.
Una hebra sentido que contenga una secuencia de las enumeradas en la tabla 4 puede hibridarse con cualquier hebra antisentido que contenga una secuencia de las enumeradas en la tabla 3, siempre que las dos secuencias tengan una región de al menos un 85 % de complementariedad en una secuencia contigua de 16, 17, 18, 19, 20 o 21 nucleótidos. Los emparejamientos de secuencias representativos se ilustran con los números de identificación de dúplex que se muestran en la tabla 5.
En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB comprende cualquiera de los números de identificación de dúplex presentados en el presente documento. En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB consiste en cualquiera de los números de identificación de dúplex presentados en el presente documento. En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB comprende la hebra sentido y/o las secuencias nucleotídicas de la hebra antisentido de cualquiera de los números de identificación de dúplex presentados en el presente documento. En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB comprende las secuencias nucleotídicas de la hebra sentido y de la hebra antisentido de cualquiera de los números de identificación de dúplex presentados en el presente documento y un grupo de direccionamiento y/o un grupo enlazador en donde el grupo de direccionamiento y/o el grupo enlazador está unido covalentemente (es decir, conjugado) a la hebra sentido o a la hebra antisentido. En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB comprende las secuencias nucleotídicas modificadas de la hebra sentido y la hebra antisentido de cualquiera de los números de identificación de dúplex presentados en el presente documento. En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB comprende las secuencias nucleotídicas modificadas de la hebra sentido y la hebra antisentido de cualquiera de los números de identificación de dúplex presentados en el presente documento y un grupo de direccionamiento y/o grupo enlazador en donde el grupo de direccionamiento y/o grupo enlazador está unido covalentemente a la hebra sentido o a la hebra antisentido.
En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido y una hebra sentido que tienen las secuencias de nucleótidos de cualquiera de los dúplex de hebra antisentido/hebra sentido de la tabla 5, y comprende además un grupo de direccionamiento de ligando de receptor de asialoglicoproteína.
En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido y una hebra sentido que tienen las secuencias nucleotídicas de cualquiera de las secuencias nucleotídicas de la hebra antisentido y/o de la hebra sentido de cualquiera de los dúplex de la tabla 5, y comprende además un grupo de direccionamiento seleccionado del grupo que consiste en (PAZ), (NAG13), (NAG13)s, (NAG18), (NAG18)s, (NAG24), (NAG24)s, (NAG25), (NAG25)s, (NAG26), (NAG26)s, (NAG27), (NAG27)s, (NAG28), (NAG28)s, (NAG29), (NAG29)s, (NAG30), (NAG30)s, (NAG31), (NAG31)s, (NAG32), (NAG32)s, (NAG33), (NAG33)s, (NAG34), (NAG34)s, (NAG35), (NAG35)s, (NAG36), (NAG36)s, (NAG37), (NAG37)s.
En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido y una hebra sentido que tienen las secuencias de nucleótidos modificadas de cualquiera de las secuencias de nucleótidos de la hebra antisentido y/o de la hebra sentido de cualquiera de los dúplex de la tabla 5.
En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB comprende una hebra antisentido y una hebra sentido que tienen las secuencias de nucleótidos modificadas de cualquiera de las secuencias de nucleótidos de la hebra antisentido y/o de la hebra sentido de cualquiera de los dúplex de la tabla 5, y comprende además un grupo de direccionamiento al ligando del receptor de asialoglicoproteína.
En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB comprende cualquiera de los dúplex de la tabla 5.
En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB consiste en cualquiera de los dúplex de la tabla 5.
T l .E m l l x n ARNi l VHB.
continuación
continuación
En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB se prepara o se proporciona como una sal, sal mixta, o un ácido libre. Los agentes de ARNi descritos en el presente documento, tras su administración a una célula que expresa un gen del VHB, inhiben o atenúan la expresión de uno o más genes del VHBin vivo.
Grupos de direccionamiento, grupos enlazadores y vehículos de suministro
En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB se conjuga con uno o más grupos no nucleotídicos que incluyen, pero sin limitación, un grupo de direccionamiento, grupo enlazador, polímero de suministro o un vehículo de suministro. El grupo no nucleotídico puede mejorar el direccionamiento, el suministro o la unión del agente de ARNi. En la tabla 6 se ofrecen ejemplos de grupos de direccionamiento y grupos enlazadores. El grupo no nucleotídico puede unirse covalentemente al extremo 3' y/o 5' de la hebra sentido y/o de la hebra antisentido. En algunas realizaciones, un agente de ARNi del VHB contiene un grupo no nucleotídico unido al extremo 3' y/o 5' de la hebra sentido. En algunas realizaciones, un grupo no nucleotídico se une al extremo 5' de una hebra sentido del agente de ARNi del VHB. Un grupo no nucleotídico puede unirse directa o indirectamente al agente de ARNi mediante un enlazador/grupo enlazador. En algunas realizaciones, un grupo no nucleotídico está unido al agente de ARNi mediante un enlace o enlazador lábil, escindible o reversible.
En algunas realizaciones, un grupo no nucleotídico mejora las propiedades farmacocinéticas o de biodistribución de un agente de ARNi o conjugado al que está unido para mejorar la distribución específica en células o tejidos y la captación específica en células del conjugado. En algunas realizaciones, un grupo no nucleotídico mejora la endocitosis del agente de ARNi.
Los grupos de direccionamiento o restos de direccionamiento mejoran las propiedades farmacocinéticas o de biodistribución de un conjugado al que están unidos para mejorar la distribución y la captación celular específica del conjugado. Un grupo de direccionamiento puede ser monovalente, divalente, trivalente, tetravalente o de mayor valencia. Entre los grupos de direccionamiento representativos se incluyen, sin limitación, compuestos con afinidad a la molécula de la superficie celular, ligandos de receptores celulares, haptenos, anticuerpos, anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos y miméticos de anticuerpos con afinidad por moléculas de la superficie celular. En algunas realizaciones, un grupo de direccionamiento está unido a un agente de ARNi mediante un enlazador, tal como un enlazador de PEG o uno, dos o tres grupos abásicos y/o ribitol (ribosa abásica). En algunas realizaciones, un grupo de direccionamiento comprende un grupo derivado de la galactosa.
Los agentes de ARNi del VHB descritos en el presente documento pueden sintetizarse con un grupo reactivo, tal como un grupo amino, en el extremo 5'. El grupo reactivo puede utilizarse para unir posteriormente un resto de direccionamiento utilizando métodos típicos de la técnica.
En algunas realizaciones, un grupo de direccionamiento comprende un ligando del receptor de asialoglicoproteína. En algunas realizaciones, un ligando del receptor de asialoglicoproteína incluye o consiste en uno o más derivados de galactosa. Como se usa en el presente documento, la expresión derivado de la galactosa incluye tanto la galactosa como los derivados de la galactosa que tengan una afinidad por el receptor de la asialoglicoproteína igual o superior a la de la galactosa. Entre los derivados de la galactosa se incluyen, pero sin limitación: galactosa, galactosamina, N-formilgalactosamina, N-acetil-galactosamina, N-propionil-galactosamina, N-n-butanoil-galactosamina y N-isobutanoilgalactosamina (véase, por ejemplo: Iobst, S.T. y Drickamer, K. J.B.C. 1996, 271, 6686). Los derivados de galactosa, y los grupos de derivados de galactosa, que son útiles para el direccionamientoin vivode oligonucleótidos y otras moléculas al hígado son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Baenziger y Fiete, 1980, Cell, 22, 611 620; Connollyet al.,1982, J. Biol. Chem., 257, 939-945). Los derivados de la galactosa se han utilizado para dirigir moléculas a los hepatocitosin vivomediante su unión al receptor de asialoglicoproteína (ASGPr) expresado en la superficie de los hepatocitos. La unión de los ligandos ASGPr a lo(s) ASGPr(s) facilita el direccionamiento celular específico hacia los hepatocitos y la endocitosis de la molécula en los hepatocitos. Los ligandos ASGPr pueden ser monoméricos (p. ej., con un único derivado de galactosa) o multiméricos (p. ej., con múltiples derivados de galactosa). El derivado de galactosa o el grupo de derivados de galactosa pueden unirse al extremo 3' o 5' del polinucleótido de ARNi mediante métodos conocidos en la técnica. La preparación de grupos de direccionamiento, como las agrupaciones de derivados de galactosa, se describe en, por ejemplo, las solicitudes de Patente de Estados Unidos con n.° de serie 15/452.324 y 15/452.423.
Como se usa en el presente documento, un grupo de derivados de galactosa comprende una molécula que tiene de dos a cuatro derivados terminales de galactosa. Un derivado terminal de la galactosa se une a una molécula a través de su carbono C-1. En algunas realizaciones, el grupo de derivados de galactosa es un trímero de derivados de galactosa (también denominado derivado triantenario de galactosa o derivado trivalente de galactosa). En algunas realizaciones, el grupo de derivados de galactosa comprende N-acetil-galactosaminas. En algunas realizaciones, el grupo de derivados de galactosa comprende tres N-acetil-galactosaminas. En algunas realizaciones, el grupo de derivados de galactosa es un tetrámero de derivados de galactosa (también denominado derivado de galactosa tetraantenario o derivado de galactosa tetravalente). En algunas realizaciones, el grupo de derivados de galactosa comprende cuatro N-acetil-galactosaminas.
Como se usa en el presente documento, un trímero de derivados de galactosa contiene tres derivados de galactosa, cada uno unido a un punto de ramificación central. Como se usa en el presente documento, un tetrámero de derivados de galactosa contiene cuatro derivados de galactosa, cada uno unido a un punto de ramificación central. Los derivados de galactosa pueden unirse al punto de ramificación central a través de los carbonos C-1 de los sacáridos. En algunas realizaciones, los derivados de galactosa están unidos al punto de ramificación mediante enlazadores o espaciadores. En algunas realizaciones, el enlazador o espaciador es un espaciador hidrófilo flexible, como un grupo de PEG (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos n.° 5.885.968; Biessenet al.J. Med. Chem. 1995 Vol. 39 p. 1538-1546). En algunas realizaciones, el espaciador de PEG es un espaciador de PEG<3>. El punto de ramificación puede ser cualquier molécula pequeña que permita la unión de tres derivados de galactosa y permita además la unión del punto de ramificación al agente de ARNi. Un ejemplo de grupo de punto de ramificación es una dilisina o un diglutamato. La unión del punto de ramificación al agente de ARNi puede producirse a través de un enlazador o espaciador. En algunas realizaciones, el enlazador o espaciador comprende un espaciador hidrófilo flexible, tal como, pero sin limitación, un espaciador de PEG. En algunas realizaciones, el enlazador comprende un enlazador rígido, tal como un grupo cíclico. En algunas realizaciones, un derivado de galactosa comprende o consiste en N-acetil-galactosamina. En algunas realizaciones, el grupo de derivados de galactosa está compuesto por un tetrámero de derivados de galactosa, que puede ser, por ejemplo, un tetrámero de N-acetil-galactosamina.
En algunas realizaciones, se describen composiciones farmacéuticas para administrar un agente de ARNi del VHB a una célula hepáticain vivo.Dichas composiciones farmacéuticas pueden incluir, por ejemplo, un agente de ARNi del VHB conjugado con un grupo de derivados de galactosa. En algunas realizaciones, el grupo de derivados de galactosa está compuesto por un trímero de derivados de galactosa, que puede ser, por ejemplo, un trímero de N-acetilgalactosamina, o un tetrámero derivado de la galactosa, que puede ser, por ejemplo, un tetrámero de N-acetilgalactosamina.
Entre los grupos de direccionamiento se incluyen, pero sin limitación, (PAZ), (NAG13), (NAG13)s, (NAG18), (NAG18)s, (NAG24), (NAG24)s, (NAG25), (NAG25)s, (NAG26), (NAG26)s, (NAG27), (NAG27)s, (NAG28), (NAG28)s, (NAG29), (NAG29)s, (NAG30), (NAG30)s, (NAG31), (NAG31)s, (NAG32), (NAG32)s, (NAG33), (NAG33)s, (NAG34), (NAG34)s, (NAG35), (NAG35)s, (NAG36), (NAG36)s, (NAG37), (NAG37)s, (NAG38), (NAG38)s, (NAG39) y (NAG39)s. Otros grupos de direccionamiento, incluidos los ligandos dirigidos al grupo de galactosa, se conocen en la técnica.
En algunas realizaciones, se conjuga un grupo enlazador con el agente de ARNi. El grupo enlazador facilita la unión covalente del agente a un grupo de direccionamiento o polímero de suministro o vehículo de suministro. El grupo enlazador puede unirse al extremo 3' o 5' de la hebra sentido o antisentido del agente de ARNi. En algunas realizaciones, el grupo enlazador está unido a la hebra sentido del agente de ARNi. En algunas realizaciones, el grupo enlazador se conjuga con el extremo 5' o 3' de una hebra sentido de un agente de ARNi. En algunas realizaciones, un grupo enlazador se conjuga con el extremo 5' de una hebra sentido del agente de ARNi. Algunos ejemplos de grupos enlazadores, incluyen, pero sin limitación: grupos reactivos como aminas primarias y alquinos, grupos alquilo, nucleósidos abásicos, ribitol (ribosa abásica) y/o grupos PEG.
Un enlazador o grupo enlazador es una conexión entre dos átomos que une un grupo químico (como un agente de ARNi) o segmento de interés a otro grupo químico (como un grupo de direccionamiento o polímero de liberación) o segmento de interés a través de uno o más enlaces covalentes. Un enlace lábil contiene una unión lábil. Un enlace puede incluir opcionalmente un espaciador que aumenta la distancia entre los dos átomos unidos. Un espaciador puede añadir flexibilidad y/o longitud a la conexión. Los espaciadores pueden incluir, pero sin limitación, grupos alquilo, grupos alquenilo, grupos alquinilo, grupos arilo, grupos aralquilo, grupos aralquenilo y grupos aralquinilo; cada uno de los cuales puede contener uno o más heteroátomos, heterociclos, aminoácidos, nucleótidos y sacáridos. Los grupos espaciadores son bien conocidos en la técnica y la lista anterior no pretende limitar el alcance de la descripción.
