ES3035028T3 - Trem2 antigen binding proteins and uses thereof - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a proteínas de unión a antígeno, como anticuerpos monoclonales, que se unen específicamente al receptor desencadenante humano expresado en células mieloides-2 (TREM2) y lo activan, así como a composiciones farmacéuticas que comprenden dichas proteínas. Las proteínas de unión a antígeno agonistas (p. ej., anticuerpos) de la invención son capaces de activar la señalización de TREM2/DAP12 en células mieloides en ausencia de entrecruzamiento mediado por Fc de las proteínas de unión a antígeno. También se describen métodos para tratar o prevenir afecciones asociadas con la pérdida de la función de TREM2, como la enfermedad de Alzheimer y la esclerosis múltiple, utilizando las proteínas de unión a antígeno. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de unión al antígeno Trem2 y sus usos

CAMPO DE LA INVENCION

[0001]La presente invención se relaciona con el campo de los biofármacos. En particular, la invención se refiere a proteínas de unión a antígenos, como anticuerpos, que se unen específicamente y activan el receptor humano de inmunoglobulinas expresado en las células mieloides-2 (TREM2), composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas de unión a antígenos, y métodos para producir y utilizar dichas proteínas de unión a antígenos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

[0002]TREM2 es un miembro de la superfamilia de receptores de Ig que se expresa en células de linaje mieloide, incluyendo macrófagos, células dendríticas y microglía (Schmid et al., Journal of Neurochemistry, Vol. 83:1309-1320, 2002; Colonna, Nature Reviews Immunology, Vol. 3: 445-453, 2003; Kiialainen et al., Neurobiology of Disease, Vol. 18: 314-322, 2005). TREM2 es un receptor inmunitario huérfano con un dominio intracelular corto y funciona mediante la señalización a través de la proteína adaptadora DAP12, cuyo dominio citoplasmático comprende un motivo ITAM (Bouchon et al., The Journal of Experimental Medicine, Vol. 194: 1111-1122, 2001). Al activarse TREM2, los residuos de tirosina dentro del motivo ITAM en DAP12 son fosforilados por la familia de quinasas Src, proporcionando sitios de acoplamiento para la proteína asociada a la cadena-Z de tirosina cinasa 70 (ZAP70) y la tirosina cinasa de bazo (Syk) a través de sus dominios SH2. (Colonna, Nature Reviews Immunology, Vol. 3) 445-453, 2003; Ulrich and Holtzman, ACS Chem. Neurosci., Vol. 7: 420-427, 2016). Las quinasas ZAP70 y Syk inducen la activación de varias cascadas de señalización corriente abajo, incluyendo la fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K), la proteína quinasa C (PKC), la quinasa regulada por señal extracelular (ERK) y el aumento del calcio intracelular (Colonna, Nature Reviews Immunology, Vol. 3: 445-453, 2003; Ulrich and Holtzman, ACS Chem. Neuroci., Vol. 7: 420-427, 2016).

[0003]TREM2 ha sido implicado en varios procesos de células mieloides, incluyendo fagocitosis, proliferación, supervivencia y regulación de la producción de citoquinas inflamatorias (Ulrich y Holtzman, ACS Chem. Neuroci., Vol. 7: 420-427, 2016). En los últimos años, TREM2 se ha relacionado con varias enfermedades. Por ejemplo, mutaciones tanto en TREM2 como en DAP12 se han vinculado a la enfermedad autosómica recesiva de Nasu-Hakola, la cual se caracteriza por quistes óseos, pérdida de masa muscular y fenotipos de desmielinización (Guerreiro et al., New England Journal of Medicine, Vol. 368: 117-127, 2013). Más recientemente, variantes en el gen TREM2 se han relacionado con un mayor riesgo de enfermedad de Alzheimer (EA) y otras formas de demencia, incluida la demencia frontotemporal (Jonsson et al., New England Journal of Medicine, Vol. 368). 107-116, 2013; Guerreiro et al., JAMA Neurology, Vol. 70:78-84, 2013; Jay et al., Journal of Experimental Medicine, Vol. 212: 287-295, 2015). En particular, la variante R47H ha sido identificada en estudios a nivel genómico como asociada con un mayor riesgo de EA de inicio tardío con una razón de posibilidades ajustada general (para poblaciones de todas las edades) de 2.3, solo superada por la fuerte asociación genética de ApoE con el Alzheimer. La mutación R47H se encuentra en el dominio extracelular de tipo Ig V del proteína TREM2 y se ha demostrado que afecta la unión a lípidos y la captación de células apoptóticas y Abeta (Wang et al., Cell, Vol. 160: 1061-1071, 2015; Yeh et al., Neuron, Vol. 91: 328-340, 2016), sugestivo de una pérdida de función ligada a la enfermedad. Además, la comparación post mortem de los cerebros de pacientes con enfermedad de Alzheimer con y sin la mutación R47H apoya la novedosa pérdida de función de barrera microglial para los portadores de la mutación, con la microglía portadora de R47H demostrando hipotéticamente una capacidad reducida para compactar placas y limitar su propagación (Yuan et al., Neuron, Vol. 90: 724-739, 2016). Alteración en la microgliosis ha sido reportada en modelos animales de enfermedad priónica, esclerosis múltiple y accidente cerebrovascular, lo que sugiere que TREM2 puede desempeñar un papel importante en el apoyo a la microgliosis en respuesta a la patología o daño en el sistema nervioso central (Ulrich y Holtzman, ACS Chem. Neuroci., Vol. 7: 420-427, 2016).

[0004]Ante los datos que indican que los déficits en la actividad de TREM2 afectan la función de los macrófagos y microglía y se correlacionan con ciertos trastornos neurodegenerativos, en el ámbito científico se necesita moléculas terapéuticas que puedan inducir o potenciar las funciones mediadas por TREM2.

[0005]La patente WO 2016/023019 se refiere a anticuerpos anti-TREM2 y métodos de uso de los mismos.

[0006]WO 2017/019846 se refiere a moléculas que se unen a PD1 y métodos de uso de las mismas.

[0007]WO 2017/062672 se refiere a anticuerpos contra TREM2 y métodos de uso de los mismos.

RESUMEN DE LA INVENCION

[0008]La presente invención se basa, en parte, en el diseño y generación de proteínas de unión a antígenos (por ejemplo, anticuerpos) que se unen específicamente y activan el TREM2 humano sin necesidad de unión cruzada adicional. Las proteínas de unión de antígenos agonistas de la invención son capaces de activar la señalización TREM2/DAP12 en las células mieloides en ausencia de agregación, agrupamiento y/o entrecruzamiento mediado por Fc de las proteínas de unión de antígenos. En consecuencia, la presente invención proporciona una proteína de unión de antígeno agonista aislada que se une específicamente a TREM2 humano, donde la proteína de unión de antígeno agonista es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 330, y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 331. También se proporciona una composición farmacéutica que comprende la proteína de unión al antígeno agonista, un polinucleótido aislado que codifica la proteína de unión al antígeno agonista, un vector de expresión que comprende el polinucleótido, una célula huésped que comprende el polinucleótido o el vector de expresión, un método para producir la proteína de unión al antígeno agonista, y la proteína de unión al antígeno agonista para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad, incluida cualquiera de las enfermedades mencionadas en las reivindicaciones.

[0009]El agonista TREM2, la proteína de unión a antígeno, es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión del mismo. En algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión del mismo es un anticuerpo quimérico o fragmento de unión del mismo. En otras formas de realización, el anticuerpo monoclonal o su fragmento de unión es un anticuerpo humanizado o su fragmento de unión. En otras formas de realización, el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión del mismo es un anticuerpo completamente humano o su fragmento de unión. El anticuerpo monoclonal puede ser de cualquier isotipo, como IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humano. En una forma de realización particular, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo humano de tipo IgG1. En otra forma de realización particular, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo humano de tipo IgG2.

[0010]El anticuerpo puede contener una o más modificaciones que afectan la glicosilación del anticuerpo. En algunas formas de realización, el anticuerpo contiene una o más mutaciones para reducir o eliminar la glicosilación. En tales formas de realización, el anticuerpo aglicosilado puede comprender una mutación en la posición de aminoácido N297 (según el esquema de numeración de la UE), como por ejemplo una mutación N297G, en su cadena pesada. El anticuerpo aglicosilado puede incluir mutaciones adicionales para estabilizar la estructura del anticuerpo. Tales mutaciones pueden incluir pares de sustituciones de cisteína, como A287C y L306C, V259C y L306C, R292C y V302C, y V323C e I332C (posiciones de aminoácidos según el esquema de numeración de la UE). En una forma de realización, el anticuerpo aglicosilado comprende mutaciones R292C y V302C (según el esquema de numeración de la UE) en su cadena pesada. En ciertas formas de realización, el anticuerpo agonista anti-TREM2 aglicosilado comprende una región constante de la cadena pesada que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 202 or SEQ ID NO: 203.

[0011]En otras formas de realización en los que la proteína de unión a antígeno agonista de TREM2 es un anticuerpo IgG2 humano (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal) o contiene una región CH1 y una región bisagra de un anticuerpo IgG2 humano, el anticuerpo puede contener una o más modificaciones que afecten la estructura de la bisagra del anticuerpo. En una de estas formas de realización, el anticuerpo agonista anti-TREM2 incluye una mutación C131S (según el esquema de numeración de la UE) en su cadena pesada. En otra forma de realización, el anticuerpo agonista anti-TREM2 comprende una mutación C214S (según el esquema de numeración de la UE) en su cadena ligera y una mutación C219S (según el esquema de numeración de la UE) en su cadena pesada. En otra forma de realización, el anticuerpo agonista anti-TREM2 incluye una mutación C214S (según el esquema de numeración de la UE) en su cadena ligera y una mutación C220S (según el esquema de numeración de la UE) en su cadena pesada.

[0012]En ciertas formas de realización, las proteínas de unión a antígenos agonistas de TREM2 de la invención pueden comprender una región CH1 y una región bisagra de un anticuerpo IgG2 humano (por ejemplo, el aminoácido de SEQ ID NO: 207), y una región Fc de un anticuerpo humano IgG1. En una forma de realización, la proteína de unión al antígeno agonista de TREM2 comprende una región CH1 y una región bisagra de un anticuerpo humano IgG2 (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 207) y una región Fc de un anticuerpo humano IgG1, en donde la región Fc comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 281.

[0013]El agonista TREM2 proteínas de unión de antígenos de la invención comprenden una cadena ligera que consta de una región variable de cadena ligera y una cadena pesada que consta de una región variable de cadena pesada, en donde la región variable de cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 330, y la región variable de la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 331. En ciertas formas de realización, las proteínas de unión a antígenos agonistas de TREM2 de la invención constan de una cadena ligera y una cadena pesada, en donde: la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 339, y la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 340.

[0014]La presente invención también proporciona polinucleótidos y vectores de expresión que codifican las proteínas de unión a antígenos agonistas de TREM2 según se especifica en las reivindicaciones, así como células huésped, como las células CHO, que contienen los polinucleótidos y vectores de expresión que los codifican. En ciertas formas de realización, la presente invención incluye métodos para producir los anticuerpos monoclonales agonistas anti-TREM2 y sus fragmentos de unión. El método comprende el cultivo de una célula huésped que contiene un vector de expresión que codifica la proteína de unión al antígeno en condiciones que permiten la expresión de la proteína de unión al antígeno, y la recuperación de la proteína de unión al antígeno del medio de cultivo o de la célula huésped, según se define en las reivindicaciones.

[0015]El agonista TREM2 proteínas de unión de antígenos descritas aquí se pueden utilizar en la fabricación de una composición farmacéutica o medicamento para el tratamiento o prevención de condiciones asociadas con la deficiencia de TREM2 o la pérdida de la actividad biológica de TREM2, como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Nasu-Hakola, la demencia frontotemporal, la esclerosis múltiple, la enfermedad priónica o el accidente cerebrovascular. Por lo tanto, la presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión a antígeno agonista de TREM2 según se define en las reivindicaciones y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

[0016]En ciertas formas de realización, la presente invención proporciona la proteína de unión al antígeno agonista tal como se define en las reivindicaciones para su uso en métodos para tratar, prevenir o reducir el riesgo de desarrollar afecciones asociadas con la deficiencia de TREM2 o la pérdida de la actividad biológica de TREM2 en un paciente que lo necesite. El método puede comprender la administración al paciente de una cantidad efectiva de las proteínas de unión al antígeno agonista TREM2 de la invención. En algunas formas de realización, la condición a tratar, prevenir o mejorar es la enfermedad de Alzheimer. En otras formas de realización, la condición a tratar, prevenir o aliviar es la esclerosis múltiple. El paciente que necesita tratamiento puede tener uno o más genotipos asociados con un mayor riesgo de desarrollar una enfermedad o afección que puede ser tratada de acuerdo con los métodos de la invención. Por ejemplo, en algunos ejemplos, el paciente tiene un genotipo asociado con un mayor riesgo de desarrollar la enfermedad de Alzheimer, como los genotipos descritos aquí. En otras formas de realización, se puede determinar que el paciente porta un alelo que codifica una variante de TREM2 asociada con un mayor riesgo de desarrollar la enfermedad de Alzheimer. Tales variantes pueden incluir la variante R47H de TREM2 y la variante R62H de TREM2.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0017]

La Figura 1Arepresenta las curvas dosis-respuesta para la actividad agonista de anticuerpos monoclonales humanos purificados anti-TREM2 de la cosecha 1. El aumento plegable en los niveles de Syk fosforilado (pSyk) en células HEK293T que expresan TREM2/DAP12 humano se representa en función de la concentración de anticuerpos humanos anti-TREM2. Actividad agonista de un anticuerpo anti-TREM2 de rata comercialmente disponible (mAb17291; mAb de R&D o Anticuerpo 1) se incluye para comparación. Se utilizaron anticuerpos de los isotipos IgG2 humano e IgG2b de rata como controles.

La Figura 1Bmuestra las curvas dosis-respuesta de la actividad agonista de anticuerpos monoclonales humanos anti-TREM2 no purificados procedentes de sobrenadantes de hibridomas de las cosechas 3, 4 y 5. El aumento plegado en los niveles de pSyk en células HEK293T que expresan TREM2/DAP12 humano se representa en función de la concentración de anticuerpos humanos anti-TREM2. Se utilizó un anticuerpo de isotipo IgG2 humano como control.

Las Figuras 2A y 2Bson alineaciones de secuencias de regiones variables de cadenas ligeras kappa de anticuerpos anti-TREM2 ejemplares con secuencias germinales originales.

La Figura 2Bes una continuación de las secuencias en la Figura 2A.

Las Figuras 3A y 3Bson alineaciones de secuencias de regiones variables de cadenas ligeras lambda de anticuerpos anti-TREM2 ejemplares a secuencias germinales originales.

La Figura 3Bes una continuación de las secuencias en la Figura 3A.

Las Figuras 4A y 4Bmuestran alineamientos de secuencia de las regiones variables de la cadena pesada de anticuerpos anti-TREM2 ejemplares con las secuencias germinales originales.

La Figura 4Bes una continuación de las secuencias en la Figura 4A.

La Figura 5es un gráfico de la señal de unión en función del tiempo de un sensor cinético anti-Fc humano (instrumento Octet® HTX; Pall ForteBio) cargado con el anticuerpo 6E7 en el momento indicado por la línea punteada (captura del 1er anticuerpo). El primer sólido denota el momento en el que se añadió un anticuerpo IgG2 humano irrelevante al sensor para reducir eventos de unión no específica (Bloqueo del sensor con G2). La segunda línea sólida indica el momento en el que se añadió el antígeno objetivo (TREM2 humano soluble) al sensor para interactuar con el anticuerpo 6E7 capturado. La línea sólida final indica el momento en que se agregó el anticuerpo de sándwich (5E3, 6E7, o un anticuerpo IgG2 de control) al sensor. Se observa un aumento en la unión cuando se agrega el anticuerpo 5E3, lo que sugiere que el anticuerpo 5E3 se une a un epítopo diferente en el TREM2 humano al epítopo al que se une el anticuerpo 6E7.

La Figura 6muestra una curva dosis-respuesta para la actividad agonista de anticuerpos monoclonales humanos anti-TREM2 (4C5, 4G10, 5E3, 6E7, 10E3, 13E7, 24G6, 16B8, 25F12, 26F2, 32E3 y 33B12) en células THP-1 diferenciadas. El incremento plegable en los niveles de Syk fosforilado (pSyk) sobre la línea de base se representa en función de la concentración de anticuerpos humanos anti-TREM2. Se utilizaron anticuerpos de isotipo IgG2 humano (HuIgG) e IgG2b de rata (RtIgG) como controles. Actividad agonista de un anticuerpo contra TREM2 de ratón/anti-humano disponible comercialmente (mAb 17291; RnD) se incluye para comparación.La Figura 7muestra las curvas dosis-respuesta para la actividad agonista de los anticuerpos humanos anti-TREM2 purificados 6E7 y 5E3 en formato IgG2 (G2), IgG1 (G1) o en formato IgG1 aglicosilada (SEFL2). El aumento plegado en los niveles de Syk fosforilado (pSyk) sobre el control isotípico correspondiente en células HEK293T que expresan TREM2/DAP12 humano se representa en función de la concentración de los anticuerpos anti-TREM2 humanos. La conversión de los anticuerpos 6E7 y 5E3 de un isotipo IgG2 a un isotipo IgG1 resulta en la pérdida parcial de la actividad agonista.

La Figura 8Aes un gráfico de barras de los números de macrófagos derivados de médula ósea (BMDMs) derivados de ratones de tipo salvaje (TREM+/+) y ratones TREM2'/_en diferentes días de cultivo bajo condiciones limitadas de CSF1. Los<t>R<e>M2'/_ BMDMs presentan un defecto de supervivencia en estas condiciones de cultivo.

La Figura 8Bmuestra un gráfico de barras del porcentaje de confluencia celular de microglía adulta de ratón derivada de ratones de tipo salvaje (TREM+/+) y ratones TREM2-/- en diferentes momentos en cultivo bajo condiciones limitantes de CSF-1. -Los microglia adultos de ratones TREM2-/- muestran un defecto de supervivencia en estas condiciones de cultivo.

La Figura 8Ces un gráfico de barras del porcentaje de confluencia celular de microglía neonatal de ratón derivada de ratones de tipo salvaje (TREM+/+) y ratones TREM2-/- en diferentes momentos en cultivo bajo condiciones limitantes de CSF-1. Las microglías de TREM2-/- neonatales presentan un defecto en la supervivencia con el tiempo.

La Figura 8Des un gráfico de barras de números de BMDMs derivados de ratones de tipo salvaje (TREM+/+) y TREM2R47H en diferentes días de cultivo bajo condiciones limitantes de CSF1. El ratón TR<e>M2R47H BM<d>M muestra un defecto de supervivencia en estas condiciones de cultivo.

La Figura 8Ees un gráfico de barras del porcentaje de confluencia celular de microglía adulta de ratón derivada de ratones tipo salvaje (TREM+/+) y TREM2R47H en diferentes momentos en cultivo bajo condiciones limitantes de CSF1. El microglia adulto del ratón TREM2R47H muestra un defecto en la supervivencia en estas condiciones de cultivo.

La Figura 8Frepresenta un gráfico de barras del porcentaje de confluencia celular de microglía neonatal de ratón derivada de ratones de tipo salvaje (TREM+/+) y ratones TREM2R47H en diferentes momentos en cultivo bajo condiciones limitantes de CSF-1. Las microglías neonatales con TREM2R47H muestran un defecto en la supervivencia que aumenta con el tiempo.

La Figura 9Aes una transferencia western de lisados celulares de macrófagos derivados de médula ósea (BMDMs) TREM2R47H y de tipo salvaje (TREM+/+) tratados con un anticuerpo anti-TREM2 o un control de isotipo. El anticuerpo anti-TREM2 activa la señalización TREM2/DAP12 en ambos tipos de macrófagos según lo indicado por el aumento en los niveles de pSyk.

La Figura 9Bes una transferencia western de lisados celulares de BMDMs TREM27' y de tipo salvaje (TREM2' /_) tratados con un anticuerpo anti-TREM2 o un control de isotipo. El anticuerpo anti-TREM2 no incrementa los niveles de pSyk en los BMDMs TREM27' confirmando que el efecto es específico para TREM2.

La Figura 10Amuestra un gráfico que representa el porcentaje de confluencia celular en función del tiempo para los BMDM TREM2R47H tratados con un anticuerpo isótico de control o un anticuerpo agonista anti-TREM2, medido mediante un ensayo de confluencia celular en tiempo real. Los datos se representan como media /- d.e. y provienen de un solo experimento representativo. El experimento se realizó dos veces de forma independiente (n=2 y se ensayó por triplicado).

La Figura 10Bes un gráfico que representa el porcentaje de confluencia celular a lo largo del tiempo para los BMDMs de tipo salvaje (TREM2+/+) tratados con un anticuerpo de control de isotipo o un anticuerpo agonista anti-TREM2, medido mediante un ensayo de confluencia celular en tiempo real. Los datos se representan como media /- d.e. y provienen de un único experimento representativo. El experimento fue realizado dos veces de forma independiente (n=2 y analizado por triplicado).

La Figura 10Ces un gráfico de barras que muestra la viabilidad celular medida por el ensayo de detección de ATP Cell Titer Glo para BMDMs TREM2R47H y TREM2+/_ tratados con vehículo, control de isotipo o un anticuerpo agonista anti-TREM2 durante 14 días.

La Figura 10Des un gráfico de barras que representa el porcentaje de confluencia celular en momentos específicos en el cultivo de microglía de ratón adulto TREM2R47H tratada con un anticuerpo de control de isotipo o un anticuerpo agonista anti-TREM2. Se observa un aumento en la supervivencia de microglía TREM2R47H con el tratamiento de anticuerpos agonistas anti-TREM2.

La Figura 10Ees un gráfico que muestra el porcentaje de confluencia celular con el tiempo para los BMDMs recolectados de ratones de tipo salvaje envejecidos (18 meses) (TREM2+/+) (n=3 animales) tratados con un anticuerpo control de isotipo o un anticuerpo agonista anti-TREM2 de la presente invención (en adelante referido como Anticuerpo 2), medido mediante un ensayo de confluencia celular en tiempo real. Los datos se representan como la media /- d.e. y provienen de un único experimento representativo. <p.0001, ANOVA de 2 vías con corrección de Sidak para comparaciones múltiples.

La Figura 10Fes un gráfico que representa el porcentaje de confluencia celular a lo largo del tiempo para los BMDMs recolectados de ratones TREM2R47H de edad avanzada (18 meses) (n=3 animales, excepción - controles de camada de ratones salvajes de la misma edad para las muestras del día 6 en el experimento de eliminación) tratados con un anticuerpo de control isotípico o un anticuerpo agonista anti-TREM2 (Anticuerpo 2), medido mediante un ensayo de confluencia celular en tiempo real. Los datos se representan como media /- d.e. y provienen de un único experimento representativo. <p.0001, ANOVA de 2 vías con corrección de Sidak para comparaciones múltiples. Se observa un aumento en la supervivencia de macrofagos de tipo salvaje y TREM2R47H con el tratamiento de anticuerpos agonistas anti-TREM2.

La Figura 11Aes un gráfico que representa el porcentaje de confluencia celular a lo largo del tiempo en un compartimento de cultivo en un ensayo de migración para BMDMs de tipo salvaje (TREM2+/+) tratados con un anticuerpo de control de isotipo o un anticuerpo agonista anti-TREM2 (Anticuerpo 1) medido mediante un ensayo de confluencia celular en tiempo real. El anticuerpo agonista anti-TREM2 tuvo efectos mínimos en la migración de los BMDM de tipo salvaje en este ensayo.

La Figura 11Bes un gráfico que representa el porcentaje de confluencia celular a lo largo del tiempo en un compartimento de cultivo en un ensayo de migración para BMDMs TREM2R47H tratados con un anticuerpo de control de isotipo o un anticuerpo agonista anti-TREM2 (Anticuerpo 1), medido mediante un ensayo de confluencia celular en tiempo real. El anticuerpo agonista anti-TREM2 resultó en una reducción pequeña pero estadísticamente significativa de la migración de los BMDM con TREM2R47H en este ensayo.

La Figura 11Ces un gráfico que muestra el porcentaje de confluencia celular a lo largo del tiempo en un compartimento de cultivo en un ensayo de migración para BMDMs TREM27- tratados con un anticuerpo de control de isotipo o un anticuerpo agonista anti-TREM2 (Anticuerpo 1), medido mediante un ensayo de confluencia celular en tiempo real. El anticuerpo agonista anti-TREM2 no tiene efecto en la migración de los BMDM TREM2-/- en este ensayo.

Las Figuras 11D y 11Eson gráficos que representan el porcentaje de confluencia celular a lo largo del tiempo en un compartimento de cultivo en un ensayo de migración para BMDMs de tipo salvaje (TREM2+/+) y BMDMs TREM2R47H, respectivamente, tratados con un anticuerpo control de isotipo o un anticuerpo agonista anti-TREM2 (Anticuerpo 2), medido mediante un ensayo de confluencia celular en tiempo real. El tratamiento con anticuerpos agonistas anti-TREM2 no tiene efecto en la migración de los BMDM de tipo salvaje y TREM2R47H en este ensayo.

La Figura 12Amuestra la regulación diferencial de los transcritos de CDC20 según lo medido por qPCR en macrófagos de tipo salvaje (TREM2+/+), TREM2R47H y TREM27- en los días 5 y 6.

La Figura 12Bmuestra la regulación diferencial de los transcritos de PKB medidos por qPCR en macrófagos de tipo salvaje (TREM2+/+), TREM2R47H y TREM27- en los días 5 y 6.

La Figura 12Cmuestra la regulación diferencial de los transcritos de NDC80 según lo medido por qPCR en macrófagos de tipo salvaje (TREM2+/+), TREM2R47H y TREM27- en los días 5 y 6.

La Figura 12Dmuestra la regulación diferencial de los transcritos de CCR2 medida por qPCR en macrófagos de tipo salvaje (TREM2+/+), TREM2R47H y TREM27- en los días 5 y 6.

La Figura 13Amuestra la regulación diferencial de los transcritos de ApoE medida por qPCR en macrófagos de tipo salvaje (TREM2+/+), heterocigotos (TREM2+/-) y knockout (TREM27-) en diferentes puntos temporales en cultivo. Todos los niveles de expresión génica se normalizan a los macrófagos de control de tipo salvaje en el Día 4 de cultivo.

La Figura 13Bmuestra la regulación diferencial de los transcritos de ApoE según lo medido por qPCR en macrófagos de tipo salvaje (TREM2+/+), heterocigotos R47H (TREM2R47H/+) y homocigotos R47H (Tr Em 2R47H) en diferentes puntos temporales en cultivo. Todos los niveles de expresión génica se normalizan con respecto a los macrófagos de control de tipo salvaje en el Día 4 de cultivo.

La Figura 13Cmuestra la regulación diferencial de los transcritos de IL-1a medida por qPCR en macrófagos de tipo salvaje (TREM2+/+), heterocigotos (TREM2+/-) y knockout (TREM27-) en diferentes momentos de cultivo. Todos los niveles de expresión génica se normalizan a los macrófagos de control de tipo salvaje en el Día 4 de cultivo.

La Figura 13Dmuestra la regulación diferencial de los transcritos de IL1a medida por qPCR en macrófagos de tipo salvaje (TREM2+/+), heterocigotos R47H (TREM2R47H/+) y homocigotos R47H (TREM2R47H) en diferentes momentos de cultivo. Todos los niveles de expresión génica se normalizan a los macrófagos de control de tipo salvaje en el Día 4 de cultivo.

La Figura 13Erepresenta la regulación diferencial de los transcritos de CX3CR1, medida por qPCR en macrófagos de tipo salvaje (TREM2+/+), heterocigotos (TREM2+/-) y knockout (TREM27-) en diferentes puntos temporales en cultivo. Todos los niveles de expresión génica se normalizan a los macrófagos de control de tipo salvaje en el día 4 de cultivo.

La Figura 13Frepresenta la regulación diferencial de los transcritos de CX3CR1 según lo medido por qPCR en macrófagos de tipo salvaje (TREM2+/+), heterocigotos R47H (TREM2R47H/+) y homocigotos R47H (T<r>E<m>2R47H) en diferentes puntos temporales en cultivo. Todos los niveles de expresión génica se normalizan a los macrófagos de control de tipo salvaje en el Día 4 de cultivo.

La Figura 13Gmuestra la regulación diferencial de los transcritos de FLT1 medida por qPCR en macrófagos de tipo salvaje (TREM2+/+), heterocigotos (TREM2+/-), y knockout (TREM27-) en diferentes puntos temporales en cultivo. Todos los niveles de expresión génica se normalizan a los macrófagos de control de tipo salvaje en el Día 4 del cultivo.

La Figura 13Hmuestra la regulación diferencial de los transcritos de FLT1 medida por qPCR en macrófagos de tipo salvaje (TREM2+/+), heterocigotos R47H (TREM2R47H/+) y homocigotos R47H (TREM2R47H) en diferentes momentos de cultivo. Todos los niveles de expresión génica se normalizan a los macrófagos de control de tipo silvestre en el cuarto día de cultivo.

Las Figuras 13I y 13Jrepresentan la regulación diferencial de los transcritos de C1qa, medida por qPCR, en macrófagos de tipo salvaje (TREM2+/+), heterocigotos R47H (TREM2R47H+/-) y homocigotos R47H (TREM2R47H) en distintos momentos de cultivo. Todos los niveles de expresión génica se normalizan a los macrófagos de control de tipo salvaje en el Día 4 de cultivo.

Las Figuras 13K y 13Lmuestran la regulación diferencial de los transcritos deCel5,medida por qPCR, en macrófagos de tipo salvaje (TREM2+/+), heterocigotos R47H (TREM2R47H+/- y TREM2+/-), y homocigotos R47H (TREM2R47H y TREM2-/"), en diferentes puntos temporales en cultivo. Todos los niveles de expresión génica se normalizan al control de tipo salvaje de los macrófagos en el Día 4 de cultivo.

Las Figuras 13M y 13Nilustran la regulación diferencial de los transcritos de Cel22, medida por qPCR, en macrófagos de tipo salvaje (TREM2+/+), heterocigotos R47H (TREM2R47H+/- y TREM2+/-) y homocigotos R47H (TREM2R47H y TREM2-/") en diferentes momentos en cultivo. Todos los niveles de expresión génica se normalizan a los macrófagos de control de tipo salvaje en el Día 4 de cultivo.

Las Figuras 13O y 13Pmuestran la regulación diferencial de los transcritos de C3, medidos mediante qPCR, en macrófagos de tipo salvaje (TREM2+/+), heterocigotos R47H (TREM2R47H+/- y TREM2+/-), y homocigotos R47H (TREM2R47H y TREM2-/-) en diferentes momentos en cultivo. Todos los niveles de expresión génica se normalizan a los macrófagos de control de tipo salvaje en el día 4 de cultivo.

La Figura 14Aes un gráfico que representa el porcentaje de confluencia celular a lo largo del tiempo en un compartimento de cultivo en un ensayo de migración para macrófagos óseos de médula (BMDMs) de tipo salvaje (TREM2+/+) y de tipo knockout (TREM2-/-), medido mediante un ensayo de confluencia celular en tiempo real. Los macrófagos con eliminación de TREM2 muestran un defecto de migración en comparación con los macrófagos de tipo salvaje en este ensayoin vitro.

La Figura 14Bes un gráfico que representa el porcentaje de confluencia celular con el tiempo en un compartimento de cultivo en un ensayo de migración para macrófagos de médula ósea de tipo salvaje (TREM2+/+) y TREM2R47H, según lo medido por un ensayo de confluencia celular en tiempo real. Las macrofagas TREM2R47H presentan un defecto de migración en comparación con las macrofagas de tipo salvaje en este ensayoin vitro. La Figura 15Amuestra una reducción en la proteína CCL2 secretada por los macrófagos TREM2R47H y TREM2-/- en comparación con los macrófagos de tipo salvaje (TREM2+/+), medida mediante ELISA.

La Figura 15Bmuestra los niveles de proteína CCL2 secretada, medidos por ELISA, en macrófagos TREM2R47H y macrófagos TREM2+/+ de tipo salvaje tratados con un anticuerpo agonista anti-TREM2 o control de isotipo. El tratamiento con anticuerpos agonistas anti-TREM2 restaura los niveles de proteína CCL2 secretada por macrófagos TREM2R47H

La Figura 16Amuestra los resultados del análisis de la vía de genes regulados por el tratamiento con anticuerpos agonistas anti-TREM2 en macrófagos TREM2R47H Los genes modulados incluyen aquellos involucrados en la regulación de la migración, proliferación, ciclo celular y supervivencia de las células mieloides.

La Figura 16Bmuestra el análisis de RNA-Seq comparando los macrófagos de tipo salvaje (TREM2+/+), knockout (TREM2-/-) y TREM2R47H al día 7 bajo condiciones limitantes de CSF-1. Los análisis de vías (WGCNA) identificaron 5 módulos/redes génicas que están regulados de manera diferencial en los macrófagos sin expresión y en los macrófagos TREM2R47H en comparación con el tipo salvaje. Los resultados indican un papel para TREM2 en el ciclo celular/proliferación y supervivencia, respuesta inmunitaria y migración, así como en la homeostasis de lípidos y colesterol.

La Figura 16Cmuestra la regulación diferencial de los transcritos de UBE2C, MELK y MMP14 según lo medido por qPCR en macrófagos de tipo salvaje (TREM2+/+) y macrófagos TREM2R47H tratados con un anticuerpo agonista anti-TREM2 (Anticuerpo 1) o control de isotipo. Los datos muestran que la expresión de la enzima MMP14 está regulada al alza, mientras que la expresión de las enzimas UBE2C y MELK está regulada a la baja en los macrófagos R47H, pero los cambios pueden ser restaurados con el tratamiento con el anticuerpo agonista anti-TREM2.

La Figura 17muestra que el tratamiento con anticuerpos aumenta la expresión de genes microgliales homeostáticos (P2ry12, Tmem119) en microglía WT y R47H KI, microglía WT sola y microglía R47H KI sola (A, B y C). También, el tratamiento con anticuerpos reduce la expresión de quimiocinas y citoquinas proinflamatorias como Ccl3, Ccl4, Ccl5, Il12b (D, E y F). Todas las estadísticas son puntuaciones de rango de Wilcoxon. La expresión es ln(cuentas+1).

La Figura 18muestra que la población infiltrada de microglia tiene una expresión aumentada de genes mieloides e inflamatorios y una expresión ligeramente menor de genes de microglia homeostáticos (A y B), y que la administración de anticuerpos Trem2 disminuyó las quimiocinas y citocinas proinflamatorias en las células de microglia infiltradas de ratones WT y R47H KI, ratones solo WT y ratones solo R47H KI (C, D y E). Todas las estadísticas son puntuaciones de rango de Wilcoxon. La expresión es ln(cuentas+1) ajustada por el conteo de UMI.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0018]La presente invención se refiere a proteínas de unión a antígenos aislados que se unen específicamente a TREM2, en particular a TREM2 humano, como se define en las reivindicaciones. En los humanos, el genTREM2se encuentra dentro de un grupo de genesTREMen el cromosoma 6p21.1. El grupo de genes TREM codifica cuatro proteínas TREM (TREM1, t Re M2, TREM4 y TREM5), así como dos proteínas similares a TREM (TLT-1 y TLT-2). El genTREM2codifica una proteína de 230 aminoácidos que consta de un dominio extracelular, una región transmembrana y una cola citoplasmática corta (Paradowska-Gorycka et al., Human Immunology, Vol. 74: 730-737, 2013). El dominio extracelular contiene un único dominio de la familia Ig-super de tipo V, con tres posibles sitios de N-glicosilación. La secuencia de aminoácidos de TREM2 en humanos de tipo salvaje (Secuencia de Referencia del NCBI: NP_061838.1) se proporciona a continuación como SEQ ID NO: 1.

