ES3038235T3 - Preparation comprising a dispersion of phospholipids and fatty acid salts - Google Patents

Preparation comprising a dispersion of phospholipids and fatty acid salts

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ES3038235T3
ES3038235T3 ES19836474T ES19836474T ES3038235T3 ES 3038235 T3 ES3038235 T3 ES 3038235T3 ES 19836474 T ES19836474 T ES 19836474T ES 19836474 T ES19836474 T ES 19836474T ES 3038235 T3 ES3038235 T3 ES 3038235T3
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Abstract

La invención se refiere a preparaciones que comprenden una mezcla de al menos un fosfolípido y al menos una sal de ácido graso de un catión con un anión derivado de un ácido graso. La invención también se refiere a un método para preparar dichas preparaciones y a su uso para proporcionar ácidos grasos poliinsaturados a células, tejidos, órganos u organismos, por ejemplo, en el campo del cultivo celular y tisular, la preservación de órganos, la nutrición humana o animal, o la cosmética. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Preparación que comprende una dispersión de fosfolípidos y sales de ácidos grasos
La invención describe composiciones que contienen fosfolípidos y sales de ácidos grasos omega-3, formulaciones y procesos para preparar dichas composiciones en forma liposómica y aplicaciones de las mismas.
Se sabe que los ácidos grasos omega-3, especialmente el ácido dodecahexaenoico (DHA) y el ácido eicosapentaenoico (EPA), tienen diversos efectos beneficiosos para la salud humana, son importantes componentes básicos de diversos constituyentes celulares y actúan como precursores de moléculas de señalización.
Las principales fuentes de estos compuestos son los aceites de pescado y de algas, así como algunos aceites derivados de plantas, donde están presentes en forma de triglicéridos. Diversos aceites, así como los ésteres etílicos derivados de aceite, están disponibles en el mercado.
Como el consumo diario de estas fuentes de omega-3 con alimentos o complementos nutritivos es limitado, es importante garantizar la máxima biodisponibilidad de estos ácidos grasos. La biodisponibilidad de los nutrientes hidrófobos en el sistema digestivo a menudo es baja y representa un reto especialmente para los complementos, porque frecuentemente se consumen independientemente de una comida en forma de cápsulas o píldoras. La secreción de líquidos digestivos (ácidos biliares, fosfolípidos, lipasas) apenas se induce o no se induce en absoluto en estado de ayuno, lo que provoca una hidrólisis enzimática incompleta de las grasas y los aceites, baja solubilización y biodisponibilidad.
Surge un problema adicional de biodisponibilidad, cuando se usan tecnologías avanzadas de formulación para saltarse partes del aparato digestivo para liberar los ácidos grasos omega-3 en la parte inferior del aparato digestivo, por ejemplo, en el intestino delgado o grueso. Para este propósito pueden usarse cápsulas o comprimidos recubiertos con respectivos polímeros de liberación. En estos sistemas, los mecanismos naturales de solubilización mencionados anteriormente son menos eficaces, lo que reduce la biodisponibilidad y tiene que compensarse con medidas adecuadas.
Lo mismo ocurre para el suministro de ácidos grasos omega-3 a células y tejidos aislados para su cultivoin vitro,por ejemplo, como parte de una composición de medio de cultivo celular sin suero. En esas aplicaciones, la solubilización en el tubo digestivo se imita preferiblemente mediante formulaciones cercanas al sistema natural para maximizar la biocompatibilidad y la biodisponibilidad. Para la adición al medio de cultivo celular, también es esencial que los ácidos grasos se dispersen en el medio de forma que permitan un paso óptimo a través de filtros estériles.
Se han desarrollado diversas estrategias para resolver el problema de biodisponibilidad, mediante formulación, modificación química de los ácidos grasos omega-3 o ambas.
Una estrategia prometedora es la hidrólisis y posterior saponificación de ésteres de ácidos grasos omega-3, que imita parte del proceso digestivo natural y aumenta de ese modo la solubilidad. El documento WO2016102323A1 describe composiciones que comprenden sales de ácidos grasos omega-3 poliinsaturados que pueden estabilizarse frente a la oxidación. También el documento US5750572 A divulga que las composiciones que comprenden sales de ácidos grasos omega-3, tales como DHA, con aminoácidos básicos, tales como arginina y lisina tienen características terapéuticas y tecnológicas favorables en comparación con composiciones que comprenden los respectivos ácidos libres.