Cualquiera de las secuencias de nucleótidos del agente de ARNi del VHB que figuran en las tablas 3 y 4, con o sin modificaciones, puede contener un grupo de direccionamiento 3' o 5' y/o un grupo enlazador. Cualquiera de las secuencias de agentes de ARNi del VHB enumeradas en las tablas 3 y 4 que contengan un grupo de direccionamiento 3' o 5' y/o un grupo enlazador, puede como alternativa no contener ningún grupo de direccionamiento y/o grupo enlazador 3' o 5', o puede contener un grupo de direccionamiento y/o grupo enlazador 3' o 5' diferente, lo que incluye, pero sin limitación, los que figuran en la tabla 3. Cualquiera de los dúplex de agentes de ARNi del VHB enumerados en la tabla 5, con o sin modificaciones, puede comprender además un grupo objetivo y/o un grupo enlazador, incluidos, pero sin limitación, los descritos en la tabla 3, y el grupo de direccionamiento o grupo enlazador puede estar unido al extremo 3' o 5' de la hebra sentido o de la hebra antisentido del dúplex del agente de ARNi del VHB.
En la tabla 6 se ofrecen ejemplos de grupos de direccionamiento y grupos enlazadores. La tabla 4 proporciona varias realizaciones de las hebras sentido del agente de ARNi del VHB que tienen un grupo de direccionamiento o un grupo enlazador unido al extremo 5' o 3'.
Ċ
77
�
��
Ċ
80
Ċ
81
Ċ
82
Ċ
83
Ċ
84
Ċ
85
Ċ
86
Ċ
87
Ċ
88
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��
Ċ
90
Ċ
91
Ċ
92
Ċ
93
Ċ
94
Ċ
95
Ċ
96
Ċ
97
Ċ
98
Ċ
99 En cada una de las estructuras anteriores de la tabla 6, NAG comprende una N-acetil-galactosamina u otro ligando ASGPr, como lo entendería un persona normalmente versada en la materia que se adjunta en vista de las estructuras anteriores y la descripción proporcionada en el presente documento. Por ejemplo, en algunas realizaciones, NAG en las estructuras proporcionadas en la tabla 6 está representado por la siguiente estructura:
(N-acetil-galactosamina)
Cada (NAGx) puede estar unido a un agente de ARNi del VHB a través de un grupo fosfato (como en (NAG25), (NAG30), y (NAG31)), o un grupo fosforotioato, (al igual que (NAG25)s, (NAG29)s, (NAG30)s, (NAG31 )s o (NAG37)s), u otro grupo enlazador.
Pueden usarse otros grupos enlazadores conocidos en la técnica.
Vehículos de suministro
En algunas realizaciones, puede utilizarse un vehículo de suministro para administrar un agente de ARNi a una célula o tejido. Un vehículo de suministro es un compuesto que mejora la administración del agente de ARNi a una célula o tejido. Un vehículo de suministro puede incluir, o consistir en, aunque no de forma limitativa, un polímero, tal como un polímero antipático, un polímero activo de membrana, un péptido, un péptido de melitina, un péptido similar a la melitina (MLP), un lípido, un polímero o péptido reversiblemente modificado, o una poliamina activa de membrana reversiblemente modificada.
En algunas realizaciones, los agentes de ARNi pueden combinarse con lípidos, nanopartículas, polímeros, liposomas, micelas, DPC u otros sistemas de suministro disponibles en la técnica. Los agentes de ARNi también pueden conjugarse químicamente con grupos diana, lípidos (incluidos, entre otros, el colesterol y los derivados de colesterilo), nanopartículas, polímeros, liposomas, micelas, DPC (véanse, por ejemplo, los documentos WO 2000/053722, WO 2008/0022309, WO 2011/104169 y WO 2012/083185, WO 2013/032829, WO 2013/158141), u otros sistemas de suministro disponibles en la técnica.
Composiciones y formulaciones farmacéuticas
Los agentes de ARNi del VHB divulgados en el presente documento pueden prepararse como composiciones o formulaciones farmacéuticas. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas incluyen al menos un agente de ARNi del VHB. Estas composiciones farmacéuticas son particularmente útiles en la inhibición de la expresión del ARNm diana en una célula diana, un grupo de células, un tejido o un organismo. Las composiciones farmacéuticas pueden utilizarse para tratar a un sujeto que padezca una enfermedad o trastorno que se beneficiaría de la reducción de la cantidad del ARNm diana, o de la inhibición de la expresión del gen diana. Las composiciones farmacéuticas pueden utilizarse para tratar a un sujeto en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno que se beneficiaría de la reducción de la cantidad del ARNm diana o de una inhibición en la expresión del gen diana. En una realización, el método incluye la administración de un agente ARNi del VHB unido a un ligando de direccionamiento como se describe en el presente documento, a un sujeto a tratar. En algunas realizaciones, uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables (incluidos vehículos, portadores, diluyentes y/o polímeros de suministro) se añaden a las composiciones farmacéuticas que incluyen un agente de ARNi del VHB, formando así una formulación farmacéutica adecuada para la administraciónin vivoa un ser humano.
Las composiciones farmacéuticas que incluyen un agente de ARNi del VHB y los métodos divulgados en el presente documento pueden disminuir la cantidad del ARNm diana en una célula, grupo de células, grupo de células, tejido, o sujeto, lo que incluye: administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de ARNi del VHB descrito en el presente documento, inhibiendo así la expresión de un ARNm diana en el sujeto.
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas que incluyen un agente de ARNi del VHB se utilizan para tratar o controlar las presentaciones clínicas asociadas a la infección por el VHB. En algunas realizaciones, se administra una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de una o más de las composiciones farmacéuticas a un sujeto que necesita dicho tratamiento, prevención o gestión. En algunas realizaciones, la administración de cualquiera de los agentes de ARNi del VHB divulgados puede utilizarse para disminuir el número, la gravedad y/o la frecuencia de los síntomas de una enfermedad en un sujeto.
Las composiciones farmacéuticas descritas que incluyen un agente de ARNi del VHB pueden utilizarse para tratar al menos un síntoma en un sujeto que tenga una enfermedad o trastorno que se beneficiaría de la reducción o inhibición de la expresión del ARNm del v Hb . En algunas realizaciones, se administra al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más composiciones farmacéuticas que incluyen un agente de ARNi del VHB, tratando así el síntoma. En otras realizaciones, se administra al sujeto una cantidad profilácticamente eficaz de uno o más agentes de ARNi del VHB, evitando así al menos un síntoma.
La vía de administración es la vía por la que un agente de ARNi del VHB entra en contacto con el organismo. En general, los métodos de administración de fármacos y ácidos nucleicos para el tratamiento de un mamífero son bien conocidos en la técnica y pueden aplicarse a la administración de las composiciones descritas en el presente documento. Los agentes de ARNi del VHB descritos en el presente documento pueden administrarse por cualquier vía adecuada en una preparación adaptada adecuadamente a la vía concreta. Por tanto, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden administrarse mediante inyección, por ejemplo, intravenosa, intramuscular, intracutánea, subcutánea, intraarticular o intraperitoneal. En algunas realizaciones, en el presente documento se describen composiciones farmacéuticas inyectables por vía subcutánea.
Las composiciones farmacéuticas que incluyen un agente de ARNi del VHB descrito en el presente documento pueden administrarse a una célula, grupo de células, tumor, tejido o sujeto mediante tecnologías de administración de oligonucleótidos conocidas en la técnica. En general, cualquier método adecuado reconocido en la técnica para administrar una molécula de ácido nucleico(in vitrooin vivo)puede adaptarse para su uso con las composiciones descritas en el presente documento. Por ejemplo, el suministro puede ser mediante administración local, (p. ej., inyección directa, implante o administración tópica), administración sistémica o por vía subcutánea, intravenosa, intraperitoneal o parenteral, incluida la administración intracraneal (p. ej., intraventricular, intraparenquimatosa e intratecal), intramuscular, transdérmica, respiratoria (aerosol), nasal, oral, rectal o tópica (incluidas bucal y sublingual). En determinadas realizaciones, las composiciones se administran mediante infusión o inyección subcutánea o intravenosa.
Por consiguiente, en algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden comprender uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden formularse para su administración a un sujeto.
Como se usa en el presente documento, una composición farmacéutica o medicamento incluye una cantidad farmacológicamente eficaz de al menos uno de los compuestos terapéuticos descritos y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Los excipientes farmacéuticamente aceptables (excipientes) son sustancias distintas del principio activo farmacéutico (API, producto terapéutico, p. ej., agente de ARNi del VHB) que se incluyen intencionadamente en el sistema de suministro del fármaco. Los excipientes no ejercen o no están destinados a ejercer un efecto terapéutico a la dosis prevista. Los excipientes pueden actuar para a) ayudar en el procesamiento del sistema de administración del fármaco durante la fabricación, b) proteger, apoyar o mejorar la estabilidad, la biodisponibilidad o la aceptabilidad por el paciente del API, c) ayudar a la identificación del producto, y/o d) mejorar cualquier otro atributo de la seguridad general, la eficacia, del suministro del APO durante la conservación o el uso. Un excipiente farmacéuticamente aceptable puede ser o no una sustancia inerte.
Los excipientes incluyen, pero sin limitación: potenciadores de la absorción, antiadherentes, agentes antiespumantes, antioxidantes, aglutinantes, agentes tampón, portadores, agentes de recubrimiento, colorantes, potenciadores del suministro, polímeros de suministro, dextrano, dextrosa, diluyentes, disgregantes, emulsionantes, extensores, cargas, saporíferos, deslizantes, humectantes, lubricantes, aceites, polímeros, conservantes, solución salina, sales, disolventes, azúcares, agentes de suspensión, matrices de liberación sostenida, edulcorantes, agentes espesantes, agentes de tonicidad, vehículos, agentes hidrófugos y humectantes.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles (en los casos donde sean hidrosolubles) y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe preservarse frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de las dispersiones y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol y cloruro sódico en la composición. Puede lograrse la absorción prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse mediante la incorporación del principio activo en la cantidad requerida en un disolvente adecuado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de filtración esterilizante. En general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación incluyen secado al vacío y liofilización que proporcionan un polvo del compuesto activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución de los mismos previamente sometida a filtración esterilizante.
Las formulaciones adecuadas para la administración intraarticular pueden presentarse en forma de una preparación acuosa estéril del fármaco que puede estar en forma microcristalina, por ejemplo, en forma de una suspensión acuosa microcristalina. También se pueden usar formulaciones liposomales o sistemas poliméricos biodegradables para presentar el principio activo tanto para administración intraarticular como oftálmica.
Los compuestos activos se pueden preparar con portadores que protegerán al compuesto contra la rápida eliminación del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, incluidos implantes y sistemas de administración microencapsulados. Pueden utilizarse polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de dichas formulaciones serán evidentes para los expertos en la materia. También pueden utilizarse suspensiones liposómicas como transportadores farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar según métodos conocidos para los expertos en la materia, por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 4.522.811.
Los agentes de ARNi del VHB pueden formularse en composiciones en formas farmacéuticas unitarias para facilitar la administración y la uniformidad de la dosis. "Forma farmacéutica unitaria" se refiere a unidades físicamente independientes adecuadas como dosis unitarias para los sujetos a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico necesario. La especificación para las formas farmacéuticas unitarias de la divulgación está dictada por y depende directamente de las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico particular que se vaya a lograr y de las limitaciones inherentes en la técnica de formulación de dicho compuesto activo para el tratamiento de individuos.
Una composición farmacéutica puede contener otros componentes adicionales que se encuentran habitualmente en las composiciones farmacéuticas. Dichos componentes adicionales incluyen, pero sin limitación: antipruriginosos, estípticos, anestésicos locales o agentes antiinflamatorios (p. ej., antihistamínicos, difenhidramina, etc.). También se prevé que las células, tejidos u órganos aislados que expresan o comprenden los agentes de ARNi definidos en el presente documento pueden utilizarse como "composiciones farmacéuticas".
Como se usa en el presente documento, "cantidad farmacológicamente eficaz", "cantidad terapéuticamente eficaz", o simplemente "cantidad eficaz" se refiere a aquella cantidad de un agente de ARNi para producir un resultado farmacológico, terapéutico o preventivo.
En general, una cantidad eficaz de un compuesto activo estará en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal/día, p. ej., de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal/día. En algunas realizaciones, una cantidad eficaz de un compuesto activo estará en el intervalo de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal por dosis. En algunas realizaciones, una cantidad eficaz de un principio activo estará en el intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal por dosis. La cantidad administrada también dependerá probablemente de variables como el estado de salud general del paciente, la eficacia biológica relativa del compuesto suministrado, la formulación del medicamento, la presencia y los tipos de excipientes en la formulación, y la vía de administración. Además, debe entenderse que la dosis inicial administrada puede aumentarse por encima del nivel superior mencionado para alcanzar rápidamente el nivel sanguíneo o tisular deseado, o la dosis inicial puede ser inferior a la óptima.
Para el tratamiento de una enfermedad o para la formación de un medicamento o composición para el tratamiento de una enfermedad, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento que incluyen un agente de ARNi del VHB pueden combinarse con un excipiente o con un segundo agente terapéutico o tratamiento lo que incluye, pero sin limitación: un segundo u otro agente de ARNi, un fármaco de molécula pequeña, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo y/o una vacuna.
Los agentes de ARNi del VHB descritos, cuando se añade a excipientes o adyuvantes farmacéuticamente aceptables, pueden empaquetarse en kits, recipientes, envases o dispensadores. Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden envasarse en jeringas precargadas o viales.
Métodos de tratamiento e inhibición de la expresión
Los agentes de ARNi del VHB divulgados en el presente documento pueden utilizarse para tratar a un sujeto (p. ej., un humano o mamífero) que padezca una enfermedad o trastorno que se beneficiaría de la administración del compuesto. En algunas realizaciones, los agentes de ARNi divulgados en el presente documento pueden utilizarse para tratar a un sujeto (p. ej., un ser humano) que padezca una enfermedad o trastorno que se beneficiaría de la reducción o inhibición de la expresión del ARNm del VHB. El sujeto recibe una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más agentes de ARNi. El sujeto puede ser un ser humano, un paciente, o paciente humano. El sujeto puede ser un adulto, adolescente, niño o bebé. Las composiciones farmacéuticas descritas que incluyen un agente de ARNi del VHB pueden utilizarse para proporcionar métodos para el tratamiento terapéutico de enfermedades. Dichos métodos incluyen la administración de una composición farmacéutica descrita en el presente documento a un ser humano o animal.
