ES3050936T3 - Prrsv minor protein-containing recombinant viral vectors and methods of making and use thereof - Google Patents

Prrsv minor protein-containing recombinant viral vectors and methods of making and use thereof

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ES3050936T3 ES20213950T ES20213950T ES3050936T3 ES 3050936 T3 ES3050936 T3 ES 3050936T3 ES 20213950 T ES20213950 T ES 20213950T ES 20213950 T ES20213950 T ES 20213950T ES 3050936 T3 ES3050936 T3 ES 3050936T3
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Abstract

La presente invención abarca vacunas o composiciones recombinantes contra el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV). En particular, la invención abarca vectores de adenovirus recombinantes que codifican y expresan antígenos, proteínas, epítopos o inmunógenos gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 y/o E del PRRSV. Dichas vacunas o composiciones pueden utilizarse para proteger a los animales del PRRSV. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0003] Vectores víricos recombinantes que contienen proteínas menores de prrsv y métodos de elaboración y uso de los mismos
[0005] REFERENCIA A SOLICITUDES RELACIONADAS
[0007] Esta solicitud reivindica prioridad a la solicitud provisional USSN 62/183.410, presentada el 23 de junio de 2015, y que se incorpora en el presente documento a modo de referencia en su totalidad.
[0009] INCORPORACIÓN POR REFERENCIA
[0011] Cualquiera de las solicitudes precedentes y todos los documentos citados en ellas o durante su tramitación ("documentos citados de la solicitud") y todos los documentos citados o a los que se hace referencia en los documentos citados en la solicitud, y todos los
[0012] documentos citados o a los que se hace referencia en el presente documento
[0013] ("documentos citados en el presente documento"), y todos los documentos citados o a los que se hace referencia en los documentos citados en el presente documento, junto con cualquier instrucción de los fabricantes, descripciones, especificaciones de producto y hojas de producto para
[0015] cualquiera de los productos mencionados en el presente documento o en
[0016] cualquier documento incorporado a modo de referencia en el presente documento, se incorporan al presente documento a modo de referencia, y pueden emplearse en la práctica de la invención. El citado o identificación de cualquier documento mencionado en esta solicitud no es una
[0018] admisión de que el mencionado documento está disponible como materia previa a la presente invención y no refleja de ninguna manera la validez, patentabilidad y/o aplicabilidad de los mencionados documentos de patente citados. Todas las secuencias a las que se hace referencia en el presente documento mediante los números de registro de GenBank se incorporan al presente documento a modo de referencia en su totalidad, y las mencionadas secuencias son tal como se describen en GenBank al día de presentación de la presente solicitud.
[0020] DECLARACIÓN RESPECTO AL LISTADO DE SECUENCIAS
[0022] El listado de secuencias asociado con esta solicitud se proporciona en formato de texto en lugar de una copia en papel, y se incorpora a modo de referencia a la memoria descriptiva. El nombre del archivo de texto que contiene el Listado de Secuencias es MER_15_265_ST25. El archivo de texto tiene 279 KB; se creó el 13 de junio de 2016; y se está presentando electrónicamente mediante EFS-Web, junto con la presentación de la memoria descriptiva.
[0024] CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0026] La presente invención se refiere a vacunas de PRRSV con vectores adenovíricos recombinantes, a composiciones y al uso de las mismas en un método para provocar una respuesta inmunitaria protectora en un animal contra el PRRSV.
[0028] SUMARIO DE LA INVENCIÓN
[0030] El PRRSV es una infección vírica devastadora en cerdos con una importancia económica enorme (Derald J. Holtkamp, 2013). Existe una gran variabilidad en las características antigénicas de los diferentes aislados y las medidas
[0032] eficaces para prevenir infecciones son limitadas. Hay dos grupos principales
[0034] de vacunas disponibles para PRRS, que son vacunas con virus vivos modificados atenuados (MLV) o con virus inactivados. Las vacunas MLV, a pesar de ser eficaces en una provocación homóloga, fallan en proporcionar una protección más amplia entre las diferentes variantes y tienen el potencial de revertir a tipo silvestre lo que da lugar a una infección fulminante. Además, los animales vacunados con vacunas MLV continúan propagando el virus y las granjas que usan estas vacunas no pueden estar libres de PRRSV. Por otra parte, las vacunas a virus inactivados son mucho más seguras, pero menos eficaces que las vacunas MLV. Por lo tanto, las opciones actuales disponibles para prevenir la infección no son seguras ni eficaces (Charemtantanakul, 2012) (Tjeerd G. Kimman, 2009). Se ha hecho un esfuerzo concertado para desarrollar vacunas recombinantes que pueden abordar las principales desventajas de las vacunas actuales durante gran parte de las últimas 2 décadas (Zhang, 2012). Sin embargo, a pesar del extenso esfuerzo, no hay una vacuna recombinante simple en el mercado con licencia para la prevención de la infección por PRRSV. La mayoría de las vacunas recombinantes que se evaluaron en el pasado estaban basadas en una o una combinación de proteínas de la envoltura vírica que se creen dianas de la respuesta de anticuerpos neutralizantes. Sin embargo, la falta de comprensión completa de la interacción funcional entre las proteínas de la envoltura o con el receptor en las células diana dificultaron el diseño racional de vacunas recombinantes eficaces.
[0036] Las proteínas de la envoltura vírica de PRRSV generalmente se clasifican
[0038] en proteínas mayores y menores en base a la abundancia de proteínas en el virión (Dokland, 2010) (Dea S, 2000). Las proteínas mayores de la envoltura vírica son gp5 (ORF 5) y M (ORF 6) y forman un dímero. Las proteínas menores de la envoltura son gp2 (ORF2), gp3 (ORF3), gp4 (ORF4) y E (ORF2b) y probablemente una proteína vírica recientemente identificada gp5a (ORF 5a). Se cree que las proteínas menores de la envoltura existen como multímeros y están implicadas en la interacción directa con el receptor, CD163, y median la entrada vírica (Phani B. Das, 2010).
[0040] La mayoría de los intentos previos por desarrollar las vacunas recombinantes se han enfocado en las proteínas mayores, gp5, M o una combinación (Dea, 1998). Esto es probablemente debido al hecho que los anticuerpos dirigidos contra las proteínas mayores se detectan fácilmente en animales infectados por PRRSV y se asume que podrían presentar dianas neutralizantes del sistema inmunitario. Además, hay un grado amplio de variabilidad de secuencia en gp5 indicando que estas proteínas están bajo presión de selección inmunitaria. Sin embargo, la supresión de anticuerpos específicos contra gp5 de suero neutralizante indicó que estos anticuerpos pertenecen en gran medida a la fracción no neutralizante del suero (Juan Li, 2012). Por lo tanto, estos han apuntado a la presencia de la diana neutralizante principal en las proteínas de la envoltura vírica diferentes de las proteínas mayores y probablemente en proteínas menores. A pesar de los grandes esfuerzos por desarrollar las proteínas mayores como antígenos en vacunas recombinantes, que van desde proteínas
[0042] recombinantes purificadas hasta vacunas administradas usando una variedad de plataformas de vectores (Jazmina L. G. Cruza, 2010), ninguna ha logrado llegar al mercado debido a la falta de poder asegurar una protección sólida. Recientemente, el foco en desarrollar vacunas de PRRS recombinantes se ha desplazado a las proteínas menores (Jing-Qiang Ren, 2014) (Sakthivel Subramaniam, 2014) (Z. S. WANG, 2011). Este cambio ha sido impulsado principalmente por tres hallazgos recientes. Primero, se ha mostrado que dos de las proteínas menores, gp2 y gp4, se unen directamente al receptor CD163. Segundo, un cambio de las proteínas menores, pero no de proteínas mayores, con EAV (virus de arteritis equina), también un arterivirus, alteró el tropismo del virus, lo que indica la importancia de las proteínas menores en la interacción con el receptor y el direccionamiento del virus a las células diana (Lu Z1, 2012) (Tian D, 2012). Finalmente, los mutantes desactivados de CD163, el cual es el principal receptor de las proteínas menores, previno la infección por el virus, mientras que la desactivación similar de CD169, receptor de las proteínas mayores, no afectó la entrada del virus (Randall S. Prather, 2013). A pesar del conocimiento en aumento sobre el rol de las proteínas menores en la entrada del virus y como diana relevante para la respuesta de anticuerpos neutralizantes, ninguna de las vacunas recombinantes desarrolladas hasta el momento en base a las proteínas menores dio como resultado la protección del animal vacunado para la infección por PRRS.
[0044] En el presente documento, los inventores presentan la inclusión de otra proteína menor
[0046] E a esta combinación de proteínas menores que da lugar a una respuesta protectora considerablemente diferente. Sorprendentemente, la presencia de la proteína E junto con gp2, gp3 y gp4 indujo una respuesta inmunitaria sólida y redujo la lesión pulmonar provocada por el PRRs . Esta es la primera vez que se ha mostrado a la proteína E como un componente fundamental del complejo de proteínas que puede inducir una respuesta inmunitaria protectora. Esto se obtuvo no solo por identificación de la proteína E como el componente esencial del complejo proteínico menor, sino que también por expresión de las cuatro proteínas a partir de una plataforma de vector simple que promovió la formación del complejo de proteínas. Este nuevo hallazgo no solo será útil para el entendimiento adicional de las interacciones fundamentales entre las proteínas víricas y el receptor celular, sino que también prepara el camino para obtener una vacuna de PRRS recombinante universal que esté libre realmente de PRRSV vivo.
[0048] En las manos de los inventores, la vacunación de animales con plásmidos agrupados que expresan gp2, gp3 y gp4 no tuvo éxito para generar una respuesta inmunitaria sólida (observación no publicada). La conclusión de este ensayo en animales fue que se presume que estas proteínas existen como multímeros y, por lo tanto, la expresión de las proteínas simultáneamente en una célula única para promover la multimerización se requiere para formar la correcta conformación que presenta un epítopo neutralizante para el sistema inmunitario. Los ensayos bioquímicos
[0050] posteriores también indicaron esto y todas las proteínas se colocaron en un
[0052] vector individual para permitir la expresión simultánea. Sorprendentemente, en el ensayo en animales informado en el presente documento, los inventores también encontraron que esto no es suficiente para inducir la respuesta inmunitaria protectora. En su lugar, el factor fundamental para la inducción de una respuesta inmunitaria protectora por estos antígenos fue la modificación introducida para redirigir las proteínas de los compartimientos intracelulares a la superficie de las células. Dicha diferencia drástica entre las proteínas modificadas y no modificadas fue completamente inesperada y abrirá nuevos caminos para enfocar provocaciones similares con una variedad de dianas víricas. Esta también es la primera vez, de acuerdo al conocimiento de los inventores; que la inmunogenicidad de las proteínas menores de la envoltura del PRRSV se potenció hasta un grado en el que puede obtenerse protección de la lesión pulmonar provocada por PRRS, así como un nivel reducido en la viremia en suero por expresión simultánea de todas las proteínas menores de un vector único e introducción de modificaciones que potenciaron la expresión en la superficie celular.
[0053] J. Huet al.,2013, Transboundary And Emerging Diseases, 61(2), páginas 109 a 20, analiza el estado actual del desarrollo de la vacuna contra el PRRSV y analiza estrategias para desarrollar una vacuna universal contra el PRRSV.
[0054] REFERENCIAS
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[0079] La presente divulgación proporciona composiciones para vacunas de PRRSV novedosas de acuerdo con la invención y uso de las mismas de acuerdo con la invención.
[0080] La presente invención proporciona una composición inmunitaria o vacunal segura y eficaz que comprende:
[0081] a. uno o más vectores víricos recombinantes, que comprenden uno o más polinucleótidos heterólogos, que codifican (i) el polipéptido o ectodominio gp2 del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV); (ii) el polipéptido o ectodominio gp3 del PRRSV; y (iii) el polipéptido o ectodominio gp4 del PRRSV; y
[0082] b. un transportador farmacéutica o veterinariamente aceptable;
[0083] en donde el uno o más vectores comprenden un vector de adenovirus 5 de PRRSV (Ad5-PRRSV) recombinante, un vector de baculovirus de PRRSV recombinante, un vector de citomegalovirus porcino de PRRSV recombinante o un vector de poxvirus de PRRSV recombinante;
[0084] además, en donde el uno o más vectores comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido o ectodominio gp2 de PRRSV redirigido, un polipéptido o ectodominio gp3 de PRRSV redirigido y un polipéptido o ectodominio gp4 de PRRSV redirigido, en los que una secuencia de localización celular existente del polipéptido o ectodominio gp2 de PRRSV de tipo silvestre, el polipéptido o ectodominio gp3 de PRRSV de tipo silvestre y el polipéptido o ectodominio gp4 de PRRSV de tipo silvestre correspondiente se ha reemplazado por una secuencia determinante de expresión de la superficie celular de un gen heterólogo.
[0085] La presente invención también proporciona un vector de adenovirus 5 de PRRSV (Ad5-PRRSV) recombinante, un vector de baculovirus de PRRSV recombinante, un vector de citomegalovirus porcino de PRRSV recombinante o un vector de poxvirus de PRRSV recombinante; en donde el vector comprende una o más secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido o ectodominio gp2 de PRRSV redirigido, un polipéptido o ectodominio gp3 de PRRSV redirigido y un polipéptido o ectodominio gp4 de PRRSV redirigido, en el que una secuencia de localización celular existente del polipéptido o ectodominio gp2 de PRRSV de tipo silvestre, el polipéptido o ectodominio gp3 de PRRSV de tipo silvestre o el polipéptido o ectodominio gp4 de PRRSV de tipo silvestre correspondiente se ha reemplazado por una secuencia determinante de expresión de la superficie celular de un gen heterólogo.
[0086] La presente invención también proporciona la composición de acuerdo con la invención o el vector Ad5-PRRSV recombinante de acuerdo con la invención para su uso en un método para provocar una respuesta inmunitaria protectora en un animal contra el PRRSV, que comprende administrar al animal la composición o vector Ad5-PRRSV recombinante y un transportador, adyuvante, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable.
[0087] En el presente documento, se describe el hallazgo sorprendente e inesperado de que la inclusión de otra proteína menor (E) de PRRSV a otras combinaciones de proteínas menores produjo una respuesta protectora considerablemente diferente. En algunas formas de realización, pueden usarse porciones suficientes de la proteína E, por ejemplo, su dominio transmembrana (TM), aminoterminal (NT) o su dominio carboxiterminal (CT), para generar la mencionada respuesta protectora.
[0088] Sorprendentemente, la presencia de la proteína E junto con gp2, gp3 y gp4 indujo una respuesta inmunitaria sólida y redujo la lesión de pulmón provocada por PRRS. Esta es la primera vez que se ha mostrado a la proteína E como un componente fundamental del complejo de proteínas que puede inducir una respuesta inmunitaria protectora. De esta manera, las vacunas descritas en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, no se obtuvieron meramente por identificación de la proteína E como el componente esencial del complejo de proteínas menores, sino también, por expresión de las cuatro proteínas de una plataforma de vector único que promovió la formación del complejo de proteínas.
[0090] La divulgación proporciona vectores víricos recombinantes que expresan versiones quiméricas de los polipéptidos o ectodominios gp2, gp3 y gp4 del PRRSV de acuerdo con la invención, que contienen diferentes determinantes de localización celular, en comparación con sus genes de tipo silvestre correspondientes. En particular, se ha agregado una porción de glucoproteína (G) de VSV y proteína activadora del plasminógeno tisular (tPA) para generar los productos de genes quiméricos resultantes para localizarlos en la superficie celular. Estos vectores recombinantes generan respuestas inmunitarias seguras y eficaces en el animal hospedador contra PRRSV. De esta manera, las modificaciones introducidas a las proteínas menores de PRRSV para obtener la expresión en superficie produjo un efecto similar como lo hizo la coexpresión de laproteina E junto con gp2, gp3 y gp4.
[0092] En consecuencia, esta divulgación proporciona de esta manera una vía para obtener una vacuna de PRRS recombinante universal que esté 100 % libre de PRRSV vivo.
[0094] La presente invención se refiere más particularmente a una vacuna o composición de PRRSV en vector adenovírico que comprende uno o más vectores adenovíricos recombinantes genomanipulados que portan y expresan polipéptidos o ectodominios gp2, gp3 y gp4 de PRRSV de acuerdo con la invención, y un transportador farmacéutica o veterinariamente aceptable, y, opcionalmente, un adyuvante, excipiente o vehículo. El PRRSV puede ser cualquier cepa, ya que las composiciones novedosas e inventivas divulgadas en el presente documento se aplican universalmente para todas las cepas conocidas y aún por ser descubiertas de PRRSV, por todas las razones descritas con mayor detalle más adelante.
[0096] El PRRSV incluye proteínas menores de PRRSV (por ejemplo, gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 y E) e incluye proteínas mayores de PRRSV adicionales (por ejemplo, gp5 y M). Similar a las otras proteínas menores, gp5a está relativamente bien conservada, y los solicitantes consideran que es una adición eficaz para los vectores víricos recombinantes seguros y eficaces de la presente divulgación.
[0098] Los vectores recombinantes de PRRSV pueden contener y expresar en un hospedador animal (en cualquier orden y dirigidos por cualquier elemento promotor, PE, que incluye el indicado, y que incluye elementos como IRES y péptidos 2A) genes o componentes(rtg= redirigido): 1) (PE)rtg gp2, (PE)rfg gp3 y(PE)rtggp4; 2) (PE)rtg gp2, (PE)rtg gp3, (PE)rtg gp4 y (PE)E; 3) (PE)rtg gp2,(PE)rtggp3, (PE)rtg gp4 y (PE)rtg E;
[0100] vectores recombinantes de PRRSV descritos en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, pueden contener y expresar en un hospedador animal por lo menos las siguientes combinaciones (en cualquier
[0102] orden, y dirigido por cualquier elemento promotor, PE, que incluye el indicado, y que incluye elementos tales como IRES y péptido de genes o componentes(rtg= redirigido; CMV = promotor de citomegalovirus; SV40 = promotor del virus de simio 40; IRES = sitio de entrada ribosomal interno, péptidos 2A autoescindibles derivados de la enfermedad del virus de pie y boca (FMD), virus de rinitis A equina, virusThosea asignao teschovirus-1 porcino): 1) (PE)gp2, (PE)gp3, (PE)gp4, (PE)E; 2)(PE)rtggp2, (PE)gp3 y (PE)gp4; 3)(PE)rtggp2, (PE)rtg gp4 y(PE)rtgE; 4) (PE)rtg gp2 y(PE)rtggp4; 5) (M-(SV40)-(CMV)-gp5-(IRES)-gp5a; 6) gp2-(SV40)-(CMV)-E; 7)rtggp2- (SV40)-(CMV)-E; 8)rtggp2-(SV40)-(CMV)-rtg E; 9) (CMV)-E; 10) E-(p2A)- gp2-(SV40)-(CMV)-gp4; 11)rtgE-(p2A)-rtggp2-(SV40)-(CMV)-rtggp4; 12) (PE)gp2-(PE)gp4-(PE)E; 13) (PE)gp2-(PE)E; 14) (PE)gp2; 15) (PE)gp2- (PE)gp3; 16) (PE)gp2-(PE)gp4; 17) (PE)gp2-(PE)gp5a; 18) (PE)E; 19) (PE)E- (PE)gp3; 20) (PE)E-(PE)gp4; 21) (PE)E-(PE)gp5a. Un vector descrito en el presente documento, pero que no forma parte de la invención reivindicada, puede contener y expresar como mínimo (PE)gp2, (PE)gp4 y (PE)E, en la versión de tipo silvestre o "rtg" de los mismos. Un vector descrito en el presente documento, pero que no forma parte de la invención reivindicada, también puede comprender ventajosamente gp2 más cualquier otro gen que codifica para un polipéptido de PRRSV.