La formulación también puede mejorar la biodisponibilidad. Por ejemplo, el documento WO2010103402 divulga formulaciones oleosas autoemulsionantes que contienen tensioactivos que han demostrado aumentar la dispersión en el estómago y aumentar la biodisponibilidad. El inconveniente de dichos sistemas es que normalmente requieren tensioactivos sintéticos no iónicos que no son de origen sostenible y cada vez menos aceptados por el consumidor. Otro inconveniente es la elevada cantidad de tensioactivo y cotensioactivo con respecto al aceite o éster etílico necesaria para generar finas gotitas de aceite después de la dispersión en agua. Finalmente, estos sistemas se encuentran todavía en estado líquido, lo que los hace propensos a oxidación y habitualmente requiere la adición de antioxidantes y precauciones especiales en cuanto a su procesamiento y envasado.
El documento US20070042008 A1 divulga composiciones que comprenden fosfolípidos, tales como fosfatidilcolina, y ácidos grasos omega 6 y omega 3. Además, el documento WO2017155396 A1 divulga formulaciones que comprenden EPA, DHA, fosfolípidos y colina.
Los fosfolípidos, tales como fosfatidilcolina (lecitina), son anfífilos naturales e ingredientes alimentarios altamente biocompatibles y fácilmente digeribles. Se han usado como emulsionantes en la industria alimentaria y como complementos nutritivos durante muchas décadas. Por lo tanto, no es sorprendente que los fosfolípidos se hayan usado para formular formas de ácidos grasos omega-3. Por ejemplo, Alaarget al.(International Journal of Nanomedicine 2016:11 5027-5040) y Hadianet al.(Iranian Journal of Pharmaceutical Research (2014), 13 (2): 393 404) han preparado formulaciones liposómicas a base de fosfolípidos a partir de ácidos grasos omega-3 libres y ásteres.
Sin embargo, las formulaciones liposómicas a base de fosfolípidos de ásteres y ácidos grasos omega-3 también presentan varias desventajas. Los triglicáridos y ásteres etílicos de omega-3 tienen una polaridad tan baja que solo pueden dispersarse de forma estable en bicapas liposómicas cantidades bajas. También son difíciles de convertir en una forma más concentrada, pulverulenta por secado sin adición de excipientes adicionales, debido al carácter pegajoso del aceite y de algunos de los fosfolípidos. El uso de ácidos grasos libres requiere neutralización de los ácidos grasos libres, lo que complica el procesamiento y puede provocar una menor calidad y estabilidad de los liposomas, además de introducir contraiones tales como sodio o potasio (mediante NaOH o KOH), que son indeseables en aplicaciones nutritivas y otras.
Se descubrió que las preparaciones de omega-3 que superan los problemas mencionados anteriormente pueden prepararse a partir de mezclas de fosfolípidos con sales de ácidos grasos omega-3 que tienen aminoácidos básicos como contraiones.
Por lo tanto, un aspecto de la presente invención es una preparación que comprende una dispersión de al menos un fosfolípido y al menos una sal de ácido graso de un catión lisina con un anión derivado de un ácido graso omega-3 u omega-6.
Una dispersión de acuerdo con la presente invención es, de acuerdo con la definición de la IUPAC, un material que comprende más de una fase donde al menos una de las fases consiste en dominios de fase finamente divididos, a menudo en el intervalo de tamaño coloidal, dispersados por toda una fase continua. Las dos fases pueden estar en el mismo estado o en diferentes estados de la materia. Son diferentes de las soluciones, donde las moléculas disueltas no forman una fase separada del soluto. La presente invención se refiere tanto a dispersiones de una fase líquida en un medio líquido como coloide (miniemulsión o microemulsión) o como suspensión (emulsión con tamaño de partícula por encima de 1 pm) como a dispersiones de una fase sólida en un medio líquido como coloide (sol) o como suspensión (con tamaño de partícula por encima de 1 pm). Además, la invención también se refiere a una dispersión de una fase sólida en un medio sólido continuo, que se denomina sol sólido.
Un coloide es una dispersión con una fase dispersada entre 1 nm y 1 pm y se define como emulsión cuando una fase líquida está dispersada en un medio líquido continuo, como sol cuando una fase sólida está dispersada en un medio líquido continuo y como sol sólido cuando una fase sólida está dispersada en un medio sólido continuo.
