ES3041380T3 - Methods and compositions for treating a serpinc1-associated disorder - Google Patents

Methods and compositions for treating a serpinc1-associated disorder

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ES3041380T3 ES16822817T ES16822817T ES3041380T3 ES 3041380 T3 ES3041380 T3 ES 3041380T3 ES 16822817 T ES16822817 T ES 16822817T ES 16822817 T ES16822817 T ES 16822817T ES 3041380 T3 ES3041380 T3 ES 3041380T3
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Abstract

La invención se refiere a iRNA, por ejemplo, ácido ribonucleico de doble cadena (ARNdc), composiciones dirigidas al gen Serpincl, y métodos para usar dichas composiciones de iRNA, por ejemplo, ARNdc, para inhibir la expresión de Serpincl y para tratar a sujetos que padecen una enfermedad asociada a Serpincl, por ejemplo, un trastorno hemorrágico, como la hemofilia. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y composiciones para tratar un trastorno asociado a serpincl
Listado de secuencias
8La presente solicitud contiene una lista de secuencias que se ha enviado electrónicamente en formato ASCII. Dicha copia ASCII, creada el 6 de diciembre de 2016, se denomina 121301-05220_SL.TXT y tiene un tamaño de 21.140 bytes.
Antecedentes de la invención
Serpinc1 es un miembro de la superfamilia de inhibidores de serina proteinasa (serpinas). Serpinc1 es un inhibidor de la proteasa plasmática que inhibe la trombina así como otras serina proteasas activadas del sistema de coagulación, tales como los factores X, IX, XI, XII y VII y, por tanto, regula la cascada de coagulación sanguínea. La actividad anticoagulante de Serpinc1 se ve potenciada por la presencia de heparina y otros glicosaminoglicanos relacionados que catalizan la formación de complejos trombina: antitrombina (TAT).
Los trastornos hemorrágicos, ya sean hereditarios o adquiridos, son afecciones en las que hay una coagulación sanguínea inadecuada. Por ejemplo, la hemofilia es un grupo de trastornos hemorrágicos genéticos hereditarios que afectan la capacidad del cuerpo para controlar la coagulación sanguínea. La hemofilia A es un trastorno genético recesivo ligado al cromosoma X que implica una falta de factor VIII de coagulación funcional y representa el 80% de los casos de hemofilia. La hemofilia B es un trastorno genético recesivo ligado al cromosoma X que implica una falta del factor IX de coagulación funcional. Comprende aproximadamente el 20% de los casos de hemofilia. La hemofilia C es un trastorno genético autosómico que implica una falta del factor XI de coagulación funcional. La hemofilia C no es completamente recesiva, ya que los individuos heterocigotos también muestran un mayor sangrado.
Aunque en la actualidad no existe cura para la hemofilia, ésta se puede controlar con infusiones regulares del factor de coagulación deficiente, por ejemplo, el factor VIII en la hemofilia A. Sin embargo, algunos hemofílicos desarrollan anticuerpos (inhibidores) contra los factores de reemplazo que se les administran y, por lo tanto, se vuelven refractarios al factor de coagulación de reemplazo. En consecuencia, las hemorragias en estos sujetos no pueden controlarse adecuadamente.
El desarrollo de inhibidores de títulos altos, por ejemplo, del factor VIII y otros factores de coagulación, es la complicación más grave del tratamiento de la hemofilia y convierte el tratamiento de las hemorragias en un gran desafío. Actualmente, las únicas estrategias para detener las hemorragias en estos sujetos son el uso de "agentes de derivación", tal como la actividad de derivación del inhibidor del factor ocho (FEIBA) y el factor VII recombinante activado (rFVIIa), la plasmaféresis, el reemplazo continuo de factores y la terapia de tolerancia inmunológica, ninguno de los cuales es completamente eficaz. Por consiguiente, existe una necesidad en la técnica de tratamientos alternativos para sujetos que tienen un trastorno hemorrágico, tal como la hemofilia.
Sumario de la invención
La presente invención está definida por las reivindicaciones. En general, se describen en este documento métodos para tratar a un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría al inhibir o reducir la expresión de un gen Serpinc1, por ejemplo, un trastorno hemorrágico, tal como la hemofilia, utilizando composiciones de ARNi que efectúan la escisión mediada por el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) de los transcritos de ARN de un gen Serpinc1 para inhibir la expresión de un gen Serpinc1. Se describen enfoques anteriores que utilizan agentes basados en interferencia de ARN (ARNi) para inhibir la expresión de Serpinc1 y para tratar sujetos que tienen una enfermedad asociada a Serpinc1 en los documentos WO2015/175510 y WO2013/163430, ambos presentados por el mismo solicitante que la presente solicitud.
La presente invención se basa, al menos en parte, en el sorprendente descubrimiento de que dosis muy bajas (por ejemplo, dosis al menos aproximadamente 30 veces inferiores a las dosis enseñadas en la técnica) de un agente de ARNi bicatenario unido a GalNAc que comprende modificaciones químicas particulares muestra una potencia excepcional para inhibir la expresión de Serpinc1, así como una duración excepcional de la inhibición de la expresión de Serpinc1. Específicamente, se demuestra aquí que dosis bajas de agentes de ARNi que incluyen un ligando GalNAc y una cadena sentido y una cadena antisentido en la que están modificados sustancialmente todos los nucleótidos, tales como agentes de ARNi que incluyen uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, incluido uno de dichos motivos en o cerca del sitio de escisión de los agentes, seis enlaces fosforotioato y un ligando GalNAc son excepcionalmente eficaces y duraderas para silenciar la actividad del gen Serpinc1.
La presente invención está definida por las reivindicaciones. Por consiguiente, en un primer aspecto, la invención se refiere a un agente de ARNi bicatenario para su uso en la prevención de al menos un síntoma, o en el tratamiento, de un sujeto humano que padece un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1, en donde el agente de ARNi bicatenario se va a administrar al sujeto como una dosis fija de aproximadamente 40 mg a aproximadamente 90 mg, en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, comprendiendo la cadena antisentido una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido al extremo 3'. En un segundo aspecto, la invención se refiere a un kit para su uso en la prevención de al menos un síntoma en, o el tratamiento de, un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de la reducción en la expresión de Serpinc1, que comprende a) el agente de ARNi bicatenario según el primer aspecto de la invención, en donde el agente de ARNi bicatenario se debe administrar al sujeto en una dosis fija de aproximadamente 40 mg a aproximadamente 90 mg, y b)
instrucciones de uso, y c) opcionalmente, medios para administrar el agente de ARNi bicatenario al sujeto.
También se describen en este documento métodos para prevenir al menos un síntoma en un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1. Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis de aproximadamente 0,200 mg/kg a aproximadamente 1,825 mg/kg de un agente de ARNi bicatenario que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido que forman una región bicatenaria, en donde la cadena sentido comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 y la cadena antisentido comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5, en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde el agente de ARNi bicatenario comprende un ligando, por ejemplo, la cadena sentido del agente de ARNi bicatenario está conjugada con un ligando, por ejemplo, un ligando está unido al extremo 3' de la cadena sentido.
También se describen en este documento métodos para tratar a un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1. Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis de aproximadamente 0,200 mg/kg a aproximadamente 1,825 mg/kg de un agente de ARNi bicatenario, en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido y una cadena antisentido que forman una región bicatenaria, en donde la cadena sentido comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 y la cadena antisentido comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5, en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde el agente de ARNi bicatenario comprende un ligando, por ejemplo, la cadena sentido del agente de ARNi bicatenario está conjugada a un ligando unido en el extremo 3' de la cadena sentido.
En una realización, todos los nucleótidos de la cadena sentido y todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados.
En otro caso, la cadena sentido y la cadena antisentido comprenden una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de cualquiera de las secuencias enumeradas en cualquiera de las Tablas 2 y 3.
En algunos casos, los nucleótidos modificados se seleccionan independientemente del grupo que consiste en un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, un nucleótido modificado con 2'-fluoro, un nucleótido que comprende un grupo 5'-fosforotioato, y un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo o un grupo bisdecilamida del ácido dodecanoico. En otros casos, el nucleótido modificado se selecciona del grupo que consiste en un nucleótido modificado con 2'-desoxi-2'-fluoro, un nucleótido modificado con 2'-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido desbloqueado, un nucleótido conformacionalmente restringido, un nucleótido de etilo restringido, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado con 2'-amino, un nucleótido modificado con 2'-alquilo, un nucleótido modificado con 2'-O-alilo, un nucleótido modificado con 2'-C-alilo, un nucleótido modificado con 2'-hidroxilo, un nucleótido morfolino, un fosforamidato y un nucleótido que comprende una base no natural.
En otro caso del agente de ARNi bicatenario, al menos una cadena comprende un saliente 3' de al menos 1 nucleótido. En otro caso, al menos una cadena comprende un saliente 3' de al menos 2 nucleótidos, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 nucleótidos. En otros casos, al menos una cadena del agente de ARNi comprende un saliente 5' de al menos 1 nucleótido. En ciertos casos, al menos una cadena comprende un saliente 5' de al menos 2 nucleótidos, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 nucleótidos. En otros casos, tanto el extremo 3' como el 5' de una cadena del agente de ARNi comprenden un saliente de al menos 1 nucleótido.
En ciertas realizaciones, el ligando es una N-acetilgalactosamina (GalNAc). El ligando puede ser uno o más GalNAc unidos al agente de ARNi a través de un enlazador ramificado monovalente, bivalente o trivalente. El ligando se puede conjugar al extremo 3' de la cadena sentido del agente de ARNi bicatenario, al extremo 5' de la cadena sentido del agente de ARNi bicatenario, al extremo 3' de la cadena antisentido del agente de ARNi bicatenario o al extremo 5' de la cadena antisentido del agente de ARNi bicatenario.
Los agentes de ARNi bicatenario pueden comprender una pluralidad, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o 6, de GalNAc, cada uno unido independientemente a una pluralidad de nucleótidos del agente de ARNi bicatenario a través de una pluralidad de enlazadores monovalentes.
En ciertas realizaciones, el ligando es
También se describen en este documento métodos para prevenir al menos un síntoma en un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1. Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis de aproximadamente 0,200 mg/kg a aproximadamente 1,825 mg/kg de un agente de ARNi bicatenario, en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido complementaria a una cadena antisentido, en donde la cadena antisentido comprende una región complementaria a parte de un ARNm que codifica Serpinc1, en donde cada cadena tiene una longitud de aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos, en donde el agente de ARNi bicatenario está representado por la fórmula (II Ie):
en la que:
n<p>' es un saliente de 2 nucleótidos y cada nucleótido dentro de n<p>' está unido a un nucleótido vecino a través de un enlace fosforotioato;
cada N<a>y N<a>' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende de 0 a 25 nucleótidos que están modificados o no modificados o combinaciones de los mismos, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de forma diferente;
YYY e Y'Y'Y' representan cada uno independientemente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, y en donde las modificaciones son modificaciones de 2'-O-metilo o 2'-fluoro;
en donde la cadena sentido y la cadena antisentido comprenden cada una independientemente dos enlaces fosforotioato en el extremo 5'; y
en donde la cadena sentido está conjugada con al menos un ligando, en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unidos a través de un enlazador ramificado monovalente, bivalente o trivalente,
evitando así al menos un síntoma en el sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1.
La presente divulgación también proporciona métodos para tratar a un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1. Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis de aproximadamente 0,200 mg/kg a aproximadamente 1,825 mg/kg de un agente de ARNi bicatenario, en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido complementaria a una cadena antisentido, en donde la cadena antisentido comprende una región complementaria a parte de un ARNm que codifica Serpinc1, en donde cada cadena tiene una longitud de aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos, en donde el agente de ARNi bicatenario está representado por la fórmula (IIIe):
en la que:
r<ip>' es un saliente de 2 nucleótidos y cada nucleótido dentro de n<p>' está unido a un nucleótido vecino a través de un enlace fosforotioato;
cada N<a>y N<a>' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende de 0 a 25 nucleótidos que están modificados o no modificados o combinaciones de los mismos, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de forma diferente;
YYY e Y'Y'Y' representan cada uno independientemente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, y en donde las modificaciones son modificaciones de 2'-O-metilo o 2'-fluoro;
en donde la cadena sentido y la cadena antisentido comprenden cada una independientemente dos enlaces fosforotioato en el extremo 5'; y
en donde la cadena sentido está conjugada con al menos un ligando, en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unidos a través de un enlazador ramificado monovalente, bivalente o trivalente,
evitando así al menos un síntoma en el sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1.
En un caso, el agente de ARNi bicatenario se administra al sujeto en una dosis única o en dos o más dosis, por ejemplo, en 3, 4, 5 o 6 dosis.
En un caso, el agente de ARNi bicatenario se administra al sujeto una vez al mes, una vez cada seis semanas, una vez cada 2 meses, una vez al trimestre o según sea necesario.
El agente de ARNi bicatenario se puede administrar al sujeto, por ejemplo, como una dosis mensual de aproximadamente 0,200 a aproximadamente 1,825 mg/kg, 0,200 a aproximadamente 1,800 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 1.700 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 1,600 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 1.500 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 1.400 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 1.400 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 1,200 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 1.100 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 1,000 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 0,900 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 0,800 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 0,700 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 0,600 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 0,500 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 0,400 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1.825 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1,800 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1.700 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1,600 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1.500 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1.400 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1.400 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1,200 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1.100 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1,000 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 0,900 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 0,800 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 0,700 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 0,600 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 0,500 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 0,400 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1.825 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1,800 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1.700 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1,600 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1.500 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1.400 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1.400 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1,200 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1.100 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1,000 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 0,900 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 0,800 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 0,700 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 0,600 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 0,500 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 0,400 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1.825 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1,800 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1.700 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1,600 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1.500 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1.400 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1.400 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1,200 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1.100 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1,000 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 0,900 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 0,800 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 0,700 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 0,600 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 0,500 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1,825 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1,800 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1,700 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1,600 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1,500 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1.400 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1.400 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1,200 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1,100 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1,000 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 0,900 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 0,800 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 0,700 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 0,600 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 0,500 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1,825 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1,800 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1,700 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1,600 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1,500 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1,400 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1,400 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1,200 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1,100 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1,000 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 0,900 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 0,800 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 0,700 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 0,600 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 0,500 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1,825 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1,800 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1,700 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1,600 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1,500 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1,400 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1,400 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1,200 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1,100 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1,000 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 0,900 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,825 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,800 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,700 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,600 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,500 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,400 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,400 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,200 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,100 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,000 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,825 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,800 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,700 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,600 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,500 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,400 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,400 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,200 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,100 mg/kg, or aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,000 mg/kg, como por ejemplo, una dosis mensual durante uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho meses, o más.
El sujeto puede ser un ser humano, tal como un ser humano que padece un trastorno hemorrágico, tal como un trastorno hemorrágico adquirido o un trastorno hemorrágico hereditario, por ejemplo, una hemofilia, por ejemplo, hemofilia A o hemofilia B.
En una realización, el sujeto tiene hemofilia A y es un sujeto inhibidor. En otra realización, el sujeto tiene hemofilia B y es un sujeto inhibidor.
En un caso, la administración del agente de ARNi bicatenario al sujeto provoca un aumento en la coagulación sanguínea y/o una disminución en la acumulación de la proteína Serpinc1.
En un caso, los métodos comprenden además la medición de los niveles de trombina en el sujeto.
El agente ARNi bicatenario se puede administrar por vía subcutánea o intravenosa.
En un caso, sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido del agente de ARNi comprenden una modificación seleccionada del grupo que consiste en una modificación de 2'-O-metilo y una modificación de 2'-fluoro. En una realización, todos los nucleótidos de la cadena sentido y todos los nucleótidos de la cadena antisentido de la cadena del agente de ARNi son nucleótidos modificados.
En un caso, el motivo YYY aparece en o cerca del sitio de escisión de la cadena sentido.
En un caso, el motivo Y'Y'Y' aparece en las posiciones 11, 12 y 13 de la cadena antisentido desde el extremo 5'.
La región bicatenaria puede tener una longitud de 15 a 30 pares de nucleótidos, de 17 a 23 pares de nucleótidos, de 17 a 25 pares de nucleótidos, de 23 a 27 pares de nucleótidos, de 19 a 21 pares de nucleótidos o de 21 a 23 pares de nucleótidos.
Cada cadena puede tener entre 15 y 30 nucleótidos, o entre 19 y 30 nucleótidos.
En un caso, la cadena sentido tiene un total de 21 nucleótidos y la cadena antisentido tiene un total de 23 nucleótidos.
En una realización, el ligando es
De acuerdo con la invención, el ligando se une al extremo 3' de la cadena sentido.
En una realización, el agente de ARNi se conjuga con el ligando como se muestra en el siguiente esquema.
donde X es O o S.
En un caso, el par de bases en la posición 1 del extremo 5' de la cadena antisentido del dúplex es un par de bases AU.
En una realización, el agente de ARNi es AD-57213 ((Sentido (5' a 3'): GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf (SEQ ID NO: 13); Antisentido (5' a 3'): usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg (SEQ ID NO: 14), donde A, C, G y U son ribosa A, C, G o U; a, c, g y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G o U; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, C, G o U; y s es un enlace fosforotioato).
En una realización, el agente se administrará como una composición farmacéutica. En una realización, el agente de ARNi se debe administrar en una solución no amortiguada, tal como solución salina o agua.
En otra realización, el ARNpi se debe administrar con una solución amortiguada, tal como una solución amortiguada que comprende acetato, citrato, prolamina, carbonato o fosfato o cualquier combinación de los mismos. En una realización, la solución amortiguada es solución salina amortiguada con fosfato (PBS).
La presente divulgación también proporciona métodos para prevenir al menos un síntoma en un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1. Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis de aproximadamente 0,200 mg/kg a aproximadamente 1,825 mg/kg de un agente de ácido ribonucleico (ARNi) bicatenario, en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, comprendiendo la cadena antisentido una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de 5' -UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde el agente de ARNi bicatenario comprende un ligando, por ejemplo, la cadena sentido del agente de ARNi bicatenario está conjugada a un ligando unido al extremo 3' de la cadena sentido.
La presente divulgación también proporciona métodos para tratar a un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1. Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis de aproximadamente 0,200 mg/kg a aproximadamente 1,825 mg/kg de un agente de ácido ribonucleico (ARNi) bicatenario, en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, comprendiendo la cadena antisentido una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de 5' -UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde el agente de ARNi bicatenario comprende un ligando, por ejemplo, la cadena sentido del agente de ARNi bicatenario está conjugada a un ligando unido al extremo 3' de la cadena sentido.
El agente de ARNi bicatenario se puede administrar al sujeto en dos o más dosis.
En una realización, el agente de ARNi bicatenario se administrará al sujeto una vez al mes. En otra realización, el agente de ARNi bicatenario se administrará al sujeto una vez cada seis semanas. En una realización, el agente de ARNi bicatenario se administrará al sujeto una vez cada 2 meses. En otra realización más, el agente de ARNi bicatenario se debe administrar al sujeto una vez por trimestre.
El agente de ARNi bicatenario se puede administrar al sujeto, por ejemplo, como una dosis mensual de aproximadamente 0,200 a aproximadamente 1,825 mg/kg, 0,200 a aproximadamente 1,800 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 1.700 mg/kg aproximadamente 0,200 a aproximadamente 1,600 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 1.500 mg/kg aproximadamente 0,200 a aproximadamente 1.400 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 1.400 mg/kg aproximadamente 0,200 a aproximadamente 1,200 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 1.100 mg/kg aproximadamente 0,200 a aproximadamente 1,000 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 0,900 mg/kg aproximadamente 0,200 a aproximadamente 0,800 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 0,700 mg/kg aproximadamente 0,200 a aproximadamente 0,600 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 0,500 mg/kg aproximadamente 0,200 a aproximadamente 0,400 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1.825 mg/kg aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1,800 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1.700 mg/kg aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1,600 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1.500 mg/kg aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1.400 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1.400 mg/kg aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1,200 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1.100 mg/kg aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1,000 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 0,900 mg/kg aproximadamente 0,225 a aproximadamente 0,800 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 0,700 mg/kg aproximadamente 0,225 a aproximadamente 0,600 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 0,500 mg/kg aproximadamente 0,225 a aproximadamente 0,400 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1.825 mg/kg aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1,800 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1.700 mg/kg aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1,600 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1.500 mg/kg aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1.400 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1.400 mg/kg aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1,200 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1.100 mg/kg aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1,000 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 0,900 mg/kg aproximadamente 0,250 a aproximadamente 0,800 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 0,700 mg/kg aproximadamente 0,250 a aproximadamente 0,600 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 0,500 mg/kg aproximadamente 0,250 a aproximadamente 0,400 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1.825 mg/kg aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1,800 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1.700 mg/kg aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1,600 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1.500 mg/kg aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1.400 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1.400 mg/kg aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1,200 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1.100 mg/kg aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1,000 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 0,900 mg/kg aproximadamente 0,425 a aproximadamente 0,800 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 0,700 mg/kg aproximadamente 0,425 a aproximadamente 0,600 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 0,500 mg/kg aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1.825 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1.800 mg/kg aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1.700 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1.600 mg/kg aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1.500 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1.400 mg/kg aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1.400 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1.200 mg/kg aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1,100 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1.000 mg/kg aproximadamente 0,450 a aproximadamente 0,900 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 0,800 mg/kg aproximadamente 0,450 a aproximadamente 0,700 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 0,600 mg/kg aproximadamente 0,450 a aproximadamente 0,500 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1.825 mg/kg aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1,800 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1.700 mg/kg aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1,600 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1.500 mg/kg aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1.400 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1.400 mg/kg aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1,200 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1.100 mg/kg aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1,000 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 0,900 mg/kg aproximadamente 0,475 a aproximadamente 0,800 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 0,700 mg/kg aproximadamente 0,475 a aproximadamente 0,600 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 0,500 mg/kg aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1.825 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1.800 mg/kg aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1.700 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1.600 mg/kg aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1.500 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1.400 mg/kg aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1.400 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1.200 mg/kg aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1,100 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1.000 mg/kg aproximadamente 0,875 a aproximadamente 0,900 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,825 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,800 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,700 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,600 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,500 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,400 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,400 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,200 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,100 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,000 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,825 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,800 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,700 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,600 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,500 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,400 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,400 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,200 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,100 mg/kg, o aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,000 mg/kg.
En algunos casos, la dosis del agente de ARNi bicatenario se administra al sujeto como una dosis mensual de aproximadamente 0,200 mg/kg a aproximadamente 0,250 mg/kg; o como una dosis mensual de aproximadamente 0,425 mg/kg a aproximadamente 0,475 mg/kg; o como una dosis mensual de aproximadamente 0,875 mg/kg a aproximadamente 0,925 mg/kg; o como una dosis mensual de aproximadamente 1,775 mg/kg a aproximadamente 1,825 mg/kg.
En un caso, el agente de ARNi bicatenario se administra al sujeto en una dosis mensual de 0,225 mg/kg.
En otro caso, el agente de ARNi bicatenario se administra al sujeto en una dosis mensual de 0,450 mg/kg.
En otro caso, el agente de ARNi bicatenario se administra al sujeto en una dosis mensual de 0,900 mg/kg.
En un caso, el agente de ARNi bicatenario se administra al sujeto en una dosis mensual de 1,800 mg/kg.
En una realización, el agente de ARNi bicatenario se administrará al sujeto por vía subcutánea.
En una realización, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto reduce la actividad de Serpinc1 en el sujeto entre aproximadamente un 70% y aproximadamente un 95%.
En otra realización, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto aumenta los niveles máximos de trombina en el sujeto hasta dentro del rango de los niveles máximos de trombina en un sujeto que no tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1.
En una realización, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto es suficiente para alcanzar niveles máximos de generación de trombina en el sujeto aproximadamente al mismo nivel alcanzado por la administración al sujeto de Factor VIII.
En otra realización, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto es suficiente para alcanzar niveles máximos de generación de trombina superiores a aproximadamente el 40% en el sujeto.
En otra realización más, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto disminuye la tasa de sangrado anual (ABR) del sujeto en aproximadamente un 80 a aproximadamente un 95% en comparación con la ABR histórica mediana a demanda de sujetos que tienen un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1 y a los que no se les administra el agente de ARNi bicatenario.
En una realización, el agente de ARNi bicatenario se debe administrar con una solución amortiguada, tal como una solución amortiguadora que comprende acetato, citrato, prolamina, carbonato o fosfato o cualquier combinación de los mismos. En una realización, la solución amortiguada es solución salina amortiguada con fosfato (PBS).
De acuerdo con el primer aspecto de la invención, el sujeto es un ser humano.
El trastorno puede ser un trastorno hemorrágico, tal como un trastorno hemorrágico adquirido o un trastorno hemorrágico hereditario, por ejemplo, una hemofilia, por ejemplo, hemofilia A o hemofilia B.
En una realización, el sujeto tiene hemofilia A y es un sujeto inhibidor. En otra realización, el sujeto tiene hemofilia B y es un sujeto inhibidor.
En una realización, el agente de ARNi bicatenario se administra al sujeto por vía subcutánea.
En una realización, todos los nucleótidos de la cadena sentido y todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados.
En una realización, los nucleótidos modificados se seleccionan independientemente del grupo que consiste en un nucleótido modificado con 2'-desoxi-2'-fluoro, un nucleótido modificado con 2'-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado con 2'-amino, un nucleótido modificado con 2'-alquilo, un nucleótido morfolino, un fosforamidato y un nucleótido que comprende una base no natural.
La región de complementariedad puede tener al menos 17 nucleótidos de longitud o 19 nucleótidos de longitud. En una realización, la región de complementariedad tiene entre 19 y 21 nucleótidos de longitud y preferiblemente 21 nucleótidos de longitud. En otro caso, la región de complementariedad tiene una longitud de entre 21 y 23 nucleótidos. En una realización, cada cadena no tiene más de 30 nucleótidos de longitud.
Al menos una cadena del agente de ARNi bicatenario puede comprender un saliente 3' de al menos 1 nucleótido o un saliente 3' de al menos 2 nucleótidos, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 nucleótidos. En otros casos, al menos una cadena del agente de ARNi comprende un saliente 5' de al menos 1 nucleótido. En ciertos casos, al menos una cadena comprende un saliente 5' de al menos 2 nucleótidos, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 nucleótidos. En otros casos, tanto el extremo 3' como el 5' de una cadena del agente de ARNi comprenden un saliente de al menos 1 nucleótido.
En ciertas realizaciones, el ligando es una N-acetilgalactosamina (GalNAc). El ligando puede ser uno o más GalNAc unidos al agente de ARNi a través de un enlazador ramificado monovalente, bivalente o trivalente. El ligando se puede conjugar al extremo 3' de la cadena sentido del agente de ARNi bicatenario, al extremo 5' de la cadena sentido del agente de ARNi bicatenario, al extremo 3' de la cadena antisentido del agente de ARNi bicatenario o al extremo 5' de la cadena antisentido del agente de ARNi bicatenario.
Los agentes de ARNi bicatenario pueden comprender una pluralidad, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o 6, de GalNAc, cada uno unido independientemente a una pluralidad de nucleótidos del agente de ARNi bicatenario a través de una pluralidad de enlazadores monovalentes.
En ciertas realizaciones, el ligando es
En una realización, el agente de ARNi se conjuga con el ligando como se muestra en el siguiente esquema.
y, donde X es O o S.
En una realización, X es O.
En una realización, la región de complementariedad consiste en la secuencia de nucleótidos de 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15).
En una realización, el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'- GGUUAACACCAUUUACUUCAA -3' (SEQ ID NO: 16), y una cadena antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'- UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3'<( S e Q>ID NO: 15).
En una realización, la cadena sentido comprende 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO: 13) y la cadena antisentido comprende 5' - usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), donde A, C, G y U son ribosa A, C, G o U; a, c, g y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G o U; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, C, G o U; y s es un enlace fosforotioato.
La presente divulgación también proporciona métodos para prevenir al menos un síntoma en un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1. Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis fija de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 100 mg de un agente de ARNi bicatenario que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido que forman una región bicatenaria, en donde la cadena sentido comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 y la cadena antisentido comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5, en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde el agente de ARNi bicatenario comprende un ligando, por ejemplo, la cadena sentido del agente de ARNi bicatenario está conjugada a un ligando unido en el extremo 3' de la cadena sentido.
La presente divulgación también proporciona métodos para tratar a un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1. Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis fija de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 100 mg de un agente de ARNi bicatenario, en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido y una cadena antisentido que forman una región bicatenaria, en donde la cadena sentido comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 y la cadena antisentido comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5, en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde el agente de ARNi bicatenario comprende un ligando, por ejemplo, la cadena sentido del agente de ARNi bicatenario está conjugada a un ligando unido al extremo 3' de la cadena sentido.
En una realización, todos los nucleótidos de la cadena sentido y todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados.
En otro caso, la cadena sentido y la cadena antisentido comprenden una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de cualquiera de las secuencias enumeradas en cualquiera de las Tablas 2 y 3.
En algunos casos, los nucleótidos modificados se seleccionan independientemente del grupo que consiste en un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, un nucleótido modificado con 2'-fluoro, un nucleótido que comprende un grupo 5'-fosforotioato, y un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo o un grupo bisdecilamida del ácido dodecanoico. En otros casos, el nucleótido modificado se selecciona del grupo que consiste en un nucleótido modificado con 2'-desoxi-2'-fluoro, un nucleótido modificado con 2'-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido desbloqueado, un nucleótido conformacionalmente restringido, un nucleótido de etilo restringido, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado con 2'-amino, un nucleótido modificado con 2'-alquilo, un nucleótido modificado con 2'-O-alilo, un nucleótido modificado con 2'-C-alilo, un nucleótido modificado con 2'-hidroxilo, un nucleótido morfolino, un fosforamidato y un nucleótido que comprende una base no natural.
En otra realización del agente de ARNi bicatenario, al menos una cadena comprende un saliente 3' de al menos 1 nucleótido. En otra realización, al menos una hebra comprende un saliente 3' de al menos 2 nucleótidos, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 nucleótidos. En otros casos, al menos una cadena del agente de ARNi comprende un saliente 5' de al menos 1 nucleótido. En ciertos casos, al menos una cadena comprende un saliente 5' de al menos 2 nucleótidos, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 nucleótidos. En otros casos, tanto el extremo 3' como el 5' de una cadena del agente de ARNi comprenden un saliente de al menos 1 nucleótido.
La presente divulgación también proporciona métodos para prevenir al menos un síntoma en un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1. Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis fija de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 100 mg de un agente de ARNi bicatenario, en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido complementaria a una cadena antisentido, en donde la cadena antisentido comprende una región complementaria a parte de un ARNm que codifica Serpinc1, en donde cada cadena tiene una longitud de aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos, en donde el agente de ARNi bicatenario está representado por la fórmula (IIIe):
sentido: 5' -N<a>-Y Y Y - N<a>- 3<'>
antisentido: (II Ie)
en la que:
n<p>' es un saliente de 2 nucleótidos y cada nucleótido dentro de n<p>' está unido a un nucleótido vecino a través de un enlace fosforotioato;
cada N<a>y N<a>' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende de 0 a 25 nucleótidos que están modificados o no modificados o combinaciones de los mismos, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de forma diferente;
YYY e Y'Y'Y' representan cada uno independientemente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, y en donde las modificaciones son modificaciones de 2'-O-metilo o 2'-fluoro;
en donde la cadena sentido y la cadena antisentido comprenden cada una independientemente dos enlaces fosforotioato en el extremo 5'; y
en donde la cadena sentido está conjugada con al menos un ligando, en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unidos a través de un enlazador ramificado monovalente, bivalente o trivalente,
evitando así al menos un síntoma en el sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1.
La presente divulgación también proporciona métodos para tratar a un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1. Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis fija de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 100 mg de un agente de ARNi bicatenario, en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido complementaria a una cadena antisentido, en donde la cadena antisentido comprende una región complementaria a parte de un ARNm que codifica Serpinc1, en donde cada cadena tiene una longitud de aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos, en donde el agente de ARNi bicatenario está representado por la fórmula (IIIe):
en la que:
n<p>' es un saliente de 2 nucleótidos y cada nucleótido dentro de n<p>' está unido a un nucleótido vecino a través de un enlace fosforotioato;
cada N<a>y N<a>' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende de 0 a 25 nucleótidos que están modificados o no modificados o combinaciones de los mismos, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de forma diferente;
YYY e Y'Y'Y' representan cada uno independientemente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, y en donde las modificaciones son modificaciones de 2'-O-metilo o 2'-fluoro;
en donde la cadena sentido y la cadena antisentido comprenden cada una independientemente dos enlaces fosforotioato en el extremo 5'; y
en donde la cadena sentido está conjugada con al menos un ligando, en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unidos a través de un enlazador ramificado monovalente, bivalente o trivalente,
evitando así al menos un síntoma en el sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1.
En un caso, el agente de ARNi bicatenario se administra al sujeto en una dosis única o en dos o más dosis, por ejemplo, en 3, 4, 5 o 6 dosis.
En un caso, el agente de ARNi bicatenario se administra al sujeto una vez al mes, una vez cada cinco semanas, una vez cada seis semanas, una vez cada siete semanas, una vez cada 2 meses, una vez al trimestre o según sea necesario.
El agente de ARNi bicatenario se puede administrar al sujeto, por ejemplo, como una dosis fija de entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 100 mg, por ejemplo, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 95 mg, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 90 mg, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 85 mg, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 80 mg, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 75 mg, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 70 mg, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 65 mg, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 60 mg, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 50 mg, entre aproximadamente 50 mg y aproximadamente 100 mg, entre aproximadamente 50 mg y aproximadamente 95 mg, entre aproximadamente 50 mg y aproximadamente 90 mg, entre aproximadamente 50 mg y aproximadamente 85 mg, entre aproximadamente 50 mg y aproximadamente 80 mg, entre aproximadamente 30 mg y aproximadamente 100 mg, entre aproximadamente 30 mg y aproximadamente 90 mg, entre aproximadamente 30 mg y aproximadamente 80 mg, entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 100 mg, entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 90 mg, entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 80 mg, entre aproximadamente 60 mg y aproximadamente 100 mg, entre aproximadamente 60 mg y aproximadamente 90 mg, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 55 mg, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 65 mg, entre aproximadamente 30 mg y aproximadamente 95 mg, entre aproximadamente 30 mg y aproximadamente 85 mg, entre aproximadamente 30 mg y aproximadamente 75 mg, entre aproximadamente 30 mg y aproximadamente 65 mg, entre aproximadamente 30 mg y aproximadamente 55 mg, entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 95 mg, entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 85 mg, entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 75 mg, entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 65 mg, entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 55 mg, o entre aproximadamente 45 mg y aproximadamente 95 mg, por ejemplo, como dosis fija durante uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho meses o más.
En algunos casos, el agente de ARNi bicatenario se puede administrar al sujeto como una dosis fija de aproximadamente 25 mg, aproximadamente 30 mg, aproximadamente 35 mg, aproximadamente 40 mg, aproximadamente 45 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 55 mg, aproximadamente 60 mg, aproximadamente 65 mg, aproximadamente 70 mg, aproximadamente 75 mg, aproximadamente 80 mg, aproximadamente 85 mg, aproximadamente 90 mg, aproximadamente 95 mg, o aproximadamente 100 mg.
El sujeto puede ser un ser humano, tal como un ser humano que padece un trastorno hemorrágico, tal como un trastorno hemorrágico adquirido o un trastorno hemorrágico hereditario, por ejemplo, una hemofilia, por ejemplo, hemofilia A o hemofilia B.
En una realización, el sujeto tiene hemofilia A y es un sujeto inhibidor. En otra realización, el sujeto tiene hemofilia B y es un sujeto inhibidor.
En un caso, la administración del agente de ARNi bicatenario al sujeto provoca un aumento en la coagulación sanguínea y/o una disminución en la acumulación de la proteína Serpinc1.
En un caso, los métodos comprenden además la medición de los niveles de trombina en el sujeto.
El agente ARNi bicatenario se puede administrar por vía subcutánea o intravenosa.
En un caso, sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido del agente de ARNi comprenden una modificación seleccionada del grupo que consiste en una modificación de 2'-O-metilo y una modificación de 2'-fluoro. En una realización, todos los nucleótidos de la cadena sentido y todos los nucleótidos de la cadena antisentido de la cadena del agente de ARNi son nucleótidos modificados. En un caso, el motivo YYY aparece en o cerca del sitio de escisión de la cadena sentido.
En un caso, el motivo Y'Y'Y' aparece en las posiciones 11, 12 y 13 de la cadena antisentido desde el extremo 5'. La región bicatenaria puede tener una longitud de 15 a 30 pares de nucleótidos, de 17 a 23 pares de nucleótidos, de 17 a 25 pares de nucleótidos, de 23 a 27 pares de nucleótidos, de 19 a 21 pares de nucleótidos o de 21 a 23 pares de nucleótidos.
Cada cadena puede tener entre 15 y 30 nucleótidos, o entre 19 y 30 nucleótidos.
En un caso, la cadena sentido tiene un total de 21 nucleótidos y la cadena antisentido tiene un total de 23 nucleótidos. En una realización, el ligando es
De acuerdo con la invención, el ligando se une al extremo 3' de la cadena sentido.
En una realización, el agente de ARNi se conjuga con el ligando como se muestra en el siguiente esquema.
donde X es O o S.
En un caso, el par de bases en la posición 1 del extremo 5' de la cadena antisentido del dúplex es un par de bases AU.
En un caso, el agente de ARNi es AD-57213 ((Sentido (5' a 3'):
GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf (SEQ ID NO: 13); Antisentido (5' a 3'): usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg (SEQ ID NO:14), donde A, C, G y U son ribosa A, C, G o U; a, c, g y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G o U; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, C, G o U; y s es un enlace fosforotioato).
En una realización, el agente se administrará como una composición farmacéutica. En una realización, el agente de ARNi se debe administrar en una solución no amortiguada, tal como solución salina o agua.
En otra realización, el ARNpi se debe administrar con una solución amortiguada, tal como una solución amortiguada que comprende acetato, citrato, prolamina, carbonato o fosfato o cualquier combinación de los mismos. En una realización, la solución amortiguada es solución salina amortiguada con fosfato (PBS).
En un caso, la presente divulgación proporciona métodos para prevenir al menos un síntoma en un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1. Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis fija de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 100 mg de un agente de ácido ribonucleico (ARNi) bicatenario, en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, comprendiendo la cadena antisentido una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de 5' -UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde el agente de ARNi bicatenario comprende un ligando, por ejemplo, la cadena sentido del agente de ARNi bicatenario está conjugada a un ligando unido en el extremo 3' de la cadena sentido.
La presente divulgación también proporciona métodos para tratar a un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1. Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis fija de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 100 mg de un agente de ácido ribonucleico (ARNi) bicatenario, en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, comprendiendo la cadena antisentido una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde el agente de ARNi bicatenario comprende un ligando, por ejemplo, la cadena sentido del agente de ARNi bicatenario está conjugada a un ligando unido en el extremo 3' de la cadena sentido.
El agente de ARNi bicatenario se puede administrar al sujeto en dos o más dosis.
En algunos casos, el agente de ARNi bicatenario se debe administrar al sujeto una vez al mes, una vez cada cinco semanas, una vez cada seis semanas, una vez cada siete semanas, una vez cada 2 meses, una vez al trimestre o según sea necesario.
En una realización, el agente de ARNi bicatenario se administrará al sujeto una vez al mes. En otra realización, el agente de ARNi bicatenario se administrará al sujeto una vez cada seis semanas. En una realización, el agente de ARNi bicatenario se administrará al sujeto una vez cada 2 meses. En otra realización más, el agente de ARNi bicatenario se debe administrar al sujeto una vez por trimestre.
El agente de ARNi bicatenario se puede administrar al sujeto, por ejemplo, como una dosis fija de entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 100 mg, por ejemplo, entre aproximadamente 25 mg a aproximadamente 95 mg, entre aproximadamente 25 mg a aproximadamente 90 mg, entre aproximadamente 25 mg a aproximadamente 85 mg, entre aproximadamente 25 mg a aproximadamente 80 mg, entre aproximadamente 25 mg a aproximadamente 75 mg, entre aproximadamente 25 mg a aproximadamente 70 mg, entre aproximadamente 25 mg a aproximadamente 65 mg, entre aproximadamente 25 mg a aproximadamente 60 mg, entre aproximadamente 25 mg a aproximadamente 50 mg, entre aproximadamente 50 mg a aproximadamente 100 mg, entre aproximadamente 50 mg a aproximadamente 95 mg, entre aproximadamente 50 mg a aproximadamente 90 mg, entre aproximadamente 50 mg a aproximadamente 85 mg, entre aproximadamente 50 mg a aproximadamente 80 mg, entre aproximadamente 30 mg a aproximadamente 100 mg, entre aproximadamente 30 mg a aproximadamente 90 mg, entre aproximadamente 30 mg a aproximadamente 80 mg, entre aproximadamente 40 mg a aproximadamente 100 mg, entre aproximadamente 40 mg a aproximadamente 90 mg, entre aproximadamente 40 mg a aproximadamente 80 mg, entre aproximadamente 60 mg a aproximadamente 100 mg, entre aproximadamente 60 mg a aproximadamente 90 mg, entre aproximadamente 25 mg a aproximadamente 55 mg, entre aproximadamente 25 mg a aproximadamente 65 mg, entre aproximadamente 30 mg a aproximadamente 95 mg, entre aproximadamente 30 mg a aproximadamente 85 mg, entre aproximadamente 30 mg a aproximadamente 75 mg, entre aproximadamente 30 mg a aproximadamente 65 mg, entre aproximadamente 30 mg a aproximadamente 55 mg, entre aproximadamente 40 mg a aproximadamente 95 mg, entre aproximadamente 40 mg a aproximadamente 85 mg, entre aproximadamente 40 mg a aproximadamente 75 mg, entre aproximadamente 40 mg a aproximadamente 65 mg, entre aproximadamente 40 mg a aproximadamente 55 mg, o entre aproximadamente 45 mg a aproximadamente 95 mg.
En algunos casos, el agente de ARNi bicatenario se puede administrar como una dosis fija de aproximadamente 25 mg, aproximadamente 30 mg, aproximadamente 35 mg, aproximadamente 40 mg, aproximadamente 45 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 55 mg, aproximadamente 60 mg, aproximadamente 65 mg, aproximadamente 70 mg, aproximadamente 75 mg, aproximadamente 80 mg, aproximadamente 85 mg, aproximadamente 90 mg, aproximadamente 95 mg o aproximadamente 100 mg.
En algunos casos, el agente de ARNi bicatenario se administra al sujeto como una dosis fija de aproximadamente 25 mg; o como una dosis fija de aproximadamente 50 mg; o como una dosis fija de aproximadamente 80 mg; o como una dosis fija de aproximadamente 100 mg.
En una realización, el agente de ARNi bicatenario se administra al sujeto por vía subcutánea.
En un caso, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto reduce la actividad de Serpinc1 en el sujeto en aproximadamente un 70% a aproximadamente un 95%, en aproximadamente un 70% a aproximadamente un 80%, en aproximadamente un 80% a aproximadamente un 90%, en aproximadamente un 90% a aproximadamente un 95% o en más del 95%.
En otro caso, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto aumenta los niveles máximos de trombina en el sujeto hasta dentro del rango de los niveles máximos de trombina en un sujeto que no tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1.
En un caso, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto es suficiente para alcanzar niveles máximos de generación de trombina en el sujeto aproximadamente al mismo nivel alcanzado mediante la administración al sujeto de Factor VIII.
En otro caso, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto es suficiente para alcanzar niveles máximos de generación de trombina superiores a aproximadamente el 40%, 45%, 50%, 55% o superiores a aproximadamente el 60% en el sujeto.
En otro caso más, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto disminuye la tasa de sangrado anual (ABR) del sujeto en aproximadamente un 80% a aproximadamente un 95%, aproximadamente un 80% a aproximadamente un 85%, aproximadamente un 85% a aproximadamente un 90% o aproximadamente un 90% a aproximadamente un 95%, en comparación con la ABR histórica mediana a demanda de sujetos que tienen un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1 y a los que no se les administra el agente de ARNi bicatenario.
En una realización, el agente de ARNi bicatenario se debe administrar con una solución amortiguada, tal como una solución amortiguada que comprende acetato, citrato, prolamina, carbonato o fosfato o cualquier combinación de los mismos. En una realización, la solución amortiguada es solución salina amortiguada con fosfato (PBS).
En una realización, el sujeto es un ser humano.
El trastorno puede ser un trastorno hemorrágico, tal como un trastorno hemorrágico adquirido o un trastorno hemorrágico hereditario, por ejemplo, una hemofilia, por ejemplo, hemofilia A o hemofilia B.
En una realización, el sujeto tiene hemofilia A y es un sujeto inhibidor. En otra realización, el sujeto tiene hemofilia B y es un sujeto inhibidor.
En una realización, el agente de ARNi bicatenario se administrará al sujeto por vía subcutánea.
En una realización, todos los nucleótidos de la cadena sentido y todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados.
En una realización, los nucleótidos modificados se seleccionan independientemente del grupo que consiste en un nucleótido modificado con 2'-desoxi-2'-fluoro, un nucleótido modificado con 2'-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado con 2'-amino, un nucleótido modificado con 2'-alquilo, un nucleótido morfolino, un fosforamidato y un nucleótido que comprende una base no natural.
La región de complementariedad puede tener al menos 17 nucleótidos de longitud o 19 nucleótidos de longitud. En una realización, la región de complementariedad tiene entre 19 y 21 nucleótidos de longitud. En otro caso, la región de complementariedad tiene una longitud de entre 21 y 23 nucleótidos.
En un caso, cada hebra no tiene más de 30 nucleótidos de longitud.
Al menos una cadena del agente de ARNi bicatenario puede comprender un saliente 3' de al menos 1 nucleótido o un saliente 3' de al menos 2 nucleótidos, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 nucleótidos. En otros casos, al menos una cadena del agente de ARNi comprende un saliente 5' de al menos 1 nucleótido. En ciertos casos, al menos una cadena comprende un saliente 5' de al menos 2 nucleótidos, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 nucleótidos. En otros casos, tanto el extremo 3' como el 5' de una cadena del agente de ARNi comprenden un saliente de al menos 1 nucleótido.
En ciertas realizaciones, el ligando es una N-acetilgalactosamina (GalNAc). El ligando puede ser uno o más GalNAc unidos al agente de ARNi a través de un enlazador ramificado monovalente, bivalente o trivalente. El ligando se puede conjugar al extremo 3' de la cadena sentido del agente de ARNi bicatenario, al extremo 5' de la cadena sentido del agente de ARNi bicatenario, al extremo 3' de la cadena antisentido del agente de ARNi bicatenario o al extremo 5' de la cadena antisentido del agente de ARNi bicatenario.
Los agentes de ARNi bicatenario pueden comprender una pluralidad, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o 6, de GalNAc, cada uno unido independientemente a una pluralidad de nucleótidos del agente de ARNi bicatenario a través de una pluralidad de enlazadores monovalentes.
En ciertas realizaciones, el ligando es
En una realización, el agente de ARNi se conjuga con el ligando como se muestra en el siguiente esquema.
y, donde X es O o S.
En una realización, X es O.
En una realización, la región de complementariedad consiste en la secuencia de nucleótidos de 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15).
En una realización, el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'- GGUUAACACCAUUUACUUCAA -3' (SEQ ID NO: 16), y una cadena antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15).
En una realización, la cadena sentido comprende 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO: 13) y la cadena antisentido comprende 5' - usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), donde A, C, G y U son ribosa A, C, G o U; a, c, g y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G o U; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, C, G o U; y s es un enlace fosforotioato.
En una realización, la cadena sentido comprende 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO: 13) y la cadena antisentido comprende 5' - usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), donde A, C, G y U son ribosa A, C, G o U; a, c, g y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G o U; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, C, G o U; y s es un enlace fosforotioato; y donde la cadena sentido está conjugada con el ligando como se muestra en el siguiente esquema.
donde X es O o S.
En una realización, el agente se administrará como una composición farmacéutica. En una realización, el agente de ARNi se debe administrar en una solución no amortiguada, tal como solución salina o agua.
En otra realización, el ARNpi se debe administrar con una solución amortiguada, tal como una solución amortiguada que comprende acetato, citrato, prolamina, carbonato o fosfato o cualquier combinación de los mismos. En una realización, la solución amortiguada es solución salina amortiguada con fosfato (PBS).
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona kits para usos como los reivindicados. Los kits pueden incluir un agente de ARNi de la divulgación, instrucciones de uso y, opcionalmente, medios para administrar el agente de ARNi al sujeto.
La presente divulgación también proporciona métodos para prevenir al menos un síntoma en un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1. Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis fija de aproximadamente 50 mg de un agente de ácido ribonucleico (ARNi) bicatenario, en donde la dosis fija del agente de ARNi bicatenario se administra al sujeto aproximadamente una vez al mes, en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, comprendiendo la cadena antisentido una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido en el extremo 3', previniendo así al menos un síntoma en el sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1.
La presente divulgación también proporciona métodos para tratar a un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1. Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis fija de aproximadamente 50 mg de un agente de ácido ribonucleico bicatenario (ARNi ), en donde la dosis fija del agente de ARNi bicatenario se administra al sujeto aproximadamente una vez al mes, en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, comprendiendo la cadena antisentido una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido al extremo 3', tratando así al sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1.
La presente divulgación también proporciona métodos para prevenir al menos un síntoma en un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1. Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis fija de aproximadamente 80 mg de un agente de ácido ribonucleico (ARNi) bicatenario, en donde la dosis fija del agente de ARNi bicatenario se administra al sujeto aproximadamente una vez al mes, en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, comprendiendo la cadena antisentido una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido en el extremo 3', previniendo así al menos un síntoma en el sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1.
