ES3052837T3

ES3052837T3 - Humanized anti-tau(ps422) antibodies and methods of use

Info

Publication number: ES3052837T3
Application number: ES20175658T
Authority: ES
Inventors: Kevin Brady; Stefan Dengl; Thomas Emrich; Guy Georges; Ulrich Goepfert; Fiona Grueninger; Adrian Hugenmatter; Anton Jochner; Hubert Kettenberger; Joerg Moelleken; Ekkehard Moessner; Michael Molhoj; Olaf Mundigl; Jens Niewoehner; Tilman Schlothauer
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2015-06-24
Filing date: 2016-06-22
Publication date: 2026-01-15
Anticipated expiration: 2036-06-22
Also published as: US20210139571A1; EP3744732A1; HK1251582A1; US9862763B2; JP2018520133A; PL3313877T3; TW201708254A; US20160376352A1; JP7257482B2; WO2016207245A1; JP6965328B2; JP6619460B2; JP2020037580A; EP3744732C0; US11572404B2; US12297263B2; EP3313877A1; US10822402B2; EP3744732B1; EP3313877B1

Abstract

La invención proporciona anticuerpos anti-Tau(pS422) humanos humanizados y métodos para utilizarlos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Anticuerpos anti-tau(ps422) humanizados y procedimientos de uso

[0003] Campo de la invención

[0004] La presente invención se refiere a anticuerpos anti-tau(pS422) humanizados que se unen específicamente al fragmento de tau fosforilada de SEQ ID NO: 03 y a su uso para el tratamiento de enfermedades cerebrales.Antecedentes

[0005] La tau humana (proteína tau asociada a los microtúbulos (proteína de ovillos neurofibrilares, filamento helicoidal emparejado-tau, PHF-tau)) es una proteína asociada a los microtúbulos neuronales encontrada predominantemente en los axones y funciona para promover la polimerización de la tubulina y para estabilizar los microtúbulos. Ocho isoformas (isoforma A, B, C, D, E, F, G, tau fetal) se encuentran en el cerebro humano, comprendiendo la isoforma más larga 441 aminoácidos (isoforma F, Uniprot P10636-8). La tau y sus propiedades también se describen por Reynolds, C.H.,et al., J. Neurochem.69 (1997) 191-198.

[0006] Tau, en su forma hiperfosforilada, es el componente principal de los filamentos helicoidales emparejados (PHF), el componente básico de las lesiones neurofibrilares en el cerebro afectado por la enfermedad de Alzheimer (EA). Tau se puede fosforilar en sus residuos de serina o treonina por varias cinasas diferentes, incluyendo GSK3beta, cdk5, MARK y miembros de la familia de MAP cinasas.

[0007] Las taupatías se caracterizan por una hiperfosforilación anómala de tau y son, de acuerdo con Iqbal, K.,et al. (Biochim. Biophys. Acta 1739 (2005) 198-210):

[0008] ● Enfermedad de Alzheimer, incluyendo la forma de la enfermedad con solo ovillos

[0009] ● Síndrome de Down, casos en adultos

[0010] ● Complejo parkinsonismo-demencia de Guam

[0011] ● Demencia pugilística

[0012] ● Demencia presenil de tipo Pick

[0013] ● Demencia con granos argirófilos

[0014] ● Demencia frontotemporal

[0015] ● Degeneración corticobasal

[0016] ● Degeneración palidopontonígrica

[0017] ● Parálisis supranuclear progresiva

[0018] ● Enfermedad de Gerstmann-Sträussler-Scheinker con ovillos.

[0019] Hasta ahora, se han encontrado cerca de 40 sitios de fosforilación de serina (S)/treonina (T) en la tau de cerebros afectados por la enfermedad de Alzheimer (Hanger, D.P.,et al., J. Biol. Chem. 282 (2007) 23645-23654). La aparición de la afección por tau en la enfermedad de Alzheimer se relaciona con su estado de fosforilación. Sin embargo, la mayoría de los 40 sitios de fosforilación no se asocian a la histopatología de la enfermedad, puesto que también se encuentran en la tau extraída de tejido cerebral fetal sano. Solo algunas fosforilaciones son exclusivas de la enfermedad y son presumiblemente responsables de la agregación anómala y la insolubilidad característica que definen a la tau en los PHF del cerebro afectado por la enfermedad de Alzheimer (Morishima-Kawashima, M.,et al., J. Biol. Chem.270 (1995) 823-829). De acuerdo con Pei, J.J.,et al. (J. Alzheimer's Disease 14 (2008) 385-392), la literatura existente proporciona información limitada y poco clara sobre los sitios que son específicos de cerebros afectados por EA. Pei usó una lista de anticuerpos específicos fosforilados contra para tau y midió sus niveles en homogeneizados de la corteza temporal medial de 22 pacientes con EA y 10 controles.

[0020] Bussiere, T.,et al. (Acta Neuropathol. 97 (1999) 221-230) describieron que la serina 422 fosforilada (pS422) en proteínas tau es un epítopo patológico encontrado en varias enfermedades con degeneración neurofibrilar. Augustinack, J.C.,et al., (Acta Neuropathol.103 (2002) 26-35) describieron la pS422 como correlacionada con la gravedad de la histopatología neuronal en la enfermedad de Alzheimer. Guillozet-Bongaarts, A., (J. Neurochem.

[0021] 97 (2006) 1005-1014) describió la fosforilación de tau en la serina 422 como parte del proceso de maduración de los PHF. La tau pS422 también se encuentra en asociación con la aparición de afecciones en diversos modelos de ratones transgénicos de la enfermedad de Alzheimer. Por tanto, Deters, N.,et al., mencionaron en Biochem. Biophys. Res. Commun. 379 (2009) 400-405 que ratones doblemente transgénicos Dom5/pR5 mostraron que un número 7 veces mayor de neuronas del hipocampo que contienen tau fosforilaron específicamente el epítopo S422 patológico. Goetz, J.,et al., (Science 293 (2001) 1491-1495) informaron de la aparición de tau fosforilada en S422 en los cerebros de ratones transgénicos con tau P301L a los que se inyectaron fibrillas Abeta42.

[0022] El documento EP 2009104 se refiere a epítopos de la proteína tau que se producen en un estado fosforilado en la proteína tau de los PHF de la enfermedad de Alzheimer y al uso de dichos epítopos para la generación de anticuerpos que detectan específicamente la proteína tau de la enfermedad de Alzheimer. Los documentos WO 2002/062851 y US 7.446.180 se refieren a anticuerpos con una especificidad por una forma truncada de forma anómala de la proteína tau y aspectos diagnósticos y terapéuticos en relación con la enfermedad de Alzheimer y las taupatías relacionadas.

[0023] El documento WO 1998/22120 se refiere a un procedimiento para tratar a un paciente con enfermedad de Alzheimer, que comprende la etapa de administrar al paciente un anticuerpo contra el fragmento de tau fosforilada de los aminoácidos de aproximadamente 207 a aproximadamente 222, los aminoácidos de aproximadamente 224 a aproximadamente 240 y los aminoácidos de aproximadamente 390 a aproximadamente 408. Los estudios en animales donde se usa el fragmento de tau fosforilada 379-408 [P-Ser396, 404] para vacunar a ratones transgénicos para tau se mencionan en Asuni, A.A.et al., J. Neuroscience 27 (2007) 9115-9129. El documento US 2008/0050383 se refiere a procedimientos de tratamiento y prevención de la enfermedad de Alzheimer u otras taupatías en un sujeto administrando un fragmento de proteína tau.

[0024] Hasegawa, M.,et al. (FEBS Lett. 384 (1996) 25-30) informan de un anticuerpo monoclonal (AP422) específico para fosfoserina 422 en la proteína tau asociada a microtúbulos.

[0025] En el documento WO 2001/55725 se informa de un anticuerpo que reconoce específicamente tau y de un anticuerpo que reconoce específicamente tau fosforilada (181) para su uso en un procedimiento para el diagnósticoin vivode una taupatía y/o para el diagnóstico diferencialin vivode una taupatía frente a una enfermedad que no sea una taupatía.

[0026] En el documento WO 2002/027017 se informa de un anticuerpo preparado a partir de un inmunógeno polipeptídico que tiene una serina fosforilada. El documento WO 2002/062851 se refiere a anticuerpos con una especificidad por una forma truncada de forma anómala de la proteína tau y aspectos diagnósticos y terapéuticos en relación con la enfermedad de Alzheimer y las taupatías relacionadas.

[0027] En el documento WO 2004/016655 se informa de un anticuerpo específico contra una proteína tau del sistema nervioso central (SNC), en el que el anticuerpo reconoce específicamente una proteína tau del SNC pero no una proteína tau periférica y en el que el anticuerpo reconoce específicamente una secuencia de aminoácidos de una porción conectiva entre la secuencia de aminoácidos codificada por el exón 4 de un gen que codifica una proteína tau y la secuencia de aminoácidos codificada por el exón 5 de la misma como un epítopo.

[0028] Anticuerpos monoclonales contra tau pS422 se describen, por ejemplo, en el documento EP 1876185. Están disponibles comercialmente anticuerpos policlonales contra tau pS422 (por ejemplo, ProSci Inc. y Biosource International).

[0029] En el documento WO 2006/055178 se informa de un procedimiento para inhibir la fosforilación de la proteína tau en Ser202/Thr205, que comprende poner en contacto una muestra que contiene una proteína tau con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une a ligandos difusibles derivados de la amiloide β inhibiendo de este modo la fosforilación de la proteína tau en Ser202/Thr205.

[0030] En el documento WO 2007/019273 se informa de una preparación de anticuerpo que se une específicamente a tau fosforilada en Tyr394 y/o Tyr310. Los estudios en animales donde se usa el fragmento de tau fosforilada 379-408 [P-Ser396,404] para vacunar a ratones transgénicos para tau se mencionan en Asuni, A. A.et al., J. Neuroscience 27 (2007) 9115-9129.

[0031] El documento EP 2009104 se refiere a epítopos de la proteína tau que se producen en un estado fosforilado en la proteína tau de los PHF de la enfermedad de Alzheimer y al uso de dichos epítopos para la generación de anticuerpos que detectan específicamente la proteína tau de la enfermedad de Alzheimer.

[0032] El documento US 2008/0050383 se refiere a procedimientos de tratamiento y prevención de la enfermedad de Alzheimer u otras taupatías en un sujeto administrando un fragmento de proteína tau.

[0033] En el documento WO 2010/037135, se informa de un polipéptido o péptido aislado, sintético o recombinante que comprende un primer dominio que comprende, o que consiste en, un ligando para un receptor de la barrera hematoencefálica (BHE) o equivalente y un segundo dominio que comprende, o que consiste en, una enzima o composición que disminuye la tasa de agregación de un agregado de proteína, inhibe la formación de un agregado de proteína, o invierte, digiere o disuelve un agregado de proteína. En el documento WO 2010/115843 se informa de un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o partes funcionales del mismo, que puede reconocer y unirse a una proteína tauin vitroy/oin vivo.