[0104] El redireccionamiento puede lograrse por reemplazo de los dominios transmembrana (TM) y de cola citoplasmática (CT) de las proteínas gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 existentes con, respectivamente, los dominios TM y CT de VSV. Las proteínas gp5 y M también pueden ser sometidas al procedimiento de redireccionamiento. Las secuencias de proteínas nativas de PRRSV también pueden ser reemplazadas o alternativamente por la secuencia señal de tPA y uno o ambos TM y CT de VSV (o aquellos mismos elementos de otro polipéptido expresado en superficie adecuado). Como alternativa, el redireccionamiento puede lograrse por reemplazo de los dominios CT de las proteínas gp2, gp3, gp4, gp5a, E, gp5 o M existentes por los dominios CT de VSV (es decir, sin cambio de los dominios TM existentes). El redireccionamiento de E también puede lograrse por reemplazo de sus señales de localización celular por aquella de una proteína de membrana de tipo II, o por VSV-G o combinaciones de las mismas, o los dominios<t>M/CT de otras glucoproteínas de superficie.
[0106] Los solicitantes además consideran muchas maneras alternativas de presentar los antígenos de PRRSV al sistema inmunitario del animal hospedador. Por ejemplo, los antígenos pueden ser presentados en la superficie de partículas similares a virus (VLP). Las versiones solubles de los antígenos podrían administrarse al animal hospedador, en donde la oligomerización (incluyendo trimerización) de las proteínas entre sí, o adicionalmente, con componentes de VSV-G, u otras proteínas víricas o cualquier oligomerización (incluyendo motivos de trimerización) (por ejemplo, motivos de GCN4 bacteriano, y similares). Adicionalmente, se contempla que los dominios TM/CT de las glucoproteínas de tipo I de superficie vírica cumplen el mismo propósito que los correspondientes dominios de VSV-G y, por lo tanto, se
[0107] pueden intercambiar con ellos.
[0108] La persona con experiencia reconocerá muchas maneras alternativas y funcionalmente equivalentes para lograr sustancialmente la misma presentación de proteínas menores de PRRSV, que incluye E, gp2, gp3, gp4, gp5a, proteínas mayores, incluyendo gp5 y M, o combinaciones de proteínas menores y/o mayores, al sistema inmunitario de los animales hospedadores.
[0109] En el presente documento se describe, pero no forma parte de la invención reivindicada, un método para vacunar un animal que comprende la administración al animal de una cantidad eficaz de una o más vacunas o composiciones que pueden comprender una cantidad eficaz de una vacuna de PRRSV con vector adenovírico y, opcionalmente, un transportador, adyuvante, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable. La administración puede ser subcutánea, intranasal, intramuscular, transdérmica, intradérmica, mucosa, incluyendo oral, o cualquier otra administración.
[0110] La invención además se refiere a la administración de la vacuna o composición que usa el protocolo de primovacunación y refuerzo. En el presente documento se describe, pero no forma parte de la invención reivindicada, un kit para llevar a cabo un método para provocar o inducir una respuesta inmunitaria que puede comprender una cualquiera de las composiciones o vacunas inmunitarias de Ad5 recombinante, o composiciones o vacunas inmunitarias inactivadas, e instrucciones para llevar a cabo el método.
[0111] DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS
[0112] En la Figura 1 se presentan mapas de insertos usados para producir cuatro vectores víricos recombinantes diferentes que expresan proteínas menores de la envoltura vírica del virus del síndrome reproductor y respiratorio porcino (PRRSV). El vAD3042 expresa gp2, gp3 y gp4 de PRRSV sin E con optimización de codones (A); el vAD3038 expresa, rtg-gp2,rtg-gp3yrtg-gp4
[0113] redireccionadas ("rtg") sin E con optimización de codones (B); el vAD3041
[0114] expresa gp2, gp3, gp4 con E con optimización de codones (C); el VAD3067 expresa rtg-gp2, rtg-gp3, rtg-gp4 con E con optimización de codones (D); el vAD3046 expresa hemaglutinina del virus influenza porcino (SIV-HA) con optimización de codones (E); el vAD3069 expresa Nucleoproteína (Np o N), M, gp5 y gp5a con optimización de codones (F); y VAD3064 expresa, rtg-M, rtg-gp5 y rtg-gp5a con optimización de codones (G);
[0115] La Figura 2 es un esquema que muestra las disposiciones de las proteínas "mayores" y "menores" de PRRSV en la superficie de una membrana vírica;
[0116] La Figura 3 es un esquema que muestra la disposición e interacciones de las proteínas "menores" de PRRSV, tal como indica la evidencia actual y descrita que se entiende que estas proteínas interaccionan con los receptores de la superficie de la célula hospedadora (por ejemplo, CD163);
[0117] La Figura 4 es una imagen de un gel que muestra el amplicón de la PCR de la región de la proteína menor de PRRSV insertado en el pasaje 3 de VAD3041 (A) y pasaje 3 de VAD3042 (B);
[0118] En la Figura 5A se presenta el esquema usado para redirigir las proteínas de la envoltura de PRRSV a la superficie celular;
[0119] En las Figuras 5B-5D se presentan mapas de las proteínas rtg-gp2, rtg-gp3 y rtg-gp4, en donde los dominios TM y CT endógenos se han reemplazado por los dominios transmembrana (TM) y de la cola citoplasmática (CT) del virus de estomatitis vesicular-G (VSV-G), se ha reemplazado la secuencia señal, se han agregado marcadores de epítopo y se han insertado secuencias
[0120] enlazadoras;
[0121] En la Figura 6 se presentan imágenes de ensayos de inmunofluorescencia (IFA) de células HEK 293T fijadas que han sido transfectadas con proteínasrtg-gp2, rtg-gp3y rtg-gp4 marcadas con epítopos; En la Figura 7 se muestra una transferencia Western (WB,del inglés Western Blot)con anti-VSVG de lisados coinmunoprecipitados (co-IP) de células HEK 293T transfectadas con plásmidos que codifican cada una de las proteínas de envoltura redireccionadas individuales;
[0122] En la Figura 8 se muestran diferentes WB de los lisados co-IP de las células HEK 293T transfectadas con plásmidos que codifican cada una de las
[0123] proteínas de envoltura redireccionadas individuales o CD16 de porcino. IP: a- VSV, Wb: a-VSV-HRP (A); IP: a-VSV, Wb: a-CD163 (B); IP: a-CD163, Wb: a-CD163-Biotina (C);
[0124] En las Figuras 9A a 9C se presentan imágenes de ensayos de inmunofluorescencia duales (IFA) de células HEK 293 infectadas con
[0125] vAD3038 (que contiene rfg-gp234 con optimización de codones); y teñidas
[0126] simultáneamente con dos anticuerpos específicos por las proteínas indicadas y diferentes marcadores de fluoróforos. Las imágenes se tomaron de campos ópticos idénticos usando filtros específicos para cada fluoróforo. Las imágenes correspondientes se muestran con una flecha;
[0127] La Figura 10 es un gráfico que detalla muestras recolectadas y el tiempo de recolección a lo largo del estudio;
[0128] La Figura 11 es un gráfico que muestra la distribución de las puntuaciones de la lesión de pulmón entre los diferentes grupos. El vAD3042 (Ad5 que
[0129] expresa, gp2 de tipo silvestre, gp3 de tipo silvestre y gp4 de tipo silvestre con optimización de codones); vAD3041 (Ad5 que expresa, gp2 de tipo silvestre, gp3 de tipo silvestre, gp4 de tipo silvestre y E de tipo silvestre con optimización de codones); VAD3038 (Ad5 que expresa, rtg-gp2, rtg-gp3 y rtg-gp4 con optimización de codones); y VAD3033 (Ad5 que expresa un gen de hemaglutinina (HA) con optimización de codones del virus influenza porcino (SIV), control negativo). La mediana (barra transversal) y media (+) y las cajas representan el intervalo entre el intervalo del 1er y 3er intercuartil. Los círculos grises indican las puntuaciones de pulmón reales de cada animal individual en cada grupo; La Figura 12 enumera y describe las secuencias presentes en el listado de secuencias; La Figura 13 es un alineamiento en ClustalW de las secuencias polipeptídicas de gp2 como se indica en las SEQ ID NO: 34-39;
[0130] La Figura 14 es un alineamiento en ClustalW de las secuencias
[0131] polipeptídicas de gp3 como se indica en las SEQ ID NO: 40-45;
[0132] La Figura 15 es un alineamiento en ClustalW de las secuencias
[0133] polipeptídicas de gp4 como se indica en las SEQ ID NO: 46-51;
[0134] La Figura 16 es un alineamiento en ClustalW de las secuencias
[0135] polipeptídicas de E como se indica en las SEQ ID NO: 52-58;
[0136] La Figura 17 es un alineamiento en ClustalW de las secuencias
[0137] polipeptídicas de gp5a como se indica en las SEQ ID NO: 62-65;
[0138] La Figura 18 es un gráfico que muestra la puntuación de la lesión de pulmón
[0139] para cerdos administrados con vAd3038 (Gp234-Rtrg vacuna inactivada) o vAd3046 (SIV-HA); La Figura 19 es un gráfico que muestra la carga vírica en suero en cerdos administrados con vAd3038 (Gp234-Rtrg vacuna inactivada) o vAd3046 (SIV- HA);
[0140] En la Figura 20 se comparan las respuestas inmunitarias de los grupos 1,2, 4 y 5, antes y después de la provocación. Las transferencias Western se ensayaron con anti-V5 para visualizar los niveles de proteína E (arriba a la izquierda); anti-Flag para detectar gp3 (derecha); y anti-HA para visualizar los niveles de proteína gp4 (abajo a la izquierda);
[0141] La Figura 21 es un gráfico que muestra la puntuación de la lesión de pulmón en cerdos administrados con vAD3067 (i.m./i.m.) seguido por vacuna inactivada, VAD3067 (i.n./i.m.) seguido por vacuna inactivada; vAD3067+vAD3064 (i.n./i.m.) seguido por vacuna inactivada; o VAD3046 seguido por placebo. Todas las vacunas inactivadas se administraron i.m. una vez;
[0142] La Figura 22 es un gráfico de la carga vírica sérica en cerdos administrados con vAD3067 (i.m./i.m.) seguido por vacuna inactivada, VAD3067 (i.n./i.m.) seguido por vacuna inactivada; vAD3067+vAD3064 (i.n./i.m.) seguido por vacuna inactivada; o VAD3046 y placebo. Todas las vacunas inactivadas se administraron i.m. una vez;
[0143] En la Figura 23 se muestran los resultados del estudio de inmunoprecipitación diseñada para interrogar la posible interacción entre E y gp4 redirigida (sin interacción observada). En la construcción, el marcador Flag
[0144] está unido a gp3; el marcador V5 está unido a E; el marcador HA está unido a gp4; y, el marcador Myc está unido a gp2. WB (transferencia Western), IP (inmunoprecipitación), S (gps soluble) y V (gps VSV-marcado);
[0145] En la Figura 24 se muestran los resultados del estudio de IP diseñado para investigar la posible interacción entre E y gp3 redirigido (sin interacción observada).
[0146] DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0147] Se hace notar que en esta divulgación y particularmente en las reivindicaciones y/o párrafos, los términos tales como "comprende", "comprendido", "que comprende" y similares pueden tener el significado que tiene atribuido en la ley de Patentes de los EE. UU.; por ejemplo, pueden referirse a "incluye", "incluido", "que incluye", y similares; y que los términos tales como "que consiste esencialmente en" y "consiste esencialmente en" tienen el significado atribuido a ellos en la ley de Patentes de los EE. UU., por ejemplo, ellos permiten elementos no indicados explícitamente, pero excluyen elementos que se encuentran en la técnica anterior o que afectan una característica básica o novedosa de la invención.
[0148] A menos que se explique de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido para una persona con experiencia ordinaria en la materia a la cual pertenece la divulgación. Los términos singulares "uno/a", "un" y "el/la" incluyen las referencias en plural a menos que el contexto lo indique
[0149] claramente de otra manera. Similarmente, la palabra "o" tiene como intención
[0150] incluir "y" a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera.
[0151] El término "“aproximadamente", como se usa en el presente documento, se refiere a aproximadamente, en la región de, a grandes rasgos o alrededor de. Cuando el término "aproximadamente" se usa junto con un intervalo numérico, modifica el intervalos por extender los límites por debajo y por encima de los valores numéricos indicados. En general, el término "aproximadamente" se usa en el presente documento para modificar un valor numérico por debajo y por encima del valor indicado con una varianza del 10 %. En un aspecto, el término "aproximadamente" se refiere a más o menos el 20 % del valor numérico del
[0152] número con el cual se está usando. Por lo tanto, aproximadamente un 50 % se refiere al intervalo entre el 45 % y el 55 %. Los intervalos numéricos indicados en el presente documento por puntos extremos incluyen todos los números y fracciones abarcados dentro del intervalo (por ejemplo, entre 1 y 5 incluye 1,1,5, 2, 2,75, 3, 3,90, 4 y 5). También se debe entender que todos los números y fracciones de los mismos se presumen que están modificados por el término "aproximadamente".
[0153] En la presente invención, el adenovirus 5 (Ad5), u otro vector adecuado que sea baculovirus, citomegalovirus porcino o poxvirus, se usa para administrar y expresarin vivoen un hospedador animal polipéptidos o ectodominios gp2, gp3 y gp4 de PRRSV de acuerdo con la invención, para provocar en el animal una respuesta inmunitaria segura y eficaz contra una provocación experimental o natural con PRRSV virulento.
[0154] Si bien se usó Ad5 para administrar las proteínas de PRRSV en la presente divulgación, podría usarse cualquier vector adecuado de acuerdo con la invención. Por ejemplo,
[0155] baculovirus, poxvirus, que incluyen poxvirus de ave y virus de la viruela del canario pueden usarse. En otra forma de realización, puede usarse como vector el citomegalovirus porcino (PCMV), que es un herpesvirus encontrado en los tejidos a lo largo del cuerpo que incluyen la nariz de cerdos recién nacidos en donde provoca inflamación (rinitis).
[0156] La presente invención, por lo tanto, se refiere a una vacuna o composición inmunitaria que comprende una cantidad eficaz de uno o más vectores Ad5 genomanipulados, u otros vectores adecuados de acuerdo con la invención, y
[0157] un transportador farmacéutica o veterinariamente aceptable, y, opcionalmente, un adyuvante, excipiente o vehículo.
[0158] En consecuencia, la presente invención abarca un vector Ad5 genomanipulado, u otro vector adecuado de acuerdo con la invención, que expresa polipéptidos o ectodominios gp2, gp3 y gp4 de PRRSV de acuerdo con la invención, que provocan una
[0159] respuesta inmunitaria en un animal.
[0160] Como se usa en el presente documento, la expresión "polipéptido menor, antígeno, epítopo o inmunógeno de PRRSV" se refiere a cualquier polipéptido menor, antígeno, epítopo o inmunógeno de un virus del síndrome reproductor y respiratorio porcino. Actualmente, los polipéptidos menores o componentes de los mismos incluyen las proteínas gp2, gp3, gp4, gp5a y E, pero puede haber
[0161] otras proteínas asociadas con las proteínas menores actualmente conocidas. En general, y como se usa en el presente documento, el término "ectodominio" se refiere al dominio o dominios de una proteina de membrana que se extiende hacia el espacio extracelular. De esta manera, cualquier referencia a identidad porcentual con el ectodominio de una proteina dada no tiene como intención incluir una comparación con no ectodominios, incluyendo dominios transmembrana (TMD) y dominios citoplasmáticos (CTD), de la mencionada proteina.
[0162] Por "animal" se comprende mamíferos, seres humanos, aves y similares. El animal puede seleccionarse del grupo que consiste en equino (por ejemplo, caballo), canino (por ejemplo, perros, lobos, zorros, coyotes, chacales), felino (por ejemplo, leones, tigres, gatos domésticos, gatos silvestres, otros gatos grandes, y otros felinos que incluyen guepardo y lince), ovino (por ejemplo, oveja), bovino (por ejemplo, ganado, vaca, búfalo), porcino (cerdo), aviar (por ejemplo, gallina, pato, ganso, pavo, codorniz, faisán, cotorra, pinzón, halcón, cuervo, avestruz, emú y casuario), primate (por ejemplo, prosimio, tarsero, mono, gibón, simio) y peces. El término "animal" también incluye un animal individual en todos sus estadios de desarrollo, incluyendo estadio embrionario y fetal.
[0163] En la presente invención, la protección inmunitaria de los animales porcinos contra el virus del síndrome reproductor y respiratorio porcino es de
[0164] importancia primordial. Sin embargo, los conceptos divulgados en el presente documento se aplicarán igualmente bien a otros virus donde, como aquí, la expresión relativamente baja o limitada de proteínas de superficie clave "que median la entrada a la célula" hace que el desarrollo de vacunas especialmente difícil. En consecuencia, como se divulga en el presente documento, el redireccionamiento y/o soporte de transporte de dichas "proteínas menores de la envoltura" a una superficie celular tiene aplicaciones de alcance amplio a todos los virus con envoltura.
[0165] En una forma de realización, la composición o vacuna de Ad5 inmunitaria comprende uno o más vectores Ad5 genomanipulados de acuerdo con la invención, y transportador farmacéutica y veterinariamente aceptable, y, opcionalmente, un excipiente, adyuvante o vehículo. El vector Ad5 genomanipulado puede comprender un polinucleótido que codifica polipéptidos o ectodominios gp2, gp3 y gp4 de PRRSV de acuerdo con la invención.
[0166] Como se usa en el presente documento, el término "antígeno" o "inmunógeno" se refiere a una sustancia que induce una respuesta inmunitaria específica en un animal hospedador. El antígeno puede comprender un organismo entero, inactivado, atenuado o vivo; una subunidad o porción de un organismo; un vector recombinante que contiene un inserto que expresa un epítopo, polipéptido, péptido, proteína o fragmento del mismo con propiedades inmunitarias; una pieza o fragmento de ácido nucleico con capacidad de inducir una respuesta inmunitaria con la presentación a un animal hospedador; una proteína, un polipéptido, un péptido, un epítopo, un hapteno o cualquier combinación de los mismos. Como alternativa, el inmunógeno o antígeno puede comprender una toxina o antitoxina.
