ES2622470T3

ES2622470T3 - Anticuerpos estables y solubles que inhiben el VEGF

Info

Publication number: ES2622470T3
Application number: ES09768693.5T
Authority: ES
Inventors: Leonardo Borras; David Urech; Tea Gunde
Original assignee: Esbatech An Alcon Biomedical Research Unit LLC
Current assignee: Esbatech a Novartis Co LLC
Priority date: 2008-06-25
Filing date: 2009-06-25
Publication date: 2017-07-06
Anticipated expiration: 2029-06-25
Also published as: FI3722310T3; RU2531523C9; MX2011000011A; KR20180098705A; US20120014958A1; CY1118829T1; KR102095257B1; LT2307454T; NO2020021I1; CA2727839A1; LTC2307454I2; PL2307454T3; US8349322B2; KR101817284B1; JP2015134792A; DK2307454T3; HRP20200814T1; ES2998307T3; WO2009155724A3; US10590193B2

Abstract

Un inmunoenlazador recombinante que se enlaza específicamente al VEGF humano con una Kd inferior a 10-8 M que comprende una cadena pesada variable (VH) y una cadena ligera variable (VL) que neutraliza el VEGF humano y comprende CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 y CDRL3, que tienen una similitud de al menos 80% con una secuencia de consenso del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 71, respectivamente

Description

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DESCRIPCION

Anticuerpos estables y solubles que inhiben el VEGF Antecedentes de la invencion

La angiogenesis esta implicada en la patogenesis de una variedad de trastornos incluyendo tumores solidos, slndromes neovasculares intraoculares tales como retinopatlas proliferativas o degeneracion macular relacionada con la edad (AMD), artritis reumatoide y psoriasis (Folkman et al. J. Biol. Chem. 267:10931-10934 (1992); Klagsbrun et al. Annu Rev. Physiol. 53: 217-239 (1991); y Garner A, Vascular diseases. En: Pathobiology of ocular disease. A dynamic approach. Garner A, Klintworth G K, Eds. 2nd Edition Marcel Dekker, NY, pp. 1625-1710 (1994)). En los tumores solidos, la angiogenesis y el crecimiento de una nueva vasculatura permiten la supervivencia del tumor y se ha demostrado una correlacion entre la densidad de la microvasculatura en secciones tumorales y la supervivencia del paciente en canceres de mama y otros (Weidner et al. N Engl J Med 324:1-6 (1991), Horak et al. Lancet 340:11201124 (1992) y Macchiarini et al. Lancet 340:145-146 (1992)).

El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es un regulador conocido de la angiogenesis y la neovascularizacion y ha demostrado ser un mediador clave de la neovascularizacion asociada con tumores y trastornos intraoculares (Ferrara et al. Endocr. Rev. 18:4-25 (1997)). El ARNm del VEGF esta sobreexpresado en muchos tumores humanos y la concentracion del VEGF en fluidos oculares esta altamente correlacionada con la presencia de proliferation activa de vasos sangulneos en pacientes con retinopatlas diabeticas y otras isquemicas relacionadas (Berkman et al., J Clin Invest 91 : 153-159 (1993), Brown et al. Human Pathol. 26:86-91 (1995); Brown et al. Cancer Res. 53: 4727-4735 (1993), Mattern et al., Brit. J. Cancer. 73: 931-934 (1996), y Dvorak et al. Am. J. Pathol. 146:1029-1039 (1995); Aiello et al. N. Engl. J. Med. 331:1480-1487 (1994)). Ademas, estudios recientes han demostrado la presencia del VEGF localizado en membranas neovasculares coroideas en pacientes afectados por AMD (Lopez et al. Invest. Ophtalmo, Vis. Sci. 37:855-868 (1996)). Se pueden usar anticuerpos neutralizantes anti- VEGF para suprimir el crecimiento de una variedad de llneas celulares tumorales humanas en ratones inmunodeprimidos y tambien inhibir la angiogenesis intraocular en modelos de trastornos retinales isquemicos (Kim et al. Nature 362:841-844 (1993), Warren et al. J. Clin. Invest 95:1789-1797 (1995), Borgstrom et al. Cancer Res. 56: 4032-4039 (1996) y Melnyk et al. Cancer Res. 56:921-924 (1996) (Adamis et al. Arch. Opthalmol. 114:66-71 (1996)).

Por lo tanto, existe una necesidad de anticuerpos monoclonales anti-VEGF capaces de ser utilizados para el tratamiento de tumores solidos y diversas enfermedades intraoculares neovasculares.

Resumen de la invencion

La invencion se relaciona con inmunoenlazadores anti-VEGF solubles y estables que comprenden CDRs de anticuerpos monoclonales de conejo. Dichos anticuerpos estan disenados para el diagnostico y/o tratamiento de trastornos mediados por el VEGF. Tambien se describen los hibridomas, acidos nucleicos, vectores y celulas huesped para la expresion de los anticuerpos recombinantes de la invencion, metodos para aislarlos y el uso de dichos anticuerpos en medicina. La invencion esta definida por las reivindicaciones.

Breve description de los dibujos

La figura 1 ilustra la cinetica de union de scFvs seleccionados al hVEGF165 usando Biacore (hVEGF165). La figura 1a muestra los datos obtenidos para 511max: Ka (1/Ms): 6,59E+05; SE (ka): 1,10E+03; kd(1/s): 4,40E-05; SE (kd): 6,30E- 07; KD(M): 6,67E-11. La figura 1 b muestra los datos obtenidos para 578max: Ka (1/Ms): 7,00E+05; SE (ka): 1,40E+03; kd(1/s): 3,07E-04; SE(kd): 8,50E-07; KD (M): 4,39E-10.

La figura 2 ilustra la especificidad de la especie mostrando cinetica de union de 578max al VEGF humano, de raton y de rata. La figura 2a muestra los datos obtenidos para el VEGF165 humano: Ka (1/Ms): 7,00E+05; SE (ka): 1,40E+03; kd(1/s): 3,07E-04; SE(kd): 8,50E-07; KD(M): 4,39E-10. La figura 2b muestra los datos obtenidos para el VEGF164 de raton: Ka (1/Ms): 1,03E+06; SE (ka): 2,30E+03; kd(1/s): 4,40E-04; SE(kd): 9,40E-07; KD(M): 4,29E-10. La figura 2c muestra los datos obtenidos para el VEGF164 de rata: Ka (1/Ms): 8,83E+05; SE (ka): 2,50E+03; kd(1/s): 5,28E-04; SE(kd): 1,20E-06; KD(M): 5,98E-10.

La figura 3 ilustra la cinetica de union de 578max a las isoformas de VEGF (hVEGF121 y hVEGF110). La figura 3a muestra los datos obtenidos para VEGF165 humano: Ka (1/Ms): 7,00E+05; SE (ka): 1,4E+03; kd(1/s): 3,07E-04; SE(kd): 8,50E- 07; KD(M): 4.39E-10. La figura 3b muestra los datos obtenidos para el VEGF121 humano: Ka (1/Ms): 5,87E+05; SE (ka): 1,20E+03; kd(1/s): 5,58E-04; SE(kd): 9,60E-07; KD(M): 9,50E-11. La figura 3c muestra los datos obtenidos para el VEGF110 humano: Ka (1/Ms): 5,23E+05; SE (ka): 1,30E+03; kd(1/s): 7,22E-04; SE(kd): 8,10E-07; KD(M): 1,38E-09.

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La figura 4 representa la cinetica de union de 578max, 578minmax y 578wt a hVEGF165. La figura 4a muestra los datos obtenidos para 578max: Ka (1/Ms): 7,00E+05; SE (ka): 1,40E+03; kd(1/s): 3,07E-04; SE(kd): 8,50E-07; KD(M): 4,39E- 10. La figura 4b muestra los datos obtenidos para 578 minmax: Ka (1/Ms): 8,06E+05; SE (ka): 2,10E+03; kd(1/s): 5,04E-04; SE(kd): 1.10E-06; KD(M): 6,25E-10. La figura 4c muestra los datos obtenidos para 578wt-His: Ka (1/Ms): 8,45E+05; SE (ka): 1,60E+03; kd(1/s): 1,69E-04; SE(kd): 7,60E-07; KD(M): 2,00E-10.

La figura 5 ilustra la estabilidad termica de 578max, 578minmax y 578minmax_DHP (despliegue medido por FT-IR). La figura 5a: 578 minmax (ESBA903): Tm=71,1 °C; la figura 5b: 578minmax_DHP (#961): Tm=70,2 °C; la figura 5c: 578max (#821): Tm = 70,4 °C.

La figura 6 ilustra la desnaturalizacion y la precipitacion de 578 derivados despues de un esfuerzo termico (Figura 6a: 50 °C, figura 6b: 60 °C, figura 6c: 70 °C) durante 30 minutos.

La figura 7 ilustra la solubilidad de 578max, 578minmax y 578minmax_DHP (determinada por precipitacion con sulfato de amonio). La figura 7a: 578max (#821). El V50 fue de 27,24%. La figura 7b: 578minmax (ESBA903). El V50 fue 28,13. La figura: 7c: 578minmax_DHP (#961). El V50 fue de 32,36%.

La figura 8 ilustra el ELISA competitivo del VEGFR2 frente al analisis HUVEC como metodo para medir la potencia. La figura 8a: comparacion de Lucentis y 511 max (#802) en ELISA competitivo del VEGFR2. R2 de Lucentis: 0,9417; R2 de ESBA802: 0,9700. EC50 de Lucentis: 7,137 nM; EC50 de #802: 0,8221 nM. La figura 8b: comparacion de Lucentis y 578max (#821) en el ELISA competitivo del VEGFR2. La figura 8c: comparacion de Lucentis, 511maxC-his y 534max en el analisis de HUVEC. R2 de Lucentis 0,9399; R2 de EP511maxC-his: 0,9313, R2 de EP534max: 0,7391. EC50 de Lucentis: 0,08825 nM, EC50 de 511maxC-his: 0,7646 nM, EC50 de 534max: 63,49 nM. La figura 8d: comparacion de Lucentis, 578 min y 578max en el analisis HUVEC. R2 de Lucentis: 0,9419, R2 de EP578min: 0,8886, R2 de EP578max: 0,9274. EC50 de Lucentis: 0,1529 nM, EC50 de 578 min: 1,528 nM, EC50 de 578max: 0,1031 nM.

La figura 9 ilustra los efectos de 578minmax sobre la proliferacion del HUVEC inducida por el hVEGF165. Los parametros del analisis fueron los siguientes: concentracion del hVEGF165: 0,08 nM (3 ng/ml); incubacion con el VEGF y el objeto de prueba: 96h. El EC50 fue de 0,08959 nM para Lucentis y 0,05516 nM para 578minmax, mientras que el R2 fue de 0,9066 para Lucentis y de 0,9622 para 578minmax.

La figura 10 ilustra los efectos de 578minmax sobre la proliferacion del HUVEC inducida por el VEGF164 de raton y el VEGF164 de rata. Los parametros del analisis fueron los siguientes: concentracion del VEGF164 de raton: 0,08 nM (3 ng/ml); concentracion del VEGF164 de rata: 0,3 nM (11,3 ng/ml). Ambas concentraciones se seleccionaron a EC90 para la proliferacion de HUVEC inducida por el VEGF; incubacion con VEGF y objeto de prueba: 96h. La figura10a ilustra los datos obtenidos para el VEGF de raton. La EC50 fue 0,1196 nM para V1253 y 0,06309 nM para 578minmax, mientras que la R2 fue 0,02744 para Lucentis, 0,9348 para V1253 y 0,9767 para EP578minmax. Lucentis no inhibio la proliferacion de HUVEC inducida por el VEGF de raton. La figura 10b ilustra los datos obtenidos para el VEGF de rata. La EC50 fue de 1,597 nM para V1253 y 0,06974 nM para 578minmax, mientras que la R2 fue 00,7664 para V1253 y 0,6635 para 578minmax.

La Figura 11 ilustra estudios de eficacia usando el analisis de Miles en cobayos inmunodeprimidos (parte I). El colorante 1 almar azul se administro por via intravenosa a cobayos inmunodeprimidos. Una hora despues de la inyeccion de colorante, se inyecto una premezcla 2 de hVEGF (2,61 nM) y Lucentis, ESBA903 o #802, respectivamente, en la piel del animal 3. Una hora despues de la inyeccion de las soluciones, los animales 3 fueron sacrificados y las pieles fueron recolectadas, limpiadas y fotografiadas digitalmente usando luz incidente y transmitida. Se evaluo el area de colorante azul Evans que se extravaso en los sitios de inyeccion usando la imagen J y se trazo la retention del area de dosificacion.

La figura 12 ilustra estudios de eficacia usando el analisis de Miles en cobayos inmunodeprimidos (parte II). La figura 12a muestra los resultados obtenidos para #803 (511max). El EC50 fue de 5,990 nM y tuvo una dispersion estadlstica entre 2.060 y 17.41 nM mientras que el R2 fue 0,5800. La figura 12b muestra los resultados obtenidos para ESBA903 (578 minmax). El EC50 fue de 3,989 y tuvo una dispersion estadlstica entre 1,456 y 10,93 nM mientras que el R2 fue de 0.3920. La figura 12c muestra el area de fuga de colorante para Lucentis. La EC50 no se pudo calcular para Lucentis debido al mal ajuste de la curva.

La figura 13 ilustra estudios de eficacia usando el analisis modificado de miles en ratas (hVEGF165 premezclado y 578 minmax (ESBA903)). La figura 13a ilustra la eficacia anti-permeabilidad del Avastin sobre la fuga vascular de la retina inducida por el VEGF en ratas, respuesta a la dosis. El Avastin inhibe la permeabilidad vascular de la retina inducida por el hVEGF. Premezclado antes de la inyeccion. Aproximadamente equimolar, 3 veces o 10 veces mas. * p<0,05 (VEGF s. BSA), ** p<0,05 (tratado con Avastin vs. VEGF). La figura 13b muestra la eficacia anti-permeabilidad de ESBA903 sobre la fuga vascular de la retina inducida por el VEGF en ratas. Respuesta a la dosis (premezclado, ivt). Inhibition completa de la permeabilidad vascular de la retina inducida por el hVEGF por ESBA903. Premezclado

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La figura 14 ilustra estudios de eficacia usando el analisis modificado de miles en ratas (administracion topica de 578 minmax (ESBA903)). La eficacia antipermeabilidad de AL-51287 (ESBA903) sobre la fuga vascular de la retina inducida por el VEGF en ratas se ensayo mediante administracion topica. Cinco dlas de pretratamiento, 4 gotas/dla con una formulacion de ESBA903 de 10 ng/ml. *p<0,05 (VEGF s. BSA), **p<0,05 (VEGF vs. AL-51287), *** p=0,060 (AL-51287 vs. AL-52667), **** (VEGF vs. AL-39324); p<0,05 (AL-39324 vs. vehlculo ref ctrl). AL-51287: ESBA903; AL- 52657: vehlculo topico control de referencia; AL-39324: inhibidor de la pequena molecula de RTK.

La figura 15 ilustra la definicion de CDR1 de VH como se usa aqul.

Description detallada

La invention se relaciona con imunoenlazadores anti-VEGF solubles y estables que comprenden CDRs de anticuerpos monoclonales de conejo. Dichos imunoenlazadores estan disenados para el diagnostico y/o tratamiento de trastornos mediados por el VEGF. Tambien se describen los hibridomas, acidos nucleicos, vectores y celulas huesped para la expresion de los anticuerpos recombinantes de la invencion, metodos para aislarlos y el uso de dichos anticuerpos en medicina.

Definiciones

Con el fin de que la presente invencion pueda entenderse mas facilmente, ciertos terminos se definiran como sigue. A lo largo de la descripcion detallada se exponen definiciones adicionales.

El termino VEGF se refiere al factor de crecimiento de celulas endoteliales vasculares de 165 aminoacidos y factores de crecimiento de celulas endoteliales vasculares relacionados con 121, 189 y 206 aminoacidos, segun se describe por Leung et al. Science 246:1306 (1989), y Houck et al. Mol. Endocrin. 5:1806 (1991) junto con las formas alelicas de origen natural y procesadas de esos factores de crecimiento.

El termino "receptor del VEGF" o "VEGFr" se refiere a un receptor celular para el VEGF, ordinariamente un receptor de superficie celular encontrado en celulas endoteliales vasculares, as! como variantes de las mismas que retienen la capacidad de enlazarse al hVEGF. Un ejemplo de un receptor del VEGF es la tirosina quinasa tipo fms (flt), un receptor transmembrana de la familia de la tirosina quinasa. DeVries et al. Science 255:989 (1992); Shibuya et al., Oncogene 5:519 (1990). El receptor flt comprende un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio intracelular con actividad de tirosina quinasa. El dominio extracelular esta implicado en el enlace del VEGF, mientras que el dominio intracelular esta implicado en la transduction de senales. Otro ejemplo de un receptor del VEGF es el receptor flk-1 (tambien denominado KDR). Matthews et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 88:9026 (1991); Terman et al. Oncogene 6:1677 (1991); Terman et al. Biochem. Biophys. Res. Comun. 187:1579 (1992). El enlace del VEGF al receptor flt da como resultado la formation de al menos dos complejos de alto peso molecular, que tienen un peso molecular aparente de 205,000 y 300,000 Daltones. Se cree que el complejo de 300,000 Dalton es un dlmero que comprende dos moleculas receptoras enlazadas a una sola molecula del VEGF.

El termino "conejo" tal como se utiliza aqul se refiere a un animal perteneciente a la familia de los leporidos.

El termino "anticuerpo" tal como se utiliza aqul es un sinonimo de "inmunoglobulina". Los anticuerpos segun la presente invencion pueden ser inmunoglobulinas enteras o fragmentos de las mismas, que comprenden al menos un dominio variable de una inmunoglobulina, tal como dominios variables individuales, Fv (Skerra A. and Pluckthun, A. (1988) Science 240:1038-41) , ScFv (Bird, R.E. et al. (1988) Science 242:423-26; Huston, J.S. et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:5879-83), Fab, (Fab')2 u otros fragmentos bien conocidos por un experto en la tecnica.

El termino “CDR” se refiere a una de las seis regiones hipervariables dentro de los dominios variables de un anticuerpo que contribuyen principalmente al enlace con el antlgeno. Una de las definiciones mas comunmente usadas para las seis CDRs fue proporcionada por Kabat E.A. Et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242). Como se usa aqul, la definicion de CDRs de Kabat solo se aplica para CDR1, CDR2 y CDR3 del dominio variable de cadena ligera (CDR L1, CDR L2, CDR L3 o L1, L2, L3), as! como para CDR2 y CDR3 del dominio variable de cadena pesada (CDR H2, CDR H3, o H2, H3). CDR1 del dominio variable de cadena pesada (CDR H1 o H1), sin embargo, tal como se usa aqul se define por los siguientes residuos (numeration de Kabat): comienza con la position 26 y termina antes de la position 36. Esta es basicamente una fusion de CDR H1 como se define de forma diferente por Kabat y Chotia (vease tambien la Figura 15 para ilustracion).

El termino "estructura de anticuerpo", o a veces solo "estructura", tal como se utiliza aqul, se refiere a la parte del dominio variable, tanto VL como VH, que sirven como escalon para los bucles de enlace del antlgeno (CDR) de este dominio variable. En esencia, es el dominio variable sin los CDRs.

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El termino "anticuerpo de cadena sencilla", "Fv de cadena sencilla" o "scFv" se refiere a una molecula que comprende un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (o region; Vh) y un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (o region; Vl), conectado por un enlazador. Tales moleculas de scFv pueden tener las estructuras generales: NH2-VL-enlazador-VH-COOH o NH2-VH-enlazador-VL-COOH.