1 MEPLRLLILLFVTELSGAHNTTVFQGVAGQSLQVSCPYDSMKHWGRRKAWCRQLGEKGPC 60

61 QRVVSTHNLWLLSFLRRWNGSTAITDDTLGGTLTITLRNLQPHDAGLYQCQSLHGSEADT

120

121 LRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESFEDAHVEHSISRSLLEGEIPFPPTSILLLLA

180

181 CIFLIKILAASALWAAAWHGQKPGTHPPSELDCGHDPGYQLQTLPGLRDT 230

[0019]Los aminoácidos 1 a 18 de la proteína TREM2 humana de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1) constituyen un péptido señal, que generalmente se elimina de la proteína madura. La proteína TREM2 humana madura comprende un dominio extracelular en los aminoácidos 19-174 de SEQ ID NO: 1, un dominio transmembrana en los aminoácidos 175-195 de SEQ ID NO: 1, y un dominio citoplasmático en los aminoácidos 196-230 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos del dominio extracelular (incluyendo el péptido señal) de TREM2 humano se proporciona a continuación como SEQ ID NO: 2.

1 MEPLRLLILLFVTELSGAHNTTVFQGVAGQSLQVSCPYDSMKHWGRRKAWCRQLGEKGPC

60

61 QRVVSTHNLWLLSFLRRWNGSTAITDDTLGGTLTITLRNLQPHDAGLYQCQSLHGSEADT

120

121 LRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESFEDAHVEHSISRSLLEGEIPFPPTS 174

[0020]El término "receptor desencadenante humano expresado en células mieloides" o "TREM2 humano" puede referirse a un polipéptido de SEQ ID NO: un polipéptido de Se Q ID NO: 2, polipéptidos de SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 1 o Número de identificación de secuencia: 2 menos el péptido señal (aminoácidos 1-18), variantes alélicas de TREM2 humano, o variantes de empalme de TREM2 humano. En algunas formas de realización, el término TREM2 humano incluye variantes naturalmente presentes de TREM2, como las mutaciones R47H, Q33X (X es un codón de terminación), Y38C, T66M, D87N, H157Y, R98W y S116C.

[0021]Debido a que el dominio citoplasmático de TREM2 carece de capacidad de señalización, debe interactuar con otras proteínas para transmitir las señales de activación de TREM2. Una de esas proteínas es la proteína activadora de DNAX de 12 kDa (DAP12). DAP12 también es conocido como proteína asociada al receptor activador de células asesinas (KARAP) y proteína de unión a tirosina quinasas(TYROBP).DAP12 es una proteína adaptadora transmembrana de tipo I que incluye un motivo ITAM en su dominio citoplasmático. El motivo ITAM media la propagación de la señal mediante la activación de las quinasas tirosinas ZAP70 y Syk, las cuales a su vez activan varias cascadas de señalización corriente abajo, incluyendo PI3K, PKC, ERK y la elevación del calcio intracelular (Colonna, Nature Reviews Immunology, Vol. 3: 445-453, 2003; Ulrich y Holtzman, ACS Chem. Neuroci., Vol. 7: 420-427, 2016). DAP12 y TREM2 se asocian a través de sus dominios transmembrana; un residuo de lisina cargado dentro del dominio transmembrana de TREM2 interactúa con un residuo de ácido aspártico cargado dentro del dominio transmembrana de DAP12.

[0022]El DAP12 humano está codificado por el genTYROBPsituado en el cromosoma 19q13.1. La proteína humana tiene una longitud de 113 aminoácidos y comprende una secuencia líder (aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO: 3) un corto dominio extracelular (aminoácidos 28-41 de la SEQ ID NO: 3), un dominio transmembrana (aminoácidos 42-65 de SEQ ID NO: 3) y un dominio citoplasmático (aminoácidos 66-113 de SEQ ID NO: 3)(Paradowska-Gorycka et al., Human Immunology, Vol. 74: 730737, 2013). DAP12 forma un homodímero a través de dos residuos de cisteína en el corto dominio extracelular. La secuencia de aminoácidos de DAP12 del ser humano de tipo silvestre (Secuencia de Referencia del NCBI: NP_003323.1) se proporciona a continuación como SEQ ID NO: 3).

1 MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALA

60

61 VYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYK 113

[0023]El término DAP12 humano puede referirse a un polipéptido de SEQ ID NO: 3, un polipéptido de SEQ ID NO: 3 menos el péptido líder (aminoácidos 1-27), variantes alélicas de DAP12 humano, o variantes de empalme de DAP12 humano.

[0024]La presente invención proporciona proteínas de unión a antígenos aisladas que se unen específicamente a TREM2 humano, tal como se define en las reivindicaciones. Como se utiliza en el presente documento, el término "proteína de unión a antígeno" se refiere a una proteína que se une específicamente a uno o más antígenos objetivo. Una proteína de unión a antígenos típicamente comprende un fragmento de unión a antígenos que se une específicamente a un antígeno y, opcionalmente, una porción de andamiaje o marco que permite que el fragmento de unión a antígenos adopte una conformación que promueve la unión de la proteína de unión a antígenos al antígeno. Un fragmento de unión a antígeno, utilizado indistintamente en el presente documento con fragmento de unión o fragmento, es una porción de un anticuerpo que carece de al menos algunos de los aminoácidos presentes en una cadena pesada o cadena ligera de longitud completa, pero que aún es capaz de unirse específicamente a un antígeno. Un fragmento de unión a antígeno incluye, pero no se limita a, un fragmento de variable de cadena única (scFv), un nanocuerpo (por ejemplo, dominio VH de anticuerpos de cadena pesada de camélidos; fragmento VHH, consulte Cortez-Retamozo et al., Cancer Research, Vol.

64:2853-2857, 2004), un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv, un fragmento Fd y un fragmento de región determinante de la complementariedad (CDR), y puede derivarse de cualquier fuente de mamífero, como humano, ratón, rata, conejo o camélido. Los fragmentos de unión a antígenos pueden competir por la unión de un antígeno objetivo con un anticuerpo intacto y los fragmentos pueden ser producidos mediante la modificación de anticuerpos intactos (por ejemplo, mediante la clivaje enzimático o químico) o sintetizados de novo utilizando tecnologías de ADN recombinante o síntesis de péptidos. La proteína de unión al antígeno de la invención es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión del mismo, tal como se define en las reivindicaciones.

[0025]Una proteína de unión a antígenos también puede incluir una proteína que contiene uno o más fragmentos de unión a antígenos incorporados en una cadena polipeptídica única o en múltiples cadenas polipeptídicas. Por ejemplo, las proteínas de unión a antígenos pueden incluir, pero no se limitan a, un diabody (ver, por ejemplo, EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 90: 6444 - 6448, 1993); un intracuerpo; un anticuerpo de dominio (un solo dominio VL o VH o dos o más dominios VH unidos por un enlace peptídico;verWard et al., Nature, Vol.

341: 544- 546, 1989); un maxicuerpo (2 scFvs fusionados a la región Fc,verFredericks et al., Protein Engineering, Design & Selection, Vol. 17: 95- 106, 2004 y Powers et al., Journal of Immunological Methods, Vol. 251: 123- 135, 2001); un triacuerpo; un tetracuerpo; un minicuerpo (scFv fusionado al dominio CH3;verOlafsen et al., Protein Eng Des Sel., Vol.17:315-23, 2004); un pepticuerpo (uno o más péptidos unidos a una región Fc,verWO 00/24782); un anticuerpo lineal (un par de segmentos Fd en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto con polipéptidos de cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de unión a antígenos,verZapata et al., Protein Eng., Vol. 8:1057-1062, 1995); un inmunofármaco modular pequeño(verSolicitud de Patente de EE. UU. N.° 20030133939); y proteínas de fusión con inmunoglobulina (por ejemplo, IgG-scFv, IgG-Fab, 2scFv-IgG, 4scFv-IgG, VH-IgG, IgG-VH, y Fab-scFv-Fc;ver, por ejemplo,Spiess et al., Mol. Immunol., Vol. 67(2 Pt A):95-106, 2015).

[0026]El término "molécula aislada" (donde la molécula es, por ejemplo, un polipéptido, un polinucleótido, una proteína de unión a antígenos o un anticuerpo) es una molécula que, en virtud de su origen o fuente de derivación, (1) no está asociada con componentes naturalmente asociados que la acompañan en su estado nativo, (2) está sustancialmente libre de otras moléculas de la misma especie, (3) es expresada por una célula de una especie diferente, o (4) no ocurre en la naturaleza. Por lo tanto, una molécula que es sintetizada químicamente o expresada en un sistema celular diferente a la célula de la que proviene naturalmente, será aislada de sus componentes naturalmente asociados. Una molécula también puede ser purificada sustancialmente libre de componentes naturalmente asociados mediante aislamiento, utilizando técnicas de purificación bien conocidas en la técnica. La pureza o homogeneidad de la molécula puede ser evaluada por varios medios bien conocidos en el campo. Por ejemplo, la pureza de una muestra de polipéptido puede ser evaluada usando electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción del gel para visualizar el polipéptido mediante técnicas bien conocidas en la técnica. Para ciertos propósitos, una resolución más alta puede ser proporcionada mediante el uso de HPLC u otros medios bien conocidos en la técnica para la purificación.

[0027]Las proteínas de unión a antígenos se unen específicamente a TREM2 humano. Una proteína de unión a antígenos se une específicamente a un antígeno objetivo cuando tiene una afinidad de unión significativamente mayor y, en consecuencia, es capaz de distinguir ese antígeno en comparación con su afinidad por otras proteínas no relacionadas, bajo condiciones de ensayo de unión similares. Las proteínas de unión a antígenos que se unen específicamente a un antígeno pueden tener una constante de disociación de equilibrio (K<d>) < 1 x 10-6 M. La proteína de unión al antígeno se une específicamente al antígeno con alta afinidad cuando el Kd es < 1 x 10-8 M. En una forma de realización, las proteínas de unión al antígeno de la invención se unen a TREM2 humano con un K<d>de < 5 x 10-7 M. En otra forma de realización, las proteínas de unión al antígeno de la invención se unen a TREM2 humano con un K<d>de < 1 x 10-7 M. En otra forma de realización, las proteínas de unión al antígeno de la invención se unen a TREM2 humano con un Kd de < 5 x 10-8 M. En otra forma de realización, las proteínas de unión al antígeno de la invención se unen a TREM2 humano con un K<d>de < 1 x 10-8 M. En ciertas formas de realización, las proteínas de unión al antígeno de la invención se unen a TREM2 humano con un Kd de < 5 x 10-9 M. En otras formas de realización, las proteínas de unión al antígeno de la invención se unen a TREM2 humano con un K<d>de < 1 x 10-9 M. En una forma de realización en particular, las proteínas de unión al antígeno de la invención se unen a TREM2 humano con un Kd de < 5 x 10-10 M. En otra forma de realización en particular, las proteínas de unión al antígeno de la invención se unen a TREM2 humano con un Kd de < 1 x 10-10 M.

[0028]La afinidad se determina utilizando una variedad de técnicas, un ejemplo de las cuales es un ensayo de ELISA de afinidad. En varios modelos, la afinidad se determina mediante un ensayo de resonancia de plasmón superficial (por ejemplo, un ensayo basado en BIAcore®). Usando esta metodología, la constante de velocidad de asociación (ka en M 'V ) y la constante de velocidad de disociación (kd en s-1) pueden ser medidas. La constante de disociación de equilibrio (K<d>en M) puede entonces ser calculada a partir de la relación de las constantes de velocidad cinética (kd/ka). En algunos ejemplos, la afinidad se determina mediante un método cinético, como un Ensayo de Exclusión Cinética (KinExA) tal como se describe en Rathanaswami et al. Analytical Biochemistry, Vol. 373:52-60, 2008. Usando un ensayo KinExA, se pueden medir la constante de disociación de equilibrio (K<d>en M) y la constante de velocidad de asociación (ka en M 'V 1). La constante de velocidad de disociación (kd en s-1) se puede calcular a partir de estos valores (K<d>x ka). En otros enfoques, la afinidad se determina mediante un método de interferometría de capa biológica, como el descrito en Kumaraswamy et al., Methods Mol. Biol., Vol. 1278:165-82, 2015 y empleado en sistemas Octet® (Pall ForteBio). Las constantes cinéticas (ka y kd) y de afinidad (K<d>) se pueden calcular en tiempo real utilizando el método de interferometría de capa biológica. En algunas formas de realización, las proteínas de unión a antígenos descritas aquí exhiben características deseables como la avidez de unión medida por kd (constante de velocidad de disociación) para TREM2 humano de alrededor de 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 s-1 o menor (valores más bajos indican mayor avidez de unión), y/o afinidad de unión medida por Kd (constante de disociación de equilibrio) para TREM2 humano de alrededor de 10-8, 10-9, 10-10, 10-11 M o menor (valores más bajos indican mayor afinidad de unión).

[0029]Las proteínas de unión a antígenos de la invención pueden unirse específicamente a TREM2 humano con una K<d>de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 100 nM, según lo medido por interferometría de capa biológica a 25 °C. Por ejemplo, en algunos ejemplos, las proteínas de unión a antígenos de la invención se unen específicamente a TREM2 humano con una K<d>inferior a 100 nM, según lo medido por interferometría de capa biológica a 25 °C. En otras formas de realización, las proteínas de unión a antígenos de la invención se unen específicamente a TREM2 humano con una K<d>inferior a 50 nM, según lo medido por interferometría de capa biológica a 25 °C. En otras formas de realización, las proteínas de unión a antígenos de la invención se unen específicamente a TREM2 humano con una K<d>inferior a 25 nM, según lo medido por interferometría de capa biológica a 25 °C. En un ejemplo particular, las proteínas de unión a antígenos de la invención se unen específicamente a TREM2 humano con una Kd inferior a 10 nM, según lo medido por interferometría de capa biológica a 25 °C. En otro ejemplo particular, las proteínas de unión a antígenos de la invención se unen específicamente a TREM2 humano con una K<d>inferior a 5 nM, según lo medido por interferometría de capa biológica a 25 °C. En otro ejemplo particular, las proteínas de unión a antígenos de la invención se unen específicamente a TREM2 humano con una Kd inferior a 1 nM, según lo medido por interferometría de capa biológica a 25 °C.

[0030]Las proteínas de unión a antígenos de la invención se unen a una región o epítopo particular de TREM2 humano. Como se utiliza en este documento, un epítopo se refiere a cualquier determinante capaz de ser específicamente unido por una proteína de unión a antígeno, como un anticuerpo o un fragmento del mismo. Un epítopo es una región de un antígeno que es unida por, o interactúa con, una proteína de unión a antígeno que se dirige a ese antígeno, y cuando el antígeno es una proteína, incluye aminoácidos específicos que entran en contacto directo, o interactúan con, la proteína de unión a antígeno. Un epítopo puede formarse tanto por aminoácidos contiguos como por aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante el plegamiento terciario de una proteína. Un epítopo lineal es un epítopo donde una secuencia primaria de aminoácidos comprende el epítopo reconocido. Un epítopo lineal típicamente incluye al menos 3 o 4 aminoácidos, y más comúnmente, al menos 5, al menos 6 o al menos 7 aminoácidos, por ejemplo, alrededor de 8 a alrededor de 10 aminoácidos en una secuencia única. Un epítopo conformacional, en contraste con un epítopo lineal, es un grupo de aminoácidos discontinuos (por ejemplo, en un polipéptido, residuos de aminoácidos que no son contiguos en la secuencia primaria del polipéptido pero que, en el contexto de la estructura terciaria y cuaternaria del polipéptido, están lo suficientemente cerca como para ser unidos por una proteína de unión a antígenos). Los determinantes del epítopo pueden incluir agrupaciones de grupos superficiales químicamente activos de moléculas como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, grupos fosforilo o sulfonilo, y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. Generalmente, las proteínas de unión a antígenos específicas para una molécula objetivo particular preferirán reconocer preferentemente un epítopo en la molécula objetivo en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas. Las proteínas de unión a antígenos descritas aquí pueden unirse a TREM2 humano en un epítopo dentro del dominio extracelular de TREM2 humano (SEQ ID NO: 2). Las proteínas de unión a antígenos pueden unirse a TREM2 humano en un epítopo dentro de los aminoácidos 19-174 de la SEQ ID NO: 1. Las proteínas de unión a antígenos pueden unirse a TREM2 humano en un epítopo dentro de los aminoácidos 23-128 de la SEQ ID NO: 1.

[0031]En ciertas formas de realización, las proteínas de unión a antígenos de la invención no se unen específicamente al TREM1 humano. Al igual que TREM2, TREM1 es una glicoproteína transmembrana que se expresa en células mieloides y señaliza a través de DAP12. La activación de la señalización de TREM1 resulta en efectos inflamatorios, como la producción de citocinas proinflamatorias, la degranulación de neutrófilos y la fagocitosis (Arts et al., Journal of Leukocyte Biology, Vol. 93: 209215, 2013). Como se discutió anteriormente, TREM1 está codificado por el gen TREM1, que se encuentra en el grupo génico TREM junto con el gen TREM2 en el cromosoma 6p21.1. La secuencia de aminoácidos de TREM1 humano de tipo salvaje (Secuencia de referencia del NCBI: NP_061113.1) se proporciona a continuación como SEQ ID NO: 4.

1 MRKTRLWGL.LWMLFVSELRAATKLTEEKYELKEGQTLDVKCDYTLEKFASSQKAWQIIRD

60

61 GEMPKTLACTERPSKNSHPVQVGRIILEDYHDHGLLRVRMVNLQVEDSGLYQCVIYQPPK

120

121 EPHMLFDRIRLWTKGFSGTPGSNENSTQNVYKIPPTTTKALCPLYTSPRTVTQAPPKST

180

181 ADVSTPDSEINLTNVTDIIRVPVFNIVILLAGGFLSKSLVFSVLFAVTLRSFVP 234

[0032]El término TREM1 humano puede referirse a un polipéptido de SEQ ID NO: 4, un polipéptido de SEQ ID NO: 4 menos el péptido señal (aminoácidos 1-20), variantes alélicas de TREM1 humano, o variantes de empalme de TREM1 humano. Una proteína de unión a antígeno de la invención no se une específicamente al TREM1 humano si tiene una afinidad de unión equivalente o menor al TREM1 humano que al que tiene para una proteína de antígeno humana no relacionada. Proteínas de unión a antígenos que no se unen específicamente a TREM1 humano pueden tener un KD para TREM1 humano > 1 * 10'5 M, > 1 * 10'4 M o > 1 * 10'3 M, según se determine por cualquiera de los métodos para medir la afinidad descritos en este documento. Una proteína de unión a antígeno de la invención puede considerarse que no se une específicamente al TREM1 humano si la proteína de unión a antígeno tiene una unión equivalente o menor al TREM1 humano en comparación con la unión al TREMI humano de un anticuerpo de control de isotipo, según se mide por cualquier método conocido en la técnica, como el método de unión de FACS descrito en el Ejemplo 2.

[0033] Las proteínas de unión al antígeno de la invención son proteínas de unión al antígeno agonistas. Una proteína de unión a antígenos agonista o una proteína de unión a antígenos activadora es una proteína de unión a antígenos (por ejemplo, un anticuerpo) que se une e induce o aumenta una o más funciones o actividades mediadas por TREM2. Las funciones o actividades mediadas por TREM2 incluyen, pero no se limitan a, la fosforilación de DAP12 (por ejemplo, la fosforilación de tirosina dentro del motivo ITAM en el dominio citoplasmático de DAP12); fosforilación de Syk; fosforilación/activación de Src; activación/fosforilación de la quinasa regulada por señal extracelular (ERK1/2); translocación de la fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K) activada a la membrana; activación de la proteína quinasa B (PKB, también conocida como Akt); activación de NF-kB y transcripción mediada por NF-kB; activación de la proteína nuclear de células T activadas (NFAT) y transcripción mediada por NFAT; activación de la proteína quinasa C (PKC); aumento del inositol trifosfato intracelular (IP3); aumento de los niveles de calcio intracelular; aumento en la supervivencia o proliferación de células mieloides, como macrófagos, microglía y células dendríticas; reducción de la apoptosis de células mieloides, como macrófagos, microglía y células dendríticas; aumento en la expresión de proteínas CCL2 en macrófagos; reducción de la producción de citoquinas inflamatorias (por ejemplo, TNF-a, IL-6, IL-10, IL-12p70 e IFN-<y>) de células mieloides (por ejemplo, macrófagos) y aumento en la fagocitosis por parte de macrófagos y microglía de células necróticas y/o apoptóticas (por ejemplo, células neuronales), restos celulares y péptidos mal plegados.

[0034] Los agonistas de TREM2, proteínas de unión al antígeno de la invención, son capaces de inducir o activar funciones mediadas por TREM2 en ausencia de agregación, agrupación y/o entrecruzamiento mediado por Fc de las proteínas de unión al antígeno. En consecuencia,in vitro,la actividad agonista de las proteínas de unión a antígenos se puede detectar con formas solubles (es decir, no unidas a un soporte sólido), monoméricas, bivalentes de las proteínas de unión a antígenos o anticuerpos. En el organismo, la actividad agonista de las proteínas de unión al antígeno de la invención puede ocurrir en ausencia de la unión de las proteínas de unión al antígeno a receptores (por ejemplo, receptores Fc) en células adyacentes para agrupar o agregar la proteína de unión al antígeno. Por lo tanto, en algunos ejemplos, la actividad agonista de las proteínas de unión a antígenos descritas aquí es independiente de la capacidad de las proteínas de unión a antígenos de unirse o interactuar con receptores Fc. En las formas de realización en las que las proteínas de unión a antígenos comprenden una región Fc (por ejemplo, anticuerpos), las proteínas de unión a antígenos conservan la actividad agonista de TREM2 sin unirse o interactuar con un receptor F<cy>, como el receptor F<cy>RIIB. La naturaleza independiente de la unión del antígeno del agonista de las proteínas de unión al antígeno de la invención es ventajosa para usos terapéuticos de las proteínas de unión al antígeno porque la actividad del agonista de las proteínas de unión al antígeno no variará con la expresión o accesibilidad del receptor Fcy en el sitio terapéutico de acción.

[0035] La dependencia de la actividad agonista de TREM2 en el entrecruzamiento, la agregación y/o la agrupación de las proteínas de unión a antígenos puede evaluarse mediante la medición de la activación o inducción de cualquiera de las funciones mediadas por TREM2 descritas aquí en ausencia de un agente de entrecruzamiento. Un agente de entrecruzamiento puede ser cualquier agente que interactúe con proteínas de unión a antígenos en un sitio que no sea el sitio de unión al antígeno para agrupar dos o más proteínas de unión a antígenos juntas. En las formas de realización en las que la proteína de unión a antígeno comprende una región Fc (por ejemplo, un anticuerpo), un agente de entrecruzamiento puede ser una proteína que se une o interactúa con la región Fc, como la proteína A, la proteína G, un anticuerpo anti-Fc o el receptor Fcy.

[0036] En algunos ejemplos, una proteína de unión a antígeno agonista de TREM2 de la invención aumenta los niveles de Syk fosforilado (pSyk) en células que expresan una proteína TREM2 (por ejemplo, una proteína TREM2 humana) en comparación con los niveles de pSyk en ausencia de la proteína de unión a antígeno o en comparación con los niveles de pSyk en presencia de un control. Las células pueden ser células de una línea mieloide que incluyen, pero no se limitan a, monocitos, macrófagos, células microgliales, células dendríticas, osteoclastos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, megacariocitos y plaquetas. En ciertas formas de realización, las proteínas de unión a antígenos agonistas de TREM2 aumentan los niveles de pSyk con un CE50 menor que aproximadamente 100 nM, menor que aproximadamente 80 nM, menor que aproximadamente 60 nM, menor que aproximadamente 50 nM, menor que aproximadamente 40 nM, menor que aproximadamente 30 nM, menor que aproximadamente 20 nM, menor que aproximadamente 10 nM, menor que aproximadamente 5 nM, menor que aproximadamente 1 nM, menor que aproximadamente 500 pM, menor que aproximadamente 300 pM, o menor que aproximadamente 100 pM. En algunas formas de realización, las proteínas de unión a antígeno agonista de TREM2 aumentan los niveles de pSyk con un CE50 de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 5 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 1 nM, o de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 500 pM. Un CE50 o concentración efectiva media es una medida de la potencia de la proteína de unión al antígeno y se refiere a la concentración de proteína de unión al antígeno requerida para inducir una respuesta a mitad de camino entre la línea base y la respuesta máxima después de un período de exposición particular. La CE50 de cualquier agonista en particular puede determinarse construyendo una curva dosis-respuesta y examinando el efecto de diferentes concentraciones del agonista en inducir actividad en un ensayo funcional particular (por ejemplo, niveles de pSyk). El CE50 es la concentración del agonista en la cual se observa el 50 % de su efecto máximo. Los incrementos en los niveles intracelulares de pSyk inducidos por los agonistas de TREM2, proteínas de unión a antígenos de la invención, pueden ser evaluados mediante varios métodos, como los ensayos basados en células descritos en los Ejemplos 2 y 6. Por ejemplo, las células que expresan TREM2 (por ejemplo, TREM2 humano) se ponen en contacto con una o más concentraciones de una proteína de unión a antígeno agonista, las células se lisan, y los niveles de pSyk en los lisados celulares se evalúan, por ejemplo, mediante transferencia Western, ensayo basado en FRET o ensayo quimioluminiscente (por ejemplo, ensayo basado en AlphaLISA). Las células en el ensayo basado en células pueden ser células, como células HEK293T o células CHO, que expresan recombinantemente TREM2 (por ejemplo, TREM2 humano). Alternativamente, las células en el ensayo basado en células son células que expresan de forma nativa TREM2 (por ejemplo, TREM2 humano), como las células THP-1, macrófagos, células microgliales o células dendríticas.

[0037] En ciertas formas de realización, la potencia de las proteínas de unión a antígenos agonistas de TREM2 para inducir o aumentar los niveles de pSyk en una célula que expresa TREM2 (por ejemplo, TREM2 humano) se mantiene en ausencia de un agente de entrecruzamiento. Por ejemplo, en algunos ejemplos de realización, las proteínas de unión a antígenos agonistas de TREM2 de la invención aumentan los niveles de pSyk con un CE50 de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 50 nM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 5 nM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 1 nM, o de aproximadamente 150 pM a aproximadamente 500 pM en ausencia de un agente de unión cruzada según lo medido por un ensayo de pSyk basado en células. En una forma de realización, la proteína de unión al antígeno agonista de TREM2 aumenta los niveles de pSyk con un CE50 inferior a 5 nM en ausencia de un agente de entrecruzamiento, según lo medido por un ensayo de pSyk basado en células. En otra forma de realización, la proteína de unión a antígeno agonista TREM2 aumenta los niveles de pSyk con un CE50 menor a 1 nM en ausencia de un agente de entrecruzamiento, según lo medido por un ensayo de pSyk basado en células. En otra forma de realización, la proteína de unión al antígeno agonista de TREM2 aumenta los niveles de pSyk con un CE50 inferior a 500 pM en ausencia de un agente de entrecruzamiento, según se mide mediante un ensayo de pSyk basado en células. En otra forma de realización, la proteína de unión al antígeno agonista de TREM2 aumenta los niveles de pSyk con un CE50 menor de 300 pM en ausencia de un agente de entrecruzamiento, según se mide mediante un ensayo de pSyk basado en células. En otra forma de realización, la proteína de unión a antígenos agonista de TREM2 aumenta los niveles de pSyk con un CE50 inferior a 100 pM en ausencia de un agente de entrecruzamiento, según lo medido por un ensayo de pSyk basado en células.

[0038] El agonista TREM2 de proteínas de unión a antígenos de la invención comprenden una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de las regiones variables de la cadena ligera y pesada de los anticuerpos que se unen específicamente al TREM2 humano, como se define en las reivindicaciones. El término CDR se refiere a la región determinante de la complementariedad (también llamada unidades mínimas de reconocimiento o región hipervariable) dentro de las secuencias variables de anticuerpos. Hay tres CDR (CDRH1, CDRH2 y CDRH3) en la región variable de la cadena pesada y tres CDR (CDRL1, CDRL2 y CDRL3) en la región variable de la cadena ligera. El término "región CDR", tal como se utiliza aquí, se refiere a un grupo de tres CDR que se encuentran en una sola región variable (es decir, los tres CDR de la cadena ligera o los tres CDR de la cadena pesada). Las CDRs en cada una de las dos cadenas típicamente están alineadas por las regiones del marco (FRs) para formar una estructura que se une específicamente con un epítopo o dominio específico en la proteína objetivo (por ejemplo, TREM2 humano). Desde el extremo N hasta el extremo C, las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas que ocurren naturalmente generalmente siguen el siguiente orden de estos elementos: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3,<c>DR3 and FR4. Un sistema de numeración ha sido ideado para asignar números a los aminoácidos que ocupan posiciones en cada uno de estos dominios. Este sistema de numeración está definido en Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (1987 y 1991, NIH, Bethesda, MD), o en Chothia y Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883. Las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) y las regiones del armazón (FR) de un anticuerpo dado pueden ser identificadas utilizando este sistema. Otros sistemas de numeración para los aminoácidos en las cadenas de inmunoglobulina incluyen IMGT® (the international InMunoGeneTics information system; Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 29:185-203; 2005) y AHo (Honegger y Pluckthun, J. Mol. Biol. 309(3):657670; 2001). Uno o más CDRs pueden ser incorporados en una molécula ya sea de forma covalente o no covalente para convertirla en una proteína de unión a antígenos.

[0039] En algunas formas de realización, una proteína de unión a antígeno de la invención puede incorporar el CDR o los CDR como parte de una cadena de polipéptidos más grande, puede enlazar covalentemente el CDR o los CDR a otra cadena de polipéptidos, o puede incorporar el CDR o los CDR de forma no covalente. Las proteínas de unión a antígenos pueden incluir al menos uno de los CDRs descritos aquí incorporados en una estructura de marco biocompatible. En un ejemplo, la estructura de marco biocompatible comprende un polipéptido o una parte del mismo que es suficiente para formar un soporte estructural con una conformación estable, o marco, o andamiaje, que es capaz de mostrar una o más secuencias de aminoácidos que se unen a un antígeno (por ejemplo, CDRs, una región variable, etc.) en una región superficial localizada. Tales estructuras pueden ser un polipéptido de origen natural o un plegamiento de polipéptidos (un motivo estructural), o pueden tener una o más modificaciones, como adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos, en relación con un polipéptido de origen natural o plegamiento. Estos andamios pueden derivarse de un polipéptido de cualquier especie (o de más de una especie), como humano, otro mamífero, otro vertebrado, invertebrado, planta, bacteria o virus.

[0040] El TREM2 agonista proteínas de unión a antígenos de la invención comprenden al menos una región variable de cadena ligera que consta de una CDRL1, CDRL2 y CDRL3, y al menos una región variable de cadena pesada que consta de una CDRH1, CDRH2 y CDRH3 de un anticuerpo agonista anti-TREM2, según se define en las reivindicaciones. Las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas y las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) asociadas de anticuerpos humanos anti-TREM2 ejemplares útiles para comprender la invención reclamada se detallan a continuación en las Tablas 1A y 1B, respectivamente.

[0041]Las proteínas de unión a antígeno de agonista TREM2 de la invención comprenden una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina (VH) y una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (VL) de un anticuerpo que se une específicamente a TREM2 humano, como se define en las reivindicaciones. La región variable, utilizada indistintamente aquí con dominio variable (región variable de una cadena ligera (VL), región variable de una cadena pesada (VH)), se refiere a la región en cada una de las cadenas de inmunoglobulina ligera y pesada que está directamente involucrada en la unión del anticuerpo al antígeno. Como se discutió anteriormente, las regiones de cadenas ligeras y pesadas variables tienen la misma estructura general y cada región consta de cuatro regiones de armazón (FR), cuyas secuencias están ampliamente conservadas, conectadas por tres CDRs. Las regiones del marco adoptan una conformación de lámina beta y las CDRs pueden formar bucles conectando la estructura de lámina beta. Las CDR en cada cadena son mantenidas en su estructura tridimensional por las regiones de armazón y forman, junto con las CDR de la otra cadena, el sitio de unión al antígeno.

[0042]El término identidad, tal como se utiliza aquí, se refiere a una relación entre las secuencias de dos o más moléculas de polipéptidos o dos o más moléculas de ácido nucleico, determinada mediante la alineación y comparación de las secuencias. La identidad porcentual, tal como se utiliza en este documento, significa el porcentaje de residuos idénticos entre los aminoácidos o nucleótidos en las moléculas comparadas y se calcula en función del tamaño de la molécula más pequeña de las que se comparan. Para estos cálculos, las brechas en las alineaciones (si las hay) deben ser abordadas por un modelo matemático o programa de computadora particular (es decir, un algoritmo). Los métodos que se pueden utilizar para calcular la identidad de los ácidos nucleicos o polipéptidos alineados incluyen aquellos descritos en Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, Nueva York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, Nueva York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, Nueva York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. y Devereux, J., eds.), 1991, Nueva York: M. Stockton Press; y Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073. Por ejemplo, la identidad de secuencia puede determinarse mediante métodos estándar que se utilizan comúnmente para comparar la similitud en la posición de los aminoácidos de dos polipéptidos. Usando un programa de computadora como BLAST o FASTA, dos secuencias de polipéptidos o de polinucleótidos se alinean para lograr una coincidencia óptima de sus respectivos residuos (ya sea a lo largo de toda la longitud de una o ambas secuencias, o a lo largo de una porción predeterminada de una o ambas secuencias). Los programas proporcionan una penalización de apertura predeterminada, una penalización de espacio predeterminada y una matriz de puntuación como PAM250 (Dayhoff et al., en Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp.). 3, 1978) o BLOSUM62 (Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA.

89:10915-10919) se puede utilizar junto con el programa de computadora. Por ejemplo, la identidad porcentual se puede calcular de la siguiente manera: el número total de coincidencias idénticas multiplicado por 100 y luego dividido por la suma de la longitud de la secuencia más larga dentro del tramo coincidente y el número de espacios introducidos en las secuencias más largas para alinear las dos secuencias. Al calcular la identidad porcentual, las secuencias que se están comparando se alinean de manera que se obtiene la mayor coincidencia entre las secuencias.

[0043]El paquete de programas GCG es un programa de computadora que se puede utilizar para determinar el porcentaje de identidad, el cual incluye GAP (Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, Universidad de Wisconsin, Madison, WI). El algoritmo informático GAP se utiliza para alinear los dos polipéptidos o dos polinucleótidos para los cuales se debe determinar el porcentaje de identidad de secuencia. Las secuencias están alineadas para un emparejamiento óptimo de sus respectivos aminoácidos o nucleótidos (el tramo emparejado, según determinado por el algoritmo). Una penalización por apertura de brecha (que se calcula como 3 veces la diagonal promedio, donde la diagonal promedio es el promedio de la diagonal de la matriz de comparación que se está utilizando; la diagonal es la puntuación o número asignado a cada coincidencia perfecta de aminoácidos por la matriz de comparación particular) y una penalización por extensión de brecha (que suele ser 1/10 veces la penalización por apertura de brecha), así como una matriz de comparación como PAM 250 o BLOSUM 62 se utilizan en conjunto con el algoritmo. En ciertas formas de realización, una matriz de comparación estándar (ver, Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 para la matriz de comparación PAM 250; Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919 para la matriz de comparación BLOSUM 62) también es utilizada por el algoritmo.

