ES3032009T3 - Enhancing autophagy or increasing longevity by administration of urolithins or precursors thereof - Google Patents

Enhancing autophagy or increasing longevity by administration of urolithins or precursors thereof

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ES3032009T3
ES3032009T3 ES23175506T ES23175506T ES3032009T3 ES 3032009 T3 ES3032009 T3 ES 3032009T3 ES 23175506 T ES23175506 T ES 23175506T ES 23175506 T ES23175506 T ES 23175506T ES 3032009 T3 ES3032009 T3 ES 3032009T3
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ES
Spain
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urolithin
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autophagy
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ES23175506T
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Christopher L Rinsch
William Blanco-Bose
Bernard Schneider
Laurent Mouchiroud
Dongryeol Ryu
Penelope Andreux
Johan Auwerx
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Original Assignee
Amazentis SA
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Abstract

Se describen métodos, compuestos y composiciones útiles para aumentar la autofagia y promover la longevidad. Los métodos, compuestos y composiciones se refieren a urolitinas, sus precursores y su uso. Ciertas urolitinas se representan mediante la Fórmula I, mientras que ciertos precursores se representan mediante la Fórmula IV. La urolitina puede ser urolitina A, urolitina B, urolitina C o urolitina D. El precursor de urolitina puede ser ácido elágico o un elagitanino. Los métodos incluyen usos in vivo, ex vivo e in vitro de los compuestos y composiciones. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Mejorar la autofagia o aumentar la longevidad mediante la administración de urolitinas o precursores de las mismas
ANTECEDENTES
[0001] La autofagia es una ruta de degradación lisosómica tanto en animales como en plantas que es esencial para el desarrollo, la diferenciación, la homeostasis y la supervivencia. En los animales, la autofagia sirve principalmente como un mecanismo adaptativo para proteger a los organismos contra diversas patologías, incluyendo infección, cáncer, neurodegeneración, enfermedad cardíaca y envejecimiento. El repertorio de funciones de mantenimiento rutinarias realizadas por la autofagia incluye eliminación de proteínas defectuosas y orgánulos, prevención de la acumulación de agregados proteicos anormales y eliminación de patógenos intracelulares. La ruta de la autofagia es la única capaz de degradar orgánulos enteros, tales como mitocondrias, peroxisomas y retículo endoplásmico.
[0002] Múltiples informes indican que las proteínas necesarias para la inducción de la autofagia, tales como sirtuina 1, tienen expresión reducida en tejidos envejecidos; se ha demostrado que los niveles de autofagia disminuyen con la edad. Los niveles reducidos de autofagia también se han asociado a obesidad, diabetes, cáncer, enfermedades neurodegenerativas, enfermedad cardiovascular, osteoartritis y degeneración macular relacionada con la edad.
[0003] Se han identificado varios compuestos que estimulan la autofagia, incluyendo rapamicina, resveratrol, metformina, espermidina y glucosamina.
[0004] Las urolitinas son metabolitos derivados del elagitanino y del ácido elágico producidos, por ejemplo, por la microflora del colon de mamíferos, incluyendo la microflora del colon humano. Se sabe que las urolitinas exhiben actividad antioxidante.
[0005] La solicitud de patente de EE.UU., US 2006/0257337, divulga composiciones y métodos para prevenir y/o tratar enfermedades de la piel, incluyendo 2-hidroxibenzo[c]cromen-6-ona. La solicitud de patente de Ee .UU., US 2011/0263521, divulga inhibidores de la degradación del ácido hialurónico para el tratamiento del envejecimiento de la piel, por ejemplo, urolitina B. La solicitud internacional, WO 2008/016554, describe una composición antienvejecimiento que comprendeShilajitpurificado, que comprende una mezcla de urolitina B y urolitina A, entre otros componentes. Chen et al (2011) Aging Cell 10(5), 908-911 divulgan que la rapamicina mejora la generación de células madre pluripotentes inducidas en ratones.
[0006] El alcance de la invención se define por las reivindicaciones. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, las composiciones farmacéuticas y los medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
[0007] Un aspecto de la invención es una urolitina para su uso en el tratamiento de trastornos de la piel, en donde el trastorno de la piel se selecciona de agresiones ambientales y lesiones cutáneas por una oxidación lipídica excesiva en pieles envejecidas y enfermas.
[0008] Un aspecto de la invención es una urolitina para su uso para mejorar o aumentar la autofagia en un animal, en donde la autofagia se mejora o se aumenta en células del animal seleccionadas de células cutáneas, por ejemplo, en donde las células cutáneas comprenden queratinocitos.
[0009] Un aspecto de la invención es una urolitina para su uso para mejorar o aumentar la autofagia en un animal, en donde la autofagia se mejora o se aumenta en un tejido u órgano del animal seleccionado de piel.
[0010] Un aspecto de la invención es una urolitina para su uso para mejorar o aumentar la autofagia en un animal, en donde la autofagia se mejora o se aumenta en células del animal seleccionadas de células epiteliales y células endoteliales.
[0011] Un aspecto de la invención es un compuesto de Fórmula II, para su uso en un método de la invención;
en donde
X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 y X8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H y OH; y con la condición de que el compuesto no sea un compuesto de Fórmula II en donde X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 y X8 son H;
X1 es OH y X2, X3, X4, X5, X6, X7 y X8 son H;
X2 es OH y X1, X3, X4, X5, X6, X7 y X8 son H (urolitina B);
X3 es OH y X1, X2, X4, X5, X6, X7 y X8 son H;
X4 es OH y X1, X2, X3, X5, X6, X7 y X8 son H;
X5 es OH y X1, X2, X3, X4, X6, X7 y X8 son H;
X6 es OH y X1, X2, X3, X4, X5, X7 y X8 son H;
X7 es OH y X1, X2, X3, X4, X5, X6 y X8 son H;
X8 es OH y X1, X2, X3, X4, X5, X6 y X7 son H;
X1 y X2 son OH, y X3, X4, X5, X6, X7 y X8 son H;
X1 y X5 son OH, y X2, X3, X4, X6, X7 y X8 son H;
X1 y X7 son OH, y X2, X3, X4, X5, X6 y X8 son H;
X1 y X8 son OH, y X2, X3, X4, X5, X6 y X7 son H;
X2 y X3 son OH, y X1, X4, X5, X6, X7 y X8 son H;
X2 y X4 son OH, y X1, X3, X5, X6, X7 y X8 son H;
X2 y X5 son OH, y X1, X3, X4, X6, X7 y X8 son H;
X2 y X6 son OH, y X1, X3, X4, X5, X7 y X8 son H (urolitina A);
X2 y X7 son OH, y X1, X3, X4, X5, X6 y X8 son H;
X3 y X4 son OH, y X1, X2, X5, X6, X7 y X8 son H;
X3 y X5 son OH, y X1, X2, X4, X6, X7 y X8 son H;
X3 y X6 son OH, y X1, X2, X4, X5, X7 y X8 son H;
X5 y X6 son OH, y X1, X2, X3, X4, X7 y X8 son H;
X5 y X8 son OH, y X1, X2, X3, X4, X6 y X7 son H;
X6 y X7 son OH, y X1, X2, X3, X4, X5 y X8 son H;
X1, X2 y X5 son OH, y X3, X4, X6, X7 y X8 son H;
X1, X2 y X6 son OH, y X3, X4, X5, X7 y X8 son H;
X1, X5 y X8 son OH, y X2, X3, X4, X6 y X7 son H;
X2, X4 y X6 son OH, y X1, X3, X5, X7 y X8 son H;
X2, X4 y X7 son OH, y X1, X3, X5, X6 y X8 son H;
X2, X6 y X7 son OH, y X1, X3, X4, X5 y X8 son H (urolitina C);
X2, X6 y X8 son OH, y X1, X3, X4, X5 y X7 son H;
X2, X7 y X8 son OH, y X1, X3, X4, X5 y X6 son H;
X1, X2, X5 y X6 son OH, y X3, X4, X7 y X8 son H;
X1, X2, X5 y X7 son OH, y X3, X4, X6 y X8 son H;
X1, X2, X6 y X7 son OH, y X3, X4, X5 y X8 son H (urolitina D);
X1, X6, X7 y X8 son OH, y X2, X3, X4 y X5 son H;
X2, X3, X6 y X7 son OH, y X1, X4, X5 y X8 son H;
X2, X4, X5 y X8 son OH, y X1, X3, X6 y X7 son H;
X2, X4, X6 y X7 son OH, y X1, X3, X5 y X8 son H;
X1, X2, X4, X5 y X7 son OH, y X3, X6 y X8 son H;
X1, X2, X6, X7 y X8 son OH, y X3, X4 y X5 son H; y
X1, X2, X3, X6, X7 y X8 son OH, y X4 y X5 son H.
[0012]Un aspecto de la invención es un compuesto deFórmula III,para su uso en un método de la invención;
en donde
R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H y OR;
R es H, alquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, un monosacárido sustituido o no sustituido o un oligosacárido sustituido o no sustituido; y
con la condición de que el compuesto no sea un compuesto de Fórmula III en donde R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son H;
R1 es OR, y R2, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son H
<R2>es OR, y<R1>, R3, R4, R5, R6, R7 y<R8>son H;
<R3>es OR, y<R1>, R2, R4, R5, R6, R7 y<R8>son H;
<R4>es OR, y<R1>, R2, R3, R5, R6, R7 y<R8>son H;
<R5>es OR, y<R1>, R2, R3, R4, R6, R7 y<R8>son H;
<R6>es OR, y<R1>, R2, R3, R4, R5, R7 y<R8>son H;
<R7>es OR, y<R1>, R2, R3, R4, R5, R6 y<R8>son H;
<R8>es OR, y<R1>, R2, R3, R4, R5, R6 y<R7>son H;
<R1y R2 son OR y R3, R4, R5, R6, R7y R8 son H;>
<R1y R5 son OR y R2, R3, R4, R6, R7y R8 son H;>
<R1y R7 son OR, y R2, R3, R4, R5, R6y R8 son H;>
<R1y R8 son OR, y R2, R3, R4, R5, R6y R7 son H;>
<R2 y R3 son OR y R1, R4, R5, R6, R7y R8 son H;>
<R2 y R4 son OR y R1, R3, R5, R6, R7y R8 son H;>
<R2 y R5 son OR y R1, R3, R4, R6, R7y R8 son H;>
<R2 y R6 son OR y R1, R3, R4, R5, R7y R8 son H;>
<R2 y R7 son OR y R1, R3, R4, R5, R6y R8 son H;>
<R2 y R8 son OR y R1, R3, R4, R5, R6y R7 son H;>
<R3>y R4 son ORy R1,R2, R5, R6, R7y<R8>son H;
R3 y R5 son OR y R1, R2, R4, R6, R7y R8 son H;
R3 y R6 son OR y R1, R2, R4, R5, R7y R8 son H;
R3 y R7 son OR, y R7, R2, R4, R5, R6y R8 son H;
R3 y R8 son OR, y R7, R2, R4, R5, R6y R7 son H;
R4 y R8 son OR, y R7, R2, R3, R5, R6y R7 son H;
R5 y R6 son OR, y R7, R2, R3, R4, R7y R8 son H;
R5 y R7 son OR, y R7, R2, R3, R4, R6y R8 son H;
R5 y R8 son OR, y R7, R2, R3, R4, R6y R7 son H;
R6 y R7 son OR, y R7, R2, R3, R4, R5y R8 son H;
R6 y R8 son OR, y R7, R2, R3, R4, R5y R7 son H;
R1 R2 y R3 son OR, y<R4,>R5, R6,<R7>y<R8>son H;
R1 R2 y R5 son OR, y<R3,>R4, R6,<R7>y<R8>son H;
R1 R2 y R6 son OR, y<R3,>R4, R5,<R7>y<R3>son H;
R1 R2 y R8 son OR, y<R3,>R4, R5,<R6>y<R7>son H;
R1 R5 y R8 son OR, y<R2,>R3, R4,<R6>y<R7>son H;
R1 R7 y R8 son OR, y<R2,>R3, R4,<R5>y<R6>son H;
<R2,>R3 y R4 son OR, yR1,R5, R6,<R7>y<R8>son H;
<R2,>R4 y R6 son OR, yR1,R3, R5,<R7>y<R8>son H;
<R2,>R4 y R7 son OR, yR1,R3, R5,<R6>y<R8>son H;
<R2,>R5 y R8 son OR, yR1,R3, R4,<R6>y<R7>son H;
<R2,>R6 y R7 son OR, yR1,R3, R4,<R5>y<R8>son H;
<R2,>R6 y R8 son OR, yR1,R3, R4,<R5>y<R7>son H;
<R2,>R7 y R8 son OR, yR1,R3, R4,<R5>y<R6>son H;
<R3,>R5 y R8 son OR, yR1,R2, R4,<R6>y<R7>son H;
<R3,>R7 y R8 son OR, yR1,R2, R4,<R5>y<R6>son H;
<R6,>R7 y R8 son OR, yR1,R2, R3,<R4>y<R5>son H;
R1 R2, R5 y R6 son OR, y R3, R4, R7y<R8>son H;
R1 R2, R5 y R7 son OR, y R3, R4, R6y<R8>son H;
R1, R2, R6 y R7 son OR, y R3,<R4, R5>y<R8>son H
R1,R6,R7 y R8 son OR, y R2,<R3, R4>y<R5>son H
R2, R3,R4 y R6 son OR, y R1,<R5, R7>y<R8>son H
R2,R3, R5 y R7 son OR, y R1,<R4, R6>y<R8>son H
R2, R3,R6 y R7 son OR, y R1,<R4, R5>y<R8>son H
R2,R4, R5 y R8 son OR, y R1,<R3, R6>y<R7>son H
R2,R4, R6 y R7 son OR, y R1,<R3, R5>y<R8>son H
<R2,>R5, R6 y R7 son OR, y R1,<R3, R4>y<R8>son H
<R2,>R6, R7 y R8 son OR, y R1,<R3, R4>y<R5>son H
R1, R2, R4, R5 y R7 son OR, y R3, R6y<R3>son H
R1, R2, R6, R7 y R8 son OR, y R3, R4y<R5>son H
R2, R3, R4, R5 y R7 son OR, yR1,R6y<R8>son H
R2, R3, R6, R7 y R8 son OR, yR1,R4y<R5>son H
R2, R4, R6, R7 y R8 son OR, yR1,R3y<R5>son H
R2, R5, R6, R7 y R8 son OR, yR1,R3y<R4>son H
R1,R2, R3, R6, R7 y R8 son OR, y R4y<R5>son H
R2, R3, R4, R6, R7 y R8 son OR, y R1y<R5>son H y
R2, R4, R5, R6, R7 y R8 son OR, y R1y<R3>son H.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
[0013]
LaFigura 1es un diagrama esquemático que representa cuatro etapas de la macroautofagia: inducción y nucleación, expansión, fusión y degradación. Las proteínas implicadas en cada etapa se indican encima de cada etapa. El papel de p62 y LC3 se explica esquemáticamente, mediante el cual p62 ayuda a transportar material celular al autofagosoma uniéndose a LC3.
LaFigura 2representa fórmulas estructurales para urolitina A (UA), ácido elágico (EA), tellimagrandina (TL), punicalagina (PA) y punicalina (PB).
LaFigura 3representa el ácido elágico (EA) y sus metabolitos, urolitina D (UD), urolitina C (UC), urolitina A (UA) y urolitina B (UB), que se producen por la microflora intestinal en los mamíferos, incluyendo seres humanos.
LaFigura 4es un grupo de cinco gráficos que representan el efecto del ácido elágico y las urolitinas A, B, C y D sobre la esperanza de vida deC. elegans.Los agentes de prueba estaban presentes a 50 pM en DMSO. DMS<o>, dimetilsulfóxido, fue el control y el vehículo para los agentes de prueba.
LaFigura 5es un conjunto de gráficos que representan la longevidad de C.elegansde tipo silvestre cultivado en presencia de urolitina A a las concentraciones mostradas.
LaFigura 6es un grupo de seis gráficos (A-F) que representan el análisis de la esperanza de vida de cepas de C.elegansde tipo silvestre y mutantes indicadas cultivadas en ausencia (negro) o presencia (gris) de urolitina A a 50 pM.
LaFigura 7es un gráfico de barras que representa el efecto de la urolitina A en las mitocondrias del músculo de C.elegans.La cepa transgénica de C.elegansSJ4103 muestra fluorescencia debido a la expresión específica del músculo de la proteína verde fluorescente (GFP) que se dirige a la membrana mitocondrial. La presencia de mitocondrias en el músculo del C.elegansse demuestra por un aumento de la fluorescencia. Los resultados se expresan como media ± SEM. *, p = 0,0014 (prueba t de Student).
LaFigura 8es un gráfico de líneas y tres gráficos de barras que representan el efecto de la urolitina A (UA) en la respiración basal y desacoplada en C.elegansjóvenes (de un día) y ancianos (de diez días).(A)Respiración basal y desacoplada (FCCP) en gusanos control de 10 días tratados con DMSO al 0,1 % y gusanos de diez días tratados con urolitina A 30 pM en DMSO al 0,1 %.(B)Área bajo la curva (AUC) representativa de la respiración desacoplada (FCCP) en gusanos control de diez días tratados con vehículo (D<m>S<o>al 0,1 %) o urolitina A 30 pM en D<m>S<o>al 0,1 %. Los resultados se expresan como media ± SEM. *, p < 0,05 (prueba t de Student). OCR, tasa de consumo de oxígeno.(C)Comparación de la respiración basal entre gusanos de un día y de diez días tratados con vehículo (DMSO al 0,1 %).(D)Comparación de la respiración basal entre gusanos de un día y de diez días tratados con UA (30 pM).
LaFigura 9Aes un grupo de tres imágenes confocales que representan el efecto de la urolitina A en la inducción de autofagia en C.elegans.LaFigura 9Bes un gráfico de puntos correspondiente que representa el efecto de la urolitina A en la inducción de autofagia. ***, p <0,001 (prueba t de Student).
LaFigura 10es un grupo de tres gráficos que representan curvas de supervivencia, mostrando el efecto de la inactivación por iARN devps-34ybec-1sobre el fenotipo de longevidad inducido por el tratamiento con urolitina A enC. elegans.Ambas inhibiciones porvps-34(B) ybec-1(C) suprimen totalmente el fenotipo de esperanza de vida observado en gusanos tratados con urolitina A (50 j M) y suministrados con un vector vacío (A). Los análisis de supervivencia se realizaron usando el método de Kaplan Meier y la significancia de las diferencias entre las curvas de supervivencia se calculó mediante la prueba de rango logarítmico. ***, p < 0,001 (prueba de rango logarítmico).
La Figura 11 es un conjunto de gráficos que demuestran los efectos del tratamiento con urolitina A (UA), urolitina B (UB), urolitina C (UC) y urolitina D (UD) en el bombeo faríngeo en gusanosC. elegansdespués de 7 y 14 días de tratamiento. (* p< 0,05; ** p<0,01; ***p<0,001)
La Figura 12 son tres gráficos de líneas que demuestran los efectos del tratamiento con ácido elágico (EA), urolitina A (UA) y urolitina B (UB) sobre la motilidad en gusanos C.elegansjóvenes en los días 1, 3, 5 y 8 del tratamiento. (* p< 0,05; ** p<0,01; ***p<0,001)
La Figura 13 es un conjunto de imágenes que demuestran trazos de lapso de tiempo de la motilidad de C.elegansdespués del tratamiento con ácido elágico (EA), urolitina A (UA), urolitina B (UB), urolitina C (UC) y urolitina D (UD) los días 8, 14 y 16 de tratamiento.
La Figura 14 es una transferencia Western de células ModeK, una línea celular epitelial intestinal de ratón, que demuestra el efecto del tratamiento con urolitina A en la proporción de marcadores de autofagia LC3-II/LC3-I, p62, y en la proporción de p-AMPKa/AMPKa. El gráfico de barras demuestra el aumento cuantificado en la proporción de LC3-II a LC3-I, y la proporción de los niveles de p-AMPKa a AMPKa observados en las transferencias Western. ctl, control.
La Figura 15 es una transferencia Western de hepatocitos primarios de ratón, que demuestra el efecto del tratamiento con urolitina A en la proporción de marcadores de autofagia LC3-II/LC3-I, p62, y en la proporción de p-AMPKa/AMPKa. El gráfico de barras demuestra el aumento cuantificado en la proporción de LC3-II a LC3-I, y la proporción de los niveles de p-AMPKa a AMPKa observados en las transferencias Western. ctl, control.
La Figura 16 es una transferencia Western de miocitos de ratón C2C12, que demuestra el efecto del tratamiento con urolitina A en la proporción de marcadores de autofagia LC3-II/LC3-I, p62, y en la proporción de p-AMPKa/AMPKa. El gráfico de barras demuestra el aumento cuantificado en la proporción de LC3-II a LC3-I, y la proporción de los niveles de p-AMPKa a AMPKa observados en las transferencias Western. ctl, control.
La Figura 17 es una transferencia Western de mioblastos primarios humanos, que demuestra el efecto del tratamiento con urolitina A en la proporción de marcadores de autofagia LC3-II/LC3-I, p62, y en la proporción de p-AMPKa/AMPKa. El gráfico de barras demuestra el aumento cuantificado en la proporción de niveles de LC3-II a LC3-I observados en las transferencias Western. Ctrl, control.
La Figura 18 es una transferencia Western de células endoteliales aórticas primarias humanas, que demuestra el efecto del tratamiento con urolitina A sobre la proporción del marcador de autofagia LC3-II/LC3-I y la proteína p62. El gráfico de barras demuestra el aumento cuantificado en la proporción de niveles de LC3-II a LC3-I observados en las transferencias Western. Ctrl, control.
La Figura 19 es una transferencia Western de hígados aislados de ratones control no tratados y de ratones a los que se les administró urolitina A a una dosis de 55 mg/kg/día mezclada con alimentos. El tratamiento con urolitina A aumentó la proporción del marcador de autofagia LC3-II/LC3-I, disminuyó p62 y aumentó la proporción de p-AMPKa/AMPKa. El gráfico de barras demuestra el aumento cuantificado en la proporción de LC3-II a LC3-I, y la proporción de los niveles de p-AMPKa a AMPKa observados en las transferencias Western. ctl, control.
La Figura 20 es un gráfico que representa el efecto de la urolitina A consumida por vía oral a 55 mg/kg/día sobre la actividad motora de ratones C57BL/6J. Los ratones jóvenes tratados aumentaron su carrera voluntaria espontánea sobre una rueda en al menos un 25 % durante el período de cinco días investigado.
La Figura 21 es un gráfico de barras que representa el efecto de la urolitina A consumida por vía oral sobre la carrera en ratones C57BL/6J envejecidos.
La Figura 22 es un gráfico de barras que representa el efecto de la urolitina A consumida por vía oral sobre la fuerza de agarre en ratones C57BL/6J envejecidos.
La Figura 23 es un par de gráficos de barras que representan el efecto de la urolitina A consumida por vía oral sobre la deambulación y el estar levantado en ratones C57BL/6J envejecidos. HFD, dieta alta en grasas; UA, urolitina A.
La Figura 24 es una transferencia Western de músculo esquelético aislado de ratones control no tratados con dieta alta en grasas (HFD) envejecidos y de ratones con dieta alta en grasas envejecidos a los que se les administró urolitina A (UA) a una dosis de 50 mg/kg/día mezclada con los alimentos. El tratamiento con urolitina A aumentó la proporción del marcador de autofagia LC3-II/LC3-I y disminuyó los niveles de p62. El gráfico de barras demuestra el aumento cuantificado en la proporción de niveles de LC3-II a LC3-I observados en las transferencias Western. Ctrl, control.
LaFigura 25muestra el efecto de la urolitina A (UA) sobre la autofagia en mioblastos C2C12. Los mioblastos incubados durante 24 horas con dosis crecientes de UA mostraron una respuesta a la dosis, con autofagia creciente a medida que se elevaba la concentración de UA (10<j>M, 50<j>M y 100<j>M), lo que se demostró por el desplazamiento en aumento en el histograma que representa los niveles de células LC3-B, un marcador de autofagia, en comparación con controles no tratados.
LaFigura 26muestra el efecto de urolitina A (UA), urolitina B (UB), urolitina C (UC) y urolitina D (UD) sobre la autofagia en células C2C12. Los mioblastos incubados con UA, UB, UC o UD a 100 j M experimentaron un aumento en la autofagia como se demuestra por el desplazamiento en el histograma que representa los niveles de células LC3-B en comparación con los controles no tratados.
LaFigura 27representa veinticinco compuestos de la invención.
LaFigura 28representa rutas sintéticas proféticas a los compuestos en la Figura 27.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Visión general
[0014]La autofagia es un proceso mediante el cual las células degradan sus propios componentes, reciclando aminoácidos y otros componentes básicos que pueden reutilizarse. Esta degradación se realiza mediante hidrolasas ácidas lisosómicas. Es un proceso estrechamente regulado que juega un papel importante en el crecimiento celular normal, el desarrollo y la homeostasis, ayudando a mantener un equilibrio entre la síntesis, la degradación y el posterior reciclaje de productos celulares. Es un mecanismo importante mediante el cual las células hambrientas pueden reasignar nutrientes de procesos menos esenciales a procesos más esenciales.
[0015]Durante la inanición de nutrientes, los niveles elevados de autofagia conducen a la descomposición de componentes no vitales y la liberación de nutrientes, garantizando que los procesos vitales puedan continuar. Las células de levadura mutantes que tienen una capacidad autofágica reducida mueren rápidamente en condiciones de deficiencia de nutrientes. Un gen conocido comoAtg7ha sido implicado en la autofagia mediada por nutrientes, y estudios en ratones han demostrado que la autofagia inducida por la inanición se vio afectada en ratones deficientes enAtg7.Komatsu Met al.(2005) J Cell Biol. 169:425-434.
[0016]La autofagia degrada los orgánulos, las membranas celulares y las proteínas degradados. Se cree que el fallo de la autofagia es un factor importante en la acumulación de daño celular y, por lo tanto, el envejecimiento.
[0017]Pueden distinguirse tres tipos de autofagia, dependiendo de la ruta por la que se suministran los componentes celulares a los lisosomas: macroautofagia, microautofagia y autofagia mediada por chaperonas (CMA).
Macroautofagia
[0018]La macroautofagia implica la degradación de proteínas de larga vida y orgánulos celulares enteros a través de un proceso de múltiples etapas(Figura 1). La macroautofagia comienza con la formación de una membrana aislante de doble capa (fagóforo) alrededor de las moléculas y/u orgánulos a degradar. El fagóforo engulle los componentes citosólicos y sella alrededor del contenido, formando un autofagosoma. Finalmente, el autofagosoma se fusiona con un lisosoma, evolucionando hacia un autofagolisosoma (o autolisosoma), en donde las hidrolasas lisosómicas digieren la carga. La microautofagia implica el secuestro directo de componentes citosólicos a través de invaginaciones o proyecciones en forma de brazos de la membrana lisosómica. La microautofagia puede servir para la renovación de proteínas de larga vida; sin embargo, la importancia y la regulación de este tipo de autofagia siguen siendo poco conocidas. Finalmente, la autofagia mediada por chaperonas es un proceso altamente selectivo dedicado a la degradación de proteínas citosólicas solubles.
[0019]La proteína asociada a microtúbulos 1A/1B-cadena ligera 3 (LC3), un homólogo mamífero de la Atg8 de levadura, es una proteína soluble con una masa molecular de aproximadamente 17 kDa que se distribuye de forma ubicua en tejidos de mamíferos y células cultivadas. Se procesa inmediatamente después de su síntesis por Atg4B, una cisteína proteasa, que expone el resto de glicina C-terminal (LC3-I). Durante la autofagia, los autofagosomas engullen componentes citoplasmáticos, incluyendo proteínas citosólicas y orgánulos. Al mismo tiempo, una forma citosólica de LC3 (LC3-I) se conjuga con fosfatidiletanolamina (PE) para formar un conjugado LC3-PE (LC3-II), que se recluta por las membranas autofagosómicas(Figura 1).
[0020]p62, también conocido como secuestrasoma-1, se identificó como un compañero novedoso de la proteína quinasa Cs atípica (aPKCs) y es una proteína celular expresada de manera ubicua. Se sabe que p62 tiene dominios que interactúan y se unen a proteínas ubiquitinadas, y se ha identificado como un componente de los cuerpos de inclusión observados en enfermedades humanas, especialmente enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica) así como en enfermedades del hígado. p62 también se ha identificado como una proteína que interactúa con LC3 y se ha demostrado que una secuencia de 11 aminoácidos en la p62 de ratón sirve para reconocer la proteína LC3. Como se ve en la figura 1, LC3 se une a p62 y la transporta (y cualquier proteína ubiquitinada o componente celular unido a él) al autofagosoma, donde se degrada. En consecuencia, una de las características distintivas de la autofagia es un aumento en la proporción de LC3-II/LC3-I con una disminución concomitante en el nivel de p62 celular.
[0021]De los tres tipos de autofagia descritos, la macroautofagia es la mejor caracterizada en células de mamíferos. La inanición es el estímulo más fuerte de macroautofagia. Durante la privación de nutrientes, la macroautofagia descompone los componentes celulares, generando aminoácidos, ácidos grasos y carbohidratos, que pueden aprovecharse para la producción de energía y para la síntesis de moléculas celulares esenciales. La macroautofagia también está implicada en reordenamientos citosólicos específicos durante la embriogénesis y el desarrollo posnatal. Adicionalmente, la macroautofagia se induce durante infecciones víricas o bacterianas, en hipoxia y en diversas condiciones de estrés, incluyendo exposición a la radiación y aumento de la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS). En estas circunstancias, la macroautofagia es esencial para el mantenimiento de la homeostasis celular al promover la eliminación de componentes dañados. De hecho, las deficiencias en la macroautofagia inducen un envejecimiento prematuro y acortan la esperanza de vida de varios organismos, incluyendoC. elegans,levadura yDrosophila.Hars ESet al.(2007) Autophagy 3:93-95; Matecic Met al.(2010) PLoS Genet. 6:e1000921; Lee JHet al.(2010) Science 327:1223-1228. Por el contrario, se propone que la regulación positiva de la macroautofagia sea un mecanismo importante subyacente a las propiedades de la restricción calórica que prolongan la esperanza de vida. Toth MLet al.(2008) Autophagy 4:330-338; Morselli Eet al.(2010) Cell Death Dis. 1:e10.
[0022]Se han identificado más de 35 proteínas Atg (relacionadas con AuTofaGia) en levaduras y mamíferos; sin embargo, el papel preciso que desempeña cada proteína Atg durante la autofagia aún no está completamente establecido. Como se ilustra en laFigura 1,el proceso de macroautofagia puede dividirse en etapas discretas, en concreto, inducción y nucleación, expansión, fusión y degradación. La fase de inducción está mediada por el complejo ULK1-Atg13-FIP200 quinasa. La regulación de la fase de nucleación, que consiste en el reclutamiento de proteínas Atg al sitio de ensamblaje del fagóforo, aún no se comprende del todo. Sin embargo, para esta etapa se requiere la clasificación de proteína vacuolar-34 (Vps34), una fosfatidilinositol-3-quinasa de clase III (PI3K). Vps34 se asocia con Beclina1, el homólogo mamífero de Atg6 de levadura, y posteriormente recluta Atg14 y Vps15 (p150) en la estructura preautofagosómica. El alargamiento y la expansión de la membrana del fagóforo requieren dos sistemas de conjugación similares a la ubiquitina que implican Atg12 (conjugado con Atg5) y Atg8/cadena ligera-3 de la proteína 1 asociada a microtúbulos (LC3, conjugada con fosfatidiletanolamina), junto con otras proteínas Atg tales como Atg9 y Atg16. La fusión del autofagosoma con un lisosoma se basa en una maquinaria de fusión celular canónica que consiste en el sistema Rab-SNARE (receptor de proteína de unión al factor sensible a N-etilmaleimida soluble) y requiere la presencia de la proteína-2 asociada a la membrana lisosómica (LAMP-2) y el gen asociado a la resistencia a la radiación UV (UVRAG). Finalmente, la digestión de la carga se logra mediante hidrolasas lisosómicas, seguido del transporte de componentes degradados al citoplasma mediante transportadores de eflujo lisosómico tales como Atg22.