Tal como se usa aqul, "identidad" se refiere a la compatibilidad de secuencia entre dos polipeptidos, moleculas o entre dos acidos nucleicos. Cuando una posicion en ambas de las dos secuencias comparadas esta ocupada por la misma base o subunidad de monomero de aminoacido (por ejemplo, si una posicion en cada una de las dos moleculas de ADN esta ocupada por adenina o una posicion en cada uno de los dos polipeptidos esta ocupada por una lisina), entonces las moleculas respectivas son identicas en esa posicion. La "identidad porcentual" entre dos secuencias es una funcion del numero de posiciones compatibles compartidas por las dos secuencias divididas por el numero de posiciones comparadas x 100. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones en dos secuencias son compatibles, entonces las dos secuencias tienen un 60% de identidad. A modo de ejemplo, las secuencias de ADN CTGACT y CAGGTT comparten una identidad del 50% (3 de las 6 posiciones totales son compatibles). Generalmente, se hace una comparacion cuando dos secuencias estan alineadas para dar la identidad maxima. Dicha alineacion puede proporcionarse utilizando, por ejemplo, el metodo de Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453, implementado convenientemente por programas informaticos tales como el programa Align (DNAstar, Inc.). El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoacidos tambien se puede determinar usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) que se ha incorporado al programa ALIGN (version 2.0), utilizando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalization de longitud de intervalo de 12 y una penalization de intervalo de 4. Ademas, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoacidos se puede determinar usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en
www.gcg.com), utilizando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250 y un peso de intervalo de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.

Secuencias "similares" son aquellas que, cuando estan alineadas, comparten residuos de aminoacidos identicos y similares, donde residuos similares son sustituciones conservadoras de residuos de aminoacidos correspondientes en una secuencia de referencia alineada. A este respecto, la "sustitucion conservadora" de un residuo en una secuencia de referencia es una sustitucion por un residuo que es flsicamente o funcionalmente similar al residuo de referencia correspondiente, por ejemplo, que tiene un tamano, forma, carga electrica, propiedades qulmicas similares, incluyendo la capacidad de formar enlaces covalentes o de hidrogeno, o similares. Por lo tanto, una secuencia de "sustitucion conservadora modificada" es una secuencia que difiere de una secuencia de referencia o una secuencia de tipo salvaje en la que estan presentes una o mas sustituciones conservadoras. La "similitud porcentual" entre dos secuencias es una funcion del numero de posiciones que contienen residuos compatibles o sustituciones conservadoras compartidas por las dos secuencias divididas por el numero de posiciones comparadas x 100. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones en dos secuencias son compatibles y 2 de 10 posiciones contienen sustituciones conservadoras, entonces las dos secuencias tienen un 80% de similitud positiva.

Como se usa aqul, el termino "modificaciones de secuencia conservadoras" pretende referirse a modificaciones de aminoacidos que no afectan negativamente o alteran las caracterlsticas de enlace del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoacidos. Tales modificaciones de secuencia conservadoras incluyen sustituciones, adiciones y eliminaciones de nucleotidos y aminoacidos. Por ejemplo, se pueden introducir modificaciones mediante tecnicas estandar conocidas en la tecnica, tales como mutagenesis dirigida y mutagenesis mediada por PCR. Las sustituciones de aminoacidos conservadoras incluyen aquellas en las que el residuo de aminoacido se reemplaza con un residuo de aminoacido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoacidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la tecnica. Estas familias incluyen aminoacidos con cadenas laterales basicas (por ejemplo lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (por ejemplo, acido aspartico, acido glutamico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina , cistelna, triptofano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales ramificadas beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromaticas (tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Por lo tanto, un residuo de aminoacido no esencial previsto en un anticuerpo anti-VEGF humano se reemplaza preferentemente por otro residuo de aminoacido de la misma familia de cadena lateral. Los metodos de identification de sustituciones conservativas de nucleotidos y aminoacidos que no eliminan la union al antlgeno son bien conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Brummell et al., Biochem 32: 11801187 (1993), Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999) y Burks et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 94: 412417 (1997)).

"Secuencia de consenso de aminoacidos", tal como se utiliza aqul, se refiere a una secuencia de aminoacidos que se puede generar usando una matriz de al menos dos, preferentemente mas, secuencias de aminoacidos alineadas, y permitiendo intervalos en la alineacion, de tal manera que sea posible determinar el residuo de aminoacido mas frecuente en cada posicion. La secuencia de consenso es la secuencia que comprende los aminoacidos que estan

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representados con mas frecuencia en cada posicion. En el caso de que dos o mas aminoacidos esten representados equitativamente en una sola posicion, la secuencia de consenso incluye ambos o todos los aminoacidos.

La secuencia de aminoacidos de una protelna puede analizarse a diversos niveles. Por ejemplo, la conservacion o la variabilidad pueden exhibirse a nivel de residuo unico, nivel de residuo multiple, residuo multiple con intervalos, etc. Los residuos pueden exhibir la conservacion del residuo identico o pueden conservarse a nivel de clase. Ejemplos de clases de aminoacidos incluyen grupos R polares pero no cargados (serina, treonina, asparagina y glutamina); grupos R cargados positivamente (lisina, arginina e histidina); grupos R cargados negativamente (acido glutamico y acido aspartico); grupos R hidrofobos (alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, valina y tirosina); y aminoacidos especiales (cistelna, glicina y prolina). Otras clases son conocidas por un experto en la tecnica y pueden definirse usando determinaciones estructurales u otros datos para evaluar la sustituibilidad. En ese sentido, un aminoacido sustituible puede referirse a cualquier aminoacido que puede ser sustituido y mantener la conservacion funcional en esa posicion.

Se reconocera, sin embargo, que los aminoacidos de la misma clase pueden variar en grado por sus propiedades bioflsicas. Por ejemplo, se reconocera que ciertos grupos R hidrofobos (por ejemplo, alanina, serina o treonina) son mas hidrofilos (es decir, de mayor hidrofilicidad o hidrofobicidad mas baja) que otros grupos R hidrofobos (por ejemplo, valina o leucina). La hidrofilia o hidrofobicidad relativa se puede determinar usando metodos reconocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Rose et al., Science, 229: 834-838 (1985) y Cornette et al., J. Mol. Biol., 195: 659-685 (1987)).

Como se usa aqul, cuando una secuencia de aminoacidos (por ejemplo, una primera secuencia Vh o Vl) esta alineada con una o mas secuencias de aminoacidos adicionales (por ejemplo, una o mas secuencias VH o VL en una base de datos), una posicion de aminoacidos en una secuencia (por ejemplo, la primera secuencia Vh o Vl) puede compararse con una "posicion correspondiente" en una o mas secuencias de aminoacidos adicionales. Como se usa aqul, la "posicion correspondiente" representa la posicion equivalente en la(s) secuencia(s) que se comparan cuando las secuencias estan alineadas optimamente, es decir, cuando las secuencias estan alineadas para lograr el porcentaje de identidad o porcentaje de similitud mas alto.

Tal como se utiliza aqul, el termino "base de datos de anticuerpos" se refiere a una coleccion de dos o mas secuencias de aminoacidos de anticuerpo (una "multiplicidad" de secuencias), y se refiere tlpicamente a una coleccion de decenas, cientos o incluso miles de secuencias de aminoacidos de anticuerpo. Una base de datos de anticuerpos puede almacenar secuencias de aminoacidos de, por ejemplo, una coleccion de regiones Vh de anticuerpo, regiones Vl de anticuerpo o ambas, o puede almacenar una coleccion de secuencias scFv comprendidas de regiones Vh y Vl. Preferiblemente, la base de datos se almacena en un medio fijo, capaz de buscar, tal como en un ordenador dentro de un programa informatico que puede buscarse. En una realizacion, la base de datos de anticuerpos es una base de datos que comprende o consiste en secuencias de anticuerpos de la llnea germinal. En otra realizacion, la base de datos de anticuerpos es una base de datos que comprende o que consiste en secuencias de anticuerpos maduros (es decir, expresado) (por ejemplo, una base de datos Kabat de secuencias maduras de anticuerpos, por ejemplo, una base de datos KBD). En otra realizacion mas, la base de datos de anticuerpos comprende o consiste en secuencias funcionalmente seleccionadas (por ejemplo, secuencias seleccionadas de un analisis de QC).

El termino “inmunoenlazador” se refiere a una molecula que contiene toda o una parte del sitio de enlace al antlgeno de un anticuerpo, por ejemplo, todo o parte del dominio variable de cadena pesada y/o ligera, de manera que el inmunoenlazador reconozca especlficamente un antlgeno objetivo. Ejemplos no limitantes de inmunoenlazadores incluyen moleculas de inmunoglobulina de longitud completa y scFvs, as! como fragmentos de anticuerpo, incluyendo, pero no limitados a (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, Cl y Ch1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la region articulada; (iii) un fragmento Fab', que es esencialmente un Fab con parte de la region articulada (vease Fundamental Immunology (Paul ed., 3.sup.rd. ed.1993); (iv) un fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y Ch1; (v) un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un solo brazo de un anticuerpo, (vi) un anticuerpo de dominio unico tal como un fragmento Dab (Ward et al., (1989) Nature 341:544- 546), que consiste en un dominio Vh o Vl, un camelido (vease Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993), y Dumoulin, et al., Protein Science 11:500-515 (2002)) o un anticuerpo de tiburon (por ejemplo, Ig-NARs Nanobodies® de tiburon); y (vii) un nanocuerpo, una region de cadena pesada que contiene el dominio variable y dos dominios constantes.

Tal como se usa aqul, el termino "propiedad funcional" es una propiedad de un polipeptido (por ejemplo, un inmunoenlazador) para el cual es deseable y/o ventajosa una mejora (por ejemplo, con relacion a un polipeptido convencional) para una persona experimentada en la tecnica, por ejemplo, con el fin de mejorar las propiedades de fabricacion o la eficacia terapeutica del polipeptido. En una realizacion, la propiedad funcional es estabilidad (por ejemplo, estabilidad termica). En otra realizacion, la propiedad funcional es solubilidad (por ejemplo, bajo condiciones celulares). En otra realizacion mas, la propiedad funcional es la no agregacion. En todavla otra realizacion, la propiedad funcional es la expresion de protelnas (por ejemplo, en una celula procariota). En otra realizacion mas, la propiedad funcional es una eficacia de replegamiento despues de una solubilizacion del cuerpo de inclusion en un proceso de

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purificacion correspondiente. En ciertas realizaciones, la afinidad de union al antlgeno no es una propiedad funcional deseada para mejorar.

El termino “epltopo” o “determinante antigenico” se refiere a un sitio sobre un antlgeno (por ejemplo, sobre el VEGF) al que se une especlficamente una inmunoglobulina o anticuerpo. Un epltopo incluye tlpicamente al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoacidos consecutivos o no consecutivos en una conformacion espacial unica. Vease, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996).

Los terminos "enlace especlfico", "enlace selectivo", "se enlazan selectivamente" y "se enlazan especlficamente", se refieren al enlace del anticuerpo a un epltopo sobre un antlgeno predeterminado. Tlpicamente, el anticuerpo se enlaza con una afinidad (Kd) de aproximadamente menos de 10-7 M, tal como aproximadamente menos de 10-8 M, 10-9 M o 10-10 M o incluso mas baja.

El termino "Kd" o "Kd" se refiere a la constante de equilibrio de disociacion de una interaccion anticuerpo-antlgeno particular. Tlpicamente, los anticuerpos de la invencion se unen al VEGF con una constante de equilibrio de disociacion (Kd) inferior a 10-8 M, 10-9 M o 10-10 M o incluso inferior, por ejemplo, segun se determina usando tecnologla de resonancia de plasmon superficial (SPR) en un instrumento BIACORE.

Los terminos "neutraliza el VEGF", "inhibe el VEGF" y "bloquea el VEGF” 'se usan indistintamente para referirse a la capacidad de un anticuerpo de la invencion para evitar que el VEGF interactue con uno o mas receptores del VEGF tales como VEGFR-1 y/o VEGFR-2, y, por ejemplo, el desencadenamiento de la transduccion de senales.

Un "inmunoenlazador recombinante" tal como se utiliza aqul se refiere a un inmunoenlazador que se produce por expresion a partir de ADN recombinante.

Un inmunoenlazador "quimerico" tal como se usa aqul tiene una porcion de la cadena pesada y/o ligera identica u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase particular de anticuerpos, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es identica u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, as! como fragmentos de dichos anticuerpos. El anticuerpo humanizado tal como se utiliza aqul es un subconjunto de anticuerpos quimericos.

Los "anticuerpos humanizados" tal como se usan aqul son inmunoenlazadores que se han sintetizado usando tecnologla de ADN recombinante para eludir la respuesta inmune a antlgenos extranos. La humanizacion es una tecnica bien establecida para reducir la inmunogenicidad de anticuerpos monoclonales de fuentes xenogenicas. Esto implica la eleccion de una estructura aceptora, preferiblemente una estructura aceptora humana, la extension de las CDRs desde el inmunoenlazador donante para ser insertado en la estructura aceptora y la sustitucion de residuos de la estructura donante en la estructura aceptora. Un metodo general para injertar CDRs en estructuras aceptoras humanas ha sido descrito por Winter en la Patente de Estados Unidos N° 5.225.539. La US6,407,213 describe una serie de posiciones de aminoacidos de la estructura en las que se prefiere una sustitucion del inmunoenlazador donante.

El termino "molecula de acido nucleico", se refiere a moleculas de ADN y moleculas de ARN. Una molecula de acido nucleico puede ser de cadena sencilla o doble cadena, pero preferiblemente es ADN de doble cadena. Un acido nucleico esta "unido operativamente" cuando se coloca en una relacion funcional con otra secuencia de acido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador esta unido operativamente a una secuencia de codificacion si afecta a la transcripcion de la secuencia.

El termino "vector" se refiere a una molecula de acido nucleico capaz de transportar otro acido nucleico al que ha sido unido. Un tipo de vector es un "plasmido", que se refiere a un bucle circular de doble cadena de ADN en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que segmentos de ADN adicionales pueden ligarse al genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicacion autonoma en una celula huesped en la que estos se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicacion y vectores episomicos de mamlferos). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomicos de mamlferos) pueden integrarse en el genoma de una celula huesped tras su introduccion en la celula huesped, y por lo tanto se replican junto con el genoma del huesped.

El termino “celula huesped” se refiere a una celula en la que se ha introducido un vector de expresion. Las celulas huesped pueden incluir celulas bacterianas, microbianas, vegetales o animales. Las bacterias, que son susceptibles a la transformacion, incluyen miembros de las enterobacteriaceae, tales como cepas de Escherichia coli o Salmonella; Bacillaceae, tales como Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus, y Haemophilus influenzae. Los microbios adecuados incluyen Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris. Las llneas de celulas huesped animales adecuadas incluyen llneas CHO (llneas de ovario de hamster chino) y celulas NS0.

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Los terminos "tratar", "tratando" y "tratamiento", se refieren a medidas terapeuticas o preventivas descritas aqul. Los metodos de "tratamiento" emplean la administracion a un sujeto, con necesidad de tal tratamiento, de un anticuerpo de la presente invention, por ejemplo, un sujeto que tiene un trastorno mediado por el VEGF o un sujeto que finalmente puede adquirir tal trastorno, con el fin de prevenir, curar, retrasar, reducir la gravedad o mejorar uno o mas slntomas del trastorno o trastorno recurrente, o para prolongar la supervivencia de un sujeto mas alla de lo esperado en ausencia de tal tratamiento.

El termino "trastorno mediado por el VEGF" se refiere a cualquier trastorno, la aparicion, progresion o la persistencia de los slntomas o estados de enfermedad de los que requiere la participation del VEGF. Los trastornos mediados por el VEGF de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, degeneration macular relacionada con la edad, glaucoma neovascular, retinopatla diabetica, retinopatla de prematuridad, fibroplasia retrolental, carcinomas de mama, carcinomas de pulmon, carcinomas gastricos, carcinomas de esofago, carcinomas colorrectales, carcinomas hepaticos, carcinomas de ovario, los comas, arrenoblastomas, carcinomas cervicales, carcinoma endometrial, hiperplasia endometrial, endometriosis, fibrosarcomas, coriocarcinoma, cancer de cabeza y cuello, carcinoma nasofarlngeo, carcinomas larlngeos, hepatoblastoma, sarcoma de Kaposi, melanoma, carcinomas cutaneos, hemangioma, hemangioma cavernoso, hemangioblastoma , carcinomas de pancreas, retinoblastoma, astrocitoma, glioblastoma, Schwannoma, oligodendroglioma, meduloblastoma, neuroblastomas, rabdomiosarcoma, sarcoma osteogenico, leiomiosarcomas, carcinomas del tracto urinario, carcinomas tiroideos, tumor de Wilm, carcinoma de celulas renales, carcinoma de prostata, proliferation vascular anormal asociada con facomatosis, edema (como el asociado a tumores cerebrales), slndrome de Meigs, artritis reumatoide, psoriasis y aterosclerosis.

El termino "dosis efectiva" o "dosificacion efectiva" se refiere a una cantidad suficiente para lograr o al menos parcialmente lograr el efecto deseado. El termino "dosis terapeuticamente efectiva" se define como una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones en un paciente que ya padece la enfermedad. Las cantidades efectivas para este uso dependeran de la gravedad del trastorno que se este tratando y del estado general del propio sistema inmune del paciente.

El termino "sujeto" se refiere a cualquier animal humano o no humano. Por ejemplo, los metodos y composiciones de la presente invencion se pueden usar para tratar un sujeto con un trastorno mediado por el VEGF.

El termino "injerto min" o "min" tal como se utiliza aqul se refiere a un dominio variable humanizado que se genero por el injerto de CDRs de conejo de un dominio variable de conejo en un marco aceptor humano de origen natural (FW 1.4, SEQ ID No. 172). No se realizan cambios en las regiones estructurales. La propia estructura se preselecciono para propiedades funcionales deseables (solubilidad y estabilidad).

El termino "injerto max" o "max" tal como se utiliza aqul se refiere a un dominio variable humanizado que se genero por injerto de CDRs de conejo de un dominio variable de conejo en la estructura aceptora humana "conejizada", “RabTor” (rFW1.4, SEQ ID No. 173), o en un derivado del mismo denominado rFW1.4(v2) (SEQ ID No. 174). La estructura "RabTor" se preparo mediante la incorporation de residuos de conejo conservados (de otro modo que son bastante variables en otras especies) en posiciones estructurales generalmente implicadas en la estructura del dominio de conejo variable y la estabilidad, con el objetivo de generar una estructura universalmente aplicable que acepta practicamente cualquier conjunto de conejo CDRs sin la necesidad de injertar restos estructurales donantes a parte de en posiciones que son diferentes en su secuencia progenitora presumible, por ejemplo, que se alteraron durante la hipermutacion somatica y por lo tanto, posiblemente contribuyen al enlace del antlgeno. La secuencia progenitora presumible se define como la contraparte mas cercana de la llnea germinal de conejo y en caso de que la contraparte de la llnea germinal mas cercana no pueda ser establecida, el consenso de subgrupo de conejo o el consenso de secuencias de conejo con un alto porcentaje de similitud.

El termino "Min Max" o "minmax" como se usa aqul se refiere a un dominio variable humanizado que comprende una cadena ligera variable "injerto min" combinada con una cadena pesada variable "injerto max".

El termino "Max-Min" o "maxmin" tal como se utiliza aqul se refiere a un dominio variable humanizado que comprende una cadena ligera variable "injerto max" combinada con una cadena pesada variable de "injerto min".

Se utilizaron diferentes nomenclaturas para los inmunoenlazadores generados. Estos se identifican tlpicamente mediante un numero (por ejemplo, #578). En aquellos casos en los que se uso un prefijo tal como EP o Epi (por ejemplo, EP 578 que es identico a Epi 578), se indica de este modo el mismo inmunoenlazador. Ocasionalmente, un inmunoenlazador recibio una segunda designation que se identifica mediante el prefijo "ESBA". Por ejemplo, ESBA903 designa el mismo inmunoenlazador que 578minmax o EP578minmax o Epi578minmax.

A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientlficos usados aqul tienen el mismo significado que comunmente entiende alguien con experiencia ordinaria en la tecnica a la que pertenece esta invencion. Aunque se pueden usar metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aqul en la practica o prueba de la presente invencion, se describen a continuation metodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, la presente

especificacion, incluyendo definiciones, controlara. Ademas, los materiales, metodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitativos.

Diversos aspectos de la invencion se describen con mas detalle en las siguientes subsecciones. Se entiende que las diversas realizaciones, preferencias y rangos pueden combinarse a voluntad. Ademas, dependiendo de la realizacion 5 especlfica, pueden no aplicarse definiciones, realizaciones o intervalos seleccionados.