[0044]Parámetros recomendados para determinar el porcentaje de identidad para polipéptidos o secuencias de nucleótidos utilizando el programa GAP incluyen los siguientes:

Algoritmo: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453;

Matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff et al., 1992,supra;

Penalización por brecha: 12 (pero sin penalización por huecos al final)

Penalización por longitud de hueco: 4

Umbral de Similitud: 0

[0045]Ciertos esquemas de alineación para alinear dos secuencias de aminoácidos pueden dar lugar a la coincidencia de solo una región corta de las dos secuencias, y esta pequeña región alineada puede tener una identidad de secuencia muy alta aunque no haya una relación significativa entre las dos secuencias completas. Por consiguiente, el método de alineación seleccionado (programa GAP) se puede ajustar si así se desea para obtener una alineación que abarque al menos 50 aminoácidos contiguos del polipéptido objetivo.

[0046]Variantes de los anticuerpos anti-TREM2 descritos aquí pueden generarse sustituyendo uno o más aminoácidos en las regiones variables de la cadena ligera o pesada para abordar vulnerabilidades químicas (por ejemplo, isomerización del ácido aspártico, desamidación de la asparagina, oxidación del triptófano y la metionina) o corregir violaciones de covarianza (ver WO2012/125495), como se describe en el Ejemplo 7. Tales variantes pueden tener propiedades biológicas, de expresión y/o estabilidad mejoradas en comparación con el anticuerpo parental. Por lo tanto, las proteínas de unión a antígenos agonistas de TREM2 descritas en este documento pueden comprender una región variable de cadena ligera y/o una región variable de cadena pesada que tenga una o más de las sustituciones de aminoácidos establecidas en cualquiera de las Tablas 13 a 18.

[0047]A menos que se indique lo contrario haciendo referencia a una secuencia específica, a lo largo de la presente especificación y reivindicaciones, la numeración de los residuos de aminoácidos en una cadena pesada o cadena ligera de inmunoglobulina sigue la numeración de Kabat-UE según se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta ed., Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU., publicación del NIH n.° 91-3242, pp. 662, 680, 689 (1991) y Edelman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 63: 78-85 (1969) El esquema de numeración de Kabat se suele usar cuando se hace referencia a la posición de un aminoácido dentro de las regiones variables, mientras que el esquema de numeración de la UE se utiliza generalmente al referirse a la posición de un aminoácido en una región constante de una inmunoglobulina. Existe en el sitio web de IMGT® (sistema de información internacional de Inmunogenética) un gráfico que resume la correspondencia entre los esquemas de numeración de Kabat y de la UE con otros esquemas de numeración.

[0048]Una sustitución de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos generalmente se designa aquí con una abreviatura de una letra para el residuo de aminoácido en una posición particular, seguida por la posición numérica del aminoácido relativa a una secuencia original de interés, y luego seguida por la abreviatura de una letra para el residuo de aminoácido sustituido. Por ejemplo, T30D simboliza una sustitución de un residuo de treonina por un residuo de aspartato en la posición del aminoácido 30, relativa a la secuencia original de interés. Otro ejemplo, S218G simboliza una sustitución de un residuo de serina por un residuo de glicina en la posición del aminoácido 218, en relación con la secuencia original de aminoácidos de interés.

[0049]El agonista TREM2 proteínas de unión a antígeno de la invención comprenden una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 330 y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 331, como se define en las reivindicaciones.

[0050]En una forma de realización específica, las proteínas de unión de antígeno agonista TREM2 de la invención comprenden una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, en la que la región variable de cadena ligera consiste en o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 330 y la región variable de la cadena pesada consiste en o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la<s>E<q>ID NO: 331.

[0051]Las variantes adicionales de los anticuerpos anti-TREM2 descritos aquí pueden ser generadas mediante la modulación de afinidad de cualquiera de los anticuerpos anti-TREM2 descritos aquí. Un anticuerpo modulado por afinidad es un anticuerpo que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en su región variable de la cadena ligera y/o región variable de la cadena pesada que incrementa o disminuye la afinidad del anticuerpo por el antígeno diana en comparación con el anticuerpo progenitor que no contiene las sustituciones de aminoácidos. Métodos de modulación de afinidad de anticuerpos son conocidos por aquellos con habilidades en la técnica e incluyen la mutagénesis por caminata de CDR (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), reorganización de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), uso de cepas mutantes deE. coli(Low et al., J. Mol. Biol., 250, 350-368, 1996), recombinación de ADN (Patten et al., Curr. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), visualización de fagos (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 7-88, 1996), técnicas de PCR (Crameri, et al., Nature, 391, 288-291, 1998), y otras estrategias de mutagénesis (Barbas et al. Proc Nat. Acad. -> Proc. Acad. Nac. Sci. USA 91:3809-3813, 1994; Schier et al. Gene 169:147-155, 1995; Yelton et al. J. Immunol. -> J. Immunol. 155:1994-2004, 1995; Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9, 1995; y Hawkins et al, J. Mol. Biol.

226:889-896, 1992). Se discuten los métodos de modulación de afinidad en Hoogenboom, Trends in Biotechnology, Vol.

15. 62-70, 1995 y Vaughan et al., Nature Biotechnology, 16: 535-539, 1998. Un método específico para generar variantes moduladas por afinidad de los anticuerpos anti-TREM2 descritos aquí es el uso de una biblioteca de mutagénesis Fab en levadura, como se describe en el Ejemplo 8.

[0052]El agonista TREM2 descrito aquí puede comprender una región variable de la cadena ligera y/o una región variable de la cadena pesada de una variante de afinidad modulada del anticuerpo 6E7 (Ejemplo 8). Por ejemplo, las proteínas de unión de antígenos agonistas de TREM2 descritas en este documento comprenden una región variable de cadena ligera y/o una región variable de cadena pesada que tiene una o más de las sustituciones de aminoácidos establecidas en la Tabla 23. El agonista de TREM2, la proteína de unión a antígenos descrita en este documento, puede comprender una región variable de cadena ligera que incluya la secuencia de SEQ ID NO: 61 con una mutación en una o más posiciones de aminoácidos 24, 31, 50, 52, 54, 56, 89, 92, 93, 94 y/o 96. La mutación puede ser seleccionada entre R24A, S31R, A50S, A50G, S52G, L54R, N56K, N56R, N56L, N56T, Q89G, D92V, S93R, F94Y, F94L, R96H, R96L, o combinaciones de las mismas. La proteína de unión al antígeno agonista de TREM2 puede comprender una región variable de cadena pesada que comprenda la secuencia de SEQ ID NO: 124 con una mutación en una o más posiciones de aminoácidos 27, 28, 30, 32, 50, 54, 58, 60, 61,63, 66, 99, 101, 103, 104 y/o 110. La mutación puede ser seleccionada de Y27S, S28G, S28H, T30N, T30G, T30E, T30A, Y32E, I50T, G54S, T58V, Y60L, S61A, S63G, S63E, G66D, Q99G, Q99S, Q99M, T101G, Y103R, Y104G, F110S, o combinaciones de las mismas. Se presentan a continuación en las Tablas 2A y 2B las secuencias de aminoácidos para las regiones variables de la cadena ligera y pesada, así como los CDRs asociados, de variantes ejemplares del anticuerpo 6E7 con mayor afinidad mejorada. Las secuencias de aminoácidos para las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas, así como las CDRs asociadas de variantes ejemplares del anticuerpo 6E7 con afinidad reducida, se presentan a continuación en las Tablas 3A y 3B, respectivamente. Las secuencias correspondientes para el anticuerpo 6E7 se enumeran para su comparación.

Tabla 2A. Secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera para anticuerpos TREM2 con mayor afinidad

Continuación

Tabla 2B. Secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada para anticuerpos TREM2 con mayor afinidad

Continuación

Continuación

Tabla 3A. Secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera para anticuerpos TREM2 con afinidad reducida

Continuación

<o>ro

o

<o>r

o

<o>ro

o

[0053]El agonista TREM2 proteínas de unión a antígenos descritas en este documento pueden incluir uno o más de los CDRs de las variantes de baja afinidad presentadas en la Tabla 3A (CDRs de la cadena ligera, es decir, CDRLs) y en la Tabla 3B (CDRs de la cadena pesada, es decir, CDRHs), que son útiles para comprender la invención reivindicada.

[0054]El TREM2 agonista proteínas de unión a antígenos de la invención son anticuerpos monoclonales agonistas anti-TREM2 o sus fragmentos de unión, según se definen en las reivindicaciones. Según se utiliza aquí, el término anticuerpo se refiere a una proteína inmunoglobulina tetramérica que consta de dos polipéptidos de cadena ligera (aproximadamente 25 kDa cada uno) y dos polipéptidos de cadena pesada (aproximadamente 50-70 kDa cada uno). Un anticuerpo es una especie de proteína que se une a un antígeno. El término "cadena ligera" o "cadena ligera de inmunoglobulina" se refiere a un polipéptido que comprende, desde el extremo amino al extremo carboxilo, una única región variable de cadena ligera de inmunoglobulina (VL) y un único dominio constante de cadena ligera de inmunoglobulina (CL). El dominio constante de la cadena ligera de la inmunoglobulina (CL) puede ser un dominio constante kappa (k) humano o un dominio constante lambda (A) humano. El término cadena pesada o cadena pesada de inmunoglobulina se refiere a un polipéptido que comprende, de extremo amino a extremo carboxilo, una sola región variable de cadena pesada de inmunoglobulina (VH), un dominio constante 1 de cadena pesada de inmunoglobulina (CH1), una región de bisagra de inmunoglobulina, un dominio constante 2 de cadena pesada de inmunoglobulina (CH2), un dominio constante 3 de cadena pesada de inmunoglobulina (CH3) y opcionalmente un dominio constante 4 de cadena pesada de inmunoglobulina (CH4). Las cadenas pesadas se clasifican como mu (p), delta (A), gamma (y), alfa (a) y epsilon (e), y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA y IgE, respectivamente. Las anticuerpos de clase IgG e IgA se dividen además en subclases, a saber, IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4, e IgA1 e IgA2, respectivamente. Las cadenas pesadas en los anticuerpos IgG, IgA e IgD tienen tres dominios (CH1, CH2 y CH3), mientras que las cadenas pesadas en los anticuerpos IgM e IgE tienen cuatro dominios (CH1, CH2, CH3 y CH4). Las regiones constantes de la cadena pesada de inmunoglobulina pueden ser de cualquier isotipo de inmunoglobulina, incluidos los subtipos. Las cadenas de anticuerpos están unidas entre sí a través de enlaces disulfuro inter-polipéptido entre el dominio CL y el dominio CH1 (es decir, entre la cadena ligera y la pesada) y entre las regiones de bisagra de las cadenas pesadas de los anticuerpos.

[0055]Los anticuerpos anti-TREM2 de la invención pueden incluir cualquier región constante de inmunoglobulina. El término "región constante", tal como se utiliza en este documento, se refiere a todos los dominios de un anticuerpo que no sean la región variable. La región constante no participa directamente en la unión de un antígeno, pero muestra varias funciones efectoras. Como se describe arriba, los anticuerpos se dividen en isotipos particulares (IgA, IgD, IgE, IgG y IgM) y subtipos (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2) dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas. La región constante de la cadena ligera puede ser, por ejemplo, una región constante de cadena ligera tipo kappa- o lambda, por ejemplo, una región constante de cadena ligera tipo kappa o lambda humana, que se encuentran en todos los cinco isotipos de anticuerpos. Se muestran ejemplos de secuencias de la región constante de la cadena ligera de inmunoglobulina humana en la siguiente tabla.

Tabla 4. Regiones constantes ejemplares de cadena ligera de inmunoglobulina humana

(Continuación)

[0056]La región constante de la cadena pesada de los anticuerpos anti-TREM2 de la invención puede ser, por ejemplo, una región constante de cadena pesada tipo alfa-, delta-, épsilon-, gamma- o miu, por ejemplo, una región constante de cadena pesada tipo alfa, delta, épsilon, gamma o miu humana. En algunos ejemplos, los anticuerpos anti-TREM2 comprenden una región constante de cadena pesada de una inmunoglobulina IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En una forma de realización, el anticuerpo anti-TREM2 consta de una región constante de cadena pesada de una inmunoglobulina IgG1 humana. En tales formas de realización, la región constante de la inmunoglobulina IgG1 humana puede incluir una o más mutaciones para prevenir la glicosilación del anticuerpo, tal como se describe con más detalle aquí. En otra forma de realización, el anticuerpo anti-TREM2 incluye una región constante de cadena pesada de una inmunoglobulina IgG2 humana. En otra forma de realización, el anticuerpo anti-TREM2 comprende una región constante de cadena pesada de una inmunoglobulina IgG4 humana. Se muestran a continuación en la Tabla 5 ejemplos de secuencias de la región constante de la cadena pesada de IgG1, IgG2 e IgG4 humanas.

Tabla 5. Regiones Constantes Ejemplares de la Cadena Pesada de Inmunoglobulina Humana

(Continuación)

[0057]Cada una de las regiones variables de la cadena ligera reveladas en las Tablas 1A, 2A y 3A y cada una de las regiones variables de la cadena pesada reveladas en las Tablas 1B, 2B y 3B pueden ser unidas a las regiones constantes de la cadena ligera mencionadas arriba (Tabla 4) y a las regiones constantes de la cadena pesada (Tabla 5) para formar cadenas completas de anticuerpos, respectivamente. Además, cada una de las secuencias de cadenas pesadas y ligeras generadas de esta manera puede combinarse para formar una estructura de anticuerpo completa. Debe entenderse que las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera proporcionadas aquí también pueden unirse a otros dominios constantes que tengan secuencias diferentes a las secuencias ejemplares mencionadas anteriormente.

[0058] El agonista TREM2 proteína de unión del antígeno de la invención es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión del antígeno del mismo, tal como se define en las reivindicaciones. En tales formas de realización, el anticuerpo anti-TREM2 puede ser un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo completamente humano que tenga un dominio constante de inmunoglobulina humana. En estas y otras formas de realización, el anticuerpo anti-TREM2 es un anticuerpo humano de tipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Por lo tanto, el anticuerpo anti-TREM2 puede, en algunas formas de realización, tener un dominio constante de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humano. En una forma de realización, el anticuerpo anti-TREM2 es un anticuerpo monoclonal humano de tipo IgG1. En otra forma de realización, el anticuerpo anti-TREM2 es un anticuerpo monoclonal humano de tipo IgG2. En otra forma de realización, el anticuerpo anti-TREM2 es un anticuerpo monoclonal humano de tipo IgG4.

[0059] El término anticuerpo monoclonal (o mAb) tal como se utiliza aquí se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que componen la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que puedan estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, ya que están dirigidos contra un sitio antigénico individual o un epítopo, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes epítopos. Los anticuerpos monoclonales pueden ser producidos utilizando cualquier técnica conocida en la técnica, por ejemplo, mediante la inmortalización de células de bazo recolectadas de un animal después de completar el programa de inmunización. Las células del bazo pueden ser inmortalizadas utilizando cualquier técnica conocida en la técnica, por ejemplo, fusionándolas con células de mieloma para producir hibridomas. Consulte, por ejemplo, Antibodies; Harlow y Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1a edición, por ejemplo de 1988, o 2a edición, por ejemplo de 2014. Las células de mieloma para usar en procedimientos de hibridoma productora de fusión preferiblemente no producen anticuerpos, tienen alta eficiencia de fusión y deficiencias enzimáticas que las hacen incapaces de crecer en ciertos medios selectivos, los cuales favorecen el crecimiento solo de las células fusionadas deseadas (hibridomas). Ejemplos de líneas celulares adecuadas para fusiones con células de ratón incluyen, pero no se limitan a, Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5XXO Bul. Ejemplos de líneas celulares adecuadas utilizadas para fusiones con células de rata incluyen, pero no se limitan a, R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F y 4B210. Otras líneas celulares útiles para fusiones celulares son U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 y UC729-6.

[0060] En algunas formas de realización, una línea celular de hibridoma se produce al inmunizar a un animal (por ejemplo, un conejo, rata, ratón o un animal transgénico con secuencias de inmunoglobulina humana) con un inmunógeno de TREM2 (como los inmunógenos descritos en el Ejemplo 1); recolectando células del bazo del animal inmunizado; fusionando las células del bazo recolectadas con una línea celular de mieloma, generando así células de hibridoma; estableciendo líneas celulares de hibridoma a partir de las células de hibridoma e identificando una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo que se une a TREM2 humano. Otro método útil para producir anticuerpos monoclonales es el método SLAM descrito en Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93. 7843-7848, 1996.

[0061] Los anticuerpos monoclonales secretados por una línea celular de hibridoma pueden ser purificados utilizando cualquier técnica conocida en el campo, como la proteína A-Sepharosa, la cromatografía de hidroxilapatita, la electroforesis en gel, la diálisis o la cromatografía de afinidad. Los sobrenadantes de hibridomas o mAbs pueden ser sometidos a un nuevo tamizaje para identificar mAbs con propiedades particulares, tales como la capacidad de unirse a TREM2 humano, la reactividad cruzada con proteínas TRE<m>2 de otras especies (por ejemplo, TREM2 de ratón, TREM2 de rata y TREM2 de mono cangrejero), la reactividad cruzada con otros miembros de la familia TREM (por ejemplo, TREM1 humano), la capacidad de inducir o aumentar la señalización mediada por TREM2, por ejemplo, usando un ensayo de pSyk como se describe aquí, o la capacidad de inducir o aumentar la función o actividades mediadas por TREM2 según se describe aquí (por ejemplo, proliferación o supervivencia de células mieloides que expresan TREM2).

[0062] En algunas formas de realización, las proteínas de unión a antígenos agonistas de TREM2 de la invención son anticuerpos quiméricos o humanizados basados en las secuencias de región variable y CDR de los anticuerpos anti-TREM2 descritos aquí, como se definen en las reivindicaciones. Un anticuerpo quimérico es un anticuerpo compuesto por segmentos de proteína de diferentes anticuerpos que están unidos covalentemente para producir cadenas ligeras o pesadas de inmunoglobulinas funcionales o fragmentos de unión de los mismos. Generalmente, una parte de la cadena pesada y/o de la cadena ligera es idéntica o homóloga a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es/son idénticas o homólogas a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos. Para métodos relacionados con anticuerpos quiméricos, consulte, por ejemplo, la Patente de EE. UU. N.° 4.816.567 y Morrison et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81:6851-6855.

[0063] En general, el objetivo de hacer un anticuerpo quimérico es crear una quimera en la que se maximice el número de aminoácidos de la especie deseada. Un ejemplo es el anticuerpo injertado con CDR, en el que el anticuerpo consta de uno o más CDR de una especie particular o perteneciente a una clase o subclase de anticuerpos en particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) del anticuerpo es/son idénticas o homólogas a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos. El injerto de CDR se describe, por ejemplo, en la Patente de EE. UU. N.° 6,180,370, No. 5,693,762, No. 5,693,761, No. 5,585,089 y N.° 5,530,101. Para su uso en humanos, la región variable o CDRs seleccionados de un anticuerpo de roedor o conejo a menudo se injertan en un anticuerpo humano, reemplazando las regiones variables o CDRs naturalmente presentes del anticuerpo humano.

[0064]Una forma útil de anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Generalmente, un anticuerpo humanizado se produce a partir de un anticuerpo monoclonal generado inicialmente en un animal no humano, como un roedor o un conejo. Ciertos residuos de aminoácidos en este anticuerpo monoclonal, típicamente de partes no reconocedoras de antígeno del anticuerpo, son modificados para ser homólogos a residuos correspondientes en un anticuerpo humano del mismo isotipo. La humanización puede realizarse, por ejemplo, mediante varios métodos al sustituir al menos una parte de la región variable de un roedor o conejo por las regiones correspondientes de un anticuerpo humano (ver, por ejemplo, Patente de EE. UU. N.° 5,585,089 y N.° 5,693,762; Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-27; y Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536).

[0065]En un aspecto de la divulgación, los CDRs de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas de los anticuerpos descritos aquí (ver, Tablas 1A, 1B, 2A, 2B, 3A y 3B) se injertan en regiones de armazón (FRs) de anticuerpos de la misma especie filogenética o de una especie filogenética diferente. Por ejemplo, los CDRs de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras enumeradas en las Tablas 1A, 1B, 2A, 2B, 3A y 3B pueden injertarse en los FRs humanos de consenso. Para crear FR humanos de consenso, los FR de varias secuencias de aminoácidos de cadenas pesadas o ligeras humanas pueden ser alineados para identificar una secuencia de aminoácidos de consenso. Alternativamente, las regiones variables injertadas de una cadena pesada o ligera pueden ser utilizadas con una región constante que es diferente de la región constante de esa cadena pesada o ligera en particular, según se revela aquí. Las regiones variables injertadas pueden ser parte de un anticuerpo Fv de cadena única.

[0066]En ciertas formas de realización, las proteínas de unión de antígeno agonista TREM2 de la invención son anticuerpos totalmente humanos. Anticuerpos totalmente humanos que se unen específicamente a TREM2 humano pueden ser generados utilizando los inmunógenos o fragmentos de los mismos descritos aquí, como polipéptidos que consisten en las secuencias de los ID NOs de SEQ. 1 y 2 o los inmunógenos descritos en el Ejemplo 1. Un anticuerpo completamente humano es un anticuerpo que comprende regiones variables y constantes derivadas de o indicativas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Un medio específico proporcionado para implementar la producción de anticuerpos completamente humanos es la humanización del sistema inmunitario humoral del ratón. Introducción de los loci de inmunoglobulina humana (Ig) en ratones en los cuales los genes Ig endógenos han sido inactivados es un medio de producir anticuerpos monoclonales humanos totalmente en ratón, un animal que puede ser inmunizado con cualquier antígeno deseado. El uso de anticuerpos totalmente humanos puede minimizar las respuestas inmunogénicas y alérgicas que a veces pueden ser causadas al administrar anticuerpos monoclonales de ratón o derivados de ratón a humanos como agentes terapéuticos.

[0067]Los anticuerpos totalmente humanos pueden ser producidos mediante la inmunización de animales transgénicos (generalmente ratones) que son capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulinas. Antígenos para este propósito típicamente tienen seis o más aminoácidos contiguos, y opcionalmente están conjugados a un portador, como un hapteno. Ver, por ejemplo, Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555; Jakobovits et al., 1993, Nature 362:255-258; y Bruggermann et al., 1993, Year in Immunol.

7:33. En un ejemplo de tal método, se producen animales transgénicos incapacitando los loci endógenos del genoma del ratón que codifican las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina del ratón, e insertando en el genoma del ratón grandes fragmentos de ADN del genoma humano que contienen loci que codifican proteínas de cadenas pesadas y ligeras humanas. Animales parcialmente modificados, que tienen menos que el conjunto completo de loci de inmunoglobulina humana, son luego cruzados para obtener un animal que tenga todas las modificaciones deseadas en su sistema inmunológico. Cuando se administra un inmunógeno a estos animales transgénicos, producen anticuerpos que son inmunoespecíficos para el inmunógeno pero tienen secuencias de aminoácidos humanas en lugar de murinas, incluidas las regiones variables. Para más detalles sobre tales métodos,consulte,por ejemplo, WO96/33735 y WO94/02602. Se describen métodos adicionales relacionados con ratones transgénicos para la producción de anticuerpos humanos en la Patente de EE. UU. N.° 5,545,807; N.° 6,713,610; N.° 6,673,986; N.° 6,162,963; N.° 5,939,598; N.° 5,545,807; N.° 6,300,129; N.° 6,255,458; N.° 5,877,397; N.° 5,874,299 y N.° 5,545,806; en las publicaciones de la CPT WO91/10741, WO90/04036, WO 94/02602, WO 96/30498, WO 98/24893 y en EP 546073B1 y EP 546073A1.

[0068]Los ratones transgénicos descritos anteriormente, denominados en este documento como ratones HuMab, contienen un minilocus de genes de inmunoglobulinas humanas que codifican secuencias de inmunoglobulinas pesadas humanas no recombinadas (mu y gamma) y cadenas ligeras kappa, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci endógenos de las cadenas mu y kappa (Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859). En consecuencia, los ratones muestran una reducida expresión de las proteínas IgM y kappa de ratón y, en respuesta a la inmunización, los transgenes introducidos de las cadenas pesadas y ligeras humanas experimentan cambio de clase y mutación somática para generar anticuerpos monoclonales humanos IgG kappa de alta afinidad (Lonberg y Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. would be translated into Spanish as Rev. Immunol. 13. 65-93; Harding y Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536-546). La preparación de ratones HuMab se describe en detalle en Taylor et al., 1992, Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen et al., 1993, International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al., 1994, J. Immunol. 152: 29122920; Lonberg et al., 1994, Nature 368: 856 859; Lonberg, 1994, Manual de Exp. Pharmacology 113:49-101; Taylor et al., 1994, International Immunology 6:579-591; Lonberg y Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol.:65-93; Harding y Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536546; Fishwild y colaboradores, 1996, Nature Biotechnology 14:845851. Vea, además, la Patente de EE. UU. N.° 5,545,806; N.° 5,569,825; N.° 5,625,126; N.° 5,633,425; N.° 5,789,650; N.° 5,877,397; N.° 5,661,016; N.° 5,814,318; N.° 5,874,299; y N.° 5,770,429; así como la Patente de EE. UU. N.° 5,545,807; Números de Publicación Internacional WO 93/1227; WO 92/22646; y WO 92/03918. Las tecnologías utilizadas para producir anticuerpos humanos en estos ratones transgénicos también se describen en WO 98/24893, y en Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15:146-156. Por ejemplo, las cepas de ratones transgénicos HCo7 y HCo12 se pueden usar para generar anticuerpos anti-TREM2 completamente humanos. Una línea particular de ratones transgénicos adecuada para la generación de anticuerpos anti-TREM totalmente humanos es la de ratones transgénicos XenoMouse® descrita en el Ejemplo 1 y en la patente estadounidense. Nos.

6,114,598; 6,162,963; 6,833,268; 7,049,426; 7,064,244; Green et al., 1994, Nature Genetics 7:1321; Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15:146156; Green and Jakobovitis, 1998, J. Ex. Med, 188:483495; Green, 1999, Journal of Immunological Methods 231:11{4}23; Kellerman y Green, Current Opinion in Biotechnology 13, 593-597, 2002.

[0069]Anticuerpos derivados de humanos también pueden ser generados utilizando técnicas de visualización de fagos. La presentación de fagos se describe, por ejemplo, en Dower et al., WO 91/17271, McCafferty et al., WO 92/01047, y Caton y Koprowski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:6450-6454 (1990). Los anticuerpos producidos por la tecnología de fagos suelen ser producidos como fragmentos de unión a antígenos, por ejemplo, fragmentos Fv o Fab, en bacterias y, por lo tanto, carecen de funciones efectoras. Las funciones efectoras pueden ser introducidas por una de dos estrategias: Los fragmentos pueden ser diseñados ya sea como anticuerpos completos para su expresión en células de mamíferos, o como fragmentos de anticuerpos biespecíficos con un segundo sitio de unión capaz de desencadenar una función efectora, si se desea. Por lo general, el fragmento Fd (VH-CH1) y la cadena ligera (VL-CL) de los anticuerpos se clonan por separado mediante PCR y se recombinan aleatoriamente en bibliotecas combinatorias de visualización de fagos, que luego pueden ser seleccionadas por su unión a un antígeno particular. Los fragmentos de anticuerpos se expresan en la superficie del fago, y la selección de Fv o Fab (y por lo tanto, el fago que contiene el ADN que codifica el fragmento de anticuerpo) mediante la unión al antígeno se logra mediante varias rondas de unión al antígeno y reamplificación, un procedimiento denominado "panning". Fragmentos de anticuerpos específicos para el antígeno son enriquecidos y finalmente aislados. -Las técnicas de visualización de fagos también pueden ser utilizadas en un enfoque para la humanización de anticuerpos monoclonales de roedores, llamado selección guiada (ver Jespers, L. S., et al., Bio/Technology 12, 899-903 (1994)). Para esto, el fragmento Fd del anticuerpo monoclonal de ratón puede ser mostrado en combinación con una biblioteca de cadenas ligeras humanas, y la biblioteca de Fab híbrida resultante puede ser seleccionada con antígeno. El fragmento Fd del ratón proporciona así una plantilla para guiar la selección. Posteriormente, las cadenas ligeras humanas seleccionadas se combinan con una biblioteca de fragmentos Fd humanos. La selección de la biblioteca resultante produce exclusivamente Fab humanos.

[0070]Una vez que se hayan obtenido células que producen anticuerpos anti-TREM2 según la invención utilizando cualquiera de las técnicas de inmunización y otras descritas anteriormente, los genes específicos de los anticuerpos pueden ser clonados mediante el aislamiento y amplificación de ADN o ARNm de los mismos de acuerdo a los procedimientos estándar descritos aquí. Los anticuerpos producidos a partir de ellos pueden ser secuenciados y se pueden identificar los CDRs, y el ADN que codifica para los CDRs puede ser manipulado según se describe aquí para generar otras proteínas de unión a antígenos agonistas de TREM2 o anticuerpos de acuerdo con la invención.

[0071]El agonista TREM2 y las proteínas de unión antigénica descritas aquí (por ejemplo, anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión de los mismos) pueden competir por la unión a TREM2 humano (SEQ ID NO: 1). o un dominio extracelular de TREM2 humano (SEQ ID NO: 2) con un anticuerpo de referencia, como uno o más de los anticuerpos anti-TREM2 descritos aquí. El término competir se refiere a la capacidad de un anticuerpo u otra proteína de unión a antígenos para interferir con la unión de otros anticuerpos o fragmentos de unión a un objetivo (por ejemplo, el TREM2 humano). La medida en que un anticuerpo o fragmento de unión puede interferir con la unión de otro anticuerpo o fragmento de unión a un objetivo (por ejemplo, TREM2 humano), y por lo tanto si se puede decir que compite, se puede determinar utilizando ensayos de unión competitiva. Numerosos tipos de ensayos de unión competitiva pueden ser utilizados, incluyendo por ejemplo: radioinmunoensayo (RIA) directo o indirecto en fase sólida, inmunoensayo enzimático (EIA) directo o indirecto en fase sólida, ensayo de competencia tipo sandwich (ver, por ejemplo, Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253); EIA directo biotina-avidina en fase sólida (ver, por ejemplo, Kirkland et al., 1986, J. Immunol.). 137:3614-3619); ensayo directo marcado en fase sólida, ensayo de sándwich directo marcado en fase sólida(ver,por ejemplo, Harlow y Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA con marcaje directo en fase sólida utilizando etiqueta I-125(ver,por ejemplo, Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15); ensayo de inmunoabsorción en fase sólida directo biotina-avidina(ver,por ejemplo, Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552); ensayos basados en resonancia de plasmón superficial (por ejemplo, utilizando sistemas Biacore®); ensayos basados en interferometría de capa biológica (por ejemplo, utilizando sistemas Octet®); y RIA directo marcado (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82). Por lo general, un ensayo de unión competitiva implica el uso de un antígeno purificado unido a una superficie sólida o células que llevan el antígeno, un anticuerpo de prueba no marcado u otra proteína de unión a antígenos, y un anticuerpo de referencia marcado o otra proteína de unión a antígenos. La inhibición competitiva se mide determinando la cantidad de etiqueta unida a la superficie sólida o a las células en presencia del anticuerpo de prueba u otra proteína de unión a antígenos. Normalmente, el anticuerpo de prueba u otra proteína de unión de antígeno está presente en exceso. Anticuerpos u otras proteínas de unión a antígenos identificadas por ensayo de competencia (es decir, anticuerpos y proteínas de unión a antígenos competidores) incluyen anticuerpos y proteínas de unión a antígenos que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia o la proteína de unión a antígenos. Por lo general, cuando un anticuerpo competidor u otra proteína de unión a antígenos está presente en exceso, inhibirá la unión específica de un anticuerpo de referencia u otra proteína de unión a antígenos a un antígeno objetivo en al menos un 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 % o 75 %. En algunas formas de realización, la unión del anticuerpo de referencia u otra proteína que se une al antígeno se inhibe en al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 97 % o más. Una proteína de unión de antígeno competidora (por ejemplo, un anticuerpo o su fragmento de unión) puede reducir la unión de TREM2 humano a un anticuerpo de referencia entre aproximadamente el 40 % y el 100 %, como entre aproximadamente el 60 % y el 100 %, específicamente entre aproximadamente el 70 % y el 100 %, y más específicamente entre aproximadamente el 80 % y el 100 %.

[0072]Un ensayo cuantitativo particularmente adecuado para detectar la unión competitiva utiliza una máquina Biacore® que mide la extensión de las interacciones utilizando la tecnología de resonancia de plasmón superficial. Un ensayo competitivo ejemplar basado en Biacore® implica la inmovilización de un anticuerpo de referencia en un chip sensor. El antígeno objetivo es luego puesto en contacto con el chip del sensor donde es capturado por el anticuerpo de referencia inmovilizado. Se inyectan anticuerpos de prueba sobre el antígeno capturado objetivo. Si el anticuerpo de prueba inyectado reconoce un epítopo distinto al reconocido por el anticuerpo inmovilizado, entonces se observa un segundo evento de unión y se consideraría que el anticuerpo de prueba no compite por la unión al antígeno objetivo con el anticuerpo de referencia.

[0073]Una prueba particularmente adecuada para detectar la unión competitiva emplea sensores cinéticos utilizados con los sistemas Octet® (Pall ForteBio), que miden las interacciones de unión utilizando la metodología de interferometría de capa biológica. Se describe una prueba de este tipo en el Ejemplo 4, en la cual se evaluaron dieciséis diferentes anticuerpos anti-TREM2 descritos aquí entre sí por su capacidad de competir por la unión a TREM2 humano. Los resultados del análisis proporcionados en la Tabla 9 muestran que los dieciséis diferentes anticuerpos podrían agruparse en cuatro bins de epítopos distintos. Es decir, un grupo de anticuerpos (anticuerpos 10E3, 13E7, 24F4, 4C5, 4G10, 32E3 y 6E7) compitió entre sí por unirse a TREM2 humano, lo que indica que comparten el mismo o un epitopo similar en TREM2 humano. Los anticuerpos 16B8, 26A10, 26C10, 26F2, 33B12 y 5E3 compitieron entre sí por la unión a TREM2, pero no compitieron con los anticuerpos del primer grupo ni con los anticuerpos 24A10, 24G6 o 25F12, lo que indica que este segundo grupo de anticuerpos se une a un epítopo distinto en el TREM2 humano. Los anticuerpos 24A10 y 24G6 comparten un epítopo similar en el TREM2 humano, ya que estos dos anticuerpos compitieron entre sí por la unión al TREM2 humano, pero no compitieron con ningún otro anticuerpo. El anticuerpo 25F12 no compitió con ninguno de los otros anticuerpos probados por la unión a TREM2 humano, lo que indica que este anticuerpo se une a otro epítopo.

[0074]En ciertas formas de realización, las proteínas de unión a antígenos agonistas de TREM2 de la invención pueden comprender una o más mutaciones o modificaciones en una región constante. Por ejemplo, en las formas de realización en las que las proteínas de unión de antígeno agonista TREM2 comprenden una región Fc (por ejemplo, anticuerpos monoclonales), las regiones constantes de cadena pesada o las regiones Fc de las proteínas de unión de antígeno (por ejemplo, anticuerpos monoclonales) pueden comprender una o más sustituciones de aminoácidos que afectan la glicosilación, la función efectora y/o la unión al receptor Fcy de la proteína de unión de antígeno.