El proceso de preparación de dichas dispersiones podría mejorarse y simplificarse. Se descubrió que las composiciones tenían mejor calidad y estabilidad. Se pudo reducir el contenido de contraiones inorgánicos no deseados, tales como sodio. La filtración estéril de las formas líquidas se vio facilitada significativamente por la composición de la invención en comparación con otras formas de ácidos grasos omega-3. Se descubrió que los polvos secos preparados a partir de las composiciones de la invención tenían mejores propiedades, lo que facilitaba su procesamiento.
También se descubrió que dichas formulaciones mejoran fuertemente la biodisponibilidad del ácido graso omega-3 para células microbianas y animales, incluyendo células humanas.
Las composiciones de la invención de esta invención consisten en fosfolípidos que pueden formar bicapas y sales de lisina de ácidos grasos omega-3. Los fosfolípidos pueden ser mezclas complejas (por ejemplo, lecitina desengrasada), cadenas principales definidas con variaciones en la composición de ácidos grasos (por ejemplo, fosfatidilcolina, con ácidos grasos insaturados o hidrogenados) o compuestos purificados y definidos (por ejemplo, dioleilfosfatidilcolina, DOPC).
En una configuración preferida de la presente invención, el ácido graso se selecciona de ácido eicosapentaenoico (EPA), ácido docosahexaenoico (DHA), ácido araquidónico (ARA), ácido alfa linolénico, ácido estearidónico, ácido eicosatetraenoico, ácido docosapentaenoico, ácido linoleico, ácidoY-linolénico y/o derivados de los mismos, preferiblemente seleccionados de los ácidos grasos omega-3 EPA y DHA.
En una configuración alternativa de la presente invención, el fosfolípido es un fosfolípido desengrasado que comprende un contenido de fosfatidilcolina mayor de un 40 % en peso, preferiblemente un 70 % en peso, preferiblemente mayor de un 90 % en peso y un contenido de fosfatidiletanolamina menor de un 5 % en peso, preferiblemente menor de un 1 % en peso.
En una realización alternativa, el fosfolípido es un fosfolípido no hidrogenado que tiene un contenido de ácido oleico y/o linoleico superior mayor de un 70 % en peso del total de ácidos grasos.
En una configuración preferida adicional de la presente invención, la relación en masa de fosfolípido a sal de ácido graso es mayor de 0,005, preferiblemente mayor de 0,01, más preferiblemente mayor de 0,09, más preferiblemente mayor de 0,39.
En una realización alternativa, la preparación está en forma de polvo o de líquido que dan como resultado dispersiones coloidales con tamaños medios de partícula más pequeños de 1 pm, preferiblemente más pequeños de 500 nm, más preferiblemente más pequeños de 250 nm cuando se mezclan con agua a un valor de pH entre pH 6,5 y 7,5.
En otra realización, los componentes están finamente dispersados entre sí, de modo que tanto el fosfolípido como las sales de ácido graso están presentes y son detectables en cantidades de 100 pg y más pequeñas.
Un objeto adicional de la presente invención es un medio de cultivo, tal como un medio de cultivo celular, que comprende una preparación de acuerdo con la presente invención, es decir, una composición que comprende fosfolípidos y sales de lisina de ácidos grasos omega-3.
En una realización preferida, el medio de cultivo está en forma líquida, en forma de gel, polvo, granulado, gránulo o en forma de comprimido.
En otras realizaciones preferidas, el medio de cultivo es un medio líquido en forma concentrada 2 veces, 3 veces, 3,33 veces, 4 veces, 5 veces o 10 veces (volumen/volumen), con respecto a la concentración de dicho medio en uso. Esto permite la preparación de un medio de cultivo "listo para usar" por simple dilución del medio concentrado con el volumen respectivo de agua estéril. Dichas formas concentradas del medio de la invención pueden usarse también por adición del mismo a un cultivo, por ejemplo, en un proceso de cultivo semicontinuo.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para preparar una preparación de acuerdo con la presente invención, que comprende al menos las siguientes etapas:
a. Disolver conjuntamente un fosfolípido y una sal de lisina de ácido graso en un disolvente miscible en agua y añadir pequeñas cantidades de agua para disolver completamente la sal;
b. Añadir la solución a un sistema acuoso para preparar una dispersión lipídica;
c. Reducir el tamaño de las partículas de la dispersión lipídica hasta un tamaño medio de partícula más pequeño de 500 nm, preferiblemente más pequeño de 250 nm, mediante sonicación u homogeneización;
d. Opcionalmente, secar la preparación, preferiblemente mediante pulverización o liofilización.