[0167] El término "proteína o péptido inmunogénico", como se usa en el presente documento, también incluye péptidos y polipéptidos que son inmunológicamente activos en el sentido que una vez administrados al hospedador, tiene la capacidad de provocar una respuesta inmunitaria del tipo humoral y/o celular dirigida contra la proteína. Preferiblemente, el fragmento de la proteína es tal que sustancialmente tiene la misma actividad inmunitaria que la proteína
[0168] completa, nativa intacta. Por lo tanto, un fragmento proteico comprende o consiste esencialmente en o consiste en por lo menos un epítopo o determinante antigénico. El término epítopo, también conocido como determinante antigénico, es la parte de una macromolécula reconocida por el sistema inmunitario y con capacidad de inducir una
[0169] reacción inmunitaria del tipo humoral (linfocitos B) y/o del tipo celular (linfocitos T).
[0170] El término “proteína o péptido inmunogénico" además contempla eliminaciones, adiciones y sustituciones de la secuencia, tal que el polipéptido funciona para producir una respuesta inmunitaria como se define en el presente documento. En este sentido, las sustituciones particularmente preferidas serán generalmente de naturaleza conservadora, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar en una familia de aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos generalmente se dividen en cuatro familias: (1)
[0171] ácidos-aspartato y glutamato; (2) básicos-lisina, arginina, histidina; (3) no polares-alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; y (4) polares no cargados-glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina y tirosina. La fenilalanina, triptofano y tirosina algunas veces
[0172] son clasificados como aminoácidos aromáticos. Razonablemente es predecible que un reemplazo aislado de leucina por isoleucina o valina, o viceversa; un aspartato por un glutamato o viceversa; una treonina por una serina o viceversa; o un reemplazo conservador similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado, no tendrá un efecto mayor
[0174] sobre la actividad biológica. Las proteínas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la molécula de referencia, pero que poseen sustituciones de aminoácidos menores que no afectan sustancialmente la inmunogenicidad de la proteína, están, por lo tanto, dentro de la definición del polipéptido de referencia.
[0176] El término "epítopo" se refiere a la parte de una parte de una macromolécula reconocida por el sistema inmunitario y con capacidad de inducir una reacción inmunitaria del tipo humoral (linfocitos B) y/o tipo celular (linfocitos T). El término también se usa como sinónimo con "determinante antigénico" o "sitio determinante antigénico". Los anticuerpos que reconocen el mismo
[0178] epítopo pueden identificarse en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión a otro de otro anticuerpo a un antígeno diana.
[0180] Una "respuesta inmunitaria" a una composición o vacuna es el desarrollo
[0182] en el hospedador de una respuesta inmunitaria mediada por células y/o anticuerpo a una composición o vacuna de interés. Con frecuencia, una “respuesta inmunitaria" incluye, pero sin limitación, uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos, linfocitos B, linfocitos T colaboradores y/o linfocitos T citotóxicos específicamente dirigidos a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de Interés. Preferiblemente, el hospedador presentará una respuesta terapéutica o protectora tal que la resistencia a una nueva infección estará potenciada y/o la severidad clínica de la enfermedad estará reducida. Dicha protección se demostrará por una reducción o falta de síntomas presentados normalmente por un hospedador infectado, un tiempo de recuperación más corto y/o un título vírico disminuido en el hospedador infectado.
[0184] El término proteína o polipéptido “inmunogénico" como se usa en el presente documento también se refiere a una secuencia de aminoácidos que provoca una respuesta inmunitaria como se describe precedentemente. Una proteína o polipéptido "inmunogénico", como se usa en el presente documento, incluye la secuencia de longitud completa de la proteína, análogos de la misma, o fragmentos inmunogénicos de la misma. Por "fragmento inmunogénico" se entiende un fragmento de una proteína que incluye uno o más epítopos y, por lo tanto, provoca la respuesta inmunitaria descrita precedentemente. Dichos fragmentos pueden identificarse usando cualquier número de técnicas de mapeo de epítopos bien conocidas en la materia. Véase, por ejemplo, Epitope
[0186] Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morns,
[0188] Ed., 1996).
[0190] Por ejemplo, pueden determinarse epítopos lineales, por ejemplo, por síntesis concurrente de grandes números de péptidos en soportes sólidos, en donde los péptidos corresponden a porciones de la molécula proteica, y por reacción de los péptidos con anticuerpos cuando los péptidos están aún unidos a los soportes. Dichas técnicas son conocidas en la materia y se describen en, por ejemplo, la Patente de los EE. UU. N.° 4.708.871; Geysenet al.,1984; Geysenet al.,1986. Similarmente, los epítopos conformacionales se pueden identificar fácilmente por determinación de la conformación espacial de aminoácidos, tal como, por ejemplo, cristalografía por rayos x y por resonancia magnética nuclear en 2 dimensiones. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, mencionado anteriormente.
[0192] Los antígenos sintéticos también se incluyen en la definición, por ejemplo, poliepítopos, epítopos flanqueantes, y otros antígenos recombinantes o derivados sintéticamente. Los fragmentos inmunogénicos, con los propósitos de la presente invención, usualmente incluyen por lo menos aproximadamente 3 aminoácidos, aproximadamente 5 aminoácidos, aproximadamente entre 10 y 15, aproximadamente entre 15 y 25 aminoácidos o más aminoácidos, de la molécula. No hay límite superior crítico para la longitud del fragmento, que podría comprender casi la longitud completa de la secuencia de la proteína, o incluso una proteína de fusión que comprende por lo menos un epítopo de la proteína.
[0194] En consecuencia, una estructura mínima de un polinucleótido que expresa
[0196] un epítopo es la que comprende o consiste esencialmente en o consiste en nucleótidos que codifican para un epítopo o determinante antigénico de la proteina o polipéptido de PRRSV. Un polinucleótido que codifica un fragmento de la proteina o polipéptido total comprende o consiste esencialmente de o consiste de un mínimo de 15 nucleótidos, de manera ventajosa aproximadamente entre 30 y 45 nucleótidos, y preferiblemente aproximadamente entre 45 y 75, por lo menos 57, 87 o 150 nucleótidos consecutivos o contiguos de la secuencia que codifica la proteina o polipéptido total. Los procedimientos de determinación de epítopos, tal como, generar bibliotecas peptídicas de superposición (Hemmeret al.,1998), Pepscan (Geysenet al.,1984; Geysenet al.,1985; Van der Zee R.et al.,1989; Geysen, 1990; Multipin.RTM. Peptide Synthesis Kits of Chiron) y algoritmos (De Grootet al.,1999), pueden usarse en la práctica de la invención, sin experimentación indebida.
[0198] Un "polinudeótido" es una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud que contiene desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y análogos en cualquier combinación. Los polinucleótidos pueden tener una estructura tridimensional, y pueden realizar cualquier función, conocida o desconocida. El término "polinucleótido" incluye moléculas de hélice de doble, simple y triple hebra. A menos que se especifique o se requiera de otra manera, cualquier forma de realización de la invención descrita en el presente documento que sea un polinucleótido abarca tanto la forma de hebra doble como cada una de las dos formas complementarias conocidas o previstas para hacer la forma de hebra
[0199] doble de la molécula de ADN, ARN o híbrida.
[0201] El término "optimización de codones" se refiere al proceso de configurar de manera óptima la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína, polipéptido, antígeno, epítopo, dominio o fragmento para su expresión/traducción en un hospedador seleccionado. En general, los niveles de expresión del gen dependen de muchos factores, tales como secuencias promotores y elementos regulatorios. Uno de los factores más importantes es la adaptación del uso de codones del gen transcripto al uso típico de codones del hospedador (Lithwich, G. and Margalit, H., Genome Res. 13, 26652673, 2003). Por lo tanto, los genes muy expresados en genomas procariotas bajo selección traduccional tienen un sesgo en el uso de codones pronunciado. Esto es porque ellos usan un pequeño subconjunto de codones que son reconocidos por la especie de ARNt más abundante (Ikemura, T., J. Mol. Biol. 151, 389-409,1981). La fuerza que modula esta adaptación de codones es llamada selección traduccional y su fuerza es importante en las bacterias de crecimiento rápido (Rocha, E.P., Genome Res. 14, 2279-2286, 2004; Sharp, P.M.et al.,Nucleic Acids Res. 33, 1141-1153). Si un gen contiene codones que son usados muy pocas veces por el hospedador, su nivel de expresión no será máximo. Esta puede ser una de las limitaciones de la expresión de proteínas heterólogas (Gustafsson, C.et al.,Trends Biotechnol. 22, 346­ 353, 2004) y del desarrollo de vacunas de ADN (Ivory, C. and Chadee, K., Genet. Vaccines Ther. 2, 17, 2004). Se han rediseñado un gran número de genes
[0203] sintéticos para aumentar su nivel de expresión. La base de datos de genes
[0205] sintéticos (SGDB) (Wu, G.et al.,Nucleic Acias Res. 35, D76-D79, 2007) contiene información de más de 200 experimentos no publicados sobre genes sintéticos. En el proceso de diseño de una secuencia de ácido nucleico que se insertará en un nuevo hospedador para expresar una proteína determinada en cantidades óptimas, la optimización en el uso de codones generalmente es uno de los pasos (Gustafsson, C., Trends Biotechnol. 22, 346­ 353, 2004). La optimización en el uso de codones básicamente involucra la alteración de los codones que se usan poco en el gen diana de manera que reflejen mejor el uso de codones del hospedador sin modificar la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada (Gustafsson, C., Trends Biotechnol. 22, 346-353, 2004). La información generalmente usada para el proceso de optimización por lo tanto es la secuencia de ADN o de la proteína a ser optimizada y una tabla de uso de codones (conjunto de referencias) del hospedador.
[0207] Existen diversos servidores públicos en internet y aplicaciones independientes que permiten algún tipo de optimización de codones por cualquier persona con experiencia en la materia."GeneDesign"(Richardson, S. M.et al.,Genome Res. 16, 550-556, 2006),"Synthetic Gene Designer"(Wu, G.et al.,Protein Expr. Purif. 47, 441-445, 2006) y"Gene Designer"(Villalobos, A.et al.,BMC Bioinformatics 7, 285, 2006) son paquetes que proporcionan una plataforma para el diseño de genes sintéticos, que incluyen un paso de optimización de codones. Respecto a los métodos para la optimización en el uso de codones disponible en cada servidor o programa,
[0209] los primeros programas desarrollados usaron solo la estrategia de "un aminoácido-un codón". Los programas y servidores más recientes ahora incluyen otros métodos para crear alguna variabilidad en el uso de codones. Esta variabilidad refleja la variabilidad en el uso de codones de genes muy expresados de manera natural y permite que se introduzcan criterios adicionales (tal como evitar sitios de restricción) en el proceso de optimización. La mayoría de las aplicaciones y servidores de internet descritos en el presente documento proporcionan tres métodos de optimización de codones: una optimización completa de todos los codones, una optimización basada en las frecuencias de uso de codones relativas del conjunto de referencias que usa una estrategia de Monte Carlo y una estrategia novedosa diseñada para maximizar la optimización con cambios mínimos entre las secuencias de búsqueda y optimizadas.
[0211] En una forma de realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica los polipéptidos o ectodominios gp2, gp3 y gp4 de PRRSV de acuerdo con la invención tiene optimización de codones para la expresión en un animal. En otra forma de realización, las secuencias con optimización de codones codifican polipéptidos o ectodominios gp2, gp3 y gp4 de PRRSV porcino de acuerdo con la invención para la expresión en animales. Las secuencias con optimización de codones, descritas en el presente documento, también pueden codificar las proteínas gp5a, gp5 o E de PRRSV, antígenos, péptidos, polipéptidos, fragmentos, dominios o epítopos para la
[0212] expresión en animales.
[0214] Los siguientes ejemplos de polinucleótidos son no limitantes: un gen o fragmento de gen, exones, intrones, ARNm, ARNt, ARNr, ARNpi, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tal como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos, uracilo, otros azúcares y grupos conectores, tales como fluororibosa y tiolato, y ramificaciones de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos puede ser modificada después de la polimerización, tal como por conjugación, con un componente demarcado. Otros tipos de modificaciones incluidas en esta definición son la protección de extremos, sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural por un análogo y la introducción de medios para unir el polinucleótido a proteínas, iones metálicos, componentes demarcado, otros polinucleótidos o soportes sólidos. Los polinucleótidos pueden obtenerse por síntesis química o proceder de un microorganismo.
[0216] El término "gen" se usa ampliamente para referirse a cualquier segmento de polinucleótido asociado con una función biológica. Por lo tanto, los genes incluyen intrones y exones como en la secuencia genómica, o solo las secuencias codificantes como en los ADNc y/o las secuencias regulatorias requeridas para su expresión. Por ejemplo, el gen también se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa ARNm o ARN funcional, o codifica una proteína específica, y que incluye secuencias reguladoras.
[0218] La invención además comprende una hebra complementaria a un polinucleótido que codifica polipéptidos o ectodominios gp2, gp3 y gp4 de PRRSV de acuerdo con la invención. La hebra complementaria puede ser polimérica y de cualquier longitud, y puede contener desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y análogos en cualquier combinación de los mismos.
[0220] Los términos "proteina", "péptido", "polipéptido" y "fragmento polipeptídico" se usan como sinónimos en el presente documento para referirse a polímeros de restos de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados o análogos de aminoácidos, y puede estar interrumpido por fracciones químicas diferentes de aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que han sido modificados naturalmente o por intervención; por ejemplo, formación de enlace disulfuro, glucosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcado o bioactivo.
[0222] Un polinucleótido o polipéptido "aislado" es uno que está "sustancialmente libre" de los materiales con los cuales está asociado en su ambiente natural. Por "sustancialmente libre", se entiende que el polinucleótido o polipéptido está por lo menos un 50 %, por lo menos un 70 %, por lo menos un 80 %, por lo menos un 90 %, o por lo menos un 95 % libre de estos materiales. Si el polinucleótido o polipéptido “aislado" se diseña como que es "casi completamente libre de contaminantes", se entiende que el polinucleótido o polipéptido aislado está
[0224] por lo menos un 98 % libre de estos materiales.
[0226] La invención además abarca polinucleótidos que codifican variantes funcionalmente equivalentes y derivados de acuerdo con la invención de los polipéptidos y ectodominios de PRRSV de acuerdo con la invención y fragmentos funcionalmente equivalentes de los mismos que pueden potenciar, disminuir o no afectar significativamente las propiedades inherentes de los polipéptidos codificados consecuentemente. Estas variantes funcionalmente equivalentes, derivados y fragmentos presentan la capacidad de conservar la actividad. Por ejemplo, cambios en una secuencia de ADN que no cambia la secuencia de aminoácidos codificados, así como aquellos que resultan en sustituciones conservadoras de restos de aminoácidos, una o unas pocas eliminaciones o adiciones de aminoácidos, y sustitución de restos de aminoácidos por análogos de aminoácidos son aquellos que no afectarán significativamente las propiedades del polipéptido codificado. Las variantes descritas en el presente documento pueden tener por lo menos un 50 %, por lo menos un 55 %, por lo menos un 60 %, por lo menos un 65 %, por lo menos un 70 %, por lo menos un 75 %, por lo menos un 80 %, por lo menos un 85 %, por lo menos un 86 %, por lo menos un 87 %, por lo menos un 88 %, por lo menos un 89 %, por lo menos un 90 %, por lo menos un 91 %, por lo menos un 92 %, por lo menos un 93 %, por lo menos un 94 %, por lo menos un 95 %, por lo menos un 96 %, por lo menos un 97 %, por lo menos un 98 % o por lo menos un 99 % de homología o identidad con el polinucleótido o polipéptido de PRRSV de interés.
[0228] La presente invención se refiere a polipéptidos o ectodominios gp2, gp3 y gp4 de PRRSV de acuerdo con la invención. Los polipéptidos descritos en el presente documento pueden tener una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 14, 16,18, 20, 31, 3439, 40-45, 46-51, 52-58, 59-61, 62-66, 68, 71, 73, 75, 77 o 79-139, o variantes o fragmentos de la misma.
[0230] Los polipéptidos descritos en el presente documento pueden tener por lo menos un 70 %, por lo menos un 75 %, por lo menos un 80 %, por lo menos un 85 %, por lo menos un 90 %, por lo menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 o E de PRRSV, particularmente con el polipéptido que tiene una secuencia como se indica en la SEQ iD NO: 1, 3, 5, 7, 14, 16,18, 20, 31, 34-39, 40-45, 46-51, 52 58, 59-61, 62-66, 68, 71,73, 75, 77 o 79-139.
[0231] Los fragmentos y variantes descritos en el presente documento de los polipéptidos gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 o E de PRRSV identificados precedentemente (SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 14, 16, 18, 20, 31, 34-39, 40-45, 46-51, 52-58, 59-61, 62-66, 68, 71, 73, 75,11o 79-139) pueden ser preparados fácilmente por una persona con experiencia en la materia usando técnicas de biología molecular bien conocidas. Las variantes descritas en el presente documento son polipéptidos homólogos que tienen una secuencia de aminoácidos por lo menos con aproximadamente un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 14, 16, 18, 20, 31, 34-39, 40-45, 46-51, 52-58, 59-61, 62­
[0232] 66, 68, 71,73, 75, 77 o 79-139.
[0233] Un fragmento inmunogénico descrito en el presente documento de un polipéptido gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 o E de PRRSV incluye por lo menos 8, 10, 15, o 20 aminoácidos consecutivos, por lo menos 21 aminoácidos, por lo menos 23 aminoácidos, por lo menos 25 aminoácidos o por lo menos 30 aminoácidos del polipéptido gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 o E de PRr Sv que tiene una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 14, 16, 18, 20, 31, 34-39, 40-45, 46-51, 52-58, 59-61, 62-66, 68, 71, 73, 75, 77 o 79-139, o variantes de los mismos. Un fragmento del polipéptido gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 o E de PRRSV descrito en el presente documento puede incluir un epítopo antigénico específico encontrado en un polipéptido gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 o E de PRRSV de longitud completa.
[0234] Un polinucleótido descrito en el presente documento puede codificar un polipéptido gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 o E de PRRSV, tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 14, 16,18, 20, 31, 34-39, 40-45, 46-51, 52-58, 59-61,62-66, 68, 71, 73, 75, 77 o 79-139. Un polinucleótido descrito en el presente documento puede codificar un polipéptido que tiene por lo menos un 70 %, por lo menos un 75 %, por lo menos un 80 %, por lo menos un 85 %, por lo menos un 90 %, por lo menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 14,16,18, 20, 31, 34-39, 40-45, 46-51, 52-58, 59-61, 62-66, 68, 71, 73, 75, 77 o 79-139, o una variante conservadora, una variante alélica, un homólogo o un fragmento inmunogénico que comprende por lo menos ocho o por lo menos diez
[0235] aminoácidos consecutivos de uno de estos polipéptidos, o una combinación de estos polipéptidos. El polinucleótido que codifica el polipéptido gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 o E de PRRSV puede tener optimización de codones para la expresión en una especie de animal específico.