[0075]El término "región Fc" se refiere a la región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que puede ser generada por la digestión de una enzima papaina de un anticuerpo intacto. La región Fc de una inmunoglobulina generalmente comprende dos dominios constantes, un dominio CH2 y un dominio CH3, y opcionalmente comprende un dominio CH4. En ciertas formas de realización, la región Fc es una región Fc de una inmunoglobulina IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En algunas formas de realización, la región Fc comprende los dominios CH2 y CH3 de una inmunoglobulina humana IgG1 o IgG2. La región Fc puede conservar la función efectora, como la unión a C1q, la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la unión a receptores Fc, la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y la fagocitosis. En otras formas de realización, la región Fc puede ser modificada para reducir o eliminar la función efectora, como se describe con más detalle a continuación.

[0076]Una de las funciones de la región Fc de una inmunoglobulina es comunicar al sistema inmunológico cuando la inmunoglobulina se une a su objetivo. Esto comúnmente se conoce como función efectora. La comunicación conduce a ADCC, fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) y/o CDC. ADCC y ADCP se llevan a cabo a través de la unión de la región Fc a los receptores Fc en la superficie de las células del sistema inmunitario. La CDC se lleva a cabo a través de la unión de la porción Fc con proteínas del sistema de complemento, por ejemplo, C1q. En algunas formas de realización, las proteínas de unión a antígenos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, de la invención comprenden una o más sustituciones de aminoácidos en la región Fc para potenciar la función efectora, incluida la actividad de ADCC, la actividad de CDC, la actividad de ADCP y/o la depuración o vida media de la proteína de unión a antígenos. Sustituciones ejemplares de aminoácidos (según el esquema de numeración de la UE) que pueden mejorar la función efectora incluyen, pero no se limitan a, E233L, L234I, L234Y, L235S, G236A, S239D, F243L, F243V, P247I, D280H, K290S, K290E, K290N, K290Y, R292P, E294L, Y296W, S298A, S298D, S298V, S298G, S298T, T299A, Y300L, V305I, Q311M, K326A, K326E, K326W, A330S, A330L, A330M, A330F, I332E, D333A, E333S, E333A, K334A, K334V, A339D, A339Q, P396L, o combinaciones de cualquiera de los anteriores.

[0077]En otras formas de realización, las proteínas de unión al antígeno agonista TREM2 (por ejemplo, anticuerpos monoclonales) de la invención incluyen una o más sustituciones de aminoácidos en una región constante de la cadena pesada para reducir la función efectora. Sustituciones ejemplares de aminoácidos (según el esquema de numeración de la UE) que pueden reducir la función efectora incluyen, pero no se limitan a, C220S, C226S, C229S, E233P, L234A, L234V, V234A, L234F, L235A, L235E, G237A, P238S, S267E, H268Q, N297A, N297G, V309L, E318A, L328F, A330S, A331S, P331S o combinaciones de cualquiera de los anteriores.

[0078]La glicosilación puede contribuir a la función efectora de los anticuerpos, en particular los anticuerpos IgG1. Por lo tanto, en algunos ejemplos, las proteínas de unión de antígenos agonistas de TREM2 de la invención pueden comprender una o más sustituciones de aminoácidos que afecten el nivel o tipo de glicosilación de las proteínas de unión. La glicosilación de polipéptidos suele ser ya sea N-glicosilación o O-glicosilación. La expresión "de enlace N" se refiere a la unión de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tri-péptidos asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del grupo de carbohidratos a la cadena lateral de asparagina. Por lo tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tri-péptidos en un polipéptido crea un posible sitio de glicosilación. La glicosilación de enlace O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa, a un ácido hidroxiamino, más comúnmente serina o treonina, aunque también se puede usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

[0079]En ciertas formas de realización, la glicosilación de las proteínas de unión a antígenos agonistas de TREM2 descritas aquí se incrementa al agregar uno o más sitios de glicosilación, por ejemplo, a la región Fc de la proteína de unión. La adición de sitios de glicosilación a la proteína de unión al antígeno puede lograrse convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de manera que contenga una o más de las secuencias de tríptidos descritas anteriormente (para sitios de glicosilación N-unidos). La alteración también puede realizarse mediante la adición o sustitución de uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia inicial (para sitios de glicosilación tipo O). Por facilidad, la secuencia de aminoácidos de la proteína de unión al antígeno puede ser alterada a través de cambios a nivel de ADN, particularmente mediante la mutación del ADN que codifica el polipéptido objetivo en bases preseleccionadas de manera que se generen codones que se traduzcan en los aminoácidos deseados.

[0080]También se describe aquí la producción de moléculas de proteínas de unión a antígenos de TREM2 con estructura de carbohidratos alterada que resulta en una actividad efectora alterada, incluidas proteínas de unión a antígenos con fucosilación ausente o reducida que presentan una actividad de ADCC mejorada. Se conocen varios métodos en la técnica para reducir o eliminar la fucosilación. Por ejemplo, la actividad efectora de ADCC es mediada por la unión de la molécula de anticuerpo al receptor F<cy>RIII, lo cual se ha demostrado que depende de la estructura de carbohidratos de la glicosilación N-vinculada en el residuo N297 del dominio CH2. Los anticuerpos no fucosilados se unen a este receptor con mayor afinidad y activan las funciones efectoras mediadas por FcyRIII de manera más eficiente que los anticuerpos nativos fucosilados. Por ejemplo, la producción recombinante de un anticuerpo no fucosilado en células CHO en las que se ha eliminado la enzima alfa-1,6-fucosil transferasa, resulta en un anticuerpo con una actividad de ADCC aumentada en 100 veces(verYamane-Ohnuki et al., Biotechnol Bioeng. 87(5):614-22, 2004). Efectos similares pueden lograrse disminuyendo la actividad de la enzima alfa-1,6-fucosil transferasa u otras enzimas en la vía de fucosilación, por ejemplo, mediante tratamiento con siARN o ARN antisentido, modificando líneas celulares para eliminar la(s) enzima(s), o cultivando con inhibidores selectivos de la glicosilación (ver Rothman et al., Mol Immunol). 26(12):1113-23, 1989). Algunas cepas de células huésped, por ejemplo Lec13 o la línea celular híbrida de rata YB2/0, producen naturalmente anticuerpos con niveles más bajos de fucosilación (ver Shields et al., J Biol Chem). 277(30):26733-40, 2002 y Shinkawa et al., J Biol Chem. 278(5):346673, 2003). Un aumento en el nivel de carbohidrato bisecado, por ejemplo, mediante la producción recombinante de anticuerpos en células que sobreexpresan la enzima GnTIII, también se ha determinado que aumenta la actividad de ADCC (citocitoxicidad dependiente de anticuerpos)(verUmana et al., Nat Biotechnol. 17(2):176-80, 1999).

[0081]En otras formas de realización, la glicosilación de las proteínas de unión a antígenos agonistas de TREM2 descritas aquí se reduce o elimina al eliminar uno o más sitios de glicosilación, por ejemplo, de la región Fc de la proteína de unión. En algunas formas de realización, la proteína de unión al antígeno agonista TREM2 es un anticuerpo monoclonal humano aglicosilado, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal humano IgG1 aglicosilado. Las sustituciones de aminoácidos que eliminan o alteran los sitios de glicosilación N enlazada pueden reducir o eliminar la glicosilación N enlazada de la proteína de unión al antígeno. En ciertas formas de realización, las proteínas de unión a antígenos agonistas de TREM2 descritas aquí comprenden una mutación en la posición N297 (según el esquema de numeración de la UE), como N297Q, N297A o N297G. En algunas formas de realización, las proteínas de unión de antígeno agonistas de TREM2 de la invención comprenden una región Fc de un anticuerpo humano IgG1 con una mutación en la posición N297. En una forma de realización particular, las proteínas de unión a antígenos agonistas de TREM2 de la invención comprenden una región Fc de un anticuerpo IgG1 humano con una mutación N297G. Por ejemplo, en algunas formas de realización, las proteínas de unión a antígenos agonistas de TREM2 de la invención comprenden una región constante de cadena pesada que contiene la secuencia de SEQ ID NO: 202.

[0082]Para mejorar la estabilidad de las moléculas que comprenden una mutación N297, la región Fc de las proteínas de unión a antígenos agonistas de TREM2 puede ser modificada aún más. Por ejemplo, en algunos ejemplos, uno o más aminoácidos en la región Fc son sustituidos por cisteína para promover la formación de enlaces disulfuro en el estado dimérico. Los residuos correspondientes a V259, A287, R292,<v>302, L306, V323 o I332 (según el esquema de numeración de la UE) de una región Fc de IgG1 pueden ser sustituidos por cisteína. Preferiblemente, pares específicos de residuos son sustituidos por cisteína de modo que prefieran formar un enlace disulfuro entre ellos, limitando o previniendo así el intercambio de enlaces disulfuro. Pares preferidos incluyen, pero no se limitan a, A287C y L306C, V259C y L306C, R292C y V302C, y V323C e I332C. En ciertas formas de realización, las proteínas de unión a antígenos agonistas de TREM2 descritas aquí comprenden una región Fc de un anticuerpo humano IgG1 con mutaciones R292C y V302C. En tales formas de realización, la región Fc también puede incluir una mutación N297, como por ejemplo una mutación N297G. En algunos ejemplos, las proteínas de unión a antígenos agonistas TREM2 de la invención comprenden una región constante de cadena pesada que incluye la secuencia de SEQ ID NO: 203.

[0083]Modificaciones en la región de la bisagra y/o dominio CH1 de la cadena pesada y/o la región constante de la cadena ligera de las proteínas de unión al antígeno agonista de TREM2 (por ejemplo, anticuerpos monoclonales) de la invención pueden realizarse para reducir o eliminar la heterogeneidad de disulfuro. Se ha observado una heterogeneidad estructural de los anticuerpos IgG2 donde los enlaces disulfuro en la bisagra y las regiones CH1 de los anticuerpos IgG2 pueden ser reorganizados para crear diferentes isoformas estructurales de disulfuro (IgG2A, IgG2B y IgG2A-B), que pueden tener diferentes niveles de actividad. Ver, por ejemplo, Dillon et al., J. Biol. Quím., Vol. 283: 16206-16215; Martinez y col., Biochemistry, Vol. 47: 7496-7508, 2008; y White y otros, Cancer Cell, Vol. 27: 138-148, 2015. Las sustituciones de aminoácidos se pueden realizar en la región de la bisagra, el dominio CH1 y/o la región constante de la cadena ligera para promover la formación de una sola isoforma de disulfuro o bloquear la proteína de unión al antígeno (por ejemplo, anticuerpo monoclonal) en una isoforma de disulfuro particular (por ejemplo, IgG2A o IgG2B). Tales mutaciones se describen en WO 2009/036209 y White et al., Cancer Cell, Vol. 27: 138-148, 2015, e incluir mutaciones C131S, C219S y C220S (según el esquema de numeración de la UE) en la cadena pesada y una mutación C214S (según el esquema de numeración de la UE) en la cadena ligera. En ciertas formas de realización, las proteínas de unión a antígenos agonistas de TREM2 de la invención son anticuerpos humanos IgG2 anti-TREM2 agonista. En algunos de estos casos, los anticuerpos agonistas de TREM2 incluyen una mutación C131S (según el esquema de numeración de la UE) en sus cadenas pesadas. En otras formas de realización, los anticuerpos agonistas de TREM2 incluyen una mutación C214S (según el esquema de numeración de la UE) en sus cadenas ligeras y una mutación C220S (según el esquema de numeración de la UE) en sus cadenas pesadas. En otras formas de realización, los anticuerpos agonistas de TREM2 incluyen una mutación C214S (según el esquema de numeración de la UE) en sus cadenas ligeras y una mutación C219S (según el esquema de numeración de la UE) en sus cadenas pesadas.

[0084]En otras formas de realización, las proteínas de unión a antígenos agonistas de TREM2 de la invención son anticuerpos agonistas anti-TREM2 que comprenden una región CH1 y una región bisagra de un anticuerpo IgG2 humano y una región Fc de un anticuerpo IgG1 humano. La disposición única de los enlaces disulfuro en la región de bisagra de los anticuerpos IgG2 se ha informado que confiere una actividad estimulante mejorada para ciertos anticuerpos anticancerígenos (White et al., Cancer Cell, Vol. 27: 138-148, 2015). Esta actividad mejorada podría transferirse a los anticuerpos de tipo IgG1 mediante el intercambio de las regiones CH1 y bisagra del anticuerpo IgG1 por aquellas presentes en el anticuerpo IgG2 (Whiteet al.,2015). La región bisagra de IgG2 incluye la secuencia de aminoácidos ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO: 206). La secuencia de aminoácidos de las regiones CH1 y bisagra de un anticuerpo IgG2 humano puede comprender la secuencia de aminoácidos de ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCP (SEQ ID NO: 207). Por lo tanto, en algunos ejemplos, los anticuerpos agonistas anti-TREM2 comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 207 en combinación con una región Fc de un anticuerpo humano IgG1. En tales formas de realización, los anticuerpos anti-TREM2 pueden incluir una o más de las mutaciones descritas anteriormente para bloquear los anticuerpos anti-TREM2 en una isoforma de disulfuro particular. Por ejemplo, en una forma de realización, el anticuerpo anti-TREM2 comprende una región CH1 y una región bisagra de un anticuerpo IgG2 humano y una región Fc de un anticuerpo IgG1 humano y comprende una mutación C131S (según el esquema de numeración de la UE) en su cadena pesada. En otro ejemplo, el anticuerpo anti-TREM2 comprende una región CH1 y una región de bisagra de un anticuerpo humano IgG2 y una región Fc de un anticuerpo humano IgG1 y contiene una mutación C214S (según el esquema de numeración de la UE) en su cadena ligera y una mutación C220S (según el esquema de numeración de la UE) en su cadena pesada. En otra forma de realización, el anticuerpo anti-TREM2 comprende una región CH1 y una región de bisagra de un anticuerpo IgG2 humano y una región Fc de un anticuerpo IgG1 humano e incluye una mutación C214S (según el esquema de numeración de la UE) en su cadena ligera y una mutación C219S (según el esquema de numeración de la UE) en su cadena pesada.

[0085]En las formas de realización en las que los anticuerpos anti-TREM2 comprenden una región CH1 y una región bisagra de un anticuerpo IgG2 humano y una región Fc de un anticuerpo IgG1 humano, los anticuerpos anti-TREM2 pueden comprender cualquiera de las mutaciones en la región Fc descritas anteriormente para modular la glicosilación de los anticuerpos. Por ejemplo, la región Fc de IgG1 humana de tales anticuerpos anti-TREM2 puede comprender una mutación en la posición de aminoácido N297 (según el esquema de numeración de la UE) en su cadena pesada. En una forma de realización particular, la mutación N297 es una mutación N297G. En ciertas formas de realización, la región Fc puede además comprender mutaciones R292C y V302C (según el esquema de numeración de la UE) en su cadena pesada.

[0086]En ciertas formas de realización, los anticuerpos anti-TREM2 de la invención comprenden una región CH1 y una región bisagra de un anticuerpo IgG2 humano y una región Fc de un anticuerpo IgG1 humano, en donde la región Fc comprende la secuencia de aminoácidos de:

A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M IS R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y

V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y G S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S

N K A L P A P IE K T IS K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R E E M T K N Q V S L T C L V K G F

Y P S D IA V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q

G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K (S E Q ID N O : 281 ).

[0087]En otras formas de realización de realización, los anticuerpos anti-TREM2 de la invención comprenden una región CH1 y una región bisagra de un anticuerpo IgG2 humano y una región Fc de un anticuerpo IgG1 humano, en donde la región Fc comprende la secuencia de aminoácidos de:

A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M IS R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y

V D G V E V H N A K T K P C E E Q Y G S T Y R C V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S

N K A L P A P IE K T IS K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R E E M T K N Q V S L T C L V K G F

Y P S D IA V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q

G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K (S E Q ID N O : 282 ).

[0088]Las modificaciones de las proteínas de unión a antígenos agonistas de TREM2 de la invención para aumentar la vida media en suero también pueden ser deseables, por ejemplo, mediante la incorporación o adición de un epítopo de unión a receptor de salvamento (por ejemplo, mediante mutación de la región apropiada o incorporando el epítopo en una etiqueta peptídica que luego se fusiona a la proteína de unión a antígeno en uno de los extremos o en el medio, por ejemplo, mediante síntesis de ADN o péptidos; ver, por ejemplo, WO96/32478) o añadiendo moléculas como PEG u otros polímeros solubles en agua, incluidos los polímeros de polisacáridos. El epítopo de unión del receptor de salvamento constituye preferentemente una región en la cual uno o más residuos de aminoácidos de uno o dos bucles de una región Fc se transfieren a una posición análoga en la proteína de unión al antígeno. Aún más preferiblemente, se transfieren tres o más residuos de uno o dos bucles de la región Fc. Aún más preferido, el epítopo se toma del dominio CH2 de la región Fc (por ejemplo, una región Fc de IgG) y se transfiere al dominio CH1, CH3 o VH, o a más de una región así, de la proteína de unión al antígeno. Alternativamente, el epítopo se toma del dominio CH2 de la región Fc y se transfiere a la región CL o VL, o a ambas, de la proteína de unión al antígeno. Consulte las solicitudes internacionales WO 97/34631 y WO 96/32478 para obtener una descripción de las variantes de Fc y su interacción con el receptor de salvamento.

[0089]En algunas formas de realización, las proteínas de unión de antígenos agonistas de TREM2 de la invención comprenden una cadena ligera que contiene la secuencia de SEQ ID NO: 339 y una cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 340.

[0090]En una forma de realización específica, las proteínas de unión a antígenos agonistas de TREM2 de la invención comprenden una cadena ligera y una cadena pesada, en donde la cadena ligera consiste en o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 339 y la cadena pesada consiste o consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 340.

[0091]En algunas formas de realización, las proteínas de unión a antígenos agonistas de TREM2 de la invención son bispecíficas, lo que significa que son capaces de unirse específicamente a dos antígenos diferentes, el TREM2 humano y un segundo antígeno. En ciertas formas de realización, el segundo antígeno es una proteína que facilita el transporte a través de la barrera hematoencefálica, como un receptor que media el transporte a través de la barrera hematoencefálica. Tales receptores incluyen, pero no se limitan a, el receptor de insulina, el receptor de transferrina, el receptor de leptina, el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), receptores de lipoproteínas de baja densidad (por ejemplo, proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad 8 (LRP8), proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad 1 (LRP1), proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad 2 (LRP2)), factor de crecimiento similar a la epidermal de unión a la heparina, cadena pesada de CD98 (CD98hc), basigin, la proteína transmembrana humana 30A (TMEM30A) y Transportador de Glucosa Tipo 1 (Glut1). En una forma de realización, el segundo antígeno es el receptor de insulina humano. En una forma de realización, el segundo antígeno es el receptor humano del factor de crecimiento similar a la insulina. En otra forma de realización, el segundo antígeno es el receptor humano de transferrina. En una forma de realización, el segundo antígeno es TMEM30A. En cualquiera de estos casos, el dominio de unión humano TREM2 podría estar en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal del bispecifico multivalente (IgG-Fab, IgG-scFv), o expresado en los formatos de unión multispecífica descritos en Spiess, C. et al., Molecular Immunology 67, 95-106 (2015) y Brinkman, U. et al., MABS 9(2)182-212 (2017).

[0092]En ciertas formas de realización, las proteínas de unión a antígenos agonistas de TREM2 son multivalentes. La valencia de la proteína de unión denota el número de dominios individuales de unión a antígenos dentro de la proteína de unión. Por ejemplo, los términos monovalente, bivalente y tetravalente con referencia a las proteínas de unión a antígenos de la invención se refieren a proteínas de unión con uno, dos y cuatro dominios de unión a antígenos, respectivamente. Por lo tanto, una proteína de unión a antígeno multivalente comprende dos o más dominios de unión a antígeno. En algunas formas de realización, las proteínas de unión a antígenos bispecíficas de la invención son bivalentes. Por lo tanto, tales proteínas de unión a antígenos bispecíficas y bivalentes contienen dos dominios de unión a antígenos: un dominio de unión a antígenos que se une a TREM2 humano y un dominio de unión a antígenos que se une a un segundo antígeno, como un antígeno que facilita el transporte a través de la barrera hematoencefálica. En otras formas de realización, las proteínas de unión a antígenos bispecíficos son multivalentes. Por ejemplo, en ciertas formas de realización, las proteínas de unión a antígenos bispecíficas son trivalentes o tetravalentes o que comprenden tres o cuatro dominios de unión a antígenos: uno o dos dominios de unión a antígenos que se unen a TREM2 humano y uno o dos dominios de unión a antígenos que se unen a un segundo antígeno, como un antígeno que facilita el transporte a través de la barrera hematoencefálica.

[0093]El término "dominio de unión al antígeno", que se utiliza de manera intercambiable con "dominio de unión", se refiere a la región de la proteína de unión al antígeno que contiene los residuos de aminoácidos que interactúan con el antígeno y le confieren a la proteína de unión al antígeno su especificidad y afinidad por el antígeno. El dominio de unión puede derivarse de un anticuerpo o de un fragmento funcional del mismo que se una específicamente al antígeno. En ciertas formas de realización, las proteínas de unión a antígenos bispecíficas de la invención comprenden un dominio de unión a antígeno que se une a TREM2 humano y un dominio de unión a antígeno que se une al receptor de insulina humano. En otras formas de realización, las proteínas de unión a antígenos bispecíficos de la invención comprenden un dominio de unión a antígeno que se une a TREM2 humano y un dominio de unión a antígeno que se une al receptor de transferrina humano. En algunas formas de realización de realización, las proteínas de unión a antígenos biespecíficas de la invención comprenden dos dominios de unión a antígenos que se unen a TREM2 humano y dos dominios de unión a antígenos que se unen al receptor de insulina humano. En otras formas de realización, las proteínas de unión a antígenos bispecíficas de la invención comprenden dos dominios de unión a antígenos que se unen a TREM2 humano y dos dominios de unión a antígenos que se unen al receptor de transferrina humano. En una forma de realización, las proteínas de unión a antígenos bispecíficos de la invención comprenden uno o dos dominios de unión a antígenos que se unen al TREM2 humano y uno o dos dominios de unión a antígenos que se unen al receptor humano de crecimiento similar a la insulina. En una forma de realización, las proteínas de unión a antígenos bispecificas de la invención comprenden uno o dos dominios de unión a antígenos que se unen a TREM2 humano y uno o dos dominios de unión a antígenos que se unen a TMEM30A. Los dominios de unión a antígenos que se unen a TREM2 humano de las proteínas de unión a antígenos agonistas bispecíficos de TREM2 pueden derivarse de cualquiera de los anticuerpos agonistas anti-TREM2 descritos aquí. Los dominios de unión de antígeno que se unen al receptor de insulina humano, al receptor de crecimiento similar a la insulina humano, TMEM30A, o al receptor de transferrina humano pueden derivarse de anticuerpos monoclonales a estos receptores conocidos en el campo, como los descritos en la Patente de EE. UU. N.° 7,388,079; la Patente de EE. UU. N.° 8,663,598; y la Publicación de Patente de EE. UU. N.° 2015/0110791, Abulrob, A. et al., J. Neurochem. 95, 1201-1214 (2005), y Muruganandam, A. et al., FASEB J. 16, 240242 (2002). En ciertas formas de realización, los dominios de unión al antígeno que se unen al receptor de insulina humano, al receptor de crecimiento similar a la insulina humano, TMEM30A, o al receptor de transferrina humano son anticuerpos de dominio único. En ciertas formas de realización, el dominio de unión a TREM2 humano se encuentra en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal del bispecifico multivalente (IgG-Fab, IgG-scFv), o se expresa en formatos de unión multispecífica conocidos en la técnica, como los descritos en Spiess, C. et al., Molecular Immunology 67, 95-106 (2015) y Brinkman, U. et al., MABS 9(2)182-212 (2017).

[0094]Métodos para la elaboración de anticuerpos biespecíficos son conocidos en el campo. Un método para fabricar una proteína o anticuerpo de unión a antígenos bispecífico implica la fusión de hibridomas o la unión de fragmentos de Fab'. Ver, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny y col., 1992, J. Immunol.

148:1547-1553. Otro método implica ingenierizar la porción Fc de las cadenas pesadas para crear protuberancias y orificios que facilitan la formación de heterodímeros de las cadenas pesadas cuando se expresan conjuntamente en una célula. Ver, por ejemplo, WO 96/027011. Todavía otro método también implica ingeniería de la porción Fc de la cadena pesada, pero utiliza dirección electrostática para fomentar la formación de heterodímeros mientras desalienta la formación de homodímeros de las cadenas pesadas cuando se coexpresan en una célula. Consulte, por ejemplo, W02009089004 y WO2014081955.

[0095]La presente invención incluye uno o más polinucleótidos aislados o ácidos nucleicos aislados que codifican las proteínas de unión a antígenos agonistas de TREM2 de la invención. Además, la presente invención abarca vectores que contienen los ácidos nucleicos, células huésped o líneas celulares que contienen los ácidos nucleicos, y métodos para producir las proteínas de unión a antígenos de la invención. Los ácidos nucleicos comprenden, por ejemplo, polinucleótidos que codifican todo o parte de una proteína de unión a antígeno, por ejemplo, una o ambas cadenas de un anticuerpo de la invención, o un fragmento, derivado, mutante o variante de la misma, polinucleótidos suficientes para ser utilizados como sondas de hibridación, cebadores de PCR o cebadores de secuenciación para identificar, analizar, mutar o amplificar un polinucleótido que codifica un polipéptido, oligonucleótidos anti-sentido para inhibir la expresión de un polinucleótido, y secuencias complementarias de lo anteriormente mencionado. Los ácidos nucleicos pueden tener cualquier longitud según sea apropiado para el uso o función deseada, y pueden incluir una o más secuencias adicionales, por ejemplo, secuencias reguladoras, y/o formar parte de un ácido nucleico más grande, por ejemplo, un vector. Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención incluyen ADN y ARN tanto en forma de hebra simple como doble, así como las secuencias complementarias correspondientes. El ADN incluye, por ejemplo, ADNc, ADN genómico, ADN sintetizado químicamente, ADN amplificado por PCR y combinaciones de estos. Las moléculas de ácido nucleico de la invención incluyen genes de longitud completa o moléculas de cDNA, así como una combinación de fragmentos de los mismos. Los ácidos nucleicos de la invención pueden provenir de fuentes humanas así como de especies no humanas.

[0096]Secuencias de aminoácidos relevantes de una inmunoglobulina o de una región de la misma (por ejemplo, región variable, región Fc, etc.) o de un polipéptido de interés pueden ser determinadas mediante secuenciación directa de proteínas, y las secuencias de nucleótidos codificantes adecuadas pueden ser diseñadas de acuerdo con una tabla de codones universal. Alternativamente, el genoma o ADNc que codifica los anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión de estos de la invención pueden ser aislados y secuenciados a partir de células que producen dichos anticuerpos (por ejemplo, hibridomas) utilizando procedimientos convencionales, como los métodos descritos en el Ejemplo 3.

[0097]Un ácido nucleico aislado, que se utiliza indistintamente aquí con polinucleótido aislado, es un ácido nucleico que ha sido separado de secuencias genéticas adyacentes presentes en el genoma del organismo del cual se aisló el ácido nucleico, en el caso de ácidos nucleicos aislados de fuentes naturales. En el caso de ácidos nucleicos sintetizados enzimáticamente a partir de una plantilla o químicamente, como productos de PCR, moléculas de ADNc u oligonucleótidos, por ejemplo, se entiende que los ácidos nucleicos resultantes de tales procesos son ácidos nucleicos aislados. Una molécula de ácido nucleico aislada se refiere a una molécula de ácido nucleico en forma de un fragmento separado o como un componente de una construcción de ácido nucleico más grande. En una forma de realización preferida, los ácidos nucleicos están sustancialmente libres de material endógeno contaminante. La molécula de ácido nucleico ha sido preferiblemente derivada de ADN o ARN aislado al menos una vez en forma sustancialmente pura y en una cantidad o concentración que permita la identificación, manipulación y recuperación de sus secuencias de nucleótidos componentes mediante métodos bioquímicos estándar (tales como los descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989). Tales secuencias se prefieren proporcionar y/o construir en forma de un marco de lectura abierto sin interrupciones por secuencias internas no traducidas, o intrones, que normalmente están presentes en genes eucariotas. Las secuencias de ADN no traducido pueden estar presentes en el 5' o 3' de un marco de lectura abierto, donde las mismas no interfieren con la manipulación o expresión de la región codificante. A menos que se especifique lo contrario, el extremo izquierdo de cualquier secuencia de polinucleótidos de cadena sencilla discutida aquí es el extremo 5'; la dirección izquierda de las secuencias de polinucleótidos de doble cadena se denomina dirección 5'. La dirección de producción de transcritos de ARN nascente de 5' a 3' se conoce como la dirección de transcripción; las regiones de secuencia en la hebra de ADN que tienen la misma secuencia que el transcripción de ARN, que se encuentran de 5' a 5' del extremo del transcripción de ARN, se conocen como secuencias corriente arriba; las regiones de secuencia en la hebra de ADN que tienen la misma secuencia que el transcripción de ARN, que se encuentran de 3' a 3' del extremo del transcripción de ARN, se conocen como secuencias corriente abajo.

[0098]También se divulgan aquí ácidos nucleicos que hibridan bajo condiciones moderadamente estrictas, y más preferiblemente condiciones altamente estrictas, con ácidos nucleicos que codifican polipéptidos según se describen aquí. Los parámetros básicos que afectan la elección de las condiciones de hibridación y las instrucciones para idear condiciones adecuadas son establecidos por Sambrook,, Fritsch y Maniatis (1989, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., capítulos 9 y 11; y Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3-6.4), y puede ser fácilmente determinado por aquellas personas con habilidades ordinarias en el campo, basándose, por ejemplo, en la longitud y/o composición de bases del ADN. Una manera de lograr condiciones moderadamente estrictas implica el uso de una solución de prelavado que contiene 5 x SSC, 0.5 % SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0), un tampón de hibridación de aproximadamente 50 % de formamida, 6 x SSC, y una temperatura de hibridación de alrededor de 55 °C (u otras soluciones de hibridación similares, como una que contiene aproximadamente 50 % de formamida, con una temperatura de hibridación de alrededor de 42 °C), y condiciones de lavado de alrededor de 60 °C, en 0,5 x SSC, 0,1 % SDS. Generalmente, las condiciones altamente estrictas se definen como las condiciones de hibridación mencionadas anteriormente, pero con un lavado a aproximadamente 68 °C, 0,2 x SSC, 0,1 % SDS. El tampón SSPE (1 x SSPE es 0,15M NaCl, 10 mM NaH2PO4 y 1,25 mM EDTA, pH 7,4) se puede sustituir por SSC (1 x SSC es 0,15M NaCl y 15 mM citrato de sodio) en los tampónes de hibridación y lavado; los lavados se realizan durante 15 minutos después de que la hibridación esté completa. Debe entenderse que la temperatura de lavado y la concentración de sal de lavado pueden ajustarse según sea necesario para lograr un grado deseado de rigurosidad aplicando los principios básicos que rigen las reacciones de hibridación y la estabilidad de los dúplex, como es conocido por los expertos en la materia y se describe más detalladamente a continuación (ver, por ejemplo, Sambrook et al., 1989).

[0099]Al hibridar un ácido nucleico con un ácido nucleico objetivo de secuencia desconocida, se asume que la longitud del híbrido es la del ácido nucleico hibridante. Cuando se hibridan ácidos nucleicos de secuencia conocida, la longitud del híbrido se puede determinar al alinear las secuencias de los ácidos nucleicos e identificar la región o regiones de complementariedad óptima de secuencia. La temperatura de hibridación para híbridos que se espera que tengan menos de 50 pares de bases de longitud debe ser de 5 a 10 °C menos que la temperatura de fusión (Tm) del híbrido, donde Tm se determina de acuerdo con las siguientes ecuaciones. Para híbridos con menos de 18 pares de bases de longitud, Tm ( °C) = 2(Número de bases A T) 4(Número de bases G C). Para los híbridos con más de 18 pares de bases de longitud, Tm ( °C) = 81,5 16,6(log10 [Na+]) 0,41( % G C) - (600/N), donde N es el número de bases en el híbrido, y [Na+] es la concentración de iones de sodio en el buffer de hibridación ([Na+] para 1 x SSC = 0,165M). Preferiblemente, cada ácido nucleico híbrido tiene una longitud de al menos 15 nucleótidos (o más preferiblemente al menos 18 nucleótidos, o al menos 20 nucleótidos, o al menos 25 nucleótidos, o al menos 30 nucleótidos, o al menos 40 nucleótidos, o más preferiblemente al menos 50 nucleótidos), o al menos el 25 % (más preferiblemente al menos el 50 %, o al menos el 60 %, o al menos el 70 %, y más preferiblemente al menos el 80 %) de la longitud del ácido nucleico de la presente invención al que se hibrida, y tiene al menos el 60 % de identidad de secuencia (más preferiblemente al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 81 %, al menos el 82 %, al menos el 83 %, al menos el 84 %, al menos el 85 %, al menos el 86 %, al menos el 87 %, al menos el 88 %, al menos el 89 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, y más preferiblemente al menos el 99,5 %) con el ácido nucleico de la presente invención al que se hibrida, donde la identidad de secuencia se determina al comparar las secuencias de los ácidos nucleicos híbridos alineados de manera que se maximice la superposición y la identidad minimizando al mismo tiempo las brechas de secuencia, tal como se describe con más detalle anteriormente.

[0100]Variantes de las proteínas de unión a antígenos, incluidas las variantes descritas aquí, pueden ser preparadas mediante mutagénesis sitio-específica de nucleótidos en el ADN que codifica el polipéptido, utilizando mutagénesis de cassetes o PCR u otras técnicas bien conocidas en el campo, para producir ADN que codifique la variante, y posteriormente expresar el ADN recombinante en cultivos celulares como se detalla aquí. Sin embargo, las proteínas de unión a antígenos que comprenden CDRs variantes con hasta aproximadamente 100-150 residuos pueden ser preparadas mediante la síntesisin vitroutilizando técnicas establecidas. Las variantes típicamente exhiben la misma actividad biológica cualitativa que el análogo natural, por ejemplo, la unión al antígeno. Tales variantes incluyen, por ejemplo, deleciones y/o inserciones y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos de las proteínas de unión a antígenos. Cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución se realiza para llegar a la construcción final, siempre y cuando la construcción final posea las características deseadas. Los cambios en los aminoácidos también pueden alterar los procesos post-traduccionales de la proteína de unión al antígeno, como cambiar el número o la posición de los sitios de glicosilación. En ciertas variantes de proteínas de unión a antígenos, se preparan con la intención de modificar aquellos residuos de aminoácidos que están directamente involucrados en la unión al epítopo. En otras formas de realización, la modificación de residuos que no están directamente implicados en la unión al epítopo, o de residuos que de ninguna manera están implicados en la unión al epítopo, es deseable, con los propósitos discutidos aquí. Mutagénesis dentro de cualquiera de las regiones CDR, regiones de armazón y/o regiones constantes se contempla, de acuerdo con las reivindicaciones. Las técnicas de análisis de covarianza pueden ser utilizadas por el artesano experto para diseñar modificaciones útiles en la secuencia de aminoácidos de la proteína de unión al antígeno. Ver, por ejemplo, Choulier, et al., Proteins 41:475-484, 2000; Demarest et al., J. Mol. 335:4148, 2004; Hugo et al., Protein Engineering 16(5):38186, 2003; Aurora et al., Publicación de Patente de EE. UU. N.° 2008/0318207 A1; Glaser et al., Publicación de Patente de EE. UU. N.° 2009/0048122 A1; Urech et al., WO 2008/110348 A1; Borras et al., WO 2009/000099 A2. Tales modificaciones determinadas por análisis de covarianza pueden mejorar las características de potencia, farmacocinética, farmacodinamia y/o fabricabilidad de una proteína de unión a antígenos.