[0034] En el documento WO 2011/026031 se informa de un anticuerpo monoclonal o su fragmento que se une específicamente a oligómeros de tau y no se une a tau soluble o fibrillas de tau, útil para tratar una taupatía, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, parálisis supranuclear progresiva y degeneración corticobasal. En el documento WO 2011/053565 se informa de un anticuerpo aislado que se une específicamente a la proteína tau humana fosforilada en uno o más de Ser(238) y Thr(245).

[0035] En el documento WO 2012/045882 se informa de un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo fosforilado en la proteína tau de mamífero, útil para tratar trastornos neurodegenerativos tales como taupatías, y para tratar o aliviar deficiencias cognitivas. En el documento WO 2012/049570 se informa de un anticuerpo antitau monoclonal humano o un fragmento de unión a tau del mismo. En el documento WO 2012/106363 se informa de un procedimiento de prevención o tratamiento de la enfermedad de Alzheimer u otras taupatías en un sujeto, que comprende administrar anticuerpos a un ser humano que necesita tratamiento contra la enfermedad de Alzheimer u otra taupatía, teniendo los anticuerpos especificidad por formas anómalas de la proteína tau, no mostrando dicho anticuerpo unión y/o reactividad a una proteína tau normal y administrándose en condiciones y en una cantidad o cantidades eficaces para prevenir o tratar la enfermedad de Alzheimer u otra taupatía.

[0036] En el documento WO 2012/149365 se informa de un anticuerpo que muestra reactividad con tau agregada y sustancialmente ausencia de reactividad con tau no agregada, en el que la tau agregada comprende al menos dos proteínas tau reticuladas entre sí, directamente o bien a través de un conector, en uno o más residuos de cisteína.

[0037] En el documento WO 2010/142423 se informa de una composición útil en el tratamiento de una taupatía, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, que comprende un anticuerpo que se une a tau, un compuesto modificado con serina fosforilada en una posición específica que se une específicamente a tau fosforilada específica y su fragmento y vehículo.

[0038] En el documento EP 1 876 185 A se informa de un anticuerpo que reconoce polipéptidos fosforilados. En el documento WO 2013/151762 se informa de un anticuerpo contra tau humanizado. En el documento WO 2014/016737 se informa de anticuerpos monoclonales de pollo novedosos contra tau fosforilada humana y usos de los mismos. En el documento WO 2014/016737 se informa de anticuerpos monoclonales de pollo novedosos contra tau fosforilada humana y usos de los mismos. En el documento WO 2012/149365 se informa de anticuerpos selectivos para dímeros de tau patológicos y oligómeros de tau patológicos prefibrilares y sus usos en el tratamiento, diagnóstico y supervisión de las taupatías.

[0039] En el documento WO 2015/091656 se informa de anticuerpos anti-tau(pS422) humanizados y procedimientos de uso. En el documento WO 2015/101586 se informan anticuerpos anti-hapteno/anti-receptor de la barrera hematoencefálica biespecíficos, complejos de los mismos y su uso como lanzaderas de la barrera hematoencefálica.

[0040] Breve sumario de la invención

[0041] La invención proporciona anticuerpos anti-tau(pS422) humana, especialmente anticuerpos anti-tau(pS422) humana humanizados, y procedimientos de uso de los mismos. Cualquier referencia en la descripción a procedimientos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) por tratamiento (o para diagnóstico).

[0042] Los anticuerpos humanizados, como se informa en el presente documento, no estaban disponibles por procedimientos de humanización estándar. Se requirió introducir mutaciones no estándar en la secuencia de aminoácidos para obtener un anticuerpo humanizado con características de unión y propiedades farmacocinéticas comparables a las del anticuerpo de conejo original que comprende dominios variables con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 07 y SEQ ID NO: 11. Esto es especialmente importante ya que se pretende que los anticuerpos, como se informa en el presente documento, atraviesen la barrera hematoencefálica humana y sean eficaces dentro del cerebro humano. Por tanto, los criterios aplicados en general para la selección de anticuerpos humanizados no son lo suficientemente rigurosos para aplicarse directamente en el caso actual.

[0043] En el presente documento se informa de un anticuerpo (humanizado) que se une específicamente a tau(pS422) humana, en el que el anticuerpo

[0044] i) se une específicamente a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 03, y/o

[0045] ii) no se une a tau humana de longitud completa (SEQ ID NO: 01) a 1 µg/ml, y/o

[0046] iii) se une específicamente a tau humana de longitud completa fosforilada en la serina en la posición 422 (SEQ ID NO: 02), y/o

[0047] iv) se une específicamente a agregados de tau humana fosforilada en la serina en la posición 422 (SEQ ID NO: 02), y/o

[0048] v) se une específicamente a tau humana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 01 y que tiene la mutación aminoacídica S422A.

[0049] Los anticuerpos, como se informa en el presente documento, muestran una selectividad con respecto a tau humana fosforilada en la serina en la posición 422, con respecto a tau humana natural no fosforilada y el mutante de tau S422A. La tau humana natural no fosforilada y el mutante de tau S422A no se unen en absoluto o se unen con una afinidad menor, respectivamente.

[0050] En el presente documento se informa de un anticuerpo monoclonal anti-tau(pS422) humana (humanizado) que es una variante humanizada del anticuerpo Mab 086 producido injertando las HVR de Mab 086 en regiones estructurales y constantes humanas, en el que los residuos estructurales de región variable humana seleccionados se sustituyen opcionalmente como sigue:

[0051] un residuo estructural de región variable humana seleccionado se sustituye por un aminoácido estructural equivalente del anticuerpo Mab 086 de conejo cuando el aminoácido (1) se une de forma no covalente al antígeno directamente, (2) es contiguo a una región HVR, (3) interactúa de otro modo con una región HVR o (4) participa en la interfaz VL-VH;

[0052] o

[0053] un aminoácido estructural humano que es inusual para una inmunoglobulina humana en esa posición se sustituye con un aminoácido de la posición equivalente del anticuerpo donante de conejo o de la posición equivalente de una inmunoglobulina humana más típica.

[0054] El anticuerpo humanizado de acuerdo con la presente invención comprende

[0055] a) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 76 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 78, o

[0056] b) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 19 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 78, o

[0057] c) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 76 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 80.

[0058] En un modo de realización de acuerdo con la invención, el anticuerpo humanizado comprende un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 76 o 19 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 78.

[0059] En un modo de realización de acuerdo con la invención, el anticuerpo es para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

[0060] En un modo de realización de acuerdo con la invención, el anticuerpo tiene una función efectora inactiva. En un modo de realización de acuerdo con la invención, el anticuerpo no tiene función efectora. En un modo de realización de acuerdo con la invención, el anticuerpo es de la subclase IgG1 humana y tiene las mutaciones L234A, L235A y P329G en ambas cadenas pesadas (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

[0061] En un modo de realización, el anticuerpo

[0062] i) se une específicamente a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 03, y/o

[0063] ii) no se une a tau humana de longitud completa (SEQ ID NO: 01) a 1 μg/ml, y/o

[0064] iii) se une específicamente a tau humana de longitud completa fosforilada en la serina en la posición 422 (SEQ ID NO: 02), y/o

[0065] iv) se une específicamente a agregados de tau humana fosforilada en la serina en la posición 422 (SEQ ID NO: 02).

[0066] En un modo de realización, el anticuerpo tiene un valor de CE<50>para

[0067] a) el fragmento de tau(pS422) humana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 03 de 6 ng/ml o menos, y/o

[0068] b) la tau(pS422) humana de longitud completa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 02 de 4,5 ng/ml o menos, y/o

[0069] c) agregados de tau(pS422) humana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 02 de 30 ng/ml o menos, y/o

[0070] d) la tau humana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 01 y que tiene la mutación aminoacídica S422A de 125 ng/ml o menos.

[0071] En un modo de realización, el anticuerpo se une específicamente a tau(pS422) humana (SEQ ID NO: 02) y no se une a tau humana (SEQ ID NO: 01).

[0072] En un modo de realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

[0073] En un modo de realización, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo que se une a tau(pS422) humana y i) se une específicamente a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 03, y/o

[0074] ii) no se une a tau humana de longitud completa (SEQ ID NO: 01) a 1 μg/ml, y/o

[0075] iii) se une específicamente a tau humana de longitud completa fosforilada en la serina en la posición 422 (SEQ ID NO: 02), y/o

[0076] iv) se une específicamente a agregados de tau humana fosforilada en la serina en la posición 422 (SEQ ID NO: 02), y/o

[0077] v) se une específicamente a tau humana de longitud completa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 01 y que tiene la mutación aminoacídica S422A, y/o

[0078] vi) tiene un valor de CE<50>para el fragmento de tau(pS422) humana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 03 de 6 ng/ml o menos, y/o

[0079] vii) tiene un valor de CE<50>para la tau(pS422) humana de longitud completa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 02 de 4,5 ng/ml o menos, y/o

[0080] viii) tiene un valor de CE<50>para agregados de tau(pS422) humana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 02 de 30 ng/ml o menos, y/o

[0081] ix) tiene un valor de CE<50>para la tau humana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 01 y que tiene la mutación aminoacídica S422A de 125 ng/ml o menos.

[0082] En un modo de realización, el anticuerpo es

[0083] a) un anticuerpo de longitud completa de la subclase IgG1 humana, o

[0084] b) un anticuerpo de longitud completa de la subclase IgG4 humana, o

[0085] c) un anticuerpo de longitud completa de la subclase IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A y P329G,

[0086] d) un anticuerpo de longitud completa de la subclase IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E y P329G,

[0087] e) un anticuerpo de longitud completa de la subclase IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A y P329G en ambas cadenas pesadas y las mutaciones T366W y S354C en una cadena pesada y las mutaciones T366S, L368A, Y407V e Y349C en la otra cadena pesada respectiva, o f) un anticuerpo de longitud completa de la subclase IgG4 humana con las mutaciones S228P y P329G en ambas cadenas pesadas y las mutaciones T366W y S354C en una cadena pesada y las mutaciones T366S, L368A, Y407V e Y349C en la otra cadena pesada respectiva.

[0088] Un aspecto informado en el presente documento es un anticuerpo anti-tau(pS422) humana (humanizado), caracterizado por que

[0089] a) el anticuerpo comprende dos cadenas pesadas de anticuerpo, comprendiendo cada una un dominio variable de la cadena pesada y una región constante de la cadena pesada, en el que

[0090] i) el dominio variable tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19,

[0091] ii) la región constante es una región constante de IgG1 humana, en la que el residuo de lisina C terminal o el dipéptido de glicina-lisina pueden estar presentes o ausentes, y

[0092] iii) la región constante comprende los cambios aminoacídicos L234A, L235A y P329G, b) el anticuerpo comprende dos cadenas ligeras de anticuerpo, comprendiendo cada una un dominio variable de la cadena ligera y un dominio constante de la cadena ligera, en el que

[0093] i) el dominio variable tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78,

[0094] ii) la región constante es una región constante de la cadena ligera kappa humana o una región constante de la cadena ligera lambda humana,

[0095] y

[0096] c) el anticuerpo

[0097] i) se une específicamente a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 03, y/o

[0098] ii) no se une a tau humana de longitud completa (SEQ ID NO: 01) a 1 μg/ml, y/o

[0099] iii) se une específicamente a tau humana de longitud completa fosforilada en la serina en la posición 422 (SEQ ID NO: 02), y/o

[0100] iv) se une específicamente a agregados de tau humana fosforilada en la serina en la posición 422 (SEQ ID NO: 02), y/o

[0101] v) se une específicamente a tau humana de longitud completa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 01 y que tiene la mutación aminoacídica S422A, y/o vi) tiene un valor de CE<50>para el fragmento de tau(pS422) humana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 03 de 6 ng/ml o menos, y/o

[0102] vii) tiene un valor de CE<50>para la tau(pS422) humana de longitud completa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 02 de 4,5 ng/ml o menos, y/o

[0103] viii) tiene un valor de CE<50>para agregados de tau(pS422) humana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 02 de 30 ng/ml o menos, y/o

[0104] ix) tiene un valor de CE<50>para la tau humana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 01 y que tiene la mutación aminoacídica S422A de 125 ng/ml o menos.