En algunas realizaciones, los agentes de ARNi del VHB descritos en el presente documento se utilizan para tratar a un sujeto infectado por el VHB. En algunas realizaciones, los agentes de ARNi del VHB descritos se utilizan para tratar al menos un síntoma en un sujeto que tiene una infección por VHB. Al sujeto se le administra una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más de los agentes de ARNi descritos.
En algunas realizaciones, el sujeto tiene a la vez una infección por el VHB y una infección por el VHD. En algunas realizaciones, los agentes de ARNi del VHB descritos en el presente documento se utilizan para tratar a un sujeto infectado tanto por el VHB como por el VHD. En algunas realizaciones, los agentes de ARNi del VHB descritos se utilizan para tratar al menos un síntoma en un sujeto que tiene una infección por el VHB o el VHD. Al sujeto se le administra una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más de los agentes de ARNi descritos.
En algunas realizaciones, los agentes de ARNi del VHB se utilizan para tratar o manejar una presentación clínica en donde un sujeto está infectado con el VHB. Se administra al sujeto una cantidad terapéutica o eficaz de uno o más de los agentes de ARNi del VHB o composiciones que contienen agentes de ARNi del VHB descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el método comprendiendo la administración de una composición que comprende un agente de ARNi del VHB descrito en el presente documento a un sujeto a tratar.
En algunas realizaciones, el nivel de expresión génica y/o la cantidad de ARNm de un gen del VHB en un sujeto al que se administra un agente de ARNi del VHB descrito se reduce al menos en aproximadamente un 5 %, un 10 %, un 15 %, un 20 %, un 25 %, un 30 %, un 35 %, un 40 %, un 45 %, un 50 %, un 55 %, un 60 %, un 65 %, un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 %, o más de un 99 % en relación con el sujeto antes de que se le administrara el agente de ARNi del VHB o con un sujeto que no recibiera el agente de ARNi del VHB. El nivel de expresión génica y/o el nivel de ARNm en el sujeto puede reducirse en una célula, grupo de células y/o tejido del sujeto. En algunas realizaciones, el nivel de proteína expresada de un gen del VHB en un sujeto al que se ha administrado un agente de ARNi del VHB descrito se reduce al menos en aproximadamente un 5 %, un 10 %, un 15 %, un 20 %, un 25 %, un 30 %, un 35 %, un 40 %, un 45 %, un 50 %, un 55 %, un 60 %, un 65 %, un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 %, o más de un 99 % en relación con el sujeto antes de que se le administrara el agente de ARNi del VHB o con un sujeto que no recibiera el agente de ARNi del VHB. El nivel de proteína en el sujeto puede reducirse en una célula, grupo de células, tejido, sangre y/u otros fluidos del sujeto. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la cantidad o el nivel de antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) en un sujeto al que se ha administrado un agente de ARNi del VHB descrito se reduce al menos en aproximadamente un 5 %, un 10 %, un 15 %, un 20 %, un 25 %, un 30 %, un 35 %, un 40 %, un 45 %, un 50 %, un 55 %, un 60 %, un 65 %, un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 %, o más de un 99 % en relación con el sujeto antes de que se le administrara el agente de ARNi del VHB o con un sujeto que no recibiera el agente de ARNi del VHB. En algunas realizaciones, la cantidad o el nivel de antígeno-e de la hepatitis B (HBeAg) en un sujeto al que se ha administrado un agente de ARNi del VHB descrito se reduce al menos en aproximadamente un 5 %, un 10 %, un 15 %, un 20 %, un 25 %, un 30 %, un 35 %, un 40 %, un 45 %, un 50 %, un 55 %, un 60 %, un 65 %, un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 %, o más de un 99 % en relación con el sujeto antes de que se le administrara el agente de ARNi del VHB o con un sujeto que no recibiera el agente de ARNi del VHB. En algunas realizaciones, la cantidad o el nivel de ADN del VHB sérico en un sujeto al que se ha administrado un agente de ARNi del VHB descrito se reduce al menos en aproximadamente un 5 %, un 10 %, un 15 %, un 20 %, un 25 %, un 30 %, un 35 %, un 40 %, un 45 %, un 50 %, un 55 %, un 60 %, un 65 %, un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 %, o más de un 99 % en relación con el sujeto antes de que se le administrara el agente de ARNi del VHB o con un sujeto que no recibiera el agente de ARNi del VHB. Una reducción de la presencia de ADN del VHB en suero, expresión génica del VHB, las cantidades o niveles de ARNm del VHB o de proteína del VHB pueden evaluarse mediante métodos conocidos en la técnica. La reducción o disminución de la cantidad o nivel de ARNm del VHB, la cantidad o nivel de proteína expresada, y/o la cantidad o nivel de ADN del VHB en suero, se denominan colectivamente en el presente documento reducción o disminución del VHB o inhibición o reducción de la expresión del VHB.
Células y tejidos y organismos no humanos
Se contemplan células, tejidos y organismos no humanos que incluyan al menos uno de los agentes ARNi del VHB descritos en el presente documento. La célula, tejido u organismo no humano se fabrica administrando el agente de ARNi a la célula, tejido u organismo no humano.
Las realizaciones y elementos anteriormente proporcionados se ilustran a continuación con los siguientes ejemplos no limitativos.
Ejemplos
Ejemplo 1. Síntesis de agentes de ARNi del VHB.
Los dúplex del agente de ARNi del VHB que se muestran en la tabla 5 se sintetizaron según lo siguiente:
A.Síntesis.Las hebras sentido y antisentido de los agentes de ARNi del VHB se sintetizaron según la tecnología de fosforamidita en fase sólida utilizada en la síntesis de oligonucleótidos. Según la escala, se utilizó un MerMade96E® (Bioautomation), un MerMade12® (Bioautomation) o un OP Pilot 100 (GE Healthcare). Las síntesis se realizaron sobre un soporte sólido de vidrio de poro controlado (CPG, 500 A o 600 A, obtenidos de Prime Synthesis, Aston, PA, EE. UU.). Todos los ARN y las fosforamiditas modificadas en 2' se adquirieron de Thermo Fisher Scientific (Milwaukee, WI, EE. UU.). Específicamente, se utilizaron las siguientes 2'-O-metilfosforamiditas: (5'-O-dimetoxitritil-N6-(benzoil)-2'-O-metil-adenosina-3'-O-(2-cianoetil-N,N-diisopropilamino) fosforamidita, 5'-O-dimetoxi-tritil-N4-(acetil)-2'-O-metil-citidina-3'-O-(2-cianoetil-N,N-diisopropil-amino) fosforamidita, (5'-O-dimetoxitritil-N2-(isobutiril)-2'-O-metil-guanosina-3'-O-(2-cianoetil-N,N-diisopropilamino) fosforamidita, y 5'-O-dimetoxitritil-2'-O-metil-uridina-3'-O-(2-cianoetil-N,N-diisopropilamino) fosforamidita. Las 2'-desoxi-2'-fluorofosforamiditas llevaban los mismos grupos protectores que las 2'-O-metil amiditas. Las fosforamiditas abásicas (3'-O-dimetoxitritil-2'-desoxirribosa-5'-O-(2-cianoetil-N,N-diisopropilamino) se adquirieron de ChemGenes (Wilmington, MA, EE. UU.). Los ligandos diana que contenían fosforamiditas se disolvieron en diclorometano anhidro o acetonitrilo anhidro (50 mM), mientras que el resto de amiditas se disolvieron en acetonitrilo anhidro (50 mM) y se añadieron tamices moleculares (3 A). Como solución activadora se utilizó 5-benciltio-1H-tetrazol (BTT, 250 mM en acetonitrilo) o 5-etiltio-1 H-tetrazol (ETT, 250 mM en acetonitrilo). Los tiempos de acoplamiento fueron de 12 min (ARN), 15 min (ligando de direccionamiento), 90 s (2'OMe), y 60 s (2'F). Para introducir enlaces fosforotioato, se empleó una solución 100 mM de 3-fenil 1,2,4-ditiazolina-5-ona (POS, obtenida de PolyOrg, Inc., Leominster, MA, EE. UU.) en acetonitrilo anhidro.
B. Escisión y desprotección del oligómero unido al soporte.Una vez finalizada la síntesis en fase sólida, el soporte sólido seco se trató con una solución 1:1 en volumen de metilamina al 40 % en peso en agua y solución de hidróxido de amonio al 28 % (Aldrich) durante 1,5 horas a 30 °C. La solución se evaporó y el residuo sólido se reconstituyó en agua (véase más adelante).
C. Purificación.Los oligómeros en bruto se purificaron mediante HPLC de intercambio aniónico utilizando una columna TSKgel SuperQ-5PW de 13 pm y un sistema LC-8 de Shimadzu. El tampón A era Tris 20 mM, EDTA 5 mM, pH 9,0 y contenía un 20 % de acetonitrilo y el tampón B era el mismo que el tampón A con la adición de cloruro sódico 1,5 M. Se registraron los trazados UV a 260 nm. Se agruparon las fracciones adecuadas y se sometieron a HPLC de exclusión por tamaño molecular utilizando una columna GE Healthcare XK 26/40 empaquetada con Sephadex G-25 fino con un tampón de funcionamiento de agua desionizada filtrada o bicarbonato amónico 100 mM, pH 6,7 y acetonitrilo al 20 %.
D. Hibridación.Las hebras complementarias se mezclaron combinando soluciones equimolares de ARN (sentido y antisentido) en solución salina tamponada con fosfato 1* (Corning, Cellgro) para formar los agentes de ARNi. Algunos agentes de ARNi se liofilizaron y almacenaron a entre -15 y -25 °C. La concentración de dúplex se determinó midiendo la absorbancia de la solución en un espectrómetro UV-Vis en solución salina tamponada con fosfato 1*. A continuación, la absorbancia de la solución a 260 nm se multiplicó por un factor de conversión y el factor de dilución para determinar la concentración de dúplex. Salvo que se especifique lo contrario, todo el factor de conversión fue de 0,037 mg/(mlcm). Para algunos experimentos, se calculó un factor de conversión a partir de un coeficiente de extinción determinado experimentalmente.
Ejemplo 2. Ratones modelo de pHBV.
Se transfectaron transitoriamentein vivoratones hembra NOD.CB17-Prkdscid/NcrCrl (NOD-SCID) de seis a ocho semanas de edad con MC-HBV1.3 mediante inyección hidrodinámica en la vena caudal (Yang PLet al."Hydrodynamic injection of viral DNA: a mouse model of acute hepatitis B virus infection", PNAS USA 2002 Vol. 99: p. 13825-13830), administrado entre 30 y 45 días antes de la administración de un agente de ARNi del VHB o control. MC-HBV1.3 es un minicírculo derivado de plásmido que contiene la misma secuencia de HBV1.3 del virus de la hepatitis B humana terminalmente redundante que en el plásmido pHBV1.3 y en los ratones transgénicos HBV1.3.32 (n.° de acceso de GenBank V01460) (Guidotti LGet al.,"High-level hepatitis B virus replication in transgenic mice", J Virol 1995 Vol. 69, p6158-6169). Se inyectaron 5 o 10 |jg de MC-HBV1.3 en solución de Ringer en un volumen total del 10 % del peso corporal del animal en ratones a través de la vena caudal para crear el modelo pHBV de infección crónica por VHB. La solución se inyectó a través de una aguja de calibre 27 en 5-7 segundos como se describió previamente (Zhang Get al.,"High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injection of naked plasmid DNA" Human Gene Therapy 1999 Vol. 10, p1735-1737). Antes de la dosis (ya sea el día 1 antes de la dosis, el día -1 o el día -2), se midieron los niveles de expresión del antígeno de la superficie de la hepatitis B (HBsAg) en suero mediante ELISA y los ratones se agruparon según los niveles promedio de expresión del HBsAg.
Análisis:En varias ocasiones, antes y después de la administración de agentes de ARNi del VHB, puede medirse el HBsAg sérico, el HBeAg sérico, el ADN del VHB sérico o el ARN del VHB hepático. Los niveles de expresión del VHB se normalizaron con respecto a los niveles de expresión previos a la administración y con respecto a los ratones de control a los que se inyectó solución salina tamponada con fosfato ("PBS").
i) Recogida de suero:Se anestesió a los ratones con isoflurano al 2-3 % y se recogieron muestras de sangre de la zona submandibular en tubos de separación de suero (Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Alemania). La sangre se dejó coagular a temperatura ambiente durante 20 min. Los tubos se centrifugaron a 8.000 x g durante 3 min para separar el suero y se almacenaron a 4 °C.
ii) Niveles séricos del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg):Se recogió el suero y se diluyó de 10 a 8000 veces en PBS con un 5 % de leche en polvo desnatada. Los patrones secundarios del HBsAg diluidos en la solución de leche desnatada se prepararon a partir de suero de ratones ICR (Harlan Sprague Dawley) que habían sido transfectados con 10 jg del plásmido pRc/CMV-HBs que expresa HBsAg (Aldevron, Fargo, ND). Los niveles de HBsAg se determinaron con un kit GS HBsAg EIA 3.0 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Redmond, WA) según las indicaciones del fabricante. Como patrón primario se utilizó la proteína HBsAg recombinante, subtipo ayw, también diluida en leche desnatada en PBS (Aldevron).
La expresión de HBsAg de cada animal se normalizó con respecto al grupo de control de ratones a los que se inyectó PBS para tener en cuenta la disminución de la expresión de MC-HBV1.3 no relacionada con el tratamiento. En primer lugar, el nivel de HBsAg de cada animal en un punto temporal se dividió por el nivel de expresión previo al tratamiento en ese animal para determinar la proporción de expresión "normalizada con respecto a antes del tratamiento". A continuación, se normalizó la expresión en un punto temporal específico con respecto al grupo de control dividiendo el cociente "normalizado con respecto a antes del tratamiento" de un animal individual por el cociente medio "normalizado con respecto a antes del tratamiento" de todos los ratones del grupo de control de PBS normal.
iii) Niveles séricos del antígeno e de la hepatitis B (HBeAg):El análisis del HBeAg se realizó con el ensayo inmunoenzimático (ELISA) de HBeAg descrito por el fabricante (DiaSorin) utilizando suero diluido de 4 a 20 veces en leche desnatada al 5 %. La cantidad de antígeno se determinó en el intervalo lineal del ensayo y se cuantificó frente a patrones de proteína HBeAg (Fitzgerald Industries International, n.° de catálogo 30-AH18, Acton, MA).
