ES3040534T3 - Modulator of sestrin-gator2 interaction for use in the treatment of treatment-resistant depression - Google Patents

Modulator of sestrin-gator2 interaction for use in the treatment of treatment-resistant depression

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ES3040534T3
ES3040534T3 ES18791427T ES18791427T ES3040534T3 ES 3040534 T3 ES3040534 T3 ES 3040534T3 ES 18791427 T ES18791427 T ES 18791427T ES 18791427 T ES18791427 T ES 18791427T ES 3040534 T3 ES3040534 T3 ES 3040534T3
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ES
Spain
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mmol
acid
solution
mixture
amino
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ES18791427T
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English (en)
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Eddine Saiah
George Vlasuk
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Original Assignee
Navitor Pharmaceuticals Inc
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Abstract

La presente invención proporciona compuestos, composiciones de los mismos y métodos para utilizarlos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Modulador de la interacción Sestrina-GATOR2 para su uso en el tratamiento de depresión resistente al tratamiento
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I-90 (o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo), o a una composición farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un método de tratamiento de depresión resistente al tratamiento.
Antecedentes de la invención
La diana mecanística de la proteína cinasa complejo 1 de rapamicina (mTORC1) es un regulador del crecimiento maestro que detecta diversas señales ambientales, tales como factores de crecimiento, tensiones celulares, y niveles de nutrientes y energía. Cuando se activa, mTORC1 fosforila sustratos que potencian los procesos anabólicos, tales como la traducción de ARNm y la síntesis de lípidos, y limita los catabólicos, tales como la autofagia. La desregulación de mTORC1 se produce en un amplio espectro de enfermedades, incluyendo diabetes, epilepsia, neurodegeneración, respuesta inmunitaria, supresión del crecimiento de músculo esquelético, y cáncer, entre otras (Howellet al.,(2013) Biochemical Society transactions 41, 906-912; Kimet al.,(2013) Molecules and cells 35, 463-473; Laplante y Sabatini, (2012) Cell 149, 274-293).
Muchos aportes aguas arriba, incluyendo factores de crecimiento y niveles de energía, señalizan a mTORC1 a través del complejo TSC, que regula Rheb, una pequeña GTPasa que es un activador esencial de mTORC1 (Brugarolaset al.,(2004) Genes & Development 18, 2893-2904; Garamiet al.,(2003) Molecular Cell 11, 1457 1466; Inokiet al.,(2003) Genes & Development 17, 1829-1834; Longet al.,(2005) Current Biology 15, 702-713; Sancaket al.,(2008) Science (Nueva York, NY) 320, 1496-1501; Saucedoet al.,(2003) Nature cell biology 5, 566 571; Stockeret al.,(2003) Nature cell biology 5, 559-565; Teeet al.,(2002) Proc Natl Acad Sci U S A 99, 13571 13576). Los aminoácidos no parecen señalizar a mTORC1 a través del eje TSC-Rheb y en su lugar actúan a través de las GTPasas Rag heterodiméricas, que consisten en RagA o RagB unida a RagC o RagD, respectivamente (Hiroseet al.,(1998) Journal of cell science 111 (parte 1), 11-21; Kimet al.,(2008) Nature cell biology 10, 935-945; Nobukuniet al.,(2005) Proc Natl Acad Sci U S A 102, 14238-14243; Roccioet al.,(2005) Oncogene 25, 657-664; Sancaket al.,(2008) Science (Nueva York, NY) 320, 1496-1501; Schürmannet al.,(1995) The Journal of biological chemistry 270, 28982-28988; Sekiguchiet al.,(2001) The Journal of biological chemistry 276, 7246-7257; Smithet al.,(2005) The Journal of biological chemistry 280, 18717-18727). Las GTPasas Rag controlan la localización subcelular de mTORC1 y los aminoácidos fomentan su reclutamiento a la superficie lisosómica, donde también reside la GTPasa Rheb (Buergeret al.,(2006) Biochemical and Biophysical Research Communications 344, 869 880; Dibbleet al.,(2012) Molecular cell 47, 535-546; Saitoet al.,(2005) Journal of Biochemistry 137, 423-430; Sancaket al.,(2008) Science (Nueva York, NY) 320, 1496-1501). Se han identificado varios componentes positivos de la ruta aguas arriba de las GTPasas Rag. El complejo Ragulator localiza las GTPasas Rag en la superficie lisosómica y, junto con la ATPasa vacuolar, fomenta el intercambio de GDP por GTP en RagA/B (Bar-Peledet al.,(2012) Cell 150, 1196-1208; Sancaket al.,(2010) Cell 141, 290-303; Zoncuet al.,(2011) Science Signaling 334, 678-683). El complejo FLCN-FNIP distinto actúa sobre RagC/D y estimula su hidrólisis de G<t>P para dar GDP (Tsunet al.,2013). Cuando RagA/B se carga con GTP y RagC/D con GDP, los heterodímeros se unen a y reclutan mTORC1 a la superficie lisosómica, donde puede entrar en contacto con su activador GTPasa Rheb.
Trabajos recientes han identificado el complejo multiproteico GATOR1 como un regulador negativo principal de la ruta de detección de aminoácidos y su pérdida provoca que la señalización de mTORC1 sea completamente insensible a la falta de aminoácidos (Bar-Peledet al.,(2013) Science 340, 1100-1106; Panchaudet al.,(2013) Science Signaling 6, ra42). GATOR1 consiste en DEPDC5, Nprl2 y Nprl3, y es una proteína activadora de GTPasa (GAP) para RagA/B. El complejo multiproteico GATOR2, que tiene cinco subunidades conocidas (WDR24, WDR59, Mios, Sec13, y Seh1L), es un componente positivo de la ruta y se encuentra aguas arriba de, o en paralelo a, GATOR1, pero su función molecular era desconocida hasta hace poco (Bar-Peledet al.,(2013) Science 340, 1100 1106).
Recientemente, se ha dilucidado información adicional sobre la ruta de mTORC1 identificando la unión de GATOR2 con una o más de las Sestrinas y demostrando que el complejo Sestrina-GATOR2 resultante regula la localización subcelular y la actividad de mTORC1. En particular, la presencia de complejos Sestrina-GATOR2 inhibe la ruta de mTORC1 y disminuye la actividad de mTORC1 evitando la translocación de mTORC1 a la membrana lisosómica. La interacción de GATO2 con las Sestrinas, y en particular con Sestrina1 y Sestrina2, se antagoniza por aminoácidos, particularmente leucina y, en menor medida, isoleucina, metionina y valina. En presencia de leucina, GATOR2 no interacciona con Sestrina1 o Sestrina2 y mTORC1 es capaz de migrar a la membrana lisosómica donde es activo. La Sestrina1 y la Sestrina2 se unen directamente a leucina y, en menor medida, a isoleucina y a metionina (Chantranuponget al.,(2014) Cell Rep.;9(1):1-8). La unión de leucina por Sestrina1 o Sestrina2 se requiere para la alteración de su interacción con GATOR2 y la activación posterior de mTORC1. Los mutantes de Sestrina2 incapaces de unirse a leucina no pueden señalizar la presencia de leucina a mTORC1, y las células agotadas de Sestrina2 y sus homólogos hacen que mTORC1 sea insensible a la ausencia de leucina (Wolfsonet al.,(2015) Science pii: ab2674 [epub antes de la impresión]).
Las Sestrinas son tres proteínas relacionadas (Sestrinal, Sestrina2 y Sestrina3) de funciones moleculares poco caracterizadas (Buckbinderet al.,(1994) Proc Natl Acad Sci U S A 91, 10640-10644; Budanovet al.,(2002) Cell 134, 451-460; Peeterset al.,(2003) Human genetics 112, 573-580). La Sestrina2 inhibe la señalización de mTORC1 y se ha propuesto que activa A<m>P<k>aguas arriba de TSC, así como que interacciona con TSC (Budanov y Karin, (2008) Cell 134, 451-460), pero estudios posteriores hallan que Sestrina2 inhibe a mTORC1 en ausencia de AMPK (Penget al.,(2014) Cell 159(1):122-33) enfatizando adicionalmente el papel importante que desempeña el complejo GATOR2 en la modulación de mTORC1 en respuesta a Sestrina2.
El documento WO 2017/070518 da a conocer compuestos y métodos útiles para modular la interacción Sestrina-GATOR2.
La modulación del complejo Sestrina-GATOR2 representa una posible diana terapéutica para modular selectivamente la actividad de mTORC1 indirectamente.
Sumario de la invención
La invención se define mediante las reivindicaciones. Cualquier contenido que se encuentre fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona con propósitos de información únicamente.
Ahora se ha hallado que el compuesto de esta invención, y las composiciones farmacéuticamente aceptables del mismo, son eficaces como moduladores de Sestrina-GATOR2. El compuesto es un compuesto de fórmula I-90
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
El compuesto de la presente invención, y las composiciones farmacéuticamente aceptables del mismo, son para su uso en un método de tratamiento de depresión resistente al tratamiento.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra el cronograma del estudio para el ejemplo A. Se aclimataron ratas Sprague Dawley macho al alojamiento durante 5 días y se realizó la administración de dosis el día 0 tal como se describe en la tabla 6. Veinticuatro horas tras la dosis (día 1), se realizó la prueba de olfateo de orina de hembra (FUST). El día 2 de estudio (48 h tras la dosis), se realizó la evaluación de la actividad locomotora (LMA). Las ratas se sometieron a ayuno durante la noche durante 20 h, tras lo cual se realizó la prueba de alimentación con supresión de novedad (NSFT) (72 h tras la dosis).
La figura 2 muestra el efecto de Ket y NV-5138 (I-90) en la FUST. Todos los datos se expresan como media ± EEM (n=8/grupo de tratamiento). *p < 0,05 y **p < 0,01 indican una diferencia significativa mediante una prueba de la t de Student bilateral para datos independientes.
La figura 3 muestra el efecto de Ket y NV-5138 (I-90) sobre la evaluación de LMA. Vehículo de ketamina (Sal); vehículo de NV-5138 (Veh); ketamina (Ket); NV-5138 (NV). Se muestra el número de roturas en los haces infrarrojos a lo largo de un periodo de 30 min. Todos los datos se expresan como media ± EEM (n=8/grupo de tratamiento). No se observaron diferencias significativas entre grupos mediante una prueba de la t de Student bilateral para datos independientes.
La figura 4 muestra el efecto de Ket y NV-5138 (I-90) en la prueba de alimentación con supresión de novedad (NSFT). Vehículo de ketamina (Sal); vehículo de NV-5138 (Veh); ketamina (Ket); NV-5138 (NV). Se muestra la latencia a alimentarse en s. Todos los datos se expresan como media ± EEM (n=8/grupo de tratamiento). **p < 0,01 indica una diferencia significativa mediante una prueba de la t de Student bilateral para datos independientes.
La figura 5 muestra el cronograma del estudio para el ejemplo B. Se aclimataron ratas Sprague Dawley macho al alojamiento durante 5 días y se realizó la administración de dosis el día 0 tal como se describe en la tabla 7. Una hora tras la dosis (día 0 1 h), se sacrificaron las ratas de los grupos 1, 2, 3 y 4, seguido de recogida de corteza prefrontal (PFC), preparación de sinaptosomas, y análisis por WB. Veinticuatro horas tras la dosis (día 1), se sacrificaron las ratas de los grupos 5, 6, 7 y 8, seguido de recogida de PFC, preparación de sinaptosomas, y análisis por WB.
La figura 6 muestra una representación esquemática de la disección de PFC de un cerebro de rata. A) Vista dorsal de un cerebro de rata y las dos líneas negras indican la ubicación de la disección para aislar la región de PFC del cerebro. B) Vista sagital de un cerebro de rata, la línea diagonal negra representa un corte para extirpar el bulbo olfativo y las dos líneas verticales negras representan cortes para aislar la región de PFC.
La figura 7 muestra el efecto de NV-5138 (I-90) y Ket sobre los niveles celulares de pmTOR, pp70S6K, y p4E-BP1 en sinaptosomas en bruto preparados a partir de PFC una hora tras la administración de dosis. Cambio en veces de pmTOR (A), pp70S6K (B) y p4E-BP1 (C) (normalizado con respecto al control Veh o Sal). Se muestran tres WB representativas de un total de n=6 usadas para el análisis estadístico encima de los gráficos para pmTOR (A), pp70S6K (B) y p4E-BP1 (C). Todos los datos son media ± EEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 indican una diferencia significativa mediante una prueba de la t de Student bilateral para datos independientes.
La figura 8 muestra el efecto de Ket y NV-5138 (I-90) sobre el nivel de GluR1, Sinapsina 1, y PSD95 en sinaptosomas en bruto preparados a partir de PFC 24 h tras la administración de dosis. Cambio en veces de GluR1 (A), Sinapsina 1 (B) y PSD95 (C) (normalizado con respecto a los grupos de control respectivos Sal o Veh) en sinaptosomas en bruto purificados a partir de PFC. Se muestran tres WB representativas de un total de n=6 usadas para el análisis estadístico encima de los gráficos para GluR1 (A), Sinapsina 1 (B) y PSD95 (C). Todos los datos son media ± EEM. *p < 0,05 y **p < 0,01 indican una diferencia significativa mediante una prueba de la t de Student bilateral para datos independientes.
La figura 9 muestra el cronograma del estudio para el ejemplo C. Se aclimataron ratas Sprague Dawley macho al alojamiento durante 5 días y se realizó la administración de dosis el día 0 tal como se describe en la tabla 8. Una hora tras la dosis (día 0 1 h), se sacrificaron las ratas de los grupos 1 y 2, seguido de la recogida de plasma y regiones de cerebro disecadas para la determinación de niveles de compuesto y el análisis por WB.
La figura 10 muestra la representación esquemática de una región de cerebro de rata disecada. Vista sagital de un cerebro de rata, la flecha blanca indica la región disecada para el análisis por WB.
La figura 11 muestra el efecto de NV-5138 (I-90) sobre los niveles de pS6 a lo largo de múltiples regiones del cerebro 1 h tras la administración. El gráfico de barras muestra el cambio en veces de S240/244pS6 en comparación con Veh que se normalizó con respecto a 1 en diversas regiones del cerebro de rata. Se muestran las WB representativas usadas para el análisis cuantitativo encima del gráfico. Todos los datos son media ± EEM. *p < 0,05 indica una diferencia significativa mediante una prueba de la t de Student bilateral para datos independientes.
La figura 12 muestra el cronograma del estudio para el ejemplo D. Se aclimataron ratas Sprague Dawley macho al alojamiento durante 5 días y se realizó la administración de dosis el día 0 tal como se describe en la tabla 9. Una hora tras la dosis (día 0 1 h), se sacrificaron las ratas de los grupos 1, 2, y 3 para la recogida de plasma, cerebro y tejidos periféricos, seguido de procesamiento para el análisis por Wb .
La figura 13 muestra el efecto de Leu y NV-5138 (I-90) sobre los niveles de pS6 en cerebro y órganos periféricos seleccionados 1 h tras la administración oral. El gráfico de barras muestra el cambio en veces de pS6 normalizado con respecto a Veh en el cerebro y los tejidos periféricos músculo gastrocnemio (gastroc.); músculo anterior tibial (TA); grasa epididimaria (grasa epi.) de rata. Se muestran WB representativas encima de los gráficos. Todos los datos son media ± EEM (n=10/grupo). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, y ****p < 0,0001 indican una diferencia significativa mediante una prueba de la t de Student bilateral para datos independientes.
La figura 14 muestra el cronograma del estudio para el ejemplo E. Se realizó la administración de dosis el día 0, tal como se describe en la tabla 10. El procedimiento de estrés crónico impredecible (CUS) comenzó el día -20 y finalizó el día 5 (grupos 3 y 4, n=14/grupo). Se alojaron dos grupos de ratas (grupos 1 y 2 n=14/grupo) normalmente durante 25 días y se usaron como grupos sin estrés (NS). La primera dosis fue el día 0. Veinticuatro horas tras la dosis (día 1), se realizó la prueba de preferencia por la sacarosa (SPT) tras 6 h de privación de agua. Luego, las ratas se sometieron a ayuno durante la noche durante 20 h, tras lo cual se realizó la NSFT (48 h tras la dosis). Se administró una segunda dosis, o bien de Veh o bien de NV-5138, el día 5, seguido del sacrificio 24 h más tarde para la recogida de cerebro, la preparación de sinaptosomas, y el análisis por WB.
La figura 15 muestra la representación esquemática de la disección de PFC de un cerebro de rata. A) Vista dorsal de un cerebro de rata y las dos líneas negras indican la ubicación de la disección para aislar la región de PFC del cerebro. B) Vista sagital de un cerebro de rata, la línea diagonal negra representa un corte para extirpar el bulbo olfativo y las dos líneas verticales negras representan cortes para aislar la región de PFC.
La figura 16 muestra el peso corporal de ratas NS y CUS el día -21 y el día 0. Tanto las ratas NS como las ratas CUS se manipularon y pesaron semanalmente. Todos los datos son media ± EEM (n=14/grupo de tratamiento). ****p < 0,0001 indica una diferencia significativa mediante ANOVA bifactorial seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey.
La figura 17 muestra el efecto de NV-5138 (I-90) sobre la SPT en ratas NS y CUS. Se trataron las ratas con Veh o NV-5138 (160 mg/kg) al final del procedimiento de NS y CUS el día 0 y se realizó la SPT 24 h tras la dosis. Se muestra la razón en volumen de sacarosa al 1 % con respecto a agua al final de una exposición de 1 h para los 4 grupos (preferencia). Todos los datos son media ± e Em (n=14/grupo de tratamiento). *p < 0,05 indica una diferencia significativa mediante ANOVA bifactorial seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. La figura 18 muestra el efecto de NV-5138 (I-90) sobre la NSFT en ratas NS y CUS. Se trataron las ratas con Veh o NV-5138 al final del procedimiento de NS y CUS y se realizó la NSFT 48 h tras la dosis. El gráfico de barras muestra la latencia a alimentarse en la NSFT. Todos los datos se muestran como media ± EEM (n=14/grupo de tratamiento). **p < 0,01 y ****p < 0,0001 indican una diferencia significativa mediante ANOVA bifactorial seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey.
La figura 19 muestra el efecto de NV-5138 (I-90) sobre la expresión de GluR1 y PSD95 en sinaptosomas preparados a partir de PFC de ratas NS y CUS.
La figura 20 muestra el cronograma del estudio para el ejemplo F. Se implantaron cánulas i.t. bilaterales en la PFC de todas las ratas, después de 5 días de aclimatación, el día -14 seguido de un periodo de recuperación de 2 semanas. El día 0 se administraron los artículos de prueba tal como se muestra en la tabla 11 de diseño del estudio.
La figura 21 muestra el efecto de la inhibición de mTORC1 en la PFC sobre la eficacia farmacológica de NV-5138 oral en la FST. A las ratas se les administró Veh-R o R por vía i.t. seguido 30 min más tarde de una administración oral de Veh-NV-5138 o NV-5138 (160 mg/kg). Se realizó la FST 24 h tras la administración oral. Todos los datos se muestran como media ± EEM (n=6-7/grupo de tratamiento). ***p < 0,001 y ****p < 0,0001 indican una diferencia significativa mediante ANOVA unifactorial seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey.
La figura 22 muestra el efecto de los tratamientos usando la evaluación de LMA. A las ratas se les administró Veh-R o R por vía i.t. seguido 30 min más tarde de una administración oral de Veh-NV-5138 o NV-5138 (I-90; 160 mg/kg). Se midió la LMA 48 h tras la administración oral. Todos los datos se muestran como media ± EEM (n=6-7/grupo de tratamiento). No se observaron diferencias significativas entre grupos mediante ANOVA unifactorial seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey.
La figura 23 muestra el efecto de la inhibición de mTORC1 en la PFC sobre la eficacia farmacológica de NV-5138 (I-90) oral. A las ratas se les administró Veh-R o R por vía i.t. seguido 30 min más tarde de una administración oral de Veh-NV-5138 o NV-5138 (160 mg/kg). Se realizó la NSFT 72 h tras la administración oral tras un periodo de ayuno de 20 h. El gráfico de barras muestra la NFST (A) y el consumo de pienso (B). Todos los datos se muestran como media ± EEM (n=6-7/grupo de tratamiento). *p < 0,05 indica una diferencia significativa mediante ANOVA unifactorial seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey.
La figura 24 muestra el estudio temporal de las pruebas conductuales del ejemplo G. Se aclimataron todas las ratas Sprague Dawley macho durante 5 días tras el envío. El día 0 se administraron los artículos de prueba tal como se muestra en la tabla 12 de diseño del estudio. Se realizó la FST el día 3 y el día 7 y se realizó la NSFT el día 10 después de un ayuno durante la noche de 20 h.
La figura 25 muestra el efecto de Ket y NV-5138 (I-90) sobre la FST a los 3 y 7 días tras la dosis. El gráfico de barras muestra la FST realizada a los 3 y 7 días tras la dosis. Vehículo de ketamina (Sal); vehículo de NV-5138 (Veh); ketamina (Ket); NV-5138 (NV). Todos los datos se muestran como media ± EEM. *p < 0,05 y **p < 0,01 indican una diferencia significativa mediante una prueba de la t de Student bilateral para datos independientes.
La figura 26 muestra el efecto de Ket y NV-5138 (I-90) sobre la NSFT a los 10 días tras la dosis. Vehículo de ketamina (Sal); vehículo de NV-5138 (Veh); ketamina (Ket); NV-5138 (NV). Los gráficos de barras muestran la NSFT realizada a los 10 días tras la dosis (A) y el consumo de pienso en jaula de alojamiento (B) (grupos 3, 4, 5 y 6). Todos los datos se muestran como media ± EEM. No se observaron diferencias significativas entre grupos mediante una prueba de la t de Student bilateral para datos independientes.
La figura 27 muestra el cronograma del estudio para el ejemplo H. Se aclimataron ratas Sprague Dawley macho al alojamiento durante 5 días y se realizó la administración de dosis el día 0 tal como se describe en la tabla 13. Veinticuatro horas tras la dosis (día 1), se sacrificaron las ratas, se prepararon cortes de cerebro y se registraron las EPSC. Luego se analizaron los cortes fijados mediante microscopía para determinar la morfología y la densidad espinal.
La figura 28 muestra la frecuencia de EPSC inducidas por 5-HT e hipocretina. El gráfico de barras muestra las EPSC inducidas por 5-hidroxitriptamina (5-HT) e hipocretina (Hcrt) en neuronas 24 h después de la administración de dosis registradas mediante registro electrofisiológico de fijación de voltaje de célula completa en PFC. El número de células mostrado se derivó de n=8 ratas. Todos los datos se expresan como media ± EEM. **p < 0,01 y ***p < 0,001 indican una diferencia significativa mediante una prueba de la t de Student bilateral para datos independientes. La figura 29 muestra el efecto de NV-5138 (I-90) sobre la morfología de dendritas. A) Imágenes bifotónicas representativas de proyecciones de apilamiento Z de alto aumento de los segmentos distal, central y proximal de la cresta apical de células piramidales de la capa V marcadas con neurobiotina 24 h después de la administración de dosis. B) Gráfico de barras que muestra la cuantificación de espinas achatadas, delgadas y con forma de seta por |jm derivadas de n=9 células/6-18 imágenes/célula aislada de 4 y 5 animales para los grupos de vehículo y NV5138, respectivamente. Todos los datos se expresan como media ± EEM. *p < 0,05 indica una diferencia significativa mediante una prueba de la t de Student bilateral para datos independientes.
La figura 30 muestra trazados de registro electrofisiológico de fijación de voltaje de célula completa de muestra de EPSC inducidas por 5-HT y Hcrt en cortes de ratas tratadas con vehículo o NV-5138 (I-90) 24 h tras la dosis.
La figura 31 muestra la distribución de probabilidad acumulada de EPSC inducidas por 5-HT y Hcrt y el efecto de NV-5138 (I-90) sobre la frecuencia, pero no sobre la amplitud.
La figura 32 muestra el cronograma del estudio para el ejemplo J. Se aclimataron ratas Sprague Dawley macho al alojamiento durante 5 días. El día -1 se sometieron las ratas a un prenatación. Comenzando el día 0, las ratas recibieron Ket o Sal en días alternos durante 7 días (del día 0 al día 6), o NV-5138 una vez al día durante 7 días (del día 0 al día 6) tal como se describe en la tabla 14.
La figura 33 muestra el efecto de Ket y NV-5138 (I-90) en la FST. Vehículo de NV-5138 (Veh); solución salina (Sal); ketamina (Ket, 10 mg/kg), NV-5138 (“Nv ”; 40 u 80 mg/kg).
La figura 34 muestra el efecto de Ket y NV-5138 (I-90) en la LMA. Vehículo de NV-5138 (Veh); solución salina (Sal); ketamina (Ket, 10 mg/kg), NV-5138 (“N<v>”; 40 u 80 mg/kg).
La figura 35 muestra el efecto de Ket y NV-5138 (I-90) en la NSFT y el control de alimentación en jaula de alojamiento. Vehículo de NV-5138 (Veh); solución salina (Sal); ketamina (Ket, 10 mg/kg), NV-5138 (“NV”; 40 u 80 mg/kg).
La figura 36 muestra el efecto de Ket (0,3 mg/kg) y NV-5138 (I-90; 160 mg/kg) en comparación con clordiazepóxido (1 mg/kg) en la prueba de amenaza humana en tití. Los datos se expresan como media ± EEM (n=10/grupo de tratamiento). *** P < 0,001 con respecto a los respectivos grupos de vehículo mediante ANOVA unifactorial seguido de la prueba de Dunnett. * indica que se observaron vómitos en 6 de los 12 animales dosificados en este grupo. La figura 37 muestra el efecto de Ket (0,3 mg/kg) y NV-5138 (I-90; 160 mg/kg) en comparación con clordiazepóxido (1 mg/kg) en el control locomotor de la prueba de amenaza humana en tití. Los datos se expresan como media ± EEM (n=10/grupo de tratamiento). *** P < 0,001 con respecto a los respectivos grupos de vehículo mediante ANOVA unifactorial seguido de la prueba de Dunnett. * indica que se observaron vómitos en 6 de los 12 animales dosificados en este grupo.
Descripción detallada de determinadas realizaciones
1. Descripción general de determinadas realizaciones de la invención:
El compuesto de la presente invención, y las composiciones del mismo, son útiles como moduladores de Sestrina-GATOR2.
2. Compuestos y definiciones:
Tal como se usa en el presente documento, se aplicarán las siguientes definiciones a menos que se indique lo contrario. Con los propósitos de esta invención, los elementos químicos se identifican según la tabla periódica de los elementos, versión CAS, Handbook of Chemistry and Physics, 75a ed. Adicionalmente, los principios generales de química orgánica se describen en “Organic Chemistry”, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999, y “March's Advanced Organic Chemistry”, 5a ed., ed.: Smith, M.B. y March, J., John Wiley & Sons, Nueva York: 2001. El término “alifático” o “grupo alifático”, tal como se usa en el presente documento, significa una cadena hidrocarbonada lineal (es decir, no ramificada) o ramificada, sustituida o no sustituida, que está completamente saturada o que contiene una o más unidades de insaturación, o un hidrocarburo monocíclico o hidrocarburo bicíclico que está completamente saturado o que contiene una o más unidades de insaturación, pero que no es aromático (también denominado en el presente documento “carbociclo”, “cicloalifático” o “cicloalquilo”), que tiene un único punto de unión a la parte restante de la molécula. A menos que se especifique lo contrario, los grupos alifáticos contienen 1-6 átomos de carbono alifáticos. En algunas realizaciones, los grupos alifáticos contienen 1-5 átomos de carbono alifáticos. En otras realizaciones, los grupos alifáticos contienen 1-4 átomos de carbono alifáticos. En todavía otras realizaciones, los grupos alifáticos contienen 1-3 átomos de carbono alifáticos, y en aún otras realizaciones, los grupos alifáticos contienen 1-2 átomos de carbono alifáticos. En algunas realizaciones, “cicloalifático” (o “carbociclo” o “cicloalquilo”) se refiere a un hidrocarburo C<3>-C<6>monocíclico que está completamente saturado o que contiene una o más unidades de insaturación, pero que no es aromático, que tiene un único punto de unión a la parte restante de la molécula. Los grupos alifáticos adecuados incluyen, pero no se limitan a, grupos alquilo, alquenilo, y alquinilo lineales o ramificados, sustituidos o no sustituidos, e híbridos de los mismos tales como (cicloalquil)alquilo, (cicloalquenil)alquilo o (cicloalquil)alquenilo.
El término “heteroátomo” significa uno o más de oxígeno, azufre, nitrógeno, fósforo, o silicio (incluyendo cualquier forma oxidada de nitrógeno, azufre, fósforo, o silicio; la forma cuaternizada de cualquier nitrógeno básico; o un nitrógeno sustituible de un anillo heterocíclico, por ejemplo, N (como en 3,4-dihidro-2H-pirrolilo), NH (como en pirrolidinilo) o NR+ (como en pirrolidinilo N-sustituido)).
El término “insaturado”, tal como se usa en el presente documento, significa que un resto tiene una o más unidades de insaturación.
Tal como se usa en el presente documento, el término “cadena hidrocarbonada lineal o ramificada, saturada o insaturada, C<1-8>(o C<1>-<6>) bivalente”, se refiere a cadenas de alquileno, alquenileno, y alquinileno bivalentes que son lineales o ramificadas tal como se define en el presente documento.
El término “alquileno” se refiere a un grupo alquilo bivalente. Una “cadena de alquileno” es un grupo polimetileno, es decir, -(CH<2>)n-, en donde n es un número entero positivo, preferiblemente desde 1 hasta 6, desde 1 hasta 4, desde 1 hasta 3, desde 1 hasta 2, o desde 2 hasta 3. Una cadena de alquileno sustituida es un grupo polimetileno en el que uno o más átomos de hidrógeno de metileno se reemplazan por un sustituyente. Los sustituyentes adecuados incluyen los descritos a continuación para un grupo alifático sustituido.
El término “alquenileno” se refiere a un grupo alquenilo bivalente. Una cadena de alquenileno sustituida es un grupo polimetileno que contiene al menos un doble enlace en el que uno o más átomos de hidrógeno se reemplazan por un sustituyente. Los sustituyentes adecuados incluyen los descritos a continuación para un grupo alifático sustituido. El término “halógeno” significa F, Cl, Br, o I.
El término “arilo” usado solo o como parte de un resto más grande como en “aralquilo”, “aralcoxilo”, o “ariloxialquilo”, se refiere a sistemas de anillos monocíclicos o bicíclicos que tienen un total de cinco a catorce miembros de anillo, en donde al menos un anillo en el sistema es aromático y en donde cada anillo en el sistema contiene de 3 a 7 miembros de anillo. El término “arilo” puede usarse de manera intercambiable con el término “anillo arilo”. En determinadas realizaciones de la presente invención, “arilo” se refiere a un sistema de anillos aromáticos que incluye, pero sin limitarse a, fenilo, bifenilo, naftilo, antracilo, y similares, que puede portar uno o más sustituyentes. Dentro del alcance del término “arilo”, tal como se usa en el presente documento, también se incluye un grupo en el que un anillo aromático está condensado con uno o más anillos no aromáticos, tales como indanilo, ftalimidilo, naftimidilo, fenantridinilo, o tetrahidronaftilo, y similares.
Los términos “heteroarilo” y “heteroar-”, usados solos o como parte de un resto más grande, por ejemplo, “heteroaralquilo”, o “heteroaralcoxilo”, se refieren a grupos que tienen de 5 a 10 átomos de anillo, preferiblemente 5, 6, ó 9 átomos de anillo; que tienen 6, 10, ó 14 electrones n compartidos en una matriz cíclica; y que tienen, además de átomos de carbono, desde uno hasta cinco heteroátomos. El término “heteroátomo” se refiere a nitrógeno, oxígeno, o azufre, e incluye cualquier forma oxidada de nitrógeno o azufre, y cualquier forma cuaternizada de un nitrógeno básico. Los grupos heteroarilo incluyen, sin limitación, tienilo, furanilo, pirrolilo, imidazolilo, pirazolilo, triazolilo, tetrazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, oxadiazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, tiadiazolilo, piridilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, indolizinilo, purinilo, naftiridinilo, y pteridinilo. Los términos “heteroarilo” y “heteroar-”, tal como se usan en el presente documento, también incluyen grupos en los que un anillo heteroaromático está condensado con uno o más anillos arilo, cicloalifáticos, o heterociclilo, donde el radical o punto de unión está en el anillo heteroaromático. Los ejemplos no limitativos incluyen indolilo, isoindolilo, benzotienilo, benzofuranilo, dibenzofuranilo, indazolilo, bencimidazolilo, benzotiazolilo, quinolilo, isoquinolilo, cinolinilo, ftalazinilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, 4H-quinolizinilo, carbazolilo, acridinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, fenoxazinilo, tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, y pirido[2,3-b]-1,4-oxazin-3(4H)-ona. Un grupo heteroarilo puede ser monocíclico o bicíclico. El término “heteroarilo” puede usarse de manera intercambiable con los términos “anillo heteroarilo”, “grupo heteroarilo”, o “heteroaromático”, cualquiera de cuyos términos incluye anillos que están opcionalmente sustituidos. El término “heteroaralquilo” se refiere a un grupo alquilo sustituido con un heteroarilo, en donde las porciones de alquilo y heteroarilo están opcionalmente sustituidas de manera independiente.
Tal como se usa en el presente documento, los términos “heterociclo”, “heterociclilo”, “radical heterocíclico”, y “anillo heterocíclico” se usan de manera intercambiable y se refieren a un resto heterocíclico monocíclico de 5 a 7 miembros o bicíclico de 7 a 10 miembros estable que está o bien saturado o bien parcialmente insaturado, y que tiene, además de átomos de carbono, uno o más, preferiblemente de uno a cuatro, heteroátomos, tal como se definió anteriormente. Cuando se usa en referencia a un átomo de anillo de un heterociclo, el término “nitrógeno” incluye un nitrógeno sustituido. Como un ejemplo, en un anillo saturado o parcialmente insaturado que tiene 0-3 heteroátomos seleccionados de oxígeno, azufre o nitrógeno, el nitrógeno puede ser N (como en 3,4-dihidro-2H-pirrolilo), NH (como en pirrolidinilo), o NR (como en pirrolidinilo W-sustituido).
Un anillo heterocíclico puede estar unido a su grupo colgante por cualquier heteroátomo o átomo de carbono que dé como resultado una estructura estable y cualquiera de los átomos de anillo puede estar opcionalmente sustituido. Los ejemplos de tales radicales heterocíclicos saturados o parcialmente insaturados incluyen, sin limitación, tetrahidrofuranilo, tetrahidrotiofenilo pirrolidinilo, piperidinilo, pirrolinilo, tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, decahidroquinolinilo, oxazolidinilo, piperazinilo, dioxanilo, dioxolanilo, diazepinilo, oxazepinilo, tiazepinilo, morfolinilo, y quinuclidinilo. Los términos “heterociclo”, “heterociclilo”, “anillo heterociclilo”, “grupo heterocíclico”, “resto heterocíclico”, y “radical heterocíclico”, se usan de manera intercambiable en el presente documento, y también incluyen grupos en los que un anillo heterociclilo está condensado con uno o más anillos arilo, heteroarilo, o cicloalifáticos, tales como indolinilo, 3H-indolilo, cromanilo, fenantridinilo, o tetrahidroquinolinilo. Un grupo heterociclilo puede ser monocíclico o bicíclico. El término “heterociclilalquilo” se refiere a un grupo alquilo sustituido con un heterociclilo, en donde las porciones de alquilo y heterociclilo están opcionalmente sustituidas de manera independiente.
Tal como se usa en el presente documento, el término “parcialmente insaturado” se refiere a un resto de anillo que incluye al menos un doble o triple enlace. Se pretende que el término “parcialmente insaturado” abarque anillos que tienen múltiples sitios de insaturación, pero no se pretende que incluya restos arilo o heteroarilo, tal como se definen en el presente documento.
Si los compuestos dados a conocer en el presente documento contienen restos “opcionalmente sustituidos”, el término “sustituido”, ya sea precedido por el término “opcionalmente” o no, significa que uno o más hidrógenos del resto designado se reemplazan por un sustituyente adecuado. A menos que se indique lo contrario, un grupo “opcionalmente sustituido” puede tener un sustituyente adecuado en cada posición sustituible del grupo, y cuando más de una posición en cualquier estructura dada puede sustituirse con más de un sustituyente seleccionado de un grupo especificado, el sustituyente puede ser o bien el mismo o bien diferente en cada posición. Combinaciones de sustituyentes previstas por esta invención son preferiblemente las que dan como resultado la formación de compuestos estables o químicamente viables. El término “estable”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a compuestos que no se alteran sustancialmente cuando se someten a condiciones para permitir su producción, detección, y, en determinadas realizaciones, su recuperación, purificación, y uso para uno o más de los propósitos dados a conocer en el presente documento.
Sustituyentes monovalentes adecuados en un átomo de carbono sustituible de un grupo “opcionalmente sustituido” son independientemente halógeno; -(CH<2>)<0-4>R°; -(CH<2>)<0-4>OR°; -O(CH<2>)cmR°, -O-(CH<2>)<0-4>C(O)OR°; -(CH<2>)<0-4>CH(OR°)<2>; -(CH<2>)<0-4>SR°; -(CH<2>)<0-4>Ph, que puede estar sustituido con R°; -(CH<2>)<0-4>O(CH<2>)<0-1>Ph que puede estar sustituido con R°; -CH=CHPh, que puede estar sustituido con R°; -(CH<2>)<0-4>O(CH<2>)<0-1>-piridilo que puede estar sustituido con R°; -NO<2>; -CN; -N<3>; -(CH2)0-4N(R°)2; -(CH2)0-4N(R°)C(O)R°; -N(R°)C(S)R°; -(CH2)0-4N(R°)C(O)NR°2; -N(R°)C(S)NR°<2>; -(CH2)0-4N(R°)C(O)OR°; -N(R°)N(R°)C(O)R°; -N(R°)N(R°)C(O)NR°2, -N(R°)N(R°)C(O)OR°; -(CH2)0-4C(O)R°; -C(S)R°; -(CH2)0-4C(O)OR°; -(CH2)0-4C(O)SR°; -(CH2)0-4C(O)OSiR°3; -(CH2)0-4OC(O)R°; -OC(O)(CH2)0-4SR-, SC(S)SR°; -(CH2)0-4SC(O)R°; -(CH2)0-4C(O)NR°2; -C(S)NR°2; -C(S)SR°; -SC(S)SR°, -(CH2)0-4OC(O)NR°2; -C(O)N(OR°)R°; -C(O)C(O)R°; -C(O)CH2C(O)R°; -C(NOR°)R°; -(CH2)0-4SSR°; -(CH2)0-4S(O)2R°; -(CH2)0-4S(O)2OR°; -(CH2)0-4OS(O)2R°; -S(R°)2NR°2; -(CH2)0-4S(O)R°; -N(R°)S(O)2NR°2; -N(R°)S(O)2R°; -N(OR°)R°; -C(NH)NR°2; -P(O)<2>R°; -P(O)R°<2>; -OP(O)R°<2>; -OP(O)(OR°)<2>; -SiR°<3>; -(alquileno lineal o ramificado C<1-4>)O-N(R°)<2>; o -(alquileno lineal o ramificado C<1-4>)C(O)O-N(R°)<2>, en donde cada R° puede estar sustituido tal como se define a continuación y es independientemente hidrógeno, grupo alifático C<1-6>, -CH<2>Ph, -O(CH<2>)<0-1>Ph, -CH<2>-(anillo heteroarilo de 5-6 miembros), o un anillo saturado, parcialmente insaturado, o arilo de 5-6 miembros que tiene 0-4 heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, o azufre, o, a pesar de la definición anterior, dos apariciones independientes de R°, tomadas junto con su(s) átomo(s) intermedio(s), forman un anillo monocíclico o bicíclico saturado, parcialmente insaturado, o arilo de 3-12 miembros que tiene 0-4 heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, o azufre, que puede estar sustituido tal como se define a continuación.
Sustituyentes monovalentes adecuados en R° (o el anillo formado tomando dos apariciones independientes de R° junto con sus átomos intermedio) son independientemente halógeno, -(CH<2>)<0-2>R^ , -(haloR^), -(CH<2>)<0-2>OH, -(CH<2>)<0-2>O R -(CH<2>)<0-2>CH(OR-)<2>; -O(haloR-), -CN, -N<3>, -(CH<2>)<0-2>C(O)R-, -(CH<2>)<0-2>C(O)OH, -(CH<2>)<0-2>C(O)OR-, -(CH<2>)<0-2>SR-, -(CH<2>)<0-2>SH, -(CH<2>)<0-2>NH<2>, -(CH<2>)<0-2>NHR-, -(CH<2>)<0-2>NR<-2>, -NO<2>, -SiRVj, -OSiRVj, -C(O)SR -(alquileno lineal o ramificado C^)C(O)OR^, o -SSR ,^ en donde cada R^ no está sustituido o cuando está precedido por “halo” está sustituido sólo con uno o más halógenos, y se selecciona independientemente de grupo alifático C<1-4>, -CH<2>Ph, -O(CH<2>)<0-1>Ph, o un anillo saturado, parcialmente insaturado, o arilo de 5-6 miembros que tiene 0-4 heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, o azufre. Sustituyentes divalentes adecuados en un átomo de carbono saturado de R° incluyen =O y =S.
Sustituyentes divalentes adecuados en un átomo de carbono saturado de un grupo “opcionalmente sustituido” incluyen los siguientes: =O, =S, =NNR<*2>, =NNHC(O)R*, =NNHC(O)OR*, =NNHS(O)<2>R*, =NR*, =NOR*, -O(C(R*<2>))<2-3>O-, o -S(C(R*<2>))<2-3>S-, en donde cada aparición independiente de R* se selecciona de hidrógeno, grupo alifático C<1-6>que puede estar sustituido tal como se define a continuación, o un anillo saturado, parcialmente insaturado, o arilo de 5-6 miembros no sustituido que tiene 0-4 heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, o azufre. Sustituyentes divalentes adecuados que están unidos a carbonos sustituibles vecinos de un grupo “opcionalmente sustituido” incluyen: -O(CR*<2>)<2-3>O-, en donde cada aparición independiente de R* se selecciona de hidrógeno, grupo alifático C<1-6>que puede estar sustituido tal como se define a continuación, o un anillo saturado, parcialmente insaturado, o arilo de 5-6 miembros no sustituido que tiene 0-4 heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, o azufre.
Sustituyentes adecuados en el grupo alifático de R* incluyen halógeno, -R^ , -(haloR^), -OH, -OR ,^ -O(haloR^), -CN, -C(O)OH, -C(O)OR^, -NH<2>, -NHR ,^ -NR^, o -NO<2>, en donde cada R^ no está sustituido o cuando está precedido por “halo” está sustituido sólo con uno o más halógenos, y es independientemente grupo alifático C<1-4>, -CH<2>Ph, -O(CH<2>)<0-1>Ph, o un anillo saturado, parcialmente insaturado, o arilo de 5-6 miembros que tiene 0-4 heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, o azufre.
Sustituyentes adecuados en un nitrógeno sustituible de un grupo “opcionalmente sustituido” incluyen -Rf , -NRf<2>, -C(O)Rt -C(O)ORt -C(O)C(O)Rt -C(O)CH<2>C(O)Rt, -S(O)<2>Rf , -S(O)<2>NR^, -C(S)NR^, -C(NH)NR^, o -N(Rt )S(O)<2>Rt ; en donde cada Rf es independientemente hidrógeno, grupo alifático C<1-6>que puede estar sustituido tal como se define a continuación, -OPh no sustituido, o un anillo saturado, parcialmente insaturado, o arilo de 5-6 miembros no sustituido que tiene 0-4 heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, o azufre, o, a pesar de la definición anteriores, dos apariciones independientes de Rf , tomadas junto con su(s) átomo(s) intermedio(s), forman un anillo monocíclico o bicíclico saturado, parcialmente insaturado, o arilo de 3-12 miembros no sustituido que tiene 0-4 heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, o azufre.
Sustituyentes adecuados en el grupo alifático de Rf son independientemente halógeno, -R^ , -(haloR^), -OH, -OR ,^ -O(haloR^), -CN, -C(O)OH, -C(O)OR^, -NH<2>, -NHR ,^ -NR^, o -NO<2>, en donde cada R^ no está sustituido o cuando está precedido por “halo” está sustituido sólo con uno o más halógenos, y es independientemente grupo alifático C<1>-<4>, -CH<2>Ph, -O(CH<2>)o-iPh, o un anillo saturado, parcialmente insaturado, o arilo de 5-6 miembros que tiene 0-4 heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, o azufre.
Tal como se usa en el presente documento, el término “sal farmacéuticamente aceptable” se refiere a aquellas sales que, dentro del alcance del criterio médico razonable, son adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales inferiores sin indebida toxicidad, irritación, respuesta alérgica, y similares, y son acordes con una relación beneficio/riesgo razonable. Las sales farmacéuticamente aceptables se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, S. M. Bergeet al.,describen sales farmacéuticamente aceptables con detalle en J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19. Las sales farmacéuticamente aceptables del compuesto de esta invención incluyen aquellas derivadas de ácidos y bases inorgánicos y orgánicos adecuados. Ejemplos de sales de adición de ácido no tóxicas farmacéuticamente aceptables son sales de un grupo amino formadas con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico y ácido perclórico o con ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico o ácido malónico o usando otros métodos usados en la técnica tales como intercambio iónico. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, benzoato, bisulfato, borato, butirato, alcanforato, alcanforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, formiato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, gluconato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, yodhidrato, 2-hidroxi-etanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, laurilsulfato, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, p-toluenosulfonato, undecanoato, valerato, y similares.