Immunoenlazadores Anti-VEGF

En un aspecto, la presente invencion se refiere a inmunoenlazadores que se unen al VEGF y por lo tanto son adecuados para bloquear la funcion del VEGF in vivo. Las CDRs de estos inmunoenlazadores se derivan de anticuerpos monoclonales anti-VEGF de conejo que se obtuvieron a partir de conejos que se inmunizaron con el VEGF 10 humano y/o un fragmento del mismo (SEQ ID No.1). Hasta donde sabemos, esta es la primera vez que se obtienen anticuerpos monoclonales anti-VEGF a partir de conejos y se caracterizan en detalle. Sorprendentemente, las afinidades (Kd) se encontraron extraordinariamente altas.

Se revela aqul un inmunoenlazador, que se enlaza especlficamente al VEGF, que comprende al menos una de una secuencia de aminoacidos CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 o CDRL3. Las secuencias de aminoacidos de 15 CDR de ejemplo para uso en los inmunoenlazadores de la descripcion se exponen en las SEQ ID Nos: 2-72 (Tablas 1-6).

Tabla 1. secuencias de aminoacidos CDR H1 de inmunoenlazadores anti-VEGF de la invencion.

Identificador de la Secuencia: CDR-H1 SEQ ID No.

60-11-4: GFPFSSGYWVC 2

60-11-6: GFSFSSGYWIC 3

435: GFSLNTNYWMC 4

453: GFSFSRSYYIY 5

375: GFSFTTTDYMC 6

610: GIDFSGAYYMG 7

578: GFSLTDYYYMT 8

534: GFSLSYYYMS 9

567: GFSLSDYYMC 10

509: GFSLSSYYMC 11

511: GFSLNTYYMN 12

509maxII: GFSLSSYYMS 13

Consenso: GFSLSSGYYMC 14

Tabla 2. Secuencias de aminoacidos de CDR H2 de inmunoenlazadores anti-VEGF de la invencion.

Identificador de la Secuencia: CDR-H2 SEQ ID No.

60: CIYAGSSGSTYYASWAKG 15

435: CMYTGSYN RAYYASWAKG 16

453: CIDAGSSGILVYANWAKG 17

375: CILAGDGSTYYANWAKG 18

610: YIDYDGDRYYASWAKG 19

578: FI DPDDDPYYATWAKG 20

534: IIGPGDYTDYASWAKG 21

567: CLDYFGSTDDASWAKG 22

509: CLDYVGDTDYASWAKG 23

511: IIAPD DTTYY ASWAKS 24

509maxII: ILDYVGDTDYASWAKG 25

Consenso: CIDAGSDGDTYYASWAKG 26

Tabla 3. Secuencias de aminoacidos CDR H3 de inmunoenlazadores anti-VEGF de la invencion.

Identificador de la Secuencia: CDR-H3 SEQ ID No.

60: GNNYYIYTDGGYAYAGLEL 27

435: GSNWYSDL 28

453: GDASYGVDSFMLPL 29

375: SDPASSWSFAL 30

610: SDYSSGWGTDI 31

578: GDHNSGWGLDI 32

534: GDDNSGWGEDI 33

567: TDDSRGWGLNI 34

509: TDDSRGWGLNI 35

511: SGDTTAWGADI 36

Consenso: GDDSSGYTDGGYAYWGLDI 37

Tabla 4. Secuencias de aminoacidos de CDR L1 de inmunoenlazadores anti-VEGF de la invencion.

Identificador de la Secuencia: CDR-L1 SEQ ID No.

60: QASQSISSYLS 38

435: QASQSIGSSLA 39

453: QSSQSVWNNNRLA 40

375: QASENINIWLS 41

610: QASQSISSWLS 42

578: QASEIIHSWLA 43

534: QASQSINIWLS 44

567: QADQSIYIWLS 45

509: QASQNIRIWLS 46

511: QASQSINIWCS 47

511max: QASQSINIWLS 48

Consenso: QASQSININNWLS 49

Tabla 5. Secuencias de aminoacidos de CDR L2 de inmunoenlazadores anti-VEGF de la invencion.

Identificador de la Secuencia: CDR-L2 SEQ ID No.

60: KASTLAS 50

435: TAANLAS 51

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453: YASTLAS 52

375: QASKLAS 53

610: QASTLAS 54

578: LASTLAS 55

534: KESTLAS 56

567: KASTLES 57

509: KASTLES 58

511: RASTLAS 59

Consenso: KASTLAS 60

Tabla 6. Secuencias de aminoacidos de CDR L3 de inmunoenlazadores anti-VEGF de la invencion.

Identificador de la Secuencia: CDR-L3 SEQ ID No.

60: QSNYGGSSSDYGNP 61

435: QNFATSDTVT 62

453: AGGYSSTSDNT 63

375: QNNYSYNRYGAP 64

610: QNNYGFRSYGGA 65

578: QNVYLASTNGAN 66

534: QNNYDSGNNGFP 67

567: QNNAHYSTNGGT 68

509: QNNAHYSTNGGT 69

511: QANYAY SAGY GAA 70

Consenso: QNNYHYSSSTNGGT 71

Aqul se describe un inmunoenlazador que comprende al menos un CDR que tiene al menos un 75% de similitud, preferiblemente al menos un 75% de identidad, mas preferiblemente al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, aun mas preferiblemente un 100% de identidad a una secuencia de consenso del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 71. El VH de dicho inmunoenlazador puede comprender las CDRs del grupo constituido por las SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26 y las SEQ ID NO: 37 y/o las CDRs de la VL de dicho inmunoenlazador pueden comprender CDRs del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 71. El CDR puede seleccionarse del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 a SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 a SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 a SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50 a SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 61 a SEQ ID NO: 70.

Se describe adicionalmente un inmunoenlazador que comprende al menos una CDR que tiene al menos un 75% de similitud, preferiblemente al menos un 75% de identidad, mas preferiblemente al menos 80%, 85%, 90% 95%, incluso mas preferiblemente 100% de identidad a una secuencia del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 50 y SEQ ID NO: 61. La VH de dicho inmunoenlazador puede comprender las CDR del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 27 y/o las CDRs de la VL de dicho inmunoenlazador pueden comprender CDRs del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 38 , SEQ ID NO: 50 y SEQ ID NO: 61. Alternativamente, el VH de dicho inmunoenlazador puede comprender las CDRs del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 27 y/o las CDRs de la VL de dicho inmunoenlazador pueden comprender CDRs del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 50 y SEQ ID NO: 61.

Tambien se describe un inmunoenlazador que comprende al menos una CDR que tiene al menos un 75% de similitud, preferiblemente al menos un 75% de identidad, mas preferiblemente al menos 80%, 85%, 90% 95%, incluso mas preferiblemente 100% de identidad a una secuencia del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16,

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SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 62. La VH de dicho inmunoenlazador puede comprender las CDRs del grupo constituido por las SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 28 y/o las CDRs de la VL de dicho inmunoenlazador pueden comprender CDRs del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 51, y SEQ ID NO: 62.

Se describe aqul tambien un inmunoenlazador que comprende al menos una CDR que tiene al menos un 75% de similitud, preferiblemente al menos un 75% de identidad, mas preferiblemente al menos 80%, 85%, 90% 95%, incluso mas preferiblemente 100% de identidad a una secuencia del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 63. El VH de dicho inmunoenlazador puede comprender las CDRs del grupo constituido por la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 17, la SEQ ID NO: 29 y/o las CDRs de la VL de dicho inmunoenlazador pueden comprender CDRs del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 63.

Se describe adicionalmente aqul un inmunoenlazador que comprende al menos una CDR que tiene al menos un 75% de similitud, preferiblemente al menos un 75% de identidad, mas preferiblemente al menos 80%, 85%, 90% 95%, incluso mas preferiblemente 100% de identidad a una secuencia del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 64. El VH de dicho inmunoenlazador puede comprender las CDRs del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 18 y la SEQ ID NO: 30 y/o las CDR de la VL de dicho inmunoenlazador pueden comprender CDRs del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 64.

Tambien se describe un inmunoenlazador que comprende al menos una CDR que tiene al menos un 75% de similitud, preferiblemente al menos un 75% de identidad, mas preferiblemente al menos 80%, 85%, 90% 95%, incluso mas preferiblemente 100% de identidad a una secuencia del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 54 y SEQ ID NO: 65. El VH de dicho inmunoenlazador puede comprender las CDRs del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 31 y/o las CDRs de la VL de dicho inmunoenlazador pueden comprender CDRs del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 54 y SEQ ID NO: 65.

Se describe ademas un inmunoenlazador que comprende al menos una CDR que tiene al menos un 75% de similitud, preferiblemente al menos un 75% de identidad, mas preferiblemente al menos 80%, 85%, 90% 95%, incluso mas preferiblemente 100% de identidad a una secuencia del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 66. La VH de dicho inmunoenlazador puede comprender las CDRs del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 32 y/o las CDR de la VL de dicho inmunoenlazador pueden comprender CDRs del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 66.

Se proporciona tambien un inmunoenlazador que comprende al menos una CDR que tiene al menos un 75% de similitud, preferiblemente al menos un 75% de identidad, mas preferiblemente al menos 80%, 85%, 90% 95%, incluso mas preferiblemente 100% de identidad a una secuencia del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 67. El VH de dicho inmunoenlazador puede comprender las CDRs del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 33 y/o las CDR de la VL de dicho inmunoenlazador pueden comprender CDRs del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 67.

Otro inmunoenlazador descrito es un inmunoenlazador que comprende al menos una CDR que tiene al menos un 75% de similitud, preferiblemente al menos un 75% de identidad, mas preferiblemente al menos 80%, 85%, 90% 95%, incluso mas preferiblemente 100% de identidad a una secuencia del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 68. El VH de dicho inmunoenlazador puede comprender las CDRs del grupo constituido por las SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 34 y/o las CDRs de la VL de dicho inmunoenlazador pueden comprender CDRs del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 68. Tambien se describe un immunoenlazador, el inmunoenlazador puede comprender CDRs del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 68. Un inmunoenlazador que comprende al menos una CDR que tiene al menos un 75% de similitud, preferiblemente al menos un 75% de identidad, mas preferiblemente al menos 80%, 85%, 90% 95%, incluso mas preferiblemente 100% de identidad a una secuencia del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 69. La VH de dicho inmunoenlazador puede comprender las CDRs del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 35 y/o las CDRs de la VL de dicho inmunoenlazador pueden comprender CDRs del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 69. Alternativamente, el VH de dicho inmunoenlazador puede comprender las CDRs del grupo que consiste delas SEQ ID NO: 13, SEC ID NO: 25 y SEQ ID NO: 35 y/o las CDRs de la VL de dicho inmunoenlazador pueden comprender CDRs del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 69.

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Se describe ademas un inmunoenlazador que comprende al menos una CDR que tiene al menos un 75% de similitud, preferiblemente al menos un 75% de identidad, mas preferiblemente al menos 80%, 85%, 90% 95%, incluso mas preferiblemente 100% de identidad a una secuencia del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 70. La VH de dicho inmunoenlazador puede comprender las CDRs del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 36. Adicionalmente o alternativamente, el VL de dicho inmunoenlazador puede comprender CDRs del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 47 , SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 70, por ejemplo la SEQ ID NO: 47, la SEQ ID NO: 59, y la SEQ ID NO: 70; o la SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 59, y SEQ ID NO: 70.

El inmunoenlazador descrito aqul neutraliza el VEGF humano y puede tener reactividad cruzada con el VEGF de rata/raton o una porcion de la misma.

El immunoenlazador puede comprender un anticuerpo o cualquier escalon de enlace alternativo capaz de acomodar las CDRs. Las CDRs expuestas en las SEQ ID Nos: 2-72 pueden injertarse en cualquier escalon de enlace adecuado usando cualquier metodo reconocido en la tecnica (vease, por ejemplo, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525, Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86: 1002910033; Patente de EE.UU. No. 5.225.539 a Winter y Patente de EE.UU. Nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 de Queen et al.). Sin embargo, se prefiere que los inmunoenlazadores descritos aqul sean humanizados y, por lo tanto, adecuados para aplicaciones terapeuticas.

En el caso de anticuerpos, las CDRs de conejo expuestas en las SEQ ID Nos: 2-72 pueden injertarse en las regiones estructurales de cualquier anticuerpo de cualquier especie. Sin embargo, se ha descubierto previamente que los anticuerpos o derivados de anticuerpo que comprenden las estructuras identificadas en la denominada pantalla de "control de calidad" (WO0148017) se caracterizan por una estabilidad y/o solubilidad generalmente alta y por lo tanto tambien pueden ser utiles en el contexto de aplicaciones extracelulares tales como la neutralizacion del VEGF humano. Ademas, se ha descubierto ademas que una combinacion particular de estas estructuras solubles y estables VL (cadena ligera variable) y VH (cadena pesada variable) es particularmente adecuada para acomodar CDRs de conejo. De acuerdo con esto, las CDRs expuestas en las SEQ ID Nos: 2-72 pueden injertarse en las estructuras de anticuerpos humanos derivadas por la revision del "control de calidad" descrito en el documento EP1479694. Las secuencias de aminoacidos de estructuras de ejemplo para uso en la invencion se exponen en las SEQ ID Nos: 172 a 174. Se descubrio sorprendentemente que tras el injerto en dicha estructura o sus derivados, la conformacion de bucle de una gran variedad de CDRs de conejo podrla ser completamente mantenida, en gran medida independiente de la secuencia de la estructura donante. Ademas, dicha estructura o sus derivadas que contienen diferentes CDRs de conejo se expresan bien y se producen de manera contraria a las cadenas individuales de tipo salvaje de conejo y todavla conservan casi totalmente la afinidad de los anticuerpos de conejo donante originales.

Por lo tanto, los CDRs y/o motivos de CDR descritos aqul estan presentes en una secuencia estructural de region variable de cadena pesada que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia, mas preferiblemente al menos 85%, 90% 95% e incluso mas preferiblemente 100% de identidad a la secuencia de la SEQ ID NO: 169. La secuencia estructural de region variable de cadena pesada puede comprender la SEQ ID NO: 170 o SEQ ID NO: 171.

Los CDRs y/o motivos de CDR descritos aqul pueden estar presentes en una secuencia estructural de region variable de cadena ligera que tiene al menos un 85% de identidad de secuencia, mas preferiblemente al menos 90%, 95%, incluso mas preferiblemente 100% de identidad a la secuencia de la SEQ ID NO: 167, mas preferiblemente que comprende la SEQ ID NO: 167 o SEQ ID NO: 168.

En anticuerpos de conejo, las CDRs pueden contener residuos de cistelna que se convierten en disulfuro unidos a residuos de cistelna en la estructura del anticuerpo. En consecuencia, puede ser necesario, al injertar CDRs de conejo que contienen residuos de cistelna en regiones estructurales que no son de conejo, introducir residuos de cistelna en la estructura no de conejo por, por ejemplo, mutagenesis para facilitar la estabilizacion del CDR de conejo a traves de un enlace disulfuro.

El inmunoenlazador, que se une especlficamente al VEGF, puede comprender al menos una de una secuencia de aminoacidos VL o VH. Las secuencias de aminoacidos VH o VL de ejemplo para su uso en los inmunoenlazadores de la invencion se exponen en las SEQ ID Nos: 72-106 y 107-166, respectivamente.

La invencion se refiere tambien a un inmunoenlazador que comprende un VH que tiene al menos un 80%, mas preferiblemente al menos un 85%, 90%, 95%, mas preferiblemente un 100% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 130 y SEQ ID NO: 131 (VH 60-11-4, VH 60-11-6, VH 60-11-4min, VH 60-11-6min, VH 60-11-4max y VH 60-11-6max, respectivamente); y/o una VL que tiene al menos 80%, mas preferiblemente al menos 85%, 90%, 95%, mas preferiblemente 100% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 82 y SEQ ID NO: 93 (VL 60, VL 60min, VL 60max, respectivamente).

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La invencion se refiere tambien a un inmunoenlazador que comprende un VH que tiene al menos 80%, mas preferiblemente al menos 85%, 90%, 95%, mas preferiblemente 100% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 120 y SEQ ID NO: 132 (VH 435, VH 435min y VH 435max, respectivamente); y/o una VL que tiene al menos 80%, mas preferiblemente al menos 85%, 90%, 95%, mas preferiblemente 100% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 83 y SEQ ID NO: 94 (VL 435, VL 435min y VL 435max, respectivamente).

Preferiblemente, dicho inmunoenlazador tiene al menos 80%, mas preferiblemente al menos 85%, 90%, 95%, mas preferiblemente 100% de identidad con la SEQ ID NO: 175 (435max).

La invencion tambien se refiere a un inmunoenlazador que comprende un VH que tiene al menos 80%, mas preferiblemente al menos 85%, 90%, 95%, mas preferiblemente 100% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 121 y SEQ ID NO: 133 (VH 453, VH 453min y VH 453max, respectivamente); y/o una VL que tiene al menos 80%, mas preferiblemente al menos 85%, 90%, 95%, mas preferiblemente 100% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 84 y SEQ ID NO: 95 (VL 453, VL 453min y VL 453max, respectivamente).

La invencion proporciona tambien se refiere a un inmunoenlazador que comprende un VH que tiene al menos 80%, mas preferiblemente al menos 85%, 90%, 95%, mas preferiblemente 100% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 122 y SEQ ID NO: 134 (VH 375, VH 375min y VH 375max, respectivamente); y/o una VL que tiene al menos 80%, mas preferiblemente al menos 85%, 90%, 95%, mas preferiblemente 100% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 85 y SEQ ID NO: 96 (VL 375, VL 375min y VL 375max, respectivamente).

La invencion se refiere tambien a un inmunoenlazador que comprende un VH que tiene al menos 80%, mas preferiblemente al menos 85%, 90%, 95%, mas preferiblemente 100% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 123 y 135 (VH 610, VH 610min y VH 610max, respectivamente); y/o una VL que tiene al menos 80%, mas preferiblemente al menos 85%, 90%, 95%, mas preferiblemente 100% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 86 y SEQ ID NO: 97 (VL 610, VL 610min y VL 610max, respectivamente).

La invencion se refiere tambien a un inmunoenlazador que comprende un VH que tiene al menos 80%, mas preferiblemente al menos 85%, 90%, 95%, mas preferiblemente 100% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEC ID NO : 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157 , SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165 y SEQ ID NO: ID NO: 166 (VH 578 y sus variantes); y/o una VL que tiene al menos 80%, mas preferiblemente al menos 85%, 90%, 95%, mas preferiblemente 100% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104 y SEQ ID NO: 105 (VL 578 y sus variantes).

Preferiblemente, dicho inmunoenlazador tiene al menos 80%, mas preferiblemente al menos 85%, 90%, 95%, mas preferiblemente 100% de identidad con las SEQ ID NO: 178 (578min), SEQ ID NO: 179 (578max) o SEQ ID NO : 180 (578minmax).

La invencion tambien se refiere a un inmunoenlazador que comprende un VH que tiene al menos 80%, mas preferiblemente al menos 85%, 90%, 95%, mas preferiblemente 100% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 125 y SEQ ID NO: 137 (VH 534, VH 534min y VH 534max, respectivamente); y/o una VL que tiene al menos 80%, mas preferiblemente al menos 85%, 90%, 95%, mas preferiblemente 100% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 88 y SEQ ID NO: 99 (VL 534, VL 534min y VL 534max, respectivamente).

La invencion se refiere tambien a un inmunoenlazador que comprende un VH que tiene al menos 80%, mas preferiblemente al menos 85%, 90%, 95%, mas preferiblemente 100% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 138 y SEQ ID NO: 143 (VH 567, VH 567min y VH 567max, respectivamente); y/o una VL que tiene al menos 80%, mas preferiblemente al menos 85%, 90%, 95%, mas preferiblemente 100% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO : 79, SEQ ID NO: 89 y SEQ ID NO: 100 (VL 567, VL 567min y VL 567max, respectivamente).

Preferiblemente, dicho inmunoenlazador tiene al menos 80%, mas preferiblemente al menos 85%, 90%, 95%, mas preferiblemente 100% de identidad con la SEQ ID NO: 177 (567min).