La presente divulgación también proporciona métodos para tratar a un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1. Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis fija de aproximadamente 80 mg de un agente de ácido ribonucleico bicatenario (ARNi ), en donde la dosis fija del agente de ARNi bicatenario se administra al sujeto aproximadamente una vez al mes, en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, comprendiendo la cadena antisentido una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido al extremo 3', tratando así al sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1.
En un caso, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto reduce la actividad de Serpinc1 en el sujeto en aproximadamente un 70% a aproximadamente un 95%, en aproximadamente un 70% a aproximadamente un 80%, en aproximadamente un 80% a aproximadamente un 90%, en aproximadamente un 90% a aproximadamente un 95% o en más del 95%.
En otro caso, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto aumenta los niveles máximos de trombina en el sujeto hasta dentro del rango de los niveles máximos de trombina en un sujeto que no tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1.
En un caso, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto es suficiente para alcanzar niveles máximos de generación de trombina en el sujeto aproximadamente al mismo nivel alcanzado mediante la administración al sujeto de Factor VIII.
En otro caso, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto es suficiente para alcanzar niveles máximos de generación de trombina superiores a aproximadamente el 40%, 45%, 50%, 55% o superiores a aproximadamente el 60% en el sujeto.
En otro caso más, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto disminuye la tasa de sangrado anual (ABR) del sujeto en aproximadamente un 80% a aproximadamente un 95%, aproximadamente un 80% a aproximadamente un 85%, aproximadamente un 85% a aproximadamente un 90% o aproximadamente un 90% a aproximadamente un 95%, en comparación con la ABR histórica mediana a demanda de sujetos que tienen un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1 y a los que no se les administra el agente de ARNi bicatenario.
En una realización, el agente de ARNi bicatenario se debe administrar con una solución amortiguada, tal como una solución amortiguada que comprende acetato, citrato, prolamina, carbonato o fosfato o cualquier combinación de los mismos. En una realización, la solución amortiguada es solución salina amortiguada con fosfato (PBS).
En una realización, el sujeto es un ser humano.
El trastorno puede ser un trastorno hemorrágico, tal como un trastorno hemorrágico adquirido o un trastorno hemorrágico hereditario, por ejemplo, una hemofilia, por ejemplo, hemofilia A o hemofilia B.
En una realización, el sujeto tiene hemofilia A y es un sujeto inhibidor. En otra realización, el sujeto tiene hemofilia B y es un sujeto inhibidor.
En una realización, el agente de ARNi bicatenario se administrará al sujeto por vía subcutánea.
En un caso, el agente de ARNi bicatenario se administra al sujeto de forma crónica.
En una realización, todos los nucleótidos de la cadena sentido y todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados.
En una realización, los nucleótidos modificados se seleccionan independientemente del grupo que consiste en un nucleótido modificado con 2'-desoxi-2'-fluoro, un nucleótido modificado con 2'-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado con 2'-amino, un nucleótido modificado con 2'-alquilo, un nucleótido morfolino, un fosforamidato y un nucleótido que comprende una base no natural.
La región de complementariedad puede tener al menos 17 nucleótidos de longitud o 19 nucleótidos de longitud. En una realización, la región de complementariedad tiene entre 19 y 21 nucleótidos de longitud. En otro caso, la región de complementariedad tiene una longitud de entre 21 y 23 nucleótidos.
En un caso, cada hebra no tiene más de 30 nucleótidos de longitud.
Al menos una cadena del agente de ARNi bicatenario puede comprender un saliente 3' de al menos 1 nucleótido o un saliente 3' de al menos 2 nucleótidos, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 nucleótidos. En otros casos, al menos una cadena del agente de ARNi comprende un saliente 5' de al menos 1 nucleótido. En ciertos casos, al menos una cadena comprende un saliente 5' de al menos 2 nucleótidos, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 nucleótidos. En otros casos, tanto el extremo 3' como el 5' de una cadena del agente de ARNi comprenden un saliente de al menos 1 nucleótido.
En ciertas realizaciones, el ligando es una N-acetilgalactosamina (GalNAc). El ligando puede ser uno o más GalNAc unidos al agente de ARNi a través de un enlazador ramificado monovalente, bivalente o trivalente. El ligando se puede conjugar al extremo 3' de la cadena sentido del agente de ARNi bicatenario, al extremo 5' de la cadena sentido del agente de ARNi bicatenario, al extremo 3' de la cadena antisentido del agente de ARNi bicatenario o al extremo 5' de la cadena antisentido del agente de ARNi bicatenario.
Los agentes de ARNi bicatenario pueden comprender una pluralidad, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o 6, de GalNAc, cada uno unido independientemente a una pluralidad de nucleótidos del agente de ARNi bicatenario a través de una pluralidad de enlazadores monovalentes.
En ciertas realizaciones, el ligando es
En una realización, el agente de ARNi se conjuga con el ligando como se muestra en el siguiente esquema.
y, donde X es O o S.
En una realización, X es O.
En una realización, la región de complementariedad consiste en la secuencia de nucleótidos de 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15).
En una realización, el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'- GGUUAACACCAUUUACUUCAA -3' (SEQ ID NO: 16), y una cadena antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'- UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (S<e>Q ID NO: 15).
En una realización, la cadena sentido comprende 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO: 13) y la cadena antisentido comprende 5' - usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), donde A, C, G y U son ribosa A, C, G o U; a, c, g y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G o U; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, C, G o U; y s es un enlace fosforotioato.
En una realización, la cadena sentido comprende 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO: 13) y la cadena antisentido comprende 5' - usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), donde A, C, G y U son ribosa A, C, G o U; a, c, g y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G o U; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, C, G o U; y s es un enlace fosforotioato; y donde la cadena sentido está conjugada con el ligando como se muestra en el siguiente esquema.
, donde X es O o S.
En una realización, el agente se administrará como una composición farmacéutica. En una realización, el agente de ARNi se debe administrar en una solución no amortiguada, tal como solución salina o agua.
En otra realización, el ARNpi se debe administrar con una solución amortiguada, tal como una solución amortiguada que comprende acetato, citrato, prolamina, carbonato o fosfato o cualquier combinación de los mismos. En una realización, la solución amortiguada es solución salina amortiguada con fosfato (PBS).
La presente divulgación también proporciona kits para realizar los métodos de la divulgación. Los kits pueden incluir un agente de ARNi de la divulgación, instrucciones de uso y, opcionalmente, medios para administrar el agente de ARNi al sujeto.
La presente divulgación también proporciona métodos para prevenir al menos un síntoma en un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1. Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis fija de aproximadamente 50 mg de un agente de ácido ribonucleico bicatenario (ARNi), en donde la dosis fija del agente de ARNi bicatenario se administra al sujeto aproximadamente una vez al mes, en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'-GGUUAACACCAUUUACUUCAA -3' (SEQ ID NO: 16), y una cadena antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido en el extremo 3', previniendo así al menos un síntoma en el sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de la reducción en la expresión de Serpinc1.
La presente divulgación también proporciona métodos para tratar a un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1. Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis fija de aproximadamente 50 mg de un agente de ácido ribonucleico (ARNi) bicatenario, en donde la dosis fija del agente de ARNi bicatenario se administra al sujeto aproximadamente una vez al mes, en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'- GGUUAACACCAUUUACUUCAA -3' (SEQ ID NO: 16), y una cadena antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido en el extremo 3', tratando así al sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de la reducción en la expresión de Serpinc1.
La presente divulgación también proporciona métodos para prevenir al menos un síntoma en un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1. Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis fija de aproximadamente 80 mg de un agente de ácido ribonucleico bicatenario (ARNi), en donde la dosis fija del agente de ARNi bicatenario se administra al sujeto aproximadamente una vez al mes, en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'-GGUUAACACCAUUUACUUCAA -3' (SEQ ID NO: 16), y una cadena antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido en el extremo 3', previniendo así al menos un síntoma en el sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de la reducción en la expresión de Serpinc1.
La presente divulgación también proporciona métodos para tratar a un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1. Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis fija de aproximadamente 80 mg de un agente de ácido ribonucleico (ARNi) bicatenario, en donde la dosis fija del agente de ARNi bicatenario se administra al sujeto aproximadamente una vez al mes, en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'- GGUUAACACCAUUUACUUCAA -3' (SEQ ID NO: 16), y una cadena antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido en el extremo 3', tratando así al sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de la reducción en la expresión de Serpinc1.
En un caso, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto reduce la actividad de Serpinc1 en el sujeto en aproximadamente un 70% a aproximadamente un 95%, en aproximadamente un 70% a aproximadamente un 80%, en aproximadamente un 80% a aproximadamente un 90%, en aproximadamente un 90% a aproximadamente un 95% o en más del 95%.
En otro caso, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto aumenta los niveles máximos de trombina en el sujeto hasta dentro del rango de los niveles máximos de trombina en un sujeto que no tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1.
En un caso, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto es suficiente para alcanzar niveles máximos de generación de trombina en el sujeto aproximadamente al mismo nivel alcanzado mediante la administración al sujeto de Factor VIII.
En otro caso, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto es suficiente para alcanzar niveles máximos de generación de trombina superiores a aproximadamente el 40%, 45%, 50%, 55% o superiores a aproximadamente el 60% en el sujeto.
En otro caso más, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto disminuye la tasa de sangrado anual (ABR) del sujeto en aproximadamente un 80% a aproximadamente un 95%, aproximadamente un 80% a aproximadamente un 85%, aproximadamente un 85% a aproximadamente un 90% o aproximadamente un 90% a aproximadamente un 95%, en comparación con la ABR histórica mediana a demanda de sujetos que tienen un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1 y a los que no se les administra el agente de ARNi bicatenario.
En una realización, el agente de ARNi bicatenario se debe administrar con una solución amortiguada, tal como una solución amortiguada que comprende acetato, citrato, prolamina, carbonato o fosfato o cualquier combinación de los mismos. En una realización, la solución amortiguada es solución salina amortiguada con fosfato (PBS).
En una realización, el sujeto es un ser humano.
El trastorno puede ser un trastorno hemorrágico, tal como un trastorno hemorrágico adquirido o un trastorno hemorrágico hereditario, por ejemplo, una hemofilia, por ejemplo, hemofilia A o hemofilia B.
En una realización, el sujeto tiene hemofilia A y es un sujeto inhibidor. En otra realización, el sujeto tiene hemofilia B y es un sujeto inhibidor.
En una realización, el agente de ARNi bicatenario se administrará al sujeto por vía subcutánea.
En un caso, el agente de ARNi bicatenario se administra al sujeto de forma crónica.
En una realización, todos los nucleótidos de la cadena sentido y todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados.
En una realización, los nucleótidos modificados se seleccionan independientemente del grupo que consiste en un nucleótido modificado con 2'-desoxi-2'-fluoro, un nucleótido modificado con 2'-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado con 2'-amino, un nucleótido modificado con 2'-alquilo, un nucleótido morfolino, un fosforamidato y un nucleótido que comprende una base no natural.
En un caso, cada hebra no tiene más de 30 nucleótidos de longitud.
Al menos una cadena del agente de ARNi bicatenario puede comprender un saliente 3' de al menos 1 nucleótido o un saliente 3' de al menos 2 nucleótidos, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 nucleótidos. En otros casos, al menos una cadena del agente de ARNi comprende un saliente 5' de al menos 1 nucleótido. En ciertos casos, al menos una cadena comprende un saliente 5' de al menos 2 nucleótidos, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 nucleótidos. En otros casos, tanto el extremo 3' como el 5' de una cadena del agente de ARNi comprenden un saliente de al menos 1 nucleótido.
En ciertas realizaciones, el ligando es una N-acetilgalactosamina (GalNAc). El ligando puede ser uno o más GalNAc unidos al agente de ARNi a través de un enlazador ramificado monovalente, bivalente o trivalente. El ligando se puede conjugar al extremo 3' de la cadena sentido del agente de ARNi bicatenario, al extremo 5' de la cadena sentido del agente de ARNi bicatenario, al extremo 3' de la cadena antisentido del agente de ARNi bicatenario o al extremo 5' de la cadena antisentido del agente de ARNi bicatenario.
Los agentes de ARNi bicatenario pueden comprender una pluralidad, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o 6, de GalNAc, cada uno unido independientemente a una pluralidad de nucleótidos del agente de ARNi bicatenario a través de una pluralidad de enlazadores monovalentes.
En ciertas realizaciones, el ligando es
En una realización, el agente de ARNi se conjuga con el ligando como se muestra en el siguiente esquema.
y, donde X es O o S.
En una realización, X es O.
En una realización, la cadena sentido comprende 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO: 13) y la cadena antisentido comprende 5' - usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), donde A, C, G y U son ribosa A, C, G o U; a, c, g y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G o U; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, C, G o U; y s es un enlace fosforotioato.
En una realización, la cadena sentido comprende 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO: 13) y la cadena antisentido comprende 5' - usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), donde A, C, G y U son ribosa A, C, G o U; a, c, g y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G o U; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, C, G o U; y s es un enlace fosforotioato; y donde la cadena sentido está conjugada con el ligando como se muestra en el siguiente esquema.
, donde X es O o S.
En otra realización, el ARNpi se debe administrar con una solución amortiguadora, tal como una solución amortiguadora que comprende acetato, citrato, prolamina, carbonato o fosfato o cualquier combinación de los mismos. En una realización, la solución amortiguada es solución salina amortiguada con fosfato (PBS).
La presente divulgación también proporciona kits para realizar los métodos de la divulgación. Los kits pueden incluir un agente de ARNi de la divulgación, instrucciones de uso y, opcionalmente, medios para administrar el agente de ARNi al sujeto.
La presente divulgación también proporciona métodos para prevenir al menos un síntoma en un sujeto que tiene hemofilia, por ejemplo, hemofilia A (con o sin inhibidores) o hemofilia B (con o sin inhibidores). Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis fija de aproximadamente 50 mg de un agente de ácido ribonucleico (ARNi) bicatenario, en donde la dosis fija del agente de ARNi bicatenario se administra al sujeto aproximadamente una vez al mes, en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'- GGUUAACACCAUUUACUUCAA -3'<( S e Q>ID NO: 16), y una cadena antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido en el extremo 3', previniendo así al menos un síntoma en el sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de la reducción en la expresión de Serpinc1.
La presente divulgación también proporciona métodos para tratar a un sujeto que tiene hemofilia, por ejemplo, hemofilia A (con o sin inhibidores) o hemofilia B (con o sin inhibidores). Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis fija de aproximadamente 50 mg de un agente de ácido ribonucleico (ARNi) bicatenario, en donde la dosis fija del agente de ARNi bicatenario se administra al sujeto aproximadamente una vez al mes, en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'-GGUUAACACCAUUUACUUCAA -3' (SEQ ID NO: 16), y una cadena antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido en el extremo 3', tratando así al sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de la reducción en la expresión de Serpinc1.
La presente divulgación también proporciona métodos para prevenir al menos un síntoma en un sujeto que tiene hemofilia, por ejemplo, hemofilia A (con o sin inhibidores) o hemofilia B (con o sin inhibidores). Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis fija de aproximadamente 80 mg de un agente de ácido ribonucleico (ARNi) bicatenario, en donde la dosis fija del agente de ARNi bicatenario se administra al sujeto aproximadamente una vez al mes, en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'- GGUUAACACCAUUUACUUCAA -3'<( S e Q>ID NO: 16), y una cadena antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido en el extremo 3', previniendo así al menos un síntoma en el sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de la reducción en la expresión de Serpinc1.
La presente invención también proporciona métodos para tratar a un sujeto que tiene hemofilia, por ejemplo, hemofilia A (con o sin inhibidores) o hemofilia B (con o sin inhibidores). Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis fija de aproximadamente 80 mg de un agente de ácido ribonucleico (ARNi) bicatenario, en donde la dosis fija del agente de ARNi bicatenario se administra al sujeto aproximadamente una vez al mes, en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'-GGUUAACACCAUUUACUUCAA -3' (SEQ ID NO: 16), y una cadena antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido en el extremo 3', tratando así al sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de la reducción en la expresión de Serpinc1.
La presente divulgación también proporciona métodos para prevenir al menos un síntoma en un sujeto que tiene hemofilia, por ejemplo, hemofilia A (con o sin inhibidores) o hemofilia B (con o sin inhibidores). Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis fija de aproximadamente 50 mg de un agente de ácido ribonucleico (ARNi) bicatenario, en donde la dosis fija del agente de ARNi bicatenario se administra al sujeto aproximadamente una vez al mes, en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'- GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO: 13) y una cadena antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'- usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), en donde A, C, G y U son ribosa A, C, G o U; a, c, g y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G o U; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, C, G o U; y s es un enlace fosforotioato, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido en el extremo 3', previniendo así al menos un síntoma en el sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1.
La presente divulgación también proporciona métodos para tratar a un sujeto que tiene hemofilia, por ejemplo, hemofilia A (con o sin inhibidores) o hemofilia B (con o sin inhibidores). Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis fija de aproximadamente 50 mg de un agente de ácido ribonucleico (ARNi) bicatenario, en donde la dosis fija del agente de ARNi bicatenario se administra al sujeto aproximadamente una vez al mes, en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO: 13) y una cadena antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), en donde A, C, G y U son ribosa A, C, G o U; a, c, g y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G o U; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, C, G o U; y s es un enlace fosforotioato, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido en el extremo 3', tratando así al sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría con una reducción en la expresión de Serpinc1.
La presente divulgación también proporciona métodos para prevenir al menos un síntoma en un sujeto que tiene hemofilia, por ejemplo, hemofilia A (con o sin inhibidores) o hemofilia B (con o sin inhibidores). Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis fija de aproximadamente 80 mg de un agente de ácido ribonucleico (ARNi) bicatenario, en donde la dosis fija del agente de ARNi bicatenario se administra al sujeto aproximadamente una vez al mes, en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'- GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO: 13) y una cadena antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'- usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), en donde A, C, G y U son ribosa A, C, G o U; a, c, g y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G o U; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, C, G o U; y s es un enlace fosforotioato, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido en el extremo 3', previniendo así al menos un síntoma en el sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1.
La presente divulgación también proporciona métodos para tratar a un sujeto que tiene hemofilia, por ejemplo, hemofilia A (con o sin inhibidores) o hemofilia B (con o sin inhibidores). Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis fija de aproximadamente 80 mg de un agente de ácido ribonucleico (ARNi) bicatenario, en donde la dosis fija del agente de ARNi bicatenario se administra al sujeto aproximadamente una vez al mes, en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO: 13) y una cadena antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), en donde A, C, G y U son ribosa A, C, G o U; a, c, g y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G o U; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, C, G o U; y s es un enlace fosforotioato, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido en el extremo 3', tratando así al sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría con una reducción en la expresión de Serpinc1.
En un caso, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto reduce la actividad de Serpinc1 en el sujeto en aproximadamente un 70% a aproximadamente un 95%, en aproximadamente un 70% a aproximadamente un 80%, en aproximadamente un 80% a aproximadamente un 90%, en aproximadamente un 90% a aproximadamente un 95% o en más del 95%.
En otro caso, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto aumenta los niveles máximos de trombina en el sujeto hasta dentro del rango de los niveles máximos de trombina en un sujeto que no tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1.
En un caso, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto es suficiente para alcanzar niveles máximos de generación de trombina en el sujeto aproximadamente al mismo nivel alcanzado mediante la administración al sujeto de Factor VIII.
En otro caso, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto es suficiente para alcanzar niveles máximos de generación de trombina superiores a aproximadamente el 40%, 45%, 50%, 55% o superiores a aproximadamente el 60% en el sujeto.
En otro caso más, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto disminuye la tasa de sangrado anual (ABR) del sujeto en aproximadamente un 80% a aproximadamente un 95%, aproximadamente un 80% a aproximadamente un 85%, aproximadamente un 85% a aproximadamente un 90% o aproximadamente un 90% a aproximadamente un 95%, en comparación con la ABR histórica mediana a demanda de sujetos que tienen un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1 y a los que no se les administra el agente de ARNi bicatenario.
En una realización, el agente de ARNi bicatenario se debe administrar con una solución amortiguada, tal como una solución amortiguada que comprende acetato, citrato, prolamina, carbonato o fosfato o cualquier combinación de los mismos. En una realización, la solución amortiguada es solución salina amortiguada con fosfato (PBS).
En una realización, el sujeto es un ser humano.
En una realización, el agente de ARNi bicatenario se administrará al sujeto por vía subcutánea.
En una realización, el agente de ARNi bicatenario se administrará al sujeto de forma crónica.
En ciertas realizaciones, el ligando es
En una realización, el agente de ARNi se conjuga con el ligando como se muestra en el siguiente esquema.
y, donde X es O o S.
En una realización, X es O.
En una realización, la cadena sentido comprende 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO: 13) y la cadena antisentido comprende 5' - usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), donde A, C, G y U son ribosa A, C, G o U; a, c, g y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G o U; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, C, G o U; y s es un enlace fosforotioato; y donde la cadena sentido está conjugada con el ligando como se muestra en el siguiente esquema.
, donde X es O o S.
En otra realización, el ARNpi se debe administrar con una solución amortiguada, tal como una solución amortiguada que comprende acetato, citrato, prolamina, carbonato o fosfato o cualquier combinación de los mismos. En una realización, la solución amortiguada es solución salina amortiguada con fosfato (PBS).
La presente divulgación también proporciona kits para realizar los métodos de la divulgación. Los kits pueden incluir un agente de ARNi de la divulgación, instrucciones de uso y, opcionalmente, medios para administrar el agente de ARNi al sujeto.
La presente divulgación también proporciona métodos para prevenir al menos un síntoma en un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1. Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis fija de aproximadamente 40 mg a aproximadamente 90 mg de un agente de ácido ribonucleico (ARNi) bicatenario, en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, comprendiendo la cadena antisentido una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de 5' -UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde el agente de ARNi bicatenario comprende un ligando, por ejemplo, la cadena sentido del agente de ARNi bicatenario está conjugada a un ligando unido en el extremo 3' de la cadena sentido.
La presente divulgación también proporciona métodos para tratar a un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1. Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis fija de aproximadamente 40 mg a aproximadamente 90 mg de un agente de ácido ribonucleico (ARNi) bicatenario, en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, comprendiendo la cadena antisentido una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde el agente de ARNi bicatenario comprende un ligando, por ejemplo, la cadena sentido del agente de ARNi bicatenario está conjugada a un ligando unido en el extremo 3' de la cadena sentido.
El agente de ARNi bicatenario se puede administrar al sujeto en dos o más dosis.
En algunos casos, el agente de ARNi bicatenario se administra al sujeto una vez al mes, una vez cada cinco semanas, una vez cada seis semanas, una vez cada siete semanas, una vez cada 2 meses, una vez al trimestre o según sea necesario.
En una realización, el agente de ARNi bicatenario se administrará al sujeto una vez al mes. En otra realización, el agente de ARNi bicatenario se administrará al sujeto una vez cada seis semanas. En una realización, el agente de ARNi bicatenario se administrará al sujeto una vez cada 2 meses. En otra realización más, el agente de ARNi bicatenario se debe administrar al sujeto una vez por trimestre.
El agente de ARNi bicatenario se puede administrar al sujeto como, por ejemplo, una dosis fija de entre aproximadamente 50 mg y aproximadamente 90 mg, entre aproximadamente 50 mg y aproximadamente 85 mg, entre aproximadamente 50 mg y aproximadamente 80 mg, entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 80 mg, entre aproximadamente 60 mg y aproximadamente 90 mg, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 55 mg, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 65 mg, entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 85 mg, entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 75 mg, entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 65 mg, o entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 55 mg.
En algunos casos, el agente de ARNi bicatenario se puede administrar como una dosis fija de aproximadamente 40 mg, aproximadamente 45 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 55 mg, aproximadamente 60 mg, aproximadamente 65 mg, aproximadamente 70 mg, aproximadamente 75 mg, aproximadamente 80 mg, aproximadamente 85 mg, o aproximadamente 90 mg.
En algunos casos, el agente de ARNi bicatenario se administra al sujeto como una dosis fija de aproximadamente 40 mg; o como una dosis fija de aproximadamente 50 mg; o como una dosis fija de aproximadamente 80 mg; o como una dosis fija de aproximadamente 90 mg.
En una realización, el agente de ARNi bicatenario se administrará al sujeto por vía subcutánea.
En una realización, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto reduce la actividad de Serpinc1 en el sujeto entre aproximadamente un 70% y aproximadamente un 95%.
En otra realización, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto aumenta los niveles máximos de trombina en el sujeto hasta dentro del rango de los niveles máximos de trombina en un sujeto que no tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1.
En una realización, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto es suficiente para alcanzar niveles máximos de generación de trombina en el sujeto aproximadamente al mismo nivel alcanzado por la administración al sujeto de Factor VIII.
En otra realización, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto es suficiente para alcanzar niveles máximos de generación de trombina superiores a aproximadamente el 40% en el sujeto.
En otra realización más, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto disminuye la tasa de sangrado anual (ABR) del sujeto en aproximadamente un 80 a aproximadamente un 95% en comparación con la ABR histórica mediana a demanda de sujetos que tienen un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1 y a los que no se les administra el agente de ARNi bicatenario.
En una realización, el agente de ARNi bicatenario se debe administrar con una solución amortiguada, tal como una solución amortiguada que comprende acetato, citrato, prolamina, carbonato o fosfato o cualquier combinación de los mismos. En una realización, la solución amortiguada es solución salina amortiguada con fosfato (PBS).
En una realización, el sujeto es un ser humano.
El trastorno puede ser un trastorno hemorrágico, tal como un trastorno hemorrágico adquirido o un trastorno hemorrágico hereditario, por ejemplo, una hemofilia, por ejemplo, hemofilia A o hemofilia B.
En una realización, el sujeto tiene hemofilia A y es un sujeto inhibidor. En otra realización, el sujeto tiene hemofilia B y es un sujeto inhibidor.
En una realización, el agente de ARNi bicatenario se administrará al sujeto por vía subcutánea.
En una realización, todos los nucleótidos de la cadena sentido y todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados.
En una realización, los nucleótidos modificados se seleccionan independientemente del grupo que consiste en un nucleótido modificado con 2'-desoxi-2'-fluoro, un nucleótido modificado con 2'-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado con 2'-amino, un nucleótido modificado con 2'-alquilo, un nucleótido morfolino, un fosforamidato y un nucleótido que comprende una base no natural.
La región de complementariedad puede tener al menos 17 nucleótidos de longitud o 19 nucleótidos de longitud. En una realización, la región de complementariedad tiene entre 19 y 21 nucleótidos de longitud. En otro caso, la región de complementariedad tiene una longitud de entre 21 y 23 nucleótidos.
En un caso, cada hebra no tiene más de 30 nucleótidos de longitud.
Al menos una cadena del agente de ARNi bicatenario puede comprender un saliente 3' de al menos 1 nucleótido o un saliente 3' de al menos 2 nucleótidos, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 nucleótidos. En otros casos, al menos una cadena del agente de ARNi comprende un saliente 5' de al menos 1 nucleótido. En ciertos casos, al menos una cadena comprende un saliente 5' de al menos 2 nucleótidos, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 nucleótidos. En otros casos, tanto el extremo 3' como el 5' de una cadena del agente de ARNi comprenden un saliente de al menos 1 nucleótido.
En ciertas realizaciones, el ligando es una N-acetilgalactosamina (GalNAc). El ligando puede ser uno o más GalNAc unidos al agente de ARNi a través de un enlazador ramificado monovalente, bivalente o trivalente. El ligando se puede conjugar al extremo 3' de la cadena sentido del agente de ARNi bicatenario, al extremo 5' de la cadena sentido del agente de ARNi bicatenario, al extremo 3' de la cadena antisentido del agente de ARNi bicatenario o al extremo 5' de la cadena antisentido del agente de ARNi bicatenario.
Los agentes de ARNi bicatenario pueden comprender una pluralidad, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o 6, de GalNAc, cada uno unido independientemente a una pluralidad de nucleótidos del agente de ARNi bicatenario a través de una pluralidad de enlazadores monovalentes.
En ciertas realizaciones, el ligando es
En una realización, el agente de ARNi se conjuga con el ligando como se muestra en el siguiente esquema.
y, donde X es O o S.
En una realización, X es O.
En una realización, la región de complementariedad consiste en la secuencia de nucleótidos de 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15).
En una realización, el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'- GGUUAACACCAUUUACUUCAA -3' (SEQ ID NO: 16), y una cadena antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15).
En una realización, la cadena sentido comprende 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO: 13) y la cadena antisentido comprende 5' - usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), donde A, C, G y U son ribosa A, C, G o U; a, c, g y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G o U; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, C, G o U; y s es un enlace fosforotioato.
En una realización, la cadena sentido comprende 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO: 13) y la cadena antisentido comprende 5' - usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), donde A, C, G y U son ribosa A, C, G o U; a, c, g y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G o U; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, C, G o U; y s es un enlace fosforotioato; y donde la cadena sentido está conjugada con el ligando como se muestra en el siguiente esquema.
, donde X es O o S.
En una realización, el agente de ARNi se administrará como una composición farmacéutica. En una realización, el agente de ARNi se debe administrar en una solución no amortiguada, tal como solución salina o agua.
En otra realización, el ARNpi se debe administrar con una solución amortiguada, tal como una solución amortiguada que comprende acetato, citrato, prolamina, carbonato o fosfato o cualquier combinación de los mismos. En una realización, la solución amortiguada es solución salina amortiguada con fosfato (PBS).
La presente divulgación también proporciona kits para realizar los métodos de la invención. Los kits pueden incluir un agente de ARNi de la divulgación, instrucciones de uso y, opcionalmente, medios para administrar el agente de ARNi al sujeto.
La presente divulgación también proporciona métodos para inhibir la expresión de Serpinc1 en un sujeto. Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis fija de aproximadamente 40 mg a aproximadamente 90 mg de un agente de ácido ribonucleico (ARNi) bicatenario, en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, comprendiendo la cadena antisentido una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de 5' -UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde el agente de ARNi bicatenario comprende un ligando, por ejemplo, la cadena sentido del agente de ARNi bicatenario está conjugada a un ligando unido en el extremo 3' de la cadena sentido.
La presente divulgación también proporciona métodos para inhibir la expresión de Serpinc1 en un sujeto. Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis fija de aproximadamente 40 mg a aproximadamente 90 mg de un agente de ácido ribonucleico (ARNi) bicatenario, en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, comprendiendo la cadena antisentido una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de 5' -UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde el agente de ARNi bicatenario comprende un ligando, por ejemplo, la cadena sentido del agente de ARNi bicatenario está conjugada a un ligando unido en el extremo 3' de la cadena sentido.
El agente de ARNi bicatenario se puede administrar al sujeto en dos o más dosis.
En algunos casos, el agente de ARNi bicatenario se debe administrar al sujeto una vez al mes, una vez cada cinco semanas, una vez cada seis semanas, una vez cada siete semanas, una vez cada 2 meses, una vez al trimestre o según sea necesario.
En una realización, el agente de ARNi bicatenario se administrará al sujeto una vez al mes. En otra realización, el agente de ARNi bicatenario se administrará al sujeto una vez cada seis semanas. En una realización, el agente de ARNi bicatenario se administrará al sujeto una vez cada 2 meses. En otra realización más, el agente de ARNi bicatenario se debe administrar al sujeto una vez por trimestre.
El agente de ARNi bicatenario se puede administrar al sujeto como, por ejemplo, una dosis fija de entre aproximadamente 50 mg y aproximadamente 90 mg, entre aproximadamente 50 mg y aproximadamente 85 mg, entre aproximadamente 50 mg y aproximadamente 80 mg, entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 80 mg, entre aproximadamente 60 mg y aproximadamente 90 mg, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 55 mg, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 65 mg, entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 85 mg, entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 75 mg, entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 65 mg, o entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 55 mg.
En algunos casos, el agente de ARNi bicatenario se puede administrar como una dosis fija de aproximadamente 40 mg, aproximadamente 45 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 55 mg, aproximadamente 60 mg, aproximadamente 65 mg, aproximadamente 70 mg, aproximadamente 75 mg, aproximadamente 80 mg, aproximadamente 85 mg, o aproximadamente 90 mg.
En algunos casos, el agente de ARNi bicatenario se administra al sujeto como una dosis fija de aproximadamente 40 mg; o como una dosis fija de aproximadamente 50 mg; o como una dosis fija de aproximadamente 80 mg; o como una dosis fija de aproximadamente 90 mg.
En una realización, el agente de ARNi bicatenario se administrará al sujeto por vía subcutánea.
En una realización, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto reduce la actividad de Serpinc1 en el sujeto entre aproximadamente un 70% y aproximadamente un 95%.
En una realización, el sujeto es un ser humano.
De acuerdo con la invención, el sujeto tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1. El trastorno puede ser un trastorno hemorrágico, tal como un trastorno hemorrágico adquirido o un trastorno hemorrágico hereditario, por ejemplo, una hemofilia, por ejemplo, hemofilia A o hemofilia B.
En una realización, el sujeto tiene hemofilia A y es un sujeto inhibidor. En otra realización, el sujeto tiene hemofilia B y es un sujeto inhibidor.
En otra realización, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto aumenta los niveles máximos de trombina en el sujeto hasta dentro del rango de los niveles máximos de trombina en un sujeto que no tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1.
En una realización, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto es suficiente para alcanzar niveles máximos de generación de trombina en el sujeto aproximadamente al mismo nivel alcanzado por la administración al sujeto de Factor VIII.
En otra realización, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto es suficiente para alcanzar niveles máximos de generación de trombina superiores a aproximadamente el 40% en el sujeto.
En otra realización más, la administración de la dosis del agente de ARNi bicatenario al sujeto disminuye la tasa de sangrado anual (ABR) del sujeto en aproximadamente un 80 a aproximadamente un 95% en comparación con la ABR histórica mediana a demanda de sujetos que tienen un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1 y a los que no se les administra el agente de ARNi bicatenario.
En una realización, el agente de ARNi bicatenario se debe administrar con una solución amortiguada, tal como una solución amortiguada que comprende acetato, citrato, prolamina, carbonato o fosfato o cualquier combinación de los mismos. En una realización, la solución amortiguada es solución salina amortiguada con fosfato (PBS).
En una realización, el agente de ARNi bicatenario se administrará al sujeto por vía subcutánea.
En una realización, todos los nucleótidos de la cadena sentido y todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados.
En una realización, los nucleótidos modificados se seleccionan independientemente del grupo que consiste en un nucleótido modificado con 2'-desoxi-2'-fluoro, un nucleótido modificado con 2'-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado con 2'-amino, un nucleótido modificado con 2'-alquilo, un nucleótido morfolino, un fosforamidato y un nucleótido que comprende una base no natural.
La región de complementariedad puede tener al menos 17 nucleótidos de longitud o 19 nucleótidos de longitud.
En una realización, la región de complementariedad tiene entre 19 y 21 nucleótidos de longitud. En otro caso, la región de complementariedad tiene una longitud de entre 21 y 23 nucleótidos.
En un caso, cada hebra no tiene más de 30 nucleótidos de longitud.
Al menos una cadena del agente de ARNi bicatenario puede comprender un saliente 3' de al menos 1 nucleótido o un saliente 3' de al menos 2 nucleótidos, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 nucleótidos. En otros casos, al menos una cadena del agente de ARNi comprende un saliente 5' de al menos 1 nucleótido. En ciertos casos, al menos una cadena comprende un saliente 5' de al menos 2 nucleótidos, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 nucleótidos. En otros casos, tanto el extremo 3' como el 5' de una cadena del agente de ARNi comprenden un saliente de al menos 1 nucleótido.
En ciertas realizaciones, el ligando es una N-acetilgalactosamina (GalNAc). El ligando puede ser uno o más GalNAc unidos al agente de ARNi a través de un enlazador ramificado monovalente, bivalente o trivalente. El ligando se puede conjugar al extremo 3' de la cadena sentido del agente de ARNi bicatenario, al extremo 5' de la cadena sentido del agente de ARNi bicatenario, al extremo 3' de la cadena antisentido del agente de ARNi bicatenario o al extremo 5' de la cadena antisentido del agente de ARNi bicatenario.
Los agentes de ARNi bicatenario pueden comprender una pluralidad, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o 6, de GalNAc, cada uno unido independientemente a una pluralidad de nucleótidos del agente de ARNi bicatenario a través de una pluralidad de enlazadores monovalentes.
En ciertas realizaciones, el ligando es
En una realización, el agente de ARNi se conjuga con el ligando como se muestra en el siguiente esquema.
y, donde X es O o S.
En una realización, X es O.
En una realización, la región de complementariedad consiste en la secuencia de nucleótidos de 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15).
En una realización, el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'- GGUUAACACCAUUUACUUCAA -3' (SEQ ID NO: 16), y una cadena antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15).
En una realización, la cadena sentido comprende 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO: 13) y la cadena antisentido comprende 5' - usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), donde A, C, G y U son ribosa A, C, G o U; a, c, g y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G o U; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, C, G o U; y s es un enlace fosforotioato.
En una realización, la cadena sentido comprende 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO: 13) y la cadena antisentido comprende 5' - usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), donde A, C, G y U son ribosa A, C, G o U; a, c, g y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G o U; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, C, G o U; y s es un enlace fosforotioato; y donde la cadena sentido está conjugada con el ligando como se muestra en el siguiente esquema.
, donde X es O o S.
En un caso, el agente se administra como una composición farmacéutica. En una realización, el agente de ARNi se debe administrar en una solución no amortiguada, tal como solución salina o agua.
En otro caso, el ARNpi se administra con una solución amortiguada, tal como una solución amortiguadora que comprende acetato, citrato, prolamina, carbonato o fosfato o cualquier combinación de los mismos. En un caso, la solución amortiguadora es solución salina amortiguada con fosfato (PBS).
La presente divulgación también proporciona kits para realizar los métodos de la divulgación. Los kits pueden incluir un agente de ARNi de la divulgación, instrucciones de uso y, opcionalmente, medios para administrar el agente de ARNi al sujeto.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1A es un gráfico que representa los efectos de una dosis subcutánea única de 0,03 mg/kg de AD-57213 sobre los niveles de generación de trombina plasmática en un sujeto humano sano.
La Figura 1B es un gráfico que representa los efectos de una dosis subcutánea única de 0,03 mg/kg de AD-57213 sobre los niveles de generación de trombina plasmática en un sujeto humano sano.
La Figura 1C es un gráfico que representa los efectos de una dosis subcutánea única de 0,03 mg/kg de AD-57213 sobre los niveles de generación de trombina plasmática en un sujeto humano sano.
La Figura 1D es un gráfico que representa los efectos de una dosis subcutánea única de 0,03 mg/kg de AD-57213 sobre los niveles de generación de trombina plasmática en un sujeto humano sano.
La Figura 2A es un gráfico que representa los efectos de una dosis subcutánea única de 0,03 mg/kg de AD-57213 sobre los niveles de proteína AT (Serpinc1) plasmática en un sujeto humano sano.
La Figura 2B es un gráfico que representa los efectos de una dosis subcutánea única de 0,03 mg/kg de AD-57213 sobre los niveles de proteína AT (Serpinc1) plasmática en un sujeto humano sano.
La Figura 3 es un gráfico que representa la asociación entre el porcentaje de apagado de AT (Serpinc1) y el porcentaje de aumento en la generación máxima de trombina en sujetos sanos a los que se les administró una dosis subcutánea única de 0,03 mg/kg de AD-57213.
La Figura 4 es un gráfico que representa el efecto de múltiples dosis de 0,015 mg/kg, 0,045 mg/kg o 0,075 mg/kg de AD-57213 sobre los niveles de proteína AT (Serpinc1) plasmática en sujetos humanos con hemofilia A o B.
La Figura 5A es un gráfico que representa el efecto de múltiples dosis de 0,225 mg/kg, 0,450 mg/kg, 0,900 mg/kg, 1,800 mg/kg u 80 mg de AD-57213 sobre los niveles de proteína AT (Serpinc1) plasmática en sujetos humanos con hemofilia A o B.
La figura 5B es un gráfico que representa el efecto dependiente de la dosis de AD-57213 sobre los niveles de proteína AT (Serpinc1) plasmática en sujetos humanos.
La Figura 6A es un gráfico que representa el efecto de múltiples dosis de 0,015 mg/kg o 0,045 mg/kg de AD-57213 sobre los niveles máximos de trombina en sujetos humanos con hemofilia A o B.
La Figura 6 B es un gráfico que representa el efecto de múltiples dosis de 0,015 mg/kg o 0,045 mg/kg de AD-57213 sobre la generación de trombina como un cambio porcentual en relación con el valor inicial del grupo en sujetos humanos con hemofilia A o B.
La Figura 7 es un gráfico que representa el efecto de múltiples dosis de 0,045 mg/kg de AD-57213 sobre el tiempo de formación del coágulo y el tiempo de coagulación en un sujeto con hemofilia A (sujeto 101 -009).
La Figura 8 es un gráfico que representa la reducción máxima media de AT por dosis equivalente mensual.
La Figura 9 es un gráfico que representa el efecto de múltiples dosis de AD-57213 sobre la generación de trombina por cuartiles reductores de AT.
La Figura 10A es un gráfico que representa la actividad relativa de AT con respecto al porcentaje de generación máxima de trombina logrado con el Factor VIII según se determinó en un sujeto al que se le administraron 225 mcg/kg qM de AD-57213.
La Figura 10B es un gráfico que representa la actividad relativa de AT con respecto al porcentaje de generación máxima de trombina logrado con el Factor VIII según se determinó en un sujeto al que se le administraron 1800 mcg/kg qM de AD-57213.
La Figura 10C es un gráfico que representa la actividad relativa de AT con respecto al porcentaje de generación máxima de trombina logrado con el Factor VIII según se determinó en un sujeto al que se le administraron 80 mg qM de AD-57213.
La Figura 11 es un gráfico que representa el efecto de múltiples dosis de AD-57213 sobre eventos de sangrado según cuartiles reductores de AT.
La Figura 12 es una tabla que muestra los datos de eventos de sangrado de los sujetos inscritos en la Parte C del ensayo clínico de Fase I de AD-57213.
La Figura 13A es un gráfico que muestra la tasa de sangrado anual mediana (ABR) antes del inicio del estudio, en la parte inicial del estudio y durante la parte de observación del estudio para todas las cohortes de dosificación en la Parte C del ensayo clínico de Fase I de AD-57213.
La Figura 13B es un gráfico que muestra la tasa de sangrado anual mediana (ABR) antes del inicio del estudio, en la parte inicial del estudio y durante la parte de observación del estudio para la cohorte mensual de 80 mg (80 mg qM x3) en la Parte C del ensayo clínico de Fase I de AD-57213.
La Figura 14A es un gráfico que representa la actividad relativa de AT con respecto al porcentaje de generación máxima de trombina logrado con el Factor VIII, determinado en un sujeto inhibidor al que se le administró una dosis mensual fija de 50 mg de AD-57213.
La Figura 14B es un gráfico que representa la actividad relativa de AT con respecto al porcentaje de generación máxima de trombina logrado con el Factor VIII, determinado en un sujeto inhibidor al que se le administró una dosis mensual fija de 50 mg de AD-57213.
La Figura 14C es un gráfico que representa la actividad relativa de AT con respecto al porcentaje de generación máxima de trombina logrado con el Factor VIII, determinado en un sujeto inhibidor al que se le administró una dosis mensual fija de 50 mg de AD-57213.
La Figura 14D es un gráfico que representa la actividad relativa de AT con respecto al porcentaje de generación máxima de trombina logrado con el Factor VIII, determinado en un sujeto inhibidor al que se le administró una dosis mensual fija de 50 mg de AD-57213.
La Figura 14E es un gráfico que representa la actividad relativa de AT con respecto al porcentaje de generación máxima de trombina logrado con el Factor VIII, determinado en un sujeto inhibidor al que se le administró una dosis mensual fija de 50 mg de AD-57213.
La Figura 14F es un gráfico que representa la actividad relativa de AT con respecto al porcentaje de generación máxima de trombina logrado con el Factor VIII, determinado en un sujeto inhibidor al que se le administró una dosis mensual fija de 50 mg de AD-57213.
La Figura 15 es un gráfico que representa el efecto de múltiples dosis de 50 mg u 80 mg de AD-57213 sobre la actividad media de AT (Serpinc1) con respecto al valor inicial en sujetos humanos con hemofilia A o B con inhibidores.
La Figura 16 es un gráfico que representa que el efecto reductor de AT de múltiples dosis de 50 mg de AD-57213 se correlaciona con una mayor generación de trombina en un sujeto con hemofilia A.
La Figura 17A es una tabla que muestra los datos de eventos de sangrado de los sujetos inscritos en la Parte D del ensayo clínico de Fase I de AD-57213.
La Figura 17B es un gráfico que muestra la tasa de sangrado anual mediana (ABR) antes del inicio del estudio, en la parte inicial del estudio y durante la parte de observación del estudio para todos los sujetos en la Parte D del ensayo clínico de Fase I de AD-57213.
La Figura 18 es un gráfico que representa el efecto de múltiples dosis de 80 mg de AD-57213 sobre la actividad media de AT (Serpinc1) con respecto al valor inicial en un sujeto humano con hemofilia sin inhibidores en el estudio de extensión de etiqueta abierta de Fase II (OLE) de AD-57213.
La Figura 19A es un gráfico que representa el efecto de múltiples dosis de 50 mg u 80 mg de AD-57213 sobre la actividad media de AT (Serpinc1) con respecto al valor inicial en sujetos humanos con hemofilia A o B sin inhibidores en el estudio de extensión de etiqueta abierta de Fase II (OLE) de AD-57213.
La Figura 19B es un gráfico que representa el efecto de múltiples dosis de 50 mg u 80 mg de AD-57213 sobre la generación máxima de trombina en sujetos humanos con hemofilia A o B sin inhibidores en el estudio de extensión de etiqueta abierta de Fase II (OLE) de AD-57213. La parte sombreada del gráfico representa el rango de niveles máximos de trombina observados en voluntarios humanos sanos (HV) a los que se les administró AD-57213 y con una reducción de AT de menos del 25% en el ensayo de Fase I de AD-57213 descrito en el Ejemplo 1. La línea discontinua que atraviesa el rango de HV representa el nivel máximo mediano de trombina observado en voluntarios humanos sanos (HV) y con una reducción de AT de menos del 25% a los que se les administró AD-57213 en el ensayo de Fase I de AD-57213 descrito en el Ejemplo 1.
La Figura 20A es una tabla que muestra los datos de eventos de sangrado de los sujetos inscritos en el ensayo clínico OLE de Fase II de AD-57213.
La Figura 20B es un gráfico que muestra la tasa de sangrado anual mediana (ABR) antes del inicio del estudio, en la parte inicial del estudio y durante la parte de observación del estudio para todos los sujetos en el ensayo clínico OLE de Fase II de AD-57213.
Descripción detallada de la invención
La presente divulgación se basa, al menos en parte, en el sorprendente descubrimiento de que dosis muy bajas (por ejemplo, dosis al menos aproximadamente 30 veces inferiores a las dosis enseñadas en la técnica) de un agente de ARNi bicatenario unido a GalNAc que comprende modificaciones químicas particulares muestra una potencia excepcional para inhibir la expresión de Serpinc1, así como una duración excepcional de la inhibición de la expresión de Serpinc1. Específicamente, se demuestra aquí que dosis bajas de agentes de ARNi que incluyen un ligando GalNAc en el que sustancialmente todos los nucleótidos son nucleótidos modificados, tal como un agente de ARNi que incluye uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, incluido uno de dichos motivos en o cerca del sitio de escisión de los agentes, seis enlaces fosforotioato y un ligando GalNAc son excepcionalmente eficaces y duraderas para silenciar la actividad del gen Serpinc1.
Por consiguiente, la presente divulgación proporciona métodos para prevenir al menos un síntoma, por ejemplo, sangrado, en un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de la inhibición o reducción de la expresión de un gen Serpinc1, por ejemplo, una enfermedad asociada a Serpinc1, tal como una hemofilia (por ejemplo, hemofilia A o hemofilia B), utilizando composiciones de ARNi que efectúan la escisión mediada por complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) de los transcritos de ARN de un gen Serpinc1. La presente divulgación proporciona además métodos para tratar a un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría al inhibir o reducir la expresión de un gen Serpinc1, por ejemplo, un trastorno hemorrágico, tal como hemofilia (por ejemplo, hemofilia A o hemofilia B), utilizando composiciones de ARNi que efectúan la escisión mediada por complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) de los transcritos de ARN de un gen Serpinc1.
Los agentes de ARNi para su uso en los métodos de la divulgación generalmente incluyen una cadena de ARN (la cadena antisentido) que tiene una región que tiene aproximadamente 30 nucleótidos o menos de longitud, por ejemplo, 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18 28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21,21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, o 21-22 nucleótidos de longitud, cuya región es sustancialmente complementaria a al menos parte de un transcrito de ARNm de un gen Serpinc1.
En otros casos, una o ambas cadenas de los agentes de ARNi bicatenario de la divulgación tienen una longitud de hasta 66 nucleótidos, por ejemplo, 36-66, 26-36, 25-36, 31-60, 22-43, 27-53 nucleótidos de longitud, con una región de al menos 19 nucleótidos contiguos que es sustancialmente complementaria a al menos una parte de un transcrito de ARNm de un gen Serpinc1. En algunos casos, las cadenas sentido y antisentido forman un dúplex de 18 a 30 nucleótidos contiguos.