Las sales derivadas de bases apropiadas incluyen sales de metales alcalinos, metales alcalinotérreos, amonio y N+(alquilo C<1>-<4>)<4>. Las sales de metales alcalinos o alcalinotérreos representativas incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio, y similares. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen, cuando sea apropiado, cationes de amonio no tóxico, amonio cuaternario, y amina formados usando contraiones tales como haluro, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, (alquil inferior)-sulfonato y aril-sulfonato.
A menos que se indique lo contrario, también se pretende que las estructuras representadas en el presente documento incluyan todas las formas isoméricas (por ejemplo, enantioméricas, diastereoméricas, y geométricas (o conformacionales)) de la estructura; por ejemplo, las configuraciones R y S para cada centro asimétrico, isómeros de doble enlace Z y E, e isómeros conformacionales Z y E. Por tanto, los isómeros estereoquímicos individuales, así como las mezclas enantioméricas, diastereoméricas, y geométricas (o conformacionales) del presente compuesto están dentro del alcance de la invención. A menos que se indique lo contrario, todas las formas tautoméricas del compuesto de la invención están dentro del alcance de la invención. Adicionalmente, a menos que se indique lo contrario, también se pretende que las estructuras representadas en el presente documento incluyan compuestos que difieren sólo en la presencia de uno o más átomos enriquecidos isotópicamente. Por ejemplo, los compuestos que tienen las presentes estructuras que incluyen el reemplazo de hidrógeno por deuterio o tritio, o el reemplazo de un carbono por un carbono enriquecido en 13C o 14C, están dentro del alcance de esta invención. Tales compuestos son útiles, por ejemplo, como herramientas analíticas, como sondas en ensayos biológicos, o como agentes terapéuticos según la presente invención.
Tal como se usa en el presente documento, el término “mimético de leucina” se define como un compuesto que reduce la cantidad de Sestrina2 unida a GATOR2 en al menos aproximadamente el 40 % a 25 pM con respecto a la leucina. En determinadas realizaciones, el “mimético de leucina” reduce la cantidad de Sestrina2 unida a GATOR2 en al menos aproximadamente el 100 %, en al menos aproximadamente el 150 %, o en al menos aproximadamente el 200 %.
Tal como se usa en el presente documento, el término “antagonista de leucina” se define como un compuesto que aumenta la cantidad de Sestrina2 unida a GATOR2 en al menos aproximadamente el 40 % a 25 pM con respecto a la leucina (representado como -40 % de actividad de leucina). En determinadas realizaciones, el “antagonista de leucina” aumenta la cantidad de Sestrina2 unida a GATOR2 en al menos aproximadamente el 100 %, en al menos aproximadamente el 150 %, o en al menos aproximadamente el 200 %.
Los términos “afinidad medible” e “inhibir de manera medible”, tal como se usan en el presente documento, significan un cambio medible en la unión de Sestrina2 a GATOR2 entre una muestra que comprende un compuesto de la presente invención, o una composición del mismo, y Sestrina2, GATOR2 y leucina, y una muestra equivalente que comprende Sestrina2, GATOR2 y leucina, en ausencia de dicho compuesto, o dicha composición del mismo.
3. Descripción de realizaciones a modo de ejemplo:
La presente invención proporciona un compuesto de fórmula I-90, o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un método de tratamiento de depresión resistente al tratamiento. En la tabla 1 a continuación se exponen el compuesto de la presente invención y determinados compuestos a modo de ejemplo.
Tabla 1. Compuesto de la presente invención y compuestos a modo de ejemplo
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1-220 1-221
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En la tabla 2 a continuación también se exponen compuestos a modo de ejemplo.
Tabla 2. Compuestos a modo de ejemplo
4. Usos, formulación y administración
Composiciones farmacéuticamente aceptables
Según otra realización, la invención proporciona una composición que comprende el compuesto de esta invención o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo y un portador, adyuvante, o vehículo farmacéuticamente aceptable, para su uso en un método de tratamiento de depresión resistente al tratamiento. La cantidad de compuesto en las composiciones de esta invención es tal que es eficaz para inhibir o activar de manera medible la interacción Sestrina-GATOR2, en una muestra biológica o en un paciente. En determinadas realizaciones, la cantidad de compuesto en las composiciones de esta invención es tal que es eficaz para inhibir o activar de manera medible la interacción Sestrina-GATOR2, en una muestra biológica o en un paciente. En determinadas realizaciones, una composición de esta invención se formula para su administración a un paciente que necesita tal composición. En algunas realizaciones, una composición de esta invención se formula para su administración oral a un paciente.
El término “paciente”, tal como se usa en el presente documento, significa un animal, preferiblemente un mamífero, y lo más preferiblemente un ser humano.
El término “portador, adyuvante, o vehículo farmacéuticamente aceptable” se refiere a un portador, adyuvante, o vehículo no tóxico que no destruye la actividad farmacológica del compuesto con el que se formula. Los portadores, adyuvantes, o vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden usarse en las composiciones de esta invención incluyen, pero no se limitan a, intercambiadores iónicos, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas tales como albúmina sérica humana, sustancias tampón tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas parciales de glicéridos de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato de disodio, hidrogenofosfato de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias a base de celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol, y lanolina.
Las composiciones de la presente invención pueden administrarse por vía oral, por vía parenteral, mediante pulverización por inhalación, por vía tópica, por vía rectal, por vía nasal, por vía bucal, por vía vaginal, o a través de un depósito implantado. El término “parenteral”, tal como se usa en el presente documento, incluye técnicas de infusión o inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional e intracraneal. Preferiblemente, las composiciones se administran por vía oral, por vía intraperitoneal o por vía intravenosa. Las formas inyectables estériles de las composiciones de esta invención pueden ser suspensiones acuosas u oleaginosas. Estas suspensiones pueden formularse según técnicas conocidas en la técnica usando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una disolución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una disolución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse se encuentran el agua, la disolución de Ringer y la disolución isotónica de cloruro de sodio. Además, como disolvente o medio de suspensión se emplean convencionalmente aceites fijos estériles.
Con este propósito, puede emplearse cualquier aceite fijo insípido incluyendo monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos tales como el ácido oleico y sus derivados glicéridos son útiles en la preparación de inyectables, al igual que los aceites naturales farmacéuticamente aceptables, tales como el aceite de oliva o el aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas. Estas disoluciones o suspensiones oleaginosas también pueden contener un diluyente o dispersante de alcohol de cadena larga tal como carboximetilcelulosa o agentes dispersantes similares que se usan comúnmente en la formulación de formas de dosificación farmacéuticamente aceptables incluyendo emulsiones y suspensiones. Otros tensioactivos usados comúnmente tales como Tween, Span y otros agentes emulsionantes o potenciadores de la biodisponibilidad que se usan comúnmente en la fabricación de formas de dosificación farmacéuticamente aceptables sólidas, líquidas, u otras también pueden usarse con propósitos de formulación.
Las composiciones farmacéuticamente aceptables de esta invención pueden administrarse por vía oral en cualquier forma de dosificación oralmente aceptable incluyendo, pero sin limitarse a, cápsulas, comprimidos, suspensiones o disoluciones acuosas. En el caso de comprimidos para uso oral, los portadores comúnmente usados incluyen lactosa y almidón de maíz. También se añaden normalmente agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio. Para la administración oral en forma de cápsula, los diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz seco. Cuando se requieren suspensiones acuosas para uso oral, el principio activo se combina con agentes emulsionantes y de suspensión. Si se desea, también pueden añadirse determinados agentes edulcorantes, aromatizantes o colorantes.
Alternativamente, las composiciones farmacéuticamente aceptables de esta invención pueden administrarse en forma de supositorios para administración rectal. Estos pueden prepararse mezclando el agente con un excipiente no irritante adecuado que es sólido a temperatura ambiente pero líquido a la temperatura rectal y, por tanto, se fundirá en el recto para liberar el fármaco. Tales materiales incluyen manteca de cacao, cera de abejas y polietilenglicoles.
Las composiciones farmacéuticamente aceptables de esta invención también pueden administrarse por vía tópica, especialmente cuando la diana del tratamiento incluye zonas u órganos fácilmente accesibles por aplicación tópica, incluyendo enfermedades de los ojos, de la piel, o del tracto intestinal inferior. Las formulaciones tópicas adecuadas se preparan fácilmente para cada una de estas zonas u órganos.
La aplicación tópica para el tracto intestinal inferior puede efectuarse en una formulación de supositorio rectal (véase anteriormente) o en una formulación de enema adecuada. También pueden usarse parches transdérmicos tópicos. Para aplicaciones tópicas, las composiciones farmacéuticamente aceptables proporcionadas pueden formularse en una pomada adecuada que contiene el componente activo suspendido o disuelto en uno o más portadores. Los portadores para administración tópica del compuesto de esta invención incluyen, pero no se limitan a, aceite mineral, vaselina líquida, vaselina blanca, propilenglicol, polioxietileno, compuesto de polioxipropileno, cera emulsionante y agua. Alternativamente, las composiciones farmacéuticamente aceptables proporcionadas pueden formularse en una loción o crema adecuada que contiene los componentes activos suspendidos o disueltos en uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. Los portadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, aceite mineral, monoestearato de sorbitano, polisorbato 60, cera de ésteres cetílicos, alcohol cetearílico, 2-octildodecanol, alcohol bencílico y agua.
Para uso oftálmico, las composiciones farmacéuticamente aceptables proporcionadas pueden formularse como suspensiones micronizadas en solución salina isotónica estéril con pH ajustado, o, preferiblemente, como disoluciones en solución salina isotónica estéril con pH ajustado, con o sin un conservante tal como cloruro de benzalconio. Alternativamente, para usos oftálmicos, las composiciones farmacéuticamente aceptables pueden formularse en una pomada tal como vaselina.
Las composiciones farmacéuticamente aceptables de esta invención también pueden administrarse por aerosol nasal o inhalación. Tales composiciones se preparan según técnicas bien conocidas en la técnica de la formulación farmacéutica y pueden prepararse como disoluciones en solución salina, empleando alcohol bencílico u otros conservantes adecuados, promotores de la absorción para potenciar la biodisponibilidad, fluorocarbonos, y/u otros agentes solubilizantes o dispersantes convencionales.
Lo más preferiblemente, las composiciones farmacéuticamente aceptables de esta invención se formulan para administración oral. Tales formulaciones pueden administrarse con o sin alimento. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticamente aceptables de esta invención se administran sin alimento. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticamente aceptables de esta invención se administran con alimento.
La cantidad del compuesto de la presente invención que puede combinarse con los materiales portadores para producir una composición en una forma de dosificación única variará dependiendo del huésped tratado y del modo particular de administración. Preferiblemente, las composiciones proporcionadas deben formularse de modo que pueda administrarse una dosificación de entre 0,01 y 100 mg/kg de peso corporal/día del inhibidor a un paciente que recibe estas composiciones.
También debe entenderse que una pauta posológica y un régimen de tratamiento específicos para cualquier paciente particular dependerán de una variedad de factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la tasa de excreción, la combinación de fármacos, y el criterio del médico responsable y la gravedad de la enfermedad particular que esté tratándose. La cantidad de un compuesto de la presente invención en la composición también dependerá del compuesto particular en la composición.
Usos de los compuestos y las composiciones farmacéuticamente aceptables
El compuesto y las composiciones descritos en el presente documento son generalmente útiles para la inhibición o activación de la interacción Sestrina-GATOR2. En algunas realizaciones, el compuesto de fórmula I-90, o la composición del mismo, es un activador de la interacción Sestrina-GATOR2.
La actividad del compuesto utilizado en esta invención como inhibidor o activador de la interacción Sestrina-GATOR2 puede someterse a ensayoin vitro, in vivoo en una línea celular. Los ensayosin vitroincluyen ensayos que determinan la inhibición o activación de la interacción Sestrina-GATOR2. Ensayosin vitroalternativos cuantifican la capacidad del inhibidor o activador para disminuir o aumentar la unión de Sestrina a GATOR2. En los ejemplos a continuación se exponen condiciones detalladas para someter a ensayo un compuesto utilizado en esta invención como inhibidor o activador de la interacción Sestrina-GATOR2.
Tal como se usa en el presente documento, los términos “tratamiento”, “tratar”, y “que trata” se refieren a revertir, aliviar, retrasar la aparición de, o inhibir el avance de una enfermedad o un trastorno, o uno o más síntomas del mismo, tal como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el tratamiento puede administrarse después de que se hayan desarrollado uno o más síntomas. En otras realizaciones, el tratamiento puede administrarse en ausencia de síntomas. Por ejemplo, el tratamiento puede administrarse a un individuo susceptible antes de la aparición de síntomas (por ejemplo, a la luz de un historial de síntomas y/o a la luz de factores genéticos u otros factores de susceptibilidad). El tratamiento también puede continuarse después de que se hayan resuelto los síntomas, por ejemplo, para prevenir o retrasar su recidiva.
Tal como se usa en el presente documento, los términos trastornos, enfermedades, y/o afecciones “mediados por mTORC1”, tal como se usan en el presente documento, significan cualquier enfermedad u otra afección perjudicial en la que se sabe que mTORC1 desempeña un papel.
Se usa el método de activación de mTORC para tratar o prevenir la depresión (véase Ignácioet al.,(2015) Br J Clin Pharmacol. 27 de noviembre). Por consiguiente, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula I-90 (o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo), o a una composición farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un método de tratamiento de depresión resistente al tratamiento (“TRD”). En algunas realizaciones, la depresión resistente al tratamiento es resistente a tratamientos de primera línea. En algunas realizaciones, la depresión resistente al tratamiento es resistente a tratamientos de segunda línea.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona el compuesto de fórmula I-90 (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo), o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un método de tratamiento de depresión resistente al tratamiento en un paciente que lo necesita, en donde dicho paciente experimenta una reducción del 50 % en la puntuación de escala de depresión. En algunas realizaciones, el paciente experimenta una reducción del 50 % en la puntuación de escala de depresión en el plazo de menos de seis semanas de administración del compuesto o de la composición farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el paciente experimenta una reducción del 50 % en la puntuación de escala de depresión en el plazo de menos de cuatro semanas de administración del compuesto o de la composición farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el paciente experimenta una reducción del 50 % en la puntuación de escala de depresión en el plazo de dos semanas de administración del compuesto o de la composición farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el paciente experimenta una reducción del 50 % en la puntuación de escala de depresión en el plazo de menos de dos semanas de administración del compuesto o de la composición farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el paciente experimenta una reducción del 50 % en la puntuación de escala de depresión en el plazo de una semana de administración del compuesto o de la composición farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el paciente experimenta una reducción del 50 % en la puntuación de escala de depresión en el plazo de siete días de administración del compuesto o de la composición farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el paciente experimenta una reducción del 50 % en la puntuación de escala de depresión en el plazo de seis días de administración del compuesto o de la composición farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el paciente experimenta una reducción del 50 % en la puntuación de escala de depresión en el plazo de cinco días de administración del compuesto o de la composición farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el paciente experimenta una reducción del 50 % en la puntuación de escala de depresión en el plazo de cuatro días de administración del compuesto o de la composición farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el paciente experimenta una reducción del 50 % en la puntuación de escala de depresión en el plazo de tres días de administración del compuesto o de la composición farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el paciente experimenta una reducción del 50 % en la puntuación de escala de depresión en el plazo de dos días de administración del compuesto o de la composición farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el paciente experimenta una reducción del 50 % en la puntuación de escala de depresión en el plazo de un día de administración del compuesto o de la composición farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el paciente experimenta una reducción del 50 % en la puntuación de escala de depresión en el plazo de veinticuatro horas de administración del compuesto o de la composición farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la puntuación de escala de depresión se selecciona de la escala de calificación de depresión de Montgomery-Asberg (MADRS), la escala de calificación de depresión de Hamilton (HAMD-6), la escala de autoevaluación del inventario de sintomatología de la depresión (IDS-SR), y la escala de impresión clínica global-gravedad (CGI-S).
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona el compuesto de fórmula I-90 (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo), o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un método de tratamiento de depresión resistente al tratamiento en un paciente que lo necesita, que comprende la etapa de administrar por vía oral a dicho paciente el compuesto o la composición farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el paciente experimenta una reducción en la puntuación de escala de depresión comparable a la ketamina administrada a través de inyección i.p. En algunas realizaciones, la reducción en la puntuación de escala de depresión resulta de una administración oral única. En alguna realización, la reducción en la puntuación de escala de depresión resulta de una pluralidad de administraciones orales.
En algunas realizaciones, se usa el método de activación de mTORC1 para provocar una actividad antidepresiva de aparición rápida. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la presente invención proporciona el compuesto de fórmula I-90 (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo), o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un método para provocar una actividad antidepresiva de aparición rápida, en un paciente que lo necesita que padece TRD, que comprende la etapa de administrar a dicho paciente el compuesto o la composición farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunas realizaciones, la actividad antidepresiva de aparición rápida se produce en el plazo de dos semanas de administración de dicho compuesto o dicha composición. En algunas realizaciones, la actividad antidepresiva de aparición rápida se produce en el plazo de una semana de administración de dicho compuesto o dicha composición. En algunas realizaciones, la actividad antidepresiva de aparición rápida se produce en el plazo de siete días de administración de dicho compuesto o dicha composición. En algunas realizaciones, la actividad antidepresiva de aparición rápida se produce en el plazo de seis días de administración de dicho compuesto o dicha composición. En algunas realizaciones, la actividad antidepresiva de aparición rápida se produce en el plazo de cinco días de administración de dicho compuesto o dicha composición. En algunas realizaciones, la actividad antidepresiva de aparición rápida se produce en el plazo de cuatro días de administración de dicho compuesto o dicha composición. En algunas realizaciones, la actividad antidepresiva de aparición rápida se produce en el plazo de tres días de administración de dicho compuesto o dicha composición. En algunas realizaciones, la actividad antidepresiva de aparición rápida se produce en el plazo de dos días de administración de dicho compuesto o dicha composición. En algunas realizaciones, la actividad antidepresiva de aparición rápida se produce en el plazo de un día de administración de dicho compuesto o dicha composición. En algunas realizaciones, la actividad antidepresiva de aparición rápida se produce en el plazo de menos de veinticuatro horas de administración de dicho compuesto o dicha composición.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona el compuesto de fórmula I-90 (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo), o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un método para provocar una actividad antidepresiva sostenida de larga duración, en un paciente que lo necesita que padece depresión resistente al tratamiento, que comprende la etapa de administrar a dicho paciente el compuesto o la composición farmacéuticamente aceptable del mismo. El paciente que lo necesita padece TRD. En algunas realizaciones, la actividad antidepresiva sostenida de larga duración persiste durante al menos veinticuatro horas después de una administración única de un compuesto o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo proporcionado. En algunas realizaciones, la actividad antidepresiva sostenida de larga duración persiste durante más de un día. En algunas realizaciones, la actividad antidepresiva sostenida de larga duración persiste durante al menos dos días. En algunas realizaciones, la actividad antidepresiva sostenida de larga duración persiste durante al menos tres días. En algunas realizaciones, la actividad antidepresiva sostenida de larga duración persiste durante al menos cuatro días. En algunas realizaciones, la actividad antidepresiva sostenida de larga duración persiste durante al menos cinco días. En algunas realizaciones, la actividad antidepresiva sostenida de larga duración persiste durante al menos seis días. En algunas realizaciones, la actividad antidepresiva sostenida de larga duración persiste durante al menos siete días.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona el compuesto de fórmula I-90 (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo), o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un método para provocar una actividad antidepresiva en un paciente que padece TRD que es tanto de aparición rápida como sostenida de larga duración.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona el compuesto de fórmula I-90 (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo), o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un método para provocar una respuesta conductual positiva en un sujeto que padece TRD, que comprende la etapa de administrar a dicho sujeto un compuesto o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo proporcionado. En algunas realizaciones, la respuesta conductual positiva se correlaciona con una mejora en el estado de ánimo. En algunas realizaciones, la respuesta conductual positiva se correlaciona con una reducción de la ansiedad. En algunas realizaciones, la respuesta conductual positiva se corresponde con una mejora en el estado de ánimo. En algunas realizaciones, la respuesta conductual positiva se correlaciona con una capacidad mejorada para hacer frente al estrés.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona el compuesto de fórmula I-90 (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo), o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un método para provocar una respuesta conductual positiva de aparición rápida en un sujeto que padece TRD, que comprende la etapa de administrar a dicho sujeto el compuesto o la composición farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunas realizaciones, la respuesta conductual positiva se produce en el plazo de veinticuatro horas de administración. En algunas realizaciones, la respuesta conductual positiva se produce en el plazo de un día de administración. En algunas realizaciones, la respuesta conductual positiva se produce en el plazo de dos días de administración. En algunas realizaciones, la respuesta conductual positiva se produce en el plazo de tres días de administración. En algunas realizaciones, la respuesta conductual positiva se produce en el plazo de cuatro días de administración. En algunas realizaciones, la respuesta conductual positiva se produce en el plazo de cinco días de administración. En algunas realizaciones, la respuesta conductual positiva se produce en el plazo de seis días de administración. En algunas realizaciones, la respuesta conductual positiva se produce en el plazo de siete días de administración. En algunas realizaciones, la respuesta conductual positiva se produce en el plazo de una semana de administración.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona el compuesto de fórmula I-90 (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo), o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un método para provocar una respuesta conductual positiva sostenida de larga duración en un sujeto que padece TRD, que comprende la etapa de administrar a dicho paciente el compuesto o la composición farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunas realizaciones, la respuesta conductual positiva sostenida de larga duración persiste durante más de un día. En algunas realizaciones, la respuesta conductual positiva sostenida de larga duración persiste durante al menos dos días. En algunas realizaciones, la respuesta conductual positiva sostenida de larga duración persiste durante al menos tres días. En algunas realizaciones, la respuesta conductual positiva sostenida de larga duración persiste durante al menos cuatro días. En algunas realizaciones, la respuesta conductual positiva sostenida de larga duración persiste durante al menos cinco días. En algunas realizaciones, la respuesta conductual positiva sostenida de larga duración persiste durante al menos seis días. En algunas realizaciones, la respuesta conductual positiva sostenida de larga duración persiste durante al menos siete días. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona el compuesto de fórmula I-90 (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo), o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un método para provocar una respuesta conductual positiva en un sujeto que padece TRD que es tanto de aparición rápida como sostenida de larga duración.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona el compuesto de fórmula I-90 (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo), o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un método para mejorar y/o revertir defectos conductuales y sinápticos provocados por estrés crónico impredecible (CUS) en un paciente que lo necesita que padece TRD, que comprende la etapa de administrar a dicho paciente el compuesto o la composición farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunas realizaciones, el método mejora y/o revierte los defectos conductuales provocados por CUS. En algunas realizaciones, el método mejora y/o revierte los defectos sinápticos provocados por CUS. En algunas realizaciones, el defecto sináptico provocado por CUS es una disminución en la expresión de proteínas postsinápticas. En algunas realizaciones, la disminución en la expresión de proteínas postsinápticas es una disminución en la expresión de GLUR1 o PSD95. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona el compuesto de fórmula I-90 (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo), o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un método para activar la expresión de proteínas neuronales en un sujeto que padece TRD, que comprende la etapa de administrar a dicho sujeto el compuesto o la composición farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunas realizaciones, el aumento en la expresión de proteínas neuronales se produce en una neurona postsináptica. En algunas realizaciones, el aumento en la expresión de proteínas neuronales incluye una expresión aumentada de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF). En algunas realizaciones, el aumento en la expresión de proteínas neuronales incluye una expresión aumentada de receptor de glutamato 1 (GluR1). En algunas realizaciones, el aumento en la expresión de proteínas neuronales incluye una expresión aumentada de sinapsina. En algunas realizaciones, el aumento en la expresión de proteínas neuronales incluye una expresión aumentada de PSD95.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona el compuesto de fórmula I-90 (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo), o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un método para aumentar la sinaptogénesis en un sujeto que padece TRD, que comprende la etapa de administrar a dicho sujeto el compuesto o la composición farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunas realizaciones, la sinaptogénesis aumentada implica remodelación sináptica. En algunas realizaciones, la sinaptogénesis aumentada implica inducción de espinas dendríticas. En algunas realizaciones, la inducción de espinas dendríticas provoca una densidad aumentada de espinas dendríticas. En algunas realizaciones, las espinas dendríticas son espinas delgadas. En algunas realizaciones, las espinas dendríticas son espinas con forma de seta. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona el compuesto de fórmula I-90 (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo), o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un método para potenciar la función sinóptica en un sujeto que padece TRD, que comprende la etapa de administrar a dicho sujeto el compuesto o la composición farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunas realizaciones, la función sinóptica potenciada en un sujeto implica un aumento en las corrientes postsinápticas excitatorias (EPSC).
Las composiciones farmacéuticamente aceptables de esta invención pueden administrarse a seres humanos y otros animales por vía oral, por vía rectal, por vía parenteral, por vía intracisternal, por vía intravaginal, por vía intraperitoneal, por vía tópica (mediante polvos, pomadas, o gotas), por vía bucal, como un pulverización oral o nasal, o similares, dependiendo de la gravedad de la infección que esté tratándose. En determinadas realizaciones, el compuesto de la invención puede administrarse por vía oral o por vía parenteral a niveles de dosificación de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg y preferiblemente de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, de peso corporal del sujeto al día, una o más veces al día, para obtener el efecto terapéutico deseado.
Las formas de dosificación líquidas para administración oral incluyen, pero no se limitan a, emulsiones, microemulsiones, disoluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los compuestos activos, las formas de dosificación líquidas pueden contener diluyentes inertes usados comúnmente en la técnica tales como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino, y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitano, y mezclas de los mismos. Además de diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, aromatizantes, y perfumantes.
Las preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles, pueden formularse según la técnica conocida usando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una disolución, suspensión o emulsión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse se encuentran el agua, la disolución de Ringer, la disolución isotónica de cloruro sódico y U.S.P. Además, como disolvente o medio de suspensión se emplean convencionalmente aceites fijos estériles. Con este propósito, puede emplearse cualquier aceite fijo insípido incluyendo monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Además, en la preparación de inyectables se usan ácidos grasos tales como el ácido oleico.
Las formulaciones inyectables pueden esterilizarse, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias, o mediante la incorporación de agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse o dispersarse en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes de su uso.
Con el fin de prolongar el efecto del compuesto de la presente invención, a menudo es deseable ralentizar la absorción del compuesto procedente de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto puede lograrse mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con escasa solubilidad en agua. La tasa de absorción del compuesto depende entonces de su tasa de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y de la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de una forma de compuesto administrada por vía parenteral se logra disolviendo o suspendiendo el compuesto en un vehículo oleaginoso. Las formas inyectables de depósito se preparan formando matrices microencapsuladas del compuesto en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicolida. Dependiendo de la razón de compuesto con respecto a polímero y de la naturaleza del polímero particular empleado, puede controlarse la tasa de liberación del compuesto. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones inyectables de depósito también se preparan atrapando el compuesto en liposomas o microemulsiones que son compatibles con los tejidos corporales.
Las composiciones para administración rectal o vaginal son preferiblemente supositorios que pueden prepararse mezclando el compuesto de esta invención con excipientes o portadores no irritantes adecuados tales como manteca de cacao, polietilenglicol o una cera para supositorios que son sólidos a temperatura ambiente pero líquidos a la temperatura corporal y, por tanto, se funden en el recto o la cavidad vaginal y liberan el compuesto activo.
Las formas de dosificación sólidas para administración oral incluyen cápsulas, comprimidos, pastillas, polvos, y gránulos. En tales formas de dosificación sólidas, el compuesto activo se mezcla con al menos un excipiente o portador inerte farmacéuticamente aceptable tal como citrato de sodio o fosfato de dicalcio y/o a) cargas o extensores tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, y ácido silícico, b) aglutinantes tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidinona, sacarosa, y goma arábiga, c) humectantes tales como glicerol, d) agentes disgregantes tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, determinados silicatos, y carbonato de sodio, e) agentes retardantes de disolución tales como parafina, f) aceleradores de absorción tales como compuestos de amonio cuaternario, g) agentes humectantes tales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol, h) absorbentes tales como caolín y arcilla de bentonita, e i) lubricantes tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato de sodio, y mezclas de los mismos. En el caso de cápsulas, comprimidos y pastillas, la forma de dosificación también puede comprender agentes tamponantes.
También pueden emplearse composiciones sólidas de un tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina rellenas blandas y duras usando excipientes tales como lactosa o azúcar de la leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares. Las formas de dosificación sólidas de comprimidos, grageas, cápsulas, pastillas, y gránulos pueden prepararse con recubrimientos y cubiertas tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de la formulación farmacéutica. Pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y también pueden ser de una composición que sólo liberen el/los principio(s) activo(s), o preferentemente, en una determinada parte del tracto intestinal, opcionalmente, de manera retardada. Los ejemplos de composiciones de incorporación que pueden usarse incluyen sustancias poliméricas y ceras. También pueden emplearse composiciones sólidas de un tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina rellenas blandas y duras usando excipientes tales como lactosa o azúcar de la leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.
Los compuestos activos también pueden estar en forma microencapsulada con uno o más excipientes tal como se indicó anteriormente. Las formas de dosificación sólidas de comprimidos, grageas, cápsulas, pastillas, y gránulos pueden prepararse con recubrimientos y cubiertas tales como recubrimientos entéricos, recubrimientos de control de liberación y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de la formulación farmacéutica. En tales formas de dosificación sólidas, el compuesto activo puede mezclarse con al menos un diluyente inerte tal como sacarosa, lactosa o almidón. Tales formas de dosificación también pueden comprender, como es práctica normal, sustancias adicionales distintas de los diluyentes inertes, por ejemplo, lubricantes para la formación de comprimidos y otros adyuvantes para la formación de comprimidos tales como estearato de magnesio y celulosa microcristalina. En el caso de cápsulas, comprimidos y pastillas, las formas de dosificación también pueden comprender agentes tamponantes. Pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y también pueden ser de una composición que sólo liberen el/los principio(s) activo(s), o preferentemente, en una determinada parte del tracto intestinal, opcionalmente, de manera retardada. Los ejemplos de composiciones de incorporación que pueden usarse incluyen sustancias poliméricas y ceras.
Las formas de dosificación para administración tópica o transdérmica de un compuesto de esta invención incluyen pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, disoluciones, pulverizaciones, inhalantes o parches. El componente activo se mezcla en condiciones estériles con un portador farmacéuticamente aceptable y cualquier conservante o tampón necesario según pueda requerirse. También se contempla que la formulación oftálmica, las gotas óticas, y los colirios estén dentro del alcance de esta invención. Adicionalmente, la presente invención contempla el uso de parches transdérmicos, que tienen la ventaja añadida de proporcionar la administración controlada de un compuesto al cuerpo. Tales formas de dosificación pueden prepararse disolviendo o dispersando el compuesto en el medio apropiado. También pueden usarse potenciadores de absorción para aumentar el flujo del compuesto a través de la piel. La velocidad puede controlarse o bien proporcionando una membrana de control de velocidad o bien dispersando el compuesto en una matriz o un gel polimérico.
También puede estar presente un agente terapéutico adicional en las composiciones de esta invención.
En algunas realizaciones, el compuesto de fórmula I-90 se administra en combinación con un agente terapéutico antidepresivo. Los agentes terapéuticos antidepresivo son bien conocidos por un experto habitual en la técnica e incluyen inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina (“SSRI”, por ejemplo sertralina, escitalopram, citalopram, fluvoxamina, fluoxetina, paroxetina), antidepresivos (por ejemplo, bupropión, venlafaxina, mirtazapina, duloxetina, amitriptilina, imipramina, selegilina, nortriptilina, trazodona, desvenlafaxina, y aripiprazol).
En algunas realizaciones, el compuesto de fórmula I-90 se administra en combinación con un procedimiento o agente terapéutico adicional útil para tratar una o más LSD. En algunas realizaciones, un compuesto proporcionado se administra en combinación con terapia de reposición enzimática, terapia química con chaperonas, trasplante de médula ósea, terapia de reducción de sustrato, a-L-iduronidasa, N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa (arilsulfatasa B) humana recombinante, un inhibidor de la biosíntesis de glicoesfingolípidos, N-butildesoxinojirimicina (Miglustat), un iminoazúcar hidrófobo, o un inhibidor de a-galactosidasa A (por ejemplo, 1-desoxi-galactonojirimicina).
Esos agentes adicionales pueden administrarse por separado de una composición que contiene el compuesto de la invención, como parte de una pauta posológica múltiple. Alternativamente, esos agentes pueden formar parte de una forma de dosificación única, mezclada junto con un compuesto de esta invención en una única composición. Si se administran como parte de una pauta posológica múltiple, los dos agentes activos pueden facilitarse de manera simultánea, de manera secuencial, o dentro de un periodo de tiempo entre sí, normalmente en el plazo de cinco horas entre sí.
Tal como se usa en el presente documento, el término “combinación”, “combinado”, y términos relacionados se refieren a la administración simultánea o secuencial de agentes terapéuticos según esta invención. Por ejemplo, un compuesto de la presente invención puede administrarse con otro agente terapéutico de manera simultánea o secuencial en formas de dosificación unitaria separadas o conjuntamente en una forma de dosificación unitaria única. Por consiguiente, la presente invención proporciona una forma de dosificación unitaria única que comprende un compuesto de la presente invención, un agente terapéutico adicional, y un portador, adyuvante, o vehículo farmacéuticamente aceptable.
La cantidad tanto de un compuesto de la invención como de un agente terapéutico adicional (en aquellas composiciones que comprenden un agente terapéutico adicional tal como se describió anteriormente) que puede combinarse con los materiales portadores para producir una forma de dosificación única variará dependiendo del huésped tratado y del modo particular de administración. Preferiblemente, las composiciones de esta invención deben formularse de modo que pueda administrarse una dosificación de entre 0,01 y 100 mg/kg de peso corporal/día de un compuesto de la invención.
En aquellas composiciones que comprenden un agente terapéutico adicional, ese agente terapéutico adicional y el compuesto de esta invención pueden actuar sinérgicamente. Por tanto, la cantidad de agente terapéutico adicional en tales composiciones será menor que la requerida en una monoterapia que utiliza sólo ese agente terapéutico. En tales composiciones, puede administrarse una dosificación de entre 0,01 y 1.000 pg/kg de peso corporal/día del agente terapéutico adicional.
La cantidad de agente terapéutico adicional presente en las composiciones de esta invención no será mayor que la cantidad que se administraría normalmente en una composición que comprende ese agente terapéutico como único agente activo. Preferiblemente, la cantidad de agente terapéutico adicional en las composiciones descritas en el presente documento oscilará entre aproximadamente el 50 % y el 100 % de la cantidad presente normalmente en una composición que comprende ese agente como único agente terapéuticamente activo.
El compuesto de esta invención, o las composiciones farmacéuticas del mismo, también pueden incorporarse en composiciones para recubrir un dispositivo médico implantable, tal como prótesis, válvulas artificiales, injertos vasculares, endoprótesis, y catéteres. Las endoprótesis vasculares, por ejemplo, se han usado para superar la reestenosis (reestrechamiento de la pared vascular después de una lesión). Sin embargo, los pacientes que usan endoprótesis u otros dispositivos implantables corren el riesgo de formación de coágulos o activación plaquetaria. Estos efectos no deseados pueden prevenirse o mitigarse recubriendo previamente el dispositivo con una composición farmacéuticamente aceptable que comprende un inhibidor de cinasas. Otra realización de la presente invención son dispositivos implantables recubiertos con un compuesto de esta invención.
Ejemplificación
Tal como se representa en los ejemplos a continuación, en determinadas realizaciones a modo de ejemplo, se preparan compuestos según los siguientes procedimientos generales. Se apreciará que, aunque los métodos generales representan la síntesis de determinados compuestos, los siguientes métodos generales, y otros métodos conocidos por un experto habitual en la técnica, puede aplicarse a todos los compuestos y subclases y especies de cada uno de estos compuestos, tal como se describen en el presente documento.
Lista de abreviaturas usadas en la sección experimental.
4A MS: tamices moleculares de 4Á
AcOH: ácido acético
ACN: acetonitrilo
Anhid.: anhidro
Ac.: acuoso
Bn: bencilo
Boc: terc-butoxicarbonilo
CbzCl: cloroformiato de bencilo
Cbz-OSU: N-(benciloxicarboniloxi)succinimida
Cu(OAc)<2>: acetato de cobre(II)
d: días
DAST: trifluoruro de dietilaminoazufre
DBU: 1,8-diazobiciclo[5.4.0]undec-7-eno
DCE: 1,2-dicloroetano
DCM: diclorometano
DEA: dietilamina
DIBAL-H: hidruro de diisobutilaluminio
DIPEA: N,N-diisopropiletilamina
DMA: N,N-dimetilacetamida
DMAP: 4-dimetilaminopiridina
DMF: N,N-dimetilformamida
DMSO-dimetilsulfóxido
DPPA: difenilfosforilazida
EDC: clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
ee: exceso enantiomérico
ESI: ionización por electrospray
Et<3>N: trietilamina
Et<2>O: dietil éter
EtOAc: acetato de etilo
EtOH: etanol
Fmoc: fluorenilmetiloxicarbonilo
Fmoc-OSu: N-(9-fluorenilmetoxicarboniloxi)succinimida
h: horas
HATU: hexafluorofosfato de 3-óxido de 1-[bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio HCOONH<4>: formiato de amonio
HPLC: cromatografía de líquidos de alta resolución
IBX: ácido 2-yodoxibenzoico
IPA: alcohol isopropílico
KOAc: acetato de potasio
M: molar
Me: metilo
MeOH: metanol
min: minutos
ml: mililitros
mM: milimolar
mmol: milimoles
MTBE: metil terc-butil éter
NaBHaCN: cianoborohidruro de sodio
Na<2>CO<3>: carbonato de sodio
NaHCOa: bicarbonato de sodio
NMP: N-metilpirrolidina
RMN: resonancia magnética nuclear
°C: grados centígrados
PBS: solución salina tamponada con fosfato
Pd/C: paladio sobre carbono
Pd(OH)<2>/C: catalizador de Pearlman
PE: éter de petróleo
PhNH<2>: anilina
PPh<3>: trifenilfosfina
Rel.: relativo
ta: temperatura ambiente
sat.: saturado
SFC: cromatografía de fluidos supercríticos
SOCh: cloruro de tionilo
TBAB: bromuro de tetra-n-butilamonio
tBuOK: terc-butóxido de potasio
TEA: trietilamina
Tf: trifluorometanosulfonato
TfAA: anhídrido trifluorometanosulfónico
TFA: ácido trifluoroacético
TIPS: triisopropilsililo
THF: tetrahidrofurano
TMSCN: cianuro de trimetilsililo
pTSA: ácido para-toluenosulfónico
TsOH: ácido p-toluenosulfónico
A continuación se describe la preparación de compuestos a modo de ejemplo. Sólo el compuesto I-90 es según la invención.
Ejemplo 1: Ácido (S)-2-(dimetilamino)-4-metilpentanoico [I-1].
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: Ácido (S)-2-(dimetilamino)-4-metilpentanoico:
Se añadieron formaldehído (38%, 24,0 g) y Pd/C (10%, 500 mg) a una disolución de ácido (S)-2-amino-4-metilpentanoico (2,0 g, 15,24 mmol) y se filtró la disolución resultante (60 ml). Se hidrogenó la mezcla a temperatura ambiente durante dos días y se filtró para retirar el catalizador. Se concentró el filtrado hasta sequedad y se añadió EtOH (30 ml) al residuo. Se agitó la mezcla durante 1 h y se filtró. Se concentró el filtrado para proporcionar ácido (S)-2-(dimetilamino)-4-metilpentanoico (1,3 g, 8,16 mmol, 53 %) como un polvo de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 160,2 [M+H]+. 1H-RMN (400 MHz, MeOD-^): 53,47 (dd,J =4,4 Hz, 10,0 Hz, 1H), 2,85 (S, 6H), 1,89-1,74 (m, 2H), 1,62-1,55 (m, 1H), 1,00 (dd,J =2,8 Hz, 6,8 Hz, 6H).
Ejemplos 2 y 3: Clorhidrato de ácido (S)-2-amino-7,7,7-trifluoroheptanoico [I-2] y clorhidrato de ácido (R)-2-amino-7,7,7-trifluoroheptanoico [I-3].
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: 1,1,1-Trifluoro-5-yodopentano:
A una disolución de 5,5,5-trifluoropentan-1-ol (2,0 g, 14,0 mmol), imidazol (1,48 g, 21,7 mmol) y PPh<3>(5,5 g, 21,0 mmol) en DCM (40 ml) se le añadió I<2>(4,45 g, 17,5 mmol) con baño de hielo. Se calentó la mezcla hasta temperatura ambiente y se agitó durante la noche. A la mezcla de lo anterior se le añadió Et<2>O (50 ml), y luego se agitó durante 10 min. Se filtró la mezcla, y se evaporó el filtrado a 65 °C para eliminar el disolvente bajo presión atmosférica, se diluyó el residuo con Et<2>O (30 ml), se filtró la mezcla, y se usó el filtrado para la siguiente etapa. Etapa 2: (S)-2-(Difenilmetilenoamino)-7,7,7-trifluoroheptanoato de terc-butilo y (R)-2-(difenilmetilenoamino)-7,7,7-trifluoroheptanoato de terc-butilo:
A una disolución de 2-(difenilmetilenoamino)acetato de terc-butilo (2,0 g, 6,78 mmol) y TBAB (109 mg, 0,339 mmol) en tolueno (35 ml) y DCM (15 ml) se le añadió KOH (50%, 20 ml) a -10 °C, después de 5 min, se añadió la disolución anterior de 1,1,1-trifluoro-5-yodopentano en Et<2>O (30 ml) gota a gota a lo largo de 5 min, se agitó la mezcla resultante a de -10 °C a 0 °C durante 1 h. Se diluyó la disolución con agua (200 ml) y se extrajo con EA (100 ml). Se lavó la fase orgánica con agua (100 ml x 2), y salmuera (100 ml), se secó (Na<2>SO<4>), se filtró y se concentró a vacío, se purificó el producto en bruto mediante cromatografía (sílice, acetato de etilo/éter de petróleo =1/10) y luego HPLC preparativa quiral [columna, R,R-whelk-ol 4,6*250 mm 5 um; disolvente, MeOH (amoniaco en metanol al 0,2 %)] para proporcionar (S)-2-(difenilmetilenoamino)-7,7,7-trifluoroheptanoato de terc-butilo (200 mg, 0,48 mmol, 7,1 %) y (R)-2-(difenilmetilenoamino)-7,7,7-trifluoroheptanoato de terc-butilo (200 mg, 0,48 mmol, 7,1 %). (S)-2-(Difenilmetilenoamino)-7,7,7-trifluoroheptanoato de ferc-butilo (200 mg, 0,48 mmol, 7,1 %). ESI-EM (EI+, m/z): 243.1 [M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, CDCla): 88,64 (d,J= 8,0 Hz, 2H), 7,43-7,46 (m, 3H), 7,38-7,39 (m, 1H), 7,31-7,34 (m, 2H), 7,15-7,17 (m, 2H), 3,91 (dd,J= 5,5 Hz, 7,5 Hz, 1H), 2,00-2,05 (m, 2H), 1,88-1,92 (m, 2H), 1,31-1,52 (m, 13H).
(R)-2-(Difenilmetilenoamino)-7,7,7-trifluoroheptanoato de terc-butilo (200 mg, 0,48 mmol, 7,1 %). ESI-EM (EI+, m/z): 243.1 [M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, CDCla): 88,64 (d,J= 7,0 Hz, 2H), 7,43-7,46 (m, 3H), 7,38-7,39 (m, 1H), 7,31-7,34 (m, 2H), 7,15-7,17 (m, 2H), 3,92 (dd,J= 5,5 Hz, 7,5 Hz, 1H), 2,00-2,05 (m, 2H), 1,88-1,92 (m, 2H), 1,31-1,52 (m, 13H).
E tapa 3: C lo rh id ra to de ác ido (S )-2 -a m in o -7 ,7 ,7 -tr if lu o ro h e p ta n o ico [I-2 ]:
Se calentó una disolución de (S)-2-(difenilmetilenoamino)-7,7,7-trifluoroheptanoato de terc-butilo (200 mg, 0,48 mmol) en HCl 6 M (10 ml) y dioxano (5 ml) hasta 100 °C durante 17 h. Se extrajo la disolución con Et2O (10 ml x 2), se concentró la fase acuosa hasta sequedad para proporcionar clorhidrato de ácido (S)-2-amino-7,7,7-trifluoroheptanoico (I-2) como un sólido de color blanco (82,7 mg, 0,35 mmol, 74%). ESI-EM (El+, m/z): 200,1 [M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, D<2>O) 53,93 (t, J= 6,0 Hz, 1H), 2,10-2,15 (m, 2H), 1,83-1,90 (m, 2H), 1,40-1,56 (m, 4H). Etapa 4: Clorhidrato de ácido (R)-2-amino-7,7,7-trifluoroheptanoico [I-3]:
Se calentó una disolución de (R)-2-(difenilmetilenoamino)-7,7,7-trifluoroheptanoato de terc-butilo (200 mg, 0,48 mmol) en HCl 6 M (10 ml) y dioxano<( 5>ml) hasta 100 °C durante 17 h. Se extrajo la disolución con Et<2>O (10 ml x 2), se concentró la fase acuosa hasta sequedad para proporcionar clorhidrato de ácido (R)-2-amino-7,7,7-trifluoroheptanoico (I-3) como un sólido de color blanco (91,6 mg, 0,39 mmol, 82%). ESI-EM (El+, m/z): 200,1 [M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, D<2>O) 53,92 (t, J = 6,0 Hz, 1H), 2,09 -2,14 (m, 2H), 1,82 - 1,89 (m, 2H), 1,39 - 1,55 (m, 4H).