[0023]En cuanto a la regulación de la macroautofagia, mTOR, la diana de mamífero de la rapamicina, se considera un importante punto de control, vinculando el estado nutricional celular con el nivel de autofagia en curso. En condiciones ricas en nutrientes, mTOR está activo e inhibe el complejo ULK1-Atg13-FIP200 necesario para la inducción de la macroautofagia. La privación de energía conduce a la inactivación de mTOR y a la estimulación de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK), que ambos inducen macroautofagia. La AMPK funciona como una quinasa sensora de energía y se activa mediante aumentos en la proporción celular de AMP a ATP. En dichas circunstancias, AMPK promueve la autofagia activando directamente ULK1 y aliviando la inhibición de la macroautofagia mediada por mTOR.
[0024]La macroautofagia puede dirigirse selectivamente hacia la eliminación de dianas particulares, por ejemplo, peroxisomas (pexofagia), retículo endoplasmático (reticulofagia), lípidos intracelulares (lipofagia), ribosomas (ribofagia) y patógenos intracelulares (xenopatía). Igualmente, las mitocondrias pueden direccionarse selectivamente para su degradación a través de macroautofagia (mitofagia).
Mitofagia: Una forma especializada de macroautofagia
[0025]La mitofagia es un proceso altamente selectivo que puede promover la eliminación de mitocondrias disfuncionales o innecesarias. Wang Ket al.(2011) Autophagy 7:297-300. La pérdida del potencial de membrana mitocondrial (A^m) representa un importante desencadenante de la mitofagia. De hecho, el fotodaño inducido por láser de mitocondrias seleccionadas dentro de hepatocitos vivos da como resultado la rápida disipación de A^m, seguido de la rápida eliminación de las mitocondrias despolarizadas mediante mitofagia. Además, el daño oxidativo puede conducir a la formación de mitocondrias hijas asimétricas caracterizadas por diferentes A^m, direccionándose la autofagia específicamente a las mitocondrias con A^m más bajo. Además de la degradación de las mitocondrias dañadas en condiciones de estrés, la mitofagia es esencial para la renovación mitocondrial en el estado basal y durante la diferenciación celular, tal como la maduración de los reticulocitos a glóbulos rojos maduros.
[0026] Las investigaciones sobre la regulación molecular de la mitofagia han revelado varias proteínas específicas de la mitofagia. Se cree que Parkina y Pink1 desempeñan papeles importantes en la degradación selectiva de las mitocondrias dañadas, al menos bajo ciertas circunstancias. Parkina es una ubiquitina ligasa citosólica E3 que se recluta selectivamente en mitocondrias disfuncionales y ayuda a su eliminación mediante mitofagia. Narenda D (2008) J Cell Biol. 183:795-803. Pinkl se importa a las mitocondrias sanas a través de un proceso dependiente de A^m y se degrada por la proteasa de tipo romboide asociada a presenilina (PARL). Matsuda Net al.(2010) J Cell Biol. 189:211-221. La disipación de A^m da como resultado la acumulación de Pink1 en la superficie mitocondrial, dando lugar al reclutamiento de Parkina, que ubiquitina las proteínas de la membrana externa, incluyendo el canal aniónico dependiente de voltaje (VDAC). Se propone que las mitocondrias etiquetadas con ubiquitina se dirijan directamente a las vacuolas autofágicas a través de la interacción de proteínas ubiquitinadas con el marcador autofagosómico LC3 (Atg8). Además, Parkina puede ubiquitinar la membrana mitocondrial interna y la proteína reguladora de la apoptosis del linfoma de células B-2 (Bcl-2), desreprimiendo de esta manera a Beclina1.
[0027] La evidencia reciente también sugiere que puede ser necesaria la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial (mPTP) para la eliminación selectiva de las mitocondrias dañadas. La apertura del mPTP provoca un aumento repentino de la permeabilidad de la membrana interna a solutos con un peso molecular de hasta 1500 Da. Esto da como resultado despolarización mitocondrial, activación de la ATPasa mitocondrial (es decir, ATP sintasa que funciona a la inversa) e hinchazón y ruptura de la membrana externa. La pérdida de A^m posterior a la transición de permeabilidad tiene por objeto la degradación de las mitocondrias individuales. La ciclosporina A previene la pérdida de A^m y la activación de la macroautofagia, un inhibidor del componente mPTP ciclofilina D. Adicionalmente, la inanición no logra inducir macroautofagia en cardiomiocitos murinos deficientes en ciclofilina D, mientras que la autofagia aumenta incluso en condiciones de alimentación en células cardíacas de ratones que sobreexpresan ciclofilina D. La desacetilasa sirtuina-3 (SIRT3) dependiente de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) parece estar implicada de manera crítica en el control de mPTP mediante la modulación de ciclofilina D.
[0028] Similar al mPTP, se cree que las proteínas apoptóticas Bnip3 (Bcl-2 y proteína-3 que interactúa con el adenovirus E1B de 19 kDa) y Nix (proteína X similar a Nip3) desencadenan la mitofagia selectiva a través de la despolarización mitocondrial. Por otra parte, Bnip3 puede inducir mitofagia al alterar competitivamente la interacción inhibidora entre Bcl-2 y Beclina1. Finalmente, Nix se asocia con las membranas mitocondriales e interactúa directamente con LC3 (Atg8).
[0029] Aunque la regulación molecular de la mitofagia aún no se ha dilucidado por completo, se propone que la ruta mTOR/AMPK sea un punto de control importante. AMPK, además de estimular la eliminación mitocondrial mediante la autofagia, mejora la actividad de sirtuina-1 (SIRT1) y su diana posterior PGC-1a, dando como resultado la estimulación de la biogénesis mitocondrial. Por tanto, a través de la actividad de AMPK, la mitofagia y la biogénesis mitocondrial están reguladas de manera coordinada, manteniendo un conjunto saludable y funcional de mitocondrias en la célula.
[0030] La lipofagia es una ruta alternativa recientemente reconocida del metabolismo de los lípidos en la cual los autofagosomas absorben los triglicéridos y el colesterol de las gotitas de lípidos intracelulares y los suministran a los lisosomas para su degradación por las hidrolasas ácidas, liberando de esta manera ácidos grasos libres. La lipofagia, por lo tanto, funciona regulando reservas de lípidos intracelulares, niveles celulares de lípidos libres, tales como ácidos grasos, y homeostasis energética.
[0031] La xenofagia es un mecanismo de defensa recientemente reconocido contra diversos tipos de patógenos intracelulares, incluyendoMycobacterium tuberculosis, Salmonella typhimurium, Legionella pneumophila,especies deBrucella,especies deChlamydia, Coxiella burnetti, Listeria monocytogenes, Shigella flexneri,especies deRickettsia, Mycobacterium marinum,especies deBurkholderiayFrancisella tularensis.
[0032] La microautofagia implica que los lisosomas engullen directamente el citoplasma mediante invaginación, protrusión o tabicación de la membrana limitante lisosómica.
Autofagia mediada por chaperonas
[0033] La autofagia mediada por chaperonas (CMA) se refiere únicamente a aquellas proteínas que tienen una secuencia peptídica consenso que puede reconocerse por la unión de un complejo chaperona/cochaperona que contiene hsc70. El complejo<c>M<a>sustrato/chaperona se mueve después a los lisosomas, donde la proteína de membrana asociada al lisosoma tipo 2a (LAMP-2A) del receptor CMA la reconoce. La proteína se despliega y se transloca a través de la membrana lisosómica con la ayuda del hsc70 lisosómico del otro lado. Por lo tanto, los sustratos de CMA se translocan a través de la membrana lisosómica uno por uno, mientras que en la macroautofagia y la microautofagia los sustratos se engullen o se secuestran en masa. Por otra parte, CMA degrada solamente ciertas proteínas y no orgánulos.
Indicaciones terapéuticas ilustrativas para una autofagia aumentada
[0034] Los compuestos, las composiciones y los métodos de la invención pueden usarse para tratar y prevenir cualquiera de las siguientes indicaciones terapéuticas para la autofagia aumentada.
La autofagia protege a los organismos del estrés metabólico
[0035] La privación de nutrientes, el agotamiento del factor de crecimiento y la hipoxia pueden inducir estrés metabólico que conduce a la inducción de autofagia y a la generación de aminoácidos y ácidos grasos libres. Estos pueden reciclarse de forma autónoma desde las células y usarse para 1) síntesisde novode proteínas importantes en la respuesta al estrés, y 2) alimentar el ciclo de TCA para mantener la función del ATP. La importancia de este proceso queda demostrada en la incapacidad de ratones yC. eleganscon deficiencias en las proteínas ATG importantes para que la autofagia resista la inanición. Por lo tanto, un papel fundamental de la autofagia es la movilización de recursos energéticos intracelulares para satisfacer la demanda celular y del organismo de sustratos metabólicos.
Inducción de autofagia para el tratamiento del corazón
[0036] La función y la supervivencia de los cardiomiocitos dependen fundamentalmente de la presencia de niveles basales de autofagia de los cardiomiocitos. El reciclaje autofágico de componentes celulares dañados en condiciones ricas en nutrientes constituye un medio importante de control de calidad de proteínas y orgánulos, librando a la célula de proteínas defectuosas (por ejemplo, mal plegadas u oxidadas) y orgánulos disfuncionales. Este hecho se destaca por la observación de que la anulación de las rutas autofágicas en el corazón adulto mediante la inactivación condicional de cualquiera de los dos genesAtg5oAtg7desencadenan hipertrofia cardíaca de aparición rápida, dilatación del ventrículo izquierdo y gasto cardíaco disminuido.
[0037] La enfermedad de Danon, una afección marcada por miopatía grave y progresiva, se debe a una fusión defectuosa de autofagosomas con lisosomas. En el desarrollo cardíaco temprano, la alteración deAtg5provoca defectosin uteroy letalidad embrionaria. En el otro extremo del espectro de edades, las disminuciones relacionadas con la edad en la eficiencia del aclaramiento autofágico probablemente contribuyan a la acumulación progresiva de proteínas y orgánulos defectuosos que, en última instancia, conducen al deterioro funcional con el tiempo. El envejecimiento normal se asocia a la pérdida de la función cardíaca debido principalmente a una alteración de la relajación durante la diástole. Las distintas formulaciones de restricción calórica (CR) pueden prolongar la esperanza de vida y mejorar la función diastólica del VI; se cree que los mecanismos subyacentes son la inducción de la autofagia. Juntos, estos hechos resaltan el papel vital de la autofagia de cardiomiocitos como mecanismo de vigilancia y control de calidad de proteínas y orgánulos.
La autofagia puede mejorar la función del músculo esquelético en situaciones de atrofia muscular
[0038] El músculo esquelético adapta su capacidad a los niveles de carga y utilización. Un aspecto central de esta adaptación es la regulación de la remodelación de las fibras a través de la degeneración o regeneración de las fibras musculares.
[0039] En ausencia de actividad muscular, se produce atrofia muscular, dando como resultado una disminución de la capacidad muscular. Se ha demostrado que esta atrofia se produce debido al aumento de los niveles de estrés oxidativo en el músculo en desuso. La atenuación de este estrés oxidativo podría conducir a una disminución de la atrofia.
[0040] El proceso de autofagia y, en particular, la mitofagia, son importantes para eliminar las mitocondrias dañadas y reducir los efectos del aumento del estrés oxidativo sobre la capacidad funcional del músculo. Se ha demostrado que el fallo del proceso de autofagia es un factor importante que contribuye a la atrofia por desuso muscular, al fallar en la eliminación de las mitocondrias dañadas. Esta disminución en el recambio de las mitocondrias conduce a una acumulación de órganos disfuncionales y al consiguiente daño muscular.
Preservar la función de autofagia durante el envejecimiento puede mejorar la sarcopenia
[0041] La atrofia del músculo esquelético y la disminución de la fuerza muscular representan un problema de salud importante y pueden producirse como consecuencia de la inmovilización, el desuso, la lesión, la inanición y el envejecimiento. En particular, la edad avanzada va inevitablemente acompañada de la pérdida de masa muscular y fuerza. Esta afección, conocida como sarcopenia del envejecimiento, tiene efectos significativos en la salud individual e impacta la gravedad de la fragilidad. Por otra parte, la falta de fuerza muscular predice en gran medida la discapacidad y la mortalidad, y la debilidad general a menudo da como resultado la pérdida de la vida independiente, afectando de esta manera a la calidad de vida individual e imponiendo una elevada carga al gasto sanitario. Aparte del envejecimiento, el músculo esquelético puede sufrir una atrofia significativa después de su desuso.
[0042] La sarcopenia se caracteriza por una pérdida gradual de proteínas musculares. El tamaño de los tejidos posmitóticos estables, tales como los músculos esqueléticos y cardíacos, está regulado por la renovación de proteínas, y el músculo esquelético está influenciado por un equilibrio entre la síntesis y la degradación de proteínas y la renovación de proteínas contráctiles. Un factor clave que influye en el desarrollo de la sarcopenia es el desequilibrio entre las tasas de síntesis y degradación de proteínas. La degradación de proteínas en las células del músculo esquelético está mediada esencialmente por la actividad de dos rutas altamente conservadas: la ruta lisosómica autofágica y la ruta ubiquitina-proteasoma.
[0043] Los estudios recientes han demostrado que la autofagia alterada que se observa en los músculos nulos ATG7 se caracteriza por atrofia muscular, debilidad y características de degeneración de miofibras. En consecuencia, se ha descubierto que la autofagia es esencial para el mantenimiento de las miofibras y para la eliminación de proteínas dañadas y orgánulos alterados.
[0044] La autofagia, que se activa cuando el músculo esquelético está bajo estrés nutricional (tal como estrés metabólico), juega un papel en la condición catabólica y en la degradación de macromoléculas y orgánulos. Las rutas catabólicas se aceleran durante el ejercicio para suministrar energía y sustratos al músculo para la continuación de las contracciones. Se ha establecido bien que las tasas de oxidación de aminoácidos (relativamente pequeñas) y de glucosa aumentan durante el ejercicio de resistencia, y es probable que se requiera un mayor consumo de energía para inducir la autofagia. Se ha demostrado que la autofagia es necesaria para el mantenimiento de las miofibras y para la eliminación de proteínas dañadas y orgánulos alterados.
[0045] Se ha demostrado que el ejercicio suave mejora la función muscular y disminuye la disminución de la función muscular observada en la sarcopenia. Estos beneficios positivos se deben, al menos en parte, a una mejora inducida por el ejercicio en el proceso de autofagia. En ratones en envejecimiento, las proteínas de autofagia LC3-II, Beclina-1, ATG7 y MuRF-1 disminuyen significativamente con la edad en el músculo. Sin embargo, los ratones sometidos a un régimen de entrenamiento durante el proceso de envejecimiento muestran una disminución significativamente atenuada en estas proteínas de autofagia. En mujeres más mayores con sobrepeso, se ha demostrado que el ejercicio suave aumenta los niveles de transcripción de los reguladores de autofagia LCB3, Atg7 y LAMP-2 y mejoran por lo tanto el proceso de autofagia. Por lo tanto, la preservación de la autofagia puede desempeñar un papel importante en la homeostasis de los miocitos esqueléticos y el recambio mitocondrial óptimo en el músculo envejecido.
[0046] Se ha demostrado una atenuación de la autofagia relacionada con la edad que da como resultado una eficiencia disminuida de la degradación de proteínas y la eliminación de orgánulos dañados. Se ha considerado responsable una disminución de la actividad proteolítica, al menos en parte, para la acumulación de componentes celulares dañados en casi todos los tejidos de organismos que envejecen.
Mejorar la autofagia como diana terapéutica para las enfermedades degenerativas musculares
[0047] Las distrofias musculares son un grupo de enfermedades genéticas musculares hereditarias caracterizadas por defectos en las proteínas musculares. Estos defectos provocan un daño progresivo del músculo esquelético acompañado de necrosis de las miofibras e inflamación local crónica, lo que lleva a la sustitución de miofibras por tejido conectivo y adiposo. En la Distrofia muscular de Duchenne (DMD), la forma más grave de estas enfermedades, el daño continuo y progresivo del músculo esquelético conduce a la parálisis completa y la muerte de los pacientes, habitualmente por insuficiencia respiratoria y/o cardíaca.
[0048] Los protocolos terapéuticos actualmente en uso, basados en la administración de corticosteroides, proporcionan cierto retraso en la progresión de la enfermedad, pero están asociados a efectos secundarios graves. Por lo tanto, se están buscando activamente terapias que sustituyan a los corticosteroides o que al menos puedan actuar como fármacos ahorradores de corticosteroides, y se exploran los mecanismos biológicos relevantes para la homeostasis del músculo esquelético, para identificar nuevas dianas.
[0049] La autofagia está emergiendo como un proceso importante que limita el daño muscular. La inhibición/alteración de la autofagia contribuye a la degeneración de las miofibras que conduce a la acumulación de orgánulos anormales. Las mutaciones que inactivan Jumpy, una fosfatasa que contrarresta la activación de VPS34 para la formación de autofagosomas y reduce la autofagia, se asocian a una miopatía centronuclear. Esta observación sugiere que la autofagia desequilibrada es patógena en la degeneración muscular. Igualmente, la hiperactivación de Akt como consecuencia de la eliminación específica del músculo de la diana de mamíferos de la rapamicina (mTOR) conduce a la inhibición de la autofagia y a un fenotipo muscular similar al observado en la distrofia muscular. La validez de la modulación de la autofagia como estrategia terapéutica se ha demostrado en un modelo de ratón con miopatía de Ulrich caracterizada por autofagia defectuosa y acumulación de orgánulos disfuncionales. La reactivación forzada de la autofagia en estos animales produjo una respuesta terapéutica beneficiosa.
[0050] Los análisisin vivoyex vivohan demostrado que la autofagia es defectuosa tanto en la distrofia muscular humana (DMD) como de ratón(mdx)y que dicho defecto contribuye a la patogénesis de la enfermedad. Se ha demostrado que las biopsias musculares de pacientes con DMD tienen niveles significativamente más bajos de LC3 II y una acumulación significativa de p62, una proteína que se sabe que se incorpora a los autofagosomas y se degrada eficientemente, con respecto a los tejidos de individuos control no afectados.
[0051] Se ha demostrado en ratones que una dieta baja en proteínas conduce a una inducción prolongada de la autofagia. En ratones con DMD alimentados con una dieta baja en proteínas, una inducción de autofagia conduce a una mejora y gestión de la progresión de la enfermedad. Se han observado mejoras significativas en la función muscular con una mejora de la tensión de todo el cuerpo, fibrosis muscular reducida, disposición de colágeno disminuida, acumulación de orgánulos dañados reducida y apoptosis de las fibras musculares reducida.
[0052] Esto demuestra que la inducción de la autofagia es un mecanismo homeostático importante que se altera en los músculos distróficos e indica que nuevos enfoques terapéuticos destinados a reactivar la autofagia pueden servir como una estrategia valiosa para reducir el daño muscular en la DMD.
La autofagia protege al hígado del estrés oxidativo y las enfermedades
[0053] Durante enfermedades hepáticas tales como cáncer y cirrosis, el hígado puede someterse a hipoxia tisular. Se ha demostrado que este proceso induce un proceso de autofagia, que, si se inhibía, daba como resultado un aumento de la apoptosis de las células hepáticas.
[0054] En la deficiencia de a1-antitripsina, la causa genética más común de enfermedad hepática humana, hay una inflamación crónica significativa y una carcinogénesis final. En esta enfermedad, se produce una mutación puntual en la a1-antitripsina Z (ATZ) que conduce a plegamiento y acumulación inadecuados de agregados. La eliminación de ATG5 en líneas celulares hepáticas conduce a una acumulación de la proteína ATZ mutante, demostrando el importante papel de la autofagia en la reducción del impacto de la enfermedad hepática.
La autofagia es importante para limitar la lesión por reperfusión isquémica
[0055] Con el avance de la edad, los pacientes tienen más probabilidades de adquirir neoplasias malignas hepáticas primarias y secundarias que son susceptibles de resección quirúrgica y trasplante. Aunque los pacientes de edad avanzada pueden ser tratados quirúrgicamente, el hígado envejecido tiene una capacidad reparadora significativamente disminuida después de la isquemia y la lesión por reperfusión asociada a estas operaciones.
[0056] El precondicionamiento isquémico es la única estrategia prometedora para mejorar el resultado de la cirugía hepática, pero sus efectos beneficiosos se limitan a los pacientes jóvenes. Hasta la fecha, ninguna estrategia terapéutica puede suprimir la isquemia y la lesión por reperfusión dependientes de la edad.
[0057] Se ha observado una reducción de la autofagia en las células viejas sometidas a un estrés grave tal como isquemia seguida de reperfusión. Los estudios han demostrado que mediante la sobreexpresión de genes de autofagia en hígados envejecidos de ratones, la autofagia aumentó y la supervivencia de las células de hepatocitos aumentó después de la isquemia y la reperfusión. En consecuencia, se ha demostrado que la autofagia defectuosa es un mecanismo causal de la lesión por reperfusión hepática dependiente de la edad y se ha demostrado que la mejora de la autofagia ofrece un beneficio terapéutico y reduce la lesión por isquemia-reperfusión hepática mediada por la edad.
Autofagia en células epiteliales intestinales como diana terapéutica
[0058] El epitelio intestinal interactúa directamente con una comunidad diversa de bacterias que incluye comensales benignos, patógenos oportunistas y patógenos manifiestos y, en consecuencia, es la primera línea de defensa contra la invasión bacteriana de los tejidos del hospedador. Uno de los medios que emplean las células epiteliales para defenderse incluye la secreción de proteínas antimicrobianas. Desafortunadamente, hay algunos patógenos intestinales, incluyendoSalmonella tyhpimuriumo bacterias comensales oportunistamente invasivas, tales comoEnterococcus faecalis,que pueden evitar esta primera línea de defensa y entrar en las células epiteliales.
[0059] Se ha demostrado que la autofagia es esencial para el reconocimiento y la degradación de patógenos intracelulares, actuando como una barrera innata contra la infección. En el cultivo celular, se ha demostrado que la autofagia limita la replicación de ciertas especies bacterianas.
[0060] Se ha demostrado mediante estudios genéticos de la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) que la autofagia juega un papel importante en la homeostasis inmunitaria intestinal. La IBD es una enfermedad inflamatoria crónica del intestino que surge de interacciones desreguladas con la microbiota residente.
[0061] Recientemente, se ha demostrado que los polimorfismos en genes de la ruta autofágica están relacionados con la enfermedad de Crohn (EC). La enfermedad de Crohn es una forma crónica de IBD que puede afectar cualquier parte del sistema gastrointestinal, pero generalmente se encuentra en el colon o el íleon terminal. El inicio promedio es a los 27 años en seres humanos y generalmente está presente durante toda la vida normal del individuo. Se caracteriza por colitis grave, estenosis y fístulas perianales, normalmente requiriendo cirugía.
[0062] El proceso inflamatorio crónico característico de la EC requiere una interacción intensiva entre las células epiteliales intestinales y las células inmunitarias competentes. En la EC, hay una respuesta inmunitaria exagerada a la microbiota intestinal, caracterizada por un aumento anormal de las células Th17, que desempeñan un papel importante en la autoinmunidad y una regulación negativa de las células Treg importantes para controlar la respuesta inmunitaria.
[0063] Recientemente se ha demostrado que la autofagia de las células epiteliales intestinales es esencial para la defensa intestinal de los mamíferos contra bacterias invasoras. La autofagia en las células epiteliales protege contra la diseminación de bacterias invasoras. Después de una infección oral con el patógeno invasorSalmonella typhimuriumasí comoEnterococcus faecalis,las células epiteliales de ratón activan la autofagia como consecuencia de la exposición a estos patógenos. También se demostró que la autofagia es fundamental para limitar la propagación extraintestinal de S.typhimurium.Esto indica que la autofagia es un mecanismo clave de defensa antibacteriana autónomo de las células epiteliales que protege contra la diseminación de bacterias intestinales.
La autofagia es importante en el envejecimiento del músculo cardíaco
[0064] Los efectos de la inducción de la autofagia en la mejora de los resultados de la lesión isquémica y el mantenimiento de los músculos la hacen especialmente relevante para el mantenimiento del músculo cardíaco y la protección contra lesiones. El músculo cardíaco se somete a una disminución progresiva de la función mitocondrial, similar a la observada en el músculo esquelético, dando como resultado un aumento en las especies reactivas de oxígeno, así como un aumento en la acumulación de orgánulos defectuosos. La eliminación de estos orgánulos dañados mediante autofagia es importante para el mantenimiento de la función del músculo cardíaco. Ya que la autofagia disminuye con la edad, promover la autofagia puede servir para proteger la función del músculo cardíaco.
[0065] El músculo cardíaco también está fuertemente expuesto a episodios isquémicos durante los infartos cardíacos. El nivel de daño del músculo cardíaco que producen estos episodios isquémicos depende en gran medida de la capacidad de las células para generar una respuesta de autofagia eficaz para limpiar los orgánulos dañados. En los animales envejecidos, una respuesta de autofagia defectuosa conduce a un aumento del daño del músculo cardíaco después de eventos isquémicos. Por lo tanto, la promoción de la autofagia durante estos eventos agudos podría servir para proteger el músculo cardíaco del daño.
La autofagia es importante en el proceso inflamatorio
[0066] Debido al papel de la autofagia en la limpieza de orgánulos defectuosos, un defecto en este proceso conduce a una acumulación de desechos celulares y a la inducción de apoptosis. La autofagia también juega un papel importante en la defensa del organismo contra patógenos microbianos al inducir su degradación. Adicionalmente, la autofagia juega un papel importante en los eventos de tráfico que activan la inmunidad innata y adaptativa.
[0067] La eliminación autofágica de cadáveres apoptóticos es fundamental para prevenir señales de peligro que podrían provocar una respuesta inflamatoria. En una respuesta de autofagia deteriorada, cuando la eliminación apoptótica no es eficiente, la inducción resultante de inflamación podría superar la tolerancia a los autoantígenos que conducen a enfermedades autoinmunitarias tales como el lupus eritematoso sistémico. Por lo tanto, la inducción de la autofagia podría servir para disminuir las respuestas inflamatorias y el desarrollo de enfermedades autoinmunitarias.
Aplicaciones de la autofagia para el tratamiento de trastornos del hígado
[0068] Varias características de los hepatocitos y del hígado en su conjunto hacen que este órgano sea particularmente dependiente de la autofagia. El hígado es bastante único en sus propiedades regenerativas ya que, si bien los hepatocitos normalmente se encuentran en un estado quiescente, conservan la capacidad de ingresar rápidamente al ciclo celular cuando hay una pérdida de tejido hepático debido a una lesión o extirpación quirúrgica. La falta de renovación celular hace que los hepatocitos sean particularmente vulnerables a los efectos de la autofagia deteriorada, ya que las células que tienen vidas largas acumulan altos niveles de orgánulos dañados, agregados de proteínas, etc. que normalmente se eliminan mediante autofagia. Esto da lugar a una lesión celular y potencialmente a una transformación.
Metabolismo de lípidos hepatocelulares
[0069] El hígado sirve como el segundo depósito más grande de lípidos almacenados en el cuerpo después del tejido adiposo. Los hepatocitos son un importante almacén celular de lípidos neutros en forma de triglicéridos (TG) y ésteres de colesterol contenidos en orgánulos especializados denominados gotitas de lípidos (LD). La autofagia media la descomposición de las reservas intracelulares de LD mediante el proceso de lipofagia. Esto permite a los hepatocitos movilizar rápidamente sus reservas de lípidos en momentos de necesidad metabólica. La pérdida de la autofagia de los hepatocitos conduce a un marcado aumento del contenido de TG y colesterol hepáticos, lo que indica que la lipofagia limita la acumulación de lípidos en el hígadoin vivo.También, la lipofagia controla la homeostasis de la energía celular al proporcionar ácidos grasos libres (FFA) procedentes de la descomposición de los TG, que posteriormente impulsa la p-oxidación mitocondrial y la generación de ATP celular. Se ha demostrado que la proteína autofagosómica LC3, crucial para la formación de la membrana del autofagosoma, se asocia a las LD.
La autofagia protege contra las enfermedades hepáticas
[0070]La deficiencia de SERPINA1/a1-antitripsina (ATD) es la causa genética más común de enfermedad hepática humana en niños. Esta enfermedad está provocada por la homocigosidad del alelo SERPINA1/a1-antitripsina Z SERPINA1-Z, una mutación puntual, lo que hace que la glucoproteína secretora hepática SERPINA1 sea propensa a plegarse mal, polimerización y agregación. La proteína SERPINA1-Z mutante se acumula en los hepatocitos y los niveles de SERPINA1 que se encuentran en la sangre y los fluidos corporales se reducen al 10-15 % de los observados normalmente. La acumulación del mutante SERPINA1-Z en el retículo endoplásmico (RE) de los hepatocitos provoca daño hepático por ganancia de función. Se ha demostrado que la degradación intracelular de agregados y polímeros de SERPINA1-Z implica la ruta autofágica.
[0071]El fármaco carbamazepina, conocido por inducir autofagia, se demostró recientemente que es eficaz en modelos celulares y de ratón de ATD. La carbamazepina aumenta la degradación autofágica de SERPINA1-Z en células cultivadas y cuando se administra por vía oral al modelo de ratón PiZ de ATD, redujo la carga hepática de SERPINA1-Z. Adicionalmente, la inducción de autofagia redujo la fibrosis hepática. En consecuencia, los fármacos que mejoran la autofagia son candidatos atractivos para mejorar la enfermedad hepática que se desarrolla en algunos pacientes con ATD.
La autofagia protege contra la enfermedad del hígado graso no alcohólico
[0072]La enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) es un componente importante del síndrome metabólico junto con la obesidad y la diabetes. NAFLD abarca un espectro de anomalías hepáticas que van desde hígado graso sencillo o esteatosis, al hígado graso con lesión hepatocelular e inflamación, que se conoce como esteatohepatitis no alcohólica (NASH). NAFLD es actualmente la enfermedad hepática más prevalente en EE.UU. y representa aproximadamente el 75 % de todas las enfermedades hepáticas crónicas.
[0073]El papel más importante de la autofagia en la enfermedad del hígado graso podría ser regular el proceso de acumulación excesiva de lípidos. De hecho, ratones con una desactivación específica de hepatocitos de Atg7, una proteína necesaria para la autofagia, que consumen una dieta alta en grasas provocó un marcado aumento de los TG del hígado y del contenido de colesterol, demostrando que los defectos de la autofagia pueden inducir esteatosis hepática. Al considerar NASH, si bien se desconocen sus causas exactas, la lipotoxicidad inducida por ácidos grasos libres (FFA) se ha implicado en los mecanismos de lesión hepatocelular de esta enfermedad. La evidencia apunta al hecho de que la autofagia de los hepatocitos hace que las células sean más resistentes a las lesiones de los FFA.