[0101]La Tabla 6 muestra secuencias de ácidos nucleicos ejemplares que codifican las regiones variables de la cadena ligera y pesada de los anticuerpos anti-TREM2 descritos aquí. Polinucleótidos que codifican las regiones variables del anticuerpo anti-TREM2 pueden ser utilizados para construir las proteínas de unión al antígeno descritas aquí.

<o>03

o

-o

<o>ro

o

[0102]Los ácidos nucleicos aislados que codifican el dominio de unión anti-TREM2 de las proteínas de unión a antígenos divulgadas aquí pueden comprender una secuencia de nucleótidos que sea al menos 80 % idéntica, al menos 90 % idéntica, al menos 95 % idéntica o al menos 98 % idéntica a cualquiera de las secuencias de nucleótidos enumeradas en la Tabla 6. Un ácido nucleico aislado que codifica una región variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TREM2, según se revela en el presente documento, puede comprender una secuencia que sea al menos 80 % idéntica, al menos 90 % idéntica, al menos 95 % idéntica o al menos 98 % idéntica a una secuencia seleccionada de los números de identificación de secuencia SEQ ID NO: 208-236 y 313-318. Un ácido nucleico aislado que codifica una región variable de la cadena ligera de un anticuerpo anti-TREM2 revelado aquí puede comprender una secuencia seleccionada de los números de identificación de secuencia: 208-236 y 313-318. Un ácido nucleico aislado que codifica una región variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TREM2 revelado aquí puede contener una secuencia que sea al menos 80 % idéntica, al menos 90 % idéntica, al menos 95 % idéntica o al menos 98 % idéntica a una secuencia seleccionada de los números de identificación de secuencia SEQ ID NOs: 237-264 y 319-325. Un ácido nucleico aislado que codifica una región variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TREM2 revelado en el presente documento puede comprender una secuencia seleccionada de los números de identificación de secuencia SEQ: 237-264 y 319-325.

[0103]Las secuencias de ácidos nucleicos proporcionadas en la Tabla 6 son únicamente ejemplares. Como apreciarán quienes estén en el campo, debido a la degeneración del código genético, se puede generar un número extremadamente grande de ácidos nucleicos, todos los cuales codifican los CDR, regiones variables y cadenas pesadas y ligeras u otros componentes de las proteínas de unión a antígenos descritas en este documento. Por lo tanto, una vez identificada una secuencia de aminoácidos específica, los expertos en la materia podrían crear cualquier cantidad de ácidos nucleicos diferentes, simplemente modificando la secuencia de uno o más codones de una manera que no altere la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada.

[0104]La presente invención también incluye vectores que contienen uno o más ácidos nucleicos que codifican uno o más componentes de las proteínas de unión a antígenos de la invención (por ejemplo, regiones variables, cadenas ligeras y cadenas pesadas). El término vector se refiere a cualquier molécula o entidad (por ejemplo, ácido nucleico, plásmido, bacteriófago o virus) utilizada para transferir información de codificación de proteínas a una célula huésped. Ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, vectores virales, vectores mamíferos no episomales y vectores de expresión, por ejemplo, vectores de expresión recombinantes. El término "vector de expresión" o "constructo de expresión" como se usa en este documento se refiere a una molécula de ADN recombinante que contiene una secuencia de codificación deseada y las secuencias de control de ácido nucleico apropiadas necesarias para la expresión de la secuencia de codificación enlazada de forma operable en una célula huesped particular. Un vector de expresión puede incluir, pero no se limita a, secuencias que afectan o controlan la transcripción, traducción, y, si hay intrones presentes, afectan el empalme del ARN de una región codificante enlazada operativamente a éste. Secuencias de ácidos nucleicos necesarias para la expresión en procariotas incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, un sitio de unión a ribosomas y posiblemente otras secuencias. Las células eucariotas son conocidas por utilizar promotores, potenciadores, y señales de terminación y poliadenilación. Una secuencia de péptido señal secretor también puede, opcionalmente, ser codificada por el vector de expresión, enlazada operativamente a la secuencia de codificación de interés, de modo que el polipéptido expresado pueda ser secretado por la célula huésped recombinante, para facilitar más la aislación del polipéptido de interés de la célula, si así se desea. Por ejemplo, en algunas formas de realización, las secuencias de péptido señal pueden ser añadidas/fusionadas al extremo amino de cualquiera de las secuencias de polipéptidos de región variable enumeradas en las Tablas 1A, 1B, 2A, 2B, 3A y 3B. En ciertas formas de realización, un péptido señal con la secuencia de aminoácidos MDMRVPAQLLGLLLLWLRg A r C (ID SEQ NO: 265) está fusionado al extremo amino de cualquiera de las secuencias polipeptídicas de la región variable en las Tablas 1A, 1B, 2A, 2B, 3A y 3B. En otras formas de realización, un péptido señal con la secuencia de aminoácidos MAWALLLLTLLTQGTGSWA (SEQ ID NO: 266) se fusiona al extremo amino de cualquiera de las secuencias de polipéptidos de la región variable en las Tablas 1A, 1B, 2A, 2B, 3A y 3B. En otras formas de realización, un péptido señal con la secuencia de aminoácidos MTCSPLLLTLLIHCTGSWA (SEQ ID NO: 267) se fusiona al extremo amino de cualquiera de las secuencias de polipéptidos de la región variable en las Tablas 1A, 1B, 2A, 2B, 3A y 3B. Otras secuencias de péptido señal adecuadas que pueden fusionarse al extremo amino de las secuencias de polipéptido de la región variable descritas aquí incluyen: MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG (SEQ ID NO: 268), MEWTWRVLFLVAAATGAHS (SEQ ID NO: 269), METPAQLLFLLLLWLPDTTG (SEQ ID NO: 270), MKHLWFFLLLVAAPRWVLS (SEQ ID NO: 272), MEWSWVFLFFLSVTTGVHS (SEQ ID NO: 273), MDIRAPTQLLGLLLLWLPGAKC (SEQ ID NO: 274), MDIRAPTQLLGLLLLWLPGARC (SEQ ID NO: 275), MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATF (SEQ ID NO: 276), MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARC (SEQ ID NO: 277), METGLRWLLLVAVLKGVQC (SEQ ID NO: 278), METGLRWLLLVAVLKGVQCQE (SEQ ID NO: 279) y MDMRAPTQLLGLLLLWLPGARC (SEQ ID NO: 280). Otras señales o péptidos secretorios son conocidos por aquellos con habilidades en la técnica y pueden ser fusionados a cualquiera de las cadenas polipeptídicas de región variable listadas en las Tablas 1A, 1B, 2A, 2B, 3A y 3B, por ejemplo, para facilitar u optimizar la expresión en células huesped particulares.

[0105]Por lo general, los vectores de expresión utilizados en las células huésped para producir las proteínas de unión al antígeno agonista TREM2 de la invención contendrán secuencias para el mantenimiento del plásmido y para la clonación y expresión de secuencias de nucleótidos exógenos que codifican los componentes de las proteínas de unión al antígeno. Tales secuencias, conocidas colectivamente como secuencias flanqueantes, en ciertas formas de realización típicamente incluirán una o más de las siguientes secuencias de nucleótidos: un promotor, una o más secuencias potenciadoras, un origen de replicación, una secuencia de terminación transcripcional, una secuencia completa de intrón que contiene un sitio de empalme donante y aceptor, una secuencia que codifica una secuencia líder para la secreción de polipéptidos, un sitio de unión de ribosomas, una secuencia de poliadenilación, una región de polienlace para insertar el ácido nucleico que codifica el polipéptido a ser expresado, y un elemento marcador seleccionable. Cada una de estas secuencias se discute a continuación.

[0106]Opcionalmente, el vector puede contener una secuencia de codificación de etiqueta, es decir, una molécula de oligonucleótido ubicada en el extremo 5' o 3' de la secuencia de codificación del polipéptido; la secuencia de etiqueta de oligonucleótido codifica poliHis (como hexaHis), FLAG, HA (hemaglutinina del virus de la gripe), myc, u otra molécula de “etiqueta” para la cual existen anticuerpos comercialmente disponibles. Esta etiqueta se fusiona típicamente al polipéptido tras la expresión del mismo, y puede servir como un medio para la purificación por afinidad o detección del polipéptido en la célula huésped. La purificación por afinidad puede lograrse, por ejemplo, mediante cromatografía de columna utilizando anticuerpos contra la etiqueta como matriz de afinidad. Opcionalmente, la etiqueta puede ser posteriormente eliminada del polipéptido purificado mediante varios medios, como el uso de ciertas peptidasas para la escisión.

[0107]Secuencias flanqueantes pueden ser homólogas (es decir, de la misma especie y/o cepa que la célula huésped), heterólogas (es decir, de una especie distinta a la especie o cepa de la célula huésped), híbridas (es decir, una combinación de secuencias flanqueantes de más de una fuente), sintéticas o nativas. Por lo tanto, la fuente de una secuencia flanqueante puede ser cualquier organismo procariota o eucariota, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, siempre que la secuencia flanqueante sea funcional en, y pueda ser activada por, la maquinaria celular del huésped.

[0108]Secuencias flanqueantes útiles en los vectores de esta invención pueden ser obtenidas por cualquiera de varios métodos bien conocidos en la técnica. Típicamente, las secuencias flanqueantes útiles en este caso habrán sido previamente identificadas mediante mapeo y/o mediante la digestión con enzimas de restricción, y por lo tanto pueden ser aisladas de la fuente de tejido adecuada utilizando las enzimas de restricción correspondientes. En algunas formas de realización, se puede conocer la secuencia completa de nucleótidos de una secuencia adyacente. Aquí, la secuencia flanqueante puede ser sintetizada usando métodos rutinarios para la síntesis de ácidos nucleicos o clonación.

[0109]Ya sea que se conozca toda la secuencia flanqueante o solo una parte de ella, se puede obtener utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y/o mediante el cribado de una biblioteca genómica con una sonda adecuada, como un oligonucleótido y/o un fragmento de secuencia flanqueante de la misma especie u otra. Donde la secuencia de flanqueo no se conoce, un fragmento de ADN que contenga una secuencia de flanqueo puede ser aislado de una pieza más grande de ADN que puede contener, por ejemplo, una secuencia codificante o incluso otro gen o genes. El aislamiento puede lograrse mediante la digestión con enzimas de restricción para producir el fragmento de ADN adecuado, seguido por el aislamiento mediante purificación con gel de agarosa, cromatografía en columna de Qiagen® (Chatsworth, CA), u otros métodos conocidos por el artesano experto. La selección de enzimas adecuadas para lograr este propósito será fácilmente evidente para una persona de habilidad ordinaria en la técnica.

[0110]Un origen de replicación es típicamente una parte de esos vectores de expresión procarióticos adquiridos comercialmente, y el origen ayuda en la amplificación del vector en una célula huesped. Si el vector de elección no contiene un sitio de replicación de origen, se puede sintetizar químicamente basándose en una secuencia conocida, y ligarlo al vector. Por ejemplo, el origen de replicación del plásmido pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) es adecuado para la mayoría de las bacterias gramnegativas, y varios orígenes virales (por ejemplo, SV40, poliomavirus, adenovirus, virus de la estomatitis vesicular (VSV), o virus papilomavirus como HPV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamíferos. Generalmente, el componente de origen de replicación no es necesario para los vectores de expresión en mamíferos (por ejemplo, el origen SV40 se utiliza a menudo solo porque también contiene el promotor temprano del virus).

[0111]Una secuencia de terminación de transcripción típicamente se encuentra en el extremo 3' de una región de codificación de polipéptidos y sirve para terminar la transcripción. Por lo general, en las células procariotas, una secuencia de terminación de transcripción es un fragmento rico en G-C seguido de una secuencia de poli-T. Mientras que la secuencia se puede clonar fácilmente de una biblioteca o incluso comprarse comercialmente como parte de un vector, también se puede sintetizar fácilmente utilizando métodos conocidos para la síntesis de ácidos nucleicos.

[0112]Un gen marcador seleccionable codifica una proteína necesaria para la supervivencia y el crecimiento de una célula huésped cultivada en un medio de cultivo selectivo. Genes típicos de marcadores de selección codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, tetraciclina o kanamicina para células huésped procariotas; (b) complementan deficiencias auxotróficas de la célula; o (c) suministran nutrientes críticos que no están disponibles en medios complejos o definidos. Los marcadores selectivos específicos son el gen de resistencia a kanamicina, el gen de resistencia a ampicilina y el gen de resistencia a tetraciclina. Ventajosamente, un gen de resistencia a la neomicina también puede ser utilizado para selección en células huesped tanto procariotas como eucariotas.

[0113]Otros genes seleccionables pueden ser usados para amplificar el gen que será expresado. La amplificación es el proceso en el cual los genes que son necesarios para la producción de una proteína crítica para el crecimiento o la supervivencia celular se repiten en tándem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes. Ejemplos de marcadores seleccionables adecuados para células de mamíferos incluyen la dihidrofolato reductasa (DHFR) y los genes de la timidina quinasa sin promotor. Los transformantes de células mamíferas se colocan bajo presión de selección, donde solo los transformantes están adaptados de manera única para sobrevivir gracias al gen seleccionable presente en el vector. La presión de selección se impone cultivando las células transformadas en condiciones en las que la concentración del agente de selección en el medio se incrementa sucesivamente, lo que conduce a la amplificación tanto del gen seleccionable como del ADN que codifica otro gen, como uno o más componentes de las proteínas de unión al antígeno descritas aquí. Como resultado, se sintetizan cantidades aumentadas de un polipéptido a partir del ADN amplificado.

[0114]Un sitio de unión al ribosoma es generalmente necesario para la iniciación de la traducción del ARNm y se caracteriza por una secuencia Shine-Dalgarno (procariotas) o una secuencia Kozak (eucariotas). El elemento se encuentra típicamente a 3' del promotor y a 5' de la secuencia codificante del polipéptido a ser expresado. En ciertas formas de realización, una o más regiones de codificación pueden estar vinculadas de manera operativa a un sitio de unión de ribosomas internos (IRES), permitiendo la traducción de dos marcos de lectura abiertos a partir de un solo transcrito de ARN.

[0115]En algunas formas de realización, como cuando se desea la glicosilación en un sistema de expresión de células huesped eucariotas, se puede manipular las diversas pre- o prosecuencias para mejorar la glicosilación o el rendimiento. Por ejemplo, uno puede alterar el sitio de clivaje de la peptidasa de un péptido señal particular, o agregar prosecuencias, lo cual también puede afectar la glicosilación. El producto final de proteína puede tener, en la posición -1 (en relación con el primer aminoácido de la proteína madura), uno o más aminoácidos adicionales incidentes a la expresión, los cuales pueden no haber sido completamente eliminados. Por ejemplo, el producto final de proteína puede tener uno o dos residuos de aminoácidos encontrados en el sitio de escisión de peptidasa, unidos al amino-termino. Alternativamente, el uso de algunos sitios de escisión enzimática puede resultar en una forma ligeramente truncada del polipéptido deseado, si la enzima corta en esa área dentro del polipéptido maduro.

[0116]La expresión y los vectores de clonación de la invención típicamente contendrán un promotor que sea reconocido por el organismo huésped y esté enlazado de manera operativa a la molécula que codifica el polipéptido. El término "operablemente vinculado", tal como se utiliza aquí, se refiere a la unión de dos o más secuencias de ácido nucleico de tal manera que se produce una molécula de ácido nucleico capaz de dirigir la transcripción de un gen dado y/o la síntesis de una molécula de proteína deseada. Por ejemplo, una secuencia de control en un vector que está enlazada operativamente a una secuencia de codificación de proteínas se liga a esta última para que la expresión de la secuencia de codificación de proteínas se logre bajo condiciones compatibles con la actividad de transcripción de las secuencias de control. Más específicamente, una secuencia promotora y/o potenciadora, que incluye cualquier combinación de elementos de control transcripcional cis-actuantes, está enlazada operativamente a una secuencia codificante si estimula o modula la transcripción de la secuencia codificante en una célula huésped apropiada u otro sistema de expresión.

[0117]Los promotores son secuencias no transcritas ubicadas corriente arriba (es decir, en el 5') del codón de inicio de un gen estructural (generalmente dentro de aproximadamente 100 a 1000 pares de bases) que controlan la transcripción del gen estructural. Los promotores se agrupan convencionalmente en una de dos clases: promotores inducibles y promotores constitutivos. Los promotores inducibles inician niveles aumentados de transcripción del ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, como la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. Los promotores constitutivos, por otro lado, transcriben uniformemente un gen al que están enlazados de manera operable, es decir, con poco o ningún control sobre la expresión génica. Un gran número de promotores, reconocidos por una variedad de células hospedadoras potenciales, son bien conocidos. Un promotor adecuado está ligado operativamente al ADN que codifica, por ejemplo, la cadena pesada, la cadena ligera u otro componente de las proteínas de unión a antígenos de la invención, mediante la eliminación del promotor del ADN fuente mediante la digestión con enzimas de restricción e insertando la secuencia del promotor deseado en el vector.

[0118]Promotores adecuados para usar con cepas de levadura también son bien conocidos en el campo. Los potenciadores de levadura se utilizan ventajosamente con los promotores de levadura. Promotores adecuados para usar con células huésped de mamíferos son bien conocidos e incluyen, pero no se limitan a, aquellos obtenidos de los genomas de virus como el virus poliomavirus, virus de la viruela aviar, adenovirus (como los serotipos 2, 8 o 9 del adenovirus), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, retrovirus, virus de la hepatitis B y Virus 40 del simio (SV40). Otros promotores mamíferos adecuados incluyen promotores mamíferos heterólogos, por ejemplo, promotores de choque térmico y el promotor de actina.

[0119]Los promotores adicionales que pueden ser de interés incluyen, pero no se limitan a: promotor temprano de SV40 (Benoist y Chambon, 1981, Nature 290:304-310); promotor de CMV (Thornsen et al., 1984, Proc. Natl. Acad. USA 81:659-663); el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797); promotor de la timidina quinasa del herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78.

1444-1445); secuencias promotoras y reguladoras del gen metalotionina Prinster et al., 1982, Nature 296:39-42); y promotores procarióticos como el promotor de la beta-lactamasa (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-3731); o el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80:21-25). También resultan de interés las siguientes regiones de control transcripcional animal, que presentan especificidad de tejido y han sido utilizadas en animales transgénicos: la región de control del gen elastasa I que está activa en las células acinares pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp.). Quant Biol. 50:399409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425515); la región de control del gen de la insulina que está activa en las células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315: 115-122); la región de control del gen de la inmunoglobulina que está activa en células linfoides (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436-1444); la región de control del virus del tumor mamario de ratón que está activa en células testiculares, mamarias, linfoides y mastocitos (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495); la región de control del gen de la albúmina que está activa en el hígado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276); la región de control del gen alfa-feto-proteína que está activa en el hígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 253:5358); la región de control del gen alfa 1 -antitripsina que está activa en el hígado (Kelsey et al., 1987, Genes y Devel. 161-171); la región de control del gen de la beta-globina que es activa en las células mieloides (Mogram et al, 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al, 1986, Cell 46:89-94); la región de control del gen de la proteína básica de la mielina que es activa en las células oligodendrocíticas en el cerebro (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); la región de control del gen de la cadena ligera de miosina-2 que es activa en el músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283-286); y la región de control del gen de la hormona liberadora de gonadotropinas que es activa en el hipotálamo (Mason et al., 1986, Science 234: 1372-1378).

[0120]Se puede insertar una secuencia potenciadora en el vector para aumentar la transcripción del ADN que codifica un componente de las proteínas de unión a antígenos (por ejemplo, la cadena ligera, cadena pesada o regiones variables) por eucariotas superiores. Los potenciadores son elementos cis-activos del ADN, usualmente de aproximadamente 10 a 300 pares de bases de longitud, que actúan sobre el promotor para aumentar la transcripción. Los potenciadores son relativamente independientes de la orientación y la posición, ya que se han encontrado en posiciones tanto 5' como 3' con respecto a la unidad de transcripción. Varias secuencias potenciadoras disponibles de genes de mamíferos son conocidas (por ejemplo, globina, elastasa, albúmina, alfa-fetoproteína e insulina). Por lo general, sin embargo, se utiliza un potenciador de un virus. El potenciador SV40, el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador del poliomavirus y los potenciadores del adenovirus conocidos en la técnica son ejemplos de elementos potenciadores 73 para la activación de promotores eucarióticos. Mientras un potenciador puede estar posicionado en el vector ya sea 5' o 3' a una secuencia codificante, típicamente se encuentra en un sitio 5' desde el promotor. Una secuencia que codifique una secuencia de señal nativa o heteróloga apropiada (secuencia líder o péptido señal) puede ser incorporada en un vector de expresión para promover la secreción extracelular de la proteína de unión al antígeno. La elección de péptido señal o líder depende del tipo de células huesped en las que se va a producir la proteína de unión al antígeno, y una secuencia de señal heteróloga puede reemplazar a la secuencia de señal nativa. Se describen arriba ejemplos de péptidos señal. Otras secuencias de señal que son funcionales en células huesped mamíferas incluyen la secuencia de señal para la interleucina-7 (IL-7) descrita en la Patente de EE. UU. N.° 4,965,195; la secuencia de señal para el receptor de interleucina-2 descrita en Cosman et al., 1984, Nature 312:768; la secuencia de señal del receptor de interleucina-4 descrita en la Patente EP N.° 0367566; la secuencia de señal del receptor de interleucina-1 de tipo I descrita en la Patente de EE. UU. N.° 4,968,607; la secuencia de señal del receptor de interleucina-1 de tipo II descrita en la Patente EP N.° 0 460846.

[0121]Los vectores de expresión pueden ser construidos a partir de un vector inicial, como un vector disponible comercialmente. Tales vectores pueden o no contener todas las secuencias flanqueantes deseadas. Donde una o más de las secuencias flanqueantes descritas aquí no estén ya presentes en el vector, pueden obtenerse individualmente y ligarse al vector. Los métodos utilizados para obtener cada una de las secuencias flanqueantes son bien conocidos por alguien experto en el campo. Los vectores de expresión pueden ser introducidos en células huesped para así producir proteínas, incluyendo proteínas de fusión, codificadas por ácidos nucleicos como se describe aquí.

[0122]En ciertas formas de realización, los ácidos nucleicos que codifican los diferentes componentes de las proteínas de unión a antígenos agonistas de TREM2 de la invención pueden ser insertados en el mismo vector de expresión. Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica una cadena ligera o región variable de un anticuerpo anti-TREM2 puede ser clonado en el mismo vector que el ácido nucleico que codifica una cadena pesada o región variable de un anticuerpo anti-TREM2. En tales formas de realización, los dos ácidos nucleicos pueden estar separados por un sitio de entrada de ribosomas interno (IRES) y bajo el control de un solo promotor, de modo que la cadena ligera y la cadena pesada se expresan a partir del mismo transcrito de ARNm. Alternativamente, los dos ácidos nucleicos pueden estar bajo el control de dos promotores separados de manera que la cadena ligera y la cadena pesada se expresen a partir de dos transcritos de ARNm separados. En algunas formas de realización, el ácido nucleico que codifica la cadena ligera o región variable del anticuerpo anti-TREM2 se clona en un vector de expresión y el ácido nucleico que codifica la cadena pesada o región variable del anticuerpo anti-TREM2 se clona en un segundo vector de expresión. En tales formas de realización, una célula huésped puede ser co-transfectada con ambos vectores de expresión para producir proteínas de unión a antígenos completas de la invención.

[0123]Después de que se haya construido el vector y se haya insertado uno o más moléculas de ácido nucleico que codifican los componentes de las proteínas de unión a antígenos descritas aquí en el sitio o sitios adecuados del vector o vectores, el (los) vector(es) completado(s) puede(n) ser insertado(s) en una célula huésped adecuada para amplificación y/o expresión de polipéptidos. Por lo tanto, la presente invención abarca una célula huésped aislada o línea celular que comprende uno o más vectores de expresión que codifican los componentes de las proteínas de unión a antígenos agonistas de TREM2 como se definen en las reivindicaciones. El término "célula huésped", tal como se utiliza aquí, se refiere a una célula que ha sido transformada, o es capaz de ser transformada, con un ácido nucleico y por lo tanto expresa un gen de interés. El término incluye la progenie de la célula madre, ya sea que la progenie sea idéntica en morfología o en composición genética a la célula madre original, siempre y cuando el gen de interés esté presente. Una célula huesped que comprende un ácido nucleico aislado de la invención, preferiblemente vinculado operativamente a al menos una secuencia de control de expresión (por ejemplo, promotor o potenciador), es una célula huesped recombinante.

[0124]La transformación de un vector de expresión para una proteína de unión a antígeno en una célula huésped seleccionada puede lograrse mediante métodos bien conocidos, incluyendo transfección, infección, co-precipitación de fosfato de calcio, electroporación, microinyección, lipofección, transfección mediada por DEAE-dextrán u otras técnicas conocidas. El método seleccionado será en parte una función del tipo de célula huésped que se utilizará. Estos métodos y otros métodos apropiados son bien conocidos por el artesano experto, y se detallan, por ejemplo, en Sambrook y otros, 2001.

[0125]Una célula huésped, cuando se cultiva en condiciones apropiadas, sintetiza una proteína de unión a antígenos que posteriormente puede ser recolectada del medio de cultivo (si la célula huésped la secreta en el medio) o directamente de la célula huésped que la produce (si no es secretada). La selección de una célula huesped apropiada dependerá de varios factores, como los niveles de expresión deseados, las modificaciones de polipéptidos que son deseables o necesarias para la actividad (como la glicosilación o la fosforilación) y la facilidad de plegamiento en una molécula biológicamente activa.

[0126]Células huésped ejemplares incluyen células procariotas, de levadura o de eucariotas superiores. Las células huésped procariotas incluyen eubacterias, como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo,EnterobacteríaceaecomoEscherichia,por ejemplo,E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella,por ejemplo,Salmonella typhimurium, Serratia,por ejemplo,Serratia marcescans,yShigella,así comoBacillus,comoB. subtilisyB. licheniformis, Pseudomonas,yStreptomyces.Microorganismos eucariotas como hongos filamentosos o levaduras son hospedadores adecuados para la clonación o expresión de polipéptidos recombinantes. La levadura Saccharomyces cerevisiae, o levadura de panadero común, es la más comúnmente utilizada entre los microorganismos hospederos eucariotas inferiores. Sin embargo, existe una serie de otros géneros, especies y cepas comúnmente disponibles y útiles aquí, como Pichia, por ejemplo, P. pastoris, Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces, Yarrowia; Candida; Trichoderma reesia; Neurospora crassa; Schwanniomyces, como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos, como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y Aspergillus, hospedando a A. nidulans y A. niger.

[0127]Células huésped para la expresión de proteínas de unión antigénica glicosiladas pueden ser derivadas de organismos multicelulares. Ejemplos de células invertebradas incluyen células de plantas e insectos. Numerosas cepas y variantes de baculovirus y células huésped de insectos permisivas correspondientes de huéspedes comoSpodoptera frugiperda(oruga),Aedes aegypti(mosquito),Aedes albopictus(mosquito),Drosophila melanogaster(mosca de la fruta) yBombyx morihan sido identificadas. Una variedad de cepas virales para la transfección de dichas células está disponible públicamente, por ejemplo, la variante L-1 delAutographa californicaNPV y la cepa Bm-5 delBombyx moriNPV.

[0128]Las células huesped de vertebrados también son hospederos adecuados, y la producción recombinante de proteínas de unión a antígenos a partir de tales células se ha convertido en un procedimiento de rutina. Las líneas celulares de mamíferos disponibles como huéspedes para la expresión son bien conocidas en el campo e incluyen, pero no se limitan a, líneas celulares inmortalizadas disponibles en la Colección de Cultivos Tipo Americano (ATCC), incluyendo pero no limitado a células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHOK1 (ATCC CCL61), Dx B-11, DG-44, y células de ovario de hámster chino / -DHFR (C<h>O, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216, 1980); línea de riñón de mono CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (293 o células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, (Graham et al., J. Gen Virol. 36:59, 1977); células renales de hámster recién nacido (BHK, ATCC CCL 10); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251, 1980); células renales de mono (CV1 ATCC CCL 70); células renales de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células renales de perro (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATc C CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células de hepatoma humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATc C CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.YAcad. Sci. 383: 44-68, 1982); células MRC 5 o células FS4; células de mieloma mamíferas y varios otros tipos de células. En ciertas formas de realización, las líneas celulares pueden ser seleccionadas mediante la determinación de qué líneas celulares tienen niveles de expresión altos y producen de manera constitutiva proteínas de unión a antígenos con propiedades de unión a TREM2 humano. En otra forma de realización, se puede seleccionar una línea celular de la línea B que no produce su propio anticuerpo pero tiene la capacidad de producir y secretar un anticuerpo heterólogo. Las células CHO son las células huésped preferidas en algunos casos para expresar las proteínas de unión al antígeno agonista TREM2 de la invención.

[0129]Células huesped son transformadas o transfectadas con los ácidos nucleicos o vectores descritos anteriormente para la producción de proteínas de unión a antígenos agonistas de TREM2 y se cultivan en medios de nutrientes convencionales modificados según corresponda para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Además, los vectores novedosos y las líneas celulares transfected con múltiples copias de unidades de transcripción separadas por un marcador selectivo son particularmente útiles para la expresión de proteínas de unión a antígenos. Por lo tanto, la presente invención también proporciona un método para producir una proteína de unión a antígeno agonista de TREM2 según se define en las reivindicaciones, como un anticuerpo monoclonal agonista de TREM2 o un fragmento de unión del mismo, que comprende el cultivo de una célula huésped que contiene uno o más vectores de expresión descritos aquí en un medio de cultivo en condiciones que permitan la expresión de la proteína de unión a antígeno codificada por uno o más de los vectores de expresión; y recuperar la proteína de unión a antígeno del medio de cultivo o de la célula huésped.

[0130]Las células huesped utilizadas para producir las proteínas de unión a antígenos de la invención pueden ser cultivadas en una variedad de medios. Los medios disponibles comercialmente como el Ham 's F10 (Sigma), el Medio Esencial Mínimo (MEM, Sigma), el RPMI-1640 (Sigma) y el Medio de Águila Modificado de Dulbecco (DMEM, Sigma) son adecuados para el cultivo de las células hospedadoras. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58: 44, 1979; Barnes y col., Anal. Biochem. 102: 255, 1980; Patentes de EE. UU. Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; o 5,122,469; WO90103430; WO 87/00195; o Patente de EE. UU. Re. N.° 30.985 puede ser utilizado como medio de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede ser complementado según sea necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), amortiguadores (como HEPES), nucleótidos (como adenosina y timidina), antibióticos (como el fármaco Gentamicina™), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos generalmente presentes a concentraciones finales en el rango micromolar), y glucosa u otra fuente de energía equivalente. Cualquier otro suplemento necesario también puede ser incluido en concentraciones apropiadas que serían conocidas por aquellos expertos en el tema. Las condiciones culturales, como la temperatura, el pH y similares, son las que se han utilizado previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el artesano hábil ordinario.

[0131]Al cultivar las células huésped, la proteína de unión al antígeno puede ser producida de forma intracelular, en el espacio periplásmico, o secretada directamente al medio. Si la proteína de unión al antígeno se produce intracelularmente, como primer paso, los desechos particulados, ya sea células hospedadoras o fragmentos lizados, se eliminan, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. La proteína de unión al antígeno puede ser purificada utilizando, por ejemplo, cromatografía de hidroxiapatita, cromatografía de intercambio catiónico o aniónico, cromatografía de exclusión de tamaño, o preferiblemente cromatografía de afinidad, utilizando el (los) antígeno(s) de interés o la proteína A o la proteína G como ligando de afinidad. La proteína A se puede utilizar para purificar proteínas que incluyen polipéptidos basados en cadenas pesadas de inmunoglobulina y1, y2 o y4 humana (Lindmark et al., J. Immunol. Meth 62: 1-13, 1983). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para la inmunoglobulina y3 humana (Guss et al., EMBO J. 5: 15671575, 1986). La matriz a la que se une el ligando de afinidad es más comúnmente agarosa, pero hay otras matrices disponibles. Matrices mecánicamente estables como el vidrio poroso controlado o el poli(estireno-divinil)benceno permiten velocidades de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos de los que se pueden lograr con agarosa. Donde la proteína comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) es útil para la purificación. Otras técnicas de purificación de proteínas, como la precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatofocalización, SDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio, también son posibles dependiendo de la proteína de unión a antígenos específica que se vaya a recuperar.

[0132]En ciertas formas de realización, la invención proporciona una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) que comprende uno o una pluralidad de las proteínas de unión a antígeno agonista de TREM2 de la invención (anticuerpos monoclonales agonistas de TREM2 o fragmentos de unión de los mismos) junto con diluyentes, vehículos, excipientes, solubilizantes, emulsionantes, conservantes y/o adyuvantes aceptables desde el punto de vista farmacéutico. Las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen, pero no se limitan a, composiciones líquidas, congeladas y liofilizadas. "Farmacéuticamente aceptable" se refiere a moléculas, compuestos y composiciones que no son tóxicos para los receptores humanos en las dosis y concentraciones empleadas, y/o que no producen reacciones alérgicas o adversas cuando se administran a humanos. En algunas formas de realización, la composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o preservar, por ejemplo, el pH, la osmolaridad, la viscosidad, la claridad, el color, la isotonicidad, el olor, la esterilidad, la estabilidad, la velocidad de disolución o liberación, la adsorción o penetración de la composición. En tales formas de realización, los materiales de formulación adecuados incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos (como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina); antimicrobianos; antioxidantes (como ácido ascórbico, sulfito de sodio o hidrogenosulfito de sodio); amortiguadores (como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos); agentes voluminizadores (como manitol o glicina); agentes quelantes (como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)); agentes complejantes (como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina); rellenos; monosacáridos; disacáridos; y otros carbohidratos (como glucosa, manosa o dextrinas); proteínas (como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas); agentes colorantes, saborizantes y diluyentes; agentes emulsionantes; polímeros hidrofílicos (como polivinilpirrolidona); polipéptidos de bajo peso molecular; contraiones formadores de sal (como sodio); conservantes (como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, fenetil alcohol, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno); disolventes (como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol); alcoholes de azúcar (como manitol o sorbitol); agentes suspensivos; tensioactivos o agentes humectantes (como pluronics, PEG, ésteres de sorbitán, polisorbatos como polisorbato 20, polisorbato 80, tritón, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes estabilizantes (como sacarosa o sorbitol); agentes potenciadores de tonicidad (como haluros de metales alcalinos, preferiblemente cloruro de sodio o potasio, manitol, sorbitol); vehículos de entrega; diluyentes; excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. Los métodos y materiales adecuados para formular moléculas para uso terapéutico son conocidos en las artes farmacéuticas, y están descritos, por ejemplo, en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a edición (editado por A.R. Genrmo), 1990, Mack Publishing Company.

[0133]En algunas formas de realización, la composición farmacéutica de la invención incluye un vehículo farmacéutico estándar, como una solución salina fosfato tamponada estéril, agua bacteriostática, entre otros. Se pueden utilizar diferentes portadores acuosos, por ejemplo, agua, agua tamponada, suero fisiológico al 0,4 %, glicina al 0,3 % y similares, y pueden incluir otras proteínas para una mayor estabilidad, como albúmina, lipoproteína, globulina, etc., sometidas a modificaciones químicas suaves u similares.