Ejemplos 4 y 5: Ácido (S)-2-amino-4,4,4-trifluorobutanoico [I-4] y ácido (R)-2-amino-4,4,4-trifluorobutanoico [I-5].
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: Ácido (S)-2-(benciloxicarbonilamino)-4,4,4-trifluorobutanoico y ácido (R)-2-(benciloxicarbonilamino)-4,4,4-trifluorobutanoico
Se añadió lentamente N-(benciloxicarboniloxi)succinimida (1,75 g, 7,01 mmol) a una disolución de ácido 2-amino-4,4,4-trifluorobutanoico (1,0 g, 6,36 mmol) y NaHCO3 (589 mg, 7,01 mmol) en acetona (60 ml) y se filtró la disolución resultante (60 ml) a 0 °C. Se agitó la mezcla a ta durante 16 h. Se extrajo la mezcla de reacción con CH<2>Cl<2>(2 x 100 ml) y se acidificó la fase acuosa con HCl (3M)a aproximadamente pH 4 y luego se extrajo con EtOAc (3 x 150 ml). Se secó la fase orgánica sobre Na<2>SO<4>y se evaporó el disolvente a vacío. Se purificó el producto en bruto resultante mediante HPLC preparativa quiral (columna, AY-H 4,6*250 mm 5 um; disolvente, EtOH) para proporcionar ácido (S)-2-(benciloxicarbonilamino)-4,4,4-trifluorobutanoico (700 mg, 2,40 mmol, 37,8 %) y ácido (R)-2-(benciloxicarbonilamino)-4,4,4-trifluorobutanoico (700 mg, 2,40 mmol, 37,8 %) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 314,0[M+Na]+.
Ácido (S)-2-(benciloxicarbonilamino)-4,4,4-trifluorobutanoico. 1H-RMN (500 MHz, DMSO-CÍ6): 513,20 (s, 1H), 7,84 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 7,40-7,30 (m, 5H), 5,06 (s, 2H), 4,31-4,27 (m, 1H), 2,85-2,58 (m, 2H).
Ácido (R)-2-(benciloxicarbonilamino)-4,4,4-trifluorobutanoico. 1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6): 5 13,21 (s, 1H), 7,85 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,38-7,30 (m, 5H), 5,06 (s, 2H), 4,31-4,27 (m, 1H), 2,83-2,59 (m, 2H).
Etapa 2: Ácido (S)-2-amino-4,4,4-trifluorobutanoico [I-4].
Se agitó una mezcla de ácido (S)-2-(benciloxicarbonilamino)-4,4,4-trifluorobutanoico (700 mg, 2,40 mmol) y Pd/C(10 %) (200 mg) en MeOH (50 ml) a ta durante 2 h bajo atmósfera de hidrógeno. Se filtró la mezcla, y se lavó la torta de filtración con MeOH (20 ml). Se concentró el filtrado para proporcionar ácido (S)-2-amino-4,4,4-trifluorobutanoico (I-4), (250 mg, 1,59 mmol, 66,3%) como un sólido de color blanco. ESI-EM (El+, m/z): 158,1 [M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6 1 gota de TFA 1 gota de D2O): 54,32 (t, J = 6,0 Hz, 1H), 3,03-2,82 (m, 2H).
E tapa 3: Á c id o (R )-2 -a m in o -4 ,4 ,4 -tr iflu o ro b u ta n o ic o [I-5 ].
Se agitó una mezcla de ácido (R)-2-(benciloxicarbonilamino)-4,4,4-trifluorobutanoico (700 mg, 2,40 mmol) y Pd/C(10 %) (200 mg) en MeOH (50 ml) a ta durante 2 h bajo atmósfera de hidrógeno. Se filtró la mezcla, y se lavó la torta de filtración con MeOH (20 ml). Se concentró el filtrado para proporcionar ácido (R)-2-amino-4,4,4-trifluorobutanoico (I-5), (250 mg, 1,59 mmol, 66,3%) como un sólido de color blanco. ESI-EM (El+, m/z): 158,1 [M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, DMSO-de+1 gota de TFA 1 gota de D<2>O): 54,31 (t,J =6,0 Hz, 1H), 3,03-2,83 (m, 2H).
Ejemplos 6 y 7: Ácido (S)-2-amino-5,5,5-trifluoropentanoico [I-6] y ácido (R)-2-amino-5,5,5-trifluoropentanoico [I-7].
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: 4,4,4-Trifluorobutanal:
A una disolución de 4,4,4-trifluorobutan-1-ol (4,0 g, 31,3 mmol) en DMSO (80 ml) se le añadió IBX (13,0 g, 46,9 mmol) bajo un baño de hielo. Se calentó la mezcla hasta temperatura ambiente y se agitó durante la noche. Se vertió la mezcla de reacción en agua (200 ml) y se extrajo con Et2O (100 ml x 2), se lavó la fase orgánica con agua (100 ml x 3), y salmuera (100 ml), se secó (Na2SO4), y se usó la disolución para la siguiente etapa.
Etapa 2: 2-(Bencilamino)-5,5,5-trifluoropentanonitrilo:
A una disolución del 4,4,4-trifluorobutanal anterior en Et2O (200 ml) se le añadió bencilamina (4 ml), AcOH (3,0 ml) y luego TMSCN (3,5 ml) con baño de hielo. Se calentó la mezcla hasta temperatura ambiente y se agitó durante la noche. Se diluyó la disolución con agua (200 ml) y se extrajo con EtOAc (100 ml), se lavó la fase orgánica con agua (100 ml x 2), y salmuera (100 ml), se secó (Na2SO4), se filtró y se concentró a vacío para proporcionar 2-(bencilamino)-5,5,5-trifluoropentanonitrilo (6,7 g, en bruto) como un sólido de color marrón que se usó para la siguiente etapa. ESI-EM (EI+, m/z): 243,1 [M+H]+.
E tapa 3: Á c id o 2 -(b e n c ila m in o )-5 ,5 ,5 -tr if lu o ro p e n ta n o ico :
Se calentó una disolución de 2-(bencilamino)-5,5,5-trifluoropentanonitrilo (6,7 g, en bruto) en HCl conc. (80 ml) y AcOH (30 ml) hasta 95 °C durante 17 h. Se concentró la disolución hasta sequedad, se diluyó con la disolución resultante filtrada (100 ml) y ACN (50 ml), se ajustó el pH a 3-4 con disolución sat. de NaHCO3, se filtró la mezcla y se secó para proporcionar ácido 2-(bencilamino)-5,5,5-trifluoropentanoico (3,5 g, 13,4 mmol, 43 % para las 3 etapas) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 262,1 [M+H]+.
Etapa 4: Ácido 2-amino-5,5,5-trifluoropentanoico:
Se agitó una mezcla de ácido 2-(bencilamino)-5,5,5-trifluoropentanoico (3,3 g, 12,6 mmol) y Pd(OH)2/C (20%, 400 mg) en AcOH (60 ml) a 30 °C durante 17 h. Se filtró la mezcla, y se concentró el filtrado hasta sequedad para proporcionar ácido 2-amino-5,5,5-trifluoropentanoico (3,0 g, en bruto) como un sólido de color marrón. ESI-EM (EI+, m/z): 172,2 [M+H]+.\
Etapa 5: Ácido (S)-2-(benciloxicarbonilamino)-5,5,5-trifluoropentanoico y ácido (R)-2-(benciloxicarbonilamino)-5,5,5-trifluoropentanoico:
A una disolución de ácido 2-amino-5,5,5-trifluoropentanoico (3,0 g, en bruto) en disolución sat. de NaHCO3 (100 ml) y acetona (100 ml) se le añadió Cbz-OSu (3,45 g, 13,9 mmol) con baño de hielo, después de 2 h. Se ajustó la mezcla a pH 3 con HCl 6 M, se extrajo con EtOAc (50 ml x 2), se lavó la fase orgánica con agua (50 ml) y salmuera (100 ml), se secó (Na2SO4), y se concentró a vacío. Se purificó el producto en bruto mediante cromatografía (sílice, acetato de etilo/éter de petróleo =1/2) y luego HPLC preparativa quiral [columna, AY-H 4,6*250 mm 5 um; disolvente, MeOH (NH<4>OH al 0,5%)] para proporcionar ácido (S)-2-(benciloxicarbonilamino)-5,5,5-trifluoropentanoico (1,50 g, 4,92 mmol, 28%, 2 etapas) y ácido (R)-2-(benciloxicarbonilamino)-5,5,5-trifluoropentanoico (1,50 g, 4,92 mmol, 28 %,\ para 2 etapas) como sólidos de color blanco.
Ácido (S)-2-(benciloxicarbonilamino)-5,5,5-trifluoropentanoico (1,50 g, 4,92 mmol, 28 % para 2 etapas). ESI-EM (EI+, m/z): 328,0 [M+Na]+. 1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6): 5 12,86 (s, 1H), 7,71 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,31-7,39 (m, 5H), 5.05 (s, 2H), 4,05-4,10 (m, 1H), 2,34-2,41 (m, 1H), 2,21-2,29 (m, 1H), 1,84-1,97 (m, 2H).
Ácido (R)-2-(benciloxicarbonilamino)-5,5,5-trifluoropentanoico (1,50 g, 4,92 mmol, 28%, 2 etapas) ESI-EM (EI+, m/z): 328,0 [M+Na]+. 1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6): 5 12,85 (s, 1H), 7,71 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,30-7,39 (m, 5H), 5.05 (s, 2H), 4,05-4,10 (m, 1H), 2,34-2,41 (m, 1H), 2,21-2,29 (m, 1H), 1,84-1,97 (m, 2H).
Etapa 6: Ácido (S)-2-amino-5,5,5-trifluoropentanoico [I-6]:
Se agitó una mezcla de ácido (S)-2-(benciloxicarbonilamino)-5,5,5-trifluoropentanoico (500 mg, 1,64 mmol) y Pd/C(10%) (50 mg) en MeOH (20 ml) a ta durante 2 h bajo hidrógeno. Se filtró la mezcla, y se lavó la torta de filtración con MeOH (20 ml). Se concentró el filtrado para proporcionar ácido (S)-2-amino-5,5,5-trifluoropentanoico (I-6) , (200 mg, 1,17 mmol, 71 %) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 172,1 [M+H]+. 1H-RMN (400 MHz, DMSO-da): 58,38 (s, 3H), 4,05 (d,J =4,4 Hz, 1H), 2,34-2,55 (m, 2H), 1,95-20,9 (m, 2H).
Etapa 7: Ácido (R)-2-amino-5,5,5-trifluoropentanoico [I-7]:
Se agitó una mezcla de ácido (R)-2-(benciloxicarbonilamino)-5,5,5-trifluoropentanoico (500 mg, 1,64 mmol) y Pd/C(10%) (50 mg) en MeOH (20 ml) a ta durante 2 h bajo hidrógeno. Se filtró la mezcla, y se lavó la torta de filtración con MeOH (20 ml). Se concentró el filtrado para proporcionar ácido (R)-2-amino-5,5,5-trifluoropentanoico (I-7) , (160 mg, 0,94 mmol, 57%) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 172,1 [M+H]+. 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6): 58,38 (s, 3H), 4,05 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 2,34-2,55 (m, 2H), 1,95-20,9 (m, 2H).
Ejemplos 8 y 9: Ácido (S)-2-amino-6,6,6-trifluorohexanoico [I-8] y ácido (R)-2-amino-6,6,6-trifluorohexanoico [I-9].
Esquema de síntesis:
Procedimiento y caracterización:
Etapa 1: Ácido (S)-2-(benciloxicarbonilamino)-6,6,6-trifluorohexanoico y ácido (R)-2-(benciloxicarbonilamino)-6,6,6-trifluorohexanoico
Se añadió lentamente carbonocloridato de bencilo (554 mg, 3,25 mmol) a una disolución de ácido 2-amino-6,6,6-trifluorohexanoico (556 mg, 2,5 mmol) y NaOH 1 M (25 ml, 25 mmol) en THF (25 ml) at 0 °C, se agitó la mezcla a ta durante 16 h. Se extrajo la mezcla de reacción con DCM (2 x 100 ml) y se acidificó la fase acuosa con HCl (3 M) a aproximadamente pH 4 y luego se extrajo con EtOAc (3 x 50 ml). Se secó la fase orgánica sobre Na2SO4 y se evaporó el disolvente a vacío. Se purificó el producto en bruto resultante mediante HPLC preparativa quiral (columna: AY-H (250*4,6 mm 5 um); fase móvil: n-hexano (DEA al 0,1 %):EtOH (DEA al 0,1 %) = 90:10) para proporcionar ácido (S)-2-(benciloxicarbonilamino)-6,6,6-trifluorohexanoico (232 mg, 0,73 mmol, 29 %) y ácido (R)-2-(benciloxicarbonilamino)-6,6,6-trifluorohexanoico (250 mg, 0,78 mmol, 31,3 %) como sólidos de color blanco. ESl-EM (EI+, m/z): 342,0 [M+Na]+.
Ácido (S)-2-(benciloxicarbonilamino)-6,6,6-trifluorohexanoico, 1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6): 5 12,68 (s, 1H), 7,66 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,38-7,32 (m, 5H), 5,04 (s, 2H), 4,00-3,96 (m, 1H), 2,28-2,19 (m, 2H), 1,80-1,51 (m, 4H).
Ácido (R)-2-(benciloxicarbonilamino)-6,6,6-trifluorohexanoico, 1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6): 5 12,68 (s, 1H), 7,67 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,38-7,30 (m, 5H), 5,04 (s, 2H), 4,00-3,96 (m, 1H), 2,33-2,15 (m, 2H), 1,82-1,51 (m, 4H).
Etapa 2: Ácido (S)-2-amino-6,6,6-trifluorohexanoico [I-8].
Se agitó una mezcla de ácido (S)-2-(benciloxicarbonilamino)-6,6,6-trifluorohexanoico (200 mg, 0,63 mmol) y Pd/C (10 %) (50 mg) en MeOH (20 ml) a ta durante 2 h bajo atmósfera de hidrógeno. Se filtró la mezcla, y se lavó la torta de filtración con MeOH (20 ml). Se concentró el filtrado para proporcionar ácido (S)-2-amino-6,6,6-trifluorohexanoico (I-8), (56,2 mg, 0,30 mmol, 48,2%) como un sólido de color blanco. ESl-EM (EI+, m/z): 186,1 [M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, DMSO-de+1 gota de TFA 1 gota de D<2>O): 53,99 (t,J =5,5 Hz, 1H), 2,32-2,30 (m, 2H), 1,91-1,83 (m, 2H), 1,70-1,57 (m, 2H).
Etapa 3: Ácido (R)-2-amino-6,6,6-trifluorohexanoico [I-9].
Se agitó la mezcla de ácido (R)-2-(benciloxicarbonilamino)-6,6,6-trifluorohexanoico (250 mg, 0,78 mmol) y Pd/C (10 %) (50 mg) en MeOH (20 ml) a ta durante 2 h bajo atmósfera de hidrógeno. Se filtró la mezcla, y se lavó la torta de filtración con MeOH (20 ml). Se concentró el filtrado para proporcionar ácido (R)-2-amino-6,6,6-trifluorohexanoico (I-9), (48,8 mg, 0,26 mmol, 33,8%) como un sólido de color blanco. ESl-EM (EI+, m/z): 186,1 [M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, DMSO-de+1 gota de TFA 1 gota de D<2>O): 53,98 (t,J =6,5 Hz, 1H), 3,33-2,28 (m, 2H), 1,93-1,81 (m, 2H), 1,71-1,54 (m, 2H).
Ejemplo 11: Ácido (S)-2-(bencilamino)-4-metilpentanoico [I-11].
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: (S)-2-(Bencilamino)-4-metilpentanoato de bencilo:
A una disolución con agitación de p-toluenosulfonato de éster bencílico de L-leucina (800 mg, 2,0 mmol) en MeOH (30 ml) se le añadió benzaldehído (0,26 g, 2,4 mmol) y acetato de potasio (0,4 g, 4,1 mmol), y se agitó la mezcla durante 30 min a ta, luego se le añadió cianoborohidruro de sodio (0,2 g, 3,0 mmol), se agitó la mezcla durante otras 5 h a ta. Se extinguió la mezcla con disolución sat. de NaHCO3 (50 ml), se extrajo con EtOAc (50 ml x 2), se lavó con la disolución resultante filtrada (50 ml) y salmuera (50 ml). Se concentró la fase orgánica purificada mediante HPLC preparativa (Boston C1821*250 mm 10 ^m, fase móvil: A: ácido trifluoroacético al 0,1 %; B: acetonitrilo) para proporcionar (S)-2-(bencilamino)-4-metilpentanoato de bencilo (200 mg, 0,64 mmol, 32 %) como un aceite incoloro. EM (EI+, m/z): 312,3 [M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, MeOD): 57,41~7,49 (m, 10H), 5,34 (dd, J = 12,0 Hz, 45,0 Hz, 2H), 4,23 (q, J = 12,0 Hz, 2H), 4,07~4,09 (m, 3H), 1,68~1,85 (m, 3H), 0,94 (dd, J = 8,5 Hz, 20,5 Hz, 6H).
Etapa 2: Ácido (S)-2-(bencilamino)-4-metilpentanoico [I-11]:
A una disolución con agitación de (S)-2-(bencilamino)-4-metilpentanoato de bencilo (50 mg, 0,16 mmol) en MeOH (5 ml) se le añadió NaOH 1 M (0,5 ml). Se agitó la reacción durante 4 h a ta. Se concentró la disolución resultante y se purificó el residuo mediante HpLC preparativa (Boston C18 21*250 mm 10 ^m, fase móvil: A: ácido trifluoroacético al 0,1 %; B: acetonitrilo) para proporcionar ácido (S)-2-(bencilamino)-4-metilpentanoico (I-11), (21 mg, 0,095 mmol, 58%) como un sólido de color blanco EM (EI+, m/z): 222,2 [M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6): 5 9,32 (s, 1H), 7,43~7,50 (m, 5H), 4,17 (dd, J = 13,0 Hz, 44,0 Hz, 2H), 3,82 (t, J = 6,5 Hz, 1H), 1,68~1,76 (m, 3H), 0,85~0,90 (m, 6H).
Ejemplo 12: Ácido (S)-4-metil-2-(2-fenilacetamido)pentanoico [I-12]:
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: (S)-4-Metil-2-(2-fenilacetamido)pentanoato de bencilo:
A una disolución de p-toluenosulfonato de éster bencílico de L-leucina (500 mg, 1,27 mmol), ácido 2-fenilacético (260 mg, 1,91 mmol) y HATU (726 mg, 1,91 mmol) en DMF (10 ml) se le añadió DIPEA (410 mg, 3,18mmol) y se agitó la disolución durante 2 h a ta. Se purificó la disolución mediante HPLC preparativa (Boston C1821 *250 mm 10 ^m, fase móvil: A: ácido trifluoroacético al 0,1%; B: acetonitrilo) para proporcionar (S)-4-metil-2-(2-fenilacetamido)pentanoato de bencilo (300 mg, 0,88 mmol, 70 %) como un sólido de color blanco. EM (EI+, m/z): 340.2 [M+H]+.
Etapa 2: Ácido (S)-4-metil-2-(2-fenilacetamido)pentanoico [I-12]:
A una disolución con agitación de (S)-4-metil-2-(2-fenilacetamido)pentanoato de bencilo (250 mg, 0,74 mmol) en EtOH (10 ml) se le añadió una cantidad catalítica de Pd/C (10 %, 20 mg). Se agitó la reacción bajo atmósfera de hidrógeno durante 3 h a 50 °C. Se filtró la disolución resultante y se concentró para proporcionar ácido (S)-4-metil-2-(2-fenilacetamido)pentanoico (I-12), (100 mg, 0,40 mmol, 54%) como un sólido de color blanco. e M (EI+, m/z): 250.2 [M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, MeOD): 57,24-7,32 (m, 5H), 4,44 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 3,58 (s, 2H), 1,64-1,68 (m, 3H), 0,96 (d, J = 6,0 Hz, 3H), 0,91 (d, J = 6,0 Hz, 3H).
Ejemplo 13: Ácido (S)-2-(isopropilamino)-4-metilpentanoico [I-13]:
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: (S)-2-(Isopropilamino)-4-metilpentanoato de bencilo:
A una disolución con agitación de p-toluenosulfonato de éster bencílico de L-leucina (1,0 g, 2,53 mmol) en MeOH (30 ml) se le añadió acetona (177 mg, 3,05 mmol) y acetato de potasio (0,5 g, 5,08 mmol), y se agitó la mezcla durante 30 min a ta, luego se le añadió cianoborohidruro de sodio (0,24 g, 3,81 mmol), se agitó la mezcla durante otras 3 h a ta. Se extinguió la mezcla con disolución sat. de NaHCO3 (50 ml), se extrajo con EtOAc (50 ml x 2), se lavó con la disolución resultante filtrada (50 ml) y salmuera (50 ml). Se concentró la fase orgánica purificada mediante HPLC preparativa (Boston C18 21*250 mm 10 pm, fase móvil: A: ácido trifluoroacético al 0,1 %; B: acetonitrilo) para proporcionar (S)-2-(isopropilamino)-4-metilpentanoato de bencilo (200 mg, 0,76 mmol, 30 %) como un aceite incoloro. EM (EI+, m/z): 264,3 [M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, MeOD): 87,22~7,29 (m, 5H), 5,07 (dd, J = 11,5 Hz, 17,0 Hz, 2H), 3,33(dd, J = 6,5 Hz, 8,5 Hz, 1H), 2,54~2,59 (m, 1H), 1,30~1,48 (m, 3H), 0,72~0,94 (m, 12H). Etapa 2: Ácido (S)-2-(isopropilamino)-4-metilpentanoico [I-13]:
A una disolución con agitación de (S)-2-(isopropilamino)-4-metilpentanoato de bencilo (200 mg, 0,76 mmol) en MeOH (10 ml), se le añadió una cantidad catalítica de Pd/C (10 %, 50 mg). Se agitó la reacción bajo atmósfera de hidrógeno durante 24 h a ta. Se filtró la disolución resultante y se concentró la filtración para proporcionar ácido (S)-2-(isopropilamino)-4-metilpentanoico (I-13), (100 mg, 0,57 mmol, 76%) como un sólido de color blanco. EM (EI+, m/z): 174,3 [M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, MeOD): 83,56 (dd, J = 6,0 Hz, 8,5 Hz, 1H), 3,33~3,40 (m, 1H), 1,75~1,86 (m, 2H), 1,53~1,58 (m, 1H), 1,31~1,36 (m, 6H), 0,96~1,02 (m, 6H). 3,85 (dd, J = 5,5 Hz, 8,5 Hz, 1H), 2,87 (q, J = 6,0 Hz, 1H), 2,68 (dd,J =7,5 Hz, 12,0 Hz, 1H), 1,92~1,99 (m, 1H), 1,65~1,78 (m, 3H), 0,88~0,96 (m, 12H).
Ejemplo 14: Ácido (S)-2-(isobutilamino)-4-metilpentanoico [I-14]:
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: (S)-2-(Isobutilamino)-4-metilpentanoato de bencilo:
A una disolución con agitación de p-toluenosulfonato de éster bencílico de L-leucina (1,0 g, 2,53 mmol) en MeOH (30 ml) se le añadió isobutiraldehído (0,22 g, 3,05 mmol) y acetato de potasio (0,5 g, 5,08 mmol), y se agitó la mezcla durante 30 min a ta, luego se le añadió cianoborohidruro de sodio (0,24 g, 3,81 mmol). Se agitó la mezcla durante otras 5 h a ta. Se extinguió la mezcla con disolución sat. de NaHCO3 (50 ml), se extrajo con EtOAc (50 ml x 2), se lavó con la disolución resultante filtrada (50 ml) y salmuera (50 ml). Se concentró la fase orgánica purificada mediante HPLC preparativa (Boston C18 21 *250 mm 10 ^m, fase móvil: A: ácido trifluoroacético al 0,1 %; B: acetonitrilo) para proporcionar (S)-2-(isobutilamino)-4-metilpentanoato de bencilo (300 mg, 1,08 mmol, 50 %) como un aceite incoloro. EM (EI+, m/z): 278,2 [M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6): 59,16 (s, 1H), 9,14 (d, J = 17,5 Hz, 2H), 7,42-7,43 (m, 5H), 5,28 (q, J = 12,0 Hz, 2H), 4,08-4,09 (m, 1H), 2,87-2,89 (m, 1H), 2,65-2,66 (m, 1H), 1,91-1,95 (m, 1H), 1,62~1,71 (m, 3H), 0,88~0,94 (m, 12H).
Etapa 2: Ácido (S)-2-(isobutilamino)-4-metilpentanoico [I-14]:
A una disolución con agitación de (S)-2-(isobutilamino)-4-metilpentanoato de bencilo (300 mg, 1,08 mmol) en MeOH (10 ml), se le añadió una cantidad catalítica de Pd/C (10%, 50 mg). Se agitó la reacción bajo atmósfera de hidrógeno durante 24 h a ta. Se filtró la disolución resultante y se concentró la filtración para proporcionar ácido (S)-2-(isobutilamino)-4-metilpentanoico (I-14), (150 mg, 0,8 mmol, 74 %) como un sólido de color blanco. EM (EI+, m/z): 188,3 [M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6): 58,82 (s, 2H), 3,85 (dd, J = 5,5 Hz, 8,5 Hz, 1H), 2,87 (q, J = 6,0 Hz, 1H), 2,68 (dd, J = 7,5 Hz, 12,0 Hz, 1H), 1,92~1,99 (m, 1H), 1,65~1,78 (m, 3H), 0,88~0,96 (m, 12H).
Ejemplo 15: Ácido (S)-2-benzamido-4-metilpentanoico [I-15]:
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: (S)-2-Benzamido-4-metilpentanoato de bencilo:
A una disolución de p-toluenosulfonato de éster bencílico de L-leucina (500 mg, 1,27 mmol), ácido benzoico (223 mg, 1,91 mmol) y HATU (726 mg, 1,91 mmol) en DMF (10 ml) se le añadió DIPEA (410 mg, 3,18mmol) y se agitó la disolución durante 2 h a ta. Se purificó la disolución mediante HPLC preparativa (Boston C1821*250 mm 10 ^m, fase móvil: A: ácido trifluoroacético al 0,1 %; B: acetonitrilo) para proporcionar (S)-2-benzamido-4-metilpentanoato de bencilo (300 mg, 0,92 mmol, 73 %) como un sólido de color blanco. EM (EI+, m/z): 326,2 [M+H]+.
Etapa 2: Ácido (S)-2-benzamido-4-metilpentanoico [I-15]:
A una disolución con agitación de (S)-2-benzamido-4-metilpentanoato de bencilo (100 mg, 0,46 mmol) en EtOH (10 ml) se le añadió una cantidad catalítica de Pd/C (10 %, 20 mg). Se agitó la reacción bajo atmósfera de hidrógeno durante 3 h a 50 °C. Se filtró la disolución resultante y se concentró para proporcionar ácido (S)-2-benzamido-4-metilpentanoico (I-15), (100 mg, 0,42 mmol, 65 %) como un sólido de color blanco. EM (EI+, m/z): 236,2 [M+H]+. 1H-RMN (400 MHz, MeOD): 57,87 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 7,47-7,57 (m, 3H), 4,69 (dd, J = 4,0 Hz, 11,0 Hz, 1H), 1,75-1,84 (m, 3H), 1,01 (dd, J = 6,5 Hz, 10,5 Hz, 6H).
Ejemplo 16: Ácido (S)-2-isobutiramido-4-metilpentanoico [I-16]:
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: (S)-2-Isobutiramido-4-metilpentanoato de bencilo:
A una disolución de p-toluenosulfonato de éster bencílico de L-leucina (500 mg, 1,27 mmol), ácido isobutírico (168 mg, 1,91 mmol) y HATU (726 mg, 1,91 mmol) en DMF (10 ml) se le añadió DIPEA (410 mg, 3,18 mmol) y se agitó la disolución durante 2 h a ta. Se purificó la disolución mediante HPLC preparativa (Boston C18 21*250 mm 10 ^m, fase móvil: A: ácido trifluoroacético al 0,1 %; B: acetonitrilo) para proporcionar (S)-2-isobutiramido-4-metilpentanoato de bencilo (300 mg, 1,03 mmol, 81 %) como un sólido de color blanco. EM (EI+, m/z): 292,2 [M+H]+. Etapa 2: Ácido (S)-2-isobutiramido-4-metilpentanoico [I-16]:
A una disolución con agitación de (S)-2-(ciclohexanocarboxamido)-4-metilpentanoato de bencilo (200 mg, 0,69 mmol) en EtOH (10 ml) se le añadió una cantidad catalítica de Pd/C (10 %, 20 mg). Se agitó la reacción bajo atmósfera de hidrógeno durante 3 h a 50 °C. Se filtró la disolución resultante y se concentró para proporcionar ácido (S)-2-isobutiramido-4-metilpentanoico (100 mg, 0,50 mmol, 73%) como un sólido de color blanco. EM (EI+, m/z): 202,2 [M+H]+. 1H-RMN (400 MHz, MeOD): 54,43 (t, J = 6,4 Hz, 1H), 2,49-2,56 (m, 1H), 1,60-1,74 (m, 3H), 1,12 (dd, J = 2,4 Hz, 6,8 Hz, 6H), 0,96 (dd, J = 6,4 Hz, 16,0 Hz, 6H).
Ejemplo 17: Ácido (S)-2-(ciclohexanosulfonamido)-4-metilpentanoico [I-17]:
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: (S)-2-(Ciclohexanosulfonamido)-4-metilpentanoato de bencilo:
A una disolución de (S)-2-amino-4-metilpentanoato de bencilo y 4-metilbencenosulfonato (500 mg, 1,27 mmol) y Et3N (642,89 mg, 6,35 mmol) en d Mf (3 ml), enfriada con un baño de hielo, se le añadió cloruro de ciclohexanosulfonilo (278,53 mg, 1,52 mmol). Se agitó la mezcla a 25 °C durante 2 h. Se diluyó la disolución con acetato de etilo (10 ml), se lavó con la disolución resultante filtrada (10 ml x 3) y salmuera (10 ml), se secó con sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró a vacío. Se purificó el producto en bruto mediante HPLC preparativa (Boston C1821*250 mm 10 ^m, fase móvil: A: ácido trifluoroacético al 0,1 %; B: acetonitrilo) para proporcionar (S)-2-(ciclohexanosulfonamido)-4-metilpentanoato de bencilo (200 mg, 0,544 mmol, 98 %) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 368,3 [M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6) 57,70 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 7,38 (t, J = 6,5 Hz, 4H), 7,37 - 7,32 (m, 1H), 5,14 (q, J = 12,5 Hz, 2H), 3,91 (td, J = 5,0 Hz, 9,5 Hz, 1H), 2,69-2,74 (m, 1H), 2,05 (d, J = 12,5 Hz, 1H), 1,97 (d, J = 12,5 Hz, 1H), 1,74 - 1,67 (m, 2H), 1,57 - 1,51 (m, 2H), 1,50 - 1,44 (m, 1H), 1,36 - 0,99 (m, 5H), 0,87 (dt, J = 10,5 Hz, J = 20,5 Hz, 6H).
Etapa 2: Ácido (S)-2-(ciclohexanosulfonamido)-4-metilpentanoico [I-17]:
A una disolución de (S)-2-(ciclohexanosulfonamido)-4-metilpentanoato de bencilo (192 mg, 0,552 mmol) en EtOH (3 ml), se le añadió Pd/C (20mg, 10 %). Se agitó la mezcla de reacción a 50 °C durante 4 h bajo hidrógeno. Se filtró la mezcla, y se lavó la torta de filtración con MeOH (10 ml). Se concentró el filtrado para proporcionar ácido (S)-2-(ciclohexanosulfonamido)-4-metilpentanoico (I-17), (23,3 mg, 0,084 mmol, 100%) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 300,2 [M+Na]+. 1H-RMN (500 MHz, DMSO-da) 512,75 (s, 1H), 7,47 (d,J =9,0 Hz, 1H), 3,76 (td,J= 5,0Hz, 9,5 Hz, 1H), 2,82 - 2,69 (m, 1H), 2,18 - 1,97 (m, 2H), 1,82 - 1,69 (m, 3H), 1,61 (d,J= 12,5Hz, 1H), 1,54 1,40 (m, 2H), 1,39 - 1,07 (m, 5H), 0,95 - 0,80 (m, 6H).
Ejemplo 18: Ácido (S)-4-metil-2-(fenilmetilsulfonamido)pentanoico [I-18]:
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: (S)-4-Metil-2-(fenilmetilsulfonamido)pentanoato de bencilo:
A una disolución de (S)-2-amino-4-metilpentanoato de bencilo y 4-metilbencenosulfonato (500 mg, 1,27 mmol) y Et3N (642,89 mg, 6,35 mmol) en DMF (3 ml), enfriada con un baño de hielo, se le añadió cloruro de fenilmetanosulfonilo (290,71 mg, 1,52 mmol). Se agitó la mezcla a 25 °C durante 2 h. Se diluyó la disolución con acetato de etilo (10 ml), se lavó con la disolución resultante filtrada (10 ml x 3) y salmuera (10 ml), se secó con sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró a vacío. Se purificó el producto en bruto mediante HPLC preparativa (Boston C1821*250 mm 10 ^m, fase móvil: A: ácido trifluoroacético al 0,1 %; B: acetonitrilo) para proporcionar (S)-4-metil-2-(fenilmetilsulfonamido)pentanoato de bencilo (149 mg, 0,396 mmol, 90%) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 398,0 [M+Na]+. 1H -RMN (500 MHz, DMSO-d6) 57,81 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,52 - 7,18 (m, 9H), 5,15 (s, 2H), 4,28 (dd, J = 13,5 Hz, 44,5 Hz, 2H), 3,87 (dd, J = 8,0 Hz, 15,0 Hz, 1H), 1,57 - 1,15 (m, 4H), 0,82 (dd, J = 4,5 Hz, 6,0 Hz, 6H).
Etapa 2: Ácido (S)-4-metil-2-(fenilmetilsulfonamido)pentanoico [I-18]:
A una disolución de (S)-4-metil-2-(fenilmetilsulfonamido)pentanoato de bencilo (121 mg, 0,322 mmol) en EtOH (3 ml), se le añadió Pd/C (20mg,10 %). Se agitó esta mezcla de reacción a 50 °C durante 4 h bajo hidrógeno. Se filtró la mezcla, y se lavó la torta de filtración con MeOH (10 ml). Se concentró el filtrado para proporcionar ácido (S)-4-metil-2-(fenilmetilsulfonamido)pentanoico (I-18), (41,2 mg, 0,144 mmol, 100%) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 308,0 [M+Na]+. 1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6) 512,77 (s, 1H), 7,59 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,47 -7,25 (m, 5H), 4,30 (dd, J = 13,5 Hz, 37,0 Hz, 2H), 3,75 (dd, J = 7,5 Hz, 15,5 Hz, 1H), 1,65 (dt, J = 6,5 Hz, 13,5 Hz, 1H), 1,45 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 0,85 (dd, J = 1,5 Hz, 6,5 Hz, 6H).
Ejemplo 19: Ácido (S)-4-metil-2-(metilsulfonamido)pentanoico [I-19]:
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: (S)-4-Metil-2-(metilsulfonamido)pentanoato de bencilo:
A una disolución de (S)-2-amino-4-metilpentanoato de bencilo y 4-metilbencenosulfonato (500 mg, 1,27 mmol) y Et3N (642,89 mg, 6,35 mmol) en DMF (3 ml), enfriada con un baño de hielo, se le añadió cloruro de metanosulfonilo (290,71 mg, 1,52 mmol), se agitó la mezcla a 25 °C durante 2 h. Se diluyó la disolución con acetato de etilo (10 ml), se lavó con la disolución resultante filtrada (10 ml x 3) y salmuera (10 ml), se secó con sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró a vacío. Se purificó el producto en bruto mediante HPLC preparativa (Boston C1821*250 mm 10 ^m, fase móvil: A: ácido trifluoroacético al 0,1 %; B: acetonitrilo) para proporcionar (S)-4-metil-2-(metilsulfonamido)pentanoato de bencilo (192 mg, 0,641 mmol, 98 %) como un sólido de color blanco. ESl-EM (EI+, m/z): 323,0 [M+Na]+. 1H -RMN (500 MHz, DMSO-de) 57,79 (d,J =8,8 Hz, 1H), 7,42 - 7,36 (m, 4H), 7,37 - 7,32 (m, 1H), 5,16 (s, 2H), 3,97 (td,J =6,0 Hz, 9,0 Hz, 1H), 2,85 (s, 3H), 1,68 (dq,J =6,5 Hz, 13,0 Hz, 1H), 1,54 - 1,46 (m, 2H), 0,91 -0,82 (m, 6H).
Etapa 2: Ácido (S)-4-metil-2-(metilsulfonamido)pentanoico [I-19]:
A una disolución de (S)-4-metil-2-(metilsulfonamido)pentanoato de bencilo (149 mg, 0,497 mmol) en EtOH (3 ml) se le añadió Pd/C (20 mg,10 %). Se agitó esta mezcla de reacción a 50 °C durante 4 h bajo atmósfera de hidrógeno. Se filtró la mezcla, y se lavó la torta de filtración con MeOH (10 ml). Se concentró el filtrado para proporcionar ácido (S)-4-metil-2-(metilsulfonamido)pentanoico (I-19), (31,4 mg, 0,150 mmol, 100%) como un sólido de color blanco. ESl-EM (EI+, m/z): 232,1 [M+Na]+. 1H-RMN (500 MHz, DMSO-de) 512,82 (s, 1H), 7,56 (d,J=9,0 Hz, 1H), 3,82 (dd,J = 8,0Hz, 15,5 Hz, 1H), 2,88 (s, 3H), 1,72 (dt,J =6,5 Hz, 13,0 Hz, 1H), 1,48 (t,J =7,0 Hz, 2H), 0,89 (t,J =7,0 Hz, 6H). Ejemplo 20: (S)-2-amino-4-metil-N-fenilpentanamida [I-20]:
Etapa 1: (S)-4-Metil-1-oxo-1-(fenilamino)pentan-2-il-carbamato de bencilo:
A una disolución de ácido (S)-2-(benciloxicarbonilamino)-4-metilpentanoico (1,0 g, 3,77 mmol) en DMF (20 ml) se le añadió anilina (702 mg, 7,55 mmol), HATU (1,72 g, 4,52 mmol) y Et3N (1,14 g, 11,31 mmol) a ta. Después de 2 h, se diluyó la disolución con EtOAc (80 ml), se lavó con la disolución resultante filtrada (80 ml x 3) y salmuera (80 ml), se secó (Na2SO4), se filtró y se concentró a vacío. Se purificó el producto en bruto mediante cromatografía (sílice, acetato de etilo/éter de petróleo =1/3) para proporcionar (S)-4-metil-1-oxo-1-(fenilamino)pentan-2-il-carbamato de bencilo (350 mg, 1,03 mmol, 27 %) como un sólido de color blanco. ESl-EM (EI+, m/z): 341,1 [M+H]+.
Etapa 2: (S)-2-Amino-4-metil-N-fenilpentanamida [I-20]:
Se agitó una mezcla de (S)-4-metil-1-oxo-1-(fenilamino)pentan-2-il-carbamato de bencilo (350 mg, 1,03 mmol) y Pd/C(10%, 50 mg) en MeOH (10 ml) a ta durante 2 h bajo hidrógeno. Se filtró la mezcla, y se lavó la torta de filtración con MeOH (10 ml). Se concentró el filtrado para proporcionar (S)-2-amino-4-metil-N-fenilpentanamida (I-20), (100 mg, 0,49 mmol, 47 %) como un sólido de color blanco. ESl-EM (EI+, m/z): 207,2 [M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6): 59,86 (s, 1H), 7,63 (dd,J =1,0 Hz, 8,5 Hz, 2H), 7,31-7,27 (m, 2H), 7,03 (t,J= 7,5 Hz, 1H), 3,31 (dd,J= 5,0 Hz, 8,5 Hz, 1H), 1,80-1,71 (m, 1H), 1,50-1,44 (m, 1H), 1,35-1,29 (m, 1H), 0,90 (dd,J =6,5 Hz, 14,0 Hz, 6H). Ejemplo 21: (S)-2-amino-N,4-dimetilpentanamida [I-21]:
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: (S)-4-Metil-1-(metilamino)-1-oxopentan-2-il-carbamato de bencilo:
A una disolución de ácido (S)-2-(benciloxicarbonilamino)-4-metilpentanoico (1,0 g, 3,77 mmol) en DMF (20 ml) se le añadió MeNH2^HCl (509 mg, 7,54 mmol), HATU (1,72 g, 4,52 mmol) y Et3N (1,14 g, 11,31 mmol) a 25 °C. Después de 2 h, se diluyó la disolución con EtOAc (80 ml), se lavó con la disolución resultante filtrada (80 ml x 3) y salmuera (80 ml), se secó (Na2SO4), se filtró y se concentró a vacío. Se purificó el producto en bruto mediante cromatografía (sílice, acetato de etilo/éter de petróleo =1/3) para proporcionar (S)-4-metil-1-(metilamino)-1-oxopentan-2-ilcarbamato de bencilo (550 mg, 1,98 mmol, 52 %) como un aceite incoloro. ESI-EM (EI+, m/z): 279,2 [M+H]+.
Etapa 2: (S)-2-Amino-N,4-dimetilpentanamida [I-21]:
Se agitó una mezcla de (S)-4-metil-1-(metilamino)-1-oxopentan-2-il-carbamato de bencilo (300 mg, 1,08 mmol) y Pd/C(10%) (50 mg) en MeOH (10 ml) a ta durante 2 h bajo hidrógeno. Se filtró la mezcla, y se lavó la torta de filtración con MeOH (10 ml). Se concentró el filtrado para proporcionar (S)-2-amino-N,4-dimetilpentanamida (I-21), (152 mg, 1,05 mmol, 98%) como un aceite incoloro. ESI-EM (EI+, m/z): 145,3 [M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6): 57,80 (s, 1H), 3,10 (dd,J =5,0 Hz, 9,0 Hz, 1H), 2,57 (dd,J =3,0 Hz, 5,0 Hz, 3H), 1,81 (s, 2H), 1,66-1,69 (m, 1H), 1,34-1,39 (m, 1H), 1,16-1,22 (m, 1H), 0,81-0,87 (m, 6H).
Ejemplo 22: Ácido (S)-4-metil-2-(fenilamino)pentanoico [I-22]:
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: (S)-2-(Ciclohexanocarboxamido)-4-metilpentanoato de bencilo:
A una disolución de p-toluenosulfonato de éster bencílico de L-leucina (500 mg, 1,27 mmol), ácido ciclohexanocarboxílico (244 mg, 1,91 mmol) y HATU (726 mg, 1,91 mmol) en d Mf (10 ml) se le añadió DIPEA (410 mg, 3,18 mmol) y se agitó la disolución durante 2 h a ta. Se purificó la disolución mediante HPLC preparativa (Boston C1821*250 mm 10 ^m, fase móvil: A: ácido trifluoroacético al 0,1 %; B: acetonitrilo) para proporcionar (S)-2-(ciclohexanocarboxamido)-4-metilpentanoato de bencilo (300 mg, 0,91 mmol, 71 %) como un sólido de color blanco. EM (EI+, m/z): 332,3 [M+H]+.
Etapa 2: Ácido (S)-2-(ciclohexanocarboxamido)-4-metilpentanoico [I-22]:
A una disolución con agitación de (S)-2-(ciclohexanocarboxamido)-4-metilpentanoato de bencilo (200 mg, 0,60 mmol) en EtOH (10 ml) se le añadió una cantidad catalítica de Pd/C (10 %, 20 mg). Se agitó la reacción bajo atmósfera de hidrógeno durante 3 h a 50 °C. Se filtró la disolución resultante y se concentró para proporcionar ácido (S)-2-(ciclohexanocarboxamido)-4-metilpentanoico (I-22), (100 mg, 0,41 mmol, 69%) como un sólido de color blanco. EM (EI+, m/z): 242,3 [M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, CD<3>OD): 54,43 (t,J= 7,5 Hz, 1H), 2,29 (td,J= 8,0 Hz, 11,0 Hz, 1H), 1,74-1,85 (m, 4H), 1,63-1,72 (m, 4H), 1,43-1,49 (m, 2H), 1,26-1,36 (m, 3H), 0,96 (dd,J =6,0 Hz, 20,5 Hz, 6H).
Ejemplo 25: Ácido (S)-4-metil-2-(fenilsulfonamido)pentanoico [I-25]:
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: (S)-4-Metil-2-(fenilsulfonamido)pentanoato de bencilo:
A una disolución de (S)-2-amino-4-metilpentanoato 4-metilbencenosulfonato de bencilo (300 mg, 0,762 mmol) y Et3N (385,73 mg, 3,81 mmol) en<d>M<f>(3 ml), enfriada con un baño de hielo, se le añadió cloruro de bencenosulfonilo (148,12 mg, 0,838 mmol). Se agitó la mezcla a 25 °C durante 2 h. Se diluyó la disolución con acetato de etilo (10 ml), se lavó con la disolución resultante filtrada (10 ml x 3) y salmuera (10 ml), se secó con sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró a vacío. El producto en bruto (280 mg, pureza: 85 %, rendimiento: 74 %) se usó directamente en la siguiente etapa. ESI-EM (EI+, m/z): 384,1 [M+Na]+.