[0074]La autofagia es una diana terapéutica atractiva para el tratamiento y la prevención tanto de NAFLD como de NASH. La intervención terapéutica para aumentar la autofagia puede revertir no sólo las manifestaciones hepáticas de NAFLD, incluyendo esteatosis hepatocelular y lesión, sino también algunas de las anomalías metabólicas subyacentes de la enfermedad a través de sus efectos sobre la resistencia a la insulina. Adicionalmente, el tratamiento mediante el aumento de la autofagia puede prevenir las complicaciones comunes en la fase terminal de NAFLD, tales como carcinoma hepatocelular.
La autofagia protege contra la enfermedad hepática alcohólica
[0075]La enfermedad hepática alcohólica (ALD) es una de las principales causas de enfermedad hepática crónica y, al igual que NAFLD, tiene un amplio espectro de características patogénicas, que van desde esteatosis hasta hepatitis alcohólica aguda grave, fibrosis, cirrosis y carcinoma hepatocelular.
[0076]Se ha demostrado que la autofagia desempeña un papel en el tratamiento de la ALD. Por ejemplo, la inducción de autofagia mediante la administración de rapamicina suprime significativamente la esteatosis aguda inducida por alcohol. También, una característica común del abuso crónico de alcohol es la formación de agregados de proteínas hepáticas conocidos como cuerpos de Mallory-Denk, que son cuerpos de inclusión citosólicos enriquecidos con Krt8/queratina 8 y Krt18 y proteínas que incluyen ubiquitina. El tratamiento con rapamicina reduce significativamente la cantidad de cuerpos de Mallory-Denk en ratones transgénicos KRT8 tratados con inhibidores del proteasoma.
[0077]En consecuencia, mejorar la autofagia hepática es una diana atractiva para mejorar la enfermedad hepática inducida por el alcohol.
La autofagia protege contra la lesión hepática inducida por fármacos
[0078]La mayoría de los fármacos se metabolizan y se detoxifican en el hígado, convirtiendo al hígado en la principal diana del daño farmacológico. La lesión hepática debida a fármacos es una causa común de retirada de fármacos aprobados en el mercado, y se cree que la hepatotoxicidad inducida por fármacos es responsable de más de la mitad de los casos agudos de insuficiencia hepática. El acetaminofeno, también conocido como paracetamol y N-acetil-paminofenol (APAP), es un fármaco antipirético y analgésico ampliamente usado y también es la fuente más común de hepatotoxicidad grave inducida por fármacos. A niveles terapéuticos APAP es seguro, pero la sobredosis produce toxicidad principalmente debido a su metabolito reactivo, N-acetil-p-benzoquinona imina (NAPQI). NAPQI puede agotar las reservas hepáticas de glutatión (GSH), un antioxidante intracelular. Tras el agotamiento de GSH, se sabe que NAPQI reacciona con proteínas celulares y mitocondriales para formar aductos proteicos. Estos aductos de proteínas mitocondriales inducidos por APAP pueden provocar daño mitocondrial y posterior necrosis.
[0079]Cuando la autofagia se mejora con rapamicina, la necrosis inducida por APAP se inhibe significativamente, tanto en hepatocitos primarios cultivados como en los hígados de ratones. Se ha observado que el tratamiento con rapamicina dos horas después de la administración de APAP mejora significativamente la lesión hepática inducida por APAP, a pesar de que ya se han producido el metabolismo de APAP y el agotamiento de GSH hepático. Esto es particularmente importante ya que los pacientes con riesgo de hepatotoxicidad por una sobredosis aguda de APAP no reciben atención médica hasta que hayan pasado la fase metabólica. En consecuencia, la intervención farmacológica dirigida a mejorar la autofagia tiene un beneficio terapéutico potencial para personas con riesgo de hepatotoxicidad por APAP después de una sobredosis.
La autofagia es importante para limitar la isquemia/lesión por reperfusión
[0080]La lesión por isquemia/reperfusión (I/R) es un factor causal que contribuye a la morbilidad y la mortalidad. La vulnerabilidad del hígado a la lesión I/R es un obstáculo importante para la resección hepática y la cirugía de trasplante, donde la reperfusión después de una isquemia sostenida es inevitable durante la hepatectomía y la reconstrucción vascular. Se sabe que la disfunción mitocondrial es uno de los eventos críticos posteriores que conducen a la muerte celular mediada por I/R.
[0081]La autofagia elimina las mitocondrias anormales o disfuncionales para garantizar una función celular y una supervivencia óptimas. Con mitofagia deteriorada o insuficiente, las células acumulan mitocondrias dañadas, lo que posteriormente conduce a la formación incontrolada de ROS, mutación del ADN mitocondrial, fallo energético y, en última instancia, muerte celular. En consecuencia, la incapacidad de la mitofagia para eliminar una pequeña cantidad de mitocondrias dañadas durante la I/R puede tener un impacto significativo en la función y la viabilidad hepatocelulares. La mitofagia es esencial para la función hepática y la supervivencia después de una lesión I/R.
[0082]Si bien minimizar las lesiones de I/R juega un papel importante en el resultado de los hígados jóvenes trasplantados, los hígados envejecidos son aún más susceptibles al impacto negativo de la lesión por I/R. En el caso de hígados envejecidos, los hepatocitos no responden al estrés I/R y regulan positivamente su respuesta de autofagia protectora endógena. De forma similar a los hígados jóvenes después de una isquemia prolongada, los hígados envejecidos después de una isquemia a corto plazo acumulan mitocondrias disfuncionales, se someten a una transición de permeabilidad mitocondrial y pierden su viabilidad poco después de la reperfusión.
[0083]Los métodos para mejorar la autofagia, incluyendo el agotamiento de nutrientes previo a la isquemia y la sobreexpresión de genes proautofagia ATG7 o BECN1, conducen a la supresión de la transición de la permeabilidad mitocondrial y aumenta la supervivencia de los hepatocitos después de la reperfusión.
[0084]Esto indica que los tratamientos con agentes que inducen la autofagia en el hígado ofrecerán protección durante una situación de I/R y ayudarán a minimizar el daño celular. Dichos tratamientos son aplicables en situaciones de trasplante de hígados tanto jóvenes como viejos. Los tratamientos pueden implicar: (i) tratamientos previos del tejido hepáticoex vivopor perfusión del hígado con una solución que contiene un inductor de autofagia; (ii) tratamiento del donante de hígado con un inductor de autofagia; o (iii) tratamiento del receptor de hígado antes de, durante la operación y/o inmediatamente después de la intervención quirúrgica. Por supuesto, estas modalidades de tratamiento pueden aplicarse individualmente o en cualquier combinación (por ejemplo: 1 y 2; 2 y 3; 1 y 3; 1,2 y 3).
Autofagia y osteoartritis
[0085]La osteoartritis (OA) es la patología articular relacionada con el envejecimiento más común y se caracteriza por la degradación de la matriz extracelular (ECM) del cartílago y la reducción de la celularidad del cartílago. Los cambios en el cartílago articular parecen ser críticos en el inicio y la progresión de la OA. Los condrocitos son la única población celular del cartílago articular adulto. La capacidad de los condrocitos articulares adultos de regenerar la arquitectura normal de la matriz del cartílago es limitada y disminuye con el envejecimiento, debido a la muerte celular y la capacidad de respuesta anormal a los estímulos anabólicos. El cartílago articular se caracteriza por una tasa muy baja de recambio celular y se ha demostrado que la autofagia juega un papel importante en la función y la supervivencia celulares de los condrocitos. De hecho, la autofagia es un proceso constitutivamente activo y protector para el mantenimiento de la homeostasis del cartílago. Los estudios han demostrado tanto en el envejecimiento de las articulaciones como en la OA en humanos y en ratones que existe una reducción en la expresión de los reguladores de la autofagia, lo que fue acompañado por un aumento en la apoptosis de los condrocitos. Se cree que la autofagia comprometida contribuye al desarrollo de la OA. Se ha demostrado que el tratamiento con el compuesto rapamicina, un conocido inductor de la autofagia, ha sido capaz de aumentar la activación de LC3 en el cartílago en un modelo animal de OA y, en consecuencia, reducir la gravedad de la degradación del cartílago articular.
Síndrome metabólico, diabetes y obesidad
[0086] Los compuestos y los métodos de la invención son útiles en el tratamiento y la prevención del síndrome metabólico, la diabetes mellitus tipo 2 y la obesidad. Como se usa en el presente documento, la expresión "síndrome metabólico" se refiere a una combinación de trastornos médicos que, cuando se producen juntos, aumentan el riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares y diabetes. Afecta a una de cada cinco personas en los Estados Unidos y la prevalencia aumenta con la edad. Algunos estudios han demostrado que la prevalencia en los Estados Unidos se estima en el 25 % de la población. De acuerdo con la definición mundial de consenso de la Fundación Internacional de Diabetes (2006), el síndrome metabólico es la obesidad central más dos cualesquiera de los siguientes:
• Triglicéridos elevados: > 150 mg/dl (1,7 mmol/l) o tratamiento específico para esta anormalidad lipídica;
• Colesterol HDL reducido: < 40 mg/dl (1,03 mmol/l) en hombres, < 50 mg/dl (1,29 mmol/l) en mujeres o tratamiento específico para esta anomalía lipídica;
• Presión arterial elevada: PS sistólica > 130 o PS diastólica >85 mm Hg o tratamiento de hipertensión previamente diagnosticada; y
• Glucosa plasmática en ayunas elevada: (FPG)>100 mg/dl (5,6 mmol/l) o diabetes tipo 2 previamente diagnosticada.
Autofagia y enfermedades neurodegenerativas
[0087] En las enfermedades neurodegenerativas, el tejido cerebral acumula autofagosomas, demostrando un aumento en la autofagia, que en organismos modelo ha demostrado tener un efecto protector. Desempeña un papel importante en la eliminación de las proteínas mal plegadas que se acumulan como resultado de varias enfermedades neurodegenerativas. Estas incluyen proteínas que tienen repeticiones poliQ como se observa en la enfermedad de Huntington y la ataxia espinocerebelosa, a-sinucleínas mutantes implicadas en el Parkinson así como en los agregados de tau.
[0088] La atenuación de genes ATG importantes en la autofagia enC. elegansdio como resultado una formación de agregados aumentada y toxicidad de las proteínas PolyQ. En la enfermedad de Alzheimer el proceso de autofagia se ve afectado como resultado de un defecto en la maduración autofagosómica que podría ser una razón importante para la acumulación de agregados. Por el contrario, la inducción de autofagia por rapamicina en modelos de enfermedad poliQ tanto enDrosophilacomo en ratones protegió a estos animales de la neurotoxicidad. Estos resultados demuestran que la inducción de autofagia puede tener un papel protector en las células neuronales contra la neurodegeneración.
[0089] El desarrollo de enfermedades neurodegenerativas en pacientes implica que la autofagia puede alcanzar un punto de saturación en el cual se excede la capacidad de degradar agregados de proteínas mutantes. Por lo tanto, la promoción de la autofagia podría ayudar a retrasar la aparición de la enfermedad de neurodegeneración.
Trastorno cognitivo
[0090] Los compuestos y los métodos de la invención son útiles para tratar un trastorno cognitivo. Como se usa en el presente documento, un trastorno cognitivo se refiere a cualquier afección que afecte la función cognitiva. En una realización, "trastorno cognitivo" se refiere a uno cualquiera o más de delirio, demencia, trastorno del aprendizaje, trastorno por déficit de atención (TDA) y trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH). En una realización, el trastorno cognitivo es un trastorno del aprendizaje. En una realización, el trastorno cognitivo es el trastorno por déficit de atención (TDA). En una realización, el trastorno cognitivo es el trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDa H).
[0091] Los compuestos y los métodos de la invención son útiles para mejorar la función cognitiva, incluso en ausencia de un trastorno cognitivo. Como se usa en el presente documento, "función cognitiva" se refiere a cualquier proceso mental que implica operaciones simbólicas, por ejemplo, percepción, memoria, atención, comprensión del habla, generación del habla, comprensión lectora, creación de imágenes, aprendizaje y razonamiento. En una realización, "función cognitiva" se refiere a uno cualquiera o más de percepción, memoria, atención y razonamiento. En una realización, "función cognitiva" se refiere a memoria.
[0092] Los métodos para medir la función cognitiva son bien conocidos y pueden incluir, por ejemplo, pruebas individuales o en batería para cualquier aspecto de la función cognitiva. Una de esas pruebas es la prueba de función cognitiva de Prudhoe. Margallo-Lanaet al.(2003) J Intellect Disability Res. 47:488-492. Otra prueba de este tipo es el Mini Examen del Estado Mental (MMSE), que está diseñado para evaluar orientación en tiempo y lugar, registro, atención y cálculo, recuerdo, uso y comprensión del lenguaje, repetición y comandos complejos. Folsteinet al.(1975) J Psych Res. 12:189-198. Otras pruebas útiles para medir la función cognitiva incluyen la Escala de Evaluación Cognitiva de la Enfermedad de Alzheimer (ADAS-Cog) (Rosenet al.(1984) Am J Psychiatry. 141(11):1356-64) y la Batería Automatizada de Pruebas Neuropsicológicas de Cambridge (CANTAB) (Robbinset al.(1994) Dementia.
5(5):266-81). Dichas pruebas pueden usarse para evaluar la función cognitiva de manera objetiva, de tal manera que los cambios en la función cognitiva, por ejemplo, en respuesta al tratamiento de acuerdo con los métodos de la invención, pueden medirse y compararse.
Mal plegamiento y agregación de proteínas
[0093] Estas enfermedades y trastornos, que se denominan colectivamente en el presente documento "enfermedades relacionadas con el amiloide", se dividen en dos categorías principales: (a) aquellos que afectan al cerebro y otras partes del sistema nervioso central; y (b) aquellos que afectan a otros órganos o tejidos del cuerpo.
[0094] En las dos secciones siguientes se enumeran ejemplos de enfermedades relacionadas con el amiloide que se incluyen en estas dos secciones; sin embargo, se conocen muchos otros ejemplos de enfermedades raras hereditarias relacionadas con el amiloide que no se incluyen aquí y es probable que en el futuro se descubran formas adicionales de enfermedades relacionadas con el amiloide.
Enfermedades neurodegenerativas asociadas a la amiloidosis
[0095] Muchas enfermedades neurodegenerativas diferentes están asociadas al plegamiento incorrecto y la agregación de una proteína o péptido específico en una parte particular del cerebro o en otra parte del sistema nervioso central, dependiendo de la enfermedad específica. A continuación se muestran ejemplos de tales enfermedades.
[0096] Diversas formas de la enfermedad de Alzheimer (EA), así como del síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis (HCHWA, tipo holandés), angiopatía amiloide cerebral y posiblemente también deterioro cognitivo leve y otras formas de demencia están asociados a la agregación de un péptido de 40/42 restos llamado pamiloide, Ap(1-40) o Ap(1-42), que forma fibras y placas amiloides insolubles en la corteza cerebral, el hipocampo o en cualquier otra parte del cerebro, dependiendo de la enfermedad específica. La enfermedad de Alzheimer también se asocia a la formación de ovillos neurofibrilares por agregación de una proteína hiperfosforilada llamada tau, que también se produce en la demencia frontotemporal (enfermedad de Pick).
[0097] La enfermedad de Parkinson (EP), la demencia con cuerpos de Lewy (DLB) y la atrofia multisistémica (MSA) están asociadas a la agregación de una proteína llamada a-sinucleína, lo que da como resultado la formación de inclusiones insolubles llamadas cuerpos de Lewy. La enfermedad de Huntington (EH), la atrofia muscular espinal y bulbar (SBMA, también conocida como enfermedad de Kennedy), la atrofia dentatorubral-palidoluisiana (DRPLA), diferentes formas de ataxia espinocerebelosa (SCA, tipos 1, 2, 3, 6 y 7) y posiblemente varias otras enfermedades neurodegenerativas hereditarias están asociadas a la agregación de diversas proteínas y péptidos que contienen repeticiones de glutamina anormalmente expandidas (tractos extendidos de poliglutamina). La enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD), encefalopatía espongiforme bovina (EEB) en vacas, scrapie en ovejas, kuru, enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS), el insomnio familiar fatal y posiblemente todas las demás formas de encefalopatía transmisible se asocian al plegamiento incorrecto y la agregación autopropagantes de proteínas priónicas.
[0098] La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y posiblemente también algunas otras formas de enfermedad de la neurona motora (EMN) están asociadas a la agregación de una proteína llamada superóxido dismutasa.
[0099] La demencia familiar británica (FBD) y la demencia familiar danesa (FDD), respectivamente, están asociados a la agregación de las secuencias peptídicas ABri y ADan derivadas de la proteína BRI.
[0100] La hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis (HCHWA, tipo islandés) se asocia a la agregación de una proteína llamada cistatina C.
Enfermedades sistémicas asociadas a amiloidosis
[0101] Además de las enfermedades neurodegenerativas enumeradas anteriormente, una amplia diversidad de enfermedades sistémicas relacionadas con el envejecimiento o degenerativas están asociadas al plegamiento incorrecto y la agregación de una proteína o péptido particular en diversos otros tejidos del cuerpo (es decir, fuera del cerebro). A continuación se muestran ejemplos de tales enfermedades.
[0102] La diabetes mellitus tipo II (también conocida como diabetes del adulto o diabetes mellitus no insulinodependiente) se asocia a la agregación de un péptido de 37 restos llamado polipéptido amiloide de los islotes (IAPP o "amilina"), que forma depósitos insolubles que se asocian a la destrucción progresiva de las células p productoras de insulina en los islotes de Langerhans dentro del páncreas.
[0103] La amiloidosis relacionada con la diálisis (DRA) y el amiloide prostático están asociados a la agregación de una proteína llamada p<2>-microglobulina, ya sea en huesos, articulaciones o tendones en DRA, que se desarrolla durante períodos prolongados de hemodiálisis, o dentro de la próstata en el caso del amiloide prostático.
[0104]La amiloidosis sistémica primaria, la amiloidosis AL sistémica y la amiloidosis asociada al mieloma se asocian a la agregación de la cadena ligera de inmunoglobulina (o, en algunos casos, la cadena pesada de inmunoglobulina) en depósitos de amiloide insolubles, que se acumulan gradualmente en varios órganos importantes tales como el hígado, los riñones, el corazón y el tracto gastrointestinal (GI).
[0105]La amiloidosis AA sistémica reactiva, la amiloidosis sistémica secundaria, la fiebre mediterránea familiar y la enfermedad inflamatoria crónica se asocian a la agregación de proteína amiloide A sérica, que forma depósitos de amiloide insolubles que se acumulan en órganos importantes tales como el hígado, los riñones y el bazo. La amiloidosis sistémica senil (SSA), la polineuropatía amiloide familiar (FAP) y la miocardiopatía amiloide familiar (FAC) están asociadas al plegamiento incorrecto y la agregación de diferentes mutantes de la proteína transtiretina (TTR), que forman inclusiones insolubles en diversos órganos y tejidos como el corazón (especialmente en FAC), nervios periféricos (especialmente en FAP) y tracto gastrointestinal (GI). Otra forma de polineuropatía amiloide familiar (PAF, tipo II) se asocia a la agregación de apolipoproteína AI en los nervios periféricos. La amiloidosis visceral familiar y la amiloidosis sistémica no neuropática hereditaria se asocian al plegamiento incorrecto y la agregación de diversos mutantes de lisozima, que forman depósitos insolubles en órganos importantes tales como el hígado, los riñones y el bazo.
[0106]La amiloidosis sistémica hereditaria finlandesa se asocia a la agregación de una proteína llamada gelsolina en los ojos (particularmente en la córnea).
[0107]La amiloidosis de la cadena a del fibrinógeno se asocia a la agregación de la cadena a del fibrinógeno A, que forma depósitos de amiloide insoluble en diversos órganos, tales como el hígado y los riñones.
[0108]La amiloidosis relacionada con la insulina se produce por la agregación de insulina en el lugar de la inyección en los diabéticos.
[0109]El carcinoma medular de tiroides se asocia a la agregación de calcitonina en los tejidos circundantes.
[0110]La amiloidosis auricular aislada se asocia a la agregación del péptido natriurético auricular (ANP) en el corazón.
[0111]Diversas formas de cataratas están asociadas a la agregación de proteínas Y-cristalina en el cristalino de los ojos.
Autofagia y función de las células endoteliales y enfermedades asociadas
Disfunción de las células endoteliales
[0112]La disfunción global de las células endoteliales se produce en varias enfermedades diversas tales como diabetes, hipertensión, enfermedad renal crónica y aterosclerosis. En estas enfermedades se cree que la disfunción de las células endoteliales se produce como resultado de la senescencia prematura inducida por estrés (SIPS). SIPS se caracteriza por autofagia subvertida y disfunción lisosómica, con la acumulación de vacuolas autolisosómicas.
[0113]La disfunción de las células endoteliales también se produce como resultado del envejecimiento con una incidencia aumentada de enfermedades cardiovasculares. Este aumento de la disfunción celular se correlaciona con una disminución de la autofagia. En seres humanos más mayores, la expresión de los marcadores de autofagia en las células endoteliales arteriales se vio afectada en un 50 % (P <0,05) y se asoció a una reducción del 30 % (P <0,05) en la dilatación arterial dependiente del endotelio (EDD). De forma similar, en ratones control C57BL/6 el envejecimiento se asoció a una disminución del 40 % (P <0,05) en los marcadores arteriales de autofagia y una reducción del 25 % (P <0,05) en la EDD, demostrando que la autofagia deteriorada es una causa de disfunción arterial relacionada con la edad.
[0114]En ratones viejos, el tratamiento con el agente potenciador de la autofagia trehalosa restableció la expresión de los marcadores de autofagia, rescató la EDD mediada por NO reduciendo el estrés oxidativo y normalizando la expresión de citocinas inflamatorias. La presente invención proporciona el conocimiento para usar compuestos que incluyen urolitinas y sus precursores como potenciadores de la autofagia para el tratamiento de individuos que tienen afecciones de salud relacionadas con la disfunción de las células endoteliales y que las necesitan.
Lesión de células endoteliales
[0115]La lesión de las células endoteliales puede producirse como resultado de procesos patológicos tales como anemia falciforme o talasemia en los que pueden producirse niveles patológicamente altos de liberación de hemo y hierro. El daño grave al músculo esquelético, así como la lesión por isquemia cardíaca produce la liberación de la proteína hemo, mioglobina, que también da como resultado lesión de las células endoteliales. Este daño a las células endoteliales vasculares puede provocar disfunción vascular y un aumento de las complicaciones cardiovasculares. La lesión de las células endoteliales provocada por la toxicidad del hemo se asocia a una disminución progresiva del potencial de membrana mitocondrial de las células endoteliales, conduciendo a la apoptosis.
[0116]Las complicaciones micro y macrovasculares se observan comúnmente en pacientes diabéticos y la disfunción endotelial contribuye al desarrollo y la progresión de las complicaciones. Las funciones anormales de las células endoteliales provocan un aumento de la tensión vascular y la aterosclerosis, seguido de hipertensión sistémica, así como una mayor incidencia de isquemia y accidente cerebrovascular en pacientes diabéticos. La disfunción mitocondrial parece ser fundamental para la disfunción endotelial vascular. La fisión mitocondrial mejorada y/o la fusión atenuada conducen a la fragmentación mitocondrial y a la alteración de la función fisiológica endotelial. La biogénesis mitocondrial anormal y la alteración de la autofagia mitocondrial aumentan la acumulación de mitocondrias dañadas, tales como mitocondrias irreversiblemente despolarizadas o con fugas, y facilitan la muerte celular. La producción de ROS mitocondrial aumentada y la sobrecarga de Ca2+ en las mitocondrias no solo provoca el efecto desadaptativo sobre la función endotelial, sino también son potencialmente perjudiciales para la supervivencia celular.
[0117]La lesión de las células endoteliales también puede resultar de procedimientos cardíacos tales como angioplastia, cirugía de derivación y reemplazo valvular. La regulación positiva de la autofagia debería conducir a una reducción de la lesión de las células endoteliales asociadas.
[0118]Las estrategias que aumenten la autofagia tendrían un claro potencial terapéutico.
Autofagia y cáncer
[0119]La autofagia y el cáncer tienen rutas reguladoras similares, con varios genes de supresión de tumores tales como PTEN, TSC1 y TSC2 que conducen a la inhibición ascendente de la señalización TOR, lo que lleva a la estimulación de la autofagia. Adicionalmente, la proteína de autofagia, Beclina1 se ha identificado como un supresor de tumores eliminado en muchos cánceres humanos. Estos resultados demuestran que la autofagia juega un papel importante en la supresión de tumores.
Envejecimiento
[0120]Con diferencia, el mayor factor de riesgo de enfermedades neurodegenerativas, tales como la enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad de Parkinson (EP) y/o la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), es el envejecimiento. Se cree que las mitocondrias contribuyen al envejecimiento mediante la acumulación de mutaciones en el ADN mitocondrial (ADNmt) y la producción neta de especies reactivas de oxígeno (ROS). Aunque la mayoría de las proteínas mitocondriales están codificadas por el genoma nuclear, las mitocondrias contienen muchas copias de su propio ADN. El ADNmt humano es una molécula circular de 16.569 pares de bases que codifica 13 componentes polipeptídicos de la cadena respiratoria, así como los ARNr y ARNt necesarios para sustentar la síntesis de proteínas intramitocondriales usando su propio código genético. Se sabe que las mutaciones hereditarias en el ADNmt provocan una diversidad de enfermedades, la mayoría de las cuales afectan al cerebro y los músculos, tejidos con altos requerimientos de energía. Se ha planteado la hipótesis de que las mutaciones somáticas del ADNmt adquiridas durante el envejecimiento contribuyen al deterioro fisiológico que se produce con el envejecimiento y a la neurodegeneración relacionada con el envejecimiento. Está bien establecido que el ADNmt acumula mutaciones con el envejecimiento, especialmente eliminaciones a gran escala y mutaciones puntuales. En la región de control del ADNmt, las mutaciones puntuales en sitios específicos pueden acumularse a niveles altos en determinados tejidos: T414G en fibroblastos cultivados, A189G y T408A en músculo y C150T en glóbulos blancos. Sin embargo, estos "puntos calientes" de la región de control no se han observado en el cerebro. Las mutaciones puntuales en nucleótidos individuales parecen producirse en niveles bajos en el cerebro, aunque el nivel general puede ser alto. Usando una estrategia de secuenciación y clonación mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se descubrió que el nivel promedio de mutaciones puntuales en dos regiones codificantes de proteínas del ADNmt del cerebro de sujetos de edad avanzada era de aproximadamente 2 mutaciones por 10 kb. Las regiones no codificantes, que pueden estar bajo menos presión de selección, potencialmente acumulan entre el doble y el cuádruple. La acumulación de estas deleciones y mutaciones puntuales con el envejecimiento se correlaciona con la disminución de la función mitocondrial. Por ejemplo, se ha descubierto una correlación negativa entre la actividad del citocromo oxidasa cerebral y el aumento de los niveles de mutación puntual en un gen del citocromo oxidasa(CO1).
[0121]La producción neta de ROS es otro mecanismo importante por el cual se cree que las mitocondrias contribuyen al envejecimiento. Las mitocondrias contienen múltiples transportadores de electrones capaces de producir ROS, así como una extensa red de defensas antioxidantes. Las agresiones mitocondriales, incluyendo el propio daño oxidativo, pueden provocar un desequilibrio entre la producción y la eliminación de ROS, dando como resultado una producción neta de ROS. La importancia para el envejecimiento de la producción neta de ROS mitocondrial está respaldada por observaciones de que mejorar las defensas antioxidantes mitocondriales puede aumentar la longevidad. EnDrosophila,la sobreexpresión de las enzimas antioxidantes mitocondriales manganeso superóxido dismutasa (MnSOD) y metionina sulfóxido reductasa prolonga la esperanza de vida. Esta estrategia tiene más éxito en cepas de corta duración deDrosophilay no tiene ningún efecto en cepas que ya tienen una larga vida. Sin embargo, recientemente se ha demostrado que la sobreexpresión de catalasa dirigida experimentalmente a las mitocondrias aumentó la esperanza de vida en una cepa de ratón que ya era longeva.
Mejorar la actividad durante el envejecimiento
[0122]La actividad en los animales está impulsada en gran medida por el ritmo circadiano y está sincronizada con el medio ambiente. La alteración del ritmo circadiano o la desincronización con el medio ambiente pueden provocar un aumento de la vigilia nocturna o de las siestas diurnas.
[0123]El envejecimiento normal va acompañado de una disminución de la actividad locomotora, ritmos circadianos alterados, así como alteraciones en los patrones de sueño y la ingesta de alimentos. Estos efectos conducen a una disminución del estado de alerta y de la vigilancia en las personas mayores, lo que lleva a un aumento de la vigilia nocturna, así como un aumento de las siestas diurnas. Los patrones de actividad también pueden verse alterados de manera similar por enfermedades, tales como la enfermedad de Alzheimer.
[0124]Los cambios en los ritmos de actividad dependientes de la edad también se observan en otros animales, por ejemplo, ratas, hámsteres, ratones y perros, con un aumento de la fragmentación y una disminución de la sincronización con el entorno. Estas alteraciones circadianas dependientes de la edad se han relacionado con la degeneración del núcleo supraquiasmático del hipotálamo. Se ha demostrado que la interrupción del sueño tanto en seres humanos como en roedores contribuye a la disfunción cognitiva dependiente de la edad.
[0125]La creciente alteración de los ritmos circadianos va acompañada de una disminución gradual de la actividad motora con la edad en varias especies, incluyendo seres humanos, ratones, monos y perros. De particular interés, la actividad diurna de los perros mayores (> 10 años de edad) disminuye en comparación con los perros jóvenes y de mediana edad. Estos cambios en la actividad pueden monitorizarse por dispositivos destinados a medir la actividad, por ejemplo, mediante un acelerómetro o empleando cámaras detectoras de movimiento.
[0126]Muchas de las alteraciones observadas en el envejecimiento como resultado de una disminución de la actividad también se observan en poblaciones más jóvenes donde las tendencias culturales han dado como resultado una disminución de la actividad, acompañada de un aumento de la ingesta calórica, conduciendo a una epidemia de obesidad. El desequilibrio calórico resultante ha provocado un aumento de varias enfermedades tales como diabetes tipo 2, cáncer de colon y síndrome metabólico, así como problemas de salud mental. Varios estudios de cohortes prospectivos y metanálisis en humanos han demostrado que la inactividad física se asocia a un riesgo elevado de desarrollar síndrome metabólico, diabetes tipo 2, hipertensión, arteriopatía coronaria, accidente cerebrovascular y enfermedades cardiovasculares.
[0127]LaTabla 1resume algunos de los tipos de células afectadas por la autofagia y los efectos beneficiosos de la autofagia en esas células.
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Compuestos ilustrativos de la invención
[0128]Los compuestos de la invención, para su uso, incluyen determinadas urolitinas. Estos compuestos pueden usarse para practicar cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, incluyendo, pero no limitado al aumento de la autofagia, y para el tratamiento o la prevención de las diversas enfermedades y afecciones descritas en el presente documento.
[0129]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a urolitinas. Como se usa en el presente documento, una "urolitina" se refiere a un compuesto deFórmula I:
en donde
R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H y OR; y
R es H, alquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, un monosacárido sustituido o no sustituido o un oligosacárido sustituido o no sustituido.