En una realización alternativa, el método de acuerdo con la presente invención comprende al menos las siguientes etapas:
a. Disolver el fosfolípido en un disolvente miscible en agua;
b. Disolver la sal de lisina de ácido graso en un sistema acuoso y añadir la solución de fosfolípido para preparar una dispersión lipídica;
c. Reducir el tamaño de las partículas de la dispersión lipídica hasta un tamaño medio de partícula más pequeño de 500 nm, preferiblemente más pequeño de 250 nm, mediante sonicación u homogeneización;
d. Opcionalmente, secar la preparación, preferiblemente mediante pulverización o liofilización.
En una realización preferiblemente del método de acuerdo con la presente invención, el disolvente miscible en agua se selecciona de uno o más de los siguientes: etanol, glicerol y propilenglicol.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un uso de una preparación de acuerdo con la presente invención para proporcionar ácidos grasos poliinsaturados a células, tejidos, órganos u organismos, preferiblemente en el campo del cultivo de células y tejidos, la conservación de órganos, la nutrición humana o animal, farmacia o cosmética.
Una realización específica se refiere a un uso de una preparación de acuerdo con la presente invención para el cultivo y la estimulación de la expansión de células madre mesenquimatosas.
Una realización alternativa se refiere al uso de una preparación de acuerdo con la presente invención como pienso o complemento alimenticio o como producto farmacéutico.
Un objeto adicional de la presente invención es una composición de piensos o producto alimenticio que contiene una preparación de acuerdo con la presente invención y al menos un ingrediente de pienso o alimenticio adicional, preferiblemente seleccionado de proteínas, hidratos de carbono, grasas, probióticos adicionales, prebióticos, enzimas, vitaminas, inmunomoduladores, sustitutos de la leche, minerales, aminoácidos, coccidiostáticos, productos a base de ácidos, medicamentos y combinaciones de los mismos.
La composición de pienso o producto alimenticio de acuerdo con la presente invención también incluye complementos dietéticos en forma de píldora, cápsula, comprimido o líquido.
Un objeto adicional de la presente invención es una composición farmacéutica que contiene una preparación de acuerdo con la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Las preparaciones de acuerdo con la presente invención, cuando se administran a animales o seres humanos, mejoran preferiblemente el estado de salud, en particular la salud intestinal, la salud cardiovascular, la salud cardiometabólica, la salud pulmonar, la salud articular, la salud ocular, la salud mental, la salud bucodental o la salud inmunitaria de un animal o un ser humano.
Por lo tanto, un objeto adicional de la presente invención es una composición de acuerdo con la presente invención para mejorar el estado de salud, en particular la salud intestinal, la salud cardiovascular, la salud cardiometabólica, la salud pulmonar, la salud articular, la salud ocular, la salud mental, la salud bucodental o la salud inmunitaria de un animal o un ser humano.
Ejemplos prácticos
Las preparaciones de ácidos grasos omega-3 se caracterizaron con los siguientes métodos:
1.1 Determinación del tamaño de partícula
El tamaño de partícula se determinó mediante mediciones de dispersión de luz dinámica (DLS) (Zetasizer Nano ZS, Malvern).
1.2 Medición de la turbidez
La turbidez de las preparaciones se midió después de dilución 100x con agua en un fotómetro a 600 nm en cubetas con un paso de luz de 1 cm.
1.3 Propiedades de la filtración estéril
Se filtraron 5 ml de preparaciones líquidas a través de un filtro de jeringa estéril de 0,2 pm. La facilidad de filtración se evaluó mediante el aumento de la contrapresión o la obstrucción completa. La medición de la turbidez mediante fotometría a 600 nm se evaluó antes y después de la filtración. Una mayor turbidez se correlaciona con mayores tamaños de partícula. La reducción de la turbidez es un signo de pérdida de material a través de filtración, lo que no es deseable, ya que la composición de la muestra debe cambiarse lo menos posible.
1.4 Secado y evaluación de propiedades en polvo
Las preparaciones se liofilizaron y las preparaciones secas se evaluaron cualitativamente con respecto a la consistencia y el comportamiento de flujo.