En algunos casos, los agentes de ARNi para uso en los métodos de la divulgación incluyen una cadena de ARN (la cadena antisentido) que puede tener hasta 66 nucleótidos de longitud, por ejemplo, 36-66, 26-36, 25-36, 31-60, 22 43, 27-53 nucleótidos de longitud, con una región de al menos 19 nucleótidos contiguos que es sustancialmente complementaria a al menos una parte de un transcrito de ARNm de un gen Serpinc1. En algunos casos, dichos agentes de ARNi que tienen cadenas antisentido de mayor longitud pueden incluir una segunda cadena de ARN (la cadena sentido) de 20 a 60 nucleótidos de longitud, en donde las cadenas sentido y antisentido forman un dúplex de 18 a 30 nucleótidos contiguos.
La siguiente descripción detallada revela cómo obtener y utilizar composiciones que contienen ARNi para inhibir la expresión de un gen Serpinc1, así como composiciones, usos y métodos para tratar sujetos que tienen enfermedades y trastornos que se beneficiarían de la inhibición y/o reducción de la expresión de este gen.
I. Definiciones
Para que la presente invención se pueda entender más fácilmente, primero se definen ciertos términos. Además, debe tenerse en cuenta que siempre que se recita un valor o un rango de valores de un parámetro, se pretende que los valores y rangos intermedios a los valores recitados también sean parte de esta invención.
Los artículos "un" y "una" se utilizan aquí para referirse a uno o más de uno (es decir, al menos uno) de los objetos gramaticales del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento, por ejemplo, una pluralidad de elementos.
El término "que incluye" se usa aquí para referirse, y se usa indistintamente, a la frase "que incluye, pero sin limitarse a".
El término "o" se utiliza aquí para significar, y se usa indistintamente con, el término "y/o", a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Como se utiliza en este documento, "Serpinc1" se refiere a un polipéptido particular expresado en una célula. Serpinc1 también se conoce como inhibidor de la serpina peptidasa, ciado C (antitrombina; AT), miembro 1; antitrombina III; AT3; antitrombina; y cofactor de heparina 1. La secuencia de un transcrito de ARNm de Serpinc1 humano se puede encontrar, por ejemplo, en GenBank número de acceso GI:254588059 (NM_000488; SEQ ID NO:1). La secuencia del ARNm de Serpinc1 de rhesus se puede encontrar, por ejemplo, en GenBank número de acceso GI:157167169 (NM_00 1104583; SEQ ID NO:2). La secuencia del ARNm de Serpinc1 de ratón se puede encontrar, por ejemplo, en GenBank Accession No. GI:237874216 (NM_080844; SEQ ID NO:3). La secuencia del ARNm de Serpinc1 de rata se puede encontrar, por ejemplo, en GenBank Accession No. GI:58865629 (NM_001012027; SEQ ID NO:4).
El término "Serpinc1" tal como se utiliza en este documento también se refiere a un polipéptido particular expresado en una célula mediante variaciones naturales en la secuencia de ADN del gen Serpinc1, tal como un polimorfismo de un solo nucleótido en el gen Serpinc1. Se han identificado numerosos SNP dentro del gen Serpinc1 y se pueden encontrar, por ejemplo, en NCBI dbSNP (véase, por ejemplo, www.ncbi.nlm.nih.gov/snp). Se pueden encontrar ejemplos no limitativos de SNP dentro del gen Serpinc1 en los números de acceso dbSNP de NCBI rs677; rs5877; rs5878; rs5879; rs941988; rs941989; rs1799876; rs19637711; rs2008946; y rs2227586.
Como se usa en este documento, un "sujeto" es un animal, tal como un mamífero, incluido un primate (tal como un ser humano, un primate no humano, por ejemplo, un mono y un chimpancé), un no primate (tal como una vaca, un cerdo, un camello, una llama, un caballo, una cabra, un conejo, una oveja, un hámster, un conejillo de indias, un gato, un perro, una rata, un ratón, un caballo y una ballena) o un ave (por ejemplo, un pato o un ganso). En una realización, el sujeto es un ser humano, tal como un ser humano tratado o evaluado por una enfermedad, trastorno o afección que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1; un ser humano en riesgo de padecer una enfermedad, trastorno o afección que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1; un ser humano que tiene una enfermedad, trastorno o afección que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1; y/o un ser humano tratado por una enfermedad, trastorno o afección que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1 como se describe en este documento.
Tal como se utiliza en este documento, los términos "tratar" o " tratamiento" se refieren a un resultado beneficioso o deseado que incluye, pero no se limita a, el alivio o la mejora de uno o más síntomas, la disminución de la extensión del sangrado, el estado estabilizado (es decir, que no empeora) del sangrado, la mejora o paliación del sangrado, ya sea detectable o indetectable. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada en ausencia de tratamiento. En los métodos de la divulgación, el tratamiento incluye el tratamiento a demanda y el control de los episodios de sangrado, el manejo perioperatorio del sangrado y la profilaxis de rutina para reducir la frecuencia de los episodios de sangrado.
El término "inferior" en el contexto del nivel de un Serpinc1 en un sujeto o de un marcador o síntoma de enfermedad se refiere a una disminución estadísticamente significativa de dicho nivel. La disminución puede ser, por ejemplo, de al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 20%, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o más, y preferiblemente hasta un nivel aceptado dentro del rango normal para un individuo sin dicho trastorno.
Como se utiliza en este documento, "prevención" o "prevenir", cuando se usa en referencia a una enfermedad, trastorno o afección de la misma, que se beneficiaría de una reducción en la expresión de un gen Serpinc1, se refiere a una reducción en la probabilidad de que un sujeto desarrolle un síntoma asociado con dicha enfermedad, trastorno o afección, por ejemplo un síntoma tal como un sangrado. La probabilidad de desarrollar un sangrado se reduce, por ejemplo, cuando un individuo que tiene uno o más factores de riesgo de sangrado no desarrolla un sangrado o desarrolla un sangrado con menos gravedad con respecto a una población que tiene los mismos factores de riesgo y no recibe el tratamiento como se describe aquí. La falta de desarrollo de una enfermedad, trastorno o afección, o la reducción en el desarrollo de un síntoma asociado con dicha enfermedad, trastorno o afección (por ejemplo, al menos aproximadamente un 10% en una escala clínicamente aceptada para esa enfermedad o trastorno), o la manifestación tardía de síntomas (por ejemplo, días, semanas, meses o años) se considera prevención eficaz.
Tal como se utiliza en este documento, el término "trastorno hemorrágico" es una enfermedad o trastorno que provoca una coagulación sanguínea deficiente y/o sangrado excesivo. Un trastorno hemorrágico puede ser un trastorno hereditario, tal como hemofilia o la enfermedad de von Willebrand, o un trastorno adquirido, asociado con, por ejemplo, coagulación intravascular diseminada, eclampsia asociada al embarazo, deficiencia de vitamina K, un trastorno autoinmune, enfermedad inflamatoria intestinal, colitis ulcerosa, un trastorno dermatológico (por ejemplo, psoriasis, pénfigo), una enfermedad respiratoria (por ejemplo, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica), una reacción alérgica a medicamentos, por ejemplo, el resultado de medicamentos, tales como aspirina, heparina y warfarina, diabetes, infección aguda por hepatitis B, infección aguda por hepatitis C, una neoplasia maligna o un tumor sólido (por ejemplo, próstata, pulmón, colon, páncreas, estómago, conducto biliar, cabeza y cuello, cuello uterino, mama, melanoma, riñón y/o una neoplasia maligna hematológica). En una realización, un trastorno hemorrágico hereditario es una hemofilia, por ejemplo, hemofilia A o B. En una realización, un sujeto que tiene un trastorno hemorrágico hereditario, por ejemplo, una hemofilia, ha desarrollado inhibidores, por ejemplo, inhibidores de aloanticuerpos, para las terapias de coagulación de reemplazo, y se denomina en el presente documento un "sujeto inhibidor". En una realización, el sujeto inhibidor tiene hemofilia A. En otra realización, el sujeto inhibidor tiene hemofilia B.
"Cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en este documento, pretende incluir la cantidad de un agente de ARNi que, cuando se administra a un sujeto que tiene un trastorno hemorrágico y sangrado, es suficiente para efectuar el tratamiento de la enfermedad (por ejemplo, disminuyendo, mejorando o manteniendo la enfermedad existente o uno o más síntomas de la enfermedad). La "cantidad terapéuticamente efectiva" puede variar dependiendo del agente de ARNi, de cómo se administra el agente, de la enfermedad y su gravedad y los antecedentes, la edad, el peso, los antecedentes familiares, la composición genética, los tipos de tratamientos anteriores o concomitantes, si los hubiera, y otras características individuales del sujeto a tratar.
"Cantidad profilácticamente eficaz", como se usa en este documento, pretende incluir la cantidad de un ARNi que, cuando se administra a un sujeto que tiene un trastorno hemorrágico pero no sangra, por ejemplo, un sujeto que tiene un trastorno hemorrágico y está programado para una cirugía (por ejemplo, tratamiento perioperatorio), es suficiente para prevenir o mejorar la enfermedad o uno o más síntomas de la enfermedad. Mejorar la enfermedad incluye retardar su evolución o reducir la gravedad de enfermedades que se desarrollan posteriormente. La "cantidad profilácticamente eficaz" puede variar dependiendo del ARNi, de cómo se administra el agente, del grado de riesgo de enfermedad y de los antecedentes, la edad, el peso, los antecedentes familiares, la composición genética, los tipos de tratamientos previos o concomitantes, si los hubiera, y otras características individuales del paciente a tratar.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad profilácticamente eficaz" también incluye una cantidad de un agente de ARNi que produce un efecto local o sistémico deseado con una relación beneficio-riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento. El ARNi empleado en los métodos de la presente invención puede administrarse en una cantidad suficiente para producir una relación beneficio-riesgo razonable aplicable a dicho tratamiento.
La frase "farmacéuticamente aceptable" se emplea en este documento para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que, dentro del alcance del criterio médico sólido, son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de sujetos humanos y animales sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.
La frase "vehículo farmacéuticamente aceptable" como se utiliza en este documento significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una carga líquida o sólida, diluyente, excipiente, auxiliar de fabricación (por ejemplo, lubricante, talco, estearato de magnesio, calcio o zinc, o ácido estérico), o material encapsulante de solvente, involucrado en el transporte del compuesto en cuestión desde un órgano o porción del cuerpo a otro órgano o porción del cuerpo. Cada vehículo debe ser “aceptable” en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes de la formulación y no ser perjudicial para el sujeto tratado. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) azúcares, tales como la lactosa, la glucosa y la sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; (3) celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6 ) gelatina; (7) agentes lubricantes, tales como estado de magnesio, lauril sulfato de sodio y talco; (8 ) excipientes, tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; (9) aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; (10 ) glicoles, tal como propilenglicol; (11) polioles, tal como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; (12 ) ésteres, tal como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes amortiguadores, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua libre de pirógenos; (17) solución salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) soluciones de pH amortiguado; (21) poliésteres, policarbonatos y/o polianhídridos; (22) agentes de carga, tales como polipéptidos y aminoácidos; (23) componentes séricos, tales como albúmina sérica, HDL y LDL; y (22) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas.
Como se utiliza en este documento, "secuencia diana" se refiere a una porción contigua de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ARNm formada durante la transcripción de un gen Serpinc1, incluido el ARNm que es un producto del procesamiento del ARN de un producto de transcripción primario. En un caso, la porción diana de la secuencia será al menos lo suficientemente larga para servir como sustrato para la escisión dirigida por ARNi en o cerca de esa porción de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ARNm formada durante la transcripción de un gen Serpinc1.
La secuencia diana puede tener una longitud de entre 9 y 36 nucleótidos, por ejemplo, una longitud de entre 15 y 30 nucleótidos. Por ejemplo, la secuencia diana puede ser de aproximadamente 15-30 nucleótidos, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18 24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21,21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, o 21-22 nucleótidos de longitud. También se contempla que los rangos y longitudes intermedios a los rangos y longitudes mencionados anteriormente sean parte de la divulgación.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "cadena que comprende una secuencia" se refiere a un oligonucleótido que comprende una cadena de nucleótidos que se describe mediante la secuencia a la que se hace referencia utilizando la nomenclatura de nucleótidos estándar.
"G", "C", "A", "T" y "U" generalmente representan un nucleótido que contiene guanina, citosina, adenina, timidina y uracilo como base, respectivamente. Sin embargo, se entenderá que el término "ribonucleótido" o "nucleótido" también puede referirse a un nucleótido modificado, como se detalla más adelante, o un resto de reemplazo sustituto (véase, por ejemplo, la Tabla 1). El experto en la técnica sabe muy bien que la guanina, la citosina, la adenina y el uracilo pueden reemplazarse por otros restos sin alterar sustancialmente las propiedades de apareamiento de bases de un oligonucleótido que comprende un nucleótido que porta dicho resto de reemplazo. Por ejemplo, sin limitación, un nucleótido que comprende inosina como su base puede aparearse con nucleótidos que contienen adenina, citosina o uracilo. Por lo tanto, los nucleótidos que contienen uracilo, guanina o adenina pueden reemplazarse en las secuencias de nucleótidos de ARNbc presentadas en la divulgación por un nucleótido que contenga, por ejemplo, inosina. En otro ejemplo, la adenina y la citosina en cualquier parte del oligonucleótido se pueden reemplazar con guanina y uracilo, respectivamente, para formar un apareamiento de bases GU Wobble con el ARNm diana. Las secuencias que contienen dichos restos de reemplazo son adecuadas para las composiciones y métodos presentados en la divulgación.
Los términos "ARNi", "agente de ARNi", "agente de iARN" y "agente de interferencia de ARN", tal como se utilizan indistintamente en el presente documento, se refieren a un agente que contiene ARN, tal como se define dicho término en el presente documento, y que media la escisión dirigida de un transcrito de ARNvíauna ruta de complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). El ARNi dirige la degradación específica de secuencia del ARNm mediante un proceso conocido como interferencia de ARN (ARNi). El ARNi modula, por ejemplo, inhibe, la expresión de Serpinc1 en una célula, por ejemplo, una célula dentro de un sujeto, tal como un sujeto mamífero.
En un caso, un agente de ARNi de la divulgación incluye un ARN monocatenario que interactúa con una secuencia de ARN diana, por ejemplo, una secuencia de ARNm diana de Serpinc1, para dirigir la escisión del ARN diana. Sin querer limitarnos a la teoría, se cree que el ARN bicatenario largo introducido en las células se descompone en ARNpi por una endonucleasa tipo III conocida como Dicer (Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485). Dicer, una enzima similar a la ribonucleasa III, procesa el ARNbc en ARN interferentes cortos de 19 a 23 pares de bases con salientes característicos de dos bases en el extremo 3' (Bernstein et al., (2001) Nature 409:363). Los ARNpi se incorporan entonces a un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) donde una o más helicasas desenrollan el dúplex de ARNpi, lo que permite que la cadena antisentido complementaria guíe el reconocimiento de la diana (Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309). Al unirse al ARNm diana apropiado, una o más endonucleasas dentro del RISC escinden la diana para inducir el silenciamiento (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188). Así, en un caso, la divulgación se refiere a un ARN monocatenario (ARNpi) generado dentro de una célula y que promueve la formación de un complejo RISC para efectuar el silenciamiento del gen diana, es decir, un gen Serpinc1. Por consiguiente, el término "ARNpi" también se utiliza en este documento para referirse a un ARNi como el descrito anteriormente.
En otro caso, el agente de ARNi puede ser un ARNpi monocatenario que se introduce en una célula u organismo para inhibir un ARNm diana. Los agentes de ARNi monocatenario se unen a la endonucleasa RISC, Argonaute 2, que luego escinde el ARNm diana. Los ARNpi monocatenarios generalmente tienen entre 15 y 30 nucleótidos y están modificados químicamente. El diseño y la prueba de ARNpi monocatenarios se describen en la patente estadounidense n.° 8.101.348 y en Lima et al., (2012) Cell 150: 883-894. Cualquiera de las secuencias de nucleótidos antisentido descritas en este documento se puede utilizar como un ARNpi monocatenario como se describe en este documento o modificado químicamente mediante los métodos descritos en Lima et al., (2012) Cell 150;:883-894.
Un "ARNi" para su uso en las composiciones, usos y métodos de la divulgación es un ARN bicatenario, y en el presente documento se denomina "agente de ARNi bicatenario", "molécula de ARN bicatenario (ARNbc)", "agente de ARNbc" o "ARNbc". El término "ARNbc" se refiere a un complejo de moléculas de ácido ribonucleico, que tiene una estructura dúplex que comprende dos cadenas de ácidos nucleicos antiparalelas y sustancialmente complementarias, que se afirma que tienen orientaciones "sentido" y "antisentido" con respecto a un ARN diana, es decir, un gen Serpinc1. Un ARN bicatenario (ARNbc) puede desencadenar la degradación de un ARN diana, por ejemplo, un ARNm, a través de un mecanismo de silenciamiento genético postranscripcional al que en este documento se denomina interferencia de ARN o ARNi.
En general, la mayoría de los nucleótidos de cada cadena de una molécula de ARNbc son ribonucleótidos, pero como se describe en detalle aquí, cada una o ambas cadenas también pueden incluir uno o más no ribonucleótidos, por ejemplo, un desoxirribonucleótido y/o un nucleótido modificado. Además, tal como se utiliza en esta memoria descriptiva, un "agente de ARNi" puede incluir ribonucleótidos con modificaciones químicas; un agente de ARNi puede incluir modificaciones sustanciales en múltiples nucleótidos.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "nucleótido modificado" se refiere a un nucleótido que tiene, independientemente, un resto de azúcar modificado, un enlace internucleótido modificado y/o una nucleobase modificada. Por tanto, el término nucleótido modificado abarca sustituciones, adiciones o eliminaciones de, por ejemplo, un grupo funcional o un átomo, en enlaces internucleósidos, restos de azúcar, o nucleobases. Las modificaciones adecuadas para su uso en los agentes de la divulgación incluyen todos los tipos de modificaciones divulgadas en este documento o conocidas en la técnica. Cualquier modificación de este tipo, tal como se utiliza en una molécula de tipo ARNpi, está comprendida en el concepto de "agente de ARNi" a los efectos de esta memoria descriptiva.
La región dúplex puede tener cualquier longitud que permita la degradación específica de un ARN diana deseado a través de una ruta RISC, y puede variar de aproximadamente 9 a 36 pares de bases de longitud, por ejemplo, aproximadamente 15-30 pares de bases de longitud, por ejemplo, aproximadamente 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 o 36 pares de bases de longitud, tal como aproximadamente 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19 25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21 -29, 21 -28, 21 -27, 21 -26, 21 -25, 21 -24, 21-23, o 21-22 pares de bases de longitud. También se contempla que los rangos y longitudes intermedios a los rangos y longitudes mencionados anteriormente sean parte de la divulgación.
Las dos cadenas que forman la estructura dúplex pueden ser porciones diferentes de una molécula de ARN más grande, o pueden ser moléculas de ARN separadas. Cuando las dos cadenas son parte de una molécula más grande, y por lo tanto están conectadas por una cadena ininterrumpida de nucleótidos entre el extremo 3' de una cadena y el extremo 5' de la otra cadena respectiva formando la estructura dúplex, la cadena de ARN de conexión se denomina "bucle de horquilla". Un bucle de horquilla puede comprender al menos un nucleótido desapareado. En algunos casos, el bucle de horquilla puede comprender al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6 , al menos 7, al menos 8 , al menos 9, al menos 10, al menos 20, al menos 23 o más nucleótidos desapareados.
Cuando las dos cadenas sustancialmente complementarias de un ARN bicatenario están compuestas por moléculas de ARN independientes, dichas moléculas no necesitan estar conectadas covalentemente, pero pueden estarlo. Cuando las dos cadenas están conectadas covalentemente por medios distintos a una cadena ininterrumpida de nucleótidos entre el extremo 3' de una cadena y el extremo 5' de la otra cadena respectiva formando la estructura dúplex, la estructura de conexión se denomina "enlazador". Las cadenas de ARN pueden tener el mismo número de nucleótidos o un número diferente. El número máximo de pares de bases es el número de nucleótidos en la cadena más corta del ARNbc menos cualquier saliente que esté presente en el dúplex. Además de la estructura dúplex, un ARNi puede comprender uno o más salientes nucleotídicos.
En un caso, un agente de ARNi de la divulgación es un ARN bicatenario de 24-30 nucleótidos que interactúa con una secuencia de ARN diana, por ejemplo, una secuencia de ARNm diana de Serpinc1, para dirigir la escisión del ARN diana. Sin querer limitarnos a la teoría, el ARN bicatenario largo introducido en las células se descompone en ARNpi por una endonucleasa tipo III conocida como Dicer (Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485). Dicer, una enzima similar a la ribonucleasa III, procesa el ARNbc en ARN interferentes cortos de 19 a 23 pares de bases con salientes característicos de dos bases en el extremo 3' (Bernstein et al., (2001) Nature 409:363). Los ARNpi se incorporan entonces a un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) donde una o más helicasas desenrollan el dúplex de ARNpi, lo que permite que la cadena antisentido complementaria guíe el reconocimiento de la diana (Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309). Al unirse al ARNm diana apropiado, una o más endonucleasas dentro del RISC escinden la diana para inducir el silenciamiento (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188).
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "saliente nucleotídico" se refiere a al menos un nucleótido desapareado que sobresale de la estructura dúplex de un ARNi, por ejemplo, un ARNbc. Por ejemplo, cuando el extremo 3' de una cadena de un ARNbc se extiende más allá del extremo 5' de la otra cadena, o viceversa, hay un saliente nucleotídico. Un ARNbc puede comprender un saliente de al menos un nucleótido; alternativamente, el saliente puede comprender al menos dos nucleótidos, al menos tres nucleótidos, al menos cuatro nucleótidos, al menos cinco nucleótidos o más. Un saliente nucleotídico puede comprender o consistir en un análogo de nucleótido/nucleósido, incluido un desoxirribonucleótido/nucleósido. El o los salientes pueden estar en la cadena sentido, en la cadena antisentido o en cualquier combinación de ellas. Además, el o los nucleótidos de un saliente pueden estar presentes en el extremo 5', en el extremo 3' o en ambos extremos de una cadena antisentido o sentido de un ARNbc.
En un caso, la cadena antisentido de un ARNbc tiene un saliente de 1 a 10 nucleótidos, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9 o 10 nucleótidos, en el extremo 3' y/o en el extremo 5'. En un caso, la cadena sentido de un ARNbc tiene un saliente de 1 a 10 nucleótidos, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9 o 10 nucleótidos, en el extremo 3' y/o en el extremo 5'. En otro caso, uno o más de los nucleótidos en el saliente se reemplazan con un nucleósido tiofosfato.
En ciertos casos, el saliente de la cadena sentido o de la cadena antisentido, o de ambas, puede incluir longitudes extendidas de más de 10 nucleótidos, por ejemplo, 10-30 nucleótidos, 10-25 nucleótidos, 10-20 nucleótidos o 10-15 nucleótidos de longitud. En ciertos casos, hay un saliente extendido en la cadena sentido del dúplex. En ciertos casos, hay un saliente extendido en el extremo 3' de la cadena sentido del dúplex. En ciertos casos, hay un saliente extendido en el extremo 5' de la cadena sentido del dúplex. En ciertos casos, hay un saliente extendido en la cadena antisentido del dúplex. En ciertos casos, hay un saliente extendido en el extremo 3' de la cadena antisentido del dúplex. En ciertos casos, hay un saliente extendido en el extremo 5' de la cadena antisentido del dúplex. En ciertos casos, uno o más de los nucleótidos en el saliente extendido se reemplazan con un nucleósido tiofosfato.
"Romo" o "extremo romo" significa que no hay nucleótidos desapareados en ese extremo del agente de ARNi bicatenario, es decir, no hay saliente nucleotídico. Un agente de ARNi de "extremos romos" es un ARNbc que es bicatenario en toda su longitud, es decir, no tiene saliente nucleotídico en ninguno de los extremos de la molécula. Los agentes de ARNi de la divulgación incluyen agentes de ARNi con salientes nucleotídicos en un extremo (es decir, agentes con un saliente y un extremo romo) o con salientes nucleotídicos en ambos extremos.
El término "cadena antisentido" o "cadena guía" se refiere a la cadena de un ARNi, por ejemplo, un ARNbc, que incluye una región que es sustancialmente complementaria a una secuencia diana, por ejemplo, un ARNm de Serpinc1. Tal como se utiliza en este documento, el término "región de complementariedad" se refiere a la región de la cadena antisentido que es sustancialmente complementaria a una secuencia, por ejemplo, una secuencia diana, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos Serpinc1, tal como se define en este documento. Cuando la región de complementariedad no es totalmente complementaria a la secuencia diana, los desapareamientos pueden estar en las regiones internas o terminales de la molécula. Generalmente, los desapareamientos más tolerados se encuentran en las regiones terminales, por ejemplo, dentro de los 5, 4, 3 o 2 nucleótidos del extremo 5' y/o 3' del ARNi.
El término "cadena sentido" o "cadena pasajera", como se utiliza en este documento, se refiere a la cadena de un ARNi que incluye una región que es sustancialmente complementaria a una región de la cadena antisentido como se define ese término en este documento.
Tal como se utiliza en este documento, el término "región de escisión" se refiere a una región que se encuentra inmediatamente adyacente al sitio de escisión. El sitio de escisión es el sitio en la diana en el que se produce la escisión. En algunos casos, la región de escisión comprende tres bases en cada extremo e inmediatamente adyacentes al sitio de escisión. En algunos casos, la región de escisión comprende dos bases en cada extremo e inmediatamente adyacentes al sitio de escisión. En algunos casos, el sitio de escisión se produce específicamente en el sitio unido por los nucleótidos 10 y 11 de la cadena antisentido, y la región de escisión comprende los nucleótidos 11, 12 y 13.
Como se utiliza en este documento, y a menos que se indique lo contrario, el término "complementario", cuando se utiliza para describir una primera secuencia de nucleótidos con respecto a una segunda secuencia de nucleótidos, se refiere a la capacidad de un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la primera secuencia de nucleótidos para hibridar y formar una estructura dúplex en determinadas condiciones con un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la segunda secuencia de nucleótidos, como lo entenderá el experto en la técnica. Estas condiciones pueden ser, por ejemplo, condiciones estrictas, que pueden incluir: 400 mM NaCI, 40 mM PIPES pH 6,4, 1 mM EDTA, 50 °C o 70 °C durante 12-16 horas, seguido de lavado (véase, por ejemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Pueden aplicarse otras condiciones, tales como las condiciones fisiológicamente relevantes que pueden encontrarse dentro de un organismo. El experto en la técnica podrá determinar el conjunto de condiciones más apropiado para un ensayo de complementariedad de dos secuencias de acuerdo con la aplicación final de los nucleótidos hibridados.
Las secuencias complementarias dentro de un ARNi, por ejemplo, dentro de un ARNbc como se describe en este documento, incluyen el apareamiento de bases del oligonucleótido o polinucleótido que comprende una primera secuencia de nucleótidos con un oligonucleótido o polinucleótido que comprende una segunda secuencia de nucleótidos a lo largo de toda la longitud de una o ambas secuencias de nucleótidos. En el presente documento se puede hacer referencia a dichas secuencias como "totalmente complementarias" entre sí. Sin embargo, cuando una primera secuencia se denomina "sustancialmente complementaria" con respecto a una segunda secuencia en este documento, las dos secuencias pueden ser totalmente complementarias o pueden formar uno o más, pero generalmente no más de 5, 4, 3 o 2 pares de bases desapareados tras la hibridación para un dúplex de hasta 30 pares de bases, mientras que conservan la capacidad de hibridarse en las condiciones más relevantes para su aplicación final, por ejemplo, la inhibición de la expresión génica a través de una ruta RISC. Sin embargo, cuando dos oligonucleótidos están diseñados para formar, tras la hibridación, uno o más salientes monocatenarios, dichos salientes no se considerarán como desapareamientos con respecto a la determinación de la complementariedad. Por ejemplo, un ARNbc que comprende un oligonucleótido de 21 nucleótidos de longitud y otro oligonucleótido de 23 nucleótidos de longitud, en donde el oligonucleótido más largo comprende una secuencia de 21 nucleótidos que es totalmente complementaria al oligonucleótido más corto, todavía puede ser denominado como "totalmente complementario" para los fines descritos en este documento.
Las secuencias "complementarias", tal como se utilizan en este documento, también pueden incluir, o estar formadas completamente a partir de, pares de bases que no sean Watson-Crick y/o pares de bases formados a partir de nucleótidos no naturales y modificados, siempre que se cumplan los requisitos anteriores con respecto a su capacidad para hibridarse. Estos pares de bases que no son Watson-Crick incluyen, pero no se limitan a, el bamboleo G:U o el apareamiento de bases Hoogstein.
Los términos "complementario", "totalmente complementario" y "sustancialmente complementario" en este documento se pueden utilizar con respecto a la coincidencia de bases entre la cadena sentido y la cadena antisentido de un ARNbc, o entre la cadena antisentido de un agente de ARNi y una secuencia diana, como se entenderá a partir del contexto de su uso.
Como se utiliza en este documento, un polinucleótido que es "sustancialmente complementario a al menos parte de" un ARN mensajero (ARNm) se refiere a un polinucleótido que es sustancialmente complementario a una porción contigua del ARNm de interés (por ejemplo, un ARNm que codifica Serpinc1). Por ejemplo, un polinucleótido es complementario a al menos una parte de un ARNm de Serpinc1 si la secuencia es sustancialmente complementaria a una porción no interrumpida de un ARNm que codifica Serpinc1.
En consecuencia, en algunos casos, los polinucleótidos de cadena antisentido descritos en este documento son totalmente complementarios a la secuencia Serpinc1 diana. En otros casos, los polinucleótidos de cadena antisentido descritos en este documento son sustancialmente complementarios a la secuencia Serpinc1 diana y comprenden una secuencia de nucleótidos contigua que es al menos aproximadamente un 80% complementaria en toda su longitud a la región equivalente de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, o un fragmento de SEQ ID NO: 1, tal como aproximadamente un 85%, aproximadamente un 86%, aproximadamente un 87%, aproximadamente un 88%, aproximadamente un 89%, aproximadamente un 90%, aproximadamente un 91%, aproximadamente un 92%, aproximadamente un 93%, aproximadamente un 94%, aproximadamente un 95%, aproximadamente un 96%, aproximadamente un 97%, aproximadamente un 98% o aproximadamente un 99% complementaria.
En un caso, un agente de ARNi de la divulgación incluye una cadena sentido que es sustancialmente complementaria a un polinucleótido antisentido que, a su vez, es complementario a una secuencia Serpinc1 diana, y en donde el polinucleótido de la cadena sentido comprende una secuencia de nucleótidos contigua que es al menos aproximadamente un 80% complementaria en toda su longitud a la región equivalente de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5, o un fragmento de cualquiera de SEQ ID NO: 5, tal como aproximadamente un 85%, aproximadamente un 86%, aproximadamente un 87%, aproximadamente un 88%, aproximadamente un 89%, aproximadamente un 90%, aproximadamente un 91%, aproximadamente un 92%, aproximadamente un 93%, aproximadamente un 94%, aproximadamente un 95%, aproximadamente un 96%, aproximadamente un 97%, aproximadamente un 98% o aproximadamente un 99% complementaria.
En un caso de la divulgación, un agente para uso en los métodos y composiciones de la divulgación es una molécula de ARN antisentido monocatenario que inhibe un ARNm diana a través de un mecanismo de inhibición antisentido. La molécula de ARN antisentido monocatenario es complementaria a una secuencia dentro del ARNm diana. Los oligonucleótidos antisentido monocatenarios pueden inhibir la traducción de manera estequiométrica mediante el apareamiento de bases con el ARNm y la obstrucción física de la maquinaria de traducción, véase Dias, N. et al., (2002) Mol Cáncer Ther 1:347-355. La molécula de ARN antisentido monocatenario puede tener aproximadamente 15 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud y tener una secuencia que es complementaria a una secuencia diana. Por ejemplo, la molécula de ARN antisentido monocatenario puede comprender una secuencia que tiene al menos aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más nucleótidos contiguos de cualquiera de las secuencias antisentido descritas en este documento.
El término "inhibir", tal como se utiliza en este documento, se usa indistintamente con "reducir", "silenciar", "regular negativamente", "suprimir" y otros términos similares, e incluye cualquier nivel de inhibición.
La frase "inhibir la expresión de una Serpinc1", como se utiliza en este documento, incluye la inhibición de la expresión de cualquier gen Serpinc1 (como, por ejemplo, un gen Serpinc1 de ratón, un gen Serpinc1 de rata, un gen Serpinc1 de mono o un gen Serpinc1 humano), así como variantes o mutantes de un gen Serpinc1 que codifican una proteína Serpinc1.
"Inhibir la expresión de un gen Serpinc1" incluye cualquier nivel de inhibición de un gen Serpinc1, por ejemplo, supresión al menos parcial de la expresión de un gen Serpinc1, tal como una inhibición de al menos aproximadamente el 5%, al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 15%, al menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 25%, al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 35%, al menos aproximadamente el 40%, al menos aproximadamente el 45%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 55%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 65%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 91%, al menos aproximadamente el 92%, al menos aproximadamente el 93%, al menos aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%. al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, o al menos aproximadamente el 99%.
La expresión de un gen Serpinc1 se puede evaluar en función del nivel de cualquier variable asociada con la expresión del gen Serpinc1, por ejemplo, el nivel de ARNm de Serpinc1, el nivel de proteína Serpinc1, o, por ejemplo, los niveles del complejo trombina:antitrombina como medida del potencial de generación de trombina, el tiempo de sangrado, el tiempo de protrombina (TP), el recuento de plaquetas y/o el tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa). La inhibición puede evaluarse mediante una disminución de un nivel absoluto o relativo de una o más de estas variables en comparación con un nivel de control. El nivel de control puede ser cualquier tipo de nivel de control que se utiliza en la técnica, por ejemplo, un nivel de referencia previo a la dosis o un nivel determinado a partir de un sujeto, célula o muestra similar que no se trata o se trata con un control (tal como, por ejemplo, control sólo con amortiguador o control con agente inactivo).
En un caso, al menos la supresión parcial de la expresión de un gen Serpinc1 se evalúa mediante una reducción de la cantidad de ARNm de Serpinc1 que puede aislarse o detectarse en una primera célula o grupo de células en el que se transcribe un gen Serpinc1 y que se ha o ha sido tratada de tal manera que se inhibe la expresión de un gen Serpinc1, en comparación con una segunda célula o grupo de células sustancialmente idéntico a la primera célula o grupo de células pero que se ha tratado o no de esa manera (células de control). El grado de inhibición puede expresarse en términos de
(ARNm en células de control<) ->(ARNm en células tratadas)
x100%
(ARNm en células de control)
La frase "poner en contacto una célula con un agente de ARNi", tal como un ARNbc, como se utiliza en este documento, incluye poner en contacto una célula por cualquier medio posible. Poner en contacto una célula con un agente de ARNi incluye poner en contacto una célula i con el ARNi o poner en contacto una célulain v ivocon el ARNi. El contacto podrá realizarse de forma directa o indirecta. Así, por ejemplo, el agente de ARNi puede ser puesto en contacto físico con la célula por el individuo que realiza el método, o alternativamente, el agente de ARNi puede ser puesto en una situación que le permita o provoque que posteriormente entre en contacto con la célula.
El contacto con una célulain v itropuede realizarse, por ejemplo, incubando la célula con el agente de ARNi. El contacto con una célulain v ivopuede realizarse, por ejemplo, inyectando el agente de ARNi en el tejido donde se encuentra la célula o cerca de él, o inyectando el agente de ARNi en otra área, por ejemplo, el torrente sanguíneo o el espacio subcutáneo, de modo que el agente llegue posteriormente al tejido donde se encuentra la célula que se va a contactar. Por ejemplo, el agente de ARNi puede contener y/o estar acoplado a un ligando, por ejemplo, GalNAc3, que dirige el agente de ARNi a un sitio de interés, por ejemplo, el hígado. También son posibles combinaciones de métodos de contactoin v itroein vivo.Por ejemplo, una célula también puede ponerse en contactoin v itrocon un agente de ARNi y posteriormente trasplantarse a un sujeto.
En un caso, poner en contacto una célula con un ARNi incluye "introducir" o "administrar el ARNi a la célula" facilitando o efectuando la captación o absorción en la célula. La absorción o captación de un ARNi puede ocurrir a través de procesos celulares activos o difusivos sin ayuda, o por agentes o dispositivos auxiliares. La introducción de un ARNi en una célula puede realizarsein v itroy/oin vivo.Por ejemplo, para la introducciónin vivo,el ARNi puede inyectarse en un sitio de tejido o administrarse sistémicamente. La administraciónin v ivotambién puede realizarse mediante un sistema de administración de beta-glucano, tales como los descritos en las patentes de EE. UU. n.° 5.032.401 y 5.607.677 y la publicación de EE. UU. n.° 2005/0281781. La introducciónin v itroen una célula incluye métodos conocidos en la técnica, tales como la electroporación y la lipofección. A continuación se describen otros enfoques y/o son conocidos en la técnica.
II. Métodos de la invención
La presente divulgación proporciona métodos terapéuticos y profilácticos que incluyen administrar a un sujeto que tiene una enfermedad asociada a Serpinc1, por ejemplo, un trastorno hemorrágico, por ejemplo, una hemofilia (por ejemplo, hemofilia A o hemofilia B), un agente de ARNi o una composición farmacéutica que comprende un agente de ARNi de la divulgación. En algunos casos de la divulgación, los métodos incluyen además administrar al sujeto un agente terapéutico adicional.
En ciertos casos de la divulgación, por ejemplo, cuando un agente de ARNi bicatenario incluye uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, incluido uno de dichos motivos en o cerca del sitio de escisión del agente, seis enlaces fosforotioato y un ligando GalNAc, dicho agente se administra en una dosis de aproximadamente 0,200 a aproximadamente 1,825 mg/kg 0 ,200 a aproximadamente 1,800 mg/kg aproximadamente 0,200 a aproximadamente 1,700 mg/kg aproximadamente 0 ,200 a aproximadamente 1,600 mg/kg aproximadamente 0,200 a aproximadamente 1,500 mg/kg aproximadamente 0,200 a aproximadamente 1,400 mg/kg aproximadamente 0,200 a aproximadamente 1,400 mg/kg aproximadamente 0 ,200 a aproximadamente 1 ,200 mg/kg aproximadamente 0 ,200 a aproximadamente 1,100 mg/kg aproximadamente 0 ,200 a aproximadamente 1 ,000 mg/kg aproximadamente 0,200 a aproximadamente 0,900 mg/kg aproximadamente 0 ,200 a aproximadamente 0,800 mg/kg aproximadamente 0,200 a aproximadamente 0,700 mg/kg aproximadamente 0 ,200 a aproximadamente 0,600 mg/kg aproximadamente 0,200 a aproximadamente 0,500 mg/kg aproximadamente 0,200 a aproximadamente 0,400 mg/kg aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1,825 mg/kg aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1,800 mg/kg aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1,700 mg/kg aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1,600 mg/kg aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1,500 mg/kg aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1,400 mg/kg aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1,400 mg/kg aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1,200 mg/kg aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1,100 mg/kg aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1,000 mg/kg aproximadamente 0,225 a aproximadamente 0,900 mg/kg aproximadamente 0,225 a aproximadamente 0,800 mg/kg aproximadamente 0,225 a aproximadamente 0,700 mg/kg aproximadamente 0,225 a aproximadamente 0,600 mg/kg aproximadamente 0,225 a aproximadamente 0,500 mg/kg aproximadamente 0,225 a aproximadamente 0,400 mg/kg aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1,825 mg/kg aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1,800 mg/kg aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1,700 mg/kg aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1,600 mg/kg aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1,500 mg/kg aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1,400 mg/kg aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1,400 mg/kg aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1,200 mg/kg aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1,100 mg/kg aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1,000 mg/kg aproximadamente 0,250 a aproximadamente 0,900 mg/kg aproximadamente 0,250 a aproximadamente 0,800 mg/kg aproximadamente 0,250 a aproximadamente 0,700 mg/kg aproximadamente 0,250 a aproximadamente 0,600 mg/kg aproximadamente 0,250 a aproximadamente 0,500 mg/kg aproximadamente 0,250 a aproximadamente 0,400 mg/kg aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1,825 mg/kg aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1,800 mg/kg aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1,700 mg/kg aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1,600 mg/kg aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1,500 mg/kg aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1,400 mg/kg aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1,400 mg/kg aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1,200 mg/kg aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1,100 mg/kg aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1,000 mg/kg aproximadamente 0,425 a aproximadamente 0,900 mg/kg aproximadamente 0,425 a aproximadamente 0,800 mg/kg aproximadamente 0,425 a aproximadamente 0,700 mg/kg aproximadamente 0,425 a aproximadamente 0,600 mg/kg aproximadamente 0,425 a aproximadamente 0,500 mg/kg aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1,825 mg/kg aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1,800 mg/kg aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1,700 mg/kg aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1,600 mg/kg aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1,500 mg/kg aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1,400 mg/kg aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1,400 mg/kg aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1,200 mg/kg aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1,100 mg/kg aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1,000 mg/kg aproximadamente 0,450 a aproximadamente 0,900 mg/kg aproximadamente 0,450 a aproximadamente 0,800 mg/kg aproximadamente 0,450 a aproximadamente 0,700 mg/kg aproximadamente 0,450 a aproximadamente 0,600 mg/kg aproximadamente 0,450 a aproximadamente 0,500 mg/kg aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1,825 mg/kg aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1,800 mg/kg aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1,700 mg/kg aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1,600 mg/kg aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1,500 mg/kg aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1,400 mg/kg aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1,400 mg/kg aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1,200 mg/kg aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1,100 mg/kg aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1,000 mg/kg aproximadamente 0,475 a aproximadamente 0,900 mg/kg aproximadamente 0,475 a aproximadamente 0,800 mg/kg aproximadamente 0,475 a aproximadamente 0,700 mg/kg aproximadamente 0,475 a aproximadamente 0,600 mg/kg aproximadamente 0,475 a aproximadamente 0,500 mg/kg aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1,825 mg/kg aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1,800 mg/kg aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1,700 mg/kg aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1,600 mg/kg aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1,500 mg/kg aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1,400 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1,400 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1,200 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1,100 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1,000 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 0,900 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,825 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,800 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,700 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,600 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,500 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,400 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,400 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,200 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,100 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,000 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,825 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,800 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,700 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,600 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,500 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,400 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,400 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,200 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,100 mg/kg, o aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,000 mg/kg. Los valores y rangos intermedios a los valores citados anteriormente también se pretende que sean parte de esta divulgación. Por ejemplo, el agente de ARNi se puede administrar al sujeto en una dosis de aproximadamente 0,015 mg/kg a aproximadamente 0,45 mg/mg.
Por ejemplo, el agente de ARNi, por ejemplo, el agente de ARNi en una composición farmacéutica, se puede administrar en una dosis de aproximadamente 0,2 mg/kg, 0,225 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,275 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,325 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,375 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,425 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,475 mg/kg, aproximadamente 0,5 mg/kg, 0,525 mg/kg, 0,55 mg/kg, 0,575 mg/kg, aproximadamente 0,6 mg/kg, 0,625 mg/kg, 0,65 mg/kg, 0,675 mg/kg, aproximadamente 0,7 mg/kg, 0,725 mg/kg, 0,75 mg/kg, 0,775 mg/kg, aproximadamente 0,8 mg/kg, 0,925 mg/kg, 0,95 mg/kg, 0,975 mg/kg, aproximadamente 1,0 mg/kg, 1,025 mg/kg, 1,05 mg/kg, 1,075 mg/kg, aproximadamente 1,1 mg/kg, 1,125 mg/kg, 1,15 mg/kg, 1,175 mg/kg, aproximadamente 1,2 mg/kg, 1,225 mg/kg, 1,25 mg/kg, 1,275 mg/kg, aproximadamente 1,3 mg/kg, 1,325 mg/kg, 1,35 mg/kg, 1,375 mg/kg, aproximadamente 1,4 mg/kg, 1,425 mg/kg, 1,45 mg/kg, 1,475 mg/kg, aproximadamente 1,5 mg/kg, 1,525 mg/kg, 1,55 mg/kg, 1,575 mg/kg, aproximadamente 1,6 mg/kg, 1,625 mg/kg, 1,65 mg/kg, 1,675 mg/kg, aproximadamente 1,7 mg/kg, 1,725 mg/kg, 1,75 mg/kg, 1,775 mg/kg, o aproximadamente 1,8 mg/kg. Los valores intermedios a los valores citados anteriormente también se pretende que formen parte de esta divulgación.
Por consiguiente, en un caso, la divulgación proporciona métodos para prevenir al menos un síntoma en un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1, por ejemplo, un trastorno hemorrágico, por ejemplo, una hemofilia. Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis profilácticamente eficaz, por ejemplo, una dosis de aproximadamente 0,200 mg/kg a aproximadamente 1,825 mg/kg, del agente de ARNi, por ejemplo, ARNbc, de la divulgación, (por ejemplo, una composición farmacéutica que comprende un ARNbc de la divulgación), previniendo así al menos un síntoma en el sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1.
En otro caso, la presente divulgación proporciona métodos para tratar a un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1, por ejemplo, un trastorno hemorrágico, por ejemplo, una hemofilia, que incluyen administrar al sujeto, por ejemplo, un ser humano, una dosis terapéuticamente eficaz, por ejemplo, una dosis de aproximadamente 0,200 mg/kg a aproximadamente 1,800 mg/kg, de un agente de ARNi dirigido contra un gen Serpinc1 o una composición farmacéutica que comprende un agente de ARNi dirigido contra un gen Serpinc1, tratando así al sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1.
En otro caso, la divulgación proporciona usos de una dosis profilácticamente eficaz, por ejemplo, una dosis de aproximadamente 0,200 mg/kg a aproximadamente 1,825 mg/kg, de un ARNi, por ejemplo, un ARNbc, de la divulgación para prevenir al menos un síntoma en un sujeto que padece un trastorno que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de la expresión de Serpinc1, tal como un trastorno hemorrágico, por ejemplo, una hemofilia.
En un caso adicional, la presente divulgación proporciona usos de una dosis profilácticamente eficaz, por ejemplo, una dosis de aproximadamente 0,200 mg/kg a aproximadamente 1,825 mg/kg de un agente de ARNi de la divulgación en la fabricación de un medicamento para prevenir al menos un síntoma en un sujeto que padece un trastorno que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de la expresión de Serpinc1, tal como un trastorno hemorrágico, por ejemplo, una hemofilia.
En otro caso, la presente divulgación proporciona usos de una dosis terapéuticamente eficaz, por ejemplo, una dosis de aproximadamente 0,200 mg/kg a aproximadamente 1,825 mg/kg, de un agente de ARNi de la divulgación para tratar a un sujeto, por ejemplo, un sujeto que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de la expresión de Serpinc1.
En aún otro caso, la presente divulgación proporciona el uso de un agente de ARNi, por ejemplo, un ARNbc, de la divulgación dirigido contra un gen Serpinc1 o una composición farmacéutica que comprende una dosis terapéuticamente eficaz, por ejemplo, una dosis de aproximadamente 0,200 mg/kg a aproximadamente 1,825 mg/kg, de un agente de ARNi dirigido contra un gen Serpinc1 en la fabricación de un medicamento para tratar a un sujeto, por ejemplo, un sujeto que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de la expresión de Serpincl, tal como un sujeto que tiene un trastorno hemorrágico, por ejemplo, una hemofilia.
En algunos casos de la divulgación, por ejemplo, cuando un agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, comprendiendo la cadena antisentido una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido al extremo 3', dicho agente se administra a una dosis de aproximadamente 0,200 a aproximadamente 1,825 mg/kg, por ejemplo, como una dosis de aproximadamente 0,200 mg/kg a aproximadamente 0,250 mg/kg; o como una dosis de aproximadamente 0,425 mg/kg a aproximadamente 0,475 mg/kg; o como una dosis de aproximadamente 0,875 mg/kg a aproximadamente 0,925 mg/kg; o como una dosis de aproximadamente 1,775 mg/kg a aproximadamente 1,825 mg/kg.
Por consiguiente, en un caso, la divulgación proporciona métodos para prevenir al menos un síntoma en un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1, por ejemplo, un trastorno hemorrágico, por ejemplo, una hemofilia. Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis profilácticamente eficaz, por ejemplo, una dosis de aproximadamente 0,200 mg/kg a aproximadamente 1,825 mg/kg, de un agente de ácido ribonucleico (ARNi) bicatenario, que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, comprendiendo la cadena antisentido una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido al extremo 3' (por ejemplo, una composición farmacéutica que comprende el agente de ARNi), previniendo así al menos un síntoma en el sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de la reducción en la expresión de Serpinc1.
En otro caso, la presente divulgación proporciona métodos para tratar a un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de la reducción en la expresión de Serpinc1, por ejemplo, un trastorno hemorrágico, por ejemplo, una hemofilia, que incluyen administrar al sujeto, por ejemplo, un ser humano, una dosis terapéuticamente eficaz, por ejemplo, una dosis de aproximadamente 0,200 mg/kg a aproximadamente 1,825 mg/kg, de un agente de ácido ribonucleico (ARNi) bicatenario, que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, comprendiendo la cadena antisentido una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido en el 3'-terminal o una composición farmacéutica que comprende el agente de ARNi dirigido contra un gen Serpinc1, tratando así al sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría con una reducción en la expresión de Serpinc1.
En otro caso, la divulgación proporciona usos de una dosis profilácticamente eficaz, por ejemplo, una dosis de aproximadamente 0,200 mg/kg a aproximadamente 1,825 mg/kg, de un agente de ácido ribonucleico (ARNi) bicatenario, que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, comprendiendo la cadena antisentido una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido en el extremo 3' para prevenir al menos un síntoma en un sujeto que padece un trastorno que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de la expresión de Serpinc1, tal como un trastorno hemorrágico. por ejemplo, una hemofilia.