Etapa 2: Ácido (S)-4-metil-2-(fenilsulfonamido)pentanoico [I-25]:
A una disolución de (S)-4-metil-2-(fenilsulfonamido)pentanoato de bencilo (200 mg, 0,553 mmol) en EtOH (3 ml), se le añadió Pd/C (20 mg,10 %). Se agitó esta mezcla de reacción a 50 °C durante 4 h bajo atmósfera de hidrógeno. Se filtró la mezcla, y se lavó la torta de filtración con MeOH (10 ml). Se concentró el filtrado para proporcionar ácido (S)-4-metil-2-(fenilsulfonamido)pentanoico (I-25), (63,7 mg, 0,234 mmol, 100 %) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 294,0 [M+Na]+. 1H- RMN (500 MHz, DMSO-de) 512,61 (s, 1H), 8,16 (d,J =8,6 Hz, 1H), 7,79 - 7,73 (m, 2H), 7,62 (t,J =7,3 Hz, 1H), 7,56 (t,J =7,4 Hz, 2H), 3,63 (dd,J =8,5 Hz, 14,5 Hz, 1H), 1,53 (td,J =6,5 Hz, 13,5Hz, 1H), 1,41 - 1,31 (m, 2H), 0,79 (d,J =6,6 Hz, 3H), 0,66 (d,J =6,5 Hz, 3H).
Ejemplo 26: Ácido (S)-4-metil-2-(fenilamino)pentanoico [I-26]:
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: (S)-4-Metil-2-(fenilamino)pentanoato de bencilo:
A una mezcla de p-toluenosulfonato de éster bencílico de L-leucina (200 mg, 0,51 mmol), ácido fenilborónico (186 mg, 1,52 mmol) y Cu(OAc)2 (462 mg, 2,54 mmol) en DCM (10 ml) se le añadió 4A MS (1,0 g) y Et3N (155 mg, 1,52 mmol) y se agitó la mezcla durante 18 h a ta. Se extinguió la mezcla con la disolución resultante filtrada (50 ml), se extrajo con EtOAc (50 ml x 2), se lavó con la disolución resultante filtrada (50 ml) y salmuera (50 ml). Se concentró la fase orgánica purificada mediante cromatografía (sílice, acetato de etilo/éter de petróleo =1/20) para proporcionar (S)-4-metil-2-(fenilamino)pentanoato de bencilo (100 mg, 0,34 mmol, 66%) como un aceite incoloro. EM (EI+, m/z): 298,2 [M+H]+.
Etapa 2: Ácido (S)-4-metil-2-(fenilamino)pentanoico [I-26]:
A una disolución con agitación de (S)-4-metil-2-(fenilamino)pentanoato de bencilo (100 mg, 0,34 mmol) en EtOH (10 ml) se le añadió una cantidad catalítica de Pd/C (10 %, 20 mg). Se agitó la reacción bajo atmósfera de hidrógeno durante 2 h a 50 °C. Se filtró la disolución resultante y se concentró para proporcionar ácido (S)-4-metil-2-(fenilamino)pentanoico (I-26), (30 mg, 0,15 mmol, 43%) como un sólido de color blanco. EM (EI+, m/z): 208,1 [M+H]+. 1H-RMN (400 MHz, CDCl3): 57,23 (t, J = 8,0 Hz, 2H), 6,83 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 6,66 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 3,99 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 2,87 (q, J = 6,0 Hz, 1H), 1,72~1,86 (m, 2H), 1,62~1,68 (m, 1H), 0,85~1,03 (m, 6H).
Ejemplo 36: Ácido (S)-2-acetamido-4-metilpentanoico [I-36]:
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: (S)-2-Acetamido-4-metilpentanoato de bencilo:
A una disolución de p-toluenosulfonato de éster bencílico de L-leucina (500 mg, 1,27 mmol), ácido acético (114 mg, 1,91 mmol) y HATU (726 mg, 1,91 mmol) en DMF (10 ml) se le añadió DIP<e>A (410 mg, 3,18 mmol) y se agitó la disolución durante 2 h a ta. Se purificó la disolución mediante HPLC preparativa (Boston C18 21*250 mm 10 ^m, fase móvil: A: ácido trifluoroacético al 0,1 %; B: acetonitrilo) para proporcionar (S)-2-acetamido-4-metilpentanoato de bencilo (300 mg, 1,14 mmol, 89 %) como un sólido de color blanco. EM (EI+, m/z): 264,2 [M+H]+.
Etapa 2: Ácido (S)-2-acetamido-4-metilpentanoico [I-36]:
A una disolución con agitación de (S)-2-acetamido-4-metilpentanoato de bencilo (250 mg, 0,74 mmol) en EtOH (10 ml) se le añadió una cantidad catalítica de Pd/C (10 %, 20 mg). Se agitó la reacción bajo atmósfera de hidrógeno durante 3 h a 50 °C. Se filtró la disolución resultante y se concentró para proporcionar ácido (S)-2-acetamido-4-metilpentanoico (I-36), (100 mg, 0,57 mmol, 81 %) como un sólido de color blanco. EM (EI+, m/z): 174,2 [M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, MeOD): 54,43 (dd,J =6,0 Hz, 9,5 Hz, 1H), 2,00 (s, 3H), 1,61-1,73 (m, 3H), 0,97 (dd,J =6,0 Hz, 17,5 Hz, 6H).
Ejemplo 45: Ácido (S,E)-2-(4-metoxi-4-oxobut-2-enamido)-4-metilpentanoico [I-45]:
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: Ácido (S,E)-2-(4-metoxi-4-oxobut-2-enamido)-4-metilpentanoico [I-45]:
A una disolución de ácido (E)-4-metoxi-4-oxobut-2-enoico (1,0 g, 7,69 mmol) en DCM (30 ml) se le añadió SOCl2 (1,83 g, 15,38 mmol), y luego DMF (0,1 ml). Se calentó la disolución hasta 40 °C durante 4 h. Se concentró la disolución hasta sequedad para proporcionar un aceite. Se diluyó el aceite con DCM (10 ml). Se añadió gota a gota la disolución de ácido (S)-2-amino-4-metilpentanoico (1,0 g, 7,62 mmol) en acetona (20 ml) y disolución sat. de Na<2>CO<3>(20 ml) enfriada con un baño de hielo. Después de 1 h, se ajustó la disolución a pH 2 con una disolución de HCl 6 M, se extrajo con EtOAc (40 x 2), se lavó con la disolución resultante filtrada (80 ml x 3) y salmuera (80 ml), se secó (Na2SO4), se filtró y se concentró a vacío. Se purificó el producto en bruto mediante cromatografía (sílice, MeOH/DCM =1/20) para proporcionar ácido (S,£)-2-(4-metoxi-4-oxobut-2-enamido)-4-metilpentanoico (I-45), (1,0 g, 4,11 mmol, 53 %) como un aceite de color amarillo. ESI-EM (EI+, m/z): 244,2 [M+H]+.1H-RMN (400 MHz, CDCls): 5 7,32 (d,J= 15,2 Hz, 1H), 7,05 (d,J= 15,2 Hz, 1H), 6,85-6,89 (m, 2H), 7,30-7,46 (m, 1H), 3,82 (s, 1H), 1,63-1,78 (m, 3H), 0,97 (d,J =4,8 Hz, 6H).
Ejemplos 46 y 47: Ácido (R)-2-am¡no-3,3-difluoro-4-met¡lpentano¡co [I-46] y ácido (S)-2-amino-3,3-difluoro-4-metilpentanoico [I-47]:
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: 2,2-Difluoro-3-metilbutanoato de etilo:
Se agitó una mezcla de 3-metil-2-oxobutanoato de etilo (10 g, 0,069 mol) y DAST (16,8 g, 0,10 mol) a ta durante 12 h. Después de comprobar mediante CCF, se añadió la mezcla de reacción gota a gota lentamente a una disolución acuosa saturada fría de bicarbonato de sodio. Se extrajo la mezcla con Et2O (300 ml * 2), y se lavaron las fases orgánicas con salmuera, se secaron y se concentraron para proporcionar un 2,2-difluoro-3-metilbutanoato de etilo en bruto (8,3 g) que se usó directamente en la siguiente etapa.
Etapa 2: 2,2-Difluoro-3-metilbutanal:
A una disolución de 2,2-difluoro-3-metilbutanoato de etilo en bruto (8,3 g) en CH2Cl2 (200 ml) se le añadió gota a gota una disolución de DIBAL-H en hexanos (1,0 M, 69 ml, 69,0 mmol) a -78 °C bajo argón, y se agitó la mezcla durante 30 min a -78 °C. Después de comprobar mediante CCF, se extinguió la reacción con ácido cítrico saturado y se extrajo con Et<2>O. Se lavó el extracto con ácido cítrico saturado, salmuera, se secó sobre Na<2>SO<4>, y se concentró a presión reducida para proporcionar un aldehído oleoso 2,2-difluoro-3-metilbutanal (4,2 g), que se usó inmediatamente en la siguiente etapa sin purificación.
Etapa 3: 2-(Benc¡lam¡no)-3,3-d¡fluoro-4-met¡lpentanon¡tr¡lo:
Se enfrió una disolución de 2,2-difluoro-3-metilbutanal en bruto (4,2 g) en 50 ml de MeOH hasta 0 °C. Se añadió ácido acético (glacial, 2,1 ml) gota a gota, manteniendo la temperatura alrededor de 0 °C, seguido de cianuro de trimetilsililo (4,2 ml) a lo largo de un periodo de 15 minutos. Se calentó la mezcla de reacción hasta 25 °C y se agitó durante la noche. Se filtró la disolución resultante fría (200 ml), se cargó en la mezcla de reacción y se extrajo la mezcla de reacción con diclorometano (2*200 ml). Se lavó la fase de diclorometano con la disolución resultante filtrada (2*100 ml), seguido de salmuera (2*50 ml). Se secó la fase de diclorometano sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró a presión reducida para proporcionar un 2-(benc¡lam¡no)-3,3-d¡fluoro-4-met¡lpentanon¡tr¡lo en bruto (2,8 g) que se usó inmediatamente en la siguiente etapa sin purificación. ESI-EM (EI+, m/z): 238,2 [M+H]+.
Etapa 4: Ácido 2-(benc¡lam¡no)-3,3-d¡fluoro-4-met¡lpentano¡co:
Se agitó una disolución de 2-(benc¡lam¡no)-3,3-d¡fluoro-4-met¡lpentanon¡tr¡lo en bruto (2,8 g) en 50 ml de ácido clorhídrico conc. y 10 ml de HOAc a 90 °C durante 24 h y se concentró. Se purificó el residuo mediante HPLC preparativa para proporcionar ácido 2-(benc¡lam¡no)-3,3-d¡fluoro-4-met¡lpentano¡co (513 mg) como un sólido de color blanco. Se purificó el producto puro mediante HPLC quiral para proporcionar ácido (R)-2-(bencilamino)-3,3-difluoro-4-metilpentanoico (80 mg) y ácido (S^^bencilamino^^-difluoro^-metilpentanoico (63 mg) que eran ambos un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 258,2 [M+H]+.
Etapa 5-A: Ácido (R^-amino^^-difluoro^-metilpentanoico [I-46]:
A una disolución de ácido (R^^bencilamino^^-difluoro^-metilpentanoico (80 mg, 0,31 mmol) en 20 ml de MeOH se le añadió HCOONH4 (98 mg, 1,56 mmol) y Pd/C (100 mg) a ta. Se agitó la mezcla a 60 °C durante 2 h. Se filtró la mezcla de reacción y se concentró para proporcionar un producto en bruto que se purificó mediante cromatografía en gel de sílice de fase inversa para proporcionar ácido (R)-2-amino-3,3-difluoro-4-metilpentanoico (I-46), (23 mg, 44 %) como un sólido de color blanco; 1H-RMN (500 MHz, D2O): 84,27 (dd, J = 24,0, 3,5 Hz, 1 H), 2,55-2,42 (m, 1 H), 1,04 (d, J = 7,0 Hz, 3 H), 0,993 (d, J = 6,5 Hz, 3 H).
Etapa 5-B: Ácido (S)-2-amino-3,3-difluoro-4-metilpentanoico [I-47]:
A una disolución de ácido (S)-2-(bencilamino)-3,3-difluoro-4-metilpentanoico (63 mg, 0,24 mmol) en 15 ml de MeOH se le añadió HCOONH4 (77 mg, 1,22 mmol) y Pd/C (100 mg) a ta. Se agitó la mezcla a 60 °C durante 2 h. Se filtró la mezcla de reacción y se concentró para proporcionar un producto en bruto que se purificó mediante cromatografía en gel de sílice de fase inversa para proporcionar ácido (S)-2-amino-3,3-difluoro-4-metilpentanoico (I-47), (14 mg, 34 %) como un sólido de color blanco; 1H-RMN (500 MHz, D2O): 84,27 (dd, J = 24,0, 3,5 Hz, 1 H), 2,55-2,42 (m, 1 H), 1,04 (d, J = 7,0 Hz, 3 H), 0,993 (d, J = 6,5 Hz, 3 H).
Ejemplo 147: Clorhidrato de (S)-2-amino-4-metil-N-(metilsulfonil)pentanamida [I-147].
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: (S)-4-Metil-1-(metilsulfonamido)-1-oxopentan-2-il-carbamato de terc-butilo:
A una disolución de ácido (S)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-4-metilpentanoico (1,0 g, 4,32 mmol), metanosulfonamida (452 mg, 4,75 mmol) y HATU (1,8 g, 4,75 mmol) en DMF (30 ml) se le añadió TEA (1,3 g, 12,9 mmol) y se agitó la disolución durante 17 h a ta. Se purificó la disolución mediante HPLC preparativa (Boston C1821*250 mm 10 pm, fase móvil: A: ácido trifluoroacético al 0,1 %; B: acetonitrilo) para proporcionar (S)-4-metil-1-(metilsulfonamido)-1-oxopentan-2-il-carbamato de terc-butilo (130 mg, 0,42 mmol, 8,9 %) como un sólido de color blanco. EM (EI-, m/z): 307,0 [M-H]-.
Etapa 2: Clorhidrato de (S)-2-amino-4-metil-N-(metilsulfonil)pentanamida [I-147]:
Se añadió una disolución de (S)-4-metil-1-(metilsulfonamido)-1-oxopentan-2-il-carbamato de terc-butilo (130 mg, 0,42 mmol) en Et<2>O (15 ml) HCl 4 M/dioxano (5 ml), se agitó durante 3 h a ta. Se filtró el sólido para proporcionar clorhidrato de (S)-2-amino-4-metil-N-(metilsulfonil)pentanamida [I-147] como un sólido de color blanco (32 mg, 0,13 mmol, 31 %). ESI-EM (EI+, m/z): 209,1 [M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, CD3OD) 83,96 (t,J= 3,0 Hz, 1H), 3,32 (s, 3H), 1,74-1,79 (m, 3H), 1,02-1,05 (m, 6H).
Ejemplo 193: Clorhidrato de (S)-2-amino-N,4,4-trimetil-N-(metilsulfonil)pentanamida [I-193].
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: (S)-4,4-Dimetil-1-(N-metilmetilsulfonamido)-1-oxopentan-2-il-carbamato de terc-butilo:
A una disolución de ácido (S)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-4,4-dimetilpentanoico (500 mg, 1,97 mmol) en DCM (60 ml) se le añadió HATU (900 mg, 2,36 mmol) y se agitó a ta durante 2 h. Luego se añadieron Cs<2>CÜ3 (1,92 g, 5,91 mmol), N-metilmetanosulfonamida (322 mg, 2,95 mmol) a la mezcla y se agitaron durante la noche a ta. Se diluyó la disolución con agua (200 ml) y se extrajo con DCM (100 ml). Se lavó la fase orgánica con agua (100 ml x 2), y salmuera (100 ml), se secó (Na<2>SÜ<4>), se filtró y se concentró a vacío, se purificó el producto en bruto mediante cromatografía (sílice, acetato de etilo/éter de petróleo =1/5) para proporcionar (S)-4,4-dimetil-1-(N-metilmetilsulfonamido)-1-oxopentan-2-il-carbamato de terc-butilo (420 mg, 1,25 mmol, 63 %) como un aceite de color amarillo. ESI-EM (EI+, m/z): 359,1 [M+Na]+.
Etapa 2: Clorhidrato de (S)-2-amino-N,4,4-trimetil-N-(metilsulfonil)pentanamida [I-193]:
A una disolución de (S)-4,4-dimetil-1-(N-metilmetilsulfonamido)-1-oxopentan-2-il-carbamato de terc-butilo (420 mg, 1,25 mmol) en Et<2>Ü (20 ml) se le añadió HCl 4 M/dioxano (10 ml), se agitó durante 17 h a ta. Se filtró el sólido para proporcionar clorhidrato de (S)-2-amino-N,4,4-trimetil-N-(metilsulfonil)pentanamida [I-193] como un sólido de color blanco (250 mg, 0,13 mmol, 71 %). ESI-EM (EI+, m/z): 237,1 [M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, DMSÜ) 58,55 (s, 3H), 4,59 (s, 1H), 3,50 (s, 3H), 3,26 (s, 3H), 1,81-1,85 (m, 1H), 1,63-1,67 (m, 1H), 0,95 (s, 9H).
Ejemplo 192: Clorhidrato de 2-amino-4-fluoro-4-metil-N-(metilsulfonil)pentanamida [I-192].
Etapa 1: 4-Fluoro-4-metil-1-(metilsulfonamido)-1-oxopentan-2-il-carbamato de terc-butilo:
A una disolución de 4-fluoro-4-metil-1-(metilsulfonamido)-1-oxopentan-2-il-carbamato de terc-butilo (270 mg, 1,08 mmol) en DCM (50 ml) se le añadió HATU (451 mg, 1,19 mmol) y se agitó a ta durante 2 h. Luego se añadieron Cs2CÜ3 (1,06 g, 3,24 mmol), metanosulfonamida (206 mg, 2,17 mmol) a la mezcla y se agitaron durante la noche a ta. Se diluyó la disolución con agua (200 ml) y se extrajo con DCM (100 ml). Se lavó la fase orgánica con agua (100 ml x 2), y salmuera (100 ml), se secó (Na2SO4), se filtró y se concentró a vacío, se purificó el producto en bruto mediante cromatografía (sílice, acetato de etilo/éter de petróleo =1/5) para proporcionar (S)-4,4-dimetil-1-(N-metilmetilsulfonamido)-1-oxopentan-2-il-carbamato de terc-butilo (200 mg, 0,6 mmol, 55 %) como un aceite de color amarillo. ESI-EM (EI+, m/z): 344,1 [M+NH4]+.
Etapa 2: Clorhidrato de 2-amino-4-fluoro-4-metil-N-(metilsulfonil)pentanamida [I-192].
A una disolución de (S)-4,4-dimetil-1-(N-metilmetilsulfonamido)-1-oxopentan-2-il-carbamato de terc-butilo (200 mg, 0,6 mmol) en Et<2>Ü (20 ml) se le añadió HCl 4 M/dioxano (10 ml), se agitó durante 17 h a ta. Se filtró el sólido para proporcionar clorhidrato de 2-amino-4-fluoro-4-metil-N-(metilsulfonil)pentanamida [I-192] como un sólido de color blanco (89,8 mg, 0,34 mmol, 57%). ESI-EM (EI+, m/z): 227,1 [M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, DMSÜ) 58,44 (s, 3H), 4,02 (s, 1H), 3,25 (s, 3H), 2,16-2,25 (m, 1H), 2,03-2,10 (m, 1H), 1,43 (s, 3H), 1,38 (s, 3H).
Ejemplo 190: Clorhidrato de (S)-2-((S)-2-amino-4,4-dimetilpentanamido)-4-metilpentanoato de metilo [I-190].
Esquema de síntesis:
Etapa 1: (S)-2-((S)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-4,4-dimetilpentanamido)-4-metilpentanoato de metilo:
A una disolución de ácido (S)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-4,4-dimetilpentanoico (500 mg, 2,0 mmol) en DCM (80 ml) se le añadió HATU (900 mg, 2,3 mmol) y se agitó a ta durante 2 h. Luego se añadieron Cs<2>CO<3>(1,95 g, 6,0 mmol), clorhidrato de (S)-2-amino-4-metilpentanoato de metilo (555 mg, 3,0 mmol) a la mezcla y se agitó durante la noche a ta. Se diluyó la disolución con agua (200 ml) y se extrajo con DCM (100 ml). Se lavó la fase orgánica con agua (100 ml x 2), y salmuera (100 ml), se secó (Na<2>SO<4>), se filtró y se concentró a vacío, se purificó el producto en bruto mediante cromatografía (sílice, acetato de etilo/éter de petróleo =1/5) para proporcionar (S)-2-((S)-2-(tercbutoxicarbonilamino)-4,4-dimetilpentanamido)-4-metilpentanoato de metilo (500 mg, 1,34 mmol, 67%) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 317,2 [M-56].
Etapa 2: Clorhidrato de (S)-2-((S)-2-amino-4,4-dimetilpentanamido)-4-metilpentanoato de metilo [I-190].
A una disolución de (S)-2-((S)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-4,4-dimetilpentanamido)-4-metilpentanoato de metilo (500 mg, 1,34 mmol) en Et<2>O (20 ml) se le añadió HCl 4 M/dioxano (10 ml), se agitó durante 17 h a ta. Se filtró el sólido para proporcionar clorhidrato de (S)-2-(S)-2-amino-4,4-dimetilpentanamido)-4-metilpentanoato de metilo [I-190] como un sólido de color blanco (300 mg, 0,97 mmol, 73%). ESI-EM (EI+, m/z): 273,2 [M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, DMSO) 89,07-9,09 (d,J =7,5 Hz, 1H), 8,42 (s, 3H), 4,29-4,34 (m, 1H), 3,82 (m, 1H), 3,60 (s, 3H), 1,72 1,83 (m, 2H), 1,50-1,62 (m, 3H), 0,86-0,91 (m, 15H).
Ejemplo 122: Clorhidrato de (S)-2-amino-4,4-dimetilpentanoato de metilo [I-122].
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: Clorhidrato de (S)-2-amino-4,4-dimetilpentanoato de metilo [I-122]:
A una disolución de ácido (S)-2-amino-4,4-dimetilpentanoico (100 mg, 0,69 mmol) en MeOH (10 ml) se le añadió HCl 4 M/dioxano (10 ml), se agitó a 80 °C durante 24 h. Se concentró la mezcla y se batió el residuo con Et<2>O para proporcionar clorhidrato de (S)-2-amino-4,4-dimetilpentanoato de metilo [I-122] como un sólido de color blanco (23,6 mg, 0,12 mmol, 20 %). ESI-EM (EI+, m/z): 160,1 [M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, CD3OD): 84,02-4,04 (m, 1H), 3,86 (s, 3H), 1,97-2,02 (m, 1H), 1,64-1,68 (m, 1H), 1,03-1,05 (d, 9H).
Ejemplo 123: Clorhidrato de (R)-2-amino-4,4-dimetilpentanoato de metilo [I-123].
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: Clorhidrato de (R)-2-amino-4,4-dimetilpentanoato de metilo [I-123]:
A una mezcla de ácido (R)-2-amino-4,4-dimetilpentanoico (50 mg, 0,34 mmol) en MeOH seco (10 ml) se le añadió SOCl2 (0,5 ml), se agitó a ta durante 17 h. Se concentró la mezcla y se batió el residuo con Et2O para proporcionar clorhidrato de (R)-2-amino-4,4-dimetilpentanoato de metilo [I-123] como un sólido de color blanco (34,2 mg, 0,17 mmol, 50%). ESI-EM (EI+, m/z): 160,1 [M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, CD3OD): 54,02-4,04 (m, 1H), 3,86 (s, 3H), 1,97-2,02 (m, 1H), 1,64-1,68 (m, 1H), 1,03 (s, 9H).
Ejemplo 205: Clorhidrato de 2-amino-N-ciano-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanamida [I-205].
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: Ácido 2-(terc-butoxicarbonilamino)-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanoico:
Se disolvió una mezcla de ácido 2-amino-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanoico (250 mg, 1,35 mmol), Boc2O (353 mg, 1,62 mmol), NaOH (80 mg, 2,0 mmol) en dioxano (10 ml) y H2O (2 ml). Se agitó la mezcla a ta durante 3 h. Se diluyó la disolución con agua (200 ml) y se extrajo con DCM (50 ml). Se lavó la fase orgánica con agua (20 ml x 2), y salmuera (10 ml), se secó (Na2SO4), se filtró y se concentró para proporcionar ácido 2-(terc-butoxicarbonilamino)-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanoico en bruto (385 mg) como un aceite incoloro. ESI-EM (EI+, m/z): 307,9 [M+Na]+. Etapa 2: 2-(Terc-butoxicarbonilamino)-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo:
Se disolvió una mezcla de ácido 2-(terc-butoxicarbonilamino)-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanoico (385 mg, 1,35 mmol), 1-hidroxipirrolidina-2,5-diona (197 mg, 1,71 mmol), DCC (353 mg, 1,71 mmol) en DCM (15 ml). Se agitó la mezcla a ta durante 17 h. Se filtró y se lavó el filtrado con salmuera (20 ml), se secó (Na<2>SO<4>), se filtró y se concentró para proporcionar 2-(terc-butoxicarbonilamino)-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo en bruto (400 mg) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 282,9 [M-100]+.
Etapa 3: 1-Cianamido-5,5,5-trifluoro-4-metil-1-oxopentan-2-il-carbamato de terc-butilo:
Se disolvió una mezcla de 2-(terc-butoxicarbonilamino)-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (300 mg, 0,78 mmol), cianamida (66 mg, 1,57 mmol), NaOH (156 mg, 3,9 mmol) en THF (16 ml). Se agitó la mezcla a 0 °C durante 0,5 h y ta durante 17 h. Se purificó la disolución mediante HPLC preparativa (Boston C1821*250 mm 10 ^m, fase móvil: A: ácido trifluoroacético al 0,1 %; B: acetonitrilo) para proporcionar 1-cianamido-5,5,5-trifluoro-4-metil-1-oxopentan-2-il-carbamato de terc-butilo (45 mg, 0,14 mmol) como un sólido de color blanco. EM (EI+, m/z): 310,3 [M+H]+.
Etapa 4: Clorhidrato de 2-amino-N-ciano-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanamida [I-205]:
A una disolución de 1-cianamido-5,5,5-trifluoro-4-metil-1-oxopentan-2-il-carbamato de terc-butilo (45 mg, 0,14 mmol) en Et<2>O (20 ml) se le añadió HCl 4 M/dioxano (10 ml), se agitó durante 24 h a ta. Se purificó la disolución mediante HPLC preparativa (Boston C1821*250 mm 10 |jm, fase móvil: A: ácido trifluoroacético al 0,1 %; B: acetonitrilo) para proporcionar clorhidrato de 2-amino-N-ciano-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanamida [I-205] (12,3 mg, 0,05 mmol, 27%) como un sólido de color blanco. EM (EI+, m/z): 210,1 [M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, CD3OD) 84,06-4,09 (m, 1H), 2,43-2,65 (m, 1H), 1,67-1,85 (m, 2H), 1,18-1,22 (m, 3H).
Ejemplo 206: Ácido 2-amino-3-(1-metilciclobutil)propanoico [I-206].
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: W-Metoxi-A/,1-dimetilciclobutanocarboxamida:
A una disolución de ácido 1-metilciclobutanocarboxílico (11,6 g, 0,1 mol), clorhidrato de W,0-dimetilhidroxilamina (19,5 g, 0,2 mol) y HATU (42 g, 0,11 mol) en DMF (300 ml) se le añadió TEA (30,3 g, 0,3 mol) y se agitó la disolución durante 17 h a ta. Se diluyó la disolución con agua (600 ml) y se extrajo con EtOAc (400 ml x 2). Se lavó la fase orgánica con HCl 1 N, NaHCO<3>sat. y salmuera (100 ml), se secó (Na<2>SO<4>), se filtró y se concentró a vacío para proporcionar N-metoxi-N,1-dimetilciclobutanocarboxamida (12,2 g, 0,07 mol, 75 %) como un aceite incoloro. ESI-EM (EI+, m/z): 158,2 [M+H]+.
Etapa 2: 1-Metilciclobutanocarbaldehído:
A una disolución de W-metoxi-N,1-dimetilciclobutanocarboxamida (2,0 g, 12,7 mmol) en THF seco (20 ml) se le añadió LiAlH<4>1M(19 ml, 19 mmol) gota a gota a 0 °C bajo N<2>. Se calentó la mezcla hasta temperatura ambiente y se agitó 2 h. Se extinguió la disolución con sal de Seignette sat. lentamente y se extrajo con Et<2>O (100 ml), se lavó la fase orgánica con agua (100 ml x 2), y salmuera (100 ml), se secó (Na<2>SO<4>), se filtró y se usó para la siguiente etapa.
Etapa 3: Z)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-3-(1-metilciclobutil)acrilato de terc-butilo:
A una disolución de reactivo de Wittig (2,15 g, 5,86 mmol) en THF seco (80 ml) se le añadió t-BuONa (844 mg, 8,79 mmol) a 0 °C y se agitó durante 1 h. Luego se añadió la disolución de 1-metilciclobutanocarbaldehído y se agitó a ta durante 17 h. Se extrajo la disolución con EtOAc (100 ml x 2). Se lavó la fase orgánica con salmuera (100 ml), se secó (Na<2>SO<4>), se filtró y se concentró a vacío. Se purificó el producto en bruto mediante cromatografía (sílice, acetato de etilo/éter de petróleo =1/30) para proporcionar (Z)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-3-(1-metilciclobutil)acrilato de terc-butilo (700 mg, 2,2 mmol) como un aceite incoloro. eS|-EM (EI+, m/z): 200,2 [M-56*2]+.
Etapa 4: 2-(Terc-butoxicarbonilamino)-3-(1-metilciclobutil)propanoato deterc-butilo:
Se agitó una mezcla de (Z)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-3-(1-metilciclobutil)acrilato de terc-butilo (700 mg, 2,2 mmol) y Pd/C (10 %, 100 mg) en MeOH (100 ml) a 30 °C durante 17 h. Se filtró la mezcla, y se concentró el filtrado hasta sequedad para proporcionar 2-(terc-butoxicarbonilamino)-3-(1-metilciclobutil)propanoato de terc-butilo (600 mg, en bruto) como un aceite incoloro. Es I-EM (EI+, m/z): 158,2 [M-156]+.
Etapa 5: Ácido 2-amino-3-(1-metilcidobutil)propanoico [I-206]:
A una disolución de 2-(terc-butoxicarbonilamino)-3-(1-metilcidobutil)propanoato de ferc-butilo (600 mg, en bruto) en Et<2>O (20 ml) se le añadió HCl 4 M/dioxano (10 ml), se agitó durante 17 h a ta. Se concentró la disolución para proporcionar ácido 2-amino-3-(1-metilciclobutil)propanoico. EM (EI+, m/z): 158,0 [M+H]+.
<1>H-RMN (500 MHz, D<2>O)<8>3,91 (t,J= 7,5 Hz, 1H), 2,06-2,02 (m, 1H), 1,88-1,64 (m, 7H), 1,15 (s, 3H).
Ejemplos 93: Ácido S-2-amino-3-(1-metilciclobutil)propanoico [I-93].
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
El procedimiento para el ácido 2-amino-3-(1-metilciclobutil)propanoico es el mismo que el ejemplo<8>
Etapa<6>: Ácido 2-(benciloxicarbonilamino)-3-(1-metilciclobutil)propanoico:
Se agitó una mezcla de ácido 2-amino-3-(1-metilciclobutil)propanoico (300 mg, en bruto), CbzOSu (714 mg, 2,8 mmol) en acetona (10 ml) y NaHCO<3>sat. (3 ml) a ta durante 5 h. Se purificó la disolución mediante HPLC preparativa (Boston C18 21*250 mm 10 pm, fase móvil: A: ácido trifluoroacético al 0,1 %; B: acetonitrilo) para proporcionar ácido 2-(benciloxicarbonilamino)-3-(1-metilciclobutil)propanoico (160 mg, 0,54 mmol) como un sólido de color blanco. EM (EI+, m/z): 292,0[M+H]+.
Etapa 7: Ácido (S)-2-(benciloxicarbonilamino)-3-(1-metilciclobutil)propanoico:
Se purificó ácido 2-(benciloxicarbonilamino)-3-(1-metilciclobutil)propanoico (160 mg, 0,54 mmol) mediante HPLC quiral para proporcionar ácido (S)-2-(benciloxicarbonilamino)-3-(1-metilciclobutil)propanoico (50 mg, 0,17 mmol) como un sólido de color blanco. EM (EI+, m/z): 292,0[M+H]+.
Etapa<8>: Ácido (S)-2-amino-3-(1-metilciclobutil)propanoico [I-93]:
Se agitó una mezcla de ácido (S)-2-(benciloxicarbonilamino)-3-(1-metilciclobutil)propanoico (50 mg, 0,17 mmol) y Pd/C (10 %, 10 mg) en MeOH (10 ml) a ta durante 1 h. Se purificó la disolución mediante HPLC preparativa (Boston C1821*250 mm 10 pm, fase móvil: A: ácido trifluoroacético al 0,1 %; B: acetonitrilo) para proporcionar ácido (S)-2-amino-3-(1-metilciclobutil)propanoico [I-93] (2 mg, 0,01 mmol) como un sólido de color blanco. EM (EI+, m/z): 292,0[M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, D<2>O)<8>3,76-3,79 (t, 1H), 1,96-2,00 (m, 1H), 1,61-1,86 (m, 7H), 1,11 (s, 3H).
Ejemplo 204: Clorhidrato de ácido 2-amino-3-(trimetilsilil)propanoico [I-204]
Etapa 1: 2-(Difenilmetilenoamino)-3-(trimetilsilil)propanoato de terc-butilo:
Se enfrió una disolución de 2-(difenilmetilenoamino)acetato de terc-butilo (2,5 g, 8,47 mmol) en THF (20 ml) hasta -78 °C, luego, se añadió LiHMDS (8,47 ml, 8,47mmol) gota a gota bajo N2. Se agitó la disolución a -78 °C durante 1 h. Se añadió (yodometil)trimetilsilano (1,8 g, 8,47 mmol) gota a gota. Se agitó la disolución a -78 °C ~ta durante la noche. Se lavó la disolución con salmuera (25 ml *2), se secó (Na<2>SO4), se concentró y se purificó mediante cromatografía (sílice, acetato de etilo/éter de petróleo =1/30) para proporcionar 2-(difenilmetilenoamino)-3-(trimetilsilil)propanoato de terc-butilo (2,3 g, 6,04 mmol, 71 %) como un sólido de color amarillo. ESI-EM (EI+, m/z): 382,3 [M+H]+.
Etapa 2: Clorhidrato de ácido 2-amino-3-(trimetilsilil)propanoico [I-204]:
Se agitó una disolución de 2-(difenilmetilenoamino)-3-(trimetilsilil)propanoato de terc-butilo (500 mg, 1,31 mmol) en HCl 4 M/dioxano<( 6>ml) durante 17 h a ta. Se añadió<d>C<m>(80 ml). Se filtró el sólido para proporcionar clorhidrato de ácido 2-amino-3-(trimetilsilil)propanoico [I-204] como un sólido de color blanco (113 mg, 0,57 mmol, 44 %). ESI-EM (EI+, m/z): 162,2 [M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, CD3OD) 513,78 (sa, 1H), 8,33 (sa, 1H), 3,75 (m, 1H), 1,00-1,14 (m, 2H), 0,06 (s, 9H).
Ejemplo 201: Clorhidrato de ácido (S)-2-amino-3-(trimetilsilil)propanoico [I-201].
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: Clorhidrato de ácido (S)-2-amino-3-(trimetilsilil)propanoico [I-201]:
Se agitó una disolución de (S)-2-(difenilmetilenoamino)-3-(trimetilsilil)propanoato de terc-butilo (300 mg, 0,79 mmol) en HCl 4 M/dioxano (3 ml) durante 17 h a ta. Se añadió<d>C<m>(40 ml). Se filtró el sólido para proporcionar clorhidrato de ácido (S)-2-amino-3-(trimetilsilil)propanoico [I-201] como un sólido de color blanco (92 mg, 0,47 mmol, 62 %). ESI-EM (EI+, m/z): 162,2 [M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, CD3OD) 5 13,76 (sa, 1H), 8,38 (sa, 1H), 3,76 (m, 1H), 1,02-1,16 (m, 2H), 0,06 (s, 9H).
Ejemplo 200: Clorhidrato de ácido (R)-2-amino-3-(trimetilsilil)propanoico [I-200].
1-200
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: Clorhidrato de ácido (R)-2-amino-3-(trimetilsilil)propanoico [I-200]:
Se agitó una disolución de (R)-2-(difenilmetilenoamino)-3-(trimetilsilil)propanoato de terc-butilo (300 mg, 0,79 mmol) en HCl 4 M/dioxano (3 ml) durante 17 h a ta. Se añadió<d>C<m>(40 ml). Se filtró el sólido para proporcionar clorhidrato de ácido (R)-2-amino-3-(trimetilsilil)propanoico [I-200] como un sólido de color blanco (80 mg, 0,41 mmol, 52 %). ESI-EM (EI+, m/z): 162,2 [M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, CD3OD) 513,77 (sa, 1H), 8,33 (sa, 1H), 3,76 (m, 1H), 1,02 1,14 (m, 2H), 0,06 (s, 9H).
Ejemplo 194: Ácido (S)-2-amino-4-fluoro-4-metilpentanoico [I-194].
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: Ácido (S)-2-amino-4-fluoro-4-metilpentanoico [I-194]:
Se agitó una mezcla de clorhidrato de (S)-2-amino-4-fluoro-4-metilpentanoato de etilo (65 mg, 0,31 mmol), LiOH.H2O (29 mg, 0,69 mmol) en H2O (2 ml) a ta durante 2,5 h. Luego, luego se añadió HCl 1 N para ajustar a pH=3. Se purificó la mezcla directamente mediante HPLC inversa (Boston C18 21*250 mm 10 ^m, fase móvil: A: ácido trifluoroacético al 0,1 %; B: acetonitrilo) para proporcionar ácido (S)-2-amino-4-fluoro-4-metilpentanoico [I-194] (40 mg, 0,27 mmol, 87%) como un sólido de color blanco. EM (EI+, m/z): 150,3 [M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, CD3OD) 5 8,10 (sa, 2H), 3,79 (m, 1H), 2,19-2,26 (m, 1H), 1,97-2,05 (m, 1H), 1,42 (d, Jz=3,5 Hz, 3H), 1,37 (d, Jz=4,0 Hz, 3H).
Ejemplo 94: (S)-3,3-Dimetil-1-(2H-tetrazol-5-il)butan-1-amina [I-94].
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: (S)-1-Ciano-3,3-dimetilbutil-carbamato de terc-butilo:
A una disolución de (S)-1-amino-4,4-dimetil-1-oxopentan-2-il-carbamato de terc-butilo (500 mg, 2,1 mmol) en DMF (10 ml) se le añadió cloruro cianúrico (450 mg, 2,5 mmol) y se agitó a ta durante 2 h. Luego, se diluyó la mezcla con salmuera (100 ml), se extrajo con acetato de etilo (50 ml), se secó (Na<2>SO4) y se concentró para proporcionar en bruto (S)-1-ciano-3,3-dimetilbutil-carbamato de terc-butilo (500 mg) como un aditivo de color amarillo. Es I-EM (EI+, m/z): 249,2 [M+Na]+.
Etapa 2: (S)-3,3-Dimetil-1-(2H-tetrazol-5-il)butil-carbamato de terc-butilo:
Se agitó una mezcla de (S)-1-ciano-3,3-dimetilbutil-carbamato de terc-butilo (en bruto 500 mg), ZnBr<2>(900 mg, 4,0 mmol), NaN3(260 mg, 4,0 mmol) en DMF (20 ml) durante 17 h a 100 °C. Luego se diluyó la mezcla con salmuera (200 ml), se extrajo con acetato de etilo (60 ml), se secó (Na<2>SO<4>) y se concentró para proporcionar (S)-3,3-dimetil-1-(2H-tetrazol-5-il)butil-carbamato de terc-butilo en bruto (400 mg) como un aditivo de color amarillo. E<s>I-EM (EI+, m/z): 214,3 [M+H-56]+.
Etapa 3: ((S)-3,3-Dimetil-1-(2H-tetrazol-5-il)butan-1-amina [I-94]:
Se agitó una disolución de (S)-3,3-dimetil-1-(2H-tetrazol-5-il)butil-carbamato de terc-butilo (en bruto 300 mg) en HCl 4 M/dioxano (3,5 ml) durante 17 h a ta. Luego, se concentró la disolución y se purificó directamente mediante HPLC en fase inversa (Boston C1821*250 mm 10 ^m, fase móvil: A: ácido trifluoroacético al 0,1 %; B: acetonitrilo) para proporcionar sal del ácido (S)-3,3-dimetil-1-(2H-tetrazol-5-il)butan-1-amina 2,2,2-trifluoroacético [I-94] (30 mg, 0,11 mmol, 9 % para la etapa 3) como un sólido de color blanco. EM (EI+, m/z): 170,2 [M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, CD3OD) 58,18 (sa, 3H), 4,48 (m, 1H), 2,14 (m, 1H), 1,73 (dd, Jz=3,5, 16,5 Hz 1H), 0,72 (s, 9H).
Ejemplo 175: Síntesis de ácido 2-amino-5,5,5-trifluoro-4-metoxipentanoico [I-175]:
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: (S)-4-Metil-2-(fenilmetilsulfonamido)pentanoato de bencilo:
A una disolución de 3-(benciloxi)propan-1-ol (10,0 g, 60,24 mmol) en DMSO (100 ml) se le añadió IBX (20,2 g, 72,29 mmol) bajo un baño de hielo. Se calentó la mezcla hasta temperatura ambiente y se agitó a esta temperatura durante 17 h. Se vertió la mezcla de reacción en agua (300 ml) y se extrajo con eA (200 ml x 2), se lavó la fase orgánica con agua (200 ml x 3), y salmuera (100 ml), se secó (Na<2>SO<4>), y se concentró la disolución y se purificó el producto en bruto mediante SCG para obtener un líquido de color amarillo claro. (8,0 g, 81 %).
1H-RMN (500 MHz, CDCl3)<8>9,77 (s, 1H), 7,36-7,26 (m, 5H), 4,53 (s, 2 H), 3,8-3,83 (m, 2H), 2,71-2,68 (m, 2H). Etapa 2: (4-(Benciloxi)-1,1,1-trifluorobutan-2-iloxi)trimetilsilano:
A una disolución de 3-(benciloxi)propanal (4,0 g, 24,4 mmol) en THF (50 ml) se le añadió trimetil(trifluorometil)silano (10,4 g, 73,2 mmol) a ta, seguido de la adición de CsF (0,37 g, 2,44 mmol). Se agitó la disolución resultante a ta durante 2 h. Luego se extinguió con agua (100 ml) y se extrajo con EA (100 ml x 2), se lavó la fase orgánica con agua (100 ml x 2), y salmuera (100 ml), se secó (Na<2>SO<4>), se filtró y se concentró. Se purificó el producto en bruto mediante ISCO Biotage para obtener (4-(benciloxi)-1,1,1-trifluorobutan-2-iloxi)trimetilsilano como un líquido incoloro. (4,5 g, 60 %)
1H-RMN (500 MHz, CDCl3)<8>7,38-7,29 (m, 5H), 4,51 (t, J= 12 Hz, 2 H), 4,23-4,19 (m, 1H), 3,59-3,57 (m, 2H), 2,04 2,01 (m, 1H), 1,78-1,73 (m, 1H), 0,13 (s, 9H).
Etapa 3: 4-(Benciloxi)-1,1,1-trifluorobutan-2-ol:
Se agitó una disolución de 4-(benciloxi)-1,1,1-trifluorobutan-2-ol (4,5 g, 14,7 mmol) en disolución de HCl (3 M en MeOH, 50 ml) a ta durante 2 h. Luego se concentró y se purificó mediante ISCO Biotage para obtener 4-(benciloxi)-1,1,1 -trifluorobutan-2-ol (2,75 g, 80 %) como un líquido incoloro.
Etapa 4: ((4,4,4-Trifluoro-3-metoxibutoxi)metil)benceno:
A una disolución de 4-(benciloxi)-1,1,1-trifluorobutan-2-ol (2,75 g, 11,75 mmol) en THF (100 ml) se le añadió t-BuOK (1,58 g, 14,1 mmol) a 0 °C y se agitó a esta temperatura durante 30 min. Luego se añadió Mel (2,17 g, 15,28 mmol) y se agitó a ta durante 1 hora adicional. Se extinguió la reacción con agua (100 ml) y se extrajo con EA (100 ml x 2), se lavó la fase orgánica con agua (100 ml x 2), y salmuera (100 ml), se secó (Na<2>SO<4>), se filtró y se concentró. Se purificó el producto en bruto mediante ISCO Biotage para obtener ((4,4,4-trifluoro-3-metoxibutoxi)metil)benceno (2,04 g, 70 %) como un líquido incoloro.
1H-RMN (500 MHz, CDCl3)<8>7,38-7,29 (m, 5H), 4,53 (t, J= 12 Hz, 2 H), 3,78-3,74 (m, 1H), 3,66-3,57 (m, 2H), 3,5 (s, 3H), 2,03-1,96 (m, 1H), 1,78-1,57 (m, 1H).
Etapa 5: 4,4,4-Trifluoro-3-metoxibutan-1-ol:
Se agitó la disolución de ((4,4,4-trifluoro-3-metoxibutoxi)metil)benceno (2,04 g, 8,23 mmol) y Pd/C (0,5 g) en MeOH (30 ml) a ta durante<2>h, luego se filtró y se concentró para obtener 4,4,4-trifluoro-3-metoxibutan-1-ol como un líquido incoloro. Este producto en bruto pasó a la siguiente etapa directamente.