La expresión de HBeAg de cada animal se normalizó con respecto al grupo de control de ratones a los que se inyectó PBS para tener en cuenta la disminución de la expresión de MC-HBV1.3 no relacionada con el tratamiento. Para la evaluación de HBeAg en suero, el HBeAg se analiza a partir de muestras de suero de grupos o subgrupos. En primer lugar, el nivel de HBeAg de cada grupo o subgrupo agrupado se dividió por el nivel de expresión previo al tratamiento en el mismo grupo o subgrupo para determinar la proporción de expresión "normalizada con respecto a antes del tratamiento". A continuación, la expresión en un punto temporal específico se normalizó con respecto al grupo de control dividiendo el cociente "normalizado con respecto a antes del tratamiento" de un grupo o subgrupo por el cociente medio "normalizado con respecto a antes del tratamiento" de todas las muestras del grupo de control de PBS normal.
iv) Niveles séricos de ADN del VHB:Se mezclaron volúmenes iguales de suero de ratones de un grupo o subgrupo hasta un volumen final de 100 jl. El ADN se aisló a partir de muestras de suero utilizando el kit QIAamp MinElute Virus Spin Kit (Qiagen, Valencia, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se añadió solución salina estéril al 0,9 % a cada muestra hasta un volumen final de 200 jl. Las muestras de suero se añadieron a tubos que contenían tampón y proteasa. Se añadió ARN portador para facilitar el aislamiento de pequeñas cantidades de ADN. Se añadió 1 ng de ADN plásmido pHCR/UbC-SEAP (Wooddell CI,et al."Long-term R<n>A interference from optimized siRNA expression constructs in adult mice". Biochem Biophys Res Commun (2005) 334, 117-127) como control de recuperación. Tras incubar 15 min a 56 °C, los ácidos nucleicos se precipitaron de los lisados con etanol y toda la solución se aplicó a una columna. Después del lavado, las muestras se eluyeron en un volumen de 50 pl de tampón AVE.
El número de copias de genomas del VHB en el ADN aislado del suero del modelo de ratón pHBV se determinó mediante qPCR. El plásmido pSEAP-HBV353-777, que codifica un segmento corto del genoma del VHB dentro del gen S (bases 353-777 del acceso al GenBank #V01460), se utilizó para crear una curva patrón de seis logaritmos. Se omitieron las muestras con una recuperación de ADN inferior a 2 desviaciones estándar de la media, basada en la detección de pHCR'UbC-SEAP. Se utilizan cebadores y sondas basados en la química TaqMan con fluor/ZEN/IBFQ.
Los ensayos qPCR se realizaron en un sistema de PCR en tiempo real 7500 Fast o StepOne Plus (Life Technologies). Para la evaluación del ADN del VHB en suero, el ADN se aisló a partir de pasos de purificación únicos o duplicados de muestras de suero de grupos agrupados. Las cuantificaciones del ADN del VHB y del plásmido de control de recuperación se determinaron mediante reacciones qPCR realizadas por triplicado. En cada reacción se incluyeron las sondas para cuantificar el VHB y pHCR/UbC-SEAP.
Ejemplo 3.Agentes de ARNi del VHB en ratones modelo pHBV.
Se utilizó el modelo de ratón pHBV descrito en el ejemplo 2 anterior. El día 1, a cada ratón se le administró una única inyección subcutánea de 200 pl que contenían 2 mg/kg (mpk) de un agente de ARNi del VHB formulado en solución salina tamponada con fosfato ("PBS"), o 200 pl de solución salina tamponada con fosfato sin un agente de ARNi del VHB, que se usará como control. Cada uno de los agentes de ARNi del VHB incluía ligandos de N-acetil-galactosamina conjugados con el extremo 5'-terminal de la hebra sentido, como se muestra en las tablas 4 y 5. Los agentes de ARNi del VHB probados incluían los que tenían los números dúplex mostrados en la tabla 7, a continuación. Las inyecciones se realizaron entre la piel y el músculo (es decir, inyecciones subcutáneas) en la piel flácida de la zona del cuello y los hombros. Se analizaron tres (3) ratones de cada grupo (n = 3).
Se recogió suero el día 8, el día 15, el día 22 y el día 29, y se determinaron los niveles séricos del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) de acuerdo con el procedimiento establecido en el ejemplo 2, anterior. Los datos del experimento se muestran en la siguiente tabla:
Tabla 7. Niveles medios de HBsAg normalizados con respecto a antes del tratamiento y al control de PBS en ratones pHBV tras la administración de agentes de ARNi del VHB del ejemplo 3 (desviación estándar reflejada como
-
Cada uno de los agentes de ARNi AD04178, AD04579, AD04580, AD04570, AD04572, AD04573, AD04574, AD04575, AD04419 y AD04578 se diseñaron para tener secuencias de cadena antisentido al menos parcialmente complementarias al marco de lectura abierto X en las posiciones 1781-1789 del genoma del VHB que se muestran en las tablas 1 y 2 anteriores. Cada uno de los agentes de ARNi del VHB mostró una reducción sustancial del HBsAg en comparación con el control de PBS en todos los puntos temporales medidos. Por ejemplo, AD04580 mostró una reducción superior al 95 % en los niveles de antígeno s en el día 8 (0,048 ± 0,007 nivel de HBsAg) cuando se normalizó con respecto a antes del tratamiento y al control con PBS.
Adicionalmente, se determinaron los niveles séricos de ADN del VHB para los grupos de PBS, AD04579 y AD04580 a partir de muestras de suero recogidas los días 8, 15, 22, 29, 36, 43 y 50, según el procedimiento descrito en el ejemplo 2, anterior. Se mezcló el suero de cada grupo y se aisló el ADN del suero por duplicado. Los resultados se presentan en la siguiente tabla.
Tabla 8. Niveles medios de ADN del VHB en suero normalizados con respecto a antes del tratamiento y al control con PBS en ratones pHBV tras la administración de agentes de ARNi del VHB del ejemplo 3 (desviación estándar reflejada como (+/-)).
Los datos de la tabla 8 indican que ambos agentes de ARNi examinados proporcionaron una reducción sustancial de los niveles de ADN del VHB en comparación con el grupo de PBS, con AD04580 logrando una reducción ligeramente superior a 1 log en la concentración mínima (p. ej., 0,0869 ± 0,0117 nivel medio de ADN en suero el día 15).
Ejemplo 4.Agentes de ARNi del VHB en ratones modelo pHBV.
Se utilizó el modelo de ratón pHBV descrito en el ejemplo 2 anterior. El día 1, cada ratón recibió una única administración subcutánea de 200 pl que contenían 2 mg/kg (mpk) de un agente de ARNi del VHB formulado en solución salina tamponada con fosfato, o 200 pl de solución salina tamponada con fosfato sin un agente de ARNi del VHB para ser utilizado como control. Cada uno de los agentes de ARNi del VHB incluía ligandos de N-acetilgalactosamina conjugados con el extremo 5'-terminal de la hebra sentido, como se muestra en las tablas 4 y 5. Los agentes de ARNi del VHB administrados incluyeron los enumerados en la tabla 9, a continuación. Las inyecciones se realizaron entre la piel y el músculo (es decir, inyecciones subcutáneas) en la piel flácida de la zona del cuello y los hombros. Se analizaron tres (3) ratones de cada grupo (n = 3).
Se recogió suero el día 8, el día 15, el día 22 y el día 29, y se determinaron los niveles séricos del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) de acuerdo con el procedimiento establecido en el ejemplo 2, anterior. Los datos del experimento se muestran en la siguiente tabla:
Tabla 9. Niveles medios de HBsAg normalizados con respecto a antes del tratamiento y al control de PBS en ratones pHBV tras la administración de agentes de ARNi del VHB del ejemplo 4 (desviación estándar reflejada como
-
Cada uno de los agentes de ARNi AD04010, AD04581, AD04591, AD04434, AD04583, AD04584, AD04585, AD04586, AD04588 y AD04438 se diseñaron para que tengan secuencias de hebra antisentido que sean al menos parcialmente complementarias al marco de lectura abierto S en las posiciones 257-275 del genoma del VHB, como se muestra en las tablas 1 y 2. Los agentes de ARNi del VHB que se muestran en la tabla 9, directamente anterior, mostraron una reducción sustancial del HBsAg en comparación con el control de PBS en todos los puntos temporales medidos. Por ejemplo, AD04585 mostró una reducción de aproximadamente el 90 % de HBsAg en el día 8, una reducción del 95 % en el día 15, una reducción del 97 % en el día 22, y una reducción del 95 % en el día 29.
Adicionalmente, se determinaron los niveles séricos de ADN del VHB para los grupos de PBS y AD04585 a partir de muestras de suero recogidas los días 8, 15, 22, 29, 36, 43 y 50, según el procedimiento descrito en el ejemplo 2, anterior. Se mezcló el suero de cada grupo y se aisló el ADN del suero por duplicado. Los resultados se presentan en la siguiente tabla.
Tabla 10. Niveles medios de ADN del VHB en suero normalizados con respecto a antes del tratamiento y al control con PBS en ratones pHBV tras la administración de agentes de ARNi del VHB del ejemplo 4 (desviación estándar r fl m - .
Los datos de la tabla 10 indican que el agente de ARNi del VHB AD04585 proporcionó una reducción de los niveles de ADN del VHB en comparación con el grupo de PBS.
Ejemplo 5.Respuesta a la dosis y combinaciones de agentes de ARNi del VHB en ratones modelo pHBV.
Se utilizó el modelo de ratón pHBV descrito en el ejemplo 2 anterior. Los ratones se dividieron en varios grupos, incluidos los que figuran en la tabla 11, a continuación, y los ratones recibieron inyecciones subcutáneas de 200 pl según la pauta posológica establecida en la tabla 11:
T l 11.r ^ ifi i n r n HBV r l m l .
A cada ratón se le administró por vía subcutánea 200 pl que contenían la cantidad de agente(s) de ARNi del VHB formulado(s) en solución salina tamponada con fosfato, o 200 pl de solución salina tamponada con fosfato sin agente de ARNi del VHB, como se expone en la tabla 11. Cada uno de los agentes de ARNi del VHB incluía ligandos de N-acetil-galactosamina conjugados con el extremo 5'-terminal de la hebra sentido, como se muestra en las tablas 4 y 5. Las inyecciones se realizaron entre la piel y el músculo (es decir, inyecciones subcutáneas) en la piel flácida de la zona del cuello y los hombros. Se analizaron tres (3) ratones de cada grupo (n = 3).
Se recogió suero el día 8, el día 15, el día 22, el día 29, el día 36, el día 43, el día 50 y el día 57, y se determinaron los niveles séricos del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) de acuerdo con el procedimiento establecido en el ejemplo 2, anterior. Los datos del experimento se muestran en la siguiente tabla:
Tabla 12.Niveles medios de HBsAg normalizados con respecto a antes del tratamiento y al control de PBS en ratones pHBV tras la administración de agentes de ARNi del VHB del ejemplo 5 (desviación estándar reflejada como
-
Los agentes de ARNi del VHB AD04580 y AD04585 mostraron individualmente una reducción del HBsAg en comparación con el control de PBS en todos los puntos temporales medidos. Además, el tratamiento combinado de AD04585 y AD04580, que, como se indica en los ejemplos anteriores, se dirigen a diferentes regiones del genoma del VHB, también mostraron una reducción del HBsAg en comparación con el control de PBS en todos los puntos temporales medidos.
Adicionalmente, se determinaron los niveles de ADN del VHB de cada uno de los grupos en la tabla 11 a partir de muestras de suero recogidas en los días 8, 15, 22, 29 y 36, según el procedimiento descrito en el ejemplo 2, anterior. Se mezcló el suero de cada grupo y se aisló el ADN del suero en reacciones duplicadas. Los resultados se presentan en la siguiente tabla.
Tabla 13. Niveles medios de ADN del VHB en suero normalizados con respecto a antes del tratamiento y al control con PBS en ratones pHBV tras la administración de agentes de ARNi del VHB del ejemplo 5 (desviación estándar r fl m - .
Los datos de la tabla 13 indican que los agentes de ARNi examinados, tanto individualmente como en combinación, proporcionaron una reducción de los niveles de ADN del VHB en comparación con el grupo de PBS. La repetición de la dosis o el aumento de la dosis produjeron reducciones adicionales del ADN del VHB.
Ejemplo 6.Agentes de ARNi del VHB en ratones pHBV: estudios de dosis-respuesta y de combinación.Se utilizó el modelo de ratón pHBV descrito en el ejemplo 2 anterior. Los ratones se dividieron en varios grupos según se indica en la tabla 14, a continuación, y a cada ratón se le administró una única inyección subcutánea de 200 pl de acuerdo con la pauta posológica establecida en la tabla 14:
Ta l 14. r ifi i n r n HBV r l m l 6.
g/kg de AD04963
/kg de AD04872 Inyección única el día 1 g/kg de AD04981
A cada ratón se le administró por vía subcutánea 200 pl que contenían la cantidad de agente(s) de ARNi del VHB formulado(s) en solución salina tamponada con fosfato, o 200 pl de solución salina tamponada con fosfato sin agente de ARNi del VHB, como se expone en la tabla 14. Cada uno de los agentes de ARNi del VHB incluía ligandos de N-acetil-galactosamina conjugados con el extremo 5'-terminal de la hebra sentido, como se muestra en las tablas 4 y 5. Las inyecciones se realizaron entre la piel y el músculo (es decir, inyecciones subcutáneas) en la piel flácida de la zona del cuello y los hombros. Se analizaron tres (3) ratones de cada grupo (n = 3).