Ejemplo 1: Preparación y caracterización de dispersiones de ácidos grasos omega-3 con dioleilfosfatidilcolina (DOPC) en tampón fosfato
Para preparar formulaciones de dispersiones de ácidos grasos omega-3 se disolvieron 0,8 g de dioleilfosfatidilcolina (DOPC, Lipoid GmbH) en 1 ml de etanol. Se añadieron y disolvieron 0,2 g de aceite de pescado (Omega-3 1400, Doppelherz®), éster etílico de omega-3 (PronovaPure® 500:200 EE, BASF), sal de lisina de ácido graso omega-3 libre en forma de sal de lisina omega-3 (AvailOm®, Evonik). La sal de lisina no se disolvió en etanol, pero se descubrió que podía disolverse cuando se añadían adicionalmente 20 pl de agua destilada.
La sal de lisina del ácido graso omega-3 libre en forma de sal de lisina omega-3 (AvailOm®, Evonik) contiene aproximadamente un 67 % de ácidos grasos y altas cantidades de los ácidos grasos omega-3 EPA y DHA y pequeñas cantidades del ácido graso omega-3 docosapentaenoico y los ácidos grasos omega-6 araquidónico, docosatetraenoico e isómero del ácido docosaenoico.
Se añadió gota a gota 1 ml de las soluciones respectivas a 20 ml de un tampón fosfato 0,1 M, pH = 8, a una temperatura de 45 °C y en agitación intensa. El pH se ajustó hasta pH = 8 con NaOH si era necesario. Después de ello, la dispersión se puso en hielo y se sonicó (Branson Sonifier, amplitud de un 100 %, impulso de un 50 %) durante 15 minutos para generar dispersiones a escala nanométrica, presumiblemente liposomas. Las dispersiones se filtraron estérilmente a través de filtros de jeringa de 0,2 pm. La turbidez y el tamaño de partícula se midieron antes y después de la filtración estéril, como se describe en 1.2. La preparación contenía 40 g/l de fosfolípidos y 10 g/l de ácidos grasos omega-3 o ésteres. En una última etapa, las dispersiones se liofilizaron y se analizó visualmente el aspecto de la preparación obtenida.
Sorprendentemente, se descubrió que las preparaciones obtenidas con la sal de lisina del ácido graso omega-3 tenían un tamaño de partícula más pequeño, mostraban las mejores propiedades de filtración y daban como resultado un polvo sustancialmente menos pegajoso después de la liofilización. Los resultados para el triglicérido y el éster etílico como ejemplo comparativo (comp.) y la sal de lisina de ácido graso (de acuerdo con la invención) se resumen en la tabla 1.
T l 1: Pr i iv r i r i n i r m - ^ n D P
Ejemplo 2: Preparación de dispersiones de ácidos grasos omega-3 y sal de lisina de ácidos grasos omega-3 con DOPC en agua
Las formulaciones se prepararon como se describe en el ejemplo 1, excepto que se usó agua en lugar de tampón fosfato. Además de la sal de lisina de ácido graso omega-3 (AvailOm®, Evonik), se usó el correspondiente ácido graso omega-3 libre para determinar las diferencias entre las dos formas. La medición del pH con un electrodo de pH después de la adición de los lípidos al agua mostró que las formulaciones con el ácido libre eran bastante ácidas y tenían que ajustarse con NaOH antes de la sonicación para obtener una dispersión apropiada, mientras que la adición de las respectivas sales daba como resultado preparaciones con un pH apropiado que podían dispersarse mediante sonicación sin adición de base. Sorprendentemente, el producto liofilizado que contenía la sal de lisina de ácido graso omega-3 (2.2) fluía mejor y era menos pegajoso que el polvo obtenido del procesamiento del ácido graso omega-3 libre (2.1 comparativo) y, por tanto, proporciona beneficios con respecto al procesamiento de dichos polvos. Los resultados se muestran en la tabla 2.
Tabla 2: Diferencias entre las composiciones preparadas con ácido graso omega-3 libre y sal de lisina de ácido graso ome a-3.
Ejemplo 3: Preparación y caracterización de dispersiones de sal de lisina de ácido graso omega-3 con DOPC a diversas relaciones de sal de ácido graso a fosfolípido
Las formulaciones se prepararon como se describe en el ejemplo 1, excepto que se usó agua en lugar de tampón fosfato y se usaron diferentes relaciones de sal de ácido graso omega-3 a fosfolípido. Las dispersiones acuosas obtenidas contenían todas 10 g/l de sal de ácido graso omega-3, pero diferentes concentraciones de DOPC. También se preparó una solución coloidal acuosa de sal de ácido graso omega-3 sin fosfolípido para comparaciones. Se diluyeron 5 ml de las dispersiones obtenidas en 45 ml de tampón fosfato 20 mM, pH = 7, para evaluar las propiedades de dispersión a pH fisiológico mediante mediciones del tamaño de partícula y la turbidez. La turbidez de las dispersiones diluidas se midió en placas de microvaloración de 96 pocillos a 600 nm con un volumen de líquido de 100 pl en un lector de microplacas (Tecan Infinite 200 PRO). Sorprendentemente se descubrió que ya pequeñas cantidades de DOPC eran suficientes para mejorar la dispersión de la sal de ácido graso omega-3 en comparación con la sal de ácido graso omega-3 sin fosfolípido añadido. Esto pudo demostrarse por la turbidez reducida y los tamaños de partícula más pequeños. Los resultados se resumen en la tabla 3.