[0105] En el presente documento se informa de un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo (humanizado) como se informa en el presente documento. Este ácido nucleico comprende un ácido nucleico que codifica la cadena pesada de anticuerpo y un ácido nucleico que codifica la cadena ligera de anticuerpo. Este ácido nucleico comprende al menos un casete de expresión. Preferentemente, dicho ácido nucleico comprende dos casetes de expresión.

[0106] En el presente documento se informa de una célula huésped que comprende el ácido nucleico como se informa en el presente documento.

[0107] En el presente documento se informa de un procedimiento de producción de un anticuerpo (humanizado) que comprende las etapas de cultivar la célula huésped como se informa en el presente documento, de modo que se produzca el anticuerpo.

[0108] Un aspecto informado en el presente documento es una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo (humanizado) como se informa en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

[0109] En un modo de realización, la formulación farmacéutica comprende además un agente terapéutico adicional. En un modo de realización, el agente terapéutico adicional es un agente terapéutico antiamiloide. En un modo de realización, el agente terapéutico antiamiloide es un anticuerpo anti-sinucleína alfa humana o un anticuerpo anti-Abeta.

[0110] Un aspecto informado en el presente documento es el anticuerpo (humanizado) como se informa en el presente documento para su uso como medicamento.

[0111] Un aspecto informado en el presente documento es el anticuerpo (humanizado) como se informa en el presente documento para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

[0112] Un aspecto informado en el presente documento es el anticuerpo (humanizado) como se informa en el presente documento para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer prodrómica.

[0113] Un aspecto informado en el presente documento es el anticuerpo (humanizado) como se informa en el presente documento para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer leve.

[0114] Un aspecto informado en el presente documento es el uso del anticuerpo (humanizado) como se informa en el presente documento en la fabricación de un medicamento.

[0115] En un modo de realización, el medicamento es para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

[0116] En un modo de realización, el medicamento es para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer prodrómica. En un modo de realización, el medicamento es para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer leve.

[0117] En un modo de realización, el medicamento es para reducir la neurodegeneración inducida por tau(pS422). En un modo de realización, el medicamento es para mantener la capacidad intelectual y la capacidad funcional. En un modo de realización, el medicamento es para ralentizar la tasa de deterioro cognitivo y funcional.

[0118] Los anticuerpos, como se informa en el presente documento, se pueden usar en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

[0119] Con los anticuerpos (humanizados) informados en el presente documento se puede efectuar la inhibición/reducción de la progresión de la enfermedad de Alzheimer y la neurohistopatología.

[0120] Los anticuerpos (humanizados) informados en el presente documento se pueden usar para proteger a un animal frente al desarrollo de la enfermedad de Alzheimer o incluso usarse para detener la progresión de la enfermedad de Alzheimer en un animal. En un modo de realización, el animal es un ser humano.

[0121] En un modo de realización, el anticuerpo (humanizado) informado en el presente documento se une a tau(pS422) en cortes cerebrales de ratones transgénicos con tau(pS422) y pacientes con enfermedad de Alzheimer; y/o marcadores tau(pS422) en células transgénicas con tau(pS422).

[0122] Los anticuerpos (humanizados) informados en el presente documento se pueden usar para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

[0123] Los anticuerpos (humanizados) como se informa en el presente documento funcionan por la inhibición mediada por anticuerpos de la siembra y la diseminación de tau(pS422) humana entre las células.

[0124] Los anticuerpos (humanizados) como se informa en el presente documento protegen a los lisosomas del daño fibrilar uniéndose a tau(pS422) humana.

[0125] Breve descripción de las figuras

[0126] Figura 1:resultado de un estudio farmacocinético en macaco cangrejero; rombo sólido:

[0127] VH35H5/VL31A1; cuadrado abierto: VH35H5/VL35F2; cuadrado sólido: VH76A6/VL35G4; triángulo sólido: VH32/VL22; círculo sólido: VH00/VL00; eje X: tiempo después de la dosificación [h]; eje y: concentración sérica, norm. de dosis [(μg/ml)/(mg/kg)].

[0128] Figura 2:acercamiento al intervalo de tiempo 0-200 h de la figura 1.

[0129] Figura 3:unión bioquímica de diferentes combinaciones de VH y VL humanizados a (A) péptido de tau fosforilada, (B) tau humana de longitud completa fosforilada, (C) péptido de tau no fosforilada, (D) tau humana de longitud completa no fosforilada; (1) = VH00/VL00, (2) = VH32/VL21, (3) = VH20/VL22, (4) = VH32/VL22, (5) = VH33/VL22; concentraciones de recubrimiento: péptido de tau fosforilada: 50 ng/ml, todas las demás dianas: 1 μg/ml; (se obtienen resultados comparables si el péptido de tau fosforilada se recubre con 1 μg/ml (datos no mostrados)).Figura 4:unión bioquímica de diferentes combinaciones de VH y VL humanizados a (A) = mutante S422A de tau humana de longitud completa, (B) = tau(pS422) humana agregada; (1) =

[0130] VH00/VL00, (2) = VH32/VL21, (3) = VH20/VL22, (4) = VH32/VL22, (5) = VH33/VL22;

[0131] concentraciones de recubrimiento: péptido de tau fosforilada: 50 ng/ml, todas las demás dianas: 1 μg/ml; (se obtienen resultados comparables si el péptido de tau fosforilada se recubre con 1 μg/ml (datos no mostrados)).

[0132] Figura 5:inmunoelectrotransferencia que muestra la selectividad de combinaciones de VH/VL humanizados seleccionadas; (1) = VH00/VL00, (2) = VH32/VL21, (3) = VH20/VL22, (4) = VH32/VL22, (5) = VH33/VL22.

[0133] Figura 6:unión a tau hiperfosforilada en extractos de cerebro de pacientes con enfermedad de Alzheimer; (1) = VH00/VL00, (2) = VH32/VL21, (3) = VH32/VL22.

[0134] Figura 7:cuantificación de los niveles de tau(pS442) en extractos de cerebro de ratón; máx-mín,

[0135] mediana y media (+); la significación se calculó usando la prueba de latde Student, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.

[0136] A: eje x: tau(pS422) [ng/mg de cerebro]; eje y: 1: valor de referencia, 2: vehículo, 3: anticuerpo anti-tau(pS422) (VH35H5/VL31A1) a 1,7 mg/kg, 4: anticuerpo anti-tau(pS422) (VH35H5/VL31A1) a 5 mg/kg, 5: anticuerpo anti-tau(pS422) (VH35H5/VL31A1) a 15 mg/kg. B: eje x: tau(pS422) [ng/mg de cerebro]; eje y: 1: valor de referencia, 2: vehículo, 3: anticuerpo anti-tau(pS422) (VH35H5/VL49G1) a 1,7 mg/kg, 4: anticuerpo anti-tau(pS422) (VH35H5/VL49G1) a 5 mg/kg, 5: anticuerpo anti-tau(pS422) (VH35H5/VL49G1) a 15 mg/kg.

[0137] Figura 8:cuantificación de tau total en extractos de cerebro de ratón; máx-mín, mediana y media (+).

[0138] A: eje x: tau total [ng/mg de cerebro]; eje y: 1: valor de referencia, 2: vehículo, 3: anticuerpo anti-tau(pS422) (VH35H5/VL49G1) a 1,7 mg/kg, 4: anticuerpo anti-tau(pS422) (VH35H5/VL49G1) a 5 mg/kg, 5: anticuerpo anti-tau(pS422) (VH35H5/VL49G1) a 15 mg/kg. B: eje x: tau total [ng/mg de cerebro]; eje y: 1: valor de referencia, 2: vehículo, 3: anticuerpo anti-tau(pS422) (VH35H5/VL31A1) a 1,7 mg/kg, 4: anticuerpo anti-tau(pS422) (VH35H5/VL31A1) a 5 mg/kg, 5: anticuerpo anti-tau(pS422) (VH35H5/VL31A1) a 15 mg/kg.

[0139] Figura 9:análisis IHQ cuantitativo de la afección por tau(pS422) en ratones TauPS2APP tratados con anticuerpo anti-tau(pS422) (VH35H5/VL31A1); máx-mín, mediana y media (+), la significación se calculó usando la prueba de latde Student, **p<0,01, ***p<0,001.

[0140] A: corteza; eje x: ocupación de área de tau(pS422) [%]; eje y: 1: valor de referencia, 2: vehículo, 3: anticuerpo anti-tau(pS422) (VH35H5/VL31A1) a 1,7 mg/kg, 4: anticuerpo antitau(pS422) (VH35H5/VL31A1) a 5 mg/kg, 5: anticuerpo anti-tau(pS422) (VH35H5/VL31A1) a 15 mg/kg.

[0141] B: hipocampo; eje x: ocupación de área [%]; eje y: 1: valor de referencia, 2: vehículo, 3: anticuerpo anti-tau(pS422) (VH35H5/VL31A1) a 1,7 mg/kg, 4: anticuerpo anti-tau(pS422) (VH35H5/VL31A1) a 5 mg/kg, 5: anticuerpo anti-tau(pS422) (VH35H5/VL31A1) a 15 mg/kg.