[0130]Como se usa en el presente documento, el término "alquilo" se refiere a un radical hidrocarburo de cadena lineal o ramificada, no cíclico o cíclico, alifático insaturado o saturado que contiene átomos de carbono. Los alquilos de cadena lineal saturados representativos incluyen metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo y similares; mientras que los alquilos ramificados saturados incluyen isopropilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo, isopentilo y similares. Los alquilos cíclicos saturados representativos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y similares; mientras que los alquilos cíclicos insaturados incluyen ciclopentenilo y ciclohexenilo, y similares. Los alquilos insaturados contienen al menos un enlace doble o triple entre átomos de carbono adyacentes (denominados un "alquenilo" o "alquinilo", respectivamente). Los alquenilos de cadena lineal y ramificados representativos incluyen etilenilo, propilenilo, 1-butenilo, 2-butenilo, isobutilenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-metil-1-butenilo, 2-metil-2-butenilo, 2,3-dimetil-2-butenilo y similares; mientras que los alquinilos de cadena lineal y ramificada representativos incluyen acetilenilo, propinilo, 1-butinilo, 2-butinilo, 1-pentinilo, 2-pentinilo, 3-metil-1 -butinilo y similares.
[0131]Como se usa en el presente documento, el término "arilo" se refiere a un radical de sistema de anillo de hidrocarburo que comprende hidrógeno, de 6 a 18 átomos de carbono y al menos un anillo aromático. Para los fines de esta invención, el radical arilo puede ser un sistema de anillo monocíclico, bicíclico, tricíclico o tetracíclico, que puede incluir sistemas de anillos condensados o unidos por puente. Los radicales arilo incluyen, pero no se limitan a, radicales arilo derivados de aceantrileno, acenaftileno, acefenantrileno, antraceno, azuleno, benceno, criseno, fluoranteno, fluoreno, as-indaceno, s-indaceno, indano, indeno, naftaleno, fenaleno, fenantreno, pleyadeno, pireno y trifenileno. A menos que se indique específicamente de otro modo en la memoria descriptiva, el término "arilo" o el prefijo "ar-" (tal como en "aralquilo") pretende incluir radicales arilo que están opcionalmente sustituidos.
[0132]Como se usa en el presente documento, el término "monosacárido" se refiere a un azúcar simple de fórmula (CH<2>ÜH)n. Los monosacáridos pueden ser sistemas de cadena lineal o de anillos, y pueden incluir una unidad de sacarosa de fórmula -CH(OH)-C(=O)-. Los ejemplos de monosacáridos incluyen eritrosa, treosa, ribosa, arabinosa, xilosa, lixosa, alosa, altrosa, glucosa, manosa, gulosa, idosa, galactosa, talosa, eritulosa, ribulosa, xilulosa, psicosa, fructosa, sorbosa, tagatosa, eritropentulosa, treopentulosa, glicerotetrulosa, glucopiranosa, fructofuranosa. En determinadas realizaciones, monosacárido se refiere a glucopiranosa.
[0133]Como se usa en el presente documento, el término "oligosacárido" se refiere a sacárido que consiste en al menos dos, hasta 10 unidades de monosacáridos enlazados glucosídicamente, preferentemente de 2 a 8 unidades monosacáridas, más preferentemente de 2 a 7 unidades de monosacárido, e incluso más preferentemente de 2 a 6 unidades de monosacárido o de 2 a 5 unidades de monosacárido.
[0134]El término "sustituido" como se usa en el presente documento (por ejemplo, en el contexto de un heterociclilo sustituido o un arilo sustituido) significa que al menos un átomo de hidrógeno se reemplaza por un sustituyente. "Sustituyentes" en el contexto de esta invención incluyen halógeno, hidroxi, oxo, ciano, nitro, imino, tioxo, amino, alquilamino, dialquilamino, alquilo, alcoxi, alquiltio, haloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, heterociclo y heterocicloalquilo, así como -NRaRb, -NRaC(=O)Rb, -NRaC(=O)NRaNRb, -NRaC(=O)ORb -NRaSO<2>Rd, -C(=O)Ra, -C(=O)ORa, -C(=O)NRaRb, -OC(=O)NRaRb, -ORa, -SRa, -SORa, -S(=O)2Ra, - OS(=O)2Ra, -S(=O)2ORa, =NSO2Ra y -SO<2>NRaRb. En lo anterior, Ra y Rb en este contexto puede ser igual o diferente e independientemente hidrógeno, alquilo, haloalquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heterociclilo. Además, cada uno de los sustituyentes anteriores también puede estar sustituido con uno o más de los sustituyentes anteriores.
[0135]En una realización, la urolitina es urolitina A.
[0136]En una realización, la urolitina es urolitina B.
[0137]En una realización, la urolitina es urolitina C.
[0138]En una realización, la urolitina es urolitina D.
[0139]En una realización, una "urolitina" se refiere a una cualquiera o una combinación de urolitina A, urolitina B, urolitina C y urolitina D (véase, por ejemplo, laFigura 2y laFigura 3).En una realización, una urolitina es urolitina A, urolitina B, urolitina C, urolitina D o cualquier combinación de urolitina A, urolitina B, urolitina C y urolitina D. En una realización, una urolitina es urolitina A, urolitina B, urolitina C o cualquier combinación de urolitina A, urolitina B y urolitina C. En una realización, una urolitina es urolitina A, urolitina B o una combinación de urolitina A y urolitina B. En una realización, una urolitina es urolitina A.
[0140]En una realización, se proporciona una urolitina como una urolitina aislada, por ejemplo, aislada de una fuente natural o preparada por síntesis total. Se pueden sintetizar urolitinas aisladasde novo.Véanse los Ejemplos 1-4.
[0141]En una realización, se proporciona una urolitina como una urolitina purificada.
[0142]En una realización, una "urolitina" como se usa en el presente documento es o puede incluir una urolitina glucuronada, metilada o sulfatada.
[0143]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a un compuesto deFórmula II
en donde
X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 y X8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H y OH;
con la condición de que el compuesto no sea un compuesto de Fórmula II en donde X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 y X8 son H;
[0144]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde al menos dos de X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 y X8 son OH.
[0145]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde al menos tres de X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 y X8 son OH.
[0146]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde al menos cuatro de X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 y X8 son OH.
[0147]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde al menos cinco de X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 y X8 son OH.
[0148]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde al menos seis de X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 y X8 son OH.
[0149]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde al menos siete de X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 y X8 son OH.
[0150]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 y X8 son OH.
[0151]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1 y X3 son OH; y X2, X4, X5, X6, X7 y X8 son H.
[0152]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1 y X4 son OH; y X2, X3, X5, X6, X7 y X8 son H.
[0153]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1 y X6 son OH; y X2, X3, X4, X5, X7 y X8 son H.
[0154]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2 y X8 son OH; y X1, X3, X4, X5, X6 y X7 son H.
[0155]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X3 y X7 son OH; y X1, X2, X4, X5, X6 y X8 son H.
[0156]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X3 y X8 son OH; y X1, X2, X4, X5, X6 y X7 son H.
[0157]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X4 y X5 son OH; y X1, X2, X3, X6, X7 y X8 son H.
[0158]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X4 y X6 son OH; y X1, X2, X3, X5, X7 y X8 son H.
[0159]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X4 y X7 son OH; y X1, X2, X3, X5, X6 y X8 son H.
[0160]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X4 y X8 son OH; y X1, X2, X3, X5, X6 y X7 son H.
[0161]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X5 y X7 son OH; y X1, X2, X3, X4, X6 y X8 son H.
[0162]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X6 y X8 son OH; y X1, X2, X3, X4, X5 y X7 son H.
[0163]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X7 y X8 son OH; y X1, X2, X3, X4, X5 y X6 son H.
[0164]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2 y X3 son OH; y X4, X5, X6, X7 y X8 son H.
[0165]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2 y X4 son OH; y X3, X5, X6, X7 y X8 son H.
[0166]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2 y X7 son OH; y X3, X4, X5, X6 y X8 son H.
[0167]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2 y X8 son OH; y X3, X4, X5, X6 y X7 son H.
[0168]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X3 y X4 son OH; y X2, X5, X6, X7 y X8 son H.
[0169]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X3 y X5 son OH; y X2, X4, X6, X7 y X8 son H.
[0170]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X3 y X6 son OH; y X2, X4, X5, X7 y X8 son H.
[0171]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X3 y X7 son OH; y X2, X4, X5, X6 y X8 son H.
[0172]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X3 y X8 son OH; y X2, X4, X5, X6 y X7 son H.
[0173]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X4 y X5 son OH; y X2, X3, X6, X7 y X8 son H.
[0174]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X4 y X6 son OH; y X2, X3, X5, X7 y X8 son H.
[0175]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X4 y X7 son OH; y X2, X3, X5, X6 y X8 son H.
[0176]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X4 y X8 son OH; y X2, X3, X5, X6 y X7 son H.
[0177]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X5 y X6 son OH; y X2, X3, X4, X7 y X8 son H.
[0178]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X5 y X7 son OH; y X2, X3, X4, X6 y X8 son H.
[0179]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X6 y X7 son OH; y X2, X3, X4, X5 y X8 son H.
[0180]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X6 y X8 son OH; y X2, X3, X4, X5 y X7 son H.
[0181]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X7 y X8 son OH; y X2, X3, X4, X5 y X6 son H.
[0182]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X3 y X4 son OH; y X1, X5, X6, X7 y X8 son H.
[0183]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X3 y X5 son OH; y X1, X4, X6, X7 y X8 son H.
[0184]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X3 y X6 son OH; y X1, X4, X5, X7 y X8 son H.
[0185]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X3 y X7 son OH; y X1, X4, X5, X6 y X8 son H.
[0186]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X3 y X8 son OH; y X1, X4, X5, X6 y X7 son H.
[0187]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X4 y X5 son OH; y X1, X3, X6, X7 y X8 son H.
[0188]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X4 y X8 son OH; y X1, X3, X5, X6 y X7 son H.
[0189]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X5 y X6 son OH; y X1, X3, X4, X7 y X8 son H.
[0190]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X5 y X7 son OH; y X1, X3, X4, X6 y X8 son H.
[0191]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X5 y X8 son OH; y X1, X3, X4, X6 y X7 son H.
[0192]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X3, X4 y X5 son OH; y X1, X2, X6, X7 y X8 son H.
[0193]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X3, X4 y X6 son OH; y X1, X2, X5, X7 y X8 son H.
[0194]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X3, X4 y X7 son OH; y X1, X2, X5, X6 y X8 son H.
[0195]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X3, X4 y X8 son OH; y X1, X2, X5, X6 y X7 son H.
[0196]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X3, X5 y X6 son OH; y X1, X2, X4, X7 y X8 son H.
[0197]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X3, X5 y X7 son OH; y X1, X2, X4, X6 y X8 son H.
[0198]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X3, X5 y X8 son OH; y X1, X2, X4, X6 y X7 son H.
[0199]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X3, X6 y X7 son OH; y X1, X2, X4, X5 y X8 son H.
[0200]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X3, X6 y X8 son OH; y X1, X2, X4, X5 y X7 son H.
[0201]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X3, X7 y X8 son OH; y X1, X2, X4, X5 y X6 son H.
[0202]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X4, X5 y X6 son OH; y X1, X2, X3, X7 y X8 son H.
[0203]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X4, X5 y X7 son OH; y X1, X2, X3, X6 y X8 son H.
[0204]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X4, X5 y X8 son OH; y X1, X2, X3, X6 y X7 son H.
[0205]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X4, X6 y X7 son OH; y X1, X2, X3, X5 y X8 son H.
[0206]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X4, X6 y X8 son OH; y X1, X2, X3, X5 y X7 son H.
[0207]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X4, X7 y X8 son OH; y X1, X2, X3, X5 y X6 son H.
[0208]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X5, X6 y X7 son OH; y X1, X2, X3, X4 y X8 son H.
[0209]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X5, X6 y X8 son OH; y X1, X2, X3, X4 y X7 son H.
[0210]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X5, X7 y X8 son OH; y X1, X2, X3, X4 y X6 son H.
[0211]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X6, X7 y X8 son OH; y X1, X2, X3, X4 y X5 son H.
[0212]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X3 y X4 son OH; y X5, X6, X7 y X8 son H.
[0213]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X3 y X5 son OH; y X4, X6, X7 y X8 son H.
[0214]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X3 y X6 son OH; y X4, X5, X7 y X8 son H.
[0215]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X3 y X7 son OH; y X4, X5, X6 y X8 son H.
[0216]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X3 y X8 son OH; y X4, X5, X6 y X7 son H.
[0217]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X4 y X5 son OH; y X3, X6, X7 y X8 son H.
[0218]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X4 y X6 son OH; y X3, X5, X7 y X8 son H.
[0219]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X4 y X7 son OH; y X3, X5, X6 y X8 son H.
[0220]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X4 y X8 son OH; y X3, X5, X6 y X7 son H.
[0221]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X5 y X8 son OH; y X3, X4, X6 y X7 son H.
[0222]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X6 y X8 son OH; y X3, X4, X5 y X7 son H.
[0223]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X7 y X8 son OH; y X3, X4, X5 y X6 son H.
[0224]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X3, X4 y X5 son OH; y X2, X6, X7 y X8 son H.
[0225]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X3, X4 y X6 son OH; y X2, X5, X7 y X8 son H.
[0226]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X3, X4 y X7 son OH; y X2, X5, X6 y X8 son H.
[0227]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X3, X4 y X8 son OH; y X2, X5, X6 y X7 son H.
[0228]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X3, X5 y X6 son OH; y X2, X4, X7 y X8 son H.
[0229]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X3, X5 y X7 son OH; y X2, X4, X6 y X8 son H.
[0230]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X3, X5 y X8 son OH; y X2, X4, X6 y X7 son H.
[0231]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X3, X6 y X7 son OH; y X2, X4, X5 y X8 son H.
[0232]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X3, X6 y X8 son OH; y X2, X4, X5 y X7 son H.
[0233]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X3, X7 y X8 son OH; y X2, X4, X5 y X6 son H.
[0234]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X4, X5 y X6 son OH; y X2, X3, X7 y X8 son H.
[0235]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X4, X5 y X7 son OH; y X2, X3, X6 y X8 son H.
[0236]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X4, X5 y X8 son OH; y X2, X3, X6 y X7 son H.
[0237]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X4, X6 y X7 son OH; y X2, X3, X5 y X8 son H.
[0238]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X4, X6 y X8 son OH; y X2, X3, X5 y X7 son H.
[0239]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X4, X7 y X8 son OH; y X2, X3, X5 y X6 son H.
[0240]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X5, X6 y X7 son OH; y X2, X3, X4 y X8 son H.
[0241]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X5, X6 y X8 son OH; y X2, X3, X4 y X7 son H.
[0242]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X5, X7 y X8 son OH; y X2, X3, X4 y X6 son H.
[0243]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X3, X4 y X5 son OH; y X1, X6, X7 y X8 son H.
[0244]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X3, X4 y X6 son OH; y X1, X5, X7 y X8 son H.
[0245]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X3, X4 y X7 son OH; y X1, X5, X6 y X8 son H.
[0246]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X3, X4 y X8 son OH; y X1, X5, X6 y X7 son H.
[0247]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X3, X5 y X6 son OH; y X1, X4, X7 y X8 son H.
[0248]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X3, X5 y X7 son OH; y X1, X4, X6 y X8 son H.
[0249]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X3, X5 y X8 son OH; y X1, X4, X6 y X7 son H.
[0250]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X3, X6 y X8 son OH; y X1, X4, X5 y X7 son H.
[0251]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X3, X7 y X8 son OH; y X1, X4, X6 y X7 son H.
[0252]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X4, X5 y X6 son OH; y X1, X3, X7 y X8 son H.
[0253]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X4, X5 y X7 son OH; y X1, X3, X6 y X8 son H.
[0254]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X4, X6 y X8 son OH; y X1, X3, X5 y X7 son H.
[0255]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X4, X7 y X8 son OH; y X1, X3, X5 y X6 son H.
[0256]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X5, X6 y X7 son OH; y X1, X3, X4 y X8 son H.
[0257]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X5, X6 y X8 son OH; y X1, X3, X4 y X7 son H.
[0258]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X5, X7 y X8 son OH; y X1, X3, X4 y X6 son H.
[0259]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X6, X7 y X8 son OH; y X1, X3, X4 y X5 son H.
[0260]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X3, X4, X5 y X6 son OH; y X1, X2, X7 y X8 son H.
[0261]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X3, X4, X5 y X7 son OH; y X1, X2, X6 y X8 son H.
[0262]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X3, X4, X5 y X8 son OH; y X1, X2, X6 y X7 son H.
[0263]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X3, X4, X6 y X7 son OH; y X1, X2, X5 y X8 son H.
[0264]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X3, X4, X6 y X8 son OH; y X1, X2, X5 y X7 son H.
[0265]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X3, X4, X7 y X8 son OH; y X1, X2, X5 y X6 son H.
[0266]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X3, X5, X6 y X7 son OH; y X1, X2, X4 y X8 son H.
[0267]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X3, X5, X6 y X8 son OH; y X1, X2, X4 y X7 son H.
[0268]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X3, X5, X7 y X8 son OH; y X1, X2, X4 y X6 son H.
[0269]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X3, X6, X7 y X8 son OH; y X1, X2, X4 y X5 son H.
[0270]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X4, X5, X6 y X7 son OH; y X1, X2, X3 y X8 son H.
[0271]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X4, X5, X6 y X8 son OH; y X1, X2, X3 y X7 son H.
[0272]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X4, X5, X7 y X8 son OH; y X1, X2, X3 y X6 son H.
[0273]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X4, X6, X7 y X8 son OH; y X1, X2, X3 y X5 son H.
[0274]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X5, X6, X7 y X8 son OH; y X1, X2, X3 y X4 son H.
[0275]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X3, X4 y X5 son OH; y X6, X7 y X8 son H.
[0276]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X3, X4 y X6 son OH; y X5, X7 y X8 son H.
[0277]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X3, X4 y X7 son OH; y X5, X6 y X8 son H.
[0278]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X3, X4 y X8 son OH; y X5, X6 y X7 son H.
[0279]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X3, X5 y X6 son OH; y X4, X7 y X8 son H.
[0280]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X3, X5 y X7 son OH; y X4, X6 y X8 son H.
[0281]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X3, X5 y X8 son OH; y X4, X6 y X7 son H.
[0282]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X3, X6 y X7 son OH; y X4, X5 y X8 son H.
[0283]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X3, X6 y X8 son OH; y X4, X5 y X7 son H.
[0284]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X3, X7 y X8 son OH; y X4, X5 y X6 son H.
[0285]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X4, X5 y X6 son OH; y X3, X7 y X8 son H.
[0286]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X4, X5 y X8 son OH; y X3, X6 y X7 son H.
[0287]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X4, X6 y X7 son OH; y X3, X5 y X8 son H.
[0288]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X4, X6 y X8 son OH; y X3, X5 y X7 son H.
[0289]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X4, X7 y X8 son OH; y X3, X5 y X6 son H.
[0290]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X5, X6 y X7 son OH; y X3, X4 y X8 son H.
[0291]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X5, X6 y X8 son OH; y X3, X4 y X7 son H.
[0292]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X5, X7 y X8 son OH; y X3, X4 y X6 son H.
[0293]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X3, X4, X5 y X6 son OH; y X2, X7 y X8 son H.
[0294]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X3, X4, X5 y X7 son OH; y X2, X6 y X8 son H.
[0295]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X3, X4, X5 y X8 son OH; y X2, X6 y X7 son H.
[0296]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X3, X4, X6 y X7 son OH; y X2, X5 y X8 son H.
[0297]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X3, X4, X6 y X8 son OH; y X2, X5 y X7 son H.
[0298]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X3, X4, X7 y X8 son OH; y X2, X5 y X7 son H.
[0299]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X3, X5, X6 y X7 son OH; y X2, X4 y X8 son H.
[0300]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X3, X5, X6 y X8 son OH; y X2, X4 y X7 son H.
[0301]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X3, X5, X7 y X8 son OH; y X2, X4 y X6 son H.
[0302]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X3, X6, X7 y X8 son OH; y X2, X4 y X5 son H.
[0303]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X4, X5, X6 y X7 son OH; y X2, X3 y X8 son H.
[0304]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X4, X5, X6 y X8 son OH; y X2, X3 y X7 son H.
[0305]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X4, X5, X7 y X8 son OH; y X2, X3 y X6 son H.
[0306]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X4, X6, X7 y X8 son OH; y X2, X3 y X6 son H.
[0307]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X5, X6, X7 y X8 son OH; y X2, X3 y X4 son H.
[0308]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X3, X4, X5 y X6 son OH; y X1, X7 y X8 son H.
[0309]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X3, X4, X5 y X7 son OH; y X1, X6 y X8 son H.
[0310]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X3, X4, X5 y X8 son OH; y X1, X6 y X7 son H.
[0311]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X3, X4, X6 y X7 son OH; y X1, X5 y X8 son H.
[0312]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X3, X4, X6 y X8 son OH; y X1, X5 y X7 son H.
[0313]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X3, X4, X7 y X8 son OH; y X1, X5 y X6 son H.
[0314]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X3, X5, X6 y X7 son OH; y X1, X4 y X8 son H.
[0315]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X3, X5, X6 y X8 son OH; y X1, X4 y X7 son H.
[0316]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X3, X5, X7 y X8 son OH; y X1, X4 y X6 son H.
[0317]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X3, X6, X7 y X8 son OH; y X1, X4 y X5 son H.
[0318]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X4, X5, X6 y X7 son OH; y X1, X3 y X8 son H.
[0319]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X4, X5, X6 y X8 son OH; y X1, X3 y X7 son H.
[0320]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X4, X5, X7 y X8 son OH; y X1, X3 y X6 son H.
[0321]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X4, X6, X7 y X8 son OH; y X1, X3 y X5 son H.
[0322]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X5, X6, X7 y X8 son OH; y X1, X3 y X5 son H.
[0323]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X3, X4, X5, X6 y X7 son OH; y X1, X2 y X8 son H.
[0324]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X3, X4, X5, X6 y X8 son OH; y X1, X2 y X7 son H.
[0325]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X3, X4, X5, X7 y X8 son OH; y X1, X2 y X6 son H.
[0326]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X3, X4, X6, X7 y X8 son OH; y X1, X2 y X5 son H.
[0327]En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X3, X5, X6, X7 y X8 son OH; y X1, X2 y X4 son H.
[0328] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X4, X5, X6, X7 y X8 son OH; y X1, X2 y X3 son H.
[0329] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X3, X4, X5 y X6 son OH; y X7 y X8 son H.
[0330] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X3, X4, X5 y X7 son OH; y X6 y X8 son H.
[0331] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X3, X4, X5 y X8 son OH; y X6 y X7 son H.
[0332] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X3, X4, X6 y X7 son OH; y X5 y X8 son H.
[0333] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X3, X4, X6 y X8 son OH; y X5 y X7 son H.
[0334] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X3, X4, X7 y X8 son OH; y X5 y X6 son H.
[0335] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X3, X5, X6 y X7 son OH; y X4 y X8 son H.
[0336] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X3, X5, X6 y X8 son OH; y X4 y X7 son H.
[0337] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X3, X5, X7 y X8 son OH; y X4 y X6 son H.
[0338] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X4, X5, X6 y X7 son OH; y X3 y X8 son H.
[0339] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X4, X5, X6 y X8 son OH; y X3 y X7 son H.
[0340] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X4, X5, X7 y X8 son OH; y X3 y X6 son H.
[0341] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X4, X6, X7 y X8 son OH; y X3 y X5 son H.
[0342] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X5, X6, X7 y X8 son OH; y X3 y X4 son H.
[0343] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X3, X4, X5, X6 y X7 son OH; y X2 y X8 son H.
[0344] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X3, X4, X5, X6 y X8 son OH; y X2 y X7 son H.
[0345] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X3, X4, X5, X7 y X8 son OH; y X2 y X6 son H.
[0346] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X3, X4, X6, X7 y X8 son OH; y X2 y X5 son H.
[0347] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X3, X5, X6, X7 y X8 son OH; y X2 y X4 son H.
[0348] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X4, X5, X6, X7 y X8 son OH; y X2 y X3 son H.
[0349] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X3, X4, X5, X6 y X7 son OH; y X1 y X8 son H.
[0350] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X3, X4, X5, X6 y X8 son OH; y X1 y X7 son H.
[0351] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X3, X4, X5, X7 y X8 son OH; y X1 y X6 son H.
[0352] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X3, X4, X6, X7 y X8 son OH; y X1 y X5 son H.
[0353] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X3, X5, X6, X7 y X8 son OH; y X1 y X4 son H.
[0354] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X4, X5, X6, X7 y X8 son OH; y X1 y X3 son H.
[0355] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X3, X4, X5, X6, X7 y X8 son OH; y X1 y X2 son H.
[0356] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X3, X4, X5, X6 y X7 son OH; y X8 es H.
[0357] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X3, X4, X5, X6 y X8 son OH; y X7 es H.
[0358] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X3, X4, X5, X7 y X8 son OH; y X6 es H.
[0359] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X3, X4, X6, X7 y X8 son OH; y X5 es H.
[0360] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X3, X5, X6, X7 y X8 son OH; y X4 es H.
[0361] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X2, X4, X5, X6, X7 y X8 son OH; y X3 es H.
[0362] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X1, X3, X4, X5, X6, X7 y X8 son OH; y X2 es H.
[0363] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde X2, X3, X4, X5, X6, X7 y X8 son OH; y X1 es H.
[0364] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a un compuesto de Fórmula III
en donde
R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H y OR;
R es H, alquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, un monosacárido sustituido o no sustituido o un oligosacárido sustituido o no sustituido; y
con la condición de que el compuesto no sea un compuesto de Fórmula III en donde R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son H;
R1 es OR, y R2, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son H;
R2 es OR, y R1, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son H;
y
[0365] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde al menos dos de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son OR.
[0366] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde al menos tres de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son OR.
[0367] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde al menos cuatro de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son OR.
[0368] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde al menos cinco de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son OR.
[0369] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde al menos seis de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son OR.
[0370] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde al menos siete de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son OR.
[0371] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son OR.
[0372] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1 y R3 son OR; y R2, R4, R5, R6, R7 y R8 son H.
[0373] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1 y R4 son OR; y R2, R3, R5, R6, R7 y R8 son H.
[0374] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1 y R6 son OR; y R2, R3, R4, R5, R7 y R8 son H.
[0375] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R4 y R5 son OR; y R1, R2, R3, R6, R7 y R8 son H.
[0376] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R4 y R6 son OR; y R1, R2, R3, R5, R7 y R8 son H.
[0377] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R4 y R7 son OR; y R1, R2, R3, R5, R6 y R8 son H.
[0378] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R7 y R8 son OR; y R1, R2, R3, R4, R5 y R6 son H.
[0379] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2 y R4 son OR; y R3, R5, R6, R7 y R8 son H.
[0380] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2 y R7 son OR; y R3, R4, R5, R6 y R8 son H.
[0381] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R3 y R4 son OR; y R2, R5, R6, R7 y R8 son H.
[0382] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R3 y R5 son OR; y R2, R4, R6, R7 y R8 son H.
[0383] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R3 y R6 son OR; y R2, R4, R5, R7 y R8 son H.
[0384] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R3 y R7 son OR; y R2, R4, R5, R6 y R8 son H.
[0385] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R3 y R8 son OR; y R2, R4, R5, R6 y R7 son H.
[0386] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R4 y R5 son OR; y R2, R3, R6, R7 y R8 son H.
[0387] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R4 y R6 son OR; y R2, R3, R5, R7 y R8 son H.
[0388] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R4 y R7 son OR; y R2, R3, R5, R6 y R8 son H.
[0389] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R4 y R8 son OR; y R2, R3, R5, R6 y R7 son H.
[0390] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R5 y R6 son OR; y R2, R3, R4, R7 y R8 son H.
[0391] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R5 y R7 son OR; y R2, R3, R4, R6 y R8 son H.
[0392] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R6 y R7 son OR; y R2, R3, R4, R5 y R8 son H.
[0393] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R6 y R8 son OR; y R2, R3, R4, R5 y R7 son H.
[0394] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R3 y R5 son OR; y R1, R4, R6, R7 y R8 son H.
[0395] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R3 y R6 son OR; y R1, R4, R5, R7 y R8 son H.
[0396] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R3 y R7 son OR; y R1, R4, R5, R6 y R8 son H.
[0397] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R3 y R8 son OR; y R1, R4, R5, R6 y R7 son H.
[0398] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R4 y R5 son OR; y R1, R3, R6, R7 y R8 son H.
[0399] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R4 y R8 son OR; y R1, R3, R5, R6 y R7 son H.
[0400] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R5 y R6 son OR; y R1, R3, R4, R7 y R8 son H.
[0401] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R5 y R7 son OR; y R1, R3, R4, R6 y R8 son H.
[0402] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R3, R4 y R5 son OR; y R1, R2, R6, R7 y R8 son H.
[0403] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R3, R4 y R6 son OR; y R1, R2, R5, R7 y R8 son H.
[0404] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R3, R4 y R7 son OR; y R1, R2, R5, R6 y R8 son H.
[0405] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R3, R4 y R8 son OR; y R1, R2, R5, R6 y R7 son H.
[0406] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R3, R5 y R6 son OR; y R1, R2, R4, R7 y R8 son H.
[0407] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R3, R5 y R7 son OR; y R1, R2, R4, R6 y R8 son H.
[0408] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R3, R6 y R7 son OR; y R1, R2, R4, R5 y R8 son H.
[0409] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R3, R6 y R8 son OR; y R1, R2, R4, R5 y R7 son H.
[0410] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R4, R5 y R6 son OR; y R1, R2, R3, R7 y R8 son H.
[0411] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R4, R5 y R7 son OR; y R1, R2, R3, R6 y R8 son H.
[0412] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R4, R5 y R8 son OR; y R1, R2, R3, R6 y R7 son H.
[0413] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R4, R6 y R7 son OR; y R1, R2, R3, R5 y R8 son H.
[0414] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R4, R6 y R8 son OR; y R1, R2, R3, R5 y R7 son H.
[0415] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R4, R7 y R8 son OR; y R1, R2, R3, R5 y R6 son H.
[0416] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R5, R6 y R7 son OR; y R1, R2, R3, R4 y R8 son H.
[0417] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R5, R6 y R8 son OR; y R1, R2, R3, R4 y R7 son H.
[0418] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R5, R7 y R8 son OR; y R1, R2, R3, R4 y R6 son H.
[0419] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R3 y R4 son OR; y R5, R6, R7 y R8 son H.
[0420] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R3 y R5 son OR; y R4, R6, R7 y R8 son H.
[0421] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R3 y R6 son OR; y R4, R5, R7 y R8 son H.
[0422] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R3 y R7 son OR; y R4, R5, R6 y R8 son H.
[0423] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R3 y R8 son OR; y R4, R5, R6 y R7 son H.
[0424] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R4 y R5 son OR; y R3, R6, R7 y R8 son H.
[0425] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R4 y R6 son OR; y R3, R5, R7 y R8 son H.
[0426] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R4 y R7 son OR; y R3, R5, R6 y R8 son H.
[0427] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R4 y R8 son OR; y R3, R5, R6 y R7 son H.
[0428] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R5 y R8 son OR; y R3, R4, R6 y R7 son H.
[0429] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R6 y R8 son OR; y R3, R4, R5 y R7 son H.
[0430] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R7 y R8 son OR; y R3, R4, R5 y R6 son H.
[0431] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R3, R4 y R5 son OR; y R2, R6, R7 y R8 son H.
[0432] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R3, R4 y R6 son OR; y R2, R5, R7 y R8 son H.