Se recogió suero el día -1 antes de la administración, y luego el día 8, el día 15, el día 22, el día 29 y el día 36, y se determinaron los niveles séricos de HBsAg de acuerdo con el procedimiento establecido en el ejemplo 2, anterior. Los datos del experimento se muestran en la tabla 15 a continuación, y el HBsAg promedio refleja el valor promedio normalizado del HBsAg:
Tabla 15.Niveles medios de HBsAg normalizados con respecto a antes del tratamiento y al control de PBS en ratones pHBV tras la administración de agentes de ARNi del VHB del ejemplo 6 (desviación estándar reflejada como
-
Los agentes de ARNi del VHB probados mostraron una reducción del HBsAg en comparación con el control de PBS en todos los puntos temporales medidos. Además, el tratamiento combinado de AD04872 (que incluye una secuencia de hebra antisentido que es al menos parcialmente complementaria al ORF S en las posiciones 261-279 del genoma del VHB, como se muestra en las tablas 1 y 2) y AD04981 o AD04963 (ambas incluyen secuencias de hebra antisentido que son al menos parcialmente complementarias al ORF X en las posiciones 1781-1799 del genoma del VHB, como se indica en las tablas 1 y 2), que se muestran en los Grupos H, I y J del ejemplo 6, ilustran que el tratamiento combinado de dos agentes de<a>R<ní>de direccionamiento, uno de ellos dirigido al ORF S y el otro al ORF X del genoma del VHB, mostraron una reducción similar del HBsAg en comparación con el control de PBS en todos los puntos temporales medidos.
Adicionalmente, también se evaluaron los niveles séricos del antígeno e de la hepatitis B (HBeAg). Las muestras de los ratones de cada grupo respectivo se mezclaron primero y las muestras de suero resultantes se analizaron de manera individual. Los datos del experimento se muestran en la siguiente tabla:
Tabla 16.Niveles medios de HBeAg normalizados con respecto a antes del tratamiento y al control de PBS en ratones pHBV tras la administración de los a entes de ARNi del VHB del ejemplo 6.
Tal como se muestra en la tabla 16, la combinación de AD04872 (dirigido al ORF S del genoma del VHB) con AD04981 o AD04963 (ambos dirigidos al ORF X del genoma del VHB), mostraron una reducción adicional de los niveles de HBeAg en relación con la administración de AD04872 solo.
Ejemplo 7.Agentes de ARNi del VHB en ratones pHBV: estudios adicionales de dosis-respuesta y de combinación.
Se utilizó el modelo de ratón pHBV descrito en el ejemplo 2 anterior. Los ratones se dividieron en varios grupos según se indica en la tabla 17, a continuación, y a cada ratón se le administró una única inyección subcutánea de 200 pl de acuerdo con la pauta posológica establecida en la tabla 17:
Tabla 17.Grupos de dosificación de ratones pHBV para el ejemplo 7.
Grupo Agente de ARNi y dosis Pauta posológica
PBS (sin agente de ARNi) Inyección única el día 1
4,0 mg/kg de AD04776 Inyección única el día 1
1,0 mg/kg de AD04982 Inyección única el día 1
2,0 mg/kg de AD04982 Inyección única el día 1
1,0 mg/kg de AD04776 Inyección única el día 1
2,0 mg/kg de AD04776 Inyección única el día 1
3,0 mg/kg de AD04872 Inyección única el día 1
3,0 mg/kg de AD04872 Inyección única el día 1
1,0 mg/kg de AD04982
3,0 mg/kg de AD04872 Inyección única el día 1
2,0 mg/kg de AD04982
A cada ratón se le administró por vía subcutánea 200 pl que contenían la cantidad de agente(s) de ARNi del VHB formulado(s) en solución salina tamponada con fosfato, o 200 pl de solución salina tamponada con fosfato sin agente de ARNi del VHB, como se expone en la tabla 17. Cada uno de los agentes de ARNi del VHB incluía ligandos de N-acetil-galactosamina conjugados con el extremo 5 '-terminal de la hebra sentido, como se muestra en las tablas 4 y 5. Las inyecciones se realizaron entre la piel y el músculo (es decir, inyecciones subcutáneas) en la piel flácida de la zona del cuello y los hombros. Se analizaron cuatro (4) ratones de cada grupo en el día -1 y en el día 8 (n = 4), y después se sacrificó a un ratón por grupo para la evaluación histológica. Se analizaron tres (3) ratones de cada grupo el día 22 y el día 29 (n = 3).
Se recogió suero el día -1 antes de la administración, y luego el día 8, el día 15, el día 22 y el día 29, y se determinaron los niveles séricos del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) de acuerdo con el procedimiento establecido en el ejemplo 2, anterior. Los datos del experimento se muestran en la tabla 18 a continuación:
Tabla 18.Niveles medios de HBsAg normalizados con respecto a antes del tratamiento (día -1) y al control de PBS en ratones pHBV tras la administración de agentes de ARNi del VHB del ejemplo 7 (desviación estándar reflejada como /- .
Los agentes de ARNi del VHB probados mostraron una reducción del HBsAg en comparación con el control de PBS en todos los puntos temporales medidos.
Adicionalmente, también se evaluaron los niveles séricos del antígeno e de la hepatitis B (HBeAg). Las muestras de los ratones de cada grupo respectivo se mezclaron primero y las muestras de suero resultantes se analizaron de manera individual. Los datos del experimento se muestran en la siguiente tabla:
Tabla 19.Niveles medios de HBeAg normalizados con respecto a antes del tratamiento y al control de PBS en ratones pHBV tras la administración de los agentes de ARNi del VHB del ejemplo 7.
Tabla 19-1.Múltiplo promedio de atenuación del HBeAg normalizado a antes del tratamiento y al control de PBS en r n HBV^ l mini r i n n ARNi l VHB l m l 7.
La tabla 19-1 refleja el porcentaje de atenuación del HBeAg en comparación con el control, que se calcula como el nivel normalizado de HBeAg del grupo de control (PBS)/nivel normalizado de HBeAg del grupo del agente o agentes de ARNi respectivos (es decir, 1,000/nivel de HBeAg). Los datos de la tabla 19-1 indican que la combinación de AD04872 (que, como se ha indicado anteriormente, incluye una secuencia de hebra antisentido que es al menos parcialmente complementaria al ORF S en las posiciones 261-279 del genoma del VHB) con AD04982 (que incluye una secuencia de hebra antisentido que es al menos parcialmente complementaria al ORF X en las posiciones 1781 1799 del genoma del VHB), mostró una reducción adicional de los niveles de HBeAg en relación con la administración de los agentes individuales de ARNi solos (véanse, p. ej., las tablas 19 y 19-1 para los grupos H e I). Además, los datos de este ejemplo también muestran que la combinación de AD04872 con AD04982 dio lugar a un múltiplo de disminución del HBeAg superior a la suma del múltiplo de disminución del HBeAg en AD04872 y AD04982 administrados individualmente. Por ejemplo, El grupo I (que es la administración de 3,0 mg/kg de AD04872 2,0 mg/kg de AD04982) dio lugar a un múltiplo de disminución del HBeAg en el día 15 de 17,0, que es mayor que la suma del múltiplo de disminución del grupo G (3,0 mg/kg de AD04872) de 4,6 más el múltiplo de disminución del grupo D (2,0 mg/kg de AD04982) de 3,2.
Además, se determinaron los niveles de ADN del VHB de cada uno de los grupos en la tabla 17 a partir de muestras de suero recogidas en los días -1, 8, 15, 22, 29 y 36, según el procedimiento descrito en el ejemplo 2, anterior. Se aisló el ADN del VHB en suero de cada animal en cada punto temporal. Los resultados se presentan en la siguiente tabla.
Tabla 20.Niveles medios de ADN del VHB en suero normalizados con respecto a antes del tratamiento y al control con PBS en ratones pHBV tras la administración de agentes de ARNi del VHB del ejemplo 7 (desviación estándar r fl m - .
continuación
Los datos de la tabla 20 indican que los agentes de ARNi examinados, tanto individualmente como en combinación, proporcionaron una reducción de los niveles de ADN del VHB en comparación con el grupo de PBS, y muestran además que la combinación de AD04872 (que se dirige al ORF S) y AD04982 (que se dirige al ORF X) reduce el ADN del VHB en suero en un grado similar al de una cantidad igual de AD04872 solo.
Ejemplo 8.Agentes de ARNi del VHB en ratones pHBV: más estudios de dosis-respuesta y de combinación.Se utilizó el modelo de ratón pHBV descrito en el ejemplo 2 anterior. Los ratones se dividieron en varios grupos según se indica en la tabla 21, a continuación, y a cada ratón se le administró una única inyección subcutánea de 200 pl de acuerdo con la pauta posológica establecida en la tabla 21:
T l 21.r ifi i n r n HBV r l m l .
Adicionalmente, el sacrificio de los ratones está programado de acuerdo con el siguiente calendario:
• Día 11: Sacrificar a 2 ratones de los grupos 2A, 3A, 4A, 5A, 6A, 7A y 8A, y sacrificar a un ratón del grupo 9. • Día 14: Sacrificar a 2 ratones de los grupos 2A, 3A, 4A, 5A, 6A, 7A y 8A.
• Día 21: Sacrificar a 2 ratones de los grupos 2B, 3B, 4B, 5B, 6B, 7B y 8B.
• Día 28: Sacrificar a 2 ratones de los grupos 1 ,2B, 3B, 4B, 5B, 6B, 7B y 8B, y a todos los ratones (4) de los grupos 10 y 12.
A cada ratón se le administró por vía subcutánea 200 pl que contenían la cantidad de agente(s) de ARNi del VHB formulado(s) en solución salina tamponada con fosfato, o 200 pl de solución salina tamponada con fosfato sin agente de ARNi del VHB, como se expone en la tabla 21. Cada uno de los agentes de ARNi del VHB incluía ligandos de N-acetil-galactosamina conjugados con el extremo 5'-terminal de la hebra sentido, como se muestra en las tablas 4 y 5. Las inyecciones se realizaron entre la piel y el músculo (es decir, inyecciones subcutáneas) en la piel flácida de la zona del cuello y los hombros. Como se muestra en la tabla 14 anterior, se analizaron cuatro (4) ratones en cada grupo (n = 4), excepto en los grupos 10, 11, 12 y 13, en los que se analizaron tres ratones (n = 3).
Se recogió suero el día -1 antes de la administración, y los días 8, 14, 21 y 28 y se determinaron los niveles séricos del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) según el procedimiento establecido en el ejemplo 2, anterior. Los datos del experimento se muestran en la siguiente tabla:
Tabla 22.Niveles medios de HBsAg normalizados con respecto a antes del tratamiento y al control de PBS en ratones pHBV tras la administración de agentes de ARNi del VHB del ejemplo 8 (desviación estándar reflejada como
Los agentes de ARNi del VHB probados, tanto solos como combinados, mostraron una reducción sustancial del HBsAg en comparación con el control de PBS en todos los puntos temporales medidos.
Ejemplo 9.Suministro de agentes de ARNi.
Se utilizó el modelo de ratón pHBV descrito en el ejemplo 2 anterior. El día 1, a cada ratón se le administró una única inyección subcutánea de 200 pl que contenían 10 mg/kg (mpk) de un agente de ARNi del VHB formulado en solución salina tamponada con fosfato, o 200 pl de solución salina tamponada con fosfato sin un agente de ARNi del VHB, que se usará como control. Los agentes de ARNi del VHB probados incluían los que tenían los números dúplex mostrados en la tabla 23, a continuación, cada uno de los cuales incluía ligandos de N-acetil-galactosamina conjugados con el extremo 5'-terminal de la hebra sentido, como se muestra en las tablas 4 y 5. Las inyecciones se realizaron entre la piel y el músculo (es decir, inyecciones subcutáneas) en la piel flácida de la zona del cuello y los hombros. Se analizaron tres (3) ratones de cada grupo (n = 3).
Se recogió suero antes de la administración y el día 8, el día 15, el día 22 y el día 29, y se determinaron los niveles séricos del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) de acuerdo con el procedimiento establecido en el ejemplo 2, anterior. Los datos del experimento se muestran en la siguiente tabla:
Tabla 23.Niveles medios de HBsAg normalizados con respecto a antes del tratamiento y al control de PBS en ratones pHBV tras la administración de agentes de ARNi del VHB del ejemplo 9 (desviación estándar reflejada como
-
Cada uno de los agentes de ARNi del VHB que se muestran en la tabla 23, anterior, incluía una secuencia de hebra antisentido que es al menos parcialmente complementaria al ORF X en las posiciones 1781-1799 del genoma del VHB. Cada uno de los agentes de ARNi mostró una reducción significativa en comparación con el control de PBS.
Ejemplo 10.Agentes de ARNi del VHB en ratones pHBV: más estudios de combinación.
Se utilizó el modelo de ratón pHBV descrito en el ejemplo 2 anterior. Los ratones se dividieron en varios grupos según se indica en la tabla 24, a continuación, y a cada ratón se le administró una única inyección subcutánea de 200 pl de acuerdo con la pauta posológica establecida en la tabla 24:
T l 24.r ifi i n r n HBV r l m l 1 .
A cada ratón se le administró por vía subcutánea 200 pl que contenían la cantidad de agente(s) de ARNi del VHB formulado(s) en solución salina tamponada con fosfato, o 200 pl de solución salina tamponada con fosfato sin agente de ARNi del VHB, como se expone en la tabla 24. Cada uno de los agentes de ARNi del VHB incluía ligandos de N-acetil-galactosamina conjugados con el extremo 5'-terminal de la hebra sentido, como se muestra en las tablas 4 y 5. Las inyecciones se realizaron entre la piel y el músculo (es decir, inyecciones subcutáneas) en la piel flácida de la zona del cuello y los hombros. Se analizaron tres (3) ratones de cada grupo (n = 3).
Se recogió suero antes de la administración y el día -1, el día 8, el día 15, el día 22, el día 29, el día 36, el día 43, el día 50, el día 57 y el día 64. Los niveles séricos del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) se determinaron de acuerdo con el procedimiento expuesto en el ejemplo 2, anterior. A continuación se muestran los datos del experimento:
Tabla 25.Niveles medios de HBsAg normalizados con respecto a antes del tratamiento y al control de PBS (Grupo A utilizado como control) en ratones pHBV tras la administración de agentes de ARNi del VHB del ejemplo 10 desviación estándar refleada como /- .