Etapa<6>: 4,4,4-Trifluoro-3-metoxibutanal:
A una disolución de 4,4,4-trifluoro-3-metoxibutan-1-ol (1,3 g en bruto procedente de la última etapa) en DMSO (20 ml) se le añadió IBX (2,76 g, 9,88 mmol) bajo un baño de hielo. Se calentó la mezcla hasta temperatura ambiente y se agitó a esta temperatura durante 17 h. Se vertió la mezcla de reacción en agua (80 ml) y se extrajo con Et2O (80 ml x 2), se lavó la fase orgánica con agua (80 ml x 3), y salmuera (80 ml), y la disolución pasó a la siguiente etapa directamente.
Etapa 7: 2-(Bencilamino)-5,5,5-trifluoro-4-metoxipentanonitrilo:
A una disolución del 4,4,4-trifluoro-3-metoxibutanal anterior en Et<2>O (160 ml) se le añadió bencilamina (2 ml), AcOH (2,0 ml) y luego TMSCN (3 ml) con baño de hielo. Se calentó la mezcla hasta temperatura ambiente y se agitó a esta temperatura durante 17 h. Se diluyó la disolución con agua (200 ml) y se extrajo con EA (100 ml), se lavó la fase orgánica con agua<( 100>ml x<2>), y salmuera<( 10 0>ml), se secó (Na<2>SO<4>), se filtró y se concentró a vacío para proporcionar 2-(bencilamino)-5,5,5-trifluoro-4-metoxipentanonitrilo (2,0 g, en bruto) como un aceite espeso de color marrón que se usó para la siguiente etapa. ESI-EM (EI+, m/z):
Etapa<8>: Ácido 2-(bencilamino)-5,5,5-trifluoro-4-metoxipentanoico:
Se calentó una disolución de 2-(bencilamino)-5,5,5-trifluoro-4-metoxipentanonitrilo (2,0 g, en bruto) en HCl conc. (30 ml) y AcOH (10 ml) hasta 100 °C durante 17 h. Se concentró la disolución hasta sequedad, se diluyó con H<2>O (100 ml) y ACN (50 ml), se ajustó el pH a 3-4 con disolución sat. de NaHCO3, se filtró la mezcla y se secó para proporcionar ácido 2-(bencilamino)-5,5,5-trifluoro-4-metoxipentanoico (0,8 g, 35 % para las 4 etapas) como un sólido de color marrón. ESI-EM (EI+, m/z): [M+H]+.
Etapa 9: Ácido 2-amino-5,5,5-trifluoro-4-metoxipentanoico [I-175]:
Se agitó una disolución de ácido 2-(bencilamino)-5,5,5-trifluoro-4-metoxipentanoico (300 mg, 1,03 mmol) y HCOONH<4>(650 mg, 10,3 mmol) en MeOH (10 ml) a<6 0>°C durante 2 h, luego se filtró y se concentró. Se purificó el producto en bruto mediante Biotage en fase inversa para obtener ácido 2-amino-5,5,5-trifluoro-4-metoxipentanoico [I-175] como un sólido de color blanco.
1H-RMN (500 MHz, metanol-d4) 54,23-4,19 (m, 1H), 3,96-3,88 (m, 1H), 3,64-3,6 (m, 3H), 2,29-2,22 (m, 1H), 2,04 1,97 (m, 1H).
Ejemplo 176: Ácido 2-amino-4,4,5-trimetilhexanoico [I-176]:
1-176
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: 2-(2,3-Dimetilbutan-2-il)malonato de dietilo:
Se enfrió una disolución de 2-(propan-2-iliden)malonato de dietilo (2 g, 10,0 mmol) en THF (60 ml) hasta 0 °C, seguido de yoduro de cobre(I) (2,9 g, 15,0 mmol). Se agitó la mezcla a 0 °C durante 0,5 h. Luego se añadió bromuro de isopropilmagnesio (1 mol/l, 30,0 ml, 30,0 mmol) gota a gota en la mezcla anterior a 0 °C. Se agitó la mezcla a 0 °C durante 2 h. Se extinguió la mezcla con HCl (1 mol/l), se extrajo con EtOAc (60 ml*2). Se separó la fase orgánica, se lavó con agua (100 ml x 2), y salmuera (130 ml), se secó (Na<2>SO<4>), se filtró y se concentró a vacío para proporcionar 2-(2,3-dimetilbutan-2-il)malonato de dietilo (2,4 g, 10,0 mmol, 98 %) como un sólido de color amarillo. ESI-EM (EI+, m/z): 245,3 [M+H] .
Etapa 2: Ácido 2-(2,3-dimetilbutan-2-il)malónico:
Se calentó una mezcla de 2-(2,3-dimetilbutan-2-il)malonato de dietilo-acetamida (2,4 g, 10,0 mmol) e hidróxido de litio hidratado (2,1 g, 50,0 mmol) en DMSO (50 ml) y agua (10 ml) hasta 98 °C y se mantuvo durante 20 h. Se enfrió la mezcla, se acidificó con HCl (1 mol/l), y se repartió entre EtOAc (30 ml) y agua (30 ml). Se separó la fase orgánica, se lavó con agua (50 ml x 2), y salmuera (50 ml), se secó (Na<2>SO<4>), se filtró y se concentró a vacío para proporcionar ácido 2-(2,3-dimetilbutan-2-il)malónico (1,8 g, 10,0 mmol, 95 %) como un aceite de color amarillo. ESI-EM (EI+, m/z): 212,2 [M+H]+.
Etapa 3: Ácido 3,3,4-trimetilpentanoico:
Se calentó una disolución de ácido 2-(2,3-dimetilbutan-2-il)malónico (1,8 g, 10,0 mmol) en DMSO (30 ml) hasta 120 °C y se mantuvo durante 12 h. Se enfrió la mezcla, y se repartió entre EtOAc (50 ml) y agua (60 ml). Se separó la fase orgánica, se lavó con agua (60 ml x 2), y salmuera (60 ml), se secó (Na<2>SO<4>), se filtró y se concentró a vacío para proporcionar ácido 3,3,4-trimetilpentanoico (1,4 g, 10,0 mmol, 95 %) como un aceite de color amarillo. ESI-EM (EI-, m/z): 143,2 [M-H] .
Etapa 4: N-Metoxi-N,3,3,4-tetrametilpentanamida:
A una disolución de ácido 3,3,4-trimetilpentanoico (1,4 g, 10,0 mmol) en 30 ml de DMF se le añadió clorhidrato de N,O-dimetilhidroxilamina (1,2 g, 12,0 mmol) a 20 °C, seguido de DIEA (3,8 g, 30,0 mmol). Luego se añadió HATU (5,8 g, 15,0 mmol). Se calentó la mezcla hasta 25 °C con agitación y se mantuvo durante 18 h. Se extinguió la mezcla de reacción con agua, seguido de metil terc-butil éter (50 ml*2). Separación de fases, se lavó la fase orgánica con salmuera (80 ml*3), se secó sobre Na<2>SO<4>, se filtró y se concentró a vacío para proporcionar N-metoxi-N, 3,3,4-tetrametilpentanamida (1,5 g, 90 %) como un aceite de color marrón. ESI-EM (EI+, m/z): 188,2 [M+H] . Etapa 4: 3,3,4-Trimetilpentanal:
A una disolución N-metoxi-N,3,3,4-tetrametilpentanamida (1,9 g, 0,01 mol) en 30 ml de THF se le añadió LiAlH4 (1 g, O, 03 mol) a 0 °C. Se agitó la mezcla a 0 °C durante 1 h. Se extinguió la mezcla de reacción con agua, seguido de metil terc-butil éter (50 ml*2). Separación de fases, se lavó la fase orgánica con salmuera (80 ml*3), se secó sobre Na<2>SO<4>y se filtró. El filtrado contenía 3, 3, 4-trimetilpentanal (1,3 g, 95 %) como una disolución incolora, que se usó en la siguiente etapa directamente.
Etapa 5: 2-(Bencilamino)-4, 4, 5-trimetilhexanonitrilo:
A una disolución del 3,3,4-trimetilpentanal anterior en metil terc-butil éter (120 ml) se le añadió bencilamina (1,6 ml), AcOH (1,0 ml) y luego TMSCN (1,8 ml) con baño de hielo. Se calentó la mezcla hasta 25 °C y se agitó durante la noche. Se diluyó la disolución con agua (60 ml) y se extrajo con EtOAc (30 ml), se lavó la fase orgánica con agua (50 ml x 2), y salmuera (50 ml), se secó (Na<2>SO<4>), se filtró y se concentró a vacío para proporcionar 2-(bencilamino)-4, 4, 5-trimetilhexanonitrilo (2 g, en bruto) como un aceite de color marrón que se usó para la siguiente etapa. ESI-EM (EI+, m/z): 245,4 [M+H] .
Etapa<6>: Ácido 2-(bencilamino)-4,4,5-trimetilhexanoico:
Se calentó una disolución de 2-(bencilamino)-4,4,5-trimetilhexanonitrilo (2 g, en bruto) en HCl conc. (60 ml) y AcOH (10 ml) hasta 95 °C durante 18 h. Se enfrió la disolución hasta 15 °C, se ajustó el pH a 3-4 con disolución sat. de NaHCO<3>, se filtró la mezcla y se secó para proporcionar ácido 2-(bencilamino)-4, 4, 5-trimetilhexanoico (0,6 g, 2,3 mmol, 30 % para las 3 etapas) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 264,4 [M+H]+.
Ácido 2-amino-4,4,5-trimetilhexanoico [I-176]:
A una disolución de ácido 2-(bencilamino)-4, 4, 5-trimetilhexanoico (78 mg, 0,3 mmol) en<8>ml de MeOH se le añadió HCOONH4 (0,13 g, 2,0 mmol) y Pd/C (30 mg) a ta. Se agitó la mezcla a 60 °C durante 2 h. Se filtró la mezcla de reacción y se concentró para proporcionar un producto en bruto que se purificó mediante cromatografía en gel de sílice de fase inversa para proporcionar ácido 2-amino-6,6,6-trifluoro-4-metilhexanoico [I-176] (40 mg, 90%) como un sólido de color blanco; ESI-EM (EI+, m/z): 174,3 [M+H] ; 1H-RMN (500 MHz, MeOD)<8>3,56 (dd,J= 7,2, 4,9 Hz, 1H), 2,12 (dd,J =14,7, 4,9 Hz, 1H), 1,66 - 1,51 (m, 2H), 0,97 (d,J =14,9 Hz,<6>H), 0,92 (dd,J =<6>,<8>, 3,6 Hz,<6>H). Ejemplo 178: Ácido 2-amino-4,4-dimetilheptanoico [I-178]
1-178
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
El procedimiento fue el mismo que el usado en el ejemplo 176
Ácido 2-amino-4,4-dimetilheptanoico [I-178]:<1>H-RMN (500 MHz, MeOD-ck) 53,77 (t,J =<6>Hz, 1H), 2,09-2,05 (m, 1H), 1,6-1,56 (m, 1H), 1,37-1,26 (m, 4H), 1,01-0,92 (m, 9 H).
Ejemplo 195: Ácido 2-amino-4,4-dimetilhexanoico [I-195], ácido (S)-2-amino-4,4-dimetilhexanoico [I-120], ácido (R)-2-amino-4,4-dimetilhexanoico [I-191].
Esquema de síntesis:
Hz,
J=
J =
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: N-Metoxi-N-metil-2-(trifenil-15-fosfaniliden)acetamida:
Se calentó una mezcla de (2-cloro-N-metoxi-N-metilacetamida (13,7 g, 0,1 mol) y trifenilfosfano (26,2 g, 0,1 mol) en acetonitrilo (200 ml) hasta 80 °C y se mantuvo durante 20 h. Se enfrió la mezcla y se concentró para eliminar el disolvente por debajo de 40 °C. Se disolvió el residuo en diclorometano (200 ml), seguido de KOH 2 N (100 ml). Se agitó la mezcla resultante a 20 °C durante 1 h. Separación de fases, se lavó la fase orgánica con salmuera (200 ml*3), se secó sobre Na<2>SO<4>y se filtró. Se concentró el filtrado a vacío para proporcionar N-metoxi-N-metil-2-(trifenil-l5-fosfanilidene)acetamida (36 g, 0,1 mol, 98%) como un sólido de color amarillo. ESI-EM (EI+, m/z): 364,4 [M+H]+.
Etapa 2: (£)-5,5,5-Trifluoro-N-metoxi-N,3-dimetilpent-2-enamida:
Se calentó una mezcla de N-metoxi-N-metil-2-(trifenil-l5-fosfaniliden)acetamida (36,3 g, 0,1 mol) y 4,4,4-trifluorobutan-<2>-ona (25,2 g,<0 , 2>mol) en tetrahidrofurano (500 ml) hasta 70 °C y se mantuvo durante 7 días. Se enfrió la mezcla y se concentró para eliminar el disolvente por debajo de 40 °C a vacío. Se purificó el residuo mediante una columna de gel de sílice (200 g, malla de 200 ~ 300, UV 254 nm) eluyendo con acetato de etilo en éter de petróleo desde el 0 hasta el 35 % para proporcionar (E)-5,5,5-trifluoro-N-metoxi-N,3-dimetilpent-2-enamida<( 6>g, 0,03 mol, 28 %) como un aceite de color amarillo. ESI-<e>M (EI+, m/z):<2 1 2 , 2>[M+H]+.
Etapa 3: 5, 5, 5-Trifluoro-N-metoxi-N,3-dimetilpentanamida:
Se agitó una mezcla de (E)-5,5,5-trifluoro-N-metoxi-N,3-dimetilpent-2-enamida<( 6>g, 0,03 mol) y Pd/C (10 %, 400 mg) en THF<( 1 0 0>ml) a 30 °C durante 18 h. Se filtró la mezcla, y se concentró el filtrado a vacío hasta sequedad para proporcionar 5,5,5-trifluoro-N-metoxi-N,3-dimetilpentanamida<( 6>g, 0,03 mol, 98 %) como un aceite de color amarillo. ESI-EM (EI+, m/z): 214,2 [M+H] .
Etapa 4: 5, 5, 5-Trifluoro-3-metilpentanal:
A una disolución 5,5,5-trifluoro-N-metoxi-N,3-dimetilpentanamida<( 6>g, 0,03 mol) en 100 ml de THF se le añadió LiAlH4 (1 g, 0,03 mol) a 0 °C. Se agitó la mezcla a 0 °C durante 1 h. Se extinguió la mezcla de reacción con agua, seguido de metil terc-butil éter (60 ml*2). Separación de fases, se lavó la fase orgánica con salmuera (80 ml*3), se secó sobre Na<2>SO<4>y se filtró. El filtrado estaba contenido para proporcionar 5,5,5-trifluoro-3-metilpentanal (4,5 g, 95 %) como una disolución incolora, que se usó en la siguiente etapa directamente.
Etapa 5: 2-(Bencilamino)-6,6,6-trifluoro-4-metilhexanonitrilo:
A una disolución del 5,5,5-trifluoro-3-metilpentanal anterior en metil terc-butil éter (200 ml) se le añadió bencilamina (5 ml), AcOH (4,0 ml) y luego TMSCN (5 ml) con baño de hielo. Se calentó la mezcla 20 °C y se agitó durante la noche. Se diluyó la disolución con agua (100 ml) y se extrajo con EtOAc (100 ml), se lavó la fase orgánica con agua (100 ml x 2), y salmuera (100 ml), se secó (Na<2>SO4), se filtró y se concentró a vacío para proporcionar 2-(bencilamino)-6,6,6-trifluoro-4-metilhexanonitrilo<( 6>g, en bruto) como un aceite de color marrón que se usó para la siguiente etapa. ESI-EM (EI+, m/z): 271,3 [M+H] .
Etapa<6>: Ácido 2-(bencilamino)-6,6,6-trifluoro-4-metilhexanoico:
Se calentó una disolución de 2-(bencilamino)-6,6,6-trifluoro-4-metilhexanonitrilo (3 g, en bruto) en HCl conc. (100 ml) y AcOH (20 ml) hasta 100 °C durante 17 h. Se enfrió la disolución hasta 15 °C, se ajustó el pH a 3-4 con disolución sat. de NaHCO<3>, se filtró la mezcla y se secó para proporcionar ácido 2-(bencilamino)-6,6,6-trifluoro-4-metilhexanoico (1 g, 13,4 mmol, 33 % para las 3 etapas) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 290,3 [M+H] .
Ácido 2-amino-6,6,6-trifluoro-4-metilhexanoico [I-177]:
A una disolución de ácido 2-(bencilamino)-6,6,6-trifluoro-4-metilhexanoico<( 88>mg, 0,31 mmol) en<8>ml de MeOH se le añadió HCOONH<4>(0,13 g, 2,0 mmol) y Pd/C (30 mg) a ta. Se agitó la mezcla a 60 °C durante 2 h. Se filtró la mezcla de reacción y se concentró para proporcionar un producto en bruto que se purificó mediante cromatografía en gel de sílice de fase inversa para proporcionar ácido 2-amino-6,6,6-trifluoro-4-metilhexanoico [I-177] (45 mg, 84%) como un sólido de color blanco; ESI-EM (EI+, m/z): 200,2 [M+H] ; 1H-RMN (500 MHz, DMSO) 53,15 (d,J =5,7 Hz, 1H), 2,39 -2,24 (m, 1H), 2,19 - 1,96 (m, 2H), 1,82 - 1,66 (m, 1H), 1,63 - 1,35 (m, 1H), 0,98 (dd,J =16,5, 6,2 Hz, 3H).
Ejemplo 179: Ácido (S)-2-amino-5-fluoro-4-(fluorometil)pentanoico [I-179]
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: 5-(Benciloximetil)-2,2-dimetil-1,3-dioxano:
A una disolución de (2,2-dimetil-1,3-dioxan-5-il)metanol (0,29 g, 2,0 mmol) en DMF (10 ml) se le añadió NaH (60 % en aceite, 0,12 g, 3,0 mmol) a 0 °C. Se agitó la mezcla a 0 °C durante 0,2 horas. Luego, se añadió (bromometil)benceno (0,45 g, 2,6 mmol). Se calentó la mezcla hasta 10 °C durante 3 h y se mantuvo durante 18 h. Se extinguió la mezcla de reacción con agua con hielo, seguido de EtOAc (60 ml). Separación de fases, se lavó la fase orgánica con salmuera (60 ml*3), se secó sobre Na<2>SO<4>y se filtró. Se concentró el filtrado y se purificó el residuo mediante columna de gel de sílice (20 g, UV 254 nm eluyendo con EtOAc en PE desde el 10 % hasta el 50%) para proporcionar 5-(benciloximetil)-2,2-dimetil-1,3-dioxano (1), (0,46 g, 0,2 mol, 95%) como un aceite incoloro. ESI-EM (EI+, m/z): 237,3 [M+H]+.
Etapa 2: 2-(Benciloximetil)propano-1,3-diol:
A una disolución de 5-(benciloximetil)-2,2-dimetil-1,3-dioxano (930 mg, 3,94 mmol) en MeOH (20 ml) se le añadió HCl acuoso 3 N (2 ml). Se agitó la mezcla a 50 °C durante 2 horas. Se concentró la mezcla de reacción y se diluyó con DCM (20 ml), se lavó con salmuera (15 ml), se secó y se evaporó para proporcionar el aceite incoloro en bruto (780 mg, 100 %). ESI-EM (EI+, m/z): 197 [M+H]+.
Etapa 3: ((3-Fluoro-2-(fluorometil)propoxi)metil)benceno:
A una disolución preenfriada de 2-(benciloximetil)propano-1,3-diol (780 mg, 3,94 mmol) en DCM (20 ml) se le añadió DAST (1,9 g, 11,8 mmol) gota a gota a -78 °C. Se agitó la mezcla a 20 °C durante 24 horas. Se extinguió la mezcla de reacción con NaHCO<3>acuoso sat. (10 ml) a -78 °C. Se separó la fase de DCM y se lavó con salmuera, se secó con MgSO<4>, se filtró a través de un lecho corto de gel de sílice y luego se concentró para proporcionar el aceite incoloro en bruto (800 mg, 100 %). ESI-EM (EI+, m/z): 223 [M+Na]+.<1>H-RMN (500 MHz,<8>7,37 - 7,28 (m, 5H), 4,65 -4,57 (m, 2H), 4,55 - 4,48 (m, 4H), 3,57 (d,J =6,2 Hz, 2H), 2,50 - 2,34 (m, 1H).
Etapa 4: 3-Fluoro-2-(fluorometil)propan-1-ol:
A una disolución preenfriada de ((3-fluoro-2-(fluorometil)propoxi)metil)benceno (800 mg, 3,94 mmol) en DCM (20 ml) se le añadió BCl<3>/tolueno (1 M,<6>ml, 6,0 mmol) gota a gota a - 78 °C. Se agitó la mezcla a -78~0 °C durante 2 horas. Se extinguió la mezcla de reacción con H<2>O (0,5 ml) a -78 °C. Se secó la fase de DCM con MgSO<4>, se filtró y se usó la disolución (aproximadamente<2 0>ml) para la siguiente etapa directamente.
Etapa 5: Trifluorometanosulfonato de 3-fluoro-2-(fluorometil)propilo:
A una disolución preenfriada de 3-fluoro-2-(fluorometil)propan-1-ol<( 8>ml de disolución procedente de la etapa 4, 1,6 mmol) se le añadió pi (“piridina”) (380 mg, 4,8 mmol) luego Tf<2>O (1,36 g, 4,8 mmol) gota a gota a -40 °C. Se agitó la mezcla a -30 °C durante 1 hora. Se extinguió la mezcla de reacción con salmuera (20 ml) a -40 °C. Se separó la fase de DCM y se secó con MgSO<4>, se filtró y luego se concentró para proporcionar el aceite de color tostado en bruto (200 mg, 51 %) que se usó para la siguiente etapa directamente.
Etapa<6>: 2-(Difenilmetilenoamino)-5-fluoro-4-(fluorometil)pentanoato de terc-butilo:
A una disolución preenfriada de 2-(difenilmetilenoamino)acetato de terc-butilo (944 mg, 3,2 mmol) en THF (20 ml) se le añadió LDA (2,5 M en THF/tolueno/hexano, 1,28 ml, 3,2 mmol) a -78 °C en 25 min. Se agitó la mezcla a esta temperatura durante 10 min. Se añadió una disolución de trifluorometanosulfonato de 3-fluoro-2-(fluorometil)propilo (200 mg, 0,82 mmol) en THF (2 ml) gota a gota a -78 °C. Se colocó la mezcla de reacción justo por encima del baño de enfriamiento y se agitó durante 1 h adicional. Se extinguió la mezcla de reacción con NH<4>CI acuoso sat. (20 ml), se extrajo con MTBE (30 ml*2), se lavó con H<2>O, salmuera (50 ml cada), se secó y se concentró para proporcionar el producto en bruto que se purificó mediante cromatografía (gel de sílice, PE al 5 %EA/PE) dos veces para proporcionar el producto deseado (22 mg, 6,9 %) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 388 [M+H]+.<1>H-RMN (500 MHz, DMSO) 57,56 - 7,45 (m,<6>H), 7,41 (t,J =7,4 Hz, 2H), 7,18 (d,J =6,3 Hz, 2H), 4,50 - 4,17 (m, 4H), 3,91 (dd,J =7,7, 5,5 Hz, 1H), 2,11 - 1,97 (m, 1H), 1,87 (dd,J =12,7, 5,5 Hz, 2H), 1,38 (s, 9H).
Etapa 7: Clorhidrato de ácido (S)-2-amino-5-fluoro-4-(fluorometil)pentanoico:
Se agitó una disolución de 2-(difenilmetilenoamino)-5-fluoro-4-(fluorometil)pentanoato de terc-butilo (55 mg, 0,14 mmol) en HCl 3 N/MeOH (2 ml) a temperatura ambiente durante 20 horas. Se concentró la mezcla de reacción y se lavó con Et2O para proporcionar el sólido en bruto que se disolvió en DCM/TFA (1:1, 2 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 20 horas. Se evaporó la mezcla de reacción y se lavó con Et<2>O para proporcionar el sólido en bruto que se disolvió en HCl<6>N (1 ml) y se agitó a 80 °C durante 2 h. Se evaporó la mezcla de reacción y se liofilizó para proporcionar el producto en bruto que se purificó mediante RP-Biotage usando HCl 3 mM/H<2>O para proporcionar el producto deseado (8,3 mg, 29 %) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 168 [M+H]+.<1>H-RMN (500 MHz, DMSO) 57,85 (bs, 3H), 4,48 (dd,J =48,3, 14,2 Hz, 4H), 3,46 - 3,36 (m, 1H), 2,47 - 2,26 (m, 1H), 1,78 (dt,J =14,3, 7,3 Hz, 1H), 1,63 - 1,53 (m, 1H).
Ejemplo 187: (S)-3-Amino-5,5-dimetil-dihidrofuran-2(3H)-ona [I-187]:
1-187
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: (S)-3-Amino-5,5-dimetil-dihidrofuran-2(3H)-ona [I-187]:
A un matraz de fondo redondo que contenía ácido (S)-2-amino-4-metilpent-4-enoico (100 mg) se le añadió HCl conc. (1 ml) y SOCl<2>(0,2 ml). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 4 horas. Se concentró la mezcla de reacción y se lavó con Et2O para proporcionar el sólido en bruto que se purificó mediante RP-Biotage usando TFA al 0,025 %/H<2>O/MeCN para proporcionar el producto deseado (20,2 mg, 11,4 %) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 130,1 [M+H]+.<1>H-RMN (500 MHz, DMSO) 58,80 (bs, 3H), 4,58 (dd,J= 11,2, 9,3 Hz, 1H), 2,53 -2,48 (m, 1H), 2,13 (t,J= 11,7 Hz, 1H), 1,45 (s, 3H), 1,40 (s, 3H).
Ejemplo 90: Síntesis de ácido (S)-2-amino-5,5-difluoro-4,4-dimetilpentanoico [I-90]:
Esquema de síntesis:
Etapa 1: 2-(1,1,1-Trifluoropropan-2-iliden)malonato de dietilo:
Se añadió TÍCI<4>(65,8 ml, 600 mmol) gota a gota a THF (1 l) con baño de hielo a lo largo de 20 min, se añadió CCI<4>(30 ml). A la mezcla se le añadió malonato de dietilo (48,0 g, 300 mmol) y 1,1-difluoropropan-2-ona (56,4 g, 600 mmol). Se calentó la mezcla hasta temperatura ambiente y se agitó durante la noche. Se añadió piridina<( 2 0 0>ml) gota a gota a lo largo de<2 0>min con baño de hielo, se vertió la mezcla de reacción en agua<( 2>l), se filtró, y se extrajo el filtrado con EtOAc (500 ml x 2), se lavó la fase orgánica con agua (600 ml), HCl 1M(600 ml x 2), agua (600 ml), NaHCO<3>sat. (600 ml) y salmuera (600 ml), se secó (Na<2>SO<4>), se filtró y se concentró a vacío y se purificó mediante cromatografía (sílice, acetato de etilo/éter de petróleo desde el 0 % hasta el 5 %) para proporcionar 2-(1,1-difluoropropan-2-iliden)malonato de dietilo (60,9 g, 258 mmol,<8 6>%) como un líquido incoloro. ESI-EM (EI+, m/z): 237,0 [M+H]+.<1>H-RMN (500 MHz, CDCla):<8>6,97 (t,J= 55,5 Hz, 1H), 4,25-4,33 (m, 4H), 2,03 (s, 3H), 1,29-1,34 (m,<6>H).
Etapa 2: 2-(1,1-Difluoro-2-metilpropan-2-il)malonato de dietilo:
A una mezcla de 2-(1,1-difluoropropan-2-iliden)malonato de dietilo (10,0 g, 42,3 mmol) y Cul (12,1 g, 63,5 mmol) en DCM (100 ml) y THF (25 ml) se le añadió gota a gota MeMgl (42,3 ml, 130,5 mmol) a -20 °C a lo largo de 1 h, se vertió la disolución en agua con hielo (200 ml) y se trató con disolución sat. de NH<4>Cl (100 ml), se agitó la mezcla durante 30 min y se filtró, se extrajo el filtrado con DCM (100 ml), se lavó la fase orgánica con agua (100 ml x 2), y salmuera<( 1 0 0>ml), se secó (Na<2>SO<4>), se filtró y se concentró a vacío para proporcionar<2>-(<1>,<1>-difluoro-<2>-metilpropan-2-il)malonato de dietilo (10,1 g, 40,2 mmol, 95 %) como un líquido de color marrón que se usó para la siguiente etapa. ESI-EM (EI+, m/z): 253,1 [M+H]+.<1>H-RMN (500 MHz, CDCl<3>):<8>6,05 (t,J =57,5 Hz, 1H), 4,17-4,23 (m, 4H), 3,49 (s, 1H), 1,22-1,28 (m,<6>H), 1,20 (s,<6>H).
Etapa 3: Ácido 4,4-difluoro-3,3-dimetilbutanoico:
Se calentó una mezcla de 2-(1,1-difluoro-2-metilpropan-2-il)malonato de dietilo (6,1 g, 24,2 mmol) y LOH.H<2>O (5,1 g, 121 mmol) en DMSO (50 ml) y H<2>O (0,5 ml) hasta 90 °C durante 17 h. Se diluyó la mezcla con agua (200 ml), se extrajo con DCM (100 ml), se ajustó la fase acuosa a pH 3-4 con una disolución de HCl<6>M, se extrajo con DCM (100 ml x 2), se secó (Na<2>SO<4>), se filtró y se concentró a vacío para proporcionar ácido 4,4-difluoro-3,3-dimetilbutanoico (3,6 g, en bruto) como un líquido de color marrón. ESI-EM (EI+, m/z): 151,1 [M-H]-.
Etapa 4: 4,4-Difluoro-N-metoxi-N,3,3-trimetilbutanamida:
A una disolución de ácido 4,4-difluoro-3,3-dimetilbutanoico (3,6 g, en bruto), clorhidrato de N,O-dimetilhidroxilamina (4,6 g, 47,4 mmol) y HATU (10,8 g, 28,4 mmol) en DMF (50 ml) se le añadió Et<3>N (7,18 g, 71,1 mmol), después de agitarse a ta durante 17 h. Se filtró la mezcla, y se diluyó el filtrado con agua (200 ml), se extrajo con Et<2>O (100 ml x 2), se lavó con agua (100 ml), 1MHCl (100 ml), y salmuera (100 ml), se secó (Na<2>SO<4>), se filtró y se concentró a vacío para proporcionar 4,4-difluoro-N-metoxi-N,3,3-trimetilbutanamida (3,1 g, 15,9 mmol,<6 6>%, 2 etapas) como un líquido de color marrón. ESI-EM (EI+, m/z): 196,0 [M+H]+.<1>H-RMN (500 MHz, CDCla):<8>5,95 (t,J =57,5 Hz, 1H), 3,69 (s, 3H), 3,17 (s, 3H), 2,51 (s, 2H), 1,12 (s,<6>H).
Etapa 5: 4,4-Difluoro-3,3-dimetilbutanal:
A una disolución de 4,4-difluoro-W-metoxi-A/,3,3-trimetilbutanamida (3,1 g, 15,9 mmol) en THF (80 ml) se le añadió gota a gota LiAlH<4>(24 ml, 24 mmol) con baño de hielo. Después de 1 h, se extinguió la mezcla con una disolución de ácido cítrico<( 1 0 0>ml), se extrajo la disolución con Et<2>O<( 1 0 0>ml x<2>), se lavó la fase orgánica con salmuera<( 1 0 0>ml), se secó (Na<2>SO<4>), y se usó la disolución para la siguiente etapa.
Etapa<6>: 2-(Bencilamino)-5,5-difluoro-4,4-dimetilpentanonitrilo:
A la disolución anterior de 4,4-difluoro-3,3-dimetilbutanal en Et<2>O (200 ml) se le añadió bencilamina (3 ml), AcOH (3 ml) y luego TMSCN (3 ml) con baño de hielo, se agitó la disolución a 0 ~ ta durante 17 h, y luego se diluyó con EtOAc (100 ml). Se lavó la disolución con H<2>O (100 ml x 2) y luego se concentró para proporcionar 2-(bencilamino)-5,5-difluoro-4,4-dimetilpentanonitrilo (3,2 g, en bruto) como un líquido de color marrón. ESI-EM (EI+, m/z): 253,0 [M+H]+.
Etapa 7: Ácido 2-(bencilamino)-5,5-difluoro-4,4-dimetilpentanoico:
Se calentó una disolución de 2-(bencilamino)-5,5-difluoro-4,4-dimetilpentanonitrilo (1,8 g, en bruto) enHCl conc.(50 ml) y AcOH (10 ml) hasta 100 °C durante 64 h. Se concentró la mezcla para eliminar el disolvente, se ajustó el pH a 12 con disolución de NaOH 1 M, se extrajo con PE (100 ml), se ajustó la fase acuosa a pH 5-6 con HCl<6>M. Se formó el sólido de color blanco, se filtró, y se lavó la torta de filtración con agua (50 ml), se secó a vacío para proporcionar ácido 2-(bencilamino)-5,5-difluoro-4,4-dimetilpentanoico (1,3 g, 4,80 mmol, 54%, 3 etapas) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 272,0
Etapa<8>: Ácido 2-amino-5,5-difluoro-4,4-dimetilpentanoico:
Se calentó una mezcla de ácido 2-(bencilamino)-5,5-difluoro-4,4-dimetilpentanoico (1,3 g, 4,80 mmol), HCOONH<4>(1,51 g, 24 mmol) y Pd/C (10%, 200 mg) en MeOH (50 ml) hasta 60 °C durante 1 h. Se filtró la mezcla, y se concentró el filtrado para proporcionar ácido 2-amino-5,5-difluoro-4,4-dimetilpentanoico (1,0 g, en bruto) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 182,0
Etapa 9: Ácido 2-(benciloxicarbonilamino)-5,5-difluoro-4,4-dimetilpentanoico
A una disolución de ácido 2-amino-5,5-difluoro-4,4-dimetilpentanoico (1,0 g, en bruto) y NaHCO<3>(1,27 g, 14,4 mmol) en acetona (30 ml) y H<2>O (30 ml) se le añadió CbzOSu (2,39 g, 9,6 mmol) con baño de hielo. Después de agitarse durante 17 h, se ajustó la mezcla a pH 3-4 con disolución de HCl 1 M, y se extrajo la disolución con EtOAc (50 ml x 2), se lavó con salmuera (50 ml), se secó (Na<2>SO<4>), se filtró y se concentró a vacío, se purificó el producto en bruto mediante cromatografía en gel de sílice de fase inversa y luego HPLC preparativa quiral [columna, CC44,6*250 mm 5 um; disolvente, MeOH (amoniaco en metanol al 0,2 %)] para proporcionar ácido ('S)-2-(benciloxicarbonilamino)-5,5-difluoro-4,4-dimetilpentanoico (400 mg, 1,27 mmol, 26%, 2 etapas) y ácido (RJ-2-(benciloxicarbonilamino)-5,5-difluoro-4,4-dimetilpentanoico (380 mg, 1,21mmol, 25%, 2 etapas) como dos aceites incoloros. ESI-EM (EI+, m/z): 316,0
Etapa 10: Ácido (S)-2-amino-5,5-difluoro-4,4-dimetilpentanoico:
Se agitó una disolución de ácido (S)-2-(benciloxicarbonilamino)-5,5-difluoro-4,4-dimetilpentanoico (400 mg, 1,27 mmol) y Pd/C (10 %, 50 mg) en MeOH (30 ml) a ta durante 2 h bajo hidrógeno, se filtró la mezcla y se concentró a vacío y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice de fase inversa para proporcionar ácido ('Sj-2-amino-5,5-difluoro-4,4-dimetilpentanoico (115,7 mg, 0,64 mmol, 50%). ESI-EM (EI+, m/z): 182,0<1>H-RMN (500 MHz, MeOD-d4):<8>5,60 (t,J =56,5 Hz, 1H), 3,97 (t,J =6,0 Hz, 1H), 2,07 (dd,J =15,5 Hz,J =5,5 Hz, 1H), 1,77 (dd,J= 15,5 Hz,J =6,5 Hz, 1H), 0,96 (d,J =9,5 Hz,<6>H).
E je m p lo 88: S ín te s is de ác ido (S )-2 -a m in o -5 ,5 -d iflu o ro -4 ,4 -d im e tilp e n ta n o ic o [I-88]:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: (S)-2-(Bencilamino)-5,5-difluoro-4,4-dimetNpentanamida:
A una disolución de 2-(bencilamino)-5,5-difluoro-4,4-dimetilpentanonitrilo (1,2 g, 4,76 mmol) en DCM (20 ml) se le añadió gota a gota H<2>SO<4>conc. (10 ml) con baño de hielo a lo largo de 5 min, se calentó la mezcla hasta temperatura ambiente y se agitó durante<6>h. Se vertió la mezcla en agua con hielo (100 ml), se ajustó la disolución PH a<8>~ 9 con disolución de NaOH al 10 %, y luego se extrajo con EtOAc (100 ml x 2), se lavó la fase orgánica con agua<( 10 0>ml), y salmuera<( 1 0 0>ml), se secó (Na<2>SO<4>), se filtró y se concentró a vacío y se purificó mediante cromatografía (MeOH/DCM desde el 0 % hasta el 5 %) y luego HPLC preparativa quiral [columna, CC44,6*250 mm 5 um; disolvente, MeOH (amoniaco en metanol al 0,2 %)] para proporcionar (S)-2-(bencilamino)-5,5-difluoro-4,4-dimetilpentanamida (400 mg, 1,48 mmol, 31 %) y (R)-2-(bencilamino)-5,5-difluoro-4,4-dimetilpentanamida (380 mg, 1,41 mmol, 30 %) como dos líquidos incoloros. ESi-EM (EI+, m/z): 253,0 [M+H]+.
Etapa 2: (S)-2-Amino-5,5-difluoro-4,4-dimetilpentanamida:
Se calentó una mezcla de (S)-2-(bencilamino)-5,5-difluoro-4,4-dimetilpentanamida (200 mg, 0,74 mmol), HCOONH<4>(233 mg, 3,7 mmol) y Pd/C<( 1 0>%, 40 mg) en MeOH (15 ml) hasta 60 °C durante<1>h. Se filtró la mezcla, y se concentró el filtrado y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice de fase inversa para proporcionar ácido trifluoroacético de (S)-2-amino-5,5-difluoro-4,4-dimetilpentanamida (128 mg, 0,44 mmol, 59%) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 181,0 [M+H]+.<1>H-RMN (500 MHz, MeOD-d4): 55,66 (t,J =56,5 Hz, 1H), 3,95 (dd,J =8,0 Hz,J =5,0 Hz, 1H), 2,14 (dd,J =10,0 Hz,J =8,0 Hz, 1H), 1,83 (dd,J =14,5 Hz,J= 5,5 Hz, 1H), 1,12 (d,J= 15,0 Hz,<6>H).
Ejemplo 185: Síntesis de (S)-2-((S)-2-amino-5,5-difluoro-4,4-dimetilpentanamido)-4-metilpentanoato de metilo [I-185]:
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
El procedimiento para el ácido 2-(benciloxicarbonilamino)-5,5-difluoro-4,4-dimetilpentanoico fue el mismo que en el ejemplo 90
Etapa 1: (S)-2-((S)-2-(Benciloxicarbonilamino)-5,5-difluoro-4,4-dimetilpentanamido)-4-metilpentanoato de metilo: Se agitó la disolución de ácido (S)-2-(benciloxicarbonilamino)-5,5-difluoro-4,4-dimetilpentanoico (150 mg, 0,476 mmol), HATU (199 mg, 0,524 mmol), clorhidrato de (S)-2-amino-4-metilpentanoato de metilo (104 mg, 0,571 mmol) y DIPEA (123 mg, 0,952 mmol) a ta durante 1 hora, luego se extinguió con agua con hielo (20 ml), se extrajo con eA (2x30ml), se secó, se filtró y se concentró. Se purificó el producto en bruto mediante cromatografía en gel de sílice de fase inversa Biotage para obtener (S)-2-((S)-2-(benciloxicarbonilamino)-5,5-difluoro-4,4-dimetilpentanamido)-4-metilpentanoato de metilo (95 mg, 45 %) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 443,0
Etapa 2: (S)-2-((S)-2-Amino-5,5-difluoro-4,4-dimetilpentanamido)-4-metilpentanoato de metilo:
Se agitó la disolución de (S)-2-((S)-2-(benciloxicarbonilamino)-5,5-difluoro-4,4-dimetilpentanamido)-4-metilpentanoato de metilo (95 mg, 0,215 mmol) y Pd/C (30 mg) en THF (5 ml) a ta durante 2 h, luego se filtró, se concentró. Se purificó el producto en bruto mediante cromatografía en gel de sílice de fase inversa Biotage para obtener (S)-2-((S)-2-amino-5,5-difluoro-4,4-dimetilpentanamido)-4-metilpentanoato de metilo (45 mg, 69 %) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 309,0
<1>H-RMN (500 MHz, DMSO-CÍ<6>): 9,11 (d,J =7 Hz, 1H), 8,41 (s, 3H), 5,81 (t,J =56,5 Hz, 1H), 4,34-4,31 (m, 1H), 3,89 3,81 (m, 1H), 3,62 (s, 3H), 1,98-1,93 (m, 1H), 1,76-1,73 (m, 1H), 1,65-1,54 (m, 3H), 0,93-0,81 (m, 12H).
Ejemplo 184: Síntesis de (S)-2-((R)-2-amino-5,5-difluoro-4,4-dimetilpentanamido)-4-metilpentanoato de metilo [I-184]:
El procedimiento fue el mismo que en el ejemplo 90, 185.
(S )-2 -((R )-2 -A m in o -5 ,5 -d iflu o ro -4 ,4 -d im e tilp e n ta n a m id o )-4 -m e tilp e n ta n o a to de m etilo : E S I-E M (EI+, m /z): 309 ,0<1>H-RMN (500 MHz, DMSO-d<6>): 9,18 (d,J= 1Hz, 1H), 8,38 (s, 3H), 5,79 (t,J = 56,5 Hz,1H), 4,37-4,32 (m, 1H), 3,85 3,78 (m, 1H), 3,58 (s, 3H), 1,97-1,92 (m, 1H), 1,77-1,72 (m, 1H), 1,61-1,51 (m, 3H), 0,94-0,82 (m, 12H).
Ejemplo 145: Síntesis de ácido (2S,4R)-2-amino-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanoico, ácido (2R,4S)-2-amino-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanoico, ácido (2R,4R)-2-amino-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanoico y ácido (2S,4S)-2-amino-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanoico: [3d; I-145]; [3c; I-146]; [3a; I-167]; [3b; I-250]
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: Síntesis de ácido (2S,4R)-2-(benciloxicarbonilamino)-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanoico, ácido (2R,4S)-2-(benciloxicarbonilamino)-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanoico, ácido (2R,4R)-2-(benciloxicarbonilamino)-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanoico y ácido (2S,4S)-2-(benciloxicarbonilamino)-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanoico:
A una disolución de ácido 2-amino-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanoico (600 mg, 3,2 mmol) en acetona (10 ml) y NaHCO<3>saturado acuoso (10 ml) se le añadió CbzOSu (970 mg, 3,9 mmol). Se agitó la mezcla a ta durante 3 h. Luego se añadió EtOAc (20 ml) y H2O (20 ml), se separó la fase acuosa y se extrajo adicionalmente con EtOAc (2 *20 ml), se combinaron los extractos y se lavaron con salmuera (20 ml), se secaron con Na<2>SO<4>anhidro, se filtraron y se concentraron, se purificó el residuo mediante pre-HPLC para proporcionar ácido 2-(benciloxicarbonilamino)-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanoico (750 mg) como un sólido de color blanco. Se purificó el producto puro mediante HPLC quiral para proporcionar los cuatro isómeros: ácido (2S,4R)-2-(benciloxicarbonilamino)-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanoico (150 mg, 15%), ácido (2R,4S)-2-(benciloxicarbonilamino)-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanoico (40 mg, 3,9 %), ácido (2R,4R)-2-(benciloxicarbonilamino)-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanoico (50 mg, 4,9 %) y ácido (2S,4S)-2-(benciloxicarbonilamino)-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanoico (80 mg, 7,8 %) que eran ambos un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 342,0 [M+Na]+.
Etapa 2-A: Síntesis de ácido (2S,4R)-2-amino-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanoico:
Se agitó una disolución de ácido (2S,4R)-2-(benciloxicarbonilamino)-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanoico (150 mg, 0,47 mmol) y Pd/C (75 mg) en MeOH (15 ml) a ta durante 3 h. Se filtró la mezcla de reacción y se concentró para proporcionar ácido (2S,4R)-2-amino-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanoico (51,7 mg, 59%) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 186,2 [M+H]+.<1>H-RMN (500 MHz, MeOD):53,64-3,60 (m, 1H), 2,77-2,71 (sa, 1H), 2,24 2,18 (m, 1H),1,76-1,69 (m, 1H),1,25 (d,J=7,0 Hz, 3 H).
E tapa 2 -B : S ín tes is de ác ido (2 R ,4 S )-2 -a m in o -5 ,5 ,5 -tr if lu o ro -4 -m e tilp e n ta n o ico :
Se agitó una disolución de ácido (2R,4S)-2-(benciloxicarbonilamino)-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanoico (40 mg, 0,12 mmol) y Pd/C (20 mg) en MeOH (4 ml) a ta durante 3 h. Se filtró la mezcla de reacción y se concentró para proporcionar ácido (2R,4S)-2-amino-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanoico (13,3 mg, 60%) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 186,2 [M+H]+.<1>H-RMN (500 MHz, MeOD):53,51-3,47 (m, 1H), 2,64-2,58 (sa, 1H), 2,12 2,06 (m, 1H),1,63-1,57 (m, 1H),1,13 (d,J= 7,0 Hz, 3 H).