[0433] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R3, R4 y R7 son OR; y R2, R5, R6 y R8 son H.
[0434] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R3, R4 y R8 son OR; y R2, R5, R6 y R7 son H.
[0435] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R3, R5 y R6 son OR; y R2, R4, R7 y R8 son H.
[0436] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R3, R5 y R7 son OR; y R2, R4, R6 y R8 son H.
[0437] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R3, R5 y R8 son OR; y R2, R4, R6 y R7 son H.
[0438] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R3, R6 y R7 son OR; y R2, R4, R5 y R8 son H.
[0439] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R3, R6 y R8 son OR; y R2, R4, R5 y R7 son H.
[0440] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R3, R7 y R8 son OR; y R2, R4, R5 y R6 son H.
[0441] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R4, R5 y R6 son OR; y R2, R3, R7 y R8 son H.
[0442] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R4, R5 y R7 son OR; y R2, R3, R6 y R8 son H.
[0443] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R4, R5 y R8 son OR; y R2, R3, R6 y R7 son H.
[0444] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R4, R6 y R7 son OR; y R2, R3, R5 y R8 son H.
[0445] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R4, R6 y R8 son OR; y R2, R3, R5 y R7 son H.
[0446] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R4, R7 y R8 son OR; y R2, R3, R5 y R6 son H.
[0447] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R5, R6 y R7 son OR; y R2, R3, R4 y R8 son H.
[0448] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R5, R6 y R8 son OR; y R2, R3, R4 y R7 son H.
[0449] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R5, R7 y R8 son OR; y R2, R3, R4 y R6 son H.
[0450] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R3, R4 y R5 son OR; y R1, R6, R7 y R8 son H.
[0451] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R3, R4 y R7 son OR; y R1, R5, R6 y R8 son H.
[0452] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R3, R4 y R8 son OR; y R1, R5, R6 y R7 son H.
[0453] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R3, R5 y R6 son OR; y R1, R4, R7 y R8 son H.
[0454] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R3, R5 y R8 son OR; y R1, R4, R6 y R7 son H.
[0455] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R3, R6 y R8 son OR; y R1, R4, R5 y R7 son H.
[0456] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R3, R7 y R8 son OR; y R1, R4, R6 y R7 son H.
[0457] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R4, R5 y R6 son OR; y R1, R3, R7 y R8 son H.
[0458] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R4, R5 y R7 son OR; y R1, R3, R6 y R8 son H.
[0459] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R4, R6 y R8 son OR; y R1, R3, R5 y R7 son H.
[0460] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R4, R7 y R8 son OR; y R1, R3, R5 y R6 son H.
[0461] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R5, R6 y R8 son OR; y R1, R3, R4 y R7 son H.
[0462] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R5, R7 y R8 son OR; y R1, R3, R4 y R6 son H.
[0463] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R3, R4, R5 y R6 son OR; y R1, R2, R7 y R8 son H.
[0464] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R3, R4, R5 y R7 son OR; y R1, R2, R6 y R8 son H.
[0465] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R3, R4, R5 y R8 son OR; y R1, R2, R6 y R7 son H.
[0466] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R3, R4, R6 y R7 son OR; y R1, R2, R5 y R8 son H.
[0467] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R3, R4, R6 y R8 son OR; y R1, R2, R5 y R7 son H.
[0468] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R3, R4, R7 y R8 son OR; y R1, R2, R5 y R6 son H.
[0469] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R3, R5, R6 y R7 son OR; y R1, R2, R4 y R8 son H.
[0470] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R3, R5, R6 y R8 son OR; y R1, R2, R4 y R7 son H.
[0471] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R3, R5, R7 y R8 son OR; y R1, R2, R4 y R6 son H.
[0472] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R3, R6, R7 y R8 son OR; y R1, R2, R4 y R5 son H.
[0473] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R4, R5, R6 y R7 son OR; y R1, R2, R3 y R8 son H.
[0474] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R4, R5, R6 y R8 son OR; y R1, R2, R3 y R7 son H.
[0475] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R4, R5, R7 y R8 son OR; y R1, R2, R3 y R6 son H.
[0476] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R4, R6, R7 y R8 son OR; y R1, R2, R3 y R5 son H.
[0477] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R5, R6, R7 y R8 son OR; y R1, R2, R3 y R4 son H.
[0478] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R3, R4 y R5 son OR; y R6, R7 y R8 son H.
[0479] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R3, R4 y R6 son OR; y R5, R7 y R8 son H.
[0480] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R3, R4 y R7 son OR; y R5, R6 y R8 son H.
[0481] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R3, R4 y R8 son OR; y R5, R6 y R7 son H.
[0482] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R3, R5 y R6 son OR; y R4, R7 y R8 son H.
[0483] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R3, R5 y R7 son OR; y R4, R6 y R8 son H.
[0484] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R3, R5 y R8 son OR; y R4, R6 y R7 son H.
[0485] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R3, R6 y R7 son OR; y R4, R5 y R8 son H.
[0486] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R3, R6 y R8 son OR; y R4, R5 y R7 son H.
[0487] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R3, R7 y R8 son OR; y R4, R5 y R6 son H.
[0488] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R4, R5 y R6 son OR; y R3, R7 y R8 son H.
[0489] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R4, R5 y R8 son OR; y R3, R6 y R7 son H.
[0490] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R4, R6 y R7 son OR; y R3, R5 y R8 son H.
[0491] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R4, R6 y R8 son OR; y R3, R5 y R7 son H.
[0492] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R4, R7 y R8 son OR; y R3, R5 y R6 son H.
[0493] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R5, R6 y R7 son OR; y R3, R4 y R8 son H.
[0494] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R5, R6 y R8 son OR; y R3, R4 y R7 son H.
[0495] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R5, R7 y R8 son OR; y R3, R4 y R6 son H.
[0496] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R3, R4, R5 y R6 son OR; y R2, R7 y R8 son H.
[0497] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R3, R4, R5 y R7 son OR; y R2, R6 y R8 son H.
[0498] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R3, R4, R5 y R8 son OR; y R2, R6 y R7 son H.
[0499] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R3, R4, R6 y R7 son OR; y R2, R5 y R8 son H.
[0500] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R3, R4, R6 y R8 son OR; y R2, R5 y R7 son H.
[0501] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R3, R4, R7 y R8 son OR; y R2, R5 y R7 son H.
[0502] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R3, R5, R6 y R7 son OR; y R2, R4 y R8 son H.
[0503] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R3, R5, R6 y R8 son OR; y R2, R4 y R7 son H.
[0504] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R3, R5, R7 y R8 son OR; y R2, R4 y R6 son H.
[0505] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R3, R6, R7 y R8 son OR; y R2, R4 y R5 son H.
[0506] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R4, R5, R6 y R7 son OR; y R2, R3 y R8 son H.
[0507] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R4, R5, R6 y R8 son OR; y R2, R3 y R7 son H.
[0508] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R4, R5, R7 y R8 son OR; y R2, R3 y R6 son H.
[0509] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R4, R6, R7 y R8 son OR; y R2, R3 y R6 son H.
[0510] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R5, R6, R7 y R8 son OR; y R2, R3 y R4 son H.
[0511] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R3, R4, R5 y R6 son OR; y R1, R7 y R8 son H.
[0512] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R3, R4, R5 y R8 son OR; y R1, R6 y R7 son H.
[0513] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R3, R4, R6 y R7 son OR; y R1, R5 y R8 son H.
[0514] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R3, R4, R6 y R8 son OR; y R1, R5 y R7 son H.
[0515] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R3, R4, R7 y R8 son OR; y R1, R5 y R6 son H.
[0516] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R3, R5, R6 y R7 son OR; y R1, R4 y R8 son H.
[0517] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R3, R5, R6 y R8 son OR; y R1, R4 y R7 son H.
[0518] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R3, R5, R7 y R8 son OR; y R1, R4 y R6 son H.
[0519] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R4, R5, R6 y R7 son OR; y R1, R3 y R8 son H.
[0520] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R4, R5, R6 y R8 son OR; y R1, R3 y R7 son H.
[0521] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R4, R5, R7 y R8 son OR; y R1, R3 y R6 son H.
[0522] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R3, R4, R5, R6 y R7 son OR; y R1, R2 y R8 son H.
[0523] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R3, R4, R5, R6 y R8 son OR; y R1, R2 y R7 son H.
[0524] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R3, R4, R5, R7 y R8 son OR; y R1, R2 y R6 son H.
[0525] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R3, R4, R6, R7 y R8 son OR; y R1, R2 y R5 son H.
[0526] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R3, R5, R6, R7 y R8 son OR; y R1, R2 y R4 son H.
[0527] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R4, R5, R6, R7 y R8 son OR; y R1, R2 y R3 son H.
[0528] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R3, R4, R5 y R6 son OR; y R7 y R8 son H.
[0529] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R3, R4, R5 y R7 son OR; y R6 y R8 son H.
[0530] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R3, R4, R5 y R8 son OR; y R6 y R7 son H.
[0531] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R3, R4, R6 y R7 son OR; y R5 y R8 son H.
[0532] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R3, R4, R6 y R8 son OR; y R5 y R7 son H.
[0533] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R3, R4, R7 y R8 son OR; y R5 y R6 son H.
[0534] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R3, R5, R6 y R7 son OR; y R4 y R8 son H.
[0535] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R3, R5, R6 y R8 son OR; y R4 y R7 son H.
[0536] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R3, R5, R7 y R8 son OR; y R4 y R6 son H.
[0537] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R4, R5, R6 y R7 son OR; y R3 y R8 son H.
[0538] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R4, R5, R6 y R8 son OR; y R3 y R7 son H.
[0539] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R4, R5, R7 y R8 son OR; y R3 y R6 son H.
[0540] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R4, R6, R7 y R8 son OR; y R3 y R5 son H.
[0541] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R5, R6, R7 y R8 son OR; y R3 y R4 son H.
[0542] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R3, R4, R5, R6 y R7 son OR; y R2 y R8 son H.
[0543] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R3, R4, R5, R6 y R8 son OR; y R2 y R7 son H.
[0544] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R3, R4, R5, R7 y R8 son OR; y R2 y R6 son H.
[0545] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R3, R4, R6, R7 y R8 son OR; y R2 y R5 son H.
[0546] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R3, R5, R6, R7 y R8 son OR; y R2 y R4 son H.
[0547] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R4, R5, R6, R7 y R8 son OR; y R2 y R3 son H.
[0548] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R3, R4, R5, R6 y R7 son OR; y R1 y R8 son H.
[0549] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R3, R4, R5, R6 y R8 son OR; y R1 y R7 son H.
[0550] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R3, R4, R5, R7 y R8 son OR; y R1 y R6 son H.
[0551] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R3, R5, R6, R7 y R8 son OR; y R1 y R4 son H.
[0552] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son OR; y R1 y R2 son H.
[0553] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R3, R4, R5, R6 y R7 son OR; y R8 es H.
[0554] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R3, R4, R5, R6 y R8 son OR; y R7 es H.
[0555] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R3, R4, R5, R7 y R8 son OR; y R6 es H.
[0556] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R3, R4, R6, R7 y R8 son OR; y R5 es H.
[0557] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R3, R5, R6, R7 y R8 son OR; y R4 es H.
[0558] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R2, R4, R5, R6, R7 y R8 son OR; y R3 es H.
[0559] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R1, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son OR; y R2 es H.
[0560] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R2, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 son OR; y R1 es H.
[0561] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los compuestos mencionados anteriormente, en donde R es H.
[0562] Las urolitinas son metabolitos de ácido elágico, punicalagina (PA), punicalina (PB), tellimagrandina (TL) y otros elagitaninos. El ácido elágico (EA) es abundante en el zumo de granada. Gilet al.(2000) J. Agric. Food Chem.
48:4581-4589. El elagitanino tellimagrandina (TL) se ha aislado previamente de la granada y otras plantas. Las fórmulas estructurales para UA, PA, PB, EA y TL se presentan en la Figura 2.
[0563] Los elagitaninos generalmente no se absorben en el intestino. Más bien, liberan EA en el intestino, que se absorbe poco en el estómago y el intestino delgado. El EA se metaboliza en gran medida por bacterias no identificadas en la luz intestinal para producir urolitinas. El metabolismo microbiano comienza en el intestino delgado y los primeros metabolitos producidos retienen cuatro hidroxilos fenólicos (urolitina D, cuatro grupos hidroxilo) y estos se metabolizan aún más a lo largo del tracto intestinal para eliminar las unidades de hidroxilo que conducen a urolitina C (tres hidroxilos), urolitina A (dos hidroxilos) y B (un hidroxilo) en las partes distales del colon (Figura 3). Los metabolitos absorbidos se conjugan con ácido glucurónico (una o dos unidades) y/o éteres metílicos (cuando están presentes grupos orto-di-hidroxilo). Los conjugados de urolitina A y B son los principales metabolitos detectados en plasma y orina, aunque también se han detectado en menores cantidades algunos derivados trihidroxi (hidroxilo-UA) o EA-dimetil éter glucurónido. Las tetrahidroxiurolitinas, las trihidroxiurolitinas y los derivados de EA generalmente no se detectan en el plasma periférico, pero se absorben en el intestino delgado y se transportan al hígado, donde se metabolizan y excretan con bilis al intestino delgado, estableciendo una circulación enterohepática que es responsable de la vida relativamente larga de las urolitinas en plasma y orina.
[0564] Además de las fuentes de alimentos naturales, han aparecido muchos artículos sobre la biosíntesis, el aislamiento y la actividad biológica de los taninos, especialmente elagitaninos, durante los últimos veinte años. El acceso a elagitaninos puros mediante el aislamiento de fuentes naturales puede ser engorroso y producir solo cantidades relativamente pequeñas de productos naturales puros. Véanse, por ejemplo, Okudaet al.,(1982) Chem Pharm Bull. 30:4230-4233; Okudaet al.(1982) Chem Pharm Bull. 30:234-4236. Es por lo tanto de destacar que se conocen métodos para la síntesis total de muchos elagitaninos. Véase, por ejemplo, Khanbabaee, K., Strategies for the synthesis of ellagitannins, En: Chemistry and Biology of Ellagitannins, Ed. S. Quideau, World Scientific Publishing, Singapur, 2009, pp. 152-202, incluyendo las referencias citadas en el mismo.
Métodos para aumentar la autofagia, aumentar la longevidad y tratamiento o prevención de enfermedades y trastornos mediante urolitinas y compuestos relacionados
[0565] En determinadas realizaciones, la invención proporciona métodos para tratar o prevenir diversas enfermedades y afecciones usando urolitinas. En realizaciones particulares, una enfermedad o trastorno tratado o prevenido de acuerdo con la presente invención es una enfermedad o trastorno asociado a una autofagia reducida o que se beneficiaría de una autofagia aumentada, incluyendo, pero no limitado a cualquiera de las enfermedades y afecciones descritas en el presente documento.
[0566] Un aspecto de la invención es un método para tratar o prevenir una enfermedad o una afección asociadas a, o caracterizadas por, autofagia reducida o disminuida, o que se beneficiarían de autofagia aumentada. El método incluye la etapa de administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de una urolitina o precursor de la misma. En realizaciones particulares, cualquiera de las urolitinas o precursores de las mismas descritos en el presente documento pueden usarse para practicar cualquier aspecto de la invención.
[0567] Como se usa en el presente documento, a menos que el contexto indique claramente otra cosa, "tratar", y palabras similares como "tratamiento", "tratado", "que trata", etc., indica una estrategia para obtener resultados beneficiosos o deseados, incluyendo resultados clínicos. El tratamiento puede implicar opcionalmente la reducción o la mejora de síntomas de la enfermedad o afección, o el retardo de la progresión de la enfermedad o afección. En algunas realizaciones, el tratamiento se logra reduciendo la duración de la enfermedad o afección. La administración de un compuesto descrito en el presente documento puede, en algunas realizaciones, tratar uno o más de dichos síntomas.
[0568] Como se usa en el presente documento, a menos que el contexto indique claramente otra cosa, "prevenir", y palabras similares como "prevención", "prevenido", "que previene", etc., indican una estrategia para prevenir, inhibir o reducir la probabilidad de aparición o recurrencia de una enfermedad o afección. También se refiere a prevenir, inhibir o reducir la probabilidad de aparición o recurrencia de los síntomas de una enfermedad o afección, u opcionalmente un enfoque para retrasar la aparición o recurrencia de una enfermedad o afección o retrasar la aparición o recurrencia de los síntomas de una enfermedad o afección. Como se usa en el presente documento, "prevenir" y palabras similares también incluyen reducir la intensidad, el efecto, los síntomas o la carga de una enfermedad o afección antes del inicio o reaparición de la enfermedad o afección.
[0569] Un aspecto de la invención es un método para aumentar la autofagia en una célula, que comprende la etapa de poner en contacto una célula con una cantidad eficaz de una urolitina o un precursor de la misma para aumentar la autofagia en la célula. En realizaciones particulares, la célula está presente en un sujeto, por ejemplo, un mamífero. Además, la invención incluye un método para aumentar la autofagia en una célula, en donde la célula está presente en un sujeto, por ejemplo, un mamífero, que comprende la etapa de proporcionar al sujeto una cantidad eficaz de una urolitina o un precursor de la misma para aumentar la autofagia en la célula.
[0570] Un aspecto de la invención es un método para aumentar la autofagia en una célula, que comprende la etapa de poner en contacto una célula con una cantidad eficaz de una urolitina, o un precursor de la misma, para aumentar la autofagia en la célula.
[0571] En realizaciones particulares, una urolitina es un compuesto que tiene una estructura expuesta en la Fórmula I, la Fórmula II o la Fórmula III, incluyendo uno cualquiera de los compuestos específicos de Fórmula II o Fórmula III descritos en el presente documento. Una "cantidad eficaz" como se usa en el presente documento se refiere a una cantidad que es suficiente para lograr o realizar un efecto biológico específico o deseado. Por ejemplo, una cantidad eficaz de urolitina para aumentar la autofagia en una célula es una cantidad de urolitina que es suficiente para aumentar la autofagia en la célula.
[0572] Un aumento de la autofagia en una célula puede medirse usando cualquier ensayo adecuado para medir la autofagia. Por ejemplo, la formación de autofagia puede determinarse usando el colorante fluorescente monodansilcadaverina (MDC) (Sigma-Aldrich, 30432). Este tinte marca selectivamente las vacuolas autofágicas. Biederbick Aet al.(1995) Eur. J. Cell. Biol. 66:3-14. La autofagia también puede determinarse examinando el cambio en la proporción de las proteínas implicadas en la autofagia, tales como LC3-II a LC3-I, por ejemplo, usando análisis de transferencia Western. Con un método tal, un aumento en la proporción LC3-II/LC3-I en una célula tratada por encima del valor inicial, la proporción LC3-II/LC3-I de células no tratadas, se consideraría como un aumento de la autofagia. El examen de otros niveles de proteínas tales como p62 también puede ayudar en la confirmación. Para calcular el porcentaje (%) de aumento de la autofagia en una célula, puede emplearse la proporción de LC3-II/LC3-I al inicio (Proporción B) y la proporción de LC3-II/LC3-I durante el tratamiento (Proporción T). El aumento porcentual (%) puede determinarse matemáticamente, por ejemplo, por la fórmula 100x[((Proporción T)-(Proporción B))/(Proporción B)].
[0573] Se dice que la autofagia aumenta en una célula si es considerablemente mayor que la autofagia que está o estaría presente en una célula de control no tratada o con placebo. En una realización se dice que la autofagia aumenta en una célula si es mayor en una cantidad o grado estadísticamente significativo que la autofagia que está o estaría presente en una célula de control no tratada o placebo. En determinadas realizaciones, el aumento de la autofagia es un aumento de al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 100 %, al menos el 150 %, al menos el 200 %, al menos el 300 %, al menos el 400 %, al menos el 500 %, al menos el 600 %, al menos el 700 %, al menos el 800 %, al menos el 900 %, al menos el 1.000 % o más del 1.000 %, en comparación con el nivel de autofagia presente en una célula no tratada o una célula tratada con un placebo.
[0574] En determinadas realizaciones, el aumento de la autofagia es un aumento del 5-500 %, el 10-500 %, el 15 500 %, el 20-500 %, el 25-500 %, el 30-500 %, el 40-500 %, el 50-500 %, el 60-500 %, al menos el 70-500 %, el 80 500 %, el 90-500 %, el 100-500 %, el 150-500 %, el 200-500 %, el 300-500 % o el 400-500 %, el 5-1.000 %, el 10 500 %, el 15-1.000 %, el 20-1.000 %, el 25-1.000 %, el 30-1.000 %, el 40-1.000 %, el 50-1.000 %, el 60-1.000 %, al menos el 70-1.000 %, el 80-1.000 %, el 90-1.000 %, el 100-1.000 %, el 150-1.000 %, el 200-1.000 %, el 300-1.000 %, el 400-1.000 %, el 500-1.000 %, el 600-1.000 %, el 700-1.000 %, el 800-1.000 % o el 900-1.000 %, en comparación con el nivel de autofagia presente en una célula no tratada o una célula tratada con un placebo.
[0575] En una realización, la autofagia es mitofagia.
[0576] En una realización, la urolitina es una urolitina aislada.
[0577] En una realización, la urolitina es una urolitina purificada.
[0578] En una realización, la urolitina se selecciona del grupo que consiste en urolitina A, urolitina B, urolitina C, urolitina D y cualquier combinación de las mismas.
[0579] En una realización, la urolitina es urolitina A.
[0580] En una realización, la urolitina es urolitina B.
[0581] En una realización, la urolitina es urolitina C.
[0582] En una realización, la urolitina es urolitina D.
[0583] En determinadas realizaciones, la urolitina es un compuesto de Fórmula I, la Fórmula II o la Fórmula III, incluyendo uno cualquiera de los compuestos específicos de estas fórmulas descritos en el presente documento.
[0584] En una realización, la célula se selecciona de células epiteliales, . En una realización, la célula se selecciona del grupo que consiste en: células endoteliales y queratinocitos (células cutáneas). En determinadas realizaciones, las células están presentes en un tejido o en un corte de tejido. En diversas realizaciones, las células se ponen en contacto con la urolitina o precursor de la mismain vivo, ex vivooin vitro.
[0585] Un animal es cualquier eucariota multicelular perteneciente al reinoAnimalia.En una realización un animal es un invertebrado, por ejemplo, un nematodo (por ejemplo,C. elegans)o una mosca de la fruta (por ejemplo,D.
melanogaster).En una realización, un animal es un vertebrado, por ejemplo, un pez o un mamífero. En una realización, un animal es un mamífero. En una realización, un animal es un primate. En una realización, un animal es un ser humano. En determinadas realizaciones, un animal es un animal doméstico, tal como un perro o un gato. En determinadas realizaciones, un animal es un animal de ganado, tal como un caballo, una vaca o una oveja.
[0586] En una realización, la urolitina es una urolitina aislada.
[0587] En una realización, la urolitina es una urolitina purificada.
[0588] En una realización, la urolitina se selecciona del grupo que consiste en urolitina A, urolitina B, urolitina C, urolitina D y cualquier combinación de las mismas.
[0589] En una realización, la urolitina es urolitina A.
[0590] En una realización, la urolitina es urolitina B.
[0591] En una realización, la urolitina es urolitina C.
[0592] En una realización, la urolitina es urolitina D.
[0593] En determinadas realizaciones, la urolitina es un compuesto de Fórmula I, la Fórmula II o la Fórmula III, incluyendo uno cualquiera de los compuestos específicos de estas fórmulas descritos en el presente documento.
[0594] De acuerdo con la invención, las urolitinas pueden usarse como reactivo de cultivo celular para ayudar a promover el crecimiento y la preservación de células y los tejidos en cultivo. Se cree que la urolitina tiene el potencial de mantener vivas las células y tejidos primarios durante largos períodos de tiempo, lo que significa que podrían usarse para una amplia gama de aplicacionesin vitro,incluyendo: (i) cultivo celular de rutina en laboratorios de investigación de líneas celulares, células primarias de cualquier origen (es decir, aisladas recientemente de seres humanos o animales); y (ii) tejidos u órganos que se mantienen en cultivo. Tanto para células como para tejidos mantenidos en cultivo, esto también podría tener aplicaciones diagnósticasin vitroasí como aplicaciones terapéuticas, tales como: expansión tisular, protección durante el transporte (para trasplante a seres humanos), para aplicaciones de terapia celular que usan células primarias que deben almacenarse congeladas, por lo que puede ser parte de una solución especial para la congelación de células. La invención incluye un método para cultivar o conservar células o tejidos, que comprende hacer crecer o cultivar las células o el tejido en un medio de cultivo que comprende una urolitina. Los medios de cultivo celular adecuados para cultivar y hacer crecer diversas células y tejidos son conocidos en la técnica y están disponibles en el mercado.
[0595] Las urolitinas y precursores de las mismas también pueden ser útiles como controles positivos cuando se prueba la autofagia y la función mitocondrial mejorada en una célula, un tejido o un organismo. Por ejemplo, una urolitina puede usarse por separado o incluirla como parte de un kit útil para examinar las vías relacionadas con la función mitocondrial tales como la vía mTOR.
[0596] En una realización, la autofagia es mitofagia.
[0597] En una realización, la urolitina es una urolitina aislada.
[0598] En una realización, la urolitina es una urolitina purificada.
[0599] En una realización, la urolitina se selecciona del grupo que consiste en urolitina A, urolitina B, urolitina C, urolitina D y cualquier combinación de las mismas.
[0600] En una realización, la urolitina es urolitina A.
[0601] En una realización, la urolitina es urolitina B.
[0602] En una realización, la urolitina es urolitina C.
[0603] En una realización, la urolitina es urolitina D.
[0604] En determinadas realizaciones, la urolitina es un compuesto de Fórmula I, la Fórmula II o la Fórmula III, incluyendo uno cualquiera de los compuestos específicos de estas fórmulas descritos en el presente documento.
[0605] En una realización, las células eucariotas son células eucariotas en cultivo primario.
[0606] En una realización, las células eucariotas son parte de una línea celular.
[0607] En una realización, las células eucariotas se seleccionan del grupo que consiste en: células epiteliales. En una realización, la célula se selecciona del grupo que consiste en: células endoteliales y queratinocitos (células cutáneas).
[0608] En determinadas realizaciones, la célula está presente en un tejido u órgano aislado o en una porción o muestra del mismo. En determinadas realizaciones, las células están presentes en un órgano aislado o en un bloque de órganos, tales como un órgano o bloque de órganos extraídos para trasplante o mantenidosex vivo.En determinadas realizaciones, las células están presentes en un tejido o en un corte de tejido.
[0609] En realizaciones particulares, la célula está presente en un cultivo primario, es decir, una "célula primaria". Como se usa en el presente documento, "cultivo primario" se refiere a células cultivadas directamente de un tejido o de un sujeto. En una realización, un cultivo primario incluye dos o más tipos de células. En una realización, un cultivo primario incluye un solo tipo de célula, por ejemplo, células endoteliales. Las células en cultivo primario a menudo solo pueden tener un número limitado de pases o divisiones.
[0610] En realizaciones particulares, la célula está presente en una línea celular. Como se usa en el presente documento, una "línea celular" se refiere a una población de células establecida, inmortalizada y genéticamente homogénea derivadas de un animal eucariota y mantenidasin vitro.En una realización, una línea celular deriva de un mamífero. En una realización, una línea celular deriva de un ser humano. Hay líneas celulares de muchos tipos disponibles de varios proveedores comerciales, incluyendo, por ejemplo, Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Manassas, Virginia.
[0611] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a un método para aumentar la autofagia en una célula, que comprende poner en contacto la célula con una cantidad eficaz de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en: urolitina A, urolitina B, urolitina C y urolitina D, aumentando de esta manera la autofagia en la célula.
[0612] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en donde la autofagia es mitofagia.
[0613] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en donde el compuesto es urolitina A.
[0614] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en donde el compuesto es urolitina B.
[0615] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en donde el compuesto es urolitina C.
[0616] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en donde el compuesto es urolitina D.
[0617] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en donde la célula se selecciona del grupo que consiste en: células epiteliales.
[0618] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a un método para aumentar la autofagia en una célula, que comprende poner en contacto la célula con una cantidad eficaz de un compuesto de Fórmula I, aumentando de esta manera la autofagia en la célula;
en donde el compuesto de Fórmula I es
en donde
R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 y R8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H y OR; y
R es H.
[0619] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en donde la autofagia es mitofagia.
[0620] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en donde la célula se selecciona del grupo que consiste en: células epiteliales.
[0621] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en donde el compuesto es un compuesto de Fórmula II como se define en el presente documento.
[0622] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en donde el compuesto es un compuesto de Fórmula III como se define en el presente documento.
[0623] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en donde el compuesto es urolitina A.
[0624] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en donde el compuesto es urolitina B.
[0625] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en donde el compuesto es urolitina C.
[0626] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en donde el compuesto es urolitina D.
Composiciones que comprenden urolitinas y otros compuestos
[0627] Un aspecto de la invención es una composición, que comprende una urolitina o un precursor de la misma y uno o más compuestos adicionales que inducen la autofagia. En determinadas realizaciones, el uno o más compuestos adicionales comprenden una urolitina. En determinadas realizaciones, el uno o más compuestos adicionales se selecciona del grupo que consiste en rapamicina, resveratrol, metformina y espermidina. En una realización relacionada, el uno o más compuestos adicionales comprenden tanto una urolitina o un precursor de la misma como un compuesto seleccionado del grupo que consiste en rapamicina, resveratrol, metformina y espermidina.
[0628] En una realización, la urolitina es una urolitina aislada.
[0629] En una realización, la urolitina es una urolitina purificada.
[0630] En una realización, la urolitina se selecciona del grupo que consiste en urolitina A, urolitina B, urolitina C, urolitina D y cualquier combinación de las mismas.
[0631] En una realización, la urolitina es urolitina A.
[0632] En una realización, la urolitina es urolitina B.
[0633] En una realización, la urolitina es urolitina C.
[0634] En una realización, la urolitina es urolitina D.
[0635] En determinadas realizaciones, la urolitina es un compuesto de Fórmula I, la Fórmula II o la Fórmula III, incluyendo uno cualquiera de los compuestos específicos de estas fórmulas descritos en el presente documento.
[0636] En determinadas realizaciones, la invención se refiere a una composición que comprende un primer compuesto seleccionado del grupo que consiste en: un compuesto de Fórmula II y un compuesto de Fórmula III, y un segundo compuesto seleccionado del grupo que consiste en rapamicina, resveratrol, metformina y espermidina.
[0637] En una realización, la composición comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.
[0638] Se sabe que la autofagia está fuertemente inducida por la restricción calórica (por ejemplo, inanición) e inhibida por la ruta mTOR. La restricción calórica, sin desnutrición, se ha informado que retrasa el envejecimiento y prolonga la esperanza de vida en varias especies, incluyendo insectos, gusanos, ratones, ratas, peces, monos e incluso seres humanos. Véase, por ejemplo, Fontana Let al.(2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:6659-6663; Colman RJet al.(2009) Science 325:201-204. Adicionalmente, se ha informado que la restricción calórica a largo plazo es muy eficaz para reducir el riesgo de aterosclerosis en seres humanos. Fontana Let al.(anteriormente citado).