[0142] Breve descripción de las secuencias

[0143] SEQ ID NO: 01 isoforma F de la proteína tau humana (441 residuos)

[0144] SEQ ID NO: 02 isoforma F de la proteína tau humana (441 residuos) fosforilada en el residuo de serina en la posición 422

[0145] SEQ ID NO: 03 fragmento de la proteína tau humana (residuos de 416 a 430 de SEQ ID NO: 01) con serina fosforilada en la posición 7 (correspondiente a la posición 422 de SEQ ID NO: 01): Ser-Ile-Asp-Met-Val-Asp-Ser(PO<3>H<2>)-Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp

[0146] SEQ ID NO: 04 CDRL1 de anticuerpo de conejo 086 - QSSQSVRTNKLA

[0147] SEQ ID NO: 05 CDRL2 de anticuerpo de conejo 086 - SASTLDF

[0148] SEQ ID NO: 06 CDRL3 de anticuerpo de conejo 086 - LGYFDCSIADCVA

[0149] SEQ ID NO: 07 VL00 de anticuerpo de conejo 086

[0150] SEQ ID NO: 08 CDRH1 de anticuerpo de conejo 086 - SNAIN

[0151] SEQ ID NO: 09 CDRH2 de anticuerpo de conejo 086 - YIAVSGNTYYASWAKG

[0152] SEQ ID NO: 10 CDRH3 de anticuerpo de conejo 086 - SNI

[0153] SEQ ID NO: 11 VH00 de anticuerpo de conejo 086

[0154] SEQ ID NO: 12 variante 1 de CDRL1 humanizada - RSSQSVRTNKLA

[0155] SEQ ID NO: 13 variante 2 de CDRL1 humanizada - RSSOSVRTNRLA

[0156] SEQ ID NO: 14 variante 1 de CDRL2 humanizada - SASTLDY

[0157] SEQ ID NO: 15 variante 1 de CDRL3 humanizada - LGYFDSSADIVA

[0158] SEQ ID NO: 16 variante 1 de VL humanizado - VL21

[0159] SEQ ID NO: 17 variante 2 de VL humanizado - VL22

[0160] SEQ ID NO: 18 CDRH2 humanizada - YIAVSGNTYYADSVKG

[0161] SEQ ID NO: 19 variante 1 de VH humanizado - VH32

[0162] SEQ ID NO: 20 variante 2 de VH humanizado - VH20

[0163] SEQ ID NO: 21 variante 3 de VH humanizado - VH33

[0164] SEQ ID NO: 22 variante 2 de CDRL2 humanizada - SASTLQS

[0165] SEQ ID NO: 23 variante 3 de CDRL2 humanizada - SASTLES

[0166] SEQ ID NO: 24 variante 2 de CDRL3 humanizada - LGYFDSSIADSVA

[0167] SEQ ID NO: 25 variante 3 de CDRL3 humanizada - LGYFDSSIADRVA

[0168] SEQ ID NO: 26 variante 4 de CDRL3 humanizada - LGYFDPSIADPVA

[0169] SEQ ID NO: 27 variante 5 de CDRL3 humanizada - LGYFDSSIADIVA

[0170] SEQ ID NO: 28 variante 6 de CDRL3 humanizada - LGYFDPSADPIA

[0171] SEQ ID NO: 29 variante 7 de CDRL3 humanizada - LGYFDPSADPVA

[0172] SEQ ID NO: 30 variante 3 de CDRL1 humanizada - RASQGVRTNKLA

[0173] SEQ ID NO: 31 variante 4 de CDRL1 humanizada - RASQSVRTNKLA

[0174] SEQ ID NO: 32 variante 4 de VL humanizado - VL01

[0175] SEQ ID NO: 33 variante 5 de VL humanizado - VL09

[0176] SEQ ID NO: 34 variante 6 de VL humanizado - VL12

[0177] SEQ ID NO: 35 variante 7 de VL humanizado - VL15

[0178] SEQ ID NO: 36 variante 8 de VL humanizado - VL16

[0179] SEQ ID NO: 37 variante 9 de VL humanizado - VL17

[0180] SEQ ID NO: 38 variante 10 de VL humanizado - VL19

[0181] SEQ ID NO: 39 variante 11 de VL humanizado - VL28

[0182] SEQ ID NO: 40 variante 12 de VL humanizado - VL33

[0183] SEQ ID NO: 41 variante 13 de VL humanizado - VL35

[0184] SEQ ID NO: 42 variante 14 de VL humanizado - VL39

[0185] SEQ ID NO: 43 variante 15 de VL humanizado - VL40

[0186] SEQ ID NO: 44 variante 16 de VL humanizado - VL41

[0187] SEQ ID NO: 45 variante 17 de VL humanizado - VL42

[0188] SEQ ID NO: 46 variante 4 de VH humanizado - VH01

[0189] SEQ ID NO: 47 variante 5 de VH humanizado - VH02

[0190] SEQ ID NO: 48 variante 6 de VH humanizado - VH03

[0191] SEQ ID NO: 49 variante 7 de VH humanizado - VH04

[0192] SEQ ID NO: 50 variante 8 de VH humanizado - VH14

[0193] SEQ ID NO: 51 variante 9 de VH humanizado - VH15

[0194] SEQ ID NO: 52 variante 10 de VH humanizado - VH18

[0195] SEQ ID NO: 53 variante 11 de VH humanizado - VH19

[0196] SEQ ID NO: 54 variante 12 de VH humanizado - VH22

[0197] SEQ ID NO: 55 variante 13 de VH humanizado - VH23

[0198] SEQ ID NO: 56 variante 14 de VH humanizado - VH24

[0199] SEQ ID NO: 57 variante 15 de VH humanizado - VH31

[0200] SEQ ID NO: 65 variante 16 de VH humanizado - VH35H5

[0201] SEQ ID NO: 66 variante 18 de VL humanizado - VL31A1

[0202] SEQ ID NO: 67 variante 19 de VL humanizado - VL49G1

[0203] SEQ ID NO: 68 variante 20 de VL humanizado - VL35F2

[0204] SEQ ID NO: 69 variante 21 de VL humanizado - VL53A2

[0205] SEQ ID NO: 70 variante 5 de CDRL1 humanizada

[0206] SEQ ID NO: 71 variante 6 de CDRL1 humanizada

[0207] SEQ ID NO: 72 variante 4 de CDRL2 humanizada

[0208] SEQ ID NO: 73 variante 5 de CDRL2 humanizada SEQ ID NO: 74 variante 8 de CDRL3 humanizada

[0209] SEQ ID NO: 75 variante 9 de CDRL3 humanizada

[0210] SEQ ID NO: 76 variante 17 de VH humanizado - VH76A6

[0211] SEQ ID NO: 77 variante 1 de CDRH1 humanizada

[0212] SEQ ID NO: 78 variante 22 de VL humanizado - VL35G4

[0213] SEQ ID NO: 79 variante 10 de CDRL3 humanizada

[0214] SEQ ID NO: 80 variante 23 de VL humanizado - VL145B12

[0215] SEQ ID NO: 81 variante 6 de CDRL2 humanizada

[0216] SEQ ID NO: 82 cadena pesada 1 de anticuerpo anti-receptor de transferrina SEQ ID NO: 83 cadena pesada 2 de anticuerpo anti-receptor de transferrina SEQ ID NO: 84 cadena pesada 3 de anticuerpo anti-receptor de transferrina SEQ ID NO: 85 cadena ligera de anticuerpo anti-receptor de transferrina SEQ ID NO: 86 variante 24 de VL humanizado - VL4G1

[0217] SEQ ID NO: 87 variante 11 de CDRL3 humanizada

[0218] Tabla de correspondencia de secuencias:

[0220]

[0221]

[0223] Descripción detallada de la invención

[0224] La presente divulgación se refiere a un péptido de unión o proteína o una parte funcional de los mismos, en particular a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o una parte funcional del mismo, en particular un péptido de unión o anticuerpo, este péptido de unión o anticuerpo reconoce y se une específicamente a un epítopo fosforilado en un mamífero, en particular en la proteína tau humana o en un fragmento de la misma, en particular a un confórmero de proteína tau patológica, pero, en un modo de realización, no se une al epítopo no fosforilado correspondiente y/o a epítopos no relacionados en el que dicho péptido de unión o anticuerpo se une a un epítopo en un mamífero, en particular en la proteína tau humana como se muestra en SEQ ID NO: 02, que consiste en los residuos aminoacídicos de tau 416-430 que comprenden una Ser fosforilada en la posición 422 (pS422).

[0225] I. Definiciones

[0226] Una "región estructural humana aceptora" para los propósitos en el presente documento es una región estructural que comprende la secuencia de aminoácidos de una región estructural de dominio variable de la cadena ligera (VL) o una región estructural de dominio variable de la cadena pesada (VH) derivada de una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana, como se define a continuación. Una región estructural humana aceptora "derivada de" una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de la misma, o puede contener cambios en la secuencia de aminoácidos. En algunos modos de realización, el número de cambios de aminoácidos es de 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos. En algunos modos de realización, la región estructural humana aceptora de VL es idéntica en secuencia a la secuencia de región estructural de inmunoglobulina humana de VL o la secuencia de región estructural consenso humana.

[0227] "Afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique de otro modo, como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañero Y se puede representar en general por la constante de disociación (Kd). La afinidad se puede medir por procedimientos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Los modos de realización ilustrativos y ejemplares específicos para medir la afinidad de unión se describen en lo que sigue.

[0228] Un anticuerpo "madurado en afinidad" se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables (HVR), en comparación con un anticuerpo original que no posee dichas alteraciones, dando como resultado dichas alteraciones una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno.

[0229] Los términos "anticuerpo anti-tau(pS422) humana" y "un anticuerpo que se une específicamente a tau(pS422) humana" se refieren a un anticuerpo que se puede unir a tau(pS422) humana con una afinidad suficiente, de modo que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico en la selección como diana de tau(pS422) humana. En un modo de realización, el grado de unión de un anticuerpo anti-tau(pS422) humana a una proteína distinta de tau(pS422) humana no relacionada es de menos de aproximadamente un 10 % de la unión del anticuerpo a tau(pS422) humana como se mide, por ejemplo, por un radioinmunoanálisis (RIA).

[0230] El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpo, incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada.

[0231] Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen pero no se limitan a Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')<2>; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenario (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

[0232] Un "anticuerpo que se une al mismo epítopo" que un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más y, a la inversa, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más.

[0233] El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie diferente.

[0234] La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante poseído por su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG<1>, IgG<2>, IgG<3>, IgG<4>, IgA<1>e IgA<2>. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman α, δ, ε, γ y μ, respectivamente.

[0235] Las "funciones efectoras" se refieren a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con la clase de anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión al receptor de Fc; citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B); y activación de linfocitos B.

[0236] Una "cantidad eficaz" de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, en las dosificaciones y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado.

[0237] El término "región Fc" en el presente documento se usa para definir una región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. En un modo de realización, una región Fc de la cadena pesada de IgG humana se extiende desde Cys226, o desde Pro230, al extremo carboxílico de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C terminal (Lys447) de la región Fc puede estar presente o no. A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de los residuos aminoacídicos en la región Fc o región constante es de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, como se describe en Kabat, E.A.et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.ª ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), publicación de NIH 91-3242.

[0238] "Región estructural" o "FR" se refiere a los residuos de dominio variable distintos de los residuos de región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable consiste, en general, en cuatro dominios de FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. En consecuencia, las secuencias de HVR y FR aparecen, en general, en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

[0239] Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en el presente documento de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fc como se define en el presente documento. El término "anticuerpo de longitud completa" indica un polipéptido multimérico que consiste en dos polipéptidos de la cadena ligera del anticuerpo y dos polipéptidos de la cadena pesada del anticuerpo unidos por enlaces disulfuro, en el que en los dos polipéptidos de la cadena pesada del anticuerpo el residuo de lisina C terminal (K) puede estar presente o no.