Etapa 2-C: Síntesis de ácido (2R,4R)-2-amino-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanoico:
Se agitó una disolución de ácido (2R,4R)-2-(benciloxicarbonilamino)-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanoico (50 mg, 0,16 mmol) y Pd/C (25 mg) en MeOH (5 ml) a ta durante 3 h. Se filtró la mezcla de reacción y se concentró para proporcionar ácido (2R,4R)-2-amino-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanoico (18,0 mg, 61 %) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 186,1 [M+H]+.<1>H-RMN (500 MHz, MeOD):53,51-3,47 (m, 1H), 2,46-2,44 (sa, 1H), 1,95 1,87 (m, 2H), 1,11 (d,J= 7,0 Hz, 3 H).
Etapa 2-D: Síntesis de ácido (2S,4S)-2-amino-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanoico:
Se agitó una disolución de ácido (2S,4S)-2-(benciloxicarbonilamino)-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanoico (80 mg, 0,25 mmol) y Pd/C (40 mg) en MeOH<( 8>ml) a ta durante 3 h. Se filtró la mezcla de reacción y se concentró para proporcionar ácido (2S,4S)-2-amino-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanoico (38,1 mg, 82%) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 186,2 [M+H]+.<1>H-RMN (500 MHz, MeOD):53,51-3,47 (m, 1H), 2,46-2,44 (sa, 1H), 1,95 1,87 (m, 2H), 1,11 (d,J= 7,0 Hz, 3 H).
Ejemplo 128: Ácido (S)-2-amino-5,5,5-trifluoro-4,4-dimetilpentanoico (I-128):
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
El procedimiento usado fue el mismo que el usado en el ejemplo 187.
Ácido (S)-2-amino-5,5,5-trifluoro-4,4-dimetilpentanoico: ESI-EM (EI+, m/z): 200,1<1>H-RMN (500 MHz, D<2>O): 53,94 (t,J =5,5 Hz, 1H), 2,23 (dd,J =15,5 Hz,J =5,5 Hz, 1H), 1,90 (dd,J= 15,5 Hz,J= 6,0 Hz, 1H), 1,13 (d,J= 8,5 Hz,<6>H).
Ejemplo 188: (S)-2-((R)-2-Amino-5,5,5-trifluoro-4,4-dimetilpentanamido)-4-metilpentanoato de metilo [I-188]:
El procedimiento para el ácido 2-(benciloxicarbonilamino)-5,5,5-trifluoro-4,4-dimetilpentanoico fue el mismo que en el ejemplo 90
Etapa 1: (S)-2-((R)-2-(Benciloxicarbonilamino)-5,5,5-trifluoro-4,4-dimetilpentanamido)-4-metilpentanoato de metilo: Se agitó la disolución de ácido (S)-2-(benciloxicarbonilamino)-5,5,5-difluoro-4,4-dimetilpentanoico (150 mg, 0,45 mmol), HATU (188 mg, 0,495 mmol), clorhidrato de (S)-2-amino-4-metilpentanoato de metilo (123 mg, 0,675 mmol) y DIPEA (175 mg, 1,35 mmol) a ta durante 1 hora, luego se extinguió con agua con hielo (20 ml), se extrajo con eA (2x30ml), se secó, se filtró y se concentró. Se purificó el producto en bruto mediante cromatografía en gel de sílice de fase inversa Biotage para obtener (S)-2-((S)-2-(benciloxicarbonilamino)-5,5-difluoro-4,4-dimetilpentanamido)-4-metilpentanoato de metilo (120 mg, 58 %) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 461,0
Etapa 2:(S)-2-((R)-2-Amino-5,5,5-trifluoro-4,4-dimetilpentanamido)-4-metilpentanoato de metilo:
Se agitó la disolución de (S)-2-((S)-2-(benciloxicarbonilamino)-5,5,5-difluoro-4,4-dimetilpentanamido)-4-metilpentanoato de metilo<( 1 2 0>mg, 0,26 mmol) y Pd/C (30 mg) en THF (10 ml) a ta durante<2>h, luego se filtró, se concentró. Se purificó el producto en bruto mediante cromatografía en gel de sílice de fase inversa Biotage para obtener (S)-2-((S)-2-amino-5,5,5-trifluoro-4,4-dimetilpentanamido)-4-metilpentanoato de metilo (49 mg, 57 %) como un sólido de color blanco. ESI-Em (EI+, m/z): 326,0
<1>H-RMN (500 MHz, MeOD-d4): 4,47 (t,J =7,5 Hz, 1H), 3,99-3,97 (m, 1H), 3,77 (s, 3H), 2,33-2,28 (m, 1H), 1,95-1,91 (m, 1H), 1,69-1,68 (m, 3H), 1,24-1,17 (m,<6>H), 1,00-0,94 (m,<6>H).
Ejemplo 189:(S)-2-((S)-2-Amino-5,5,5-trifluoro-4,4-dimetilpentanamido)-4-metilpentanoato de metilo [I-189]:
Esquema de síntesis:
El procedimiento usado fue el mismo que el usado en el ejemplo 188.
Procedimientos y caracterización:
Ejemplo 189: (S)-2-((S)-2-Amino-5,5,5-trifluoro-4,4-dimetilpentanamido)-4-metilpentanoato de metilo [I-189]:<1>H-RMN (500 MHz, MeOD-cf4): 4,52 (t,J= 7,5 Hz, 1H), 4,02-3,99 (m, 1H), 3,73 (s, 3H), 2,35-2,30 (m, 1H), 1,95-1,91 (m, 1H), 1,78-1,67 (m, 3H), 1,25 (s, 3H), 1,17 (s, 3H), 1,01-0,97 (m,<6>H).
Ejemplo 108: Ácido (S)-2-amino-6-fluorohexanoico [I-108].
Ejemplo 109: Ácido (R)-2-Amino-6-fluorohexanoico [I-109].
Etapa 1: 2-(Difenilmetilenoamino)-6-fluorohexanoato de tere-butilo:
Se agitó una mezcla de 1-fluoro-4-yodobutano (2,0 g, 9,90 mmol), d2-(difenilmetilenoamino)acetato de terc-butilo (2,43 g, 8,25 mmol), TBAB (266 mg, 0,83 mmol) y KOH (ac. al 50 %) (10 ml) en DCM (10 ml) y tolueno (25 ml) durante 16 h a 50 °C. Se purificó la disolución mediante SGC (sílice, acetato de etilo/éter de petróleo =1/5) para proporcionar 2-(difenilmetilenoamino)-6-fluorohexanoato de terc-butilo (0,91 g, 2,47 mmol, 30 %) como un aceite incoloro. EM (EI+, m/z): 370,2 [M+H]+.
Etapa 2: Ácido (S)-2-amino-6-fluorohexanoico [I-108]:
Se agitó una disolución de (S)-2-(difenilmetilenoamino)-6-fluorohexanoato de terc-butilo (360 mg, 0,97 mmol) en dioxano<( 1 0>ml) y HCl (ac.<6>M) durante 16 h a ta. Se extrajo la mezcla con éter y agua. Se extrajo la fase acuosa con EA después de ajustar el pH a 3-4. Se concentró la fase org. para proporcionar ácido (S)-2-amino-6-fluorohexanoico [I-108] como un sólido de color blanco (125 mg, 0,84 mmol,<86>%). ESI-EM (EI+, m/z): 150,3 [M+H]+.
1H-RMN (500 MHz, D2O) 54,469 (t,J= 6,0 Hz, 1H), 4,351 (t,J= 6,0 Hz, 1H), 3,950 (t,J= 6,0 Hz, 1H), 1,904-1,820 (m, 2H), 1,690-1,588 (m, 2H), 1,456-1,388 (m, 2H).
Etapa 2: Ácido (R)-2-amino-6-fluorohexanoico [I-109]:
Se agitó una disolución de (R)-2-(difenilmet¡lenoam¡no)-6-fluorohexanoato de terc-butilo (300 mg, 0,81 mmol) en dioxano<( 1 0>ml) y HCl (ac.<6>M) durante 16 h a ta. Se extrajo la mezcla con éter y agua. Se extrajo la fase acuosa con EA después de ajustar el pH a 3-4. Se purificó la fase org. mediante HPLC para proporcionar ácido (R)-2-amino-<6>-fluorohexanoico [I-109] como un sólido de color blanco (35 mg, 0,23 mmol, 29%). ESI-EM (EI+, m/z): 150,2 [M+H]+. 1H-RMN (500 MHz, D2O) 54,505 (t,J =6,0 Hz, 1H), 4,410 (t,J =6,0 Hz, 1H), 3,823 (t,J =6,0 Hz, 1H), 1,906-1,827 (m, 2H), 1,722-1,639 (m, 2H), 1,485-1,399 (m, 2H).
Ejemplo 198: 2-Am¡no-5,5,5-tr¡fluoro-4-(tr¡fluoromet¡l)pentanoato de metilo (I-198):
Etapa 1: 4,4,4-Tr¡fluoro-N-metox¡-N-met¡l-3-(tr¡fluoromet¡l)but-2-enam¡da:
A una disolución con agitación de hexafluoroacetona trihidratada (30 g, 136 mmol) se le añadió H<2>SO<4>(100 ml,conc.)gota a gota lentamente a lo largo de 1 h, y se introdujo la hexafluoroacetona gaseosa a la disolución de N-metoxi-N-metil^trifenilfosforaniliden^acetamida (10 g, 27,5 mmol) en THF (200 ml). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 16 h. Luego se añadió éter de petróleo<( 200>ml), se separó por filtración el precipitado de color blanco. Se concentró el filtrado, se purificó el residuo mediante gel de sílice cromatografía (éter de petróleo/acetato de etilo=5/1~3/1) para proporcionar 4,4,4-tr¡fluoro-N-metox¡-N-met¡l-3-(tr¡fluoromet¡l)but-2-enam¡da (6,2 g, 24,7 mmol, 90 %) como un aceite ligero. ESI-EM (EI+, m/z): 252,1[M+H]+.<1>H-RMN (500 MHz, CDCls): 57,15 (s, 1H), 3,67 (s, 3H), 3,26 (s, 3H).
Etapa 2: 4,4,4-Trifluoro-N-metoxi-N-metil-3-(trifluorometil)butanamida:
Se agitó una mezcla de 4,4,4-tr¡fluoro-N-metox¡-N-met¡l-3-(tr¡fluoromet¡l)but-2-enam¡da (4,5 g, 17,9 mmol), Pd(OH)2/C (620 mg) en MeOH (100 ml) a temperatura ambiente bajo atmósfera de hidrógeno durante 16 h. Luego se filtró y se concentró para proporcionar 4,4,4-tr¡fluoro-N-metox¡-N-met¡l-3-(tr¡fluoromet¡l)butanam¡da (1,8 g, 7,1 mmol, 40%) como un aceite ligero. ESI-EM (El+, m/z): 254,1[M+H]+.
Etapa 3: 4,4,4-Trifluoro-3-(trifluorometil)butanal:
A una disolución de 4,4,4-tr¡fluoro-N-metox¡-N-met¡l-3-(tr¡fluoromet¡l)butanam¡da (1,8 g, 7,1 mmol) en THF (50 ml) se le añadió gota a gota LiAlH<4>(8,5 ml, 8,5 mmol) con baño de hielo, después de 1 h, se extinguió la mezcla con disolución de ácido cítrico (100 ml), se extrajo la disolución con Et2O (100 ml x 2), se lavó la fase orgánica con salmuera (100 ml), se secó (Na<2>SO4), y se usó la disolución para la siguiente etapa.
Etapa 4: 2-(Benc¡lam¡no)-5,5,5-tr¡fluoro-4-(tr¡fluoromet¡l)pentanon¡tr¡lo:
A la disolución anterior de 4,4,4-trifluoro-3-(trifluorometil)butanal en Et<2>O (200 ml) se le añadió bencilamina (2 ml), AcOH (2 ml) y luego TMSCN (2 ml) con baño de hielo, se agitó la disolución a 0 ~ ta durante 17 h, y luego se diluyó con EtOAc (100 ml). Se lavó la disolución con H2O (100 ml x 2) y luego se concentró para proporcionar 2-(bencilamino)-5,5,5-trifluoro-4-(trifluorometil)pentanonitrilo (2,1 g, en bruto) como un líquido de color marrón. ESI-EM (EI+, m/z): 311,2 [M+H]+.
Etapa 5: Ácido 2-(bencilamino)-5,5,5-trifluoro-4-(trifluorometil)pentanoico:
Se calentó una disolución de 2-(bencilamino)-5,5,5-trifluoro-4-(trifluorometil)pentanonitrilo (2,1 g, en bruto) en HCl conc. (50 ml) y AcOH (10 ml) hasta 100 °C durante 40 h. Se concentró la mezcla para eliminar el disolvente, se ajustó el pH a 12 con disolución de NaOH 1 M, se extrajo con PE (100 ml), se ajustó la fase acuosa a pH 5-6 con HCl<6>M, se formó el sólido de color blanco, se filtró, y se lavó la torta de filtración con agua (50 ml), se secó a vacío para proporcionar ácido 2-(bencilamino)-5,5,5-trifluoro-4-(trifluorometil)pentanoico (1,0 g, 3,0 mmol, 42 %, 3 etapas) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 272,0
Etapa<6>: 2-(Bencilamino)-5,5,5-trifluoro-4-(trifluorometil)pentanoato de metilo:
Se calentó una disolución de ácido 2-(bencilamino)-5,5,5-trifluoro-4-(trifluorometil)pentanoico (800 mg, 2,4 mmol) en HCl/MeOH (50 ml, 2M) hasta 75 °C durante 17 h. Se concentró la disolución y se purificó mediante HpLC preparativa (Boston C1821*250 mm 10 Ím, fase móvil: A: 0,1 % TFA; B: ACN) para proporcionar 2-(bencilamino)-5,5,5-trifluoro-4-(trifluorometil)pentanoato de metilo (120 mg, 0,35 mmol, 15%) como un aceite incoloro. ESI-EM (EI+, m/z): 344,1 [M+H]+.
Etapa 7: Ácido trifluoroacético de 2-amino-5,5,5-trifluoro-4-(trifluorometil)pentanoato de metilo:
Se calentó una mezcla de 2-(bencilamino)-5,5,5-trifluoro-4-(trifluorometil)pentanoato de metilo (100 mg, 0,30 mmol), HCOONH<4>(92 mg, 1,5 mmol) y Pd/C (10 %, 20 mg) en MeOH (10 ml) hasta 65 °C durante 1 h. Se filtró la mezcla, y se concentró el filtrado y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice de fase inversa para proporcionar ácido trifluoroacético de 2-amino-5,5,5-trifluoro-4-(trifluorometil)pentanoato de metilo (76 mg,<0 , 21>mmol, 70 %) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 254,1 [M+H]+.<1>H-RMN (500 MHz, MeODd) 54,26 (dd,J =7,5 Hz,J =6,0 Hz, 1H), 3,91 (m, 4H), 2,49 (dd,J =8,5 Hz,J =5,0 Hz, 1H), 2,33-2,37 (m, 1H).
Ejemplo 164: Ácido (S)-2-amino-5,5,5-trifluoro-4-(trifluorometil)pentanoico (I-164):
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: Ácido 2-amino-5,5,5-trifluoro-4-(trifluorometil)pentanoico:
Se agitó una disolución de ácido 2-(bencilamino)-5,5,5-trifluoro-4-(trifluorometil)pentanoico (480 mg, 1,46 mmol) y Pd(OH)<2>/C (20 %, 100 mg) en AcOH (15 ml) a 35 °C durante 17 h bajo hidrógeno. Se filtró la mezcla y se concentró el filtrado a vacío para proporcionar ácido 2-amino-5,5,5-trifluoro-4-(trifluorometil)pentanoico (460 mg, en bruto) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 240,2 [M+H]+.
Etapa 2: Ácido (S)-2-(benciloxicarbonilamino)-5,5,5-trifluoro-4-(trifluorometil)pentanoico:
A una disolución de ácido 2-amino-5,5,5-trifluoro-4-(trifluorometil)pentanoico (460 mg, en bruto) y NaHCO<3>(368 mg, 4,38 mmol) en acetona (30 ml) y H<2>O (30 ml) se le añadió CbzOSu (727 mg, 2,92 mmol) con baño de hielo. Después de 17 h, se ajustó la mezcla de reacción a un pH de 3-4 con disolución de HCl 1M,y se extrajo la disolución con EtOAc (50 ml x 2), se lavó con salmuera (50 ml), se secó (Na<2>SO4), se filtró y se concentró a vacío, se purificó el producto en bruto mediante cromatografía en gel de sílice de fase inversa y luego HPLC preparativa quiral [columna, CC4 4,6*250 mm 5 um; disolvente, MeOH (amoniaco en metanol al 0,2 %)] para proporcionar ácido (S)-2-(benciloxicarbonilamino)-5,5,5-trifluoro-4-(trifluorometil)pentanoico (27 mg, 0,072 mmol, 5 %, 2 etapas) y ácido (R)-2-(benciloxicarbonilamino)-5,5,5-trifluoro-4-(trifluorometil)pentanoico (22 mg, 0,059 mmol, 4%, 2 etapas) como dos aceites incoloros. ESI-EM (EI+, m/z): 396,0 [M+Na]+.
Etapa 3: Ácido (S)-2-amino-5,5,5-trifluoro-4-(trifluorometil)pentanoico:
Se agitó una mezcla de ácido (S)-2-(benciloxicarbonilamino)-5,5,5-trifluoro-4-(trifluorometil)pentanoico (27 mg, 0,072 mmol) y Pd/C (10 %, 5 mg) en MeOH (10 ml) a ta durante 1 h. Se filtró la disolución y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice de fase inversa para proporcionar ácido (S)-2-amino-5,5,5-trifluoro-4-(trifluorometil)pentanoico [I-164] (8,5 mg, 0,036 mmol, 49%) como un sólido de color blanco. EM (EI+, m/z): 240,2[M+H]+.<1>H-RMN (500 MHz, D<2>O) 53,74-3,80 (m, 2H), 2,88-2,31 (m, 1H), 1,91-2,20 (m, 1H).
Ejemplo 203: Ácido 2-amino-4-ciclopentilbutanoico [I-203]:
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: 2-Ciclopentilacetaldehído:
A una disolución de 3-ciclopentilpropan-1-ol (2,0 g, 17,5 mmol) en DMSO (40 ml) se le añadió IBX (7,35 g, 26,3 mmol) bajo un baño de hielo. Se calentó la mezcla hasta temperatura ambiente y se agitó durante la noche. Se vertió la mezcla de reacción en agua<( 2 0 0>ml) y se extrajo con Et<2>O<( 1 0 0>ml x<2>), se lavó la fase orgánica con agua (100 ml x 3), y salmuera (100 ml), se secó (Na<2>SO<4>), y se usó la disolución para la siguiente etapa.
Etapa 2: (Z)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-4-ciclopentilbut-2-enoato de tere-butilo:
A una disolución del reactivo de Wittig (2,5 g,<6 , 8>mmol) en THF (50 ml) se le añadió NaOt-Bu (785 mg, 8,2 mmol) con baño de hielo. Después de 1 h, se añadió la disolución anterior de 2-ciclopentilacetaldehído en Et2O (200 ml). Se calentó la mezcla hasta temperatura ambiente y se agitó durante la noche. Se diluyó la disolución con agua (200 ml) y se extrajo con EA (100 ml x 2), se lavó la fase orgánica con agua (100 ml x 2), y salmuera (100 ml), se secó (Na<2>SO4), se filtró y se concentró a vacío y se purificó mediante cromatografía (sílice, acetato de etilo/éter de petróleo =1/20) para proporcionar (Z)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-4-ciclopentilbut-2-enoato de terc-butilo (1,0 g, 3,1 mmol, 45 %, 2 etapas) como un líquido incoloro. ESI-EM (EI+, m/z): 326,2 [M+H]+.
Etapa 3: 2-(Terc-butoxicarbonilamino)-4-ciclopentilbutanoato de tere-butilo:
Se calentó una mezcla de (Z)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-4-ciclopentilbut-2-enoato de terc-butilo (240 mg, 0,74 mmol) HCOONH<4>(233 mg, 3,7 mmol) y Pd/C (10 %, 30 mg) en MeOH (15 ml) a reflujo durante 4 h. Se filtró la mezcla y se concentró, se diluyó con Et2O (50 ml), se lavó con agua (50 ml) y salmuera (50 ml), se secó (Na<2>SO4), se filtró y se concentró a vacío para proporcionar 2-(terc-butoxicarbonilamino)-4-ciclopentilbutanoato de tere-butilo (224 mg, 0,69 mmol, 93 %) como un líquido incoloro. ESI-EM (EI+, m/z): 328,2 [M+H]+.
Etapa 4: Ácido 2-amino-4-ciclopentilbutanoico:
Se calentó una disolución de 2-(terc-butoxicarbonilamino)-4-ciclopentilbutanoato de tere-butilo (224 mg, 0,69 mmol) en HCl<6>M (20 ml) y dioxano (10 ml) hasta 70 °C durante 2 h. Se concentró la mezcla a vacío, se diluyó con agua (30 ml), se extrajo con Et2O (20 ml x 2), y se concentró el filtrado hasta sequedad para proporcionar ácido 2-amino-4-ciclopentilbutanoico (114,9 mg, 0,52 mmol, 81 %) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 172,3 [M+H]+.<1>H-RMN (500 MHz, D<2>O): 53,91 (t,J =6,0 Hz, 1H), 1,82-1,89 (m, 2H), 1,66-1,72 (m, 3H), 1,28-1,52 (m,<6>H), 1,00-1,01 (m, 2H).
Ejemplo 202: Ácido 2-amino-5-ciclopentilpentanoico [I-202]:
Etapa 1: 3-Ciclopentilpropanal:
A una disolución de 3-ciclopentilpropan-1-ol (1,0 g, 7,8 mmol) en DMSO (20 ml) se le añadió IBX (3,28 g, 11,7 mmol) bajo un baño de hielo. Se calentó la mezcla hasta temperatura ambiente y se agitó durante la noche. Se vertió la mezcla de reacción en agua (100 ml) y se extrajo con Et<2>O (60 ml x 2), se lavó la fase orgánica con agua (100 ml x 3), y salmuera (100 ml), se secó (Na<2>SO<4>), y se usó la disolución para la siguiente etapa.
Etapa 2: (£)-2-(Terc-butoxicarbonilamino)-5-ciclopentilpent-2-enoato deterc-butilo:
A una disolución del reactivo de Wittig (500 mg, 1,36 mmol) en THF (15 ml) se le añadió NaOt-Bu (157 mg, 1,63 mmol) con baño de hielo. Después de 1 h, se añadió la disolución anterior de 3-ciclopentilpropanal en Et<2>O<( 10 0>ml). Se calentó la mezcla hasta temperatura ambiente y se agitó durante la noche. Se diluyó la disolución con agua (200 ml) y se extrajo con EtOAc (100 ml), se lavó la fase orgánica con agua (100 ml x 2), y salmuera (100 ml), se secó (Na<2>SO<4>), se filtró y se concentró a vacío y se purificó mediante cromatografía (sílice, acetato de etilo/éter de petróleo =1/20) para proporcionar (E)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-5-ciclopentilpent-2-enoato de terc-butilo (250 mg, 0,74 mmol, 9,5 %, 2 etapas) como un líquido incoloro. ESI-EM (El+, m/z): 340,2 [M+H]+.
Etapa 3: 2-(Terc-butoxicarbonilamino)-5-ciclopentilpentanoato de terc-butilo:
Se agitó una mezcla de 2-(terc-butoxicarbonilamino)-5-ciclopentilpent-2-enoato (250 mg, 0,74 mmol) y Pd/C (10 %, 30mg) en MeOH (15 ml) a ta durante 17 h bajo hidrógeno. Se filtró la mezcla y se concentró para proporcionar 2-(terc-butoxicarbonilamino)-5-ciclopentilpentanoato de terc-butilo (250 mg, 0,73 mmol, 99 %) como un líquido incoloro. ESI-EM (EI+, m/z): 342,2 [M+H]+.
Etapa 4: Ácido 2-amino-5-ciclopentilpentanoico:
Se calentó una disolución de 2-(terc-butoxicarbonilamino)-5-ciclopentilpentanoato (250 mg, 0,73 mmol) en HCl<6>M (20 ml) y dioxano (10 ml) hasta 80 °C durante 5 h. Se concentró la mezcla a vacío, se diluyó con agua (30 ml), se extrajo con Et<2>O (20 ml x 2), y se concentró el filtrado hasta sequedad para proporcionar ácido 2-amino-5-ciclopentilpentanoico (115 mg, 0,52 mmol, 71 %) como un sólido de color blanco. ESl-EM (EI+, m/z): 186,2 [M+H]+.
<1>H-RMN (400 MHz, D<2>O): 53,84 (t,J =6,0 Hz, 1H), 1,79-1,84 (m, 2H), 1,61-1,67 (m, 3H), 1,25-1,49 (m,<8>H), 0,95 0,99 (m, 2H.
Ejemplo 197: Síntesis de 2-amino-N-ciclopentil-3,3-difluoro-N,4-dimetilpentanamida [I-197]:
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: 2-(Bencilamino)-N-ciclopentil-3,3-difluoro-N,4-dimetilpentanamida:
Se agitó una mezcla de ácido 2-(bencilamino)-3,3-difluoro-4-metilpentanoico (80 mg, 0,31 mmol), N-metilciclopentanamina (62 mg, 0,62 mmol), HATU (141 mg, 0,37 mmol) y Et<3>N (94 mg, 0,93) en DMF (2 ml) a ta durante 3 h. Se purificó la mezcla mediante HPLC preparativa (Boston C1821*250 mm 10 Ím, fase móvil: A: 0,1 % TFA; B: ACN) para proporcionar 2-(bencilamino)-N-ciclopentil-3,3-difluoro-N,4-dimetilpentanamida (45 mg, 0,13 mmol, 43 %) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 339,0
Etapa 2: 2-Amino-N-ciclopentil-3,3-difluoro-N,4-dimetilpentanamida:
Se calentó una mezcla de 2-(bencilamino)-N-ciclopentil-3,3-difluoro-N,4-dimetilpentanamida (45 mg, 0,13 mmol), HCOONH<4>(41 mg, 0,65 mmol) y Pd/C (10 %, 10 mg) en MeOH (5 ml) hasta 60 °C durante 1 h. Se filtró la mezcla, y se concentró el filtrado y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice de fase inversa para proporcionar<2>-amino-N-ciclopentil-3,3-difluoro-N,4-dimetilpentanamida (16,3 mg, 0,066mmol, 49%) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 249,2 1H-RMN (500 MHz, MeOD-d4) 55,26 (dd,J= 15,5 Hz,J =6,0 Hz, 0,5H), 5,08 (dd,J =16,5 Hz,J= 5,0 Hz, 1H), 4,28-4,31 (m, 0,5H), 2,97 (d,J =48,5 Hz, 3H), 2,38 (m, 1H), 1,65-1,99 (m,<8>H), 11,16 (dt,J= 6,5 Hz,J =3,0 Hz,<6>H).
Ejemplo 196: Ácido 2-amino-5-fluoro-4,4-dimetilpentanoico [I-196].
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: 3-Hidroxi-N-metoxi-N,2,2-trimetilpropanamida:
Se agitó la mezcla de ácido 3-hidroxi-2,2-dimetilpropanoico (10 g, 84,7 mmol), clorhidrato deN,O-dimetilhidroxilamina (16,4 g, 101,7 mmol), EDCI (24,4 g, 127,1 mmol), HOBT (17,2 g, 127,1 mmol) y DIPEA (28 ml, 169,5 mmol) en DMF (200 ml) a ta durante 16 h. Se extrajo la mezcla de reacción con EtOAc (200 ml x 3) y agua (100 ml), se combinaron las fases orgánicas que se lavaron con HCl 1 N (30 ml*2), NaHCO<3>1 N (30 ml x 2) y salmuera (50 ml), se secaron, se concentraron para proporcionar un residuo que se purificó mediante cromatografía (sílice, acetato de etilo/éter de petróleo =1/2) para proporcionar 3-hidroxi-N-metoxi-N,2,2-trimetilpropanamida (6,9 g, 50 %) como un aceite incoloro. ESI-EM (EI+, m/z): 162,2 [M+H]+.
Etapa 2: 3-Fluoro-N-metoxi-N,2,2-trimet¡lpropanam¡da:
A una mezcla de 3-hidrox¡-N-metox¡-N,2,2-tr¡metilpropanam¡da (4,5 g, 27,9 mmol) en DCM (40 ml), enfriada hasta -78 °C se le añadió DAST (7,4 ml, 55,9 mmol) gota a gota. Luego se agitó a ta durante 1-2 h, se enfrió hasta -78 °C de nuevo, se añadió DAST (4 ml, 27,9 mmol) gota a gota. Se agitó la mezcla de reacción a ta durante 1 h adicional. Enfriándose la mezcla de reacción hasta -78 °C, se añadió NH<4>Cl sat. (15 ml) lentamente, se añadió DCM (50 ml), se separó la fase orgánica, se lavó con NH4Cl sat. (30 ml), salmuera (30 ml x 2), se secó, se concentró para proporcionar un residuo que se purificó mediante cromatografía (sílice, acetato de etilo/éter de petróleo =1/4) para proporcionar 3-fluoro-N-metoxi-N,2,2-trimet¡lpropanam¡da (1,9 g, 28%) como un aceite incoloro. ESI-EM (EI+, m/z): 164,2 [M+H]+.
Etapa 3: 3-Fluoro-2,2-dimetilpropanal:
A una mezcla de 3-fluoro-N-metoxi-N,2,2-trimet¡lpropanam¡da (1,0 g, 61,3 mmol) en THF(10 ml), enfriada hasta 0 °C se le añadió L¡AlH<4>(6,1 ml, 61,3 mmol, 1Men THF) gota a gota. Luego se agitó a esta temperatura durante 0,5-1 h. Se añadió NH<4>Cl sat. (10 ml) lentamente, se extrajo con Et<2>O (20 ml x 3), se lavó con agua (15 ml x 2) y salmuera (15 ml), se secó, se usó para la siguiente etapa directamente. ESI-EM (EI+, m/z): sin EM.
Etapa 4: (Z)-2-(terc-butox¡carbon¡lam¡no)-5-fluoro-4,4-d¡met¡lpent-2-enoato de tere-butilo:
Se agitó la mezcla de 3-fluoro-2,2-dimetilpropanal (aproximadamente 630 mg, 6,1 mmol, disolución de Et<2>O procedente de la etapa anterior), 2-(terc-butoxicarbon¡lam¡no)-2-dietox¡fosfor¡l-acetato de terc-butilo (2,25 g, 6,1 mmol) y t-BuONa (1,2 g, 12,3 mmol) en THF(15 ml) a ta durante 16 h. Se añadió NH4Cl sat. (15 ml), se extrajo con EA (30 ml x 3), se combinó con fases orgánicas, se lavó con agua(15 ml) y salmuera (15 ml), se secó, se concentró para proporcionar un residuo que se purificó mediante cromatografía (sílice, éter de petróleo en DCM) para proporcionar (Z)-2-(terc-butoxicarbonilam¡no)-5-fluoro-4,4-d¡met¡lpent-2-enoato de terc-butilo (190 mg, 0,60 mmol,<8>%) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 206 [M-111]+.
Etapa 5: 2-(Terc-butoxicarbonilam¡no)-5-fluoro-4,4-d¡met¡lpentanoato detere-butilo:
Se agitó una mezcla de (Z)-2-(terc-butox¡carbon¡lam¡no)-5-fluoro-4,4-d¡met¡lpent-2-enoato de terc-butilo (190 mg, 0,60 mmol) y Pd/C (10 %, 30mg) en IPA (15 ml) a ta durante 17 h bajo hidrógeno. Se filtró la mezcla y se concentró para proporcionar 2-(terc-butoxicarbonilam¡no)-5-fluoro-4,4-d¡met¡lpentanoato de terc-butilo<( 2 00>mg, en bruto) como un líquido incoloro. ESI-EM (EI+, m/z): 342,2 [M+Na]+.
Etapa<6>: Ácido 2-amino-5-fluoro-4,4-d¡met¡lpentanoico-ác¡do trifluoroacético:
Se calentó una disolución de 2-(terc-butoxicarbonilam¡no)-5-fluoro-4,4-d¡met¡lpentanoato de terc-butilo (200 mg, en bruto) en HCl<6>M (20 ml) y dioxano (10 ml) hasta 50 °C durante 17 h. Se concentró la mezcla a vacío, se diluyó con agua (30 ml), se extrajo con Et2O (20 ml x 2), y se concentró el filtrado a vacío y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice de fase inversa para proporcionar ácido 2-am¡no-5-c¡clopentilpentano¡co-ác¡do trifluoroacético (31,7 mg, 0,11 mmol, 19%) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 164,2 [M+H]+.<1>H-RMN (500 MHz, D<2>O): 54,16 (d,J =47,5 Hz, 1H), 3,97 (t,J= 5,5 Hz, 1H), 2,03 (dd,J =15,5 Hz,J= 5,5 Hz, 1H), 1,71 (dd,J= 15,5 Hz,J =6,0 Hz, 1H), 0,91 (dd,J= 15,0 Hz,J= 2,0 Hz,<6>H).
Ejemplo 186: Síntesis de ácido 2,4-diamino-4-met¡lpentano¡co [I-186]:
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: 4-(Metoxi(metil)amino)-2-metil-4-oxobutan-2-il-carbamato de ferc-butilo:
A una disolución de ácido 3-(terc-butoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (1 g, 4,61 mmol), clorhidrato deN,O-dimetilhidroxilamina (536 mg, 5,53 mmol), HATU (2,26 g, 5,99 mmol), en DMF (15 ml) se le añadió DIPEA (1,49 g, 11,53 mmol). Se agitó la disolución a ta durante 2 h, luego, se diluyó la mezcla con salmuera (100 ml), se extrajo con EtOAc (50 ml x 2). Se combinaron las fases orgánicas, se concentraron y se purificaron mediante cromatografía (sílice, acetato de etilo/éter de petróleo =1/3) para proporcionar 4-(metoxi(metil)amino)-2-metil-4-oxobutan-2-ilcarbamato d terc-butilo (1,0 g, 3,8 mmol, 82 %) como un aceite incoloro. ESI-EM (EI+, m/z): 261,2 [M+H]+.
Etapa 2: 2-Metil-4-oxobutan-2-il-carbamato de ferc-butilo:
Se añadió una disolución de 4-(metoxi(metil)amino)-2-metil-4-oxobutan-2-il-carbamato de ferc-butilo (3,8 g, 14,6 mmol) en THF (50 ml) LiAlH<4>(16 ml, 1Men THF) a t.a. Se agitó la disolución a ta durante 2 h, se extinguió con Na<2>SO<4>'<1 0>H<2>O, se filtró y se lavó mediante THF para proporcionar 2-metil-4-oxobutan-2-il-carbamato de terc-butilo como una disolución de color amarillo (aproximadamente 14 mmol en 110 ml THF). EM (EI+, m/z): 146,3 [M+H-56]+. Etapa 3: 4-(Bencilamino)-4-ciano-2-metilbutan-2-il-carbamato de terc-butilo:
A una disolución de 2-metil-4-oxobutan-2-il-carbamato de terc-butilo (en bruto aproximadamente 14 mmol en 110 ml de THF) se le añadió BnNH<2>(2,2 ml) y AcOH (2,2 ml). Se agitó la disolución a ta durante 10 min. Se añadió TMSCN (2,2 ml). Se agitó la mezcla a ta durante 17 h. Luego, se concentró la mezcla de reacción y mediante cromatografía (sílice, acetato de etilo/éter de petróleo =1/4) para proporcionar 4-(bencilamino)-4-ciano-2-metilbutan-2-il-carbamato de terc-butilo (670 mg, 2,11 mmol, 15 %) como un aditivo de color amarillo. EM (EI+, m/z): 318,3 [M+H]+.
Etapa 4: 5-Amino-4-(bencilamino)-2-metil-5-oxopentan-2-il-carbamato deferc-bufilo:
A una mezcla de 4-(bencilamino)-4-ciano-2-metilbutan-2-il-carbamato de terc-butilo (640 mg, 2,00 mmol), K<2>CO<3>(550 mg, 3,98 mmol) en DMSO (16 ml) se le añadió H<2>O<2>al 30 % (0,64 ml, 5,67 mmol) y se agitó durante 17 h a t.a. Luego, se diluyó mezcla de reacción con H<2>O (200 ml), se extrajo con EtOAc (100 ml x 2). Se combinaron las fases orgánicas, se concentraron para proporcionar ácido 2-(bencilamino)-4-(terc-butoxicarbonilamino)-4-metilpentanoico (en bruto 890 mg) como un aditivo de color amarillo. EM (EI+, m/z): 336,0 [M+H]+.
Etapa 5: Ácido 2-(bencilamino)-4-(terc-butoxicarbonilamino)-4-metilpentanoico:
Se agitó una mezcla de 5-amino-4-(bencilamino)-2-metil-5-oxopentan-2-il-carbamato de ferc-butilo (en bruto 890 mg, aproximadamente 2,0 mmol), KOH (406 mg, 7,25 mmol) en etano-1,2-diol (9 ml) y H<2>O (9 ml) durante 5 h a 100 °C. Luego, se diluyó la mezcla de reacción con salmuera (200 ml), se extrajo con THF/EA=2:1(90 ml x 5), se combinaron las fases orgánicas, se concentraron y se purificaron mediante HPLC inversa (Boston C1821*250 mm 10 pm, fase móvil: A: ácido trifluoroacético al 0,1 %; B: acetonitrilo) para proporcionar ácido 2-(bencilamino)-4-(tercbutoxicarbonilamino)-4-metilpentanoico (120 mg, 0,36 mmol, 18 %) como un sólido de color blanco. EM (EI+, m/z): 337,3 [M+H]+.
Etapa<6>: Ácido 2-amino-4-(terc-butoxicarbonilamino)-4-metilpentanoico:
Se calentó una mezcla de ácido 2-(bencilamino)-4-(terc-butoxicarbonilamino)-4-metilpentanoico (140 mg, 0,42 mmol), HCOONH<4>(132 mg, 2,1 mmol) y Pd/C (10 %, 20 mg) en MeOH (15 ml) hasta 60° C durante 1 h. Se filtró la mezcla, y se concentró el filtrado y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice de fase inversa para proporcionar ácido 2-amino-4-(terc-butoxicarbonilamino)-4-metilpentanoico (60 mg, 0,24 mmol, 58 %) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 247,2
Etapa 7: Ácido 2,4-diamino-4-metilpentanoico:
Se agitó una disolución de ácido 2-amino-4-(terc-butoxicarbonilamino)-4-metilpentanoico (60 mg, 0,24 mmol) en HCl<6>M (10 ml) y dioxano (0 ml) a ta durante 17 h. Se concentró la disolución a vacío para proporcionar ácido 2,4-diamino-4-metilpentanoico (51,8 mg, 0,236 mmol, 97%) como un sólido de color blanco. ESI-Em (EI+, m/z): 147,1 1H-RMN (500 MHz, D<2>O)<8>4,04 (dd, J = 9,5 Hz, J = 3,5 Hz, 1H), 2,32 (dd, J = 15,0 Hz, J = 9,5 Hz, 1H),1,94 (dd, J = 15,0 Hz, J = 3,0 Hz, 1H), 1,38 (dd, J = 9,5 Hz, J = 5,0 Hz,<6>H).
Ejemplo 199: Síntesis de 4,4,4-trifluoro-3-metil-1-(2H-tetrazol-5-il)butan-1-amina [I-199]:
Esquema de síntesis:
Procedimientos y caracterización:
Etapa 1: W-Metoxi-A/-metil-2-(trifenil-l5-fosfanilidene)acetamida:
Se calentó una mezcla de 2-cloro-A/-metoxi-N-metilacetamida (13,7 g, 0,1 mol) y trifenilfosfano (26,2 g, 0,1 mol) en acetonitrilo (200 ml) hasta 80 °C y se mantuvo durante 20 h. Se enfrió la mezcla y se concentró para eliminar el disolvente por debajo de 40 °C. Se disolvió el residuo en diclorometano (200 ml), seguido de KOH 2 N (100 ml). Se agitó la mezcla resultante a 20 °C durante 1 h. Se lavó la fase orgánica con salmuera (200 ml x 3), se secó sobre Na<2>SO<4>y se filtró. Se concentró el filtrado a vacío para proporcionar N-metoxi-N-metil-2-(trifenil-l5-fosfaniliden)acetamida (36 g, 0,1 mol, 98 %) como un sólido de color amarillo. ESI-EM (EI+, m/z): 364,4 [M+H] . Etapa 2: (£)-4,4,4-Trifluoro-N-metoxi-N,3-dimetilbut-2-enamida:
Se calentó una mezcla de W-metoxi-N-metil-2-(trifenil-l5-fosfaniliden)acetamida (36,3 g, 0,1 mol) y 1,1,1-trifluoropropan-<2>-ona (22,4 g,<0 , 2>mol) en tetrahidrofurano (500 ml) hasta<2 0>°C y se mantuvo durante<2 0>h. Se enfrió la mezcla y se concentró para eliminar el disolvente por debajo de 40 °C a vacío. Se purificó el residuo mediante columna de gel de sílice (200 g, malla de 200 ~ 300, UV 254 nm) eluyendo con acetato de etilo en éter de petróleo desde el 0 hasta el 25 % para proporcionar (E)-4,4,4-trifluoro-N-metoxi-N, 3-dimetilbut-2-enamida (19,5 g, 0,1 mol, 98 %) como un aceite de color amarillo. ESI-EM (EI+, m/z): 198,2 [M+H] .
Etapa 3: 4,4,4-Trifluoro-N-metoxi-N, 3-dimetilbutanamida:
Se agitó una mezcla de (E)-4,4,4-trifluoro-N-metoxi-N, 3-dimetilbut-2-enamida (2 g, 0,01 mol) y Pd/C (10 %, 200 mg) en THF (50 ml) a 26 °C durante 18 h. Se filtró la mezcla, y se concentró el filtrado a vacío hasta sequedad para proporcionar 4,4,4-trifluoro-N-metox¡-A/,3-d¡met¡lbutanam¡da (2 g, 0,01 mol, 98 %) como un aceite de color amarillo. ESI-EM (EI+, m/z): 200,2 [M+H]+.
Etapa 4: 4,4,4-trifluoro-3-metilbutanal:
A una disolución 4,4,4-trifluoro-W-metoxi-A/,3-dimetilbutanamida (2 g, 0,01 mol) en 40 ml de THF se le añadió L¡AlH<4>(0,4 g, 0,01 mol) a 0 °C. Se agitó la mezcla a 0 °C durante 1 h. Se extinguió la mezcla de reacción con agua, seguido de metil terc-butil éter (30 ml x 2). Se lavó la fase orgánica con salmuera (50 ml x 3), se secó sobre Na<2>SO<4>y se filtró. El filtrado contenía para proporcionar 4,4,4-trifluoro-3-metilbutanal (1,4 g, en bruto) como una disolución incolora, que se usó en la siguiente etapa directamente.
Etapa 5: 2-(Bencilamino)-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanonitrilo:
A una disolución del 4,4,4-trifluoro-3-metilbutanal anterior en metil terc-butil éter (100 ml) se le añadió bencilamina (1,5 ml), AcOH (1,0 ml) y luego TMSCN (1,5 ml) con baño de hielo. Se calentó la mezcla 20 °C y se agitó durante la noche. Se diluyó la disolución con agua (30 ml) y se extrajo con EtOAc (30 ml). Se lavó la fase orgánica con agua (30 ml x 2), y salmuera (50 ml), se secó (Na<2>SO<4>), se filtró y se concentró a vacío para proporcionar 2-(bencilamino)-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanonitrilo (2,6 g, en bruto) como un aceite de color marrón que se usó para la siguiente etapa. ESI-EM (EI+, m/z): 257,3 [M+H] .
Etapa<6>: W-Bencil-4,4,4-trifluoro-3-metil-1-(2H-tetrazol-5-il)butan-1-amina:
A una disolución de 2-(bencilamino)-5,5,5-trifluoro-4-metilpentanonitrilo (0,3 g, en bruto) en DMF (10 ml) se le añadió NH<4>Cl (0,15 g, 0,003 mol) y NaN<3>(0,21 g, 0,003 mol), se calentó hasta 95 °C durante 18 h. Se enfrió la disolución hasta 15 °C y se extrajo con EtOAc (20 ml), se lavó la fase orgánica con agua (20 ml x 2), y salmuera (20 ml), se secó (Na<2>SO<4>), se filtró y se concentró a vacío para proporcionar N-bencil-4,4,4-trifluoro-3-metil-1-(2H-tetrazol-5-il)butan-1-amina (0,1 g, 0,5 mmol, 33% para 3 etapas) como un sólido de color blanco. ESI-EM (EI+, m/z): 300,3 [M+H] .
Ácido trifluoroacético de 4,4,4-trifluoro-3-metil-1-(2H-tetrazol-5-il)butan-1-amina:
A una disolución de W-bencil-4,4,4-trifluoro-3-metil-1-(2H-tetrazol-5-il)butan-1-amina (160 mg, 0,54 mmol) en MeOH (15 ml) se le añadió HCOONH<4>(0,17 g, 2,7 mmol) y Pd/C (30 mg) a ta. Se agitó la mezcla a 60 °C durante 2 h. Se filtró la mezcla de reacción y se concentró para proporcionar un producto en bruto que se purificó mediante cromatografía en gel de sílice de fase inversa para proporcionar ácido trifluoroacético de 4,4,4-trifluoro-3-metil-1-(2H-tetrazol-5-il)butan-1-amina (72,8 mg, 0,23 mmol, 42%) como un sólido de color blanco; ESI-EM (EI+, m/z): 210,2 [M+H] ; 1H-RMN (500 MHz, DMSO-de)<8>4,67-4,93 (m, 1H), 2,31 - 2,41 (m, 1H), 2,00-2,12 (m, 2H), 0,99 (dd,J= 16,8,J =6,4 Hz,<6>H).