[0134]Concentraciones ejemplares de las proteínas de unión al antígeno en la formulación pueden variar desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 200 mg/ml o desde aproximadamente 0,1 mg/mL hasta aproximadamente 50 mg/mL, o desde aproximadamente 0,5 mg/mL hasta aproximadamente 25 mg/mL, o alternativamente desde aproximadamente 2 mg/mL hasta aproximadamente 10 mg/mL. Una formulación acuosa de la proteína de unión al antígeno puede prepararse en una solución amortiguada a un pH, por ejemplo, que oscile entre aproximadamente 4,5 y aproximadamente 6,5, o entre aproximadamente 4,8 y aproximadamente 5,5, o alternativamente, alrededor de 5,0. Ejemplos de buffers que son adecuados para un pH dentro de este rango incluyen acetato (por ejemplo, acetato de sodio), succinato (como succinato de sodio), gluconato, histidina, citrato y otros buffers de ácidos orgánicos. La concentración del tampón puede estar entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 200 mM, o entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 60 mM, dependiendo, por ejemplo, del tampón y de la isotonicidad deseada de la formulación.

[0135]Un agente de tonicidad, que también puede estabilizar la proteína de unión al antígeno, puede incluirse en la formulación. Agentes de tonicidad ejemplares incluyen polioles, como manitol, sacarosa o trehalosa. Preferiblemente, la formulación acuosa es isotónica, aunque soluciones hipertónicas o hipotónicas pueden ser adecuadas. Concentraciones ejemplares del poliol en la formulación pueden variar desde aproximadamente un 1 % hasta aproximadamente un 15 % p/v.

[0136]Se puede agregar un tensioactivo a la formulación de la proteína de unión a antígenos para reducir la agregación de la proteína de unión a antígenos formulada y/o minimizar la formación de partículas en la formulación y/o reducir la adsorción. Los surfactantes ejemplares incluyen surfactantes no iónicos como los polisorbatos (por ejemplo, polisorbato 20 o polisorbato 80) o los poloxámeros (por ejemplo, poloxamer 188). Concentraciones ejemplares de tensioactivo pueden variar desde aproximadamente 0,001 % hasta aproximadamente 0,5 %, o desde aproximadamente 0,005 % hasta aproximadamente 0,2 %, o alternativamente desde aproximadamente 0,004 % hasta aproximadamente 0,01 % p/v.

[0137]En una forma de realización, la formulación contiene los agentes identificados anteriormente (es decir, proteína de unión a antígeno, tampón, poliol y tensioactivo) y es esencialmente libre de uno o más conservantes, como alcohol bencílico, fenol, m-cresol, clorobutanol y cloruro de benzetonio. En otra forma de realización, un conservante puede ser incluido en la formulación, por ejemplo, a concentraciones que van desde aproximadamente 0,1 % hasta aproximadamente 2 %, o alternativamente desde aproximadamente 0,5 % hasta aproximadamente 1 %. Uno o más otros vehículos farmacéuticamente aceptables, excipientes o estabilizadores como los descritos en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a Edición, (A.R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company, pueden incluirse en la formulación siempre que no afecten adversamente las características deseadas de la formulación.

[0138]Formulaciones terapéuticas de la proteína de unión al antígeno se preparan para su almacenamiento mezclando la proteína de unión al antígeno con el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a edición, (A.R. Genrmo, ed), 1990, Mack Publishing Company), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los destinatarios a las dosis y concentraciones empleadas e incluyen buffers (por ejemplo, fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos); antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico y metionina); conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio, fenol, alcohol butílico o bencílico, parabenos alquílicos como metil o propilparabeno, catecol; resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (por ejemplo, menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas (como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas); polímeros hidrofílicos (por ejemplo, polivinilpirrolidona); aminoácidos (por ejemplo, glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina); monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa, maltosa o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; azúcares como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales como el sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de proteínas de Zn); y/o surfactantes no iónicos, como polisorbatos (por ejemplo, polisorbato 20 o polisorbato 80) o poloxámeros (por ejemplo, poloxamer 188); o polietilenglicol (PEG).

[0139]En una forma de realización, una formulación adecuada de la invención reivindicada contiene un tampón isotónico como fosfato, acetato o tampón TRIS en combinación con un agente de tonicidad, como un poliol, sorbitol, sacarosa o cloruro de sodio, que tonifica y estabiliza. Un ejemplo de un agente de tonicidad como este es el sorbitol al 5 % o la sacarosa. Además, la formulación podría incluir opcionalmente un surfactante en una concentración de 0,01 % a 0,02 % en peso/volumen, por ejemplo, para prevenir la agregación o mejorar la estabilidad. El pH de la formulación puede variar entre 4,5 y 6,5 o entre 4,5 y 5,5. Otras descripciones ejemplares de formulaciones farmacéuticas para proteínas de unión a antígenos se pueden encontrar en la Publicación de Patente de EE. UU. n.° 2003/0113316 y en la Patente de EE. UU. n.° 6,171,586.

[0140]Se contemplan también suspensiones y formas cristalinas de proteínas de unión a antígenos. Los métodos para hacer suspensiones y formas cristalinas son conocidos por alguien hábil en la técnica.

[0141]Las formulaciones que se utilizarán para la administraciónin vivodeben ser estériles. Las composiciones de la invención pueden ser esterilizadas mediante técnicas de esterilización convencionales y bien conocidas. Por ejemplo, la esterilización se logra fácilmente mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles. Las soluciones resultantes pueden ser envasadas para su uso o filtradas bajo condiciones asépticas y liofilizadas, siendo la preparación liofilizada combinada con una solución estéril antes de la administración.

[0142]El proceso de liofilización se emplea a menudo para estabilizar polipéptidos para su almacenamiento a largo plazo, especialmente cuando el polipéptido es relativamente inestable en composiciones líquidas. Un ciclo de liofilización suele estar compuesto por tres etapas: congelación, secado primario y secado secundario (ver Williams y Polli, Journal of Parenteral Science and Technology, Volumen 38, Número 2, páginas 48-59, 1984). En el paso de congelación, la solución se enfría hasta que esté adecuadamente congelada. El agua a granel en la solución forma hielo en esta etapa. El hielo sublima en la etapa de secado primario, la cual se lleva a cabo al reducir la presión en la cámara por debajo de la presión de vapor del hielo, utilizando un vacío. Finalmente, el agua sorbida o ligada se elimina en la etapa de secado secundario bajo presión reducida en la cámara y una temperatura elevada en el estante. El proceso produce un material conocido como un pastel liofilizado. Posteriormente, el pastel puede ser reconstituido antes de usarlo.

[0143]La práctica estándar de reconstitución para material liofilizado es agregar un volumen de agua pura (típicamente equivalente al volumen retirado durante la liofilización), aunque a veces se utilizan soluciones diluidas de agentes antibacterianos en la producción de productos farmacéuticos para administración parenteral (ver Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, Volumen 18). 1311-1354, 1992).

[0144]Excipientes han sido notados en algunos casos por actuar como estabilizadores para productos liofilizados (ver Carpenter et al., Volumen 74:) 225-239, 1991). Por ejemplo, los excipientes conocidos incluyen polioles (como el manitol, sorbitol y glicerol); azúcares (como glucosa y sacarosa); y aminoácidos (como alanina, glicina y ácido glutámico).

[0145]Además, los polioles y los azúcares suelen utilizarse para proteger los polipéptidos del daño causado por el congelamiento y el secado, y para mejorar la estabilidad durante el almacenamiento en estado seco. En general, los azúcares, en particular los disacáridos, son efectivos tanto en el proceso de liofilización como durante el almacenamiento. Otras clases de moléculas, incluyendo mono y disacáridos y polímeros como PVP, también han sido reportadas como estabilizadores de productos liofilizados.

[0146]Para la inyección, la formulación farmacéutica y/o medicamento puede ser un polvo adecuado para reconstitución con una solución apropiada como se describe arriba. Ejemplos de estos incluyen, pero no se limitan a, polvos liofilizados, polvos secados por rotación o por pulverización, polvos amorfos, gránulos, precipitados o partículas. Para la inyección, las formulaciones pueden opcionalmente contener estabilizadores, modificadores de pH, surfactantes, modificadores de biodisponibilidad y combinaciones de estos.

[0147]Preparaciones de liberación sostenida pueden ser preparadas. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros sólidos hidrofóbicos que contienen la proteína de unión al antígeno, las cuales están en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) o poli(vinilalcohol)), poliláctidos (Patente de<e>E. UU. N.° 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato, etileno-vinil acetato no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradable como el Lupron Depot™ (microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que polímeros como el acetato de vinilo-etileno y el ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas por períodos de tiempo más cortos. Cuando los polipéptidos encapsulados permanecen en el cuerpo durante mucho tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37 °C, lo que resulta en una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Estrategias racionales pueden ser diseñadas para la estabilización dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S--S intermoleculares a través del intercambio de tio-disulfuro, la estabilización puede lograrse mediante la modificación de residuos sulfhidrilo, la liofilización de soluciones ácidas, el control del contenido de humedad, el uso de aditivos adecuados y el desarrollo de composiciones específicas de matriz polimérica.

[0148]Las formulaciones de la invención pueden estar diseñadas para ser de acción corta, de liberación rápida, de acción prolongada o de liberación sostenida. Por lo tanto, las formulaciones farmacéuticas también pueden ser formuladas para liberación controlada o para liberación lenta.

[0149]Dosificaciones específicas pueden ser ajustadas dependiendo de la enfermedad, trastorno o condición a tratar (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, demencia frontotemporal o enfermedad de Nasu-Hakola), la edad, peso corporal, condiciones generales de salud, sexo y dieta del sujeto, intervalos de dosis, vías de administración, tasa de excreción y combinaciones de fármacos.

[0150]El agonista TREM2 de las proteínas de unión a antígenos de la invención se puede administrar por cualquier medio adecuado, incluyendo vía parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar, intratecal, intracerebral, intracerebroventricular e intranasal, y, si se desea para un tratamiento local, administración intralesional. La administración parenteral incluye la administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intradérmica o subcutánea. Además, la proteína de unión al antígeno se administra adecuadamente mediante infusión pulsátil, especialmente con dosis decrecientes de la proteína de unión al antígeno. Preferiblemente, la dosificación se administra mediante inyecciones, preferiblemente intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. Otros métodos de administración están contemplados, incluyendo la administración tópica, en particular transdérmica, transmucosa, rectal, oral o local, por ejemplo a través de un catéter colocado cerca del sitio deseado. En ciertas formas de realización, la proteína de unión a antígenos agonista de TREM2 de la invención se administra por vía intravenosa o subcutánea en una solución fisiológica a una dosis que oscila entre 0,01 mg/kg y 100 mg/kg con una frecuencia que va desde diaria hasta mensualmente (por ejemplo, todos los días, cada dos días, cada tres días, o 2, 3, 4, 5 o 6 veces por semana), preferiblemente una dosis que oscila entre 0,1 y 45 mg/kg, 0,1 y 15 mg/kg o 0,1 y 10 mg/kg con una frecuencia de una vez por semana, una vez cada dos semanas o una vez al mes.

[0151]El agonista TREM2 y las proteínas de unión a antígenos descritas aquí (por ejemplo, anticuerpos monoclonales agonistas de TREM2 y fragmentos de unión de los mismos) son útiles para su uso en métodos para prevenir, tratar o mejorar una condición relacionada con la deficiencia de TREM2 o la pérdida de la función biológica de TREM2 en un paciente que lo necesite. Como se utiliza aquí, el término tratar o tratamiento es una intervención realizada con la intención de prevenir el desarrollo o alterar la patología de un trastorno. Por consiguiente, el tratamiento se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas. Los pacientes que necesitan tratamiento incluyen a aquellos que ya han sido diagnosticados con el trastorno o condición o que sufren de él, así como a aquellos en los que se debe prevenir el trastorno o condición, como por ejemplo, pacientes que tienen riesgo de desarrollar el trastorno o condición basado en marcadores genéticos. El tratamiento incluye cualquier indicio de éxito en la mejora de una lesión, patología o condición, incluyendo cualquier parámetro objetivo o subjetivo como la reducción, remisión, disminución de síntomas, o hacer que la lesión, patología o condición sea más tolerable para el paciente, ralentización en la tasa de degeneración o declive, hacer que el punto final de la degeneración sea menos debilitante, o mejorar el bienestar físico o mental de un paciente. El tratamiento o la mejora de los síntomas pueden basarse en parámetros objetivos o subjetivos, incluyendo los resultados de un examen físico, la autoevaluación del paciente, pruebas cognitivas, pruebas de función motora, exámenes neuropsiquiátricos y/o una evaluación psiquiátrica.

[0152]La actividad biológica de TREM2 ha sido implicada en varios procesos fisiológicos, incluyendo procesos de células mieloides, como la fagocitosis, proliferación, supervivencia y regulación de la producción de citoquinas inflamatorias; osteoclastogénesis; diferenciación de osteoclastos; regulación negativa de la autoinmunidad; respuestas inflamatorias; remodelación y reparación ósea; resorción ósea; reparación de tejidos, microgliosis y homeostasis cerebral. Ver, por ejemplo, Colonna, Nature Reviews Immunology, Vol. 3: 445-453, 2003; Paradowska-Gorycka et al., Human Immunology, Vol. 74: 730-737, 2013; y Ulrich y Holtzman, ACS Chem. Neuroci., Vol. 7: 420-427, 2016. La pérdida de la función de TREM2 o la deficiencia de TREM2 se ha vinculado a varios trastornos y enfermedades, incluyendo la osteodisplasia lipomembranosa poliquística con leucoencefalopatía esclerosante (PLOSL; también conocida como enfermedad de Nasu-Hakola), la enfermedad de Alzheimer, la demencia frontotemporal, la esclerosis múltiple, la enfermedad priónica, el accidente cerebrovascular, la osteoporosis y la osteopetrosis. Consulte, por ejemplo, Jonsson et al., New England Journal of Medicine, Vol. 368: 107-116, 2013; Guerreiro y colaboradores, New England Journal of Medicine, Vol. 368: 117-127, 2013; Paradowska-Gorycka et al., Human Immunology, Vol. 74: 730-737, 2013; y Ulrich y Holtzman, ACS Chem. Neurosci, Vol. 7: 420-427, 2016. Por lo tanto, las proteínas de unión a antígenos agonistas de TREM2 de la invención pueden administrarse a pacientes para prevenir, mejorar o tratar cualquiera de estas enfermedades o trastornos u otras condiciones asociadas con la deficiencia de TREM2 o la pérdida de la función biológica o actividad de TREM2. En ciertas formas de realización, las proteínas de unión de antígeno agonistas de la invención se destinan a prevenir, tratar o mejorar una afección asociada con la deficiencia de TREM2 o la pérdida de la función de TREM2 en un paciente que lo necesite, mediante la administración al paciente de una cantidad efectiva de una proteína de unión de antígeno agonista de TREM2 según se define en las reivindicaciones. El agonista TREM2 proteína de unión a antígenos es un anticuerpo monoclonal antagonista de TREM2 o un fragmento de unión del mismo. El término paciente incluye a los pacientes humanos y se utiliza indistintamente con el término sujeto.

[0153]Una “cantidad efectiva” es generalmente una cantidad suficiente para reducir la gravedad y/o frecuencia de los síntomas, eliminar los síntomas y/o la causa subyacente, prevenir la aparición de síntomas y/o su causa subyacente, y/o mejorar o remediar el daño que resulta de o está asociado con una condición particular. En algunas formas de realización, la cantidad efectiva es una cantidad terapéuticamente efectiva o una cantidad profilácticamente efectiva. Una cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad suficiente para remediar un estado de enfermedad o síntoma(s), particularmente un estado o síntoma(s) asociado(s) con el estado de enfermedad, o de lo contrario prevenir, obstaculizar, retardar o revertir la progresión del estado de enfermedad o cualquier otro síntoma no deseado asociado con la enfermedad de cualquier manera posible (es decir, que proporcione eficacia terapéutica). Una cantidad profílacticamente efectiva es una cantidad de proteína de unión a antígenos que, al ser administrada a un sujeto, tendrá el efecto profílactico previsto, por ejemplo, previniendo o retrasando la aparición (o recurrencia) de la condición, o reduciendo la probabilidad de aparición (o recurrencia) de la condición. El efecto terapéutico completo o profiláctico no necesariamente se produce con la administración de una sola dosis, y puede ocurrir solo después de la administración de una serie de dosis. Por lo tanto, una cantidad efectiva terapéutica o profiláctica puede ser administrada en una o más administraciones.

[0154]Condiciones o trastornos asociados con la deficiencia de TREM2 o la pérdida de la función de TREM2 que pueden ser prevenidos, tratados o mejorados de acuerdo con los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, la enfermedad de Nasu-Hakola, la enfermedad de Alzheimer, la demencia frontotemporal, la esclerosis múltiple, el síndrome de Guillain-Barré, la esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Parkinson, la lesión cerebral traumática, la lesión de médula espinal, el lupus eritematoso sistémico, la artritis reumatoide, la enfermedad priónica, el accidente cerebrovascular, la osteoporosis, la osteopetrosis y la osteosclerosis. En ciertas formas de realización, la condición o trastorno a prevenir, tratar o aliviar de acuerdo con los métodos de la invención es la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Nasu-Hakola, la demencia frontotemporal, la esclerosis múltiple, la enfermedad priónica o el accidente cerebrovascular.

[0155]En una forma de realización, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígenos agonista para su uso en un método para prevenir, tratar o mejorar la enfermedad de Alzheimer en un paciente que lo necesite, que comprende la administración al paciente de una cantidad efectiva de una proteína de unión a antígenos agonista de TREM2 según se define en las reivindicaciones. El agonista de TREM2, proteína de unión a antígeno administrada al paciente, es un anticuerpo monoclonal anti-TREM2 agonista o un fragmento de unión a antígeno del mismo, según se define en las reivindicaciones. En algunas formas de realización, el paciente al que se le administrará una proteína de unión a antígeno agonista de TREM2 es un paciente en riesgo de desarrollar la enfermedad de Alzheimer. Por ejemplo, en una forma de realización, se ha determinado que el paciente tiene al menos un alelo que contiene la mutación rs75932628-T en el genTREM2, por ejemplo, el paciente tiene un genotipo de CT en rs75932628. En formas relacionadas, el paciente en riesgo de desarrollar la enfermedad de Alzheimer es un paciente que se ha determinado que porta un alelo variante de TREM2 que codifica una histidina en lugar de una arginina en la posición 47 en SEQ ID NO: 1. En otras formas de realización, se ha determinado que el paciente tiene al menos un alelo que contiene la mutación rs143332484-T en el genTREM2,por ejemplo, el paciente tiene un genotipo de CT en rs143332484. En formas relacionadas, el paciente en riesgo de desarrollar la enfermedad de Alzheimer es un paciente que ha sido determinado como portador de un alelo variante de TREM2 que codifica una histidina en lugar de una arginina en la posición 62 en SEQ ID NO: 1. En algunas formas de realización, se ha determinado que un paciente en riesgo de desarrollar la enfermedad de Alzheimer tiene al menos un alelo que contiene la mutación rs6910730-G en el genTREMI,al menos un alelo que contiene la mutación rs7759295-C corriente arriba del genTREM2,y/o al menos un alelo £4 del genAPOE.

[0156]En otra forma de realización, la presente invención proporciona una proteína de unión de antígeno agonista para su uso en un método para prevenir, tratar o mejorar la demencia frontotemporal o la enfermedad de Nasu-Hakola en un paciente que lo necesite, que comprende la administración al paciente de una cantidad eficaz de una proteína de unión de antígeno agonista de TREM2 según se define en las reivindicaciones. El agonista de TREM2, proteína de unión a antígenos, administrado al paciente es un anticuerpo monoclonal agonista de TREM2 o fragmento de unión a antígenos del mismo, según se define en las reivindicaciones. En algunas formas de realización, el paciente al que se le administrará una proteína de unión al antígeno agonista de TREM2 es un paciente en riesgo de desarrollar demencia frontotemporal o la enfermedad de Nasu-Hakola. Por ejemplo, en una de esas formas de realización, se ha determinado que el paciente tiene al menos un alelo que contiene la mutación rs104894002-A en el genTREM2,por ejemplo, el paciente tiene un genotipo de GA o AA en rs104894002. En las formas de realización relacionadas, el paciente en riesgo de desarrollar demencia frontotemporal o la enfermedad de Nasu-Hakola es un paciente que se ha determinado que lleva un alelo variante TREM2 que codifica una proteína TREM2 truncada como resultado de la sustitución de un codón de parada en lugar de glutamina en la posición 33 en SEQ ID NO: 1. En otra forma de realización, se ha determinado que el paciente tiene al menos un alelo que contiene la mutación rs201258663-A en el genTREM2,por ejemplo, el paciente tiene un genotipo de GA o AA en rs201258663. En formas relacionadas, el paciente en riesgo de desarrollar demencia frontotemporal o enfermedad de Nasu-Hakola es un paciente que se ha determinado que porta un alelo variante de TREM2 que codifica una metionina en lugar de treonina en la posición 66 en SEQ ID NO: 1. En algunas formas de realización, el paciente en riesgo de desarrollar demencia frontotemporal o la enfermedad de Nasu-Hakola es un paciente que se ha determinado que lleva un alelo variante de TREM2 que codifica una cisteína en lugar de una tirosina en la posición 38 en la SEQ ID NO: 1.

[0157]En otra forma de realización, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígenos agonista para su uso en un método para prevenir, tratar o mejorar la esclerosis múltiple en un paciente necesitado de ello, que comprende la administración al paciente de una cantidad efectiva de una proteína de unión a antígenos agonista de TREM2 según se define en las reivindicaciones. El agonista de TREM2 proteína de unión a antígeno administrado al paciente es un anticuerpo monoclonal anti-TREM2 agonista o un fragmento de unión a antígeno del mismo según se define en las reivindicaciones. En algunas formas de realización, el paciente al que se le administrará una proteína de unión a antígenos agonista de TREM2 es un paciente en riesgo de desarrollar esclerosis múltiple.

[0158]Como se describe en los Ejemplos 9 y 10, un anticuerpo agonista anti-TREM2 capaz de activar la señalización TREM2/DAP12, medida por el aumento de los niveles de pSyk, rescató el defecto de viabilidad en macrófagos y microglía resultado de una mutación de pérdida de función en TREM2, y restauró la secreción de CCL2 en macrófagos deficientes en TREM2. Estos resultados indican que la activación de la señalización TREM2/DAP12 con un anticuerpo agonista anti-TREM2 puede mejorar la función de los macrófagos/microglía, lo cual a su vez podría ser terapéutico en condiciones asociadas con una función insuficiente de los macrófagos/microglía. Por lo tanto, una proteína de unión de antígeno agonista de TREM2 según se describe aquí podría aumentar la supervivencia o proliferación de células mieloides, como microglía, macrófagos o células dendríticas, en un paciente que lo necesite cuando se utiliza en un método que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de la proteína de unión de antígeno agonista de TREM2 descrita aquí. En ciertas formas de realización, la proteína de unión de antígeno agonista de TREM2 administrada al paciente es un anticuerpo monoclonal agonista anti-TREM2 según se define en las reivindicaciones. En algunas formas de realización, el paciente que necesita tratamiento corre el riesgo de, sufre de o ha sido diagnosticado con un trastorno neurodegenerativo. En una forma de realización, el trastorno neurodegenerativo es la enfermedad de Alzheimer. En algunas formas de realización, el paciente que necesita tratamiento está en riesgo de, sufre de, o ha sido diagnosticado con un trastorno autoinmune. En una forma de realización, el trastorno autoinmune es esclerosis múltiple.

[0159]El agonista TREM2 proteínas de unión a antígenos de la invención también son útiles para detectar el TREM2 humano en muestras biológicas e identificar células o tejidos que expresan TREM2 humano. Por ejemplo, las proteínas de unión a antígenos se pueden utilizar en ensayos diagnósticos, como inmunoensayos, para detectar y/o cuantificar TREM2 expresado en un tejido o célula (macrófagos o microglía) o la presencia de formas solubles de TREM2 en un fluido corporal, como el líquido cefalorraquídeo, la sangre, el suero o el plasma. Además, las proteínas de unión de antígeno agonista de TREM2 descritas aquí se pueden usar para activar la señalización TREM2/DAP12 en células mieloides, modulando así la actividad biológica de estas células. Tales actividades biológicas incluyen la liberación de citoquinas, la fagocitosis y la microgliosis.

[0160]El TREM2 agonista proteínas de unión de antígeno descritas en este documento se pueden utilizar con fines de diagnóstico para detectar, diagnosticar o monitorear condiciones asociadas con disfunción de TREM2, tales como enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson), lesiones del sistema nervioso central (lesión cerebral traumática, lesión de la médula espinal, accidente cerebrovascular), enfermedades autoinmunes (esclerosis múltiple, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico), demencia frontotemporal, enfermedad de Nasu-Hakola y trastornos óseos (por ejemplo, osteoporosis, osteopetrosis, osteosclerosis). Por ejemplo, se ha observado un aumento en el nivel de una forma soluble de TREM2 en el líquido cefalorraquídeo en pacientes con esclerosis múltiple (Piccio et al., Brain, Vol. 131: 3081-3091, 2008). También se describen aquí métodos para la detección de la presencia de TREM2 en una muestra utilizando métodos inmunohistológicos clásicos conocidos por los expertos en la materia (por ejemplo, Tijssen, 1993, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Vol 15 (Eds R.H. Burdon y P.H. van Knippenberg, Elsevier, Ámsterdam); Zola, 1987, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc.); Jalkanen y col., 1985, J. Cell. 101:976-985; Jalkanen et al., 1987, J. Cell Biol.

101:976-985; Jalkanen y colaboradores, 1987, J. Cell Biol. 105:3087-3096. Ejemplos de métodos útiles en la detección de la presencia de TREM2 incluyen ensayos inmunológicos, como el ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA), utilizando las proteínas de unión al antígeno descritas aquí. La detección de TREM2 se puede realizarin vivooin vitro.

[0161]Para aplicaciones diagnósticas, la proteína de unión a antígenos puede ser etiquetada con un grupo de etiquetado detectable. Los grupos de etiquetado adecuados incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), grupos fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fosforescentes de lantánidos), grupos enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), grupos quimioluminiscentes, grupos de biotinilo, o epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un reportero secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cierre de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas de epítopos). En algunas formas de realización, el grupo de etiquetado se acopla a la proteína de unión al antígeno a través de brazos espaciadores de diferentes longitudes para reducir posibles impedimentos estéricos. Se conocen varios métodos para etiquetar proteínas en el campo y pueden ser utilizados.

[0162]En otra forma de realización, las proteínas de unión a antígenos descritas aquí pueden ser utilizadas para identificar una célula o células que expresen TREM2. En una forma de realización específica, la proteína de unión al antígeno está marcada con un grupo de marcado y se detecta la unión de la proteína de unión al antígeno marcada a TREM2. Las proteínas de unión a antígenos también pueden ser utilizadas en ensayos de inmunoprecipitación en muestras biológicas. En otra forma de realización específica, la unión de la proteína de unión al antígeno a TREM2 se detectain vivo.En una forma de realización específica adicional, la proteína de unión al antígeno se aísla y se mide utilizando técnicas conocidas en el campo. Vea, por ejemplo, Harlow y Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor (ed. 1991 y suplementos periódicos); John E. Coligan, ed., 1993, Current Protocols In Immunology, Nueva York: John Wiley & Sons.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Generación de Anticuerpos Humanos Anti-TREM2

Inmunizaciones

[0163]Los anticuerpos completamente humanos contra TREM2 humano fueron generados al inmunizar ratones transgénicos XenoMouse®. Estos ratones transgénicos llevan transgenes de inmunoglobulina humana que permiten la producción de anticuerpos totalmente humanos específicos del antígeno tras la inmunización.Ver,por ejemplo, la patente de EE. UU. Nos 6,114,598; 6,162,963; 6,833,268; 7,049,426; 7,064,244; Green et al., 1994, Nature Genetics 7:13-21; Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15:146-156; Green y Jakobovitis, 1998, J. Ex. Med, 188:483-495; Green, 1999, Journal of Immunological Methods 231:11-23; Kellerman y Green, Current Opinion in Biotechnology 13, 593-597, 2002. Se utilizaron animales de las cepas XMG2-K, XMG2-KL, XMG4-K y XMG4-KL del XenoMouse® 80 para las inmunizaciones. Los ratones de las cepas XenoMouse® XMG2-K y XMG2-KL producen anticuerpos IgG2 totalmente humanos con cadenas ligeras kappa (XMG2-K) o con cadenas ligeras kappa y lambda (XMG2-KL). Los ratones de las cepas XenoMouse® XMG4-K y XMG4-KL producen anticuerpos IgG4 completamente humanos con cadenas ligeras kappa (XMG4-K) o con cadenas ligeras kappa y lambda (XMG4-KL).

[0164]Se utilizaron múltiples inmunógenos y vías de inmunización para producir una respuesta inmune al TREM2 humano en las cepas XenoMouse®. Para las inmunizaciones con proteínas recombinantes solubles, los ratones fueron inmunizados con una proteína TREM2 soluble, que era una proteína de fusión que comprendía el dominio extracelular (ECD) de TREM2 humano (aminoácidos 1-174; s Eq ID NO:). 2) fusionado al extremo N de una región Fc de IgG1 humana a través de un enlazador Gly-Ser-Ser. Los animales fueron inmunizados con la proteína soluble TREM2 mezclada con oligodesoxinucleótidos CpG (CpG-ODN) o CpG-ODN y ácido poliinosínico:poliocitidílico (Poly I:C) y adyuvante QS21, 8 a 12 veces durante 4 a 8 semanas mediante inyecciones subcutáneas. El impulso inicial contenía 10 pg de proteína, mientras que los impulsos siguientes contenían 5 pg de proteína.

[0165]El inmunógeno para la inmunización genética fue creado recubriendo cuentas de oro (BioRad, Hercules, California) con GM-CSF de ratón, CpG-ODN y vectores de expresión que codifican el TREM2 humano de tipo salvaje (SEQ ID NO: 1) y DAP12 humano de tipo salvaje (SEQ ID NO: 3). El inmunógeno genético fue entregado a la epidermis del abdomen de un ratón afeitado utilizando el sistema Helios Gene Gun según las instrucciones del fabricante (BioRad, Hércules, California). Los ratones fueron inmunizados con el inmunógeno genético 12-16 veces durante 6-8 semanas.

[0166]Los títulos séricos específicos de TREM2 humano fueron monitoreados mediante análisis de FACS en células vivas en un citómetro de flujo Accuri o FacsCalibur (BD Biosciences) o mediante ELISA específico de TREM2. Animales con los títulos nativos de suero más altos dirigidos contra TREM2 humano de cuatro cosechas separadas fueron sacrificados y utilizados para la generación de hibridomas. La Tabla 7 a continuación proporciona una descripción de cada grupo de cosecha.

Tabla 7. Grupos de Inmunización TREM2

Preparación de Anticuerpos Monoclonales

[0167]Se identificaron animales que presentaban títulos séricos específicos del antígeno adecuados y se obtuvieron linfocitos del bazo y/o ganglios linfáticos drenantes. Los linfocitos combinados (de cada recolección) fueron disociados del tejido linfoide mediante trituración en un medio adecuado (por ejemplo, Medio Águila Modificado de Dulbecco (DMEM); Invitrogen, Carlsbad, CA). Las células B fueron seleccionadas y/o expandidas utilizando métodos estándar, y se fusionaron con un socio de fusión adecuado (por ejemplo, células de mieloma no secretoras P3X63Ag8.653) utilizando técnicas convencionales.

[0168]Para la cosecha 1, los grupos de hibridomas fusionados de tejidos inmunes selectos fueron sembrados en pocillos policlonales, agotados para generar medios condicionados, y luego examinados para la unión a la proteína humana soluble TREM2 (proteína de fusión descrita anteriormente). Las células que recibieron este recubrimiento se agruparon y luego se clasificaron clonalmente por FACS para obtener una célula viva por pocillo. Para la cosecha 3, 4 y 5, se utilizaron piscinas de hibridomas fusionados de tejido inmune seleccionado como fuente de material para enriquecimientos basados en FACS. Específicamente, las células híbridas se descongelaron y se cultivaron en medio de selección de DMEM durante 3-4 días. El medio de cultivo se cambió a medio híbrido BDQY para hibridomas un día antes de la clasificación a granel. Las células fueron lavadas en 10 mL de buffer FACS estéril y luego incubadas con proteína soluble TREM2 biotinilada a una concentración de 2 a 5 pg/mL en un volumen de reacción de 1 mL durante 1 hora a 4 °C. Para el grupo de recolección 3, que fue inmunizado con proteína soluble TREM2, este paso se realizó en presencia de 100 pg/mL de IgG humana policlonal (Jackson ImmunoResearch) para bloquear cualquier unión a la región Fc. El paso de bloqueo con IgG humana policlonal se omitió para la cosecha 4 y 5, ya que estas cosechas provenían de animales inmunizados genéticamente.

[0169]Después de un lavado de dilución en 10 mL de tampón FACS, se agregó a las células 1 mL de un cóctel de anticuerpos que contenía 5 pg/mL de cada uno de los siguientes: anticuerpo de cabra anti-IgG humana conjugado con Alexa Fluor 488 (Jackson Immunoresearch) y estreptavidina conjugada con Alexa Fluor 647 (Jackson Immunoresearch). Las células fueron luego incubadas a 4° C durante 30 minutos. Después de la incubación, las células fueron lavadas en 10 mL de tampón FACS, resuspendidas en 2 mL de medio híbrido BDQY para hibridomas que contiene 5 pL de 7-AAD (BD Pharmingen, Cat: 559925), luego pasar por un tamiz de celda de 40 micrones para eliminar cualquier grumo. Las células fueron clasificadas en lotes en el BD FACSAria mediante la selección de la población de células vivas positivas para ambas señales de fluorescencia de Alexa Fluor 488 y Alexa Fluor 647.

[0170]Las células ordenadas fueron transferidas a placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos y se cultivaron durante unos días antes de ser contadas y teñidas nuevamente utilizando el método descrito anteriormente para verificar el enriquecimiento de células específicas de antígeno. Las células fueron luego clasificadas de forma individual en placas de microtitulación de 384 pocillos que contenían medio hibridoma BDQY y se cultivaron durante un máximo de 2 semanas antes de recolectar los sobrenadantes para su análisis.

Ejemplo 2. Selección de anticuerpos de unión específica a TREM2

[0171]Los anticuerpos producidos a partir de los hibridomas descritos en el Ejemplo 1 fueron evaluados en cuanto a su unión a TREM2 humano, actividad agonista de TREM2 humano y reactividad cruzada con otras proteínas TREM. Se describen a continuación los métodos y resultados de estos cribados.

