ES2998307T3 - Stable and soluble antibodies inhibiting vegf - Google Patents

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ES2998307T3 ES20158159T ES20158159T ES2998307T3 ES 2998307 T3 ES2998307 T3 ES 2998307T3 ES 20158159 T ES20158159 T ES 20158159T ES 20158159 T ES20158159 T ES 20158159T ES 2998307 T3 ES2998307 T3 ES 2998307T3
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Leonardo Borras
David Urech
Tea Gunde
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Novartis AG
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Abstract

La presente invención se refiere a inmunoligantes anti-VEGF solubles y estables que comprenden CDR de anticuerpos monoclonales de conejo. Dichos anticuerpos están diseñados para el diagnóstico y/o tratamiento de trastornos mediados por VEGF. También se describen los hibridomas, ácidos nucleicos, vectores y células hospedadoras para la expresión de los anticuerpos recombinantes de la invención, los métodos para aislarlos y el uso de dichos anticuerpos en medicina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos estables y solubles inhibidores del VEGF
Campo de la invención
Antecedentes de la invención
La angiogénesis está involucrada en la patogenia de una diversidad de trastornos que incluyen tumores sólidos, síndromes neovasculares intraoculares, tales como retinopatías proliferativas o degeneración macular senil (AMD, por sus siglas en inglés), artritis reumatoide y psoriasis (Folkman et al., J. Biol. Chem. 267:10931-10934 (1992); Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol. 53:217-239 (1991); y Garner A, Vascular diseases. En: Pathobiology o f ocular disease. A dynamic approach. Garner A, Klintworth G K, Ed. 2.a Edición Marcel Dekker, NY, págs. 1625-1710 (1994)). En tumores sólidos, la angiogénesis y el crecimiento de nueva vasculatura permite la supervivencia del tumor, y se ha demostrado una correlación entre la densidad de microvasos en cortes tumorales y la supervivencia del paciente en cánceres de mama y otros cánceres (Weidner et al., N Engl J Med 324:1-6 (1991); Horak et al., Lancet 340:1120-1124 (1992); y Macchiarini et al., Lancet 340:145-146 (1992)).
El factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF, por sus siglas en inglés) es un regulador conocido de la angiogénesis y la neovascularización, y se ha demostrado que es un mediador clave de la neovascularización asociada con tumores y trastornos intraoculares (Ferrara et al., Endocr. Rev. 18:4-25 (1997)). El ARNm de VEGF se sobreexpresa en muchos tumores humanos, y la concentración de VEGF en los humores oculares están estrechamente correlacionados con la presencia de proliferación activa de vasos sanguíneos en pacientes con retinopatía diabética y otras retinopatías relacionadas con la isquemia (Berkman et al., J Clin Invest 91:153-159 (1993); Brown et al., Human Pathol. 26:86-91 (1995); Brown et al., Cancer Res. 53:4727-4735 (1993); Mattern et al., Brit. J. Cancer. 73:931-934 (1996); y Dvorak et al., Am J. Pathol. 146:1029-1039 (1995); Aiello et al., N. Engl. J. Med. 331:1480-1487 (1994)). Además, unos estudios recientes han demostrado la presencia de VEGF localizado en membranas neovasculares coroideas en pacientes afectados por AMD (López et al., Invest. Ophtalmo. Vis. Sci.
37:855-868 (1996)). Se pueden utilizar anticuerpos neutralizantes anti-VEGF para suprimir el crecimiento de diversas líneas celulares de tumor humano en ratones lampiños y también inhibir la angiogénesis intraocular en modelos de trastornos retinianos isquémicos (Kim et al., Nature 362:841-844 (1993); Warren et al., J. Clin. Invest 95:1789-1797 (1995); Borgstrom et al. Cancer Res. 56:4032-4039 (1996); y Melnyk et al., Cancer Res. 56:921-924 (1996)) (Adamis et al., Arch. Opthalmol. 114:66-71 (1996)).
Liang, W-C et al.: «Cross-species vascular endothelial growth factor (VEGF)-blocking antibodies completely inhibit the growth of human tumor xenografts and measure the contribution of stromal VEGF»,JBC (2006), 281(2):951-961, desvelan anticuerpos específicos contra el VEGF humano.
Por tanto, se necesitan anticuerpos monoclonales anti-VEGF que se puedan utilizar para el tratamiento de tumores sólidos y diferentes enfermedades intraoculares neovasculares.
Sumario de la invención
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
La invención proporciona inmunoligadores anti-VEGF solubles y estables que comprenden CDR (regiones determinantes de complementariedad) de anticuerpos monoclonales de conejo. Dichos anticuerpos están diseñados para el diagnóstico y/o el tratamiento de trastornos mediados por VEGF. También se divulgan, aunque no se reivindican, hibridomas, ácidos nucleicos, vectores y células hospedadoras para la expresión de los anticuerpos recombinantes de la invención, métodos para aislarlos y el uso de dichos anticuerpos en medicina.
Descripción breve de los dibujos
La Figura 1 ilustra la cinética de unión de scFv seleccionados a hVEGF-165 utilizando Biacore (hVEGF165). La Fig. 1a muestra los datos obtenidos para 511max: Ka (1/Ms): 6,59E+05; SE (ka): 1,10E+03; kd(l/s):4,40E-05; SE(kd):6,30E-07; KD(M): 6,67E-11. La Fig. 1b muestra los datos obtenidos para 578max: Ka (1/Ms): 7,00E+05; SE (ka): 1,40E+03; kd(1/s): 3,07E-04; SE(kd): 8,50E-07; KD(M): 4,39E-10.
La Figura 2 ilustra la especificidad de especie mostrando la cinética de unión de 578max a VEGF humano, de ratón y de rata. La Fig. 2a muestra los datos obtenidos para VEGF 165 humano: Ka (1/Ms): 7,00E+05; SE (ka): 1,40E+03; kd(1/s): 3,07E-04; SE(kd): 8,50E-07; KD(M): 4,39E-10. La Fig. 2b muestra los datos obtenidos para VEGF164 de ratón: Ka (1/Ms): 1,03E+06; SE (ka): 2,30E+03; kd(1/s): 4,40E-04; SE(kd): 9,40E-07; KD(M): 4,29E-10. La Fig. 2c muestra los datos obtenidos para VEGF 164 de rata: Ka (1/Ms): 8,83E+05; SE (ka): 2,50E+03; kd(1/s): 5,28E-04; SE(kd): 1,20E-06; KD(M): 5,98E-10.
La Figura 3 ilustra la cinética de unión de 578max a isotermas de VEGF (hVEGF121 y hVEGF110). La Fig. 3a muestra los datos obtenidos para VEGF 165 humano: Ka (1/Ms): 7,00E+05; SE (ka): 1,4E+03; kd(11s): 3,07E-04; SE(kd): 8,50E-07; KD(M): 4,39E-10. La Fig. 3b muestra los datos obtenidos para VEGF121 humano: Ka (1/Ms): 5,87E+05; SE (ka): 1.20E+03; kd(1/s): 5,58E-04; SE(kd): 9,60E-07; KD(M): 9,50E-11. La Fig. 3c muestra los datos obtenidos para VEGF 110 humano: Ka (1/Ms): 5,23E+05; SE (ka): 1,30E+03; kd(1/s): 7,22E-04; SE(kd): 8.10E-07; KD(M): 1,38E-09.
La Figura 4 representa la cinética de unión de 578max, 578minmax y 578wt a hVEGF165. La Fig. 4a muestra los datos obtenidos para 578max: Ka (1/Ms): 7,00E+05; SE (ka): 1,40E+03; kd(1/s): 3,07E-04; SE(kd): 8,50E-07; KD(M): 4,39E-10. La Fig. 4b muestra los datos obtenidos para 578minmax: Ka (1/Ms): 8,06E+05; SE (ka): 2,10E+03; kd(1/s): 5,04E-04; SE(kd): 1,10E-06; KD(M): 6,25E-10. La Fig. 4c muestra los datos obtenidos para 578wt-His: Ka (1/Ms): 8,45E+05; SE (ka): 1,60E+03; kd(1/s): 1,69E-04; SE(kd): 7,60E-07; KD(M): 2,00E-10.
La Figura 5 ilustra la estabilidad térmica de 578max, 578minmax y 578minmax_DHP (desplegamiento medido por FT-IR). Fig. 5a: 578minmax (ESBA903): Tm = 71,1°C; Figura 5b: 578minmax_DHP (#961): Tm = 70,2°C; Figura 5c: 578max (#821): Tm = 70,4°C.
La Figura 6 ilustra la desnaturalización y la precipitación de derivados 578 después del estrés térmico (Fig 6a: 50°C, Fig 6b: 60°C, Fig 6c: 70°C) durante 30 min.
La Figura 7 ilustra la solubilidad de 578max, 578minmax y 578minmax_DHP (determinada por precipitación con sulfato de amonio). Fig 7a: 578max (#821). La V50 fue del 27,24 % Fig. 7b: 578minmax (ESBA903). La V50 fue del 28,13. Fig.: 7c: 578minmax_DHP (#961). La V50 fue del 32,36 %.
La Figura 8 ilustra el ELISA de competición para VEGFR2 frente al ensayo con HUVEC como métodos para medir la potencia. Fig. 8a: Comparación de Lucentis y 511max (#802) en ELISA de competición para VEGFR2. R2 de Lucentis: 0,9417; R2 de ESBA802: 0,9700. CE50 de Lucentis: 7,137 nM; CE50 de #802: 0,8221 nM. Fig 8b: Comparación de Lucentis y 578max (#821) en ELISA de competición para VEGFR2. Fig 8c: Comparación de Lucentis, 511maxC-his y 534max en un ensayo con HUVEC. R2 de Lucentis: 0,9399; R2 de EP511maxC-his: 0,9313, R2 de EP534max: 0,7391. CE50 de Lucentis: 0,08825 nM, CE50 de 511maxC-his: 0,7646 nM, CE50 de 534max: 63,49 nM. Fig. 8d: Comparación de Lucentis, 578min y 578max en un ensayo con HUVEC. R2 de Lucentis: 0,9419, R2 de EP578min: 0,8886, R2 de EP578max: 0,9274. CE50 de Lucentis: 0,1529 nM, CE50 de 578min: 1,528 nM, CE50 de 578max: 0,1031 nM.
La Figura 9 ilustra los efectos de 578minmax sobre la proliferación de HUVEC inducida por hVEGF165. Los parámetros del ensayo fueron los siguientes: concentración de VEGF 165 h: 0,08nM (3 ng/ml); incubación con VEGF y elemento de prueba: 96h. La CE50 fue 0,08959 nM para Lucentis y 0,05516 nM para 578minmax, mientras que el R2 fue 0,9066 para Lucentis y 0,9622 para 578minmax.
La Figura 10 ilustra los efectos de 578minmax sobre la proliferación de HUVEC inducida por VEGF 164 de ratón y VEGF164 de rata. Los parámetros del ensayo fueron los siguientes: concentración de VEGF164 de ratón: 0,08 nM (3 ng/ml); concentración de VEGF164 de rata: 0,3 nM (11,3 ng/ml). Ambas concentraciones se seleccionaron en la CE90 para la proliferación de HUVEC inducida por VEGF; incubación con VEGF y elemento de prueba: 96h. La Fig. 10a ilustra los datos obtenidos para VEGF de ratón. La CE50 fue 0,1196 nM para V1253 y 0,06309 nM para 578minmax, mientras que el R2 fue 0,02744 para Lucentis y 0,9348 para V1253 y 0,9767 para EP578minmax. Lucentis no inhibió la proliferación de HUVEC inducida por VEGF de ratón. La Fig. 10b ilustra los datos obtenidos para VEGF de rata. La CE50 fue 1,597 nM para V1253 y 0,06974 nM para 578minmax, mientras que el R2 fue 00,7664 para V1253 y 0,6635 para 578minmax.
La Figura 11 ilustra estudios de eficacia utilizando el ensayo de Miles en cobayas lampiñas (parte I). Se administró el tinte azul Alamar 1 por vía intravenosa a cobayas lampiñas. Una hora después de la inyección del tinte, se inyectó una premezcla 2 de hVEGF (2,61nM) y Lucentis, ESBA903 o #802, respectivamente, en la piel del animal 3. Una hora después de la inyección de las disoluciones, los animales 3 se sacrificaron y sus pieles se recogieron, se lavaron y se fotografiaron digitalmente utilizando luz incidente y transmitida. La zona de colorante azul de Evans que se extravasó a los sitios de inyección se evaluó utilizando Image J y se representó gráficamente la retención de la dosis-zona.
La Figura 12 ilustra estudios de eficacia en los que se utiliza el ensayo de Miles en cobayas lampiñas (parte II). La Fig. 12a muestra los resultados obtenidos para #803 (511max). La CE50 fue 5,990nM y tenía una dispersión estadística de entre 2,060 y 17,41 nM mientras que el R2fue 0,5800. La Fig. 12b muestra los resultados obtenidos para ESBA903 (578minmax). La CE50 fue 3,989 y tenía una dispersión estadística de entre 1,456 y 10,93 nM mientras que el R2 fue 0,3920. La Fig. 12c muestra la zona de extravasación de tinte para Lucentis. No se pudo calcular la CE50 para Lucentis debido al pobre ajuste de la curva.
La Figura 13 ilustra estudios de eficacia en los que se utiliza el ensayo de Miles modificado en ratas (hVEGF165 y 578minmax premezclados (ESBA903)). La Fig. 13a ilustra la eficacia anti-permeabilidad de Avastin tras la extravasación vascular retiniana inducida por VEGF en ratas - respuesta a la dosis. Avastin inhibe la permeabilidad vascular retiniana inducida por hVEGF. Premezclados antes de la inyección. Un exceso aproximadamente equimolar, del triple o del décuplo. *p<0,05 (VEGF frente a BSA), **p<0,05 (tratadas con Avastin frente a VEGF). La Fig. 13b muestra la eficacia anti-permeabilidad de ESBA903 tras la extravasación vascular retiniana inducida por VEGF en ratas. Respuesta a la dosis (premezcla, ivt). Inhibición completa de la permeabilidad vascular retinaria inducida por hVEGF por parte de ESBA903. Premezclados antes de la inyección. Un exceso aproximadamente equimolar, del triple o del décuplo. *p<0,05 (VEGF frente a BSA), **p<0,05 (tratadas con ESBA903 frente a VEGF).
La Figura 14 ilustra estudios de eficacia en los que se utiliza el ensayo de Miles modificado en ratas (administración tópica de 578minmax (ESBA903)). Se evaluó la eficacia anti-permeabilidad de AL-51287 (ESBA903) tras la extravasación vascular retinaria inducida por VEGF en ratas tras la administración tópica. Cinco días antes del tratamiento, 4 gotas/día con una formulación de ESBA903 de 10 ng/ml. *p<0,05 (V<e>G<f>frente a BSA), **p<0,05 (VEGF frente a AL-51287), ***p=0,060 (AL-51287 frente a AL-52667), ****(VEGF frente a AL-39324); p<0,05 (AL-39324 frente al control de ref. de vehículo). AL-51287: ESBA903; AL-52657: control de referencia de vehículo tópico; AL-39324: inhibidor de RTK de bajo peso molecular.
La Figura 15 ilustra la definición de CDR1 de VH tal como se utiliza en la presente.
Descripción detallada
La invención proporciona inmunoligadores anti-VEGF solubles y estables que comprenden CDR de anticuerpos monoclonales de conejo. Dichos inmunoligadores están diseñados para el diagnóstico y/o el tratamiento de trastornos mediados por VEGF. También se divulgan, aunque no se reivindican, hibridomas, ácidos nucleicos, vectores y células hospedadoras para la expresión de los anticuerpos recombinantes de la invención, métodos para aislarlos y el uso de dichos anticuerpos en medicina.
Definiciones
Con el fin de que la presente invención se pueda entender más fácilmente, se definirán ciertos términos tal como se indica a continuación. Se exponen definiciones adicionales a lo largo de la descripción detallada.
El término «VEGF» se refiere al factor de crecimiento de células del endotelio vascular de 165 aminoácidos, y factores de crecimiento de células del endotelio vascular de 121, 189 y 206 aminoácidos relacionados, tal como se describen en Leung et al., Science 246:1306 (1989) y Houck et al., Mol. Endocrin. 5:1806 (1991) junto con las formas alélicas de origen natural y procesadas de esos factores de crecimiento.
El término «receptor de VEGF» o «VEGFr» se refiere a un receptor celular para VEGF, normalmente un receptor de la superficie celular presente en células del endotelio vascular, así como variantes de este que conservan la capacidad de unirse a hVEGF. Un ejemplo de un receptor de VEGF es la tirosinacinasa similar a fms (fit), un receptor transmembranario de la familia de las tirosina cinasas. DeVries et al., Science 255:989 (1992); Shibuya et al., Oncogene 5:519 (1990). El receptor fit comprende un dominio extracelular, un dominio transmembranario y un dominio intracelular con actividad de tirosinacinasa. El dominio extracelular interviene en la unión de VEGF, mientras que el dominio intracelular interviene en la transducción de señales. Otro ejemplo de un receptor de VEGF es el receptor flk-1 (denominado también KDR). Matthews et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 88:9026 (1991); Terman et al., Oncogene 6:1677 (1991); Terman et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 187:1579 (1992). La unión de VEGF al receptor flt da como resultado la formación de al menos dos complejos de alto peso molecular, que tienen un peso molecular aparente de 205.000 y 300.000 Dalton. Se cree que el complejo de 300000 Dalton es un dímero que comprende dos moléculas de receptor unidas a una única molécula de VEGF.
El término «conejo», tal como se utiliza en la presente, se refiere a un animal que pertenece a la familia de los lepóridos.
El término «anticuerpo», tal como se utiliza en la presente, es un sinónimo de «inmunoglobulina». Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención pueden ser inmunoglobulinas enteras o fragmentos de estas, que comprenden al menos un dominio variable de una inmunoglobulina, tal como dominios variables únicos, Fv (Skerra A. y Pluckthun, A. (1988) Science 240:1038-41), scFv (Bird, R.E. et al., (1988) Science 242:423-26; Huston, J.S. et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83), Fab, (Fab')2 u otros fragmentos muy conocidos por un experto en la técnica.
El término «CDR» se refiere a una de las seis regiones hipervariables dentro de los dominios variables de un anticuerpo que contribuyen principalmente a la unión del antígeno. Una de las definiciones utilizadas más habitualmente para las seis CDR fue proporcionada por Kabat E.A. et al., (1991) Sequences o f proteins o f immunologicalinterest. Publicación de NIH 91-3242). Tal como se utiliza en la presente, la definición de Kabat de las CDR solamente se aplica a CDR1, CDR2 y CDR3 del dominio variable de cadena ligera (CDR L1, CDR L2, CDR L3, o L1, L2, L3), así como a CDR2 y c Dr 3 del dominio variable de cadena pesada (c Dr H2, CDR H3, o H2, H3). Sin embargo, la CDR1 del dominio variable de cadena pesada (CDR H1 o H1), tal como se utiliza en la presente, está definida por los siguientes residuos (numeración de Kabat): Empieza en la posición 26 y termina antes de la posición 36. Esto es básicamente una fusión de CDR H1 tal como se define de forma diferente según Kabat y Chotia (véase también la Figura 15 con fines ilustrativos).