[0639] Por otra parte, se sabe que la inhibición de la ruta mTOR promueve la autofagia y se sabe que los inhibidores de la ruta mTOR activan la autofagia. Se sabe que los inhibidores de la ruta mTOR incluyen rapamicina, metformina y resveratrol. Los agentes adicionales conocidos por estimular la autofagia, aunque a través de diferentes mecanismo o mecanismos, incluyen espermidina, clonidina, rilmenidina, tiramina, morfina, baclofeno, mastoparán, propranolol, bupivacaina, N-dodecil lisinamida, tamoxifeno, interferón (IFN)-gamma, trehalosa y vinblastina
[0640] La rapamicina ((3S,6R,7E,9R,10R,12R,14S,15E,17E,19E,21S,23S,26R,27R,34aS)-9,10,12,13,14,21,22,23,24,25,26,27,32,33,34,34a-hexadecahidro-9,27-dihidroxi-3-[(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-hidroxi-3-metoxilciclohexil]-1-metiletil]-10,21-dimetoxi-6,8,12,14,20,26-hexametil-23,27-epoxi-3H-pirido[2,1-c][1,4]-oxaazaciclohentriacontin-1,5,11,28,29(4H,6H,31H)-pentona), también conocida como sirolimus, es un agente inmunosupresor macrólido. Fue aprobado por la FDA en septiembre de 1999 y se comercializa con el nombre comercial Rapamune® por Pfizer (anteriormente por Wyeth). Se une a la proteína citosólica de unión a FK 12 (FKBP12) para formar un complejo que inhibe la ruta mTOR al unirse directamente al Complejo mTORI (mTORCI). EnC. elegansy en levadura, la rapamicina prolonga la esperanza de vida solo en condiciones en las que puede inducirse la autofagia. En 2006 se demostró por primera vez que la rapamicina prolonga la esperanza de vida de los eucariotas. Powerset al.((2006) Genes Dev. 20:174-184) mostraron un efecto dosis-sensible de la rapamicina en la extensión de la esperanza de vida en células de levadura. Sobre la base de este y otros trabajos, en un estudio de 2009, la esperanza de vida de los ratones suministrados con rapamicina aumentó entre un 28 y un 38 % desde el inicio del tratamiento, o entre un 9 y un 14 % en total de aumento de la esperanza de vida máxima. Harrison DEet al.(2009) Nature 460:392-395. De particular interés, el tratamiento se inició en ratones de 20 meses, el equivalente a 60 años humanos.
[0641] La metformina (Diamida A/,W-dimetilimidodicarbonimídica; rosiglitazona) es un compuesto de tiazolidinediona en una clase de fármacos antidiabéticos orales conocidos como la clase de biguanidas. Está disponible en el mercado en los Estados Unidos como Glucophage, Fortamet, Glumetza y Riomet, principalmente para su uso en el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 2 (resistente a la insulina). Dowling RJOet al.(2007) Cancer Res. 67:10804-10812 informaron que la metformina inhibe la ruta mTOR en células de cáncer de mama.
[0642] El resveratrol (3,5,4'-trihidroxi-trans-estilbeno) es un fenol natural que se encuentra en la piel de las uvas rojas y otras frutas, y es un activador indirecto de la sirtuina 1. También se ha producido por síntesis química. Farina Aet al.(2006) Nat. Prod. Res. 20:247-252. El resveratrol está disponible como suplemento nutricional a través de varios proveedores comerciales. Varios estudios han informado que el resveratrol extiende la esperanza de vida en levaduras, C.elegans, Drosophila,ciertos peces y ratones. Además, Brito PMet al.(2009) Atherosclerosis 205 126 134 informaron que el resveratrol inhibe la ruta mTOR.
[0643] Baur JAet al.(2006) Nature 444:337-342 informaron que el resveratrol desplaza la fisiología de ratones de mediana edad con una dieta alta en calorías a la de los ratones con una dieta estándar y aumenta significativamente su supervivencia. De acuerdo con Bauret al.,el resveratrol produce cambios asociados a una esperanza de vida más larga, incluyendo una sensibilidad a la insulina aumentada, niveles reducidos del factor de crecimiento similar a la insulina-1 (IGF-I), actividad aumentada de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) y del coactivador 1a del receptor gamma activado por el proliferador de peroxisomas (PGC-1a), número mitocondrial aumentado y función motora mejorada. El análisis paramétrico del enriquecimiento del conjunto de genes reveló que el resveratrol se oponía a los efectos de la dieta alta en calorías en 144 de 153 rutas significativamente alteradas.
[0644] Pearson KJet al.(2008) Cell Metab. 8:157-168 informaron que ratones ancianos alimentados con resveratrol muestran una marcada reducción en los signos de envejecimiento, incluyendo albuminuria reducida, inflamación disminuida y apoptosis en el endotelio vascular, elasticidad aórtica aumentada, mayor coordinación motora, formación de cataratas reducida y densidad mineral ósea preservada.
[0645] Además del resveratrol, se ha informado que otras moléculas pequeñas activan las sirtuinas y extienden la esperanza de vida en levaduras, incluyendo buteína (3,4,2',4'-tetrahidroxicalcona), piceatannol (3,5,3',4'-tetrahidroxitrans-estilbeno), isoliquiritigenina (4,2',4'-trihidroxicalcona), fisetina (3,7,3',4'-tetrahidroxiflavona) y quercetina (3,5,7,3',4'-pentahidroxiflavona). Howitz KTet al.(2003) Nature 425:191-196; Wood, JGet al.(2004) Nature 430:686-689, corrigendum Nature 431:107.
[0646] Los efectos de diversos tratamientos sobre el envejecimiento y la longevidad se evalúan habitualmente en invertebrados, incluyendo nematodos (C.elegans),levaduras y moscas de la fruta(Drosophila). C. elegans,en particular, es el modelo más comúnmente empleadoin vivopara determinar el impacto en la longevidad debido a su corta esperanza de vida y su facilidad de manipulación genética. Las intervenciones farmacéuticas que extienden la esperanza de vida de C.eleganstambién se ha demostrado que prolongan la esperanza de vida de levadura y las moscas de la fruta.
[0647] De forma importante, de acuerdo con la actual invención, se ha descubierto que la urolitina A es inesperadamente más potente, en términos de extensión de la vida, que cualquiera de rapamicina, resveratrol, metformina o espermidina. Con referencia a la Tabla 11, está claro que las urolitinas son las más potentes entre todos los compuestos enumerados, en términos de extensión de la vida, aumentando la extensión media de la vida en un 75 % frente al 27 % para metformina, el otro compuesto más potente enumerado. Esto ilustra que las urolitinas muestran efectos superiores con respecto a su capacidad para retrasar las consecuencias negativas relacionadas con el envejecimiento. Los efectos de otras urolitinas también han mostrado efectos impresionantes en la extensión de la vida (Figura 4). Se observan efectos similares en todas las urolitinas probadas, por lo que se espera que la clase de compuestos en su conjunto muestre efectos comparables.
T l 11. m r i n l f l m iv r x n r l r nz vi. l n
[0648] Como se indica anteriormente, la invención abarca métodos y composiciones que combinan urolitinas, con uno o más agentes adicionales que promueven la autofagia. Dichos agentes incluyen, sin limitación, rapamicina, metformina, resveratrol, espermidina, galato de epigalocatequina, genisteína, silibinina, curcumina, clonidina, rilmenidina, tiramina, morfina, baclofeno, mastoparán, propranolol, bupivacaina, N-dodecil lisinamida, tamoxifeno, IFN-gamma, trehalosa y vinblastina.
[0649] La invención abarca además métodos y composiciones que combinan urolitinas o precursores de las mismas, junto con uno o más agentes que son útiles para los trastornos mitocondriales. Dichos agentes, que pueden identificarse como medicamentos y suplementos mitocondriales, incluyen riboflavina (vitamina B<2>), L-creatina, L-arginina, L-carnitina, B50 o B100 (complejos de vitaminas B), vitamina E, vitamina C, ácido alfalipoico y ácido folínico (por ejemplo, como leucovorina).
Formulaciones y uso clínico
[0650] Se cree que los métodos y composiciones de la invención son útiles en cualquiera de una diversidad de entornos clínicos para los que es deseable aumentar la autofagia y/o mejorar la función mitocondrial. Los métodos y las composiciones de la invención pueden usarse para el tratamiento y la prevención de enfermedades y afecciones en las que es deseable aumentar la autofagia y/o mejorar la función mitocondrial. Las indicaciones no limitantes para el uso clínico incluyen: trastornos inmunitarios, mejorar la función de las células madre, todas las afecciones de salud relacionadas con el envejecimiento en las que se acumula una disminución de la autofagia con el envejecimiento y/o un aumento de mitocondrias defectuosas o que funcionan de manera subóptima, por ejemplo, enfermedad neurodegenerativa, cardiopatía, enfermedad vascular, ateroesclerosis, degeneración macular, pérdida auditiva sensorial, obesidad, hígado graso, cáncer y enfermedad infecciosa. También se cree que los métodos y las composiciones de la invención son útiles en el tratamiento y la prevención de la lesión por isquemia y reperfusión (incluyendo, por ejemplo, accidente cerebrovascular, infarto de miocardio, derivación cardíaca y trasplante de órganos). También se cree que los métodos y las composiciones de la invención son útiles en el tratamiento de determinados trastornos de la piel, incluyendo envejecimiento de la piel, inflamación de la piel y psoriasis. También se cree que los métodos y las composiciones de la invención son útiles en el tratamiento de la osteoartritis.
[0651] En otro aspecto, la presente invención presenta un método para mejorar la autofagia en un sujeto con una enfermedad o afección; el método incluye administrar al sujeto una cantidad efectiva de una urolitina o un precursor de la misma, tratando de esta manera la enfermedad o afección en el sujeto. En realizaciones relacionadas, la invención incluye métodos para tratar o prevenir cualquiera de una diversidad de enfermedades o afecciones proporcionando a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una urolitina o un precursor de la misma. En realizaciones particulares, la urolitina o el precursor de la misma está presente en una composición farmacéutica. En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica comprende uno o más principios activos adicionales, tales como, por ejemplo, una o más urolitina adicional o precursor de la misma u otro compuesto descrito en el presente documento. En realizaciones particulares, la urolitina o precursor de la misma está presente en un alimento o bebida médicos, alimentos o bebidas funcionales o nutracéuticos. En determinadas realizaciones, la comida o bebida médica, el alimento o la bebida funcional o el nutracéutico comprende uno o más principios activos adicionales, tales como, por ejemplo, una o más urolitina adicional o precursor de la misma u otro compuesto descrito en el presente documento.
[0652] La urolitina o precursor de la misma puede administrarse, sola o junto con al menos un agente distinto, a un sujeto (por ejemplo, un mamífero) en cualquiera de una diversidad de formas. Por ejemplo, la urolitina o precursor de la misma puede administrarse por vía oral o por vía parenteral. Por vía parenteral incluye, sin limitación, por vía intravenosa, por vía intramuscular, por vía intraperitoneal, por vía subcutánea, por vía intraarticular, por vía intrasinovial, por vía intraocular, por vía intratecal, por vía tópica o por inhalación. Como tal, la forma de la dosis de urolitina o precursor de la misma puede ser cualquiera de una diversidad de formas adecuadas, incluyendo compuestos puros, alimentos naturales, alimentos procesados, zumos naturales, concentrados y extractos, soluciones inyectables, microcápsulas, nanocápsulas, liposomas, emplastos, formas de inhalación, pulverizaciones nasales, gotas nasales, colirios, comprimidos sublinguales y preparaciones de liberación sostenida.
[0653] Los compuestos de esta invención pueden proporcionarse en forma aislada. Como se usa en el presente documento, el término "aislado" significa sustancialmente eliminado de otros compuestos o componentes con los que de otro modo podría encontrarse el compuesto de interés, por ejemplo, como se encuentra en la naturaleza. En una realización, un compuesto se aísla cuando se elimina esencialmente por completo de otros compuestos o componentes con los que de otro modo se podría encontrar el compuesto de interés. En una realización, un compuesto se aísla cuando es puro.
[0654] Los compuestos de la presente invención pueden incorporarse en una diversidad de formulaciones para administración terapéutica. Más particularmente, los compuestos de la presente invención pueden formularse en composiciones farmacéuticas mediante combinación con vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables apropiados y pueden formularse en preparaciones en formas sólidas, semisólidas, líquidas o gaseosas, tales como comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, pomadas, soluciones, supositorios, inyecciones, inhalantes, geles, microesferas y aerosoles. Como tal, la administración de los compuestos puede lograrse de varias maneras, incluyendo sin limitación administración oral, yugal, rectal, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, transdérmica e intratraqueal. El principio activo puede ser sistémico después de la administración o puede localizarse mediante el uso de administración regional, administración intramural o el uso de un implante que actúa para retener la dosis activa en el sitio de la implantación.
[0655] Los compuestos de la invención también pueden formularse como aditivos alimenticios, ingredientes alimenticios, alimentos funcionales, suplementos dietéticos, alimentos medicinales, nutracéuticos o suplementos alimenticios. En determinadas realizaciones, los compuestos de la invención pueden incluirse en bebidas nutracéuticas de volúmenes variables para permitir la administración de una dosis diaria en un formato conveniente. Como un ejemplo no limitante, las bebidas pueden suministrar dosis eficaces en un volumen final que varía de 5 ml a 1000 ml, suministradas como una dosis única o en dosis múltiples. En determinadas realizaciones, las composiciones y los métodos de la invención se usan para y en animales no humanos. En consecuencia, los compuestos y las composiciones de la invención pueden formularse como productos veterinarios. Los compuestos y la composición también pueden formularse en alimentos funcionales para su administración a animales, por ejemplo, perros, gatos, caballos, etc.
[0656] En las formas de dosificación farmacéuticas, los compuestos pueden administrarse en forma de sus sales farmacéuticamente aceptables. La expresión "sal farmacéuticamente aceptable" pretende abarcar cualquiera y todas las formas de sal aceptables derivadas de un ácido o base fisiológicamente aceptables. Los compuestos de la presente invención pueden utilizarse como el ácido libre o la base libre. Como alternativa, los compuestos de la presente invención pueden usarse en forma de sales de adición de ácido o base, que pueden formarse mediante métodos bien conocidos en la técnica.
[0657] Los compuestos también pueden usarse en asociación apropiada con otros compuestos farmacéuticamente activos. Los siguientes métodos y excipientes son meramente ilustrativos y no son limitantes en modo alguno.
[0658] Para preparaciones orales, los compuestos pueden usarse solos o en combinación con aditivos adecuados para preparar comprimidos, polvos, gránulos o cápsulas, por ejemplo, con aditivos convencionales, tales como lactosa, manitol, almidón de maíz o almidón de patata; con aglutinantes, tales como celulosa cristalina, derivados de celulosa, goma arábiga, almidón de maíz o gelatinas; con disgregantes, tales como almidón de maíz, almidón de patata o carboximetilcelulosa sódica; con lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio; y si se desea, con diluyentes, agentes tamponantes, agentes humectantes, conservantes y agentes saborizantes.
[0659] Los compuestos pueden formularse en preparaciones para inyecciones disolviendo, suspendiendo o emulsionándolos en un disolvente acuoso o no acuoso, tales como aceites vegetales u otros similares, glicéridos de ácidos alifáticos sintéticos, ésteres de ácidos alifáticos superiores o propilenglicol; y si se desea, con aditivos convencionales tales como solubilizantes, agentes isotónicos, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, estabilizantes y conservantes.
[0660] Los compuestos pueden usarse en formulaciones de aerosol para administrarse por inhalación. Los compuestos de la presente invención pueden formularse en propulsores aceptables presurizados tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares.
[0661] Adicionalmente, los compuestos pueden prepararse como supositorios mediante mezcla con una diversidad de bases tales como bases emulsionantes o bases hidrosolubles. Los compuestos de la presente invención pueden administrarse por vía rectal a través de un supositorio. El supositorio puede incluir vehículos tales como manteca de cacao, carboceras y polietilenglicoles, que se funden a la temperatura corporal, pero se solidifican a temperatura ambiente.
[0662] Las formas farmacéuticas unitarias para administración oral o rectal tales como jarabes, elixires y suspensiones pueden proporcionarse en donde cada unidad de dosificación, por ejemplo, cucharadita, cucharada, comprimido o supositorio, contiene una cantidad predeterminada de la composición que contiene uno o más compuestos de la presente invención. De forma similar, las formas farmacéuticas unitarias para inyección o administración intravenosa pueden comprender el compuesto de la presente invención en una composición como una solución en agua estéril, solución salina normal u otro vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde cada unidad de dosificación, por ejemplo, ml o l, contiene una cantidad predeterminada de la composición que contiene uno o más compuestos de la presente invención.
[0663] Los implantes para formulaciones de liberación sostenida son bien conocidos en la técnica. Los implantes están formulados como microesferas; placas, etc., con polímeros biodegradables o no biodegradables. Por ejemplo, los polímeros de ácido láctico y/o ácido glicólico forman un polímero erosionable que es bien tolerado por el hospedador. El implante que contiene los compuestos inhibidores puede colocarse cerca de un sitio de interés, de tal manera que la concentración local de principio activo aumenta en relación con el resto del cuerpo.
[0664] La expresión "forma farmacéutica unitaria", como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para sujetos humanos y animales, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuestos de la presente invención calculada en una cantidad suficiente de tal manera que produzca el efecto deseado en asociación con un diluyente, transportador o vehículo farmacéuticamente aceptables. Las especificaciones para las formas farmacéuticas unitarias novedosas de la presente invención dependen del compuesto particular empleado y el efecto que se va a conseguir, y la farmacodinámica asociada a cada compuesto en el hospedador.
[0665] Los excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como vehículos, adyuvantes, vehículos o diluyentes, están fácilmente disponibles para el público. Por otra parte, las sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, tales como agentes de ajuste del pH y tampones, agentes de ajuste de la tonicidad, estabilizantes, agentes humectantes y similares, están fácilmente disponibles para el público.
[0666] Para uso clínico, la urolitina se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz. Como se usa en el presente documento, una "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad que es suficiente para lograr o realizar un efecto biológico específico o deseado. Como se usa en el presente documento, una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad suficiente para realizar, en una sola dosis o en dosis múltiples, un efecto terapéutico deseado. Un experto puede determinar cantidades terapéuticamente eficaces basándose en estudiosin vitro,preclínicos o clínicos, o cualquier combinación de los mismos.
[0667] En una realización las urolitinas y sus precursores pueden administrarse por medio de productos naturales. Uno de ellos es la granada, que contiene elagitaninos y ácido elágico. Las granadas pueden procesarse de varias maneras para poner en práctica esta invención. El zumo de granada puede variar ampliamente en términos de sus constituyentes polifenoles, particularmente punicalagina, el elagitanino que tiene la mayor concentración se encuentra en la granada. El material de partida (es decir, granadas y su diversidad), el método para exprimir, así como las condiciones de almacenamiento afectarán a los niveles de punicalagina que se encuentran en el producto de zumo final. La Tabla 12 a continuación proporciona ejemplos de zumos que se han comprado en tiendas y de diferentes orígenes. Se observa una gran variación en la punicalagina de un lote de zumo a otro. Con el fin de poner en práctica esta invención es ventajoso que los individuos consuman un lote estandarizado de zumo que proporcione niveles conocidos y consistentes de elagitaninos. Actualmente en el mercado el zumo de granada no está estandarizado según los niveles de elagitaninos y la dosificación no está indicada. En consecuencia, los zumos actualmente disponibles no son adecuados para practicar eficazmente la invención ya que no ofrecen la posibilidad de una dosificación consistente por parte de un individuo, debido a las amplias variaciones de elagitaninos y sus concentraciones encontradas en los diferentes productos.
Tabla 12. Variación del contenid ^ ranada disponibles en el mercado
[0668] Como se ha descrito anteriormente, el consumo de elagitaninos por parte de los seres humanos conduce a la formación de urolitinas por la microflora intestinal antes de su absorción. Se cree que el consumo de elagitaninos tiene el potencial de modificar la microflora del intestino. En un estudio con ratas se observó que las urolitinas se encontraban en la orina sólo después de cuatro días de consumo, lo que sugiere que las ratas necesitaron tiempo para adaptar su microflora para metabolizar los taninos de la granada y producir los metabolitos de la urolitina. Cerdaet al.(2003) Eur J Nutr 42:18-28. Este descubrimiento sugiere que la dosificación óptima de elagitaninos en seres humanos puede requerir un período similar para que la microflora de cada individuo se adapte de manera óptima para metabolizar los elagitaninos consumidos o equivalentes de ácido elágico en urolitinas.
[0669] Adicionalmente, se ha demostrado que la composición de la microflora de los individuos puede variar drásticamente y que algunos individuos pueden metabolizar los elagitaninos más completamente que otros. Por ejemplo, tras el consumo de zumo de granada, algunas personas pueden convertir preferentemente los elagitaninos o equivalentes de ácido elágico en urolitina A, mientras que otros pueden convertirse preferentemente en urolitina C. También, se ha observado que ciertos individuos son altamente conversores (es decir, se forma un alto nivel de urolitinas en el intestino a partir de elagitaninos y equivalentes de ácido elágico consumidos), mientras que otros tienen una baja capacidad de conversión (es decir, sólo se forma un bajo nivel de urolitinas en el intestino a partir de los elagitaninos y equivalentes de ácido elágico consumidos). Se cree que estas diferencias en la producción de metabolitos desde un alto productor hasta un bajo productor y las variaciones de urolitina se deben a diferencias en la microflora del colon y al posible requisito de un período de adaptación. Cerdaet al.(2004) Eur J Nutr 43:205-220. En consecuencia, debido a estas variaciones a la hora de administrar elagitaninos y sus equivalentes, para determinadas aplicaciones puede resultar beneficioso administrar urolitinas directamente.
[0670] La dosificación generalmente será diaria a semanal. En una realización, la dosificación es al menos semanal. Por ejemplo, un sujeto puede recibir una dosis una vez a la semana, dos veces a la semana, tres veces a la semana o cada dos días. En una realización, la dosificación es al menos diariamente. Por ejemplo, un sujeto puede recibir una o más dosis diarias.
[0671] Se cree que la dosificación para una mayor eficacia en humanos implica una administración prolongada diaria, por ejemplo, al suministrar elagitaninos, cantidades equivalentes a al menos 500 ml (16 onzas) de zumo de granada al día. Se contempla el uso extendido para incluir el uso durante 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses o incluso más.
[0672] Para uso clínico, puede administrarse una urolitina para tratar una afección crónica o aguda. Como se observa que la autofagia aumenta en las células en menos de un día, por ejemplo, después de 8 horas, las urolitinas y sus variantes de Fórmula I, Fórmula II y Fórmula III pueden administrarse de forma aguda para tratar una afección que necesita de forma aguda una inducción de autofagia. Dichos casos pueden incluir afecciones debidas a lesiones por reperfusión (por ejemplo, trasplante de órganos), infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, lesión isquémica, durante una cirugía (por ejemplo, durante un procedimiento de angioplastia o reemplazo de una válvula cardíaca) o después de una lesión traumática.
[0673] Para uso clínico, generalmente se administrará una urolitina de la misma en una cantidad igual o equivalente a 0,2 - 2000 miligramos (mg) de urolitina por kilogramo (kg) de peso corporal del sujeto por día. En una realización, la urolitina se administra en una dosis igual o equivalente a 2 - 2000 mg de urolitina por kg de peso corporal del sujeto por día. En una realización, la urolitina se administra en una dosis igual o equivalente a 20 - 2000 mg de urolitina por kg de peso corporal del sujeto por día. En una realización, la urolitina se administra en una dosis igual o equivalente a 50 - 2000 mg de urolitina por kg de peso corporal del sujeto por día. En una realización, la urolitina se administra en una dosis igual o equivalente a 100 -2000 mg de urolitina por kg de peso corporal del sujeto por día. En una realización, la urolitina se administra en una dosis igual o equivalente a 200 - 2000 mg de urolitina por kg de peso corporal del sujeto por día.
[0674] Las formulaciones de urolitina pueden administrarse a sujetos humanos en cantidades terapéuticamente eficaces. Los intervalos de dosis típicos son desde aproximadamente 0,01 microgramos/kg a aproximadamente 2 mg/kg de peso corporal por día. La dosificación del fármaco a administrar es probable que dependa de tales variables como el tipo y el grado del trastorno, el estado general de salud del sujeto en particular, el compuesto específico que se está administrando, los excipientes usados para formular el compuesto y su vía de administración. Pueden usarse experimentos de rutina para optimizar la dosis y la frecuencia de dosificación de cualquier compuesto en particular.
[0675] En una realización, la urolitina se administra a una concentración en el intervalo de aproximadamente 0,001 microgramos/kg a más de aproximadamente 500 mg/kg. Por ejemplo, la concentración puede ser de 0,001 microgramos/kg, 0,01 microgramos/kg, 0,05 microgramos/kg, 0,1 microgramos/kg, 0,5 microgramos/kg, 1.0 microgramos/kg, 10,0 microgramos/kg, 50,0 microgramos/kg, 100,0 microgramos/kg, 500 microgramos/kg, 1.0 mg/kg, 5,0 mg/kg, 10,0 mg/kg, 15,0 mg/kg, 20,0 mg/kg, 25,0 mg/kg, 30,0 mg/kg, 35,0 mg/kg, 40,0 mg/kg, 45.0 mg/kg, 50,0 mg/kg, 60,0 mg/kg, 70,0 mg/kg, 80,0 mg/kg, 90,0 mg/kg, 100,0 mg/kg, 150,0 mg/kg, 200,0 mg/kg, 250.0 mg/kg, 300,0 mg/kg, 350,0 mg/kg, 400,0 mg/kg, 450,0 mg/kg, a más de aproximadamente 500,0 mg/kg o cualquier valor incremental del mismo. Debe entenderse que todos los valores e intervalos entre estos valores e intervalos pretenden estar abarcados por la presente invención.
[0676] En una realización, la urolitina se administra a una dosificación en el intervalo de aproximadamente 0,2 miligramos/kg/día a más de aproximadamente 100 mg/kg/día. Por ejemplo, la dosis puede ser de 0,2 mg/kg/día a 100 mg/kg/día, de 0,2 mg/kg/día a 50 mg/kg/día, de 0,2 mg/kg/día a 25 mg/kg/día, de 0,2 mg/kg/día a 10 mg/kg/día, de 0,2 mg/kg/día a 7,5 mg/kg/día, de 0,2 mg/kg/día a 5 mg/kg/día, de 0,25 mg/kg/día a 100 mg/kg/día, de 0,25 mg/kg/día a 50 mg/kg/día, de 0,25 mg/kg/día a 25 mg/kg/día, de 0,25 mg/kg/día a 10 mg/kg/día, de 0,25 mg/kg/día a 7,5 mg/kg/día, de 0,25 mg/kg/día a 5 mg/kg/día, de 0,5 mg/kg/día a 50 mg/kg/día, de 0,5 mg/kg/día a 25 mg/kg/día, de 0,5 mg/kg/día a 20 mg/kg/día, de 0,5 mg/kg/día a 15 mg/kg/día, de 0,5 mg/kg/día a 10 mg/kg/día, de 0,5 mg/kg/día a 7,5 mg/kg/día, de 0,5 mg/kg/día a 5 mg/kg/día, de 0,75 mg/kg/día a 50 mg/kg/día, de 0,75 mg/kg/día a 25 mg/kg/día, de 0,75 mg/kg/día a 20 mg/kg/día, de 0,75 mg/kg/día a 15 mg/kg/día, de 0,75 mg/kg/día a 10 mg/kg/día, de 0,75 mg/kg/día a 7,5 mg/kg/día, de 0,75 mg/kg/día a 5 mg/kg/día, de 1,0 mg/kg/día a 50 mg/kg/día, de 1,0 mg/kg/día a 25 mg/kg/día, de 1,0 mg/kg/día a 20 mg/kg/día, de 1,0 mg/kg/día a 15 mg/kg/día, de 1,0 mg/kg/día a 10 mg/kg/día, de 1,0 mg/kg/día a 7,5 mg/kg/día, de 1,0 mg/kg/día a 5 mg/kg/día, de 2 mg/kg/día a 50 mg/kg/día, de 2 mg/kg/día a 25 mg/kg/día, de 2 mg/kg/día a 20 mg/kg/día, de 2 mg/kg/día a 15 mg/kg/día, de 2 mg/kg/día a 10 mg/kg/día, de 2 mg/kg/día a 7,5 mg/kg/día o de 2 mg/kg/día a 5 mg/kg/día.
[0677] En una realización, la urolitina se administra a una dosificación en el intervalo de aproximadamente 0,25 miligramos/kg/día a aproximadamente 25 mg/kg/día. Por ejemplo, la dosificación puede ser de 0,25 mg/kg/día, 0,5 mg/kg/día, 0,75 mg/kg/día, 1,0 mg/kg/día, 1,25 mg/kg/día, 1,5 mg/kg/día, 1,75 mg/kg/día, 2,0 mg/kg/día, 2,25 mg/kg/día, 2,5 mg/kg/día, 2,75 mg/kg/día, 3,0 mg/kg/día, 3,25 mg/kg/día, 3,5 mg/kg/día, 3,75 mg/kg/día, 4.0 mg/kg/día, 4,25 mg/kg/día, 4,5 mg/kg/día, 4,75 mg/kg/día, 5 mg/kg/día, 5,5 mg/kg/día, 6,0 mg/kg/día, 6,5 mg/kg/día, 7,0 mg/kg/día, 7,5 mg/kg/día, 8,0 mg/kg/día, 8,5 mg/kg/día, 9,0 mg/kg/día, 9,5 mg/kg/día, 10 mg/kg/día, 11 mg/kg/día, 12 mg/kg/día, 13 mg/kg/día, 14 mg/kg/día, 15 mg/kg/día, 16 mg/kg/día, 17 mg/kg/día, 18 mg/kg/día, 19 mg/kg/día, 20 mg/kg/día, 21 mg/kg/día, 22 mg/kg/día, 23 mg/kg/día, 24 mg/kg/día, 25 mg/kg/día, 26 mg/kg/día, 27 mg/kg/día, 28 mg/kg/día, 29 mg/kg/día, 30 mg/kg/día, 31 mg/kg/día, 32 mg/kg/día, 33 mg/kg/día, 34 mg/kg/día, 35 mg/kg/día, 36 mg/kg/día, 37 mg/kg/día, 38 mg/kg/día, 39 mg/kg/día, 40 mg/kg/día, 41 mg/kg/día, 42 mg/kg/día, 43 mg/kg/día, 44 mg/kg/día, 45 mg/kg/día, 46 mg/kg/día, 47 mg/kg/día, 48 mg/kg/día, 49 mg/kg/día o 50 mg/kg/día.
[0678] En otra realización, la urolitina se administra en concentraciones que varían desde 0,01 micromolar hasta mayor que o igual a 500 micromolar. Por ejemplo, la dosis puede ser de 0,01 micromolar, 0,02 micromolar, 0,05 micromolar, 0,1 micromolar, 0,15 micromolar, 0,2 micromolar, 0,5 micromolar, 0,7 micromolar, 1,0 micromolar, 3.0 micromolar, 5,0 micromolar, 7,0 micromolar, 10,0 micromolar, 15,0 micromolar, 20,0 micromolar, 25,0 micromolar, 30.0 micromolar, 35,0 micromolar, 40,0 micromolar, 45,0 micromolar, 50,0 micromolar, 60,0 micromolar, 70.0 micromolar, 80,0 micromolar, 90,0 micromolar, 100,0 micromolar, 150,0 micromolar, 200,0 micromolar, 250.0 micromolar, 300,0 micromolar, 350,0 micromolar, 400,0 micromolar, 450,0 micromolar, a más de aproximadamente 500,0 micromolar o cualquier valor incremental del mismo. Debe entenderse que todos los valores e intervalos entre estos valores e intervalos pretenden estar abarcados por la presente invención.