[0240] Los términos "célula huésped", "línea de células huésped" y "cultivo de células huésped" se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen la célula transformada primaria y la descendencia derivada de la misma independientemente del número de pases. La descendencia puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula original, sino que puede contener mutaciones. La descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada o seleccionada en la célula transformada originalmente se incluye en el presente documento.

[0241] Una "región estructural consenso humana" es una región estructural que representa los residuos aminoacídicos que se producen más comúnmente en una selección de secuencias de región estructural de VL o VH de inmunoglobulina humana. En general, la selección de secuencias de VL o VH de inmunoglobulina humana es de un subgrupo de secuencias de dominio variable. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat, E.A.et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.ª ed., Bethesda MD (1991), publicación de NIH 91-3242, vols.1-3.

[0242] Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos aminoacídicos de HVR no humanas y residuos aminoacídicos de FR humanas. En determinados modos de realización, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, las CDR) se corresponden con las de un anticuerpo no humano, y todas o sustancialmente todas las FR se corresponden con las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que experimenta humanización.

[0243] El término "región hipervariable" o "HVR", como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia ("regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR") y forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables") y/o contienen los residuos en contacto con el antígeno ("contactos con el antígeno"). En general, los anticuerpos comprenden seis HVR; tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3).

[0244] Las HVR en el presente documento incluyen

[0245] (a) los bucles hipervariables que se producen en los residuos aminoacídicos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) (Chothia, C. y Lesk, A.M., J. Mol. Biol.196 (1987) 901-917); (b) las CDR que se producen en los residuos aminoacídicos 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) (Kabat E.A.et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.ª ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242,);

[0246] (c) los contactos con antígeno que se producen en los residuos aminoacídicos 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) y 93-101 (H3) (MacCallumet al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); y

[0247] (d) combinaciones de (a), (b) y/o (c), que incluyen los residuos aminoacídicos de HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) y 94-102 (H3).

[0248] A menos que se indique de otro modo, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, los residuos de FR) se numeran en el presente documento de acuerdo con Kabatet al.,supra.

[0249] Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado con una o más moléculas heterólogas.

[0250] Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domésticos (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos, tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En determinados modos de realización, el individuo o sujeto es un ser humano.

[0251] Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha separado de un componente de su entorno natural. En algunos modos de realización, un anticuerpo se purifica a más de un 95 % o un 99 % de pureza, como se determina, por ejemplo, por electroforesis (por ejemplo, SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), electroforesis capilar) o cromatografía (por ejemplo, HPLC de intercambio iónico o de fase inversa). Para una revisión de los procedimientos para la evaluación de la pureza de anticuerpos, véase, por ejemplo, Flatman, S.et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87.

[0252] Un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que contienen habitualmente la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural.

[0254] Un "ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-tau(pS422) humana" se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo (o fragmentos de las mismas), incluyéndose dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico en un único vector o vectores separados, y estando dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico presente(s) en una o más localizaciones en una célula huésped.

[0256] El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando presentes, en general, dichas variantes en cantidades despreciables. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige contra un único determinante en un antígeno. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se ha de interpretar como que requiere la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar por una variedad de técnicas, incluyendo pero sin limitarse al procedimiento de hibridoma, procedimientos de ADN recombinante, procedimientos de presentación en fagos y procedimientos que utilizan animales transgénicos que contienen todos o parte de los locus de inmunoglobulina humana, describiéndose en el presente documento dichos procedimientos y otros procedimientos ejemplares para preparar anticuerpos monoclonales.

[0258] "Anticuerpos naturales" se refieren a moléculas de inmunoglobulina naturales con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos IgG naturales son glucoproteínas heterotetrámeras de aproximadamente 150.000 dáltones, compuestas por dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que se enlazan con disulfuro. Del extremo N al C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada dominio pesado variable o dominio variable de la cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3). De forma similar, del extremo N al C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también llamada dominio ligero variable o dominio variable de la cadena ligera, seguido de un dominio ligero constante (CL). La cadena ligera de un anticuerpo se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa (κ) y lambda (λ), en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.

[0260] El término "prospecto del envase" se usa para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en envases comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, politerapia, contraindicaciones y/o advertencias que atañen al uso de dichos productos terapéuticos.

[0262] "Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos aminoacídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoacídicos en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación se puede lograr, para los propósitos de determinación del porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos, de diversas maneras que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático disponible públicamente, tal como el programa informático BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima en toda la longitud de las secuencias que se comparen. Sin embargo, para los propósitos en el presente documento, se generan valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 se creó por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de EE. UU., Washington D.C., 20559, donde se ha registrado con el n.º de registro de derechos de autor de EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente en Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 se debe compilar para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían.

[0264] En situaciones en las que se emplee ALIGN-2 para realizar comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B (que se puede parafrasear de forma alternativa como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula como sigue:

[0266] 100 veces la fracción X/Y

[0267] donde X es el número de residuos aminoacídicos puntuados como emparejamientos idénticos por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos aminoacídicos en B. Se apreciará que, cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos de A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos de B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no igualará el % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se establezca específicamente de otro modo, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa informático ALIGN-2.

[0268] El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en una forma tal que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene ningún componente adicional que sea inaceptablemente tóxico para un sujeto al que se le administraría la formulación. Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, un excipiente, un estabilizante o un conservante.

[0269] El término "tau(pS422) humana", como se usa en el presente documento, se refiere a tau(pS422) humana natural (UniProt P37840). El término engloba a tau(pS422) humana no procesada "de longitud completa", así como a cualquier forma de tau(pS422) humana que resulte del procesamiento en la célula. El término también engloba a variantes naturales de tau(pS422) humana, por ejemplo, mutantes, variantes de empalme o variantes alélicas. La secuencia de aminoácidos de tau(pS422) humana se muestra en SEQ ID NO: 02.

[0270] Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo, tales como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural del individuo que se está tratando, y que se puede realizar para la profilaxis o bien durante el trascurso de los análisis clínicos. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, evitar la aparición o recidiva de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, evitar la metástasis, disminuir la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o atenuación del grado de actividad de la enfermedad y remisión o pronóstico mejorado. En algunos modos de realización, se usan los anticuerpos de la invención para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.

[0271] El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural tienen, en general, estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones estructurales (FR) conservadas y tres regiones hipervariables (HVR). (Véase, por ejemplo, Kindt, T.J.et al. Kuby Immunology, 6.ª ed., W.H. Freeman y Co., N.Y. (2007), página 91). Un único dominio VH o VL puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular se pueden aislar usando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para cribar una colección de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Véanse, por ejemplo, Portolano, S.et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T.et al., Nature 352 (1991) 624-628).

[0272] El término "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede propagar otro ácido nucleico al que se enlaza. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Determinados vectores pueden dirigir la expresión de los ácidos nucleicos a los que se enlazan de forma funcional. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión".

[0273] II. Composiciones y procedimientos

[0274] A. Anticuerpos anti-tau(pS422) humana humanizados ejemplares

[0275] Los anticuerpos humanizados, como se informa en el presente documento, no estaban disponibles por procedimientos de humanización estándar. Se requirió introducir mutaciones no estándar en la secuencia de aminoácidos para obtener un anticuerpo humanizado con características de unión y propiedades farmacocinéticas comparables a las del anticuerpo de conejo original. Esto es especialmente importante ya que se pretende que los anticuerpos, como se informa en el presente documento, atraviesen la barrera hematoencefálica humana y sean eficaces dentro del cerebro humano. Por tanto, los criterios aplicados en general para la selección de anticuerpos humanizados no eran lo suficientemente rigurosos para aplicarse directamente en el caso actual.

[0276] Se ha descubierto que, para obtener un anticuerpo humanizado adecuado y desarrollable, se tuvo que reemplazar dos cisteínas que formaban un puente disulfuro en la CDRL3 (CDR3 de la cadena ligera) por serina e isoleucina, respectivamente. Además para garantizar la orientación apropiada de la misma CDRL3, se delecionó un residuo de isoleucina presente en el medio de la CDRL3 de conejo, dando como resultado una CDRL3 humanizada que es un residuo aminoacídico más pequeño que la CDRL3 de conejo original.

[0277] También se ha descubierto que para mantener las propiedades farmacocinéticasin vivo, el residuo aminoacídico en la posición 32 en la cadena ligera debe ser una lisina (numeración de acuerdo con Kabat). La retirada del puente disulfuro en la HVR-L3 de la cadena ligera no tiene un impacto sobre el comportamiento cinéticoin vivo. Se ha descubierto además que es ventajoso mantener tres residuos aminoacídicos de valina en la cadena pesada en las posiciones 4, 24 y 78 (numeración de acuerdo con Kabat). Sin estar vinculados por esta teoría, se supone que estos residuos se requieren para garantizar la presentación apropiada de los bucles de unión a antígeno de la región variable de la cadena pesada. Adicionalmente, la presencia de un residuo de arginina en la posición 71 en el dominio variable de la cadena pesada es ventajosa (numeración de acuerdo con Kabat).

[0278] La HVR-L3 comprende dos residuos de ácido aspártico que podrían ser un punto caliente de desamidación, especialmente durante el almacenamiento prolongado. En la variante de dominio variable de la cadena ligera VL35G4 se ha cambiado uno de estos dos residuos de ácido aspártico.

[0279] Toda la numeración como se usa en el presente documento se basa en el esquema de numeración de dominio variable de Kabat.

[0280] En la siguiente tabla se muestran las características de las diferentes variantes humanizadas del dominio variable de la cadena ligera de conejo en combinación con los dominios variables de la cadena pesada humanizada VH14 y VH20, respectivamente. El compañero de unión fue tau(pS422) humana.

[0282]

[0285]

[0288]

[0289]

[0291] Valores de referencia VH00 con VL00 (anticuerpo de conejo):

[0292] 25 °C: kd = 2,6E-04; t/2 = 44 min.

[0293] 37 °C: ka = 3,7E+04, kd = 5,25E-03, KD = 1,4E-08, t/2 = 22 min.

[0294] En la siguiente tabla se muestran las características de las diferentes variantes humanizadas del dominio variable de la cadena ligera de conejo en combinación con los dominios variables de la cadena ligera humanizada VL17 y VL19, respectivamente.

[0296]

[0297]

[0300]

[0302] Valores de referencia VH00 con VL00 (anticuerpo de conejo):

[0303] 25 °C: kd = 2,6E-04; t/2 = 44 min.

[0304] 37 °C: ka = 3,7E+04, kd = 5,25E-03, KD = 1,4E-08, t/2 = 22 min.

[0305] En la siguiente tabla se muestran las constantes cinéticas para diferentes combinaciones de VH/VL (determinadas de acuerdo con el ejemplo 8).

[0307]

[0309] La unión bioquímica de diferentes combinaciones de VH y VL humanizados se muestra en las figuras 3 y 4. En la siguiente tabla se muestra la especificidad de unión para diferentes combinaciones de VH/VL (valores de CE50 en [ng/ml]).