Los agentes de ARNi del VHB AD04585 y AD04771 se diseñaron con secuencias de hebra antisentido que son al menos parcialmente complementarias al marco de lectura abierto S en las posiciones 257-275 del genoma del VHB, como se muestra en las tablas 1 y 2. Los agentes de ARNi del VHB AD04580 y AD04776 se diseñaron para tener secuencias de hebra antisentido que son al menos parcialmente complementarias al marco de lectura abierto X en las posiciones 1781-1799 del genoma del VHB, como se muestra en las tablas 1 y 2. Los agentes de ARNi del VHB probados, tanto solos como combinados, mostraron una reducción del HBsAg en comparación con el control de PBS en todos los puntos temporales medidos. Cada dosis posterior redujo aún más el valor de concentración mínima de reducción del HBsAg.
Adicionalmente, se determinaron los niveles séricos de ADN del VHB para el grupo C (3,0 mg/kg de AD04585), el grupo E (3,0 mg/kg de AD04580) y el grupo G (1,5 mg/kg de AD04585 1,5 mg/kg de AD04580) en la tabla 24, a partir de muestras de suero recogidas los días -1, 8, 15, 22, 29, y 36, 43 y 50 según el procedimiento expuesto en el ejemplo 2, anterior. Se aisló el ADN del VHB en suero de cada animal en cada uno de estos puntos temporales. Los resultados se presentan en la siguiente tabla.
Tabla 26. Niveles medios de ADN del VHB en suero normalizados con respecto a antes del tratamiento y los controles de PBS (ambos grupos A y B de PBS) en ratones pHBV tras la administración de agentes de ARNi del VHB l m l 1 vi i n n r r fl m - .
Los datos de la tabla 26 indican que los agentes de ARNi del VHB examinados, tanto individualmente como en combinación, proporcionaron una reducción de los niveles de ADN del VHB en comparación con el grupo de PBS. Ejemplo 11.Agentes de ARNi del VHB en ratones pHBV: estudios de combinación.
Se utilizó el modelo de ratón pHBV descrito en el ejemplo 2 anterior. Los ratones se dividieron en varios grupos según se indica en la tabla 27, a continuación, y a cada ratón se le administró una única inyección subcutánea de 200 pl de acuerdo con la pauta posológica establecida en la tabla 27:
T l 27. r ifi i n r n HBV r l m l 11.
A cada ratón se le administró por vía subcutánea 200 pl que contenían la cantidad de agente(s) de ARNi del VHB formulado(s) en solución salina tamponada con fosfato, o 200 pl de solución salina tamponada con fosfato sin agente de ARNi del VHB, como se expone en la tabla 24. Cada uno de los agentes de ARNi del VHB incluía ligandos de N-acetil-galactosamina conjugados con el extremo 5 '-terminal de la hebra sentido, como se muestra en las tablas 4 y 5. Las inyecciones se realizaron entre la piel y el músculo (es decir, inyecciones subcutáneas) en la piel flácida de la zona del cuello y los hombros. Se analizaron tres (3) ratones de cada grupo (n = 3).
Se recogió suero el día -1 antes de la administración, y luego el día 8, el día 15, el día 22, el día 29 y el día 36 (excepto para el grupo L (AD04882) y el grupo M (AD04885), y se determinaron los niveles séricos del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) conforme al procedimiento establecido en el ejemplo 2, anterior. Los datos del experimento se muestran en la siguiente tabla:
Tabla 28.Promedio de HBsAg normalizado con respecto a antes del tratamiento y al control de PBS en ratones pHBV tras la administración de los agentes de ARNi del VHB del ejemplo 11 (desviación estándar reflejada como
El agente de ARNi AD04962 se diseñó para tener una secuencia de hebra antisentido que es al menos parcialmente complementaria al marco de lectura abierto S en las posiciones 257-275 del genoma del VHB, como se muestra en las tablas 1 y 2. El agente de ARNi AD04872 se diseñó para tener una secuencia de hebra antisentido que es al menos parcialmente complementaria al marco de lectura abierto S en las posiciones 261-279 del genoma del VHB, como se muestra en las tablas 1 y 2. El agente de ARNi AD04963 se diseñó para tener una secuencia de hebra antisentido que es al menos parcialmente complementaria al marco de lectura abierto X en las posiciones 1781-1799 del genoma del VHB, como se muestra en las tablas 1 y 2. Los agentes de ARNi AD04882 y AD04885 se diseñaron para tener secuencias de hebra antisentido que son al menos parcialmente complementarias al marco de lectura abierto X en las posiciones 1780-1798 del genoma del VHB, como se muestra en las tablas 1 y 2. Los agentes de ARNi del VHB que se muestran en la tabla 9, directamente anterior, mostraron una reducción del HBsAg en comparación con el control de PBS en todos los puntos temporales medidos, tanto individualmente como en combinación. La repetición de la dosis produjo una reducción adicional del HBsAg.
Adicionalmente, también se evaluaron los niveles séricos del antígeno e de la hepatitis B (HBeAg) en todos los grupos excepto en los grupos L y M. Primero se agruparon las muestras de los ratones de cada grupo respectivo y las muestras de suero resultantes se analizaron por separado. Los datos del experimento se muestran en la siguiente tabla:
Tabla 29. Niveles medios de HBeAg normalizados con respecto a antes del tratamiento y al control de PBS en ratones pHBV tras la administración de los a entes de^ ARNi del VHB del ejemplo 11.
continuación
Además, se determinaron los niveles séricos de ADN del VHB para cada uno de los grupos de la tabla 27 a partir de muestras de suero recogidas los días 8, 15, 22 y 29, según el procedimiento descrito en el ejemplo 2, anterior. Se aisló el ADN del VHB en suero de cada animal en cada punto temporal. Los resultados se presentan en la siguiente tabla.
Tabla 30. Niveles medios de ADN del VHB en suero normalizados con respecto a antes del tratamiento y al control con PBS en ratones pHBV tras la administración de agentes de ARNi del VHB del ejemplo 7 (desviación estándar r fl m - .
Los datos de la tabla 30 indican que los agentes de ARNi examinados, tanto individualmente como en combinación, proporcionaron una reducción de los niveles de ADN del VHB en comparación con el grupo de PBS. La repetición de la dosis produjo una reducción adicional del ADN del VHB.
Ejemplo 12.Agentes ARNi del VHB en ratones pHBV.
Se utilizó el modelo de ratón pHBV descrito en el ejemplo 2 anterior. Los ratones se dividieron en varios grupos según se indica en la tabla 31, a continuación, y a cada ratón se le administró una única inyección subcutánea de 200 pl de acuerdo con la pauta posológica establecida en la tabla 31:
Tabl 1.r ifi i n r n HBV r l m lo 12.
A cada ratón se le administró por vía subcutánea 200 pl que contenían la cantidad de agente de ARNi del VHB formulado en solución salina tamponada con fosfato, o 200 pl de solución salina tamponada con fosfato sin agente de ARNi del VHB, como se expone en la tabla 24. Cada uno de los agentes de ARNi del VHB incluía ligandos de N-acetilgalactosamina conjugados con el extremo 5 '-terminal de la hebra sentido, como se muestra en las tablas 4 y 5. Las inyecciones se realizaron entre la piel y el músculo (es decir, inyecciones subcutáneas) en la piel flácida de la zona del cuello y los hombros. Se analizaron tres (3) ratones de cada grupo (n = 3).
Se recogió suero antes de la administración y el día 8, el día 15 y el día 22. También se recogió suero el día 29 del grupo A (PBS), el grupo B (2,0 mg/kg de AD04871), el grupo C (2,0 mg/kg de AD04872), el grupo D (2,0 mg/kg de AD04874), el grupo E (2,0 mg/kg de AD04875) y el grupo F (2,0 mg/kg de AD04876), el día 36, el día 43 y el día 50. Los niveles séricos del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) se determinaron de acuerdo con el procedimiento expuesto en el ejemplo 2, anterior. Los datos del experimento se muestran en la siguiente tabla:
Tabla 32.Promedio de HBsAg normalizado con respecto a antes del tratamiento y al control de PBS en ratones pHBV tras la administración de los agentes de ARNi del VHB del ejemplo 12 (desviación estándar reflejada como
-
Cada uno de los agentes de ARNi del VHB AD04871, AD04872, AD04874, AD04875 y AD04876 se diseñaron para que tuviesen secuencias de hebra antisentido que eran al menos parcialmente complementarias al marco de lectura abierto S en las posiciones 261-279 del genoma del VHB, como se muestra en las tablas 1 y 2. Cada uno de estos agentes de ARNi del VHB debería mostrar una reducción sustancial del HBsAg en comparación con el control de PBS. Por ejemplo, una dosis única de 2 mg/kg de AD04871 (grupo B), AD04872 (grupo C) y AD04874 (grupo D) y AD04876 (grupo F), mostró una reducción superior al 90 % del HBsAg en cada uno de los puntos temporales medidos desde el día 15 hasta el día 43 en comparación con el control. Cada uno de los agentes de ARNi del VHB AD04881, AD04883 y AD04884 se diseñaron para tener secuencias de hebra antisentido que son al menos parcialmente complementarias al marco de lectura abierto X en las posiciones 1780-1798 del genoma del VHB, como se muestra en las tablas 1 y 2.
Ejemplo 13.Respuesta a la dosis y combinaciones de agentes de ARNi del VHB en ratones modelo con inactivación de la región X.
Como medio alternativo para evaluar los efectos de la combinación de un agente de ARNi que incluye una secuencia de hebra antisentido que es al menos parcialmente complementaria a una región localizada en el ORF S de un ARNm del VHB, y un segundo agente de ARNi que incluye una secuencia de hebra antisentido que es al menos parcialmente complementaria a una región localizada en el ORF X de un ARNm del VHB, se generó un plásmido que incluía el genoma del VHB con una inactivación del sitio de unión para los agentes de ARNi del VHB que se dirigen a las posiciones 1780 y 1781, como se muestra en las tablas 1 y 2 (en lo sucesivo, ratones con inactivación de la región X). Este modelo se generó mutando diez (10) bases en el plásmido pHBV1.3 dentro del sitio de unión de estos agentes de ARNi. El resto del ARNm del VHB, incluida la región S, seguía siendo funcional. Por tanto, en este modelo de ratón de VHB, se espera que la inclusión de un agente de ARNi del VHB que tenga una hebra antisentido dirigida a las posiciones 1780 y 1781 del genoma del VHB descrito en el presente documento sea ineficaz para silenciar la expresión.
Los ratones se dividieron en varios grupos, incluidos los que figuran en la tabla 33, a continuación, y los ratones recibieron inyecciones subcutáneas de 200 pl según la pauta posológica establecida en la tabla siguiente:
T l . r i r n n in iv i n l r i n X r l m l 1 .
A cada ratón se le administró por vía subcutánea 200 pl que contenían la cantidad de agente(s) de ARNi del VHB formulado(s) en solución salina tamponada con fosfato, o 200 pl de solución salina tamponada con fosfato sin agente de ARNi del VHB, como se expone en la tabla 33. Cada uno de los agentes de ARNi del VHB incluía ligandos de N-acetil-galactosamina conjugados con el extremo 5 '-terminal de la hebra sentido, como se muestra en las tablas 4 y 5. Las inyecciones se realizaron entre la piel y el músculo (es decir, inyecciones subcutáneas) en la piel flácida de la zona del cuello y los hombros. Se analizaron tres (3) ratones de cada grupo (n = 3).
Se recogió suero el día 5, el día 8, el día 15, el día 22 y el día 29, y se determinaron los niveles séricos del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) de acuerdo con el procedimiento establecido en el ejemplo 2, anterior. También se recogió suero de los grupos 1 a 5 los días 36 y 43. Los datos del experimento se muestran en la tabla 34 a continuación:
Tabla 34. Promedio de HBsAg normalizado con respecto a antes del tratamiento y al control con PBS en ratones con inactivación de la región X tras la administración de los agentes de ARNi del VHB del ejemplo 13 (desviación n r r fl m - .
Como se esperaba, el grupo 6, que fue una dosis única de 3,0 mg/kg del agente de ARNi del VHB AD04963 e incluye una hebra antisentido que es al menos parcialmente complementaria al marco de lectura abierto X en las posiciones 1781-1799 del genoma del VHB, fue incapaz de atenuar el HBsAg. Adicionalmente, cada uno de los grupos 2 a 5 proporcionó una reducción sustancial del HBsAg en comparación con el control con PBS, tanto el grupo 3 como el grupo 5 mostraron una reducción superior a 2 log del HBsAg en el valor de concentración mínima (día 22).
Ejemplo 14.Respuesta a la dosis y combinaciones de agentes de ARNi del VHB en ratones modelo con inactivación de la región X.
Se utilizó el modelo de ratón con inactivación de la región X descrito en el ejemplo 13 anterior. Los ratones se dividieron en varios grupos, incluidos los que figuran en la tabla 31, a continuación, y a cada ratón se le administró una única inyección subcutánea de 200 pl de acuerdo con la pauta posológica establecida en la tabla 35:
Tabla 35.Gru i r n n in iv i n l r i n X r el ejemplo 14.
A cada ratón se le administró por vía subcutánea 200 pl que contenían la cantidad de agente(s) de ARNi del VHB formulado(s) en solución salina tamponada con fosfato, o 200 pl de solución salina tamponada con fosfato sin agente de ARNi del VHB, como se expone en la tabla 35. Cada uno de los agentes de ARNi del VHB incluía ligandos de N-acetil-galactosamina conjugados con el extremo 5 '-terminal de la hebra sentido, como se muestra en las tablas 4 y 5. Las inyecciones se realizaron entre la piel y el músculo (es decir, inyecciones subcutáneas) en la piel flácida de la zona del cuello y los hombros. Se analizaron tres (3) ratones de cada grupo indicado en la tabla 35 (n = 3).