El término «armazón de anticuerpo», o en ocasiones únicamente «armazón», tal como se utiliza en la presente, se refiere a la parte del dominio variable, ya sea VL o VH, que sirve de soporte para los bucles de unión a antígeno (CDR) de este dominio variable. Básicamente, es el dominio variable sin las CDR.
Se pretende que el término «anticuerpo monocatenario», «Fv monocatenario» o «scFv» se refiera a una molécula que comprende un dominio (o región; Vh) variable de cadena pesada de anticuerpo y un dominio (o región; Vl) variable de cadena ligera de anticuerpo conectados por un conector. Tales moléculas de scFv pueden tener las estructuras generales: NH2-VL-conector-VH-COOH o NH2-VH-conector-VL-COOH.
Tal como se utiliza en la presente, «identidad» se refiere a la coincidencia secuencial entre dos polipéptidos, moléculas o entre dos ácidos nucleicos. Cuando una posición en ambas de las dos secuencias comparadas está ocupada por la misma base o subunidad monomérica de aminoácido (por ejemplo, si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, o una posición en cada uno de dos polipéptidos está ocupada por una lisina), entonces las respectivas moléculas son idénticas en esa posición. El «porcentaje de identidad» entre dos secuencias es una función del número de posiciones coincidentes compartidas por las dos secuencias dividido por el número de posiciones comparadas x 100. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones en dos secuencias coinciden, entonces las dos secuencias tienen un 60% de identidad. A modo de ejemplo, las secuencias de ADN CTGACT y CAGGTT comparten un 50% de identidad (3 de las 6 posiciones totales coinciden). Generalmente, se realiza una comparación cuando dos secuencias están alineadas para obtener la máxima identidad. Tal alineación se puede proporcionar utilizando, por ejemplo, el método de Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453, implementado convenientemente por programas informáticos tales como el programa Align (DNAstar, Inc.). El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos también se puede determinar utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), utilizando un tabla de peso de residuos PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970)) que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de programas informáticos GCG (disponible en www.gcg.com), utilizando ya sea una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1,2, 3, 4, 5 o 6.
Son secuencias «similares» aquellas que, cuando se alinean, comparten residuos aminoacídicos idénticos y similares, donde los residuos similares son sustituciones conservadoras para residuos aminoacídicos correspondientes en una secuencia de referencia alineada. A este respecto, una «sustitución conservadora» de un residuo en una secuencia de referencia es una sustitución por un residuo que es física o funcionalmente similar al residuo de referencia correspondiente, por ejemplo, que tiene un tamaño, una forma, una carga eléctrica, propiedades químicas similares, que incluyen la capacidad de formar enlaces covalentes o de hidrógeno, o similares. Por tanto, una secuencia «modificada por sustitución conservadora» es una que difiere de una secuencia de referencia o una secuencia natural (wildtype o wt) en que hay una o más sustituciones conservadoras presentes. El "porcentaje de similitud" entre dos secuencias es una función del número de posiciones que contienen residuos coincidentes o sustituciones conservadoras compartidas por las dos secuencias dividido por el número de posiciones comparadas x 100. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones en dos secuencias coinciden y 2 de 10 posiciones contienen sustituciones conservadoras, entonces las dos secuencias tienen un 80% de similitud positiva.
Tal como se utiliza en la presente, se pretende que el término «modificaciones conservadoras de la secuencia» se refiera a modificaciones de aminoácidos que no afectan ni alteran negativamente las características de unión del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Tales modificaciones conservadoras de la secuencia incluyen sustituciones, adiciones y deleciones de nucleótidos y aminoácidos. Por ejemplo, pueden introducirse modificaciones mediante técnicas estándar conocidas en la materia, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras incluyen aquellas en las que el residuo aminoacídico se reemplaza con un residuo aminoacídico que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos aminoacídicos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales con ramificaciones en la posición beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por tanto, un residuo aminoacídico no esencial predicho en un anticuerpo anti-VEGF humano se reemplaza preferentemente con otro residuo aminoacídico de la misma familia de cadenas laterales. Los métodos de identificación de sustituciones conservadoras de nucleótidos y aminoácidos que no eliminan la unión a antígeno son muy conocidos en la técnica (véanse, p. ej., Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); y Burks et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997))
«Secuencia de aminoácidos consenso», tal como se utiliza en la presente, se refiere a una secuencia de aminoácidos que se puede generar utilizando una matriz de al menos dos, y preferentemente más, secuencias de aminoácidos alineadas, y permitiendo huecos en la alineación, de tal modo que es posible determinar el residuo aminoacídico más frecuente en cada posición. La secuencia consenso es aquella secuencia que comprende los aminoácidos que están representados con la mayor frecuencia en cada posición. En el caso de que dos o más aminoácidos estén representados por igual en una única posición, la secuencia consenso incluye ambos o todos estos aminoácidos.
La secuencia de aminoácidos de una proteína se puede analizar a diferentes niveles. Por ejemplo, se puede presentar conservación o variabilidad a nivel de un único residuo, nivel de múltiples residuos, múltiples residuos con huecos, etc. Los residuos pueden presentar conservación del residuo idéntico o pueden estar conservados a nivel de clase. Los ejemplos de clases de aminoácidos incluyen grupos R polares pero sin carga (Serina, Treonina, Asparagina y Glutamina); grupos R cargados positivamente (Lisina, Arginina e Histidina); grupos R cargados negativamente (Ácido glutámico y Ácido aspártico); grupos R hidrófobos (Alanina, Isoleucina, Leucina, Metionina, Fenilalanina, Triptófano, Valina y Tirosina); y aminoácidos especiales (Cisteína, Glicina y Prolina). Un experto en la técnica conoce otras clases y estas se pueden definir utilizando determinaciones estructurales u otros datos para evaluar su sustituibilidad. En ese sentido, un aminoácido sustituible se puede referir a cualquier aminoácido que se puede sustituir y mantener la conservación funcional en esa posición.
Sin embargo, se reconocerá que los aminoácidos de la misma clase pueden variar en gran medida por sus propiedades biofísicas. Por ejemplo, se reconocerá que determinados grupos R hidrófobos (p. ej., Alanina, Serina o Treonina) son más hidrófilos (es decir, de mayor hidrofilicidad o menor hidrofobicidad) que otros grupos R hidrófobos (p. ej., Valina o Leucina). La hidrofilia o hidrofobia relativa se puede determinar utilizando métodos reconocidos en la técnica (véanse, p. ej., Rose et al., Science, 229: 834-838 (1985) y Comette et al., J. Mol. Biol., 195: 659-685 (1987)).
Tal como se utiliza en la presente, cuando una secuencia de aminoácidos (por ejemplo, una primera secuencia Vh o Vl) se alinea con una o más secuencias de aminoácidos adicionales (por ejemplo, una o más secuencias VH o VL en una base de datos), una posición de aminoácido en una secuencia (por ejemplo, la primera secuencia V<h>o V<l>) se puede comparar con una «posición correspondiente» en la una o más secuencias de aminoácidos adicionales. Tal como se utiliza en la presente, la «posición correspondiente» representa la posición equivalente en la secuencia o secuencias que se están comparando cuando las secuencias tienen una alineación óptima, es decir, cuando las secuencias están alineadas para conseguir el porcentaje de identidad o porcentaje de similitud más alto.
Tal como se utiliza en la presente, la expresión "base de datos de anticuerpos" se refiere a una colección de dos o más secuencias de aminoácidos de anticuerpos (una "multiplicidad" de secuencias), y normalmente se refiere a una colección de decenas, cientos o incluso miles de secuencias de aminoácidos de anticuerpos. Una base de datos de anticuerpos puede almacenar secuencias de aminoácidos de, por ejemplo, una colección de regiones Vh de anticuerpos, regiones Vl de anticuerpos o ambas, o puede almacenar una colección de secuencias scFv compuestas por regiones Vh y Vl. Preferentemente, la base de datos se almacena en un medio fijo, con motor de búsqueda, tal como un ordenador dentro un programa informático con motor de búsqueda. En una realización, la base de datos de anticuerpos es una base de datos que comprende o consiste en secuencias de anticuerpos de la línea germinal. En otra realización, la base de datos de anticuerpos es una base de datos que comprende o consiste en secuencias de anticuerpos maduras (es decir, expresadas) (p. ej., una base de datos de Kabat de secuencias de anticuerpos maduras, p. ej., una base de datos KBD). En otra realización más, la base de datos de anticuerpos comprende o consiste en secuencias seleccionadas funcionalmente (p. ej., secuencias seleccionadas a partir de un ensayo QC).
El término «inmunoligador» se refiere a una molécula que contiene la totalidad o una parte del sitio de unión a antígeno de un anticuerpo, por ejemplo, la totalidad o parte del dominio variable de cadena pesada y/o ligera, de tal modo que el inmunoligador reconoce específicamente un antígeno diana. Como ejemplos no limitativos de inmunoligadores se incluyen moléculas de inmunoglobulina completa y scFv, así como fragmentos de anticuerpo, incluyendo pero sin limitación, (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, V<h>, C<l>y C<h>1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fab', que es esencialmente un Fab con parte de la región bisagra (véase, Fundamental Immunology (Paul ed., 3.a ed. 1993); (iv) un fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y Ch1; (v) un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un único brazo de un anticuerpo, (vi) un anticuerpo monodominio tal como un fragmento Dab (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio Vh o Vl, un anticuerpo de camélido (véase Hamers-Casterman, et al., Nature 363:446-448 (1993) y Dumoulin, et al., Protein Science 11:500-515 (2002)) o de tiburón (p. ej., Ig-NAR de tiburón Nanobodies®); y (vii) un nanocuerpo, una región de cadena pesada que contiene el dominio variable y dos dominios constantes.
Tal como se utiliza en la presente, la expresión «propiedad funcional» es una propiedad de un polipéptido (p. ej., un inmunoligador) para el que una mejora (p. ej., en relación con un polipéptido convencional) es deseable y/o ventajosa para un experto en la técnica, p. ej., con el fin de mejorar las propiedades de fabricación o la eficacia terapéutica del polipéptido. En una realización, la propiedad funcional es estabilidad (p. ej., estabilidad térmica). En otra realización, la propiedad funcional es solubilidad (p. ej., en condiciones celulares). En otra realización más, la propiedad funcional es la no agregación. Incluso en otra realización, la propiedad funcional es la expresión de proteínas (p. ej., en células procariotas). En otra realización más, la propiedad funcional es una eficiencia de replegamiento después de una solubilización de cuerpos de inclusión en un proceso de purificación correspondiente. En ciertas realizaciones, la afinidad de unión al antígeno no es una propiedad funcional que se desea mejorar.
El término «epítopo» o «determinante antigénico» se refiere a un sitio en un antígeno (p. ej., en VEGF) al que se une específicamente una inmunoglobulina o un anticuerpo. Un epítopo normalmente incluye al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos consecutivos o no consecutivos en una conformación espacial singular. Véase, p. ej., Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996).
Los términos «unión específica», «unión selectiva», «se une selectivamente» y «se une específicamente» se refieren a un anticuerpo que se une a un epítopo en un antígeno predeterminado. Normalmente, el anticuerpo se une con una afinidad (K<d>) de aproximadamente menos de 10'7 M, tal como aproximadamente menos de 10'8 M, 10'9 M o 10'1° M o incluso menor.
El término «Kd» o «Kd» se refiere a la constante de equilibrio de disociación de una interacción de anticuerpoantígeno particular. Normalmente, los anticuerpos se la invención se unen a VEGF con una constante de equilibrio de disociación (K<d>) de menos de aproximadamente 10'7 M, tal como menos de aproximadamente 10'8 M, 10'9 M o 10'10 M o incluso menor, por ejemplo, tal como se determina utilizando tecnología de resonancia de plasmones superficiales (SPR, por sus siglas en inglés) en un instrumento BIACORE.
Los términos «neutraliza VEGF», «inhibe VEGF» y «bloquea VEGF» se utilizan indistintamente para hacer referencia a la capacidad de un anticuerpo de la invención para evitar que VEGF interactúe con uno o más receptores de VEGF tales como VEGFR-1 y/o VEGFR-2, y, por ejemplo, desencadene la transducción de señales.
Un «inmunoligador recombinante», tal como se utiliza en la presente, se refiere a un inmunoligador que se produce mediante expresión a partir de ADN recombinante.
Un inmunoligador "quimérico", tal como se utiliza en la presente, tiene una parte de la cadena pesada y/o ligera idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase particular de anticuerpos, mientras que el resto de la cadena o cadenas es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos. Un anticuerpo humanizado, tal como se utiliza en la presente, es un subgrupo de anticuerpos quiméricos.
«Anticuerpos humanizados», tal como se utilizan en la presente, son inmunoligadores que se han sintetizado utilizando tecnología de ADN recombinante para eludir la respuesta inmunitaria a antígenos exógenos. La humanización es una técnica bien consolidada para reducir la inmunogenia de anticuerpos monoclonales de fuentes xenogénicas. Esto implica la elección de un armazón aceptor, preferentemente un armazón aceptor humano, la extensión de las CDR del inmunoligador donante que se han de insertar en el armazón aceptor y la sustitución de residuos procedentes del armazón donante en el armazón aceptor. En la Patente de EE. UU. N.° 5 225 539, Winter divulga un método general para injertar CDR en marcos aceptores humanos. El documento US6 407 213 divulga una serie de posiciones de aminoácidos del marco en las que se prefiere una sustitución del inmunoligador donante.
El término «molécula de ácido nucleico» se refiere a moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero es preferentemente ADN bicatenario. Un ácido nucleico está «unido operativamente» cuando se establece una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si el promotor influye en la transcripción de la secuencia.
El término «vector» se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha ligado. Un tipo de vector es un «plásmido», que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, donde pueden ligarse segmentos de ADN adicionales en el genoma vírico. Determinados vectores tienen capacidad de replicación autónoma en una célula hospedadora en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamífero). Se pueden integrar otros vectores (por ejemplo, vectores no episómicos de mamífero) en el genoma de una célula hospedadora tras la introducción en la célula hospedadora, y de este modo se replican junto con el genoma hospedador.
El término «célula hospedadora» se refiere a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión. Las células hospedadoras pueden incluir células bacterianas, microbianas, vegetales o de animales. Las bacterias, que son susceptibles de transformación, incluyen miembros de las enterobacterias, tales como cepas de Escherichia coli o Salmonella; Bacillaceae, tales como Bacillus subtilis; neumococos; estreptococos, y Haemophilus influenzae. Los microbios adecuados incluyen Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris. Las líneas celulares hospedadoras de animal adecuadas incluyen células CHO (líneas de ovario de hámster chino) y NS0.
Los términos «tratar», «que trata/n» y «tratamiento» se refieren a medidas terapéuticas o preventivas descritas en la presente. Los métodos de «tratamiento» emplean la administración a un sujeto, que necesita tal tratamiento, un anticuerpo de la presente invención, por ejemplo, un sujeto que padece un trastorno mediado por VEGF o un sujeto que puede desarrollar un trastorno de este tipo a la larga, con el fin de prevenir, curar, retrasar, reducir la gravedad de, o mejorar uno o más síntomas del trastorno o trastorno recurrente, o con el fin de prolongar la supervivencia de un sujeto superando la esperada en ausencia de tal tratamiento.
El término «trastorno mediado por VEGF» se refiere a cualquier trastorno, la aparición, la evolución o la persistencia de los síntomas o estados patológicos de este que requiere la participación de VEGF. Como trastornos ilustrativos mediados por VEGF se incluyen, pero sin limitación, degeneración macular senil, glaucoma neovascular, retinopatía diabética, retinopatía de la prematuridad, fibroplasia retrolenticular, carcinomas de mama, carcinomas pulmonares, carcinomas gástricos, carcinomas esofágicos, carcinomas colorrectales, carcinomas hepáticos, carcinomas ováricos, sarcomas, arrenoblastomas, carcinomas cervicouterinos, carcinoma endometrial, hiperplasia endometrial, endometriosis, fibrosarcomas, coriocarcinoma, cáncer de cabeza y cuello, carcinoma nasofaríngeo, carcinomas laríngeos, hepatoblastoma, sarcoma de Kaposi, melanoma, carcinomas de piel, hemangioma, hemangioma cavernoso, hemangioblastoma, carcinomas pancreáticos, retinoblastoma, astrocitoma, glioblastoma, schwannoma, oligodendroglioma, meduloblastoma, neuroblastomas, rabdomiosarcoma, sarcoma osteogénico, leiomiosarcomas, carcinomas de las vías urinarias, carcinomas de tiroides, tumor de Wilms, carcinoma de células renales, carcinoma prostático, proliferación vascular anómala asociada con facomatosis, edema (tal como el asociado con tumores cerebrales), síndrome de Meigs, artritis reumatoide, psoriasis y ateroesclerosis.
El término «dosis eficaz» o «dosificación eficaz» se refiere a una cantidad suficiente para conseguir o al menos conseguir parcialmente el efecto deseado. El término «dosis terapéuticamente eficaz» se define como una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones en un paciente que ya está sufriendo la enfermedad. Las cantidades eficaces para este uso dependerán de la gravedad del trastorno que se esté tratando y el estado general del propio sistema inmunitario del paciente.
El término «sujeto» se refiere a cualquier animal humano o no humano. Por ejemplo, los métodos y las composiciones de la presente invención se pueden utilizan para tratar un sujeto con un trastorno mediado por VEGF.
El término «Min-injerto» o «min», tal como se utiliza en la presente, se refiere a un domino variable humanizado que se generó injertando CDR de conejo procedentes de un dominio variable de conejo en un armazón aceptor humano de origen natural (FW 1.4, SEQ ID No. 172). No se realizaron cambios en las regiones de armazón. El propio armazón se preseleccionó en función de propiedades funcionales deseables (solubilidad y estabilidad).
El término «Max-injerto» o «max», tal como se utiliza en la presente, se refiere a un domino variable humanizado que se generó injertando CDR de conejo procedentes de un dominio variable de conejo en el marco aceptor humano, «conejizado» «RabTor» (rFW1.4, SEQ ID No. 173) o en un derivado de este denominado rFW1.4(v2) (SEQ ID No. 174). El armazón «RabTor» se preparó incorporando residuos de conejo conservados (que por lo demás son bastante variables en otras especies) en posiciones del armazón involucradas generalmente en la estructura y estabilidad del dominio variable de conejo, con el objetivo de generar un armazón aplicable universalmente que acepte prácticamente cualquier conjunto de CDR de conejo sin la necesidad de injertar residuos del armazón donante aparte de en posiciones que son diferentes en su presunta secuencia progenitora, p. ej., que se alteraron durante la hipermutación somática y, por tanto, contribuyen posiblemente a la unión a antígeno. La presunta secuencia progenitora se define de modo que sea la parte complementaria de la línea germinal de conejo más próxima y, en el caso de que no se pueda determinar la parte complementaria de la línea germinal más próxima, el consenso de un subgrupo de conejo o el consenso de secuencias de conejo con un porcentaje de similitud alto.