Tabla 3: Composiciones con diversas relaciones de DOPC a sal de lisina de ácido graso omega-3, tamaño de partícula
=
Ejemplo 4: Preparación y caracterización de dispersiones de ácidos grasos omega-3 con lecitina en agua
Las formulaciones se prepararon como se describe en el ejemplo 3, excepto que en lugar de DOPC se usaron 0,8 g de lecitina/fosfatidilcolina de girasol desengrasada con un contenido de fosfatidilcolina >90 % en peso (Lipoid H 100). Se prepararon diluciones en tampón fosfato a pH = 7 y se midió la turbidez como se describe en el ejemplo 3. Los resultados se muestran en la tabla 4 y fueron comparables a los obtenidos con DOPC. Ya pequeñas cantidades de fosfolípido dieron como resultado una dispersión mucho más fina de las sales de ácido graso a este valor de pH, como se indica por una turbidez menor. Las diferencias también eran fáciles de observar visualmente. Mientras que 4.6 parecía bastante lechoso, las composiciones que contenían fosfolípido eran casi transparentes y solo ligeramente turbias.
Tabla 4: Composiciones con diversas relaciones de lecitina a sal de lisina de ácido graso omega-3, tamaño de partícula
=
Ejemplo 5: Método alternativo para preparar dispersiones de sal de ácido graso omega-3 con dioleilfosfatidilcolina en agua
Se descubrió que pueden prepararse preparaciones de acuerdo con la invención en una secuencia de mezcla que simplifica el proceso y no es adecuada para la forma de ácido graso omega-3 libre o ésteres respectivos. En lugar de disolver la sal de lisina de ácido graso omega-3 con el fosfolípido en etanol, se disolvió directamente en agua a una concentración de 10 g/l y la solución etanólica de fosfolípido se añadió posteriormente. Después de ello, se sonicó la dispersión y se filtró estérilmente como se describe en los ejemplos previos.
Ejemplo 6: Estimulación de la producción de ácido 18-hidroxi-eicosapentaenoico (18-HEPE) en la cepa de B. meqaterium DSM 32963
Debido a su baja polaridad, la biodisponibilidad de los ácidos grasos omega-3 a menudo no es suficiente y solo cantidades bajas se usan realmente y se convierten por las células en reacciones bioquímicas. Podría demostrarse que las preparaciones descritas en esta invención potencian la biodisponibilidad y la conversión metabólica de ácidos grasos omega-3 de las células microbianas, lo que es relevante en aplicaciones nutricionales tales como la utilización y modulación del microbioma.
Bacillus megateriumDSM 32963 se ha identificado por cribado de aislados de origen natural. Se ha depositado en DSMZ el 27 de noviembre de 2018 en virtud de las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con el Propósito del Procedimiento en materia de Patentes con el número de acceso mencionado anteriormente a nombre de Evonik Degussa GmbH.
Las preparaciones descritas en la tabla 1 se añadieron a cultivos microbianos deBacillus megateriumDSM 32963 en cultivos líquidos en matraces agitados. Con propósitos de comparación, también se añadió una solución de sal de lisina de ácido graso omega-3 en agua con la misma concentración de ácido graso omega-3. Se descubrió queBacillus megateriumDSM 32963 cataliza la conversión de ácido eicosapentaenoico (EPA) en ácido 18-hidroxieicosapentaenoico bioactivo (18-HEPE).