Ejemplo 210.Ensayo de inmunotransferencia de tipo Western
Este ensayo de cribado midió la actividad de los compuestos de pruebain vitroen complejos GATOR2/Sestrina2 purificados a través de inmunoprecipitación de FLAG-WDR24 expresada de manera estable a partir de células HEK293T. Se modificaron por ingeniería células HEK293T (293T) para expresar de manera estable FLAG-WDR24 etiquetada de manera N-terminal a través de transducción mediante lentivirus. Los lentivirus se produjeron mediante cotransfección del vector de transferencia lentiviral pLJM60 con la envoltura AVPR y los plásmidos de empaquetamiento VSV-G de CMV en células HEK-293T usando el reactivo de transfección xTremeGene 9 (Roche Diagnostics). Se cambió el medio 24 horas tras la transfección a medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con suero fetal inactivado al 30 %. Se recogieron los sobrenadantes que contenían virus 48 y 72 horas después de la transfección y se hicieron pasar a través de un filtro de 0,45 pm para eliminar las células. Se infectaron las células diana en placas de histocultivo de<6>pocillos en medio que contenía Polybrene<8>pg/ml y se realizaron infecciones por centrifugación mediante centrifugación a 2.200 rpm durante 1 hora. Veinticuatro horas después de la infección, se eliminó el virus y se seleccionaron las células con el antibiótico apropiado. Luego se hicieron crecer las células en DMEM complementado con suero bovino fetal al 10 % y antibióticos.
Para cribar los compuestos miméticos de leucina, se sembraron 2.000.000 células 293T que expresan FLAG-WDR24 en una placa de histocultivo de 10 cm. Setenta y dos horas más tarde, se colocaron las células en medio RPMI convencional formulado sin aminoácidos y complementado con glucosa 5 mM (-AA RPMI, US Biological Life Sciences) durante 1 hora, luego se sometieron a lisis posteriormente en tampón de lisis (HEPES 40 mM, Triton al 1 %, p-glicerofosfato de sodio 10 mM, pirofosfato de sodio 10 mM, MgCh 2,5 mM e inhibidores de proteasas). Para aislar el complejo FLAG-WDR24/Sestrina2 endógena, se sometió el lisado en bruto (equivalente a 2-4 mg de proteína total) en un volumen de 1 ml a inmunoprecipitación con 30 pl de resina anti-flag (SIGMA) durante 2 horas a 4 °C, se lavó dos veces en tampón de lisis frío más NaCl 0,5 M y se resuspendió en 1 ml de tampón citosólico frío (HEPES 40 mM pH 7,4, KCl 140 mM, NaCl 10 mM, MgCh 2,5 mM, TritonX-100 al 0,1 %). Luego se añadieron compuestos de prueba o controles (se filtró la disolución resultante o leucina) a cada muestra de inmunoprecipitación a diversas concentraciones y se incubaron con rotación a 4 °C durante 60 minutos. Después del periodo de incubación, se centrifugaron las muestras para sedimentar el complejo FLAG-WDR24/Sestrina2 endógena unido a la resina anti-flag, se eliminó completamente el sobrenadante y se resuspendió la resina en tampón de muestra de SDS-PAGE y se sometió a ebullición durante 5 minutos. Luego se procesaron las muestras mediante SDS-PAGE y se realizaron inmunotransferencias de tipo Western con anticuerpos anti-FLAG (SIGMA) y anti-Sestrina2 (Cell Signaling Technology) tal como se describe en L. Chantranupong,et al.,Cell Reports 9:1-8 (2014).
Se sometieron a barrido las membranas de inmunotransferencia de tipo Western resultantes y se cuantificaron las intensidades de banda correspondientes a Sestrina2 y FLAG-WDR24 usando la plataforma de obtención de imágenes LI-COR®. Para determinar la cantidad de Sestrina2 unida a GATOR2 para cada condición, se normalizó la intensidad de banda de Sestrina2 con respecto a la intensidad de banda de FLAG-WDR24. Para cada lote de compuestos sometidos a prueba, también se realizaron un control negativo (se filtró la disolución resultante) y un control positivo (leucina, 25 j M, SIGMA). Se normalizó el agotamiento de Sestrina2 endógena unida a FLAG-WDR24 por leucina para representar el 100 % de actividad. Los compuestos se sometieron a ensayo por duplicado, y se cuantificó la actividad de cada compuesto como porcentaje de actividad de leucina y se promedió. Intentos repetidos del ensayo dieron como resultado una desviación estándar del<2 0>% en la actividad de leucina promedio en comparación con el agua; por tanto, los compuestos de prueba que reducen la cantidad de Sestrina2 unida a GATOR2 en al menos el 40% a 25 j M por duplicado se consideraron estadísticamente significativos y se caracterizaron como miméticos de leucina. Algunos compuestos aumentaron la cantidad de Sestrina2 unida a FLAG-WDR24. Los compuestos que aumentaron la cantidad de Sestrina2 unida a GATOR2 en más del 40 % (representado como menos del -40 % de actividad de leucina) se caracterizaron como antagonistas de leucina. Ejemplo 211. Método de identificación de compuestos que imitan o antagonizan la actividad de leucina sobre Sestrina2 y la interacción Sestrina2/GATOR2.
Introducción
Sestrinal y Sestrina2 interaccionan con GATOR2 a través de los componentes WDR24 y SehIL de GATOR2 a niveles insuficientes de leucina. En condiciones suficientes de leucina, la leucina se une directamente a Sestrina2 induciendo la disociación de Sestrina2 a partir de GATOR2. El objetivo de los siguientes métodos es identificar compuestos que imitan el efecto de leucina en la unión a Sestrina2 y la alteración de Sestrina2/GATOR2. Además, los métodos identifican compuestos que antagonizan la unión de leucina a Sestrina2 e impiden la disociación de Sestrina2 a partir de GATOR2 en respuesta a la leucina.
Método 1 (ensayo PPIin vitro)
Este ensayo de cribado midió la actividad de los compuestosin vitroen complejos GATOR2/Sestrina2 purificados a través de inmunoprecipitación de FLAG-WDR24 expresada de manera estable a partir de células HEK293T. Se modificaron por ingeniería células HEK293T (293T) para expresar de manera estable Flag-WDR24 etiquetada de manera N-terminal a través de transducción mediante lentivirus. Los lentivirus se produjeron mediante cotransfección del vector de transferencia lentiviral pLJM60 con la envoltura AVPR y los plásmidos de empaquetamiento VSV-G de CMV en células HEK-293T usando el reactivo de transfección XTremeGene 9. Se cambió el medio 24 horas tras la transfección a medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con suero fetal inactivado al 30 %. Se recogieron los sobrenadantes que contenían virus 48 y 72 horas después de la transfección y se hicieron pasar a través de un filtro de 0,45 jm para eliminar las células. Se infectaron las células diana en placas de histocultivo de<6>pocillos en medio que contenía Polybrene<8>jg/ml y se realizaron infecciones por centrifugación mediante centrifugación a<2 . 2 0 0>rpm durante<1>hora. 24 horas después de la infección, se eliminó el virus y se seleccionaron las células con el antibiótico apropiado. Luego se hicieron crecer las células en DMEM complementado con suero bovino fetal al<10>% y antibióticos.
Para cribar compuestos miméticos de leucina, se sembraron 2.000.000 293T que expresan Flag-WDR24 en una placa de histocultivo de 10 cm. 72 horas más tarde, se colocaron las células en medio RPMI convencional formulado sin aminoácidos y complementado con glucosa 5 mM (-AA RPMI, US Biological Life Sciences) durante 1 hora, luego se sometieron a lisis posteriormente en tampón de lisis (HEPES 40 mM, Triton al 1 %, beta-glicerofosfato de sodio 10 mM, pirofosfato de sodio 10 mM, MgCh 2,5 mM e inhibidores de proteasas). Se aisló el complejo FLAG-WDR24/Sestrina2 endógena de la siguiente manera: se sometió el lisado en bruto (equivalente a 2-4 mg de proteína total) en un volumen de 1 ml a inmunoprecipitación (IP) con 30 j l de resina anti-flag (SIGMA) durante 2 horas a 4 °C, se lavó dos veces en tampón de lisis frío más NaCl 0,5 M y se resuspendió en 1 ml de tampón citosólico frío (HEPES 40 mM pH 7,4, KCl 140 mM, NaCl 10 mM, MgCh 2,5 mM, TritonX-100 al 0,1 %). Luego se añadieron los compuestos a cada muestra a una concentración dada de 25 j M y se incubaron con rotación a 4 °C durante 30 minutos. Después del periodo de incubación, se centrifugaron las muestras para sedimentar el complejo FLAG-WDR24/Sestrina2 endógena unido a la resina anti-flag, se eliminó completamente el sobrenadante y se resuspendió la resina en tampón de muestra de electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) y se sometió a ebullición durante 5 minutos. Luego se procesaron las muestras mediante SDS-PAGE y se realizaron inmunotransferencias de tipo Western con anticuerpos anti-Flag (SIGMA) y anti-Sestrina2 (Cell Signaling Technology) tal como se describe en L. Chantranupong,et al.,Cell Reports 9:1-8 (2014).
Se sometieron a barrido las membranas de inmunotransferencia de tipo Western resultantes y se cuantificaron las intensidades de banda correspondientes a Sestrina2 y Flag-WDR24 usando la plataforma de obtención de imágenes LI-COR®. Para determinar la cantidad de Sestrina2 unida a GATOR2 para cada condición, se normalizó la intensidad de banda de Sestrina2 con respecto a la intensidad de banda de Flag-WDR24. Para cada lote de compuestos sometidos a prueba, también se realizaron un control negativo (agua) y un control positivo (leucina, 25<j>M, S<i>GMA). Se normalizó el agotamiento de Sestrina2 endógena unida a Flag-WDR24 por leucina para representar el 100 % de actividad. Los compuestos se sometieron a ensayo por duplicado, y se cuantificó la actividad de cada compuesto como porcentaje de actividad de leucina y se promedió. En la tabla 3 se presenta una tabla que enumera datos cuantificados de los compuestos sometidos a prueba. Intentos repetidos del ensayo dieron como resultado una desviación estándar del<2 0>% en la actividad de leucina promedio en comparación con el agua; por tanto, compuestos en los que ambos duplicados reducen la cantidad de Sestrina2 unida a GATOR2 en al menos el 40 % a 25 |jM se consideraron estadísticamente significativos y se denominaron miméticos de leucina. Algunos compuestos aumentaron la cantidad de Sestrina2 unida a Flag-WDR24 (mostrado como porcentaje negativo de actividad de leucina en la tabla 3). Los compuestos que mostraron menos del -40 % de actividad de leucina también se consideraron éxitos y se denominaron antagonistas de leucina.
Método 2 (activación de mTORC1 basada en células)
Para demostrar la eficacia de los compuestos identificados como miméticos de leucina en células intactas, se midió la señalización de mTORC1 en respuesta al tratamiento con compuesto tras la privación de leucina a través de inmunotransferencia de tipo Western. Tras la privación de leucina, la adición de leucina exógena activa mTORC1 cuando se mide la señalización de 10 a 90 minutos después de la adición de leucina, tal como se describe en Wang, S., Tsun, Z.,et al.Science 347(6218): 188-194 (2015). Por tanto, se diseñó un ensayo similar para someter a prueba si los compuestos identificados como miméticos de leucina activan mTORC1 de manera similar. Brevemente, se sembraron 800.000 células HEK293T en cada pocillo de una placa de 6 pocillos en DMEM complementado con suero bovino fetal al 10 % y antibióticos. Al día siguiente, se colocaron las células en DMEM modificado sin leucina (Thermo Scientific) o suero durante 1 hora, seguido de la adición de mimético de leucina (n=3) a una concentración dada durante cierto periodo de tiempo superior a 10 minutos. Luego se sometieron a lisis las células, se procesaron para SDS-PAGE y se realizó inmunotransferencia de tipo Western con anticuerpos dirigidos contra los sustratos de mTORC1 cinasa S6 fosforilada (Thr389) y 4EBP1 fosforilada (Thr37/46) (Cell Signaling Technology) y controles de carga (beta-actina, Santa Cruz Biotechnology) tal como se describe en Kang, S.A.,et al.Science 341(6144): 364 374 (2013). Luego se normalizó la intensidad de las bandas correspondientes a los sustratos fosforilados con respecto a la banda de actina usando la plataforma de obtención de imágenes LI-COR®. Los compuestos que aumentaron significativamente la señalización de mTORC1 con respecto a células privadas de leucina no tratadas con compuesto (prueba de la t de Student, p<0,05) se consideraron activos en las células. Como control positivo, se añadió leucina a 100<j>M a las células privadas de leucina durante 60 minutos.
Método 3 (activación de mTORC1 basada en células)
Para demostrar la eficacia de los compuestos identificados como antagonistas de leucina o para determinar si los miméticos de leucina débiles potencian la actividad de leucina en células intactas, se repitió el mismo paradigma que antes, pero con los siguientes cambios: se colocaron las células en medio DMEM sin leucina (tal como se describe en el método 3) durante 60 minutos, seguido de compuesto (n=3) durante cierto periodo de tiempo superior o igual a 60 minutos. Después del tratamiento con compuesto, se estimularon las células con 30 y 100<j>M de leucina durante 60 minutos. Se midió la señalización de mTORC1 a través de inmunotransferencia de tipo Western tal como se describe en el método 2. Los compuestos que redujeron los niveles de sustratos de mTORC1 fosforilados normalizados con respecto a actina en respuesta a leucina o bien a 30 j M o bien a 100 j M de manera estadísticamente significativa (prueba de la t de Student, p<0,05) se consideraron activos en las células. Los compuestos que aumentaron los niveles de sustratos de mTORC1 fosforilados normalizados con respecto a actina en respuesta a leucina o bien a 30 j M o bien a 100 j M de manera estadísticamente significativa (prueba de la t de Student, p<0,05) se consideraron potenciadores de leucina en las células. Como control, se pretrataron células privadas de leucina con agua antes de la adición de leucina. Alternativamente, se sometieron a ensayo posibles antagonistas de leucina en células HEK293T de la misma manera descrita anteriormente, pero sin privación de leucina ni estimulación con leucina. Se realizaron inmunotransferencias de tipo Western para determinar si se atenuaba la señalización de mTORC1 de nivel inicial tras el tratamiento con compuesto en condiciones de cultivo repletas.
Método 4
Se midió la capacidad de los compuestos para modular la interacción entre Sestrina2 y GATOR2 en células repitiendo el ensayo descrito en los métodos 2 y 3, pero en células HEK293T modificadas por ingeniería para expresar de manera estable Flag-WDR24 sembradas en placas de histocultivo de 10 cm. Se midió la interacción entre Sestrina2 endógena y Flag-WDR24 a partir del lisado obtenido de las células después del tratamiento con compuesto (n=3) tal como se describe en el método 1. Brevemente, para medir la cantidad de Sestrina2 endógena unida a Flag-WDR24 después del tratamiento de las células, se realizó una inmunoprecipitación con la resina antiflag y se procesaron las muestras resultantes para SDS-PAGE e inmunotransferencia de tipo Western para medir las cantidades de Sestrina2 endógena unida a Flag-WDR24. Los compuestos que modularon la cantidad de Sestrina2 unida a GATOR2 de manera estadísticamente significativa (prueba de la t de Student, p<0,05) se consideraron éxitos.
Método 5 (ensayo basado en células ALPHALisa)
Para demostrar la eficacia de los compuestos identificados como miméticos de leucina en células intactas en un formato basado en placa, se midió la señalización de mTORC1 en respuesta al tratamiento con compuesto tras la privación de leucina a través de AlphaLISA. Brevemente, se sembraron 1.000.000 células HEK293T en matraces de cultivo celular T-75 en DMEM complementado con suero bovino fetal al 10%. Después de que las células alcanzaran la confluencia, se colocaron en DMEM modificado sin leucina (Thermo Scientific) con suero bovino fetal dializado al 10 % durante 1 hora. Luego se sometieron a tripsinización las células, y volvieron a sembrarse en placas de fondo transparente negras de 96 pocilios a 50.000 células/pocillo en DMEM sin leucina con suero bovino fetal dializado al 10 %. Se permitió que las células se adhirieran a la placa durante 2 horas, seguido de la adición de los compuestos (n=4) a una concentración dada durante cierto periodo de tiempo superior a 1 hora. Después de alcanzar el punto de tiempo, se sometieron a lisis las células y se sometieron a ensayo mediante el kit SureFire Ultra AlphaLISA de p-p70S6K (Thr389) según las instrucciones del fabricante (http://www.perkinelmer.com/CMSResources/Images/44-176283MAN_SureFire_TGR70S_p70_pT389.pdf). Los compuestos que aumentaron significativamente la señalización de mTORC1 con respecto a las células privadas de leucina no tratadas con compuesto (prueba de la t de Student, p<0,05) se consideraron activadores de mTORC1. Los compuestos que disminuyeron significativamente la señalización de mTORC1 con respecto a las células privadas de leucina no tratadas con compuesto (prueba de la t de Student, p<0,05) se consideraron inhibidores en las células. Como control positivo, se añadió leucina a 100 pM a las células privadas de leucina durante un periodo de tiempo igual al tratamiento con compuesto.
Método 6. Protocolo de desplazamiento térmico (desplazamiento de Tf):
Se fusionó de manera N-terminal Sestrina2 humana de longitud completa con codones optimizados con la etiqueta His-MBP y se clonó en el vector de expresión bacteriana pMAL6H-C5XT. Se transformó este vector en células LOBSTR deEscherichia coli(DE3) (Kerafast). Se hicieron crecer las células a 37 °C hasta una DO de 0,6, luego se indujo la producción de proteínas con IPTG 0,2 mM a 18 °C durante 12-14 h. Se recogieron las células mediante centrifugación a 6.000 g, se resuspendieron en tampón de lisis (fosfato de potasio 50 mM, pH 8,0, NaCl 500 mM, imidazol 30 mM, DTT 1 mM, Benzonase 10 pg/ml y PMSF 1 mM) y se sometieron a lisis mediante sonicación. Se aclaró el lisado mediante centrifugación a 10.000 g durante 20 min. Se aisló la proteína Sestrina2 a partir de la fracción soluble hasta prácticamente el 100 % de pureza a través de captura por afinidad de la etiqueta His, seguido de intercambio iónico y cromatografía de exclusión molecular. Para el ensayo de desplazamiento térmico, se diluyó proteína Sestrina2 hasta 2 mg/ml en tampón de dilución (HCl de Tris 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, DTT 1 mM, EDTA 0,1 mM). Antes de realizar el ensayo de desplazamiento térmico, se combinaron 2 pl de proteína Sestrina2 con 8 pl de colorante ROX (Thermo Fisher), 1 pl de vehículo o compuesto, y 14 pl de tampón de dilución por pocillo de una placa de 96 pocillos, y se incubaron sobre hielo durante 1 hora para permitir la unión del compuesto. Luego se ejecutó el ensayo de desplazamiento térmico en un dispositivo MX3005p de Agilent y se sometió a ensayo cada compuesto por triplicado a 10 pM, 100 pM y 1000 pM. La incubación con leucina desplazó la temperatura de fusión de Sestrina2 en de 2,16 a 11,61 °C de manera dependiente de la dosis. Un desplazamiento positivo de 2°C o más se considera estadísticamente significativo basándose en la variabilidad del % de Cv de mediciones de desplazamiento térmico repetidas de Sestrina2 incubada con vehículo.
Método 7. Ensayo de unión a ligando indirecto (ILBA)
Se detectó la unión de Sestrina2 a leucina u otro ligando en células intactas,in vitroo con proteína purificada a través de inmunodetección con el anticuerpo monoclonal de conejo anti-Sestrina2 de Cell Signaling Technology (CST, n.° de cat. 8487). Se modulo la unión del anticuerpo de CST a Sestrina2 nativa (no desnaturalizada) mediante la unión de leucina de tal manera que la afinidad del anticuerpo disminuye tras la unión de leucina. De manera similar, la afinidad del anticuerpo de CST por Sestrina2 nativa disminuyó tras la unión de los compuestos a Sestrina2 nativa de manera similar a la leucina. Por el contrario, los compuestos que desestabilizaron la Sestrina2 tal como se midió mediante el ensayo de desplazamiento térmico aumentaron la afinidad del anticuerpo de CST por Sestrina2 no desnaturalizada. Como resultado, se desarrollaron múltiples formatos de este ensayo de unión a ligando indirecto (ILBA) que miden la afinidad del anticuerpo anti-Sestrina2 de CST después de la unión de leucina o compuesto. En una versión, se realizó el ensayo con lisado en bruto generado a partir de una línea celular humana después de un periodo de 1 hora de privación de aminoácidos (se lisan las células en Triton al 1 %, beta-glicerofosfato 10 mM, pirofosfato de sodio 10 mM, HEPES 40 mM [pH 7,4], NaCl 150 mM y MgCh 2,5 mM). Luego se incubó el lisado con leucina u otro compuesto durante 1 hora sobre hielo o a temperatura ambiente. Después de la incubación con compuesto, se sometieron las muestras a inmunoprecipitación con el anticuerpo anti-Sestrina2 de CST durante 1,5 horas, seguido de una incubación de 30 minutos con Sepharose acoplada a proteína A tal como se describe en L. Chantranupong,et al.,Cell Reports 9:1-8 (2014). Se precipitó el complejo proteína-anticuerpo conjugado con Sepharose a través de centrifugación y se sometió la fracción no retenida a una segunda ronda de inmunoprecipitación con un anticuerpo policlonal de conejo anti-Sestrina2 (Protein Tech, #10795-1-AP) para determinar que los niveles totales de proteína Sestrina2 entre muestras eran iguales. Se realizó SDS-PAGE con las muestras de inmunoprecipitación, seguido de inmunotransferencia de tipo Western con el anticuerpo monoclonal de ratón anti-Sestrina2 de SIGMA (n.° de cat. WH0083667M3). La unión de leucina indujo una disminución significativa en la intensidad de la banda correspondiente a Sestrina2 en un 50 % o más en la inmunotransferencia con muestras immunoprecipitadas con el anticuerpo anti-Sestrina2 de CST, pero no condujo a ningún cambio en la banda de Sestrina2 en la inmunotransferencia con muestras immunoprecipitadas con el anticuerpo de Protein Tech. Esta versión del ensayo también midió una inestabilidad aumentada de Sestrina2 inducida por la incubación con los compuestos. Se realizó el ensayo de la misma manera, pero los compuestos que desestabilizaron la Sestrina2 (tal como se mide mediante el ensayo de desplazamiento térmico) dieron como resultado un aumento en la intensidad de banda de inmunotransferencia correspondiente a Sestrina2 inmunoprecipitada usando el anticuerpo de CST.
También se realizó este ensayo en células humanas cultivadas que sobreexpresan Sestrina2 fusionada de manera N-terminal con una etiqueta Flag. En esta versión del ensayo, el procedimiento seguía siendo el mismo, pero se realizó inmunotransferencia con un anticuerpo de ratón anti-Flag (#F3165, SIGMA). No se observó la disminución en la afinidad del anticuerpo de CST tras la unión de leucina o Y-metil-leucina cuando se realizó un ILBA con una forma de mutante puntual de Sestrina2 incapaz de unirse a leucina.
En otra versión del ensayo, se sometieron células humanas cultivadas a cierta combinación de privación de aminoácidos durante 1 hora, seguido de estimulación con leucina o compuestos. Una hora después de la estimulación, se sometieron a lisis las células y se procesaron tal como se describió anteriormente con la excepción de la etapa de unión a ligando de 1 hora.
También se realizó el ensayo de unión a ligando indirecto en un formato de múltiples pocillos usando la tecnología ALPHAlisa (Perkin Elmer). Esta versión del ensayo requirió anticuerpo anti-Sestrina2 biotinilado, perlas donadoras de estreptavidina (Perkin Elmer) o bien acopladas con perlas aceptoras anti-Flag (Perkin Elmer) para la detección de Flag-Sestrina2 sobreexpresada, o bien acopladas con anticuerpo de ratón anti-Sestrina2 (SIGMA) y perlas aceptoras anti-IgG de ratón (Perkin Elmer) para la detección de Sestrina2 endógena.
Se realizó el ensayo tal como se describió anteriormente, pero con las siguientes modificaciones: para la parte de unión de leucina o compuesto del ensayo, se diluyó lisado en bruto generado a partir de células que sobreexpresan de manera transitoria o estable Flag-Sestrina2 humana después de 1 hora de privación de aminoácidos hasta 0,8 mg/ml de proteína total en tampón de lisis y se dispuso en una placa de múltiples pocillos tal como una placa de 96 pocillos. Para la detección de Sestrina2 endógena, se diluyó lisado en bruto hasta 4 mg/ml de proteína total en tampón de lisis. Se añadió leucina o compuesto a cada pocillo y se incubó la placa sobre hielo o a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación suave. Durante la etapa de unión a ligando, se diluyó anticuerpo anti-Sestrina2 (CST) biotinilado hasta 5 nM en tampón de inmunoensayo ALPHAlisa (Perkin Elmer), y se combinaron 5 nM de anticuerpo de ratón anti-Sestrina2 (SIGMA con una reserva 4X de perlas aceptoras anti-IgG de ratón (40 |jg/ml) para los ensayos que detectan Sestrina2 endógena. Para la detección de Flag-Sestrina2, se preparó una reserva 4X de perlas aceptoras anti-Flag (40 jg/ml) en tampón de inmunoensayo. Después de la etapa de unión a ligando, se combinaron 5 j l de lisado con 10 j l del anticuerpo anti-Sestrina2 biotinilado, 12,5 j l de perlas aceptoras anti-Flag o mezcla de anticuerpo de ratón anti-Sestrina2/perlas aceptoras anti-IgG de ratón, y 10 j l de tampón de inmunoensayo ALPHAlisa y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Finalmente, se añadieron 12,5 j l de perlas donadoras de estreptavidina (160 jg/ml en tampón de inmunoensayo) durante una hora adicional en la oscuridad antes de la lectura de la placa en un lector de placas Envision.
También se realizó el ensayo ALPHAlisa tal como se describió, pero con proteína Sestrina2 purificada a una concentración de reacción final de 3 ng/ml diluida en tampón de inmunoensayo.
Finalmente, se realizó ALPHAlisa con lisado a partir de células tratadas con leucina o compuesto en condiciones de privación de aminoácidos antes de la lisis. Se realizó tratamiento basado en células en una placa de múltiples pocillos, y se usaron 15 j l de lisado (1 mg/ml de proteína total) por reacción de ALPHAlisa en combinación con 10 j l de anticuerpo biotinilado, 12,5 j l de la mezcla de anticuerpo/perlas aceptoras y 12,5 j l de la mezcla de perlas donadoras de estreptavidina.
También se realizó el ensayo de unión a ligando indirecto con un método basado en captura tal como un ELISA de tipo sándwich tal como se realiza en la técnica. En una versión del ensayo, se realizó ILBA usando la tecnología MULTI-ARRAY® desarrollada por Meso-Scale Discovery (MSD). El sistema de MSD estaba basado en la detección por electroquimioluminiscencia de la unión del anticuerpo al analito. Se realizó ILBA con lisado en bruto que expresa Sestrina2 endógena o Flag-Sestrina2 sobreexpresada y se realizó tratamiento con leucina o bienin vitroo bien en células antes de la lisis. Para ILBAin vitrocon Sestrina2 endógena, se preparó lisado en bruto (0,8 mg/ml de proteína total) y se realizó la unión de leucina de la misma manera tal como se describe para ILBA de ALPHAlisa. Después de completarse la unión a ligando, se añadió anticuerpo anti-Sestrina2 biotinilado de CST a cada pocillo hasta una concentración final de 0,25 jg/ml y se incubó con agitación suave durante 1 hora a 4 °C. Se logró la captura de cada muestra en un pocillo de una placa de 96 pocillos de una de las siguientes maneras: placas de MSD recubiertas con estreptavidina o placas de<m>S<d>descubiertas recubiertas con anticuerpo de ratón anti-Sestrina2 de SIGMA. La captura requirió 25 j l de muestra por pocillo, seguido de 1 hora de incubación con agitación a 350 rpm. Después de la captura de muestra, se lavaron los pocillos tres veces con solución salina tamponada con Tris con Tween al 0,1 % (TBS-T). Si las muestras se capturaban sobre la placa recubierta con estreptavidina, luego se añadió anticuerpo monoclonal de ratón anti-Sestrina2 (SIGMA) hasta una concentración final de 1 jg/ml durante 1 hora con agitación a 350 rpm. Se lavaron los pocillos nuevamente en TBS-T, y se añadió anticuerpo secundario anti-IgG de ratón SULFO-TAG a una concentración final de 1 jg/ml (MSD) durante una hora con agitación a 350 rpm. Finalmente, se lavaron los pocillos tres veces con TBS-T y se añadió tampón de lectura 2X (MSD) y se leyó la placa inmediatamente en un instrumento de MSD. Si las muestras se capturaban con placas descubiertas recubiertas con el anticuerpo de ratón anti-Sestrina2, después del lavado, se añadió un anticuerpo secundario SULFO-TAG conjugado con estreptavidina (MSD) a una concentración final de 1 jg/ml durante 1 hora con agitación, seguido de lavados e incubación con tampón de lectura antes del análisis.
En otra versión de este ensayo, se analizó lisado en bruto que sobreexpresa Flag-Sestrina2 y se capturó o detectó con el anticuerpo monoclonal de ratón anti-Flag (SIGMA) usando el mismo protocolo basado en MSD tal como se describió anteriormente.
Para todos los ensayos, los compuestos que disminuyeron la señal correspondiente a la inmunorreactividad de Sestrina2 de manera significativa se consideraron miméticos de leucina, mientras que los compuestos que aumentaron la señal de manera significativa se consideraron potenciales antagonistas de leucina.
La tabla 3 muestra la actividad de compuestos seleccionados que no son según la invención. Los números de compuesto corresponden a los números de compuesto en las tablas 1 y 2. Los compuestos que tienen una actividad designada como “A” proporcionaron un % de actividad con respecto a leucina de >40 %, los compuestos que tienen una actividad designada como “B” proporcionaron un % de actividad con respecto a leucina de <-40 %; los compuestos que tienen una actividad designada como “C” proporcionaron un % de actividad con respecto a leucina de entre el -40 y el 40 %. Los compuestos que tienen una actividad designada como “D” proporcionaron un desplazamiento con respecto a control de DMSO de 0,5 a 2 veces, los compuestos que tienen una actividad designada como “E” proporcionaron un desplazamiento con respecto a DMSO de 2,1-5 veces, los compuestos que tienen una actividad designada como “F” proporcionaron un desplazamiento con respecto a DMSO de 5,1-10 veces y los compuestos que tienen una actividad designada como “G” proporcionaron un desplazamiento con respecto a DMSO de 10,1 a 14 veces, a las concentraciones designadas.
La actividad para el ensayo de % de actividad con respecto a leucina se determinó usando el método de ensayo 1. La actividad para el ensayo de activación de mTORC1 basada en células se determinó usando el método de ensayo 2.
Tabla 3. Datos de ensayo para compuestos a modo de ejemplo
La tabla 4 muestra compuestos seleccionados que son activos en el ensayo basado en células ALPHALisa (método 5). Sólo el compuesto I-90 es según la invención. Los números de compuesto corresponden a los números de compuesto en las tablas 1 y 2. Los compuestos enumerados en la tabla 4 son activadores de mTORC1 y tienen una actividad de >2-veces frente al control positivo de leucina.
Tabla 4. Compuestos a modo de ejemplo que son activos en el ensayo basado en células ALPHALisa
La tabla 5 muestra compuestos seleccionados que son activos en el ensayo de desplazamiento térmico (método 6). Sólo el compuesto I-90 es según la invención. Los números de compuesto corresponden a los números de compuesto en las tablas 1 y 2. Los compuestos enumerados en la tabla 5 mostraron un desplazamiento positivo de 2 °C o más.
Tabla 5. Compuestos a modo de ejemplo que son activos en el ensayo de desplazamiento térmico
Materiales y métodos generales para las pruebasin vivo
Uso de animales:se alojaron en los grupos ratas Sprague Dawley macho que pesaban 175-200 g (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) tras su llegada (Universidad de Yale, New Haven CT) y se aclimataron 5 días antes de iniciar los estudios experimentales. Se proporcionaron pienso y agua a voluntad a las ratas excepto durante el ayuno especificado por el protocolo. Se monitorizaron los animales diariamente para detectar signos clínicos. Un veterinario cualificado supervisó todos los procedimientos con roedores. Todo el personal recibió entrenamiento por parte del Comité de Cuidado y Uso de Animales de Yale (IACUC). Todos los procedimientos con animales se realizaron en la Universidad de Yale en estricta conformidad con el IACUC de Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Yale.
Análisis conductual usando la prueba de olfateo de orina de hembra (FUST):se realizó la FUST según procedimientos publicados (Malquesman, O.et al.,Biol Psychiatry 67(9): 864-71 (2010)), 24 h tras la administración de dosis. Brevemente, se habituaron las ratas durante 60 min a un bastoncillo de algodón inmerso en agua del grifo en su jaula de alojamiento. A continuación, se expusieron las ratas a un 2° bastoncillo de algodón inmerso en agua del grifo y, 45 min más tarde, se expusieron a un 3er bastoncillo de algodón infundido con orina de rata fresca procedente de ratas hembra de 11 a 14 semanas de edad en estro. Se cuantificó el tiempo total (s) empleado olfateando el aplicador con punta de algodón a lo largo de 5 min para cada animal.
Análisis conductual usando la evaluación de actividad locomotora (LMA):se evaluó la LMA según procedimientos publicados (Warner-Schmidt, J.L. y Duman, R.S. PNAS 104(11): 4647-52 (2007)), en un campo abierto equipado con medidores de actividad automatizados que consistían en filas paralelas de haces infrarrojos. Se registró el número de roturas de haces a lo largo de un intervalo de 30 min para cada animal.
Análisis conductual usando la prueba de alimentación con supresión de novedad (NSFT):se realizó la NSFT tal como se describió previamente (Warner-Schmidt, J.L. y Duman, R.S. PNAS 104(11): 4647-52 (2007)). Las ratas se sometieron a ayuno en sus jaulas de alojamiento durante 20 h y luego se colocaron en un campo abierto de Plexiglas (76,5 cm x 76,5 cm x 40 cm) con una pequeña cantidad de pienso en el centro. Se permitió que los animales exploraran el campo abierto durante 8 min y se registró la latencia a alimentarse (s).
Análisis conductual usando la prueba de preferencia por la sacarosa (SPT):se habituaron las ratas a una disolución de sacarosa al 1 % de sabrosa sacarosa durante 48 h para evitar la neofobia. Se trataron las ratas con NV-5138 o Veh al final del día 0 y se realizó la SPT 24 h tras la administración el día 1. Para la SPT, se privó de agua a las ratas durante 6 h y se expusieron durante 60 min a dos botellas con volúmenes iguales de sacarosa al 1 % o agua. La razón del volumen de agua con sacarosa consumida con respecto al agua total consumida durante la prueba de 1 h se definió como preferencia por la sacarosa (por ejemplo, una razón de 1 indicaría que la rata consumió sólo sacarosa al 1 %, mientras que una razón de 0,5 indicaría que la rata bebió cantidades iguales de sacarosa al 1 % y agua).
Condiciones de estrés crónico impredecible (CUS):se expusieron las ratas a una secuencia variable de 12 factores estresantes impredecibles, impidiendo la habituación tal como se describe (Li, N.et al.,Biol Psychiatry 69(8): 754-61 (2011)). Se aplicaron los doce factores estresantes siguientes (2 al día, durante 25 días): rotación de la jaula, luz encendida, luz apagada, estrés por frío, aislamiento, estrés por natación, privación de pienso y agua, lecho húmedo, estroboscopio, inclinación de la jaula, exposición a olores, y alojamiento en grupo. Los animales en los grupos sin estrés (NS) se alojaron normalmente sin la aplicación de factores estresantes externos. Tanto las ratas NS como las ratas CUS se manipularon y pesaron semanalmente.
Prueba de amenaza humana (HTT) en tití:se expusieron titíes a la presencia de un observador humano a lo largo de un periodo de tiempo prolongado de manera regular. Se sabe que tal estimulación prolongada aumenta el cortisol en plasma y que el posterior aumento en la función hipotalámica-hipofisaria-suprarrenal contribuye a la fisiopatología de la enfermedad depresiva.
Ejemplo A: Cambios conductuales en las pruebas de alimentación con supresión de novedad y de olfateo de orina de hembra después de una dosis única de compuesto o ketamina.
Diseño del estudio:se aleatorizaron treinta y dos (32) ratas Sprague Dawley macho que pesaban entre 175 y 200 g en 4 grupos de estudio (n=8/grupo de tratamiento), tras un periodo de aclimatación de 5 días. El día 0 de estudio, las ratas recibieron una dosis única de solución salina (Sal) o ketamina (Ket) en los grupos 1 y 2, respectivamente, mediante inyección intraperitoneal (i.p.). Las ratas en los grupos 3 y 4 recibieron una dosis única del vehículo de NV-5138 (Veh, metilcelulosa al 0,5 %/Tween-80 al 0,1%) o NV-5138 (160 mg/kg), respectivamente, mediante alimentación por sonda gástrica. Todas las ratas se sometieron a la FUST el día 1, 24 h después de la administración de dosis. El día 2, 48 h después de la administración de dosis, se midió la LMA de todas las ratas en un campo abierto. Luego, las ratas se sometieron a ayuno durante 20 h y se sometieron a la NSFT, 72 h tras la dosis. El diseño del estudio se presenta en la tabla 6. El cronograma de la administración de artículo de prueba y las 3 pruebas conductuales se resume en la figura 1.
Preparación de artículos de prueba:se disolvió Ket (Sigma, n.° de cat. K1884) en Sal a una concentración de 10 mg/ml. Se inyectó por vía i.p. un volumen de 1 ml/kg de Sal o Ket para los grupos 1 y 2, respectivamente. Se preparó NV-5138 (Navitor, lote n.° 06) mediante su disolución en Veh (metilcelulosa al 0,5 %/Tween-80 al 0,1 %) a una concentración de 50 mg/ml. Se administró el volumen de dosificación basándose en el peso del animal (3,2 ml/kg) de Veh o NV-5138 mediante alimentación por sonda gástrica para estudiar a los animales en los grupos 3 y 4, respectivamente. Los artículos de prueba se prepararon el día de administración de dosis.
Resultados:los resultados para la FUST del día 1 se resumen en la figura 2. El tratamiento con Ket aumentó significativamente la cantidad de tiempo que emplearon las ratas macho en olfatear la orina de hembra en 2,1 veces (36,5 ± 7,9 s en comparación con 17,4 ± 3,9 s en el grupo 2 de Ket frente al grupo 1 de Sal, respectivamente, p < 0,05). De manera similar, el tratamiento con NV-5138 aumentó significativamente la cantidad de tiempo que emplearon las ratas macho en olfatear la orina de hembra en 2,9 veces (33,8 ± 2,9 s en comparación con 11,6 ± 6,2 s en el grupo 4 de NV-5138 en comparación con el grupo 3 de Veh, respectivamente, p < 0,01). Los resultados para la LMA del día 2 se resumen en la figura 3. Se cuantificó el número medio de roturas de haces. No hubo diferencias significativas en la LMA entre grupos usando una prueba de la t de Student bilateral para datos independientes. Los resultados para la NSFT del día 3 se resumen en la figura 4. Se observó una disminución significativa del 31 % en la latencia a alimentarse (p < 0,01) en el grupo 2 (Ket) en comparación con el grupo 1 (Sal). De manera similar, se observó una disminución significativa del 36 % (p < 0,01) en la latencia a alimentarse en el grupo 4 (NV) en comparación con el grupo 3 (Veh).
Tabla 6: Diseño del estudio para el ejemplo A
Ejemplo B: Efectos comparativos de la dosis única de administración de NV-5138 y ketamina de la señalización de la ruta de mTORC1 y la expresión de proteínas sinápticas en preparaciones de sinaptosomas derivadas de la corteza prefrontal de rata
Diseño del estudio:se aleatorizaron cuarenta y ocho (48) ratas Sprague Dawley macho que pesaban entre 175 y 200 g en 8 grupos de estudio (n=6/grupo), tras un periodo de aclimatación de 5 días. El día 0 de estudio, las ratas en los grupos 3 y 7 recibieron una dosis única de Sal, mientras que los grupos 4 y 8 recibieron una dosis única de Ket (10 mg/kg), cada una mediante inyección i.p. Las ratas en los grupos 1 y 5 recibieron una dosis única de Veh, mientras que los grupos 2 y 6 recibieron una dosis única de NV-5138 (160 mg/kg), cada una mediante alimentación por sonda gástrica. 1 hora después de la administración de dosis, se sacrificaron las ratas en los grupos 1-4 mediante decapitación consciente, seguido de la recogida de la PFC. Se prepararon sinaptosomas en bruto a partir de la PFC y tres sustratos de mTORC1, pmTOR, pp70S6K y p4E-BP1, y se cuantificaron los controles de carga de proteína total correspondientes (mTOR, p70S6K, y GAPDH) mediante WB. Veinticuatro horas después de la administración de dosis, se sacrificaron las ratas en los grupos 5-8 mediante decapitación consciente, seguido de la recogida de la PFC. Se prepararon sinaptosomas en bruto a partir de la PFC y se cuantificaron las proteínas sinápticas (GluR1 y PSD95), así como el control de carga de proteína total (GAPDH), mediante WB. El diseño del estudio se presenta en la tabla 7. El cronograma de la administración de artículo de prueba y el sacrificio de ratas para la WB se proporciona en la figura 5.
Formulación de Ket y NV-5138 para su administración:se disolvió Ket (Sigma, n.° de cat. K1884) en Sal a una concentración de 10 mg/ml. Se inyectó i.p. un volumen de 1 ml/kg. Se preparó NV-5138 (Navitor, lote n.° 06) mediante su disolución en Veh a una concentración de 50 mg/ml. Se administró el volumen de dosificación basándose en el peso del animal (3,2 ml/kg) mediante alimentación por sonda gástrica. Los artículos de prueba se prepararon el día de administración de dosis.
Preparaciones de sinaptosomas de corteza prefrontal:se disecó el cerebro de las ratas en todos los grupos (n=6/grupo) y se enjuagó en PBS. Se recogió la PFC tal como se muestra en la figura 6 y se homogeneizó a 4 °C en tampón de homogeneización (sacarosa 0,32 M, HEPES 20 mM a pH 7,4, EDTA 1 mM, NaF 5 mM, NaVO<3>1 mM y cóctel de inhibidores de proteasas (Roche; #19543200)). Se centrifugó el homogeneizado durante 10 min a 2.800 rpm a 4 °C, tras lo cual se retiró el sobrenadante y volvió a centrifugarse a 12.000 rpm durante 10 min a 4 °C. Se resuspendió el sedimento resultante que contenía sinaptosomas en bruto en tampón de lisis (HCl de Tris 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, Triton X-100 al 1 %, SDS al 0,1 %, EDTA 2 mM, NaVOa 1 mM, NaF 5 mM y cóctel de inhibidores de proteasas) y se sometió a sonicación sobre hielo durante 20 s a una amplitud del 50 %. Se determinó la concentración de proteína mediante el ensayo de Bradford y se mezclaron todas las muestras con tampón de carga (HCl de Tris 60 mM, pH 6,8, DTT 20 mM, SDS al 2 %, glicerol al 10 %, p-mercaptoetanol al 5 % y azul de bromofenol al 0,01 %) y se almacenaron a -20 °C hasta su análisis por WB.
Análisis por inmunotransferencia de tipo Western:se realizó análisis por inmunotransferencia de tipo Western para GluR1, PSD95 y GAPDH tal como se describió previamente. Brevemente, se cargaron preparaciones de sinaptosomas (15 |jg de proteína total) en gel de SDS-PAGE al 10-15% para la electroforesis y se transfirieron a una membrana de poli(difluoruro de vinilideno) (PVDF) en tampón de transferencia (tampón de electroforesis premezclado 10X que contiene Tris 25 mM, glicina 192 mM, pH 8,3; Bio-Rad). Se bloquearon las membranas de PVDF durante 1 h a temperatura ambiente con tampón de bloqueo (BSA al 2 % en PBS-T (fosfato 10 mM, pH 7,4, KCl 2,7 mM, NaCI 137 mM y Tween-20 al 0,1 %)) y se incubaron posteriormente con anticuerpos primarios: anticuerpo de conejo anti-pmTOR a 1:1000 (Cell Signaling; #5536), anticuerpo de conejo anti-mTOR a 1:1000 (Cell Signaling; #2972), anticuerpo de conejo anti-pp70S6K a 1:1000 (Cell Signaling; #9205), anticuerpo de conejo antip70S6K a 1:1000 (Cell Signaling; #2708), anticuerpo de conejo anti-p4E-BP1 a 1:1000 (Cell Signaling; #2855), anticuerpo de conejo anti-GluR1 a 1:1000 (Cell Signaling; #13185), anticuerpo de conejo anti-Sinapsina 1 a 1:1000 (Cell Signaling; #5297), anticuerpo de conejo anti-PSD95 a 1:1000 (Cell Signaling; #9644) y anticuerpo de conejo anti-GAPDH a 1:1000 (Cell Signaling; #5174) en tampón de bloqueo durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, se lavaron las membranas 3 veces en tampón PBS-T y se incubaron con anticuerpo secundario anti-IgG de ratón o anti-IgG de conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante a de 1:5000 a 1:10000 (Vector Laboratories Inc.) durante 1 h. Después de tres lavados finales con tampón PBS-T, se detectaron las bandas usando quimioluminiscencia potenciada. Luego se incubaron las membranas de inmunotransferencia en el tampón de separación (SDS al 2 %, p-mercaptoetanol 100 mM, HCl de Tris 50 mM, pH 6,8) durante 30 min a 50-55 °C, seguido de tres lavados con tampón PBS-T. Se mantuvieron las membranas de inmunotransferencia separadas en disolución de bloqueo durante 1 h y se incubaron con el anticuerpo primario dirigido contra los niveles totales de la proteína respectiva o GAPDH para el control de carga. Se realizó análisis densitométrico de la inmunorreactividad de proteína fosforilada y total para cada proteína usando el software Image J de NIH. Se usaron las lecturas densitométricas resultantes para generar una razón de niveles de proteína fosforilada con respecto a proteína total respectiva o GAPDH tal como se indica. Se normalizó adicionalmente la razón resultante con respecto al grupo de control tratado con Sal o Veh para cada proteína.