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La invencion se refiere tambien a un inmunoenlazador que comprende un VH que tiene al menos un 80%, mas preferiblemente al menos un 85%, 90%, 95%, mas preferiblemente un 100% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 139 y SEQ ID NO: 140 (VH 509, VH 509min, VH 509max y VH 509maxII, respectivamente); y/o una VL que tiene al menos 80%, mas preferiblemente al menos 85%, 90%, 95%, mas preferiblemente 100% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 90 y SEQ ID NO: 101 (VL 509, VL 509min y VL 509max, respectivamente).

La invencion tambien se refiere a un inmunoenlazador que comprende un VH que tiene al menos 80%, mas preferiblemente al menos 85%, 90%, 95%, mas preferiblemente 100% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 141 y SEQ ID NO: 145 (VH 511, VH 511 min, VH 511 max y VH 511 maxDHP, respectivamente); y/o una VL que tiene al menos 80%, mas preferiblemente al menos 85%, 90%, 95%, mas preferiblemente 100% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 102 y SEQ ID NO: 106 (VL 511, VL 511min, VL 511max y VL 511 minC41 L, respectivamente).

Preferiblemente, dicho inmunoenlazador tiene al menos 80%, mas preferiblemente al menos 85%, 90%, 95%, mas preferiblemente 100% de identidad con la SEQ ID NO: 176 (511_max).

Se da a conocer un inmunoenlazador, que se enlaza especlficamente al VEGF, que comprende una secuencia de aminoacidos con similitud sustancial con una secuencia de aminoacidos expuesta en las SEQ ID Nos: 2-166 y en las SEQ ID Nos: 175-180, y en las que el inmunoenlazador esencialmente retiene o mejora las propiedades funcionales deseadas del inmunoenlazador anti-VEGF descrito. Las similitudes porcentuales preferidas incluyen, pero no se limitan a, identidad de al menos 80%, 85%, 90% o 95%.

El inmunoenlazador, que se enlaza especlficamente al VEGF, puede comprender una secuencia de aminoacidos con identidad sustancial con una secuencia de aminoacidos establecida en las SEQ ID Nos: 2-166 y en las SEQ ID Nos. 175-180, y en la que el inmunoenlazador retiene o mejora las propiedades funcionales deseadas del inmunoenlazador anti-VEGF descrito. Las identidades porcentuales preferidas incluyen, pero no se limitan a, identidad de al menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95%.

El inmunoenlazador, que se enlaza especlficamente al VEGF, puede comprender una secuencia de aminoacidos con sustituciones conservadoras con respecto a una secuencia de aminoacidos expuesta en las SEQ ID Nos: 2-166 y en las SEQ ID Nos. 175-180 y en las que el inmunoenlazador retiene o mejora las propiedades funcionales deseadas del inmunoenlazador anti-VEGF descrito.

Los inmunoenlazadores que se enlazan especlficamente al VEGF humano pueden o no reaccionar de forma cruzada con moleculas del VEGF de otras especies, por ejemplo, el VEGF de raton, el VEGF de rata, el VEGF de conejo o el VEGF de cobayo. En una realizacion particular, el inmunoenlazador anti-VEGF puede enlazarse especlficamente al VEGF humano y de rata/raton.

Los inmunoenlazadores que se enlazan especlficamente al VEGF humano pueden ser madurados por afinidad.

En una realizacion, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de la presente invencion son anticuerpos de cadena sencilla (scFv) o fragmentos Fab. En el caso de anticuerpos scFv, un dominio VL seleccionado se puede enlazar a un dominio VH seleccionado en cualquier orientacion mediante un enlazador flexible. Un enlazador de estado de la tecnica adecuado consiste en secuencias de aminoacidos de GGGGS repetidas o variantes de las mismas. En una realizacion preferida de la presente invencion, tambien es posible un enlazador (GGGGS)4 de la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO: 181, pero tambien son posibles variantes de 1-3 repeticiones (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448). Otros enlazadores que se pueden usar para la presente invencion se describen por Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31: 94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 y Roovers et al. (2001), Cancer Immunol. Immunother. 50:51-59. La disposicion puede ser VL-enlazador-VH o VH-enlazador-VL, siendo la primera orientacion la preferida. Sin embargo, tambien se contemplan anticuerpos de dominio sencillo VH o VL. En el caso de fragmentos Fab, los dominios variables de cadena ligera VL seleccionados se fusionan a la region constante de una cadena kappa de Ig humana, mientras que los dominios variables VH de cadenas pesadas adecuados se fusionan con el primer dominio (terminal N) constante CH1 de un IgG humano. En el terminal C del dominio constante o en otros sitios del dominio variable o constante, puede formarse un puente disulfuro intercadena. Alternativamente, las dos cadenas tambien pueden estar enlazadas por un enlazador flexible que da como resultado un anticuerpo Fab de cadena sencilla.

Los anticuerpos o derivados de anticuerpos pueden tener afinidades con el VEGF humano con constantes de disociacion Kd en un intervalo de 10'14 M a 10'5 M. En una realizacion preferida de la presente invencion, el Kd es <1 nM. La afinidad de un anticuerpo para un antlgeno se puede determinar experimentalmente usando un metodo

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adecuado (Berzofsky et al. "Antibody-Antigen Interactions", in Fundamental Immunology, Paul, W.E., Ed, Raven Press: New York, NY (1992); Kuby, J. Immunology, W.H. Freeman and Company: New York, NY) y metodos descritos en el mismo.

La empresa Epitomics vende un anticuerpo anti-VEGF que es un anticuerpo monoclonal de conejo (anticuerpo de conejo VEGF (C-term), No. de cat. 1909-1). Dicho anticuerpo esta dirigido contra residuos en el terminal C del VEGF humano y, por lo tanto, no es capaz de neutralizar el VEGF. Por lo tanto, dicho anticuerpo no es adecuado para aplicaciones terapeuticas. Ademas, dicho IgG monoclonal no es un anticuerpo humanizado sino que es una inmunoglobulina natural de conejo de longitud completa. Ademas, se demostro que este anticuerpo no reconoce la forma nativa del VEGF.

Immunoenlazadores que enlazan a los mismos epltopos en el VEGF

En otro aspecto, la invention se refiere a anticuerpos que se enlazan a un epltopo en el VEGF reconocido por un anticuerpo que comprende una cualquiera de las secuencias de aminoacidos expuestas en las SEQ ID No 2-211. Tales anticuerpos pueden identificarse basandose en su capacidad para competir en forma cruzada con un anticuerpo que comprende una o mas de las secuencias de aminoacidos expuestas en las SEQ ID No 2-211 en analisis estandar de enlace al VEGF incluyendo, pero sin limitarse, a ELISA. La capacidad de un anticuerpo de prueba para inhibir la union al VEGF humano de un anticuerpo que comprende una o mas de las secuencias de aminoacidos expuestas en las SEQ ID No 2-211 demuestra que el anticuerpo de prueba puede competir de forma cruzada y as! interactuar con un epltopo de solapamiento en el VEGF humano como un anticuerpo que comprende una o mas de las secuencias de aminoacidos expuestas en la SEQ ID No 2-211.

De manera adicional o alternativamente, tales anticuerpos pueden identificarse tambien utilizando tecnicas de mapeo de epltopos estandar para determinar si se enlazan a los mismos inmunogenos peptldicos. Tambien se pueden emplear tecnicas de modelacion estructural para definir adicionalmente los determinantes moleculares precisos de la interaction anticuerpo/VEGF, incluyendo, pero sin limitarse a, RMN, cristalografla de rayos X, modelado basado en ordenador o tomografla de protelnas (Banyay et al., 2004 ASSAY and Drug Development Technologies (2), 5, pagina 516-567). De hecho, se ha resuelto la estructura cristalina del VEGF y se conocen los residuos de aminoacidos superficiales implicados en el enlace de VEGFr (Fuh, et al., 2006, J. Biol. Chem., 281, 6625-6631). Por consiguiente, dada la secuencia de aminoacidos del inmunogeno peptldico y el conocimiento estructural del VEGF disponible en la tecnica, esta bien dentro de la habilidad en la tecnica identificar anticuerpos que se unen a un epltopo en el VEGF reconocido por los anticuerpos que comprenden una o mas de las secuencias de aminoacidos expuestas en las SEQ ID No 2-211.

Los anticuerpos que se enlazan a un epltopo en el VEGF reconocidos por un anticuerpo que comprende una o mas de las secuencias de aminoacidos expuestas en las SEQ ID No 2-211 pueden enlazarse al VEGF con una afinidad de al menos 107 M-1, por ejemplo, por lo menos 108 M-1, por lo menos 109 M-1, por lo menos 1010 M-1, por lo menos 1011 M-1, por lo menos 1012 M'1 o por lo menos 1013 M-1.

Los anticuerpos que se enlazan a un epltopo en el VEGF reconocido por un anticuerpo que comprende una cualquiera o mas de las secuencias de aminoacidos expuestas en las SEQ ID No 2-211 pueden enlazarse especlficamente al VEGF humano y no reaccionar de forma cruzada con moleculas del VEGF de otras especies, por ejemplo, el VEGF de raton, el VGEF de rata, el VEGF de conejo, o el VEGF de cobayo.

Los anticuerpos que se enlazan a un epltopo en el VEGF reconocido por un anticuerpo que comprende una cualquiera o mas de las secuencias de aminoacidos expuestas en las SEQ ID No 2-211 pueden reaccionar de forma cruzada con moleculas del VEGF de otras especies, por ejemplo el VEGF de raton, el VEGF de rata, o el VEGF de conejo.

Variantes optimizadas

Los anticuerpos de la invencion pueden optimizarse adicionalmente para lograr propiedades funcionales mejoradas, por ejemplo, para mayor solubilidad y/o estabilidad.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos de la invencion se optimizan de acuerdo con la metodologla de "consenso funcional" descrita en el documento WO2008/110348 "Ingenierla basada en secuencias y optimization de anticuerpos de cadena sencilla", presentada 12 de marzo de 2008, por ejemplo, los inmunoenlazadores del VEGF de la invencion se pueden comparar con una base de datos de scFvs funcionalmente seleccionados para identificar posiciones de residuos de aminoacidos que son mas o menos tolerantes a la variabilidad que la(s) posicion(es) correspondiente(s) en el inmunoenlazador del VEGF, indicando de este modo que dicha position o posiciones de residuo identificadas pueden ser adecuadas para la ingenierla para mejorar la funcionalidad tal como estabilidad y/o solubilidad.

Posiciones estructurales de ejemplo para sustitucion se describen en el documento W02009/000099, titulado "Metodos de modification de anticuerpos y anticuerpos modificados con propiedades funcionales mejoradas",

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publicado el 31 de diciembre de 2008 y el documento WO2009/000098, titulado "Ingenierla basada en secuencias y optimizacion de anticuerpos de cadena sencilla”, publicado el 31 de diciembre de 2008. Por ejemplo, se pueden introducir una o mas de las siguientes sustituciones en una posicion de aminoacido (se hace referencia a la numeracion AHo para cada una de las posiciones de aminoacidos listadas a continuation) en la region variable de cadena pesada de un inmunoenlazador de la invention:

(a) Q o E en la posicion 1 del aminoacido;

(b) Q o E en la posicion 6 del aminoacido;

(c) T, S o A en la posicion 7 del aminoacido, mas preferiblemente T o A, aun mas preferiblemente T;

(d) A, T, P, V o D, mas preferiblemente T, P, V o D, en la posicion 10 del aminoacido,

(e) L o V, mas preferiblemente L, en la posicion 12 del aminoacido,

(f) V, R, Q, M o K, mas preferiblemente V, R, Q o M en la posicion 13 del aminoacido;

(g) R, M, E, Q o K, mas preferiblemente R, M, E o Q, incluso mas preferiblemente R o E, en la posicion 14 del aminoacido;

(h) L o V, mas preferiblemente L, en la posicion 19 del aminoacido;

(i) R, T, K o N, mas preferiblemente R, T o N, aun mas preferiblemente N, en la posicion 20 del aminoacido;

(j) I, F, L o V, mas preferiblemente I, F o L, incluso mas preferiblemente I o L, en la posicion 21 del aminoacido;

(k) R o K, mas preferiblemente K, en la posicion 45 del aminoacido;

(l) T, P, V, A o R, mas preferiblemente T, P, V o R, incluso mas preferiblemente R, en la posicion 47 del aminoacido;

(m) K, Q, H o E, mas preferiblemente K, H o E, aun mas preferiblemente K, en la posicion 50 del aminoacido;

(n) M o I, mas preferentemente I, en la posicion 55 del aminoacido;

(o) K o R, mas preferentemente K, en la posicion 77 del aminoacido;

(p) A, V, L o I, mas preferiblemente A, L o I, aun mas preferiblemente A, en la posicion 78 del aminoacido;

(q) E, R, T o A, mas preferiblemente E, T o A, aun mas preferiblemente E, en la posicion 82 del aminoacido;

(r) T, S, I o L, mas preferiblemente T, S o L, incluso mas preferiblemente T, en la posicion 86 del aminoacido;

(s) D, S, N o G, mas preferiblemente D, N o G, aun mas preferiblemente N, en la posicion 87 del aminoacido;

(t) A, V, L o F, mas preferiblemente A, V o F, aun mas preferentemente V, en la posicion 89 del aminoacido;

(u) F, S, H, D o Y, mas preferiblemente F, S, H o D, en la posicion 90 del aminoacido;

(v) D, Q o E, mas preferiblemente D o Q, incluso mas preferiblemente D, en la posicion 92 del aminoacido;

(w) G, N, T o S, mas preferiblemente G, N o T, incluso mas preferiblemente G, en la posicion 95 del aminoacido;

(x) T, A, P, F o S, mas preferiblemente T, A, P o F, aun mas preferiblemente F, en la posicion 98 del aminoacido;

(y) R, Q, V, I, M, F o L, mas preferiblemente R, Q, I, M, F o L, incluso mas preferiblemente Y, incluso mas preferiblemente L, en la posicion 103 del aminoacido; y

(z) N, S o A, mas preferiblemente N o S, aun mas preferiblemente N, en la posicion 107 del aminoacido.

De manera adicional o alternativamente, se pueden introducir una o mas de las siguientes sustituciones en la region variable de la cadena ligera de un inmunoenlazador de la invencion:

(aa) Q, D, L, E, S o I, mas preferiblemente L, E, S o I, incluso mas preferiblemente L o E, en la posicion 1 del aminoacido;

(bb) S, A, Y, I, P o T, mas preferiblemente A, Y, I, P o T, incluso mas preferiblemente P o T en la posicion 2 del aminoacido;

(cc) Q, V, T o I, mas preferiblemente V, T o I, aun mas preferentemente V o T, en la posicion 3 del aminoacido;

(dd) V, L, I o M, mas preferiblemente V o L, en la posicion 4 del aminoacido;

(ee) S, E o P, mas preferiblemente S o E, aun mas preferiblemente S, en la posicion 7 del aminoacido;

(ff) T o I, mas preferiblemente I, en la posicion 10 del aminoacido;

(gg) A o V, mas preferiblemente A, en la posicion 11 del aminoacido;

5 (hh) S o Y, mas preferiblemente Y, en la posicion 12 del aminoacido;

(ii) T, S o A, mas preferiblemente T o S, incluso mas preferiblemente T, en la posicion 14 del aminoacido;

(jj) S o R, mas preferiblemente S, en la posicion 18 de aminoacido;

(kk) T o R, mas preferiblemente R, en la posicion 20 del aminoacido;

(ll) R o Q, mas preferiblemente Q, en la posicion 24 del aminoacido;

10 (mm) H o Q, mas preferentemente H, en la posicion 46 del aminoacido;

(nn) K, R o I, mas preferiblemente R o I, incluso mas preferiblemente R, en la posicion 47 del aminoacido;

(oo) R, Q, K, E, T o M, mas preferiblemente Q, K, E, T o M, en la posicion 50 del aminoacido;

(pp) K, T, S, N, Q o P, mas preferiblemente T, S, N, Q o P, en la posicion 53 del aminoacido;

(qq) I o M, mas preferiblemente M, en la posicion 56 del aminoacido;

15 (rr) H, S, F o Y, mas preferiblemente H, S o F, en la posicion 57 del aminoacido;

(ss) I, V o T, mas preferiblemente V o T, R, incluso mas preferiblemente T, en la posicion 74 del aminoacido;

(tt) R, Q o K, mas preferiblemente R o Q, incluso mas preferiblemente R, en la posicion 82 del aminoacido;

(uu) L o F, mas preferiblemente F, en la posicion 91 del aminoacido;

(vv) G, D, T o A, mas preferiblemente G, D o T, aun mas preferiblemente T, en la posicion 92 del aminoacido;

20 (xx) S o N, mas preferiblemente N, en la posicion 94 del aminoacido;

(yy) F, Y o S, mas preferiblemente Y o S, aun mas preferiblemente S, en la posicion 101 del aminoacido; y

(zz) D, F, H, E, L, A, T, V, S, G o I, mas preferiblemente H, E, L, A, T, V, S, G o I, aun mas preferiblemente A O V, en la posicion 103 del aminoacido.

El sistema de numeracion AHo se describe adicionalmente en Honegger, A. y Pluckthun, A. (2001) J. Mol. Biol. 309: 25 657-670). Alternativamente, puede usarse el sistema de numeracion Kabat como se describe adicionalmente en Kabat

et al. (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Las tablas de conversion para los dos sistemas de numeracion diferentes usados para identificar las posiciones de residuos de aminoacidos en regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo se proporcionan en A. Honegger, J.Mol.Biol. 309 (2001) 657-670.

30 En ciertas realizaciones preferidas, el inmunoenlazador comprende una mutacion que mejora la solubilidad en una posicion de aminoacido seleccionada del grupo de posiciones de aminoacidos de cadena pesada que consiste en 12, 103 y 144 (convention de numeracion AHo). En una realization preferida, el inmunoenlazador comprende una o mas sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: (a) serina (S) en la posicion 12 del aminoacido de cadena pesada; (b) serina (S) o treonina (T) en la posicion 103 del aminoacido de cadena pesada; y (c) serina (S) o treonina 35 (T) en la posicion 144 del aminoacido de cadena pesada. En otra realizacion, el inmunoenlazador comprende las

siguientes sustituciones: (a) serina (S) en la posicion 12 del aminoacido de cadena pesada; (b) serina (S) o treonina (T) en la posicion 103 del aminoacido de cadena pesada; y (c) serina (S) o treonina (T) en la posicion 144 del aminoacido de cadena pesada.

Hibridomas que expresan anticuerpos anti-VEGF de conejo

40 En otro aspecto, la invention proporciona un hibridoma que expresa un anticuerpo monoclonal que comprende una cualquiera o mas de las secuencias de aminoacidos expuestas en las SEQ ID Nos 72-81 y SEQ ID Nos 107-117. Los metodos para generar hibridomas a parti r de celulas B de conejo son bien conocidos en la tecnica y se describen, por ejemplo, en la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2005/0033031.

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Produccion de Inmunoenlazadores Anti-VEGF

Los anticuerpos o derivados de anticuerpos de la presente invencion pueden generarse usando tecnicas de rutina en el campo de la genetica recombinante. Conociendo las secuencias de los polipeptidos, los ADNc que los codifican pueden ser generados por slntesis genica (
www.genscript.com). Estos ADNc pueden clonarse en plasmidos vector adecuados. Una vez que se obtiene el ADN que codifica un dominio VL y/o VH, se puede realizar la mutagenesis dirigida al sitio, por ejemplo mediante PCR utilizando cebadores mutagenicos, para obtener diversos derivados. La mejor secuencia de "inicio" puede elegirse dependiendo del numero de alteraciones deseadas en las secuencias VL y/o VH.

Los procedimientos para incorporar o injertar CDRs en regiones estructurales incluyen los expuestos en, por ejemplo, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033; Patente de los Estados Unidos No. 5.225.539 para Winter y Patentes de los Estados Unidos No. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 de Queen et al.

Pueden usarse tecnicas estandar de clonacion y mutagenesis bien conocidas por una persona experimentada en la tecnica para unir enlazadores, redistribuir dominios o construir fusiones para la produccion de fragmentos Fab. Los protocolos basicos que describen los metodos generales de esta invencion se describen en Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook and Russell, 3a edition, 2001) y en Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 1999).