A partir de 10 ml de caldo Luria Bertami (LB, Thermo Fisher Scientific) con un 0,1 % de glucosa (LBG) se hizo crecer un cultivo deB. megateriumDSM 32963 durante 24 h a 30 °C y 200 rpm en un matraz de 100 ml. El cultivo completo se transfirió al cultivo principal de 200 ml en LBG. El cultivo principal se cultivó durante 6 h a 30 °C y 200 rpm en un matraz de 2 l. A continuación, se recogió el cultivo celular en porciones de 10 ml, se eliminó el sobrenadante por centrifugación (15 min, 4000 rpm, temperatura ambiente) y se resuspendió el sedimento celular en 10 ml de LBG o LBG con 9,76 g/l de FeSSIF-V2 (biorelevant.com), que es una mezcla de taurocolato, fosfolípidos y otros componentes diseñados para simular los tensioactivos biliares, y se añadieron 2 ml de soluciones madre de lípidos, que se prepararon a partir de los preparaciones filtradas estériles del ejemplo 2 para obtener la misma concentración de EPA en cada experimento (tabla 5), respectivamente. Además, los complementos también se añadieron respectivamente a los diferentes medios en matraces de agitación sin células, y se trataron en las mismas condiciones para controlar la formación de productos no bioquímicos. Estos cultivos y los controles respectivos se incubaron en matraces de agitación de 100 ml durante 16 h a 30 °C y 200 rpm.
Tabla 5: Com lementos re aración de soluciones madre su contenido calculado de EPA /l
Posteriormente, las células se separaron por centrifugación (15 min, 4000 rpm, temperatura ambiente), y se extrajeron los sobrenadantes para analizar la presencia de metabolitos omega-3. Los sobrenadantes se diluyeron con un disolvente que consistía en una mezcla de agua/acetonitrilo (la relación de sobrenadantes:disolvente era 1:2, composición del disolvente: 65 % de H2O, pH 8 y 35 % de MeCN).
Las muestras diluidas de sobrenadante se filtraron y se usaron después para la detección de ácido 18-hidroxieicosapentaenoico (18-HEPE) mediante análisis de lC/ESI-MS (Agilent QQQ 6420, Gemini 3p C6-Phenyl) en modo SIM positivo a m/z 318, así como del compuesto precursor EPA a m/z 302.
En presencia y ausencia de sales biliares, se formó y se detectó 18-HEPE en el sobrenadante más eficazmente, cuando se proporcionó ácido graso omega-3 a las células deBacillus megateriumDSM 32963 como sal de lisina omega-3 formulada con fosfolípidos. Los resultados se resumen en la tabla 6.
Tabla 6: Concentraciones medidas de 18-HEPE (mg/l) de los sobrenadantes de cultivo en ausencia y presencia de ácidos biliares
Ejemplo 7: Expansión estimulada de células estromales mesenquimatosas de médula ósea humana mediante la adición de sales de ácidos grasos omega-3 dispersados en fosfolípidos
Las células estromales mesenquimatosas (MSC) de médula ósea humana se usan con propósitos médicos en forma de terapias celulares y para obtener tipos específicos de células y tejidos para ingeniería de tejidos, por ejemplo, para la generación de condrocitos para generar cartílagoin vitro.Para hacer esto, se requieren composiciones adecuadas de medio que permitan una expansión/multiplicación eficaz de las células aisladas. En general, se supone que es necesario complementar los lípidos si se usan medios sin suero químicamente definidos. La idoneidad de las formulaciones lipídicas descritas en esta invención para expandir eficazmente células estromales se evaluó como se describe en el siguiente fragmento.
Se preparó un medio de cultivo celular químicamente definido como el descrito por Jungetal.(Cytotherapy, 2010; 12: 637-657). La composición del medio se muestra en la tabla 7.
T l 7: m i i n m i ími m n fini r l l iv l l r m l m n im
El concentrado de lípidos químicamente definido se obtuvo por Thermo Fisher Scientific (n.° de catálogo 11905031) y consistía en una mezcla de ácidos grasos y colesterol formulada con tensioactivos no iónicos (Polisorbato 80 y Pluronic F-68).
Se prepararon dos lotes adicionales de este medio, uno sin concentrado de lípidos químicamente definido y otro donde el concentrado de lípidos químicamente definido se remplazó por la preparación de sal de lisina omega-3 formulada con DOPC (ejemplo 1.3). Se añadieron 0,1 ml de la preparación líquida a 100 ml de medio de cultivo celular, lo que corresponde a una dilución 1000x y da como resultado una concentración de ácidos grasos de aproximadamente 10 mg/l.