En un caso adicional, la presente divulgación proporciona usos de una dosis profilácticamente eficaz, por ejemplo, una dosis de aproximadamente 0,200 mg/kg a aproximadamente 1,825 mg/kg de un agente de ácido ribonucleico (ARNi) bicatenario, que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, comprendiendo la cadena antisentido una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido en el extremo 3' en la fabricación de un medicamento para prevenir al menos un síntoma en un sujeto que padece un trastorno que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de Serpinc1. expresión, como un trastorno hemorrágico, por ejemplo, una hemofilia.
En otro caso, la presente divulgación proporciona usos de una dosis terapéuticamente eficaz, por ejemplo, una dosis de aproximadamente 0,200 mg/kg a aproximadamente 1,825 mg/kg, de un agente de ácido ribonucleico bicatenario (ARNi), que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, comprendiendo la cadena antisentido una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido en el extremo 3' para tratar a un sujeto, por ejemplo, un sujeto que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de la expresión de Serpincl.
En aún otro caso, la presente divulgación proporciona el uso de un agente de ARNi, por ejemplo, un ARNbc, dirigido contra un gen Serpinc1 o una composición farmacéutica que comprende una dosis terapéuticamente eficaz, por ejemplo, una dosis de aproximadamente 0,200 mg/kg a aproximadamente 1,825 mg/kg, de un agente de ácido ribonucleico bicatenario (ARNi), que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, comprendiendo la cadena antisentido una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido en el extremo 3' en la fabricación de un medicamento para tratar a un sujeto, por ejemplo, un sujeto que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de la expresión de Serpinc1, tal como un sujeto que tiene un trastorno hemorrágico, por ejemplo, una hemofilia.
Un agente de ARNi de la invención se administrará a un sujeto como una dosis fija. Una "dosis fija" (por ejemplo, una dosis en mg) significa que se utiliza una dosis de un agente de ARNi para todos los sujetos, independientemente de cualquier factor específico relacionado con el sujeto, tal como el peso. Una dosis fija de un agente de ARNi puede basarse en un peso o edad predeterminados.
En algunos casos, el agente de ARNi se administra como una dosis fija de entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 100 mg, por ejemplo, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 95 mg, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 90 mg, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 85 mg, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 80 mg, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 75 mg, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 70 mg, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 65 mg, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 60 mg, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 50 mg, entre aproximadamente 50 mg y aproximadamente 100 mg, entre aproximadamente 50 mg y aproximadamente 95 mg, entre aproximadamente 50 mg y aproximadamente 90 mg, entre aproximadamente 50 mg y aproximadamente 85 mg, entre aproximadamente 50 mg y aproximadamente 80 mg, entre aproximadamente 30 mg y aproximadamente 100 mg, entre aproximadamente 30 mg y aproximadamente 90 mg, entre aproximadamente 30 mg y aproximadamente 80 mg, entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 100 mg, entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 90 mg, entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 80 mg, entre aproximadamente 60 mg y aproximadamente 100 mg, entre aproximadamente 60 mg y aproximadamente 90 mg,, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 55 mg, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 65 mg, entre aproximadamente 30 mg y aproximadamente 95 mg, entre aproximadamente 30 mg y aproximadamente 85 mg, entre aproximadamente 30 mg y aproximadamente 75 mg, entre aproximadamente 30 mg y aproximadamente 65 mg, entre aproximadamente 30 mg y aproximadamente 55 mg, entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 95 mg, entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 85 mg, entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 75 mg, entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 65 mg, entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 55 mg, o entre aproximadamente 45 mg y aproximadamente 95 mg.
En algunos casos, el agente de ARNi se administra como una dosis fija de aproximadamente 25 mg, aproximadamente 30 mg, aproximadamente 35 mg, aproximadamente 40 mg, aproximadamente 45 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 55 mg, aproximadamente 60 mg, aproximadamente 65 mg, aproximadamente 70 mg, aproximadamente 75 mg, aproximadamente 80 mg, aproximadamente 85 mg, aproximadamente 90 mg, aproximadamente 95 mg o aproximadamente 100 mg.
Por consiguiente, en un caso, la divulgación proporciona métodos para prevenir al menos un síntoma en un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1, por ejemplo, un trastorno hemorrágico, por ejemplo, una hemofilia. Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis profilácticamente eficaz, por ejemplo, una dosis fija de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 100 mg, del agente de ARNi, por ejemplo, ARNbc, de la divulgación, (por ejemplo, una composición farmacéutica que comprende un ARNbc de la divulgación), previniendo así al menos un síntoma en el sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1. En un caso, los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis profilácticamente eficaz, por ejemplo, una dosis fija de aproximadamente 50 mg, del agente de ARNi, por ejemplo, ARNbc, de la divulgación, (por ejemplo, una composición farmacéutica que comprende un ARNbc de la divulgación), previniendo así al menos un síntoma en el sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1. En otro caso, los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis profilácticamente eficaz, por ejemplo, una dosis fija de aproximadamente 80 mg, del agente de ARNi, por ejemplo, ARNbc, de la divulgación, (por ejemplo, una composición farmacéutica que comprende un ARNbc de la divulgación), previniendo así al menos un síntoma en el sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1.
En otro caso, la presente divulgación proporciona métodos para tratar a un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1, por ejemplo, un trastorno hemorrágico, por ejemplo, una hemofilia, que incluyen administrar al sujeto, por ejemplo, un ser humano, una dosis terapéuticamente eficaz, por ejemplo, una dosis fija de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 100 mg, de un agente de ARNi dirigido contra un gen Serpincl o una composición farmacéutica que comprende un agente de ARNi dirigido contra un gen Serpincl, tratando así al sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1. En un caso, los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis terapéuticamente eficaz, por ejemplo, una dosis fija de aproximadamente 50 mg, del agente de ARNi, por ejemplo, ARNbc, de la divulgación, (por ejemplo, una composición farmacéutica que comprende un ARNbc de la divulgación), tratando así al sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1. En otro caso, los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis terapéuticamente eficaz, por ejemplo, una dosis fija de aproximadamente 80 mg, del agente de ARNi, por ejemplo, ARNbc, de la divulgación, (por ejemplo, una composición farmacéutica que comprende un ARNbc de la divulgación), tratando así al sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1.
La divulgación también proporciona usos de una dosis profilácticamente eficaz, por ejemplo, una dosis fija de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 100 mg, de un ARNi, por ejemplo, un ARNbc, de la divulgación para prevenir al menos un síntoma en un sujeto que sufre un trastorno que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de la expresión de Serpinc1, tal como un trastorno hemorrágico, por ejemplo, una hemofilia. En un caso, la divulgación proporciona usos de una dosis profilácticamente eficaz, por ejemplo, una dosis fija de aproximadamente 50 mg, de un ARNi, por ejemplo, un ARNbc, de la divulgación para prevenir al menos un síntoma en un sujeto que padece un trastorno que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de la expresión de Serpinc1, tal como un trastorno hemorrágico, por ejemplo, una hemofilia. En otro caso, la divulgación proporciona usos de una dosis profilácticamente eficaz, por ejemplo, una dosis fija de aproximadamente 80 mg, de un ARNi, por ejemplo, un ARNbc, de la divulgación para prevenir al menos un síntoma en un sujeto que padece un trastorno que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de la expresión de Serpinc1, tal como un trastorno hemorrágico, por ejemplo, una hemofilia.
La presente divulgación también proporciona usos de una dosis profilácticamente eficaz, por ejemplo, una dosis fija de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 100 mg de un agente de ARNi de la invención en la fabricación de un medicamento para prevenir al menos un síntoma en un sujeto que padece un trastorno que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de la expresión de Serpinc1, tal como un trastorno hemorrágico, por ejemplo, una hemofilia. En un caso, la presente invención proporciona usos de una dosis profilácticamente eficaz, por ejemplo, una dosis fija de aproximadamente 50 mg de un agente de ARNi de la divulgación en la fabricación de un medicamento para prevenir al menos un síntoma en un sujeto que sufre un trastorno que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de la expresión de Serpinc1, tal como un trastorno hemorrágico, por ejemplo, una hemofilia. En otro caso, la presente divulgación proporciona usos de una dosis profilácticamente eficaz, por ejemplo, una dosis fija de aproximadamente 80 mg de un agente de ARNi de la divulgación en la fabricación de un medicamento para prevenir al menos un síntoma en un sujeto que padece un trastorno que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de la expresión de Serpinc1, tal como un trastorno hemorrágico, por ejemplo, una hemofilia.
En otro caso, la presente divulgación proporciona usos de una dosis terapéuticamente eficaz, por ejemplo, una dosis fija de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 100 mg, de un agente de ARNi de la divulgación para tratar a un sujeto, por ejemplo, un sujeto que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de la expresión de Serpinc1. En un caso, la presente divulgación proporciona usos de una dosis terapéuticamente eficaz, por ejemplo, una dosis fija de aproximadamente 50 mg, de un agente de ARNi de la divulgación para tratar a un sujeto, por ejemplo, un sujeto que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de la expresión de Serpinc1. En otro caso, la presente divulgación proporciona usos de una dosis terapéuticamente eficaz, por ejemplo, una dosis fija de aproximadamente 80 mg, de un agente de ARNi de la divulgación para tratar a un sujeto, por ejemplo, un sujeto que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de la expresión de Serpinc1.
En otro caso más, la presente divulgación proporciona el uso de un agente de ARNi, por ejemplo, un ARNbc, de la divulgación que se dirige a un gen Serpinc1 o una composición farmacéutica que comprende una dosis terapéuticamente eficaz, por ejemplo, una dosis fija de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 100 mg, de un agente de ARNi que se dirige a un gen Serpinc1 en la fabricación de un medicamento para tratar a un sujeto, por ejemplo, un sujeto que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de la expresión de Serpinc1, tal como un sujeto que tiene un trastorno hemorrágico, por ejemplo, una hemofilia. En un caso, la presente divulgación proporciona el uso de un agente de ARNi, por ejemplo, un ARNbc, de la divulgación que se dirige a un gen Serpinc1 o una composición farmacéutica que comprende una dosis terapéuticamente eficaz, por ejemplo, una dosis fija de aproximadamente 50 mg, de un agente de ARNi que se dirige a un gen Serpinc1 en la fabricación de un medicamento para tratar a un sujeto, por ejemplo, un sujeto que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de la expresión de Serpinc1, tal como un sujeto que tiene un trastorno hemorrágico, por ejemplo, una hemofilia. En otro caso, la presente divulgación proporciona el uso de un agente de ARNi, por ejemplo, un ARNbc, de la divulgación que se dirige a un gen Serpinc1 o una composición farmacéutica que comprende una dosis terapéuticamente eficaz, por ejemplo, una dosis fija de aproximadamente 80 mg, de un agente de ARNi que se dirige a un gen Serpinc1 en la fabricación de un medicamento para tratar a un sujeto, por ejemplo, un sujeto que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de la expresión de Serpinc1, tal como un sujeto que tiene un trastorno hemorrágico, por ejemplo, una hemofilia.
En algunos casos de la divulgación, por ejemplo, cuando un agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, comprendiendo la cadena antisentido una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido al extremo 3', dicho agente se administra en una dosis fija de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 100 mg, por ejemplo, como una dosis fija de aproximadamente 25 mg; o como una dosis fija de aproximadamente 50 mg; o como una dosis fija de aproximadamente 80 mg; o como una dosis fija de aproximadamente 100 mg. En un caso, la dosis fija es de 50 mg. En otra realización, la dosis fija es de 80 mg.
Por consiguiente, en un caso, la divulgación proporciona métodos para prevenir al menos un síntoma en un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1, por ejemplo, un trastorno hemorrágico, por ejemplo, una hemofilia. Los métodos incluyen administrar al sujeto una dosis profilácticamente eficaz, por ejemplo, una dosis fija de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 100 mg, de un agente de ácido ribonucleico (ARNi) bicatenario, que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, comprendiendo la cadena antisentido una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido en el extremo 3' (por ejemplo, una composición farmacéutica que comprende el agente de ARNi), previniendo así al menos un síntoma en el sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de la reducción en la expresión de Serpinc1. En un caso, la dosis fija es de 50 mg. En otra realización, la dosis fija es de 80 mg.
En otro caso, la presente divulgación proporciona métodos para tratar a un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de la reducción en la expresión de Serpinc1, por ejemplo, un trastorno hemorrágico, por ejemplo, una hemofilia, que incluyen administrar al sujeto, por ejemplo, un ser humano, una dosis terapéuticamente eficaz, por ejemplo, una dosis fija de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 100 mg, de un agente de ácido ribonucleico (ARNi) bicatenario, que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, comprendiendo la cadena antisentido una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido en el extremo 3' o una composición farmacéutica que comprende el agente de ARNi dirigido contra un gen Serpinc1, tratando así al sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1. En un caso, la dosis fija es de 50 mg. En otra realización, la dosis fija es de 80 mg.
En otro caso, la divulgación proporciona usos de una dosis profilácticamente eficaz, por ejemplo, una dosis fija de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 100 mg, de un agente de ácido ribonucleico (ARNi) bicatenario, que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, comprendiendo la cadena antisentido una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido en el extremo 3' para prevenir al menos un síntoma en un sujeto que padece un trastorno que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de la expresión de Serpinc1, tal como un trastorno hemorrágico, por ejemplo, una hemofilia. En un caso, la dosis fija es de 50 mg. En otra realización, la dosis fija es de 80 mg.
En un caso adicional, la presente divulgación proporciona usos de una dosis profilácticamente eficaz, por ejemplo, una dosis fija de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 100 mg de un agente de ácido ribonucléico (ARNi) bicatenario, que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, comprendiendo la cadena antisentido una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido en el extremo 3' en la fabricación de un medicamento para prevenir al menos un síntoma en un sujeto que padece un trastorno que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de la expresión de Serpinc1, tal como un trastorno hemorrágico, por ejemplo, una hemofilia. En un caso, la dosis fija es de 50 mg. En otra realización, la dosis fija es de 80 mg.
En otro caso, la presente divulgación proporciona usos de una dosis terapéuticamente eficaz, por ejemplo, una dosis fija de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 100 mg, de un agente de ácido ribonucleico (ARNi) bicatenario, que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, comprendiendo la cadena antisentido una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido en el extremo 3' para tratar a un sujeto, por ejemplo, un sujeto que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de la expresión de Serpinc1. En un caso, la dosis fija es de 50 mg. En otra realización, la dosis fija es de 80 mg.
En otro caso más, la presente divulgación proporciona el uso de un agente de ARNi, por ejemplo, un ARNbc, de la divulgación dirigido a un gen Serpinc1 o una composición farmacéutica que comprende una dosis terapéuticamente eficaz, por ejemplo, una dosis fija de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 100 mg, de un agente de ácido ribonucleico bicatenario (ARNi), que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, comprendiendo la cadena antisentido una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido en el extremo 3' en la fabricación de un medicamento para tratar a un sujeto. por ejemplo, un sujeto que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de la expresión de Serpinc1, tal como un sujeto que tiene un trastorno hemorrágico, por ejemplo, una hemofilia. En un caso, la dosis fija es de 50 mg. En otra realización, la dosis fija es de 80 mg.
Los métodos y usos de la divulgación incluyen administrar una composición descrita en este documento de manera que la expresión del gen Serpinc1 diana disminuya, tal como durante aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43 , 44 , 45 , 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 , 67, 68 , 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, o aproximadamente 80 días. En un caso, la expresión del gen Serpinc1 diana disminuye durante un período prolongado, por ejemplo, al menos aproximadamente siete días o más, por ejemplo, aproximadamente una semana, dos semanas, tres semanas, aproximadamente cuatro semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 2 meses, aproximadamente un trimestre, o más.
La reducción en la expresión genética se puede evaluar mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, una reducción en la expresión de Serpinc1 puede determinarse determinando el nivel de expresión de ARNm de Serpinc1 usando métodos rutinarios para una persona con conocimientos normales en la técnica, por ejemplo, transferencia Northern, qRT-PCR, determinando el nivel de proteína de Serpinc1 usando métodos rutinarios para una persona con conocimientos normales en la técnica, tal como transferencia Western, técnicas inmunológicas, y/o determinando una actividad biológica de Serpinc1, tal como afectar una o más moléculas asociadas con el mecanismo de coagulación sanguínea celular (o en un entornoin vivo,la propia coagulación sanguínea). En un caso, se determinan el tiempo de generación de trombina, el tiempo de formación del coágulo y/o el tiempo de coagulación para evaluar la expresión de Serpinc1 utilizando, por ejemplo, el análisis de tromboelastometría ROTEM® de sangre completa.
La administración del ARNbc de acuerdo con los métodos y usos de la divulgación puede dar como resultado una reducción de la gravedad, signos, síntomas y/o marcadores de dichas enfermedades o trastornos en un paciente con una enfermedad asociada a Serpinc1. Por "reducción" en este contexto se entiende una disminución estadísticamente significativa de dicho nivel. La reducción puede ser, por ejemplo, de al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o aproximadamente 100%.
La eficacia del tratamiento o la prevención de una enfermedad se puede evaluar, por ejemplo, midiendo la progresión de la enfermedad, la remisión de la enfermedad, la gravedad de los síntomas, la frecuencia de las hemorragias, la reducción del dolor, la calidad de vida, la dosis de un medicamento necesaria para mantener el efecto del tratamiento, el nivel de un marcador de enfermedad o cualquier otro parámetro medible apropiado para una enfermedad determinada que se esté tratando o que se esté buscando prevenir. Está dentro de la capacidad de una persona experta en la técnica monitorizar la eficacia del tratamiento o la prevención midiendo cualquiera de dichos parámetros o cualquier combinación de parámetros. Por ejemplo, la eficacia del tratamiento de un trastorno hemorrágico puede evaluarse, por ejemplo, mediante el control periódico de los niveles de trombina:antitrombina. Las comparaciones de las lecturas posteriores con las lecturas iniciales proporcionan al médico una indicación de si el tratamiento es eficaz. Está dentro de la capacidad de una persona experta en la técnica monitorizar la eficacia del tratamiento o la prevención midiendo cualquiera de dichos parámetros o cualquier combinación de parámetros. En relación con la administración de un ARNi dirigido a Serpinc1 o una composición farmacéutica del mismo, "eficaz contra" un trastorno hemorrágico indica que la administración de una manera clínicamente apropiada da como resultado un efecto beneficioso para al menos una fracción estadísticamente significativa de pacientes, tal como una mejora de los síntomas, una cura, una reducción de la enfermedad, prolongación de la vida, mejora en la calidad de vida u otro efecto generalmente reconocido como positivo por los médicos familiarizados con el tratamiento de los trastornos hemorrágicos y las causas relacionadas.
Un efecto terapéutico o preventivo es evidente cuando hay una mejoría estadísticamente significativa en uno o más parámetros del estado de la enfermedad, o por la falta de empeoramiento o desarrollo de síntomas que de otro modo serían anticipados. A modo de ejemplo, un cambio favorable de al menos el 10% en un parámetro medible de la enfermedad, y preferiblemente al menos el 20%, 30%, 40%, 50% o más, puede ser indicativo de un tratamiento eficaz. La eficacia de un fármaco de ARNi determinado o de una formulación de ese fármaco también se puede juzgar utilizando un modelo animal experimental para la enfermedad dada, tal como se conoce en la técnica. Cuando se utiliza un modelo animal experimental, la eficacia del tratamiento se evidencia cuando se observa una reducción estadísticamente significativa de un marcador o síntoma.
Alternativamente, la eficacia se puede medir mediante una reducción en la gravedad de la enfermedad según lo determine un experto en la técnica del diagnóstico basándose en una escala de clasificación de gravedad de la enfermedad clínicamente aceptada. Cualquier cambio positivo que dé como resultado, por ejemplo, una disminución de la gravedad de la enfermedad medida utilizando la escala apropiada, representa un tratamiento adecuado utilizando un ARNi o una formulación de ARNi como se describe en este documento.
El ARNi (o composiciones farmacéuticas que comprenden el ARNi) se pueden administrar al sujeto aproximadamente una vez a la semana, aproximadamente dos veces al mes, aproximadamente una vez cada seis semanas, aproximadamente una vez cada 2 meses o una vez al trimestre.
Se puede administrar un agente de ARNi bicatenario a un sujeto en una o más dosis. Por ejemplo, un agente de ARNi bicatenario puede administrarse a un sujeto en una dosis mensual de aproximadamente 0 ,200 mg/kg a aproximadamente 1,825 mg/kg. Como alternativa, un agente de ARNi bicatenario se puede administrar a un sujeto como una dosis fija de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 100 mg.
En un caso, un agente de ARNi bicatenario que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, comprendiendo la cadena antisentido una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de 5' -UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido en el extremo 3', se administra al sujeto como una dosis mensual de aproximadamente 0,200 mg/kg a aproximadamente 0,250 mg/kg, por ejemplo, aproximadamente 0,225 mg/kg.
En otro caso, un agente de ARNi bicatenario que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, comprendiendo la cadena antisentido una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de 5' -UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido en el extremo 3', se administra al sujeto como una dosis mensual de aproximadamente 0,425 mg/kg a aproximadamente 0,475 mg/kg, por ejemplo, aproximadamente 0,450 mg/kg.
En otro caso más, un agente de ARNi bicatenario que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, comprendiendo la cadena antisentido una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de 5' -UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido al extremo 3', se administra al sujeto como una dosis mensual de aproximadamente 0,875 mg/kg a aproximadamente 0,925 mg/kg, por ejemplo, aproximadamente 0,900 mg/kg.
En un caso, un agente de ARNi bicatenario que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, comprendiendo la cadena antisentido una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de 5' -UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido en el extremo 3', se administra al sujeto como una dosis mensual de aproximadamente 1,775 mg/kg a aproximadamente 1,825 mg/kg, por ejemplo, aproximadamente 1,800 mg/kg.
En un caso, un agente de ARNi bicatenario que comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, comprendiendo la cadena antisentido una región de complementariedad de al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), donde prácticamente todos los nucleótidos de la cadena sentido y prácticamente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y donde la cadena sentido está conjugada con un ligando unido al extremo 3', se administra al sujeto en una dosis fija de aproximadamente 25 a aproximadamente 100 mg, por ejemplo, aproximadamente 25 mg, 50 mg, 80 mg o 100 mg. En un caso, la dosis fija es de 50 mg. En otro caso, la dosis fija es de 80 mg.
La administración puede repetirse, por ejemplo, de forma regular, tal como mensualmente, durante un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses o más. Después de un régimen de tratamiento inicial, los tratamientos pueden administrarse con menor frecuencia. Por ejemplo, después de una administración mensual durante tres meses, la administración puede repetirse una vez por trimestre, durante un año o más.
En consecuencia, en algunos casos, el agente de ARNi se administra en un régimen de dosificación que incluye una "fase de carga" de administraciones poco espaciadas que puede ser seguida por una "fase de mantenimiento", en la que el agente de ARNi se administra a intervalos más espaciados.
Opcionalmente, se puede repetir un programa de dosificación de carga y/o un programa de dosificación de mantenimiento durante una o más iteraciones. El número de iteraciones puede depender del logro de un efecto deseado, por ejemplo, la supresión de un gen Serpinc1, y/o el logro de un efecto terapéutico o profiláctico, por ejemplo, aumentar la coagulación sanguínea, reducir el tiempo de formación del coágulo y/o reducir el tiempo de coagulación.
La administración del ARNi puede reducir los niveles de Serpinc1, por ejemplo, en una célula, tejido, sangre, orina u otro compartimento del paciente en al menos aproximadamente un 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o al menos aproximadamente 99% o más.
El ARNi se puede administrar mediante infusión intravenosa durante un período de tiempo, tal como por ejemplo durante 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o aproximadamente un período de 25 minutos.
Antes de administrar una dosis completa de ARNi, a los pacientes se les puede administrar una dosis más pequeña, tal como una infusión al 5%, y se los puede controlar para detectar efectos adversos, tal como una reacción alérgica. En otro ejemplo, se puede controlar al paciente para detectar efectos inmunoestimulantes no deseados, tal como el aumento de los niveles de citocinas (por ejemplo, TNF-alfa o INF-alfa).
Debido a los efectos inhibidores sobre la expresión de Serpinc1, una composición de acuerdo con la divulgación o una composición farmacéutica preparada a partir de la misma puede mejorar la calidad de vida.
Un ARNi de la divulgación puede administrarse en forma "pura" o como un "ARNi libre". Se administra un ARNi puro en ausencia de una composición farmacéutica. El ARNi puro puede estar en una solución amortiguadora adecuada. La solución amortiguadora puede comprender acetato, citrato, prolamina, carbonato o fosfato, o cualquier combinación de los mismos. En una realización, la solución amortiguada es solución salina amortiguada con fosfato (PBS). El pH y la osmolaridad de la solución amortiguadora que contiene el ARNi se pueden ajustar de modo que sean adecuados para su administración a un sujeto.
Alternativamente, un ARNi de la divulgación puede administrarse como una composición farmacéutica, tal como una formulación liposomal de ARNbc.
Los sujetos que se beneficiarían de una reducción y/o inhibición de la expresión del gen Serpinc1 son aquellos que tienen un trastorno hemorrágico, por ejemplo, un trastorno hemorrágico hereditario o un trastorno hemorrágico adquirido como se describe en este documento. En una realización, un sujeto que tiene un trastorno hemorrágico hereditario tiene hemofilia, por ejemplo, hemofilia A o B. En una realización, un sujeto que tiene un trastorno hemorrágico hereditario, por ejemplo, una hemofilia, es un sujeto inhibidor (un sujeto que se ha vuelto refractario a los factores de coagulación de reemplazo). En una realización, el sujeto inhibidor tiene hemofilia A. En otra realización, el sujeto inhibidor tiene hemofilia B. El tratamiento de un sujeto que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de la expresión del gen Serpinc1 incluye tratamiento terapéutico (por ejemplo, a demanda, por ejemplo, el sujeto está sangrando (sangrado espontáneo o sangrado como resultado de un traumatismo) y no coagula) y profiláctico (por ejemplo, el sujeto no está sangrando y/o se va a someter a cirugía).
La divulgación proporciona además métodos y usos para el uso de un ARNi o una composición farmacéutica del mismo, por ejemplo, para tratar a un sujeto que se beneficiaría de la reducción y/o inhibición de la expresión de Serpinc1, por ejemplo, un sujeto que tiene un trastorno hemorrágico, en combinación con otros productos farmacéuticos y/u otros métodos terapéuticos, por ejemplo, con productos farmacéuticos conocidos y/o métodos terapéuticos conocidos, tales como, por ejemplo, los que se emplean actualmente para tratar estos trastornos.
Por ejemplo, en ciertos casos, un ARNi dirigido contra Serpinc1 se administra en combinación con, por ejemplo, un agente útil para tratar un trastorno hemorrágico como se describe en otra parte del presente documento. Por ejemplo, terapias adicionales y métodos terapéuticos adecuados para tratar a un sujeto que se beneficiaría de la reducción en la expresión de Serpinc1, por ejemplo, un sujeto que tiene un trastorno hemorrágico, incluyen plasma reciente congelado (FFP); FVIIa recombinante; FIX recombinante; concentrados de FXI; concentrados de FVIII que contienen vWF inactivados por virus; terapia de desensibilización que puede incluir grandes dosis de FVIII o FIX, junto con esteroides o inmunoglobulina intravenosa (IVIG) y ciclofosfamida; plasmaféresis junto con inmunosupresión e infusión de FVIII o FIX, con o sin terapia antifibrinolítica; inducción de tolerancia inmunitaria (ITI), con o sin terapia inmunosupresora (por ejemplo, ciclofosfamida, prednisona y/o anti-CD20); acetato de desmopresina ; antifibrinolíticos, tales como ácido aminocaproico y ácido tranexámico; concentrado de complejo de protrombina activado (PCC); agentes antihemofílicos; corticosteroides; agentes inmunosupresores; y estrógenos.
El ARNi y un agente terapéutico y/o tratamiento adicional pueden administrarse al mismo tiempo y/o en la misma combinación, por ejemplo, por vía parenteral, o el agente terapéutico adicional puede administrarse como parte de una composición separada, o en momentos separados y/o mediante otro método conocido en la técnica o descrito en este documento.
En un caso, la presente divulgación proporciona métodos para tratar a un sujeto que padece un trastorno hemorrágico, por ejemplo, una hemofilia, mediante la administración subcutánea al sujeto del compuesto AD-57213 (cadena sentido: 5'- GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO:13) y cadena antisentido: 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), donde A, C, G y U son ribosa A, C, G o U; a, c, g y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G o U; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, C, G o U; y s es un enlace fosforotioato) en una dosis de aproximadamente 0 ,200 mg/kg a aproximadamente 1,800 mg/kg, por ejemplo, una dosis mensual de aproximadamente 0,200 mg/kg a aproximadamente 0,250 mg/kg; aproximadamente 0,425 mg/kg a aproximadamente 0,475 mg/kg; aproximadamente 0,875 mg/kg a aproximadamente 0,925 mg/kg; o aproximadamente 1,775 mg/kg a aproximadamente 1,825 mg/kg.
En otro caso, la presente divulgación proporciona métodos para tratar a un sujeto que padece un trastorno hemorrágico, por ejemplo, una hemofilia, mediante la administración subcutánea al sujeto del compuesto AD-57213 (cadena sentido: 5'- GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO: 13) y cadena antisentido: 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), donde A, C, G y U son ribosa A, C, G o U; a, c, g y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G o U; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, C, G o U; y s es un enlace fosforotioato) en una dosis fija de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 100 mg, por ejemplo, una dosis fija de aproximadamente 25 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 80 mg o aproximadamente 100 mg. En un caso, la dosis fija es de 50 mg. En otra realización, la dosis fija es de 80 mg.
III. ARNi para uso en los métodos de la divulgación
En este documento se describen métodos para el uso de agentes de ARNi bicatenario mejorados que inhiben la expresión de un gen Serpinc1 en una célula, tal como una célula dentro de un sujeto, por ejemplo, un mamífero, tal como un ser humano que tiene un trastorno asociado a Serpinc1, por ejemplo, un trastorno hemorrágico, por ejemplo, hemofilia.
En consecuencia, la divulgación proporciona agentes de ARNi bicatenario con modificaciones químicas capaces de inhibir la expresión de un gen diana (es decir, un gen Serpinc1)in vivo.En ciertos casos de la divulgación, sustancialmente todos los nucleótidos de un ARNi de la divulgación están modificados. En otras realizaciones de la invención, todos los nucleótidos de un ARNi de la invención están modificados. Los ARNi de la invención en los que prácticamente todos los nucleótidos están modificados lo están en gran medida, pero no en su totalidad, y pueden incluir no más de 5, 4, 3, 2 o 1 nucleótido sin modificar.
El agente de ARNi comprende una cadena sentido y una cadena antisentido. Cada cadena del agente ARNi puede tener una longitud de entre 12 y 30 nucleótidos. Por ejemplo, cada cadena puede tener entre 14 y 30 nucleótidos de longitud, entre 17 y 30 nucleótidos de longitud, entre 19 y 30 nucleótidos de longitud, entre 25 y 30 nucleótidos de longitud, entre 27 y 30 nucleótidos de longitud, entre 17 y 23 nucleótidos de longitud, entre 17 y 21 nucleótidos de longitud, entre 17 y 19 nucleótidos de longitud, entre 19 y 25 nucleótidos de longitud, entre 19 y 23 nucleótidos de longitud, entre 19 y 21 nucleótidos de longitud, entre 21 y 25 nucleótidos de longitud o entre 21 y 23 nucleótidos de longitud.
La cadena sentido y la cadena antisentido típicamente forman un ARN bicatenario dúplex ("ARNbc"), también denominado en este documento "agente de ARNi". La región dúplex de un agente de ARNi puede tener una longitud de entre 12 y 30 pares de nucleótidos. Por ejemplo, la región dúplex puede tener una longitud de entre 14 y 30 pares de nucleótidos, una longitud de entre 17 y 30 pares de nucleótidos, una longitud de entre 27 y 30 pares de nucleótidos, una longitud de entre 17 y 23 pares de nucleótidos, una longitud de entre 17 y 21 pares de nucleótidos, una longitud de entre 17 y 19 pares de nucleótidos, una longitud de entre 19 y 25 pares de nucleótidos, una longitud de entre 19 y 23 pares de nucleótidos, una longitud de entre 19 y 21 pares de nucleótidos, una longitud de entre 21 y 25 pares de nucleótidos o una longitud de entre 21 y 23 pares de nucleótidos. En otro ejemplo, la región dúplex se selecciona de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26 y 27 nucleótidos de longitud.
En un caso, el agente de ARNi puede contener una o más regiones salientes y/o grupos de encaperuzamiento en el extremo 3', el extremo 5', o ambos extremos de una o ambas cadenas. El saliente puede tener una longitud de 1 a 6 nucleótidos, por ejemplo, una longitud de 2 a 6 nucleótidos, una longitud de 1 a 5 nucleótidos, una longitud de 2 a 5 nucleótidos, una longitud de 1 a 4 nucleótidos, una longitud de 2 a 4 nucleótidos, una longitud de 1 a 3 nucleótidos, una longitud de 2 a 3 nucleótidos o una longitud de 1 a 2 nucleótidos. Los salientes pueden ser el resultado de que una cadena sea más larga que la otra, o el resultado de que dos cadenas de la misma longitud estén escalonadas. El saliente puede formar un desapareamiento con el ARNm diana, o puede ser complementario a las secuencias genéticas a las que se dirige, o puede ser otra secuencia. Las primeras y segundas cadenas también pueden unirse, por ejemplo, mediante bases adicionales para formar una horquilla, o mediante otros enlaces no básicos.
En un caso, los nucleótidos en la región saliente del agente de ARNi pueden ser cada uno independientemente un nucleótido modificado o no modificado que incluye, pero no se limita a, modificado con 2'-azúcar, tal como, 2-F, 2'-O-metil, timidina (T), 2'-O-metoxietil-5-metiluridina (Teo), 2'-O-metoxietiladenosina (Aeo), 2'-O-metoxietil-5-metilcitidina (m5Ceo) y cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, TT puede ser una secuencia saliente para cualquiera de los extremos de cualquiera de las cadenas. El saliente puede formar un desapareamiento con el ARNm diana, o puede ser complementario a las secuencias genéticas a las que se dirige, o puede ser otra secuencia.
Los salientes 5' o 3' de la cadena sentido, la cadena antisentido o ambas cadenas del agente de ARNi pueden estar fosforilados. En algunos casos, la o las regiones salientes contienen dos nucleótidos que tienen un fosforotioato entre ellos, donde los dos nucleótidos pueden ser iguales o diferentes. En un caso, el saliente está presente en el extremo 3' de la cadena sentido, la cadena antisentido o ambas cadenas. En un caso, este saliente 3' está presente en la cadena antisentido. En un caso, este saliente 3' está presente en la cadena sentido.
El agente de ARNi puede contener sólo un único saliente, lo que puede fortalecer la actividad de interferencia del ARNi, sin afectar su estabilidad general. Por ejemplo, el saliente monocatenario puede estar ubicado en el extremo 3'-terminal de la cadena sentido, o alternativamente en el extremo 3'-terminal de la cadena antisentido. El ARNi también puede tener un extremo romo, ubicado en el extremo 5' de la cadena antisentido (o en el extremo 3' de la cadena sentido) ov iceversa .Generalmente, la cadena antisentido del ARNi tiene un nucleótido saliente en el extremo 3', y el extremo 5' es romo. Sin querer limitarnos a la teoría, el extremo romo asimétrico en el extremo 5' de la cadena antisentido y el saliente del extremo 3' de la cadena antisentido favorecen la carga de la cadena guía en el proceso RISC.
Cualquiera de los ácidos nucleicos presentados en la divulgación puede sintetizarse y/o modificarse mediante métodos bien establecidos en la técnica, tal como los descritos en "Current protocols in nucleic acid chemistry", Beaucage, SL et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY, EE. UU. Las modificaciones incluyen, por ejemplo, modificaciones finales, por ejemplo, modificaciones del extremo 5' (fosforilación, conjugación, enlaces invertidos) o modificaciones del extremo 3' (conjugación, nucleótidos de ADN, enlaces invertidos, etc.); modificaciones de bases, por ejemplo, reemplazo con bases estabilizadoras, bases desestabilizadoras o bases que se aparean con un repertorio expandido de socios, eliminación de bases (nucleótidos básicos) o bases conjugadas; modificaciones de azúcar (por ejemplo, en la posición 2' o 4') o reemplazo del azúcar; y/o modificaciones de la estructura principal, incluida la modificación o reemplazo de los enlaces fosfodiéster. Los ejemplos específicos de compuestos de ARNi útiles en los casos descritos en este documento incluyen, pero no se limitan a, los ARN que contienen cadenas principales modificadas o ningún enlace internucleósido natural. Los ARN que tienen cadenas principales modificadas incluyen, entre otros, aquellos que no tienen un átomo de fósforo en la cadena principal. A los efectos de esta memoria descriptiva, y como a veces se hace referencia en la técnica, los ARN modificados que no tienen un átomo de fósforo en su estructura internucleosídica también pueden considerarse oligonucleósidos. En algunos casos, un ARNi modificado tendrá un átomo de fósforo en su estructura internucleósida.
Las cadenas principales de ARN modificadas incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metil y otros alquil fosfonatos incluyendo 3'-alquilen fosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos incluyendo 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y boranofosfatos que tienen enlaces 3'-5' normales, análogos de estos enlazados 2'-5' y aquellos que tienen polaridad invertida en donde los pares adyacentes de unidades de nucleósidos están enlazados 3'-5' a 5'-3' o 2'-5' a 5'-2'. También se incluyen diversas sales, sales mixtas y formas de ácidos libres.
Las patentes representativas de EE. UU. que enseñan la preparación de los enlaces que contienen fósforo anteriores incluyen, pero no se limitan a, las patentes de EE. UU. n.° 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.195; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.316; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; 5.625.050; 6.028.188; 6.124.445; 6.160.109; 6.169.170; 6.172.209; 6. 239.265; 6.277.603; 6.326.199; 6.346.614; 6.444.423; 6.531.590; 6.534.639; 6.608.035; 6.683.167; 6.858.715; 6.867.294; 6.878.805; 7.015.315; 7.041.816; 7.273.933; 7.321.029; y patente de EE. UU. RE39464.
Las estructuras principales de ARN modificadas que no incluyen un átomo de fósforo en su interior tienen estructuras principales que están formadas por enlaces internucleósidos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, heteroátomos mixtos y enlaces internucleósidos de alquilo o cicloalquilo, o uno o más enlaces internucleósidos heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Estos incluyen aquellos que tienen enlaces morfolino (formados en parte a partir de la porción de azúcar de un nucleósido); cadenas principales de siloxano; cadenas principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales de metileno formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales que contienen alquenos; cadenas principales de sulfamato; cadenas principales de metilenimino y metilenhidrazino; cadenas principales de sulfonato y sulfonamida; cadenas principales de amida; y otros que tienen partes componentes mixtas de N, O, S y CH2.
Las patentes representativas de EE. UU. que enseñan la preparación de los oligonucleósidos anteriores incluyen, pero no se limitan a, las patentes de EE. UU. n.° 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.64.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; y 5.677.439.
En otros casos, se contemplan miméticos de ARN adecuados para su uso en los ARNi, en los que tanto el azúcar como el enlace internucleósido, es decir, la estructura principal, de las unidades de nucleótidos se reemplazan con grupos nuevos. Las unidades base se mantienen para la hibridación con un compuesto diana de ácido nucleico apropiado. Uno de estos compuestos oligoméricos, un mimético de ARN que ha demostrado tener excelentes propiedades de hibridación, se denomina ácido nucleico peptídico (PNA). En los compuestos de PNA, la estructura de azúcar de un ARN se reemplaza por una estructura que contiene amida, en particular una estructura de aminoetilglicina. Las nucleobases se retienen y se unen directa o indirectamente a los átomos de nitrógeno aza de la porción amida de la cadena principal. Las patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de compuestos de PNA incluyen, entre otras, las patentes de EE. UU. n.° 5.539.082; 5.714.331; y 5.719.262. Se describen compuestos de PNA adicionales adecuados para su uso en los ARNi de la divulgación, por ejemplo, en Nielsen et al., Science, 1991,254, 1497-1500.
Algunos casos presentados en la divulgación incluyen ARN con cadenas principales de fosforotioato y oligonucleósidos con cadenas principales de heteroátomos, y en particular --CH<2>--NH--CH<2>-, --CH<2>- -N(CH<3>)--O--CH<2>--, --CH<2>--O-N(CH<3>)--CH<2>--, --CH<2>--N(CH<3>)--N(CH<3>)--CH<2>-- y --N(CH<3>)--CH<2>--CH<2>-- de la patente de EE. UU. n.2 5.489.677 mencionada anteriormente, y las cadenas principales de amida de la patente de EE. UU. n.° 5.602.240 mencionada anteriormente. En algunos casos, los ARN presentados en este documento tienen estructuras de cadena principal de morfolino de la patente de EE. UU. n.° 5.034.506 mencionada anteriormente.
Los ARN modificados también pueden contener uno o más restos de azúcar sustituidos. Los ARNi, por ejemplo, ARNbc, que aparecen en este documento pueden incluir uno de los siguientes en la posición 2': OH; F; O-, S- o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; o O-alquil-O-alquilo, donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C<1>a C<10>sustituido o no sustituido o alquenilo y alquinilo C<2>a C<10>. Las modificaciones adecuadas ejemplares incluyen O<m>CH<3>, O(CH<2>).<n>OCH<3>, O(CH<2>)<n>NH<2>, O(CH<2>)<n>CH<3>, O(CH<2>)<n>ONH<2>, y O(CH<2>)<n>ON<2>, donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. En otros casos, los ARNbc incluyen uno de los siguientes en la posición 2': alquilo inferior C<1>a C<10>, alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH<3>, OCN, Cl, Br, CN, CF<3>, OCF<3>, SOCH<3>, SO<2>CH<3>, ONO<2>, NO<2>, N<3>, NH<2>, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo reportero, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un ARNi, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un ARNi, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. En algunos casos, la modificación incluye un 2'-metoxietoxi (2'-O--CH<2>CH<2>OCH<3>, también conocido como 2'-O-(2-metoxietil) o 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504), es decir, un grupo alcoxi-alcoxi. Otra modificación ejemplar es 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O(CH<2>)<2>ON(CH<3>)<2>, también conocido como 2'-DMAOE, como se describe en los ejemplos a continuación, y 2'-dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la técnica como 2'-O-dimetilaminoetoxietilo o 2'-DMAEOE), es decir, 2'-O--CH<2>--O--CH<2>--N(CH<2>)<2>.
Otras modificaciones incluyen 2 '-metoxi (2 '-OCH<3>), 2 '-aminopropoxi (2 '-OCH<2>CH<2>CH<2>NH<2>) y 2 '-fluoro (2 '-F). También se pueden realizar modificaciones similares en otras posiciones del ARN de un ARNi, particularmente en la posición 3' del azúcar en el nucleótido terminal 3' o en ARNbcs unidos 2'-5' y la posición 5' del nucleótido terminal 5'. Los ARNi también pueden tener miméticos de azúcar, tales como restos de ciclobutilo en lugar del azúcar pentofuranosilo. Las patentes representativas de EE. UU. que enseñan la preparación de dichas estructuras de azúcar modificadas incluyen, pero no se limitan a, las patentes de EE. UU. n.° 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; y 5.700.920, algunas de las cuales son de propiedad común con la presente solicitud.
Un ARNi también puede incluir modificaciones o sustituciones de nucleobases (a menudo denominadas en la técnica simplemente como "base"). Tal como se utiliza en este documento, las nucleobases "no modificadas" o "naturales" incluyen las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales tales como la desoxitimina (dT), la 5-metilcitosina (5-me-C), la 5-hidroximetilcitosina, la xantina, la hipoxantina, la 2-aminoadenina, el 6 -metilo y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, el 2 -propilo y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, el 2 -tiouracilo, la 2-tiotimina y la 2-tiocitosina, el 5-halouracilo y la citosina, el 5-propiniluracilo y la citosina, el 6 -azouracilo, la citosina y la timina, el 5-uracilo (pseudouracilo), el 4-tiouracilo, el 8 -halo, el 8 -amino, el 8 -tiol, el 8 -tioalquilo, el 8 -hidroxi y otras adeninas y guaninas 8 -sustituidas, el 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8 -azaguanina y 8 -azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina. Otras nucleobases incluyen las descritas en la patente estadounidense n.° 3.687.808, las descritas en Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P., ed. Wiley-VCH, 2008; las descritas en The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J. L., ed. John Wiley & Sons, 1990; estas últimas descritas por Englisch et al., Angewandt e Chemie, Edición Internacional, 1991, 30, 613, y las divulgadas por Sanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S. T. y Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993. Algunas de estas nucleobases son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los compuestos oligoméricos presentados en la divulgación. Estos incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6 -azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y 0-6 sustituidas, incluidas 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha demostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina aumentan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico en 0,6-1,2 °C (Sanghvi, YS, Crooke, ST y Lebleu, B., Eds., ARNbc Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, págs. 276-278) y son sustituciones de bases ejemplares, incluso más particularmente cuando se combinan con modificaciones de 2 '-O-metoxietil azúcar.
Las patentes representativas de EE. UU. que enseñan la preparación de algunas de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente, así como otras nucleobases modificadas, incluyen, pero no se limitan a, las patentes de EE. UU. mencionadas anteriormente n.23.687.808, 4.845.205; 5.130.30; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121, 5.596.091; 5.614.617; 5.681.941; 5.750.692; 6.015.886; 6.147.200; 6.166.197; 6.222.025; 6.235.887; 6.380.368; 6.528.640; 6.639.062; 6.617.438; 7.045.610; 7.427.672; y 7.495.088.
El ARN de un ARNi también se puede modificar para incluir uno o más restos de azúcar bicíclicos. Un "azúcar bicíclico" es un anillo de furanosilo modificado por la unión de dos átomos. Un "nucleósido bicíclico" ("BNA") es un nucleósido que tiene un resto de azúcar que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar, formando así un sistema de anillo bicíclico. En ciertos casos, el puente conecta el carbono 4' y el carbono 2' del anillo de azúcar. Por lo tanto, en algunos casos un agente de la divulgación puede incluir el ARN de un ARNi que también puede modificarse para incluir uno o más ácidos nucleicos bloqueados (LNA). Un ácido nucleico bloqueado es un nucleótido que tiene un resto de ribosa modificado en el que el resto de ribosa comprende un puente adicional que conecta los carbonos 2' y 4'. En otras palabras, un LNA es un nucleótido que comprende un resto de azúcar bicíclico que comprende un puente 4'-CH2-O-2'. Esta estructura "bloquea" efectivamente la ribosa en la conformación estructural 3'-endo. Se ha demostrado que la adición de ácidos nucleicos bloqueados a los ARNpi aumenta la estabilidad del ARNpi en suero y reduce los efectos no deseados (Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31 (12):3185-3193).
Los ejemplos de nucleósidos bicíclicos para uso en los polinucleótidos de la divulgación incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden un puente entre los átomos del anillo de ribosilo 4' y 2'. En ciertos casos, los agentes polinucleotídicos antisentido de la divulgación incluyen uno o más nucleósidos bicíclicos que comprenden un puente 4' a 2 '. Los ejemplos de dichos nucleósidos bicíclicos con puente de 4' a 2 ' incluyen, pero no se limitan a, 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' también denominado "etilo restringido" o "cEt") y 4'-CH(C<h>2<o c>H3)-0-2' (y análogos del mismo; véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 7.399.845); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' (y análogos del mismo; véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 8.278.283); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (y análogos del mismo; véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 8.278.425); 4'-CH2-ON(CH3)-2' (véase, por ejemplo, EE. UU. publicación de patente n.° 2004/0171570); 4'-CH2-N(R)-O-2', donde R es H, alquilo C1-C12 o un grupo protector (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 7.427.672); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (véase, por ejemplo, Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); y 4'-CH2-C(=CH2)-2' (y análogos de los mismos; véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 8.278.426).
Otras patentes y publicaciones de patentes de EE. UU. representativas que enseñan la preparación de nucleótidos de ácidos nucleicos bloqueados incluyen, pero no se limitan a, las siguientes: patentes de EE. UU. n.° 6.268.490; 6.525.191; 6.670.461; 6.770.748; 6.794.499; 6.998.484; 7.053.207; 7.034.133; 7.084.125; 7.399.845; 7.427.672; 7.569.686; 7.741.457; 8.022.193; 8.030.467; 8.278.425; 8.278.426; 8.278.283; US 2008/0039618; y US 2009/0012281.
Cualquiera de los nucleósidos bicíclicos anteriores se puede preparar con una o más configuraciones de azúcar estereoquímicas que incluyen, por ejemplo, a-L-ribofuranosa y p-D-ribofuranosa (véase el documento WO 99/14226).
El ARN de un ARNi también se puede modificar para incluir uno o más nucleótidos de etilo restringidos. Como se utiliza en este documento, un "nucleótido de etilo restringido" o "cEt" es un ácido nucleico bloqueado que comprende un resto de azúcar bicíclico que comprende un puente 4'-CH(CH3)-0-2'. En un caso, un nucleótido de etilo restringido está en la conformación S, a la que aquí se hace referencia como "S-cEt".