La secuencia de ADN que alberga un gen que codifica un polipeptido scFv, o en el caso de fragmentos Fab, que codifica ya sea dos genes separados o un operon bicistronico que comprende los dos genes para las fusiones VL-Ck y VH-CH1 son clonadas en un vector de expresion adecuado , preferiblemente uno con un promotor inducible. Se debe tener cuidado de que delante de cada gen este presente un sitio apropiado de enlace al ribosoma que asegure la traduccion. Debe entenderse que los anticuerpos de la presente invencion comprenden las secuencias descritas en lugar de consistir en ellas. Por ejemplo, las estrategias de clonacion pueden requerir que se haga una construccion a partir de la cual este presente un anticuerpo con uno o algunos residuos adicionales en el extremo terminal N. Especlficamente, la metionina derivada del codon de inicio puede estar presente en la protelna final en los casos en los que no ha sido dividida despues de la traduccion. La mayorla de las construcciones para anticuerpos scFv dan lugar a una alanina adicional en el extremo terminal N. En una realization preferida de la presente invencion, se elige un vector de expresion para expresion periplasmica en E. coli (Krebber, 1997). Dicho vector comprende un promotor delante de una secuencia de senal divisible. La secuencia codificante para el peptido del anticuerpo se fusiona despues en marco a la secuencia de senal divisible. Esto permite el direccionamiento del polipeptido expresado al periplasma bacteriano donde la secuencia de senal se divide. El anticuerpo se pliega a continuation. En el caso de los fragmentos Fab, tanto los peptidos de fusiones VL-Ck como los de VH-CH1 deben estar enlazados a una senal de exportation. El enlace S-S covalente se forma en las cistelnas terminales C despues de que los peptidos han alcanzado el periplasma. Si se prefiere la expresion citoplasmica de anticuerpos, dichos anticuerpos usualmente pueden obtenerse con altos rendimientos de cuerpos de inclusion, los cuales pueden ser facilmente separados de otros fragmentos celulares y protelnas. En este caso, los cuerpos de inclusion se solubilizan en un agente desnaturalizante tal como, por ejemplo, clorhidrato de guanidina (GndHCl) y a continuacion replegados por procedimientos de renaturalizacion bien conocidos por personas experimentadas en la tecnica.

Los plasmidos que expresan los polipeptidos scFv o Fab se introducen en un huesped adecuado, preferiblemente una celula bacteriana, de levadura o de mamlfero, mas preferiblemente una cepa de E. coli adecuada como por ejemplo JM83 para expresion periplasmica o BL21 para expresion en cuerpos de inclusion. El polipeptido puede cosechado a partir del periplasma o de cuerpos de inclusion y purificarse usando tecnicas estandar tales como cromatografla de intercambio ionico, cromatografla de fase inversa, cromatografla de afinidad y/o filtration en gel, conocidas por personas experimentadas en la tecnica.

Los anticuerpos o derivados de anticuerpos de la presente invencion se pueden caracterizar con respecto al rendimiento, solubilidad y estabilidad in vitro. Las capacidades de enlace hacia el VEGF, preferiblemente hacia el VEGF humano, pueden probarse in vitro mediante ELISA o resonancia de plasmon superficial (BIACore), usando el VEGF humano recombinante como se describe en el documento WO9729131, este ultimo metodo tambien permitiendo determinar la constante del Indice de koff, que preferiblemente debe ser Menos de 10'3s'1. Se prefieren valores de Kd de <10 nM.

Aparte de anticuerpos con fuerte afinidad de enlazarse con el VEGF humano, tambien es deseable seleccionar anticuerpos anti-VEGF que tengan otras propiedades beneficiosas desde una perspectiva terapeutica. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser uno que inhiba el crecimiento de celulas HUVEC en respuesta al VEGF (vease el ejemplo 3). En una realizacion, el anticuerpo puede ser capaz de inhibir la proliferation de celulas HUVEC en respuesta a una concentration casi maximamente eficaz del VEGF (0,08 nM). Preferiblemente, el anticuerpo tiene un valor de dosis efectiva 50 (ED50) de no mas de aproximadamente 5 nM, preferiblemente no mas de aproximadamente 1 nM,

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preferiblemente no mas de aproximadamente 1 nM, preferiblemente no mas de aproximadamente 0,5 nM y lo mas preferible no mas de aproximadamente 0,06 nM, para inhibir la proliferacion inducida por el VEGF de celulas endoteliales en este "analisis de crecimiento de celulas endoteliales", es decir, a estas concentraciones el anticuerpo es capaz de inhibir el crecimiento in vitro de celulas endoteliales inducido por el VEGF, por ejemplo, 50% o mas.

Moleculas biespeclficas

En otro aspecto, la presente invencion presenta moleculas biespeclficas que comprenden un anticuerpo anti-VEGF, o un fragmento del mismo, de la invencion. Un anticuerpo de la invencion o sus porciones de union a antlgeno, puede derivarse o ligarse a otra molecula funcional, por ejemplo, otro peptido o protelna (por ejemplo, otro anticuerpo o ligando para un receptor) para generar una molecula biespeclfica que se enlaza a por lo menos dos sitios de enlace o moleculas diana diferentes. El anticuerpo de la invencion puede derivarse o enlazarse a mas de una otra molecula funcional para generar moleculas multiespeclficas que se enlazan a mas de dos sitios de enlace y/o moleculas diana diferentes; tambien se pretende que tales moleculas multiespeclficas esten abarcadas por el termino "molecula biespeclfica" tal como se usa aqul. Para crear una molecula biespeclfica de la invencion, un anticuerpo de la invencion puede estar funcionalmente unido (por ejemplo, por acoplamiento qulmico, fusion genetica, asociacion no covalente o de otro modo) a una o mas moleculas de enlace, tales como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, antlgenos especlficos de tumor o especlficos de patogenos, peptidos o mimeticos de enlace, de manera que resulta una molecula biespeclfica. Por consiguiente, la presente invencion incluye moleculas biespeclficas que comprenden al menos una primera molecula de enlace que tiene especificidad para el VEGF y una segunda molecula de union que tiene especificidad para uno o mas epltopos objetivo adicionales.

En una realizacion, las moleculas biespeclficas de la invencion comprenden una especificidad de enlace de al menos un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo del mismo, que incluye, por ejemplo, un Fab, Fab', F(ab')2, Fv o un Fv de cadena sencilla. El anticuerpo puede ser tambien un dlmero de cadena ligera o de cadena pesada, o cualquier fragmento mlnimo del mismo tal como un Fv o una construction de cadena sencilla como se describe en Ladner et al. Patente de los Estados Unidos No. 4.946.778.

Aunque se prefieren los anticuerpos monoclonales humanos, otros anticuerpos que pueden emplearse en las moleculas biespeclficas de la invencion son anticuerpos monoclonales murinos, quimericos y humanizados.

Las moleculas biespeclficas de la presente invencion se pueden preparar conjugando las especificidades de union constituyentes usando metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, cada especificidad de union de la molecula biespeclfica puede ser generada separadamente y luego conjugada entre si. Cuando las especificidades de union son protelnas o peptidos, se puede usar una variedad de agentes de acoplamiento o entrecruzamiento para la conjugation covalente. Ejemplos de agentes de entrecruzamiento incluyen la protelna A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil- tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(acido 2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilenedimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2- piridilditio)propionato (SPDP), y sulfosuccinimidilo 4-(N-maleimidometilo)ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) (ver, por ejemplo, Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686, Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Otros metodos incluyen los descritos en Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229: 81-83), y Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Los agentes de conjugacion preferidos son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

Cuando las especificidades de enlace son anticuerpos, pueden conjugarse mediante enlace de sulfhidrilo, por ejemplo, a traves de las regiones articuladas del terminal C de las dos cadenas pesadas u otros sitios, ya sean de origen natural o introducidos artificialmente. En una realizacion particularmente preferida, la region articulada se modifica para contener un numero impar de residuos sulfhidrilo, preferiblemente uno, antes de la conjugacion.

Alternativamente, ambas especificidades de enlace se pueden codificar en el mismo vector y expresarse y ensamblarse en la misma celula huesped. Este metodo es particularmente util donde la molecula biespeclfica es una mAbxmAb, mAbxFab, FabxF(ab')2 o ligando x protelna de fusion Fab. Una molecula biespeclfica de la invencion puede ser una molecula de cadena sencilla que comprende un anticuerpo de cadena sencilla y un determinante de enlace, o una molecula biespeclfica de cadena sencilla que comprende dos determinantes de union. Las moleculas biespeclficas pueden comprender al menos dos moleculas de cadena sencilla. Ademas, una molecula bispeclfica puede ser un scFv que se enlaza especlficamente al primer objetivo, en el que el VH y el VL de dicho scFv estan enlazados con un enlazador flexible que comprende un dominio que proporciona una union especlfica a un segundo objetivo. Los enlazadores adecuados se describen en la Solicitud Provisional de los Estados Unidos No. 60/937.820. Los metodos para preparar moleculas biespeclficas se describen, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos numero 5.260.203; patente de los Estados Unidos numero 5.455.030; patente de Estados Unidos numero 4.881.175; patente de los Estados Unidos numero 5.132.405; patente de los Estados Unidos numero 5.091.513; patente de los Estados Unidos numero 5.476.786; patente de los Estados Unidos numero 5.013.653; patente de los Estados Unidos numero 5.258.498; la patente de los Estados Unidos numero 5.482.858.

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El enlace de las moleculas biespeclficas a sus objetivos especlficos puede confirmarse, por ejemplo, mediante el analisis inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), el radioinmunoensayo (RIA), el analisis FACS, el bioensayo (por ejemplo, la inhibicion del crecimiento) o mediante el analisis de inmunoprecipitacion. Cada uno de estos analisis detecta generalmente la presencia de complejos protelna-anticuerpo de particular interes empleando un reactivo marcado (por ejemplo, un anticuerpo) especlfico para el complejo de interes. Por ejemplo, los complejos del VEGF anticuerpo pueden ser detectados usando, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo unido a una enzima que reconoce y se une especlficamente a los complejos anticuerpo VEGF. Alternativamente, los complejos se pueden detectar usando cualquiera de una variedad de otros inmunoensayos. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser marcado radioactivamente y utilizado en un radioinmunoensayo (RIA) (vease, por ejemplo, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986). El isotopo radiactivo puede ser detectado por medios tales como el uso de un contador g o un contador de centelleo o por autorradiografla.

Inmunoconjugados

En otro aspecto, la presente invencion presenta un anticuerpo anti-VEGF, o un fragmento del mismo, conjugado con una fraccion terapeutica, tal como una citotoxina, un farmaco (por ejemplo, un inmunosupresor) o una radiotoxina. Tales conjugados se denominan aqul como "inmunoconjugados". Los inmunoconjugados que incluyen una o mas citotoxinas se denominan "inmunotoxinas". Una citotoxina o agente citotoxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para (por ejemplo, mata) las celulas. Ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procalna, tetracalna, lidocalna, propranolol y puromicina y sus analogos o homologos. Los agentes terapeuticos tambien incluyen, por ejemplo, antimetabolitos (por ejemplo metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5- fluorouracilo decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU ), ciclotosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y platino de cis-diclorodiamina(II)(DDP)cisplatina), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibioticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)), y agentes antimitoticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina).

Otros ejemplos preferidos de citotoxinas terapeuticas que pueden conjugarse con un anticuerpo de la invencion incluyen duocarmicinas, caliqueamicinas, maitansinas y auristatinas, y derivados de las mismas. Un ejemplo de un conjugado de anticuerpo de caliqueamicina esta disponible comercialmente (Mylotarg™; Wyeth-Ayerst).

Las citotoxinas pueden conjugarse con anticuerpos de la invencion utilizando la tecnologla de enlazador disponible en la tecnica. Ejemplos de tipos de enlaces que se han usado para conjugar una citotoxina con un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, hidrazonas, tioeteres, esteres, disulfuros y enlazadores que contienen peptidos. Se puede elegir un enlazador que sea, por ejemplo, susceptible a la rotura por pH bajo dentro del compartimento lisosomico o susceptible a la rotura por proteasas, tales como proteasas expresadas preferiblemente en tejido tumoral tales como catepsinas (por ejemplo, catepsinas B, C, D).

Para mas informacion sobre los tipos de citotoxinas, enlazadores y metodos para conjugar agentes terapeuticos con anticuerpos, vease tambien Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. and Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. and Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.

Los anticuerpos de la presente invencion tambien pueden conjugarse con un isotopo radiactivo para generar radiofarmacos citotoxicos, tambien denominados radioimmunoconjugados. Ejemplos de isotopos radiactivos que se pueden conjugar con anticuerpos para su uso diagnostico o terapeutico incluyen, pero no se limitan a, yodo131, indio111, itrio90 y lutecio177. En la tecnica se establecen metodos para preparar radioinmunoconjugados . Ejemplos de radioinmunoconjugados estan disponibles comercialmente, incluyendo Zevalin™ (IDEC Pharmaceuticals) y BexxarTM (Corixa Pharmaceuticals), y pueden usarse metodos similares para preparar radioinmunoconjugados usando los anticuerpos de la invencion.

Los conjugados de anticuerpo de la invencion se pueden usar para modificar una respuesta biologica dada, y la fraccion de farmaco no debe interpretarse como limitado a agentes terapeuticos qulmicos clasicos. Por ejemplo, la fraccion de farmaco puede ser una protelna o polipeptido que posee una actividad biologica deseada. Tales protelnas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimaticamente activa, o fragmento activo del mismo, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas o toxina de difteria; una protelna tal como factor de necrosis tumoral o interferon-y, o modificadores de la respuesta biologica tales como, por ejemplo, linfoquinas, interleucina 1 (“IL-1”), interleucina 2 (“IL- 2”), interleucina 6 ("IL-6"), factor estimulante de colonias de granulocitos macrofagos ("GM-CSF"), factor estimulante de colonias de granulocitos ("G-CSF") u otros factores de crecimiento.

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Las tecnicas para la conjugacion de dicha fraccion terapeutica con anticuerpos son bien conocidas, vease, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).

Usos de anticuerpos anti-VEGF

Para aplicaciones terapeuticas, los anticuerpos anti-VEGF de la invention se administran a un mamlfero, preferiblemente un humano, en una forma de dosificacion farmaceuticamente aceptable tal como los aqul discutidos, incluyendo aquellos que se pueden administrar a un ser humano por via intravenosa, como un bolo o por infusion continua durante un periodo de tiempo, por vlas topicas, intraoculares, intramusculares, intraperitoneales, intracerebroespinal, subcutanea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral o de inhalation. Los anticuerpos tambien se administran adecuadamente por vlas intratumoral, peritumoral, intralesional o perilesional, para ejercer efectos terapeuticos tanto locales como sistemicos. Se espera que la via intraperitoneal sea particularmente util, por ejemplo, en el tratamiento de tumores ovaricos.

Para la prevention o el tratamiento de la enfermedad, la dosificacion apropiada de anticuerpo dependera del tipo de enfermedad a tratar, como se ha definido anteriormente, de la gravedad y curso de la enfermedad, si el anticuerpo se administra con fines preventivos o terapeuticos, terapia previa, la historia cllnica del paciente y la respuesta al anticuerpo, y la discretion del medico que lo atiende. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente en una sola vez o en una serie de tratamientos.

Los anticuerpos anti-VEGF son utiles en el tratamiento de enfermedades mediadas por el VEGF como se describe aqul. Por ejemplo, la degeneration macular relacionada con la edad (AMD) es una de las principales causas de perdida visual grave en la poblacion de edad avanzada. La forma exudativa de AMD se caracteriza por neovascularization coroidea y desprendimiento de celulas epiteliales de pigmento retiniano. Debido a que la neovascularizacion coroidea se asocia con un empeoramiento dramatico en el pronostico, los anticuerpos del VEGF de la presente invencion son especialmente utiles para reducir la gravedad de la AMD. El progreso de esta terapia es facilmente monitorizado por tecnicas convencionales incluyendo oftalmoscopia, microscopla de fondo ocular y tomografla computarizada ocular.

Se consideran todas las dosis aprobadas por la FDA y los reglmenes adecuados para su uso con Lucentis.

De acuerdo con otra realization de la invencion, la efectividad del anticuerpo en la prevencion o el tratamiento de la enfermedad puede mejorarse administrando el anticuerpo en serie o en combination con otro agente que sea eficaz para esos propositos, tal como el factor de necrosis tumoral (TNF), un anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar la actividad angiogenica del factor de crecimiento de fibroblastos acido o basico (FGF) o del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), un anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar las actividades coagulantes del factor tisular, protelna C o protelna S (vease Esmon et al. Publication de patente PCT No. WO 91/01753, publicada el 21 de febrero de 1991), un anticuerpo capaz de enlazarse al receptor HER2 (vease Hudziak et al., Publicacion de Patente PCT No. WO 89/06692, publicada el 27 de julio de 1989 ), o uno o mas agentes terapeuticos convencionales tales como, por ejemplo, agentes alquilantes, fotocoagulantes (tales como verteporfina), antagonistas del acido folico, antimetabolitos del metabolismo del acido nucleico, antibioticos, analogos de pirimidina, 5 fluorouracilo, cisplatino, nucleosidos de purina, aminas, aminoacidos, nucleosidos de triazol o corticosteroides. Tales otros agentes pueden estar presentes en la composition que se administra o pueden administrarse por separado. Ademas, el anticuerpo se administra adecuadamente en serie o en combinacion con tratamientos radiologicos, ya sea que impliquen irradiation o administration de sustancias radiactivas.

Los anticuerpos de la invencion pueden utilizarse como agentes de purification por afinidad. En este proceso, los anticuerpos se inmovilizan en una fase solida tal como resina Sephadex o papel de filtro, utilizando metodos bien conocidos en la tecnica. El anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene la protelna del VEGF (o fragmento de la misma) a ser purificada, y despues se lava el soporte con un disolvente adecuado que eliminara sustancialmente todo el material de la muestra excepto la protelna del VEGF, que esta enlazada al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro disolvente adecuado, tal como regulador de glicina, pH de 5.0, que liberara la protelna del VEGF del anticuerpo.

Los anticuerpos anti-VEGF tambien pueden ser utiles en analisis de diagnostico para la protelna VEGF, por ejemplo, detectar su expresion en celulas, tejidos o suero especlficos. Tales metodos de diagnostico pueden ser utiles en el diagnostico de cancer.

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Para aplicaciones de diagnostico, el anticuerpo tlpicamente se marcara con una fraccion detectable. Existen numerosas etiquetas disponibles que se pueden agrupar generalmente en las siguientes categorlas:

(a) Radioisotopos, tales como 111In, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P o 35S. El anticuerpo puede marcarse con el radioisotopo usando las tecnicas descritas en Current Protocols in Immunology, volumenes 1 y 2, Coligen et al., Ed. Wiley - Interscience, Nueva York, N.Y., Pubs. (1991), por ejemplo, y la radioactividad se puede medir usando conteo de centelleo.

(b) Se dispone de marcadores fluorescentes tales como quelatos de tierras raras (quelatos de europio) o fluorescelna y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, lissamina, ficoeritrina y rojo de Texas. Los marcadores fluorescentes pueden conjugarse con el anticuerpo utilizando las tecnicas descritas en Current Protocols in Immunology, supra, por ejemplo. La fluorescencia se puede cuantificar usando un fluorlmetro.

(c) Se encuentran disponibles diversas etiquetas de enzima-sustrato y la Patente de Estados Unidos No. 4,275,149 proporciona una revision de algunos de estos. La enzima generalmente cataliza una alteracion qulmica del sustrato cromogenico que puede medirse usando diversas tecnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato, que puede medirse espectrofotometricamente. Alternativamente, la enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Las tecnicas para cuantificar un cambio en la fluorescencia se describen anteriormente. El sustrato quimioluminiscente se excita electronicamente mediante una reaccion qulmica y puede emitir entonces luz que puede medirse (por ejemplo, mediante un quimioluminometro) o da energla a un aceptor fluorescente. Ejemplos de marcadores enzimaticos incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasa de luciernaga y luciferasa bacteriana, patente de Estados Unidos No. 4,737,456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinedionas, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa tales como peroxidasa de rabano picante (HRPO), fosfatasa alcalina, .beta.- galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacarido oxidasas (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa- 6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heteroclclicas (tales como uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa y similares. Las tecnicas para conjugar enzimas a anticuerpos se describen en O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981). Ejemplos de combinaciones enzima sustrato incluyen, por ejemplo:

(i) peroxidasa de rabano picante (HRPO) con peroxidasa de hidrogeno como sustrato, donde la peroxidasa de hidrogeno oxida un precursor de colorante (por ejemplo, ortofenilendiamina (OPD) o clorhidrato de 3,3',5,5'-tetrametil benzidina (TMB));

(ii) fosfatasa alcalina (AP) con para-nitrofenil fosfato como sustrato cromogenico; y

(iii) .beta.-D-galactosidasa (.beta.-D-Gal) con un sustrato cromogenico (por ejemplo, P-nitrofenil-.beta.-D- galactosidasa) o sustrato fluorogenico 4-metilumbeliferil-.beta.-D-galactosidasa.