[0236] Un polinucleótido descrito en el presente documento puede tener una secuencia nucleotídica como se indica en la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 21-24, 30, 67, 69, 70, 72, 74, 76 o 78, o una variante de la misma. Un polinucleótido descrito en el presente documento puede tener por lo menos un 70 %, por lo menos un 75 %, por lo menos un 80 %, por lo menos un 85 %, por lo menos un 90 %, por lo menos un 95 %, por lo menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 21-24, 30, 67, 69, 70, 72, 74, 76 o 78, o una variante de la misma.
[0237] El polipéptido E de PRRSV se describe en el presente documento. Un polipéptido descrito en el presente documento puede tener una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 7, 20, 52-58 o 130-139, y variante o fragmento de la misma.
[0238] Un polipéptido descrito en el presente documento puede tener por lo menos un 70 %, por lo menos un 75 %, por lo menos un 80 %, por lo menos un 85 %, por lo menos un 90 %, por lo menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido E de PRRSV, particularmente con los polipéptidos que tienen una secuencia como se indica en la SEQ ID
[0239] NO: 7, 20, 52-58 o 130-139.
[0240] Los fragmentos y variantes de los polipéptidos E de PRRSV descritos en el presente documento identificados precedentemente (SEQ ID NO: 7, 20, 52-58 o 130-139) pueden ser preparados fácilmente por una persona con experiencia en la materia usando técnicas de biología molecular bien conocidas.
[0241] Las variantes descritas en el presente documento son polipéptidos homólogos que tienen una secuencia de aminoácidos por lo menos con aproximadamente un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 7, 20, 52-58 o 130-139.
[0242] Un fragmento inmunogénico de un polipéptido E de PRRSV descrito en el presente documento incluye por lo menos 8, 10, 15 o 20 aminoácidos consecutivos, por lo menos 21 aminoácidos, por lo menos 23 aminoácidos, por lo menos 25 aminoácidos o por lo menos 30 aminoácidos del polipéptido E de PRRSV que tiene una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 7, 20, 52-58 o 130-139, o variantes de la misma. Un fragmento de un polipéptido E de PRRSV descrito en el presente documento puede incluir un epítopo antigénico específico encontrado en un polipéptido E de PRRSV de longitud completa.
[0243] Un polinucleótido descrito en el presente documento puede codificar un polipéptido E de PRRSV, tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 7, 20, 52-58 o 130-139. Un polinucleótido descrito en el presente documento puede codificar un polipéptido que tiene por lo menos un 70 %, por lo menos un 75 %, por lo menos un 80 %, por lo menos un 85 %, por lo menos un 90 %, por lo menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como se indica en la
[0244] SEQ ID NO: 7, 20, 52-58 o 130-139, o una variante conservadora, una variante alélica, un homólogo o un fragmento inmunogénico que comprende por lo menos ocho o por lo menos diez aminoácidos consecutivos de uno de estos polipéptidos, o una combinación de estos polipéptidos. El polinucleótido que codifica el polipéptido E de PRRSV puede tener
[0245] optimización de codones para la expresión en una especie de animal específico.
[0246] La presente invención se refiere al polipéptido o ectodominio gp2 de PRRSV de acuerdo con la invención. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia como se indica en
[0247] 15 la SEQ ID NO: 1,14, 34-39 o 80-89, y variante o fragmento de la misma.
[0248] En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido que tiene por lo menos un 70 %, por lo menos un 75 %, por lo menos un 80 %, por lo menos un 85 %, por lo menos un 90 %, por lo menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido o ectodominio gp2 de PRRSV de la invención, particularmente
[0249] 20 con los polipéptidos que tienen una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 1, 14, 34-39 u 80-89.
[0250] En el presente documento se describen fragmentos y variantes de los polipéptidos o ectodominios gp2 de PRRSV identificados precedentemente (SEQ ID NO:
[0251] 1, 14, 34-39 u 80-89) que pueden ser preparados fácilmente por una persona con experiencia en la materia usando técnicas de biología molecular bien conocidas.
[0252] Las variantes son polipéptidos homólogos que tienen una secuencia de aminoácidos por lo menos con aproximadamente un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 1,14, 34-39 u 80-89.
[0253] Un fragmento inmunogénico de un polipéptido gp2 de PRRSV descrito en el presente documento incluye por lo menos 8, 10, 15 o 20 aminoácidos consecutivos, por lo menos 21 aminoácidos, por lo menos 23 aminoácidos, por lo menos 25 aminoácidos o por lo menos 30 aminoácidos del polipéptido gp2 de PRRSV descrito en el presente documento que tiene una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 1, 14, 34-39 u 80-89, o variantes de la misma. Un fragmento de un polipéptido gp2 de PRRSV descrito en el presente documento puede incluir un epítopo antigénico específico
[0254] encontrado en un polipéptido gp2 de PRRSV de longitud completa.
[0255] La presente invención se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido o ectodominio gp2 de PRRSV de acuerdo con la invención, tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 1, 14, 34-39 u 80-89. En aún otro aspecto, la presente invención se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene por lo menos un 70 %, por lo menos un 75 %, por lo menos un 80 %, por lo menos un 85 %, por lo menos un 90 %, por lo menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia
[0256] con un polipéptido que tiene una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 1, 14, 34-39 u 80-89. Una variante conservadora, una variante alélica, un homólogo o un fragmento inmunogénico que comprende por lo menos ocho o por lo menos diez aminoácidos consecutivos de uno de estos polipéptidos, o una combinación de estos polipéptidos también se describe en el presente documento. El polinucleótido que codifica el polipéptido gp2 de PRRSV puede tener optimización de codones para la expresión en una especie de animal específico.
[0257] La presente invención se refiere al polipéptido o ectodominio gp3 de PRRSV de acuerdo con la invención. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 3,16 o 40-45, y variante o fragmento de la misma.
[0258] En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido que tiene por lo menos un 70 %, por lo menos un 75 %, por lo menos un 80 %, por lo menos un 85 %, por lo menos un 90 %, por lo menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido o ectodominio gp3 de PRRSV de la invención, particularmente con los polipéptidos que tienen una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 3, 16 o 40-45. En el presente documento se describen fragmentos y variantes de los polipéptidos o ectodominios gp3 de PRRSV identificados precedentemente (SEQ ID NO: 3, 16 o 40-45) que pueden ser preparados fácilmente por una persona con experiencia en la materia usando técnicas de biología molecular bien conocidas.
[0259] Las variantes son polipéptidos homólogos que tienen una secuencia de aminoácidos por lo menos con aproximadamente un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %,
[0260] 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 3,16 o 40-45.
[0261] Un fragmento inmunogénico de un polipéptido gp3 de PRRSV descrito en el presente documento incluye por lo menos 8, 10, 15 o 20 aminoácidos consecutivos, por lo menos 21 aminoácidos, por lo menos 23 aminoácidos, por lo menos 25 aminoácidos o por lo menos 30 aminoácidos del polipéptido gp3 de PRRSV descrito en el presente documento que tiene una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 3, 16 o 40-45, o variantes de la misma. Un fragmento de un polipéptido gp3 de PRRSV descrito en el presente documento puede incluir un epítopo antigénico específico encontrado en un polipéptido gp3 de PRRSV de longitud completa.
[0262] La presente invención se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido o ectodominio gp3 de PRRSV de acuerdo con la invención, tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 3, 16 o 40-45. En aún otro aspecto, la presente invención se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene por lo menos un 70 %, por lo menos un 75 %, por lo menos un 80 %, por lo menos un 85 %, por lo menos un 90 %, por lo menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 3, 16 o 40-45Una variante conservadora, una variante alélica, un homólogo o un fragmento inmunogénico que comprende por lo menos ocho o por lo menos diez aminoácidos consecutivos de uno de estos polipéptidos, o una
[0263] combinación de estos polipéptidos también se describen en el presente documento. El polinucleótido que codifica el polipéptido gp3 de P<r>R<s>V puede tener optimización de codones para la expresión en una especie de animal específico.
[0264] La presente invención se refiere al polipéptido o ectodominio gp4 de PRRSV de acuerdo con la invención. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 5, 18 o 46-51, y variante o fragmento de la misma.
[0265] En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido que tiene por lo menos un 70 %, por lo menos un 75 %, por lo menos un 80 %, por lo menos un 85 %, por lo menos un 90 %, por lo menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido o ectodominio gp4 de PRRSV de la invención, particularmente con los polipéptidos que tiene una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 5, 18 o 46-51. En el presente documento se describen fragmentos y variantes de los polipéptidos o ectodominios gp4 de PRRSV identificados precedentemente (SEQ ID NO: 5, 18 o 46-51) que pueden ser preparados fácilmente por una persona con experiencia en la materia usando técnicas de biología molecular bien conocidas.
[0266] Las variantes son polipéptidos homólogos que tienen una secuencia de aminoácidos por lo menos con aproximadamente un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 5, 18 o 46-51.
[0267] UN fragmento inmunogénico de un polipéptido gp4 de PRRSV descrito en el presente documento incluye por lo menos 8, 10, 15 o 20 aminoácidos consecutivos, por lo menos 21aminoácidos, por lo menos 23 aminoácidos, por lo menos 25 aminoácidos o por lo menos 30 aminoácidos del polipéptido gp4 de PRRSV descrito en el presente documento que tiene una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 5, 18 o 46-51, o variantes de la misma. Un fragmento de un polipéptido gp4 de PRRSV descrito en el presente documento incluye un epítopo antigénico específico encontrado en un polipéptido gp4 de PRRSV de longitud completa.
[0268] La presente invención se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido o ectodominio gp4 de PRRSV de acuerdo con la invención, tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 5, 18 o 46-51. En aún otro aspecto, la presente invención se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene por lo menos un 70 %, por lo menos un 75 %, por lo menos un 80 %, por lo menos un 85 %, por lo menos un 90 %, por lo menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 5, 18 o 46-51. Una variante conservadora, una variante alélica, un homólogo o un fragmento inmunogénico que comprende por lo menos ocho o por lo menos diez aminoácidos consecutivos de uno de estos polipéptidos, o una combinación de estos polipéptidos también se describe en el presente documento. El polinucleótido que codifica el polipéptido gp4 de PRRSV puede tener optimización de codones para la expresión en una especie de animal específico.
[0269] El polipéptido gp5a de PRRSV se describe en el presente documento. Un polipéptido descrito en el presente documento puede tener una secuencia como se indica en
[0270] la SEQ ID NO: 31 o 62-65, y variante o fragmento de la misma.
[0271] Un polipéptido descrito en el presente documento puede tener por lo menos un 70 %, por lo menos un 75 %, por lo menos un 80 %, por lo menos un 85 %, por lo menos un 90 %, por lo menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido gp5a de PRRSV, particularmente con los polipéptidos que tiene una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 31 o 62-65.
[0272] Los fragmentos y variantes de los polipéptidos gp5a de PRRSV descritos en el presente documento identificadosprecedentemente(SEQ ID NO: 31 o 62-65) pueden ser preparados fácilmente por una persona con experiencia en la materia usando técnicas de biología molecular bien conocidas.
[0273] Las variantes descritas en el presente documento son polipéptidos homólogos que tienen una secuencia de aminoácidos por lo menos con aproximadamente un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 31 o 62-65.
[0274] Un fragmento inmunogénico de un polipéptido gp5a de PRRSV descrito en el presente documento incluye por lo menos 8, 10, 15 o 20 aminoácidos consecutivos, por lo menos 21 aminoácidos, por lo menos 23 aminoácidos, por lo menos 25 aminoácidos o por lo menos 30 aminoácidos del polipéptido gp5a de PRRSV que tiene una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 31 o 62-65, o variantes de la misma. Un fragmento de un polipéptido gp5a
[0275] de PRRSV descrito en el presente documento puede incluir un epítopo antigénico especifico encontrado en un
[0276] polipéptido gp5a de PRRSV de longitud completa.
[0277] Un polinucleótido descrito en el presente documento puede codificar un polipéptido gp5a de PRRSV, tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 31 o 62-65. Un polinucleótido descrito en el presente documento puede codificar un polipéptido que tiene por lo menos un 70 %, por lo menos un 75 %, por lo menos un 80 %, por lo menos un 85 %, por lo menos un 90 %, por lo menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 31 o 62-65, o una variante conservadora, una variante alélica, un homólogo o un fragmento inmunogénico que comprende por lo menos ocho o por lo menos diez aminoácidos consecutivos de uno de estos polipéptidos, o una combinación de estos polipéptidos. El polinucleótido que codifica el polipéptido gp5a de PRRSV puede tener optimización de codones para la expresión en una especie de animal específico.
[0278] En el presente documento se describe un polinucleótido que tiene una secuencia nucleotídica como se indica en la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 21-24, 30, 67, 69, 70, 72, 74, 76 o 78, o una variante de la misma. En el presente documento se describe un polinucleótido que tiene por lo menos un 70 %, por lo menos un 75 %, por lo menos un 80 %, por lo menos un 85 %, por lo menos un 90 %, por lo menos un 95 %, por lo menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polinucleótido
[0279] que tiene una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11,
[0280] 12, 13, 15,17, 19, 21-24, 30, 67, 69, 70, 72, 74, 76 o 78, o una variante de la misma.
[0281] La invención proporciona una vacuna o composición inmunitaria segura y eficaz que comprende: uno o más vectores víricos recombinantes, que comprenden uno o más polinucleótidos heterólogos, que codifican un polipéptido o ectodominio gp2, gp3 y gp4de PRRSV de acuerdo con la invención; y un transportador farmacéutica o veterinariamente aceptable. "Variante del mismo" tiene como intención abarcar versiones equivalentes inmunológicamente de los polipéptidos y ectodominios, que incluyen, por ejemplo, variantes redirigidas de las proteínas como se divulga en el presente documento. "Equivalente inmunológicamente" se refiere a que la "variante del mismo" tiene la capacidad de provocar una respuesta inmunitaria sustancialmente similar en comparación con el polipéptido o ectodominio original comparado que incluye una respuesta inmunitaria protectora.
[0282] En la composición de acuerdo con la invención, el uno o más vectores comprenden un vector adenovirus 5 de PRRSV (Ad5-PRRSV) recombinante, un vector baculovirus de PRRSV recombinante, un vector citomegalovirus porcino de PRRSV recombinante o un vector poxvirus de PRRSV recombinante.
[0283] El uno o más vectores comprenden uno o más polinucleótidos heterólogos de acuerdo con la invención que codifican un polipéptido o ectodominio gp2, gp3 y gp4 de PRRSV, en donde una secuencia de localización celular existente de gp2, gp3 y gp4 se ha reemplazado por una secuencia determinante de expresión en la superficie celular de un gen heterólogo.
[0284] Los vectores descritos en el presente documento también pueden comprender: una
[0285] secuencia nucleotídica que codifica un antígeno E de PRRSV,
[0286] polipéptido, ectodominio o variante del mismo; o, una secuencia nucleotídica que codifica un antígeno gp5a, gp5 o M de PRRSV modificado, polipéptido, ectodominio o variante del mismo, en donde se ha reemplazado una secuencia de localización celular existente de gp5a, gp5 o M por una secuencia determinante de expresión en superficie celular de un gen heterólogo. Los vectores descritos en el presente documento también pueden comprender una mezcla de dos vectores, un primer vector que expresa proteínas menores de PRRSV redirigidas, y un segundo vector que expresa proteínas mayores de PRRSV redirigidas.
[0287] En algunas formas de realización, el o los vectores recombinantes comprenden un polinucleótido que codifica un antígeno, polipéptido o ectodominio que tiene: por lo menos un 90 % de identidad de secuencia con una cualquiera o más de las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 14, 16, 18, 20, 31, 34-39, 40-45, 46-51, 52-58, 59­ 61, 62-66, 68, 71, 73, 75, 77 o 79-139; o, por lo menos con
[0288] un 90 % de identidad de secuencia con una secuencia de ectodominio como se
[0289] indica en una subsecuencia de la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 14, 16,18, 20, 31, 3439, 40-45, 46-51, 52-58, 59-61,62­ 66, 68, 71, 73, 75, 77 o 79-139.
[0290] En algunas formas de realización, el vector Ad5-PRRSV recombinante comprende un polinucleótido que tiene: por lo menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11,12, 13,15,17,19, 21-24, 30, 67, 69, 70, 72, 74, 76 o 78; o, por lo menos un 90 % de identidad de secuencia con una secuencia de ectodominio codificada por una subsecuencia de la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 21-24, 30, 67, 69, 70, 72, 74,
[0291] 76 o 78.
[0292] En algunas formas de realización, la composición o vacuna comprende uno o dos vectores Ad5-PRRSV. En algunas formas de realización, rtg-gp2, rtg-gp3 y rtg-gp4 se pueden expresar mediante el Ad5-PRRSV. Ad5-PRRSV descrito en el presente documento, pero que no forma parte de la invención reivindicada, puede expresar gp2 y E; gp2, gp4 y E; gp2, gp3, gp4 y E; rtg-gp2 y E; rtg-gp2, rtg-gp4 y E; rtg-gp3 y E; rtg-gp4 y E; E solo; rtg- E solo; rtg-gp5, rtg-M.
[0293] En algunas formas de realización, el vector Ad5-PRRSV recombinante comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido o ectodominio que tiene por lo menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 14, 16, 18, 20, 31, 34-39, 40-45, 46-51, 52-58, 59-61, 6266, 68, 71, 73, 75, 77 o 79-139; o, comprende un polinucleótido que codifica un ectodominio que tiene por lo menos un 90 % de identidad de secuencia con un ectodominio como se indica en una subsecuencia de la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 14, 16, 18, 20, 31, 34-39, 40-45, 46­ 51, 52-58, 59-61, 62-66, 68, 71, 73, 75, 77 o 79-139.
[0294] En algunas formas de realización, el vector Ad5-PRRSV recombinante comprende un polinucleótido que tiene por lo menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 21-24, 30, 67, 69, 70, 72, 74, 76 o 78; o, comprende un polinucleótido que tiene por lo menos un 90 % de identidad con una secuencia de ectodominio codificado por una subsecuencia de la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11,12, 13,15,17,19, 2124, 30, 67, 69, 70, 72, 74, 76 o 78.
[0295] Un vector Ad5-PRRSV recombinante
[0296] descrito en el presente documento, pero que no forma parte de la invención reivindicada, puede comprender uno o más polinucleótidos que codifican uno o más antígenos de gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 o E de PRRSV, polipéptido, ectodominio o variantes de los mismos, o combinaciones de los mismos.
[0297] En algunas formas de realización, el vector Ad5-PRRSV recombinante comprende uno o más polinucleótidos que codifican para uno o más antígenos, polipéptidos o ectodominios que tienen: (a) por lo menos un 90 % de identidad de secuencia con una secuencia indicada en la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 14, 16, 18, 20, 31, 34-39, 40-45, 46-51, 52­ 58, 59-61, 62-66, 68, 71, 73, 75, 77 o 79-139; o, (b) por lo menos un 90 % de identidad de secuencia con el o los ectodominios abarcados por una secuencia indicada en la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 14, 16, 18, 20, 31, 34-39, 40-45, 46-51, 52-58, 59-61,62-66, 68, 71,73, 75, 77 o 79-139. Por "ectodominios abarcados por", se entiende que solo la porción extracelular (es decir, no la porción transmembrana ni citoplasmatica) de una SEQ ID NO determinada es sometida a la limitación de identidad de secuencia porcentual. Por ejemplo, si un polipéptido que consiste de 200 aminoácidos tiene los aminoácidos de expansión en el ectodominio n.° 20 a 100, un polipéptido comparador necesita ser solo el 90 % idéntico (es decir, en el caso del 90 % de identidad de lenguaje de la secuencia) a lo largo de los aminoácidos n.° 20 a 100. Ahora que la invención se ha divulgado, los solicitantes visualizan que la persona con experiencia puede seleccionar de manera rutinaria una variedad amplia de TMD y CTD para combinar con los ectodominios de los polipéptidos de PRRSV individuales y en combinación divulgados.