Un ARNi de la divulgación también puede incluir uno o más "nucleótidos conformacionalmente restringidos" ("CRN"). Los CRN son análogos de nucleótidos con un enlace que conecta los carbonos C2' y C4' de la ribosa o los carbonos C3 y -C5' de la ribosa. Los CRN bloquean el anillo de ribosa en una conformación estable y aumentan la afinidad de hibridación con el ARNm. El enlazador tiene la longitud suficiente para colocar el oxígeno en una posición óptima para estabilidad y afinidad, dando como resultado una menor fruncimiento del anillo de ribosa.
Las publicaciones representativas que enseñan la preparación de algunos de los CRN mencionados anteriormente incluyen, pero no se limitan a, la publicación de patente de EE. UU. n.° 2013/0190383 y la publicación PCT WO 2013/036868.
Uno o más de los nucleótidos de un ARNi de la divulgación también pueden incluir un nucleótido sustituido con hidroximetilo. Un "nucleótido sustituido con hidroximetilo" es un 2'-3'-seco-nucleótido acíclico, también conocido como modificación de "ácido nucleico desbloqueado" ("UNA").
Las publicaciones representativas de EE. UU. que enseñan la preparación de UNA incluyen, pero no se limitan a, la patente de EE. UU. N.° 8.314.227 y las publicaciones de patente de EE. UU. N.° 2013/0096289, 2013/0011922 y 2011/0313020.
Las modificaciones potencialmente estabilizadoras de los extremos de las moléculas de ARN pueden incluir N-(acetilaminocaproil)-4-hidroxiprolinol (Hyp-C6 -NHAc), N-(caproil-4-hidroxiprolinol (Hyp-C6 ), N-(acetil-4-hidroxiprolinol (Hyp-NHAc), timidina-2'-0-desoxitimidina (éter), N-(aminocaproil)-4-hidroxiprolinol (Hyp-C6 -amino), 2-docosanoiluridina-3"-fosfato, base invertida dT(idT) y otros. La divulgación de esta modificación se puede encontrar en la publicación PCT n2 WO 2011/005861.
A. ARNi modificados que comprenden motivos de la invención
En ciertos casos de la divulgación, los agentes de ARNi bicatenario de la divulgación incluyen agentes con modificaciones químicas como se divulga, por ejemplo, en la Solicitud Provisional de EE. UU. n.° 61/561,710, presentada el 18 de noviembre de 2011, o en PCT/US2012/065691, presentada el 16 de noviembre de 2012.
Como se muestra en este documento, en la Solicitud Provisional n.° 61/561.710 y en PCT/US2012/065691, se puede obtener un resultado superior al introducir uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en una cadena sentido y/o una cadena antisentido de un agente de ARNi, particularmente en el sitio de escisión o cerca de él. En algunos casos, la cadena sentido y la cadena antisentido del agente de ARNi pueden modificarse por completo. La introducción de estos motivos interrumpe el patrón de modificación, si está presente, de la cadena sentido y/o antisentido. El agente de ARNi puede conjugarse opcionalmente con un ligando derivado de GalNAc, por ejemplo en la cadena sentido. Los agentes de ARNi resultantes presentan una actividad de silenciamiento genético superior.
Más específicamente, se ha descubierto sorprendentemente que cuando la cadena sentido y la cadena antisentido del agente de ARNi bicatenario se modifican para tener uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en o cerca del sitio de escisión de al menos una cadena de un agente de ARNi, la actividad de silenciamiento génico del agente de ARNi se mejoró de forma superior.
En un caso, el agente de ARNi es un 19-mero romo de doble extremo de 19 nucleótidos de longitud, en donde la cadena sentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-F en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 7, 8 , 9 desde el extremo 5'. La cadena antisentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-O-metilo en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 11, 12 y 13 desde el extremo 5'.
En otro caso, el agente de ARNi es un 20-mero romo de doble extremo de 20 nucleótidos de longitud, en donde la cadena sentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-F en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 8 , 9, 10 desde el extremo 5'. La cadena antisentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-O-metilo en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 11, 12 y 13 desde el extremo 5'.
En otro caso más, el agente de ARNi es un 21 -mero romo de doble extremo de 21 nucleótidos de longitud, en donde la cadena sentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-F en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 9, 10, 11 desde el extremo 5'. La cadena antisentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-O-metilo en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 11, 12 y 13 desde el extremo 5'.
En un caso, el agente de ARNi comprende una cadena sentido de 21 nucleótidos y una cadena antisentido de 23 nucleótidos, en donde la cadena sentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-F en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 9, 10, 11 desde el extremo 5'; la cadena antisentido contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-O-metilo en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 11, 12, 13 desde el extremo 5', en donde un extremo del agente de ARNi es romo, mientras que el otro extremo comprende un saliente de 2 nucleótidos. Preferiblemente, el saliente de 2 nucleótidos está en el extremo 3' de la cadena antisentido. Cuando el saliente de 2 nucleótidos está en el extremo 3' de la cadena antisentido, puede haber dos enlaces internucleótidos de fosforotioato entre los tres nucleótidos terminales, donde dos de los tres nucleótidos son los nucleótidos salientes, y el tercer nucleótido es un nucleótido emparejado junto al nucleótido saliente. En un caso, el agente de ARNi tiene además dos enlaces internucleótidos de fosforotioato entre los tres nucleótidos terminales tanto en el extremo 5' de la cadena sentido como en el extremo 5' de la cadena antisentido. En un caso, cada nucleótido de la cadena sentido y de la cadena antisentido del agente de ARNi, incluidos los nucleótidos que forman parte de los motivos, son nucleótidos modificados. En un caso, cada residuo se modifica independientemente con un 2'-O-metilo o 3'-fluoro, por ejemplo, en un motivo alterno. Opcionalmente, el agente de ARNi comprende además un ligando (preferiblemente GalNAc3).
En un caso, el agente de ARNi comprende cadenas sentido y antisentido, en donde el agente de ARNi comprende una primera cadena que tiene una longitud que es de al menos 25 y como máximo 29 nucleótidos y una segunda cadena que tiene una longitud que es como máximo 30 nucleótidos con al menos un motivo de tres modificaciones 2'-O-metilo en tres nucleótidos consecutivos en la posición 11, 12, 13 desde el extremo 5'; en donde el extremo 3' de la primera cadena y el extremo 5' de la segunda cadena forman un extremo romo y la segunda cadena es 1 a 4 nucleótidos más larga en su extremo 3' que la primera cadena, en donde la región dúplex es una región que tiene al menos 25 nucleótidos de longitud, y la segunda cadena es suficientemente complementaria a un ARNm diana a lo largo de al menos 19 nucleótidos de la longitud de la segunda cadena para reducir la expresión del gen diana cuando el agente de ARNi se introduce en una célula de mamífero, y en donde la escisión del agente de ARNi da como resultado preferentemente un ARNpi que comprende el extremo 3' de la segunda cadena, reduciendo así la expresión del gen diana en el mamífero. Opcionalmente, el agente de ARNi comprende además un ligando.
En un caso, la cadena sentido del agente de ARNi contiene al menos un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, donde uno de los motivos aparece en el sitio de escisión en la cadena sentido.
En un caso, la cadena antisentido del agente de ARNi también puede contener al menos un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, donde uno de los motivos aparece en o cerca del sitio de escisión en la cadena antisentido.
Para un agente de ARNi que tiene una región dúplex de 17 a 23 nucleótidos de longitud, el sitio de escisión de la cadena antisentido normalmente está alrededor de las posiciones 10, 11 y 12 desde el extremo 5'. Así, los motivos de tres modificaciones idénticas pueden aparecer en las posiciones 9, 10, 11; 10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14; o 13, 14, 15 de la cadena antisentido, comenzando el recuento desde el 1er nucleótido desde el extremo 5' de la cadena antisentido, o bien, comenzando el recuento desde el 1er nucleótido emparejado dentro de la región dúplex desde el extremo 5' de la cadena antisentido. El sitio de escisión en la cadena antisentido también puede cambiar según la longitud de la región dúplex del ARNi desde el extremo 5'.
La cadena sentido del agente de ARNi puede contener al menos un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en el sitio de escisión de la cadena; y la cadena antisentido puede tener al menos un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en o cerca del sitio de escisión de la cadena. Cuando la cadena sentido y la cadena antisentido forman un dúplex de ARNbc, la cadena sentido y la cadena antisentido pueden alinearse de tal manera que un motivo de los tres nucleótidos de la cadena sentido y un motivo de los tres nucleótidos de la cadena antisentido tengan al menos una superposición de nucleótidos, es decir, al menos uno de los tres nucleótidos del motivo en la cadena sentido forma un par de bases con al menos uno de los tres nucleótidos del motivo en la cadena antisentido. Alternativamente, al menos dos nucleótidos pueden superponerse, o los tres nucleótidos pueden superponerse.
En un caso, la cadena sentido del agente de ARNi puede contener más de un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos. El primer motivo puede aparecer en o cerca del sitio de escisión de la cadena, y los otros motivos pueden ser una modificación de ala. El término "modificación de ala" en este documento se refiere a un motivo que aparece en otra porción de la cadena que está separada del motivo en o cerca del sitio de escisión de la misma cadena. La modificación de ala es adyacente al primer motivo o está separada por al menos uno o más nucleótidos. Cuando los motivos están inmediatamente adyacentes entre sí, la química de los motivos es distinta entre sí y cuando los motivos están separados por uno o más nucleótidos, la química puede ser la misma o diferente. Pueden estar presentes dos o más modificaciones de ala. Por ejemplo, cuando hay dos modificaciones de ala, cada modificación de ala puede ocurrir en un extremo con respecto al primer motivo que está en el sitio de escisión o cerca de él, o en cualquier lado del motivo principal.
Al igual que la cadena sentido, la cadena antisentido del agente de ARNi puede contener más de un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, con al menos uno de los motivos apareciendo en el sitio de escisión de la cadena o cerca del mismo. Esta cadena antisentido también puede contener una o más modificaciones de ala en una alineación similar a las modificaciones de ala que pueden estar presentes en la cadena sentido.
En un caso, la modificación de ala en la cadena sentido o la cadena antisentido del agente de ARNi normalmente no incluye el primer o los dos primeros nucleótidos terminales en el extremo 3', el extremo 5' o ambos extremos de la cadena.
En otro caso, la modificación de ala en la cadena sentido o la cadena antisentido del agente de ARNi normalmente no incluye el primer o los dos primeros nucleótidos emparejados dentro de la región dúplex en el extremo 3', el extremo 5' o ambos extremos de la cadena.
Cuando la cadena sentido y la cadena antisentido del agente de ARNi contienen cada una al menos una modificación de ala, las modificaciones de ala pueden caer en el mismo extremo de la región dúplex y tener una superposición de uno, dos o tres nucleótidos.
Cuando la cadena sentido y la cadena antisentido del agente de ARNi contienen cada una al menos dos modificaciones de ala, la cadena sentido y la cadena antisentido se pueden alinear de tal manera que dos modificaciones de cada una de las cadenas caigan en un extremo de la región dúplex, con una superposición de uno, dos o tres nucleótidos; dos modificaciones de cada una de las cadenas caigan en el otro extremo de la región dúplex, con una superposición de uno, dos o tres nucleótidos; dos modificaciones de una cadena caigan en cada lado del motivo principal, con una superposición de uno, dos o tres nucleótidos en la región dúplex.
En un caso, cada nucleótido de la cadena sentido y de la cadena antisentido del agente de ARNi, incluidos los nucleótidos que forman parte de los motivos, pueden modificarse. Cada nucleótido puede modificarse con la misma o diferente modificación que puede incluir una o más alteraciones de uno o ambos oxígenos de fosfato no enlazantes y/o de uno o más de los oxígenos de fosfato enlazantes; alteración de un constituyente del azúcar ribosa, por ejemplo, del hidroxilo 2 ' en el azúcar ribosa; reemplazo total de la porción fosfato con enlazadores "desfosfo"; modificación o reemplazo de una base natural; y reemplazo o modificación de la estructura principal de ribosa-fosfato.
Como los ácidos nucleicos son polímeros de subunidades, muchas de las modificaciones ocurren en una posición que se repite dentro de un ácido nucleico, por ejemplo, una modificación de una base, o un resto de fosfato, o un O no enlazante de un resto de fosfato. En algunos casos la modificación ocurrirá en todas las posiciones del sujeto en el ácido nucleico, pero en muchos casos no será así. A modo de ejemplo, una modificación sólo puede ocurrir en una posición terminal 3' o 5', sólo puede ocurrir en una región terminal, por ejemplo, en una posición en un nucleótido terminal o en los últimos 2, 3, 4, 5 o 10 nucleótidos de una cadena. Una modificación puede ocurrir en una región de doble cadena, en una región de cadena simple o en ambas. Una modificación puede ocurrir sólo en la región de doble cadena de un ARN o puede ocurrir sólo en una región de cadena simple de un ARN. Por ejemplo, una modificación de fosforotioato en una posición O no enlazante puede ocurrir solamente en uno o ambos extremos, puede ocurrir solamente en una región terminal, por ejemplo, en una posición en un nucleótido terminal o en los últimos 2, 3, 4, 5 o 10 nucleótidos de una hebra, o puede ocurrir en regiones de doble cadena y de cadena simple, particularmente en los extremos. El o los extremos 5' pueden estar fosforilados.
Es posible, por ejemplo, mejorar la estabilidad, incluir bases particulares en salientes, o incluir nucleótidos modificados o sustitutos de nucleótidos, en salientes de cadena simple, por ejemplo en un saliente 5' o 3', o en ambos. Por ejemplo, puede ser deseable incluir nucleótidos de purina en los salientes. En algunos casos, todas o algunas de las bases en un saliente de 3' o 5' pueden modificarse, por ejemplo, con una modificación descrita en este documento. Las modificaciones pueden incluir, por ejemplo, el uso de modificaciones en la posición 2 ' del azúcar ribosa con modificaciones que son conocidas en la técnica, por ejemplo, el uso de desoxirribonucleótidos, 2 '-desoxi-2 '-fluoro (2 '-F) o 2'-O-metilo modificado en lugar del riboazúcar de la nucleobase, y modificaciones en el grupo fosfato, por ejemplo, modificaciones de fosforotioato. Los salientes no necesitan ser homólogos a la secuencia diana.
En un caso, cada residuo de la cadena sentido y de la cadena antisentido se modifica independientemente con LNA, HNA, CeNA, 2'-metoxietilo, 2'-O-metilo, 2'-O-alilo, 2'-C-alilo, 2'-desoxi, 2'-hidroxilo o 2'-fluoro. Las cadenas pueden contener más de una modificación. En un caso, cada residuo de la cadena sentido y de la cadena antisentido se modifica independientemente con 2'-O-metilo o 2'-fluoro.
Normalmente hay al menos dos modificaciones diferentes en la cadena sentido y en la cadena antisentido. Estas dos modificaciones pueden ser las modificaciones 2'-O-metilo o 2'-fluoro, u otras.
En un caso, el N<a>y/o N<b>comprenden modificaciones de un patrón alterno. El término "motivo alterno" como se utiliza en este documento se refiere a un motivo que tiene una o más modificaciones, ocurriendo cada modificación en nucleótidos alternados de una cadena. El nucleótido alterno puede referirse a uno por cada dos nucleótidos o uno por cada tres nucleótidos, o un patrón similar. Por ejemplo, si A, B y C representan cada uno un tipo de modificación del nucleótido, el motivo alterno puede ser "A<b>ABABABA<b>A<b>...," "AABBAABBAABB...," "AABAABAABAAB...," "AAABAAABAAAB...," "AAABBBAAABBB...," o "ABCABCABCABC...," etc.
El tipo de modificaciones contenidas en el motivo alterno pueden ser iguales o diferentes. Por ejemplo, si A, B, C, D representan cada uno un tipo de modificación en el nucleótido, el patrón alterno, es decir, las modificaciones en cada uno de los otros nucleótidos, pueden ser las mismas, pero cada una de las cadenas sentido o antisentido se puede seleccionar entre varias posibilidades de modificaciones dentro del motivo alterno, tal como "ABABAB...", "ACACAC..." "BDBDBD..." o "CDCDCD...", etc.
En un caso, el agente de ARNi de la divulgación comprende que el patrón de modificación del motivo alterno en la cadena sentido se desplaza con respecto al patrón de modificación del motivo alterno en la cadena antisentido. El desplazamiento puede ser tal que el grupo modificado de nucleótidos de la cadena sentido corresponda a un grupo modificado de forma diferente de nucleótidos de la cadena antisentido yv iceve rsa .Por ejemplo, la cadena sentido cuando se empareja con la cadena antisentido en el dúplex de ARNbc, el motivo alterno en la cadena sentido puede comenzar con "ABABAB" desde 5'-3' de la hebra y el motivo alterno en la cadena antisentido puede comenzar con "BABABA" desde 5'-3' de la cadena dentro de la región dúplex. Como otro ejemplo, el motivo alterno en la cadena sentido puede comenzar con "AABBAABB" desde 5'-3' de la cadena, y el motivo alterno en la cadena antisentido puede comenzar con "BBAABBAA" desde 5'-3' de la cadena dentro de la región dúplex, de modo que hay un cambio completo o parcial de los patrones de modificación entre la cadena sentido y la cadena antisentido.
En un caso, el agente de ARNi comprende el patrón del motivo alterno de la modificación 2'-O-metilo y la modificación 2'-F en la cadena sentido inicialmente tiene un desplazamiento con respecto al patrón del motivo alterno de la modificación 2'-O-metilo y la modificación 2'-F en la cadena antisentido inicialmente, es decir, el nucleótido modificado 2'-O-metilo en la cadena sentido se aparea con un nucleótido modificado 2'-F en la cadena antisentido y viceversa. La posición 1 de la cadena sentido puede comenzar con la modificación 2'-F, y la posición 1 de la cadena antisentido puede comenzar con la modificación 2'-O-metilo.
La introducción de uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en la cadena sentido y/o la cadena antisentido interrumpe el patrón de modificación inicial presente en la cadena sentido y/o la cadena antisentido. Esta interrupción del patrón de modificación de la cadena sentido y/o antisentido mediante la introducción de uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en la cadena sentido y/o antisentido mejora sorprendentemente la actividad de silenciamiento del gen diana.
En un caso, cuando se introduce el motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en cualquiera de las cadenas, la modificación del nucleótido junto al motivo es una modificación diferente a la modificación del motivo. Por ejemplo, la porción de la secuencia que contiene el motivo es "...N<a>YYYN<b>...", donde "Y" representa la modificación del motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, y "N<a>" y "N<b>" representan una modificación del nucleótido junto al motivo "YYY" que es diferente a la modificación de Y, y donde N<a>y N<b>pueden ser modificaciones iguales o diferentes. Alternativamente, N<a>y/o N<b>pueden estar presentes o ausentes cuando hay una modificación de ala presente.
El agente de ARNi puede comprender además al menos un enlace internucleótido de fosforotioato o metilfosfonato. La modificación del enlace internucleótido fosforotioato o metilfosfonato puede ocurrir en cualquier nucleótido de la cadena sentido o de la cadena antisentido o en ambas cadenas en cualquier posición de la cadena. Por ejemplo, la modificación del enlace internucleotídico puede ocurrir en cada nucleótido de la cadena sentido y/o de la cadena antisentido; cada modificación del enlace intemudeotídico puede ocurrir en un patrón alterno en la cadena sentido y/o en la cadena antisentido; o la cadena sentido o la cadena antisentido pueden contener ambas modificaciones del enlace internucleotídico en un patrón alterno. El patrón alterno de la modificación del enlace internucleótido en la cadena sentido puede ser el mismo o diferente de la cadena antisentido, y el patrón alterno de la modificación del enlace internucleótido en la cadena sentido puede tener un desplazamiento con respecto al patrón alterno de la modificación del enlace internucleótido en la cadena antisentido.
En un caso, el ARNi comprende una modificación del enlace internucleótido fosforotioato o metilfosfonato en la región saliente. Por ejemplo, la región saliente puede contener dos nucleótidos que tienen un enlace internucleotídico fosforotioato o metilfosfonato entre los dos nucleótidos. También se pueden realizar modificaciones de enlace entre nucleótidos para unir los nucleótidos salientes con los nucleótidos emparejados terminales dentro de la región dúplex. Por ejemplo, al menos 2, 3, 4 o todos los nucleótidos salientes pueden estar unidos a través de enlaces internucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato y, opcionalmente, puede haber enlaces internucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato adicionales que unan el nucleótido saliente con un nucleótido emparejado que esté al lado del nucleótido saliente. Por ejemplo, puede haber al menos dos enlaces internucleotídicos de fosforotioato entre los tres nucleótidos terminales, en los que dos de los tres nucleótidos son nucleótidos salientes y el tercero es un nucleótido emparejado junto al nucleótido saliente. Estos tres nucleótidos terminales pueden estar en el extremo 3' de la cadena antisentido, el extremo 3' de la cadena sentido, el extremo 5' de la cadena antisentido y/o el extremo 5' de la cadena antisentido.
En un caso, el saliente de 2 nucleótidos está en el extremo 3' de la cadena antisentido, y hay dos enlaces internucleotídicos de fosforotioato entre los tres nucleótidos terminales, donde dos de los tres nucleótidos son los nucleótidos salientes y el tercer nucleótido es un nucleótido emparejado junto al nucleótido saliente. Opcionalmente, el agente de ARNi puede tener además dos enlaces internucleotídicos de fosforotioato entre los tres nucleótidos terminales tanto en el extremo 5' de la cadena sentido como en el extremo 5' de la cadena antisentido.
En un caso, el agente de ARNi comprende emparejamiento(s) erróneo(s) con el diana, dentro del dúplex, o combinaciones de los mismos. Un "emparejamiento erróneo" puede ser un apareamiento de bases no canónico o un apareamiento de nucleótidos distinto al canónico. El emparejamiento erróneo puede ocurrir en la región del saliente o en la región dúplex. El par de bases se puede clasificar en función de su propensión a promover la disociación o la fusión (por ejemplo, en la energía libre de asociación o disociación de un emparejamiento en particular, el enfoque más simple es examinar los pares sobre una base de par individual, aunque también se puede utilizar el análisis del vecino próximo o similar). En términos de promover la disociación: Se prefiere A:U sobre G:C; se prefiere G:U sobre G:C; y se prefiere I:C sobre G:C (I=inosina). Los emparejamientos erróneos, por ejemplo, los emparejamientos no canónicos o distintos de los canónicos (como se describe en otra parte aquí) se prefieren a los emparejamientos canónicos (A:T, A:U, G:C); y los emparejamientos que incluyen una base universal se prefieren a los emparejamientos canónicos. Una "base universal" es una base que exhibe la capacidad de reemplazar cualquiera de las cuatro bases normales (G, C, A y U) sin desestabilizar significativamente las interacciones de pares de bases vecinos ni alterar la utilidad bioquímica funcional esperada del oligonucleótido modificado. Los ejemplos no limitantes de bases universales incluyen 2 '-desoxiinosina (desoxinucleótido de hipoxantina) o sus derivados, análogos de nitroazol y bases aromáticas hidrofóbicas que no forman enlaces de hidrógeno.
En un caso, el agente de ARNi comprende al menos uno de los primeros 1, 2, 3, 4 o 5 pares de bases dentro de las regiones dúplex del extremo 5' de la cadena antisentido seleccionada independientemente del grupo de: A:U, G:U, I:C y pares con emparejamiento erróneo, por ejemplo, emparejamientos no canónicos o distintos de los canónicos o emparejamientos que incluyen una base universal, para promover la disociación de la cadena antisentido en el extremo 5' del dúplex.
En un caso, el nucleótido en la posición 1 dentro de la región dúplex desde el extremo 5' en la cadena antisentido se selecciona del grupo que consiste en A, dA, dU, U y dT. Alternativamente, al menos uno de los primeros 1,2 o 3 pares de bases dentro de la región dúplex del extremo 5' de la cadena antisentido es un par de bases AU. Por ejemplo, el primer par de bases dentro de la región dúplex del extremo 5' de la cadena antisentido es un par de bases AU. En otro caso, el nucleótido en el extremo 3' de la cadena sentido es desoxitimina (dT). En otro caso, el nucleótido en el extremo 3' de la cadena antisentido es desoxitimina (dT). En un caso, hay una secuencia corta de nucleótidos de desoxitimina, por ejemplo, dos nucleótidos dT en el extremo 3' de la cadena sentido y/o antisentido.
En un caso, la secuencia de la cadena sentido puede representarse mediante la fórmula (I):
5' n<p>-N<a>-(X X X )<i>-N<b>-Y Y Y -N<b>-(Z Z Z )<j>-N<a>-n<q>3' (I)
en la que:
i y j son cada uno independientemente 0 o 1 ;
p y q son cada uno independientemente 0 -6 ;
cada N<a>representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende de 0 a 25 nucleótidos modificados, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de forma diferente;
cada N<b>representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende de 0 a 10 nucleótidos modificados;
cada n+ y n<q>representan independientemente un nucleótido saliente;
donde Nb e Y no tienen la misma modificación; y
XXX, YYY y ZZZ representan cada uno independientemente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos. Preferiblemente YYY son todos nucleótidos modificados 2'-F.
En un caso, el N<a>y/o N<b>comprenden modificaciones de patrón alterno.
En un caso, el motivo YYY aparece en o cerca del sitio de escisión de la cadena sentido. Por ejemplo, cuando el agente de ARNi tiene una región dúplex de 17-23 nucleótidos de longitud, el motivo YYY puede aparecer en el sitio de escisión o en sus proximidades (por ejemplo: puede aparecer en las posiciones 6 , 7, 8 , 7, 8 , 9, 8 , 9, 10, 9, 10, 11, 10, 11, 12 o 11, 12, 13) de - la cadena sentido, comenzando el recuento desde el primer nucleótido, desde el extremo 5'; u opcionalmente, comenzando el recuento en el 1<er>nucleótido emparejado dentro de la región dúplex, desde el extremo 5'.
En un caso, i es 1 y j es 0, o i es 0 y j es 1, o tanto i como j son 1. Por tanto, la cadena sentido se puede representar mediante las siguientes fórmulas:
5' n<p>-N<a>-YYY-N<b>-ZZZ-N<a>-n<q>3' (Ib);
5' n<p>-N<a>-XXX-N<b>-YYY-N<a>-n<q>3' (Ic);
o
5' n<p>-N<a>-XXX-N<b>-YYY-N<b>-ZZZ-N<a>-n<q>3' (Id).
Cuando la cadena sentido está representada por la fórmula (Ib), N<b>representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada N<a>puede representar independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende de 2 a 20, de 2 a 15 o de 2 a 10 nucleótidos modificados.
Cuando la cadena sentido se representa como fórmula (Ic), N<b>representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada N<a>puede representar independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende de 2 a 20, de 2 a 15 o de 2 a 10 nucleótidos modificados.
Cuando la cadena sentido se representa como fórmula (Id), cada N<b>representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Preferiblemente, N<b>es 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Cada N<a>puede representar independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2 20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cada uno de X, Y y Z pueden ser iguales o diferentes entre sí.
En otros casos, i es 0 y j es 0, y la cadena sentido puede representarse mediante la fórmula:
5' n<p>-N<a>-YYY- N<a>-n<q>3' (Ia).
Cuando la cadena sentido está representada por la fórmula (Ia), cada N<a>puede representar independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende de 2 a 20, de 2 a 15 o de 2 a 10 nucleótidos modificados.
En un caso, la secuencia de la cadena antisentido del ARNi puede representarse mediante la fórmula (II):
5' n<q'>-N<a>'-(Z'Z'Z')<k>-N<d>'-Y'Y"Y'-N<d>'-(X'X'X')<l>-N'<a>-n<p>' 3' (II)
en la que:
k y l son cada uno independientemente 0 o 1 ;
p' y q' son cada uno independientemente 0 -6 ;
cada N<a>' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende de 0 a 25 nucleótidos modificados, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de forma diferente;
cada N<b>' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende de 0 a 10 nucleótidos modificados;
cada n<p>' y n<g>' representan independientemente un nucleótido saliente;
donde N<b>' e Y' no tienen la misma modificación;
y
X'X'X', Y'Y'Y' y Z'Z'Z' representan cada uno independientemente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos.
En un caso, N<a>' y/o N<b>' comprenden modificaciones de patrón alterno.
El motivo Y'Y'Y' aparece en o cerca del sitio de escisión de la cadena antisentido. Por ejemplo, cuando el agente de ARNi tiene una región dúplex de 17-23 nucleótidos de longitud, el motivo Y'Y'Y' puede aparecer en las posiciones 9, 10, 11; 10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14; o 13, 14, 15 de la cadena antisentido, con el recuento comenzando desde el 1<er>nucleótido, desde el extremo 5'; u opcionalmente, el recuento comenzando en el 1<er>nucleótido emparejado dentro de la región dúplex, desde el extremo 5'. Preferiblemente, el motivo Y'Y'Y' aparece en las posiciones 11, 12, 13. En un caso, el motivo Y'Y'Y' son todos nucleótidos modificados 2'-OMe.
En un caso, k es 1 y l es 0, o k es 0 y l es 1, o tanto k como l son 1.
Por tanto, la cadena antisentido puede representarse mediante las siguientes fórmulas:
5' n<q'>-N<a>'-Z'Z'Z'-N<b>'-Y'Y'Y'-N<a>'-n<p'>3' (IIb);
5' n<q>-N<a>'-Y'Y'Y'-N<b>'-X'X'X'-n<p'>3' (IIc);
o
5' n<q>-N<a>'- Z'Z'Z'-N<b>'-Y'Y'Y'-N<b>'- X'X'X'-N<a>'-n<p'>3' (IId).
Cuando la cadena antisentido está representada por la fórmula (Ilb), N<b>' representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada N<a>' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende de 2 a 20, de 2 a 15 o de 2 a 10 nucleótidos modificados.
Cuando la cadena antisentido se representa como fórmula (IIc), N<b>' representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada N<a>' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende de 2 a 20, de 2 a 15 o de 2 a 10 nucleótidos modificados.
Cuando la cadena antisentido se representa como fórmula (IId), cada N<b>' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada N<a>' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende de 2 a 20, de 2 a 15 o de 2 a 10 nucleótidos modificados. Preferiblemente, N<b>es 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6.
En otros casos, k es 0 y l es 0 y la cadena antisentido puede representarse mediante la fórmula:
5' n<p'>-N<a'>-Y'Y'Y'-N<a'>-n<q'>3' (Ia).
Cuando la cadena antisentido se representa como fórmula (IIa), cada N<a>' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2 -20 , 2-15 o 2 -10 nucleótidos modificados.
Cada uno de X', Y' y Z' pueden ser iguales o diferentes entre sí.
Cada nucleótido de la cadena sentido y de la cadena antisentido puede modificarse independientemente con LNA, HNA, CeNA, 2'-metoxietilo, 2'-O-metilo, 2'-O-alilo, 2'-C-alilo, 2'-hidroxilo o 2'-fluoro. Por ejemplo, cada nucleótido de la cadena sentido y de la cadena antisentido se modifica independientemente con 2'-O-metilo o 2'-fluoro. Cada X, Y, Z, X', Y' y Z', en particular, pueden representar una modificación 2'-O-metilo o una modificación 2'-fluoro.
En un caso, la cadena sentido del agente de ARNi puede contener el motivo YYY que aparece en las posiciones 9, 10 y 11 de la cadena cuando la región dúplex tiene 21 nt, comenzando el recuento desde el 1<er>nucleótido desde el extremo 5', u opcionalmente, comenzando el recuento en el 1<er>nucleótido emparejado dentro de la región dúplex, desde el extremo 5'; e Y representa la modificación 2'-F. La cadena sentido puede contener además motivos XXX o motivos ZZZ como modificaciones de ala en el extremo opuesto de la región dúplex; y XXX y ZZZ representan cada uno independientemente una modificación 2'-OMe o una modificación 2'-F.
En un caso, la cadena antisentido puede contener el motivo Y'Y'Y' que aparece en las posiciones 11, 12, 13 de la cadena, comenzando el recuento desde el 1<er>nucleótido desde el extremo 5', u opcionalmente, comenzando el recuento en el 1<er>nucleótido emparejado dentro de la región dúplex, desde el extremo 5'; e Y' representa la modificación 2'-O-metilo. La cadena antisentido puede contener además un motivo X'X'X' o motivos Z'Z'Z' como modificaciones del ala en el extremo opuesto de la región dúplex; y X'X'X' y Z'Z'Z' representan cada uno independientemente una modificación 2'-OMe o una modificación 2'-F.
La cadena sentido representada por cualquiera de las fórmulas anteriores (Ia), (Ib), (Ic) y (Id) forma un dúplex con una cadena antisentido representada por cualquiera de las fórmulas (IIa), (IIb), (IIc) y (IId), respectivamente.
En consecuencia, los agentes de ARNi para su uso en los métodos de la divulgación pueden comprender una cadena sentido y una cadena antisentido, teniendo cada cadena de 14 a 30 nucleótidos, estando el dúplex de ARNi representado por la fórmula (III):
en la que:
i, j, k y l son cada uno independientemente 0 o 1 ;
p, p', q y q' son cada uno independientemente 0 -6 ;
cada N<a>y N<a>' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende de 0 a 25 nucleótidos modificados, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de forma diferente;
cada N<b>y N<b>' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende de 0 a 10 nucleótidos modificados;
donde
cada n<p>', n<p>, n<q>', y n<q>, cada uno de los cuales puede estar presente o no, representa independientemente un nucleótido saliente; y
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' y Z'Z'Z' representan cada uno independientemente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos.
En un caso, i es 0 y j es 0; o i es 1 y j es 0; o i es 0 y j es 1; o tanto i como j son 0; o tanto i como j son 1. En otro caso, k es 0 y l es 0 ; o k es 1 y l es 0 ; k es 0 y l es 1 ; o tanto k como l son 0 ; o tanto k como l son 1.
Las combinaciones ejemplares de la cadena sentido y la cadena antisentido que forman un dúplex de ARNi incluyen las fórmulas siguientes:
5'n<p>- N<a>-Y Y Y -N<a>-n<q>3' 3'n<p>-N<a>-Y 'YT-N<a'>n<q'>5' (IIIa)
5'n<p>-N<a>-YY Y -N<b>-Z Z Z -N<a>-n<q>3' 3' n<p>-N<a>-Y''Y'Y'-N<b'>-Z'Z'Z'-N<a'>n<q'>5' (IIIb) 5' n<p>-N<a>- X X X -N<b>-Y Y Y - N<a>-n<q>3' 3' n<p>-N<a>-X'X'X'-N<b'>-Y''YY'-N<a>-n<q'>5' (IIIc) 5'n<p>-N<a>- X X X -N<b>-Y Y Y -N<b>- Z Z Z -N<a>-n<q>3' 3' n<p'>-N<a>-X'X'X'-N<b'>-Y"Y"Y'-N<b'>-Z'Z'Z'-N<a>-n<q'>5' (IIId)
5' - N<a>-Y Y Y -N<a>- 3' 3' n<p>-N<a>-Y'Y'Y' -N<a'>5' (IIIe)
Cuando el agente de ARNi está representado por la fórmula (IIIa), cada N<a>representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende de 2 a 20, de 2 a 15 o de 2 a 10 nucleótidos modificados.
Cuando el agente de ARNi está representado por la fórmula (IIIb), cada N<b>representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 1-10, 1-7, 1-5 o 1-4 nucleótidos modificados. Cada N<a>representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende de 2 a 20, de 2 a 15 o de 2 a 10 nucleótidos modificados.
Cuando el agente de ARNi se representa como la fórmula (IIIc), cada N<b>, N<b>' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada N<a>representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende de 2 a 20, de 2 a 15 o de 2 a 10 nucleótidos modificados.
Cuando el agente de ARNi se representa como la fórmula (IIId), cada N<b>, N<b>' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada N<a>, N<a>' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende de 2 a 20, de 2 a 15 o de 2 a 10 nucleótidos modificados. Cada uno de N<a>, N<a>', N<b>y N<b>' comprende independientemente modificaciones de patrón alterno.
Cuando el agente de ARNi se representa como la fórmula (IIId), cada N<b>, N<b>' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada N<a>, N<a>' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende de 2 a 20, de 2 a 15 o de 2 a 10 nucleótidos modificados. Cada uno de N<a>, N<a>', N<b>y N<b>' comprende independientemente modificaciones de patrón alterno.
Cuando el agente de ARNi se representa como la fórmula (IIIe), cada N<a>y N<a>' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende de 0 a 25 nucleótidos que están modificados o no modificados o combinaciones de los mismos, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de forma diferente.
Cada uno de X, Y y Z en las fórmulas (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), (IIId) y (IIIe) pueden ser iguales o diferentes entre sí. Cuando el agente de ARNi está representado por la fórmula (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), (IIId) y (IIIe), al menos uno de los nucleótidos Y puede formar un par de bases con uno de los nucleótidos Y'. Alternativamente, al menos dos de los nucleótidos Y forman pares de bases con los nucleótidos Y' correspondientes; o los tres nucleótidos Y forman pares de bases con los nucleótidos Y' correspondientes.
Cuando el agente de ARNi está representado por la fórmula (IIIb) o (IIId), al menos uno de los nucleótidos Z puede formar un par de bases con uno de los nucleótidos Z'. Alternativamente, al menos dos de los nucleótidos Z forman pares de bases con los nucleótidos Z' correspondientes; o los tres nucleótidos Z forman pares de bases con los nucleótidos Z' correspondientes.
Cuando el agente de ARNi se representa como fórmula (IIIc) o (IlId), al menos uno de los nucleótidos X puede formar un par de bases con uno de los nucleótidos X'. Alternativamente, al menos dos de los nucleótidos X forman pares de bases con los nucleótidos X' correspondientes; o los tres nucleótidos X forman pares de bases con los nucleótidos X' correspondientes.
En un caso, la modificación en el nucleótido Y es diferente a la modificación en el nucleótido Y', la modificación en el nucleótido Z es diferente a la modificación en el nucleótido Z', y/o la modificación en el nucleótido X es diferente a la modificación en el nucleótido X'.
En un caso, cuando el agente de ARNi está representado por la fórmula (IIId), las modificaciones de N<a>son modificaciones de 2'-O-metilo o 2'-fluoro. En otro caso, cuando el agente de ARNi está representado por la fórmula (IIId), las modificaciones de N<a>son modificaciones de 2'-O-metilo o 2'-fluoro y n<p>' >0 y al menos un n<p>' está unido a un nucleótido vecino a través de un enlace fosforotioato. En otro caso más, cuando el agente de ARNi está representado por la fórmula (IIId), las modificaciones de N<a>son modificaciones de 2'-O-metilo o 2'-fluoro, n<p>' >0 y al menos un n<p>' está unido a un nucleótido vecino a través de un enlace fosforotioato, y la cadena sentido está conjugada a uno o más derivados de GalNAc unidos a través de un enlazador ramificado monovalente, bivalente o trivalente. En otro caso, cuando el agente de ARNi está representado por la fórmula (IIId), las modificaciones de N<a>son modificaciones de 2'-O-metilo o 2'-fluoro, n<p>' >0 y al menos un n<p>' está unido a un nucleótido vecino a través de un enlace fosforotioato, la cadena sentido comprende al menos un enlace fosforotioato y la cadena sentido está conjugada con uno o más derivados de GalNAc unidos a través de un enlazador ramificado monovalente, bivalente o trivalente.
En un caso, cuando el agente de ARNi está representado por la fórmula (IIIa), las modificaciones de N<a>son modificaciones de 2'-O-metilo o 2'-fluoro, n<p>' >0 y al menos un n<p>' está unido a un nucleótido vecino a través de un enlace fosforotioato, la cadena sentido comprende al menos un enlace fosforotioato y la cadena sentido está conjugada a uno o más derivados de GalNAc unidos a través de un enlazador ramificado monovalente, bivalente o trivalente.
En un caso, el agente de ARNi es un multímero que contiene al menos dos dúplex representados por la fórmula (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), (IIId) y (IIIe), en donde los dúplex están conectados por un enlazador. El enlazador puede ser escindible o no escindible. Opcionalmente, el multímero comprende además un ligando. Cada uno de los dúplex puede dirigirse contra el mismo gen o a dos genes diferentes; o cada uno de los dúplex puede dirigirse contra el mismo gen en dos sitios diana diferentes.
En un caso, el agente de ARNi es un multímero que contiene tres, cuatro, cinco, seis o más dúplex representados por la fórmula (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), (IIId) y (IIIe), en donde los dúplex están conectados por un enlazador. El enlazador puede ser escindible o no escindible. Opcionalmente, el multímero comprende además un ligando. Cada uno de los dúplex puede dirigirse contra el mismo gen o a dos genes diferentes; o cada uno de los dúplex puede dirigirse contra el mismo gen en dos sitios diana diferentes.
En un caso, dos agentes de ARNi representados por la fórmula (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), (IIId) y (IIIe) están unidos entre sí en el extremo 5', y uno o ambos extremos 3' y están opcionalmente conjugados a un ligando. Cada uno de los agentes puede dirigirse contra el mismo gen o a dos genes diferentes; o cada uno de los agentes puede dirigirse contra el mismo gen en dos sitios diana diferentes.
Varias publicaciones describen agentes de ARNi multiméricos que pueden utilizarse en los métodos de la divulgación. Estas publicaciones incluyen WO2007/091269, patente de EE. UU. n.27858769, WO2010/141511, WO2007/117686, WO2009/014887 y WO2011/031520.
El agente de ARNi que contiene conjugaciones de uno o más restos de hidrato de carbono con un agente de ARNi puede optimizar una o más propiedades del agente de ARNi. En muchos casos, el resto de hidrato de carbono se unirá a una subunidad modificada del agente de ARNi. Por ejemplo, el azúcar ribosa de una o más subunidades de ribonucleótidos de un agente de ARNbc se puede reemplazar con otro resto, por ejemplo, un portador no hidrato de carbono (preferiblemente cíclico) al que está unido un ligando de hidrato de carbono. Una subunidad de ribonucleótido en la que el azúcar ribosa de la subunidad ha sido reemplazado se denomina en este documento subunidad de modificación de reemplazo de ribosa (RRMS). Un portador cíclico puede ser un sistema de anillo carbocíclico, es decir, todos los átomos del anillo son átomos de carbono, o un sistema de anillo heterocíclico, es decir, uno o más átomos del anillo pueden ser un heteroátomo, por ejemplo, nitrógeno, oxígeno, azufre. El portador cíclico puede ser un sistema de anillo monocíclico, o puede contener dos o más anillos, por ejemplo, anillos fusionados. El portador cíclico puede ser un sistema de anillo completamente saturado, o puede contener uno o más enlaces dobles.
El ligando puede unirse al polinucleótido a través de un portador. Los portadores incluyen (i) al menos un "punto de fijación a la estructura principal", preferiblemente dos "puntos de fijación a la estructura principal" y (ii) al menos un "punto de fijación de amarre". Un "punto de unión a la estructura principal", como se usa en este documento, se refiere a un grupo funcional, por ejemplo, un grupo hidroxilo, o en general, un enlace disponible para, y que es adecuado para la incorporación del portador en la estructura principal, por ejemplo, el fosfato o fosfato modificado, por ejemplo, que contiene azufre, de un ácido ribonucleico. Un "punto de unión de anclaje" (TAP) en algunos casos se refiere a un átomo anular constituyente del portador cíclico, por ejemplo, un átomo de carbono o un heteroátomo (distinto de un átomo que proporciona un punto de unión a la estructura principal), que conecta un resto seleccionado. El resto puede ser, por ejemplo, un hidrato de carbono, por ejemplo, monosacárido, disacárido, trisacárido, tetrasacárido, oligosacárido y polisacárido. Opcionalmente, el resto seleccionado está conectado mediante una atadura intermedia al portador cíclico. Así, el portador cíclico a menudo incluirá un grupo funcional, por ejemplo, un grupo amino, o en general, proporcionará un enlace que sea adecuado para la incorporación o unión de otra entidad química, por ejemplo, un ligando al anillo constituyente.
Los agentes de ARNi se pueden conjugar con un ligando a través de un portador, donde el portador puede ser un grupo cíclico o un grupo acíclico; preferiblemente, el grupo cíclico se selecciona de pirrolidinilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, dioxolano, oxazolidinilo, isoxazolidinilo, morfolinilo, tiazolidinilo, isotiazolidinilo, quinoxalinilo, piridazinonilo, tetrahidrofurilo y decalina; preferiblemente, el grupo acíclico se selecciona de la estructura principal de serinol o la estructura principal de dietanolamina.
En ciertos casos específicos, el agente de ARNi para su uso en los métodos de la divulgación es AD-57213 (cadena sentido: 5'- GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3' (SEQ ID NO: 13) y cadena antisentido: 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO:14), donde A, C, G y U son ribosa A, C, G o U; a, c, g y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G o U; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, C, G o U; y s es un enlace fosforotioato.
Estos agentes pueden comprender además un ligando.
Ligandos
Los agentes de ARN bicatenario (ARNbc) de la divulgación pueden conjugarse opcionalmente con uno o más ligandos. El ligando se puede unir a la cadena sentido, a la cadena antisentido o a ambas cadenas, en el extremo 3', en el extremo 5' o en ambos extremos. Por ejemplo, el ligando puede estar conjugado a la cadena sentido. De acuerdo con la invención, el ligando se conjuga al extremo 3' de la cadena sentido.
En un caso, el ligando es un conjugado de hidrato de carbono, tal como un monosacárido. El ligando puede ser una N-acetilgalactosamina (GalNAc) GalNAc o un derivado de GalNAc. La GalNAc o su derivado se puede unir a un agente de ARNia tra vé s deun enlazador monovalente. En algunos casos, la GalNAc o el derivado de GalNAc se une a un agente de ARNi de la invencióna tra vé s deun enlazador bivalente. En otros casos, la GalNAc o un derivado de GalNAc se une a un agente de ARNia tra vé s deun enlace trivalente.
En un caso, un conjugado de hidrato de carbono para uso en las composiciones y métodos de la divulgación se selecciona del grupo que consiste en:
En una realización, la GalNAc o un derivado de GalNAc es GalNAc3:
En algunos casos, el ligando, por ejemplo, el ligando GalNAc, está unido al extremo 3' del agente de ARNi. En una realización, el agente de ARNi se conjuga con el ligando, por ejemplo, el ligando GalNAc, como se muestra en el siguiente esquema.
donde X es O o S. En una realización, X es O.
Una amplia variedad de entidades se pueden acoplar a los agentes de ARNi de la presente divulgación. Los restos preferidos son ligandos que están acoplados, preferiblemente de forma covalente, ya sea directa o indirectamentea tra vé s deuna atadura intermedia.
En casos preferidos, un ligando altera la distribución, la orientación o la vida útil de la molécula en la que está incorporado. En casos preferidos, un ligando proporciona una afinidad mejorada por una diana seleccionada, por ejemplo, una molécula, una célula o un tipo de célula, un compartimento, un receptor, por ejemplo, un compartimento celular u orgánico, un tejido, un órgano o una región del cuerpo, como, por ejemplo, en comparación con una especie que carece de dicho ligando. Los ligandos que proporcionan una afinidad mejorada por una diana seleccionada también se denominan ligandos de direccionamiento.
Algunos ligandos pueden tener propiedades endosomolíticas. Los ligandos endosomolíticos promueven la lisis del endosoma y/o el transporte de la composición de la divulgación, o sus componentes, desde el endosoma al citoplasma de la célula. El ligando endosomolítico puede ser un péptido polianiónico o peptidomimético que muestra actividad de membrana dependiente del pH y fusogenicidad. En un caso, el ligando endosomolítico asume su conformación activa al pH endosómico. La conformación "activa" es aquella conformación en la que el ligando endosomolítico promueve la lisis del endosoma y/o el transporte de la composición de la divulgación, o sus componentes, desde el endosoma al citoplasma de la célula. Los ligandos endosomolíticos ejemplares incluyen el péptido GALA (Subbarao et al., Biochemistry, 1987, 26: 2964-2972), el péptido EALA (Vogel et al., J. Am. Chem. Soc., 1996, 118: 1581-1586) y sus derivados (Turk et al., Biochem. Biophys. Acta, 2002, 1559: 56-68). En un caso, el componente endosomolítico puede contener un grupo químico (por ejemplo, un aminoácido) que experimentará un cambio de carga o protonación en respuesta a un cambio de pH. El componente endosomolítico puede ser lineal o ramificado.
Los ligandos pueden mejorar las propiedades de transporte, hibridación y especificidad, y también pueden mejorar la resistencia a las nucleasas del oligorribonucleótido natural o modificado resultante, o una molécula polimérica que comprende cualquier combinación de monómeros descritos en este documento y/o ribonucleótidos naturales o modificados.
Los ligandos en general pueden incluir modificadores terapéuticos, por ejemplo, para mejorar la captación; compuestos de diagnóstico o grupos informadores, por ejemplo, para monitorizar la distribución; agentes de reticulación; y restos que confieren resistencia a las nucleasas. Los ejemplos generales incluyen lípidos, esteroides, vitaminas, azúcares, proteínas, péptidos, poliaminas, e imitadores de péptidos.
Los ligandos pueden incluir una sustancia natural, tal como una proteína (por ejemplo, seroalbúmina humana , lipoproteína de baja densidad , lipoproteína de alta densidad , o globulina); un hidrato de carbono (por ejemplo, un dextrano, pululano, quitina, quitosano, inulina, ciclodextrina o ácido hialurónico); o un lípido. El ligando también puede ser una molécula recombinante o sintética, tal como un polímero sintético, por ejemplo, un poliaminoácido sintético, un oligonucleótido (por ejemplo, un aptámero). Los ejemplos de poliaminoácidos incluyen poliaminoácido que es una polilisina (PLL), ácido poli L-aspártico, ácido poli L-glutámico, copolímero de anhídrido de ácido maleico-estireno, copolímero de poli(L-lactida-co-glicolida), copolímero de anhídrido maleico-éter divinílico, copolímero de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HMPA), polietilenglicol (PEG), alcohol polivinílico (PVA), poliuretano, ácido poli(2-etilacrílico), polímeros de N-isopropilacrilamida, o polifosfazina. Los ejemplos de poliaminas incluyen: polietilenimina, polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, pseudopéptido-poliamina, poliamina peptidomimética, poliamina dendrímera, arginina, amidina, protamina, lípido catiónico, porfirina catiónica, sal cuaternaria de una poliamina, o un péptido alfa helicoidal.