En otra realizacion de la invencion, el anticuerpo anti-VEGF no necesita ser marcado, y su presencia se puede detectar usando un anticuerpo marcado que se enlaza al anticuerpo VEGF.

Los anticuerpos de la presente invencion pueden emplearse en cualquier metodo de analisis conocido, tales como analisis de enlace competitivo, analisis en sandwich directos e indirectos y analisis de inmunoprecipitacion. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc.1987).

Los analisis de enlace competitivo se basan en la capacidad de un estandar marcado para competir con el analito de la muestra de prueba para enlazarse con una cantidad limitada de anticuerpo. La cantidad de protelna del VEGF en la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad de estandar que se une a los anticuerpos. Para facilitar la determinacion de la cantidad de estandar que se enlaza, los anticuerpos generalmente se insolubilizan antes o despues de la competencia, de modo que el estandar y el analito que estan unidos a los anticuerpos pueden separarse convenientemente del estandar y del analito que permanecen sin enlazarse.

Los analisis en sandwich implican el uso de dos anticuerpos, cada uno capaz de unirse a una porcion inmunogenica diferente, o epltopo, de la protelna que se va a detectar. En un analisis en sandwich, el analito de la muestra de prueba esta enlazado por un primer anticuerpo que se inmoviliza sobre un soporte solido y, a continuacion, un segundo anticuerpo se enlaza al analito, formando as! un complejo de tres partes insoluble. Vease, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos 4,376,110. El segundo anticuerpo puede estar marcado con una fraccion detectable (analisis en sandwich directo) o puede medirse utilizando un anticuerpo anti-inmunoglobulina que esta marcado con una fraccion detectable (analisis en sandwich indirecto). Por ejemplo, un tipo de analisis en sandwich es un analisis ELISA, en cuyo caso la fraccion detectable es una enzima.

Para la inmunohistoqulmica, la muestra del tumor puede estar fresca o congelada o puede estar incrustada en parafina y fijada con un conservante tal como formalina, por ejemplo.

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Los anticuerpos tambien pueden usarse para analisis de diagnostico in vivo. Generalmente, el anticuerpo esta marcado con un radionuclido (tal como 111In, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P o 35S) de manera que el tumor puede localizarse usando inmunocentelleo.

El anticuerpo de la presente invencion puede proporcionarse en un kit, una combinacion empaquetada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para realizar el analisis de diagnostico. Donde el anticuerpo esta marcado con una enzima, el kit incluira sustratos y cofactores requeridos por la enzima (por ejemplo, un precursor de sustrato que proporciona el cromoforo o fluoroforo detectable). Ademas, se pueden incluir otros aditivos tales como estabilizadores, reguladores (por ejemplo, un regulador de bloque o regulador de lisis) y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos se pueden variar ampliamente para proporcionar concentraciones en solucion de los reactivos que optimizan sustancialmente la sensibilidad del analisis. En particular, los reactivos pueden proporcionarse como polvos secos, usualmente liofilizados, incluyendo excipientes que al disolverse proporcionaran una solucion de reactivo que tiene la concentracion apropiada.

Preparaciones Farmaceuticas

En un aspecto, la invencion proporciona formulaciones farmaceuticas que comprenden anticuerpos anti-VEGF de la invencion para el tratamiento de enfermedades mediadas por el VEGF. El termino "formulacion farmaceutica" se refiere a preparaciones que estan en tal forma que permiten que la actividad biologica del anticuerpo o derivado de anticuerpo sea inequlvocamente eficaz y que no contengan componentes adicionales que sean toxicos para los sujetos a los que se administrarla la formulacion. Los excipientes "farmaceuticamente aceptables" (vehlculos, aditivos) son aquellos que se pueden administrar razonablemente a un mamlfero en cuestion para proporcionar una dosis eficaz del ingrediente activo empleado.

Una formulacion "estable" es aquella en la que el anticuerpo o derivado de anticuerpo en la misma, conserva esencialmente su estabilidad flsica y/o estabilidad qulmica y/o actividad biologica durante el almacenamiento. Diversas tecnicas anallticas para medir la estabilidad de protelnas estan disponibles en la tecnica y se revisan en Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., Pubs. (1991) y Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993), por ejemplo. La estabilidad se puede medir a una temperatura seleccionada durante un perlodo de tiempo seleccionado. Preferiblemente, la formulacion es estable a temperatura ambiente (aproximadamente 30 °C) o a 40 °C durante al menos 1 semana y/o estable a aproximadamente 2-8 °C durante al menos 3 meses a 2 anos. Ademas, la formulacion es preferiblemente estable despues de la congelacion (a, por ejemplo, -70 °C) y descongelacion de la formulacion.

Un anticuerpo o derivado de anticuerpo "conserva su estabilidad flsica" en una formulacion farmaceutica si cumple con las especificaciones de liberacion definidas para la agregacion, degradation, precipitation y/o desnaturalizacion tras un examen visual de color y/o claridad o medido por dispersion de luz UV o por cromatografla de exclusion por tamanos, u otros metodos adecuados reconocidos en la tecnica.

Un anticuerpo o derivado de anticuerpo "conserva su estabilidad qulmica" en una formulacion farmaceutica, si la estabilidad qulmica en un momento dado es tal que se considera que la protelna aun retiene su actividad biologica como se define a continuation. La estabilidad qulmica puede evaluarse detectando y cuantificando formas qulmicamente alteradas de la protelna. La alteration qulmica puede implicar la modification del tamano (por ejemplo, recorte) que se puede evaluar usando cromatografla de exclusion de tamano, SDS-PAGE y/o ionization de desorcion por laser asistida por matriz/espectrometrla de masas de tiempo de vuelo (MALDI/TOF MS), por ejemplo. Otros tipos de alteracion qulmica incluyen alteracion de la carga (por ejemplo, que se produce como resultado de la desamidacion) que se puede evaluar por cromatografla de intercambio ionico, por ejemplo.

Un anticuerpo o derivado de anticuerpo "retiene su actividad biologica" en una formulacion farmaceutica, si la actividad biologica del anticuerpo en un tiempo dado esta dentro de aproximadamente el 10% (dentro de los errores del analisis) de la actividad biologica exhibida en el momento en que la formulacion farmaceutica se preparo tal como se determino en un analisis de enlace al antlgeno, por ejemplo. Otros analisis de "actividad biologica" para anticuerpos se elaboran aqul mas adelante.

Por "isotonico" se entiende que la formulacion de interes tiene esencialmente la misma presion osmotica que la sangre humana. Las formulaciones isotonicas generalmente tendran una presion osmotica de aproximadamente 250 a 350 mOsm. La isotonicidad se puede medir usando un osmometro de presion de vapor o tipo congelador, por ejemplo.

Un "poliol" es una sustancia con multiples grupos hidroxilo, e incluye azucares (azucares reductores y no reductores), alcoholes de azucar y acidos de azucar. Los polioles preferidos en la presente invencion tienen un peso molecular que es inferior a aproximadamente 600 kD (por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 120 a aproximadamente 400 kD). Un "azucar reductor" es aquel que contiene un grupo hemiacetal que puede reducir iones metalicos o reaccionar covalentemente con lisina y otros grupos amino en protelnas y un "azucar no reductor" es aquel que no tiene estas propiedades de un azucar reductor. Ejemplos de azucares reductores son fructosa, manosa, maltosa, lactosa,

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arabinosa, xilosa, ribosa, ramnosa, galactosa y glucosa. Los azucares no reductores incluyen sacarosa, trehalosa, sorbosa, melezitosa y rafinosa. Manitol, xilitol, eritritol, treitol, sorbitol y glicerol son ejemplos de alcoholes de azucar. En cuanto a los acidos de azucar, estos incluyen el L-gluconato y sus sales metalicas. Cuando se desea que la formulacion sea estable al congelamiento y descongelamiento, el poliol es preferiblemente uno que no cristaliza a temperaturas de congelacion (por ejemplo, -20 °C) de tal manera que desestabiliza el anticuerpo en la formulacion. Los azucares no reductores tales como sacarosa y trehalosa son los polioles preferidos en la presente invencion, prefiriendose la trehalosa sobre la sacarosa, debido a la estabilidad en solucion superior de la trehalosa.

Como se usa en el presente documento, "regulador" se refiere a una solucion regulada que resiste cambios en el pH por la accion de sus componentes conjugados acido-base. El regulador de esta invencion tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 8,0; de manera preferible de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 7. Ejemplos de reguladores que controlaran el pH en este intervalo incluyen acetato (por ejemplo acetato de sodio), succinato (tal como succinato de sodio), gluconato, histidina, citrato y otros reguladores de acidos organicos. Cuando se desea una formulacion estable de congelacion y descongelacion, el regulador preferiblemente no es fosfato.

En un sentido farmacologico, en el contexto de la presente invencion, una "cantidad terapeuticamente efectiva" de un anticuerpo o derivado de anticuerpo se refiere a una cantidad efectiva en la prevention o tratamiento de un trastorno para el tratamiento del cual el anticuerpo o derivado de anticuerpo es efectivo. Una "enfermedad/trastorno" es cualquier condition que se beneficiarla del tratamiento con el anticuerpo o derivado de anticuerpo. Esto incluye trastornos o enfermedades cronicas y agudas incluyendo aquellas condiciones patologicas que predisponen al mamlfero al trastorno en cuestion.

Un "conservante" es un compuesto que puede incluirse en la formulacion para reducir esencialmente la accion bacteriana en el mismo, facilitando por lo tanto la production de una formulacion de uso multiple, por ejemplo. Ejemplos de conservantes potenciales incluyen cloruro de octadecildimetilbencil amonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio (una mezcla de cloruros de alquilbencildimetilamonio en los que los grupos alquilo son compuestos de cadena larga) y cloruro de bencetonio. Otros tipos de conservantes incluyen alcoholes aromaticos tales como fenol, alcohol butllico y bencllico, alquilparabenos tales como metil o propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3- pentanol y m-cresol. El conservante mas preferido en la presente invencion es alcohol bencllico.

La presente invencion tambien proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden uno o mas anticuerpos o compuestos derivados de anticuerpos, junto con al menos un vehlculo o excipiente fisiologicamente aceptable. Las composiciones farmaceuticas pueden comprender, por ejemplo, uno o mas de agua, reguladores (por ejemplo, solucion salina regulada neutra o solucion salina regulada con fosfato), etanol, aceite mineral, aceite vegetal, dimetilsulfoxido, carbohidratos (por ejemplo glucosa, manosa, sacarosa o dextranos), manitol, protelnas, coadyuvantes, polipeptidos o aminoacidos tales como glicina, antioxidantes, agentes quelantes tales como EDTA o glutation y/o conservantes. Como se ha indicado anteriormente, pueden incluirse (pero no necesariamente) otros ingredientes activos en las composiciones farmaceuticas proporcionadas aqul.

Un vehlculo es una sustancia que puede estar asociada con un anticuerpo o derivado de anticuerpo antes de la administration a un paciente, a menudo con el proposito de controlar la estabilidad o biodisponibilidad del compuesto. Los vehlculos para uso dentro de tales formulaciones son generalmente biocompatibles, y tambien pueden ser biodegradables. Los vehlculos incluyen, por ejemplo, moleculas monovalentes o multivalentes tales como albumina de suero (por ejemplo, humana o bovina), albumina de huevo, peptidos, polilisina y polisacaridos tales como aminodextrano y poliamidoaminas. Los vehlculos tambien incluyen materiales de soporte solidos tales como perlas y micropartlculas que comprenden, por ejemplo, polilactato poliglicolato, poli(lactida-co-glicolida), poliacrilato, latex, almidon, celulosa o dextrano. Un vehlculo puede soportar los compuestos de varias maneras, incluyendo enlace covalente (ya sea directamente o por medio de un grupo enlazador), interaction no covalente o mezcla.

Las composiciones farmaceuticas se pueden formular para cualquier forma apropiada de administracion, incluyendo, por ejemplo, administracion topica, intraocular, oral, nasal, rectal o parenteral. En ciertas realizaciones, se prefieren composiciones en una forma adecuada para uso topico, por ejemplo, como gotas oculares. Otras formas incluyen, por ejemplo, plldoras, tabletas, pastillas, grageas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o granulos dispersables, emulsion, capsulas duras o blandas o jarabes o ellxires. Dentro de otras realizaciones, las composiciones proporcionadas aqul pueden formularse como un liofilizado. El termino parenteral como se usa en la presente memoria incluye inyeccion subcutanea, intradermica, intravascular (por ejemplo, intravenosa), intramuscular, espinal, intracraneal, intratecal e intraperitoneal, as! como cualquier tecnica de inyeccion o infusion similar.

La composition farmaceutica puede prepararse como una suspension esteril inyectable acuosa u oleaginosa en la que el modulador, dependiendo del vehlculo y la concentration utilizada, esta suspendido o disuelto en el vehlculo. Dicha composicion puede formularse de acuerdo con la tecnica conocida usando agentes dispersantes, humectantes y/o agentes de suspension adecuados tales como los mencionados anteriormente. Entre los vehlculos y disolventes aceptables que pueden emplearse estan agua, 1,3-butanodiol, solucion de Ringer y solucion isotonica de cloruro de

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sodio. Ademas, pueden emplearse aceites fijos esteriles como disolvente o medio de suspension. Para este proposito se puede emplear cualquier aceite fijo blando, incluyendo mono o digliceridos sinteticos. Ademas, se pueden usar acidos grasos tales como acido oleico en la preparacion de composiciones inyectables, y pueden disolverse adyuvantes tales como anestesicos locales, conservantes y/o agentes reguladores, en el vehlculo.

Las composiciones farmaceuticas se pueden formular como formulaciones de liberacion sostenida (es decir, una formulacion tal como una capsula que efectua una liberacion lenta del modulador despues de la administracion). Tales formulaciones se pueden preparar generalmente usando tecnologla bien conocida y se administran, por ejemplo, mediante implante oral, rectal o subcutaneo, o mediante implantacion en el sitio objetivo deseado. Los vehlculos para uso dentro de tales formulaciones son biocompatibles, y tambien pueden ser biodegradables; preferiblemente la formulacion proporciona un nivel relativamente constante de liberacion del modulador. La cantidad de un anticuerpo o derivado de anticuerpo contenido dentro de una formulacion de liberacion sostenida depende, por ejemplo, del sitio de implantacion, de la velocidad y duracion esperada de la liberacion y de la naturaleza de la enfermedad o trastorno a tratar o prevenir.

Los anticuerpos o derivados de anticuerpos proporcionados aqul se administran generalmente en una cantidad que alcanza una concentracion en un fluido corporal (por ejemplo, sangre, plasma, suero, CSF, llquido sinovial, linfa, llquido intersticial celular, lagrimas u orina) que es suficiente para unirse detectablemente al VEGF y prevenir o inhibir enfermedades/trastornos mediados por el VEGF. Se considera que una dosis es eficaz si resulta en un beneficio discernible para el paciente como se describe aqul. Las dosis sistemicas preferidas oscilan entre aproximadamente 0,1 mg y aproximadamente 140 mg por kilogramo de peso corporal por dla (aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 7 g por paciente por dla), siendo las dosis orales generalmente aproximadamente 5-20 veces superiores a las dosis intravenosas. La cantidad de anticuerpo o derivado de anticuerpo que se puede combinar con los materiales vehlculo para producir una forma de dosificacion unica variara dependiendo del huesped tratado y del modo particular de administracion. Las formas de unidad de dosificacion contendran generalmente entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 500 mg de un ingrediente activo.

Las composiciones farmaceuticas se pueden envasar para tratar afecciones que responden a un anticuerpo o derivado de anticuerpo dirigido al VEGF. Las composiciones farmaceuticas envasadas pueden incluir un recipiente que contiene una cantidad efectiva de al menos un anticuerpo o derivado de anticuerpo como se describe en la presente memoria e instrucciones (por ejemplo, etiquetado) que indican que la composicion contenida debe usarse para tratar una enfermedad o trastorno sensible a un anticuerpo o derivado de anticuerpo seguido de la administracion en el paciente.

Los anticuerpos o derivados de anticuerpos de la presente invencion tambien pueden ser modificados qulmicamente. Los grupos modificadores preferidos son pollmeros, por ejemplo un pollmero polialqueno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido o un polisacarido ramificado o no ramificado. Dicho grupo efector puede aumentar la vida media del anticuerpo in vivo. Ejemplos particulares de pollmeros sinteticos incluyen poli(etilenglicol) (PEG) de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido, poli(propilenglicol), poli(vinil alcohol) o derivados de los mismos. Los pollmeros de origen natural incluyen lactosa, amilosa, dextrano, glicogeno o derivados de los mismos. El tamano del pollmero se puede variar segun se desee, pero generalmente estara en un rango de peso molecular medio de 500 Da a 50000 Da. Para la aplicacion local en la que el anticuerpo esta disenado para penetrar en el tejido, un peso molecular preferido del pollmero es de aproximadamente 5000 Da. La molecula de pollmero puede unirse al anticuerpo, en particular al extremo terminal C de la cadena pesada del fragmento Fab a traves de un peptido de bisagra enlazado covalentemente como se describe en el documento WO0194585. En cuanto a la fijacion de fracciones de PEG, se hace referencia a "Poly (ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnological and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, Nueva York y "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences" , 1998, M. Aslam y A. Dent, Grove Publishers, Nueva York.

Despues de la preparacion del anticuerpo o derivado de anticuerpo de interes como se ha descrito anteriormente, se prepara la formulacion farmaceutica que lo contiene. El anticuerpo que se va a formular no ha sido sometido a liofilizacion previa y la formulacion de interes aqul es una formulacion acuosa. Preferiblemente, el anticuerpo o derivado de anticuerpo en la formulacion es un fragmento de anticuerpo, tal como un scFv. La cantidad terapeuticamente efectiva de anticuerpo presente en la formulacion se determina teniendo en cuenta los volumenes de dosis deseados y el modo o modos de administracion, por ejemplo. De aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, preferiblemente de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 40 mg/ml y lo mas preferiblemente de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml es una concentracion de ejemplo de anticuerpo en la formulacion.

Se prepara una formulacion acuosa que comprende el anticuerpo o derivado de anticuerpo en una solucion de pH regulado. El regulador de esta invencion tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 8,0, preferiblemente de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 7. Ejemplos de reguladores que controlaran el pH dentro de este intervalo incluye acetato (por ejemplo acetato de sodio), succinato (tal como succinato de sodio), gluconato, histidina, citrato y otros reguladores de acidos organicos. La concentracion del regulador puede ser de

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aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM, preferiblemente de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 30 mM, dependiendo, por ejemplo, del regulador y de la isotonicidad deseada de la formulacion.

En la formulacion se incluye un poliol, que actua como un tonificante y puede estabilizar el anticuerpo. En realizaciones preferidas, la formulacion no contiene una cantidad tonificante de una sal tal como cloruro de sodio, ya que esto puede causar que el anticuerpo o derivado de anticuerpo se precipite y/o puede dar lugar a oxidacion a pH bajo. En realizaciones preferidas, el poliol es un azucar no reductor, tal como sacarosa o trehalosa. El poliol se anade a la formulacion en una cantidad que puede variar con respecto a la isotonicidad deseada de la formulacion. Preferiblemente, la formulacion acuosa es isotonica, en cuyo caso las concentraciones adecuadas del poliol en la formulacion estan en el intervalo de aproximadamente 1% a aproximadamente 15% p/v, preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 2% a aproximadamente 10% p/v, por ejemplo. Sin embargo, las formulaciones hipertonicas o hipotonicas tambien pueden ser adecuadas. La cantidad de poliol anadido tambien puede alterarse con respecto al peso molecular del poliol. Por ejemplo, se puede anadir una cantidad inferior de un monosacarido (por ejemplo manitol), en comparacion con un disacarido (tal como trehalosa).