El término «Min-Max» o «minmax», tal como se utiliza en la presente, se refiere a un dominio variable humanizado constituido por una cadena ligera variable de «Min-injerto» combinada con una cadena pesada variable de «Maxinjerto».
El término «Max-Min» o «maxmin», tal como se utiliza en la presente, se refiere a un dominio variable humanizado constituido por una cadena ligera variable de «Max-injerto» combinada con una cadena pesada variable de «Mininjerto».
Se utilizaron diferentes nomenclaturas para los inmunoligadores generados. Estos se identifican normalmente mediante un número (p. ej., #578). En aquellos casos en los que se utiliza un prefijo tal como EP o Epi (p. ej., EP 578 que es idéntico a Epi 578), se indica así el mismo inmunoligador. Ocasionalmente, un inmunoligador recibió una segunda denominación que se identifica mediante el prefijo «ESBA». Por ejemplo, ESBA903 designa el mismo inmunoligador que 578minmax o EP578minmax o Epi578minmax.
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado con el que los entiende normalmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluidas las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.
Varios aspectos de la invención se describen más detalladamente en las siguientes subsecciones. Se entiende que las diferentes realizaciones, preferencias e intervalos se pueden combinar según se desee. Además, dependiendo de la realización específica, puede que no se apliquen definiciones, realizaciones o intervalos seleccionados.
Inmunoligadores anti-VEGF
En un aspecto, la presente invención proporciona inmunoligadores que se unen al VEGF y, por tanto, son adecuados para bloquear la función del VEGF in vivo. Las CDR de estos inmunoligadores proceden de anticuerpos monoclonales anti-VEGF de conejo que se obtuvieron a partir de conejos que se inmunizaron con VEGF humano y/o con un fragmento de este (SEQ ID No.1). A nuestro entender, esta es la primera vez que se obtuvieron anticuerpos anti-VEGF monoclonales a partir de conejos y se caracterizaron en detalle. Sorprendentemente, las afinidades (Kd) resultaron ser extraordinariamente altas.
En determinados aspectos, la divulgación no reivindicada proporciona un inmunoligador, que se une específicamente al VEGF, que comprende al menos una de una secuencia de aminoácidos de CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 o CDRL3. Las secuencias de aminoácidos de CDR ilustrativas para su uso en los inmunoligadores se exponen en las SEQ ID No: 2-72 (Tablas 1-6).
Tabla 1. Secuencias de aminoácidos CDR H1 de inmunoli adores anti-VEGF
Tabla 2. Secuencias de aminoácidos CDR H2 de inmunoli adores antiVEGF
Tabla 3. Secuencias de aminoácidos CDR H3 de inmunoli adores antiVEGF.
Tabla 4. Secuencias de aminoácidos CDR L1 de inmunoli adores anti-VEGF.
Tabla 5. Secuencias de aminoácidos CDR L2 de inmunoligadores anti-VEGF.
Tabla 6. Secuencias de aminoácidos CDR L3 de inmunoli adores anti-VEGF.
En un aspecto, la divulgación no reivindicada proporciona un inmunoligador que comprende al menos una CDR que tiene una similitud de al menos 75 %, preferentemente una identidad de al menos 75 %, más preferentemente una identidad de al menos 80 %, 85 %, 90 % 95 %, incluso más preferentemente de 100 %, con una secuencia consenso del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 71. Preferentemente, el VH de dicho inmunoligador comprende las CDR del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 37 y/o las CDR del VL de dicho inmunoligador comprende las CDR del grupo que consiste en<s>E<q>ID NO: 49, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 71. Preferentemente; la CDR se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 a SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 a SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 a SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 a SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 61 a SEQ ID NO: 70.
En otro aspecto, la divulgación no reivindicada proporciona un inmunoligador que comprende al menos un CDR que tiene una similitud de al menos 75 %, preferentemente una identidad de al menos 75 %, más preferentemente una identidad de al menos 80 %, 85 %, 90 % 95 %, incluso más preferentemente de 100 %, con una secuencia consenso del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 50 y SEQ ID NO: 61.
Preferentemente, el VH de dicho inmunoligador comprende las CDR del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 27 y/o las CDR del VL de dicho inmunoligador comprende las CDR del grupo que consiste en S<e>Q ID NO: 38, S<e>Q ID NO: 50 y SEQ ID NO: 61. En otra realización preferida, el VH de dicho inmunoligador comprende las CDR del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, SEQ ID n O: 15 y SEQ ID NO: 27 y/o las CDR del VL de dicho inmunoligador comprende las CDR del grupo que consiste en SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 50 y SEQ ID NO: 61.
En otro aspecto, la divulgación no reivindicada proporciona un inmunoligador que comprende al menos un CDR que tiene una similitud de al menos 75 %, preferentemente una identidad de al menos 75 %, más preferentemente una identidad de al menos 80 %, 85 %, 90 % 95 %, incluso más preferentemente de 100 %, con una secuencia consenso del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 62. Preferentemente, el VH de dicho inmunoligador comprende las CDR del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 28 y/o las CDR del VL de dicho inmunoligador comprende las CDR del grupo que consiste en SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 62.
En otro aspecto, la divulgación no reivindicada proporciona un inmunoligador que comprende al menos un CDR que tiene una similitud de al menos 75 %, preferentemente una identidad de al menos 75 %, más preferentemente una identidad de al menos 80 %, 85 %, 90 % 95 %, incluso más preferentemente de 100 %, con una secuencia consenso del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 63. Preferentemente, el VH de dicho inmunoligador comprende las CDR del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 29 y/o las CDR del VL de dicho inmunoligador comprende las CDR del grupo que consiste en SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 63.
En otro aspecto, la divulgación no reivindicada proporciona un inmunoligador que comprende al menos un CDR que tiene una similitud de al menos 75 %, preferentemente una identidad de al menos 75 %, más preferentemente una identidad de al menos 80 %, 85 %, 90 % 95 %, incluso más preferentemente de 100 %, con una secuencia consenso del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 64. Preferentemente, el VH de dicho inmunoligador comprende las CDR del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 30 y/o las CDR del VL de dicho inmunoligador comprende las CDR del grupo que consiste en Se Q ID NO: 41, SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 64.
En otro aspecto, la divulgación no reivindicada proporciona un inmunoligador que comprende al menos un CDR que tiene una similitud de al menos 75 %, preferentemente una identidad de al menos 75 %, más preferentemente una identidad de al menos 80 %, 85 %, 90 % 95 %, incluso más preferentemente de 100 %, con una secuencia consenso del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 54 y SEQ ID NO: 65. Preferentemente, el VH de dicho inmunoligador comprende las CDR del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 31 y/o las CDR del VL de dicho inmunoligador comprende las CDR del grupo que consiste en Se Q ID NO: 42, SEQ ID NO: 54 y SEQ ID NO: 65.
En otro aspecto, la divulgación no reivindicada proporciona un inmunoligador que comprende al menos un CDR que tiene una similitud de al menos 75 %, preferentemente una identidad de al menos 75 %, más preferentemente una identidad de al menos 80 %, 85 %, 90 % 95 %, incluso más preferentemente de 100 %, con una secuencia consenso del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 66. Preferentemente, el VH de dicho inmunoligador comprende las CDR del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 32 y/o las CDR del VL de dicho inmunoligador comprende las CDR del grupo que consiste en Se Q ID NO: 43, SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 66.
En otro aspecto, la divulgación no reivindicada proporciona un inmunoligador que comprende al menos un CDR que tiene una similitud de al menos 75 %, preferentemente una identidad de al menos 75 %, más preferentemente una identidad de al menos 80 %, 85 %, 90 % 95 %, incluso más preferentemente de 100 %, con una secuencia consenso del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 67. Preferentemente, el VH de dicho inmunoligador comprende las CDR del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 33 y/o las CDR del VL de dicho inmunoligador comprende las CDR del grupo que consiste en Se Q ID NO: 44, SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 67.
En otro aspecto, la divulgación no reivindicada proporciona un inmunoligador que comprende al menos un CDR que tiene una similitud de al menos 75 %, preferentemente una identidad de al menos 75 %, más preferentemente una identidad de al menos 80 %, 85 %, 90 % 95 %, incluso más preferentemente de 100 %, con una secuencia consenso del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 68. Preferentemente, el VH de dicho inmunoligador comprende las CDR del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 34 y/o las CDR del VL de dicho inmunoligador comprende las CDR del grupo que consiste en SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 68
En otro aspecto, la divulgación no reivindicada proporciona un inmunoligador que comprende al menos un CDR que tiene una similitud de al menos 75 %, preferentemente una identidad de al menos 75 %, más preferentemente una identidad de al menos 80 %, 85 %, 90 % 95 %, incluso más preferentemente de 100 %, con una secuencia consenso del grupo que consiste en SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 69. Preferentemente, el VH de dicho inmunoligador comprende las CDR del grupo que consiste en SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 35 y/o las CDR del VL de dicho inmunoligador comprende las CDR del grupo que consiste en SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 69. Como alternativa, el VH de dicho inmunoligador puede comprender las CDR del grupo que consiste en SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 35 y/o las c Dr del VL de dicho inmunoligador comprende las CDR del grupo que consiste en SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 69.
En otro aspecto, la divulgación no reivindicada proporciona un inmunoligador que comprende al menos un CDR que tiene una similitud de al menos 75 %, preferentemente una identidad de al menos 75 %, más preferentemente una identidad de al menos 80 %, 85 %, 90 % 95 %, incluso más preferentemente de 100 %, con una secuencia consenso del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 70. Preferentemente, el VH de dicho inmunoligador comprende las CDR del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 36. Adicionalmente o como alternativa, la VL de dicho inmunoligador comprende las CDR del grupo que consiste en SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 70, p. ej., SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 70; o SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 70.
En una realización muy preferida, el inmunoligador divulgado en la presente, neutraliza el VEGF humano y reacciona de forma cruzada con el VEGF de rata/ratón o con una parte del mismo.
El inmunoligador puede comprender un anticuerpo o cualquier soporte de unión alternativo capaz de albergar CDR. Las CDR expuestas en las SEQ ID No: 2-72 se pueden injertar en cualquier soporte de unión adecuado utilizando cualesquiera métodos reconocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033; la Patente de EE. UU. N.° 5225539 de Winter, y las Patentes de EE. UU. N.os 5530 101, 5585089, 5693 762 y 6 180 370 de Queen et al.). Sin embargo, se prefiere que los inmunoligadores que se dan a conocer en la presente estén humanizados y, por tanto, son adecuados para aplicaciones terapéuticas.
En el caso de anticuerpos, las CDR de conejo expuestas en las SEQ ID No: 2-72 se pueden injertar en las regiones de armazón de cualquier anticuerpo de cualquier especie. Sin embargo, se ha descubierto previamente que los anticuerpos o derivados de anticuerpo que comprenden los armazones identificados en el denominado cribado de «control de calidad» (documento WO0148017) se caracterizan por una estabilidad y/o solubilidad generalmente alta y, por tanto, también pueden ser útiles en el contexto de aplicaciones extracelulares tales como la neutralización de VEGF humano. Es más, se ha descubierto además que una combinación particular de estos armazones solubles y estables de VL (cadena ligera variable) y VH (cadena pesada variable) es particularmente adecuada para albergar CDR de conejo. Por consiguiente, en una realización, las CDR expuestas en las SEQ ID No: 2-72 se injertan en los marcos de anticuerpo humano obtenidos mediante el cribado de «control de calidad» divulgado en el documento EP1479694. Las secuencias de aminoácidos de marcos ilustrativos se exponen en las SEQ ID No: 172 a 174. Se descubrió sorprendentemente que al injertar en dicho armazón o sus derivados, se podía mantener por completo la conformación de bucle de una gran diversidad de CDR de conejo, con gran independencia de la secuencia del armazón donante. Es más, dicho armazón o sus derivados que contienen diferentes CDR de conejo se expresan y producen bien al contrario que las cadenas independientes naturales de conejo y siguen conservando casi por completo la afinidad de los anticuerpos de conejo donantes originales.
Por tanto, en una realización preferida, las CDR y/o los motivos de CDR que se divulgan en el presente documento están presentes en una secuencia de armazón de la región variable de cadena pesada que tiene una identidad de secuencia de al menos 80 %, más preferentemente de al menos 85 %, 90 % 95 %, incluso más preferentemente una identidad de 100% con la secuencia de SEQ ID NO: 169. En una realización preferida, la secuencia de armazón de la región variable de cadena pesada comprende SEQ ID NO: 170 o SEQ ID NO: 171.
En una realización preferida, las CDR y/o motivos de CDR divulgados en la presente, están presentes en una secuencia de armazón de la región variable de cadena ligera que tiene una identidad de secuencia de al menos 85 %, más preferentemente de al menos 90 %, 95 %, incluso más preferentemente una identidad de 100 %, con la secuencia de SEQ ID NO: 167, más preferentemente que comprende la SEQ ID NO: 167 o SEQ ID NO: 168.
En anticuerpos de conejo, las CDR pueden contener residuos de cisteína que se unen a través de puentes disulfuro a residuos de cisteína en el armazón del anticuerpo. Por consiguiente, puede ser necesario, a la hora de injertar CDR de conejo que contienen residuos de cisteína en regiones de armazón que no son de conejo, introducir residuos de cisteína en el armazón que no es de conejo mediante, por ejemplo, mutagénesis para facilitar la estabilización de CDR de conejo a través de una unión de disulfuro.
En otro aspecto, la divulgación no reivindicada proporciona un inmunoligador, que se une específicamente al VEGF, que comprende al menos una secuencia de aminoácidos de VH o de VL.
Las secuencias de aminoácidos de VH o VL ilustrativas para su uso en los inmunoligadores se exponen en las SEQ ID No: 72-106 y 107-166, respectivamente.
En un aspecto preferido, la divulgación no reivindicada proporciona un inmunoligador que comprende una VH que tiene una identidad de al menos 80 %, más preferentemente de al menos 85 %, 90 %, 95 %, con la mayor preferencia una identidad de 100 %, con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 130 y SEQ ID NO: 131 (VH 60-11-4, VH 60-11 6, VH 60-11-4min, VH 60-11-6min, VH 60-11-4max y VH 60-11-6max, respectivamente);
y/o una VL que tiene una identidad de al menos 80 %, más preferentemente de al menos 85 %, 90 %, 95 %, con la mayor preferencia una identidad de 100 %, con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 82 y SEQ ID NO: 93 (VL 60, VL 60min, VL 60max, respectivamente).
En otro aspecto, la divulgación no reivindicada proporciona un inmunoligador que comprende una VH que tiene una identidad de al menos 80 %, más preferentemente de al menos 85 %, 90 %, 95 %, con la mayor preferencia una identidad de 100 %, con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 120 y SEQ ID NO: 132 (VH 435, VH 435min y VH 435max, respectivamente);
y/o una VL que tiene una identidad de al menos 80 %, más preferentemente de al menos 85 %, 90 %, 95 %, con la mayor preferencia una identidad de 100 %, con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 83 y SEQ ID NO:94 (VL 435, VL 435min y VL 435max, respectivamente).
Preferentemente, dicho inmunoligador tiene una identidad de al menos 80 %, más preferentemente de al menos 85 %, 90 %, 95 %, con la mayor preferencia una identidad de 100 %, con la SEQ ID NO: 175 (435max).
En otro aspecto, la divulgación no reivindicada proporciona un inmunoligador que comprende una VH que tiene una identidad de al menos 80 %, más preferentemente de al menos 85 %, 90 %, 95 %, con la mayor preferencia una identidad de 100 %, con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 121 y SEQ ID NO: 133 (VH 453, VH 453min y VH 453max, respectivamente);
y/o una VL que tiene una identidad de al menos 80 %, más preferentemente de al menos 85 %, 90 %, 95 %, con la mayor preferencia una identidad de 100 %, con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 84 y SEQ ID NO: 95(VL 453, VL 453min y VL 453max, respectivamente).
En otro aspecto, la divulgación no reivindicada proporciona un inmunoligador que comprende una VH que tiene una identidad de al menos 80 %, más preferentemente de al menos 85 %, 90 %, 95 %, con la mayor preferencia una identidad de 100 %, con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 122 y SEQ ID NO: 134 (VH 375, VH 375min y VH 375max, respectivamente);
y/o una VL que tiene una identidad de al menos 80 %, más preferentemente de al menos 85 %, 90 %, 95 %, con la mayor preferencia una identidad de 100 %, con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 85 y SEQ ID NO:96 (VL 375, VL 375min y VL 375max, respectivamente).
En otro aspecto, la divulgación no reivindicada proporciona un inmunoligador que comprende una VH que tiene una identidad de al menos 80 %, más preferentemente de al menos 85 %, 90 %, 95 %, con la mayor preferencia una identidad de 100 %, con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 123 y 135 (VH 610, VH 610min y VH 610max, respectivamente);
y/o una VL que tiene una identidad de al menos 80 %, más preferentemente de al menos 85 %, 90 %, 95 %, con la mayor preferencia una identidad de 100 %, con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 86 y SEQ ID NO: 97 (VL 610, VL 610min y VL 610max, respectivamente).
En otro aspecto, la divulgación no reivindicada proporciona un inmunoligador que comprende una VH que tiene una identidad de al menos 80 %, más preferentemente de al menos 85 %, 90 %, 95 %, con la mayor preferencia una identidad de 100 %, con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO:154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO:157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165 y SEQ ID NO: 166 (VH 578 y sus variantes);
y/o una VL que tiene una identidad de al menos 80 %, más preferentemente de al menos 85 %, 90 %, 95 %, con la mayor preferencia una identidad de 100 %, con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104 y SEQ ID NO: 105 (VL 578 y sus variantes).
Preferentemente, dicho inmunoligador tiene una identidad de al menos 80 %, más preferentemente de al menos 85 %, 90 %, 95 %, con la mayor preferencia una identidad de 100 %, con la SEQ ID NO: 178 (578min), SEQ ID NO: 179 (578max) o SEQ ID NO: 180 (578minmax).
En otro aspecto, la divulgación no reivindicada proporciona un inmunoligador que comprende una VH que tiene una identidad de al menos 80 %, más preferentemente de al menos 85 %, 90 %, 95 %, con la mayor preferencia una identidad de 100 %, con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 125 y SEQ ID NO: 137 (VH 534, VH 534min y VH 534max, respectivamente);
y/o una VL que tiene una identidad de al menos 80 %, más preferentemente de al menos 85 %, 90 %, 95 %, con la mayor preferencia una identidad de 100 %, con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 88 y SEQ ID NO: 99 (VL 534, VL 534min y VL 534max, respectivamente).
En otro aspecto, la divulgación no reivindicada proporciona un inmunoligador que comprende una VH que tiene una identidad de al menos 80 %, más preferentemente de al menos 85 %, 90 %, 95 %, con la mayor preferencia una identidad de 100 %, con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 138 y SEQ ID NO: 143 (VH 567, VH 567min y VH 567max, respectivamente);
y/o una VL que tiene una identidad de al menos 80 %, más preferentemente de al menos 85 %, 90 %, 95 %, con la mayor preferencia una identidad de 100 %, con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO:89 y SEQ ID NO: 100 (VL 567, VL 567min y VL 567max, respectivamente).