[0298] En algunas formas de realización, el uno o más polinucleótidos tienen por lo menos un 90 % de identidad de secuencia con una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 21-24, 30, 67, 69, 70, 72, 74, 76 o 78; o, los polinucleótidos tienen por lo menos un 90%de identidad de secuencia a lo largo de la longitud de un ectodominio codificado por una secuencia como se indica en una subsecuencia de la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 21-24, 30, 67, 69, 70, 72, 74, 76 o 78. Las personas con experiencia en la materia usando técnicas de rutina pueden comprender o evaluar qué secuencias polinucleotídicas codifican ectodominios.
[0300] En algunas formas de realización, el vector Ad5-PRRSV comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido gp2 de PRRSV de acuerdo con la invención que tiene: (a) por lo menos un 90 % de identidad de secuencia con una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 1, 14, 34-39 u 80-89 (proteína gp2); o (b) por lo menos un 90 % de identidad de secuencia con una secuencia de ectodominio como se indica en una subsecuencia de la SEQ ID NO: 1,14, 34-39 u 80-89.
[0302] El vector Ad5-PRRSV descrito en el presente documento también puede comprender un polinucleótido que codifica un polipéptido E de PRRSV que tiene: (a) por lo menos un 90 % de identidad de secuencia con una secuencia como se
[0304] indica en la SEQ ID NO: 7, 20, 52-58 o 130-139 (proteína E); o (b) por lo menos un 90 % de identidad de secuencia con una secuencia de ectodominio como se indica en una subsecuencia de la SEQ ID NO: 7, 20, 52­ 58 o 130-
[0305] 139.
[0307] En algunas formas de realización, el vector Ad5-PRRSV comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido gp3 de PRRSV de acuerdo con la invención que tiene: (a) por lo menos un 90 % de identidad de secuencia con una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 5, 18, 40-45 o 90-99 (proteina gp3); o (b) por lo menos un 90 % de identidad de secuencia con una secuencia de ectodominio como se indica en una subsecuencia de la SEQ ID NO: 5,18, 40-45 o 90-99.
[0309] El vector Ad5-PRRSV descrito en el presente documento, pero que no forma parte de la invención reivindicada, puede comprender dos polinucleótidos que codifican los polipéptidos gp2 y E de PRRSV que tienen: (a) por lo menos un 90 % de identidad de secuencia con una de las secuencias como se indica en la SEQ ID NO: 1,14, 34­ 39 u 80-89 (proteina gp2) y una de las secuencias como se indica en la SEQ ID NO: 7, 20, 52-58 o 130-139 (proteina E); o (b) por lo menos un 90 % de identidad de secuencia con una secuencia de ectodominio como se indica en una subsecuencia de la SEQ ID NO: 1, 14, 34-39 u 80-89 (proteina gp2) y una secuencia de ectodominio como se indica en una subsecuencia de la SEQ ID NO: 7, 20, 52-58 o 130-139 (proteina E).
[0311] El vector Ad5-PRRSV descrito en el presente documento, pero que no forma parte de la invención reivindicada, puede comprender polinucleótidos que codifican los polipéptidos gp2, E y gp4 de PRRSV que tienen: (a) por lo menos un 90 % de identidad de secuencia con una de las secuencias como se indica en la SEQ ID NO: 1,14, 34-39 u 80-89 (proteina gp2), una de las secuencias como se indica en la SEQ ID NO: 7, 20, 52-58 o 130-139 (proteina E) y una de las secuencias como se indica en la SEQ ID NO: 5, 18, 40-45, 90-99 (proteina gp3); o (b) por lo menos un 90 % de identidad
[0313] de secuencia con un ectodominio abarcado por una de las secuencias como se indica en la SEQ ID NO: 1, 14, 34­ 39 u 80-89 (proteina gp2), un ectodominio abarcado por una de las secuencias como se indica en la SEQ ID NO: 7, 20, 52-58 o 130-139 (proteina E) y un ectodominio abarcado por una de las secuencias como se indica en la SEQ ID NO: 5, 18, 40-4590-99 (proteina gp3).
[0315] En otro aspecto, la divulgación proporciona la composición de acuerdo con la invención o el vector Ad5-PRRSV recombinante de acuerdo con la invención para su uso en un método para provocar una respuesta inmunitaria protectora en un animal que lo necesite contra PRRSV que comprende administrar al animal un vector de Ad5-PRRSV recombinante que expresa gp2, gp3 y gp4 de acuerdo con la invención, y un transportador, adyuvante, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable.
[0317] El vector Ad5-PRRSV descrito en el presente documento, pero que no forma parte de la invención reivindicada, puede comprender uno o más polinucleótidos que codifican uno o más polipéptidos que tienen: (a) por lo menos un 90 % de identidad de secuencia con una de las secuencias como se indica en la SEQ ID NO: 1, 14, 34-39 u 80­ -89 (proteina gp2) y SEQ ID NO: 7, 20, 52-58 o 130-139 (proteina E); o (b) por lo menos un 90 % de identidad de secuencia con el o los ectodominios de la proteina gp2 o la proteina E abarcados por las correspondientes SEQ ID NO previas.
[0319] El vector Ad5-PRRSV descrito en el presente documento, pero que no forma parte de la invención reivindicada, puede comprender uno o más polinucleótidos que codifican uno o más
[0320] polipéptidos que tienen por lo menos un 90 % de identidad de secuencia con una
[0322] de las secuencias como se indica en la SEQ ID NO: 1, 14, 34-39 u 80-89 (proteina gp2), una de las secuencias como se indica en la SEQ ID NO: 7, 20, 52-58 o 130-139 (proteina E) y una de las secuencias como se indica en la SEQ ID NO: 5, 18, 40-45, 90-99 (proteina gp3); o (b) por lo menos un 90%de identidad de secuencia con los ectodominios de gp2, E y gp3 abarcados por las correspondientes SEQ ID NO previas.
[0324] En algunas formas de realización, la administración es por vía oro-nasal, aspersión, agua de bebida, intramuscular, o administración subcutánea, intradérmica, transdérmica. En algunas formas de realización, la administración es una primovacunación y refuerzo. En algunas formas de realización, la primera vacunación es una mezcla de dos vectores Ad5, en donde el primero expresa proteínas menores de PRRSV redirigidas de acuerdo con la invención y el segundo expresa proteínas mayores de PRRSV; y el refuerzo comprende o consiste esencialmente en ambos vectores de la primera vacunación, o alguno de los vectores solos. En algunas formas de realización, el animal en necesidad de protección es un animal porcino.
[0326] En general, la comparación de secuencias de aminoácidos se lleva a cabo por alineamiento de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de una estructura conocida con la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de estructura desconocida. Luego se comparan los aminoácidos de las secuencias y se agrupan juntos los grupos de aminoácidos que son homólogos. Este método detecta regiones conservadas de los polipéptidos y da cuenta de las inserciones y eliminaciones de aminoácidos. La homología
[0328] entre secuencias de aminoácidos se puede determinar mediante el uso de algoritmos comercialmente disponibles (véase también la descripción de homología previa). Además de los que se mencionan en algún otro lugar del presente documento, se deben mencionar los programas BLAST, BLAST con huecos, BLASTN, BLASTP y PSI-BLAST, proporcionados por el National Center for Biotechnology Information. Estos programas se usan ampliamente en la materia para este propósito y pueden alinear regiones homólogas de dos secuencias de aminoácidos.
[0330] Como alternativa o de forma adicional, el término "homología" o "identidad", por ejemplo, con respecto a una secuencia nucleotídica o de aminoácidos, puede indicar una medida cuantitativa de homología entre dos secuencias. El porcentaje de identidad de secuencia se puede calcular como (N<ref>- N<dif>) x 100/N<re>f, en donde N<dif>es el número total de restos no idénticos en las dos secuencias alineadas y en donde N<ref>es el número de restos en una de las secuencias. Por lo tanto, la secuencia de ADN AGTCAGTC tendrá una identidad de secuencia del 75 % con la secuencia AATCAATC (N<ref>= 8; N<dif>= 2).
[0332] Como alternativa o adicionalmente, "homología" o "identidad" con respecto a secuencias se puede referir al número de posiciones con nucleótidos o aminoácidos idénticos dividido por el número de nucleótidos o aminoácidos en la más corta de las dos secuencias en donde el alineamiento de las dos secuencias se puede determinar de acuerdo con el algoritmo de Wilbur y
[0334] Lipman (Wilburet al.,1983), por ejemplo, usando un tamaño de ventana de 20 nucleótidos, una longitud de ventana de 4 nucleótidos y una penalización por huecos de 4, y el análisis e interpretación asistida por ordenador de los datos de secuencia incluyendo el alineamiento se puede llevar a cabo convenientemente usando programas comercialmente disponibles (por
[0336] ejemplo, Vector NTI Software™, Invitrogen Inc. CA, EE. UU.). Cuando se dice que las secuencias de ARN son similares, o que tienen un grado de identidad u homología de secuencia con secuencias de ADN, la timidina (T) en la secuencia de ADN se considera igual a uracilo (U) en la secuencia de ARN. Por lo tanto, las secuencias de ARN están dentro del alcance de la
[0338] invención y pueden proceder de secuencias de ADN, mediante la consideración de que la timidina (T) en la secuencia de ADN se considera igual a uracilo (U) en las secuencias de ARN. Y, sin una experimentación innecesaria, las personas con experiencia en la materia pueden consultar muchos otros programas o referencias para determinar el porcentaje de
[0340] homología.
[0342] La invención además abarca los polinucleótidos de PRRSV de acuerdo con la invención contenidos en una molécula de vector o un vector de expresión de acuerdo con la invención y conectados de forma operativa a un elemento promotor y, opcionalmente, a un potenciador.
[0344] Un "vector" se refiere a un plásmidos de ADN o ARN recombinante,
[0346] bacteriófago o virus que comprende un polinucleótido heterólogo a administrar a una célula diana, ya seain vitrooin vivo.El polinucleótido heterólogo puede comprender una secuencia de interés para el propósito de prevención o terapia y, opcionalmente, puede estar en la forma de un casete de expresión. Tal como se usa en el presente documento, un vector no necesita ser capaz de replicarse en la célula o sujeto diana objetivo. El término "vector" incluye vectores para clonado, así como también vectores víricos.
[0348] El término "genomanipulado" o "recombinante" designa a un polinucleótido de origen semisintético o sintético que no existe en la naturaleza o bien que está conectado a otro polinucleótido en una disposición que no existe en la naturaleza.
[0349] "Heterólogo" significa derivado de una entidad genéticamente diferente del resto de la entidad a la cual se la compara. Por ejemplo, se puede incorporar un polinucleótido por técnicas de ingeniería genética en un plásmido o vector derivado de una fuente diferente, y por lo tanto es un polinucleótido heterólogo. Un promotor separado de su secuencia codificante nativa y conectado de forma operativa a una secuencia codificante diferente de la secuencia nativa es un promotor heterólogo.
[0350] Los polinucleótidos de la invención pueden comprender secuencias adicionales, tales como secuencias codificantes adicionales dentro de la misma unidad de transcripción, elementos de control, tales como promotores, sitios de unión a ribosoma, 5'UTR, 3'UTR, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, unidades de transcripción adicionales bajo el control de mismo promotor o de uno diferente, secuencias que permiten el clonado, la expresión, la recombinación homologa y la transformación de una célula hospedadora, y cualquiera de dichas construcciones que puedan ser deseables
[0351] para proporcionar las formas de realización de esta invención.
[0352] Los elementos para la expresión de un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de PRRSV ventajosamente están presentes en un vector de la invención. Mínimamente, esto comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un codón de inicio (ATG), un codón de finalización y un promotor, y opcionalmente también una secuencia de poliadenilación para ciertos vectores tales como plásmidos y ciertos vectores víricos. Cuando el polinucleótido codifica un fragmento de polipéptido, por ejemplo, un péptido de PRRSV, ventajosamente, en el vector, se coloca un ATG en 5' del marco de lectura y se coloca un codón de finalización en
[0353] 3'. Puede haber otros elementos para el control de la expresión, tales como secuencias potenciadoras, secuencias de estabilización, tales como un intrón y/o secuencias no traducidas en 5' o 3' y secuencias señales que permiten la secreción de la proteína.
[0354] Los métodos para elaborar y/o administrar un vector o recombinantes o
[0355] plásmido para la expresión de productos génicos de la invención ya seain vivoo bienin vitropuede ser cualquier método deseado, por ejemplo, un método similar o análogo a los métodos que se divulgan en los documentos que se citan en: las patentes de los EE. UU. N.° 4.603.112; 4.769.330; 4.394.448; 4.722.848; 4.745.051; 4.769.331; 4.945.050; 5.494.807;
[0356] 5.514.375; 5.744.140; 5.744.141; 5.756.103; 5.762.938; 5.766.599;
[0357] 5.990.091; 5.174.993; 5.505.941; 5.338.683; 5.494.807; 5.591.639;
[0358] 5.589.466; 5.677.178; 5.591.439; 5.552.143; 5.580.859; 6.130.066;
[0359] 6.004.777; 6.130.066; 6.497.883; 6.464.984; 6.451.770; 6.391.314;
[0360] 6.387.376; 6.376.473; 6.368.603; 6.348.196; 6.306.400; 6.228.846:
[0361] 6.221.362; 6.217.883; 6.207.166; 6.207.165; 6.159.477; 6.153.199:
[0362] 6.090.393; 6.074.649; 6.045.803; 6.033.670; 6.485.729; 6.103.526:
[0363] 6.224.882; 6.312.682; 6.348.450; 6.312.683. and 6.596.279; la Solicitud de patente de los EE. UU. acta N.° 12/753,597; WO 90/01543; WO91/11525; WO 94/16716; WO 96/39491; WO 98/33510; EP 265785; EP 0370573. La presente invención también se refiere a una composición o vacuna de acuerdo con la invención que comprende vectores de expresión. La composición o vacuna puede comprender, consistir esencialmente en, o consistir en uno o más vectores de acuerdo con la invención, por ejemplo, vectores de expresión, tales como vectores de expresiónin vivo,que comprenden, consisten esencialmente o consisten en (o que expresan) los polipéptidos o ectodominios de PRRSV de acuerdo con la invención. El vector contiene y expresa un polinucleótido que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un polinucleótido que codifica (o que expresa) los polipéptidos o ectodominios de PRRSV de acuerdo con la invención, en un transportador y, opcionalmente, un adyuvante, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptables.
[0364] De acuerdo a otra forma de realización, el vector o los vectores en la composición o vacuna comprenden, o consisten esencialmente en, o consisten en uno o más polinucleótidos que codifican los polipéptidos o ectodominios de PRRSV de acuerdo con la invención. La composición o vacuna de la invención comprende, consiste esencialmente en, o consiste en uno o más vectores de acuerdo con la invención que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en, y ventajosamente que también expresan,in vivobajo condiciones apropiadas o condiciones adecuadas o en una célula hospedadora adecuada, polinucleótidos de diferentes aislados de PRRSV que codifican las mismas proteínas y/o diferentes proteínas.
[0365] El término plásmido cubre a cualquier unidad de transcripción de ADN que comprende un polinucleótido de acuerdo a la invención y los elementos necesarios para su expresiónin vivoen una o más células del hospedador o diana deseado; y, con respecto a esto, ha de notarse que un plásmido superenrollado y todos sus topoisómeros, plásmidos circulares abiertos, así como también las formas lineales del plásmido, están abarcadas dentro del alcance de la invención.
[0367] Cada plásmido comprende o contiene o consiste esencialmente en, además del polinucleótido heterólogo que codifica una proteína recombinante o ectodominio de acuerdo con la invención, opcionalmente fusionado con un polinucleótido que codifica una secuencia peptídica heteróloga, variante, análogo o fragmento, operativamente conectado a un promotor o bajo el control de un promotor o dependiente de un promotor. En general, es ventajoso emplear un promotor fuerte que sea funcional en células eucariotas. El promotor fuerte preferido es el promotor de citomegalovirus temprano inmediato (CMV-IE) de origen humano o murino, u opcionalmente con otro origen tal como de rata o de conejillo de la India. El promotor de
[0369] CMV-IE puede comprender el segmento promotor real, que puede o no estar
[0371] asociado con el segmento potenciador. Se puede hacer referencia a los documentos EP-A- 260 148, EP-A-323 597, las Patentes de los EE. UU. N.° 5.168.062, 5.385.839, y 4.968.615, así como también a la Solicitud PCT N.° WO87/03905. El promotor de CMV-IE es ventajosamente un CMV-IE humano (Boshartet al.,1985) o CMV-IE murino.
[0373] En términos más generales, el promotor es uno de origen vírico o de origen celular. Un promotor vírico fuerte distinto al CMV-IE que puede ser adecuadamente empleado en la práctica de la invención es el promotor temprano/tardío del virus SV40 o el promotor LTR del virus de sarcoma de Rous. Un promotor celular fuerte que puede ser adecuadamente empleado en la práctica de la invención es el promotor de un gen del citoesqueleto, tal como, por ejemplo, el promotor de desmina (Kwissaet al.,2000) o el promotor de actina (Miyazakiet al.,1989).
[0375] Se pueden incluir subfragmentos funcionales de estos promotores, es decir, porciones de estos promotores que mantienen una actividad promotora adecuada, dentro de la presente invención, por ejemplo, promotores CMV-IE truncados de acuerdo a la Solicitud PCT N.° WO98/00166 o la Patente de los EE. U<u>. N.° 6.156.567. Un promotor en la práctica de la invención consecuentemente incluye derivados o subfragmentos de un promotor de longitud completa que mantienen una actividad promotora adecuada y que, por lo tanto, funcionan como promotor, preferiblemente promoviendo una actividad sustancialmente similar a la del promotor real o de longitud
[0377] completa del que se obtuvo el derivado o subfragmento, por ejemplo, una
[0379] actividad semejante a la de los promotores de CMV-IE truncados de la Patente de los EE. UU. N.° 6.156.567 similar a la de los promotores de CMV- IE de longitud completa. Por lo tanto, un promotor de CMV-IE en la práctica de la invención puede comprender o consistir esencialmente en o consistir en la porción promotora del promotor de longitud completa y/o la porción potenciadora del promotor de longitud completa, así como también derivados y subfragmentos.
[0381] Preferiblemente, los plásmidos comprenden o consisten esencialmente en otros elementos para el control de la expresión. Es particularmente ventajoso incorporar una o más secuencias estabilizantes, por ejemplo, una o más secuencias intrónicas, preferiblemente el primer intrón del hCMV-IE (Solicitud PCT N.° WO89/01036), el intrón II del gen de p-globina de conejo (van Ooyenet al.,1979).