Tambien se anade un agente tensioactivo a la formulacion de anticuerpo o derivado de anticuerpo. Los agentes tensioactivos de ejemplo incluyen agentes tensioactivos no ionicos tales como polisorbatos (por ejemplo, polisorbatos 20, 80, etc.) o poloxameros (por ejemplo, poloxamero 188). La cantidad de agente tensioactivo anadido es tal que reduce la agregacion del anticuerpo/derivado de anticuerpo formulado y/o minimiza la formation de partlculas en la formulacion y/o reduce la adsorcion. Por ejemplo, el agente tensioactivo puede estar presente en la formulacion en una cantidad de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 0,5%, preferiblemente de aproximadamente 0,005% a aproximadamente 0,2% y mas preferiblemente de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,1%.

En una realization, la formulacion contiene los agentes anteriormente identificados (es decir, anticuerpo o derivado de anticuerpo, regulador, poliol y agente tensioactivo) y esta esencialmente libre de uno o mas conservantes, tales como alcohol bencllico, fenol, m-cresol, clorobutanol y Cl de benzetonio. En otra realizacion, se puede incluir un conservante en la formulacion, particularmente cuando la formulacion es una formulacion de dosis multiple. La concentration de conservante puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 2%, lo mas preferiblemente de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 1%. Uno o mas vehlculos, excipientes o estabilizadores farmaceuticamente aceptables tales como los descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences 21a edition, Osol,

A. Ed. (2006) pueden incluirse en la formulacion siempre que no afecten negativamente a las caracterlsticas deseadas de la formulacion. Los vehlculos, excipientes o estabilizadores aceptables no son toxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen: agentes reguladores adicionales, codisolventes, antioxidantes incluyendo acido ascorbico y metionina, agentes quelantes tales como EDTA, complejos metalicos (por ejemplo complejos de protelna Zn), pollmeros biodegradables tales como poliesteres, y/o contraiones formadores de sales tales como sodio.

Las formulaciones a utilizar para la administration in vivo deben ser esteriles. Esto se logra facilmente por filtration a traves de membranas de filtracion esteriles, antes o despues de la preparation de la formulacion.

La formulacion se administra a un mamlfero que necesita tratamiento con el anticuerpo, preferiblemente un ser humano, de acuerdo con metodos conocidos, tales como la administracion intravenosa como un bolo o por infusion continua durante un perlodo de tiempo, por via intramuscular, intraperitoneal, intracerobrospinal, subcutanea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, topica o de inhalation. En realizaciones preferidas, la formulacion se administra al mamlfero por aplicacion topica de gotas oculares a la superficie ocular. Para estos propositos, la formulacion puede aplicarse usando un aplicador de gotas oculares, por ejemplo.

La dosificacion apropiada ("cantidad terapeuticamente efectiva") del anticuerpo dependera, por ejemplo, de la condition que se va a tratar, de la gravedad y del curso de la condition, si el anticuerpo se administra con fines preventivos o terapeuticos, tratamiento previo, la historia cllnica del paciente y la respuesta al anticuerpo, el tipo de anticuerpo utilizado y la discretion del medico que lo atiende. El anticuerpo o derivado de anticuerpo se administra adecuadamente al paciente en una sola vez o en una serie de tratamientos y puede administrarse al paciente en cualquier momento a partir del diagnostico. El anticuerpo o derivado de anticuerpo se puede administrar como unico tratamiento o junto con otros farmacos o terapias utiles para tratar la condicion en cuestion.

Como una proposition general, la cantidad terapeuticamente efectiva del anticuerpo o derivado de anticuerpo administrado estara en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal del paciente, ya sea por una o mas administraciones, siendo el intervalo tlpico de anticuerpo usado aproximadamente 0,3 a aproximadamente 20 mg/kg, mas preferiblemente aproximadamente 0,3 a aproximadamente 15 mg/kg, administrados diariamente, por ejemplo. Sin embargo, pueden ser utiles otros reglmenes de dosificacion. El progreso de esta terapia se controla facilmente mediante tecnicas convencionales.

Se consideran las dosificaciones y reglmenes aprobados por la FDA adecuados para su uso con Lucentis.

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Artlcuios de Fabricacion

Tambien se describe aqul un artlcuio de fabricacion que comprende un recipiente que contiene ia formuiacion farmaceutica acuosa de ia presente invencion y opcionaimente proporciona instrucciones para su uso. Los recipientes adecuados inciuyen, por ejempio, boteiias, viaies, apiicadores de gotas para ios ojos y jeringas. Ei recipiente puede estar formado a partir de una variedad de materiaies taies como vidrio o piastico. Un recipiente de ejempio es un viai de vidrio o piastico de un soio uso de 3-20 cc. Aiternativamente, para una formuiacion muitidosis, ei recipiente puede ser un viai de vidrio de 3-100 cc. Ei envase contiene ia formuiacion y tiene ia etiqueta, o asociada con, ei recipiente puede indicar instrucciones de uso. Ei artlcuio de fabricacion puede inciuir ademas otros materiaies deseabies desde ei punto de vista comerciai y dei usuario, inciuyendo otros reguiadores, diiuyentes, fiitros, agujas, jeringuiiias e insertos de paquete con instrucciones de uso.

Ejempiificacion

La presente descripcion se iiustra adicionaimente mediante ios siguientes ejempios, ios cuaies no deben ser interpretados como iimitantes adicionaies.

A io iargo de ios ejempios, se usaron ios siguientes materiaies y metodos, a menos que se indique io contrario. Materiaies y Metodos Generaies

En generai, ia practica de ia presente invencion empiea, a menos que se indique io contrario, tecnicas convencionaies de qulmica, bioiogla moiecuiar, tecnoiogla de ADN recombinante, inmunoiogla (especiaimente, por ejempio, tecnoiogla de anticuerpos) y tecnicas estandar de preparacion de poiipeptidos. Vease, por ejempio, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Moiecuiar Cioning: Coid Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocois (Methods in Moiecuiar Bioiogy), 510, Paui, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practicai Approach (Practicai Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Iri Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manuai, Hariow et ai., C.S.H.L. Press, Pub. (1999); y Current Protocois in Moiecuiar Bioiogy, eds. Ausubei et ai., John Wiiey & Sons (1992).

Medidas de termoestabiiidad

Se obtuvieron espectros IR con transfortmadas de Fourier (FTIR-ATR) de refiectancia totai atenuada para diversas cadenas senciiias y moiecuias derivadas utiiizando ia ceiuia Bio-ATR FT-IR en un Tensor Bruker. Las moiecuias se concentraron hasta 3 mg/mi y se diaiizaron durante ia noche a 4 °C contra PBS, un pH de 6,5 y se recogio ei fiujo dei reguiador como bianco. Los perfiies de desnaturaiizacion se obtuvieron por exposicion termica de ias moiecuias con una ampiia gama de temperaturas en pasos de 5 °C (25 a 95 °C). Todas ias manipuiaciones de espectros se reaiizaron utiiizando ei software OPUS. Ei reguiador principai y ei fondo transitorio atmosferico (CO2 y H2O) se sustrajeron dei espectro de protelnas. Ei espectro de protelna resuitante se corrigio entonces contra ia ilnea base y se determino ei espectro de protelna amida I a partir de ia anchura dei pico resoivibie mas ancho en ia region esperada. Se obtuvieron espectros de segunda derivada para ios espectros de bandas de amida I usando una funcion poiinomiai de tercer grado con una funcion de suavizamiento. Los cambios en ia estructura de ia protelna se estimaron mediante ei anaiisis de ia segunda derivada de amida I usando una curva de caiibracion iineai para ios caicuios iniciaies de ajuste de curva suponiendo una desnaturaiizacion dei 0% para ias 3 mediciones mas bajas y una desnaturaiizacion dei 100% para ias tres mediciones mas aitas. Los perfiies de desnaturaiizacion se utiiizaron para aproximar ios puntos medios de ias transiciones de despiiegue termico (TM) para cada variante apiicando ei modeio sigmoidai de Boitzmann.

Mediciones de soiubiiidad

La soiubiiidad reiativa de diversas moiecuias de scFv se midio despues de mejorar ia agregacion de protelnas y ia precipitacion en presencia de suifato de amonio. Se anadio suifato de amonio a ia protelna en disoiuciones acuosas para producir incrementos de 5% de saturacion en ia mezcia finai de sai y protelna. La precipitacion en ei rango dinamico se determino emplricamente y ios intervaios de saturacion se redujeron en este rango hasta un 2,5% de saturacion de intervaios en ia mezcia finai. Despues de ia adicion de suifato de amonio, ias muestras se mezciaron suavemente y se centrifugaron durante 30 minutos a 6000 rpm. La protelna restante en ios sobrenadantes se recupero para cada porcentaje de saturacion de suifato de amonio. Las curvas de soiubiiidad se determinaron midiendo ia concentracion de protelna en ei sobrenadante mediante medidas UV-VIS usando un espectrofotometro NanoDropTM 1000. Las mediciones de ia protelna soiubie restante en ios sobrenadantes se normaiizaron y se usaron para estimar puntos medios de soiubiiidad reiativa para cada variante apiicando ei modeio sigmoidai de Boitzmann.

Prueba de estabiiidad a corto piazo

Las moiecuias de scFv se examinaron despues de dos semanas de incubacion a 40 °C para ia presencia de agregados soiubies y productos de degradacion. Las protelnas con una concentracion de 10 mg/mi se diaiizaron durante ia noche a 4 °C contra PBS con una ampiia gama de pH (3,5, 4,5, 5,5, 6,5, 7,0, 7,5 y 8,5). Las moiecuias de controi con ia

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misma concentracion en regulador PBS estandar (pH 6,5) se almacenaron a -80 °C durante el perlodo de 2 semanas. La determinacion de las bandas de degradacion por SDS-PAGE se realizo en puntos de tiempo t=0 y t=14d y los agregados solubles se evaluaron en la SEC-HPLC. La determinacion de la actividad restante despues de 2 semanas a 40 °C se realizo usando Biacore.

Ejemplo 1

Estrategia de inmunizacion para generar anticuerpos anti-VEGF.

En este ejemplo, se describe una estrategia de inmunizacion que utiliza un nuevo peptido antigenico derivado del VEGF, para generar anticuerpos capaces de reconocer el VEGFA humano, de raton y de conejo.

De los estudios de mutagenesis de escaneo de alanina realizados en Genentech se conocen los residuos de VEGFA que son cruciales para la interaccion de alta afinidad con el VEGFr (Fuh, G. et al. (2006) J. Biol. Chem. 281, 66256631). Aunque el sitio de union al receptor probablemente represente un epltopo conformacional, la mayorla de los residuos cruciales se encuentran en una helice alfa, en los primeros 10 aminoacidos del VEGFA maduro.

El VEGFA de conejo contiene tres cambios de aminoacidos en esta helice alfa, cuando se compara con la secuencia humana; en contraste, el VEGFA de raton es identico al humano en esta region. Por lo tanto, para la generacion de anticuerpos de reaccion cruzada raton y humano, el conejo presenta una especie adecuada para la inmunizacion. Ademas, la inmunizacion de conejo puede conducir a Abs con mayor afinidad que la inmunizacion de raton.

Como se ha indicado anteriormente, la interaccion con residuos en la helice alfa terminal N de VEGFA parece ser la mas crucial para el enlace a VEGFR1. Por lo tanto, este estiramiento de 10 aminoacidos puede usarse como un epltopo para la inmunizacion. Alternativamente, puede inyectarse VEGFA de longitud completa, sin embargo, otros tramos peptldicos en VEGFA son mas inmunogenicos, disminuyendo as! la posibilidad de crear anticuerpos neutralizantes. Esta hipotesis se apoya en el hecho de que dos peptidos diferentes, ambos situados cerca del terminal C de VEGFA son potencialmente inmunogenicos como se predice por el metodo de Johnson y Wolf. Este metodo predice solo un potencial inmunogenico menor para la helice alfa terminal N. Por lo tanto, la inmunizacion con el peptido que constituye solo la helice alfa, puede ser mas sencilla que la inmunizacion con VEGFA de longitud completa. La probabilidad de provocar una fuerte respuesta inmunitaria puede incrementarse adicionalmente por fusion o acoplamiento qulmico del peptido a hemocianina de lapa californiana (KLH).

Se realizaron cuatro estrategias de inmunizacion de la siguiente manera

A. Preinmunizacion de conejos con VEGFA165 humano de longitud completa para aumentar la probabilidad de obtener enlazadores conformacionales. Segundo refuerzo con el peptido de un tramo aa 16-KFMDVYQRSYCHP-28 (subrayado: interaccion del receptor, doble subrayado, divergente en conejo, la Cis participa en el enlace disulfuro segun la estructura cristalina). La Cis contenida en la secuencia peptldica podrla ser utilizada para el acoplamiento a KLH y, por lo tanto, no estarla expuesta como Cis libre. El peptido final se verla como sigue: KFMDVYQRSY-Cis-KLH.

B. Preinmunizacion de ratones con VEGFA165 de longitud completa para aumentar la probabilidad de obtener enlazadores conformacionales. Segundo refuerzo con el peptido de un tramo aa 16-KFMDVYQRSYCHP-28 (la Cis esta implicada en un enlace disulfuro segun la estructura cristalina). La Cis contenida en la secuencia peptldica puede utilizarse para acoplarse a KLH y, por lo tanto, no se expondrla como Cis libre. El peptido final se verla como sigue: KFMDVYQRSY-Cis-KLH.

C. Preinmunizacion de conejos/ratones con peptido de un tramo aa 16-KFMDVYQRSYCHP-28 (peptido final: KFMDVYQRSY-Cis-KLH). Segundo refuerzo con VEGFA1 65 de longitud completa para aumentar la probabilidad de obtener enlazadores conformacionales.

D. Inmunizacion con VEGFA165 de longitud completa en conejos.

Ejemplo 2

Injerto de CDR y humanizacion funcional de anticuerpos monoclonales anti-VEGF de conejo.

Injerto de CDRs de conejo

A diferencia de los metodos de humanizacion tradicionales que emplean la infraestructura de aceptor de anticuerpos humanos que comparte la mayor homologla de secuencia con el anticuerpo donador no humano, las CDRs de conejo se injertaron en la infraestructura FW1.4 (SEQ ID No. 172) para generar un injerto mlnimo o en la infraestructura "conejizada" rFW1.4 (SEQ ID No. 173) o su variante rFW1.4(v2) (SEQ ID No. 174) para generar un injerto maximo. Ambas infraestructuras se seleccionaron principalmente para las propiedades funcionales deseables (solubilidad y estabilidad), adecuacion estructural para acomodar una gran variedad de CDRs de conejo y homologla razonable con

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la secuencia de consenso de dominio variable de conejo. La infraestructura rFW1.4 es un derivado de FW1.4 que se diseno adicionalmente con el objetivo de servir como infraestructura de aceptor universal para virtualmente cualquier conjunto de CDRs de conejo. Aunque la secuencia de estructura estable y soluble FW1.4 exhibe alta homologla con anticuerpos de conejo, no es la secuencia mas homologa disponible.

Identification de residuos potencialmente implicados en el enlace

Para cada secuencia de dominio variable de conejo, se identifico la contraparte de la llnea germinal de conejo mas proxima. Si no se pudo establecer la llnea germinal mas cercana, se comparo la secuencia con el consenso de subgrupos o el consenso de secuencias de conejo con un alto porcentaje de similitud. Residuos raros de la infraestructura se consideraron como posible resultado de la hipermutacion somatica y, por tanto, desempenan un papel en el enlace con el antlgeno. En consecuencia, se consideraron tales residuos para injertar sobre la infraestructura del aceptor rFW1.4 o rFW1.4(v2) para generar injertos maximos. En particular, se injertaron restos potencialmente implicados en contacto directo con antlgeno o influencia en la disposition de VL y VH. Otros residuos descritos para influir en la estructura de la CDR se sustituyeron si fuera necesario. No se realizaron sustituciones estructurales cuando se injertaron CDRs en FW1.4 (injertos mlnimos). Por ejemplo, para generar el residuo de 578 minmax, VH 94 (H94) de rFW1.4 se muto a un residuo correspondiente en la secuencia donante. El anticuerpo de conejo 578 contiene Gli a H94 mientras que ambos, la llnea germinal mas homologa y el consenso de conejo contienen Arg en la position H94. Gli tiene una flexibilidad excepcional (angulos phi positivos) que no se encuentra para otros aminoacidos. Esto sugiere un papel en el angulo de torsion de la cadena principal y una posible fuerte influencia de la conformation del bucle con implicaciones en la actividad. Otros ejemplos de posiciones de infraestructura que se injertaron para obtener los injertos Max como se describen aqul se pueden identificar haciendo una alineacion de secuencias de las regiones estructurales de rFW1.4, rFW1.4(v2) y las secuencias scFv de interes proporcionadas aqul. Como se conoce en la tecnica, pueden usarse herramientas de la red, por ejemplo, para dicho proposito (por ejemplo ClustalW como estaba disponible el 23 de junio de 2009 en
http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html o MultiAlin como estaba disponible el 23 de junio de 2009 en
http://bioinfo.genotoul.fr/multalin). Todas las posiciones de infraestructura en las que rFW1.4 y rFW1.4(v2) contienen el mismo residuo y en las que el scFv de interes revela un residuo diferente, son posiciones de estructura que fueron injertadas para obtener los injertos Max.

Reestructuracion del dominio

Las cadenas ligeras variables de injertos Min se combinaron con injertos Max de cadena pesada variable para identificar combinaciones optimas en terminos de propiedades bioflsicas (solubilidad y estabilidad) y actividad.

Clonacion y expresion de scFvs

Los scFv descritos y caracterizados en este documento se produjeron como sigue. Las secuencias VL humanizadas (SEQ ID NOs: 82-106) se conectaron a secuencias VH humanizadas (SEQ ID NOs: 118-166) a traves del enlazador de la SEQ ID NO: 181 para producir un scFv de la siguiente orientation: NH2-VL-enlazador-VH-COOH. En muchos casos, las secuencias de ADN que codifican para los diversos scFv se sintetizaron de novo en el proveedor de servicios Entelechon GmbH (
www.entelechon.com). Los insertos de ADN resultantes se clonaron en el vector de expresion bacteriano pGMP002 a traves de sitios de restriction NcoI e HindIII introducidos en el extremo 5 'y 3' de la secuencia de ADN scFv, respectivamente. Entre la secuencia de ADN del dominio VL y el dominio VH, se encuentra un sitio de restriccion BamHI. En algunos casos, el ADN que codifica scFv no se sintetizo de novo, pero las construcciones que expresan scFv se clonaron mediante mezcla de dominios. Por consiguiente, los dominios VL se escindieron y se introdujeron en las nuevas construcciones a traves de los sitios de restriccion Ncol y BamHI, los dominios VH a traves de los sitios de restriccion BamHI y HindIII. En otros casos, se introdujeron mutaciones puntuales en el dominio VH y/o VL usando metodos de PCR de ensamblaje de vanguardia. La donation de GMP002 se describe en el Ejemplo 1 del documento WO2008006235. La production de scFvs se realizo analogamente a ESBA105 como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO2008006235.