Los ligandos también pueden incluir grupos de direccionamiento, por ejemplo, un agente de direccionamiento de células o tejidos, por ejemplo, una lectina, glicoproteína, lípido o proteína, por ejemplo, un anticuerpo, que se une a un tipo de célula específico, tal como una célula renal. Un grupo de direccionamiento puede ser una tirotropina, melanotropina, lectina, glicoproteína, proteína A tensioactiva, hidrato de carbono de mucina, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetil-glucosamina, manosa multivalente, fucosa multivalente, poliaminoácidos glicosilados, galactosa multivalente, transferrina, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato, un lípido, colesterol, un esteroide, ácido biliar, folato, vitamina B12, biotina, un péptido RGD, un mimético de péptido RGD o un aptámero.
Otros ejemplos de ligandos incluyen colorantes, agentes intercalantes (por ejemplo, acridinas), reticulantes (por ejemplo, psoraleno, mitomicina C), porfirinas (TPPC4, texafirina, safirina), hidrocarburos aromáticos policíclicos (por ejemplo, fenazina, dihidrofenazina), endonucleasas artificiales o un quelante (por ejemplo, EDTA), moléculas lipofílicas, por ejemplo, colesterol, ácido cólico, ácido adamantano acético, ácido 1-pireno butírico, dihidrotestosterona, 1,3-bis-O(hexadecil)glicerol, grupo geraniloxihexilo, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, grupo heptadecilo, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido O3-(oleoil)litocólico, ácido O3-(oleoil)colénico, dimetoxitritilo o fenoxazina) y conjugados peptídicos (por ejemplo, péptido antennapedia, péptido Tat), agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG (por ejemplo, PEG-40K), MPEG, 2, poliamino, alquilo, alquilo sustituido, marcadores radiomarcados, enzimas, haptenos (por ejemplo, biotina), facilitadores del transporte/absorción (por ejemplo, aspirina, vitamina E, ácido fólico), ribonucleasas sintéticas (por ejemplo, imidazol, bisimidazol, histamina, grupos de imidazol, conjugados de acridina-imidazol, complejos de Eu3+ de tetraazamacrociclos), dinitrofenilo, HRP, o AP.
Los ligandos pueden ser proteínas, por ejemplo, glicoproteínas, o péptidos, por ejemplo, moléculas que tienen una afinidad específica por un coligando, o anticuerpos, por ejemplo, un anticuerpo, que se une a un tipo de célula específico, tal como una célula cancerosa, una célula endotelial o una célula ósea. Los ligandos también pueden incluir hormonas y receptores hormonales. También pueden incluir especies no peptídicas, tales como lípidos, lectinas, hidratos de carbono, vitaminas, cofactores, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetilgalactosamina, N-acetil-glucosamina, manosa multivalente, fucosa multivalente, o aptámeros. El ligando puede ser, por ejemplo, un lipopolisacárido, un activador de la p38 MAP cinasa, o un activador de NF-kB.
El ligando puede ser una sustancia, por ejemplo, un fármaco, que puede aumentar la captación del agente de ARNi en la célula, por ejemplo, alterando el citoesqueleto de la célula, por ejemplo, alterando los microtúbulos, microfilamentos y/o filamentos intermedios de la célula. El fármaco puede ser, por ejemplo, taxón, vincristina, vinblastina, citocalasina, nocodazol, japlakinolida, latrunculina A, faloidina, swinholida A, indanocina, o mioservina.
El ligando puede aumentar la captación del oligonucleótido en la célula, por ejemplo, activando una respuesta inflamatoria. Los ligandos ejemplares que tendrían tal efecto incluyen el factor de necrosis tumoral alfa (TNFalfa), la interleucina-1 beta, o el interferón gamma.
En un caso, el ligando es un lípido o una molécula basada en lípidos. Tal molécula lipídica o basada en lípidos se une preferiblemente a una proteína sérica, por ejemplo, seroalbúmina humana (HSA). Un ligando de unión a HSA permite la distribución del conjugado a un tejido diana, por ejemplo, un tejido diana del cuerpo que no sea el riñón. Por ejemplo, el tejido diana puede ser el hígado, incluidas las células parenquimatosas del hígado. También pueden utilizarse otras moléculas que puedan unirse a HSA como ligandos. Por ejemplo, se pueden utilizar naproxeno o aspirina. Un ligando lipídico o basado en lípidos puede (a) aumentar la resistencia a la degradación del conjugado, (b) aumentar el direccionamiento o el transporte hacia una célula o membrana celular diana, y/o (c) puede usarse para ajustar la unión a una proteína sérica, por ejemplo, HSA.
Se puede utilizar un ligando basado en lípidos para modular, por ejemplo, controlar la unión del conjugado a un tejido diana. Por ejemplo, un lípido o un ligando basado en lípidos que se une a la HSA con más fuerza tendrá menos probabilidades de llegar al riñón, y por lo tanto será menos probable que se elimine del cuerpo. Se puede utilizar un ligando lipídico o basado en lípidos que se una a HSA con menos fuerza para dirigir el conjugado al riñón.
En un caso preferido, el ligando basado en lípidos se une a HSA. Preferiblemente, se une a HSA con una afinidad suficiente para que el conjugado se distribuya preferiblemente a un tejido no renal. Sin embargo, se prefiere que la afinidad no sea tan fuerte que la unión del ligando a HSA no pueda revertirse.
En otro caso preferido, el ligando basado en lípidos se une a HSA débilmente o no se une en absoluto, de modo que el conjugado se distribuirá preferiblemente al riñón. También se pueden utilizar otros restos que se dirigen a las células renales en lugar o además del ligando basado en lípidos.
En otro caso, el ligando es un resto, por ejemplo, una vitamina, que es absorbido por una célula diana, por ejemplo, una célula en proliferación. Estos son particularmente útiles para tratar trastornos caracterizados por una proliferación celular no deseada, por ejemplo, del tipo maligno o no maligno, por ejemplo, células cancerosas. Las vitaminas ejemplares incluyen la vitamina A, E y K. Otras vitaminas ejemplares incluyen las vitaminas B, por ejemplo, ácido fólico, B12, riboflavina, biotina, piridoxal u otras vitaminas o nutrientes absorbidos por las células cancerosas. También se incluyen HAS, lipoproteínas de baja densidad (LDL) y lipoproteínas de alta densidad (HDL).
En otro caso, el ligando es un agente de permeación celular, preferiblemente un agente de permeación celular helicoidal. Preferiblemente, el agente es anfipático. Un agente ejemplar es un péptido tal como tat o antennopedia. Si el agente es un péptido, puede modificarse, incluido un peptidilmemético, invertómeros, enlaces no peptídicos o pseudopeptídicos, y el uso de D-aminoácidos. El agente helicoidal es preferiblemente un agente alfa-helicoidal, que preferiblemente tiene una fase lipófila y una lipófoba.
El ligando puede ser un péptido o peptidomimético. Un peptidomimético (también denominado en este documento oligopeptidomimético) es una molécula capaz de plegarse en una estructura tridimensional definida similar a un péptido natural. El resto peptídico o peptidomimético puede tener una longitud de aproximadamente 5 a 50 aminoácidos, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 aminoácidos de longitud. Un péptido o peptidomimético puede ser, por ejemplo, un péptido de permeación celular, un péptido catiónico, un péptido anfipático o un péptido hidrófobo (por ejemplo, que consiste principalmente en Tyr, Trp o Phe). El resto peptídico puede ser un péptido dendrímero, un péptido restringido o un péptido reticulado. En otra alternativa, el resto peptídico puede incluir una secuencia de translocación de membrana hidrófoba (MTS). Un péptido que contiene una MTS hidrófoba ejemplar es RFGF que tiene la secuencia de aminoácidos AAVa Ll PaVl La LlA p (SEQ ID NO: 9). Un análogo de RfGf (por ejemplo, secuencia de aminoácidos AALLPVLLAAP (SEQ ID NO: 10)) que contiene una MTS hidrófoba también puede ser un resto de direccionamiento. El resto peptídico puede ser un péptido de "suministro", que puede transportar moléculas polares grandes, incluidos péptidos, oligonucleótidos y proteínas, a través de las membranas celulares. Por ejemplo, se ha descubierto que las secuencias de la proteína Tat del VIH (GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 11)) y la proteína Antennapedia de Drosophila (RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 12)) son capaces de funcionar como péptidos de suministro. Un péptido o peptidomimético puede estar codificado por una secuencia aleatoria de ADN, tal como un péptido identificado a partir de una biblioteca de visualización de fagos, o biblioteca combinatoria de una perla y un compuesto (OBOC) (Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991). Preferiblemente, el péptido o peptidomimético unido a un agente de ARNi a través de una unidad monomérica incorporada es un péptido dirigido a las células, tal como un péptido de ácido arginina-glicina-aspártico (RGD), o un mimético de RGD. Un resto peptídico puede tener una longitud que varía entre aproximadamente 5 aminoácidos y aproximadamente 40 aminoácidos. Los restos peptídicos pueden tener una modificación estructural, por ejemplo para aumentar la estabilidad o dirigir las propiedades conformacionales. Se puede utilizar cualquiera de las modificaciones estructurales descritas a continuación. Un resto peptídico RGD se puede utilizar para dirigirlo contra una célula tumoral, tal como una célula tumoral endotelial o una célula tumoral de cáncer de mama (Zitzmann et al., Cancer Res., 62:5139-43, 2002). Un péptido RGD puede facilitar el direccionamiento de un agente de ARNi hacia tumores de una variedad de otros tejidos, incluidos el pulmón, el riñón, el bazo o el hígado (Aoki et al., Cancer Gene Therapy 8:783-787, 2001). Preferiblemente, el péptido RGD facilitará el direccionamiento de un agente de ARNi hacia el riñón. El péptido RGD puede ser lineal o cíclico, y puede modificarse, por ejemplo, glicosilarse o metilarse para facilitar su direccionamiento hacia tejidos específicos. Por ejemplo, un péptido RGD glicosilado puede suministrar un agente de ARNi a una célula tumoral que expresa avB3 (Haubner et al., Jour. Nucl. Med., 42:326-336, 2001). Se pueden utilizar péptidos que se dirijan contra marcadores enriquecidos en células proliferantes. Por ejemplo, los péptidos y peptidomiméticos que contienen RGD pueden dirigirse contra las células cancerosas, en particular a las células que exhiben una integrina. De este modo, se podrían utilizar péptidos RGD, péptidos cíclicos que contienen RGD, péptidos RGD que incluyen D-aminoácidos, así como miméticos sintéticos de RGD. Además de RGD, se pueden utilizar otros restos que se dirijan contra el ligando de integrina. Generalmente, dichos ligandos se pueden utilizar para controlar la proliferación de células y la angiogénesis. Los conjugados preferidos de este tipo de ligando se dirigen contra PECAM-1, VEGF u otro gen del cáncer, por ejemplo, un gen del cáncer descrito en este documento.
Un "péptido de permeación celular" es capaz de permear una célula, por ejemplo, una célula microbiana, tal como una célula bacteriana o fúngica, o una célula de mamífero, tal como una célula humana. Un péptido que permea las células microbianas puede ser, por ejemplo, un péptido lineal a-helicoidal (por ejemplo, LL-37 o Ceropin P1), un péptido que contiene un enlace disulfuro (por ejemplo, a-defensina, p-defensina o bactenecina) o un péptido que contiene sólo uno o dos aminoácidos dominantes (por ejemplo, PR-39 o indolicidina). Un péptido de permeación celular también puede incluir una señal de localización nuclear (NLS). Por ejemplo, un péptido de permeación celular puede ser un péptido anfipático bipartito, tal como el MPG, que deriva del dominio peptídico de fusión de la gp41 del VIH-1 y la NLS de la antígeno T grande del SV40 (Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003).
En un caso, un péptido de direccionamiento puede ser un péptido a-helicoidal anfipático. Los péptidos a-helicoidales anfipáticos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, cecropinas, licotoxinas, paradaxinas, buforina, CPF, péptido similar a bombinina (BLP), catelicidinas, ceratotoxinas, péptidos de S. clava, péptidos antimicrobianos intestinales de mixinos (HFIAP), magaininas, brevininas-2, dermaseptinas, melitinas, pleurocidina, péptidos H2A, péptidos de Xenopus, esculentinis-1, y caerinas. Se considerarán preferentemente varios factores para mantener la integridad de la estabilidad de la hélice. Por ejemplo, se utilizará un número máximo de residuos de estabilización de hélice (por ejemplo, leu, ala o lys) y se utilizará un número mínimo de residuos de desestabilización de hélice (por ejemplo, prolina o unidades monoméricas cíclicas). Se considerará el residuo de encaperuzamiento (por ejemplo, Gly es un residuo de N-encaperuzamiento ejemplar y/o se puede utilizar la amidación C-terminal para proporcionar un enlace de H adicional para estabilizar la hélice. La formación de puentes salinos entre residuos con cargas opuestas, separados por posiciones i ± 3 o i ± 4, puede proporcionar estabilidad. Por ejemplo, residuos catiónicos tales como lisina, arginina, homo-arginina, ornitina o histidina pueden formar puentes salinos con los residuos aniónicos glutamato o aspartato.
Los ligandos peptídicos y peptidomiméticos incluyen aquellos que tienen péptidos naturales o modificados, por ejemplo, péptidos D o L; péptidos a, p o<y>; N-metil péptidos; azapéptidos; péptidos que tienen uno o más enlaces amida, es decir, péptido, reemplazados con uno o más enlaces urea, tiourea, carbamato o sulfonil urea; o péptidos cíclicos.
El ligando de direccionamiento puede ser cualquier ligando que sea capaz de dirigirse contra un receptor específico. Algunos ejemplos son: folato, GalNAc, galactosa, manosa, manosa-6 P, grupos de azúcares tal como el grupo GalNAc, el grupo de manosa, el grupo de galactosa, o un aptámero. Un grupo es una combinación de dos o más unidades de azúcar. Los ligandos de direccionamiento también incluyen ligandos del receptor de integrina, ligandos del receptor de quimiocina, transferrina, biotina, ligandos del receptor de serotonina, PSMA, endotelina, GCPII, somatostatina, ligandos de LDL y HDL. Los ligandos también pueden basarse en ácido nucleico, por ejemplo, un aptámero. El aptámero puede no estar modificado o tener cualquier combinación de las modificaciones descritas en este documento.
Los agentes de liberación endosómica incluyen imidazoles, poli u oligoimidazoles, PEI, péptidos, péptidos fusogénicos, policarboxilatos, poliacaciones, oligo o poli cationes o aniones enmascarados, acetales, poliacetales, cetales/policetiales, ortoésteres, polímeros con cargas catiónicas o aniónicas enmascaradas o desenmascaradas, dendrímeros con cargas catiónicas o aniónicas enmascaradas o desenmascaradas.
Modulador PK significa modulador farmacocinético. Los moduladores PK incluyen lipófilos, ácidos biliares, esteroides, análogos de fosfolípidos, péptidos, agentes de unión a proteínas, PEG, vitaminas, etc. Los moduladores PK ejemplares incluyen, pero no se limitan a, colesterol, ácidos grasos, ácido cólico, ácido litocólico, dialquilglicéridos, diacilglicérido, fosfolípidos, esfingolípidos, naproxeno, ibuprofeno, vitamina E, biotina, etc. También se sabe que los oligonucleótidos que comprenden una serie de enlaces fosforotioato se unen a la proteína sérica, por lo que los oligonucleótidos cortos, por ejemplo, oligonucleótidos de aproximadamente 5 bases, 10 bases, 15 bases o 20 bases, que comprenden múltiples enlaces fosforotioato en la columna vertebral también son susceptibles de la presente divulgación como ligandos (por ejemplo, como ligandos moduladores de PK).
Además, los aptámeros que se unen a componentes del suero (por ejemplo, proteínas del suero) también son susceptibles de la presente divulgación como ligandos moduladores de PK.
Otros conjugados de ligando susceptibles de la divulgación se describen en las solicitudes de patente de EE. UU. USSN: 10/916,185, presentada el 10 de agosto de 2004; USSN: 10/946,873, presentada el 21 de septiembre de 2004; USSN: 10/833,934, presentada el 3 de agosto de 2007; USSN: 11/115,989 presentada el 27 de abril de 2005 y USSN: 11/944,227 presentada el 21 de noviembre de 2007.
Cuando hay dos o más ligandos presentes, todos ellos pueden tener las mismas propiedades, todos pueden tener propiedades diferentes o algunos ligandos pueden tener las mismas propiedades mientras que otros pueden tener propiedades diferentes. Por ejemplo, un ligando puede tener propiedades de direccionamiento, tener actividad endosomolítica o tener propiedades moduladoras de PK. En un caso preferido, todos los ligandos tienen propiedades diferentes.
Los ligandos se pueden acoplar a los oligonucleótidos en varios lugares, por ejemplo, en el extremo 3', en el extremo 5' y/o en una posición interna. En casos preferidos, el ligando se une a los oligonucleótidosa tra vé s deun anclaje intermedio, por ejemplo, un portador descrito en este documento. El ligando o ligando anclado puede estar presente en un monómero cuando éste se incorpora a la cadena en crecimiento. En algunos casos, el ligando puede incorporarse mediante acoplamiento a un monómero "precursor" después de que el monómero "precursor" se haya incorporado a la cadena en crecimiento. Por ejemplo, un monómero que tenga, por ejemplo, un enlace terminado en amino (es decir, que no tenga ligando asociado), por ejemplo, TAP-(CH2)nNH2, se puede incorporar en una cadena de oligonucleótidos en crecimiento. En una operación posterior, es decir, después de la incorporación del monómero precursor en la cadena, un ligando que tiene un grupo electrófilo, por ejemplo, un éster de pentafluorofenilo o un grupo aldehído, se puede unir posteriormente al monómero precursor acoplando el grupo electrófilo del ligando con el grupo nucleófilo terminal de la unión del monómero precursor.
En otro ejemplo, se puede incorporar un monómero que tenga un grupo químico adecuado para participar en la reacción de química click, por ejemplo, un enlace/anclaje terminado en azida o alquino. En una operación posterior, es decir, después de la incorporación del monómero precursor en la cadena, se puede unir un ligando que tenga un grupo químico complementario, por ejemplo un alquino o una azida, al monómero precursor acoplando el alquino y la azida entre sí.
En el caso de los oligonucleótidos bicatenarios, los ligandos se pueden unir a una o ambas cadenas. En algunas realizaciones, un agente de ARNi bicatenario contiene un ligando conjugado a la cadena sentido. En otros casos, un agente de ARNi bicatenario contiene un ligando conjugado a la cadena antisentido.
En algunos casos, el ligando se puede conjugar con nucleobases, restos de azúcar, o enlaces internucleosídicos de moléculas de ácido nucleico. La conjugación con nucleobases de purina o derivados de las mismas puede ocurrir en cualquier posición, incluidos los átomos endocíclicos y exocíclicos. En algunos casos, las posiciones 2, 6 , 7 u 8 de una nucleobase de purina están unidas a un resto conjugado. La conjugación con nucleobases de pirimidina o derivados de las mismas también puede ocurrir en cualquier posición. En algunos casos, las posiciones 2, 5 y 6 de una nucleobase de pirimidina pueden sustituirse por un resto conjugado. La conjugación con restos de azúcar de nucleósidos puede ocurrir en cualquier átomo de carbono. Los átomos de carbono de ejemplo de un resto de azúcar que pueden unirse a un resto conjugado incluyen los átomos de carbono 2', 3' y 5'. La posición 1' también se puede unir a un resto conjugado, tal como en un residuo abásico. Los enlaces internucleosídicos también pueden tener restos conjugados. Para los enlaces que contienen fósforo (por ejemplo, fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditiotato, fosforoamidato, y similares), el resto conjugado se puede unir directamente al átomo de fósforo o a un átomo de O, N o S unido al átomo de fósforo. Para enlaces internucleosídicos que contienen amina o amida (por ejemplo, PNA), el resto conjugado se puede unir al átomo de nitrógeno de la amina o amida o a un átomo de carbono adyacente.
Se puede utilizar cualquier ligando adecuado en el campo de la interferencia de ARN, aunque el ligando suele ser un hidrato de carbono, por ejemplo, un monosacárido (tal como GalNAc), un disacárido, un trisacárido, un tetrasacárido o un polisacárido.
Los enlaces que conjugan el ligando al ácido nucleico incluyen los comentados anteriormente. Por ejemplo, el ligando puede ser uno o más derivados de GalNAc (N-acetilglucosamina) unidos a través de un enlazador ramificado monovalente, bivalente o trivalente.
En un caso, el ARNbc de la divulgación está conjugado con enlaces ramificados bivalentes y trivalentes que incluyen las estructuras que se muestran en cualquiera de las fórmulas (IV) - (VII):
Fórmula (IV)
en la que:
q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B y q5C representan independientemente para cada aparición de 0 a 20 y en donde la unidad repetitiva puede ser la misma o diferente;
para cada ocurrencia ausente, CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH<2>, CH<2>NH o CH<2>O;
<q>2A,<q>2B,<q>3A,<q>3B,<q>4A,<q>4B,<q>5A,<q>5B,<q>5C son, independientemente para cada aparición ausente, alquileno, alquileno sustituido, en donde uno o más metilenos pueden estar interrumpidos o terminados por uno o más de O, S, S(O), SO<2>, N(R<N>), C(R')=C(R"), C<e>C o C(O);
R<2A>, R<2B>, R<3A>, R<3B>, R<4A>, R<4B>, R<5A>, R<5B>, R<5C>son cada uno independientemente para cada aparición ausente, NH, O, S, CH<2>, C(O)O, C(O)NH, NHCH(R<a>)C(O), -C(O)-CH(R<a>)-NH-,
o heterociclilo;
L2A, L2B, L3A, L3B, L4A, L4B, L5A, L5B y L5C representan el ligando; es decir, cada uno independientemente para cada aparición un monosacárido (tal como GalNAc), disacárido, trisacárido, tetrasacárido, oligosacárido o polisacárido; y Ra es H o cadena lateral de aminoácido.
Los derivados de GalNAc conjugantes trivalentes son particularmente útiles para su uso con agentes de ARNi para inhibir la expresión de un gen diana, tales como los de fórmula (VII):
donde L5A, l_5B y L5C representan un monosacárido, tal como el derivado de GalNAc. Los ejemplos de grupos enlazadores ramificados bivalentes y trivalentes adecuados que conjugan derivados de GalNAc incluyen, pero no se limitan a, los siguientes compuestos:
Las patentes representativas de EE. UU. que enseñan la preparación de conjugados de ARN incluyen, pero no se limitan a, las patentes de EE. UU. n.° 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717, 5.580.731; 5.591.584; 5.109.124; 5.118.802; 5.138.045; 5.414.077; 5.486.603; 5.512.439; 5.578.718; 5.608.046; 4.587.044; 4.605.735; 4.667.025; 4.762.779; 4.789.737; 4.824.941; 4.835.263; 4.876.335; 4.904.582; 4.958.013; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.245.022; 5.254.469; 5.258.506; 5.262.536; 5.272.250; 5.292.873; 5.317.098; 5.371.241, 5.391.723; 5.416.203, 5.451.463; 5.510.475; 5.512.667; 5.514.785; 5.565.552; 5.567.810; 5.574.142; 5.585.481; 5.587.371; 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 y 5.688.941; 6.294.664; 6.320.017; 6.576.752; 6.783.931; 6.900.297; 7.037.646; 8.106.022.
No es necesario que todas las posiciones de un compuesto dado se modifiquen de manera uniforme, y de hecho se pueden incorporar más de una de las modificaciones mencionadas anteriormente en un solo compuesto o incluso en un solo nucleósido dentro de un ARNi. La presente divulgación también incluye compuestos de ARNi que son compuestos quiméricos.
Los compuestos de ARNi "quiméricos" o "quimeras", en el contexto de esta divulgación, son compuestos de ARNi, preferiblemente ARNbc, que contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una formada por al menos una unidad monomérica, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto de ARNbc. Estos ARNi normalmente contienen al menos una región en la que el ARN está modificado para conferirle mayor resistencia a la degradación por nucleasas, mayor captación celular, y/o mayor afinidad de unión por el ácido nucleico diana. Una región adicional del ARNi puede servir como sustrato para enzimas capaces de escindir híbridos de ARN:ADN o ARN:ARN. Por ejemplo, la ARNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un dúplex ARN:ADN. Por lo tanto, la activación de la ARNasa H da como resultado la escisión de la diana de ARN, mejorando así en gran medida la eficiencia de la inhibición de la expresión genética por parte del ARNi. En consecuencia, a menudo se pueden obtener resultados comparables con ARNi más cortos cuando se utilizan ARNbc quiméricos, en comparación con los ARNbc desoxifosforotioato que hibridan con la misma región diana. La escisión de la diana de ARN se puede detectar de forma rutinaria mediante electroforesis en gel y, si es necesario, técnicas de hibridación de ácidos nucleicos asociadas conocidas en la técnica.
En ciertos casos, el ARN de un ARNi puede ser modificado por un grupo no ligando. Se han conjugado varias moléculas no ligando con ARNi para mejorar la actividad, la distribución celular o la captación celular del ARNi, y los procedimientos para realizar dichas conjugaciones están disponibles en la bibliografía científica. Estos restos no ligantes incluyen restos lipídicos, tales como el colesterol (Kubo, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54-61; Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. NY Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), una cadena alifática, por ejemplo, residuos de dodecandiol o undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969), o ácido acético adamantano (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), un resto de palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), o un resto de octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923). Más arriba se enumeran patentes representativas de los Estados Unidos que enseñan la preparación de dichos conjugados de ARN. Los protocolos de conjugación típicos implican la síntesis de un ARN que porta un aminoenlazador en una o más posiciones de la secuencia. Luego, el grupo amino reacciona con la molécula que se está conjugando utilizando reactivos de acoplamiento o activación apropiados. La reacción de conjugación puede realizarse con el ARN todavía unido al soporte sólido o después de la escisión del ARN, en fase de solución. La purificación del conjugado de ARN mediante HPLC generalmente produce el conjugado puro.
En algunos casos, un agente de ARNi bicatenario de la divulgación es AD-57213.
VI. Administración de un ARNi de la invención
La administración de un ARNi de la divulgación a una célula, por ejemplo, una célula dentro de un sujeto, tal como un sujeto humano (por ejemplo, un sujeto que lo necesita, tal como un sujeto que tiene un trastorno hemorrágico), se puede lograr de varias maneras diferentes. Por ejemplo, la administración puede realizarse poniendo en contacto una célula con un ARNi de la divulgación, ya seain v itrooin vivo.La administraciónin v ivose puede realizar directamente administrando una composición que comprende un ARNi, por ejemplo, un ARNbc, a un sujeto. Alternativamente, la administraciónin v ivopuede realizarse indirectamente administrando uno o más vectores que codifican y dirigen la expresión del ARNi. Estas alternativas se analizan más adelante.
En general, cualquier método de administración de una molécula de ácido nucleico(in v itrooin vivo)se puede adaptar para su uso con un ARNi de la divulgación (véase, por ejemplo, Akhtar S. y Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol. 2(5):139-144 y el documento WO94/02595). Para la administraciónin vivo,los factores a tener en cuenta para administrar una molécula de ARNi incluyen, por ejemplo, la estabilidad biológica de la molécula administrada, la prevención de efectos no específicos y la acumulación de la molécula administrada en el tejido diana. Los efectos no específicos de un ARNi se pueden minimizar mediante la administración local, por ejemplo, mediante inyección directa o implantación en un tejido o administrando la preparación por vía tópica. La administración local en un sitio de tratamiento maximiza la concentración local del agente, limita la exposición del agente a los tejidos sistémicos que de otro modo podrían resultar dañados por el agente o que podrían degradarlo, y permite administrar una dosis total más baja de la molécula de ARNi. Varios estudios han demostrado una eliminación exitosa de productos genéticos cuando se administra un ARNi localmente. Por ejemplo, se demostró que la administración intraocular de un ARNbc de VEGF mediante inyección intravítrea en monos cinomolgos (Tolentino, MJ., et al (2004) Retina 24:132-138) y las inyecciones subretinianas en ratones (Reich, SJ., et al (2003) Mol. Vis. 9:210-216) previenen la neovascularización en un modelo experimental de degeneración macular relacionada con la edad. Además, la inyección intratumoral directa de un ARNbc en ratones reduce el volumen del tumor (Pille, J., et al (2005) Mol. Ther.11:267-274) y puede prolongar la supervivencia de los ratones portadores de tumores (Kim, WJ., et al (2006) Mol. Ther. 14:343-350; Li, S., et al (2007) Mol. Ther. 15:515-523). La interferencia de ARN también ha demostrado tener éxito con la administración local al SNC mediante inyección directa (Dorn, G., et al. (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH., et al (2005) Gene Ther. 12:59-66; Makimura, H., et al (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT, et al (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, ER., et al (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-17275; Akaneya,Y., et al (2005) J. Neurophysiol. 93:594-602) y a los pulmones por administración intranasal (Howard, KA., et al (2006) Mol. Ther. 14:476-484; Zhang, X., et al (2004) J. Biol. Chem. 279:10677-10684; Bitko, V., et al (2005) Nat. Med. 11:50-55). Para administrar un ARNi sistémicamente para el tratamiento de una enfermedad, el ARN puede modificarse o administrarse alternativamente utilizando un sistema de administración de fármacos; ambos métodos actúan para prevenir la rápida degradación del ARNbc por endo- y exonucleasasin vivo.La modificación del ARN o del portador farmacéutico también puede permitir la orientación de la composición de ARNi al tejido diana y evitar efectos no deseados fuera de la diana. Las moléculas de ARNi se pueden modificar mediante conjugación química con grupos lipófilos tal como el colesterol para mejorar la captación celular y prevenir la degradación. Por ejemplo, se inyectó sistémicamente en ratones un ARNi dirigido contra ApoB conjugado con un resto de colesterol lipofílico, y esto dio como resultado la eliminación del ARNm de apoB tanto en el hígado como en el yeyuno (Soutschek, J., et al (2004) Nature 432:173-178). Se ha demostrado que la conjugación de un ARNi con un aptámero inhibe el crecimiento tumoral y media la regresión tumoral en un modelo de ratón de cáncer de próstata (McNamara, JO., et al (2006) Nat. Biotechnol. 24:1005-1015). En un caso alternativo, el ARNi se puede administrar utilizando sistemas de administración de fármacos tales como una nanopartícula, un dendrímero, un polímero, liposomas, o un sistema de administración catiónico. Los sistemas de administración catiónicos con carga positiva facilitan la unión de una molécula de ARNi (con carga negativa) y también mejoran las interacciones en la membrana celular con carga negativa para permitir una absorción eficiente de un ARNi por parte de la célula. Los lípidos catiónicos, dendrímeros o polímeros pueden unirse a un ARNi o ser inducidos a formar una vesícula o micela (véase, por ejemplo, Kim SH., et al (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116) que encierra un ARNi. La formación de vesículas o micelas previene además la degradación del ARNi cuando se administra sistémicamente. Los métodos para obtener y administrar complejos de ARNi catiónicos están dentro de las capacidades de una persona experta en la técnica (véase, por ejemplo, Sorensen, DR., et al (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, UN., et al (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, AS et al (2007) J. Hypertens. 25:197-205). Algunos ejemplos no limitativos de sistemas de administración de fármacos útiles para la administración sistémica de ARNi incluyen DOTAP (Sorensen, DR., et al (2003), más arriba; Verma, UN., et al (2003),m ás arriba ),Oligofectamina, "partículas lipídicas de ácidos nucleicos sólidos" (Zimmermann, TS., et al (2006) Nature 441:111-114), cardiolipina (Chien, PY., et al (2005) Cancer Gene Ther. 12:321-328; Pal, A., et al (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091), polietilenimina (Bonnet ME., et al (2008) Pharm. Res. 16 de agosto. Publicación electrónica antes de su impresión; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), péptidos Arg-Gly-Asp (Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487), y poliamidoaminas (Tomalia, DA., et al (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo, H., et al (1999) Pharm. Res. 16:1799-1804). En algunos casos, un a Rní forma un complejo con ciclodextrina para administración sistémica. Los métodos de administración y composiciones farmacéuticas de ARNi y ciclodextrinas se pueden encontrar en la patente de EE. UU. n.° 7.427.605.
A. ARNi codificados por vector de la invención
El ARNi dirigido contra el gen Serpinc1 se puede expresar a partir de unidades de transcripción insertadas en vectores de ADN o ARN (véase, por ejemplo, Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al., Publicación PCT Internacional n.° W o 00/22113, Conrad, Publicación PCT Internacional n.° WO 00/22114, y Conrad, patente de EE.UU. n.° 6.054.299). La expresión puede ser transitoria (del orden de horas a semanas) o sostenida (de semanas a meses o más), dependiendo de la construcción específica utilizada y del tejido o tipo de célula diana. Estos transgenes pueden introducirse como una construcción lineal, un plásmido circular o un vector viral, que puede ser un vector integrador o no integrador. El transgén también puede construirse para permitir su herencia como plásmido extracromosómico (Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).
La cadena o cadenas individuales de un ARNi se pueden transcribir desde un promotor en un vector de expresión. Cuando se deben expresar dos cadenas separadas para generar, por ejemplo, un ARN bicatenario, se pueden cointroducir dos vectores de expresión separados (por ejemplo, mediante transfección o infección) en una célula diana. Alternativamente, cada cadena individual de un ARNbc puede ser transcrita por promotores, ambos ubicados en el mismo plásmido de expresión. En un caso, un ARNbc se expresa como polinucleótidos repetidos invertidos unidos por una secuencia de polinucleótidos enlazadores, de modo que el ARNbc tiene una estructura de tallo y bucle.
Los vectores de expresión de ARNi son generalmente plásmidos de ADN o vectores virales. Se pueden utilizar vectores de expresión compatibles con células eucariotas, preferiblemente aquellos compatibles con células de vertebrados, para producir construcciones recombinantes para la expresión de un ARNi como se describe en este documento. Los vectores de expresión de células eucariotas son bien conocidos en la técnica y están disponibles en varias fuentes comerciales. Normalmente, dichos vectores se proporcionan conteniendo sitios de restricción convenientes para la inserción del segmento de ácido nucleico deseado. La administración de vectores que expresan ARNi puede ser sistémica, tal como por ejemplo mediante administración intravenosa o intramuscular, mediante administración a células diana extraídas del paciente, seguido de su reintroducción en el paciente, o por cualquier otro medio que permita la introducción en una célula diana deseada.
Los plásmidos de expresión de ARNi se pueden transfectar en células diana como un complejo con portadores lipídicos catiónicos (por ejemplo, Oligofectamina) o portadores lipídicos no catiónicos (por ejemplo, Transit-TKO™). En este documento también se contemplan múltiples transfecciones de lípidos para supresiones mediadas por ARNi dirigidas a diferentes regiones de un ARN diana durante un período de una semana o más. La introducción exitosa de vectores en células huésped se puede monitorizar utilizando varios métodos conocidos. Por ejemplo, la transfección transitoria se puede señalar con un informador, tal como un marcador fluorescente, tal como la proteína verde fluorescente (GFP). La transfección estable de célulase x v ivose puede garantizar utilizando marcadores que proporcionan a la célula transfectada resistencia a factores ambientales específicos (por ejemplo, antibióticos y fármacos), tal como la resistencia a higromicina B.
Los sistemas de vectores virales que pueden utilizarse con los métodos y composiciones descritos en este documento incluyen, pero no se limitan a, (a) vectores de adenovirus; (b) vectores de retrovirus, incluyendo pero no limitados a vectores lentivirales, virus de la leucemia murina de Moloney, etc.; (c) vectores de virus adenoasociados; (d) vectores del virus del herpes simple; (e) vectores de SV 40; (f) vectores del virus del polioma; (g) vectores del virus del papiloma; (h) vectores de picornavirus; (i) vectores del virus de la viruela tales como un ortopox, por ejemplo, vectores del virus de la vacuna o avipox, por ejemplo, viruela del canario o viruela aviar; y (j) un adenovirus dependiente de auxiliar o gutless. Los virus con replicación defectuosa también pueden ser ventajosos. Diferentes vectores se incorporarán o no al genoma de las células. Las construcciones pueden incluir secuencias virales para transfección, si se desea. Alternativamente, la construcción puede incorporarse en vectores capaces de replicación episomal, por ejemplo, vectores EPV y EBV. Las construcciones para la expresión recombinante de un ARNi generalmente requerirán elementos reguladores, por ejemplo, promotores, potenciadores, etc., para asegurar la expresión del ARNi en las células diana. A continuación se describen con más detalle otros casos a considerar para vectores y construcciones.
Los vectores útiles para la administración de un ARNi incluirán elementos reguladores (promotor, potenciador, etc.) suficientes para la expresión del ARNi en la célula o tejido diana deseado. Los elementos reguladores pueden elegirse para proporcionar una expresión constitutiva o regulada/inducible.
La expresión del ARNi se puede regular con precisión, por ejemplo, mediante el uso de una secuencia reguladora inducible que sea sensible a ciertos reguladores fisiológicos, por ejemplo, los niveles de glucosa circulante o las hormonas (Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24). Dichos sistemas de expresión inducibles, adecuados para el control de la expresión de ARNbc en células o en mamíferos incluyen, por ejemplo, la regulación por ecdisona, por estrógeno, progesterona, tetraciclina, inductores químicos de dimerización e isopropil-beta-D1 - tiogalactopiranósido (IPTG). Una persona experta en la técnica podría elegir la secuencia promotora/reguladora adecuada en función del uso previsto del transgén de ARNi.
Se pueden utilizar vectores virales que contienen secuencias de ácidos nucleicos que codifican un ARNi. Por ejemplo, se puede utilizar un vector retroviral (véase Miller et al., Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993)). Estos vectores retrovirales contienen los componentes necesarios para el correcto empaquetamiento del genoma viral y su integración en el ADN de la célula hospedadora. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican un ARNi se clonan en uno o más vectores, lo que facilita la administración del ácido nucleico a un paciente. Se pueden encontrar más detalles sobre los vectores retrovirales, por ejemplo, en Boesen et al., Biotherapy 6:291-302 (1994), que describe el uso de un vector retroviral para administrar el gen mdr1 a las células madre hematopoyéticas con el fin de hacer que las células madre sean más resistentes a la quimioterapia. Otras referencias que ilustran el uso de vectores retrovirales en terapia génica son: Clowes et al., J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994); Kiem et al., Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons and Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); y Grossman and Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993). Los vectores lentivirales contemplados para su uso incluyen, por ejemplo, los vectores basados en VIH descritos en las patentes de EE. UU. n.° 6.143.520; 5.665.557; y 5.981.276.
También se contempla el uso de adenovirus en la administración de ARNi de la divulgación. Los adenovirus son vehículos especialmente atractivos, por ejemplo, para transportar genes a los epitelios respiratorios. Los adenovirus infectan naturalmente los epitelios respiratorios donde causan una enfermedad leve. Otros dianas de los sistemas de administración basados en adenovirus son el hígado, el sistema nervioso central, las células endoteliales y el músculo. Los adenovirus tienen la ventaja de ser capaces de infectar células que no se dividen. Kozarsky y Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993) presentan una revisión de la terapia génica basada en adenovirus. Bout et al., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994) demostraron el uso de vectores de adenovirus para transferir genes a los epitelios respiratorios de monos rhesus. Se pueden encontrar otros ejemplos del uso de adenovirus en terapia génica en Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993); Publicación PCT WO94/12649; y Wang, et al., Gene Therapy 2:775-783 (1995). En Xia H et al. (2002 ), Nat. Biotech. 20 , se describen un vector de AV adecuado para expresar un ARNi descrito en la divulgación, un método para construir el vector de AV recombinante, y un método para administrar el vector a las células diana. 1006-1010.
Los vectores del virus adenoasociado (AAV) también pueden usarse para administrar un ARNi de la divulgación (Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993); patente de EE. UU. n.° 5.436.146). En un caso, el ARNi se puede expresar como dos moléculas de ARN monocatenario complementarias e independientes a partir de un vector de AAV recombinante que tiene, por ejemplo, los promotores de ARN U6 o H1, o el promotor del citomegalovirus (CMV). Los vectores de AAV adecuados para expresar el ARNbc descrito en la divulgación, los métodos para construir el vector de AV recombinante y los métodos para administrar los vectores a las células diana se describen en Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol.
63: 3822-3826; patente de EE. UU. N.° 5.252.479; patente de EE. UU. N.° 5.139.941; Solicitud de Patente Internacional n.° WO 94/13788; y Solicitud de Patente Internacional n.° WO 93/24641.
Otro vector viral adecuado para la administración de un ARNi de la infección es un virus de la viruela, tal como un virus de la vacuna, por ejemplo, un virus de la vacuna atenuado tal como el Virus Ankara Modificado (MVA) o NYVAC, un virus de la viruela aviar tal como la viruela aviar o la viruela del canario.
El tropismo de los vectores virales se puede modificar seudotipando los vectores con proteínas de envoltura u otros antígenos de superficie de otros virus, o sustituyendo diferentes proteínas de la cápside viral, según corresponda. Por ejemplo, los vectores lentivirales se pueden pseudotipar con proteínas de superficie del virus de la estomatitis vesicular (VSV), la rabia, el ébola, el Mokola y similares. Los vectores de AAV pueden diseñarse para dirigirse contra diferentes células mediante la ingeniería de los vectores para expresar diferentes serotipos de proteínas de la cápside; véase, por ejemplo, Rabinowitz JE et al. (2002), J Virol 76:791 -801.
La preparación farmacéutica de un vector puede incluir el vector en un diluyente aceptable, o puede incluir una matriz de liberación lenta en la que está embebido el vehículo de administración de genes. Alternativamente, cuando el vector de administración de genes completo se puede producir intacto a partir de células recombinantes, por ejemplo, vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que producen el sistema de administración de genes.
V. Composiciones farmacéuticas de la invención
La presente divulgación también proporciona composiciones y formulaciones farmacéuticas que incluyen los ARNi de la divulgación. En un caso, se proporcionan aquí composiciones farmacéuticas que contienen un ARNi, como se describe aquí, y un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas que contienen el ARNi son útiles para tratar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o actividad de un gen Serpinc1, por ejemplo, una enfermedad asociada a Serpinc1. Estas composiciones farmacéuticas se formulan en función del modo de administración. Un ejemplo son las composiciones que están formuladas para administración sistémica mediante administración parenteral, por ejemplo, mediante administración subcutánea (SC) o intravenosa (IV). Otro ejemplo son las composiciones que están formuladas para administración directa al parénquima cerebral, por ejemplo, mediante infusión en el cerebro, tal como mediante infusión con bomba continua. Las composiciones farmacéuticas de la divulgación pueden administrarse en dosis suficientes para inhibir la expresión de un gen Serpinc1.
En ciertos casos de la divulgación, por ejemplo, cuando una composición farmacéutica comprende un agente de ARNi bicatenario que incluye uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, incluido uno de dichos motivos en o cerca del sitio de escisión del agente, seis enlaces fosforotioato y un ligando GalNAc, dicha composición se administra en una dosis de 0,200 a aproximadamente 1,825 mg/kg, 0,200 a aproximadamente 1.800 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 1,700 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 1.600 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 1,500 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 1.400 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 1,400 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 1.200 mg/kg, aproximadamente 0 ,200 a aproximadamente 1,100 mg/kg, aproximadamente 0 ,200 a aproximadamente 1.000 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 0,900 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 0,800 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 0,700 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 0,600 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 0,500 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 0,400 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1,825 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1.800 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1,700 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1.600 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1,500 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1.400 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1,400 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1.200 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1,100 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1.000 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 0,900 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 0,800 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 0,700 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 0,600 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 0,500 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 0,400 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1,825 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1.800 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1,700 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1.600 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1,500 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1.400 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1,400 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1.200 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1,100 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1.000 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 0,900 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 0,800 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 0,700 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 0,600 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 0,500 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 0,400 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1,825 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1.800 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1,700 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1.600 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1,500 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1.400 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1,400 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1.200 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1,100 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1.000 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 0,900 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 0,800 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 0,700 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 0,600 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 0,500 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1.825 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1,800 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1.700 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1,600 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1.500 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1,400 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1.400 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1,200 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1.100 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1,000 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 0,900 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 0,800 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 0,700 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 0,600 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 0,500 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1,825 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1.800 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1,700 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1.600 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1,500 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1.400 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1,400 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1.200 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1,100 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1.000 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 0,900 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 0,800 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 0,700 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 0,600 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 0,500 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1.825 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1,800 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1.700 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1,600 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1.500 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1,400 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1.400 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1,200 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1.100 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1,000 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 0,900 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,825 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1.800 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,700 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1.600 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,500 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1.400 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,400 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1.200 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,100 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1.000 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,825 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1.800 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,700 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1.600 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,500 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1.400 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,400 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1.200 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,100 mg/kg, o aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,000 mg/kg. Los valores y rangos intermedios a los valores citados anteriormente también se pretende que sean parte de esta divulgación. por ejemplo, el agente de ARNi puede administrarse al sujeto en una dosis de aproximadamente 0,015 mg/kg a aproximadamente 0,45 mg/mg.
Por ejemplo, el agente de ARNi, por ejemplo, el agente de ARNi en una composición farmacéutica, se puede administrar en una dosis de aproximadamente 0,2 mg/kg, 0,225 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,275 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,325 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,375 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,425 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,475 mg/kg, aproximadamente 0,5 mg/kg, 0,525 mg/kg, 0,55 mg/kg, 0,575 mg/kg, aproximadamente 0,6 mg/kg, 0,625 mg/kg, 0,65 mg/kg, 0,675 mg/kg, aproximadamente 0,7 mg/kg, 0,725 mg/kg, 0,75 mg/kg, 0,775 mg/kg, aproximadamente 0,8 mg/kg, 0,925 mg/kg, 0,95 mg/kg, 0,975 mg/kg, aproximadamente 1,0 mg/kg, 1,025 mg/kg, 1,05 mg/kg, 1,075 mg/kg, aproximadamente 1,1 mg/kg, 1,125 mg/kg, 1,15 mg/kg, 1,175 mg/kg, aproximadamente 1,2 mg/kg, 1,225 mg/kg, 1,25 mg/kg, 1,275 mg/kg, aproximadamente 1,3 mg/kg, 1,325 mg/kg, 1,35 mg/kg, 1,375 mg/kg, aproximadamente 1,4 mg/kg, 1,425 mg/kg, 1,45 mg/kg, 1,475 mg/kg, aproximadamente 1,5 mg/kg, 1,525 mg/kg, 1,55 mg/kg, 1,575 mg/kg, aproximadamente 1,6 mg/kg, 1,625 mg/kg, 1,65 mg/kg, 1,675 mg/kg, aproximadamente 1,7 mg/kg, 1,725 mg/kg, 1,75 mg/kg, 1,775 mg/kg, o aproximadamente 1,8 mg/kg. Los valores intermedios a los valores citados anteriormente también se pretende que formen parte de esta divulgación.