Las células estromales mesenquimatosas de médula ósea humana derivadas en medio químicamente definido a partir de células mononucleares de médula ósea se obtuvieron de StemCell Technologies, se descongelaron según las recomendaciones del proveedor y se expandieron en las tres versiones diferentes de medio. El medio se inoculó a una densidad celular de 150000 células/ml y las células se expandieron en matraces de cultivo celular T25 en una estufa de incubación de CO2. El medio se remplazó cada 2-3 días y las células se pasaron antes de volverse confluyentes. Las células se desprendieron con Accutase™ (StemCell Technologies), se determinó la concentración de células viables y se inoculó medio fresco con 150000 células/ml en cada pase.
Las duplicaciones de población acumuladas (CPD), como indicador del rendimiento de crecimiento, se calcularon a partir del número de pases y de las concentraciones medidas de células. Sorprendentemente, se descubrió que el concentrado de lípidos químicamente definido como se describe en la bibliografía no tenía un efecto positivo sobre CPD (CPD = 4,63) en comparación con el medio sin lípidos añadidos (CPD = 4,77). En cambio, la adición de sal de lisina omega-3 formulada con DOPC sí tuvo efectos positivos y dio como resultado CPD aumentadas de 7,37.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una preparación que comprende una dispersión de
- al menos un fosfolípido, y
- al menos una sal de ácido graso de un catión de lisina con un anión derivado de un ácido graso omega-3 u omega-6.
2. Preparación de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el ácido graso se selecciona de ácido eicosapentaenoico (EPA), ácido docosahexaenoico (DHA), ácido araquidónico (ARA), ácido alfa linolénico, ácido estearidónico, ácido eicosatetraenoico, ácido docosapentaenoico, ácido linoleico, ácidoY-linolénico y/o derivados de los mismos.
3. Preparación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el fosfolípido es un fosfolípido desengrasado que comprende un contenido de fosfatidilcolina mayor de un 40 % en peso y un contenido de fosfatidiletanolamina menor de un 5 % en peso.
4. Preparación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el fosfolípido es un fosfolípido no hidrogenado que tiene un contenido de ácido oleico y/o linoleico mayor de un 70 % en peso del total de ácidos grasos.
5. Preparación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la relación en masa de fosfolípido a sal de ácido graso es mayor de 0,005.
6. Preparación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la preparación está en forma de polvo o de líquido, que dan como resultado dispersiones coloidales con tamaños medios de partícula más pequeños de 1 pm cuando se mezclan con agua a un valor de pH entre pH 6,5 y 7,5.
7. Preparación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los componentes están dispersados finamente entre sí de modo que tanto el fosfolípido como las sales de ácidos grasos están presentes y sean detectables en cantidades de 100 pg y más pequeñas.
8. Un medio de cultivo, tal como un medio de cultivo celular, que comprende una preparación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
9. El medio de cultivo de acuerdo con la reivindicación 9, en donde dicho medio de cultivo está en forma líquida, en forma de gel, polvo, granulado, gránulo o en forma de comprimido.
10. Método para preparar una preparación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende al menos las siguientes etapas:
a. Disolver conjuntamente un fosfolípido y una sal de lisina de ácido graso en un disolvente miscible en agua y añadir pequeñas cantidades de agua para disolver completamente la sal;
b. Añadir la solución a un sistema acuoso para preparar una dispersión lipídica;
c. Reducir el tamaño de las partículas de la dispersión lipídica hasta un tamaño medio de partícula más pequeño de 500 nm mediante sonicación u homogeneización;
d. Opcionalmente, secar la preparación.
11. Método para preparar una preparación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende al menos las siguientes etapas:
a. Disolver el fosfolípido en un disolvente miscible en agua;
b. Disolver la sal de lisina de ácido graso en un sistema acuoso y añadir la solución de fosfolípido para preparar una dispersión lipídica;
c. Reducir el tamaño de las partículas de la dispersión lipídica hasta un tamaño medio de partícula más pequeño de 500 nm, preferiblemente más pequeño de 250 nm, mediante sonicación u homogeneización;
d. Opcionalmente, secar la preparación.
12. Método de acuerdo con la reivindicación 11 o reivindicación 12, en donde el disolvente miscible en agua se selecciona de uno o más de los siguientes: etanol, glicerol y propilenglicol.
13. Uso de una preparación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para proporcionar ácidos grasos poliinsaturados a células, tejidos, órganos u organismos en el campo del cultivo de células y tejidos, la conservación de órganos, la nutrición humana o animal, farmacia o cosmética.
14. Uso de una preparación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para el cultivo y la estimulación de la expansión de células madre mesenquimatosas.
15. Uso de una preparación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 como pienso o complemento alimenticio o como producto farmacéutico.
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