Ejemplo 3

Analisis de enlace Biacore de scFvs ANTI-VEGF

En este ejemplo, se examino la capacidad de enlace Biacore de scFvs y se midio la afinidad de enlace usando el metodo de ejemplo de resonancia de plasmon de superficie con BIAcoreTM-T100. Las protelnas VEGF, examinadas para el enlace por estos candidatos scFv, en este ejemplo y ejemplos posteriores, incluyen VEGF165 humano recombinante expresado por Escherichia coli purificado (PeproTech EC Ltd.), VEGF121 humano recombinante (PeproTech EC Ltd.), VEGF110 humano recombinante (ESBATech AG ), VEGF164 murina recombinante (PeproTech EC Ltd.), VEGF164 de rata recombinante (Biovision), VEGF110 de conejo recombinante (ESBATech AG) y PLGF humano recombinante (PeproTech EC Ltd.). Para el experimento de resonancia de plasmon superficial, se activaron chips de biosensor de dextrano carboximetilado (CM4, GE Healthcare) con hidrocloruro de N-etil-N'-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida y N-hidroxisuccinimida de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Cada una de

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las 6 formas diferentes de VEGF, como se ha ejemplificado anteriormente, se acoplo a 1 de las 4 celdas de flujo diferentes en un chip de sensor CM4 usando un procedimiento estandar de acoplamiento de amina. El intervalo de respuestas obtenido con estas moleculas de VEGF inmovilizadas despues del acoplamiento y bloqueo fue ~250-500 unidades de respuesta (RU) para hVEGFi65, ~200 RU para hVEGFiio, hVEGFi2i, VEGFi64 murina, VEGFi64 de rata y VEGF110 de conejo y -400 RU para PLGF. La cuarta celda de flujo de cada chip se trato de manera similar excepto que no se bloquearon las protelnas antes del bloqueo y se uso la celda de flujo como referencia en llnea. Se incubaron varias concentraciones de scFv anti-VEGF (por ejemplo 90 nM, 30 nM, i0 nM, 3,33 nM, i,ii nM, 0,37 nM, 0,i2 nM y 0,04 nM) en regulador HBS-EP (HEPES 0,0i M, pH 7,4 o 5, 0,i5 M de NaCl, EDTA 3 mM, 0,005% de agente tensioactivo P20) fue inyectado en las celdas de flujo a una magnitud de flujo de 30 pl/min durante 5 min. Se dejo continuar la disociacion del scFv anti-VEGF del VEGF sobre el chip CM4 durante i0 minutos a 25 °C. Se generaron sensorgramas para cada muestra de scFv anti-VEGF despues de la correccion de la llnea de referencia en llnea seguidos por la sustraccion del regulador de la muestra. Se calcularon la constante de velocidad de disociacion aparente (kd), la constante de velocidad de asociacion aparente (ka) y la constante de equilibrio de disociacion aparente (Kd) utilizando un modelo de union Langmuir de uno a uno con el software de evaluation BIAcore Ti00 version i.i.

Como resultado de ejemplo, algunos candidatos principales de scFv anti-VEGF se enumeran en la Tabla 7 mostrando su afinidad de enlace a hVEGFi65. Su potencia como inhibidores de VEGF, que se mide usando analisis ELISA y/o HUVEC de competition de VEGFR y se describe en estos ultimos ejemplos, se muestra tambien en la Tabla 7. Las curvas cineticas de algunos candidatos de ejemplo principales, por ejemplo, 5iimax y 578max, por su enlace a HVEGFi65 se ilustran en la Figura i. Tambien se determinaron sus constantes de afinidad (kd, ka y Kd). Algunos candidatos principales tambien muestran especificidad de especie en su enlace a diversas protelnas VEGF de diferentes fuentes. Por ejemplo, algunos datos de afinidad medidos a pH 5 usando VEGFi64 de raton y de rata como companeros de enlace se muestran en las Tablas 8a y b. Un ejemplo de candidato principal de scFv, 578 minmax, tiene un Kd de 5,76E-i0 M y 7,48E-i0 M en su union al VEGFi64 de raton y de rata, respectivamente, a un pH de 5 (Tablas 8a y b) y 2,73E- ii y 2,19E-i i a un pH de 7,4 (datos no mostrados). Esta especificidad de especie se ilustra adicionalmente en la Figura 4 en las curvas cineticas y datos de afinidad para el enlace entre 578 minmax y protelnas del VEGF humanas, de raton, o de rata.

Ademas de la especificidad de especies en su union a los VEGFs de diferentes organismos, muchos candidatos principales de scFv tambien muestran afinidades de enlace diferenciadas hacia diversas isoformas del VEGF. Por ejemplo, los datos de afinidad medidos a pH 5,0 para algunos candidatos scFv que se unen al VEGF165 humano, VEGF121 y VEGF110 se comparan en la Tabla 9. En los mismos experimentos, la protelna PIGF tambien se uso como un control negativo sin capacidad de enlace a los candidatos scFv. Ademas, las curvas cineticas diferenciadas y los datos de afinidad para el enlace entre las isoformas 578Max y VEGF, como ejemplo, se ilustran en la Figura 3.

La presente invention tambien describe derivados que se originan de los candidatos principales de scFv anti-VEGF, que se mencionan anteriormente. Algunos derivados principales de los candidatos 578 y 511, enumerados en la Tabla 10, son ejemplificados por su afinidad y potencia (medidas a pH 5,0). En este experimento, la medicion con Biacore se utilizo para la afinidad de estos derivados hacia hVEGFi65, mientras que los analisis ELISA por competicion de hVEGFR2 y/o HUVEC se utilizaron para definir su potencia para inhibir los VEGFs (Tabla 10). Tres derivados, 578max, 578minmax y 578wt-His, se ejemplifican adicionalmente en sus curvas cineticas y datos de afinidad para el enlace a hVEGFi65 en la Figura 4.

Para los derivados de candidatos principales, se determinaron sus caracterizaciones bioflsicas y se ejemplificaron en las Figuras 5-7 y la Tabla 11. Estas caracterlsticas incluyen, como se ejemplifica en la tabla 11, Tm determinado por FTIR, el porcentaje de placa b o perdida de protelna despues de la incubation a 60 °C durante 30 min, solubilidad determinada por precipitation con sulfato de amonio, rendimiento de replegamiento durante el proceso de production y niveles de expresion en E. coli. Tres derivados, 578max, 578minmax y 578minmax_DHP, se caracterizaron por su estabilidad termica en sus curvas de despliegue frente a diferentes temperaturas medidas por FT-IR (Figura 5).

Claims

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1. Un inmunoenlazador recombinante que se enlaza especlficamente al VEGF humano con una Kd inferior a 10'8 M que comprende una cadena pesada variable (VH) y una cadena ligera variable (VL) que neutraliza el VEGF humano y comprende CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 y CDRL3, que tienen una similitud de al menos 80% con una secuencia de consenso del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 71, respectivamente.
2. El inmunoenlazador de la reivindicacion 1 que es un imunoenlazador quimerico.
3. El inmunoenlazador de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que se humaniza.
4. El immunoenlazador de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que:

a. la VH comprende CDRs del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 27 y en donde la VL comprende CDRs del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 50 y SEQ ID NO: 61;

b. la VH comprende CDRs del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 27 y la VL comprende CDRs del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 50 y SEQ ID NO: 61;

c. la VH comprende CDRs del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 28 y la VL comprende CDRs del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 62;

d. la VH comprende CDRs del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 29 y la VL comprende CDRs del grupo que consiste en SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 63;

e. la VH comprende CDRs del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 30 y la VL comprende CDRs del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 64;

f. la VH comprende CDRs del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 31 y la VL comprende CDRs del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 54 y SEQ ID NO: 65;

g. la VH comprende CDRs del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 32 y la VL comprende CDRs del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 66;

h. la VH comprende CDRs del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 33 y la VL

comprende CDRs del grupo que consiste en SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 67;

i. la VH comprende CDRs del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 34 y la VL

comprende CDRs del grupo que consiste en SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 68;

j. la VH comprende CDRs de (i) el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 35; (ii) el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 25 y la SEQ ID NO: 35; (iii) el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 35; o (iv) el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 25 y la SEQ ID NO: 35; y la VL comprende CDRs del grupo que consiste en SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 69;

k. la VH comprende CDRs del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 36 y donde la VL comprende (i) CDRs del grupo que consiste en SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 70; o (ii) CDRs del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 70.
5. El immunoenlazador de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una secuencia estructural de region variable de region variable de cadena pesada que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 169.
6. El inmunoenlazador de la reivindicacion 5, en el que la estructura de la region variable de la cadena pesada es la SEQ ID NO: 170 o SEQ ID NO: 171.
7. El inmunoenlazador de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que tiene eliminaciones en las posiciones 1, 83 u 87 de la region variable de cadena pesada de acuerdo con el sistema de numeracion AHo.
8. El inmunoenlazador de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que tiene una sustitucion en al menos una de las posiciones 2, 12, 24, 25, 46, 54, 55, 83, 84, 87, 89, 103, 105, 108 o 144 en la region variable de cadena pesada de acuerdo con el sistema de numeracion AHo.
9. El inmunoenlazador de la reivindicacion 8, en el que dichas sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en:

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i. Glutamina en la posicion 2;

ii. Serina en la posicion 12;

iii. Treonina en la posicion 24;

iv. Valina en la posicion 25;

v. Leucina en la posicion 46;

vi. Tirosina en la posicion 54; vii Isoleucina en la posicion 55;

viii. Alanina en la posicion 83;

ix. Asparagina en la posicion 84

x. Alanina o leucina en la posicion 87;

xi. Alanina o leucina en la posicion 89;

xii. Serina o treonina en la posicion 103;

xiii. Fenilalanina en la posicion 105;

xiv. Arginina en la posicion 108; y

xv. Serina o treonina en la posicion 144.
10. El inmunoenlazador de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende una secuencia de estructura de region variable de cadena ligera que tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 167.
11. El inmunoenlazador de la reivindicacion 10, en el que la estructura de la region variable de la cadena ligera es la SEQ ID NO: 167 o SEQ ID NO: 168.
12. El inmunoenlazador de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que tiene una sustitucion en al menos una de las posiciones 1,2, o 15 de la region variable de cadena ligera de acuerdo con el sistema de numeracion AHo.
13. El inmunoenlazador de la reivindicacion 12, en el que dichas sustituciones se seleccionan del grupo que consiste en:

i. Aspartato en la posicion 1;

ii. Valina en la posicion 2; y

iii. Treonina en la posicion 15.
14. El immunoenlazador de una cualquiera de las reivindicaciones 5-13, que comprende:

a. Una region variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 80% similar a la SEQ ID NO: 107 y una region variable de cadena ligera al menos un 80% similar a la SEQ ID NO: 72;

b. Una region variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 80% similar a la SEQ ID NO: 109 y una region variable de cadena ligera al menos un 80% similar a la SEQ ID NO: 73;

c. Una region variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 80% similar a la SEQ ID NO: 110 y una region variable de cadena ligera al menos un 80% similar a la SEQ ID NO: 74;

d. Una region variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 80% similar a la SEQ ID NO: 111 y una region variable de cadena ligera al menos un 80% similar a la SEQ ID NO: 75;

e. Una region variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 80% similar a la SEQ ID NO: 112 y una region variable de cadena ligera al menos un 80% similar a la SEQ ID NO: 76;

f. Una region variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 80% similar a la SEQ ID NO: 113 y una region variable de cadena ligera al menos un 80% similar a la SEQ ID NO: 77;

5

10

15

20

25

30

35

40

45

g. Una region variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 80% similar a

la SEQ ID NO: 114 y una region variable de cadena ligera al menos un 80% similar a la SEQ ID NO: 78;

h. Una region variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 80% similar a

la SEQ ID NO: 115 y una region variable de cadena ligera al menos un 80% similar a la SEQ ID NO: 79;

i. Una region variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 80% similar a la SEQ ID NO: 116 y una region variable de cadena ligera al menos un 80% similar a la SEQ ID NO: 80;

j. Una region variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 80% similar a la SEQ ID NO: 117 y una region variable de cadena ligera al menos un 80% similar a la SEQ ID NO: 81.
15. El inmunoenlazador de la reivindicacion 14, que tiene al menos un 80% de identidad con las SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179 o SEQ ID NO: 180.
16. El inmunoenlazador de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que se enlaza especlficamente al VEGF humano y de rata/raton.
17. El inmunoenlazador de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que es un anticuerpo, scFv, Fab o Dab.
18. Una composicion que comprende el inmunoenlazador de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, y un vehlculo farmaceuticamente aceptable.
19. La composicion de la reivindicacion 18, formulada para administracion topica, intraocular, oral, nasal, rectal o parental.
20. Una molecula de acido nucleico aislada que codifica el inmunoenlazador de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
21. Un vector de expresion que comprende la molecula de acido nucleico de la reivindicacion 20.
22. Una celula huesped que comprende el vector de expresion de la reivindicacion 21.
23. Uso del inmunoenlazador de una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 en la produccion de un medicamento para el tratamiento o prevencion de una enfermedad mediada por VEGF humano.
24. El inmunoenlazador de una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 para uso en el tratamiento o prevencion de una enfermedad mediada por VEGF humano.
25. El uso de la reivindicacion 23 o el inmunoenlazador para uso de la reivindicacion 24, en el que la enfermedad mediada por VEGF se selecciona del grupo que consiste en degeneration macular relacionada con la edad, glaucoma neovascular, retinopatla diabetica, retinopatla de prematuridad, fibroplasia retrolental, carcinomas de mama , carcinomas de pulmon, carcinomas gastricos, carcinomas de esofago, carcinomas colorrectales, carcinomas de hlgado, carcinomas de ovario, los comas, arrenoblastomas, carcinoma cervical, carcinoma de endometrio, hiperplasia del endometrio, endometriosis, fibrosarcomas, coriocarcinoma, cancer de cabeza y cuello, carcinoma nasofarlngeo, carcinomas larlngeos , hepatoblastoma, sarcoma de Kaposi, melanoma, carcinomas cutaneos, hemangioma, hemangioma cavernoso, hemangioblastoma, carcinomas de pancreas, retinoblastoma, astrocitoma, glioblastoma, Schwannoma, oligodendroglioma, meduloblastoma, neuroblastomas, rabdomiosarcoma, sarcoma osteogenico, leiomiosarcomas, carcinomas del tracto urinario, carcinomas tiroideos, tumor de Wilm, carcinoma de celula renal, carcinoma de prostata, proliferation vascular anormal asociada con facomatosis, edema (tal como el asociado con tumores cerebrales), slndrome de Meigs, artritis reumatoide, psoriasis y aterosclerosis.
26. Un hibridoma que produce un anticuerpo que comprende una cualquiera de las secuencias de aminoacidos expuestas en las SEQ ID NOs: 60-166 y en las SEQ ID NOs: 175-180.
27. El inmunoenlazador de una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 en una forma de dosificacion farmaceuticamente aceptable para las vlas topica, intraocular, intramuscular, intraperitoneal, intracerobrospinal, subcutanea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral o de inhalation.
28. El inmunoenlazador de la reivindicacion 4, en el que el VH comprende secuencias CDRH1, CDRH2 y CDRH3 de las SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 32, respectivamente, y la VL comprende secuencias CDRL1, CDRL2 y CDRL3 de las SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 66, respectivamente.
29. El inmunoenlazador de la reivindicacion 28, en el que la region variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 164 y la region variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 87.

5

10

15

20

25
30. Un fragmento enlazador de antlgeno del inmunoenlazador de la reivindicacion 28 o 29, en el que el fragmento es un scFv o un Fab, un F(ab')2 o un Fab'.
31. El fragmento enlazador de antlgeno de la reivindicacion 30, en el que el fragmento es un scFv, y en el que la region variable de cadena pesada y la region variable de cadena ligera estan enlazadas por la secuencia de la SEQ ID NO: 181.
32. Una composicion farmaceutica que comprende el inmunoenlazador de cualquiera de las reivindicaciones 4, 28 o 29 o el fragmento enlazador del antlgeno de cualquiera de las reivindicaciones 30-31, y un vehlculo farmaceuticamente aceptable.
33. El uso del inmunoenlazador de una cualquiera de las reivindicaciones 28-29, el fragmento de union al antlgeno de cualquiera de las reivindicaciones 30-31, o la composicion farmaceutica de la reivindicacion 32 en la produccion de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad mediada por el VEGF humano.
34. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 32 para uso en el tratamiento de una enfermedad mediada por el VEGF humano.
35. La composicion farmaceutica para uso de la reivindicacion 34, en la que la enfermedad mediada por VEGF se selecciona del grupo que consiste en degeneracion macular relacionada con la edad, glaucoma neovascular, retinopatla diabetica, retinopatla de prematuridad, fibroplasia retrolental, carcinomas de mama, carcinomas de pulmon, carcinomas gastricos, carcinomas del esofago, carcinomas colorrectales, carcinomas del hlgado, carcinomas del ovario, los comas, arrenoblastomas, carcinomas cervicales, carcinoma endometrial, hiperplasia endometrial, endometriosis, fibrosarcomas, coriocarcinoma, cancer de cabeza y cuello, carcinoma nasofarlngeo, carcinomas larlngeos, hepatoblastoma, sarcoma de Kaposi, melanoma, carcinomas de la piel, hemangioma, hemangioma cavernoso, hemangioblastoma, carcinomas de pancreas, retinoblastoma, astrocitoma, glioblastoma, Schwannoma, oligodendroglioma, meduloblastoma, neuroblastomas, rabdomiosarcoma, sarcoma osteogenico, leiomiosarcomas, carcinomas del tracto urinario, carcinomas de tiroides, tumor de Wilm, carcinoma de celulas renales, carcinoma de prostata, proliferacion vascular anormal asociada con facomatosis, edema (como el asociado con tumores cerebrales), slndrome de Meigs, artritis reumatoide, psoriasis y aterosclerosis.
36. Una molecula biespeclfica que comprende el inmunoenlazador de una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 o 27-29, o el fragmento enlazador del antlgeno de una cualquiera de las reivindicaciones 30-31.
37. Una molecula multiespeclfica que comprende el inmunoenlazador de una cualquiera de las reivindicaciones 1-18 o 27-29, o el fragmento enlazador del antlgeno de una cualquiera de las reivindicaciones 30-31.

Tiempo [s]

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201

Fig. 1b

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300 500

Tiempo [s]

Fig. 2b

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Fig. 2c

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205

Fig. 3a

RU

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Tiempo

Fig. 3b

RU

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Tiempo [s]

207

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208

Fig. 4b

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Fig. 4c

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Tiempo [s]

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Vatores normalizados a la protema nativa

(%)

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Valores normaliiados a la protema nativa (%]

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212

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Fig. 7a

Ql ssjope:e|U3

Valores normalizados a la protema nativa

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Fig, 6c

213

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Ci

Saturacion de NH4(S04)2(%)

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i

■ Lucentis * 576 min t 578 may

Fig. 8c

Concentration (nM)

imagen17

■ Lucentis

* 511 may C-his

▼ 534 max

Fig. 8d

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216

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□ Lucentis ■ 578min-max

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□ Lucentis a V1253 ;r 578min-max

Fig. 10a

imagen20

cP

nM

&

<?*

□ hVEGFR1/Fc a V1253 * 578minmax

Fig. 10b

Fig. 10

imagen21

903/802 scFv (nM)
62.1 20.7 6.9 2.3 0.77 0.25 0.09 0

•

•

•

$ %

•

•

# • % %

•

m • • • 9

•

PBS PBS PBS

\ r /

Luc 6.9

Fuga vascular hacia la piel

Fig. 11

cone. (nM)

6IZ

Area de la fuga del colorante (plxeles)

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Area de la fuga del colorante

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03

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3

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X

Area de la fuga del colorante

Fig. 12c

imagen26

M Area de la fuga dell colorante

Concentracion de Lucentis (ng/ml)

222

imagen27

N (ojos)

VEGF

8

Fig. 13a

imagen28

Grupos de tratamiento

223

0

N (ojas)

Net ABS(fi).62Q/74QnmfpesQ/0td$ma ABS

Fig. 13b

■ I

BSA

5

51287

Q.35pg

VEGF

10

51287 1 052^g VEGF 10

t or

i

51287
3.5|jg

VEGF

9

Grupos de tratamiento

224

Fig. 14

imagen29

VEGF

*

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BSA

n(ojos)=

6

6

imagen31

AL-51287

(Topico

9

imagen32

AL-52657 AL-39324 Vehiculo Ctrl ref

(Vehiculo Top.) (Oral) (Oral)

12 12 12

Kabat Chothia

Definicion de ESBATech

i-------------------------

Chothia

A______

Kabat

imagen33

25

25

r

Av

A

f

26 27 28 29 30 31 * * * * 32 33 34 35 35a 35b 36

26 27 28 29 30 31 31a 31b 32 33 34 35 * * * * 36

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imagen35

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