El suero se recogió el día 1 (antes de la dosis), el día 8, el día 15, el día 22 y el día 29, y se determinaron los niveles séricos del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) de acuerdo con el procedimiento establecido en el ejemplo 2, anterior. Los datos del experimento se muestran en la siguiente tabla:
Tabla 36.Niveles medios de HBsAg normalizados con respecto a antes del tratamiento y al control de PBS en r n n in iv i n l r i n X l m l 14.
La tabla 36 muestra que el agente de ARNi del VHB AD04872 administrado solo, y la combinación de AD04872 (que incluye una hebra antisentido que es al menos parcialmente complementaria al marco de lectura abierto S de las posiciones 261-279 del genoma del VHB) y AD05070 (que incluye una hebra antisentido que es al menos parcialmente complementaria al marco de lectura abierto X en las posiciones 1781-1799 del genoma del VHB), proporcionó una reducción significativa del HBsAg en comparación con el control de PBS en cada uno de los puntos temporales medidos. . La adición de 0,7 mg/kg a los 2 mg/kg del agente de ARNi del VHB AD05070 para el que había un sitio diana mutado en este modelo de región X inactivada no disminuyó la actividad de 2 mg/kg del agente de ARNi del VHB AD04872.
Adicionalmente, los niveles séricos de ADN del VHB se determinaron a partir de muestras de suero recogidas los días 8, 15 y 22 de acuerdo con el procedimiento establecido en el ejemplo 2, anterior. Se mezcló el suero de cada grupo y luego se aisló el ADN del suero de manera individual. Los resultados se presentan en la siguiente tabla.
Tabla 37. Niveles medios de ADN del VHB en suero normalizados con respecto a antes del tratamiento y los controles de PBS en ratones con inactivación de la región X tras la administración de agentes de ARNi del VHB del m l 14 vi i n n r r fl m - .
La adición de 0,7 mg/kg a los 2 mg/kg del agente de ARNi del VHB AD05070 para el que había un sitio diana mutado en este modelo de región X inactivada no disminuyó la actividad de 2 mg/kg del agente de ARNi del VHB AD04872.
Ejemplo 15.Agentes ARNi del VHB en ratones pHBV.
Se utilizó el modelo de ratón pHBV descrito en el ejemplo 2 anterior. Los ratones se dividieron en varios grupos, incluidos los que figuran en la tabla 38, a continuación, y a cada ratón se le administró una única inyección subcutánea de 200 pl de acuerdo con la pauta posológica establecida en la tabla 38:
Tabl . r ifi i n r n HBV r l m lo 15.
A cada ratón se le administró por vía subcutánea 200 pl que contenían la cantidad de agente(s) de ARNi del VHB formulado(s) en solución salina tamponada con fosfato, o 200 pl de solución salina tamponada con fosfato sin agente de ARNi del VHB, como se expone en la tabla 38. Cada uno de los agentes de ARNi del VHB incluía ligandos de N-acetil-galactosamina conjugados con el extremo 5 '-terminal de la hebra sentido, como se muestra en las tablas 4 y 5. Las inyecciones se realizaron entre la piel y el músculo (es decir, inyecciones subcutáneas) en la piel flácida de la zona del cuello y los hombros. Se analizaron tres (3) ratones de cada grupo (n = 3).
Se recogió suero el día -1 antes de la administración, y luego el día 8, el día 15, el día 22, el día 29, el día 36, el día 43 y el día 50. Los niveles séricos del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) se determinaron de acuerdo con el procedimiento expuesto en el ejemplo 2, anterior. Los datos del experimento se muestran en la tabla 39 a continuación, y el HBsAg promedio refleja el valor promedio normalizado del HBsAg:
Tabla 39.Promedio de HBsAg normalizado con respecto a antes del tratamiento y al control de PBS en ratones pHBV r l mini r i n l n ARNi l VHB l m l 15.
Cada uno de los agentes de ARNi AD04776, AD05069, AD05070, AD05071, AD05073 y AD05074 se diseñaron para que tuviesen secuencias de hebra antisentido que eran al menos parcialmente complementarias al marco de lectura abierto X en las posiciones 1781-1799 del genoma del VHB,, como se muestra en las tablas 1 y 2.
Cada uno de los agentes de ARNi AD05075, AD05076, AD05077 y AD05078 se diseñó para tener secuencias de hebra antisentido que son al menos parcialmente complementarias al marco de lectura abierto X en las posiciones 1780-1798 del genoma del VHB, como se muestra en las tablas 1 y 2.
La tabla 39 muestra que los agentes de ARNi del VHB AD04776, AD05069, AD05070, AD05071, AD05073 y AD05074 administrados solos o en combinación con AD04872 (que incluye una cadena antisentido que es al menos parcialmente complementaria al marco de lectura abierto S en las posiciones 261-279 del genoma del VHB) proporcionaron una reducción significativa del HBsAg en comparación con el control de PBS en cada uno de los puntos temporales medidos.
Ejemplo 16.Agentes de ARNi del VHB en ratones pHBV: estudios de dosis-respuesta y de combinación.
Se utilizó el modelo de ratón pHBV descrito en el ejemplo 2 anterior. Los ratones se dividieron en varios grupos según se indica en la tabla 40, a continuación, y a cada ratón se le administró una única inyección subcutánea de 200 pl de acuerdo con la pauta posológica establecida en la tabla 40:
T l 4 . r ifi i n r n HBV r l m l 1 .
A cada ratón se le administró por vía subcutánea 200 pl que contenían la cantidad de agente(s) de ARNi del VHB formulado(s) en solución salina tamponada con fosfato, o 200 pl de solución salina tamponada con fosfato sin agente de ARNi del VHB, como se expone en la tabla 40. Cada uno de los agentes de ARNi del VHB incluía ligandos de N-acetil-galactosamina conjugados con el extremo 5'-terminal de la hebra sentido, como se muestra en las tablas 4 y 5. Las inyecciones se realizaron entre la piel y el músculo (es decir, inyecciones subcutáneas) en la piel flácida de la zona del cuello y los hombros. Se analizaron seis (6) ratones de cada grupo (n = 6).
Se recogió suero antes de la administración y el día 8, el día 15, el día 22 y el día 29, y se determinaron los niveles séricos del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) de acuerdo con el procedimiento establecido en el ejemplo 2, anterior. Los datos del experimento se muestran en la tabla 41 a continuación:
Tabla 41.Niveles medios de HBsAg normalizados con respecto a antes del tratamiento y al control de PBS en ratones pHBV tras la administración de agentes de ARNi del VHB del ejemplo 16 (desviación estándar reflejada como /- .
continuación
Los agentes de ARNi del VHB probados, tanto individualmente como en combinación, mostraron una reducción del HBsAg en comparación con el control de PBS en todos los puntos temporales medidos. La expresión de HBsAg se redujo aún más en todos los grupos que recibieron una nueva dosis el día 22.
Adicionalmente, también se evaluaron los niveles séricos del antígeno e de la hepatitis B (HBeAg). Para la medición del día 8, se mezclaron las muestras de suero de los seis ratones de cada grupo y las muestras resultantes se analizaron de manera individual. Para el día -1, el día 15, el día 22 y el día 29, los seis ratones de cada grupo se emparejaron dentro de cada grupo y se agruparon sus respectivas muestras de suero, formando tres subgrupos para cada grupo. A continuación, se analizaron las muestras de suero de cada uno de los tres subgrupos de cada grupo. Los datos del experimento se muestran en la tabla 42 a continuación:
Tabla 42.Niveles medios de HBeAg normalizados con respecto a antes del tratamiento y al control de PBS en ratones pHBV tras la administración de agentes de ARNi del VHB del ejemplo 16 (desviación estándar para los días -
Los agentes de ARNi del VHB probados, tanto individualmente como en combinación, mostraron una reducción del HBeAg en comparación con el control de solución salina en todos los puntos temporales medidos. La expresión de HBeAg se redujo aún más en todos los grupos que recibieron una nueva dosis el día 22.
Además, se determinaron los niveles séricos de ADN del VHB para cada uno de los grupos de la tabla 40 a partir de muestras de suero recogidas los días -1, 8, 15 y 22, según el procedimiento descrito en el ejemplo 2, anterior. Se mezcló el suero de cada par de ratones y, a continuación, se aisló el ADN de cada grupo de suero en un único aislamiento. Los resultados se presentan en la siguiente tabla.
Tabla 43. Niveles medios de ADN del VHB en suero normalizados con respecto a antes del tratamiento y al control con PBS en ratones pHBV tras la administración de agentes de ARNi del VHB del ejemplo 16 (desviación estándar r fl m - .
continuación
Los agentes de ARNi del VHB probados, tanto individualmente como en combinación, mostraron una reducción del ADN del VHB en suero en comparación con el control de solución salina en todos los puntos temporales medidos, excepto en los grupos 11 y 12 que no presentaron reducción del ADN del VHB en suero en el día 8.
Ejemplo 17.Agentes ARNi del VHB en ratones pHBV.
Se utilizó el modelo de ratón pHBV descrito en el ejemplo 2 anterior. Los ratones se dividieron en varios grupos según se indica en la tabla 44, a continuación, y a cada ratón se le administró una única inyección subcutánea de 200 pl de acuerdo con la pauta posológica establecida en la tabla 44:
T l 44. r ifi i n r n HBV r l m l 17.
A cada ratón se le administró por vía subcutánea 200 pl que contenían la cantidad de agente(s) de ARNi del VHB formulado(s) en solución salina tamponada con fosfato, o 200 pl de solución salina tamponada con fosfato sin agente de ARNi del VHB, como se expone en la tabla 44. Cada uno de los agentes de ARNi del VHB incluía ligandos de N-acetil-galactosamina conjugados con el extremo 5'-terminal de la hebra sentido, como se muestra en las tablas 4 y 5. Las inyecciones se realizaron entre la piel y el músculo (es decir, inyecciones subcutáneas) en la piel flácida de la zona del cuello y los hombros. Se analizaron tres (3) ratones de cada grupo (n = 3).
Se recogió suero antes de la administración y el día 8, el día 14, el día 21, el día 29 y el día 36, y se determinaron los niveles séricos del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) de acuerdo con el procedimiento establecido en el ejemplo 2, anterior. Los datos del experimento se muestran en la tabla 45 a continuación:
Tabla 45.Niveles medios de HBsAg normalizados con respecto a antes del tratamiento y al control de PBS en ratones pHBV tras la administración de agentes de ARNi del VHB del ejemplo 17 (desviación estándar reflejada como (+/-)).
continuación
Las combinaciones de agentes de ARNi del VHB probadas mostraron una reducción del HBsAg en comparación con el control de solución salina en todos los puntos temporales medidos. Las combinaciones que contenían AD04872 mostraron mayores reducciones que las combinaciones equivalentes con AD04585 en lugar de AD04872.
Adicionalmente, se determinaron los niveles de ADN del VHB en suero para las muestras de suero recogidas los días 8, 14, 21 y 29 de conformidad con el procedimiento establecido en el ejemplo 2, anterior. Se aisló el ADN del VHB en suero de cada animal en cada punto temporal. Los resultados se muestran en la tabla 46 a continuación:
Tabla 46. Niveles medios de ADN del VHB en suero normalizados con respecto a antes del tratamiento y al control con PBS en ratones pHBV tras la administración de agentes de ARNi del VHB del ejemplo 17 (desviación estándar r fl m - .
0,354 ± 0,299 0,345 ± 0,187 0,522 ± 0,234 0,509 ± 0,106
continuación
Las combinaciones de agentes de ARNi del VHB probadas mostraron una reducción del ADN del VHB en suero en comparación con el control de solución salina en todos los puntos temporales medidos. Las combinaciones que contenían AD04872 mostraron mayores reducciones que las combinaciones equivalentes con AD04585 en lugar de AD04872. Estas mayores reducciones se observaron en los días 22 y 29.
Ejemplo 18. Agentes ARNi del VHB en un modelo de ratón humanizado infectado por el VHB.
Para este estudio, se trasplantaron hepatocitos humanos a ratones FRG® macho (genotipo con triple inactivación de Fah -/-/ Rag2 -/-/ Il2rg -/- en un fondo genético C57BL/6) (Yecuris) cuando tenían 1-2 meses de edad. Se permitió que los hepatocitos humanos repoblaran el hígado durante aproximadamente 6 meses con tratamiento periódico con NTBC para desincentivar el crecimiento de los hepatocitos de ratón. A los 9 meses de edad, los ratones recibieron una inoculación intravenosa de 4 * 108 genomas/kg de VHB genotipo C, que infectó a los hepatocitos humanos. Después de 2-3 meses, los niveles de ADN del VHB en suero alcanzaron una meseta, lo que indica que los hepatocitos humanos estaban infectados al máximo (los hepatocitos de ratón no pueden ser infectados por el VHB). Los ratones tenían un año de edad al inicio del tratamiento con agentes de ARNi del VHB, acercándose así al final de su expectativa de vida.
Se tomaron muestras de suero antes del tratamiento los días -10 y -3. A partir del día 1, a cada ratón se le administró 0,01 mg/kg de entecavir disuelto en agua por sonda nasogástrica para inhibir la replicación del VHB. La dosificación diaria de entecavir continuó hasta el día de del sacrificio de los ratones. Se esperaba que la administración de entecavir redujera el ADN sérico del VHB en pacientes humanos con infección crónica, pero no reducen el HBsAg.
Los ratones se dividieron en varios grupos, incluidos los que figuran en la tabla 47, a continuación:
T l 47. r ifi i n r n m l h m niz FR inf r l VHB r l m l 1 .
Cada ratón recibió también una administración subcutánea de 100 pl por cada 20 gramos de peso corporal que contenía la cantidad de agente(s) de ARNi del VHB formulado(s) en solución salina tamponada con fosfato, o un volumen igual de solución salina tamponada con fosfato sin agente de ARNi del VHB, el día 1 y el día 29 (si sigue vivo el día 29), según el calendario establecido en la tabla 47, directamente anterior. Cada uno de los agentes de ARNi del VHB incluía ligandos de N-acetil-galactosamina conjugados con el extremo 5'-terminal de la hebra sentido, como se muestra en las tablas 4 y 5. Las inyecciones se realizaron entre la piel y el músculo (es decir, inyecciones subcutáneas) en la piel flácida de la zona del cuello y los hombros.