Preferentemente, dicho inmunoligador tiene una identidad de al menos 80 %, más preferentemente de al menos 85 %, 90 %, 95 %, con la mayor preferencia una identidad de 100 %, con la SEQ ID NO: 177 (567min).
En otro aspecto, la divulgación no reivindicada proporciona un inmunoligador que comprende una VH que tiene una identidad de al menos 80 %, más preferentemente de al menos 85 %, 90 %, 95 %, con la mayor preferencia una identidad de 100 %, con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO:139 y SEQ ID NO: 140 (VH 509, VH 509min, VH 509max y VH 509maxII, respectivamente);
y/o una VL que tiene una identidad de al menos 80 %, más preferentemente de al menos 85 %, 90 %, 95 %, con la mayor preferencia una identidad de 100 %, con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 90 y SEQ ID NO: 101 (VL 509, VL 509min y VL 509max, respectivamente).
En otro aspecto, la divulgación no reivindicada proporciona un inmunoligador que comprende una VH que tiene una identidad de al menos 80 %, más preferentemente de al menos 85 %, 90 %, 95 %, con la mayor preferencia una identidad de 100 %, con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 141 y SEQ ID NO: 145 (VH 511, VH 511min, VH 511max y VH 511maxDHP, respectivamente);
y/o una VL que tiene una identidad de al menos 80 %, más preferentemente de al menos 85 %, 90 %, 95 %, con la mayor preferencia una identidad de 100 %, con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 102 y SEQ ID NO: 106 (VL 511, VL 511min, VL 511max y VL 511minC41L, respectivamente).
Preferentemente, dicho inmunoligador tiene una identidad de al menos 80 %, más preferentemente de al menos 85 %, 90 %, 95 %, con la mayor preferencia una identidad de 100 %, con la SEQ ID NO: 176 (511_max).
En determinados aspectos, la divulgación no reivindicada proporciona además un inmunoligador, que se une específicamente al VEGF, que comprende una secuencia de aminoácidos con una similitud sustancial respecto a una secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID No: 2-166 y en las SEQ ID No: 175-180, y en donde el inmunoligador conserva o mejora esencialmente las propiedades funcionales deseadas del inmunoligador anti-VEGF de la invención. Las similitudes porcentuales preferidas incluyen, pero sin limitación, una identidad de al menos 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %.
En determinados aspectos, la divulgación no reivindicada proporciona además un inmunoligador, que se une específicamente al VEGF, que comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad sustancial respecto a una secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID No: 2-166 y en las SEQ ID No. 175-180, y en donde el inmunoligador conserva o mejora las propiedades funcionales deseadas del inmunoligador anti-VEGF de la invención. Las identidades porcentuales preferidas incluyen, pero sin limitación, una identidad de al menos 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %.
En determinados aspectos, la divulgación no reivindicada proporciona además un inmunoligador, que se une específicamente al VEGF, que comprende una secuencia de aminoácidos con sustituciones conservadoras respecto a una secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID No: 2-166 y en las SEQ ID No. 175-180, y en donde el inmunoligador conserva o mejora las propiedades funcionales deseadas del inmunoligador anti-VEGF de la invención.
En algunos aspectos, la divulgación no reivindicada proporciona inmunoligadores que se unen específicamente al VEGF humano y que reaccionan de forma cruzada con moléculas de VEGF de otras especies, por ejemplo, VEGF de ratón, VEGF de rata, VEGF de conejo o VEGF de cobaya. En una realización particular, el inmunoligador anti-VEGF se puede unir específicamente a VEGF humano y/o de rata/ratón.
En algunos aspectos, la divulgación no reivindicada proporciona inmunoligadores que se unen específicamente al VEGF humano y que no reaccionan de forma cruzada con moléculas de VEGF de otras especies, por ejemplo, VEGF de ratón, VEGF de rata, VEGF de conejo o VEGF de cobaya.
En algunos aspectos, la divulgación no reivindicada proporciona inmunoligadores que se unen específicamente al VEGF humano y en donde los inmunoligadores están madurados por afinidad.
En una realización, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de la presente invención son anticuerpos monocatenarios (scFv) o fragmentos Fab. En el caso de anticuerpos scFv, se puede unir un dominio VL seleccionado a un dominio VH seleccionado en cualquier orientación mediante un conector flexible. Un conector adecuado del estado de la técnica consiste en secuencias de aminoácidos GGGGS repetidas o variantes de estas. En una realización preferida de la presente invención, un conector (GGGGS)4 de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 181, pero también son posibles variantes de 1-3 repeticiones (Holliger et al., (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448). Otros conectores que pueden utilizarse en la presente invención se describen en Alfthan et al., (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al., (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106, Hu et al., (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al., (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 y Roovers et al., (2001), Cancer Immunol. Immunother. 50:51-59. La disposición puede ser bien VL-conector-VH o bien VH-conector-VL, siendo la primera orientación la preferida. Sin embargo, también se contemplan anticuerpos de dominio VL o VL único. En el caso de fragmentos Fab, se fusionan dominios variables de cadena ligera VL seleccionados con la región constante de una cadena kappa de Ig humana, mientras que los dominios variables de cadena pesada VH adecuados se fusionan con el primer dominio constante (aminoterminal) CH1 de una IgG humana. En el extremo C del dominio constante o en otros sitios del dominio variable o constante, se puede formar un puente disulfuro intercatenario. Como alternativa, las dos cadenas también pueden se pueden unir mediante un conector flexible para dar como resultado un anticuerpo Fab monocatenario.
Los anticuerpos o derivados de anticuerpo de la presente invención pueden tener afinidades por el VEGF humano con constantes de disociación Kd en un intervalo de 10'14M a 10'5M. En una realización preferida de la presente invención, la Kd es < 1 nM. La afinidad de un anticuerpo por un antígeno se puede determinar experimentalmente utilizando un método adecuado (Berzofsky et al., «Antibody-Antigen Interactions», en Fundamental Immunology, Paul, W.E., Ed, Raven Press: Nueva York, NY (1992); Kuby, J. Immunology, W.H. Freeman and Company: Nueva York, NY) y métodos descritos en ellos.
La empresa Epitomics vende una anticuerpo anti-VEGF que es un anticuerpo monoclonal de conejo (VEGF (C-term) Rabbit Antibody, N.° de catálogo 1909-1). Dicho anticuerpo se dirige a residuos en el extremo C de VEGF humano y, por lo tanto, no es capaz de neutralizar VEGF. Por ende, dicho anticuerpo no es adecuado para aplicaciones terapéuticas. Es más, dicha IgG monoclonal no es un anticuerpo humanizado sino que es una inmunoglobulina completa de conejo natural. Además, se ha demostrado que este anticuerpo no reconoce la forma nativa de VEGF.
Inmunoligadores que se unen a los mismos epítopos en VEGF
En otro aspecto, la divulgación no reivindicada proporciona anticuerpos que se unen a un epítopo en VEGF reconocido por un anticuerpo que comprende una cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID No 2-211. Tales anticuerpos se pueden identificar basándose en su capacidad de competir de forma cruzada con un anticuerpo que comprende una cualquiera o más de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID No 2-211 en ensayos de unión a VEGF estándar que incluyen, pero sin limitación, ELISA. La capacidad de un anticuerpo de ensayo para inhibir la unión al VEGF humano de un anticuerpo que comprende una cualquiera o más de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID No 2-211, demuestra que el anticuerpo de ensayo puede competir de forma cruzada, por tanto, interaccionar con un epítopo superpuesto en VEGF humano como un anticuerpo que comprende una cualquiera o más de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID No 2-211.
Adicionalmente o como alternativa, tales anticuerpos también se pueden identificar utilizando técnicas de mapeo epitópico estándar para determinar si se unen a los mismos inmunógenos peptídicos. También pueden emplearse técnicas de modelado estructural para definir adicionalmente los determinantes moleculares exactos de la interacción anticuerpo/VEGF, que incluyen, pero sin limitación, RMN, cristalografía de rayos X, modelado por ordenador o tomografía de proteínas (Banyay et al., 2004 ASSAY and Drug Development Technologies (2), 5, págs.
516-567). De hecho, la estructura cristalina de VEGF se ha resuelto y se conocen los residuos aminoacídicos de la superficie que participan en la unión a VEGFr (Fuh, et al., 2006, J. Biol. Chem., 281, 6625-6631). Por consiguiente, dada la secuencia de aminoácidos del inmunógeno peptídico y el conocimiento estructural del VEGF disponible en la técnica, identificar anticuerpos que se unen a un epítopo en VEGF reconocido por los anticuerpos que comprenden una cualquiera o más de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID No 2-211, entra dentro de las competencias de la técnica.
En algunas realizaciones, los anticuerpos que se unen a un epítopo en VEGF reconocido por un anticuerpo que comprende una cualquiera o más de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID No 2-211, pueden unirse al VEGF con una afinidad de al menos 107 M-1, por ejemplo, al menos 107 M-1, al menos 108 M-1, al menos 109 M-1, al menos 1010 M-1, al menos 1011 M-1, al menos 1012 M'1 o al menos 1013 M-1.
En algunas realizaciones, los anticuerpos que se unen a un epítopo en VEGF reconocido por un anticuerpo que comprende una cualquiera o más de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID No 2-211, se unen específicamente al VEGF humano y no reaccionan de forma cruzada con moléculas de VEGF de otras especies, por ejemplo, VEGF de ratón, VGEF de rata, VEGF de conejo o VEGF de cobaya.
En algunas realizaciones, los anticuerpos que se unen a un epítopo en VEGF reconocido por un anticuerpo que comprende una cualquiera o más de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID No 2-211, reaccionan de forma cruzada con moléculas de VEGF de otras especies, por ejemplo, VEGF de ratón, VGEF de rata o VEGF de conejo.
Variantes optimizadas
Los anticuerpos desvelados, pero no reivindicados, pueden optimizarse además para que tengan propiedades funcionales mejoradas, p. ej., solubilidad y/o estabilidad mejoradas.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención se optimizan de acuerdo con la metodología «consenso funcional». Por ejemplo, los inmunoligadores del VEGF se pueden comparar con una base de datos de scFv seleccionados funcionalmente para identificar posiciones de residuos de aminoácidos que sean más o menos tolerantes a la variabilidad que la posición o posiciones correspondientes en el inmunoligador del VEGF, con lo que se indica que este tipo de posición o posiciones de residuos identificadas puede ser adecuado para la modificación genética para mejorar la funcionalidad, tal como la estabilidad y/o solubilidad. Por ejemplo, en la región variable de cadena pesada de un inmunoligador pueden introducirse una o más de las siguientes sustituciones en una posición de aminoácido (se hace referencia a la numeración AHo de cada una de las posiciones de aminoácidos enumeradas a continuación)
(a) Q o E en la posición de aminoácido 1;
(b) Q o E en la posición de aminoácido 6;
(c) T, S o A en la posición de aminoácido 7, más preferentemente T o A, incluso más preferentemente T;
(d) A, T, P, V o D, más preferentemente T, P, V o D, en la posición de aminoácido 10,
(e) L o V, más preferentemente L, en la posición de aminoácido 12,
(f) V, R, Q, M o K, más preferentemente V, R, Q o M en la posición de aminoácido 13;
(g) R, M, E, Q o K, más preferentemente R, M, E o Q, incluso más preferentemente R o E, en la posición de aminoácido 14;
(h) L o V, más preferentemente L, en la posición de aminoácido 19;
(i) R, T, K o N, más preferentemente R, T o N, incluso más preferentemente N, en la posición de aminoácido 20;
(j) I, F, L o V, más preferentemente I, F o L, incluso más preferentemente I o L, en la posición de aminoácido 21;
(k) R o K, más preferentemente K, en la posición de aminoácido 45;
(l) T, P, V, A o R, más preferentemente T, P, V o R, incluso más preferentemente R, en la posición de aminoácido 47;
(m) K, Q, H o E, más preferentemente K, H o E, incluso más preferentemente K, en la posición de aminoácido 50;
(n) M o I, más preferentemente I, en la posición de aminoácido 55;
(o) K o R, más preferentemente K, en la posición de aminoácido 77;
(p) A, V, L o I, más preferentemente A, L o I, incluso más preferentemente A, en la posición de aminoácido 78; (q) E, R, T o A, más preferentemente E, T o A, incluso más preferentemente E, en la posición de aminoácido 82;
(r) T, S, I o L, más preferentemente T, S o L, incluso más preferentemente T, en la posición de aminoácido 86; (s) D, S, N o G, más preferentemente D, N o G, incluso más preferentemente N, en la posición de aminoácido 87;
(t) A, V, L o F, más preferentemente A, V o F, incluso más preferentemente V, en la posición de aminoácido 89; (u) F, S, H, D o Y, más preferentemente F, S, H o D, en la posición de aminoácido 90;
(v) D, Q o E, más preferentemente D o Q, incluso más preferentemente D, en la posición de aminoácido 92; (w) G, N, T o S, más preferentemente G, N o T, incluso más preferentemente G, en la posición de aminoácido 95;
(x) T, A, P, F o S, más preferentemente T, A, P o F, incluso más preferentemente F, en la posición de aminoácido 98;
(y) R, Q, V, I, M, F o L, más preferentemente R, Q, I, M, F o L, incluso más preferentemente Y, incluso más preferentemente L, en la posición de aminoácido 103; y
(z) N, S o A, más preferentemente N o S, incluso más preferentemente N, en la posición de aminoácido 107. Adicionalmente o como alternativa, en la región variable de cadena ligera de un inmunoligador pueden introducirse una o más de las siguientes sustituciones
(aa) Q, D, L, E, S o I, más preferentemente L, E, S o I, incluso más preferentemente L o E, en la posición de aminoácido 1;
(bb) S, A, Y, I, P o T, más preferentemente A, Y, I, P o T, incluso más preferentemente P o T, en la posición de aminoácido 2;
(cc) Q, V, T o I, más preferentemente V, T o I, incluso más preferentemente V o T, en la posición de aminoácido 3;
(dd) V, L, I o M, más preferentemente V o L, en la posición de aminoácido 4;
(ee) S, E o P, más preferentemente S o E, incluso más preferentemente S, en la posición de aminoácido 7;
(ff) T o I, más preferentemente I, en la posición de aminoácido 10;
(gg) A o V, más preferentemente A, en la posición de aminoácido 11;
(hh) S o Y, más preferentemente Y, en la posición de aminoácido 12;
(ii) T, S o A, más preferentemente T o S, incluso más preferentemente T, en la posición de aminoácido 14; (jj) S o R, más preferentemente S, en la posición de aminoácido 18;
(kk) T o R, más preferentemente R, en la posición de aminoácido 20;
(ll) R o Q, más preferentemente Q, en la posición de aminoácido 24;
(mm) H o Q, más preferentemente H, en la posición de aminoácido 46;
(nn) K, R o I, más preferentemente R o I, incluso más preferentemente R, en la posición de aminoácido 47;
(oo) R, Q, K, E, T o M, más preferentemente Q, K, E, T o M, en la posición de aminoácido 50;
(pp) K, T, S, N, Q o P, más preferentemente T, S, N, Q o P, en la posición de aminoácido 53;
(qq) I o M, más preferentemente M, en la posición de aminoácido 56;
(rr) H, S, F o Y, más preferentemente H, S o F, en la posición de aminoácido 57;
(ss) I, V o T, más preferentemente V o T, R, incluso más preferentemente T, en la posición de aminoácido 74;
(tt) R, Q o K, más preferentemente R o Q, incluso más preferentemente R, en la posición de aminoácido 82;
(uu) L o F, más preferentemente F, en la posición de aminoácido 91;
(vv) G, D, T o A, más preferentemente G, D o T, incluso más preferentemente T, en la posición de aminoácido 92;
(xx) S o N, más preferentemente N, en la posición de aminoácido 94;
(yy) F, Y o S, más preferentemente Y o S, incluso más preferentemente S, en la posición de aminoácido 101; y
(zz) D, F, H, E, L, A, T, V, S, G o I, más preferentemente H, E, L, A, T,V, S, G o I, incluso más preferentemente A o V, en la posición de aminoácido 103.
El sistema de numeración de AHo se describe además en Honegger, A. y Pluckthun, A. (2001) J. Mol. Biol. 309:657-670). Como alternativa, se puede utilizar el sistema de numeración de Kabat tal como se describe además en Kabat et al. (Kabat, E. A., et al., (1991) Sequences o f Proteins o f Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de Estados Unidos, Publicación de NIH N.° 91-3242). Se proporcionan tablas de conversión para los dos sistemas de numeración diferentes utilizados para identificar posiciones de residuos aminoacídicos en regiones variables de cadena pesada y ligera en A. Honegger, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670.
En ciertas realizaciones preferidas, el inmunoligador comprende una mutación que mejora la solubilidad en una posición de aminoácido seleccionada del grupo de posiciones de aminoácido de cadena pesada que consiste en 12, 103 y 144 (convenio de numeración de AHo). En una realización preferida, el inmunoligador comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: (a) Serina (S) en la posición de aminoácido de cadena pesada 12; (b) Serina (S) o Treonina (T) en la posición de aminoácido de cadena pesada 103; y (c) Serina (S) o Treonina (T) en la posición de aminoácido de cadena pesada 144. En otra realización, el inmunoligador comprende las siguientes sustituciones: (a) Serina (S) en la posición de aminoácido de cadena pesada 12; (b) Serina (S) o Treonina (T) en la posición de aminoácido de cadena pesada 103; y (c) Serina (S) o Treonina (T) en la posición de aminoácido de cadena pesada 144.
Hibridomas que expresan anticuerpos anti-VEGF de conejo
En otro aspecto, la divulgación no reivindicada proporciona un hibridoma que expresa un anticuerpo monoclonal que comprende una cualquiera o más de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID No 72-81 y SEQ ID No 107-117. En la técnica se conocen bien métodos para generar hibridomas a partir de linfocitos B de conejo y éstos se desvelan, por ejemplo, en la solicitud de Patente de EE.UU. N.° 2005/0033031.
Producción de inmunoligadores anti-VEGF
Los anticuerpos o derivados de anticuerpo pueden generarse utilizando técnicas rutinarias en el campo de la genética recombinante. Conociendo las secuencias de los polipéptidos, se pueden generar los ADNc que las codifican mediante síntesis génica (www.genscript.com). Estos ADNc se pueden clonar en plásmidos vectoriales adecuados. Una vez que se obtiene el ADN que codifica un dominio VL y/o un dominio VH, se puede realizar una mutagénesis dirigida al sitio, por ejemplo, mediante PCR utilizando cebadores mutagénicos, para obtener diferentes derivados. La mejor secuencia «de partida» se puede elegir dependiendo del número de alteraciones deseadas en las secuencias VL y/o VH.
Los métodos para incorporar o injertar CDR en regiones de armazón incluyen los presentados en, p. ej., Riechmann, L. et al., (1998) Nature 332:323-327: Jones, P et al., (1986) Nature 321:522-525: Queen, C. et al., (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033; Patente de EE.UU. N.° 5.225.539 de Winter y Patentes de EE.UU. N.° 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 de Queen et al.