[0679] En aun otra realización, la urolitina se administra a concentraciones que varían de 0,10 microgramos/ml a 500.0 microgramos/ml. Por ejemplo, la concentración puede ser de 0,10 microgramos/ml, 0,50 microgramos/ml, 1 microgramo/ml, 2,0 microgramos/ml, 5,0 microgramos/ml, 10,0 microgramos/ml, 20 microgramos/ml, 25 microgramos/ml. 30 microgramos/ml, 35 microgramos/ml, 40 microgramos/ml, 45 microgramos/ml, 50 microgramos/ml, 60,0 microgramos/ml, 70,0 microgramos/ml, 80,0 microgramos/ml, 90,0 microgramos/ml, 100.0 microgramos/ml, 150,0 microgramos/ml, 200,0 microgramos/ml, 250,0 g/ml. 250,0 microgramos/ml, 300.0 microgramos/ml, 350,0 microgramos/ml, 400,0 microgramos/ml, 450,0 microgramos/ml, a más de aproximadamente 500,0 microgramos/ml o cualquier valor incremental del mismo. Debe entenderse que todos los valores e intervalos entre estos valores e intervalos pretenden estar abarcados por la presente invención.
[0680] La expresión "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de urolitina necesaria para mejorar la autofagia, por ejemplo, en una enfermedad asociada a agregados de proteínas mal plegados. La cantidad eficaz de urolitina usada para mejorar la autofagia varía dependiendo de la forma de administración, la edad, el peso corporal y el estado de salud general del sujeto. Una cantidad eficaz de la urolitina, como se define en el presente documento, puede variar de acuerdo con factores tales como el cuadro clínico, la edad y el peso del sujeto y la capacidad de la urolitina de desencadenar una respuesta deseada en el sujeto. Las pautas posológicas pueden ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Una cantidad eficaz también es aquella en que los efectos terapéuticamente beneficiosos contrarrestan cualquier efecto tóxico o perjudicial (por ejemplo, efectos secundarios) del compuesto inductor de autofagia. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de urolitina (es decir, una dosificación eficaz) puede variar de aproximadamente 0,001 a 30 mg/kg de peso corporal, preferentemente de aproximadamente 0,01 a 25 mg/kg de peso corporal, más preferentemente de aproximadamente 0,1 a 20 mg/kg de peso corporal, e incluso más preferentemente de aproximadamente 1 a 10 mg/kg, de 2 a 9 mg/kg, de 3 a 8 mg/kg, de 4 a 7 mg/kg o de 5 a 6 mg/kg de peso corporal. El experto en la materia apreciará que determinados factores pueden influir en la dosis necesaria para tratar eficazmente a un sujeto, incluyendo, pero no limitado a la gravedad de la enfermedad o trastorno, los tratamientos anteriores, el estado de salud general y/o la edad del sujeto y otras enfermedades presentes. Por otra parte, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de la urolitina puede incluir un solo tratamiento o, preferentemente, puede incluir una serie de tratamientos. En un ejemplo, se trata un sujeto con la urolitina en el intervalo de entre aproximadamente 0,1 y 20 mg/kg de peso corporal, una vez a la semana durante entre aproximadamente 1 y 10 semanas, preferentemente entre 2 y 8 semanas, más preferentemente entre aproximadamente 3 y 7 semanas e incluso más preferentemente durante aproximadamente 4, 5 o 6 semanas. También se apreciará que la dosificación eficaz de la urolitina usada para el tratamiento puede aumentar o disminuir durante el transcurso del tratamiento particular.
[0681] Los ejemplos ilustrativos no limitantes de dosificaciones de urolitina que pueden usarse se proporcionan en la Tabla 13.
Tabla 13. Do ifi i n El i nin Á i l i r liin n r nes y hombres
[0682] Los ejemplos ilustrativos no limitantes adicionales de dosis de urolitina que pueden usarse se proporcionan en la Tabla 14.
Tabla 14. Dosificación de urolitina en ratones seres humanos
continuación
[0683] Los ejemplos ilustrativos no limitantes adicionales de intervalos de dosis de urolitina que pueden usarse se proporcionan en la Tabla 15.
Tabla 15. Dosificación de urolitina en seres humanos
continuación
[0684] Cualquier dosis puede darse como dosis única o en dosis divididas.
[0685] En una realización, la urolitina se administra en una dosis suficiente para alcanzar un nivel sérico máximo de urolitina y sus metabolitos conocidos (glucurónidos, sulfonatos, etc.) de al menos 0,001 micromolar (|jM). En una realización, la urolitina se administra en una dosis suficiente para alcanzar un nivel sérico máximo de urolitina de al menos 0,01<j>M. En una realización, la urolitina o precursor de la misma se administra en una dosis suficiente para alcanzar un nivel sérico máximo de urolitina de al menos 0,1 j M. En una realización, la urolitina se administra en una dosis suficiente para alcanzar un nivel sérico máximo de urolitina de al menos 1 j M. En diversas realizaciones, la urolitina se administra en una dosis suficiente para alcanzar un nivel sérico máximo de urolitina de al menos 10<j>M, al menos 20<j>M, al menos 30<j>M, al menos 40<j>M, al menos 50<j>M, al menos 60<j>M, al menos 70<j>M, al menos 80<j>M, al menos 90 j M, al menos 100 j M o al menos 200 j M.
[0686] En una realización, la urolitina se administra en una dosis suficiente para alcanzar un nivel sérico sostenido de urolitina de al menos 0,001 micromolar (j M). En una realización, la urolitina se administra en una dosis suficiente para alcanzar un nivel sérico sostenido de urolitina de al menos 0,01<j>M. En una realización, la urolitina se administra en una dosis suficiente para alcanzar un nivel sérico sostenido de urolitina de al menos 0,1 j M. En una realización, la urolitina se administra en una dosis suficiente para alcanzar un nivel sérico sostenido de urolitina de al menos 1 j M. En una realización, la urolitina se administra en una dosis suficiente para alcanzar un nivel sérico sostenido de urolitina de al menos 10 j M, la urolitina se administra en una dosis suficiente para alcanzar un nivel sérico sostenido de urolitina de al menos 50 j M. El nivel sérico sostenido puede medirse usando cualquier método adecuado, por ejemplo, cromatografía líquida de alta presión (HPLC) o HPLC-EM.
e j e m p l o s
Ejemplo 1
Síntesis de urolitina A
[0687] La urolitina A (4) se preparó en dos etapas a partir de bromuro 1 y resorcinol 2. El compuesto puro se obtuvo como un polvo amarillo pálido.
Etapa 1:
[0688] Una mezcla de ácido 2-bromo-5-metoxibenzoico 1 (27,6 g; 119mmol; 1,0 eq.), resorcinol 2 (26,3 g; 239 mmol; 2,0. eq) e hidróxido sódico (10,5 g; 263 mmol; 2,2 eq.) en agua (120 ml) se calentó a reflujo durante 1 hora. Una solución acuosa al 5 % de sulfato de cobre (3,88 g de CuSO4'5H2O en 50 ml de agua; 15,5 mmol; 0,1 eq.) se añadió después y la mezcla se sometió a reflujo durante 30 minutos adicionales. La mezcla se dejó enfriar a temperatura ambiente y el sólido se filtró en un filtro Büchner. El residuo se lavó con agua fría para dar un sólido rojo pálido que se trituró en MeOH caliente. La suspensión se dejó durante la noche a 4 °C. El precipitado resultante se filtró y se lavó con MeOH frío para producir el compuesto del título 3 como un sólido marrón pálido.
Etapa 2:
[0689] A una suspensión de 3 (10,0 g; 41 mmol; 1,0 eq.) en diclorometano seco (100 ml) se añadió gota a gota a 0 °C una solución 1 M de tribromuro de boro en diclorometano seco (11,93 ml de BBr<3>puro en 110 ml de diclorometano anhidro; 124 mmol; 3,0 eq.). La mezcla se dejó a 0 °C durante 1 hora y después se dejó calentar a temperatura ambiente. La solución se agitó a dicha temperatura durante 17 horas. Después se añadió hielo exhaustivamente a la mezcla. El precipitado amarillo se filtró y se lavó con agua fría para dar un sólido amarillo que se calentó a reflujo en ácido acético durante 3 horas. La solución caliente se filtró rápidamente y el precipitado se lavó con ácido acético, después con éter dietílico para producir el compuesto del título 4 como un sólido amarillo. RMN 1H y 13C estaban de acuerdo con la estructura de 4.
Ejemplo 2
Síntesis de urolitina B
[0690] La urolitina B (3) se preparó en una etapa mediante el acoplamiento de resorcinol (1) y ácido 2-bromobenzoico (2) siguiendo el procedimiento empleado para la preparación de urolitina A en el Ejemplo 1.
[0691] Una mezcla de resorcinol 1 (8,40 g; 75,6 mmol; 2,0 eq.), ácido 2-bromobenzoico (7,60 g; 37,8 mmol; 1,0 eq.) y NaOH (3,34 g; 83,5 mmol; 2,2 eq.) en agua (38 ml) se calentó a reflujo y se agitó durante 2 horas. Agua (30 ml) y CuSÜ4-5H2O (0,95 g; 3,78 mmol; 0,1 eq.) se añadieron y la mezcla se agitó a reflujo durante 1 hora adicional. La reacción se enfrió después lentamente a temperatura ambiente y el precipitado resultante se filtró. El producto se disolvió después en etanol absoluto y se concentró. El producto bruto se disolvió en metanol caliente y se filtró sobre papel para proporcionar el compuesto del título. RMN 1H y 13C estaban de acuerdo con la estructura de 3.
Ejemplo 3
Síntesis de urolitina C
[0692] La urolitina C (4) se preparó en dos etapas a partir de resorcinol (1) y ácido 2-bromo-4,5-dimetoxibenzoico (2) siguiendo el procedimiento anterior para la preparación de urolitina A en el Ejemplo 1.
[0693] Una mezcla de resorcinol 1 (8,00 g; 72,6 mmol; 2,0 eq.), ácido 2-bromo-4,5-dimetoxibenzoico 2 (9,50 g; 36,3 mmol; 1,0 eq.) y NaOH (3,20 g; 79,9 mmol; 2,2 eq.) en agua (36 ml) se calentó a reflujo y se agitó durante 2 horas. Agua (20 ml) y CuSO4'5H2O (0,91 g; 3,63 mmol; 0,1 eq.) se añadieron y la mezcla se agitó a reflujo durante 1 hora adicional. La reacción se enfrió después lentamente a temperatura ambiente y el precipitado resultante se filtró. El producto se disolvió después en etanol absoluto y se concentró. El producto bruto se llevó a la siguiente etapa sin purificación adicional.
Etapa 2: Preparación del compuesto 4
[0694] Una solución 1 M de BBr<3>en diclorometano (11 ml; 11,0 mmol; 6,0 eq.) se añadió gota a gota a una solución de intermedio 3 (500 mg; 1,84 mmol; 1,0 eq.) en diclorometano frío (0 °C) (5 ml). La mezcla de reacción se agitó después a 0 °C durante 1 hora y a temperatura ambiente durante 48 horas adicionales. La reacción se hidrolizó después mediante la adición de hielo. El precipitado se filtró y se lavó con agua helada hasta pH 7. El producto se disolvió después en etanol absoluto y se concentró. El producto bruto se secó al vacío en presencia de P<2>oh<5>para proporcionar el compuesto del título. RMN 1H y 13C estaban de acuerdo con la estructura de 4.
Ejemplo 4
Síntesis de urolitina D
[0695] La urolitina D (5) se preparó en tres etapas a partir de 2,3-dimetoxifenol (1) y ácido 2-bromo-4,5-dimetoxibenzoico (2).
Etapa 1: Preparación del compuesto 3
[0696] Cloruro de oxalilo (1,07 ml; 12,6 mmol; 1,1 eq.) y dimetilformamida (1 gota; cat.) se añadieron a una suspensión fría (0 °C) de ácido 2-bromo-4,5-dimetoxibenzoico 2 (3,00 g; 11,5 mmol; 1,0 eq.) en diclorometano (20 ml). Después de la adición, la mezcla de reacción se agitó durante 5 minutos a 0°C y después durante 16 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida. El aceite resultante se solubilizó en diclorometano (10 ml) y se enfrió a 0 °C. 2,3-Metoxifenol 1 (1,90 g; 12,6 mmol; 1,1 eq.) y trietilamina (2,4 ml; 17,2 mmol; 1,5 eq.) se añadieron sucesivamente y la mezcla se agitó durante 5 minutos. Finalmente se añadió acetonitrilo (10 ml) y la solución resultante se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente. La reacción se detuvo mediante la adición de una solución saturada de cloruro de amonio y las capas se separaron. La fase acuosa se extrajo con diclorometano y las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice para producir el compuesto del título 3.
Etapa 2: Preparación del compuesto 4
[0697] Acetato sódico (1,79 g; 21,8 mmol; 2,0 eq.), (S)-Phos (451 mg; 1,1 mmol; 0,1 eq.) y diacetato de paladio (244 mg; 1,1 mmol; 0,1 eq.) se añadieron sucesivamente a una solución de 3 (4,32 g; 10,9 mmol; 1 eq.) en dimetilacetamida (200 ml) en una atmósfera de argón. La mezcla de reacción se agitó a 130 °C durante 3 días. La reacción se inactivó mediante la adición de agua y la mezcla se extrajo con diclorometano. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato sódico y se concentraron a presión reducida. La dimetilacetamida restante se eliminó usando un aparato de Hickman. El aceite oscuro bruto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice para producir el compuesto del título 4.
Etapa 3: Preparación del compuesto 5
[0698] Tribromuro de boro (726 pl; 10,3 mmol; 5,0 eq.) se añadió a una solución fría (15 °C) del compuesto 4 (650 mg; 2,0 mmol; 1,0 eq.) en cloroformo (7,3 ml). Después de la adición, la mezcla de reacción se dejó alcanzar la temperatura ambiente y se agitó durante 15 minutos. La mezcla se calentó después a 60 °C y se agitó durante 4 días. La reacción se inactivó mediante la adición de metanol y la mezcla se evaporó a sequedad. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna en C<18>para producir el compuesto puro 5.
Ejemplo 5
Las urolitinas prolongan la esperanza de vida enC. elegans
[0699] Las cepas deC. elegansse cultivaron a 20 °C en placas de agar con medio de crecimiento de nematodos (NGM) sembradas con la cepa deE. coliOP50. La cepa usada fue Bristol N2 de tipo silvestre proporcionada por el Centro de Genética Caenorhabditis (Universidad de Minnesota). Todos los compuestos se disolvieron en DMSO. Los animales fueron expuestos a compuestos de huevos en placas sembradas con bacterias OP50 vivas. Se prepararon placas control con las concentraciones correspondientes de DMSO (0,1 %). Para pruebas de esperanza de vida, los gusanos se observaron usando un microscopio estereoscópico Nikon SMZ 1500 (Nikon, Melville, NY, EE.UU.). Brevemente, se transfirieron 10 gusanos L4 a placas que contenían medio NGM con vehículo solo (DMSO al 0,1 %) o compuestos de prueba disueltos en DMSO (DMSO al 0,1 %) y se sembraron con la cepa deE. coliOP50. Después de 3 días (correspondiente al día 0), se usaron de 60 a 100 gusanos L4 recién desarrollados por condición, se puntuaron y se transfirieron a placas nuevas cada 3 días a partir del día 1 (gusanos adultos jóvenes). Todos los experimentos de esperanza de vida se realizaron a 20 °C. Se censuraron los animales que se arrastraban fuera del plato o que tenían un fenotipo de "vulva explotada".
[0700] El tratamiento con urolitinas A, B, C y D a una concentración de 50 pM prolongó la esperanza de vida en C.elegans(Figura 4). El ácido elágico (EA) en la misma concentración no mostró efectos en la prolongación de la esperanza de vida de losC. elegans.
[0701] El tratamiento con urolitina A prolongó la esperanza de vida enC. elegansde una manera dependiente de la dosis (Figura 5). A una concentración de 10 pM la mediana de la esperanza de vida aumentó un 27,7 % y a una concentración de 50 pM la mediana de la esperanza de vida aumentó un 75 %.
Ejemplo 6
La urolitina A activaAMPK/aak-2ySIRT1lsir-2.1para mediar la longevidad
[0702] Los ensayos de esperanza de vida se realizaron con cepas deC. elegans(A) tipo silvestre (N2), (B)sir-2.1 (ok434)mutante, (C)aak-2(ok524),(D)daf-16(mu86),(E)eat-2(ad465)y (F)daf-2(e1370)mutante mantenidos durante su vida completa en placas suplementadas con 50 pM de urolitina A o con un tratamiento control y sembradas con bacterias OP50. Las placas de control sin urolitina A contenían una concentración equivalente de DMSO. Los ensayos de esperanza de vida de gusanos se realizaron a 20 °C. Se censuraron los animales que se arrastraban fuera del plato o que tenían un fenotipo de "vulva explotada".
[0703]sir-2.1: sir-2.1codifica el homólogo de mamífero de la desacetilasa SIRT1 dependiente de NAD en C.elegans.La actividad SIR-2.1/SIRT1 está mediada por el nivel de NAD+ nivel y está bien descrito que participa en la regulación de la longevidad en levaduras, C.elegans,yDrosophilaen respuesta a la restricción calórica.
[0704] aak-2/AMPK:aak-2codifica el homólogo mamífero de la quinasa dependiente de AMP AMPK en C.elegans.
[0705]daf-16codifica un factor de transcripción FOXO.
[0706]eat-2codifica una proteína implicada en el bombeo faríngeo.
[0707]daf-2codifica el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1) en C.elegans.
[0708] Los resultados se muestran en la Tabla 16 y la Figura 6. Como se muestra en la figura, la urolitina A extendió significativamente la esperanza de vida enC. elegansde tipo silvestre en un 75 %, demostrando que la urolitina A es un compuesto prolongevidad.
T l 1 . Ex n i n l r nz vi n m nir-2.1 k-2 f-1 f-2 -2 . l n
continuación
Estrés energético: ruta de restricción calórica
[0709] El mutantesir-2.1suprimió completamente la actividad de la urolitina A en la extensión de la mediana de la esperanza de vida enC. elegans.Esto indica quesir-2.1es necesario para la extensión de la esperanza de vida inducida por la urolitina A y que la urolitina A depende desir-2.1para extender la esperanza de vida.
[0710] El mutanteel aak-2suprimió significativamente el fenotipo de extensión de la esperanza de vida inducido por la urolitina A desde un aumento del 75 % en la esperanza de vida media hasta una extensión del 12,5 %. Esto indica queaak-2juega un papel importante en la esperanza de vida posterior a la exposición a la urolitina A. Esto también demuestra que la activación de AMPK por urolitina A es una etapa clave en la extensión de la esperanza de vida inducida por urolitina A.
Ruta de señalización de insulina
[0711] El mutantedaf-2suprimió completamente la actividad de la urolitina A en la extensión de la mediana de la esperanza de vida en C.elegans.Esto indica quedaf-2es necesario para la extensión de la esperanza de vida inducida por la urolitina A y que la urolitina A depende dedaf-2para extender la esperanza de vida.
[0712] El tratamiento de C.eleganscon cualquiera de rapamicina, resveratrol o metformina induce un aumento en la esperanza de vida media del gusano, que se ha demostrado que es el resultado de actuar sobre la ruta de la autofagia.
[0713] Vale la pena señalar que la extensión de la esperanza de vida inducida por el tratamiento con urolitina A (75 %) es mucho mayor que la extensión de la vida inducida por cualquiera de resveratrol (12,6 %), rapamicina (19 %) o metformina (27 %) solos.
Ejemplo 7
La urolitina A aumenta la actividad m itocondrial enC. elegans
[0714] Las cepas deC. elegansse cultivaron a 20 °C en placas de agar con medio de crecimiento de nematodos (NGM) sembradas con bacterias HT115 y que contenían urolitina A 50 pM o una concentración correspondiente de DMSO como control. Los gusanos fueron tratados desde los huevos hasta el primer día de edad adulta. Las cepas usadas fueron las SJ4103 (zcIs14[myo-3::GFP(mit)]), que es una línea transgénica estable que expresa una proteína fluorescente verde (GFP) localizada mitocondrialmente con un péptido señal de importación mitocondrial escindible bajo el control del promotor muscular específico de la pared corporalmyo-3.La expresión y la cuantificación de GFP se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente. Durieux Jet al.(2011) Cell 144:79-91. Los gusanos se trataron con urolitina A 50 pM desde huevos y se controló la GFP después de un día de edad adulta. Los ensayos fluorimétricos se realizaron usando un lector de placas de múltiples marcadores Victor X4 (Perkin-Elmer Life Science). Se recogieron ochenta gusanos al azar (20 gusanos por pocillo de una placa de 96 pocillos de paredes negras), y cada pocillo se leyó cuatro veces y se promedió.
[0715] Los resultados en Figura 7 muestran que el tratamiento de gusanos con urolitina A induce la expresión del indicador GFP mitocondrial impulsado por el promotor específico de músculomyo-3en C.elegans.Este sorprendente aumento en la expresión de GFP proporciona una evidencia clara de que la capacidad mitocondrial aumentó debido a la urolitina A. Para permitir tal aumento en la señal de GFP observada, las mitocondrias del músculo deben estar agrandadas o ser más numerosas en estos gusanos.
Ejemplo 8
La urolitina A aumenta la función m itocondrial enC. elegansenvejecidos
[0716] Las cepas deC. elegansse cultivaron a 20 °C en placas de agar con medio de crecimiento de nematodos (NGM) sembradas con la cepa deE. coliOP50. La cepa usada fue Bristol N2 de tipo silvestre proporcionada por el Centro de Genética Caenorhabditis (Universidad de Minnesota). La urolitina A se disolvió en DMSO. Los animales fueron expuestos a compuestos de huevos en placas sembradas con bacterias OP50 vivas. Se prepararon placas control con la concentración correspondiente de DMSO (0,1 %).
[0717] La medición del consumo de oxígeno es un indicador directo de la actividad mitocondrial. El efecto de la urolitina A sobre la actividad mitocondrial en C.elegansenvejecidos (10 días de edad) se evaluó tratando C.eleganscon urolitina A durante 10 días de la edad adulta, momento en el que se midió el consumo de oxígeno mediante el equipo Seahorse XF24 (Seahorse Bioscience Inc., North Billerica, MA). 250 C.elegansde diez días fueron usados por condición.C. elegansse recuperaron de placas NGM con medio M9, se lavaron tres veces en 2 ml de M9 para eliminar las bacterias residuales y se resuspendieron en 500 pl de medio M9. Los gusanos se transfirieron a placas Seahorse convencionales de 24 pocillos (n.° 100777-004) (50 gusanos por pocillo) y se midió el consumo de oxígeno. El consumo basal de oxígeno de los gusanos se midió primero durante 30 minutos a intervalos de 5 minutos (0 min, 5 min, 15 min, 20 min, 25 min y 30 min) con 5 réplicas por intervalo. Las tasas de respiración se normalizaron al número exacto de gusanos por pocillo determinado después de completar el experimento usando un estereomicroscopio. Después de determinar el consumo basal de oxígeno, el consumo de oxígeno desacoplado se midió añadiendo carbonilcianuro-p-(trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP) en el momento de 30 minutos al medio para evaluar la capacidad máxima de consumo de oxígeno y la capacidad mitocondrial máxima. El consumo de oxígeno desacoplado se midió a intervalos de 5 minutos (35 min, 40 min, 45 min, 50 min, 55 min y 60 min) para permitir medir la función mitocondrial a lo largo del tiempo.
[0718] FCCP es un agente desacoplador químico que suprime el enlace obligatorio entre la cadena respiratoria y el sistema de fosforilación que se observa con las mitocondrias intactas. Este efecto se debe a las propiedades anfipáticas de la molécula que se disuelve en las bicapas de fosfolípidos mitocondriales. Esto aumenta drásticamente la permeabilidad iónica de la membrana mitocondrial y genera una espectacular fuga de protones que conduce a un aumento en el consumo de oxígeno debido a la extinción por parte del oxígeno de los electrones bombeados a la cadena respiratoria en paralelo a la fuga de protones. Dado que este consumo de oxígeno está disociado (desacoplado) de la producción de ATP (fosforilación oxidativa), FCCP aumenta el consumo de oxígeno al tiempo que disminuye la generación de energía (ATP) por parte de las mitocondrias. Las mitocondrias completamente desacopladas, como se logra con FCCP, muestran la máxima capacidad de su cadena respiratoria mitocondrial (consumo máximo de oxígeno) sin el "freno" que representa la fosforilación oxidativa y la producción de energía.
[0719] Los resultados representados en la Figura 8 (A y B) ilustran que la urolitina A aumenta la capacidad mitocondrial máximaC.elegansenvejecidos de 10 días, como lo representa un efecto prolongado sobre el aumento de la respiración desacoplada en gusanos tratados con urolitina A frente a gusanos tratados con control (DMSO). Los gusanos control no tratados mostraron un breve aumento en la respiración desacoplada que rápidamente volvió a los niveles basales de consumo de oxígeno. Los gusanos tratados con urolitina A mostraron una elevación más extendida en el consumo de oxígeno. El grado de actividad mitocondrial mejorada se muestra comparando el área bajo las curvas (AUC) durante el período de desacoplamiento con la respiración acoplada promedio empleada como el valor inicial. Se observó que la urolitina A aumentó significativamente la respiración desacoplada en gusanos envejecidos en comparación con los gusanos control no tratados durante el período de 30 minutos evaluado. La Figura 8C muestra los C.elegansenvejecidos, de 10 días, tienen una disminución en la respiración basal en comparación con los C.elegansjóvenes, de 1 día. La Figura 8D muestra que el tratamiento de gusanos con urolitina A a 30 pM normaliza las tasas de respiración y los C.elegansenvejecidos, de 10 días muestran niveles de consumo de oxígeno comparables a los de los C.elegansjóvenes, de 1 día.
Ejemplo 9
La urolitina A aumenta la autofagia en C.elegans
[0720] Las cepas deC. elegansse cultivaron a 20 °C en placas de agar con medio de crecimiento de nematodos (NGM) sembradas con bacterias OP50 y que contenían urolitina A 50 pM o una concentración correspondiente de DMSO como control. Los gusanos fueron tratados desde los huevos hasta el segundo día de la edad adulta. Las cepas usadas fueron las DA2122 (adIs2122[lgg-1::GFP rol-6(su1006)]), que es una línea transgénica que expresa la proteína LGG-1 (homóloga de LC3 en seres humanos) fusionada con la proteína verde fluorescente (GFP). Para la adquisición de imágenes, los gusanos se inmovilizaron con tetramisol (Sigma) y se montaron en almohadillas de agarosa al 6 % sobre portaobjetos de vidrio. Las imágenes se adquirieron usando el microscopio confocal vertical Zeiss LSM 700 (Carl Zeiss<a>G, Oberkochen, Alemania) de la misma parte de C.elegans.Para cada condición, se observaron y se tomaron imágenes de múltiples gusanos con los mismos parámetros iniciales. El procesamiento de imágenes y la cuantificación de eventos autofágicos se realizaron con el software Fiji.
[0721] Los resultados representados en la Figura 9 ilustran que la urolitina A aumenta el número de eventos autofágicos, como se representa por el número aumentado de puntos LGG-1::GFP por campo focal (plano) en gusanos tratados con urolitina A frente a gusanos tratados con control (DMSO). Esta observación se confirmó por el hecho de que la privación de alimentos, una intervención dietética que aumenta la autofagia enC. elegans,muestra el mismo perfil que los gusanos tratados con urolitina A. Este resultado proporciona evidencia clara de que el tratamiento con urolitina A es un inductor de la autofagia en los gusanos y podría explicar el fenotipo de longevidad asociado a un tratamiento tal, como ya se ha descrito que la inducción de la autofagia, por manipulación dietética o tratamiento con compuestos específicos, aumenta la esperanza de vida en varias especies animales. Hansen Met al.(2008) PLoS Genetics 4:e24; Eisenberg Tet al.(2009) Nat Cell Biol 11:1305-14; Bjedov Iet al.(2010) Cell Metab 11:35-46.
Ejemplo 10
La ruta autofágica está implicada en el fenotipo de longevidad inducido por la urolitina A enC. elegans
[0722] Las pruebas de esperanza de vida se realizaron como se describe. Mouchiroud Let al.(2011) Aging Cell 10:39-54. Brevemente, los gusanos se observaron usando un microscopio estereoscópico Nikon SMZ1500 (Nikon, Melville, NY, EE.UU.). Brevemente, se transfirieron 10 gusanos L4 a placas que contenían medio NGM con vehículo (DMSO al 0,1 %, concentración final) o urolitina A disuelta en DMSO (concentración final 50 j M) y se sembraron con clones de iARN deE. colicomo se indica. Después de 3 días (correspondiente al día 0), se usaron 60-100 gusanos L4 recién desarrollados por condición, se puntuaron y se transfirieron a placas nuevas cada 3 días a partir del día 1 (gusanos adultos jóvenes). Todos los experimentos de esperanza de vida se realizaron a 20 °C. Se censuraron los animales que se arrastraban fuera del plato o que tenían un fenotipo de "vulva explotada".
[0723] Los análisis de supervivencia se realizaron usando el método de Kaplan Meier y la significancia de las diferencias entre las curvas de supervivencia se calculó mediante la prueba de rango logarítmico. Las diferencias entre dos grupos se evaluaron mediante pruebas t de dos colas. El análisis de la varianza, evaluado mediante la prueba de comparación múltiple de Bonferroni, se usó al comparar más de dos grupos. El software estadístico usado fue GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc.) y todos los valores de p <0,05 se consideraron significativos.
[0724] El silenciamiento genético se llevó a cabo como se describió anteriormente usando el proceso de interferencia de a Rn (iARN). Mouchiroud Let al.(2011) Aging Cell 10:39-54. En C.elegans,la iARN se produce mediante la alimentación. Brevemente, los nematodos fueron alimentados con bacterias modificadas con un plásmido que codifica un ARNbc dirigido a un gen de interés. Los gusanos se comen estas bacterias, lo que simplemente permitirá la inactivación de este gen. Como control, los gusanos fueron alimentados con los clones de iARN HT115, que codifica un vector vacío.
[0725] Para determinar el requisito de la ruta autofágica para el fenotipo de esperanza de vida inducido por el tratamiento con urolitina A (Figura 10), dos genes que codifican proteínas autofágicas importantes fueron inhibidos por interferencia de ARN (iARN). Estas dos proteínas fueronvps-34(nombre de secuencia: B0025.1, homólogo de VPS34 en seres humanos), que codifica una fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) que regula múltiples etapas en el tráfico vesicular y que es necesaria para el mecanismo de autofagia, ybec-1(nombre de secuencia: T19E7.3, homólogo de beclina en seres humanos), que codifica un complejo de fosfatidilinositol 3-quinasa de clase III que desempeña un papel en la localización de proteínas de autofagia en estructuras preautofagosómicas. Ya se ha descrito que la inhibición de su expresión por iARN suprime el fenotipo de esperanza de vida inducido por la restricción dietética, que es una condición experimental que promueve la autofagia en C.elegans.Hansen Met al.(2008) PLoS Genetics 4:e24.
Tabla 17. Proteínas im licadas en la ruta de la autofa ia en diferentes es ecies
[0726] Los resultados representados en la Figura 10 ilustran que la urolitina A aumentó la esperanza de vida de los gusanos mediante la activación del mecanismo de autofagia. El hecho de que la extensión de la vida observada en gusanos tratados con urolitina A y suministrados con el vector vacío se suprima cuando estos gusanos se alimentan con bacterias que expresan iARN contravps-34obec-1revela que estas dos proteínas son necesarias y esenciales para el fenotipo de longevidad. Una observación tal muestra que el tratamiento con urolitina A promueve la actividad devps-34ybec-1y conduce a la inducción del mecanismo de autofagia para extender la longevidad.