[0383] Como señal de poliadenilación (poliA) para los plásmidos y vectores víricos distintos a poxvirus, se puede usar la señal de poli(A) del gen de la hormona de crecimiento bovina (bGH) (véase la Patente de los EE. UU. N.° 5.122.458), o la señal de poli(A) del gen de p-globina de conejo o la señal de poli(A) del virus SV40.
[0385] De acuerdo con otra forma de realización de la invención, los vectores de expresión son vectores de expresión que se usan para la expresiónin vitrode proteínas en un sistema celular apropiado. Las proteínas expresadas se pueden recoger en o del sobrenadante de cultivo después de la secreción, o no después de ella (si no hay secreción, típicamente se hace o se lleva a cabo
[0387] una lisis celular), opcionalmente se concentran por métodos de concentración, tales como ultrafiltración, y/o se purifican por medios de purificación, tales como los métodos cromatográficos de tipo afinidad, intercambio iónico o filtración en gel.
[0389] Una "célula hospedadora" describe a una célula procariota o eucariota que se ha alterado genéticamente, o que es capaz de ser alterada genéticamente mediante la administración de un polinucleótido exógeno, tal como un plásmido o vector recombinante. Cuando se hace referencia a células genéticamente alteradas, el término se refiere tanto a la célula originalmente alterada y a la progenie de la misma. Las células hospedadoras incluyen, pero sin limitación, células de riñón de hámster bebé (BHK), células de carcinoma de colon (Caco-2), células COS7, células HEK 293, células MCF-7, células MCF-10A, líneas de renales caninas de Madin-Darby (MDCK), células de pulmón de visón (Mv1 Lu), células MRC-5, células U937, células de ovario de hámster chino (CHO), células Vero de mono (línea celular con origen en el riñón de un mono verde africano), células de codorniz (línea celular de músculo de codorniz QM7), línea celular de pollo DF1, y células VERO. Los polinucleótidos que comprenden una secuencia deseada se pueden insertar en un vector adecuado de clonación o expresión, y el vector a su vez se puede introducir en una célula hospedadora adecuada para su replicación y amplificación. Los polinucleótidos se pueden introducir en células hospedadoras por cualquier medio conocido en la materia. Los vectores que contienen los polinucleótidos de interés se pueden introducir en
[0390] la célula hospedadora por cualquiera de un número de medios apropiados, incluyendo captación directa, endocitosis, transfección, apareamiento f, electroporación, transfección empleando cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio, DEAE-dextrano u otras sustancias; bombardeo con microproyectiles; lipofección; e infección (en donde el vector es infeccioso, por ejemplo, un vector retrovírico). La elección de los vectores o polinucleótidos de introducción con frecuencia ha de depender de las características de la célula hospedadora. En una forma de realización de la presente invención, el vector es un vector Ad5 como se describe en el documento US 2010/0255029.
[0391] Las ventajas de las vacunas a PRRSV que se basan en el vector Ad5 incluyen, pero sin limitación, que las mismas (1) inducen una inmunidad amplia, incluyendo respuestas humoral, celular y mucosal (2) no expresan todas las proteínas PRRSV y, por lo tanto, son compatibles con la estrategia DIVA (infección diferenciada a partir de animales vacunados), (3) inducen un inicio rápido de la inmunidad y (4) su producción posee menos riesgos para el medioambiente que las vacunas inactivadas en el caso de una liberación accidental.
[0392] La invención se refiere a vectores Ad5 genomanipulados o recombinantes que expresan polipéptidos o ectodominios de PRRSV de acuerdo con la invención. Las proteínas menores de la envoltura de PRRSV incluyen gp2, gp3, gp4,
[0393] gp5a o la proteína E, antes mencionadas. El vector Ad5 genomanipulado puede
[0394] comprender uno o más polinucleótidos que codifican los polipéptidos o ectodominios de PRRSV de acuerdo con la invención. Un vector Ad5 genomanipulado descrito en el presente documento, pero que no forma parte de la invención reivindicada, puede comprender uno o más polinucleótidos que codifican un antígeno gp2 de PRRSV o variantes de los mismos, un antígeno E de PRRSV o variantes del mismo, un antígeno gp3 de PRRSV o variantes del mismo, un antígeno de PRRSV o variantes del mismo, antígeno gp4 o variantes del mismo o una combinación de los mismos.
[0395] En una forma de realización, la invención proporciona la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una formulación para la administración y
[0396] expresión de los polipéptidos o ectodominios de acuerdo con la invención en una célula diana. La determinación de la cantidad profilácticamente o terapéuticamente eficaz es parte de la experimentación de rutina de las personas con experiencia en la materia. En otra forma de realización, la formulación comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que
[0397] expresa los polipéptidos o ectodominios de PRRSV de acuerdo con la invención y un transportador, vehículo, adyuvante o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable. En otra forma de realización, el transportador, vehículo, adyuvante o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable facilita la transfección y/o mejora la conservación del vector o la
[0398] proteína.
[0399] Los transportadores o vehículos o adyuvantes o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables son bien conocidos para las personas con experiencia en la materia. Por ejemplo, un transportador o
[0400] vehículo o adyuvante o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser agua estéril, una solución de NaCI al 0,9 % (por ejemplo, solución salina) o un tampón fosfato. Otros transportadores o vehículos o adyuvantes o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables que se pueden usar para los métodos de esta invención incluyen, pero sin limitación, poli-(L-glutamato) o polivinilpirrolidona. El transportador o vehículo o adyuvante o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser cualquier compuesto o combinación de compuestos que faciliten la administración del vector (o proteína expresada a partir de un vector de la invenciónin vitro),ventajosamente, el transportador, vehículo, adyuvante o excipiente puede facilitar la transfección y/o mejorar la conservación del vector (o proteína). Las dosis y los volúmenes de dosis se exponen en el presente documento en la descripción general y también pueden ser determinados por las personas con experiencia en la materia a partir de la divulgación leída en conjunto con el conocimiento de la materia, sin ninguna experimentación innecesaria.
[0401] Los lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternaria que son, aunque no exclusivamente, adecuados para plásmidos, son los que tienen la siguiente fórmula:
[0404]
[0407] en donde R1 es un radical alifático de cadena lineal saturado o insaturado que tiene entre 12 y 18 átomos de carbono, R2 es otro radical alifático que contiene 2 o 3
[0409] átomos de carbono y X es un grupo amino o hidroxilo, por ejemplo, el DMRIE. En otra forma de realización, el lípido catiónico se puede asociar con un lípido neutro, por ejemplo, el DOPE.
[0411] Entre estos lípidos catiónicos, se prefiere el DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N,N-
[0412] dimetil-2,3-bis(tetradeciloxi)-1-propano amonio; documento WO96/34109), ventajosamente asociado con un lípido neutro, ventajosamente DOPE (dioleoil-fosfatidil-etanolamina; Behr, 1994), para formar DMRIE-DOPE.
[0414] La mezcla de plásmidos con el adyuvante se forma extemporáneamente y/o contemporáneamente con la administración de la preparación o poco antes
[0416] de la administración de la preparación; por ejemplo, poco antes o después de la administración, se forma la mezcla de plásmido y adyuvante, ventajosamente para dar un tiempo suficiente antes de la administración para que la mezcla forme un complejo, por ejemplo, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 60 minutos antes de la administración, tal como
[0418] aproximadamente 30 minutos antes de la administración.
[0420] Cuando DOPE está presente, la proporción molar de DMRIE:DOPE puede ser entre aproximadamente 95:aproximadamente 5 y aproximadamente 5:aproximadamente 95, o aproximadamente 1:aproximadamente 1, por ejemplo, 1:1. La proporción en peso de adyuvante DMRIE o DMRIE-DOPE:plásmido puede ser entre aproximadamente 50: aproximadamente 1 y aproximadamente 1: aproximadamente 10, tal como aproximadamente
[0422] 10: aproximadamente 1 y aproximadamente 1:aproximadamente 5, y ventajosamente aproximadamente 1:aproximadamente 1 y
[0424] aproximadamente 1:aproximadamente 2, por ejemplo, 1:1 y 1:2.
[0426] En otra forma de realización, el transportador, adyuvante, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser una emulsión de agua en aceite. Los ejemplos de emulsiones adecuadas de agua en aceite incluyen emulsiones para vacuna de agua en aceite a base de aceite que son estables y fluidas a 4 °C que contienen: entre el 6 y el 50 % v/v de una fase acuosa que contiene antígeno, preferiblemente entre el 12 y el 25 % v/v, entre el 50 y el 94 % v/v de una fase oleosa que contiene un aceite totalmente o en parte no metabolizable (por ejemplo, aceite mineral, tal como aceite de parafina) y/o aceite metabolizable (por ejemplo, aceite vegetal, o ésteres de ácido graso, poliol o alcohol), entre el 0,2 y el 20 % p/v de tensioactivos, preferiblemente entre el 3 y el 8 % p/v, en donde el último es total o en parte, o en una mezcla de algún éster de poliglicerol, en donde dichos ésteres de poliglicerol son preferiblemente (poli)ricinoleatos de poliglicerol, o aceites de polioxietileno ricino o algún aceite de polioxietileno ricino hidrogenado. Los ejemplos de tensioactivos que se pueden usar en una emulsión de agua en aceite incluyen a ésteres de sorbitano etoxilados (por ejemplo, polioxietileno (20) sorbitano monooleato (TWEEN 80®),
[0428] disponible de AppliChem, Inc., Cheshire, CT) y ésteres de sorbitano (por ejemplo, sorbitano monooleato (SPAN 80®), disponible de Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Además, con respecto a una emulsión de agua en aceite, véase también la Patente de los EE. UU. N.° 6.919.084. En algunas formas de
[0429] realización, la fase acuosa que contiene antígeno comprende una solución salina que comprende uno o más agentes tamponantes. Un ejemplo de una solución tampón adecuada es solución salina tamponada con fosfato. En una forma de realización, la emulsión de agua en aceite puede ser una triple emulsión agua/aceite/agua (W/O/W) (véase, por ejemplo, la Patente de los EE. UU. N.° 6.358.500). Los ejemplos de otras emulsiones adecuadas se describen en la Patente de los EE. UU. N.° 7.371.395.
[0430] Las composiciones y vacunas inmunitarias de acuerdo a la invención pueden comprender o consistir esencialmente en uno o más adyuvantes. Los adyuvantes adecuados para usar en la práctica de la presente invención son (1) polímeros de ácido acrílico o metacrílico, anhídrido maleico y polímeros derivados de alquenilo, (2) secuencias inmunoestimuladoras (ISS), tales como secuencias oligodesoxirribonucleotídicas que tienen una o más unidades CpG no metiladas (Klinmanet al.,1996; WO98/16247), (3) una emulsión de aceite en agua, tal como la emulsión SPT que se describe en la pág. 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" publicado por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, y la emulsión MF59 que se describe en la pág. 183 del mismo trabajo, (4) lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario, por ejemplo, DDA (5) citocinas, (6) hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, (7) saponina u (8) otros adyuvantes divulgados en cualquier documento citado en la presente solicitud, o (9) cualquier combinación o mezcla de
[0431] los mismos.
[0432] La emulsión de aceite en agua (3), que es especialmente apropiada para los vectores víricos, puede usarse en: aceite de parafina líquida liviana (tipo farmacopea europea), aceite de isoprenoide, tal como escualano, escualeno, aceite que resulta de la oligomerización de alquenos, por ejemplo, isobuteno o deceno, esteres de ácidos o alcoholes que tienen un grupo alquilo de cadena lineal, tal como los aceites vegetales, oleato de etilo, propilenglicol, di(caprilato/caprato), glicerol tri(caprilato/caprato) y propilenglicol dioleato, o ésteres de alcoholes o ácidos grasos ramificados, en especial ásteres de ácido isosteárico.
[0433] El aceite se usa en combinación con emulsionantes para formar una emulsión. Los emulsionantes pueden ser tensioactivos no iónicos, tales como: ésteres de por un lado de sorbitano, manida (por ejemplo, oleato de anhidromanitol), glicerol, poliglicerol o propilenglicol, y por otro lado ácidos oleico, isoesteárico, ricinoleico o hidroxiesteárico, en donde, opcionalmente, dichos ésteres están etoxilados, o bloques de copolímeros de polioxipropileno-polioxietileno, tales como Pluronic, por ejemplo, L121.
[0434] Entre los polímeros de tipo adyuvante (1), se da preferencia a los polímeros de ácido acrílico o metacrílico entrecruzados, en especial entrecruzados con éteres de polialquenilo de azúcares o polialcoholes. Estos compuestos se conocen bajo el nombre de carbómeros (Pharmeuropa, vol. 8, n.° 2, junio de 1996). Una persona con experiencia en la materia también se puede referir a la Patente de los EE. UU. N-° 2.909.462, que proporciona dichos polímeros acrílicos
[0435] entrecruzados con compuestos de polihidroxilo que tienen por lo menos tres
[0436] grupos hidroxilos, preferiblemente no más de ocho de dichos grupos, en donde los átomos de hidrógeno de por lo menos tres grupos hidroxilo se reemplazan por radicales alifáticos insaturados que tienen por lo menos dos átomos de carbono. Los radicales preferidos con aquellos que contienen entre 2 y 4 átomos de carbono, por ejemplo, vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados también pueden contener otros sustituyentes, tales como metilo. Los productos que se venden bajo el nombre Carbopol (BF Goodrich, Ohio, EE. u U.) son especialmente adecuados. Los mismos se entrecruzan con alil sacarosa o con alil pentaeritritol. Entre ellos, se hace referencia al Carbopol 974P/934P y971P.
[0437] Entre los copolímeros derivados de anhídrido maleico-alquenilo, se da preferencia a los EMA (Monsanto), que son copolímeros de etileno y anhídrido maleico de cadena lineal, o entrecruzados y los mismos están, por ejemplo, entrecruzados con éter de divinilo. También se hace referencia a J. Fieldset al.,1960.
[0438] Con respecto a la estructura, los polímeros de ácido acrilico o metacrílico y los EMA preferiblemente se forman con unidades básicas que tienen la siguiente fórmula:
[0441]
[0444] en donde:
[0445] R1 y R2, que pueden ser iguales o diferentes, representan H o CH3
[0446] x = 0 o 1, preferiblemente x = 1
[0447] y = 1 o 2, con x y = 2.
[0448] Para los EMA, x = 0 e y = 2 y para los carbómeros x = y = 1.
[0449] Estos polímeros son solubles en agua o en solución salina fisiológica (20 g/l de NaCI) y el pH se puede ajustar entre 7,3 y 7,4, por ejemplo, con soda (NaOH), para proporcionar la solución adyuvante en donde se pueden incorporar el o los vectores de expresión. La concentración de polímero en la composición de vacuna o inmunitaria final puede estar en el intervalo entre el 0,01 y el 1,5 % p/v, entre el 0,05 y el 1 % p/v o entre el 0,1 y el 0,4 % p/v. La citocina o citocinas (5) pueden estar en forma de proteína en la composición de vacuna o inmunitaria, o se pueden coexpresar en el hospedador con el inmunógeno o los inmunógenos o epítopo(s) de los mismos. Se da preferencia a la coexpresión de la citocina o citocinas, ya sea mediante el mismo vector con el que se expresan el inmunógeno o los inmunógenos o epítopo(s) de los mismos, o mediante un vector separado.
[0450] La invención comprende preparar dichas composiciones de combinación; por ejemplo, mediante el mezclado de los componentes activos, ventajosamente juntos y con un adyuvante, transportador, citocina, y/o diluyente.
[0451] Las citocinas que se pueden usar en la presente invención incluyen, pero sin limitación, un factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF), interferón a (IFNa), interferón p (IFNp), interferón y (IFNy), interleucina- 1a(IL-1a), interleucina-1p (IL-1p), interleucina-2 (IL-2), interleucina-3 (IL- 3), interleucina-4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5), interleucina-6 (lL-6),
[0452] interleucina-7 (IL-7), interleucina-8 (IL-8), interleucina-9 (IL-9), interleucina-10 (IL-10), interleucina-11 (IL-11), interleucina-12 (IL-12), factor de necrosis tumoral a (TNFa), factor de necrosis tumoral p (TNFp) y factor de crecimiento transformante p (TGFp). Ha de comprenderse que las citocinas se pueden coadministrar y/o administrar secuencialmente con la
[0453] composición de vacuna o inmunitaria de la presente invención. Por lo tanto, por ejemplo, la vacuna de la presente invención también puede contener una molécula de ácido nucleico exógena que expresain vivouna citocina adecuada, por ejemplo, una citocina coincidente con este hospedador a vacunar o en donde se va a producir una respuesta inmunitaria (por
[0454] ejemplo, una citocina de felino para preparaciones a administrar a un felino).
[0455] En otra forma de realización, la composición de la presente invención se puede preparar usando el procedimiento químico o físico como se describe en Staufferet al.(Recent Patents on Anti-lnfective Drug Discovery, 1, 291
[0456] 296, 2006). Algunas de las técnicas de inactivación se resumen en la tabla
[0457] siguiente.
[0458] Tabla 1. Técnicas de inactivación
[0460]
[0461] La composición y/o vacuna inmunitaria de acuerdo a la invención comprende o consiste esencialmente en, o consiste en una cantidad eficaz para provocar una respuesta protectora o terapéutica de uno o más vectores de expresión y/o polipéptidos o ectodominios de acuerdo con la invención; y, puede determinarse una cantidad eficaz a partir de esta divulgación, incluyendo los documentos citados en el presente documento, y el conocimiento en la materia, sin experimentación innecesaria.
[0463] Las composiciones o vacunas de la presente invención se pueden administrar a un animal a través del agua de bebida, vía oro-nasal, aspersiones, aerosoles, instilación intranasal, inyección transdérmica, subcutánea o intramuscular. Ventajosamente, las vacunas se administran por vía transdérmica, oro-nasal, subcutánea, intramuscular, aspersión o en el agua de bebida.
[0465] La presente invención contempla por lo menos una administración a un
[0467] animal de una cantidad eficaz de la composición terapéutica elaborada de acuerdo a la invención. La composición terapéutica de acuerdo a la invención se puede administrar mediante un aparato sin agujas (como, por ejemplo, con un aparato Pigjet, Dermojet, Biojector, Vetjet o Vitajet (Bioject, Oregon, EE. UU.)).
[0469] En una forma de realización de la invención, se puede emplear un régimen de primovacunación y refuerzo, que comprende por lo menos una primera administración y por lo menos una administración de refuerzo usando por lo menos una proteína, polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno común. La composición o vacuna inmunitaria que se usa en la administración primaria es de naturaleza diferente a las que se usan como refuerzo. Sin embargo, ha de notarse que se puede usar la misma composición como administración primaria y como administración de refuerzo. El protocolo de administración se denomina "primovacunación y refuerzo".