[0310]

[0312] La sensibilidad de las combinaciones de VH/VL humanizados seleccionadas con respecto al mutante de tau humana S422A se puede observar a partir de las inmunoelectrotransferencias mostradas en la figura 5. Todas las variantes humanizadas se unen selectivamente a tau humana fosforilada en S422. Hay un nivel bajo de reactividad cruzada con respecto a los epítopos fosforilados distintos de S422 del anticuerpo de conejo original, pero las variantes humanizadas mostradas tienen menos reactividad cruzada a este respecto que el anticuerpo de conejo original.

[0313] En la figura 6 se muestra la unión a PHF-tau en extractos de cerebro de pacientes con enfermedad de Alzheimer para el anticuerpo de conejo original y para anticuerpos anti-tau(pS422) humana humanizados seleccionados. En base a lo anterior, se eligió la combinación de VH32/VL22 como anticuerpo humanizado.

[0314] Se han encontrado las siguientes tasas de aclaramiento promedio en macaco cangrejero con la combinación de VH/VL original y la combinación de VH/VL humanizado (el aclaramiento normal para IgG humana es de 0,18-0,36 ml/h/kg).

[0316]

[0318] n.d. = no determinado

[0319] Se puede observar que la combinación VH32/VL22 tiene una tasa de aclaramiento incrementada que es dependiente de la dosis.

[0320] En la siguiente tabla se muestran las constantes cinéticas para otras combinaciones de VH/VL generadas para abordar la tasa de aclaramiento dependiente de la dosis incrementada de VH32/VL22 con el fragmento de tau(pS422) (determinado de acuerdo con el ejemplo 10).

[0322]

[0323] En la siguiente tabla se muestran las constantes cinéticas para combinaciones de VH/VL como fragmento Fab con tau(pS422) de longitud completa y fragmento de tau(pS422) (determinadas de acuerdo con el ejemplo 11 y el ejemplo 12).

[0325]

[0327] En la siguiente tabla se muestra la especificidad de unión para diferentes combinaciones de VH/VL determinadas por ELISA (selectividad para tau fosforilada frente a no fosforilada).

[0329]

[0331] Se han encontrado las siguientes tasas de aclaramiento promedio en macaco cangrejero con diferentes combinaciones de VH/VL (el aclaramiento normal para IgG humana es de 0,18-0,36 ml/h/kg; n.d. = no determinado).

[0333]

[0335] Se han encontrado las siguientes tasas de aclaramiento promedio en ratones con diferentes combinaciones de VH/VL (el aclaramiento normal para IgG humana es de 0,18-0,36 ml/h/kg).

[0337]

[0338]

[0340] En un modo de realización de todos los aspectos, como se informa en el presente documento, el anticuerpo antitau(pS422) humana humanizado tiene una tasa de aclaramiento promedio después de la aplicación intravenosa de menos de 0,6 ml/h/kg a una dosis de hasta 25 mg/kg. En un modo de realización, la tasa de aclaramiento promedio es de 0,3 ml/h/kg o menos a una dosis de hasta 25 mg/kg.

[0341] En el presente documento se proporciona un anticuerpo anti-tau(pS422) humana (humanizado) que comprende al menos una o dos o tres o cuatro o cinco o seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 08; (b) HVR-H2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 09; (c) HVR-H3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; (d) HVR-L1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; (e) HVR-L2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73; y (f) HVR-L3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15. En el presente documento se proporciona un anticuerpo anti-tau(pS422) humana (humanizado) que comprende al menos una o dos o tres o cuatro o cinco o seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 08; (b) HVR-H2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 09; (c) HVR-H3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; (d) HVR-L1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70; (e) HVR-L2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72; y (f) HVR-L3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15. En el presente documento se proporciona un anticuerpo anti-tau(pS422) humana (humanizado) que comprende al menos una o dos o tres o cuatro o cinco o seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 08; (b) HVR-H2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 09; (c) HVR-H3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; (d) HVR-L1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; (e) HVR-L2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; y (f) HVR-L3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74. En el presente documento se proporciona un anticuerpo anti-tau(pS422) humana (humanizado) que comprende al menos una o dos o tres o cuatro o cinco o seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 08; (b) HVR-H2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77; (c) HVR-H3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; (d) HVR-L1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; (e) HVR-L2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; y (f) HVR-L3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 75. En el presente documento se proporciona un anticuerpo anti-tau(pS422) humana (humanizado) que comprende al menos una o dos o tres o cuatro o cinco o seis HVR seleccionadas de (a) HVR-H1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 08; (b) HVR-H2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77; (c) HVR-H3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; (d) HVR-L1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; (e) HVR-L2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; y (f) HVR-L3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79. En el presente documento se proporciona un anticuerpo (humanizado) que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de HVR de VH seleccionadas de (a) HVR-H1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 08; (b) HVR-H2, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 09; y (c) HVR-H3, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

[0342] En otro modo de realización, el VH o VL contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o deleciones en relación con la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-tau(pS422) humana que comprende esa secuencia conserva la capacidad de unirse a tau(pS422) humana.

[0343] En otro modo de realización de la invención, un anticuerpo anti-tau(pS422) humana de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores es un anticuerpo monoclonal, incluyendo un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En un modo de realización, un anticuerpo anti-tau(pS422) humana es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fv, Fab, Fab', scFv, diacuerpo o F(ab')<2>. En otro modo de realización, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, un anticuerpo IgG1 o IgG4 intacto u otra clase o isotipo de anticuerpo como se define en el presente documento.

[0344] El anticuerpo (humanizado), como se informa en el presente documento, reduce los niveles de tau(pS422) en el cerebro de ratones TauPS2APP transgénicos.

[0345] En otro modo de realización, un anticuerpo anti-tau(pS422) humana (humanizado) de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede incorporar cualquiera de los rasgos característicos, individualmente o en combinación, como se describen en las secciones 1-7 a continuación:

[0347] 1. Afinidad de anticuerpo

[0349] En determinados modos de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento tiene una constante de disociación (KD) de ≤100 nM, ≤50 nM, o entre 1 nM y 100 nM (por ejemplo, 10<-7>M o menos, por ejemplo, de 10<-7>M a 10<-9>M).

[0351] En un modo de realización, Kd se mide por un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA). En un modo de realización, se realiza un RIA con la versión de Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno. Por ejemplo, se mide la afinidad de unión en solución de los Fab por el antígeno equilibrando los Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (<125>I) en presencia de una serie de valoraciones de antígeno no marcado, capturando, a continuación, el antígeno unido con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (véase, por ejemplo, Chen, Y.et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881). Para establecer las condiciones para el ensayo, se recubren placas de múltiples pocillos MICROTITER<®>(Thermo Scientific) durante la noche con 5 μg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6) y posteriormente se bloquean con seroalbúmina bovina al 2 % (p/v) en PBS durante de dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). En una placa no adsorbente (Nunc, n.º 269620), se mezcla<125>I-antígeno 100 pM o 26 pM con diluciones sucesivas de un Fab de interés (por ejemplo, consecuente con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta L.G.et al., Cancer Res.57 (1997) 4593-4599). A continuación, se incuba el Fab de interés durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un período más largo (por ejemplo, aproximadamente 65 horas) para garantizar que se alcanza el equilibrio. Después de esto, se transfieren las mezclas a la placa de captura para su incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). A continuación, se retira la solución y se lava la placa ocho veces con polisorbato 20 (TWEEN 20<®>) al 0,1 % en PBS. Cuando las placas se han secado, se añaden 150 μl/pocillo de centelleador (MICROSCINT-20™; Packard) y se cuentan las placas en un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) durante diez minutos. Se eligen concentraciones de cada Fab que dan menos de o igual a un 20 % de unión máxima para su uso en ensayos de unión competitiva.

[0353] De acuerdo con otro modo de realización, se mide Kd usando un ensayo de resonancia de plasmón superficial BIAcore<®>. Por ejemplo, se realiza un ensayo usando un BIAcore<®>-2000 o un BIAcore<®>-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con chips CM5 con antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (UR). En un modo de realización, se activan chips de biosensor con dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore, Inc.) con clorhidrato deN-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) yN-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se diluye el antígeno con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, hasta 5 μg/ml (~0,2 μM) antes de su inyección a un caudal de 5 μl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Tras la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para mediciones cinéticas, se inyectan diluciones sucesivas al 2 % de Fab (de 0,78 nM a 500 nM) en PBS con tensioactivo polisorbato 20 (TWEEN 20<®>) (PBST) al 0,05 % a 25 °C a un caudal de aproximadamente 25 μl/min. Se calculan las velocidades de asociación (k<as>) y las velocidades de disociación (k<dis>) usando un modelo de unión uno a uno de Langmuir simple (programa informático de evaluación de BIACORE<®>, versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. Se calcula la constante de disociación en equilibrio (Kd) como la proporción k<dis>/k<as>(véase, por ejemplo, Chen, Y.et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881). Si la velocidad de asociación excede 10<6>M<-1>s<-1>por el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, a continuación se puede determinar la velocidad de asociación usando una técnica de extinción de fluorescencia que mide el incremento o disminución de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25 °C de un anticuerpo (forma Fab) anti-antígeno 20 nM en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno como se mide en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con interrupción de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO™ serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.

[0355] 2. Fragmentos de anticuerpo

[0357] En determinados modos de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, los fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')<2>, Fv y scFv, y otros fragmentos descritos a continuación. Para una revisión de determinados fragmentos de anticuerpo, véase Hudson, P.J.et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134. Para una revisión de los fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Plueckthun, A., en: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315; véanse también los documentos WO 93/16185; US 5.571.894 y US 5.587.458. Para un análisis de los fragmentos Fab y F(ab')<2>que comprenden residuos de epítopo de unión al receptor de rescate y que tienen una semividain vivoincrementada, véase el documento US 5.869.046.

[0358] Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véanse, por ejemplo, los documentos EP 0 404 097; WO 1993/01161; Hudson, P.J.et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134; y Holliger, P.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448. También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudson, P.J.et al., Nat. Med.9 (2003) 129-134).

[0359] Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden todo o una porción del dominio variable de la cadena pesada o todo o una porción del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En determinados modos de realización, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, por ejemplo, el documento US 6.248.516).

[0360] Se pueden preparar fragmentos de anticuerpo por diversas técnicas, incluyendo, pero sin limitarse a digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como producción por células huésped recombinantes (por ejemplo,E. colio fago), como se describe en el presente documento.

[0361] 3. Anticuerpos humanizados

[0362] Típicamente, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir la inmunogenicidad en seres humanos, mientras se conservan la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano original. En general, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que las HVR, por ejemplo, las CDR, (o porciones de las mismas) se derivan de un anticuerpo no humano y las FR (o porciones de las mismas) se derivan de secuencias de anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de o una región constante humana de longitud completa. En algunos modos de realización, se sustituyen algunos residuos de FR en un anticuerpo humanizado con los residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que se derivan los residuos de HVR), por ejemplo, para restablecer o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.