Ejemplo 11
Las urolitinas mantienen la función muscular enC. elegansdurante el proceso de envejecimiento
[0727] Para examinar el efecto de las urolitinas sobre la función muscular, se examinó el bombeo faríngeo en gusanosC. elegansel día 7 y el día 14. Los gusanos se observaron usando un microscopio estereoscópico Nikon SMZ 1500 (Nikon, Melville, NY, EE.UU.). Diez gusanos L4 se transfirieron a placas que contenían medio NGM con vehículo (DMSO al 0,1 %, concentración final) o el compuesto de interés (urolitina A (UA), urolitina B (UB), urolitina C (UC), urolitina D (UD)) disuelto en DMSO (concentración final 50 j M) y se sembró con clones de iARN deE. colicomo se indica. Después de 3 días (correspondiente al día 0), se usaron de 60 a 100 gusanos L4 recién desarrollados por condición, se puntuaron y se transfirieron a placas nuevas cada 3 días a partir del día 1 (gusanos adultos jóvenes). Los experimentos se realizaron a 20 °C. Se censuraron los animales que se arrastraban fuera del plato o que tenían un fenotipo de "vulva explotada".
[0728] Las tasas de bombeo faríngeo se midieron los días 7 y 14 para 10 gusanos transfiriendo gusanos individuales a una placa sin sembrar y puntuando el bombeo faríngeo bajo un microscopio de disección durante 30 segundos. Después se calcularon las tasas de bombeo faríngeo extrapolando el bombeo realizado por los gusanos durante este período de 30 segundos.
[0729] El bombeo faríngeo en el día 7 aumentó notablemente para todas las urolitinas probadas (Figura 11), demostrando la capacidad del tratamiento con urolitina para mejorar la función muscular en gusanos jóvenes. Esta función muscular mejorada se mantiene en los gusanos que envejecen y el tratamiento con urolitina también mejora la función muscular en los gusanos el día 14. En los gusanos de edad avanzada (día 14), el tratamiento con urolitina, y en particular con urolitina A y B, disminuye la disminución de la actividad muscular relacionada con la edad (bombeo faríngeo).
[0730] Para examinar el efecto de las urolitinas sobre la actividad muscular durante el envejecimiento, se examinó la movilidad de C.elegansa lo largo del tiempo. Se prepararon poblaciones sincronizadas de nematodos de tipo silvestre mediante métodos convencionales y se cultivaron a 20 °C en agar NGM que conteníaE. coli(OP50) con o sin compuestos de prueba (ácido elágico (E<a>), urolitinas A (UA) y B (UB)). El Día 0, se prepararon cinco placas, conteniendo cada una 10 gusanos adultos jóvenes. Se analizó la movilidad de los gusanos a diferentes edades, día 1, 3, 5 y 8 de edad adulta. Para estos estudios se empleó la cepa de gusano de tipo silvestre (N2, Bristol).
[0731] Para el seguimiento del movimiento de C.elegans,se grabaron 45 segundos de video usando una cámara Nikon DS-L2 / DS-Fi1 y una configuración de controlador, conectado tanto a un ordenador como a un microscopio de campo brillante convencional, rastreando una placa completa de 10 gusanos, con 5 placas por condición. El movimiento de los gusanos durante este tiempo se calculó usando una versión adaptada del software de libre acceso Parallel Worm Tracker para MATLAB. El movimiento total durante el seguimiento de 45 segundos se promedió en todos los gusanos para cada condición. Este experimento se repitió dos veces con entre 40 y 70 gusanos por condición.
[0732] El tratamiento con ácido elágico no tiene ningún efecto sobre esta disminución de la movilidad relacionada con la edad (Figura 12). Por el contrario, el tratamiento con urolitina con 50<j>M de urolitina A o B, demostró una marcada capacidad para reducir la disminución de la función muscular y mantener la función muscular en gusanos C.elegansenvejecidos. Esto demuestra la capacidad del tratamiento con urolitina para preservar la función muscular durante el proceso de envejecimiento.
[0733] Para caracterizar adicionalmente el efecto de las urolitinas sobre la función y la movilidad muscular, C.elegansse trataron y se observó su movilidad bajo microscopía de lapso de tiempo. Se examinaron los efectos de la urolitina A sobre la función muscular en C.elegans.Brevemente, los gusanos se observaron usando un microscopio estereoscópico Nikon SMZ1500 (Nikon, Melville, NY, EE.UU.). Brevemente, 5 gusanos provenientes de diferentes placas se transfirieron a placas que contenían medio NGM con vehículo (DMSO al 0,1 %, concentración final) o compuesto de interés (ácido elágico (EA), urolitina A (UA), urolitina B (UB), urolitina C (UC), urolitina D (UD)) disuelto en DMSO (concentración final 50 j M) y se sembró con clones de iARN deE. colicomo se indica. El lapso de tiempo se realizó grabando 20 imágenes de gusanos móviles con un intervalo de 10 segundos usando un microscopio Zeiss Axioplan-2 (Carl Zeiss Microlmaging, Thornwood, NY, EE.UU.). El seguimiento de gusanos se realizó usando el software ImageJ. Los experimentos se repitieron tres veces.
[0734] El tratamiento con urolitina dio como resultado un marcado aumento de la motilidad que se mantuvo en diversos grados durante el proceso de envejecimiento (Figura 13). El efecto más fuerte se observó con la urolitina B. Los resultados presentados aquí demuestran la capacidad de todos los tratamientos con urolitina para mejorar la función muscular en C.elegansy preservar la función muscular contra la disminución de la actividad muscular relacionada con la edad.
Ejemplo 12
Las urolitinas inducen la autofagia en células de mamíferos
[0735] También se examinó la capacidad de las urolitinas para inducir la autofagia en células de mamíferos. Células ModeK derivadas del intestino, se cultivaron en medio RPMI 1640 que incluía 4,5 g/l de glucosa, 10 % suero fetal de ternera, piruvato sódico 1 mM, HEPES 10 mM, NEAA 0,1 mM, 2-Mercaptoetanol Penicilina 100 UI/ml y Estreptomicina 100 |jg/ml. Las células se cultivaron a 37 °C en una atmósfera de CO al 5 %.<2>. Las células se trataron con concentraciones crecientes de urolitina A (10 jM , 20 jM y 50 jM ). El tratamiento se realizó durante ocho horas, después de lo cual las células se lisaron y se prepararon para el análisis de transferencia Western. Los niveles de expresión de proteínas se examinaron para detectar proteínas relacionadas con la autofagia LC3-I y II (Cell Signaling antibody n.° 4108), p62 (Cell Signaling antibody n.° 5114), AMPKa (Cell Signaling antibody n.° 2603) y p-AMPKa (Cell Signaling antibody n.° 2531). Se midió el nivel de la proteína de mantenimiento HSP90 (anticuerpo n.° 610418 de BD Transduction Laboratories) como un control de carga.
[0736] Las concentraciones crecientes de urolitina A dieron como resultado niveles crecientes de AMPKa fosforilada (Figura 14). La proporción de p-AMPKa/AMPKa aumentó de manera dependiente de la dosis en respuesta al tratamiento con urolitina A, que varía desde inducción de 4 veces hasta más de 10 veces. El tratamiento con urolitina A también dio como resultado aumentos significativos en la proporción LC3-II/LC3-I (un sello distintivo de la autofagia), a todas las dosis probadas. La proporción de LC3-II/LC3-I aumentó hasta 10 veces en las células tratadas en comparación con las células tratadas con vehículo en las dosis probadas. Los niveles de p62 disminuyeron con la adición de urolitina A, de acuerdo con el proceso de autofagia. Estos resultados demuestran la capacidad de la urolitina A para inducir la autofagia.
[0737] La inducción de autofagia por urolitinas también se demostró en hepatocitos primarios de mamíferos. Se aislaron hepatocitos primarios mediante perfusión a través de la vena cava inferior suprahepática de ratones C57BL/6J de tipo silvestre de 7 a 9 semanas de edad, como se ha descrito anteriormente (Ryuet al.,2011). Los hepatocitos primarios aislados se cultivaron en Medio 199 que incluía 4,5 g/l de glucosa, 10% suero fetal de ternera, NEAA 0,1 mM, HEPES 10 mM y gentamicina 50 jg/ml. Estas células se trataron después con 10 jM , 20 jM o 50 jM de urolitina A durante un período de 16 horas, después de lo cual las células se lisaron y se prepararon para el análisis de transferencia Western. Los niveles de expresión de proteínas se examinaron para detectar proteínas relacionadas con la autofagia LC3-I y II (Cell Signaling antibody n.° 4108), p62 (Cell Signaling antibody n.° 5114), AMPKa (Cell Signaling antibody n.° 2603) y p-AMPKa (Cell Signaling antibody n.° 2531). Se midió el nivel de la proteína de mantenimiento HSP90 (anticuerpo n.° 610418 de BD Transduction Laboratories) como un control de carga.
[0738] El tratamiento con urolitina A a 20 y 50 jM condujo a mayores niveles de AMPKa fosforilada, en las células tratadas, la proporción de p-AMPKa/AMPK-a aumentó significativamente muy por encima de 10 veces la proporción de p-AMPKa/AMPK-a observada en las células control. De forma importante, se observó un efecto dependiente de la dosis y un aumento en la proporción de LC3-II a LC3-I después del tratamiento con urolitina A, un sello distintivo de la autofagia (Figura 15). Se observó que los niveles de proteína P62 disminuyeron después de la exposición a la urolitina A. Este efecto de la dosis de urolitina A en la proporción de proteína LC3-II/LC3-I, junto con la disminución de p62, demuestra la capacidad de la urolitina A para inducir autofagia en hepatocitos primarios de mamíferos y demuestra una actividad de autofagia general de las urolitinas en células primarias.
Ejemplo 13
Las urolitinas inducen la autofagia entre especies en células de mamíferos
[0739] La capacidad de las urolitinas para inducir la autofagia en células musculares de todas las especies se examinó usando mioblastos C2C12 de ratón y células de músculo esquelético primarias humanas.
[0740] Se cultivaron mioblastos C2C12 en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que incluía 4,5 g/l de glucosa, 20 % suero fetal de ternera y 50 jg/m l de gentamicina. Se disolvió urolitina en DMSO en una solución madre de 1 mM. Las células se trataron con concentraciones finales de urolitina A de 10 jM , 20 jM y 50 jM durante un período de 16 horas. Las células control se tratan con DMSO a una concentración final equivalente durante el mismo período y sirven como control sin tratar.
[0741] Se cultivaron miocitos esqueléticos primarios humanosin vitroy se expusieron a concentraciones crecientes de urolitina A, incluyendo 10 jM , 20 jM y 50 jM durante 16 horas. Los mioblastos esqueléticos humanos se cultivaron en DMEM más suero de caballo al 2 %. Las células control se tratan con DMSO a una concentración final equivalente durante el mismo período y sirven como control sin tratar.
[0742] Al final del tratamiento, las células se lisaron con tampón RIPA, se aplicaron a SDS-PAGE y se analizaron mediante transferencia Western. Los niveles de expresión de proteínas se examinaron para detectar proteínas relacionadas con la autofagia LC3-I y LC3-II (Cell Signaling antibody n.° 4108), p62 (Cell Signaling antibody n.° 5114), AMPKa (Cell Signaling antibody n.° 2603) y p-AMPKa (Cell Signaling antibody n.° 2531). Se midió el nivel de la proteína de mantenimiento p-actina (Cell Signaling Antibody n.° 4967) como un control de carga. Los resultados representativos se muestran en las Figuras 16 y 17.
[0743] En ambas células musculares C2C12 de ratón (Figura 16) y mioblastos primarios humanos (Figura 17) el tratamiento con urolitina A condujo a un aumento de la autofagia dependiente de la dosis, como se verifica mediante un aumento en la proporción de LC3-II a LC3-I, acompañado de una disminución en los niveles de p62, como se observa por el cambio en la densidad de las bandas en las transferencias Western. También, los niveles de AMPKa fosforilado (pAMPKa) aumentaron, y la proporción de pAMPKa/AMPKa aumenta varias veces en respuesta a la exposición a la urolitina A.
Ejemplo 14
Las urolitinas inducen la autofagia en células primarias
[0744] Las células endoteliales aórticas humanas (HAOEC) son células endoteliales primarias aisladas de la aorta humana normal. Procedieron de Cell Applications Inc. (CAI), San Diego, EE.UU. y se obtuvieron crioconservadas en el segundo pase de la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC). Las células se descongelaron y se cultivaron con medio de crecimiento de células endoteliales, proporcionada por la ECACC, número de catálogo 06091509 (CAI N.° 211-500), en una incubadora a 37 °C, humidificada con CO<2>al 5 %; el medio se cambió 24 horas después de la descongelación. El medio de crecimiento de células endoteliales se cambió cada dos días hasta que las células alcanzaron una confluencia del 80 %. Las células se subcultivaron después en cuatro placas de 6 pocillos y, después de una incubación durante la noche, se trataron con diferentes concentraciones de urolitina A, 10 pM, 20 pM y 50 pM o un control de DMSO durante un período de 16 horas, 3 pocillos por tratamiento. Las células control se tratan con DMSO a una concentración final equivalente durante el mismo período y sirven como control sin tratar.
[0745] Al final del tratamiento, las células se lisaron con tampón RIPA, se aplicaron a SDS-PAGE y se analizaron mediante transferencia Western. Los niveles de expresión de proteínas se examinaron para detectar proteínas relacionadas con la autofagia LC3-I y LC3-II (Cell Signaling antibody n.° 4108) y p62 (Cell Signaling antibody n.° 5114). Se midió el nivel de la proteína de mantenimiento HSP90 (anticuerpo n.° 610418 de BD Transduction Laboratories) como un control de carga. Los resultados representativos se muestran en la Figura 18.
[0746] En las células endoteliales aórticas primarias humanas (Figura 18) el tratamiento con urolitina A condujo a un aumento de la autofagia dependiente de la dosis, como se verifica mediante un aumento en la proporción de LC3-II a LC3-I hasta una inducción de hasta 3 veces a 50 pM de urolitina A, que también fue acompañado por una disminución en los niveles de p62, como se observa por el cambio en la densidad de las bandas en las transferencias Western. Estos resultados indican claramente que las urolitinas aumentan la autofagia en las células endoteliales.
Ejemplo 15
Las urolitinas inducen la autofagia en mamíferos
[0747] Para determinar la capacidad de la urolitina A para inducir la autofagiain vivo,se trataron ratones C57BL/6J sanos de 10 semanas de edad con una dieta convencional para roedores o bien una dieta que contenía urolitina A mezclada con alimentos para alcanzar una dosis de 55 mg/kg/día administrada a los ratones. Después de 8 semanas de tratamiento con urolitina A, se sacrificaron los ratones y se aisló quirúrgicamente el hígado de cada animal. Los hígados aislados se colocaron después en tampón de lisis y se prepararon para el análisis de transferencia Western.
[0748] Los niveles de expresión de proteínas se examinaron para detectar proteínas relacionadas con la autofagia L<c>3-I y LC3-II (Cell Signaling antibody n.° 4108), p62 (Cell Signaling antibody n.° 5114), AMPKa (Cell Signaling antibody n.° 2603) y p-AMPKa (Cell Signaling antibody n.° 2531). Se midió el nivel de la proteína de mantenimiento HSP90 (anticuerpo n.° 610418 de BD Transduction Laboratories) como un control de carga. Cada carril en la transferencia Western representa una muestra de proteína para el hígado de un solo ratón, para permitir la observación de los efectos en varios animales tratados.
[0749] El tratamiento con urolitina A a una dosis oral de 55 mg/kg/d que se mezcló con la dieta del pienso animal provocó un aumento de los niveles de AMPKa fosforilada (pAMPKa), así como un aumento en la proporción de LC3-II a LC3-I, un sello distintivo de la autofagia, en el hígado de un ratón sano tras el consumo oral (Figura 19). Se observó que el aumento de la autofagia inducida por el tratamiento oral era, en promedio, aproximadamente del 400 % con respecto a los ratones de control no tratados según la proporción de LC3-II/LC3-I. Los niveles de proteína p62 también disminuyeron con el tratamiento con urolitina A. Estos resultados demuestran la capacidad de la urolitina A para inducir la autofagia en células y tejidos de mamíferos después del consumo oral.
Ejemplo 16
La urolitina A mejora la actividad motora en mamíferos
[0750] Para examinar el efecto del tratamiento con urolitina A sobre la actividad y la función muscular en mamíferos, se trataron ratones C57BL/6J de 10 semanas de edad con una dieta convencional para roedores o bien una dieta que contenía urolitina A mezclada con alimentos para alcanzar una dosis de 55 mg/kg/día administrada a los ratones. Después de 11 semanas de tratamiento con urolitina A, se colocó una rueda para correr de 23 cm de diámetro en la jaula de cada ratón. La actividad de ejercicio espontáneo se midió durante un período de cinco días a intervalos de 20 minutos, permitiendo la captura del ritmo circadiano de la actividad física.
[0751] El tratamiento con urolitina A dio como resultado un aumento significativo y sostenido en la distancia recorrida por los ratones cada día (Figura 20). Durante los 3 días iniciales, los animales tratados con urolitina A mostraron un aumento del 25 % con respecto a los controles no tratados en la distancia acumulada recorrida. Esta diferencia aumentó aún más hasta el 29 % en los dos últimos días de la prueba. Estos resultados demuestran la capacidad del tratamiento con urolitina A para mejorar la actividad motora en mamíferos. Se observó un claro efecto del entrenamiento en el que los ratones a los que se administró urolitina A no sólo aumentaron su actividad de carrera espontánea, sino que hubo un aumento con el tiempo. Adicionalmente, esto demostró que los beneficios persisten en el tiempo.
Ejemplo 17
La urolitina A mejora la actividad motora en mamíferos envejecidos
[0752] Para examinar los efectos del tratamiento con urolitina A sobre la actividad motora en mamíferos de edad avanzada, se trataron ratones C57BL/6J de 17 meses de edad con una dieta para roedores alta en grasas o una dieta para roedores alta en grasas que contenía urolitina A mezclada con alimentos para alcanzar una dosis de 50 mg/kg/día suministrada a los ratones.
[0753] Después de 30 semanas de tratamiento con urolitina A, los ratones se alojaron individualmente y se colocó una rueda de 23 cm de diámetro en la jaula de cada ratón. La actividad de ejercicio espontáneo se midió de forma continua durante un período de dos días, lo que permitió capturar el ritmo circadiano de la actividad de ejercicio. Después de eso, los ratones fueron devueltos a sus jaulas.
[0754] Los ratones se acostumbraron a la presencia de la rueda de actividad el día 1. Para medir el efecto del tratamiento con urolitina A sobre la actividad y la función muscular, se midió la distancia acumulada que cubrieron los animales durante el período pico de carrera (fase oscura) del día 2. Como se muestra en la Figura 21, el tratamiento con urolitina A dio como resultado un aumento del 57 % (p<0,05) en la distancia acumulada recorrida en ratones envejecidos tratados y alimentados con una dieta alta en grasas. Esto muestra claramente los beneficios positivos de las urolitinas sobre la actividad espontánea y la carrera durante el envejecimiento. Esto proporciona evidencia de que la administración de urolitina a una población que envejece mejorará la actividad locomotora y la capacidad de correr y ayudará a prevenir el deterioro natural observado.
Ejemplo 18
La urolitina A mejora la fuerza muscular en mamíferos envejecidos
[0755] Para examinar los efectos del tratamiento con urolitina A sobre la función muscular en mamíferos envejecidos, se trataron ratones C57BL/6J de 17 meses de edad con una dieta para roedores alta en grasas o bien una dieta para roedores alta en grasas que contenía urolitina A mezclada con alimentos para alcanzar una dosis de 50 mg/kg/día administrada a los ratones.
[0756] Después de 26 semanas de tratamiento con urolitina A, se evaluó la función neuromuscular de los ratones mediante una prueba de prensión. Usando la prueba de prensión, puede medirse la fuerza de agarre de las extremidades anteriores de los ratones. Los ratones se colocaron sobre una rejilla para permitir que sus patas delanteras agarraran el soporte. Para medir la fuerza de agarre, los ratones son arrastrados hacia atrás en el eje del sensor hasta que ya no pueden sostener la rejilla.
[0757] Los resultados representativos se muestran en la Figura 22. Los ratones que recibieron urolitina A mostraron una mayor fuerza de agarre que los ratones no tratados.
Ejemplo 19
La urolitina A mejora la actividad locomotora en mamíferos envejecidos
[0758] La actividad locomotora también puede evaluarse midiendo los movimientos de los animales mediante detección infrarroja. Para determinar los efectos de la urolitina A sobre la actividad locomotora espontánea en animales envejecidos, se trataron ratones C57BL/6J de 16 meses de edad con una dieta convencional para roedores o bien una dieta que contenía urolitina A mezclada con alimentos para alcanzar una dosis de 50 mg/kg/día administrada a los ratones. Después de 34 semanas de tratamiento con urolitina A, los ratones fueron colocados en un sistema de monitorización de actividad locomotora, TSE Systems. Los transmisores y los receptores de infrarrojos se colocan en los ejes x, y y z. La interrupción de los rayos infrarrojos en el eje x, y por el paso del ratón, permite una medición del movimiento horizontal (ambulación). La interrupción de los rayos infrarrojos en el eje z por el ratón, permite medir el comportamiento de levantarse. Cada interrupción del haz da como resultado el registro de un recuento. Se midieron los recuentos totales para cada período de 30 minutos durante un período de dos días. Los recuentos totales observados durante el período de oscuridad de 12 horas, que corresponde al momento de mayor actividad en ratones, se sumaron para cada animal.
[0759] La Figura 23 muestra que los ratones envejecidos tratados con urolitina A mostraron un aumento del 14 % en la deambulación y un aumento del 25 % en levantarse. Estos resultados demuestran la capacidad de la urolitina A para aumentar la movilidad en animales envejecidos.
Ejemplo 20
La urolitina A aumenta la autofagia en el músculo esquelético de mamíferos envejecidos
[0760] Después de 34 semanas de tratamiento, los ratones del Ejemplo 19 se sacrificaron y se recogieron los órganos. Se evaluó la presencia de autofagia en los músculos gastrocnemios mediante la evaluación del cambio en la proporción de los marcadores de autofagia LC3 y p62 mediante análisis de transferencia Western. Cada carril corresponde a una muestra de músculo de un ratón individual. Los resultados representativos se muestran en la Figura 24. La proporción de LC3-II/LC3-I aumentó en los músculos de los ratones tratados con urolitina A (UA) frente a los ratones no tratados. Esto fue acompañado por una disminución en los niveles de p62 en los músculos de los ratones tratados con UA frente a los no tratados. Estos cambios en los niveles de LC3 y p62 en el músculo de ratones son consistentes con un aumento en el nivel de autofagia. Esto demuestra que la administración oral de urolitina A conduce a la autofagia a nivel de órganos, incluyendo el músculo. Los ratones que recibieron UA en sus dietas también mostraron un aumento de la activación de AMPK en sus músculos, como se observa por un aumento en la proporción de p-AMPKa/AMPKa.
Ejemplo 21
Las urolitinas inducen la autofagia en células musculares de ratón
[0761] Para determinar la capacidad de la urolitina A para inducir la autofagia en células musculares de ratón, se sembraron mioblastos de ratón C2C12 indiferenciados en matraces T25 y se incubaron durante la noche. Las células se incubaron en CO<2>al 5 % a 37°C. Estas células fueron tratadas con una de las urolitinas: urolitina A (UA), urolitina B (UB), urolitina C (UC) o urolitina D (UD), disueltas en una solución de DMSO al 0,1 % durante 24 horas. En un experimento UA, UB, UC y UD se dosificaron a una concentración de 100 pM para el tratamiento de mioblastos C2C12. En un estudio separado, se incubaron mioblastos C2C12 a concentraciones crecientes de UA (10 pM, 50 pM y 100 pM). Para cada experimento, se trató un cultivo de control con DMSO al 0,1 % durante el mismo período y sirvió como el control sin tratar. En los últimos 30 minutos de incubación, se añadió inhibidor de la degradación de lisosomas al cultivo. Las células se lavaron después con una solución de tampón fosfato y después se trataron con una solución al 1 % de enzima tripsina para eliminar las células adhesivas de las placas de cultivo celular. Las células se trataron después con reactivo de permeabilización selectiva EMD Millipore para permeabilizar las células y hacer que las proteínas celulares internas fueran accesibles al tratamiento con anticuerpos. Las células se incubaron después con anticuerpo contra LC3B de acuerdo con el protocolo del kit (EMD Millipore FlowCellect™ Autofagia LC3 Kit de ensayo basado en anticuerpos (N.° de cat. FCCH100171)). Las células se lavaron después y se resuspendieron en el tampón de ensayo del kit. Las células resultantes se pasaron después por un citómetro de flujo y se cuantificó la fluorescencia de LC3B-FITC para medir el nivel de LC3B en células C2C12 para los diversos tratamientos. Cuando las células se someten a autofagia, sus niveles intracelulares de LC3-II aumentan, lo que se detecta mediante este método. Esta autofagia puede detectarse mediante el marcado con anticuerpos fluorescentes de LC3B, que puede medirse cuantitativamente mediante citometría de flujo. Un aumento en la autofagia celular se refleja en una señal creciente en el histograma de LC3B FITC.
[0762] El tratamiento con urolitina A de las células C2C12 produce un aumento en la expresión de LC3B que depende de la dosis (Figura 25) demostrando la capacidad de la urolitina A para inducir autofagia en células musculares de ratón de una manera dependiente de la dosis (10 pM, 50 pM y 100 pM). En un estudio separado, también se observó inducción de autofagia en mioblastos de ratón C2C12 después del tratamiento con urolitina A (UA), urolitina B (UB), urolitina C (UC) y urolitina D (UD) a 100 pM después de 24 horas de tratamiento (Figura 26). La incubación con UA, UB, UC y UD condujeron a una señal creciente de LC3B como lo muestra el desplazamiento positivo del histograma. Estos datos demuestran la capacidad de las urolitinas como una clase de compuestos para inducir autofagia en mioblastos de mamíferos.
Ejemplo 22
Síntesis de urolitinas y precursores de urolitinas
[0763] Los ejemplos de compuestos de urolitina de la invención se muestran en la Figura 27 como compuestos 1 a 16. Los ejemplos de precursores de urolitina de esta invención se muestran en la Figura 27 como compuestos 17 a 25.
[0764] La Figura 28 describe métodos para sintetizar los compuestos 1 a 25 para permitir su uso terapéutico en la presente invención. Se conservan varias reacciones químicas y los detalles se proporcionan a continuación como Reacciones A, B, C y D.
Reacción A
[0765] Se añadieron cloruro de oxalilo (1 eq.) y dimetilformamida (cat.) a una suspensión del ácido benzoico (1 eq.) en diclorometano. La mezcla de reacción se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente y se concentró a presión reducida. El residuo se solubilizó inmediatamente en diclorometano y se enfrió a 0 °C. Se añadieron sucesivamente el fenol (1,1 eq.) y la trietilamina (1,5 eq.) y la mezcla se agitó durante 5 minutos. Finalmente se añadió acetonitrilo y la solución resultante se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente. La reacción se detuvo mediante la adición de una solución saturada de cloruro de amonio y las capas se separaron. La fase acuosa se extrajo con diclorometano y las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice.
Reacción B
[0766] Acetato sódico (2 eq.), (S)-Phos (0,1 eq.) y diacetato de paladio (0,1 eq.) se añadieron sucesivamente a una solución del éster (1 eq.) en dimetilacetamida en una atmósfera de argón. La mezcla de reacción se agitó a 130 °C durante 3 días. La reacción se inactivó mediante la adición de agua y la mezcla se extrajo con diclorometano. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato sódico y se concentraron a presión reducida. La dimetilacetamida restante se eliminó usando un aparato de Hickman. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice.
Reacción C
[0767] Se añadió tribromuro de boro (1,25 eq. De la fracción metoxi) a una solución de la urolitina protegida (1 eq.) en cloroformo. La mezcla se calentó después a 60 °C y se agitó durante 4 días. La reacción se inactivó mediante la adición de metanol y la mezcla se evaporó a sequedad. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre C<18>.
Reacción D
[0768] Una mezcla del difenol (2 eq.), el ácido bromobenzoico (1 eq.) y NaOH (2,2 eq.) en agua se calentó a reflujo y se agitó durante 2 horas. Se añadieron agua y CuSO4'5H2O (0,1 eq.) y la mezcla se agitó a reflujo durante 1 hora adicional. La reacción se enfrió después a temperatura ambiente y el precipitado se filtró sobre una frita de vidrio (porosidad 4). El producto se disolvió después en etanol absoluto y se concentró para eliminar el agua. El residuo se disolvió en metanol caliente y se filtró sobre papel.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Una urolitina para su uso en el tratamiento de trastornos de la piel, en donde el trastorno de la piel se selecciona de agresiones ambientales y lesiones cutáneas por una oxidación lipídica excesiva en pieles envejecidas y enfermas.
2. Una urolitina para su uso, de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el trastorno de la piel se selecciona de agresiones ambientales, por ejemplo, luz UV.
3. Una urolitina para su uso, de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el trastorno de la piel es una lesión de la piel por una oxidación excesiva de lípidos en la piel envejecida y enferma.
4. Una urolitina para su uso para mejorar o aumentar la autofagia en un animal, en donde la autofagia se mejora o se aumenta en células del animal seleccionadas de células de la piel.
5. Una urolitina para su uso, como se reivindica en la reivindicación 7 en donde las células de la piel comprenden queratinocitos.
6. Una urolitina para su uso para mejorar o aumentar la autofagia en un animal, en donde la autofagia se mejora o se aumenta en un tejido u órgano del animal seleccionado de piel.
7. Una urolitina para su uso para mejorar o aumentar la autofagia en un animal, en donde la autofagia se mejora o se aumenta en células del animal seleccionadas de células epiteliales y células endoteliales.
8. Una urolitina para su uso, en el tratamiento de trastornos de la piel, en donde la urolitina, se combina con uno o más agentes seleccionados de rapamicina, metformina, resveratrol, espermidina, galato de epigalocatequina, genisteína, silibinina, curcumina, clonidina, rilmenidina, tiramina, morfina, baclofeno, mastoparán, propranolol, bupivacaina, N-dodecil lisinamida, tamoxifeno, IFN-gamma, trehalosa y vinblastina.
9. Una urolitina para su uso, en el tratamiento de trastornos de la piel, en donde la urolitina, se combina con uno o más agentes seleccionados de 3riboflavina (vitamina B2), L-creatina, L-arginina, L-carnitina, los complejos de vitamina B B50 o B100, vitamina E, vitamina C, ácido alfa-lipoico y ácido folínico (por ejemplo, leucovorina).
10. Una urolitina para su uso, en el tratamiento de trastornos de la piel, en donde la urolitina se combina con uno o más agentes seleccionados de resveratrol, pirroloquinolina quinona, genisteína, hidroxitirosol y quercetina
11. Una urolitina para su uso, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la urolitina es una cualquiera o una combinación de urolitina A, urolitina B, urolitina C y urolitina D, por ejemplo, urolitina A.
12. Una urolitina para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde la urolitina o combinación de las mismas se administra por vía tópica.
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