Se pueden utilizar técnicas de clonación y mutagénesis estándar muy conocidas por el experto en la técnica para acoplar conectores, reordenar dominios o construir fusiones para la producción de fragmentos Fab. Se describen protocolos básicos que dan a conocer los métodos generales de esta invención en Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook y Russell, 3.a ed. 2001) y en Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 1999).
La secuencia de ADN que alberga un gen que codifica un polipéptido de scFv, o en el caso de fragmentos Fab, que codifica bien dos genes separados o bien un operón bicistrónico que comprende los dos genes para las fusiones VL-Ck y VH-CH1 se clonan en un vector de expresión adecuada, preferentemente uno con un promotor inducible. Se debe procurar que delante de cada gen haya presente un sitio de unión al ribosoma apropiado que garantice la traducción. Debe entenderse que los anticuerpos desvelados, pero no reivindicados, comprenden las secuencias desveladas en lugar de consistir en ellas. Por ejemplo, las estrategias de clonación pueden requerir que se prepare un constructo a partir del cual un anticuerpo con uno o unos pocos residuos adicionales en el extremo aminoterminal están presentes. Específicamente, la metionina derivada del codón iniciador puede estar presente en la proteína final en casos donde no se ha escindido postraduccionalmente. La mayoría de los constructos para anticuerpos scFv dan lugar a una alanina adicional en el extremo aminoterminal. En un aspecto preferido de la divulgación no reivindicada se elige un vector de expresión para la expresión periplásmica en E. coli (Krebber, 1997). Dicho vector comprende un promotor delante de una secuencia señal escindible. La secuencia codificante para el péptido de anticuerpo se fusiona entonces en el mismo marco de lectura con la secuencia señal escindible. Esto permite dirigir el polipéptido expresado al periplasma bacteriano donde la secuencia señal se escinde. Entonces el anticuerpo se pliega. En el caso de los fragmentos Fab, ambos péptidos de las fusiones VL-Ck y VH-CH1 deben estar unidos a una señal de exportación. El enlace S-S covalente se forma en las cisteínas carboxiterminales una vez que los péptidos han llegado al periplasma. Si se prefiere la expresión citoplásmica de anticuerpos, dichos anticuerpos normalmente se pueden obtener en rendimientos altos a partir de cuerpos de inclusión, que se pueden separar fácilmente de otros fragmentos celulares y proteína. En este caso, los cuerpos de inclusión se solubilizan en un agente desnaturalizante tal como, p. ej., clorhidrato de guanidina (GndHCl) y a continuación se repliegan mediante procedimientos de renaturalización muy conocidos por los expertos en la técnica.
Se introducen plásmidos que expresan los polipéptidos de scFv o Fab en un hospedador adecuado, preferentemente una célula bacteriana, de levadura o de mamífero, con la mayor preferencia una cepa de E. coli adecuada como, por ejemplo, JM83 para la expresión periplásmica o BL21 para la expresión en cuerpos de inclusión. El polipéptido se puede recoger ya sea a partir del periplasma o a partir de cuerpos de inclusión y purificar utilizando técnicas estándar tales como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía en fase inversa, cromatografía de afinidad y/o filtración en gel conocidas por el experto en la técnica.
Los anticuerpos o derivados de anticuerpos de la presente divulgación pueden caracterizarse con respecto al rendimiento, la solubilidad y la estabilidad in vitro. Las capacidades de unión respecto a VEGF, preferentemente respecto a VEGF humano, se pueden evaluar in vitro mediante ELISA o resonancia de plasmones superficiales (BIACore), utilizando VEGF humano recombinante tal como se describe en el documento WO9729131, permitiendo este último método determinar también la constante de velocidad k f que debe ser preferentemente de menos de 1 0 'V . Se prefieren valores de Kd á10 nM.
Aparte de anticuerpos con una fuerte afinidad de unión por VEGF humano, también es deseable seleccionar anticuerpos anti-VEGF que tengan otras propiedades beneficiosas desde una perspectiva terapéutica. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser uno que inhiba el crecimiento de células HUVEC en respuesta a VEGF (véase el Ejemplo 3). En una realización, el anticuerpo puede ser capaz de inhibir la proliferación de células HUVEC en respuesta a una concentración casi máximamente eficaz de VEGF (0,08 nM). Preferentemente, el anticuerpo tiene un valor de dosis eficaz 50 (DE50) de no más de aproximadamente 5 nM, preferentemente de no más de aproximadamente 1 nM, preferentemente de no más de aproximadamente 1 nM, preferentemente de no más de aproximadamente 0,5 nM y con la mayor preferencia de no más de aproximadamente 0,06 nM, para inhibir la proliferación inducida por VEGF de células endoteliales en este «ensayo de crecimiento de células endoteliales», es decir, a estas concentraciones el anticuerpo es capaz de inhibir el crecimiento de células endoteliales inducido por VEGF in vitro, p. ej., un 50 % o más.
Moléculas biespecíficas
En otro aspecto, la divulgación no reivindicada presenta moléculas biespecíficas que comprenden un anticuerpo anti-VEGF, o un fragmento del mismo. Un anticuerpo o partes de unión a antígeno del mismo, puede derivatizarse o unirse a otra molécula funcional, p. ej., a otro péptido o proteína (p. ej., a otro anticuerpo o ligando de un receptor) para generar una molécula biespecífica que se una a al menos dos sitios de unión o moléculas diana diferentes. El anticuerpo puede derivatizarse o unirse a más de una molécula funcional diferente para generar moléculas multiespecíficas que se unan a más de dos sitios de unión y/o moléculas diana diferentes; se pretende que tales moléculas multiespecíficas también estén englobadas en el término «molécula biespecífica» tal como se utiliza en la presente. Para crear una molécula biespecífica, un anticuerpo puede unirse funcionalmente (p. ej., mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más moléculas de unión diferentes, tales como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, antígenos específicos dr un tumor o específicos de un patógeno, péptido o mimético de unión, de modo que se produzca una molécula biespecífica. Por consiguiente, la divulgación no reivindicada incluye moléculas biespecíficas que comprenden al menos una primera molécula de unión que tiene especificidad por VEGF y una segunda molécula de unión que tiene especificidad por uno o más epítopos diana adicionales.
En una realización, las moléculas biespecíficas comprenden una especificidad de unión con al menos un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo del mismo, que incluye, p. ej., un Fab, Fab', F(ab')2, Fv o un Fv monocatenario. El anticuerpo también puede ser un dímero de cadena ligera o cadena pesada, o cualquiera de sus fragmentos mínimos tales como un Fv o un constructo monocatenario, como se describe en la Patente de EE.UU. N.° 4946778 de Ladner et al.
Aunque se prefieren los anticuerpos monoclonales humanos, otros anticuerpos que se pueden emplear en las moléculas biespecíficas son anticuerpos monoclonales murinos, quiméricos y humanizados.
Las moléculas biespecíficas pueden prepararse conjugando las especificidades de unión constituyentes usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, cada especificidad de unión de la molécula biespecífica se puede generar por separado y después conjugarse entre sí. Cuando las especificidades de unión son proteínas o péptidos, puede utilizarse una diversidad de agentes de acoplamiento o de entrecruzamiento para la conjugación covalente. Como ejemplos de agentes de entrecruzamiento se incluyen la proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilendimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) y 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC) (véase, p. ej., Karpovsky et al., (l984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al., (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:8648). Otros métodos incluyen los descritos en Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. N.° 78, 118-132; Brennan et al., (1985) Science 229:81-83) y Glennie et al., (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Los agentes de conjugación preferidos son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles en Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
Cuando las especificidades de unión son anticuerpos, se pueden conjugar mediante enlace sulfhidrílico, por ejemplo, a través de las regiones bisagra del extremo C de las dos cadenas pesadas u otros sitios, ya sean de origen natural o introducidos de forma artificial. En una realización particularmente preferida, la región bisagra se modifica para que contenga un número impar de residuos sulfhidrilo, preferentemente uno, antes de la conjugación.
Como alternativa, ambas especificidades de unión se pueden codificar en el mismo vector, y expresarse y ensamblarse en la misma célula hospedadora. Este método es particularmente útil cuando la molécula biespecífica es una proteína de fusión mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 o ligando x Fab. Una molécula biespecífica puede ser una molécula monocatenaria que comprenda un anticuerpo monocatenario y un determinante de unión, o una molécula biespecífica monocatenaria que comprenda dos determinantes de unión. Las moléculas biespecíficas pueden comprender al menos dos moléculas monocatenarias. Además, una molécula biespecífica puede ser un scFv que se une específicamente a una primera diana, donde los VH y VL de dicho scFv están unidos con un conector flexible que comprende un dominio que proporciona unión específica a una segunda diana. Se describen conectores adecuados en la Solicitud Provisional Estadounidense N.° 60/937.820. Se describen métodos para preparar moléculas biespecíficas, por ejemplo, en la Patente Estadounidense Número 5.260.203; Patente Estadounidense Número 5.455.030; Patente Estadounidense Número 4.881.175; Patente Estadounidense Número 5.132.405; Patente Estadounidense Número 5.091.513; Patente Estadounidense Número 5.476.786; Patente Estadounidense Número 5.013.653; Patente Estadounidense Número 5.258.498; y Patente Estadounidense Número 5.482.858.
La unión de las moléculas biespecíficas a sus dianas específicas se puede confirmar, por ejemplo, mediante un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), análisis FACS, bioensayo (p. ej., inhibición del crecimiento) o ensayo de inmunotransferencia. Cada uno de estos ensayos detecta generalmente la presencia de complejos de proteína-anticuerpo de interés particular empleando un reactivo marcado (por ejemplo, un anticuerpo) específico para el complejo de interés. Por ejemplo, los complejos de VEGF-anticuerpo se pueden detectar utilizando, p. ej., un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, unido a una enzima, que reconoce y se une específicamente a los complejos de anticuerpo-VEGF. Como alternativa, los complejos se pueden detectar utilizando cualquiera de una diversidad de inmunoensayos diferentes. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse radioactivamente y utilizarse en un radioinmunoensayo (RIA) (véase, por ejemplo, Weintraub, B., Principies o f Radioimmunoassays, Séptimo Curso de Formación sobre Técnicas de Ensayo con Radioligandos, Asociación de Endocrinología Estadounidense, marzo, 1986).
El isotopo radioactivo se puede detectar por medios tales como el uso de un contador de<y>o un contador de centelleo o mediante autorradiografía.
Inmunoconjugados
En otro aspecto, la divulgación no reivindicada se refiere a un anticuerpo anti-VEGF, o a un fragmento del mismo, conjugado con un resto terapéutico, tal como una citotoxina, un fármaco (p. ej., un inmunosupresor) o una radiotoxina. En la presente, tales conjugados se denominan «inmunoconjugados». Los inmunoconjugados que incluyen una o más citotoxinas se denominan «inmunotoxinas». Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células (p. ej., que las destruya). Los ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina, y análogos u homólogos de estos. Los agentes terapéuticos también incluyen, por ejemplo, antimetabolitos (p. ej., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil dacarbazina), agentes alquilantes (p. ej., mecloretamina, tiotepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (p. ej., daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (p. ej., dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)) y agentes antimitóticos (p. ej., vincristina y vinblastina).
Otros ejemplos preferidos de citotoxinas terapéuticas que se pueden conjugar con un anticuerpo incluyen duocarmicinas, calicheamicinas, maitansinas y auristatinas, y derivados de estas. En el comercio se dispone de un ejemplo de un conjugado de anticuerpo con calicheamicina (Mylotarg™; Wyeth-Ayerst).
Las citotoxinas se pueden conjugar con anticuerpos utilizando la tecnología de conector disponible en la materia. Los ejemplos de tipos de conectores que se han utilizado para conjugar una citotoxina con un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, hidrazonas, tioéteres, ésteres, disulfuros y conectores que contienen péptidos. Se puede elegir un conector que sea, por ejemplo, susceptible de escisión por pH bajo dentro del compartimiento lisosómico o susceptible de escisión por proteasas, tales como proteasas expresadas preferentemente en tejido tumoral tal como catepsinas (p. ej., catepsinas B, C, D).
Para un análisis más profundo de los tipos de citotoxinas, conectores y métodos para conjugar agentes terapéuticos con anticuerpos, véanse también Saito, G. et al., (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, PA. et al., (2003) CáncerImmunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cáncer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cáncer 2:750-763; Pastan, I. y Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. y Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.
Los anticuerpos también pueden conjugarse con un isótopo radiactivo para generar radiofármacos citotóxicos, también denominados radioinmunoconjugados. Los ejemplos de isótopos radioactivos que se pueden conjugar con anticuerpos para uso diagnóstico o terapéutico incluyen, pero no se limitan a, yodo131, indio111, itrio90 y lutecio177. Los métodos para preparar radioinmunoconjugados están consolidados en la técnica. En el comercio se dispone de ejemplos de radioinmunoconjugados, incluyendo Zevalin™ (IDEC Pharmaceuticals) y Bexxar™ (Corixa Pharmaceuticals), y utilizando los anticuerpos desvelados pero no reivindicados, pueden utilizarse métodos similares para preparar radioinmunoconjugados.
Los conjugados de anticuerpo pueden utilizarse para modificar una respuesta biológica dada, y no debe interpretarse que el resto farmacéutico se limite a agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto farmacéutico puede ser una proteína o polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa o fragmento activo de esta, tal como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas o toxina diftérica; una proteína tal como el factor de necrosis tumoral o interferón-Y; o modificadores de la respuesta biológica tales como, por ejemplo, linfocinas, interleucina-1 («IL-1»), interleucina-2 («IL-2»), interleucina-6 («IL-6»), factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos («GM-CSF»), factor estimulador de colonias de granulocitos («G-CSF») u otros factores de crecimiento.
Las técnicas para conjugar un resto terapéutico de este tipo con anticuerpos son muy conocidas, véase, p. ej., Arnon et al., «Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy», en MonoclonalAntibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., «Antibodies For Drug Delivery», en Controlled Drug Delivery (2.a Ed.), Robinson et al. (eds.), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc.
1987); Thorpe, «Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review», en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985); «Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy», en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), págs. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al., «The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates», Immunol. Rev. 62:119-58 (1982).
Usos de anticuerpos anti-VEGF
Para aplicaciones terapéuticas, los anticuerpos anti-VEGF de la invención se administran a un mamífero, preferentemente un ser humano, en una forma farmacéutica farmacéuticamente aceptable tal como aquellas explicadas en la presente, que incluyen las que se pueden administrar a un ser humano por vía intravenosa, como un bolo o por infusión continua a lo largo de un periodo de tiempo, por vía tópica, intraocular, intramuscular, intraperitoneal, intracefalorraquídea, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral o inhalatoria. Los anticuerpos también se pueden administrar convenientemente por vía intratumoral, peritumoral, intralesional o perilesional, para ejercer efectos terapéuticos locales sí como sistémicos. Cabe esperar que la vía intraperitoneal sea particularmente útil, por ejemplo, en el tratamiento de tumores ováricos.
Para la prevención o el tratamiento de una enfermedad, la dosificación apropiada de anticuerpo dependerá del tipo de enfermedad que se vaya a tratar, tal como se ha definido anteriormente, la gravedad y la evolución de la enfermedad, si el anticuerpo se administra a efectos preventivos o terapéuticos, la terapia previa, la anamnesis del paciente y la respuesta al anticuerpo, y el criterio del médico responsable. El anticuerpo se administra convenientemente al paciente una vez o a lo largo de una serie de tratamientos.
Los anticuerpos anti-VEGF son útiles en el tratamiento de enfermedades mediadas por VEGF tal como se describe en la presente. Por ejemplo, la degeneración macular senil (AMD) es una de las causas principales de la pérdida de visión grave en la población anciana. La forma exudativa de AMD se caracteriza por la neovascularización coroidea y el desprendimiento de células epiteliales del pigmento retiniano. Debido a que la neovascularización coroidea se asocia con un empeoramiento drástico en el pronóstico, los anticuerpos contra VEGF de la presente invención son especialmente útiles en la reducción de la gravedad de AMD. La evolución de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante técnicas convencionales, que incluyen oftalmoscopia, microscopia del fondo de ojo y tomografía computarizada ocular.
De acuerdo con otra realización de la invención, la efectividad del anticuerpo en la prevención o el tratamiento de la enfermedad se puede mejorar administrando el anticuerpo en serie o junto con otro agente que sea eficaz para esos fines, tal como el factor de necrosis tumoral (TNF, por sus siglas en inglés), un anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar la actividad angiogénica del factor de crecimiento fibroblástico (FGF) ácido o básico o el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), un anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar las actividades coagulantes del factor tisular, proteína C o proteína S (véase Esmon et al., Publicación de Patente de PCT N.° WO 91/01753, publicada el 21 de febrero de 1991), un anticuerpo capaz de unirse al receptor de HER2 (véase Hudziak et al., Publicación de Patente de PCT N^ WO 89/06692, publicada el 27 de julio de 1989), o uno o más agentes terapéuticos convencionales tales como, por ejemplo, agentes alquilantes, fotocoagulantes ( tales como verteporfina), antagonistas del ácido fólico, anti-metabolitos del metabolismo de ácidos nucleicos, antibióticos, análogos de pirimidina, 5-fluorouracilo, cisplatino, nucleósidos purínicos, aminas, aminoácidos, nucleósidos triazólicos o corticosteroides. Estos otros agentes pueden estar presentes en la composición que se está administrando o se pueden administrar por separado. Además, el anticuerpo se puede administrar convenientemente en serie o en combinación con tratamientos radiológicos, ya sea que impliquen irradiación o la administración de sustancias radioactivas.
Los anticuerpos de la invención se pueden utilizar como agentes de purificación por afinidad. En este proceso, los anticuerpos se inmovilizan en una fase sólida tal como una resina Sephadex o papel de filtro, utilizando métodos muy conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene la proteína VEGF (o fragmento de esta) que se desea purificar, y posteriormente el soporte se lava con un disolvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material en la muestra salvo la proteína VEGF, que está unida al anticuerpo inmovilizado. Por último, el soporte se lava con otro disolvente adecuado, tal como un tampón de glicina, pH 5,0, que liberará la proteína VEGF del anticuerpo.
Los anticuerpos anti-VEGF también pueden ser útiles en ensayos de diagnóstico para la proteína VEGF, p. ej., detectando su expresión en células, tejidos o suero específicos. Tales métodos de diagnóstico pueden ser útiles en el diagnóstico del cáncer.
Para aplicaciones de diagnóstico, el anticuerpo se marcará normalmente con un resto detectable. Existen numerosos marcadores disponibles que se pueden agrupar generalmente en las siguientes categorías:
(a) Radioisótopos, tales como 111In, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P o 35S. El anticuerpo se puede marcar con el radioisótopo utilizando las técnicas descritas en Current Protocols in Immunology, Tomos 1 y 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, Nueva York, N.Y, Pubs. (1991), por ejemplo, y la radioactividad se puede medir utilizando conteo de centelleo.
(b) Marcadores fluorescentes tales como quelatos de tierras raras (quelatos de europio) o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, Lisamina, ficoeritrina y Rojo Texas. Los marcadores fluorescentes se pueden conjugar con el anticuerpo utilizando las técnicas desveladas, por ejemplo, en Current Protocols in Immunology, citado anteriormente. La fluorescencia se puede cuantificar utilizando un fluorímetro.