[0363] Los anticuerpos humanizados y los procedimientos de preparación de los mismos se revisan, por ejemplo, en Almagro, J.C. y Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633, y se describen además, por ejemplo, en Riechmann, I.et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; los documentos US 5.821.337, US 7.527.791, US 6.982.321 y US 7.087.409; Kashmiri, S.V.et al., Methods 36 (2005) 25-34 (que describen el injerto de la región determinante de la especificidad (SDR)); Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 (que describe el "rebarnizado"); Dall'Acqua, W.F.et al., Methods 36 (2005) 43-60 (que describen el "reordenamiento de FR"); y Osbourn, J.et al., Methods 36 (2005) 61-68 y Klimka, A.et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (que describen el enfoque de "selección guiada" para el reordenamiento de FR).

[0364] Las regiones estructurales humanas que se pueden usar para la humanización incluyen, pero no se limitan a: regiones estructurales seleccionadas usando el procedimiento de "mejor ajuste" (véase, por ejemplo, Sims, M.J.et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308); regiones estructurales derivadas de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de la cadena ligera o pesada (véanse, por ejemplo, Carter, P.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; y Presta, L.G.et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632); regiones estructurales maduras (mutadas somáticamente) humanas o regiones estructurales de estirpe germinal humana (véase, por ejemplo, Almagro, J.C. y Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633); y regiones estructurales derivadas del cribado de colecciones de FR (véanse, por ejemplo, Baca, M.et al., J. Biol. Chem.272 (1997) 10678-10684 y Rosok, M.J.et al., J. Biol. Chem.271 (1996) 22611-22618).

[0365] 4. Anticuerpos multiespecíficos

[0366] En determinados modos de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión por al menos dos sitios diferentes. En determinados modos de realización, una de las especificidades de unión es por la tau(pS422) humana y la otra es por cualquier otro antígeno. Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo.

[0367] Las técnicas para preparar anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, la coexpresión recombinante de dos pares cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que tienen diferentes especificidades (véanse Milstein, C. y Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, documento WO 93/08829 y Traunecker, A.et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659), y genomanipulación de "botón en ojal" (véase, por ejemplo, el documento US 5.731.168). También se pueden preparar anticuerpos multiespecíficos genomanipulando los efectos de conducción electrostática para preparar moléculas heterodiméricas de Fc de anticuerpo (documento WO 2009/089004); reticulando dos o más anticuerpos o fragmentos (véanse, por ejemplo, documento US 4.676.980 y Brennan, M.et al., Science 229 (1985) 81-83); usando cremalleras de leucinas para producir anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Kostelny, S.A.et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553); usando la tecnología de "diacuerpos" para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico (véase, por ejemplo, Holliger, P.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448); y usando dímeros de Fv monocatenario (scFv) (véase, por ejemplo, Gruber, M.et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374); y preparando anticuerpos triespecíficos como se describe, por ejemplo, en Tutt, A.et al., J. Immunol.147 (1991) 60-69).

[0368] También se incluyen en el presente documento anticuerpos genomanipulados con tres o más sitios de unión a antígeno funcionales, incluyendo los "anticuerpos pulpo" (véase, por ejemplo, el documento US 2006/0025576). El anticuerpo o fragmento en el presente documento también incluye un "Fab de doble acción" o "DAF" que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a tau(pS422) humana, así como otro antígeno diferente (véase, el documento US 2008/0069820, por ejemplo).

[0369] El anticuerpo o fragmento en el presente documento también incluye los anticuerpos multiespecíficos descritos en los documentos WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 y WO 2010/145793.

[0370] 5. Variantes de anticuerpo

[0371] En determinados modos de realización se contemplan variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Se pueden preparar variantes de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o por síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Se puede realizar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión a antígeno.

[0372] a) Variantes de sustitución, inserción y deleción

[0373] En determinados modos de realización se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una o más sustituciones aminoacídicas. Los sitios de interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las HVR y las FR. Las sustituciones conservadoras se muestran en la siguiente tabla bajo el encabezamiento de "sustituciones preferentes". Se proporcionan cambios más sustanciales en la siguiente tabla bajo el encabezamiento de "sustituciones ejemplares" y como se describe además a continuación en referencia a las clases de cadena lateral de aminoácido. Se pueden introducir sustituciones aminoacídicas en un anticuerpo de interés y cribar los productos para detectar una actividad deseada, por ejemplo, unión a antígeno conservada/mejorada, inmunogenicidad disminuida, o ADCC o CDC mejorada.

[0374] TABLA

[0376]

[0377]

[0379] Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con propiedades de cadena lateral comunes:

[0380] (1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

[0381] (2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

[0382] (3) ácidos: Asp, Glu;

[0383] (4) básicos: His, Lys, Arg;

[0384] (5) residuos que influyen en la orientación de cadena: Gly, Pro;

[0385] (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

[0386] Las sustituciones no conservadoras conllevarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. Un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado). En general, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para su estudio adicional tendrá(n) modificaciones (por ejemplo, mejoras) en determinadas propiedades biológicas (por ejemplo, afinidad incrementada, inmunogenicidad reducida) en relación con el anticuerpo original y/o habrá(n) conservado sustancialmente determinadas propiedades biológicas del anticuerpo original. Una variante de sustitución ejemplar es un anticuerpo madurado en afinidad, que se puede generar convenientemente, por ejemplo, usando técnicas de maduración de la afinidad basadas en presentación en fagos, tales como las descritas en el presente documento. En resumen, se mutan uno o más residuos de HVR y los anticuerpos variantes se presentan en fagos y se criban para detectar una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión).

[0387] Se pueden realizar alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en las HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad de anticuerpo. Dichas alteraciones se pueden realizar en "puntos calientes" de la HVR, es decir, residuos codificados por codones que experimentan una mutación con alta frecuencia durante el proceso de maduración somática (véase, por ejemplo, Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196), y/o residuos que se ponen en contacto con el antígeno, sometiéndose a prueba el VH o VL variante resultante para detectar la afinidad de unión. Se ha descrito la maduración de afinidad construyendo y reseleccionando de colecciones secundarias, por ejemplo, en Hoogenboom, H.R.et al., en Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37. En algunos modos de realización de maduración de afinidad, se introduce diversidad en los genes variables elegidos para su maduración por cualquiera de una variedad de procedimientos (por ejemplo, PCR propensa a error, reordenamiento de cadenas o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). A continuación, se crea una colección secundaria. A continuación, se criba la colección para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro procedimiento para introducir diversidad implica enfoques dirigidos a HVR, en los que se aleatorizan varios residuos de HVR (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez). Se pueden identificar específicamente los residuos de HVR implicados en la unión a antígeno, por ejemplo, usando mutagénesis por barrido de alanina o modelado. A menudo se seleccionan como diana, en particular, CDR-H3 y CDR-L3.

[0388] En determinados modos de realización se pueden producir sustituciones, inserciones o deleciones dentro de una o más HVR, siempre que dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo de unirse al antígeno. Por ejemplo, se pueden realizar alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras como se proporciona en el presente documento) que no reduzcan sustancialmente la afinidad de unión en las HVR. Dichas alteraciones, por ejemplo, pueden estar fuera de los residuos que se ponen en contacto con el antígeno en las HVR. En determinados modos de realización de las secuencias de VH y VL variantes proporcionadas anteriormente, cada HVR está inalterada o bien no contiene más de una, dos o tres sustituciones aminoacídicas.

[0389] Un procedimiento útil para la identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que se puede seleccionar como diana para la mutagénesis se llama "mutagénesis por barrido de alanina" como se describe por Cunningham, B.C. y Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085. En este procedimiento se identifica un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos con carga tales como arg, asp, his, lys y glu) y se reemplaza por un aminoácido neutro o con carga negativa (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con el antígeno se ve afectada. Se pueden introducir otras sustituciones en las localizaciones de aminoácidos que demuestren sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. De forma alternativa, o adicionalmente, una estructura cristalina de un complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos adyacentes se pueden seleccionar como diana o eliminar como candidatos para sustitución. Se pueden cribar variantes para determinar si contienen las propiedades deseadas. Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxiterminales que varían en longitud desde un residuo hasta polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuenciales de residuos aminoacídicos individuales o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N terminal. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión en el extremo N o C del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que incrementa la semivida en suero del anticuerpo.

[0391] b) Variantes de glucosilación

[0393] En determinados modos de realización se altera un anticuerpo proporcionado en el presente documento para incrementar o disminuir el grado en el que el anticuerpo se glucosila. La adición o deleción de sitios de glucosilación en un anticuerpo se puede lograr convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que se crea o se retira uno o más sitios de glucosilación. Cuando el anticuerpo comprende una región Fc, se puede alterar el carbohidrato fijado a la misma. Los anticuerpos naturales producidos por células de mamífero comprenden típicamente un oligosacárido biantenario ramificado que se fija en general por un enlace N a Asn297 del dominio CH2 de la región Fc (véase, por ejemplo, Wright, A. y Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32). El oligosacárido puede incluir diversos carbohidratos, por ejemplo, manosa, N-acetilglucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como una fucosa fijada a una GlcNAc en el "tallo" de la estructura de oligosacárido biantenario. En algunos modos de realización se pueden realizar modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la invención para crear variantes de anticuerpo con determinadas propiedades mejoradas.

[0395] c) Variantes de región Fc

[0397] En determinados modos de realización se pueden introducir una o más modificaciones aminoacídicas en la región Fc de un anticuerpo proporcionado en el presente documento, generando de este modo una variante de región Fc. La variante de región Fc puede comprender una secuencia de región Fc humana (por ejemplo, una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación aminoacídica (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones aminoacídicas.

[0399] En determinados modos de realización, la invención contempla una variante de anticuerpo que posee algunas, pero no todas, las funciones efectoras, que le convierten en un candidato deseable para aplicaciones en las que la semivida del anticuerpoin vivoes importante, aunque determinadas funciones efectoras (tales como el complemento y ADCC) son innecesarias o perjudiciales. Se pueden llevar a cabo ensayos de citotoxicidadin vitroy/oin vivopara confirmar la reducción/disminución de las actividades CDC y/o ADCC. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo ensayos de unión a receptor de Fc (FcR) para garantizar que el anticuerpo carece de unión a FcγR (de ahí que probablemente carece de actividad ADCC), pero conserva su capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para mediar en la ADCC, los linfocitos NK, expresan solo FcγRIII, mientras que los monocitos expresan FcγRI, FcγRII y FcγRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch, J.V. y Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492. Los ejemplos no limitantes de ensayosin vitropara evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés se describen en el documento US 5.500.362 (véanse, por ejemplo, Hellstrom, I.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063; y Hellstrom, I.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502); documento US 5.821.337 (véase Bruggemann, M.et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361). De forma alternativa, se pueden emplear procedimientos de ensayos no radioactivos (véanse, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc., Mountain View, CA); y el ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96<®>(Promega, Madison, WI)). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, se puede evaluarin vivola actividad ADCC de la molécula de interés, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes, R.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656. También se pueden llevar a cabo ensayos de unión a C1q para confirmar que el anticuerpo no se puede unir a C1q y de ahí que carece de actividad CDC. Véase, por ejemplo, ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC (véanse, por ejemplo, Gazzano-Santoro, H.,et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S.,et al., Blood 101 (2003) 1045-1052; y Cragg, M.S. y M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743). También se pueden realizar determinaciones de unión al FcRn y de aclaramiento/semividain vivousando procedimientos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Petkova, S.B.,et al., Int. Immunol.18 (2006: 1759-1769).