Se recogió suero el día 8, el día 15, el día 22, el día 29, el día 36 y el día 40, y se determinaron los niveles séricos del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) de acuerdo con el procedimiento establecido en el ejemplo 2, anterior. Los datos del experimento se muestran en la siguiente tabla:
Tabla 48. Niveles medios de HBsAg normalizados con respecto a antes del tratamiento (día -3) para cada ratón m l FR h m niz inf r l VHB l m l 18.
Adicionalmente, los niveles séricos de ADN del VHB se determinaron a partir de muestras de suero recogidas en los días -10, -3, 8, 15, 22, 29, 36 y 40, según el procedimiento descrito en el ejemplo 2, anterior. Los resultados se muestran en la tabla 49 a continuación:
Tabla 49. Niveles de ADN del VHB en suero normalizados a la media del día -10 anterior al tratamiento y del día -3 para cada ratón humanizado FRG infectado por el VHB tras la administración de los agentes de ARNi del VHB del m l 14.
Como se esperaba, la administración de entecavir redujo la replicación viral tanto en ausencia como en presencia de agentes de ARNi del VHB.
OTRAS REALIZACIONES
Debe entenderse que, aunque la invención se ha descrito junto con la descripción detallada de la misma, se pretende que la anterior descripción ilustre, y no limite, el alcance de la invención, que se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones están comprendidos en el alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (29)

  1. REIVINDICACIONES 1. Una composición que comprende un agente de ARNi del VHB, en donde el agente de ARNi del VHB comprende una hebra sentido que comprende una secuencia de nucleobases de SEQ ID NO: 302 o 319 y una hebra antisentido al menos parcialmente complementaria a la hebra sentido, y en donde al menos un nucleótido de la hebra sentido y/o al menos un nucleótido de la hebra antisentido del agente de ARNi es un nucleótido modificado y/o tiene un enlace internucleosídico modificado.
  2. 2. La composición de la reivindicación 1, en donde la hebra antisentido comprende una secuencia de nucleobases seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 171, 179 o 180.
  3. 3. La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde 0, 1, 2, 3 o 4 nucleótidos tanto en la hebra sentido como en la hebra antisentido son ribonucleótidos no modificados.
  4. 4. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde tanto la hebra sentido como la hebra antisentido comprenden independientemente 1, 2, 3, 4, 5 o 6 enlaces fosforotioato.
  5. 5. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el agente ARNi del VHB comprende un ligando de direccionamiento que se conjuga con el extremo 3' o 5' de la hebra sentido o antisentido, opcionalmente, en donde el ligando de direccionamiento comprende N-acetil-galactosamina, por ejemplo en donde el ligando de direccionamiento comprende un trímero de N-acetil-galactosamina o un tetrámero de N-acetil-galactosamina.
  6. 6. La composición de la reivindicación 5, en donde el ligando de direccionamiento se selecciona del grupo que consiste en:
    Ċ
    ı33 �
    ��� �
    ��� �
    ��� �
    ��� �
    ��� �
    ���
    en donde NAG es N-acetil-galactosamina.
  7. 7. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, en donde el ligando de direccionamiento se conjuga con el extremo 5' o 3' de la hebra sentido.
  8. 8. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la hebra sentido comprende al menos un nucleósido abásico invertido.
  9. 9. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el agente de ARNi del VHB comprende una hebra sentido que tiene la secuencia de nucleobases de SEQ ID NO: 302 y una hebra antisentido que tiene la secuencia de nucleobases de SEQ ID NO: 171.
  10. 10. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la hebra sentido tiene una estructura de: (NAG25)sgsuggacuuCfUfCfucaauuuucus(invAb) (SEQ ID NO: 229); (NAG37)s(invAb)sguggacuuCfUfCfucaauuuucus(invAb) (SEQ ID n O: 252); (NAG37)s(invAb)sgguggacuuCfUfCfucaauuuucus(invAb) (SEQ ID NO: 253); o (NAG25)s(invAb)sguggacuuCfUfCfucaauuuucus(invAb) (S<e>Q ID NO: 273); en donde a, g, c y u son nucleótidos modificados con 2'-O-metilo; Af, Cf, Gf y Uf son nucleótidos modificados con 2'-fluoro; s es un enlace internucleosídico de fosforotioato; y en donde (invAb) es un desoxirribonucleótido abásico invertido (enlazado en 3'-3').
  11. 11. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde la hebra antisentido tiene una estructura de: asGfsasAfaAfuugagAfgAfaGfuCfcAfsc (SEQ ID NO: 100); asGfsasAfaAfuUfgAfgAfgAfaGfuCfcasc (SEQ ID NO: 126); asGfsasAfaAfuUfgAfgAfgAfaGfuCfcacusu (SEQ ID NO: 127); o asGfsasAfaAfuUfgAfgAfgAfaGfuCfcacsc (SEQ ID NO: 128).
  12. 12. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde el agente de ARNi del VHB comprende una estructura dúplex seleccionada del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO: 100 y SEQ ID NO: 229 (AD04511); (b) SEQ ID NO: 126 y SEQ ID NO: 252 (AD04872); (c) SEQ ID NO: 127 y SEQ ID NO: 252 (AD04873); (d) SEQ ID NO: 128 y SEQ ID NO: 253 (AD04874); y (e) SEQ ID NO: 126 y SEQ ID NO: 273 (AD05164).
  13. 13. La composición de la reivindicación 11, en donde el agente de ARNi del VHB comprende una hebra sentido unida en el extremo terminal 5' a NAG37s y que tiene la estructura (NAG37)s-(invAb)sguggacuuCfUfCfucaauuuucus(invAb) (SEQ ID NO: 252) y una hebra antisentido que tiene la estructura asGfsasAfaAfuUfgAfgAfgAfaGfuCfcasc (SEQ ID NO: 126).
  14. 14. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde el agente de ARNi del VHB es una sal.
  15. 15. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde el agente de ARNi del VHB es una sal sódica.
  16. 16. La composición de la reivindicación 15, en donde el agente de ARNi del VHB tiene la estructura: Ċ
    ı43 Ċ
    ı44 �
    ���
  17. 17. Una composición que comprende un primer agente de ARNi según una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, y un segundo agente de ARNi que comprende una hebra sentido y una hebra antisentido, en donde el primer agente de ARNi se dirige al marco de lectura abierto (ORF) S de un gen del VHB, y el segundo agente de ARNi se dirige al marco de lectura abierto (ORF) X de un gen del VHB.
  18. 18. La composición de la reivindicación 17, en donde el segundo agente de ARNi del VHB comprende un ligando de direccionamiento que se conjuga con el extremo 3' o 5' de la hebra sentido o antisentido, opcionalmente, en donde el ligando de direccionamiento comprende N-acetil-galactosamina, por ejemplo en donde el ligando de direccionamiento comprende un trímero de N-acetil-galactosamina o un tetrámero de N-acetil-galactosamina.
  19. 19. La composición de la reivindicación 17 o la reivindicación 18, en donde el segundo agente de ARNi del VHB es una sal, opcionalmente, en donde el segundo agente de ARNi del VHB es una sal sódica.
  20. 20. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 17-19, en donde el primer agente de ARNi del VHB se selecciona del grupo que consiste en: la SEQ ID NO: 100 y la SEQ ID NO: 229 (AD04511); la SEQ ID NO: 126 y la SEQ ID NO: 252 (AD04872); la SEQ ID NO: 127 y la SEQ ID NO: 252 (AD04873); la SEQ ID NO: 128 y la SEQ ID NO: 253 (AD04874); y la SEQ ID NO: 126 y la SEQ ID NO: 273 (AD05164); y el segundo agente de ARNi del VHB se selecciona del grupo que consiste en: la<s>E<q>ID NO: 61 y la S<e>Q ID NO: 196 (AD03498); la SEQ ID NO: 62 y la SEQ ID NO: 195 (AD03499); la SEQ ID NO: 63 y la SEQ ID NO: 195 (AD03500); la SEQ ID NO: 64 y la SEQ ID NO: 195 (AD03501); la SEQ ID NO: 66 y la SEQ ID NO: 197 (AD03738); la SEQ ID NO: 67 y la SEQ ID NO: 197 (AD03739); la SEQ ID NO: 64 y la SEQ ID NO: 198 (AD03967); la SEQ ID NO: 68 y la SEQ ID NO: 198 (AD03968); la SEQ ID NO: 64 y la SEQ ID NO: 199 (AD03969); la SEQ ID NO: 68 y la SEQ ID NO: 203 (AD03970); la SEQ ID NO: 69 y la SEQ ID NO: 199 (AD03971); la SEQ ID NO: 64 y la SEQ ID NO: 200 (AD03972); la SEQ ID NO: 64 y la SEQ ID NO: 201 (AD03973); la SEQ ID NO: 64 y la SEQ ID NO: 202 (AD03974); la SEQ ID NO: 70 y la SEQ ID NO: 199 (AD03975); la SEQ ID NO: 71 y la SEQ ID NO: 203 (AD03976); la SEQ ID NO: 70 y la SEQ ID NO: 201 (AD03977); la SEQ ID NO: 70 y la SEQ ID NO: 195 (AD03978); la SEQ ID NO: 80 y la SEQ ID NO: 213 (AD04176); la SEQ ID NO: 64 y la SEQ ID NO: 214 (AD04177); la SEQ ID NO: 68 y la SEQ ID NO: 214 (AD04178); la SEQ ID NO: 68 y la SEQ ID NO: 215 (AD04412); la SEQ ID NO: 68 y la SEQ ID NO: 216 (AD04413); la SEQ ID NO: 81 y la SEQ ID NO: 215 (AD04414); la SEQ ID NO: 68 y la SEQ ID NO: 217 (AD04415); la SEQ ID NO: 82 y la SEQ ID NO: 218 (AD04416); la SEQ ID NO: 83 y la SEQ ID NO: 218 (AD04417); la SEQ ID NO: 84 y la SEQ ID NO: 218 (AD04418); la SEQ ID NO: 85 y la SEQ ID NO: 218 (AD04419); la SEQ ID NO: 86 y la SEQ ID NO: 218 (AD04420); la SEQ ID NO: 87 y la SEQ ID NO: 218 (AD04421); la SEQ ID NO: 68 y la SEQ ID NO: 230 (AD04570); la SEQ ID NO: 101 y la SEQ ID NO: 230 (AD04571); la SEQ ID NO: 102 y la SEQ ID NO: 230 (AD04572); la SEQ ID NO: 103 y la SEQ ID NO: 231 (AD04573); la SEQ ID NO: 102 y la SEQ ID NO: 231 (AD04574); la SEQ ID NO: 105 y la SEQ ID NO: 232 (AD04575); la SEQ ID NO: 106 y la SEQ ID NO: 232 (AD04576); la SEQ ID NO: 68 y la SEQ ID NO: 233 (AD04577); la SEQ ID NO: 102 y la SEQ ID NO: 232 (AD04578); la SEQ ID NO: 71 y la SEQ ID NO: 214 (AD04579); la SEQ ID NO: 107 y la SEQ ID NO: 214 (AD04580); la SEQ ID NO: 102 y la SEQ ID NO: 248 (AD04776); la SEQ ID NO: 106 y la SEQ ID NO: 249 (AD04777); la SEQ ID NO: 106 y la SEQ ID NO: 250 (AD04778); la SEQ ID NO: 82 y la SEQ ID NO: 248 (AD04823); la SEQ ID NO: 131 y la SEQ ID NO: 256 (AD04881); la SEQ ID NO: 132 y la SEQ ID NO: 257 (AD04882); la SEQ ID NO: 133 y la SEQ ID NO: 258 (AD04883); la SEQ ID NO: 134 y la SEQ ID NO: 259 (AD04884); la SEQ ID NO: 135 y la SEQ ID NO: 260 (AD04885); la SEQ ID NO: 107 y la SEQ ID NO: 216 (AD04963); la SEQ ID NO: 136 y la SEQ ID NO: 248 (AD04981); la SEQ ID NO: 137 y la SEQ ID NO: 248 (AD04982); la SEQ ID NO: 138 y la SEQ ID NO: 0248 (AD04983); la SEQ ID NO: 139 y la SEQ ID NO: 261 (AD05069); la SEQ ID NO: 140 y la SEQ ID NO: 262 (AD05070); la SEQ ID NO: 141 y la SEQ ID NO: 263 (AD05071); la SEQ ID NO: 68 y la SEQ ID NO: 264 (AD05072); la SEQ ID NO: 142 y la SEQ ID NO: 265 (AD05073); la SEQ ID NO: 143 y la SEQ ID NO: 248 (AD05074); la SEQ ID NO: 144 y la SEQ ID NO: 266 (AD05075); la SEQ ID NO: 145 y la SEQ ID NO: 267 (AD05076); la SEQ ID NO: 146 y la SEQ ID NO: 268 (AD05077); la SEQ ID NO: 147 y la SEQ ID NO: 269 (AD05078); la SEQ ID NO: 148 y la SEQ ID NO: 270 (AD05147); la SEQ ID NO: 140 y la SEQ ID NO: 271 (AD05148); la SEQ ID NO: 148 y la SEQ ID NO: 272 (AD05149); y la SEQ ID NO: 140 y la SEQ ID NO: 274 (AD05165).
  21. 21. La composición de la reivindicación 20, en donde la proporción en peso entre el primer agente de ARNi del VHB y el segundo agente de ARNi del VHB es de aproximadamente 2:1.
  22. 22. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-21, que comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable.
  23. 23. La composición de la reivindicación 22, que está formulado para inyección subcutánea.
  24. 24. La composición de la reivindicación 22 o la reivindicación 23, que es una solución inyectable estéril.
  25. 25. La composición de la reivindicación 22, que es un polvo estéril para la preparación de una solución inyectable estéril.
  26. 26. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 23-25, que se envasa en una jeringa precargada o en un vial.
  27. 27. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 21-26, para su uso en el tratamiento terapéutico de una infección crónica por el VHB.
  28. 28. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 21-27 y un agente terapéutico adicional para su uso en el tratamiento de la infección crónica por el VHB, en donde la composición y el agente terapéutico adicional se administran por separado.
  29. 29. La composición y el agente terapéutico adicional para su uso según la reivindicación 28, en donde el agente terapéutico adicional es un inhibidor nucleosídico o un inhibidor nucleotídico.
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