(c) Existen diversos marcadores de enzima-sustrato disponibles y la Pat. Estadounidense N.° 4.275.149 proporciona un análisis de estos. La enzima generalmente cataliza una alteración química del sustrato cromogénico que se puede medir utilizando varias técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato, que se puede medir espectrofotométricamente. Como alternativa, la enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Anteriormente se han descrito técnicas para cuantificar un cambio en la fluorescencia. El sustrato quimioluminiscente pasa a un estado electrónico excitado mediante una reacción química y puede emitir entonces luz que se puede medir (utilizando un quimioluminómetro, por ejemplo) o dona energía a un aceptor fluorescente. Los ejemplos de marcadores enzimáticos incluyen luciferasas (p. ej., luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; Patente de EE.UU. N.° 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinodionas, malatodeshidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rábano picante (HRPO), fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacáridos (p. ej., glucosaoxidasa, galactosaoxidasa y glucosa-6-fosfatodeshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (tales como uricasa y xantinaoxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa y similares. Se describen técnicas de conjugación de enzimas con anticuerpos en O'Sullivan et al., Methods for the Preparation o f Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, en Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, Nueva York, 73:147-166 (1981). Los ejemplos de combinaciones de enzima-sustrato incluyen, por ejemplo:
(i) peroxidasa de rábano picante (HRPO) con hidrógenoperoxidasa como sustrato, en donde la hidrógenoperoxidasa oxida un precursor colorante (por ejemplo, orto-fenilendiamina (OPD) o clorhidrato de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB));
(ii) fosfatasa alcalina (AP) con para-nitrofenilfosfato como sustrato cromógeno; y
iii) beta-D-galactosidasa (beta-D-Gal) con un sustrato cromogénico (por ejemplo, P-nitrofenil-beta-D-galactosidasa) o sustrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-beta-D- galactosidasa.
En otra realización de la invención, no es necesario marcar el anticuerpo anti-VEGF y su presencia se puede detectar utilizando un anticuerpo marcado que se une al anticuerpo contra VEGF.
Los anticuerpos de la presente invención se pueden emplear en cualquier método de ensayo conocido, tal como ensayos de unión competitiva, ensayos de tipo sándwich y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual o f Techniques, págs.147-158 (CRC Press, Inc. 1987).
Los ensayos de unión competitiva se basan en la capacidad de un patrón marcado para competir con el analito de la muestra de prueba por la unión con una cantidad limitada de anticuerpo. La cantidad de proteína VEGF en la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad de patrón que se llega a unir a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de patrón que se llega a unir, los anticuerpos generalmente se insolubilizan antes o después de la competición, de modo que el patrón y el analito que están unidos a los anticuerpos se puedan separar convenientemente del patrón y el analito que quedan sin unirse.
Los ensayos de tipo sándwich implican el uso de dos anticuerpos, cada uno capaz de unirse a una porción inmunógena o epítopo diferente, de la proteína que se ha de detectar. En un ensayo de tipo sándwich, un primer anticuerpo que está inmovilizado en un suporte sólido se une al analito de la muestra de prueba, y después un segundo anticuerpo se une al analito, para formar así un complejo de tres partes insoluble. Véanse, p. ej., las patentes de los EE. UU. NY 4.376.110. El segundo anticuerpo puede estar de por sí marcado con un resto detectable (ensayos de tipo sándwich directos) o se puede medir utilizando un anticuerpo anti-inmunoglobulina que está marcado con un resto detectable (ensayo de tipo sándwich indirecto). Por ejemplo, un tipo de ensayo de tipo sándwich es un ensayo ELISA, en cuyo caso el resto detectable es una enzima.
Para la inmunohistoquímica, la muestra tumoral puede ser fresca o estar congelada, o puede estar embebida en parafina o fijada con un conservante tal como formalina, por ejemplo.
Los anticuerpos también se pueden utilizar para ensayos de diagnóstico in vivo. Generalmente, el anticuerpo está marcado con un radionúclido (tal como 111In, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P o 35S) de tal modo que el tumor se pueda localizar utilizando inmunogammagrafía.
El anticuerpo de la presente invención se puede proporcionar en un kit, una combinación envasada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para realizar el ensayo de diagnóstico. Cuando el anticuerpo está marcado con una enzima, el kit incluirá sustratos y cofactores requeridos por la enzima (por ejemplo, un precursor de sustrato que proporcione el cromóforo o fluoróforo detectable). Además, se pueden incluir otros aditivos tales como estabilizantes, tampones (por ejemplo, un tampón de bloqueo o tampón de lisis) y similares. Las cantidades relativas de los diferentes reactivos se pueden variar mucho para proporcionar concentraciones en disolución de los reactivos que optimicen sustancialmente la sensibilidad del ensayo. Particularmente, los reactivos se pueden proporcionar como polvos secos, habitualmente liofilizados, que incluyen excipientes que al disolverse proporcionarán una disolución de los reactivos con la concentración apropiada.
Preparados farmacéuticos
En un aspecto, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos anti-VEGF para el tratamiento de enfermedades mediadas por VEGF. El término «formulación farmacéutica» se refiere a preparados que están en una forma tal que permita que la actividad biológica del anticuerpo o derivado de anticuerpo sea inequívocamente eficaz, y que no contienen componentes adicionales que sean tóxicos para los sujetos a los que se les administraría la formulación. Los excipientes (vehículos, aditivos) «farmacéuticamente aceptables» son aquellos que se pueden administrar razonablemente a un sujeto que es un mamífero para proporcionar una dosis eficaz del principio activo empleado.
Una formulación «estable» es una en la que el anticuerpo o derivado de anticuerpo de esta conserva esencialmente su estabilidad física y/o estabilidad química y/o actividad biológica tras su almacenamiento. En la técnica se dispone de varias técnicas analíticas para medir la estabilidad de proteínas y se explican en Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y, Pubs. (1991) y Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993), por ejemplo. La estabilidad se puede medir a una temperatura seleccionada durante un periodo de tiempo seleccionado. Preferentemente, la formulación es estable a temperatura ambiente (aproximadamente 30° C) o a 40° C durante al menos 1 semana y/o estable a aproximadamente 2-8° C durante de al menos 3 meses a 2 años. Además, la formulación es preferentemente estable después de congelar (por ejemplo, a -70°C) y descongelar la formulación.
Un anticuerpo o derivado de anticuerpo «conserva su estabilidad física» en una formulación farmacéutica si cumple las especificaciones de liberación definidas para la agregación, degradación, precipitación y/o desnaturalización tras la inspección visual del color y/o la transparencia, o según se mide por dispersión de la luz UV o por cromatografía de exclusión por tamaño, u otros métodos reconocidos en la técnica adecuados.
Un anticuerpo o derivado de anticuerpo «conserva su estabilidad química» en una formulación farmacéutica, si la estabilidad química en un momento dado es tal que se considera que la proteína sigue conservando su actividad biológica tal como se define a continuación. La estabilidad química se puede evaluar detectando y cuantificando químicamente formas alteradas de la proteína. La alteración química puede implicar la modificación del tamaño (p. ej., recorte) que se puede evaluar utilizando cromatografía de exclusión por tamaño, SDS-PAGE y/o ionización/desorción mediante láser asistida por matriz/espectrometría de masas de tiempo de vuelo y (MALDI/TOF MS), por ejemplo. Otros tipos de alteración química incluyen la alteración de la carga (p. ej., que tiene lugar como resultado de la desamidación) que se puede evaluar mediante cromatografía de intercambio iónico, por ejemplo.
Un anticuerpo o derivado de anticuerpo «conserva su actividad biológica» en una formulación farmacéutica, si la actividad biológica del anticuerpo en un momento dado difiere como máximo en aproximadamente un 10% (dentro de los márgenes de error del ensayo) respecto a la actividad biológica presentada en el momento en el que se preparó la formulación farmacéutica según se determina en un ensayo de unión a antígeno, por ejemplo. Otros ensayos de «actividad biológica» para anticuerpo se explican detalladamente más adelante en la presente.
Por «isotónica» se entiende que la formulación de interés tiene esencialmente la misma presión osmótica que la sangre humana. Las formulaciones isotónicas generalmente tendrán una presión osmótica de aproximadamente 250 a 350 mOsm. La isotonicidad se puede medir utilizando un osmómetro de tipo presión de vapor o congelación de hielo, por ejemplo.
Un «poliol» es una sustancia con múltiples grupos hidroxilo, e incluye azúcares (azúcares reductores y no reductores), alcoholes de azúcar y ácidos de azúcar. Los polioles preferidos en la presente tienen un peso molecular que es menor de aproximadamente 600 kD (p. ej., en el intervalo de aproximadamente 120 a aproximadamente 400 kD). Un «azúcar reductor» es aquel que contiene un grupo hemiacetal que puede reducir iones metálicos o reaccionar covalentemente con lisina y otros grupos amino en proteínas y un «azúcar no reductor» es aquel que no tiene estas propiedades de un azúcar reductor. Son ejemplos de azúcares reductores la fructosa, manosa, maltosa, lactosa, arabinosa, xilosa, ribosa, ramnosa, galactosa y glucosa. Los azúcares no reductores incluyen sacarosa, trehalosa, sorbosa, melecitosa y rafinosa. El manitol, xilitol, eritritol, treitol, sorbitol y glicerol son ejemplos de alcoholes de azúcar. En lo que respecta a ácidos de azúcar, estos incluyen L-gluconato y sus sales metálicas. Cuando se desea que la formulación sea estable a la congelación-descongelación, el poliol es preferentemente uno que no cristalice a temperaturas de congelación (por ejemplo, -20°C) de tal modo que desestabilice el anticuerpo en la formulación. Los azúcares no reductores tales como sacarosa y trehalosa son los polioles preferidos en la presente, con preferencia por la trehalosa frente a la sacarosa, debido a la superior estabilidad en disolución de la trehalosa.
Tal como se utiliza en la presente, «tampón» se refiere a una disolución tamponada que resiste cambios en el pH por la acción de sus componentes de conjugado ácido-base. El tampón de esta invención tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 8,0; preferentemente de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 7. Como ejemplos de tampones que controlen el pH en este intervalo se incluyen tampones de acetato (p. ej., acetato de sodio), succinato (tal como succinato de sodio), gluconato, histidina, citrato y otros ácidos orgánicos. Cuando se desea una formulación estable a la congelación-descongelación, preferentemente el tampón no es fosfato.
En un sentido farmacológico, en el contexto de la presente invención, una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un anticuerpo o derivado de anticuerpo se refiere a una cantidad eficaz en la prevención o el tratamiento de un trastorno para cuyo tratamiento el anticuerpo o derivado de anticuerpo es eficaz. Una «enfermedad/trastorno» es cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento con el anticuerpo o derivado de anticuerpo. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas que incluyen aquellas afecciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión.
Un «conservante» es un compuesto que se puede incluir en la formulación para reducir esencialmente la acción bacteriana en esta, lo cual facilita así la producción de una formulación multiuso, por ejemplo. Los ejemplos de conservantes potenciales incluyen cloruro de octadecildimetilbencilamonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio (una mezcla de cloruros de alquilbencildimetilamonio en la que los grupos alquilo son compuestos de cadena larga) y cloruro de bencetonio. Otros tipos de conservantes incluyen alcoholes aromáticos tales como fenol, alcohol butílico y bencílico, alquilparabenos tales como metil- o propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol y m-cresol. El conservante más preferido en la presente es el alcohol bencílico.
La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más anticuerpos o compuestos derivados de anticuerpo, junto con al menos un portador o excipiente fisiológicamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender, por ejemplo, uno o más de agua, tampones (por ejemplo, solución salina tamponada neutra o solución salina tamponada con fosfato), etanol, aceite mineral, aceite vegetal, sulfóxido de dimetilo, hidratos de carbono, (por ejemplo, glucosa, manosa, sacarosa o dextranos), manitol, proteínas, adyuvantes, polipéptidos o aminoácidos tales como glicina, antioxidantes, agentes quelantes tales como EDTA o glutatión y/o conservantes. Tal como se ha indicado anteriormente, otros principios activos se pueden incluir (pero no es necesario) en las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente.
Un portador es una sustancia que se puede asociar con un anticuerpo o derivado de anticuerpo antes de la administración a un paciente, a menudo a fin de controlar la estabilidad o biodisponibilidad del compuesto. Los portadores para su uso dentro de tales formulaciones son generalmente biocompatibles y también pueden ser biodegradables. Los portadores incluyen, por ejemplo, moléculas monovalentes o multivalentes tales como seroalbúmina (p. ej., humana o bovina), albúmina de huevo, péptidos, polilisina y polisacáridos tales como aminodextrano y poliamidoaminas. Los portadores también incluyen materiales de soporte sólidos tales como perlas y micropartículas que comprenden, por ejemplo, polilactato poliglicolato, poli(láctido-co-glicólido), poliacrilato, látex, almidón, celulosa o dextrano. Un portador puede portar los compuestos de diversas formas, que incluyen enlace covalente (ya sea directamente o a través de un grupo conector), interacción no covalente o mezcla.
Las composiciones farmacéuticas se pueden formular para cualquier forma apropiada de administración, que incluye, por ejemplo, la administración tópica, intraocular, oral, nasal, rectal o parenteral. En ciertas realizaciones, se prefieren composiciones en una forma adecuada para el uso tópico, por ejemplo, como colirio. Otras formas incluyen, por ejemplo, pastillas, comprimidos, sellos, grageas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos dispersables, emulsión, cápsulas duras o blandas, o jarabes o elixires. En otras realizaciones más, las composiciones proporcionadas en la presente se pueden formular como un liofilizado. El término parenteral, tal como se utiliza en la presente, incluye inyección subcutánea, intradérmica, intravascular (por ejemplo, intravenosa), intramuscular, raquídea, intracraneal, intratecal e intraperitoneal, así como cualquier técnica de inyección o infusión similar.
La composición farmacéutica se puede preparar como una suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril en la que el modulador, dependiendo del vehículo y la concentración utilizados, está bien suspendido o bien disuelto en el vehículo. Una composición de este tipo se puede formular de acuerdo con la técnica conocida utilizando dispersantes, agentes humectantes y/o agentes de suspensión adecuados tales como los mencionados anteriormente. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear están el agua, 1,3-butanodiol, disolución de Ringer y disolución de cloruro de sodio isotónica. Además, se pueden emplear aceites fijos, estériles como un medios de suspensión o disolvente. A este efecto, se puede emplear cualquier aceite fijo insípido, incluidos mono- o diglicéridos sintéticos. Además, se pueden utilizar ácidos grasos tales como el ácido oleico en la preparación de composiciones inyectables, y se pueden disolver adyuvantes tales como anestésicos locales, conservantes y/o agentes tamponantes en el vehículo.
Las composiciones farmacéuticas pueden formularse como formulaciones de liberación sostenida (es decir, una formulación tal como una cápsula que efectúa una liberación lenta del modulador después de su administración). Tales formulaciones se pueden preparar generalmente utilizando tecnología muy conocida y administrar mediante, por ejemplo, implantación oral, rectal o subcutánea, o mediante implantación en el sitio diana deseado. Los portadores para su uso dentro de tales formulaciones son biocompatibles, y también pueden ser biodegradables; preferentemente la formulación proporciona un nivel relativamente constante de liberación del modulador. La cantidad de un anticuerpo o derivado de anticuerpo contenida dentro de una formulación de liberación sostenida depende de, por ejemplo, el sitio de implantación, la velocidad y la duración esperada de la liberación y la naturaleza de la enfermedad/trastorno que se ha de tratar o prevenir.
El anticuerpo o derivados de anticuerpo proporcionados en la presente se administran generalmente en una cantidad que consigue una concentración en un líquido corporal (p. ej., sangre, plasma, suero, LCR, líquido sinovial, linfa, líquido intersticial celular, lágrimas u orina) que es suficiente para unirse de forma detectable al VEGF y prevenir o inhibir enfermedades/trastornos mediados por VEGF. Una dosis se considera que es eficaz si da como resultado un beneficio perceptible para el paciente tal como se describe en la presente. Las dosis sistémicas preferidas varían de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 140 mg por kilogramo de peso corporal al día (de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 7 g por paciente al día), multiplicándose las dosis orales generalmente por 5-20 respecto a las dosis intravenosas. La cantidad de anticuerpo o derivado de anticuerpo que se puede combinar con los materiales portadores para producir una única forma farmacéutica variará dependiendo del hospedador tratado y el modo particular de administración. Las formas farmacéuticas unitarias generalmente contendrán entre aproximadamente 1 mg a aproximadamente 500 mg de un principio activo.
Las composiciones farmacéuticas se pueden envasar para tratar afecciones que responden a un anticuerpo o derivado de anticuerpo dirigido a VEGF. Las composiciones farmacéuticas envasadas pueden incluir un recipiente que contenga una cantidad eficaz de al menos un anticuerpo o derivado de anticuerpo, como se describe en la presente, e instrucciones (p. ej. etiquetado) que indiquen que la composición contenida se utilizará para tratar una enfermedad/trastorno que responde a un anticuerpo o derivado de anticuerpo después de su administración al paciente.
Los anticuerpos o derivados de anticuerpo de la presente invención también se pueden modificar químicamente. Los grupos modificadores preferidos son polímeros, por ejemplo, un polímero de polialqueno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena lineal o ramificada sustituido opcionalmente, o un polisacárido ramificado o no ramificado. Tal grupo efector puede incrementar la semivida del anticuerpo in vivo. Los ejemplos particulares de polímeros sintéticos incluyen poli(etilenglicol) (PEG), poli(propilenglicol), poli(alcohol vinílico) de cadena lineal o ramificada sustituido opcionalmente, o derivados de estos. Los polímeros de origen natural particulares incluyen lactosa, amilosa, dextrano, glucógeno o derivados de estos. El tamaño del polímero se puede variar como se desee, pero generalmente estará en un intervalo de peso molecular promedio de 500 Da a 50000 Da. Para una aplicación local donde el anticuerpo se diseña para entrar en el tejido, un peso molecular preferido del polímero es de aproximadamente 5000 Da. Como se describe en el documento WO0194585, la molécula polimérica se puede unir al anticuerpo, en particular al extremo carboxiterminal de la cadena pesada del fragmento Fab a través un péptido bisagra unido de manera covalente. En lo que respecta al acoplamiento de restos de PEG, se hace referencia a «Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnological and Biomedical Applications», 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, Nueva York y «Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences», 1998, M. Aslam y A. Dent, Editorial Grove, Nueva York.
Después de preparar el anticuerpo o derivado de anticuerpo de interés, como se ha descrito anteriormente, se prepara la formulación farmacéutica que lo comprende. El anticuerpo que se ha de formular no se ha sometido a liofilización previa y la formulación de interés de la presente es una formulación acuosa. Preferentemente, el anticuerpo o derivado de anticuerpo de la formulación es un fragmento de anticuerpo, tal como un scFv. La cantidad terapéuticamente eficaz de anticuerpo presente en la formulación se determina teniendo en cuenta los volúmenes de dosis y el modo o modos de administración deseados, por ejemplo. De aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, preferentemente de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 40 mg/ml y con la mayor preferencia de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml es una concentración de anticuerpo a modo de ejemplo en la formulación.