En algunos casos de la divulgación, por ejemplo, cuando un agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, comprendiendo la cadena antisentido una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de 5' - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido en el extremo 3', dicho agente en una composición farmacéutica se administra a una dosis de aproximadamente 0,200 a aproximadamente 1,825 mg/kg, 0,200 a aproximadamente 1, 800 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 1,700 mg/kg aproximadamente 0 ,200 a aproximadamente 1 , 600 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 1,500 mg/kg aproximadamente 0 ,200 a aproximadamente 1, 400 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 1,400 mg/kg aproximadamente 0 ,200 a aproximadamente 1, 200 mg/kg, aproximadamente 0 ,200 a aproximadamente 1,100 mg/kg aproximadamente 0 ,200 a aproximadamente 1, 000 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 0,900 mg/kg aproximadamente 0 ,200 a aproximadamente 0 , 800 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 0,700 mg/kg aproximadamente 0 ,200 a aproximadamente 0 , 600 mg/kg, aproximadamente 0,200 a aproximadamente 0,500 mg/kg aproximadamente 0 ,200 a aproximadamente 0 , 400 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1,825 mg/kg aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1, 800 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1,700 mg/kg aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1, 600 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1,500 mg/kg aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1, 400 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1,400 mg/kg aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1, 200 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1,100 mg/kg aproximadamente 0,225 a aproximadamente 1, 000 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 0,900 mg/kg aproximadamente 0,225 a aproximadamente 0 , 800 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 0,700 mg/kg aproximadamente 0,225 a aproximadamente 0 , 600 mg/kg, aproximadamente 0,225 a aproximadamente 0,500 mg/kg aproximadamente 0,225 a aproximadamente 0 , 400 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1,825 mg/kg aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1, 800 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1,700 mg/kg aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1, 600 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1,500 mg/kg aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1, 400 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1,400 mg/kg aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1, 200 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1,100 mg/kg aproximadamente 0,250 a aproximadamente 1, 000 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 0,900 mg/kg aproximadamente 0,250 a aproximadamente 0 , 800 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 0,700 mg/kg aproximadamente 0,250 a aproximadamente 0 , 600 mg/kg, aproximadamente 0,250 a aproximadamente 0,500 mg/kg aproximadamente 0,250 a aproximadamente 0 , 400 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1,825 mg/kg aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1, 800 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1,700 mg/kg aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1, 600 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1,500 mg/kg aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1, 400 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1,400 mg/kg aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1, 200 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1,100 mg/kg aproximadamente 0,425 a aproximadamente 1, 000 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 0,900 mg/kg aproximadamente 0,425 a aproximadamente 0 , 800 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 0,700 mg/kg aproximadamente 0,425 a aproximadamente 0 , 600 mg/kg, aproximadamente 0,425 a aproximadamente 0,500 mg/kg aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1, 825 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1,800 mg/kg aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1, 700 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1,600 mg/kg aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1, 500 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1,400 mg/kg aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1, 400 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1,200 mg/kg aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1, 100 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 1,000 mg/kg aproximadamente 0,450 a aproximadamente 0 , 900 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 0,800 mg/kg aproximadamente 0,450 a aproximadamente 0 , 700 mg/kg, aproximadamente 0,450 a aproximadamente 0,600 mg/kg aproximadamente 0,450 a aproximadamente 0 , 500 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1,825 mg/kg aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1, 800 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1,700 mg/kg aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1, 600 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1,500 mg/kg aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1, 400 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1,400 mg/kg aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1, 200 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1,100 mg/kg aproximadamente 0,475 a aproximadamente 1, 000 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 0,900 mg/kg aproximadamente 0,475 a aproximadamente 0 , 800 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 0,700 mg/kg aproximadamente 0,475 a aproximadamente 0 , 600 mg/kg, aproximadamente 0,475 a aproximadamente 0,500 mg/kg aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1, 825 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1,800 mg/kg aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1, 700 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1,600 mg/kg aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1, 500 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1,400 mg/kg aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1, 400 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1,200 mg/kg aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1, 100 mg/kg, aproximadamente 0,875 a aproximadamente 1,000 mg/kg aproximadamente 0,875 a aproximadamente 0 , 900 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,825 mg/kg aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1, 800 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,700 mg/kg aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1, 600 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,500 mg/kg aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1, 400 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,400 mg/kg aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1, 200 mg/kg, aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1,100 mg/kg aproximadamente 0,900 a aproximadamente 1, 000 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,825 mg/kg aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1, 800 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,700 mg/kg aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1, 600 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,500 mg/kg aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1, 400 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,400 mg/kg aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1, 200 mg/kg, aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,100 mg/kg o aproximadamente 0,925 a aproximadamente 1,000 mg/kg. Los valores y rangos intermedios a los valores citados anteriormente también se consideran parte de esta divulgación, por ejemplo, el agente de ARNi puede administrarse al sujeto en una dosis de aproximadamente 0 , ,015 mg/kg a aproximadamente 0,45 mg/kg.
Por ejemplo, el agente de ARNi, por ejemplo, el agente de ARNi en una composición farmacéutica, se puede administrar en una dosis de aproximadamente 0,2 mg/kg, 0,225 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,275 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,325 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,375 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,425 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,475 mg/kg, aproximadamente 0,5 mg/kg, 0,525 mg/kg, 0,55 mg/kg, 0,575 mg/kg, aproximadamente 0,6 mg/kg, 0,625 mg/kg, 0,65 mg/kg, 0,675 mg/kg, aproximadamente 0,7 mg/kg, 0,725 mg/kg, 0,75 mg/kg, 0,775 mg/kg, aproximadamente 0,8 mg/kg, 0,925 mg/kg, 0,95 mg/kg, 0,975 mg/kg, aproximadamente 1,0 mg/kg, 1,025 mg/kg, 1,05 mg/kg, 1,075 mg/kg, aproximadamente 1,1 mg/kg, 1,125 mg/kg, 1,15 mg/kg, 1,175 mg/kg, aproximadamente 1,2 mg/kg, 1,225 mg/kg, 1,25 mg/kg, 1,275 mg/kg, aproximadamente 1,3 mg/kg, 1,325 mg/kg, 1,35 mg/kg, 1,375 mg/kg, aproximadamente 1,4 mg/kg, 1,425 mg/kg, 1,45 mg/kg, 1,475 mg/kg, aproximadamente 1,5 mg/kg, 1,525 mg/kg, 1,55 mg/kg, 1,575 mg/kg, aproximadamente 1,6 mg/kg, 1,625 mg/kg, 1,65 mg/kg, 1,675 mg/kg, aproximadamente 1,7 mg/kg, 1,725 mg/kg, 1,75 mg/kg, 1,775 mg/kg o aproximadamente 1,8 mg/kg. Los valores intermedios a los valores citados anteriormente también se pretende que formen parte de esta divulgación.
Se debe administrar a un sujeto una composición farmacéutica que comprende el agente de ARNi como una dosis fija. Una "dosis fija" (por ejemplo, una dosis en mg) significa que una dosis de un agente de ARNi se usa para todos los sujetos, independientemente de cualquier factor específico relacionado con el sujeto, tal como el peso. Una dosis fija de un agente de ARNi de la divulgación puede basarse en un peso o edad predeterminados.
En algunos casos, la composición farmacéutica que comprende el agente de ARNi se administra como una dosis fija de entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 100 mg, por ejemplo, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 95 mg, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 90 mg, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 85 mg, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 80 mg, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 75 mg, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 70 mg, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 65 mg, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 60 mg, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 50 mg, entre aproximadamente 50 mg y aproximadamente 100 mg, entre aproximadamente 50 mg y aproximadamente 95 mg, entre aproximadamente 50 mg y aproximadamente 90 mg, entre aproximadamente 50 mg y aproximadamente 85 mg, entre aproximadamente 50 mg y aproximadamente 80 mg, entre aproximadamente 30 mg y aproximadamente 100 mg, entre aproximadamente 30 mg y aproximadamente 90 mg, entre aproximadamente 30 mg y aproximadamente 80 mg, entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 100 mg, entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 90 mg, entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 80 mg, entre aproximadamente 60 mg y aproximadamente 100 mg, entre aproximadamente 60 mg y aproximadamente 90 mg,, entre aproximadamente 25 mg y aproximadamente 55 mg, entre aproximadamente 30 mg y aproximadamente 95 mg, entre aproximadamente 30 mg y aproximadamente 85 mg, entre aproximadamente 30 mg y aproximadamente 75 mg, entre aproximadamente 30 mg y aproximadamente 65 mg, entre aproximadamente 30 mg y aproximadamente 55 mg, entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 95 mg, entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 85 mg, entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 75 mg, entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 65 mg, entre aproximadamente 40 mg y aproximadamente 55 mg, o entre aproximadamente 45 mg y aproximadamente 95 mg.
En algunos casos, la composición farmacéutica que comprende el agente de ARNi se administra como una dosis fija de aproximadamente 25 mg, aproximadamente 30 mg, aproximadamente 35 mg, aproximadamente 40 mg, aproximadamente 45 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 55 mg, aproximadamente 60 mg, aproximadamente 65 mg, aproximadamente 70 mg, aproximadamente 75 mg, aproximadamente 80 mg, aproximadamente 85 mg, aproximadamente 90 mg, aproximadamente 95 mg, o aproximadamente 100 mg.
Se puede administrar una composición farmacéutica que comprende el ARNi al sujeto aproximadamente una vez al mes, aproximadamente una vez cada cinco semanas, aproximadamente una vez cada seis semanas, aproximadamente una vez cada 2 meses o una vez al trimestre.
Una composición farmacéutica que comprende el agente de ARNi se puede administrar a un sujeto en una o más dosis. En algunos casos, las composiciones farmacéuticas que comprenden el agente de ARNi bicatenario se pueden administrar a un sujeto como una dosis mensual de aproximadamente 0,200 mg/kg a aproximadamente 0,250 mg/kg, una dosis mensual de aproximadamente 0,425 mg/kg a aproximadamente 0,475 mg/kg, una dosis mensual de aproximadamente 0,875 mg/kg a aproximadamente 0,925 mg/kg, o como una dosis mensual de aproximadamente 1,775 mg/kg a aproximadamente 1,825 mg/kg. En algunos casos, las composiciones farmacéuticas que comprenden el agente ARNi bicatenario se pueden administrar a un sujeto como una dosis fija de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 100 mg, por ejemplo, aproximadamente 25 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 80 mg o aproximadamente 100 mg.
La composición farmacéutica se puede administrar mediante infusión intravenosa durante un período de tiempo, tal como durante 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 y 21,22, 23, 24, o aproximadamente un período de 25 minutos. La administración puede repetirse, por ejemplo, de forma regular, tal como semanalmente, quincenalmente (es decir, cada dos semanas), mensualmente, cada dos meses, cada tres meses, cada cuatro meses o más. Después de un régimen de tratamiento inicial, los tratamientos pueden administrarse con menor frecuencia. Por ejemplo, después de una administración semanal o quincenal durante tres meses, la administración puede repetirse una vez al mes, durante seis meses o un año o más.
La composición farmacéutica se puede administrar una vez al día, o el ARNi se puede administrar en dos, tres o más subdosis a intervalos apropiados a lo largo del día o incluso mediante infusión continua o administración a través de una formulación de liberación controlada. En este caso, el ARNi contenido en cada subdosis debe ser correspondientemente menor para alcanzar la dosis diaria total. La unidad de dosificación también se puede preparar para su administración durante varios días, por ejemplo, utilizando una formulación de liberación sostenida convencional que proporciona una liberación sostenida del ARNi durante un período de varios días. Las formulaciones de liberación sostenida son bien conocidas en la técnica y son particularmente útiles para la administración de agentes en un sitio particular, tal como se podría usar con los agentes de la presente divulgación. En este caso, la unidad de dosificación contiene un múltiplo correspondiente de la dosis diaria.
En otros casos, una dosis única de las composiciones farmacéuticas puede ser de larga duración, de modo que las dosis posteriores se administren en intervalos de no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7 u 8 semanas. En algunos casos de la divulgación, una dosis única de las composiciones farmacéuticas de la divulgación se administra una vez al mes.
El experto apreciará que ciertos factores pueden influir en la dosis y el momento necesarios para tratar eficazmente a un sujeto, incluidos, pero sin limitarse a, la gravedad de la enfermedad o trastorno, tratamientos previos, la salud general y/o la edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición puede incluir un tratamiento único o una serie de tratamientos. Las estimaciones de dosis efectivas y vidas mediasin v ivopara los ARNi individuales abarcados por la divulgación se pueden realizar utilizando metodologías convencionales o sobre la base de pruebasin v ivoutilizando un modelo animal apropiado, como se describe en otra parte del presente documento.
Los avances en la genética de ratones han generado una serie de modelos de ratón para el estudio de diversas enfermedades humanas, tal como un trastorno hemorrágico que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1. Estos modelos se pueden utilizar para pruebasin v ivode ARNi, así como para determinar una dosis terapéuticamente efectiva. Se conocen modelos de ratón adecuados en la técnica e incluyen, por ejemplo, modelos de ratón con hemofilia A y modelos de ratón con hemofilia B, por ejemplo, ratones que contienen un gen de factor de coagulación inactivado, tales como los descritos en Bolliger, et al. (2010) Thromb Haemost 103:1233-1238, Bi L, et al. (1995) Nat Genet 10: 119-21, Lin et al. (1997) Blood 90: 3962-6, Kundu et al. (1998) Blood 92: 168-74, Wang et al. (1997) Proc Natl Acad Sci U S A 94: 11563-6, y Jin, et al. (2004) Blood 104:1733.
Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación se pueden administrar de varias maneras dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistémico y del área a tratar. La administración puede ser tópica (por ejemplo, mediante un parche transdérmico), pulmonar, por ejemplo, mediante inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluso mediante nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica y transdérmica, oral o parenteral. La administración parenteral incluye inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; subdérmica, por ejemplo, a través de un dispositivo implantado; o intracraneal, por ejemplo, mediante administración intraparenquimatosa, intratecal o intraventricular.
El ARNi se puede administrar de manera que se dirija a un tejido específico, tal como el hígado (por ejemplo, los hepatocitos del hígado).
Las composiciones y formulaciones farmacéuticas para administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, aerosoles, líquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables portadores farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo u oleosas, espesantes y similares. Los condones recubiertos, guantes y similares también pueden ser útiles. Las formulaciones tópicas adecuadas incluyen aquellas en las que los ARNi presentados en la divulgación están mezclados con un agente de administración tópica, tales como lípidos, liposomas, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, esteroides, agentes quelantes y tensioactivos. Las formulaciones tópicas se describen en detalle en la patente de EE. UU. n.° 6.747.014.
A. Formulaciones adicionales
i. Emulsiones
Las composiciones de la presente divulgación pueden prepararse y formularse como emulsiones. Las emulsiones son típicamente sistemas heterogéneos de un líquido disperso en otro en forma de gotitas que normalmente superan los 0,1 pm de diámetro (véanse, por ejemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), Nueva York, NY; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 199; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., Volumen 1, pág. 245; Block en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 2, pág. 335; Higuchi et al., en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, pág. 301). Las emulsiones son a menudo sistemas bifásicos que comprenden dos fases líquidas inmiscibles íntimamente mezcladas y dispersas entre sí. En general, las emulsiones pueden ser de tipo agua en aceite (w/o) o aceite en agua (o/w). Cuando una fase acuosa se divide finamente y se dispersa en pequeñas gotas en una fase oleosa a granel, la composición resultante se denomina emulsión de agua en aceite (w/o). Alternativamente, cuando una fase oleosa se divide finamente y se dispersa en pequeñas gotas en una fase acuosa masiva, la composición resultante se denomina emulsión de aceite en agua (o/w). Las emulsiones pueden contener componentes adicionales además de las fases dispersas, y el fármaco activo que puede estar presente como una solución en la fase acuosa, en la fase oleosa o en sí mismo como una fase separada. Los excipientes farmacéuticos tales como emulsionantes, estabilizadores, colorantes y antioxidantes también pueden estar presentes en las emulsiones según sea necesario. Las emulsiones farmacéuticas también pueden ser emulsiones múltiples que se componen de más de dos fases tales como, por ejemplo, en el caso de las emulsiones de aceite en agua en aceite (o/w/o) y agua en aceite en agua (w/o/w). Estas formulaciones complejas a menudo proporcionan ciertas ventajas que las emulsiones binarias simples no ofrecen. Las emulsiones múltiples en las que gotitas de aceite individuales de una emulsión o/w encierran pequeñas gotitas de agua constituyen una emulsión w/o/w. De la misma manera, un sistema de gotitas de aceite encerradas en glóbulos de agua estabilizados en una fase continua oleosa proporciona una emulsión o/w/o.
Las emulsiones se caracterizan por una estabilidad termodinámica escasa o nula. A menudo, la fase dispersa o discontinua de la emulsión se dispersa bien en la fase externa o continua y se mantiene en esta forma a través de emulsionantes o la viscosidad de la formulación. Cualquiera de las fases de la emulsión puede ser semisólida o sólida, como es el caso de las bases de ungüentos y cremas tipo emulsión. Otros medios para estabilizar emulsiones implican el uso de emulsionantes que pueden incorporarse a cualquiera de las fases de la emulsión. Los emulsionantes pueden clasificarse en cuatro categorías: tensioactivos sintéticos, emulsionantes naturales, bases de absorción, y sólidos finamente dispersos (véase, por ejemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), Nueva York, NY; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y, volumen 1, pág.
199).
Los tensioactivos sintéticos, también conocidos como agentes tensioactivos, han encontrado una amplia aplicabilidad en la formulación de emulsiones y se han revisado en la bibliografía (véanse, por ejemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), Nueva York, NY; Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y, volumen 1, pág. 285; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., 1988, volumen 1, pág. 199). Los tensioactivos suelen ser anfifílicos, y comprenden una porción hidrófila y una hidrófoba. La relación entre la naturaleza hidrófila e hidrófoba del tensioactivo se ha denominado equilibrio hidrófilo/lipófilo (HLB), y es una herramienta valiosa para categorizar y seleccionar tensioactivos en la preparación de formulaciones. Los tensioactivos pueden clasificarse en diferentes clases según la naturaleza del grupo hidrófilo: no iónico, aniónico, catiónico y anfotérico (véanse, por ejemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), Nueva York, NY Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 285).
Los emulsionantes naturales utilizados en formulaciones de emulsiones incluyen lanolina, cera de abejas, fosfátidos, lecitina y goma arábiga. Las bases de absorción poseen propiedades hidrófilas de manera que pueden absorber agua para formar emulsiones agua/aceite y, sin embargo, conservar su consistencia semisólida, tales como lanolina anhidra y vaselina hidrófila. Los sólidos finamente divididos también se han utilizado como buenos emulsionantes, especialmente en combinación con tensioactivos y en preparaciones viscosas. Estos incluyen sólidos inorgánicos polares, tales como hidróxidos de metales pesados, arcillas no hinchables tales como bentonita, atapulgita, hectorita, caolín, montmorillonita, silicato de aluminio coloidal y silicato de aluminio y magnesio coloidal, pigmentos y sólidos no polares tales como carbono o triestearato de glicerilo.
Una gran variedad de materiales no emulsionantes también se incluyen en las formulaciones de emulsiones y contribuyen a las propiedades de las emulsiones. Estos incluyen grasas, aceites, ceras, ácidos grasos, alcoholes grasos, ésteres grasos, humectantes, coloides hidrófilos, conservantes y antioxidantes (Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY, volumen 1, pág. 335; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY, volumen 1, pág. 199).
Los coloides hidrófilos o hidrocoloides incluyen gomas naturales y polímeros sintéticos tales como polisacáridos (por ejemplo, goma arábiga, agar, ácido algínico, carragenina, goma guar, goma karaya, y tragacanto), derivados de celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa y carboxipropilcelulosa) y polímeros sintéticos (por ejemplo, carbómeros, éteres de celulosa, y polímeros de carboxivinilo). Estos se dispersan o se hinchan en agua para formar soluciones coloidales que estabilizan las emulsiones formando fuertes películas interfaciales alrededor de las gotas de la fase dispersa y aumentando la viscosidad de la fase externa.
Dado que las emulsiones a menudo contienen una serie de ingredientes tales como hidratos de carbono, proteínas, esteroles y fosfátidos que pueden favorecer fácilmente el crecimiento de microbios, estas formulaciones a menudo incorporan conservantes. Los conservantes comúnmente utilizados incluidos en las formulaciones de emulsiones incluyen metilparabeno, propilparabeno, sales de amonio cuaternario, cloruro de benzalconio, ésteres de ácido phidroxibenzoico y ácido bórico. También se suelen añadir antioxidantes a las formulaciones de emulsiones para evitar el deterioro de la formulación. Los antioxidantes utilizados pueden ser eliminadores de radicales libres tales como tocoferoles, galatos de alquilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado o agentes reductores tales como ácido ascórbico y metabisulfito de sodio, y sinergistas antioxidantes tales como ácido cítrico, ácido tartárico y lecitina.
La aplicación de formulaciones de emulsión por vía dermatológica, oral y parenteral, y los métodos para su fabricación se han revisado en la bibliografía (véanse, por ejemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Alien, LV., Popovich NG. y Ansel HC., 20 O4 , Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), Nueva York, NY; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY, volumen 1, pág. 199). Las formulaciones de emulsión para administración oral se han utilizado ampliamente debido a su facilidad de formulación, así como a su eficacia desde el punto de vista de la absorción y la biodisponibilidad (véanse, por ejemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG. y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), Nueva York, NY; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY, volumen 1, pág. 245; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY, volumen 1, pág. 199). Los laxantes a base de aceite mineral, las vitaminas solubles en aceite y las preparaciones nutritivas con alto contenido de grasa se encuentran entre los materiales que comúnmente se han administrado por vía oral como emulsiones de aceite en agua.
ii. Microemulsiones
En un caso de la presente divulgación, las composiciones de ARNi y ácidos nucleicos se formulan como microemulsiones. Una microemulsión puede definirse como un sistema de agua, aceite y anfifílico que es una única solución líquida ópticamente isótropa y termodinámicamente estable (véanse, por ejemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG. y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8.a ed.), Nueva York, NY; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY, volumen 1, pág. 245). Normalmente, las microemulsiones son sistemas que se preparan dispersando primero un aceite en una solución acuosa de tensioactivo y añadiendo después una cantidad suficiente de un cuarto componente, generalmente un alcohol de cadena intermedia, para formar un sistema transparente. Por lo tanto, las microemulsiones también se han descrito como dispersiones isotrópicamente transparentes y termodinámicamente estables de dos líquidos inmiscibles que están estabilizados por películas interfaciales de moléculas tensioactivas (Leung y Shah, en: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, Nueva York, páginas 185-215). Las microemulsiones comúnmente se preparan mediante una combinación de tres a cinco componentes que incluyen aceite, agua, tensioactivo, cotensioactivo y electrolito. El tipo de microemulsión que se elija es agua en aceite (w/o) o aceite en agua (o/w) depende de las propiedades del aceite y del tensioactivo utilizados, así como de la estructura y el empaquetamiento geométrico de las cabezas polares y las colas hidrocarbonadas de las moléculas del tensioactivo (Schott, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, pág. 271).
El enfoque fenomenológico que utiliza diagramas de fases se ha estudiado ampliamente y ha proporcionado un conocimiento integral, a un experto en la técnica, de cómo formular microemulsiones (véanse, por ejemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG. y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), Nueva York, NY; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY, volumen 1, pág. 245; Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY, volumen 1, pág. 335). En comparación con las emulsiones convencionales, las microemulsiones ofrecen la ventaja de solubilizar medicamentos insolubles en agua en una formulación de gotitas termodinámicamente estables que se forman espontáneamente.
Los tensioactivos utilizados en la preparación de microemulsiones incluyen, pero no se limitan a, tensioactivos iónicos, tensioactivos no iónicos, Brij 96, éteres de oleilo de polioxietileno, ésteres de ácidos grasos de poliglicerol, monolaurato de tetraglicerol (ML310), monooleato de tetraglicerol (MO310), monooleato de hexaglicerol (PO310), pentaoleato de hexaglicerol (PO500), monocaprato de decaglicerol (MCA750), monooleato de decaglicerol (MO750), sesquioleato de decaglicerol (SO750), decaoleato de decaglicerol (DAO750), solos o en combinación con cotensioactivos. El cotensioactivo, generalmente un alcohol de cadena corta tal como etanol, 1 -propanol y 1 -butanol, sirve para aumentar la fluidez interfacial al penetrar en la película de tensioactivo y en consecuencia crear una película desordenada debido al espacio vacío generado entre las moléculas de tensioactivo. Sin embargo, las microemulsiones pueden prepararse sin el uso de cotensioactivos, y en la técnica se conocen sistemas de microemulsiones autoemulsionantes sin alcohol. La fase acuosa normalmente puede ser, pero no se limita a, agua, una solución acuosa del fármaco, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceroles, propilenglicoles y derivados de etilenglicol. La fase oleosa puede incluir, pero no se limita a, materiales tales como Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, ésteres de ácidos grasos, mono, di y triglicéridos de cadena media (C8-C12), ésteres de ácidos grasos de glicerilo polioxietilados, alcoholes grasos, glicéridos poliglicolizados, glicéridos C8-C10 poliglicolizados saturados, aceites vegetales y aceite de silicona.
Las microemulsiones son especialmente interesantes desde el punto de vista de la solubilización de fármacos y la mejora de la absorción de fármacos. Se han propuesto microemulsiones basadas en lípidos (tanto o/w como w/o) para mejorar la biodisponibilidad oral de los fármacos, incluidos los péptidos (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 6.191.105; 7.063.860; 7.070.802; 7.157.099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Las microemulsiones ofrecen ventajas como una mejor solubilización del fármaco, protección del fármaco contra la hidrólisis enzimática, posible mejora de la absorción del fármaco debido a alteraciones inducidas por el tensioactivo en la fluidez y permeabilidad de la membrana, facilidad de preparación, facilidad de administración oral en comparación con las formas de dosificación sólidas, potencia clínica mejorada, y menor toxicidad (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 6.191.105; 7.063.860; 7.070.802; 7.157.099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138 143). A menudo, las microemulsiones pueden formarse espontáneamente cuando sus componentes se juntan a temperatura ambiente. Esto puede ser especialmente ventajoso a la hora de formular fármacos termolábiles, péptidos o ARNi. Las microemulsiones también han sido eficaces en la administración transdérmica de componentes activos en aplicaciones cosméticas y farmacéuticas. Se espera que las composiciones y formulaciones de microemulsión de la presente divulgación faciliten la mayor absorción sistémica de ARNi y ácidos nucleicos del tracto gastrointestinal, así como mejorar la captación celular local de ARNi y ácidos nucleicos.
Las microemulsiones de la presente divulgación también pueden contener componentes y aditivos adicionales tales como monoestearato de sorbitán (Grill 3), Labrasol, y potenciadores de la penetración para mejorar las propiedades de la formulación y mejorar la absorción de los ARNi y ácidos nucleicos de la presente divulgación. Los potenciadores de la penetración utilizados en las microemulsiones de la presente divulgación se pueden clasificar como pertenecientes a una de cinco amplias categorías: tensioactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pág. 92). Cada una de estas clases se ha discutido anteriormente.
iii. Micropartículas
Un agente de ARNi de la divulgación puede incorporarse en una partícula, por ejemplo, una micropartícula. Las micropartículas se pueden producir mediante secado por aspersión, pero también se pueden producir mediante otros métodos, incluida la liofilización, la evaporación, el secado en lecho fluido, el secado a vacío, o una combinación de estas técnicas.
iv. Potenciadores de la penetración
En un caso, la presente divulgación emplea diversos potenciadores de la penetración para efectuar la administración eficiente de ácidos nucleicos, particularmente ARNi, a la piel de animales. La mayoría de los medicamentos están presentes en solución tanto en forma ionizada como no ionizada. Sin embargo, normalmente sólo los fármacos liposolubles o lipofílicos atraviesan fácilmente las membranas celulares. Se ha descubierto que incluso los fármacos no lipofílicos pueden atravesar las membranas celulares si la membrana que deben atravesar está tratada con un potenciador de la penetración. Además de ayudar a la difusión de fármacos no lipofílicos a través de las membranas celulares, los potenciadores de la penetración también mejoran la permeabilidad de los fármacos lipófilos.
Los potenciadores de la penetración pueden clasificarse como pertenecientes a una de cinco amplias categorías, es decir, tensioactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes (véanse, por ejemplo, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, Nueva York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pág.92). A continuación se describen con mayor detalle cada una de las clases de potenciadores de la penetración mencionadas anteriormente.
Los tensioactivos (o "agentes tensioactivos") son entidades químicas que, cuando se disuelven en una solución acuosa, reducen la tensión superficial de la solución o la tensión interfacial entre la solución acuosa y otro líquido, con el resultado de que se mejora la absorción de ARNi a través de la mucosa. Además de las sales biliares y los ácidos grasos, estos potenciadores de la penetración incluyen, por ejemplo, lauril sulfato de sodio, polioxietileno-9-lauril éter y polioxietileno-20-cetil éter (véanse, por ejemplo, Malmsten, M. Surfactants andpolymers in drug delivery, Informa Health Care, Nueva York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pág. 92); y emulsiones perfluoroquímicas, tal como FC-43. Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
Varios ácidos grasos y sus derivados que actúan como potenciadores de la penetración incluyen, por ejemplo, ácido oleico, ácido láurico, ácido cáprico (ácido n-decanoico), ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína (1-monooleoil-rac-glicerol), dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidónico, 1-monocaprato de glicerol, 1-dodecilazacicloheptan-2 -ona, acilcarnitinas, acilcolinas, ésteres de alquilo C1-20 de los mismos (por ejemplo, metilo, isopropilo y t-butilo), y mono y diglicéridos de los mismos (es decir, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.) (véanse, por ejemplo, Touitou, E., et al. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pág. 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
El papel fisiológico de la bilis incluye la facilitación de la dispersión y absorción de lípidos y vitaminas liposolubles (véanse, por ejemplo, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, Nueva York, NY, 2002; Brunton, Capítulo 38 en: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9a edición, Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, Nueva York, 1996, págs. 934-935). Diversas sales biliares naturales y sus derivados sintéticos actúan como potenciadores de la penetración. Por tanto, el término "sales biliares" incluye cualquiera de los componentes naturales de la bilis, así como cualquiera de sus derivados sintéticos. Las sales biliares adecuadas incluyen, por ejemplo, ácido cólico (o su sal sódica farmacéuticamente aceptable, colato sódico), ácido deshidrocólico (deshidrocolato sódico), ácido desoxicólico (desoxicolato sódico), ácido glucólico (glucolato sódico), ácido glicólico (glicolato sódico), ácido glicodesoxicólico (glicodesoxicolato sódico), ácido taurocólico (taurocolato sódico), ácido taurodesoxicólico (taurodesoxicolato sódico), ácido quenodesoxicólico (quenodesoxicolato sódico), ácido ursodesoxicólico (UDCA), tauro-24,25-dihidrofusidato sódico (STDHF), glicodihidrofusidato sódico y polioxietileno-9-lauril éter (POE) (véanse, por ejemplo, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, Nueva York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Swinyard, Capítulo 39 en: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, páginas 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).
Los agentes quelantes, como se utilizan en relación con la presente divulgación, se pueden definir como compuestos que eliminan iones metálicos de la solución formando complejos con ellos, con el resultado de que se mejora la absorción de ARNi a través de la mucosa. Con respecto a su uso como potenciadores de la penetración en la presente divulgación, los agentes quelantes tienen la ventaja adicional de servir también como inhibidores de la ADNasa, ya que la mayoría de las nucleasas de ADN caracterizadas requieren un ion metálico divalente para la catálisis, y por lo tanto son inhibidas por los agentes quelantes (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Los agentes quelantes adecuados incluyen, entre otros, etilendiaminotetraacetato disódico (EDTA), ácido cítrico, salicilatos (por ejemplo, salicilato de sodio, 5-metoxisalicilato y homovanilato), derivados N-acílicos de colágeno, laureth-9 y derivados N-aminoacílicos de beta-dicetonas (enaminas) (véase, por ejemplo, Katdare, A. et al., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).
Tal como se utiliza en el presente documento, los compuestos no quelantes no tensioactivos que mejoran la penetración se pueden definir como compuestos que demuestran una actividad insignificante como agentes quelantes o tensioactivos pero que, no obstante, mejoran la absorción de ARNi a través de la mucosa alimentaria (véase, por ejemplo, Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1 -33). Esta clase de potenciadores de la penetración incluye, por ejemplo, ureas cíclicas insaturadas, derivados de 1 -alquil- y 1 -alquenilazaciclo-alcanona (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92); y agentes antiinflamatorios no esteroideos tales como diclofenaco sódico, indometacina y fenilbutazona (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).
También se pueden añadir agentes que mejoran la captación de ARNi a nivel celular a las composiciones farmacéuticas y de otro tipo de la presente divulgación. Por ejemplo, también se sabe que los lípidos catiónicos, tal como la lipofectina (Junichi et al., patente de EE. UU. n.° 5.705.188), los derivados catiónicos de glicerol, y las moléculas policatiónicas, tal como la polilisina (Lollo et al., solicitud PCT WO 97/30731), mejoran la captación celular de ARNbc. Los ejemplos de reactivos de transfección disponibles comercialmente incluyen, por ejemplo, Lipofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine 2000™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), 293fectin™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Cellfectin™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), DMRIE-C™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), FreeStyle™ MAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine™ 2000 CD (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), RNAiMAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Oligofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Optifect™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), reactivo de transfección X-tremeGENE Q2 (Roche; Grenzacherstrasse, Switzerland), reactivo de transfección liposomal DOTAP (Grenzacherstrasse, Suiza), reactivo de transfección liposomal DOSPER (Grenzacherstrasse, Suiza), o Fugene (Grenzacherstrasse, Suiza), reactivo Transfectam® (Promega; Madison, WI), reactivo de transfección TransFast™ (Promega; Madison, WI), reactivo Tfx™-20 (Promega; Madison, WI), reactivo Tfx™-50 (Promega; Madison, WI), DreamFect™ (OZ Biosciences; Marseille, Francia), EcoTransfect (OZ Biosciences; Marsella, Francia), reactivo de transfección TransPassa D1 (New England Biolabs; Ipswich, MA, EE. UU), LyoVec™/LipoGen™ (Invitrogen; San Diego, CA, EE. UU.), reactivo de transfección PerFectin (Genlantis; San Diego, CA, EE. UU.), reactivo de transfección NeuroPORTER (Genlantis; San Diego, CA, EE. UU.), reactivo de transfección GenePORTER (Genlantis; San Diego, CA, EE. UU:), reactivo de transfección GenePORTER 2 (Genlantis; San Diego, CA, EE. UU.), reactivo de transfección Cytofectin (Genlantis; San Diego, CA, EE. UU.), reactivo de transfección BaculoPORTER (Genlantis; San Diego, CA, EE. UU.), reactivo de transfección TroganPORTER™ (Genlantis; San Diego, CA, EE. UU:), RiboFect (Bioline; Taunton, MA, EE. UU.), PlasFect (Bioline; Taunton, MA, EE. UU.), UniFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, EE. UU.), SureFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, EE. UU.), o HiFect™ (B-Bridge International, Mountain View, CA, EE. UU.), entre otros.
Se pueden utilizar otros agentes para mejorar la penetración de los ácidos nucleicos administrados, incluidos glicoles tales como etilenglicol y propilenglicol, pirroles tal como 2 -pirrol, azonas, y terpenos tales como limoneno y mentona.
v. Portadores
Ciertas composiciones de la presente divulgación también incorporan compuestos portadores en la formulación. Como se usa en este documento, "compuesto portador" o "portador" puede referirse a un ácido nucleico, o análogo del mismo, que es inerte (es decir, no posee actividad biológicap e r se)pero es reconocido como un ácido nucleico mediante procesosin v ivoque reducen la biodisponibilidad de un ácido nucleico que tiene actividad biológica, por ejemplo, degradando el ácido nucleico biológicamente activo o promoviendo su eliminación de la circulación. La coadministración de un ácido nucleico y un compuesto portador, típicamente con un exceso de esta última sustancia, puede dar lugar a una reducción sustancial de la cantidad de ácido nucleico recuperado en el hígado, el riñón u otros reservorios extracirculatorios, presumiblemente debido a la competencia entre el compuesto portador y el ácido nucleico por un receptor común. Por ejemplo, la recuperación de un ARNbc parcialmente fosforotioato en el tejido hepático se puede reducir cuando se coadministra con ácido poliinosínico, sulfato de dextrano, ácido policitídico o ácido 4-acetamido-4'isotiociano-estilbeno-2,2'-disulfónico (Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6 , 177-183.
vi. Excipientes
A diferencia de un compuesto portador, un "vehículo farmacéutico" o "excipiente" es un disolvente farmacéuticamente aceptable, un agente de suspensión o cualquier otro vehículo farmacológicamente inerte para administrar uno o más ácidos nucleicos a un animal. El excipiente puede ser líquido o sólido y se selecciona, teniendo en cuenta la forma de administración planificada, para proporcionar el volumen, la consistencia, etc. deseados cuando se combina con un ácido nucleico y los demás componentes de una composición farmacéutica determinada. Los portadores farmacéuticos típicos incluyen, pero no se limitan a, agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa, etc.); cargas (por ejemplo, lactosa y otros azúcares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, etilcelulosa, poliacrilatos o hidrogenofosfato de calcio, etc.); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, sílice, dióxido de silicio coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, aceites vegetales hidrogenados, almidón de maíz, polietilenglicoles, benzoato de sodio, acetato de sodio, etc.); disgregantes (por ejemplo, almidón, glicolato de almidón sódico, etc.); y agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato de sodio, etc.).
También se pueden utilizar excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para administración no parenteral que no reaccionen de forma perjudicial con los ácidos nucleicos para formular las composiciones de la presente divulgación. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, soluciones salinas, alcoholes, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.
Las formulaciones para la administración tópica de ácidos nucleicos pueden incluir soluciones acuosas estériles y no estériles, soluciones no acuosas en solventes comunes tales como alcoholes, o soluciones de ácidos nucleicos en bases de aceite líquidas o sólidas. Las soluciones también pueden contener amortiguadores, diluyentes y otros aditivos adecuados. Se pueden utilizar excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para administración no parenteral que no reaccionen de forma perjudicial con los ácidos nucleicos.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, soluciones salinas, alcohol, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.
vii. Otros componentes
Las composiciones de la presente divulgación pueden contener adicionalmente otros componentes adjuntos que se encuentran convencionalmente en composiciones farmacéuticas, en sus niveles de uso establecidos en la técnica. Así, por ejemplo, las composiciones pueden contener materiales farmacéuticamente activos adicionales compatibles tales como, por ejemplo, antipruriginosos, astringentes, anestésicos locales o agentes antiinflamatorios, o pueden contener materiales adicionales útiles para formular físicamente diversas formas de dosificación de las composiciones de la presente divulgación, tales como colorantes, agentes aromatizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, agentes espesantes y estabilizantes. Sin embargo, dichos materiales, cuando se añaden, no deben interferir indebidamente con las actividades biológicas de los componentes de las composiciones de la presente divulgación. Las formulaciones se pueden esterilizar y, si se desea, mezclar con agentes auxiliares, por ejemplo, lubricantes, conservantes, estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, amortiguadores, colorantes, saborizantes y/o sustancias aromáticas y similares que no interactúen de forma perjudicial con el ácido nucleico de la formulación.
Las suspensiones acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes.
En algunos casos, las composiciones farmacéuticas presentadas en la divulgación incluyen (a) uno o más compuestos de ARNi y (b) uno o más agentes que funcionan mediante un mecanismo distinto de ARNi y que son útiles para tratar un trastorno hemolítico. Los ejemplos de dichos agentes incluyen, pero no se limitan a, un agente antiinflamatorio, un agente antiesteatosis, un agente antiviral y/o un agente antifibrótico. Además, otras sustancias comúnmente utilizadas para proteger el hígado, tal como silimarina, también pueden utilizarse junto con los ARNi descritos en este documento. Otros agentes útiles para tratar enfermedades hepáticas incluyen telbivudina, entecavir, e inhibidores de proteasa tal como telaprevir y otros descritos, por ejemplo, en Tung et al., Publicaciones de Solicitudes de EE. UU. n.° 2005/0148548, 2004/0167116 y 2003/0144217; y en Hale et al., Publicación de Solicitud de EE. UU. n.° 2004/0127488.
La toxicidad y la eficacia terapéutica de dichos compuestos se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos de células o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, y puede expresarse como la relación LD50/ED50. Se prefieren los compuestos que muestran altos índices terapéuticos.
Los datos obtenidos de ensayos de cultivo celular y estudios con animales se pueden utilizar para formular una variedad de dosis para uso en seres humanos. La dosificación de las composiciones presentadas en la presente divulgación se encuentra generalmente dentro de un rango de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto utilizado en los métodos presentados en la divulgación, la dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un rango de concentración plasmática circulante del compuesto o, cuando sea apropiado, del producto polipeptídico de una secuencia diana (por ejemplo, logrando una concentración disminuida del polipéptido) que incluye el ISERPINC10 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logra una inhibición de la mitad del máximo de los síntomas) según lo determinado en el cultivo celular. Esta información puede utilizarse para determinar con mayor precisión las dosis útiles en seres humanos. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento.
Además de su administración, como se discutió anteriormente, los ARNi presentados en la divulgación se pueden administrar en combinación con otros agentes conocidos eficaces en el tratamiento de procesos patológicos mediados por la expresión de SERPINC1. En cualquier caso, el médico administrador puede ajustar la cantidad y el momento de la administración de ARNi en función de los resultados observados utilizando medidas estándar de eficacia conocidas en la técnica o descritas en este documento.
VI. Kits
La presente divulgación también proporciona kits para realizar cualquiera de los métodos de la divulgación. Dichos kits incluyen uno o más agentes de ARNi e instrucciones de uso, por ejemplo, instrucciones para administrar una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de un agente de ARNi. Los kits pueden comprender además opcionalmente medios para administrar el agente de ARNi (por ejemplo, un dispositivo de inyección) o medios para medir la inhibición de Serpinc1 (por ejemplo, medios para medir la inhibición del ARNm de Serpinc1, la proteína Serpinc1 y/o la actividad de Serpinc1). Dichos medios para medir la inhibición de Serpinc1 pueden comprender un medio para obtener una muestra de un sujeto, tal como, por ejemplo, una muestra de plasma. Los kits de la divulgación pueden comprender además opcionalmente medios para determinar la cantidad terapéuticamente eficaz o profilácticamente eficaz.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende una persona con conocimientos normales en la técnica a la que pertenece esta divulgación. Aunque se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento en la práctica o prueba de los ARNi y métodos presentados en la divulgación, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. Además, los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no pretenden ser limitativos.
EJEMPLOS
Tabla1: Abreviaturas de monómeros de nucleótidos utilizados en la representación de secuencias de ácidos nucleicos. Se entenderá que estos monómeros, cuando están presentes en un oligonucleótido, están unidos mutuamente por enlaces 5'-3'-fosfodiéster.
Ejemplo 1: Administración de una dosis única de AD-57213 a sujetos humanos sanos
A veinticuatro voluntarios humanos sanos, en cohortes de 3:1 (activo:placebo), se les administró una dosis única de 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,6 mg/kg o 1,0 mg/kg de AD-57213 (Sentido (5' a 3'): GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAfL96 (SEQ ID NO:13); Antisentido (5' a 3'): usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg (SEQ ID NO:14)). Se recolectaron muestras de plasma los días 0, 1, 2, 3, 7, 10, 14, 21,28, 42, 56 y 70 después de la administración para monitorizar los niveles de proteína AT, la actividad de AT, y la duración del silenciamiento de la proteína AT. Los niveles de proteína AT se monitorizaron mediante ELISA, y los niveles de actividad de AT se monitorizaron mediante la generación de curvas de generación de trombina utilizando un trombinoscopio automatizado calibrado (factor tisular = 1 pM). El cambio en el pico de trombina se calculó con respecto al valor pico de trombina promedio para dos valores previos a la dosis para cada sujeto.
No hubo ningún evento adverso grave, 3 eventos adversos leves que probablemente no estaban relacionados con la administración del agente, y 1 evento adverso leve (dolor de cabeza) que potencialmente estaba relacionado con la administración del agente. Tampoco hubo reacciones en el lugar de la inyección, y los exámenes físicos, las constantes vitales y los electrocardiogramas de todos los sujetos estaban dentro de los límites normales. Además, todas las pruebas de función hepática, los niveles de bilirrubina total, el índice internacional normalizado de tiempos de protrombina (TP/INR), los recuentos de plaquetas, los niveles de hemoglobina y las pruebas de coagulación (es decir, tiempos de tromboplastina parcial activada (TTPA), tiempos de protrombina (TP), niveles de fibrinógeno, y niveles de dímero D de fibrina) de todos los sujetos no cambiaron durante el curso del estudio y estaban dentro de los límites normales.
Las Figuras 1A - D y 2A - B muestran que una dosis única de 0,03 mg/kg de AD-57213 da como resultado una reducción de aproximadamente el 20% y hasta el 33% en los niveles de proteína AT (Figuras 2A y 2B) y una reducción correspondiente en la actividad de AT (Figuras 1A - D) con una durabilidad de reducción de más de 60 días.
La Figura 3 demuestra además que existe una asociación significativa entre la reducción de AT y la generación máxima de trombina. En concreto, se observó un aumento de hasta el 152% en la generación máxima de trombina, con un aumento máximo medio de la trombina máxima del 138% ± 8,9% (media ± SEM). Además, y en consonancia con una mayor generación de trombina con una mayor reducción de AT, los niveles de Factor VIII o IX eran normales.
Ejemplo 2: Administración de dosis múltiples de AD-57213 a pacientes humanos con hemofilia A o B
Fase I - Partes B, C y D del ensayo clínico
En la Parte B de un ensayo clínico de Fase I de AD-57213 (Sentido (5' a 3'): GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAfL96 (SEQ ID NO: 13); Antisentido (5' a 3'): usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg (SEQ ID NO:14)), a tres pacientes con hemofilia A (n=2) o B (n=1) se les administró por vía subcutánea 0,015 mg/kg semanales durante tres semanas (15 microgramos/kg qw x 3; 15 mcg/kg) de AD-57213; a seis pacientes con hemofilia A se les administró por vía subcutánea 0,045 mg/kg semanales durante tres semanas (45 microgramos/kg qw x 3; 45 mcg/kg) de AD-57213; y a tres pacientes con hemofilia A (n = 2) o B (n = 1) se les administró por vía subcutánea 0,075 mg/kg semanalmente durante tres semanas (75 microgramos/kg qw x 3; 75 mcg/kg) de AD-57213.
En la Parte C de un ensayo clínico de Fase I de AD-57213 (Sentido (5' a 3'): GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAfL96 (SEQ ID NO: 13); Antisentido (5' a 3'): usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg (SEQ ID NO:14)), a tres pacientes con hemofilia A (n=2) o B (n=1) se les administró por vía subcutánea una dosis mensual de 0,225 mg/kg de AD-57213 durante tres meses (225 microgramos/kg qm x 3; 225 mcg/kg); a tres pacientes con hemofilia A (n=2) o B (n=1) se les administró por vía subcutánea una dosis mensual de 0,450 mg/kg de AD-57213 durante tres meses (450 microgramos/kg qm x 3; 450 mcg/kg); a tres pacientes con hemofilia A se les administró por vía subcutánea una dosis mensual de 0,900 mg/kg de AD-57213 durante tres meses (900 microgramos/kg qm x 3; 900 mcg/kg); a tres pacientes con hemofilia A se les administró por vía subcutánea una dosis mensual de 1,800 mg/kg de AD-57213 durante tres meses (1800 microgramos/kg qm x 3; 1800 mcg/kg); y a seis pacientes con hemofilia A (n = 3) o B (n = 3) se les administró por vía subcutánea una dosis fija mensual de 80 mg de AD-57213 durante tres meses (80 mg qM x 3).
En la Parte D de un ensayo clínico de Fase I de AD-57213 (Sentido (5' a 3'): GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAfL96 (SEQ ID NO: 13); Antisentido (5' a 3'): usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg (SEQ ID NO:14)), a seis pacientes inhibidores que tenían hemofilia A (n = 5) o B (n = 1) y que utilizaban agentes de derivación (BPA) para el tratamiento del sangrado se les administró por vía subcutánea una dosis fija de 50 mg de AD-57213 mensualmente durante tres meses (50 mg qM x 3); y a 10 pacientes que tenían hemofilia A y utilizaban agentes de derivación (BPA) para el tratamiento del sangrado se les administró por vía subcutánea una dosis fija de 80 mg de AD-57213 mensualmente durante tres meses (80 mg qM x 3).
Se recolectaron muestras de plasma después de la administración de AD-57213 para monitorizar los niveles de proteína AT, la actividad de AT, y la duración del silenciamiento de la proteína AT. Los niveles de proteína AT se monitorizaron mediante ELISA, y los niveles de actividad de AT se monitorizaron mediante la generación de curvas de generación de trombina utilizando un trombinoscopio automatizado calibrado (factor tisular = 1 pM). El cambio en el pico de trombina se calculó con respecto al valor pico de trombina promedio para dos valores previos a la dosis para cada sujeto.
Las características demográficas y basales de los pacientes que participaron en las Partes B, C y D del estudio se proporcionan en la Tabla 2.
Tabla 2. Características demográficas y basales de los participantes del estudio
En las Partes B, C y D del estudio, no hubo eventos adversos graves, ninguna interrupción, ninguna reacción en el lugar de la inyección, y los exámenes físicos, las constantes vitales y los electrocardiogramas de todos los pacientes estaban dentro de los límites normales. Además, todas las pruebas de función hepática y los hemogramas completos de todos los pacientes no cambiaron durante el curso del estudio y estaban dentro de los límites normales. Tampoco hubo eventos tromboembólicos durante el curso de este estudio ni aumentos clínicamente significativos en el nivel de dímero D de fibrina en ninguno de los pacientes. Cualquier evento hemorrágico se manejó exitosamente con la administración de factor de reemplazo estándar o agente de derivación. Además, no se observaron casos de formación de anticuerpos antifármaco (ADA).
La reducción de los niveles de AT en las cohortes de 15 mcg/kg, 45 mcg/kg y 75 mcg/kg, que se muestra como una reducción media de AT con respecto al valor inicial, se representa en la Figura 4. La Figura 4 demuestra que dosis semanales de 0,015 mg/kg durante tres semanas de AD-57213 dan como resultado una reducción máxima media de AT del 29% ± 12% (media ± SEM). La reducción máxima de AT fue de hasta 53%. La Figura 4 también demuestra que dosis semanales de 0,045 mg/kg durante tres semanas de AD-57213 dan como resultado una reducción máxima media de AT de 55 ± 9% (media ± SEM) y una reducción máxima de AT de 86%. Además, la Figura 4 también demuestra que dosis semanales de 0,075 mg/kg durante tres semanas de AD-57213 dan como resultado una reducción máxima media de AT de 61 ± 8% (media ± SEM) y una reducción máxima de AT de 74%.
La reducción de los niveles de AT en las cohortes de 225 mcg/kg, 450 mcg/kg, 900 mcg/kg, 1800 mcg/kg y 80 mg, que se muestra como una reducción media de AT con respecto al valor inicial, se representa en la Figura 5A. La Figura 5A demuestra que dosis mensuales de 0,225 mg/kg durante tres meses de AD-57213 dan como resultado una reducción máxima media de AT de 70% ± 9% (media ± SEM). La reducción máxima de AT fue de hasta 80%. La Figura 5A también demuestra que dosis mensuales de 0,450 mg/kg durante tres meses de AD-57213 dan como resultado una reducción máxima media de AT de 77 ± 5% (media ± SEM) y una reducción máxima de AT de 85%. Además, la Figura 5A también demuestra que dosis mensuales de 0,900 mg/kg durante tres meses de AD-57213 dan como resultado una reducción máxima media de AT de 78 ± 7% (media ± SEM) y una reducción máxima de AT de 88%. Además, la Figura 5A demuestra que dosis mensuales de 1,800 mg/kg durante tres meses de AD-57213 dan como resultado una reducción máxima media de AT de 79 ± 3% (media ± SEM) y una reducción máxima de AT de 84%. La Figura 5A también demuestra que dosis mensuales de 80 mg durante tres meses de AD-57213 dan como resultado una reducción máxima media de AT de 87 ± 1% (media ± SEM).