Cribado de unión primaria de TREM2

[0172]Los sobrenadantes de hibridomas agotados se probaron para la unión a TREM2 humano por ELISA. En resumen, las placas de neutravidina se generaron incubando una placa de ensayo Corning 3702 de 384 pocillos con neutravidina (Thermo 3100B) a 10 pg/mL (40 pL/pocillo) en PBS al 1X a 4 °C durante la noche. Las placas fueron lavadas con PBS 1X utilizando un lavador de placas Biotek y luego bloqueadas con leche al 1 % en PBS 1X (90 pL/pozo) a temperatura ambiente (TA) durante 30 minutos. Las placas fueron luego lavadas nuevamente con PBS 1X utilizando la lavadora de placas. La muestra de captura fue la proteína soluble humana TREM2 biotinilada (proteína de fusión TREM2 ECDhuIgG1 Fc) y se agregó a 0,5 pg/mL en leche al 1 %/PBS al 1X en un volumen de 40 pL por pocillo. Las placas fueron luego incubadas a temperatura ambiente durante 1 hora para inmovilizar la proteína TREM2 en los pocillos de las placas. Tras la incubación, las placas fueron nuevamente lavadas con PBS 1X utilizando la lavadora de placas. Se añadieron 10pL de cada sobrenadante de hibridoma a ser probado y 40pL de leche al 1 %/PBS 1X (dilución 1:5) a cada pocillo de las placas y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Nuevamente, las placas fueron lavadas con PBS 1X utilizando el lavador de placas. Cabra anti-kappa humano-HRP (Southern Biotech, 2060-05) y cabra anti-lambda humano-HRP (Southern Biotech, 2070-05) diluidas juntas 1:2000 en leche al 1 %/PBS 1X o cabra anti-IgG Fc humano POD diluida 1:4000 en leche al 1 %/PBS 1X se añadió a las placas (40 pl/pozo) y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de que los platos fueron lavados con PBS 1X utilizando la lavadora de placas, se añadieron 40 pL por pocillo de sustrato TMB (Neogen, lote N.° 150114) a los platos y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. La reacción se detuvo con ácido clorhídrico 1N (40uL/pozo) después del período de incubación. Las lecturas de OD a 450 nm se obtuvieron con un lector de placas.

[0173]La prueba ELISA primaria identificó 2,523 anticuerpos que resultaron positivos para la unión a TREM2 de los cuatro grupos de cosechas separados. Estos anticuerpos identificados fueron avanzados a las pruebas de ensayo funcional.

Cribados para ensayos Funcionales de TREM2

[0174]Los anticuerpos que dieron positivo en la prueba de unión a TREM2 en el ensayo de ELISA fueron evaluados por su actividad agonista en TREM2 humano en un ensayo de señalización de fosfo-Syk (pSyk) basado en células. La proteína TREM2 humana, que es una glicoproteína transmembrana, se une con la proteína adaptadora, DAP12, para la señalización y función a través del reclutamiento de las tirosina quinasas proteína asociada a la cadena Z (ZAP70) y la quinasa tirosina del bazo (Syk) (Colonna, Nature Reviews Immunology, Vol. 3: 445-453, 2003). La forma fosforilada de Syk es indicativa de la activación de la señalización de TREM2/DAP12. Por lo tanto, se desarrolló un ensayo de AlphaLISA basado en células (Perkins Elmer) para detectar formas fosforiladas de Syk en respuesta a la modulación de TREM2/DAP12. La prueba emplea un anticuerpo conejo anti-pSyk, un anticuerpo ratón biotinilado anti-Syk total, cuentas aceptoras conjugadas a anticuerpos IgG anti-conejo, y cuentas donantes recubiertas con estreptavidina. Las formas fosforiladas de Syk presentes en los lisados celulares son unidas tanto por el anticuerpo conejo anti-pSyk como por el anticuerpo ratón anti-Syk total. Las cuentas aceptoras, que están conjugadas a un anticuerpo anti-IgG de conejo, se unen al anticuerpo anti-pSyk de conejo, y las cuentas donantes recubiertas de estreptavidina se unen al anticuerpo anti-Syk total de ratón biotinilado. La excitación de las cuentas donantes a una longitud de onda de 680 nm resulta en la liberación de oxígeno singlete, que a su vez produce una señal fluorescente amplificada en las cuentas aceptoras, generando así una emisión a 615 nm. La emisión a 615 nm no se detecta si las cuentas donadoras y aceptoras no están ubicadas en proximidad cercana entre sí (es decir, la cuenta aceptora no se recluta al complejo porque Syk no está fosforilado y, por lo tanto, no está unido por el anticuerpo anti-pSyk de conejo). Por lo tanto, la cantidad de luz emitida a 615 nm es proporcional a la cantidad de Syk fosforilado presente en el lisado celular, lo que a su vez es indicativo de la activación de la señalización TREM2/DAP12 por el anticuerpo anti-TREM2.

[0175]Las células HEK293T que expresan de manera estable TREM2 humano y DAP12 humano (línea celular G13) fueron sembradas en medio de crecimiento a 40.000 células por pocillo (en 90 o 80<j>L) en placas de cultivo de 96 pocillos de área media o a 50.000 células por pocillo (en 200<j>L) en placas recubiertas con poli-D-lisina. Las células se incubaron durante la noche a 37 °C y 5 % de CO2. Se añadieron anticuerpos anti-humanos TREM2 ya sea a una sola concentración (para la primera selección de un solo punto) o a un rango de concentraciones (para pruebas de potencia). Después de incubar las células y el anticuerpo a temperatura ambiente durante 30 a 40 minutos, se retiró por completo el medio de cultivo. Las células fueron lisadas con 20<j>L (para 40.000 células) o 25<j>L (para 50.000 células) de tampón de lisis que contenía 82 inhibidores de proteasas/fosfatasas en hielo durante 45 a 60 minutos. El lisado celular (5 j L) se transfirió a los pocillos apropiados de una placa de ensayo blanca de 384 pocillos que contenía una mezcla de 15 j L de anticuerpo de conejo anti-pSyk (concentración final: 1 nM), anticuerpos de ratón anti-Syk biotinilados (concentración final: 1 nM) y perlas aceptoras conjugadas con anticuerpos anti-IgG de conejo (concentración final: 10 jg/mL). Las placas de ensayo fueron luego incubadas en hielo durante 2 horas. Perlas de donantes recubiertas con estreptavidina (5<j>L) fueron añadidas posteriormente a los pocillos (concentración final: 40 jg/mL) y las placas de ensayo se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora en la oscuridad. La señal AlphaLISA (conteos) fue medida por el lector multietiqueta EnVision. La actividad agonista del anticuerpo se informó como un valor relativo al control (S/B): S/B= Señal de muestra pSyk (conteos) / Señal basal pSyk (conteos de señal de control de isotipo pSyk).

[0176]Anticuerpos de los sobrenadantes de hibridomas que dieron positivo en la unión a TREM2 fueron inicialmente probados a una sola concentración en el ensayo de pSyk. Para este cribado de un único punto, se añadió el sobrenadante de hibridoma agotado (ESN) que contiene anticuerpos anti-huTREM2 a las células ya sea basado en el volumen (10 j L para la cosecha 1, dilución de 1:10) o en la concentración (20 j L de ESN que previamente se normalizó a 10 jg/m L para las cosechas 3, 4 y 5, dilución de 1:5). De los 2.523 anticuerpos positivos para la unión a TREM2 de las cuatro cosechas separadas, 140 anticuerpos mostraron actividad en el ensayo de pSyk a una sola concentración. Estos anticuerpos fueron avanzados para la evaluación de potencia.

[0177]La evaluación de la potencia se realizó inicialmente en anticuerpos anti-TREM2 derivados de hibridomas clonales no purificados y cuantificados, y posteriormente en anticuerpos monoclonales derivados de hibridomas purificados y/o recombinantes. Para la cosecha 1, los anticuerpos anti-TREM2 se titraron en serie a un factor de 3 desde 100 jg/mL hasta 0,005 jg/mL y se añadieron 10 j L de cada dilución a las células (concentraciones finales de anticuerpo de 10 jg/mL a 0,0005 jg/mL, 66,67 nM a 0,003 nM). Para la evaluación de la potencia de la cosecha 3, 4 y 5, el medio de cultivo fue completamente retirado de las células. Los anticuerpos anti-TREM2 se titularon en serie a 3 veces desde 2 jg/m L hasta 0,003 jg/mL en medio de crecimiento y se agregaron 50 j L de cada dilución a las células (concentración final de anticuerpos de 13,33 nM a 0,02 nM). Los valores de CE50 para cada anticuerpo anti-TREM2 fueron determinados mediante un modelo de ajuste logístico de cuatro parámetros del programa GraphPad Prism Versión 6,07 a partir de las curvas de respuesta a la dosis de 10 puntos.

[0178]De los 140 anticuerpos evaluados en cuanto a potencia, se seleccionaron 93 anticuerpos para continuar con la evaluación y caracterización. La Figura 1A muestra las curvas dosis-respuesta para los mejores anticuerpos agonistas anti-TREM2 de la cosecha 1, mientras que la Figura 1B muestra las curvas dosis-respuesta para los mejores anticuerpos agonistas anti-TREM2 de las cosechas 3, 4 y 5. Los valores de CE50 de los 18 mejores anticuerpos de las cuatro recolecciones se proporcionan en la Tabla 8 a continuación. Como se evidencia a partir de los valores bajos de CE50 en nanomolares o subnanomolares, la mayoría de los anticuerpos anti-TREM2 son agonistas potentes de la señalización de TREM2/DAP12. Varios de los anticuerpos son más potentes y producen un mayor nivel de activación máxima de la señalización TREM2/DAP12 que un anticuerpo comercialmente disponible de rata anti-humano/ratón TREM2 (mAb17291; Rat IgG2b Clone No.237920, R&D Systems), que tenía un valor de CE50 de 0,50 nM y un Emax de 13,8 en este ensayo. Es importante destacar que la actividad agonista de los anticuerpos anti-TREM2 se observó en ausencia de un agente de entrecruzamiento (por ejemplo, proteína G, proteína A o anticuerpo secundario anti-humano) o inmovilización de los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos unidos a placa), lo que sugiere que los anticuerpos pueden interactuar y activar eficazmente el TREM2 humano en forma soluble y monomérica. Para muchos anticuerpos agonistas, se requiere el entrecruzamiento de sus regiones Fc para agrupar los anticuerpos y activar efectivamente el receptor objetivo. Ver, por ejemplo, Natoni et al., British Journal of Haematology, Vol. 139: 568-577, 2007; Vonderheide and Glennie, Clin.

568-577, 2007; Vonderheide y Glennie, Clin. Cancer Res., Vol. 19: 1035-1043, 2013. Se ha observado tal requisito de entrecruzamiento para lograr la actividad agonista en otros anticuerpos de TREM2. Consulte, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.° 8,981,061 y WO 2016/023019. Los anticuerpos TREm 2 descritos aquí tienen una ventaja sobre estos otros anticuerpos TREM2 en el sentido de que son agonistas independientes de la unión cruzada del TREM2 humano (por ejemplo, no requieren unión cruzada u oligomerización a través de sus dominios Fc para la actividad agonista).

Selectividad y reactividad cruzada de los anticuerpos TREM2.

[0179]Los anticuerpos anti-TREM2 que demostraron actividad agonista en la pantalla de potencia fueron evaluados adicionalmente para determinar su reactividad cruzada con TREM2 de ratón y cynomologus, así como su reactividad cruzada con la proteína TREM1 humana. Para la pantalla de reactividad cruzada de especies, se transfirieron células HEK293 con vectores de expresión que contenían ya sea el ADNc de TREM2 de ratón y DAP12 de ratón o el ADNc de TREM2 de macaco cangrejero y DAP12 de macaco cangrejero, en medio Gibco™ Opti-MEM® (Gibco, Cat. N.° 31985088) y el reactivo 293Fectin™ (Invitrogen, Cat. N.° 12347019) siguiendo el protocolo establecido por el fabricante. La reactividad cruzada de TREM1 se evaluó utilizando una línea celular que expresa de manera estable TREM1/DAP12 humano. Se cribaron los sobrenadantes de los hibridomas en busca de la presencia de anticuerpos monoclonales que se unieran a TREM1 humano, TREM2 de ratón o TREM2 de cynomolgus mediante la incubación de los sobrenadantes en cada una de las células transfecatdas durante 1 hora, seguido por pasos de lavado. Las células fueron luego incubadas con un anticuerpo de cabra anti-Fc humano conjugado a Alexa Fluor 647 (Jackson Immunochemicals 109-605-098) durante 15 minutos. La unión fue detectada por FACS utilizando la máquina de FACS Accuri con el autosampler Intellicyt. Se incluyeron anticuerpos de control de isotipo irrelevantes en el análisis por FACS. Los datos se informaron como el promedio geométrico (GM) de veces sobre la unión de anticuerpos de control no relevantes. De los 93 anticuerpos de las cuatro cosechas examinados para la reactividad cruzada, 50 anticuerpos fueron reactivos con TREM2 de cínomolgo y 9 anticuerpos fueron reactivos con TREM2 de ratón. Ninguno de los anticuerpos probados mostró reactividad cruzada con TREM1 humano. Los datos de todas las pantallas para los 18 mejores anticuerpos monoclonales anti-TREM2 de las cuatro cosechas se resumen en la Tabla 8 a continuación.

Tabla 8. Datos resumidos de los principales anticuerpos monoclonales anti-TREM2 obtenidos de la pantalla de hibridomas

Ejemplo 3. Secuenciación de los anticuerpos agonistas anti-TREM2 en humanos

[0180]Se purificó ARN (total o ARNm) de pocillos que contenían células híbridas productoras de anticuerpos agonistas anti-TREM2 utilizando un kit Qiagen RNeasy mini o el kit Invitrogen mRNA catcher plus. Se usó ARN purificado para amplificar los genes de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos (V) mediante la síntesis de ADNc a través de la transcripción inversa, seguida de una reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). El anticuerpo totalmente humano de cadena pesada gamma se obtuvo utilizando el kit de PCR de transcriptasa inversa de un solo paso Qiagen (Qiagen). Este kit se utilizó para generar la primera hebra de ADNc a partir de la plantilla de ARN y luego para amplificar la región variable de la cadena pesada gamma mediante PCR multiplex. El iniciador específico para la cadena gamma del 5 % se apareó con la secuencia de señal de la cadena pesada del anticuerpo, mientras que el iniciador del 3 % se apareó con una región del dominio constante de gamma. La cadena ligera kappa totalmente humana se obtuvo utilizando el kit Qiagen One Step Reverse Transcriptase PCR (Qiagen). Este kit se utilizó para generar la primera hebra de ADNc a partir de la plantilla de ARN y luego para amplificar la región variable de la cadena ligera kappa utilizando PCR multiplex. El cebador específico de la cadena ligera kappa del 5 % se unió a la secuencia de señal de la cadena ligera del anticuerpo, mientras que el cebador del 3 % se unió a una región del dominio constante kappa. La cadena ligera lambda completamente humana se obtuvo utilizando el kit de PCR de transcriptasa inversa de un solo paso de Qiagen. Este kit se utilizó para generar la primera hebra de ADNc a partir de la plantilla de ARN y luego para amplificar la región variable de la cadena ligera lambda mediante PCR multiplex. El iniciador específico de la cadena ligera lambda del 5 % se apareó con la secuencia de señal de la cadena ligera mientras que el iniciador del 3 % se apareó con una región del dominio constante de lambda.

[0181]El ADNc amplificado fue purificado enzimáticamente utilizando exonucleasa I y fosfatasa alcalina y el producto de PCR purificado fue secuenciado directamente. Las secuencias de aminoácidos se dedujeron a partir de las secuencias de ácidos nucleicos correspondientes de forma bioinformática. Se completaron dos ciclos adicionales e independientes de amplificación y secuenciación por RT-PCR para cada muestra de hibridoma con el fin de confirmar que cualquier mutación observada no fuera consecuencia de la PCR. Se proporcionan las secuencias de aminoácidos para las regiones variables de la cadena ligera y las CDR asociadas para anticuerpos ejemplares en la Tabla 1A, mientras que las secuencias de aminoácidos para las regiones variables de la cadena pesada y las CDR asociadas para los anticuerpos se proporcionan en la Tabla 1B. La Tabla 6 proporciona secuencias de ácidos nucleicos que codifican las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas de los anticuerpos ejemplares.

[0182]Las secuencias de aminoácidos derivadas para cada región variable de la cadena ligera y pesada fueron luego analizadas para determinar el origen de la secuencia germline de los anticuerpos y para identificar desviaciones de la secuencia germline. Se muestra una comparación de cada una de las secuencias de la región variable de la cadena ligera y la cadena pesada con sus secuencias germinales originales en las Figuras 2A-4B. La identidad de los genes de línea germinal se indica al lado de cada número de clon de anticuerpo. Las secuencias de aminoácidos correspondientes a las CDR de los anticuerpos secuenciados fueron alineadas y estos alineamientos se utilizaron para agrupar los clones por similitud.

Ejemplo 4. Análisis de agrupación de epítopos de anticuerpos agonistas anti-TREM2

[0183]Se determinaron los grupos de epítopos de un subconjunto de anticuerpos agonistas anti-TREM2 humano utilizando sensores anti-Fc humano (cinético) (18-5090) en un instrumento Octet® HTX (Pall ForteBio). Cada uno de los dieciséis diferentes anticuerpos anti-TREM2 producidos a partir de hibridomas fue cuantificado y cargado en uno de los sensores anti-Fc humano a 5 pg/mL durante 2 minutos (Cargar anticuerpo). El sensor fue luego bloqueado con 100 pg/mL de un anticuerpo IgG2 humano irrelevante durante 5 minutos. Se añadió una proteína humana TREM2 recombinante soluble (dominio extracelular humano TREM2 (aminoácidos 1-174) acoplado a una etiqueta Flag/His (TREM2 ECD-FlagHis humano)) al sensor a 4 pg/mL durante 5 minutos para permitir la unión de la proteína TREM2 soluble al anticuerpo de carga. A continuación, cada uno de los dieciséis diferentes anticuerpos anti-TREM2 (Anticuerpo de tipo sándwich) se añadió al sensor a 5 pg/mL y se permitió que se uniera durante 5 minutos. Todos los amortiguadores de ensayo contenían 10 mM de Tris (pH 7.6), 0,1 % de Tritón X-100, 150 mM de NaCl, 1 mM de CaCh y 1 mg/mL de BSA. La prueba se realizó a 25 °C. Los resultados cinéticos experimentales se ajustaron a un modelo de unión 1:1.

[0184]Si el anticuerpo de carga y el anticuerpo de sándwich se unen a un epítopo similar en el TREM2 humano, entonces la adición del anticuerpo de sándwich al sensor no producirá un evento de unión. Sin embargo, si la adición del anticuerpo sandwich produce un evento de unión, entonces el anticuerpo sandwich se une a un epítopo diferente en el TREM2 humano que el anticuerpo de carga y los dos anticuerpos se clasifican en diferentes contenedores de epítopos. La Figura 5 representa datos de unión de un sensor cargado con el anticuerpo 6E7 y expuesto ya sea al anticuerpo 5E3 o al anticuerpo 6E7 como el anticuerpo de sándwich. Como se esperaba, se observó un aumento en la unión con la adición de la proteína soluble humana TREM2, lo que indica que el anticuerpo 6E7 se unió específicamente a un epítopo en el TREM2 humano. No se observó una unión adicional cuando se añadió 6E7 como el anticuerpo de sándwich, ya que el anticuerpo 6E7 inmovilizado en el sensor ya estaba unido a este epítopo particular en el TREM2 humano. Sin embargo, cuando se añadió el anticuerpo 5E3 como anticuerpo de sándwich, se observó un aumento en la unión, lo que indica que el anticuerpo 5E3 se une a un epítopo diferente en el TREM2 humano que el anticuerpo 6E7.

[0185]Se muestra a continuación en la Tabla 9 un resumen de los datos de agrupación de epítopos para dieciséis anticuerpos diferentes contra TREM2. Basándose en los datos de unión, los anticuerpos podrían ser agrupados en cuatro compartimentos epitopales distintos. Los anticuerpos 10E3, 13E7, 24F4, 4C5, 4G10, 32E3 y 6E7 parecen compartir un epítopo similar (grupo A), que es diferente al epítopo unido por los anticuerpos 16B8, 26A10, 26C10, 26F2, 33B 12 y 5E3 (grupo B). Los anticuerpos 24A10 y 24G6 comparten un epítopo similar en el TREM2 humano (compartimento C), mientras que el anticuerpo 25F12 tiene un epítopo de unión distinto (compartimento D) en comparación con cualquiera de los otros anticuerpos probados.

Tabla 9. Resumen de análisis de agrupación de epítopos

Ejemplo 5. Determinación de la afinidad de unión de anticuerpos agonistas anti-TREM2

[0186]Para cuantificar la afinidad de unión de anticuerpos agonistas para TREM2 humano, se determinaron las constantes de velocidad de asociación y disociación, así como la constante de disociación de equilibrio utilizando sensores anti-Fc humano (cinéticos) en un instrumento Octet® HTX (Pall ForteBio). Los anticuerpos agonistas anti-TREM2 se prepararon en medio nulo DMEM, 250 pL a 10 pg/mL. Se añadieron 250 pL de buffer de ensayo (10 mM de Tris (pH 7,6), 0,1 % de Tritón X-100, 150 mM de NaCl, 1 mM de CaCh y 1 mg/mL de<b>S<a>) a las soluciones de anticuerpos para obtener un volumen final de 500 pL y una concentración final de anticuerpo de 5 pg/mL. El sensor anti-humano Fc fue preincubado en 200 pL del tampón de ensayo durante un mínimo de 10 minutos. El sensor fue luego regenerado durante 5 segundos en 10 mM de glicina a pH 1,5. Se cargaron anticuerpos agonistas anti-TREM2 de prueba en el sensor durante 2 minutos, y se tomaron medidas de línea base durante 2 minutos. El sensor cargado con anticuerpos se unió a la proteína recombinante soluble humana TREM2 (dominio extracelular de TREM2 humano (aminoácidos 1 a 174) acoplado a una etiqueta Flag/His (TREM2 ECD-FlagHis humano)) o a la proteína soluble recombinante del TREM2 de cínomolgo (dominio extracelular de TREM2 de cínomolgo acoplado a una etiqueta Flag/His) en una serie de dilución seriada de 2 veces comenzando en 100 nM con una serie de dilución de 6 puntos. Las proteínas recombinantes de TREM2 se permitieron asociar con el sensor cargado de anticuerpos durante 10 minutos, y luego se midió la disociación durante 10 minutos. El ensayo se llevó a cabo a 25 °C. Los resultados cinéticos experimentales se ajustaron globalmente a un modelo de unión 1:1 para determinar las constantes de velocidad de asociación y disociación, así como la constante de disociación en equilibrio. La Tabla 10 proporciona los resultados del ensayo para TREM2 humano para anticuerpos seleccionados y la Tabla 11 proporciona los resultados del ensayo para TREM2 de cynomolgus para anticuerpos seleccionados.

Tabla 10. Afinidad de unión para TREM2 humano

Tabla 11. Afinidad de unión para Cyno TREM2

Ejemplo 6. Actividad agonista de los anticuerpos anti-TREM2 en células THP1

[0187]Se evaluaron los anticuerpos anti-TREM2 seleccionados por su capacidad para activar la señalización humana de TREM2/DAP12 en células THP1. La línea celular THP-1 es una línea celular monocítica de leucemia humana, que se utiliza comúnmente como un modeloin vitrode la función de los monocitos y los macrófagos humanos (Chanput et al., International Immunopharmacology, Vol. 23: 37-45, 2014.

[0188]Las células THP1 en suspensión (1*10® células/mL) fueron diferenciadas mediante incubación en medio de crecimiento (RPMI, 10 % FBS (inactivado por calor), 1 % Glutamax, 1 % Hepes, 1 % Pen/Strep) que contenía 20 nM de acetato de forbol 12-miristato 13 (PMA) a 37 °C / 5 % CO2 durante 72 horas. Después de 72 horas de estimulación, las células se adhirieron a la superficie de los platos tratados para cultivo de tejidos. PMA fue suavemente lavado con PBS y reemplazado con un nuevo medio de cultivo fresco que contenía 10 ng/mL de IL-4. Las células fueron incubadas continuamente a 37 °C / 5 % de CO2 durante otras 72 horas. El día 6 (fin de la diferenciación celular), las células fueron recolectadas con un tampón de disociación celular no enzimático o eliminador de células y fueron sembradas en medio de crecimiento a 100.000 células por pozo en placas de 96 pocillos tratadas para cultivo de tejidos. Las células se incubaron durante la noche a 37 °C / 5 % CO2.

[0189]Al día siguiente, las células fueron tratadas con anticuerpos anti-TREM2 humanos durante 10 minutos a temperatura ambiente, y luego se retiró el medio. Las células fueron lisadas con 30 pl de buffer de lisis durante 45 a 60 minutos sobre hielo. El lisado celular (5 pL) fue transferido a placas de 384 pocillos para la determinación de los niveles de Syk fosforilado (pSyk) utilizando el ensayo AlphaLISA descrito en el Ejemplo 2. La CE50 para cada anticuerpo anti-TREM2 se determinó a partir de una curva dosis-respuesta mediante un modelo de ajuste logístico de cuatro parámetros de GraphPad Prism Versión 6,07.

[0190]Los resultados del experimento se muestran en la Figura 6 y en la Tabla 12. Todos los anticuerpos anti-TREM2 probados indujeron niveles de pSyk 86 en las células THP-1 diferenciadas de manera dosis-dependiente. Todas los anticuerpos anti-TREM2 produjeron una mayor activación de Syk que el mAB 17291 (RnD), un anticuerpo comercial de rata anti-humano/ratón (Rat IgG2b Clone No.237920, R&D Systems), con diez de los anticuerpos produciendo una activación máxima 2 veces mayor o superior al anticuerpo comercial. Los anticuerpos 10E3 y 13E7 mostraron los valores más altos de Emax, que eran aproximadamente 4,5 veces mayores que los del anticuerpo comercial.

Tabla 12. Activación de la señalización de TREM2/DAP12 en células THP-1 por medio de anticuerpos anti-TREM2

Ejemplo 7. Ingeniería de anticuerpos agonistas anti-TREM2

[0191]Un subconjunto de los anticuerpos anti-TREM2 fueron seleccionados para posteriormente ser modificados con el objetivo de mejorar las propiedades biofísicas, de expresión y/o estabilidad de los anticuerpos. Se analizaron las secuencias de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas de los anticuerpos 10E3, 13E7, 4C5, 6E7, 5E3 y 24G6 en busca de puntos críticos químicos potenciales (por ejemplo, isomerización de aspartato, deamidación de asparagina y oxidación de triptófano) y violaciones de covarianza. La corrección de violaciones de covarianza puede mejorar la estabilidad térmica, la expresión y las propiedades biofísicas de los anticuerpos (ver, por ejemplo, WO 2012/125495). Las tablas 13-18 a continuación resumen los resultados del análisis de secuencias para cada uno de los seis anticuerpos e identifican mutaciones específicas en posiciones particulares dentro de las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que pueden realizarse para mejorar la estabilidad, expresión y/o propiedades biofísicas de los anticuerpos. La región particular (por ejemplo, regiones del marco 1, 2, 3 o 4 (FR1, FR2, FR3 o FR4) o regiones determinantes de la complementariedad 1, 2 o 3 (CDR1, CDR2 o CDR3) dentro de la secuencia también se indican.

Tabla 13. Variantes diseñadas del anticuerpo 10E3

Tabla 14. Variantes ingenierizadas del anticuerpo 13E7

Tabla 15. Variantes ingenierizadas del anticuerpo 4C5

Tabla 16. Variantes modificadas del anticuerpo 6E7

Tabla 17. Variantes diseñadas del anticuerpo 5E3

Tabla 18. Variantes diseñadas del anticuerpo 24G6

Tabla 20. Secuencias de nucleótidos variables ejemplares de anticuerpos diseñados

(Continuación)

[0192]Seleccione anticuerpos anti-TREM2, que fueron aislados de hibridomas como anticuerpos IgG2 humanos, se convirtieron en anticuerpos IgG1 humanos o variantes aglicosiladas de anticuerpos IgG1 humanos (mutaciones N297G, R292C, V302C según la numeración de la UE) mediante la transferencia de las regiones variables de los anticuerpos a las regiones constantes de IgG1 humanas. Se evaluaron los anticuerpos del tipo IgG1 para la actividad agonista utilizando el ensayo de activación pSyk de AlphaLISA descrito en el Ejemplo 2. Sorprendentemente, la conversión de estos anticuerpos selectos de un isotipo IgG2 a un isotipo IgG1 resultó en una pérdida parcial de la actividad agonista (Figura 7).

[0193]La disposición única de los enlaces disulfuro en la región de bisagra de los anticuerpos de IgG2 se ha informado que confiere una actividad estimulante mejorada para ciertos anticuerpos anticancerígenos (White et al., Cancer Cell, Vol.

27: 138-148, 2015). Esta actividad mejorada podría transferirse a los anticuerpos de tipo IgG1 intercambiando las regiones CH1 y bisagra del anticuerpo IgG1 por las del anticuerpo IgG2 (White et al., 2015).

[0194]Para evaluar si la actividad agonista de los anticuerpos 24G6, 6E7 y 5E3 anti-TREM2 de tipo IgG2 podría ser mejorada o mantenida al convertirse en isotipos de IgG1, se crearon construcciones en las cuales las secuencias de la región variable de la cadena pesada de cada uno de los anticuerpos 24G6, 6E7 y 5E3 se insertaron en marcos de lectura con secuencias que codifican las regiones CH1 y bisagra de un anticuerpo humano de tipo IgG2 y secuencias que codifican la región Fc (regiones CH2 y CH3) de un anticuerpo humano de tipo IgG1 sin glicanos. La región Fc del anticuerpo IgG1 humano aglicosilado comprendía la secuencia de una región Fc de IgG1z humana con mutaciones N297G, R292c y V302C según la numeración de la UE (SEQ ID NO: 282).

[0195]Además de reemplazar las regiones CH1 y bisagra de los anticuerpos IgG1 con las de los anticuerpos IgG2, se realizaron mutaciones puntuales en residuos específicos dentro de las regiones de bisagra y CH1 para fijar los anticuerpos en una configuración particular de enlace disulfuro. Se ha informado que los enlaces disulfuro en las regiones de bisagra y CH1 de los anticuerpos IgG2 pueden reorganizarse para crear diferentes isoformas disulfuro estructurales (IgG2A, IgG2B y IgG2A-B) y estas diferentes isoformas disulfuro pueden tener diferentes niveles de actividad. Ver, por ejemplo, Dillon et al., J. Biol. Chem, Vol. 283: 16206-16215; Martinez et al., Biochemistry, Vol. 47: 16206-16215; Martínez et al., Biochemistry, Vol. 47: 7496-7508, 2008; y White et al., Cancer Cell, Vol. 27: 138-148, 2015. Para bloquear las modificaciones de bisagra en los anticuerpos IgG1 en una configuración de disulfuro IgG2B, se realizaron dos conjuntos de mutaciones puntuales: Una mutación C127S según la numeración de Kabat (C131S según la numeración de la UE) en la cadena pesada y una mutación C214S en la cadena ligera combinada con una mutación C233S en la cadena pesada, ambas según la numeración de Kabat (C214S y C220S según la numeración de la UE). Ver, por ejemplo, WO 2009/036209. Se espera que las versiones de IgG1 modificadas con bisagra IgG2 de los anticuerpos 6E7 y 5E3 que contienen las mutaciones puntuales adicionales muestren una actividad agonista equivalente o superior en el ensayo de activación de pSyk AlphaLISA en comparación con las moléculas parentales de IgG2.

Tabla 21. Secuencias de aminoácidos de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpos ejemplares

(Continuación)

(Continuación)

(Continuación)

Tabla 22. Secuencias de nucleótidos de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpos ejemplares

(Continuación)

(Continuación)

(Continuación)

(Continuación)

(Continuación)

(Continuación)

(Continuación)

(Continuación)

Ejemplo 8. Modulación de Afinidad de Agonistas de Anticuerpos Anti-TREM2

[0196]Para generar variantes de anticuerpos con mayor o menor afinidad por TREM2 humano, se realizó la modulación de afinidad del anticuerpo monoclonal agonista anti-TREM2 6E7 utilizando la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) de bibliotecas de Fab mostradas en levadura. Se utilizó una estrategia de construcción de biblioteca imparcial, donde se completó la mutagénesis de saturación NNK para cada residuo de aminoácido de cada CDR de la cadena ligera y pesada para generar mutaciones puntuales. Se generó una biblioteca Fab separada para cada CDR. Las seis bibliotecas de fragmentos Fab presentadas en levaduras fueron separadamente clasificadas y cribadas en busca de variantes con una mayor y una menor unión al TREM2 humano utilizando FACS. Se construyeron, clasificaron y cribaron bibliotecas secundarias que combinaron mutaciones enriquecidas mediante CDR y reorganización de cadenas. Los datos de cribado por citometría de flujo para las variantes 6E7 se muestran en la Tabla 19 a continuación. Las posiciones de los aminoácidos de las mutaciones puntuales en las regiones indicadas de las regiones variables de cadena pesada y ligera 6E7 están numeradas con respecto a la secuencia de la región variable de cadena pesada 6E7 (SEQ ID NO: 124) y la secuencia de la región variable de la cadena ligera 6E7 (SEQ ID NO: 61). Veintidós variantes fueron seleccionadas para una evaluación y caracterización adicional. Se proporcionan las secuencias completas de la región variable de las cadenas pesadas y ligeras y los CDR asociados para algunas variantes seleccionadas que presentan una mayor afinidad de unión en comparación con el anticuerpo 6E7 en las Tablas 2A y 2B, mientras que las secuencias completas de la región variable de las cadenas pesadas y ligeras y los CDR asociados para algunas variantes seleccionadas que presentan una menor afinidad de unión en comparación con el anticuerpo 6E7 se proporcionan en las Tablas 3A y 3B.

Tabla 23. Variantes de Modulación de la Afinidad del Anticuerpo 6E7

(Continuación)

(Continuación)

(Continuación)

Ejemplo 9. Rescate del defecto de supervivencia de macrófagos y microglía por el anticuerpo agonista anti-TREM2

[0197]La variante R47H de TREM2 humano ha sido asociada con un mayor riesgo de enfermedad de Alzheimer de inicio tardío (Jonsson et al., New England Journal of Medicine, Vol. 368: 107-116, 2013). Para apuntar específicamente al genTrem2sin perturbar elementos reguladores adicionales, se utilizó un enfoque basado en la edición génica para generar ratonesTrem2-/-oTREM2R47H.La cepaTrem2-/-fue generada mediante la ingeniería de una deleción de 5 pb o 11 pb en el exón 1 del gen Trem2 y la cepa TREM2R47H se generó mediante la ingeniería de una mutación puntual en el residuo 47 del gen Trem2 del ratón, análoga a la variante humana. Los análisis detallados de qPCR de homogeneizados cerebrales de ratonesTrem2-/-yTREM2R47Hconfirmaron una pérdida del gen en los ratones knockout y una expresión de Trem2 comparable a los controles de edad salvaje para los ratonesTREM2R47H(datos no mostrados). No se observaron diferencias significativas en otros genesTREMen el locus(Tremí, TremLI,yTremL2)en condiciones basales o estimuladas con LPS en ratonesTrem2-/-oTREM2R47Hde tipo salvaje (datos no mostrados).