Se prepara una formulación acuosa que comprende el anticuerpo o derivado de anticuerpo en una disolución reguladora del pH. El tampón de esta invención tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 8,0, preferentemente de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 7. Como ejemplos de tampones que controlarán el pH en de este intervalo se incluyen tampones de acetato (por ejemplo, de acetato de sodio), succinato (tal como succinato de sodio), gluconato, histidina, citrato y otros ácidos orgánicos. La concentración de tampón puede ser de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM, preferentemente de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 30 mM, dependiendo, por ejemplo, del tampón y la isotonicidad deseada de la formulación.
Se incluye un poliol, que actúa como un tonificador y puede estabilizar el anticuerpo, en la formulación. En realizaciones preferidas, la formulación no contiene una cantidad tonificante de una sal tal como cloruro de sodio, ya que esto puede hacer que el anticuerpo o derivado de anticuerpo precipite y/o puede provocar la oxidación a pH bajo. En realizaciones preferidas, el poliol es un azúcar no reductor, tal como sacarosa o trehalosa. El poliol se añade a la formulación en una cantidad que puede variar con respecto a la isotonicidad desead de la formulación. Preferentemente la formulación acuosa es isotónica, en cuyo caso las concentraciones adecuadas del poliol en la formulación están en el intervalo de aproximadamente un 1% a aproximadamente un 15% p/v, preferentemente en el intervalo de aproximadamente un 2% a aproximadamente un 10% p/v, por ejemplo. Sin embargo, las formulaciones hipertónicas o hipotónicas también pueden ser adecuadas. La cantidad de poliol añadida también puede variar con respecto al peso molecular del poliol. Por ejemplo, se puede añadir una menor cantidad de un monosacárido (p. ej., manitol), en comparación con un disacárido (tal como trehalosa).
También se añade un tensioactivo a la formulación de anticuerpo o derivado de anticuerpo. Como tensioactivos ilustrativos se incluyen tensioactivos no iónicos tales como polisorbatos (p. ej., polisorbatos 20, 80 etc) o poloxámeros (p. ej., poloxámero 188). La cantidad de tensioactivo añadida es tal que reduce la agregación del anticuerpo/derivado de anticuerpo formulado y/o minimiza la formación de particulados en la formulación y/o reduce la adsorción. Por ejemplo, el tensioactivo puede estar presente en la formulación en una cantidad de aproximadamente un 0,001% a aproximadamente un 0,5%, preferentemente de aproximadamente un 0,005% a aproximadamente un 0,2% y con la mayor preferencia de aproximadamente un 0,01% a aproximadamente un 0,1%.
En una realización, la formulación contiene los agentes identificados anteriormente (es decir, anticuerpo o derivado de anticuerpo, tampón, poliol y tensioactivo) y está esencialmente exenta de uno o más conservantes, tales como alcohol bencílico, fenol, m-cresol, clorobutanol y bencetonio Cl. En otra realización, se puede incluir un conservante en la formulación, particularmente cuando la formulación es una formulación multidosis. La concentración de conservante puede estar en el intervalo de aproximadamente un 0,1% a aproximadamente un 2%, con la mayor preferencia de aproximadamente un 0,5% a aproximadamente un 1%. Se pueden incluir uno o más portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables diferentes tales como los descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences 21.a edición, Osol, A. Ed. (2006) en la formulación siempre que no afecten de forma adversa a las características deseadas de la formulación. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen: agentes tamponantes adicionales, codisolventes, antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina, agentes quelantes tales como EDTA, complejos metálicos (p. ej., complejos de proteína-Zn), polímeros biodegradables tales como poliésteres, y/o contraiones formadores de sales tales como sodio.
Las formulaciones que se vayan a utilizar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, antes de, o después de, la preparación de la formulación.
La formulación se administra a un mamífero que necesita tratamiento con el anticuerpo, preferentemente un ser humano, de acuerdo con métodos conocidos, tales como la administración intravenosa como un bolo o mediante infusión continua a lo largo de un periodo de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracefalorraquídea, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o inhalatoria. En realizaciones preferidas, la formulación se administra al mamífero mediante la aplicación tópica de colirio a la superficie ocular. A tales efectos, la formulación se puede aplicar utilizando un aplicador de colirio, por ejemplo.
La dosificación apropiada («cantidad terapéuticamente eficaz») del anticuerpo dependerá, por ejemplo, de la enfermedad que se vaya a tratar, la gravedad y la evolución de la afección, si el anticuerpo se administra a efectos preventivos o terapéuticos, la terapia previa, la anamnesis del paciente y la respuesta al anticuerpo, el tipo de anticuerpo utilizado y el criterio del médico responsable. El anticuerpo o derivado de anticuerpo se administra convenientemente al paciente una vez o a lo largo de una serie de tratamientos y se puede administrar al paciente en cualquier momento a partir del diagnóstico. El anticuerpo o derivado de anticuerpo se puede administrar como tratamiento único o junto con otros fármacos o terapias útiles en el tratamiento de la afección en cuestión.
Como propuesta general, la cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o derivado de anticuerpo administrada estará en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal del paciente ya sea mediante una o más administraciones, siendo el intervalo típico de anticuerpo utilizado de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 20 mg/kg, más preferentemente de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 15 mg/kg, administrados a diario, por ejemplo. Sin embargo, otras pautas posológicas pueden ser útiles. La evolución de esta terapia se monitorea fácilmente mediante técnicas convencionales.
Artículos de fabricación
En otro aspecto de la divulgación que no se reivindica, se proporciona un artículo de fabricación que comprende un recipiente que contiene la formulación farmacéutica acuosa de la presente invención y que opcionalmente proporciona instrucciones para su uso. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, aplicadores de colirio y jeringas. El recipiente puede estar formado por diversidad de materiales tales como vidrio o plástico. Un recipiente a modo de ejemplo es un vial de virio o plástico desechable de 3-20 cc. Como alternativa, para una formulación multidosis, el recipiente puede ser un vial de vidrio de 3-100 cc. El recipiente contiene la formulación, y la etiqueta sobre el mismo, o asociada al mismo, puede indicar el modo de empleo. El artículo de fabricación puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, que incluyen otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos del envase con instrucciones de uso.
Ejemplificación
La presente divulgación se ilustra además mediante los siguientes ejemplos, los cuales no se deben interpretar como más limitantes.
A lo largo de los ejemplos, se utilizan los siguientes materiales y métodos a menos que se indique lo contrario.
Materiales y métodos generales
En general, la puesta en práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de química, biología molecular, tecnología de ADN recombinante, inmunología (especialmente, por ejemplo, tecnología de anticuerpos) y técnicas estándar de preparación de polipéptidos. Véanse, p. ej., Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub. (1999); y Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992).
Mediciones de la termoestabilidad
Se obtuvieron espectros de IR por transformada de Fourier en reflectancia total atenuada (FTIR-ATR) para diferentes cadenas independientes y moléculas derivadas utilizando la celda para FT-IR de Bio-ATR en un Tensor de Bruker. Las moléculas se concentraron hasta 3mg/ml y se dializaron durante la noche a 4°C frente a PBS, pH 6,5 y se recogió el caudal de tampón como blanco. Los perfiles de desnaturalización se obtuvieron termoestimulando las moléculas con un intervalo amplio de temperaturas en incrementos de 5°C (de 25 a 95°C). Todas las manipulaciones de los espectros se realizaron utilizando el programa informático OPUS. La señal de fondo atmosférico transitorio (CO2 y H2O) y del tampón principal se sustrajeron del espectro de la proteína. El espectro de la proteína resultante se corrigió entonces respecto a la línea basal y los espectros de amida I de la proteína se determinaron a partir de la anchura del pico resoluble más ancho en la región esperada. Se obtuvieron espectros de la segunda derivada para los espectros de la banda de amida I utilizando una función polinómica de tercer grado con una función de suavizado. Se estimaron los cambios en la estructura de la proteína mediante un análisis de la segunda derivada de la amida I utilizando una curva de calibrado lineal para los cálculos de ajuste a la curva inicial suponiendo un 0% de desnaturalización para las 3 mediciones más bajas y un 100% de desnaturalización para las 3 mediciones más altas. Se utilizaron los perfiles de desnaturalización para aproximar los puntos medios de las transiciones de desplegamiento térmicas (TM) para cada variante aplicando el modelo sigmoidal de Boltzmann.
Mediciones de solubilidad
Se midió la solubilidad relativa de diversas moléculas de scFv después de fomentar la agregación y precipitación de la proteína en presencia de sulfato de amonio. Se añadió sulfato de amonio a la proteína en disoluciones acuosas para conseguir incrementos de un 5% de la saturación en la mezcla de sal-proteína final. La precipitación en el intervalo dinámico se determinó empíricamente y los intervalos de saturación se redujeron en este intervalo a intervalos de saturación de un 2.5% en la mezcla final. Después de la adición de sulfato de amonio, se mezclaron las muestras cuidadosamente y centrifugaron 30 minutos a 6000rpm. Se recuperó la proteína restante en los sobrenadantes para cada porcentaje de saturación de sulfato de amonio. Las curvas de solubilidad se determinaron midiendo la concentración de proteína en el sobrenadante mediante mediciones de UV-VIS utilizando un espectrofotómetro NanoDropTM 1000. Las mediciones de la proteína soluble remanente en los sobrenadantes se normalizaron y se utilizaron para estimar los puntos medios de solubilidad relativa para cada variante aplicando el modelo sigmoidal de Boltzmann.
Prueba de solubilidad a corto plazo
Las moléculas de scFv se examinaron después de dos semanas de incubación a 40°C para determinar la presencia de productos de degradación y agregados solubles. Se dializaron proteínas con una concentración de 10 mg/ml durante la noche a 4°C frente a PBS con un intervalo amplio de pH (3,5, 4,5, 5,5, 6,5, 7,0, 7,5 y 8,5). Se almacenaron moléculas de control con la misma concentración en tampón PBS estándar (pH 6,5) a -80°C durante el periodo de 2 semanas. La determinación de las bandas de degradación mediante SDS-PAGE se realizó en los puntos de tiempo t=0 y t=14d, y se evaluaron los agregados solubles en el SEC-HPLC. La determinación de la actividad remanente después de 2 semanas a 40°C se realizó utilizando Biacore.
EJEMPLO 1
ESTRATEGIA DE INMUNIZACIÓN PARA GENERAR ANTICUERPOS ANTI-VEGF.
En este ejemplo, se describe una estrategia de inmunización que utilizó un péptido derivado de VEGF antigénico novedoso, para generar anticuerpos capaces de reconocer VEGFA humano, de ratón y conejo.
A partir de estudios de mutagénesis por barrido de alanina realizados en Genentech, se conocen los residuos de VEGFA que son cruciales para una interacción de alta afinidad con VEGFr (Fuh, G. et al., (2006) J. Biol. Chem.
281, 6625-6631). Aunque el sitio de unión al receptor probablemente constituye un epítopo conformacional, la mayoría de los residuos cruciales se encuentran en una hélice alfa, en los 10 primeros aminoácidos de VEGFA maduro.
El VEGFA de conejo contiene tres cambios de aminoácido en esta hélice alfa, cuando se compara con la secuencia humana; en cambio, el VEGFA de ratón es idéntico al humano en esta región. Por tanto, para la generación de anticuerpos de reacción cruzada ratón-humano, el conejo representa una especie adecuada para la inmunización. Además, la inmunización de conejo puede conducir a Ab que tengan mayor afinidad mayor que la inmunización de ratón.
Tal como se ha indicado anteriormente, la interacción con residuos en la hélice alfa aminoterminal de VEGFA parece ser el factor más crucial para la unión a VEGFR1. Por lo tanto, este tramo con una longitud de 10 aminoácidos se puede utilizar como epítopo para la inmunización. Como alternativa, se puede inyectar el VEGFA completo, sin embargo, otros tramos peptídicos de VEGFA son más inmunógenos, lo cual se reduce así la probabilidad de generar anticuerpos neutralizantes. Esta hipótesis está respaldada por el hecho de que dos péptidos diferentes, encontrándose ambos próximos al extremo C de VEGFA, son potencialmente inmunógenos según predice el método de Johnson y Wolf. Este método predice únicamente un leve potencial inmunogénico de la hélice alfa aminoterminal. Por lo tanto, la inmunización con el péptido que constituye la hélice alfa solamente, puede ser más sencilla que la inmunización con el VEGFA completo. La probabilidad de desencadenar una respuesta inmunitaria fuerte se puede incrementar aún más mediante la fusión o el acoplamiento químico del péptido a hemocianina de lapa californiana (KLH, por sus siglas en inglés).
Se realizaron cuatro estrategias de inmunización tal como se indica a continuación
1. A. Preinmunización de conejos con VEGFA165 humano completo para incrementar la probabilidad de obtener ligadores conformacionales. Segundo refuerzo con péptido del tramo de aa 16-KFMDVYQRSYCHP-28 (subrayado: interacción con el receptor; doble subrayado, divergente en conejo, Cys participa en el enlace disulfuro de acuerdo con su estructura cristalina). La Cys contenida en la secuencia peptídica se podría utilizar para el acoplamiento con KLH y, por lo tanto, no estaría expuesta como Cys libre. El péptido final tendría el siguiente aspecto: KFMDVYQRSY-Cys-KLH.
2. B. Preinmunización de ratones con VEGFA165 completo para incrementar la probabilidad de obtener ligadores conformacionales. Segundo refuerzo con péptido del tramo de aa 16-KFMDVYQRSYCHP -28 (Cys participa en el enlace disulfuro de acuerdo con su estructura cristalina). La Cys contenida en la secuencia peptídica se puede utilizar para el acoplamiento con KLH y, por lo tanto, no se expondría como Cys libre. El péptido final tendría el siguiente aspecto: KFMDVYQRSY-Cys-KLH.
3. C. Preinmunización de conejos/ratones con péptido del tramo de aa 16-KFMDVYQRSYCHP -28 (péptido final: KFMDVYQRSY-Cys-KLH). Segundo refuerzo con VEGFA165 completo para incrementar la probabilidad de obtener ligadores conformacionales.
4. D. Inmunización con VEGFA165 completo en conejos.
EJEMPLO 2
Injerto de CDR y humanización funcional de anticuerpos anti-VEGF de conejo monoclonales.
Injerto de CDR de conejo
A diferencia de los métodos de humanización tradicionales que emplean el armazón aceptor de anticuerpo humano que comparte la mayor homología secuencial con el anticuerpo donante no humano, las CDR de conejo se injertaron ya sea en el armazón FW1.4 (SEQ ID No. 172) para generar un Min-injerto o en el armazón «conejizado» rFW1.4 (Se Q ID No. 173) o su variante rFW1.4(v2) (SEQ ID No. 174) para generar un Max-injerto. Ambos armazones se seleccionaron fundamentalmente en función de propiedades funcionales deseables (solubilidad y estabilidad), idoneidad estructural para albergar una gran variedad de CDR de conejo y homología razonable con la secuencia consenso de dominio variable de conejo. El armazón rFW1.4 es un derivado de FW1.4 que se diseñó además con el objetivo de servir como armazón aceptor universal para prácticamente cualquier conjunto de CDR de conejo. Aunque la secuencia de armazón estable y soluble FW1.4 presenta una alta homología con anticuerpos de conejo, no es la secuencia más homóloga disponible.
Identificación de residuos involucrados potencialmente en la unión
Para cada secuencia de dominio variable de conejo, se identificó la parte complementaria de la línea germinal de conejo más cercana. Si no se pudo determinar la línea germinal más próxima, la secuencia se comparó frente al consenso de un subgrupo o el consenso de secuencias de conejo con un porcentaje de similitud alto. Los residuos de armazón inusuales se consideraron como resultado posible de la hipermutación somática y, por lo tanto, que desempeñan una función en la unión a antígeno. Por consiguiente, tales residuos se tuvieron en cuenta para el injerto en el armazón aceptor rFW1.4 o rFW1.4(v2) a fin de generar Max-injertos. Particularmente, se injertaron los residuos involucrados potencialmente en contacto directo con el antígeno o que afectaban a la disposición de VL y VH. En caso necesario, se sustituyeron residuos adicionales descritos como influentes sobre la estructura de CDR. No se realizaron sustituciones de armazón cuando se injertaron CDR en FW1.4 (Min-injertos). Por ejemplo, para generar 578minmax, se mutó el residuo VH 94 (H94) de rFW1.4 al residuo correspondiente en la secuencia donante. El anticuerpo 578 de conejo contiene Gly en H94 mientras que tanto la línea germinal más homóloga como el consenso de conejo contienen Arg en la posición H94. Gly tiene una flexibilidad excepcional (ángulos phi positivos) que no se encuentra en otros aminoácidos. Esto sugiere que desempeña un papel en el ángulo de torsión de la cadena principal y una posible influencia fuerte de la conformación de bucle con repercusiones sobre la actividad. Se pueden identificar otros ejemplos de posiciones de armazón que se injertaron para obtener los Maxinjertos tal como se dan a conocer en la presente realizando una alineación de secuencias de las regiones de armazón de rFW1.4, rFW1.4(v2) y las secuencias scFv de interés proporcionadas en la presente. Con tal fin se pueden utilizar, por ejemplo, herramientas en línea como las conocidas en la técnica (p. ej., ClustalW según su disponibilidad el 23 de junio de 2009 en http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html o MultiAlin según su disponibilidad el 23 de junio de 2009 en http://bioinfo.genotoul.fr/multalin). Todas las posiciones de armazón en las que rFW1.4 y rFW1.4(v2) contienen el mismo residuo y en las que el scFv de interés revela un residuo diferente, son posiciones de armazón que se injertaron para obtener los Max-injertos.
Reordenamiento de dominios
Se combinaron cadenas ligeras variables de Min-injertos con Max-injertos de cadena pesada variable para identificar combinaciones óptimas en términos de propiedades biofísicas (solubilidad y estabilidad) y actividad.
Clonación y expresión de scFv
Los scFv descritos y caracterizados en la presente se produjeron tal como se indica a continuación. Las secuencias de VL humanizadas (SEQ ID NO:82-106) se conectaron con las secuencias de VH humanizadas (SEQ ID NO:118-166) a través del conector de SEQ ID NO:181 para producir un scFv de la siguiente orientación: NH2-VL-conector-VH-COOH. En muchos casos, se sintetizaron de novo secuencias de ADN que codificaban los diferentes scFv en el proveedor de servicios Entelechon GmbH (www.entelechon.com). Las inserciones de ADN resultantes se clonaron en el vector de expresión bacteriano pGMP002 a través de sitios de restricción NcoI y HindIII introducidos en el extremo 5' y 3' de la secuencia de ADN de scFv, respectivamente. Entre la secuencia de ADN del dominio VL y el dominio VH, se localiza un sitio de restricción BamHI. En algunos casos, el ADN que codificaba scFv no se sintetizó de novo, sino que los constructos que expresaban scFv se clonaron mediante reordenación de dominios.