[0471] En otro aspecto del protocolo de por primovacunación y refuerzo de la invención, se administra una composición que comprende la vacuna o composición de Ad5 PRRSV genomanipulado seguido por la administración de una vacuna o composición que comprende un vector vírico recombinante que contiene y que expresa un antígeno de PRRSVin vivo,o una vacuna o composición vírica inactivada que comprende el antígeno de PRRSV, o una vacuna o composición que comprende una subunidad (proteica) de PRRSV, o una vacuna o composición de ADN plasmídico que contiene o expresa un
[0472] antígeno de PRRSV. De forma similar, un protocolo de primovacunación y refuerzo
[0474] puede comprender la administración de una vacuna o composición que comprende un vector vírico recombinante que contiene y expresa un antígeno de PRRSVin vivo,o una vacuna o composición vírica inactivada que comprende el antígeno de PRRSV, o una vacuna o composición que comprende una Subunidad (proteica) de PRRSV, o una vacuna o composición de ADN plasmídico que contiene o que expresa un antígeno de PRRSV, seguido por la administración de una composición que comprende la vacuna o composición de Ad5 PRRSV genomanipulado. Ha de notarse que tanto la primera administración como la segunda pueden comprender la composición que comprende la vacuna o composición de Ad5 PRRSV genomanipulado. Además, ha de notarse que tanto la primera administración como la segunda pueden comprender una o más composiciones que comprenden los vectores genomanipulados de la presente invención.
[0476] Un protocolo de primovacunación y refuerzo comprende por lo menos una administración de primovacunación y por lo menos una administración de refuerzo usando por lo menos un antígeno común. La vacuna o composición que se usa en la administración de primovacunación puede ser de naturaleza diferente de la que se usa luego como vacuna o composición de refuerzo. La administración de primovacunación puede comprender una o más administraciones. De forma similar, la administración de refuerzo puede comprender una o más administraciones.
[0478] Las diferentes administraciones preferiblemente se llevan a cabo con entre aproximadamente 1 y aproximadamente 6 semanas de separación, o entre
[0480] aproximadamente 2 y aproximadamente 4 semanas de separación. También se contempla un refuerzo repetido entre cada 2 a 6 semanas o un refuerzo anual. Los animales preferiblemente por lo menos tienen un día de edad al momento de la primera administración.
[0482] La composición y/o vacuna inmunitaria contiene por dosis entre aproximadamente 104 y aproximadamente 1011, ventajosamente entre aproximadamente 105 y aproximadamente 1010 y más ventajosamente entre aproximadamente 106 y aproximadamente 109 partículas víricas de adenovirus recombinante que expresa un antígeno, epítopo o inmunógeno de PRRSV. En el caso de la composición y/o vacuna inmunitaria basada en poxvirus, una dosis puede ser de entre aproximadamente 102 ufp y aproximadamente 109 ufp. La composición y/o vacuna inmunitaria contiene por dosis entre aproximadamente 102 y aproximadamente 107, ventajosamente entre aproximadamente 103 y aproximadamente 105 ufp de poxvirus o herpesvirus recombinante que expresa el antígeno, epítopo o inmunógeno de PRRSV.
[0484] El vector vírico puede ser un vector de expresión de viruela aviar atenuado. En una forma de realización, el vector de expresión de viruela aviar puede ser un vector de viruela deGalloanserae,por ejemplo, TROVAC®. En otra forma de realización, el vector de expresión de viruela aviar puede ser un vector de viruela de canario, por ejemplo, ALVAC®. En aún otra forma de realización, se puede usar una plataforma de expresión de baculovirus. Por
[0486] ejemplo, los antígenos se pueden producir en un sistema de expresión de
[0488] baculovirus usando cultivos de células de insecto como hospedadores, y se pueden administrar los polipéptidos recombinantes resultantes a los animales. Como alternativa, se puede administrar el baculovirus recombinante completo como vacuna. Los antígenos, epítopos o inmunógenos de PRRSV son gp2, gp3 y gp4 de acuerdo con la invención. Otros virus que se pueden usar incluyen, pero sin limitación, un virus de la variolovacuna, tal como un virus atenuado de la variolovacuna, por ejemplo, NWAC, adenovirus y herpesvirus, incluyendo a CMV porcino.
[0490] La eficacia de las vacunas se puede ensayar entre aproximadamente 2 y 4 semanas después de la última inmunización mediante una provocación de los animales con una cepa virulenta de PRRSV. Se pueden usar cepas tanto homologas como heterólogas para la provocación para probar la eficacia de la vacuna. El animal se puede provocar mediante aspersión, vía intranasal, i.m., intratraqueal y/u oral. La provocación vírica puede ser con entre aproximadamente 103 y aproximadamente 109 viriones o unidades infectivas por dosis, en un volumen que depende de la vía de administración. Por ejemplo, si la administración es por aspersión, se aerosoliza una suspensión de virus para generar gotas de entre aproximadamente 1 y 200 |jm, si la administración es por vía intranasal, intratraqueal u oral, el volumen del virus de provocación es de entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 5 ml. Los animales se pueden observar diariamente durante 14 días después de la provocación para ver
[0492] signos clínicos y la mortalidad. Además, los grupos de animales se pueden
[0494] sacrificar y evaluar para ver hallazgos histopatológicos. Se pueden recoger hisopos orofaríngeos, traqueales o cloacales de todos los animales después de la provocación para la detección de virus. La presencia o ausencia de antígenos víricos en los tejidos puede evaluarse por inmunohistoquímica, aislamiento y titulación vírica, o detección de ácidos nucleicos, tal como por reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa (RT-PCR). Se pueden recoger muestras de sangre después de la provocación y se pueden analizar para ver la presencia de anticuerpos específicos del virus anti-gp2, gp3, gp4, gp5a, E de PRRSV. Como alternativa, cuando los vectores genomanipulados contienen marcadores de epítopo, se pueden usar anticuerpos específicos de marcadores para detectar la presencia y localización de los polipéptidos de vacuna recombinantes.
[0496] Una persona con experiencia en la materia ha de comprender que la divulgación del presente documento se proporciona a modo de ejemplo y que la presente invención no se limita a la misma. A partir de la divulgación en el presente documento y del conocimiento dela materia, las personas con experiencia en la materia pueden determinar el número de administraciones, la vía de administración y las dosis a usar para cada protocolo de inmunización, sin ninguna experimentación innecesaria.
[0498] Un kit para llevar a cabo un método de inducción de una respuesta inmunitaria o protectora contra PRRSV en un animal, que comprende una composición o
[0500] vacuna inmunitaria de Ad5 recombinante o una composición o vacuna
[0502] inmunitaria de PRRSV inactivado e instrucciones para llevar a cabo el método de administración en una cantidad eficaz para producir una respuesta inmunitaria en el animal se describe en el presente documento, pero no forma parte de la invención reivindicada.
[0504] A menos que se mencione específicamente de otra forma, la construcción de insertos de ácido nucleico, plásmidos y vectores víricos recombinantes se llevó a cabo usando las técnicas convencionales de biología molecular conocidas en la materia, por ejemplo, las que se describen en J. Sambrooket al.(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2o Edición, Coid Spring Harbor Laboratory, Coid Spring Harbor, Nueva York, 1989).
[0506] En particular con respecto a la elegibilidad de la materia sujeto, los vectores que se divulgan en el presente documento no dan lugar a la expresión en el animal vacunado de niveles de tipo natural de las proteínas de PRRSV. Cada expresión de un gen es conducida por elementos promotores heterólogos no nativos, y, por lo tanto, la cantidad final de cada proteína afín expresada no será equivalente a la que se produce durante una infección por PRRSV natural. Más aún, un propósito importante del sistema de expresión divulgado es producir niveles relativamente elevados de proteínas menores de la envoltura de PRRSV (nativas, modificadas o genomanipuladas), y presentar apropiadamente las proteínas menores al sistema inmunitario del animal para provocar en los animales una respuesta inmunitaria segura y protectora. Los niveles y la presentación de las proteínas menores de la envoltura de PRRSV que son típicos de la infección
[0508] por PRRSV natural no provocan una respuesta inmunitaria segura y eficaz
[0510] contra las proteínas menores de PRRSV. Por consiguiente, tanto las composiciones de vacuna divulgadas, como así también su disposición final dentro del animal vacunado, difieren significativamente en estructura y función en comparación con sus homólogos más cercanos de origen natural.
[0511] La invención se ilustra de forma adicional mediante los siguientes ejemplos no limitantes.
[0512] EJEMPLOS
[0513] Ejemplo 1 - Construcción y ensayo de plásmidos que expresan genes
[0514] de PRRSV
[0515] Con el objetivo de incrementar la visibilidad para el sistema inmunitario, las proteínas de envoltura de PRRSV se redirigieron a la superficie celular desde los compartimentos intracelulares mediante la introducción de múltiples cambios manteniendo el dominio extracelular (sitio de unión
[0516] supuesto para anticuerpo). El redireccionamiento de los genes de envoltura se intentó inicialmente mediante la eliminación de los dominios citoplasmático y transmembrana de la proteína nativa, que son un sitio probable para la señal de retención, y reemplazándolos por dominios similares de la glucoproteína del virus de la estomatitis (VSV-G), otra proteína vírica conocida, para su
[0517] expresión en la superficie celular. La secuencia señal de los genes nativos de envoltura también se reemplazó por la secuencia señal del activador de plasminógeno tisular (tPA), una proteína secretoria bien caracterizada, para promover la entrada de las proteínas modificadas a la vía secretoria y su eventual expresión en la superficie celular. También se insertaron marcadores específicos de epítopo en cada una de las proteínas redirigidas para controlar la expresión y la translocación de las proteínas dentro de la célula. Se insertaron los marcadores de epítopo Myc, Flag y HA flanqueados con secuencias enlazadoras en gp2, gp3 y gp4, respectivamente (Figuras 5A-5D).
[0518] Expresión en superficie de las proteínas redirigidas.Se sintetizó cada uno de los genes redirigidos en su totalidad, y se clonó en el plásmido de expresión con el promotor de CMV. Se transfectaron los plásmidos en células HEK 293T y se detectó su expresión en células fijadas por ensayo inmunofluorescente (IFA) (Figura 6). La expresión en superficie celular y de proteína total se detectó fácilmente en las células transfectadas tanto con gp3-Flag-VSV como con gp4-HA-VSV. Sin embargo, la expresión en las células transfectadas con gp2-Myc-VS se detectó solamente después de la permeabllización de las células, lo que indica que las modificaciones introducidas en la gp2 no fueron suficientes para redirigir la proteína a la superficie de las células. Más aún, tras la permeabilización, la tinción para gp2-Myc-VSV fue distintivamente diferente de la de las proteínas modificadas (redirigidas) gp3 o gp4. En el caso de gp2-myc-VSV, la tinción fue más focal e intensa, mientras que para gp3-Flag-VSV y gp4-HA-VSV fue más difusa a lo largo de la célula. Esto indicó que la proteína gp2-VSV-Myc se expresó, pero que podría haberse plegado inapropiadamente, quedando atrapada en algún compartimento subcelular. Puede haber varias razones
[0519] para la incapacidad de la gp2 modificada para plegarse apropiadamente.
[0520] Primero, esto puede ser debido a un requerimiento de otras partes de la proteina para un plegamiento apropiado, tal como la secuencia señal, la cola transmembrana o citoplasmatica que se eliminaron en el proceso de modificación para expresión superficial. Segundo, también puede deberse a una eliminación incompleta de los dominios de gp2, la que aún contiene alguna señal de retención. Tercero, este mal plegamiento podría haberse inducido debido a la presencia del marcador myc, que no está presente en la gp3 o la gp4 modificada. Cuarto, se ha demostrado que la falta de expresión de una de las proteínas menores interrumpe la incorporación de todas las proteínas menores al virión; por lo tanto, gp2 podría requerir la presencia de gp3 y de gp4 para conseguir un plegamiento apropiado.
[0521] Las proteínas redirigidas interaccionan para formar oligómeros.La interacción entre las proteínas menores se ha investigado mediante un ensayo funcional y se ha demostrado directamente mediante un ensayo bioquímico. Los plásmidos que codifican cada una de las proteínas redirigidas se cotransfectaron a células HEK-293T y la interacción entre las proteínas menores se ensayó mediante ensayo de coinmunoprecipitación (Co-IP). Como se muestra en la Figura 7, el anticuerpo anti-HA extrae específicamente a gp4-HA-VSV (carril 3) pero no a gp3-flag-VSV (carril 2) o a gp2-myc-VSV (carril 1). Sin embargo, cuando se cotransfectaron todas las proteínas modificadas, el mismo anticuerpo anti-HA extrajo una banda proteica adicional distinta a gp4-HA-VSV (carril 4, marca roja), lo que indica que la proteína adicional tiene interacción directa con gp4-HA-VSV, pero no
[0522] con el anticuerpo anti-HA. El tamaño de esta banda es similar a gp2-Myc- VSV (carril 6) o a gp3-Flag-VSV (carril 7), lo que indica que esta proteína que interacciona con gp4 puede ser gp2, gp3 o ambas. Una sonda subsiguiente de la banda adicional en la co-IP (carril 4) con anticuerpo anti-Flag o anti-Myc fue positiva para ambos (no mostrado), lo que indica que esta banda contiene tanto gp2 como la proteína gp3. Por lo tanto, la conclusión a partir de este y de otros experimentos es que las modificaciones que se introdujeron para la expresión superficial de las gp no alteraron su estructura cuaternaria.
[0524] Las proteínas redirigidas mantienen la interacción con el receptor CD163 después de su modificación.El siguiente paso para asegurar el plegamiento apropiado de las proteínas redirigidas fue mostrar que las mismas aún mantienen su capacidad para interaccionar con el receptor, CD163 porcino. Se cotransfectó cada uno de los plásmidos que expresan las proteínas redirigidas con el plásmido que expresa CD163 (dominios 4-9), previamente mostrado como suficiente para mediar la entrada de virus a las células diana. Se inmunoprecipitó una porción del lisado celular con anticuerpo anti-VSV (específico para las proteínas de envoltura) y la otra porción se inmunoprecipitó con anticuerpo anti-CD163. El lisado precipitado con anticuerpo anti-CD163 se investigó con anticuerpo anti-CD163 conjugado con biotina para controlar la entrada de CD163 en cada reacción de co-IP (Figura 8C). El lisado inmunoprecipitado con anti-VSV se ejecutó por duplicado y se investigó una membrana con anti-VSV-HRP (Figura 8A), para
[0526] medir la cantidad de gp modificada, y la otra membrana se investigó con anti-
[0527] CD163 (Figura 8B) para medir la cantidad de CD163 coinmunoprecipitado con las glucoproteínas de envoltura modificadas.
[0529] Todas las glucoproteínas menores de envoltura modificadas interaccionaron con CD163, mientras que la gp5 modificada, una glucoproteína mayor usada como control negativo, tuvo una interacción mucho más débil o indétectable con CD163.
[0531] Ejemplo 2 - Vacunación de animales con plásmidos que expresan genes de envoltura de PRRSV agrupados
[0533] Se dividieron treinta y dos cerdos de 3 semanas en 4 grupos, de 8 animales cada uno (Tabla 2).
[0535] Tabla 2. Detalles del estudio.
[0537]
[0540] El grupo de tipo silvestre recibió un agrupamiento de 3 plásmidos que
[0542] expresan las gp no redirigidas, el grupo recombinante recibió un agrupamiento de los tres plásmidos que expresan las gp redirigidas (es decir, Figuras 5B a 5D), el grupo simulado recibió plásmido que codifica la glucoproteína de virus de la rabia, mientras que el grupo sin vacunar recibió solo tampón Tris-EDTA. Cada plásmido estuvo a una concentración de aproximadamente 1 |jg/|jl, y se administraron aproximadamente 400 |jg de cada plásmido a 200 jil por cada lóbulo auditivo. Después de 4 inmunizaciones, se dividió adicionalmente cada grupo y se reforzó con vacuna inactivada, en adyuvante TS6 (US 7.371.395 B2, de Merial), o bien recibió una 5.a ronda de inmunización con ADN.
[0543] Mientras que pareció haber una tendencia hacia una mayor protección contra las lesiones pulmonares en los animales vacunados con cualquiera de los plásmidos agrupados, en comparación con los grupos con G de virus de la rabia o sin vacunar, la media entre todos los grupos no fue estadísticamente diferente. Tampoco hubo diferencia significativa entre los grupos que recibieron plásmidos dirigidos frente a los redirigidos.
[0544] Por lo tanto, luego los Solicitantes decidieron poner todos los genes dentro de un vector individual, para permitir la expresión simultanea dentro de una célula individual, para facilitar la interacción/oligomerización de las proteínas de envoltura de PRRSV.
[0545] Ejemplo 3 - Construcción y ensayo de vectores víricos que expresan
[0546] los genes de PRRSV
[0547] Células y medios. Las células HEK 293 (ATCC) se mantuvieron en MEM (Gibco n.° 11095) con el 10%de suero fetal bovino (Moregate Lote n.° 81827101) a 37 °C en CO<2>al 5 %. Estas células se usaron para rescatar el adenovirus recombinante (vAD3041, VAD3042, vAD3038, vAD3033, y vAD3067) y elaborar soluciones madres de virus.
[0548] Construcción de vectores víricos e inmunógenos.Las proteínas menores de la envoltura de PRRSV incluyen a gp2 (ORF2), gp3 (ORF3), gp4 (ORF4) y E (ORF2b). La secuencia de ADN de cada una de estas proteínas se obtuvo de GenBank n.° de registro U87392 (VR2332, PRRSV de tipo II). El VR2332 (cepa norteamericana) representa uno de los dos serotipos principales conocidos de PRRSV (Doneet al.,1996). El otro, prototipo Lelystad, es representativo de por lo menos la mayor parte de las cepas que se han aislado en Europa occidental. Se construyó la secuencia optimizada por codones de cada proteína con un promotor apropiado para expresar todas las proteínas a partir de un vector vírico individual (Figura 1). En cada caso, los promotores de SV40 (virus 40 de simio) y OMV (Citomegalovirus) conducen la expresión de gp2 y gp4, respectivamente, en direcciones opuestas, según se indica mediante flechas. Se prevé que estos promotores puedan intercambiarse, de forma que SV40 pueda conducir la expresión de gp4 y OMV pueda conducir la expresión de gp2. Dichas variaciones han de ser obvias para las personas con experiencia en la materia. De manera importante, debido al rol fundamental divulgado que tienen las proteínas menores de PRRSV para provocar una respuesta inmunitaria segura y protectora, los
[0549] Solicitantes están convencidos de que las siguientes estrategias se aplicará equivalentemente bien a todas las cepas de PRRSV. Por consiguiente, se pueden preparar versiones optimizadas por codones de las proteínas menores de Lelystad mediante métodos de rutina, y se pueden clonar las secuencias resultantes en los vectores recombinantes de la presente divulgación.
[0550] En todas las construcciones de Ad5 PRRSV, la expresión de la glucoproteína menor de envoltura gp3 está promovida por un Sitio de Entrada Ribosomal Interno (IRES). La expresión de la glucoproteína menor de envoltura E en VAD3041 y VAD3067 (Figuras 1C y 1D) está permitida por la presencia del
[0551] péptido autoescindible (p2A), situado en las construcciones de Ad5 inmediatamente después de la región codificante de gp2.