[0198]Para entender el efecto de los cambios en TREM2 en las células mieloides, se compararon las propiedades de los macrófagos derivados de médula ósea (BMDMs) de TREM2-/- y las microglías adultas y neonatales con los macrófagos y microglías silvestres en condiciones limitadas de CSF-1. Coherente con estudios recientes sobre microglía y macrófagos TREM2-/- que sufren una deficiencia de supervivencia a niveles bajos de CSF-1 (Wang et al., Cell, Vol. 160; 1061-1071, 2015; Wu et al., Journal of Experimental Medicine, Vol. 212: 681-697, 2015), también se observó una supervivencia reducida de los BMDMs y la microglía aislados de nuestros ratones TREM27', lo que confirma que presentan un comportamiento dependiente de TREM2, como se ha reportado en otros modelos TREM27' (Figuras 8A-8C). Para determinar si la mutación R47H también afecta la capacidad de las células mieloides para sobrevivir bajo condiciones de desafío, se realizaron estudios similares en BMDMs y microglía TREM2R47H En el estudio de Lui et al. (2015), se observó una reducción en la supervivencia de los BMDM y microglía aislados de nuestros ratones TREM27', confirmando que muestran un comportamiento dependiente de TREM2 como se ha informado en otros modelos TREM27' (Figuras 8A-8C). Para determinar si la mutación R47H también afecta la capacidad de las células mieloides para sobrevivir en condiciones desafiantes, se realizaron estudios similares en BMDM y microglía TREM2R47H Curiosamente, los BMDM y microglía TREM2R47H también mostraron una menor supervivencia en condiciones de cultivo similares, al igual que los BMDM y microglía TREM27' (Figura 8D-8F). Sin embargo, los defectos de supervivencia de los BMDM y microglía TREM2R47H eran menos pronunciados que los defectos de supervivencia de los BMDM y microglía TREM2'/_. Efectos dependientes de la dosis génica sobre la supervivencia de células mieloides tanto TREM2R47H como TREM27', también fueron observados, siendo los efectos mucho más pronunciados en las células knockout en comparación con las células variantes (datos no mostrados). Mientras que el fenotipo de los macrófagos TREM2R47H sigue la misma tendencia que los macrófagos TREM27', los fenotipos no pueden explicarse simplemente por una reducción en la expresión de TREM2 R47H en la superficie celular, ya que los BMDM de tipo salvaje y TREM2R47H parecían tener niveles comparables de expresión de TREM2 en la superficie (datos no mostrados). En general, los resultados de estos experimentos respaldan una pérdida de función para la variante R47H que imita una pérdida de la proteína TREM2, aunque con un fenotipo menos pronunciado en comparación con la eliminación genética.

[0199]A continuación, la activación de TREM2 fue evaluada en BMDM TREM2R47H Un anticuerpo anti-TREM2 humano/ratón comercialmente disponible para ratones (mAb17291; Rat IgG2b Clone N.° 237920, de R&D Systems) aumentó los niveles de pSyk tanto en BMDMs R47H como en BMDMs de tipo silvestre, según se midió por transferencia Western, con el efecto siendo más pronunciado en los BMDMs de tipo silvestre (Figura 9A). Los anticuerpos no tuvieron efecto en los macrófagos TREM27' que apoyan la activación específica de TREM2 (Figura 9B). Para determinar si la activación de la señalización de Syk mediada por TREM2/DAP12 en los macrófagos puede mejorar los fenotipos biológicos más corriente abajo, incluida la reducción de la supervivencia, los BMDMs TREM2R47H fueron tratados con el anticuerpo agonista anti-TREM2 (anticuerpo mAb17291) o un control de isotipo, y la confluencia celular fue monitoreada utilizando el Sistema de Imágenes Incucyte Xoom. Notablemente, se observó un rescate en la supervivencia celular de los BMDM con TREM2R47H cuando los macrófagos fueron tratados con el anticuerpo agonista anti-TREM2, con casi una restauración completa a niveles de tipo salvaje (Figuras 10A-10C). El aumento significativo en la supervivencia celular se observó tanto en la imágenes en tiempo real (Figuras 10A y 10B) como en los ensayos de viabilidad celular final (acumulación de ATP) (Figura 10C). Un rescate equivalente en la supervivencia celular no se observó cuando los BMDMs fueron tratados con anticuerpos de control de isotipo (Figuras 10A-10C). No se observó un aumento en la supervivencia de los macrófagos homocigotos knockout de TREM2, confirmando que el efecto es específico para la activación de TREM2 por el anticuerpo (datos no mostrados). Un rescate similar de la supervivencia celular se observó en microglía adulta TREM2R47H cuando se trataron con el mismo anticuerpo agonista anti-TREM2, mientras que no se observó un rescate equivalente en la supervivencia celular cuando la microglía se trató con un anticuerpo control de isotipo (Figura 10D).

[0200]Además, un anticuerpo antagonista de TREM2 (Anticuerpo 2) que activó la señalización de Syk pero no compitió con el anticuerpo comercial, aumentó la supervivencia de los macrófagos cosechados de animales de edad avanzada (18 meses de edad) de tipo salvaje y R47H (Figuras 10E y 10F), mientras que no se observó un rescate equivalente en la supervivencia celular cuando las microglías fueron tratadas con un anticuerpo de control isotipo (Figuras 10E y 10F).

[0201]Para evaluar el efecto del tratamiento con anticuerpos agonistas anti-TREM2 en la migración de células mieloides de tipo salvaje, con knockout de TREM2 y con TREM2R47H, se evaluaron macrófagos derivados de médula ósea aislados de ratones de cada uno de los diferentes genotipos en un ensayo de migración. El día 5, se cosecharon BMDMs de ratones TREM2+/+, TREM2R47H y TREM27' y se sembraron en placas de ensayo de migración de 96 pocillos Radius™ (Cell Biolabs) en medio RPMI completo suplementado con 50 ng/ml de M-CSF. Las células fueron tratadas con un anticuerpo agonista anti-TREM2 (Anticuerpo 1 o Anticuerpo 2), un anticuerpo control de isotipo, o el vehículo durante 24 horas. Las células fueron lavadas al día siguiente siguiendo el protocolo del fabricante para eliminar la capa de Gel Biocompatible y exponer el área libre de células para la migración. Los medios de cultivo fueron reemplazados por medios de crecimiento frescos suplementados con 50 ng/ml de M-CSF y anticuerpo agonista anti-TREM2, anticuerpo de control de isotipo o control de vehículo como se mencionó anteriormente. La confluencia celular fue monitoreada utilizando el Sistema de Imágenes Incucyte Zoom y los datos fueron representados como porcentaje de confluencia. Curiosamente, el tratamiento con el Anticuerpo 1 resultó en una reducción pequeña pero estadísticamente significativa en la proliferación/migración de los macrófagos TREM2R47H (Figura 11B) con efectos mínimos en los macrófagos de tipo salvaje (TREM2+/+) (Figura 11A) y sin efecto en los macrófagos de los ratones knockout (TREM2-/-) (Figura 11C). El tratamiento con el Anticuerpo 2 no tuvo efecto en la migración en los macrófagos de tipo salvaje (TREM2+/+) o TREM2R47H (Figuras 11D y 11E).

[0202]A nivel molecular, esta reducción en la migración de macrófagos se reflejó en una reducción en la superficie celular de FLT1 en macrófagos TREM2R47H y de tipo salvaje tras el tratamiento con un anticuerpo agonista anti-TREM2 (tanto con como sin tratamiento con lipopolisacáridos), mientras que no se observaron diferencias significativas en otros quimioquinas/receptores de quimiocinas (por ejemplo, CCR5) en los puntos temporales seleccionados para el estudio (datos no mostrados). La correlación consistente entre la migración y FLT1 tanto a través de diferentes genotipos como con la manipulación farmacológica con un anticuerpo apunta a una emocionante nueva conexión entre TREM2 y FLT1 que requerirá una investigación adicional. Igualmente interesante es la observación de que un anticuerpo que activa la señalización de TREM2/DAP12 de manera proximal puede tener efectos opuestos en la supervivencia y migración; diferentes anticuerpos (dependiendo de dónde se unan y cómo interactúen con los ligandos endógenos) probablemente tendrán perfiles de actividad proximal y distal diferentes.

[0203]Los resultados de estos experimentos demuestran que un anticuerpo que puede activar la señalización de TREM2/DAP12 puede rescatar el defecto de viabilidad de los macrófagos y microglía resultante de una mutación de pérdida de función en TREM2. Los resultados sugieren que un anticuerpo agonista que pueda activar TREM2 y potenciar la actividad de los macrófagos/microglía podría ser terapéutico en la enfermedad de Alzheimer y otras condiciones asociadas con la pérdida de función de TREM2.

Ejemplo 10. Regulación génica por el anticuerpo agonista anti-TREM2 en macrófagos

[0204]Con el fin de comprender las bases de los cambios fenotípicos de los macrófagos derivados de ratones TREM2-/- y<t>R<e>M2R47H descritos en el Ejemplo 9 a nivel del transcriptoma, se realizaron análisis de RNA-Seq comparando los macrófagos de tipo salvaje, TREM2-/- y TREM2R47H en el día 7 bajo condiciones limitantes de CSF-1. El día 7 se recolectaron los BMDMs y se aisló el ARN total utilizando el kit RNeasy Mini (Qiagen) siguiendo el protocolo del fabricante.

[0205]Se usaron 1-2 |jg de ARN total purificado de macrófagosex vivoderivados de médula ósea para la preparación de una biblioteca de ADNc utilizando un protocolo modificado basado en el kit de preparación de muestras de ARN Truseq de Illumina (Illumina, San Diego, CA) y los métodos publicados para la secuenciación de ARN específica de hebra (Perkins, T. T. et al., PLoS genetics, Vol. 5: e1000569, 2009; Parkhomchuk, D. et al.). Investigación de ácidos nucleicos, Vol. 37: e123, 2009. Después de la selección de poli-A, fragmentación y cebado, se realizó la transcripción inversa para la síntesis de ADNc de la primera hebra en presencia de RNaseOut (Life Technologies, Carlsbad, CA) y actinomicina-D (MP Biomedicals, Santa Ana, CA). El ADNc sintetizado fue posteriormente purificado utilizando cuentas de AMPure RNAClean (Beckman Coulter, Pasadena, CA) siguiendo las instrucciones comerciales. Un método modificado mediante la incorporación de dUTP en lugar de dTTP fue preparado y utilizado para la síntesis de la segunda hebra (Perkins et al., PLoS genetics, Vol. 5, e1000569, 2009; Parkhomchuk et al., Nucleic Acids Research, Vol. 37, e123, 2009). Después de la purificación de las cuentas con AMPure XP (Beckman Coulter), siguiendo el protocolo estándar recomendado por Illumina, se realizaron de forma secuencial la reparación de extremos, la adición de colas A y la ligación de adaptadores de índice para la generación de bibliotecas de ADNc. Después de la selección de tamaños de las bibliotecas usando Pippen Prep (SAGE Biosciences, Beverly, MA), las hebras de ADNc que contienen dUTP fueron destruidas mediante la digestión de enzimas USER (New England Biolabs, Ipswich, MA), seguido por un paso de enriquecimiento de PCR para introducir especificidad de hebra. Después de la limpieza, las bibliotecas de ADNc enriquecido fueron analizadas en el Bioanalizador de Agilent y cuantificadas mediante ensayos de Pico-Green QuantiT™ (Life Technologies) antes de ser secuenciadas en la plataforma Illumina HiSeq. Cada biblioteca generó al menos 35 millones de lecturas de 75pb en pares para análisis posterior.

[0206]Los fragmentos de secuenciación de RNA-seq fueron alineados utilizando el alineador OSA (Hu et al., Bioinformatics, Vol. 28: 1933-1934, 2012) incrustado en el flujo de trabajo del Omicsoft ArrayStudio (Omicsoft Inc., EE. UU.). Se utilizó la versión GRCm38 del genoma de ratón y la anotación de genes de UCSC en el alineamiento y cuantificación. La cuantificación se realizó a nivel de gen y de transcripción basada en RSEM (Li et al., BMC Bioinformatics, Vol. 12). 323, 2011). El nivel de expresión génica normalizado se calculó por fragmentos por kilobase por millón de lecturas (FPKM), luego se normalizó por cuantiles al percentil 70 a 10 (FPKQ). Solo se utilizaron los genes con al menos una muestra expresada en FPKQ > 1 en el siguiente análisis estadístico. Los recuentos de lecturas crudas de los genes seleccionados fueron comparados utilizando el paquete DESeq2 de R Bioconductor siguiendo la distribución Binomial Negativa (Love et al., Genome Biology, Vol. 15). 550, 2014). Los genes con valor corregido de p BH <0,05 y cambio de múltiplos >1,5 o < 2/3 fueron seleccionados como genes diferencialmente expresados de manera significativa. El análisis de vías se realizó utilizando el Análisis de Vías Ingenuity (IPA, QIAGEN Redwood City, EE. UU.).

[0207]Consistente con la gradación en la severidad de los fenotipos observados en los macrófagos TREM27', Tr EM2R47H y salvajes, se observaron tendencias similares en los transcritos diferencialmente regulados, con la magnitud del efecto siendo mayor en los macrófagos TREM2-/- y los macrófagos TREM2R47H ubicándose entre los macrófagos salvajes y los macrófagos TREM2-/-. Esta regulación diferencial fue confirmada para un subconjunto de los genes en un experimento independiente mediante qPCR (Figuras 12A-12D). Los análisis de vías señalan un papel de TREM2 en el ciclo celular, la supervivencia celular, la proliferación celular y la migración, con una interacción cruzada presumiblemente entre la vía del complemento, la homeostasis lipídica y las quimioquinas/receptores y factores migratorios (datos no mostrados).

[0208]Las diferencias en la regulación de los transcritos a lo largo del tiempo fueron confirmadas por qPCR para varios genes, incluyendo algunos factores genéticos conocidos vinculados a la Enfermedad de Alzheimer, como ApoE (Figuras 13A y 13B), citocinas proinflamatorias como Il-1a (Figuras 13C y 13D), y una serie de quimiocinas/receptores de quimiocinas incluyendo Cx3cr1 (Figuras 13E y 13F), Ccl5 (Figuras 13K y 13L), Ccl22 (Figuras 13M y 13N), Ccr5, Ccr2, y Ccl3, así como genes del complemento incluyendo C1qa (Figuras 13I y 13J) y C3 (Figuras 13O y 13P). En cada caso, el efecto fue significativamente más pronunciado en los macrófagos TREM2-/- en comparación con los macrófagos TREM2R47H Por primera vez, se observó una conexión entre TREM2 y el receptor proangiogénico, Vegfr1 (Flt1), con una reducción de Flt1 en macrófagos TREM2-/- y TREM2R47H (Figuras 13G y 13H). Además, se observó un aumento en VEGF-a tanto en los macrófagos TREM2-/- como en los macrófagos TREM2R47H, lo que es consistente con la falta de receptor disponible para la unión (datos no mostrados). La reducción en múltiples factores migratorios resulta en una migración/movilidad reducida de los macrófagos TREM2-/- y TREM2R47H (Figuras 14A y 14B). Estudios recientes han informado de una reducción en el número/migración de microglías en regiones circundantes a placas y células apoptóticas en ratones knockout de TREM2 (Mazaheri et al., EMBO reports, e201743922, 2017; Wang et al., Cell, Vol. 160: 1061 1071, 2015).

[0209]De acuerdo con los datos de secuenciación de ARN, también se observó una reducción en la quimiocina MCP-1/CCL2 secretada por los macrófagos TREM2-/- y TREM2R47H (Figura 15A). La secreción reducida de MCP-1/CCL2 por los macrófagos TREM2R47H en condiciones de desafío podría restaurarse con el tratamiento con un anticuerpo agonista anti-TREM2 (anticuerpo mAb17291) (Figura 15B). La capacidad del anticuerpo agonista anti-TREM2 para aumentar MCP-1/CCL2 junto con mejorar la supervivencia de los mieloides (Ejemplo 9) es destacable y apunta a una mejora general en diferentes aspectos del funcionamiento de las células mieloides con el tratamiento con anticuerpos agonistas. Además, cuando se trataron los macrófagos TREM2R47H con oligómeros de Abeta, se observó un aumento en MCP-1/CCL2 que se potenció aún más con el tratamiento de un anticuerpo agonista anti-TREM2 (datos no mostrados).

[0210]Tratamiento con anticuerpos agonistas anti-TREM2 de macrófagos TREM2R47H también moduló la expresión génica en una dirección opuesta al efecto del genotipo e incluyó genes implicados en la regulación de la migración, proliferación, ciclo celular y supervivencia de las células mieloides (Figuras 16A y 16B). Los análisis de vías de los genes regulados de manera diferencial revelan un papel potencial para TREM2 en la modulación de diferentes aspectos de la biología de las células mieloides en condiciones de desafío, incluida la replicación del ADN, la regulación del ciclo celular, la proliferación, la muerte celular y la modulación de las quimiocinas/citoquinas. En el contexto de la etiología de la enfermedad de Alzheimer, estos datos transgénicos respaldan la hipótesis de que un déficit en TREM2, ya sea en forma de una variante de pérdida de función o una expresión reducida en la superficie celular, contribuye a un déficit fundamental en la proliferación/sobrevivencia que resulta en la subsiguiente incapacidad para funcionar eficientemente en cuanto a la fagocitosis de placas/células apoptóticas, la modulación de citoquinas o potencialmente una nueva función de barrera. Además, el efecto directo en la reducción de la secreción de quimiocinas migratorias como CCL2 y CCR2 también probablemente reduce la capacidad de los macrófagos/microglía para migrar eficientemente hacia células apoptóticas y placas, lo que puede contribuir aún más a un aumento de la carga de placas al inicio del curso de la enfermedad. La capacidad de un anticuerpo que potencia la señalización proximal para también rescatar el defecto de viabilidad y restaurar los niveles de quimiocinas demuestra elegantemente la correlación entre el funcionamiento proximal y la biología más distal, y respalda firmemente una estrategia de anticuerpos terapéuticos que potencialmente pueden potenciar la actividad de los macrófagos/microglía y ser beneficiosos en enfermedades.

Ejemplo 11. Eficacia del anticuerpo agonista anti-TREM2 en el modelo EAE de esclerosis múltiple

[0211]La eficacia de los anticuerpos agonistas anti-TREM2 descritos aquí en la mejora de los síntomas y/o progresión de la enfermedad de la esclerosis múltiple se evalúa en el modelo de encefalitis autoinmune experimental (EAE) de la esclerosis múltiple. EAE se induce en animales mediante la glicoproteína de mielina oligodendrocítica (MOG) y la toxina de pertussis como se describe anteriormente en Feinstein et al., Ann. Neurol., Vol. 51: 694-702, 2002. Brevemente, grupos de ratones hembra TREM2 de tipo salvaje (cepa C57BL/6) de 7 a 9 semanas de edad, TREM27' y TREM2R47H son inyectados subcutáneamente con 100 pg de péptido MOG 35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK (SEC ID NO: 283)) emulsionado en adyuvante completo de Freund que contiene 4 mg/mL deMycobacterium tuberculosisH37RA. La toxina de la tos ferina se inyecta intraperitonealmente a 200 ng/ratón en 200 pL de suero fisiológico el día 0 y el día 2. Los anticuerpos anti-TREM2 (30 mg/kg y 100 mg/kg) se administran en los días 0, 7 y 14 para determinar el efecto del tratamiento con anticuerpos en diferentes momentos de la progresión de la enfermedad. Se miden múltiples citoquinas y puntos finales de inflamación, incluidos TREM2 soluble, MCP-1/2, MIP1a y b, CCL2, CCR2 y otras quimiocinas/citoquinas en la periferia, el SNC y el LCR para evaluar el efecto de los anticuerpos anti-TREM2. Además, la afectación neurológica de los animales se evalúa mediante puntuación clínica de la siguiente manera: 0, sin signos clínicos de EAE; 1, cola caída; 2, cola flácida y marcha anormal (ataxia y/o paresia de las extremidades traseras); 3, paresia severa de las extremidades traseras; 4, parálisis completa del cuerpo trasero; y 5, moribundo o muerte.

Ejemplo 12. La eficacia del anticuerpo agonista anti-TREM2 en modelos animales de peritonitis y sepsis

[0212]El efecto de los anticuerpos agonistas anti-TREM2 descritos aquí en la modulación de la respuesta inflamatoria aguda se evalúa en modelos animales de peritonitis y sepsis. Zymosan, un componente de la pared celular de polisacáridos derivado deSaccharomyces cerevisiae,se puede inyectar en la cavidad peritoneal de animales para reproducir la respuesta inflamatoria asociada con la peritonitis (ver Cash et al., Methods in Enzymology, Vol. 461: 379 396, 2009). Se administra zymosan (1 mg/kg) por vía intraperitoneal de manera simultánea o 24 horas después de la administración de anticuerpos anti-TREM2 (20 mg/kg), anticuerpo control de isotipo o vehículo. Se recogen plasma, LCR, SNC y fluido de lavado peritoneal y macrófagos 4 y 24 horas después del tratamiento. Se miden múltiples citocinas y puntos finales de inflamación, incluida una evaluación cuantitativa de diferentes tipos de células mieloides, así como TREM2 soluble, MCP-1/2, MIP1a y b, CCL2, CCR2 y quimiocinas/citocinas adicionales en la periferia, el SNC y el LCR para evaluar el efecto de los anticuerpos anti-TREM2 en la respuesta inflamatoria.

[0213]En una serie separada de experimentos, se evalúa el efecto de los anticuerpos agonistas anti-TREM2 en un modelo de sepsis bacteriana gramnegativa con lipopolisacáridos (LPS). Se administra LPS (1 mg/kg) por vía intraperitoneal 24 horas después de la administración de anticuerpos anti-TREM2 (20 mg/kg), anticuerpo control de isotipo 0 vehículo. Se recogen muestras de plasma, LCR y del SNC 4 y 24 horas después del tratamiento. Se miden múltiples citocinas y puntos finales de inflamación, incluida una evaluación cuantitativa de diferentes tipos de células mieloides, así como T<r>EM2 soluble, MCP-1/2, MIP1a y b, CCL2, CCR2 y otras quimiocinas/citocinas adicionales en la periferia, SNC y LCR para evaluar el efecto de los anticuerpos anti-TREM2 en la respuesta inflamatoria.

Ejemplo 13. Mapeo de epítopos de anticuerpos anti-TREM2

Método de inmunotransferencia para mapeo de epítopos de anticuerpos anti-TREM2

[0214]Los péptidos PepSpot (JPT Peptide Technologies) para Trem2 soluble humano fueron diseñados para cubrir todo el dominio extracelular (comenzando en la histidina 21), generando 74 péptidos lineales de 10-mer, incluyendo 6 péptidos de control adicionales, para un total de 80 pepspots por membrana de celulosa. Las secuencias de péptidos de 10 mer fueron seleccionadas caminando a lo largo de la proteína por 2 aminoácidos, lo que resultó en una superposición de 8 aminoácidos. Las membranas fueron lavadas con 40 ml de metanol al 100 % a temperatura ambiente durante 10 minutos con agitación suave, seguido inmediatamente por 3 lavados de 40 ml de TBST (TBS 0,05 % Tween 20) durante 10 minutos cada uno. Las membranas fueron bloqueadas con tampón de bloqueo LICOR sin diluir (Odyssey® Blocking Buffer 927-40000) durante toda la noche a temperatura ambiente con agitación suave e incubadas con 1 pg/ml 24G6 (PL-52705, Fecha de lote 2.24.2017, [hu anti-<huTrem2> 21-191_24G6 VK4 (1-242) VL]::huKLC-CL [hu anti-<huTrem2> 21-191_24G6 VH3 (1-471) VH]::huIgG1zSEFL2-2 (anticuerpo monoclonal), iPS:536553, SS-28346) durante toda la noche a 4oC con agitación suave en tampón de bloqueo Licor que contiene 1 % Tween 20. Al día siguiente, los blots fueron lavados 4 veces con Buffer TBST (Tris Buffered Saline 0,05 % Tween 20) durante 15 minutos cada uno y se sondaron con un anticuerpo secundario (Licor cat No. 925-32232 IRDye® 800CW Goat anti-human LotNo. C70419-05) a una dilución de 1:20.000 en buffer de bloqueo Licor con 1 % Tween 20 y 0,1 % SDS. Las manchas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave, protegidas de la luz, seguido por otros 4 lavados en TBST y se secaron durante 1 hora a temperatura ambiente. La transferencia Western fue escaneada en el canal 800 utilizando el generador de imágenes de fluorescencia infrarroja Licor Odyssey.

Método MSD para el mapeo de epítopos de anticuerpos anti-TREM2

[0215]Los péptidos (secuencias diseñadas como se describe anteriormente) se sintetizaron con biotina en el N-terminus (Sigma) hacia Trem2 soluble humano y se normalizaron a 20 mg/ml en 100 % DMSO. Las placas SECTOR MSD GOLD de 96 pocillos de pequeño tamaño con Streptavidina (MSDNo.L45SA) fueron recubiertas con los péptidos biotinilados a 5 pg/ml en 2X PBS (ca/-mg) pH 7,8-7,9 en un volumen total de 50 pl por pocillo y se permitió incubar a temperatura ambiente durante 2 horas con agitación suave. Las placas fueron lavadas 3 veces con tampón TBST (solución salina tamponada con Tris al 2 % y 0,05 % de Tween-20, pH 7.2), 150 pl por pocillo, utilizando un lavador de placas automático. Anticuerpo monoclonal 24G6.1 (N.° de lote PL-51585, fecha 12/9/2016, hu anti-<huTrem2> IgG2) fue marcado con etiqueta m Sd sulfo según el procedimiento operativo estándar del fabricante para servir como reactivo de detección y se agregó a 1 pg/ml en Diluyente MSD 100 (N.° de ref. R50AA-3), en un volumen total de 25 pl por pocillo. Las placas se permitieron incubar durante 1 hora a temperatura ambiente, con agitación suave, luego se lavaron 3 veces con buffer TBST (solución salina tamponada con Tris 0,05 % Tween-20, pH 7.2), 150 pl por pocillo, utilizando un lavador de placas automatizado, volteándolas y lavándolas adicionalmente 3 veces. MSD Read Buffer T surfactant 4x stock (No.R92TC-3) se preparó diluyendo a 1X con H2O y agregando 150 pl de volumen total por pocillo. Las placas fueron leídas inmediatamente en el lector MSD Sector 6000.

Resultados

[0216]Se encontró que el anticuerpo 24G6 se une a los siguientes péptidos (HRDAGDLWFP (SEQ ID NO: 360), AGDLWFPGE (SEQ ID NO: 361) y GDLWFPGESE (SEQ ID NO: 362)). Esta información proporcionada demostró que 24G6 reconoció el siguiente péptido (HRDAGDLWFPGESE (SEQ ID No : 363)) en TREM2. Análisis de alanina de un péptido ligeramente más largo PLDHRDAGDLWFPGESE (SEQ ID NO: 364) también se llevó a cabo para identificar los sitios clave de contacto. Se encontró que 24G6 mostraba poco o ningún enlace a dos péptidos de exploración de alanina (PLDHRDAGDAWFPGESE (SEQ ID NO: 365); PLDHRDAGDLWAPGESE (SEQ ID NO: 366) (aminoácidos subrayados)), sugiriendo que esos contactos eran clave para su reconocimiento de este péptido. Esta obra ayudó a definir el péptido mínimo para el reconocimiento de TREM2 humano por este anticuerpo como<g>D<l>WFP (SEQ ID NO: 367). Este anticuerpo también demostró una menor afinidad por TREM2 de cynomolgus. Se observaron datos similares para péptidos que contenían la secuencia correspondiente de TREM2 del macaco cangrejero. Para los otros anticuerpos anti-TREM2 (6E7, 5E3 y 13E7), no se identificaron péptidos específicos que ayudaran a dilucidar un epítopo peptídico utilizando el método descrito.

Ejemplo 14. Modulación periférica de anticuerpos agonistas anti-TREM2 en células microgliales

[0217]Con el fin de comprender los efectos del tratamiento farmacológico en el transcriptoma global, se realizaron estudios de ARN-Seq en células Cd11b residentes del SNC aisladas de ratones WT y TREM2 R47H dosificados con la versión sin efector de uno de nuestros anticuerpos agonistas TREM2. Se utilizaron ratones macho B6 TREM2+/+, TREM2-/- y TREM2R47H (de 60-67 días de edad) para estudios de ARN de células individuales. El tratamiento con anticuerpos, ya sea con el anticuerpo anti-murino TREM2 estable sin función efectora (SEFL) o el control isotipo anti-humanoHer, se administró por vía intravenosa a una dosis de 30 mg/kg en 5 ml/kg. En el modelo de inflamación aguda, los animales tratados con anticuerpos recibieron LPS (fuente) por vía intraperitoneal 16 horas después del tratamiento con anticuerpos a 5 mg/kg en 5 ml/kg y fueron estimulados con LPS durante 4 horas. El anticuerpo de control de isotipo en controles de hermanos de camada emparejados por genotipo, edad y sexo se administró simultáneamente.

[0218]Se extrajeron cerebros de ratones tratados tras la asfixia por CO2 y los tejidos se disociaron utilizando el kit de disociación cerebral para adultos de Miltenyi para ratones y ratas (Miltenyi Biotec 130-107-677) siguiendo los protocolos estándar del fabricante. Las células CD11b fueron enriquecidas positivamente utilizando microesferas (Miltenyi Biotec 130-049-601), lavadas dos veces en PBS frío recién preparado 0,04% BSA y resuspendidas en PBS frío recién preparado 0,04 % BSA a una concentración de 500-1000 células/pl con una viabilidad superior al 70 %. Los cerebros fueron recolectados y las microglías fueron aisladas utilizando el kit de aislamiento de Cd11b de Miltenyi, previamente publicado. Las bibliotecas de NGS fueron preparadas según lo descrito en las directrices de los fabricantes de 10x Chromium. La transcripción inversa, la amplificación total de ADNc y la construcción de la biblioteca se realizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante. La secuenciación de ARN de célula única se realizó utilizando el kit Chromium Single Cell 3' con química V2 (10x Genomics). Las células CD11b+ enriquecidas fueron cargadas y encapsuladas en el Chromium Single Cell Chip A (10x Genomics) para lograr una recuperación celular de 5.000 células por muestra. Una profundidad de lectura de secuenciación de más de 2x del estudio de Keren-Shaul et al., con aproximadamente 2095 genes identificados por célula y xUMIs por célula se logró. Se aplicó el embebido estocástico vecino t-distribuido (t-SNE) para visualizar perfiles de expresión génica de células individuales y las células se agruparon en tipos celulares utilizando el agrupamiento por dbscan.

[0219]Se identificaron un total de once poblaciones distintas. El clúster más dominante de células fueron, como se esperaba, microglía, definidas por una firma génica de Trem2+, Tmem119+, P2ry12+, Hexb+, Lyz2-, con las células microgliales representando el 60 % del número total de células analizadas en todos los grupos de tratamiento y genotipos. Se identificaron también pequeñas poblaciones residuales de células endoteliales, astrocitos, células NK y oligodendrocitos que persistieron después del enriquecimiento magnético. Los grupos dominantes de microglía se separaron claramente en dos grupos según el tratamiento con LPS: un grupo de microglía más homeostática y un grupo de microglía activada. Dentro del estado activado por LPS, se observaron los efectos más sutiles de las diferencias genotípicas (WT vs. R47H) y el tratamiento con anticuerpos en ambos grupos WT y R47H. Estos patrones persistieron incluso al examinar únicamente los grupos de microglía. Además, también se observaron grupos más pequeños de células mieloides que tenían las características de los genes microgliales 120, así como marcadores clásicos de infiltración.

[0220]Un análisis cuidadoso del tratamiento con anticuerpos en los cúmulos de microglía reveló que el tratamiento con anticuerpos tuvo algunos efectos biológicos distintos. Primero, el tratamiento con anticuerpos aumentó el nivel de genes homeostáticos, incluidos Cx3cr1, Tmem119, Ctsd y P2ry12, tanto en las microglías Wt como en las R47H, en las microglías WT solamente y en las microglías R47H solamente (Figura 17 A, B y C). En segundo lugar, el tratamiento con anticuerpos disminuyó los niveles de transcripción de quimiocinas y citocinas proinflamatorias, incluidas Il1a, Il1b, Il27, Il12b, Ccr7, Ccl2, Ccl3, Ccl4 y Ccl5 (Figura 17 D, E y F). Tercero, el tratamiento con anticuerpos moduló varios genes involucrados en la señalización de Syk, incluidas varias DUSPs (fosfatasas que regulan las quinasas Src) y genes en la vía de señalización de MAPK. Se observaron muy pocas diferencias entre las microglías WT y R47H aisladas de ratones normales y no desafiados de 7 semanas de edad.

[0221]Al examinar las diferencias entre las microglías WT y R47H en un estado no perturbado, así como determinar los efectos del tratamiento con anticuerpos, notamos que en los animales tratados con LPS/anticuerpos, alrededor del 15 % de las células que se agrupaban con los grupos de microglías más tradicionales presentaban una firma genética distintiva con una representación más alta del genotipo R47H. Un análisis cuidadoso reveló que estas células primero se agruparon con el grupo de microglía más grande ya que eranTrem2+, Tmem119+, Cx3cr1+ y Hexb+,marcadores clásicos utilizados para definir la microglía homeostática. Sin embargo, estas células también estaban enriquecidas en genes como S100a8, Lcn2, S100a9, Camp, Hp, Cxcr2 e Illr2 tanto en las poblaciones WT como R47H en comparación con el grupo microglial más grande y clásico. Cuando realizamos el análisis de vías de los genes principales que se expresaron preferentemente en este grupo, encontramos que estos resultados estaban asociados con la función de monocitos y neutrófilos (Figura 18 A y B). Este grupo de células de infiltrado/microglia también respondió al tratamiento con anticuerpos con una regulación negativa de las quimiocinas y citocinas proinflamatorias tanto en ratones WT y R47H KI, solo en ratones WT y solo en ratones R47HKi (Figura 18 C, D y E).

[0222]Los datos muestran que una dosis aguda del anticuerpo agonista de la presente divulgación en un modelo de desafío con LPS es adecuada para regular positivamente la función microglial de la misma manera que la sobreexpresión génica constitutiva hace en una indicación crónica como la AD. Además, la activación específica de TREM2 por el anticuerpo agonista de la divulgación afecta a múltiples genes homeostáticos en un modo de tratamiento con LPS y restaura un estado más homeostático en general.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de unión de antígeno agonista aislada que se une específicamente a TREM2 humano, en la que la proteína de unión de antígeno agonista es un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 330, y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 331.

2. La proteína de unión a antígeno agonista aislada de la reivindicación 1, en la que el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo quimérico o fragmento de unión a antígeno del mismo, o un anticuerpo totalmente humano o fragmento de unión a antígeno del mismo.

3. La proteína de unión al antígeno agonista aislado de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo humano de tipo IgG1.

4. La proteína de unión a antígenos agonistas aislada de la reivindicación 1, que comprende una región constante de cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 197, y una región constante de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 203.

5. El aislado agonista proteína de unión de antígeno de la reivindicación 1, que comprende una cadena ligera que contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 339 y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 340.

6. La proteína de unión a antígenos agonista aislada de la reivindicación 3, en la que el anticuerpo contiene una mutación en la posición de aminoácido N297 de acuerdo con la numeración de la UE en su cadena pesada, preferentemente donde la mutación es N297G, opcionalmente donde el anticuerpo además contiene las mutaciones R292C y V302C según la numeración de la UE en su cadena pesada.

7. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de unión a antígenos agonista de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico.

8. Un polinucleótido aislado que codifica la proteína de unión de antígeno agonista de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

9. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de la reivindicación 8.

10. Una célula huésped que comprende el polinucleótido de la reivindicación 8 o el vector de expresión de la reivindicación 9.

11. Un método para producir una proteína de unión de antígeno agonista de acuerdo con alguna de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende el cultivo de una célula huésped que contiene uno o más vectores de expresión que codifican la proteína de unión de antígeno en un medio de cultivo en condiciones que permiten la expresión de la proteína de unión de antígeno; y la recuperación de la proteína de unión de antígeno del medio de cultivo o de la célula huésped.

12. La proteína de unión a antígenos agonista de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para su uso en el tratamiento o prevención de la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Nasu-Hakola, la demencia frontotemporal, la esclerosis múltiple, el síndrome de Guillain-Barré, la esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Parkinson, lesión cerebral traumática, lesión de médula espinal, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, enfermedad priónica, accidente cerebrovascular, osteoporosis, osteopetrosis u osteosclerosis.

13. La proteína de unión al antígeno agonista de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para su uso según la reivindicación 12 en el tratamiento o prevención de la enfermedad de Alzheimer, la demencia frontotemporal, o la esclerosis múltiple.