Por consiguiente, los dominios VL se escindieron y se introdujeron en los nuevos constructos a través de los sitios de restricción NcoI y BamHI y los dominios VH a través de los sitios de restricción BamHI y HindIII. En otros casos, se introdujeron mutaciones puntuales en el dominio VH y/o VL utilizando métodos de ensamblaje por PCR del estado de la técnica. La clonación de GMP002 se describe en el Ejemplo 1 del documento WO2008006235. La producción de los scFv se realizó de forma análoga a la de ESBA105, como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO2008006235.
EXAMPLE3
ANÁLISIS DE UNIÓN POR BIACORE DE LOS SCFV ANTI-VEGF
En este ejemplo, se evaluó la capacidad de unión por Biacore de los scFv y se midió la afinidad de unión utilizando el método ilustrativo de resonancia de plasmón superficial con BIAcore™-T100. Las proteínas VEGF, probadas para determinar la unión a estos scFv candidatos, en este ejemplo y en ejemplos posteriores, incluyen VEGF165 humano recombinante (PeproTech EC Ltd.), VEGF121 humano recombinante (PeproTech EC Ltd.), VEGF110 humano recombinante (ESBA Tech AG), VEGF164 murino recombinante (PeproTech EC Ltd.), VEGF164 de rata recombinante (Biovision), VEGF110 de conejo recombinante (ESBATech AG) y PLGF humano recombinante (PeproTech EC Ltd.) purificados y expresados en Escherichia coli. Para el experimento de resonancia de plasmones superficiales, se activaron chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM4, GE Healthcare) con clorhidrato de W-etil-W-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida y W-hidroxisuccinimida de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Cada una de las 6 formas de VEGF diferentes, tal como se ejemplificaron anteriormente, se acopló con 1 de las 4 cubetas de lectura diferentes en un chip sensor CM4 utilizando un procedimiento de acoplamiento amínico estándar. La diversidad de respuestas obtenidas con estas moléculas de VEGF inmovilizadas después del acoplamiento y bloqueo fueron -250-500 unidades de respuesta (UR) para hVEGF165, -200 UR para hVEGFnü, hVEGF121, VEGF164 murino, VEGF164 de rata y VEGF110 de conejo y ~400 UR para PLGF. La 4.a cubeta de lectura de cada chip se trató de forma similar salvo que no se inmovilizaron proteínas antes del bloqueo, y la cubeta de lectura se utilizó como referencia en línea. Se inyectaron varias concentraciones de scFv anti-VEGF (p. ej., 90 nM, 30 nM, 10 nM, 3,33 nM, 1,11 nM, 0,37 nM, 0,12 nM y 0,04 nM) en tampón HBS-EP (HEPES 0,01 M, pH 7,4 o 5, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005 %) en las cubetas de lectura a un caudal de 30 pl/min durante 5 min. Se permitió que la disociación del scFv anti-VEGF del VEGF en el chip CM4 transcurriera durante 10 min a 25°C. Se generaron sensogramas de cada muestra de scFv anti-VEGF después de la corrección de la cubeta de referencia en línea seguido de la sustracción de la muestra de tampón. La constante de la velocidad de disociación aparente (kd), la constante de la velocidad de asociación aparente (ka) y la constante de equilibrio de disociación aparente (K<d>), se calcularon utilizando el modelo de unión de Langmuir unívoco con el programa informático de evaluación BIAcore T100, versión 1.1.
Como un resultado ilustrativo, algunos candidatos de scFv anti-VEGF principales se enumeran en la Tabla 7 que muestra su afinidad de unión a hVEGF165. Su potencia como inhibidores de VEGF, que se mide utilizando ELISA de competición y/o ensayo con HUVEC para VEGFR y que se describe en ejemplos posteriores, también se muestra en la Tabla 7. En la Figura 1 se ilustran las curvas cinéticas de algunos candidatos principales ilustrativos, p. ej., 511max y 578max, con respecto a su unión a hVEGF165. También se determinaron sus constantes de afinidad (kd, ka y K<d>). Algunos candidatos principales también presentan especificidad de especie en su unión a diferentes proteínas de VEGF de fuentes diferentes. Por ejemplo, algunos datos de afinidad medidos a un pH de 5 utilizando VEGF164 de ratón y de rata como compañero de unión, se muestran en las Tablas 8 a y b. Un candidato de scFv principal ilustrativo, 578minmax, tiene una Kd de 5,76E-10 M y 7,48E-10 M en su unión a VEGF164 de ratón y de rata, respectivamente a un pH de 5 (Tablas 8 a y b) y de 2,73E-11 y 2,19E-11 a un pH de 7,4 (datos no mostrados). Esta especificidad de especie se ilustra además en la Figura 4 en las curvas cinéticas y los datos de afinidad para la unión entre 578minmax y las proteínas VEGF humana, de ratón y de rata.
Aparte de la especificidad de especie en su unión a VEGF de organismos diferentes, muchos candidatos de scFv principales también presentan afinidades de unión diferenciadas hacia diversas isoformas de VEGF. Por ejemplo, los datos de afinidad medidos a pH 5,0 para algunos scFv candidatos que se unen a VEGF165, VEGF121 y VEGF110 humanos se comparan en la Tabla 9. En los mismos experimentos, también se utilizó la proteína PIGF como control negativo sin capacidad de unión a esos scFv candidatos. Además, las curvas cinéticas y los datos de afinidad diferenciados para la unión entre 578Max e isoformas de VEGF, como ejemplo, se ilustran en la Figura 3.
La presente invención también desvela derivados que se originan a partir de los candidatos de scFv anti-VEGF principales, que se mencionan anteriormente. Se ilustran algunos derivados principales de candidato 578 y 511, tal como se enumeran en la Tabla 10, con respecto a su afinidad y potencia (medidas a un pH de 5,0). En este experimento, se utilizó medición con Biacore para determinar la afinidad de estos derivados hacia hVEGF165, mientras que se utilizó el ensayo ELISA de competición y/o el ensayo con HUVEC para hVEGFR2, para definir su potencia con respecto a la inhibición de los VEGF (Tabla 10). Tres derivados, 578max, 578minmax y 578 wt-His, se ejemplifican además en sus curvas cinéticas y datos de afinidad para la unión a hVEGF165 en la Figura 4.
Para los derivados de los candidatos principales, se determinaron sus caracterizaciones biofísicas y se ilustraron en las Figuras 5-7 y en la tabla 11. Estas características incluyen, tal como se ilustra en la tabla 11, la Tm determinada por FTIR, el porcentaje de pérdida de proteína o lamina p después de una incubación a 60°C durante 30 min, la solubilidad determinada por precipitación con sulfato de amonio, el rendimiento de replegamiento durante el proceso de producción y los niveles de expresión en E. coli. Tres derivados, 578max, 578minmax y 578minmax_DHP, se caracterizaron por su estabilidad térmica en sus curvas de desplegamiento frente a diferentes temperaturas medidas por FT-IR (Figura 5).
Tabla 7: revisión eneral de la afinidad otencia de los candidatos rinci ales
Tabla 8a: es ecificidad de es ecie de candidatos rinci ales seleccionados VEGF 164 de ratón de rata)
Tabla 8b: es ecificidad de es ecie de los candidatos de desarrollo seleccionados
Tabla 9: Unión de candidatos rinci ales seleccionados a isoformas de VEGF VEGF121 hVEGF110 humanos)
(continuación)
Tabla 10: Revisión eneral sobre la afinidad otencia de derivados rinci ales 578 511
Tabla 11: Revisión eneral de la caracterización biofísica de derivados rinci ales 578 511
(continuación)
Algunos derivados, como los que se enumeran en la Figura 6, se compararon con respecto a su desnaturalización y precipitación después de estrés térmico (p. ej., a 50°C, 60°C o 70°C) durante 30 minutos. 578max, 578minmax y 578minmax_DHP se ejemplificaron además por su solubilidad, que se determinó mediante precipitación con sulfato de amonio. Como en la Figura 7, el porcentaje de proteínas solubles de estos derivados en diferentes concentraciones de sulfato de amonio se compararon.
Tabla 12a: ligadores anti-VEGF des ués de incubación durante 30 min a 50°C
Tabla 12a: ligadores anti-VEGF des ués de incubación durante 30 min a 60°C
Tabla 12a: ligadores anti-VEGF des ués de incubación durante 30 min a 70°C
EJEMPLO 4
ENSAYOS DE BLOQUEO DEL RECEPTOR DE VEGF
Para candidatos de scFv anti-VEGF o sus derivados, también se midió su potencia como inhibidores de VEGF además de su afinidad de unión a VEGF en el Ejemplo 3. Los métodos para medir su potencia incluyen, por ejemplo, el ELISA de competición para VEGFR, tal como se ejemplifica en este ejemplo, y ensayos con HUVEC (Figura 8).
Los ensayos ELISA de competición para VEGFR incluyen, por ejemplo, ensayos de bloqueo del receptor VEGFR2 y ensayos de bloqueo del receptor VEGFR1. Para el ensayo de bloqueo del receptor VEGFR2, una placa de ELISA Maxisorp de 96 pocillos (Nunc) at 0,05 |jg/ml se recubrió con VEGF165 humano en PBS y se bloqueó utilizando PBS con BSA al 0,1 % y Tween 20 al 0,2 % (PBST). 500 ng/ml de quimera de VEGFR2 humano recombinante/Fc (R&D Systems Inc.), que consistía en los residuos aminoacídicos 1-764 del dominio extracelular de VEGFR2 humano fusionados con un Fc de IgG1 humana marcado con 6x histidina, se incubó primero con scFv anti-VEGF diluidos en serie 1:3 en PBST Después de 30-60 min de incubación a temperatura ambiente, las mezclas se transfirieron a la placa con VEGF165 humano inmovilizado y se incubaron durante 90 min. La unión de la quimera de VEGFR2/Fc al VEGF165 inmovilizado se detectó con Fcy de cabra anti-IgG humana (Fab2) acoplado a peroxidasa de rábano picante (Jackson ImmunoResearch) seguido de sustrato (sustrato BM Blue POD, Roche Diagnostics). Se midió la densidad óptica a 450 nm (DO 450 nm) utilizando un lector de microplacas Sunrise (Tecan). Los datos se analizaron utilizando un ajuste de curva logística de 4 parámetros, y se calcularon los valores de CE50 a partir de las curvas de respuesta a la dosis de los scFv. La potencia de los candidatos principales, o de sus derivados, ilustrativos, medida a través de un ensayo de bloqueo del receptor VEGFR2, se enumera en las Tablas 7 y 9.
Para el ensayo de bloqueo del receptor VEGFR1, una placa de ELISA Maxisorp de 96 pocillos (Nunc) se recubrió con VEGF165 humano a 0,0125 |jg/ml en PBS y se bloqueó utilizando PBS con BSA al 0,4 % y Tween 20 al 0,1 %. En primer lugar, 100 ng/ml de quimera de VEGFR1 humano recombinante/Fc (R&D Systems Inc.), que consistía en los residuos aminoacídicos 1-687 del dominio extracelular de VEGFR1 humano fusionados a un Fc de IgGi humana marcado con 6x histidina, se incubaron con scFv anti-VEGF diluidos en serie 1:3 en PBST Después de 30-60 min de incubación a temperatura ambiente, las mezclas se transfirieron a la placa con VEGF165 humano inmovilizado y se incubaron durante 90 min. La unión de la quimera de VEGFR1/Fc al VEGF165 inmovilizado se detectó con Fcy de cabra anti-IgG humana (Fab2) acoplado a peroxidasa de rábano picante (Jackson ImmunoResearch) seguido de sustrato (sustrato BM Blue POD, Roche Diagnostics). Se midió la densidad óptica a 450 nm (DO 450 nm) utilizando un lector de microplacas Sunrise (Tecan). Los datos se analizaron al igual que antes, y se calcularon los valores de CE50 a partir de las curvas de respuesta a la dosis de los scFv. La potencia de los candidatos principales ilustrativos, medida a través de un ensayo de bloqueo del receptor VEGFR1, se enumera en la Tabla 7.
EJEMPLO 5
ENSAYO CON HUVEC DE LA INHIBICIÓN DE VEGF
Este ejemplo ejemplifica ensayos con HUVEC como otro método para medir la potencia de los scFv anti-VEGF candidatos, o sus derivados, que se dan a conocer como inhibidores de VEGF.
Se utilizaron células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVEC) (Promocell), mezcladas de varios donantes, en del pase 2 al pase 14. Las células se sembraron con una densidad de 1000 células/pocillo en 50 j l de medio completo de crecimiento de células endoteliales (ECGM) (Promocell), que contenía un 0,4% de ECGS/H, un 2% de suero fetal bovino, 0,1 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico, 1 jg/m l de Hidrocortisona, 1 ng/ml de factor fibroblástico básico y un 1% de penicilina/estreptomicina (Gibco). Entre 7 y 8 h después, a las células se añadieron 50 j l de medio de privación de nutrientes (ECGM sin complementos que contenía FCS termoinactivado al 0,5 % y penicilina/estreptomicina al 1 %) y las células se privaron de nutrientes durante 15 a 16 horas. Se prepararon diluciones en serie 1:3 de los scFv anti-VEGF (0,023-150 nM) y de uno de los siguientes VEGF165 humano recombinante (0,08 nM), VEGFm de ratón recombinante (0,08 nM) o VEGFm de rata recombinante (0,3 nM) en medio de privación de nutrientes y se preincubaron durante 30-60 min a temperatura ambiente. Las diferentes concentraciones de VEGF se utilizaron para compensar sus actividades biológicas relativas diferentes. Se utilizaron concentraciones que estimulan la proliferación inducida por VEGF submáxima (CE90). Se añadieron 100 j l de las mezclas a las placas de cultivo tisular de 96 pocillos que contenían la suspensión de HUVEC y se incubaron durante 4 días en una estufa de incubación humidificada a 37 °C/5% de CO2. La proliferación de las HUVEC se evaluó midiendo la absorbancia a 450 nm (como longitud de onda de referencia se utilizó 620 nm) después de la adición de 20 jl/pocillo de reactivo de proliferación celular WST-1 (Roche) utilizando un lector de microplacas Sunrise (Tecan). Los datos se analizaron utilizando un ajuste de curva logística de 4 parámetros, y la concentración de scFv anti-VEGF requerida para inhibir la proliferación de HUVEC en un 50% (CE50) se dedujo a partir de curvas de inhibición.
La potencia de los candidatos principales, o de sus derivados, ilustrativos, medida a través de análisis con HUVEC se enumera en la Tabla 7. Además, la inhibición de la proliferación de HUVEC inducida por hVEGF-165 por un derivado de candidatos principales, 578minmax, se ilustra en la Figura 9. La CE50 de 578minmax para la inhibición de la proliferación celular inducida por hVEGF-^ se determina que es 0,06 nM (Figura 9). La potencia de 578minmax como inhibidor de VEGF es aproximadamente 1,6 veces mejor en comparación con Lucentis. La inhibición de la proliferación de HUVEC inducida por VEGF164 de ratón o de rata por parte de 578minmax también se ejemplifica en la Figura 10. La CE50 de 578minmax para la inhibición de la proliferación celular inducida por VEGF164 de ratón y de rata se determina que es 0,06 nM y 0,07 nM, respectivamente (Figura 10). Por tanto, los VEGF de ratón y de rata son equipotentes a la VEGF humana al ser inhibidos por el derivado a modo de ejemplo (578minmax). También en este experimento, Lucentis no inhibe la proliferación inducida por VEGF de roedor.
EJEMPLO 6
EFECTOS DE SCFV ANTI-VEGF SOBRE LA PERMEABILIDAD VASCULAR INDUCIDA POR HVEGFiss EN COBAYAS LAMPIÑAS
En este ejemplo, se evaluó el efecto de scFv anti-VEGF sobre la permeabilidad vascular inducida por VEGF165 humano en cobayas utilizando el ensayo de Miles. Se marcaron treinta sitios de aplicación por animal en la espalda de cobayas macho lampiñas utilizando un rotulador permanente. El día del tratamiento, se administró a cada animal por vía intravenosa 1 ml de una disolución de colorante azul de Evans al 1 % con anestesia general. Una hora

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Una inmunoglobulina o un fragmento de la misma, que comprende una cadena pesada variable (VH) y una cadena ligera variable (VL), en donde la cadena pesada variable (VH) comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 164; y la cadena pesada variable (VL) comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 87.
2. La inmunoglobulina o fragmento de la misma según la reivindicación 1, en donde la inmunoglobulina o fragmento de la misma es un scFv, un fragmento Fab, un fragmento Fab' o un fragmento F(ab')2.
3. La inmunoglobulina o fragmento de la misma según la reivindicación 1 o 2, en donde la cadena ligera variable de la inmunoglobulina o fragmento de la misma tiene un residuo de metionina aminoterminal en la proteína final derivado del codón iniciador.
4. La inmunoglobulina o fragmento de la misma según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la inmunoglobulina o fragmento de la misma es un scFv, y la cadena pesada variable y la cadena ligera variable están unidas por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 181.
5. Una composición farmacéutica que comprende la inmunoglobulina o fragmento de la misma según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. La composición farmacéutica de la reivindicación 5, para su uso en el tratamiento de una enfermedad mediada por VEGF.
7. Uso de la composición farmacéutica de la reivindicación 5, para la producción de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad mediada por VEGF humano.
8. La composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 6, o el uso según la reivindicación 7, en donde la enfermedad mediada por VEGF se selecciona del grupo que consiste en degeneración macular senil, glaucoma neovascular, retinopatía diabética y retinopatía de la prematuridad.
9. La composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 6, o el uso según la reivindicación 7, en donde la enfermedad mediada por VEGF se selecciona del grupo que consiste en fibroplasia retrolenticular, carcinomas de mama, carcinomas de pulmón, carcinomas gástricos, carcinomas esofágicos, carcinomas colorrectales, carcinomas hepáticos, carcinomas ováricos, sarcomas, arrenoblastomas, carcinomas cervicouterinos, carcinoma endometrial, hiperplasia endometrial, endometriosis, fibrosarcomas, coriocarcinoma, cáncer de cabeza y cuello, carcinoma nasofaríngeo, carcinomas laríngeos, hepatoblastoma, sarcoma de Kaposi, melanoma, carcinomas de piel, hemangioma, hemangioma cavernoso, hemangioblastoma, carcinomas pancreáticos, retinoblastoma, astrocitoma, glioblastoma, schwannoma, oligodendroglioma, meduloblastoma, neuroblastomas, rabdomiosarcoma, sarcoma osteogénico, leiomiosarcomas, carcinomas de las vías urinarias, carcinomas de tiroides, tumor de Wilms, carcinoma de células renales, carcinoma prostático, proliferación vascular anómala asociada con facomatosis, edema (tal como el asociado con tumores cerebrales), síndrome de Meigs, artritis reumatoide, psoriasis y ateroesclerosis.
10. La composición farmacéutica para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 6, 8 y 9, o para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde la inmunoglobulina o fragmento de la misma se formula para administración tópica, intraocular, oral, nasal, rectal o parenteral.
11. Un kit para su uso en un método de diagnóstico de una enfermedad mediada por VEGF, comprendiendo el kit la inmunoglobulina o fragmento de la misma según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o la composición farmacéutica de la reivindicación 5.
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