Como se demuestra en la Figura 5B, que representa la dosis de AD-57213 frente al nadir relativo de los niveles de proteína AT, la administración de AD-57213 a pacientes humanos reduce los niveles de proteína AT de manera dependiente de la dosis.
La evaluación de la generación de trombina en voluntarios humanos sanos (Ejemplo 1) y pacientes con hemofilia A o B demostró que las dosis semanales de AD-57213 dieron como resultado un aumento de hasta un 334% (con respecto al valor inicial) en la generación de trombina en pacientes con hemofilia, con un aumento medio en la generación de trombina de 112 ± 38% (p < 0,05), con respecto al valor inicial cuando la AT se redujo en >50% (Figura 6 B). La Figura 6A demuestra que el pico máximo de trombina alcanzado en pacientes con hemofilia A o B a los que se les administraron dosis semanales de AD-57213 estuvo en el rango bajo de generación de trombina en sujetos normales.
El análisis de tromboelastometría ROTEM® (véase, por ejemplo, Young, et al. (2013) Blood 121:1944) de sangre completa de un sujeto (sujeto 101 -009) demuestra que la administración de AD-57213 a 0,045 mg/kg semanalmente durante tres semanas no sólo produce un aumento en la generación máxima de trombina, sino que también produce una mejora notable y duradera en la formación de coágulos de sangre completa, como lo demuestra una disminución en el tiempo de formación de coágulos y el tiempo de coagulación (Figura 7). El sujeto 101-009 no ha presentado episodios de sangrado desde el día 2, y actualmente lleva 47 días sin sangrado.
Un análisis post-hoc de la generación de trombina por cuartiles de reducción de AT (Partes B y C) demuestra que, en el cuartil de reducción de AT más alto (>75% de reducción de AT), hay un aumento de 289% en la generación media de trombina con respecto al valor inicial (Figura 9). Este nivel de generación de trombina está dentro del rango de generación de trombina observado en voluntarios sanos.
Un subestudio de tres pacientes exploró la equivalencia de la administración de AD-57213 y la administración de Factor VIII. Brevemente, se administró Factor VIII a cada uno de los tres pacientes, y se recogió plasma de los pacientes a las -0,5, 1, 2, 6 , 24 y 48 horas después de la administración. Se analizaron las muestras de cada sujeto para determinar los niveles de Factor VIII y los niveles de generación de trombina, y se utilizaron para establecer relaciones individualizadas entre el Factor VIII y la generación máxima de trombina. Estos datos se utilizaron después para compararlos con los niveles máximos de generación de trombina alcanzados con la administración de AD-57213. Como se muestra en las Figuras 10A-10C, la administración de AD-57213 es suficiente para alcanzar niveles máximos de generación de trombina en el sujeto aproximadamente al mismo nivel alcanzado por la administración al sujeto de Factor VIII y suficiente para alcanzar niveles máximos de generación de trombina superiores a aproximadamente el 40% en el sujeto.
Un análisis post-hoc de los eventos de sangrado por cuartil de reducción de AT (Partes B y C) demuestra que hay una tendencia reducida al sangrado con niveles crecientes de reducción de AT, con una tasa de sangrado anual (ABR) estimada media de 5 ± 2 (mediana = 1) en el cuartil de reducción de AT más alto (Figura 11). Este análisis incluye más de 1100 días acumulados con una reducción de AT >75% en 16 pacientes.
También se realizó un análisis post-hoc de los eventos de sangrado en la cohorte de la Parte C. La Figura 12 proporciona los datos de los pacientes utilizados para este análisis. Como se muestra en la Figura 13A, la mediana histórica de ABR para todos los pacientes inscritos en la Cohorte C y que recibieron factores de reemplazo profilácticos (PPx) fue 2, y la mediana histórica de ABR para todos los pacientes inscritos en la Cohorte C y que recibieron factores de reemplazo a demanda (OD) fue 28. La administración de AD-57213 a estos pacientes dio como resultado una reducción significativa de la ABR mediana. En particular, la administración de AD-57213 dio como resultado una mediana del 53% de pacientes que no informaron sangrados durante el período de observación (día 29 hasta la última visita del estudio o última dosis 56 días, lo que ocurra primero) y una mediana del 82% de pacientes que no informaron sangrados espontáneos durante el período de observación. La Figura 13B demuestra que para los pacientes que recibieron dosis mensuales de 80 mg de AD-57213 en la cohorte C y recibieron factores de reemplazo profiláctico (PPx), la ABR histórica mediana fue 6. Sin embargo, después de la administración de AD-57213, la ABR mediana durante el período de observación fue 0.
La Parte D del estudio de Fase I evaluó el efecto de la administración de AD-57213 en pacientes con hemofilia A o B que han desarrollado anticuerpos (inhibidores) contra los factores de reemplazo que se les administraron y por lo tanto se han vuelto refractarios al factor de coagulación de reemplazo. En consecuencia, para evaluar la respuesta máxima de trombina de estos pacientes, antes de la administración de AD-57213, a los pacientes inscritos en la cohorte de 50 mg se les administró su agente de derivación estándar (BPA) (por ejemplo, concentrado de complejo de protrombina activado y/o FVII activado recombinante ), se recolectaron muestras de plasma a las -1,2, 6 y 24 horas después de la administración de BPA, y las muestras se analizaron para determinar la generación de trombina. Como se muestra en las Figuras 14A-14F, la reducción de AT y la generación de trombina en pacientes con inhibidores a los que se les administró AD-57213 son comparables a la reducción de AT y la generación de trombina observadas después de la administración de AD-57213 con dosis similares en pacientes sin inhibidores. Además, las Figuras 14A-14F demuestran que la generación de trombina después de la administración de AD-57213 supera consistentemente los niveles transitorios alcanzados con la administración de BPA.
Como se muestra en la Figura 15, la administración subcutánea mensual de AD-57213 a 50 mg y 80 mg logra una reducción de AT dependiente de la dosis de aproximadamente el 80% en pacientes con hemofilia e inhibidores. Además, como se muestra en la Figura 16, el efecto de reducción de AT logrado en pacientes a los que se les administró AD-57213 se correlaciona con una mayor generación de trombina.
También se realizó un análisis post-hoc exploratorio de los eventos de sangrado en los pacientes de la Parte D del estudio. La Figura 17A muestra que la administración de AD-57213 a pacientes con inhibidores que tienen hemofilia A o B una vez al mes en una dosis de 50 mg o 80 mg da como resultado una reducción significativa en la ABR previa al estudio. Además, como se muestra en la Figura 17B, la tasa de sangrado anual mediana (ABR) es cero para todos los pacientes con inhibidores a los que se les administró AD-57213 en la Parte D de este estudio de Fase I, y el 56% de los pacientes no presentan sangrado, y el 69% de los pacientes no experimentaron sangrados espontáneos.
En resumen, AD-57213 es bien tolerado en pacientes con hemofilia A y B con y sin inhibidores. No hubo eventos adversos graves relacionados con el fármaco en estudio ni eventos tromboembólicos. Los datos demuestran que hay actividad clínica y corrección del fenotipo de hemofilia en pacientes sin inhibidores. Los datos demuestran además que existe una reducción de AT dependiente de la dosis y un aumento de la generación de trombina con un régimen de dosis subcutánea una vez al mes, y que la administración de una dosis fija de 50 mg u 80 mg de AD-57213 proporciona una reducción de AT constante de aproximadamente el 80%.
Además, los datos demuestran que la administración de AD-57213 a pacientes con inhibidores da como resultado una disminución de AT y un aumento en la generación de trombina consistente con los pacientes sin inhibidores, y que los aumentos en la generación de trombina exceden consistentemente aquellos logrados transitoriamente con la administración de BPA.
Ejemplo 3: Administración de dosis múltiples de AD-57213 a pacientes humanos con hemofilia A o B
Ensayo clínico de extensión de etiqueta abierta (OLE) de Fase II
En un estudio OLE de Fase II de AD-57213 (Sentido (5' a 3'):
GfsgsGfsgsGfCfCfCfCfL96 (SEQ ID NO: 13); Antisentido (5' a 3'):
usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg (SEQ ID NO: 14)), los pacientes sin inhibidores a los que se les había administrado previamente AD-57213 en los ensayos clínicos de Fase I Partes B y C descritos anteriormente fueron elegibles para ser inscritos en un estudio de extensión de etiqueta abierta (OLE) de Fase II. Doce pacientes del estudio de Fase I Parte B con hemofilia A o B a los que se les había administrado por vía subcutánea 0,015 mg/kg semanalmente durante tres semanas (15 microgramos/kg qw x 3; 15 mcg/kg) de AD-57213; o a los que se les había administrado por vía subcutánea 0,045 mg/kg semanalmente durante tres semanas (45 microgramos/kg qw x 3; 45 mcg/kg) de AD-57213; o a los que se les había administrado por vía subcutánea 0,075 mg/kg semanalmente durante tres semanas (75 microgramos/kg qw x 3; 75 mcg/kg) de AD-57213; y 18 pacientes del estudio de Fase I Parte C con hemofilia A o B a los que se les había administrado por vía subcutánea una dosis mensual de 0,225 mg/kg de AD-57213 durante tres meses (225 microgramos/kg qm x 3; 225 mcg/kg); o se les había administrado por vía subcutánea una dosis mensual de 0,450 mg/kg de AD-57213 durante tres meses (450 microgramos/kg qm x 3; 450 mcg/kg); o se les había administrado por vía subcutánea una dosis mensual de 0,900 mg/kg de AD-57213 durante tres meses (900 microgramos/kg qm x 3; 900 mcg/kg); o se les había administrado por vía subcutánea una dosis mensual de 1,800 mg/kg de AD-57213 durante tres meses (1800 microgramos/kg qm x 3; 1800 mcg/kg); o a quienes se les había administrado por vía subcutánea una dosis fija mensual de 80 mg de AD-57213 durante tres meses (80 mg qM x 3) eran elegibles para participar en este estudio.
Se incluyeron dieciséis pacientes. A ocho pacientes con hemofilia A (n=6 ) o hemofilia B (n=2) se les administró por vía subcutánea una dosis fija de 50 mg de AD-57213 mensualmente durante tres meses (50 mg qM x 3); y a 8 pacientes con hemofilia A (n=7) o hemofilia B (n=1) se les administró por vía subcutánea una dosis fija de 80 mg de AD-57213 mensualmente durante tres meses (50 mg qM x 3). Las características demográficas y basales de los pacientes incluidos en este estudio se muestran en la Tabla 3 a continuación.
Tabla 3. Características demográficas y basales de los participantes del estudio
En general, AD-57213 fue bien tolerado en pacientes sin inhibidores en el OLE de Fase II, con el período de exposición más prolongado de hasta 14 meses de tratamiento continuo, y no hubo eventos adversos graves (EAG) relacionados con el fármaco, ni interrupciones debido a eventos adversos, ni eventos tromboembólicos o evidencia de laboratorio de formación de coágulos patológicos. Todos los eventos adversos (EA) fueron leves o moderados en gravedad, y los EA más comunes consistieron en reacciones leves en el lugar de la inyección (ISR) en 4/16 (25 por ciento) de los pacientes. Se observaron aumentos asintomáticos de la alanina aminotransferasa (ALT) mayores de 3 veces el límite superior de lo normal (LSN), sin elevaciones concurrentes de la bilirrubina mayores de 2 veces el LSN, en 3 pacientes, todos ellos con antecedentes médicos de infección por hepatitis C. Todos los eventos de sangrado intermenstrual se manejaron exitosamente con factor de reemplazo. Además, no se observaron casos de formación de anticuerpos antifármaco (ADA).
Las Figuras 19A y 19B demuestran además la actividad clínica de la administración de AD-57213. Específicamente, como se muestra en la Figura 19A, la dosificación subcutánea una vez al mes de AD-57213 a 50 mg o 80 mg logra una reducción de AT dependiente de la dosis de ~80%, y como se muestra en la Figura 19B, la dosificación subcutánea una vez al mes de AD-57213 a 50 mg o 80 mg logra niveles de generación de trombina que se aproximan al extremo inferior del rango normal.
También se realizó un análisis post-hoc exploratorio de los eventos de sangrado en los pacientes sin inhibidores en el estudio OLE de Fase II. La Figura 20A muestra que la administración de AD-57213 a pacientes con hemofilia A o B una vez al mes en una dosis de 50 mg o 80 mg da como resultado una reducción significativa en la ABR previa al estudio. Además, como se muestra en la Figura 20B, la administración de AD-57213 a pacientes con hemofilia A o B una vez al mes en una dosis de 50 mg u 80 mg reduce la tasa de sangrado anual mediana (ABR) a 1 y reduce la tasa de sangrado espontáneo anualizada mediana (AsBR) a cero.
Además, durante el OLE de Fase II, un paciente (sujeto C1-3) se sometió a un procedimiento quirúrgico opcional. En concreto, un paciente con hemofilia A grave que recibía 50 mg mensuales de AD-57213 se sometió a una septoplastia opcional. El procedimiento se realizó con éxito sin eventos adversos asociados. Además, como informó el investigador a través de una comunicación personal, la utilización acumulada perioperatoria del factor VIII recombinante fue aproximadamente 5 veces menor que el utilizado habitualmente por el investigador para este tipo de cirugía en un paciente con hemofilia A grave. Con base en la puntuación de eficacia de la hemostasia de la Sociedad Internacional de Trombosis y Hemostasia (ISTH), el investigador calificó el control de la hemostasia en los períodos intraoperatorio, 24 horas después de la operación y 7 días después de la operación como "excelente".
En resumen, AD-57213 fue generalmente bien tolerado en pacientes con hemofilia A y B sin inhibidores. No hubo eventos adversos graves ni eventos tromboembólicos relacionados con la administración de AD-57213. Además, los datos demuestran que AD-57213 tiene actividad clínica ya que una dosis subcutánea mensual de 50 mg y 80 mg logra una reducción de aT dependiente de la dosis de ~80 % y niveles de generación de trombina que se acercan al extremo inferior del rango normal. Además, el análisis post-hoc exploratorio de eventos de sangrado en pacientes con hemofilia A o B sin inhibidores demuestra que la administración de AD-57213 redujo la ABR mediana a 1 y la tasa de sangrado espontáneo anualizada mediana (AsBR) a cero. Ocho de dieciséis (50%) pacientes no presentaron sangrado, y once de dieciséis (69%) pacientes no experimentaron sangrado espontáneo. Además, durante el primer caso quirúrgico de un sujeto con hemofilia A grave y al que se le administró AD-57213, se utilizó una reducción significativa del factor de reemplazo para mantener la hemostasia en el sujeto.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> ALNYLAM PHARMACEUTICALS, INC.
AKINC, AKIN
SORENSEN, BENNY
GARG, PUSHKAL
ROBBIE, GABRIEL
<120> MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA EL TRATAMIENTO DE UN TRASTORNO ASOCIADO A SERPINC1 <130> 121301-05220
<140>
<141>
<150> 62/429,241
<151> 2016-12-02
<150> 62/366,304
<151> 2016-07-25
<150> 62/315,228
<151> 2016-03-30
<150> 62/264,013
<151> 2015-12-07
<160> 16
<170> PatentIn versión 3.5
<210> 1
<211> 1599
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1
tctgccccac cctgtcctct ggaacctctg cgagatttag aggaaagaac cagttttcag 60 gcggattgcc tcagatcaca ctatctccac ttgcccagcc ctgtggaaga ttagcggcca 120 tgtattccaa tgtgatagga actgtaacct ctggaaaaag gaaggtttat cttttgtcct 180 tgctgctcat tggcttctgg gactgcgtga cctgtcacgg gagccctgtg gacatctgca 240 cagccaagcc gcgggacatt cccatgaatc ccatgtgcat ttaccgctcc ccggagaaga 300 aggcaactga ggatgagggc tcagaacaga agatcccgga ggccaccaac cggcgtgtct 360 gggaactgtc caaggccaat tcccgctttg ctaccacttt ctatcagcac ctggcagatt 420 ccaagaatga caatgataac attttcctgt cacccctgag tatctccacg gcttttgcta 480 tgaccaagct gggtgcctgt aatgacaccc tccagcaact gatggaggta tttaagtttg 540 acaccatatc tgagaaaaca tctgatcaga tccacttctt ctttgccaaa ctgaactgcc 600 gactctatcg aaaagccaac aaatcctcca agttagtatc agccaatcgc ctttttggag 660 acaaatccct taccttcaat gagacctacc aggacatcag tgagttggta tatggagcca 720 agctccagcc cctggacttc aaggaaaatg cagagcaatc cagagcggcc atcaacaaat 780 gggtgtccaa taagaccgaa ggccgaatca ccgatgtcat tccctcggaa gccatcaatg 840 agctcactgt tctggtgctg gttaacacca tttacttcaa gggcctgtgg aagtcaaagt 900 tcagccctga gaacacaagg aaggaactgt tctacaaggc tgatggagag tcgtgttcag 960 catctatgat gtaccaggaa ggcaagttcc gttatcggcg cgtggctgaa ggcacccagg 1020 tgcttgagtt gcccttcaaa ggtgatgaca tcaccatggt cctcatcttg cccaagcctg 1080 agaagagcct ggccaaggta gagaaggaac tcaccccaga ggtgctgcaa gagtggctgg 1140 atgaattgga ggagatgatg ctggtggtcc acatgccccg cttccgcatt gaggacggct 1200 tcagtttgaa ggagcagctg caagacatgg gccttgtcga tctgttcagc cctgaaaagt 1260 ccaaactccc aggtattgtt gcagaaggcc gagatgacct ctatgtctca gatgcattcc 1320 ataaggcatt tcttgaggta aatgaagaag gcagtgaagc agctgcaagt accgctgttg 1380 tgattgctgg ccgttcgcta aaccccaaca gggtgacttt caaggccaac aggcctttcc 1440 tggtttttat aagagaagtt cctctgaaca ctattatctt catgggcaga gtagccaacc 1500 cttgtgttaa gtaaaatgtt cttattcttt gcacctcttc ctatttttgg tttgtgaaca 1560 gaagtaaaaa taaatacaaa ctacttccat ctcacatta 1599
<210> 2
<211> 1545
<212> ADN
<213> Macaca mulatta
<400> 2
ggcacgagga ccatctccac ttgcccagcc ctgtggaaga ttagcgacca tgtattccaa 60 tgtgatagga accgtagcct ctggaaaaag gaaggtttat cttctgtcct tgctgctcat 120 tggcctctgg gactgtatga cctgtcacgg gagccctgtg gacatctgca cagccaagcc 180 gcgggacatt cccatgaatc ccatgtgcat ttaccgctcc ccggagaaga aggcaactga 240 ggatgagggc tcagaacaga agatccccga ggccaccaac cggcgcgtct gggaactgtc 300 caaggccaat tcccgctttg ctaccacttt ctatcagcac ctggcagatt ccaagaacga 360 caaggataac attttcctgt cacccctgag tgtctccacg gcttttgcta tgaccaagct 420 gggtgcctgt aatgacaccc tcaagcaact gatggaggta tttaagtttg acaccatatc 480 tgagaaaaca tctgatcaga tccacttctt ctttgccaaa ctgaactgcc gactctatcg 540 aaaagccaac aaatcctcca agttagtatc agccaatcgc ctttttggag acaaatccct 600 taccttcaat gagacctacc aggacatcag tgagttggta tacggagcca agctccagcc 660 cctggacttc aaggaaaatg cagagcaatc cagagcggcc atcaacaaat gggtgtccaa 720 taagaccgaa ggccgaatca ccgatgtcat tcccccggaa gccatcaacg agctcactgt 780 tctggtgctg gttaacacca tttacttcaa gggcctgtgg aagtcaaagt ttagccctga 840 gaacacaagg atggaaccgt tctacaaggc tgatggagag tcgtgttcag cgtctatgat 900 gtaccaggaa ggcaagttct gttatcggcg cgtggctgaa ggcacccagg tgcttgagtt 960 gcccttcaag ggtgatgaca tcaccatggt gctcatcctg cccaagcctg agaagagcct 1020 gaccaaggtg gagcaggaac tcaccccaga ggtgctgcag gagtggctgg atgagttgga 1080 ggagatgatg ctggtggttc acatgccccg cttccgcatt gaggacggct tcagtttgaa 1140 ggagcagctg caagacatgg gccttgtcga tctgttcagc cctgaaaagt ccaaactccc 1200 aggtattgtt gcagaaggcc gggatgacct ctatgtctcc gatgcattcc ataaggcatt 1260 tcttgaggta aatgaagaag gcagtgaagc agctgcaagt accgccattg ggattgctgg 1320 ccgttcgcta aaccccaaca gggtgacctt caaggccaac aggcctttcc tggtttttat 1380 aagagaagtt cctctgaaca ctattatctt catgggcaga gtagccaacc cttgtgtgag 1440 ctaaactgtt cttattcttt gtacctcttc ctattttggt ttgtgaatag aagtaaaaat 1500 aaatacaact actcccatct tacattaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1545
<210> 3
<211> 2171
<212> ADN
<213> Mus musculus
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ataggtaatt ttagaaatag atctgatttg tatctgagac attttagtga agtggtgaga 60 tataagacat aatcagaaga catatctacc tgaagacttt aaggggagag ctccctcccc 120 cacctggcct ctggacctct cagatttagg ggaaagaacc agttttcgga gtgatcgtct 180 cagtcagcac catctctgta ggagcatcgg ccatgtattc ccctggggca ggaagtgggg 240 ctgctggtga gaggaagctt tgtctcctct ctctgctcct catcggtgcc ttgggctgtg 300 ctatctgtca cggaaaccct gtggacgaca tctgcatagc gaagccccga gacatccccg 360 tgaatccctt gtgcatttac cgctcccctg ggaagaaggc caccgaggag gatggctcag 420 agcagaaggt tccagaagcc accaaccggc gggtctggga actgtccaag gccaattcgc 480 gatttgccac taacttctac cagcacctgg cagactccaa gaatgacaac gacaacattt 540 tcctgtcacc cttgagcatc tccactgctt ttgctatgac caagctgggt gcctgtaacg 600 acactctcaa gcagctgatg gaggttttta aatttgatac catctccgag aagacatccg 660 accagatcca cttcttcttt gccaaactga actgccgact ctatcgaaaa gccaacaagt 720 cctctgactt ggtatcagcc aaccgccttt ttggagacaa atccctcacc ttcaacgaga 780 gctatcaaga tgttagtgag gttgtctatg gagccaagct ccagcccctg gacttcaagg 840 agaatccgga gcaatccaga gtgaccatca acaactgggt agctaataag actgaaggcc 900 gcatcaaaga tgtcatccca cagggcgcca ttaacgagct cactgccctg gttctggtta 960 acaccattta cttcaagggc ctgtggaagt caaagttcag ccctgagaac acaaggaagg 1020 aaccgttcta taaggtcgat gggcagtcat gcccagtgcc tatgatgtac caggaaggca 1080 aattcaaata ccggcgcgtg gcagagggca cccaggtgct agagctgccc ttcaaggggg 1140 atgacatcac catggtgctc atcctgccca agcctgagaa gagcctggcc aaggtggagc 1200 aggagctcac cccagagctg ctgcaggagt ggctggatga gctgtcagag actatgcttg 1260 tggtccacat gccccgcttc cgcaccgagg atggcttcag tctgaaggag cagctgcaag 1320 acatgggcct cattgatctc ttcagccctg aaaagtccca actcccaggg atcgttgctg 1380 gaggcaggga cgacctctat gtctccgacg cattccacaa agcatttctt gaggtaaatg 1440 aggaaggcag tgaagcagca gcgagtactt ctgtcgtgat tactggccgg tcactgaacc 1500 ccaatagggt gaccttcaag gccaacaggc ccttcctggt tcttataagg gaagttgcac 1560 tgaacactat tatattcatg gggagagtgg ctaatccttg tgtgaactaa aatattctta 1620 atctttgcac cttttcctac tttggtgttt gtgaatagaa gtaaaaataa atacgactgc 1680 cacctcacga gaatggactt ttccacttga agacgagaga ctggagtaca gatgctacac 1740 cacttttggg caagtgaagg gggagcagcc agccacggtg gcacaaacct atatcctggt 1800 gcttttgaag gtagaagcag ggcggtcagg agttaaggcc agttgaggct gggctgcaga 1860 gtgaaagacc atgtctcaag atggtctttc tcctccccaa agtagaaaag aaaaccataa 1920 aaacaagagg taaatatatt actatttcat cttagaggat agcaggcatc ttgaaagggt 1980 agagggacct taaattctca ttattgcccc catactacaa actaaaaaac aaacccgaat 2040 caatctccca taaagacaga gattcaaata agagtattaa acgttttatt tctcaaacca 2100 ctcacatgca taatgttctt atacacagtg tcaaaataaa gagaaatgca tttttataca 2160 aaaaaaaaaa a 2171
<210> 4
<211> 1561
<212> ADN
<213> Rattus norvegicus
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cggagggatt gctcagcact gtctccacgg cttctctgca gaagcgtcca ccatgtattc 60 cccgggaata ggaagtgcgg ttgctggaga gaggaagctt tgtctcctct ctctgctact 120 cattggtgcc ttgggctgtg ctgtctgtca tggaaaccct gtggacgaca tctgcatagc 180 gaagccccga gacatccccg tgaaccccat gtgcatttac cgctcccctg cgaagaaggc 240 cacggaggag gatgtcctag agcagaaggt tccggaagcc accaaccggc gggtctggga 300 actgtccaag gccaattctc gatttgccac taacttctat cagcacctgg cagactccaa 360 gaacgacaac gacaacattt tcctgtcacc cttgagcatc tccacggcgt ttgctatgac 420 caagctgggt gcttgtaata acaccctcaa gcagctgatg gaggttttta aatttgatac 480 catctccgag aagacatccg accagatcca cttcttcttt gccaaactga actgccgact 540 ctatcgaaaa gccaacaagt cctctaactt ggtgtcagcc aaccgccttt ttggagacaa 600 atcccttacc ttcaatgaga gctatcaaga cgttagtgag attgtctatg gagccaagct 660 tcagcccctg gacttcaagg agaatccgga gcaatccaga gtgaccatca acaactgggt 720 agctaataag actgaaggcc gcatcaaaga cgtcatcccc caaggagcca ttgatgagct 780 cactgccctg gtgctggtta acaccattta cttcaagggc ctgtggaagt caaagttcag 840 ccctgagaac acaaggaagg aaccattcca caaagttgat gggcagtcat gcctggtgcc 900 catgatgtac caggaaggca aattcaaata caggcgtgtg ggagagggta cccaggtgct 960 agagatgccc ttcaaggggg acgacatcac catggtgctc atcctgccca agcctgagaa 1020 gagcctggct aaggtggagc aggaactcac cccggagctg ctgcaggagt ggctggatga 1080 gctgtcggag gtcatgcttg tggtccacgt gccccgcttc cgcatcgagg acagcttcag 1140 tctgaaggag cagctgcaag acatgggcct tgttgatctc ttcagccctg agaagtccca 1200 actcccaggg atcattgctg aaggcaggga cgacctcttt gtctccgatg cattccacaa 1260 agcgtttctt gaggtaaatg aggaaggcag tgaagcagca gcgagtactt ctgtcgtgat 1320 tactggccgg tcactgaacc ccagtagggt gaccttcaag gccaacaggc ccttcctggt 1380 tcttataagg gaagtcgcac tgaacactat tatattcatg gggagagtgt ctaatccttg 1440 tgtgaactaa aatattctta atctttgcac cttttcctat ctcggtgttt gttaatggaa 1500 gtaaaaataa atatgactgc cacctcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560 a 1561
<210> 5
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<212> ADN
<213> Homo sapiens
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taatgtgaga tggaagtagt ttgtatttat ttttacttct gttcacaaac caaaaatagg 60 aagaggtgca aagaataaga acattttact taacacaagg gttggctact ctgcccatga 120 agataatagt gttcagagga acttctctta taaaaaccag gaaaggcctg ttggccttga 180 aagtcaccct gttggggttt agcgaacggc cagcaatcac aacagcggta cttgcagctg 240 cttcactgcc ttcttcattt acctcaagaa atgccttatg gaatgcatct gagacataga 300 ggtcatctcg gccttctgca acaatacctg ggagtttgga cttttcaggg ctgaacagat 360 cgacaaggcc catgtcttgc agctgctcct tcaaactgaa gccgtcctca atgcggaagc 420 ggggcatgtg gaccaccagc atcatctcct ccaattcatc cagccactct tgcagcacct 480 ctggggtgag ttccttctct accttggcca ggctcttctc aggcttgggc aagatgagga 540 ccatggtgat gtcatcacct ttgaagggca actcaagcac ctgggtgcct tcagccacgc 600 gccgataacg gaacttgcct tcctggtaca tcatagatgc tgaacacgac tctccatcag 660 ccttgtagaa cagttccttc cttgtgttct cagggctgaa ctttgacttc cacaggccct 720 tgaagtaaat ggtgttaacc agcaccagaa cagtgagctc attgatggct tccgagggaa 780 tgacatcggt gattcggcct tcggtcttat tggacaccca tttgttgatg gccgctctgg 840 attgctctgc attttccttg aagtccaggg gctggagctt ggctccatat accaactcac 900 tgatgtcctg gtaggtctca ttgaaggtaa gggatttgtc tccaaaaagg cgattggctg 960 atactaactt ggaggatttg ttggcttttc gatagagtcg gcagttcagt ttggcaaaga 1020 agaagtggat ctgatcagat gttttctcag atatggtgtc aaacttaaat acctccatca 1080 gttgctggag ggtgtcatta caggcaccca gcttggtcat agcaaaagcc gtggagatac 1140 tcaggggtga caggaaaatg ttatcattgt cattcttgga atctgccagg tgctgataga 1200 aagtggtagc aaagcgggaa ttggccttgg acagttccca gacacgccgg ttggtggcct 1260 ccgggatctt ctgttctgag ccctcatcct cagttgcctt cttctccggg gagcggtaaa 1320 tgcacatggg attcatggga atgtcccgcg gcttggctgt gcagatgtcc acagggctcc 1380 cgtgacaggt cacgcagtcc cagaagccaa tgagcagcaa ggacaaaaga taaaccttcc 1440 tttttccaga ggttacagtt cctatcacat tggaatacat ggccgctaat cttccacagg 1500 gctgggcaag tggagatagt gtgatctgag gcaatccgcc tgaaaactgg ttctttcctc 1560 taaatctcgc agaggttcca gaggacaggg tggggcaga 1599
<210> 6
<211> 1545
<212> ADN
<213> Macaca mulatta
<400> 6
tttttttttt ttttttttta atgtaagatg ggagtagttg tatttatttt tacttctatt 60 cacaaaccaa aataggaaga ggtacaaaga ataagaacag tttagctcac acaagggttg 120 gctactctgc ccatgaagat aatagtgttc agaggaactt ctcttataaa aaccaggaaa 180 ggcctgttgg ccttgaaggt caccctgttg gggtttagcg aacggccagc aatcccaatg 240 gcggtacttg cagctgcttc actgccttct tcatttacct caagaaatgc cttatggaat 300 gcatcggaga catagaggtc atcccggcct tctgcaacaa tacctgggag tttggacttt 360 tcagggctga acagatcgac aaggcccatg tcttgcagct gctccttcaa actgaagccg 420 tcctcaatgc ggaagcgggg catgtgaacc accagcatca tctcctccaa ctcatccagc 480 cactcctgca gcacctctgg ggtgagttcc tgctccacct tggtcaggct cttctcaggc 540 ttgggcagga tgagcaccat ggtgatgtca tcacccttga agggcaactc aagcacctgg 600 gtgccttcag ccacgcgccg ataacagaac ttgccttcct ggtacatcat agacgctgaa 660 cacgactctc catcagcctt gtagaacggt tccatccttg tgttctcagg gctaaacttt 720 gacttccaca ggcccttgaa gtaaatggtg ttaaccagca ccagaacagt gagctcgttg 780 atggcttccg ggggaatgac atcggtgatt cggccttcgg tcttattgga cacccatttg 840 ttgatggccg ctctggattg ctctgcattt tccttgaagt ccaggggctg gagcttggct 900 ccgtatacca actcactgat gtcctggtag gtctcattga aggtaaggga tttgtctcca 960 aaaaggcgat tggctgatac taacttggag gatttgttgg cttttcgata gagtcggcag 1020 ttcagtttgg caaagaagaa gtggatctga tcagatgttt tctcagatat ggtgtcaaac 1080 ttaaatacct ccatcagttg cttgagggtg tcattacagg cacccagctt ggtcatagca 1140 aaagccgtgg agacactcag gggtgacagg aaaatgttat ccttgtcgtt cttggaatct 1200 gccaggtgct gatagaaagt ggtagcaaag cgggaattgg ccttggacag ttcccagacg 1260 cgccggttgg tggcctcggg gatcttctgt tctgagccct catcctcagt tgccttcttc 1320 tccggggagc ggtaaatgca catgggattc atgggaatgt cccgcggctt ggctgtgcag 1380 atgtccacag ggctcccgtg acaggtcata cagtcccaga ggccaatgag cagcaaggac 1440 agaagataaa ccttcctttt tccagaggct acggttccta tcacattgga atacatggtc 1500 gctaatcttc cacagggctg ggcaagtgga gatggtcctc gtgcc 1545
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tttttttttt ttgtataaaa atgcatttct ctttattttg acactgtgta taagaacatt 60 atgcatgtga gtggtttgag aaataaaacg tttaatactc ttatttgaat ctctgtcttt 120 atgggagatt gattcgggtt tgttttttag tttgtagtat gggggcaata atgagaattt 180 aaggtccctc taccctttca agatgcctgc tatcctctaa gatgaaatag taatatattt 240 acctcttgtt tttatggttt tcttttctac tttggggagg agaaagacca tcttgagaca 300 tggtctttca ctctgcagcc cagcctcaac tggccttaac tcctgaccgc cctgcttcta 360 ccttcaaaag caccaggata taggtttgtg ccaccgtggc tggctgctcc cccttcactt 420 gcccaaaagt ggtgtagcat ctgtactcca gtctctcgtc ttcaagtgga aaagtccatt 480 ctcgtgaggt ggcagtcgta tttattttta cttctattca caaacaccaa agtaggaaaa 540 ggtgcaaaga ttaagaatat tttagttcac acaaggatta gccactctcc ccatgaatat 600 aatagtgttc agtgcaactt cccttataag aaccaggaag ggcctgttgg ccttgaaggt 660 caccctattg gggttcagtg accggccagt aatcacgaca gaagtactcg ctgctgcttc 720 actgccttcc tcatttacct caagaaatgc tttgtggaat gcgtcggaga catagaggtc 780 gtccctgcct ccagcaacga tccctgggag ttgggacttt tcagggctga agagatcaat 840 gaggcccatg tcttgcagct gctccttcag actgaagcca tcctcggtgc ggaagcgggg 900 catgtggacc acaagcatag tctctgacag ctcatccagc cactcctgca gcagctctgg 960 ggtgagctcc tgctccacct tggccaggct cttctcaggc ttgggcagga tgagcaccat 1020 ggtgatgtca tcccccttga agggcagctc tagcacctgg gtgccctctg ccacgcgccg 1080 gtatttgaat ttgccttcct ggtacatcat aggcactggg catgactgcc catcgacctt 1140 atagaacggt tccttccttg tgttctcagg gctgaacttt gacttccaca ggcccttgaa 1200 gtaaatggtg ttaaccagaa ccagggcagt gagctcgtta atggcgccct gtgggatgac 1260 atctttgatg cggccttcag tcttattagc tacccagttg ttgatggtca ctctggattg 1320 ctccggattc tccttgaagt ccaggggctg gagcttggct ccatagacaa cctcactaac 1380 atcttgatag ctctcgttga aggtgaggga tttgtctcca aaaaggcggt tggctgatac 1440 caagtcagag gacttgttgg cttttcgata gagtcggcag ttcagtttgg caaagaagaa 1500 gtggatctgg tcggatgtct tctcggagat ggtatcaaat ttaaaaacct ccatcagctg 1560 cttgagagtg tcgttacagg cacccagctt ggtcatagca aaagcagtgg agatgctcaa 1620 gggtgacagg aaaatgttgt cgttgtcatt cttggagtct gccaggtgct ggtagaagtt 1680 agtggcaaat cgcgaattgg ccttggacag ttcccagacc cgccggttgg tggcttctgg 1740 aaccttctgc tctgagccat cctcctcggt ggccttcttc ccaggggagc ggtaaatgca 1800 caagggattc acggggatgt ctcggggctt cgctatgcag atgtcgtcca cagggtttcc 1860 gtgacagata gcacagccca aggcaccgat gaggagcaga gagaggagac aaagcttcct 1920 ctcaccagca gccccacttc ctgccccagg ggaatacatg gccgatgctc ctacagagat 1980 ggtgctgact gagacgatca ctccgaaaac tggttctttc ccctaaatct gagaggtcca 2040 gaggccaggt gggggaggga gctctcccct taaagtcttc aggtagatat gtcttctgat 2100 tatgtcttat atctcaccac ttcactaaaa tgtctcagat acaaatcaga tctatttcta 2160 aaattaccta t 2171
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<213> Rattus norvegicus
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tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttgaggt ggcagtcata tttattttta 60 cttccattaa caaacaccga gataggaaaa ggtgcaaaga ttaagaatat tttagttcac 120 acaaggatta gacactctcc ccatgaatat aatagtgttc agtgcgactt cccttataag 180 aaccaggaag ggcctgttgg ccttgaaggt caccctactg gggttcagtg accggccagt 240 aatcacgaca gaagtactcg ctgctgcttc actgccttcc tcatttacct caagaaacgc 300 tttgtggaat gcatcggaga caaagaggtc gtccctgcct tcagcaatga tccctgggag 360 ttgggacttc tcagggctga agagatcaac aaggcccatg tcttgcagct gctccttcag 420 actgaagctg tcctcgatgc ggaagcgggg cacgtggacc acaagcatga cctccgacag 480 ctcatccagc cactcctgca gcagctccgg ggtgagttcc tgctccacct tagccaggct 540 cttctcaggc ttgggcagga tgagcaccat ggtgatgtcg tcccccttga agggcatctc 600 tagcacctgg gtaccctctc ccacacgcct gtatttgaat ttgccttcct ggtacatcat 660 gggcaccagg catgactgcc catcaacttt gtggaatggt tccttccttg tgttctcagg 720 gctgaacttt gacttccaca ggcccttgaa gtaaatggtg ttaaccagca ccagggcagt 780 gagctcatca atggctcctt gggggatgac gtctttgatg cggccttcag tcttattagc 840 tacccagttg ttgatggtca ctctggattg ctccggattc tccttgaagt ccaggggctg 900 aagcttggct ccatagacaa tctcactaac gtcttgatag ctctcattga aggtaaggga 960 tttgtctcca aaaaggcggt tggctgacac caagttagag gacttgttgg cttttcgata 1020 gagtcggcag ttcagtttgg caaagaagaa gtggatctgg tcggatgtct tctcggagat 1080 ggtatcaaat ttaaaaacct ccatcagctg cttgagggtg ttattacaag cacccagctt 1140 ggtcatagca aacgccgtgg agatgctcaa gggtgacagg aaaatgttgt cgttgtcgtt 1200 cttggagtct gccaggtgct gatagaagtt agtggcaaat cgagaattgg ccttggacag 1260 ttcccagacc cgccggttgg tggcttccgg aaccttctgc tctaggacat cctcctccgt 1320 ggccttcttc gcaggggagc ggtaaatgca catggggttc acggggatgt ctcggggctt 1380 cgctatgcag atgtcgtcca cagggtttcc atgacagaca gcacagccca aggcaccaat 1440 gagtagcaga gagaggagac aaagcttcct ctctccagca accgcacttc ctattcccgg 1500 ggaatacatg gtggacgctt ctgcagagaa gccgtggaga cagtgctgag caatccctcc 1560 g 1561
<210> 9
<211> 16
<212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<221> fuente
<223> /nota= "Descripción de Desconocido:
Péptido RFGF"
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> Desconocido
<220>
<221> fuente
<223> /nota= "Descripción de Desconocido:
Péptido análogo de RFGF"
<400> 10
Ala Ala Leu Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 11
<211> 13
<212> PRT
<213> Virus de inmunodeficiencia humana
<210> 12
<211> 16
<212> PRT
<213> Drosophila sp.
<400> 12
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
<210> 13
<211> 21
<212> ARN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<223> /nota= "Descripción de la secuencia artificial: Sintético oligonucleótido"
<400> 13
gguuaacacc auuuacuuca a
<210> 14
<211> 23
<212> ARN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<223> /nota= "Descripción de la secuencia artificial: Sintético oligonucleótido"
<400> 14
uugaaguaaa ugguguuaac cag
<210> 15
<211> 23
<212> ARN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<223> /nota= "Descripción de la secuencia artificial: Sintético oligonucleótido"
<400> 15
uugaaguaaa ugguguuaac cag
<210> 16
<211> 21
<212> ARN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<223> /nota= "Descripción de la secuencia artificial: Sintético oligonucleótido"
<400> 16
gguuaacacc auuuacuuca a

Claims (28)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un agente de ARNi bicatenario para su uso en la prevención de al menos un síntoma en, o en el tratamiento de, un sujeto humano que tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1, en donde el agente de ARNi bicatenario se debe administrar al sujeto como una dosis fija de aproximadamente 40 mg a aproximadamente 90 mg, en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, comprendiendo la cadena antisentido una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena sentido y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados, y en donde la cadena sentido está conjugada a un ligando unido en el extremo 3'.
  2. 2. El agente de ARNi bicatenario para uso de la reivindicación 1, en donde la dosis fija del agente de ARNi bicatenario se debe administrar al sujeto una vez al mes, una vez cada seis semanas, una vez cada 2 meses, o trimestralmente.
  3. 3. El agente de ARNi bicatenario para uso de la reivindicación 1 o 2, en donde el agente de ARNi bicatenario se debe administrar al sujeto como una dosis fija de aproximadamente 50 mg o aproximadamente 80 mg.
  4. 4. El agente de ARNi bicatenario para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en donde el agente de ARNi bicatenario se debe administrar al sujeto por vía subcutánea.
  5. 5. El agente de ARNi bicatenario para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la administración del agente de ARNi bicatenario al sujeto (i) reduce la actividad de Serpincl en el sujeto aproximadamente 70% a aproximadamente 95%; y/o (ii) aumenta los niveles máximos de trombina en el sujeto hasta el rango de los niveles máximos de trombina en un sujeto que no tiene un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1; y/o (iii) es suficiente para alcanzar niveles máximos de generación de trombina en el sujeto aproximadamente al mismo nivel alcanzado mediante la administración al sujeto de Factor VIII; y/o (iv) es suficiente para alcanzar niveles máximos de generación de trombina superiores a aproximadamente 40% de equivalencia con la administración de Factor VIII en el sujeto; y/o (v) disminuye la tasa de sangrado anual (ABR) del sujeto en aproximadamente un 80 a aproximadamente un 95% en comparación con la ABR histórica mediana a demanda de sujetos que tienen un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1 y a los que no se les administra el agente de ARNi bicatenario.
  6. 6. El agente de ARNi bicatenario para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el trastorno es un trastorno hemorrágico.
  7. 7. El agente de ARNi bicatenario para uso de la reivindicación 6 , en donde el trastorno hemorrágico es: (i) un trastorno hemorrágico adquirido o un trastorno hemorrágico hereditario; o (ii) una hemofilia.
  8. 8. El agente de ARNi bicatenario para uso de la reivindicación 7(ii), en donde la hemofilia es hemofilia A o hemofilia B; la hemofilia es hemofilia A y el sujeto es un sujeto inhibidor; o la hemofilia es hemofilia B y el sujeto es un sujeto inhibidor.
  9. 9. El agente de ARNi bicatenario para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -8 , en donde todos los nucleótidos de la cadena sentido y todos los nucleótidos de la cadena antisentido son nucleótidos modificados.
  10. 10. El agente de ARNi bicatenario para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde los nucleótidos modificados se seleccionan independientemente del grupo que consiste en un nucleótido modificado con 2 '-desoxi-2 '-fluoro, un nucleótido modificado con 2 '-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado con 2'-amino, un nucleótido modificado con 2'-alquilo, un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, un nucleótido modificado con 2 '-fluoro, un nucleótido morfolino, un fosforamidato, un nucleótido que comprende un grupo fosforotioato, un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo o un grupo bisdecilamida del ácido dodecanoico, y un nucleótido que comprende una base no natural.
  11. 11. El agente de ARNi bicatenario para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde la región de complementariedad tiene: (i) al menos 17 nucleótidos de longitud; y/o (ii) entre 19 y 21 nucleótidos de longitud.
  12. 12. El agente de ARNi bicatenario para uso de la reivindicación 11 (ii), en donde la región de complementariedad tiene una longitud de 21 nucleótidos.
  13. 13. El agente de ARNi bicatenario para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde cada cadena no tiene más de 30 nucleótidos de longitud.
  14. 14. El agente de ARNi bicatenario para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que al menos una cadena comprende un saliente 3' de al menos 1 nucleótido.
  15. 15. El agente de ARNi bicatenario para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde al menos una cadena comprende un saliente 3' de al menos 2 nucleótidos.
  16. 16. El agente de ARNi bicatenario para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -15, en donde el ligando es un derivado de N-acetilgalactosamina (GalNAc).
  17. 17. El agente de ARNi bicatenario para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde el ligando es
  18. 18. El agente de ARNi bicatenario para uso de la reivindicación 17, en donde el agente de ARNi bicatenario está conjugado en el extremo 3' de la cadena sentido al ligando como se muestra en el siguiente esquema.
    y en donde X es O o S; preferiblemente en donde el X es O.
  19. 19. El agente de ARNi bicatenario para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'-GGUUAACACCAUUUACUUCAA -3' (SEQ ID NO: 16), y una cadena antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15).
  20. 20. El agente de ARNi bicatenario para uso de la reivindicación 19, en donde la cadena sentido comprende la secuencia 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3' (SEQ ID NO:13) y la cadena antisentido comprende la secuencia 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3' (SEQ ID NO:14), donde a, c, g y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G y U; Af, Cf, Gf y Uf son 2'-fluoro A, C, G y U; y s es un enlace fosforotioato.
  21. 21. El agente de ARNi bicatenario para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -20, en el que la cadena sentido comprende la secuencia 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3' (SEQ ID NO: 13) y la cadena antisentido comprende la secuencia 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3' (SEQ ID NO: 14), donde a, c, g y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G y U; Af, Cf, Gf y Uf son 2'-fluoro A, C, G y U; y s es un enlace fosforotioato; y donde la cadena sentido está conjugada en el extremo 3' al ligando como se muestra en el siguiente esquema
    , donde X es O o S.
  22. 22. El agente de ARNi bicatenario para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-21, en donde el agente de ARNi bicatenario se debe administrar al sujeto como una composición farmacéutica.
  23. 23. El agente de ARNi bicatenario para uso de la reivindicación 22, en el que el agente de ARNi bicatenario se va a administrar al sujeto: (i) en una solución no amortiguada, en donde preferiblemente la solución no amortiguada es solución salina o agua; o (ii) en una solución amortiguada.
  24. 24. El agente de ARNi bicatenario para uso de la reivindicación 23(ii), en el que la solución amortiguada comprende acetato, citrato, prolamina, carbonato o fosfato o cualquier combinación de los mismos.
  25. 25. El agente de ARNi bicatenario para uso de la reivindicación 24, en el que la solución amortiguada es solución salina amortiguada con fosfato.
  26. 26. Un kit para su uso en la prevención de al menos un síntoma o en el tratamiento de un sujeto que padece un trastorno que se beneficiaría de una reducción en la expresión de Serpinc1, que comprende a) el agente de ARNi bicatenario de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, en donde el agente de ARNi bicatenario se debe administrar al sujeto en una dosis fija de aproximadamente 40 mg a aproximadamente 90 mg, y b) instrucciones de uso, y c) opcionalmente, medios para administrar el agente de ARNi bicatenario al sujeto.
  27. 27. El agente de ARNi bicatenario para uso según la reivindicación 1, en el que el trastorno es una hemofilia, en el que el agente de ARNi bicatenario se debe administrar al sujeto en una dosis fija de 80 mg una vez al mes, y en el que la secuencia de la cadena sentido es 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3' (SEQ ID NO:13) y la secuencia de la cadena antisentido es 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3' (SEQ ID NO:14), donde a, c, g y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G y U; Af, Cf, Gf y Uf son 2'-fluoro A, C, G y U; y s es un enlace fosforotioato; y donde la cadena sentido está conjugada en el extremo 3' al ligando como se muestra en el siguiente esquema
    , donde X es O.
  28. 28. El kit para uso de la reivindicación 26, en donde el trastorno es una hemofilia, en donde el agente de ARNi bicatenario se debe administrar al sujeto por vía subcutánea en una dosis fija de 80 mg una vez al mes, y en donde la cadena sentido consiste en 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3' (SEQ ID NO:13) y la cadena antisentido consiste en 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3' (SEQ ID NO:14), donde a, c, g y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, C, G y U; Af, Cf, Gf y Uf son 2'-fluoro A, C, G y U; y s es un enlace fosforotioato; y donde la cadena sentido está conjugada en el extremo 3' al ligando como se muestra en el siguiente esquema
    , donde X es O.
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