[0552] Además, la semivida de los transcriptos a partir de los promotores de SV40 y CMV se potencia por la adición de colas de poli A (pA) de SV40 o de timidina cinasa (TK). Se usaron los sitios attL1 y attL2 (lejos hacia izquierda
[0553] y derecha de cada inserto mostrado en la Figura 1) para insertar los fragmentos sintéticos completos en el genoma adenovírico por recombinación LR, Gateway Technology (Invitrogen) (creando así VAD3042, VAD3038, vAD3041 y vAD3067). Los insertos de la Figura 1 se sintetizaron químicamente (Genscript) para contener los sitios de restricción apropiados para clonar en el clon de expresión para generar el Ad5 recombinante (Gateway Technology, Invitrogen). Una vez más, se contemplan variaciones con respecto al elemento que promueve la expresión de cada gen particular
[0554] de PRRSV, y todas están bien dentro del alcance de las personas con experiencia en la materia ante la lectura de esta divulgación.
[0555] Por consiguiente, se ensamblaron múltiples combinaciones de proteínas menores para su recombinación en el vector Ad5: una conteniendo solo tres
[0556] de las proteínas menores sin E (vAD3042) (Figura 1A; SEQ ID NO: 2); una conteniendo las proteínasrtg-gp2, rtggp3, rtg-gp4sin E (vAD3038) (Figura 1B; SEQ ID NO: 3); una conteniendo las cuatro proteínas menores gp2, gp3, gp4 y E (vAD3041) optimizadas por codones (Figura 1C; SEQ ID NO: 3); y una conteniendo las cuatro proteínas menoresrtg-gp2, rtg-gp3, rtg-gp4y E (vAD3067) optimizadas por codones (Figura 1D; SEQ ID NO: 4).
[0557] Tabla 3. Localizaciones de las características dentro de las construcciones
[0558]
[0559]
[0560]
[0562] Producción de virus.Se generaron los clones de expresión por recombinación LR de vector de entrada con vector de destino usando la tecnología Gateway (Invitrogen). Los adenovirus recombinantes vAD3041, vAD3042 y vAD3038 se generaron por transfección de los clones de
[0563] expresión linealizados en células HEK 293 con reactivo de transfección.
[0564] Después del rescate, se recogió cada virus por ciclo de congelación y descongelación y separación de los desechos celulares por centrifugación. Para su pasaje, se inoculó cada virus en una monocapa de células HEK 293 y aproximadamente entre 3 y 4 días después de la infección, se recogió el virus con ciclo de congelación y descongelación y separación por centrifugación. Se hicieron tres pasajes para elaborar el virus simulado, que se almacenó a -80 °C. Como control negativo, se ensambló el gen de hemaglutinina (HA) optimizado por codones del Virus de Influenza Porcina (SIV) de forma similar a los vectores víricos de Ad5 (vAD3033).
[0565] Título vírico.Se colocaron en placas células HEK 293 a una densidad de 7 * 105 células por placa en tres placas de 96 pocillos con medio m Em (Gibco #11095) que contenía FBS al 2 % (Moregate Lote n.° 81827101), aminoácidos no esenciales (Gibco n.° 11140), antibióticos y antimicóticos (Gibco n.° 15240). En el día de la infección, se infectó cada placa con 100 |jl por pocillo de virus diluido entre 10-3 y 10-10. Los títulos víricos se leyeron en el día 10 después de la infección y se usó el promedio de tres placas para el cálculo del título. El título de la solución madre de pasaje 3 de VAD3041 P.3 fue 10903 TCID<50>por ml, y el de VAD3042 P.3 fue 108,90 TCID<50>por ml. El título de la solución madre de pasaje 3 de vAD3038 P.3 fue 10993 TCID<50>por ml, y el de otro lote de VAD3042 P.3 fue 10997 TCID<50>por ml.;[0566] Se extrajo ADN vírico de cada solución madre de virus y se amplificó con los cebadores pAd directo (5'-GAC TTT GAC CGT TTA CGT GGA GAC-3');[0567] (SEQ ID NO: 26) y pAd inverso (5'-CCT TAA GCC ACG CCC ACA CAT;[0568] TTC-3') (SEQ ID NO: 27) usando la Platinum PCR Supermix High Fidelity (Invitrogen #12532) según las indicaciones. Los amplicones de PCR tuvieron el mismo tamaño al esperado: por ejemplo, 4709 pb para VAD3041; 4408 pb para vAD3042 (Figura 4). Las secuencias nucleotídicas de los amplicones de PCR de cada adenovirus recombinante fueron idénticas a las construcciones de los vectores de entrada (descritos en la Figura 1), y no hubo cambios en la secuencia nucleotídica de los casetes transgénicos (genes PRRSV y promotor y colas poli A).;[0569] Expresión de proteínas menores de la envoltura redirigidas a partir de;[0570] 10adenovirus recombinante.La expresión simultánea de cada una de las proteínas modificadas de envoltura a partir del adenovirus recombinante dentro de una célula individual se confirmó mediante el uso de ensayo de inmunofluorescencia dual. El vAD3038 recombinante se usó para infectar una monocapa confluente de HEK293 a una MOI alta y se fijaron las células;[0571] después de 48 horas, y se visualizaron por IFA para ver la expresión de los antígenos recombinantes. Se demostró que todas las proteínas se expresaron bien incluido en la superficie celular (Figuras 9A y 9B).;[0572] De manera importante, la expresión de gp2, que fue defectuosa cuando se la expresó sola, mostrada más tempranamente como una expresión intracelular;[0573] focal intensa sin expresión superficial detectable, mejoró con una expresión intracelular difusa y una expresión en superficie celular distintiva (Figura 9C). Esto indicó que el plegamiento y transporte apropiado de la gp2 modificada podría depender de la coexpresión de gp3 y/o gp4. Este resultado sugiere;[0574] que la formación del epítopo neutralizante requiere la formación de una estructura de orden mayor mediante la interacción de las proteínas menores.;[0575] Ejemplo 4 - Ensayo clínico para probar la seguridad y eficacia de las vacunas de Ad5 PRRSVSe dividieron al azar sesenta (60) cerdos en 4 grupos, cada uno conteniendo 15 animales (Tabla 3). El Grupo 1 recibió vAD3038, que expresa solo gp2, gp3 y gp3, mientras que el Grupo 2 recibió vAD3041, que además expresa E. El Grupo 3 recibió VAD3042, que expresa las gp2, gp3 and gp4 redirigidas y el Grupo 4 recibió vAD3033 que expresa HA de SIV (control;[0576] negativo). Los Grupos que recibieron las vacunas adenovíricas se primovacunaron mediante la administración de 1 ml de la preparación en cada fosa nasal, en total 2 ml, aproximadamente a una concentración de 108­ 9 TCID50/ml. Estos grupos se reforzaron después de 21 días con la misma preparación administrada por vía intramuscular. Después de 42 días del inicio del experimento, se;[0577] provocaron todos los animales con PRRSV cepa NADC20 por vía intranasal. Todos los animales se sacrificaron 2 semanas después de la provocación y se examinaron para ver lesiones en pulmón, y se recogieron muestras para el análisis el título vírico en tejidos y suero, según se indica en la Figura 9.;[0578] Tabla 3. Esquema de ensayos de vacunación;[0581] ;[0583] En general, los datos demuestran que mientras que la vacunación con un vector individual que codifica las proteínas menores de la envoltura gp2, gp3 y gp4 (vAD3042) no confiere ninguna ventaja significativa en;[0584] comparación con el control negativo, la adición de la proteína menor E (vAD3041) produce una diferencia significativa en la protección contra las lesiones pulmonares a partir de una provocación con PRRSV. Más aún, el redireccionamiento de las proteínas menores (vAD3038) también produce una diferencia significativa (Figura 11). Por consiguiente, los datos y resultados que se divulgan en el presente documento apoyan un modelo aplicable en forma general, en donde se proporciona protección contra una provocación con PRRSV mediante los anticuerpos dirigidos contra una cualquiera de las proteínas de superficie (por ejemplo, gp2), o la estructura oligomérica de la superficie formada y presentada por la;[0585] estructura/disposición terciaria/cuaternaria de las proteínas. Como tal, estos anticuerpos protectores funcionan, por lo menos en parte, mediante el bloqueo de la infección por PRRSV interfiriendo con la unión de las proteínas víricas al o a los receptores celulares.;[0586] Antes de esta divulgación, la interacción de la proteína E con el resto de las proteínas menores u otras proteínas en el virión no se conocía como un requisito previo para la producción de inmunidad protectora. El presente ensayo de vacunación, por lo tanto, ha relevado un sorprendente e inesperado;[0587] rol de la proteína menor E, ya sea sola o en combinación con una o más de gp2, gp3 y gp4, para provocar en animales porcinos una protección significativamente superior contra la provocación con PRRSV virulento.;[0588] Los Solicitantes prevén, por ejemplo, que un epítopo neutralizante se puede, por ejemplo, localizar directamente en la proteína E, o que se puede inducir por una cualquiera o por una combinación de proteínas menores en presencia de la proteína E. En vista de las referencias dela técnica anterior, este hallazgo es enteramente inesperado y sorprendente. Por consiguiente, este descubrimiento casual no solo identificó una composición antigénica protectora contra PRRSV, que sirve como base para el desarrollo de vacunas libres de PRRSV vivos, sino que también abre nuevas áreas de investigación sobre el PRRSV para dilucidar las interacciones proteínaproteína / virus-receptor celular.;[0589] En vista de los datos y resultados, los Solicitantes prevén que otras combinaciones de E proteína menor (por ejemplo E gp2; E gp2 gp3; E gp2 gp4; y similares) similarmente superarán el problema de presentar un "epítopo neutralizante" (definido en el presente documento como un epítopo que es capaz de provocar en un animal una respuesta inmunitaria protectora, incluyendo la producción de anticuerpos neutralizantes de virus) al sistema inmunitario de un animal. Más aún, los resultados indican que el redireccionamiento de las proteínas menores de PRRSV provoca una inmunidad similar sorprendentemente segura y protectora.;[0590] Los Solicitantes han revelado así dos estrategias importantes, incluso;[0591] relacionadas, para superar la incapacidad de las gp2, gp3, y gp4 expresadas separadamente para presentar un epítopo neutralizante de virus al sistema inmunitario de un animal hospedador, y provocar una respuesta inmunitaria protectora contra la provocación con PRRSV virulento.;[0592] Más aún, esta solicitud divulga, por primera vez, que la inmunogenicidad de las proteínas menores de envoltura de PRRSV se puede potenciar suficientemente para producir respuestas inmunitarias protectoras. Estas estrategias de la invención se prevé que tienen una amplia aplicabilidad para otros virus, en particular cuando la localización celular tiene un rol en la prevención a la presentación de los epítopos neutralizantes de virus al sistema inmunitario del hospedador.;[0593] Ejemplo 4 - Ensayo clínico para probar la seguridad y eficacia de las vacunas de Ad5 PRRSVSe llevó a cabo otro estudio usando los métodos que se divulgaron en el Ejemplo 3, y la Tabla 4 proporciona un resumen. Los vectores adenovíricos tuvieron insertos de acuerdo a lo siguiente:VAD3038(Gp234-Rdir);VAD3067(Gp234-Rdir+E-opt);VAD3064(M-gp5-gp5a-Rdir);vAD3041(Gp234E);VAD3069(Np-M-gp5-gp5a);VAD3046(SIV-HA).;[0594] Tabla 4. Esquema de ensayo de vacunación (i.m.=intramuscular;;[0595] i.n.=intranasal);[0597] ;[0599] Resumen. Los datos demostraron que las proteínas menores de la envoltura de PRRSV redirigidas expresadas por vector reforzadas con vacuna inactivada disminuyeron la carga vírica sérica en los cerdos y que produjeron;[0600] una protección significativa de las lesiones pulmonares (Figuras 18 y 19). Estos datos no podrían haberse previsto antes de este estudio, incluso en vista de los datos que se presentaron en el Ejemplo 3. Ahora que se ha llevado a cabo este estudio, los Solicitantes prevén que la sorprendente protección de lesiones pulmonares y la reducción de la carga vírica sérica;[0601] pueden ser atribuibles a un fuerte efecto de primovacunación de las proteínas menores de la envoltura redirigidas (Figura 20). También fue impredecible el hallazgo de que la adición de E a las proteínas menores redirigidas de la envoltura no mostró una protección significativa contra las lesiones pulmonares (Figuras 21 y 22), contrariamente al resultado opuesto divulgado;[0602] en el Ejemplo 3 (es decir, la administración de la adenoconstrucción;[0603] que contiene las proteínas menores de la envoltura E+Ts redujo significativamente las lesiones pulmonares). En vista de los datos de interacción que se muestran en las Figuras 23 y 24, los Solicitantes prevén que pérdida de predicción de las lesiones pulmonares podría estar provocada por interacción negativa de la E de tipo silvestre con las proteínas menores de la envoltura redirigidas (es decir, debido a los dominios TM y CT alterados, presentes en las proteínas redirigidas). *

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES
1. Una composición inmunitaria o de vacuna segura y eficaz que comprende:
a. uno o más vectores víricos recombinantes, que comprenden uno o más polinucleótidos heterólogos, que codifican (i) el polipéptido o ectodominio gp2 del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV); (ii) el polipéptido o ectodominio gp3 de PRRSV; y (iii) el polipéptido o ectodominio gp4 de PRRSV; y
b. un transportador farmacéutica o veterinariamente aceptable;
en donde el uno o más vectores comprenden un vector adenovirus 5 de PRRSV (Ad5-PRRSV) recombinante, un vector de baculovirus de PRRSV recombinante, un vector de citomegalovirus de PRRSV porcino recombinante o un vector de poxvirus de PRRSV recombinante; en donde, además, el uno o más vectores comprenden:una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido o ectodominio gp2 de PRRSV redirigido y un polipéptido o ectodominio gp3 de PRRSV redirigido y un polipéptido o ectodominio gp4 de PRRSV redirigido, en el que una secuencia de localización celular existente del correspondiente
polipéptido o ectodominio de gp2 de PRRSV de tipo silvestre y polipéptido o ectodominio gp3 de PRRSV de tipo silvestre y polipéptido o ectodominio gp4 de PRRSV de tipo silvestre se ha reemplazado por una secuencia determinante de expresión de superficie celular de un gen heterólogo.
2. La composición de la reivindicación 1, en donde el o los vectores recombinantes comprenden un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene:
a. por lo menos un 90 % de identidad de secuencia con una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 14,16 o 18; o
b. por lo menos un 90 % de identidad de secuencia con una secuencia de ectodominio como se indica en una subsecuencia de la SEQ ID NO: 14, 16 o 18 .
3. La composición de la reivindicación 1, en donde el vector de PRRSV recombinante es un vector Ad5-PRRSV, que comprende un polinucleótido que tiene:
a. por lo menos un 90 % de identidad de secuencia con una secuencia
como se indica en la SEQ ID NO: 13, 15 o 17; o
b. por lo menos un 90 % de identidad de secuencia con una subsecuencia de la SEQ ID NO:
13, 15 o 17 que codifica una secuencia de ectodominio.
4. Un vector adenovirus 5 de PRRSV (Ad5-PRRSV) recombinante, un vector de baculovirus de PRRSV recombinante, un vector de citomegalovirus porcino de PRRSV recombinante o un vector de poxvirus de PRRSV recombinante;
en donde el vector comprende una o más secuencias nucleotídicas que codifican un polipéptido o ectodominio gp2 de PRRSV redirigido y un polipéptido o ectodominio gp3 de PRRSV redirigido y un polipéptido o ectodominio gp4 de PRRSV redirigido, en el que una secuencia de localización celular existente del correspondiente polipéptido o ectodominio gp2 de PRRSV de tipo silvestre y polipéptido o ectodominio gp3 de PRRSV de tipo silvestre y polipéptido o ectodominio gp4 de PRRSV de tipo silvestre se ha reemplazado por una secuencia determinante de expresión de superficie celular de un gen heterólogo.
5. El vector Ad5-PRRSV recombinante de la reivindicación 4 que comprende, consiste esencialmente en o consiste en uno o más
uno o más polinucleótidos que codifican un polipéptido o ectodominio gp2 de PRRSV y un polipéptido o ectodominio gp3 de PRRSV y un polipéptido o ectodominio gp4 de PRRSV; en donde, además, el uno o más polinucleótidos codifica(n) uno o más polipéptido(s) o ectodominio(s) que tienen:
a. por lo menos un 90 % de identidad de secuencia con una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 14, 16 o 18 ; o
b. por lo menos un 90 % de identidad de secuencia con una secuencia de ectodominio
como se indica en una subsecuencia de la SEQ ID NO: 14, 16 o 18 .
6. El vector Ad5-PRRSV recombinante de la reivindicación 4 o la reivindicación 5 que comprende, consiste esencialmente en o consiste en uno o más polinucleótidos que codifican un polipéptido o ectodominio gp2 de PRRSV y un polipéptido o ectodominio gp3 de PRRSV y un polipéptido o ectodominio gp4 de PRRSV; en donde, además, el uno o más polinucleótidos tienen:
a. por lo menos un 90 % de identidad de secuencia con una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 13, 15 o 17; o
b. por lo menos un 90 % de identidad de secuencia con una subsecuencia de la SEQ ID NO: 13, 15 o 17 que codifica una secuencia de ectodominio.
7. El vector Ad5-PRRSV recombinante de la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en donde el vector Ad5-PRRSV comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido o ectodominio gp2 de PRRSV redirigido, un polipéptido o ectodominio gp3 de PRRSV redirigido y un polipéptido o ectodominio gp4 de PRRSV redirigido que tienen:
a. por lo menos un 90 % de identidad de secuencia con una secuencia como se indica en la SEQ ID NO: 14, 16 y 18; o
b. por lo menos un 90 % de identidad de secuencia con una secuencia de ectodominio como se indica en una subsecuencia de la SEQ ID NO: 14, 16 y 18.
8. La composición de la reivindicación 1 el vector Ad5-PRRSV recombinante de la reivindicación 4 para su uso en un método para provocar una respuesta inmunitaria protectora en un animal contra el PRRSV que comprende administrar al animal la composición o vector Ad5-PRRSV recombinante y un transportador, adyuvante, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable.
9. La composición o vector Ad5-PRRSV recombinante para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la administración se realiza por vía oro-nasal, aspersión, agua de bebida, administración intramuscular, subcutánea, intradérmica o transdérmica.
10. La composición o vector Ad5-PRRSV recombinante para su uso de acuerdo con la reivindicación 8 o reivindicación 9, en donde la administración es una primovacunación y refuerzo.
11. La composición o vector Ad5-PRRSV recombinante para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la primera vacunación es una mezcla de dos vectores Ad5, siendo el primer vector Ad5 el vector Ad5 de PRRSV recombinante que expresa las proteínas menores de PRRSV redirigidas y el segundo vector Ad5 expresa las proteínas mayores de PRRSV; opcionalmente, en donde el refuerzo comprende o consiste en los dos vectores de la primera vacunación o un vector solo.
12. La composición o vector Ad5-PRRSV recombinante para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en donde el animal es un cerdo.
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