Resultados:los resultados para el análisis por WB de pmTOR, pp70S6K y P4E-BP, normalizados con respecto al control Veh o Sal, se resumen en la figura 7. La administración de NV-5138 y Ket aumentó significativamente los niveles de pmTOR y p4E-BP1 en sinaptosomas en bruto preparados a partir de PFC 1 h después de la administración. Además, NV-5138, pero no Ket, aumentó significativamente los niveles de pp70S6K 1 h después de la administración. Los resultados para el análisis por WB de las proteínas sinápticas GluR1 y Sinapsina 1 se resumen en la figura 8. La administración de NV-5138 y Ket aumentó significativamente los niveles de GluR1 y Sinapsina 1 en sinaptosomas en bruto preparados a partir de PFC 24 h después de la administración. Además, Ket aumentó significativamente los niveles de PSD95 24 h después de la administración, mientras que hubo una tendencia hacia una expresión aumentada tras la administración de NV-5138.
Tabla 7: Diseño del estudio para el ejemplo B
Ejemplo C: Efecto de la dosis oral única de NV-5138 sobre la ruta de señalización de mTORC1 en múltiples regiones del cerebro de rata
Diseño del estudio: se aleatorizaron diez (10) ratas macho que pesaban entre 175 y 200 g en 2 grupos de estudio (n=5/grupo), tras un periodo de aclimatación de 5 días. El grupo 1 recibió una administración única de Veh mediante alimentación por sonda gástrica y el grupo 2 recibió una administración única de NV-5138 (160 mg/kg, preparado en Veh) mediante alimentación por sonda gástrica. 1 hora tras la administración, se sacrificaron las ratas mediante decapitación consciente, se recogió plasma para el análisis de la exposición a NV-5138, además del aislamiento de la p Fc , el hipocampo, el cuerpo estriado, la neocorteza y el cerebelo mediante microdisección. Se prepararon extractos de proteína total a partir de los tejidos recogidos y se sometieron a análisis por WB, seguido de análisis cuantitativo de sustratos de mTORC1 seleccionados. El diseño del estudio se presenta en la tabla 8. El cronograma de la administración de artículo de prueba y el sacrificio de ratas para WB se proporciona en la figura 9.
Formulación de NV-5138 (160 mg/ml):se preparó NV-5138 (Navitor, lote n.° 09) mediante su disolución en Veh a una concentración de 160 mg/ml. Se administró el volumen de dosificación basándose en el peso del animal (10 ml/kg) mediante alimentación por sonda gástrica para estudiar a los animales en el grupo 2. Los artículos de prueba se prepararon el día de administración de dosis.
Análisis por inmunotransferencia de tipo Western:se cargaron preparaciones de sinaptosomas (15 |jg de proteína total) y se separaron en geles de Bis-Tris al 4-12% de NuPAg E y se transfirieron a una membrana de PVDF (membrana de PVDF Immobilon-FL, Millipore) usando tampón CAPS (ácido 3-(ciclohexilamino)-1-propanosulfónico 10 mM, etanol al 12,5%, pH=10). Después de la transferencia, se incubaron las membranas durante 1 h a temperatura ambiente en tampón de bloqueo Odyssey (Licor). Después del bloqueo, se incubaron las membranas a 4 °C durante la noche con anticuerpos primarios. Los anticuerpos primarios usados fueron anticuerpo de conejo antis400M40pS6 (Cell Signaling; #5364) a 1:1000 y anticuerpo de ratón anti-a-tubulina (Sigma; #T5168) a 1:10000 en tampón de bloqueo Odyssey. Al día siguiente, se lavaron las membranas tres veces en TBS-Tween 1X (Tris 25 mM, pH 7,4, KCl 3,0 mM, NaCl 140 mM y Tween-20 al 0,05%) y se incubaron con anticuerpos secundarios acoplados con colorante (anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón acoplado con IRdye680 y anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo acoplado con lRdye800 de LI-COR) a 1:20000 en tampón de bloqueo Odyssey durante 30 min, luego se lavaron tres veces en TBS-Tween 1X. Se cuantificaron las señales usando el sistema de obtención de imágenes infrarrojas Odyssey (LI-COR Bioscience). Se usaron las lecturas densitométricas resultantes para generar una razón de proteína fosforilada con respecto a a-tubulina. Se normalizó adicionalmente la razón resultante con respecto al grupo de control tratado con vehículo.
Preparaciones de sinaptosomas de corteza prefrontal:1 hora tras la administración de dosis, se sacrificaron las ratas mediante decapitación consciente, y se recogieron plasma y cerebro. Se disecaron los cerebros para cada grupo (n=5, Veh; n=5, NV) y se enjuagaron en PBS. Se recogieron la PFC, el cuerpo estriado, el hipocampo, la neocorteza y el cerebelo tal como se muestra en la figura 10 y se homogeneizaron a 4 °C en tampón de homogeneización (sacarosa 0,32 M, HEPES 20 mM a pH 7,4, EDTA 1 mM, NaF 5 mM, NaVO<3>1 mM y cóctel de inhibidores de proteasas (Roche; #19543200)). Se centrifugaron los homogeneizados durante 10 min a 2.800 rpm a 4 °C, tras lo cual se retiraron los sobrenadantes y volvieron a centrifugarse a 12.000 rpm durante 10 min a 4 °C. Se resuspendieron los sedimentos resultantes en tampón de lisis (HCl de Tris 50 mM (pH 7,5), NaCl150 mM, Triton X-100 al 1 %, SDS al 0,1 %, EDTA 2 mM, NaVO<3>1 mM, NaF 5 mM y cóctel de inhibidores de proteasas) y se sometieron a sonicación sobre hielo durante 20 s a una amplitud del 50 %. Se determinaron las concentraciones de proteína total mediante el ensayo de Bradford y se mezclaron todas las muestras con tampón de carga (HCl de Tris 50 mM, pH 6,8, SDS al 2 %, glicerol al 5 %, p-mercaptoetanol al 5 % y azul de bromofenol al 0,01 %) y se almacenaron a -20 °C hasta su análisis por WB.
Análisis de los compuestos: para la determinación de los niveles de compuesto en plasma, se precipitaron las proteínas a partir de 50 j l del homogeneizado de tejido resultante que contenía 150 j l del patrón interno (tolbutamida) en acetonitrilo, seguido de centrifugación a 3000 rpm durante 10 min. Se añadieron 100 microlitros del sobrenadante resultante a 100 j l de agua, se mezclaron bien y se inyectaron en el sistema de CL-EM/EM usando el siguiente programa para evaluar los niveles de compuesto:
• Columna LUX Cellulose de Phenomenex (4,6 x 150 mm, 5 jm )
• Fase móvil A - 0,1 % de ácido fórmico en agua
• Fase móvil B - 0,1 % de ácido fórmico en acetonitrilo
• Gradiente:
° Inicial - 40 % de A
° 2 minutos - 40 % de A
° 2,1 minutos - 2 % de A
° 3 minutos - 2 % de A
° 3,1 minutos - 40 % de A
° 4 minutos - 40%de A
• Velocidad de flujo: 0,8 ml/min
• Temp. de la columna: 40 °C
• Espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Sciex 5500
Resultados:los resultados para la exposición de regiones del cerebro a NV-5138 se resumen en la figura 11. En resumen, la administración oral de NV-5138 a 160 mg/kg en ratas que tienen acceso a voluntad al pienso dieron como resultado una activación significativa de mTORC1 en la mayoría, pero no la totalidad, de las principales regiones del cerebro.
Tabla 8: Diseño del estudio para el ejemplo C
Ejemplo D: Efecto de la dosis oral única de NV-5138 o leucina sobre la ruta de señalización de mTORC1 en cerebro y órganos periféricos seleccionados de rata
Diseño del estudio:se aleatorizaron treinta (30) ratas macho que pesaban entre 175 y 200 g en 3 grupos de estudio (n=10), tras un periodo de aclimatación de 5 días. Se administraron los artículos de prueba mediante alimentación por sonda gástrica como las dosis mostradas en la tabla 9 y el cronograma mostrado en la figura 12. 1 hora tras la administración de dosis, se sacrificaron las ratas mediante decapitación consciente, y se recogieron plasma, cerebro y tejidos periféricos seleccionados para determinar el nivel de compuesto y el análisis por WB. Se prepararon tejidos para WB para cuantificar el sustrato de mTORC1 pS6 como una medida de la actividad de mTORC1.
Preparación de artículos de prueba:se prepararon NV-5138 (Navitor, lote n.° 12) y leucina (Leu, Sigma; #L8912) mediante su disolución en Veh (metilcelulosa al 0,5 %/Tween-80 al 0,1 %) a una concentración de 16 mg/ml y 100 mg/ml, respectivamente. Se administró el volumen de dosificación basándose en el peso del animal (10 ml/kg) mediante alimentación por sonda gástrica. Los artículos de prueba se prepararon el día de administración de dosis.Preparaciones de tejidos:1 hora tras la administración de dosis, se sacrificaron las ratas mediante decapitación consciente, se recogieron plasma, cerebro y tejidos periféricos y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido. Se descongelaron los tejidos y se homogeneizaron durante 1 min dos veces usando el homogeneizador MP en tampón de lisis (tampón de lisis celular: Triton X-100 al 1 %, HEPES 50 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM, EDTA 2 mM, beta-glicerofosfato 10 mM, pirofosfato de sodio 10 mM, y 1 comprimido de inhibidores de proteasas por 50 ml nuevos) a 4 °C. Luego se sometieron a sonicación los lisados sobre hielo durante 20 s a una amplitud del 50 %. Se determinó la concentración de proteína mediante el ensayo de Bradford y se mezclaron todas las muestras con tampón de carga (HCl de Tris 50 mM, pH 6,8, SDS al 2%, glicerol al 5%, p-mercaptoetanol al 5% y azul de bromofenol al 0,01 %) y se almacenaron a -20 °C hasta su análisis por WB.
Análisis por inmunotransferencia de tipo Western (WB):se cargaron cantidades iguales de cada muestra (15 |jg de proteína total) y se separaron en geles de Bis-Tris al 4-12% de NuPAGE y se transfirieron a una membrana de PVDF (membrana de PVDF Immobilon-FL, Millipore) usando tampón CAPS (ácido 3-(ciclohexilamino)-1-propanosulfónico 10 mM, etanol al 12,5%, pH = 10). Después de la transferencia, se incubaron las membranas durante 1 h a temperatura ambiente en tampón de bloqueo Odyssey (Licor). Después del bloqueo, se incubaron las membranas a 4 °C durante la noche con anticuerpos primarios. Los anticuerpos primarios usados fueron anticuerpo de conejo anti-S400/440pS6 (Cell Signaling; #5364) a 1:1000, anticuerpo de ratón anti-GAPDH (Sigma; #G8795) a 1:1000 y anticuerpo de ratón anti-a-tubulina (Sigma; #T5168) a 1:10000 en tampón de bloqueo Odyssey. Al día siguiente, se lavaron las membranas tres veces en TBS-Tween 1X (Tris 25 mM, pH 7,4, KCl 3,0 mM, NaCl 140 mM y Tween-20 al 0,05 %) y se incubaron con anticuerpos secundarios acoplados con colorante (anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón acoplado con IRdye680 y anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo acoplado con IRdye800 de LI-COR) a 1:20000 en tampón de bloqueo Odyssey durante 30 min, luego se lavaron tres veces en TBS-Tween 1X. Se cuantificaron las señales usando el sistema de obtención de imágenes infrarrojas Odyssey (LI-COR Bioscience). Se usaron las lecturas densitométricas resultantes para generar una razón de proteína fosforilada con respecto a atubulina o GAPDH. Se normalizó adicionalmente la razón resultante con respecto al grupo de control tratado con vehículo.
Análisis de los compuestos: para la determinación de los niveles de compuesto en las preparaciones de tejidos, se añadió alcohol isopropílico al 70% a una razón de 3:1 v:p (jl:mg) a las muestras de tejido, seguido de homogeneización con un batidor de perlas (Biospec). Se precipitaron las proteínas a partir de 50 j l del homogeneizado de tejido resultado en l5o j l de acetonitrilo que contenía el patrón interno (tolbutamida), seguido de centrifugación a 3000 rpm durante 10 min. Se añadieron l0o microlitros del sobrenadante resultante a 100 j l de agua, se mezclaron bien y se inyectaron en el sistema de CL-EM/EM usando el siguiente programa para evaluar los niveles de compuesto:
• Columna LUX Cellulose de Phenomenex (4,6 x 150 mm, 5 jm )
• Fase móvil A - 0,1 % de ácido fórmico en agua
• Fase móvil B - 0,1 % de ácido fórmico en acetonitrilo
• Gradiente:
° Inicial - 40 % de A
° 2 minutos - 40 % de A
° 2,1 minutos - 2 % de A
° 3 minutos - 2 % de A
° 3,1 minutos - 40 % de A
° 4 minutos - 40 % de A
• Velocidad de flujo: 0,8 ml/min
• Temp. de la columna: 40 °C
• Espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Sciex 5500
Resultados:los resultados de una administración única de NV-5138 en la activación de mTORC1 se resumen en la figura 13. NV-5138 dio como resultado una activación significativa de mTORC1 tal como se muestra por los niveles aumentados de pS6 en cerebro de rata a diferencia de Leu donde no se observó activación. A diferencia del tratamiento de cerebro, Leu y NV-5138 aumentaron significativamente el nivel de pS6 en riñón, corazón, músculo anterior tibial y grasa epididimaria de rata. Se produjo un aumento significativo de los niveles de pS6 en testículos e hígado después de la administración de dosis con Leu; sin embargo, sólo se observó una activación significativa en los testículos, pero no en el hígado, tras la administración de NV-5138.
Table 9: Diseño del estudio para el ejemplo D
Ejemplo E: Efecto de una dosis única de NV-5138 sobre las pruebas de preferencia por la sacarosa y alimentación con supresión de novedad y la expresión de proteínas sinápticas
Diseño del estudio:se aleatorizaron cincuenta y seis (56) ratas macho que pesaban entre 175 y 200 g en 4 grupos de estudio (n=14/grupo), tras un periodo de aclimatación de 5 días. El día -20 de estudio, se sometieron dos grupos de ratas a CUS durante 25 días y se alojaron dos grupos de ratas normalmente que sirvieron como grupo de NS. El día 21 del protocolo de CUS, las ratas recibieron una dosis única de Veh o NV-5138 (160 mg/kg) mediante alimentación por sonda gástrica (día 0). Se realizaron la SPT y la NSFT 24 y 48 h tras la administración (días 1 y 2), respectivamente. Tras completarse las pruebas conductuales, después de 25 días del protocolo de CUS, se administró una segunda dosis de NV-5138 o Veh el día 5 y se sacrificaron las ratas 24 h más tarde mediante decapitación consciente. Se prepararon sinaptosomas en bruto a partir de la PFC y se cuantificaron las proteínas sinápticas GluR1 y PSD95 mediante WB. El diseño del estudio se presenta en la tabla 10. El cronograma de la administración de artículo de prueba, las pruebas conductuales y el sacrificio de ratas para WB se proporciona en la figura 14.
Formulación de NV-5138 (50 mg/ml).Se preparó NV-5138 (Navitor, lote n.° 07) mediante su disolución en Veh hasta una concentración de 50 mg/ml. Se administró la disolución a las ratas en los grupos 2 y 4 mediante alimentación por sonda gástrica a un volumen de 10 ml/kg para una dosis final de 160 mg/kg. Se administró un volumen equivalente de Veh a los grupos 1 y 3.
Preparaciones de sinaptosomas de corteza prefrontal',se disecó el cerebro de las ratas en los grupos 1 (n=8), 3 (n=7) y 4 (n=7) y se enjuagó en PBS. No se realizaron preparaciones de tejidos del grupo 2. Se recogió la PFC tal como se muestra en la figura 15 y se homogeneizó a 4 °C en tampón de homogeneización (sacarosa 0,32 M, HEPES 20 mM a pH 7,4, EDTA 1 mM, NaF 5 mM, NaVO<3>1 mM y cóctel de inhibidores de proteasas (Roche; #19543200)). Se centrifugó el homogeneizado durante 10 min a 2.800 rpm a 4 °C, tras lo cual se retiró el sobrenadante y volvió a centrifugarse a 12.000 rpm durante 10 min a 4 °C. Se resuspendió el sedimento resultante en tampón de lisis (HCl de Tris 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, Triton X-100 al 1 %, SDS al 0,1 %, EDTA 2 mM, NaVO<3>1 mM, NaF 5 mM y cóctel de inhibidores de proteasas) y se sometió a sonicación sobre hielo durante 20 s a una amplitud del 50 %. Se determinó la concentración de proteína mediante el ensayo de Bradford y se mezclaron todas las muestras con tampón de carga (HCl de Tris 60 mM, pH 6,8, DTT 20 mM, Sd S al 2 %, glicerol al 10 %, pmercaptoetanol al 5 % y azul de bromofenol al 0,01 %) y se almacenaron a -20 °C hasta su análisis por WB.
Análisis por inmunotransferencia de tipo Western, se realizó análisis por inmunotransferencia de tipo Western para GluR1, PSD95 y GAPDH tal como se describió previamente (Li, N.et al.,Science 329(5994), 959-964 (2010)). Brevemente, se cargaron sinaptosomas (15 |jg de proteína) en gel de SDS-PAGE al 10-15 % para la electroforesis y se transfirieron usando transferencia a una membrana de poli(difluoruro de vinilideno) (PVDF) en tampón de transferencia (tampón de electroforesis premezclado 10X que contiene Tris 25 mM, glicina 192 mM, pH 8,3; Bio-Rad). Se bloquearon las membranas de PVDF durante 1 h a temperatura ambiente con tampón de bloqueo (BSA al 2% en PBS-T (fosfato 10 mM, pH 7,4, KCl 2,7 mM, NaCl 137 mM y Tween-20 al 0,1 %)) y se incubaron posteriormente con anticuerpos primarios. anticuerpo de conejo anti-GluR1 a 1,1000 (Cell Signaling; #13185), anticuerpo de conejo anti-PSD95 a 1.1000 (Cell Signaling; #9644) y anticuerpo de conejo anti-GAPDH a 1.1000 (Cell Signaling; #5174) en tampón de bloqueo durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, se lavaron las membranas 3 veces en tampón PBS-T, y se incubaron con anticuerpo secundario anti-IgG de ratón o anti-IgG de conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante a de 1.5000 a 1.10000 (Vector Laboratories Inc.) durante 1 h. Después de tres lavados finales con tampón PBS-T, se detectaron las bandas usando quimioluminiscencia potenciada. Luego se incubaron las membranas de inmunotransferencia en el tampón de separación (SDS al 2 %, p-mercaptoetanol 100 mM, Tris 50 mM, pH 6,8) durante 30 min a 50-55 °C, seguido de tres lavados con tampón<p>B<s>-T. Se mantuvieron las membranas de inmunotransferencia separadas en disolución de bloqueo durante 1 h y se incubaron con el anticuerpo primario dirigido contra GAPDH para el control de carga. Se realizó el análisis densitométrico de la inmunorreactividad total para cada proteína usando el software Image J de NIH. Se usaron las lecturas densitométricas resultantes para generar una razón de proteína total con respecto a GAPDH. Se normalizó adicionalmente la razón resultante con respecto al grupo de NS-Veh para cada proteína.
Resultados:los resultados para las mediciones de peso corporal se resumen en la figura 16. Se aleatorizaron las ratas en 4 grupos por peso corporal el día -21 de estudio de modo que sus pesos corporales medios fueran iguales al inicio del procedimiento de CUS. Se alojaron los grupos 1 (n=14) y 2 (n=14) en sus jaulas regulares. Se sometieron los grupos 3 (n=14) y 4 (n=14) a CUS desde el día -20 hasta el día 0 (nota. murió un animal de cada uno de estos grupos durante el CUS; por tanto, los datos desde el día -21 son de n=13 en cada grupo). Después de 21 días (día 1), las ratas sin estrés (NS) había ganado un promedio de 180,1 g, mientras que las ratas CUS ganaron un 15 % menos de peso (134,9 g) en comparación con el grupo sin estrés (p < 0,0001). Los resultados para la SPT se resumen en la figura 17. Se realizó la SPT el día 1 (24 h después de la administración de dosis). En ratas NS, la razón media de consumo de sacarosa al 1 % con respecto a agua fue equivalente en los grupos de Veh y NV-5138 (0,78 y 0,76, respectivamente). En cambio, las ratas en el grupo 3 mostraron una preferencia por la sacarosa disminuida con una razón media de sacarosa al 1 % con respecto a agua de 0,59 (p < 0,05 en comparación con todos los demás grupos). Las ratas en el grupo 4 tuvieron una preferencia por la disolución de sacarosa que era idéntica a la del grupo 2 (razón de 0,79). Los resultados para la NSFT se resumen en la figura 18. En los grupos 1 y 2, la latencia a alimentarse disminuyó significativamente 48 h después del tratamiento con NV-5138 desde 596,7 ± 24,7 s hasta 430,6 ± 25,3 s (p < 0,01). Después de 21 días de CUS, las ratas en el grupo 3 mostraron una latencia a alimentarse aumentada (773,9 ± 36,2 s) en comparación con el grupo 1 (p < 0,01, 596,7 ± 24,7 s). El tratamiento de animales CUS con NV-5138 disminuyó significativamente la latencia a alimentarse hasta 520,1 ± 40,35 s en el grupo 4 en comparación con 773,9 ± 36,2 s en el grupo 3 (p < 0,0001). No se observaron diferencias significativas en la alimentación en jaula de alojamiento inmediatamente después de la NSFT, lo que sugiere que un apetito disminuido no era un factor en estos resultados. No hubo ningún efecto sobre la alimentación en jaula de alojamiento. Los resultados para el análisis por inmunotransferencia de tipo Western de GluR1 y PSD95 en sinaptosomas en bruto se resumen en la figura 19. Las concentraciones tanto de GluR1 (panel A) como de PSD95 (panel B) en el grupo 3 disminuyeron significativamente (“ 20 %) en comparación con el grupo 1 (**p < 0,01). El tratamiento con NV-5138 condujo a la normalización de ambos marcadores sinápticos 24 h tras la dosis (**p < 0,01 para GluRI y *p < 0,05 para PSD95).
Tabla 10: Diseño del estudio para el ejemplo E
Ejemplo F: dependencia de la activación de mTORC1 para la actividad farmacológica de NV-5138 en las pruebas de natación forzada y alimentación con supresión de novedad tras una administración oral única en ratas
Diseño del estudio:se aleatorizaron veinte (20) ratas macho que pesaban entre 175 y 200 g en 3 grupos de estudio (n=6-7/grupo), tras un periodo de aclimatación de 5 días. A todas las ratas se les implantaron de manera quirúrgica cánulas i.t. bilaterales en la PFC 2 semanas antes de la administración de dosis. El día de administración de dosis, todos los grupos de tratamiento recibieron infusiones i.t. bilaterales (0,5 pl/lado) que contenían o bien vehículo de rapamicina (R) (Veh-R, DMSO al 10 %) o bien rapamicina (R, 0,01 nmol/pl) que se había demostrado previamente que inhibía completamente la actividad de mTORC1. Treinta minutos tras las infusiones intratecales, se administró o bien vehículo de NV-5138 (Veh-NV, metilcelulosa al 0,5 %/Tween-80 al 0,1%) o bien NV-5138 (160 mg/kg) mediante alimentación por sonda gástrica. Se evaluó cada grupo de tratamiento en el tiempo designado tras la administración de dosis oral en la FST 24 h (día 1), la LMA 48 h (día 2) y la NSFT 72 h (día 3 tras un periodo de ayuno de 20 h). Se midió la LMA para descartar cambio globales en la actividad locomotora en general. El diseño del estudio se presenta en la tabla 11 y el cronograma de procedimientos quirúrgicos, administración de artículo de prueba y pruebas conductuales se proporciona en la figura 20.
Preparación de artículos de prueba:se preparó rapamicina (Cell Signaling; #9904) en una disolución de DMSO al 10% (Veh-R) hasta una concentración final de 10 pM. Se administró R o Veh-R de manera bilateral (0,005 nmol/0,5 pl por lado) en la PFC medial a través de infusión i.t. 30 min antes del tratamiento con NV-5138 o Veh-NV mediante alimentación por sonda gástrica. Se preparó NV-5138 (lote n.° 07) mediante su disolución en Veh (metilcelulosa al 0,5 %/Tween-80 al 0,1%) a una concentración de 50 mg/ml. Se administró el volumen de dosificación basándose en el peso del animal (3,2 ml/kg) mediante alimentación por sonda gástrica para estudiar a los animales en los grupos 2 y 3.
Procedimiento quirúrgico y administración de Rapamicina:a las ratas se les implantó de manera estereotáctica una cánula de guía (22GA) en la PFC medial (coordinadas desde el bregma: 3,2 Ap , ± 1,0 ML, -3,5 DV desde la dura). Se llevaron a cabo procedimientos quirúrgicos bajo anestesia de Nembutal (i.p. 55 mg/kg). El cuidado posoperatorio consistió en la administración periquirúrgica de carprofeno (5 mg/kg) y antibiótico triple tópico. Después de un periodo de recuperación de 2 semanas, se administró R (0,01 nmol en 1 pl para la infusión en PFC) o Veh-R a la velocidad de 0,25 pl/min con una cánula de inyección (26GA) que sobresalía 0,5 mm más allá de la cánula de guía 30 min antes de la administración oral de NV-5138 o Veh-NV. Se eligió la dosis de rapamicina basándose en informes previos que demuestran una inhibición eficaz y selectiva de la actividad de mTORC1.
Resultados:los resultados para la FST se resumen en la figura 21. Hubo una disminución significative del 46 % en el tiempo de inmovilidad (la medida primaria de eficacia en este modelo) comparando el grupo de Veh-R/Veh-NV con Veh-R/NV-5138 desde 268 ± 11 s hasta 144 ± 15 s, respectivamente (p < 0,0001). Se eliminó esta diferencia mediante la infusión previa de R indicado por la falta de efecto significativo sobre el tiempo de inmovilidad entre los grupos de R/NV-5138 y Veh-R/Veh-NV y la diferencia significativa comparando Veh-R/NV-5138 con R/NV-5138 (p < 0,001). Los resultados para la evaluación de LMA se resumen en la figura 22. No hubo diferencias significativas en la LMA entre grupos de tratamiento. Los resultados para la prueba de alimentación con supresión de novedad se resumen en la figura 23. Hubo una disminución significativa del 46 % en la latencia a alimentarse (la medida primaria de eficacia en este modelo) en el 32 % comparando el grupo de Veh-R/Veh-NV (747 ± 68 s) con Veh-R/NV-5138 (510 ± 50 s) (p < 0,05). Se eliminó esta diferencia mediante la infusión previa de R indicado por la falta de efecto significativo sobre la latencia a alimentarse entre R/NV-5138 y Veh-R/Veh-NV (figura 23, panel A). No se observaron diferencias significativas en la alimentación en jaula de alojamiento tal como se mide mediante el consumo de pienso global inmediatamente después de la NSFT.
Tabla 11: Diseño del estudio para el ejemplo F
Ejemplo G: Duración de los cambios conductuales en la prueba de natación forzada y la prueba de alimentación con supresión de novedad después de una dosis única de NV-5138 de ketamina
Diseño del estudio:se aleatorizaron cuarenta y ocho (48) ratas macho que pesaban entre 175 y 200 g en 6 grupos de estudio (n=8/grupo), tras un periodo de aclimatación de 5 días. Se administró una dosis única de todos los artículos de prueba el día 0 y se realizaron las pruebas conductuales 3, 7 y 10 días más tarde. El día 0, a los grupos 1 y 2 se les administraron dosis de NV-5138 (160 mg/kg mediante alimentación por sonda gástrica) y Ket (10 mg/kg mediante inyección i.p.), respectivamente, y se sometieron a FST el día 3. Las ratas en los grupos 3 y 4 recibieron una dosis única del vehículo de NV-5138 (Veh) o NV-5138 (160 mg/kg), respectivamente, mediante alimentación por sonda gástrica el día 0. Las ratas en los grupos 5 y 6 recibieron una dosis única del vehículo de Ket (Sal) o Ket (10 mg/kg), respectivamente, mediante inyección i.p. el día 0. Las ratas en los grupos 3-6 se sometieron a FST el día 7 y a NSFT el día 10. Todas las ratas en los grupos 3-6 se sometieron a ayuno la noche anterior durante 20 horas para la NSFT. El diseño del estudio se presenta en la tabla 12. El cronograma de la administración de artículo de prueba y pruebas conductuales se proporciona en la figura 24.
Resultados:los resultados para la FST se resumen en la figura 25. El tratamiento con Ket disminuyó significativamente la cantidad de tiempo que permanecieron inmóviles las ratas macho en la FST realizada 3 días después de una dosis única en un 31 % (137,9 ± 12,18 s en comparación con 95,5 ± 7,8 s en el grupo 5 de Sal frente al grupo 2 de Ket, respectivamente, p < 0,05). De manera similar, el tratamiento con NV-5138 disminuyó significativamente la cantidad de tiempo que permanecieron inmóviles las ratas macho en la FST realizada 3 días después de una dosis única en un 39 % (145,3 ± 16,99 s en comparación con 87,9 ± 9,0 s en el grupo 3 de Veh frente al grupo 1 de NV-5138, respectivamente, p < 0,05). Ket disminuyó significativamente la cantidad de tiempo que permanecieron inmóviles las ratas macho en la FST realizada 7 días después de una dosis única en un 31 % (137,9 ± 12,18 s en comparación con 95,0±11,1 s en el grupo 5 de Sal frente al grupo 6 de Ket, respectivamente, p < 0,05). De manera similar, el tratamiento con NV-5138 disminuyó significativamente la cantidad de tiempo que permanecieron inmóviles las ratas macho en la FST realizada 7 días después de una dosis única en un 34 % (145,3 ± 16,99 s en comparación con 96,0 ± 11,3 s en el grupo 3 de Veh frente al grupo 4 de NV-5138, respectivamente, p < 0,05). Los resultados de la NSFT y el control de alimentación en jaula de alojamiento se resumen en la figura 26. No se observó ninguna diferencia significativa entre las ratas tratadas con Sal y Ket o entre las ratas tratadas con Veh y NV. No hubo ninguna diferencia en el consumo de pienso en jaula de alojamiento entre los grupos 3-6.
Tabla 12: Diseño del estudio para el ejemplo G
Ejemplo H: Cambios fisiológicos en las neuronas piramidales de la capa V después de una dosis única de NV-5138
Diseño del estudio:se aleatorizaron dieciséis (16) ratas macho que pesaban entre 175 y 200 g en 2 grupos de estudio (n=8), tras un periodo de aclimatación de 5 días. El día 0 de estudio, las ratas recibieron una dosis única de vehículo de N<v>(Veh, metilcelulosa al 0,5 %/Tween-80 al 0,1 %) o NV-5138 (160 mg/kg), mediante alimentación por sonda gástrica. El día 1, 24 h después de la administración de dosis, se sacrificaron las ratas, y se prepararon cortes de cerebro y se sometieron a registro electrofisiológico de fijación de voltaje de célula completa de neuronas piramidales de la capa V en la PFC. El diseño del estudio se presenta en la tabla 13. El cronograma de la administración de artículo de prueba y el análisis fisiológico se resume en la figura 27.
Preparación de artículos de prueba:se preparó NV-5138 (Navitor, lote n.° 07) mediante su disolución en Veh (metilcelulosa al 0,5 %/Tween-80 al 0,1%) a una concentración de 50 mg/ml. Se administró el volumen de dosificación basándose en el peso del animal (3,2 ml/kg) mediante alimentación por sonda gástrica para estudiar a los animales. Los artículos de prueba se prepararon el día de administración de dosis.
Preparación de cortes de cerebro:se prepararon cortes de cerebro según procedimientos publicados (Liu, R.J.et al.,J. Neurosci. 22(21): 9453-9464 (2002)). Brevemente, se anestesiaron las ratas con cloral hidratado (400 mg/kg, i.p.), en cumplimiento con los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Yale. Después de la decapitación, se extirparon los cerebros rápidamente y se colocaron en líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) helado (4 °C) en el que la sacarosa (252 mM) se sustituyó por NaCl (ACSF sin sacarosa) para impedir el hinchamiento de las células. Se disecó un bloque de tejido que contenía PFC y se realizaron cortes frontales (400 |jm) en ACSF sin sacarosa con un cortador de tejido de cuchillas oscilantes (Leica VT1000S). Después de la colocación del corte en una cámara de registro sumergida, se aumentó la temperatura del baño hasta 32 °C. Las concentraciones conocidas de fármacos disueltos en ACSF, aplicadas a través de una disposición de llave de paso a una velocidad de flujo rápida (~4 ml/min), llegaron al corte en el plazo de 7-10 s. El ACSF patrón (pH = 7,35) se equilibró con el 95 % de<0 2>/el 5 % de CO<2>y contenía NaCl 128 mM, KCl 3 mM, CaCl<2>2 mM, MgSO<4>2 mM, NaHCo<3>24 mM, NaH<2>PO<4>1,25 mM y D-glucosa 10 mM. Se permitió un periodo de recuperación de ~1-2 h antes de comenzar el registro.
Registro electrofisiológico:Se visualizaron las neuronas piramidales en la capa V mediante microscopía de vídeo usando un microscopio Olympus BX50WI (lente IR *60) con microscopía de vídeo de contraste de interferencia diferencial de infrarrojo (iR/DIC) (Olympus), según procedimientos publicados (Lambe, E.K. y Aghajanian, G.K. Neuron 40(1):139-150 (2003)). Las pipetas de parche de baja resistencia (3-5 MQ) se extrajeron de los tubos de vidrio de registro electrofisiológico de fijación de voltaje (Warner Instruments) usando un dispositivo de extracción horizontal Flaming-Brown (modelo P-97; Sutter Instruments). Se cargaron las pipetas con la siguiente disolución: gluconato de K 115 mM, KCl 5 mM, MgCh 2 mM, Mg-ATP 2 mM, Na<2>ATP 2 mM, fosfocreatina de Na<2>10 mM, Na<2>GTP 0,4 mM y HEPES 10 mM, pH 7,33. Se añadió neurobiotina (0,3 %) a la disolución de la pipeta para marcar las células para su posterior obtención de imágenes. Se realizaron registros de célula completa con un amplificador Axoclamp-2B (Axon Instruments). La señal de salida se sometió a filtro de paso bajo a 3 KHz, se amplificó *100 a través del dispositivo Cyberamp, se digitalizó a 15 kHz, y se adquirió usando el software pClamp 9.2/Digidata 1320 (Axon Instruments). La resistencia en serie, monitorizada a lo largo de todo el experimento, estaba habitualmente entre 4 y 8 MQ. Para minimizar los errores de resistencia en serie, se descartaron las células si la resistencia en serie aumentaba por encima de 10 Q. Se estudiaron las corrientes postsinápticas en el modo de registro electrofisiológico de fijación de voltaje de electrodo único continuo (filtro de paso bajo de 3000 Hz) fijado cerca del potencial de reposo (75 mV ± 5 mV) para minimizar las corrientes de mantenimiento. Después de completarse el registro, se transfirieron los cortes a paraformaldehído al 4 % en tampón fosfato 0,1 M y se almacenaron durante la noche a 4 °C. Luego se procesaron los cortes con estreptavidina conjugada con Alexa 594 (1:1000; Invitrogen) para la visualización de neurobiotina en las células marcadas.
Análisis de la densidad espinal:Se obtuvieron imágenes de las neuronas marcadas dentro de la capa V de la circunvolución anterior (Cg1) y la mPFC prelímbica (Cg3) con un sistema de barrido láser de Ti:Sapphire bifotónico para el análisis de la densidad espinal y la morfología (810 nanómetros; Mai Tai, Spectra Physics, Mountain Vista, California) acoplado con un dispositivo de barrido láser Radiance 2000 BioRad de detección directa (Zeiss Micromaging, Thornwood, Nueva York) montado en un microscopio Olympus BX50WI, usando un objetivo de inmersión en agua 60x (apertura numérica de 0,9). Esto incluye el número total de espinas en las crestas proximal y distal de las neuronas de la capa V, así como el diámetro de cabeza de espina, y la indicación de maduración de espina. La longitud de los segmentos de ramificación de cresta apical se determina dentro de la matriz tridimensional de cada apilamiento Z usando Neurolucida 10.2 (MicroBrightField). Los análisis de densidad espinal y diámetro de cabeza de espina se realizan con el módulo Autospine de Neurolucida Explorer (versión 10.2) en los apilamientos de imágenes sin procesar (2-5 secciones ópticas, 1 jm de separación). Se muestrearon la densidad espinal y la segmentación(“beading")en tres zonas: puntas de las ramificaciones de cresta a medida que se aproximan a la membrana de la piamadre, dendritas intermedias aproximadamente a mitad de camino entre la membrana de la piamadre y la bifurcación del tronco apical, y dendritas de cresta proximal justamente distales a la bifurcación. Los resultados se expresaron en cuanto a longitud dendrítica total, densidad espinal, y densidad de segmentación. Los resultados se expresaron en cuanto a densidad espinal por 10 |jm.
Resultados:los resultados de los registros electrofisiológicos de fijación de voltaje de célula completa de células piramidales de la capa V se resumen en la figura 28. Después de una dosis única de NV-5138, aumentó significativamente la frecuencia de EPSC inducidas por 5-HT y Hcrt con respecto a las ratas tratadas con vehículo. Se usaron ocho ratas por grupo y se registraron de 3 a 5 células por rata. Los trazados de registro electrofisiológico de fijación de voltaje de EPSC inducidas por 5-HT y Hcrt se muestran en la figura 30. Las distribuciones de probabilidad acumulada de EPSC inducidas por 5-HT y Hcrt y el efecto de NV-5138 se muestran en la figura 31. Los resultados del análisis de morfología y densidad de espinas dendríticas se resumen en la figura 29. Una dosis única de NV-5138 reveló un aumento significativo en la densidad espinal global con un aumento específico del subtipo de espinas “delgadas” y “con forma de seta” en dendritas de neuronas piramidales de la capa V. Se tomaron imágenes de 1 portaobjetos por animal, 4 ratas tratadas con Veh y 5 ratas tratadas con NV-5138 de los grupos 1 y 2, respectivamente. Hubo un aumento significativo en la densidad total de dendritas apicales de neuronas piramidales de la capa V de mPFC 24 h tras una administración oral única de NV. Se observaron aumentos significativos en los subtipos específicos de espinas dendríticas morfológicas “delgadas” y “con forma de seta”. La administración de NV-5138 también aumentó significativamente la frecuencia de EPSC inducidas tanto por 5-HT como por Hcrt con respecto a las ratas tratadas con vehículo, que es similar a lo que se observó previamente para la ketamina (Li, N.et al.,Science 329(5994): 959-964 (2010)), pero distinto de GLYX-13 usando procedimientos similares (Liu, RJ.et al.,Neuropsychopharmacology 42(6): 1231-42 (2017)). Este estudio demuestra que la activación directa de mTORC1 tras una administración oral única de NV-5138 da como resultado una inducción de la formación de espinas dendríticas funcionales, que se ha implicado en una señalización sináptica aumentada y una mejora en el estado de ánimo para otros agentes antidepresivos de acción rápida.
Tabla 13: Diseño del estudio para el ejemplo H
Ejemplo I: Cambios conductuales en las pruebas de natación forzada y alimentación con supresión de novedad después de la administración de dosis diaria de compuesto o la administración de dosis cada dos días de ketaminaDiseño del estudio:se aleatorizaron veinticuatro (24) ratas Sprague Dawley macho que pesaban entre 175 y 200 g en 4 grupos de estudio (n=6/grupo), tras un periodo de aclimatación de 5 días. El día -1 de estudio, se sometieron las ratas a una prenatación. Comenzando el día 0 de estudio, la ratas en el grupo 2 recibieron una dosis de Ket (10 mg/kg) en días alternos (día 0, 2, 4, y 6), cada una mediante inyección i.p. Las ratas en el grupo 1 recibieron una dosis diaria de Veh mediante alimentación por sonda gástrica durante 7 días (días 0 a 6). Las ratas en los grupos 3 y 4 recibieron una dosis diaria de NV-5138 (40 u 80 mg/kg) durante 7 días (días 0 a 6), cada una mediante alimentación por sonda gástrica. Todas las ratas se sometieron a la FST el día 7, 24 h después de la última administración de dosis. El día 8, 48 h después de la última administración de dosis, se midió la LMA de todas las ratas en un campo abierto. Luego, las ratas se sometieron a ayuno durante 20 h y se sometieron a la NSFT el día 9 (72 h tras la última dosis). El diseño del estudio se presenta en la tabla 14. El cronograma de la administración de artículo de prueba y las pruebas conductuales se resume en la figura 32.
Preparación de artículos de prueba:se disolvió Ket (Sigma, n.° de cat. K1884) en Sal a una concentración de 10mg/ml. Se administraron volúmenes de inyección (i.p) de 1 ml/kg de Ket al grupo 2. Se preparó NV-5138 mediante su disolución en Veh (metilcelulosa al 0,5 %/Tween-80 al 0,1 %) a una concentración de 50 mg/ml. Se administró el volumen de dosificación basándose en el peso del animal (3,2 ml/kg) de Veh o NV-5138 diariamente mediante alimentación por sonda gástrica para estudiar a los animales en los grupos 1, 3 y 4, respectivamente. Los artículos de prueba se prepararon el día de administración de dosis.
Resultados:los resultados para la FST del día 7 se resumen en la figura 33. Los resultados para la LMA del día 8 se resumen en la figura 34. Los resultados para la NSFT y el control de alimentación en jaula de alojamiento del día 9 se resumen en la figura 35. Se observaron efectos significativos de NV-5138 a 80 mg/kg en la FST y la NSFT. La ketamina produjo efectos significativos en ambas pruebas. No se observaron efectos significativos en la LMA ni en la alimentación en jaula de alojamiento.
Tabla 14: Diseño del estudio para el ejemplo J
Ejemplo J: Prueba de amenaza humana en tití
Diseño del estudio:se emparejaron treinta y seis (36) titíes(Callithrix jacchus)y se dividieron aleatoriamente en grupos de tratamiento. Veinticuatro horas antes de la prueba de amenaza humana (HTT), se trataron los animales con vehículo, ketamina (0,3 mg/kg; i.m.) o NV-5138 (160 mg/kg; v.o.). Al día siguiente, se trataron los mismos animales o bien con vehículo (s.c.) o bien con clordiazepóxido (1 mg/kg; s.c.). Luego se monitorizaron los animales para determinar el número de posturas por amenaza a lo largo de un periodo de dos (2) minutos con la presencia de un observador humano. Se monitorizo la actividad locomotora a lo largo del mismo periodo, tal como se mide por el número de saltos observados.
Resultados:el número de posturas por amenaza para los animales se resume en la figura 36. El número de saltos para los animales se resume en la figura 37. Los datos confirman que la ketamina induce un perfil del tipo ansiolítico/antidepresivo en la HTT en tití veinticuatro horas después de la administración en dosis única sin cambios significativos en la actividad locomotora. Sin embargo, la mitad de los animales (6) desarrollaron vómitos leves (datos no mostrados). NV-5138 produjo efectos del tipo ansiolítico/antidepresivo similares sin deterioro locomotor. De manera importante, no se observaron efectos adversos, tales como vómitos. El clordiazepóxido produjo resultados similares.

Claims (6)

  1. REIVINDICACIONES i . Un compuesto de fórmula I-90, o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo:
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un método de tratamiento de depresión resistente al tratamiento.
  2. 2. El compuesto o composición para su uso según la reivindicación 1, en donde dicho método comprende además administrar a dicho paciente una terapia o un agente terapéutico adicional.
  3. 3. La composición para su uso según la reivindicación 1, en donde la composición farmacéuticamente aceptable que comprende un compuesto de fórmula I-90 comprende además un portador, adyuvante, o vehículo farmacéuticamente aceptable.
  4. 4. La composición para su uso según la reivindicación 3, en donde dicho método comprende además administrar a dicho paciente una terapia o un agente terapéutico adicional.
  5. 5. El compuesto o composición para su uso según la reivindicación 1, en donde la depresión resistente al tratamiento es resistente a tratamientos de primera línea.
  6. 6. El compuesto o composición para su uso según la reivindicación 1, en donde la depresión resistente al tratamiento es resistente a tratamientos de segunda línea.
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