[0401] Los anticuerpos con una función efectora reducida incluyen aquellos con una sustitución de uno o más de los residuos de región Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (documento US 6.737.056). Dichos mutantes de región Fc incluyen mutantes de región Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones aminoacídicas 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el denominado mutante de la región Fc "DANA" con la sustitución de los residuos 265 y 297 por alanina (documento US 7.332.581).

[0402] Se describen determinadas variantes de anticuerpo con unión mejorada o disminuida a los FcR (véanse, por ejemplo, los documentos US 6.737.056, WO 2004/056312 y Shields, R.L.et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604).

[0403] En algunos modos de realización, se realizan alteraciones en la región Fc, que dan como resultado una unión a C1q y/o una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) alteradas (es decir, disminuidas), por ejemplo, como se describe en los documentos US 6.194.551, WO 99/51642 e Idusogie, E.E.,et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184.

[0404] En el documento US 2005/0014934, se describen anticuerpos con semividas incrementadas y unión mejorada al receptor de Fc neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer, R.L.et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593 y Kim, J.K.et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434). Estos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fc a FcRn. Dichas variantes de región Fc incluyen aquellas con sustituciones en uno o más residuos de región Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, sustitución del residuo 434 de región Fc (documento US 7.371.826).

[0405] Véanse también Duncan, A.R. y Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; los documentos US 5.648.260; US 5.624.821; y WO 94/29351 en relación con otros ejemplos de variantes de región Fc.

[0406] d) Variantes de anticuerpo genomanipulado con cisteína

[0407] En determinados modos de realización, puede ser deseable crear anticuerpos genomanipulados con cisteína, por ejemplo, "tioMAb", en los que uno o más residuos de un anticuerpo se sustituyen con residuos de cisteína. En modos de realización particulares, los residuos sustituidos se producen en sitios accesibles del anticuerpo. Al sustituir esos residuos con cisteína, los grupos tiol reactivos se sitúan, de este modo, en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden usar para conjugar el anticuerpo con otros restos, tales como restos de fármaco o restos de conector-fármaco, para crear un inmunoconjugado, como se describe además en el presente documento. En determinados modos de realización, uno cualquiera o más de los siguientes residuos se puede sustituir con cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración EU) de la región Fc de la cadena pesada. Los anticuerpos genomanipulados con cisteína se pueden generar como se describe, por ejemplo, en el documento US 7.521.541.

[0408] e) Derivados de anticuerpo

[0409] En determinados modos de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento se puede modificar además para que contenga restos no proteínicos adicionales que son conocidos en la técnica y están fácilmente disponibles. Los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, polímeros hidrosolubles. Los ejemplos no limitantes de polímeros hidrosolubles incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o bien copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(nvinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de poli(óxido de propileno)/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), poli(alcohol vinílico) y mezclas de los mismos. El polietilenglicol-propionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. El número de polímeros fijados al anticuerpo puede variar y, si se fija más de un polímero, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, se puede determinar el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización en base a consideraciones que incluyen, pero sin limitarse a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que se van a mejorar, si el derivado de anticuerpo se usará en un tratamiento en condiciones definidas, etc. En otro modo de realización se proporcionan conjugados de un anticuerpo y un resto no proteínico que se pueden calentar selectivamente por exposición a la radiación. En un modo de realización, el resto no proteínico es un nanotubo de carbono (Kam, N.W.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye, pero no se limita a, longitudes de onda que no dañan células normales, pero que calientan el resto no proteínico hasta una temperatura a la que las células próximas al anticuerpo-resto no proteínico se destruyen.

[0410] B. Procedimientos y composiciones recombinantes

[0411] Los anticuerpos se pueden producir usando procedimientos y composiciones recombinantes, por ejemplo, como se describe en el documento US 4.816.567. En el presente documento se describe un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-tau(pS422) humana. Dicho ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende el VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo (por ejemplo, las cadenas ligeras y/o pesadas del anticuerpo). Se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden dicho ácido nucleico. Se proporciona una célula huésped que comprende dicho ácido nucleico. Una célula huésped comprende (por ejemplo, se ha transformado con): (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo. La célula huésped es eucariota, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o célula linfática (por ejemplo, célula Y0, NS0, Sp20). Se proporciona un procedimiento de preparación de un anticuerpo anti-tau(pS422) humana, en el que el procedimiento comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, como se proporciona anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo y, opcionalmente, recuperar el anticuerpo de la célula huésped (o medio de cultivo de células huésped).

[0412] Para la producción recombinante de un anticuerpo anti-tau(pS422) humana, el ácido nucleico que codifica un anticuerpo, por ejemplo, como se describe anteriormente, se aísla y se inserta en uno o más vectores para su clonación y/o expresión adicional en una célula huésped. Dicho ácido nucleico se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas, que se pueden unir específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo).

[0413] Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión de vectores que codifican el anticuerpo incluyen las células procariotas o eucariotas descritas en el presente documento. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos en bacterias, en particular, cuando no se necesitan la glucosilación ni la función efectora de Fc. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, véanse, por ejemplo, los documentos US 5.648.237, US 5.789.199 y US 5.840.523. (Véase también Charlton, K.A., en: Methods in Molecular Biology, vol.

[0414] 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpo enE. coli). Después de la expresión, se puede aislar el anticuerpo de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente.

[0415] Además de procariotas, los microbios eucariotas tales como los hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican el anticuerpo, incluyendo cepas de hongos y levaduras con vías de glucosilación que se han "humanizado", dando como resultado la producción de un anticuerpo con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véanse Gerngross, T.U., Nat. Biotech.22 (2004) 1409-1414; y Li, H.et al., Nat. Biotech.24 (2006) 210-215.

[0416] Las células huésped adecuadas para la expresión del anticuerpo glucosilado también se derivan de organismos pluricelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus que se pueden usar junto con células de insecto, en particular para la transfección de células deSpodoptera frugiperda.

[0417] También se pueden utilizar cultivos de células vegetales como huéspedes. Véanse, por ejemplo, los documentos US 5.959.177, US 6.040.498, US 6.420.548, US 7.125.978 y US 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas).

[0418] También se pueden usar células de vertebrado como huéspedes. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas celulares de mamífero que se adapten al cultivo en suspensión. Otros ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 como se describe, por ejemplo, en Graham, F.L.et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74); células de riñón de cría de hámster (BHK); células de Sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en in Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252); células de riñón de mono (CV1); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA); células de riñón canino (MDCK); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A); células de pulmón humano (W138); células de hígado humano (Hep G2); células de tumor mamario de ratón (MMT 060562); células TRI, como se describe, por ejemplo, en Mather, J.P.et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; células MRC 5; y células FS4. Otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO DHFR-(Urlaub, G.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); y líneas celulares de mieloma, tales como Y0, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos, véase, por ejemplo, Yazaki, P. y Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp.255-268.

[0419] C. Ensayos

[0420] Los anticuerpos anti-tau(pS422) humana proporcionados en el presente documento se pueden identificar, cribar para determinar o caracterizar para determinar sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas por diversos ensayos conocidos en la técnica.

[0421] 1. Ensayos de unión y otros ensayos

[0422] Un anticuerpo de la invención se puede someter a prueba para determinar su actividad de unión a antígeno, por ejemplo, por procedimientos conocidos, tales como ELISA, alphaLISA, inmunoelectrotransferencia, matriz de anticuerpos o de fase inversa, etc.

[0423] En un ensayo ELISA o alphaLISA ejemplar, se une tau(pS422) en solución (por ejemplo, en sobrenadantes celulares, lisados de células o tejidos, líquidos corporales, etc.) por un anticuerpo de captura, que se une específicamente a un primer epítopo en tau(pS422), o tau(pS422) en una determinada conformación y un anticuerpo de detección acoplado a una entidad de detección, que se une específicamente a un segundo epítopo o conformación de tau(pS422). La lectura se basa en la entidad de detección (quimioluminiscencia, fluorescencia, luminiscencia inducida por transferencia de energía, etc.). En algunos casos, se puede usar el mismo anticuerpo en el mismo ensayo que el anticuerpo de captura y detección para detectar formas agregadas de tau(pS422) (véase, por ejemplo, Tokuda, T.et al., Neurology 75 (2010) 1766-1772).

[0424] En el caso de la matriz de anticuerpos, se colocan los anticuerpos sobre chips de vidrio o nitrocelulosa. Se bloquean los portaobjetos y se incuban con una solución que contiene tau(pS422), se lavan para retirar los anticuerpos no unidos y se detectan los anticuerpos unidos con un anticuerpo secundario correspondiente marcado de forma fluorescente. Se mide la señal de fluorescencia con un escáner de portaobjetos para fluorescencia. De forma similar para una matriz de fase inversa, se colocan tau(pS422) recombinante, sobrenadante celular, lisados de células o tejidos, líquidos corporales, etc., sobre chips de vidrio o nitrocelulosa. Se bloquean los portaobjetos y se incuban las matrices individuales con un anticuerpo contra un epítopo específico en tau(pS422). Se retiran por lavado los anticuerpos no unidos y se detectan los anticuerpos unidos con un anticuerpo secundario correspondiente marcado de forma fluorescente. Se mide la señal de fluorescencia por un escáner de portaobjetos para fluorescencia (Dernick, G.,et al., J. Lipid Res.52 (2011) 2323-2331).

[0425] En el ejemplo de inmunoelectrotransferencia, se separa por peso molecular tau(pS422) recombinante agregada o tau(pS422) derivada de, por ejemplo, sobrenadante celular, lisados de células o tejidos, líquidos corporales, etc., en SDS PAGE o condiciones de gel natural y se transfiere a una membrana de nitrocelulosa o PVDF. Después del bloqueo, se incuba la membrana con anticuerpos específicos para una secuencia de aminoácidos o conformaciones de tau(pS422).

[0426] Después de esto, se lava la membrana para retirar el anticuerpo no unido. Se detectan los anticuerpos unidos por los anticuerpos secundarios correspondientes acoplados a entidades de detección para quimioluminiscencia o fluorescencia u otros medios de detección. Se unirán anticuerpos específicos para las secuencias de aminoácidos de tau(pS422) a tau(pS422) en diversas formas agregadas y, de ahí, pesos moleculares, siempre que el epítopo no se enmascare por la agregación. Por otra parte, los anticuerpos específicos de conformación detectarán solo determinadas formas agregadas de tau(pS422) revelando solo bandas a pesos moleculares específicos (véase, por ejemplo, Towbin, H.,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 4350-4353; Burnette, W.N., Anal. Biochem.112 (1981) 195-203).

[0427] Se pueden usar ensayos de competencia para identificar un anticuerpo que compite con el anticuerpo (humanizado) como se informa en el presente documento por su unión a tau(pS422) humana. Un anticuerpo competidor de este tipo se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o uno conformacional) que se une por el anticuerpo (humanizado) como se informa en el presente documento. Los procedimientos ejemplares detallados para cartografiar un epítopo al que se une un anticuerpo se proporcionan en Morris, G.E. (ed.), Epitope Mapping Protocols, en: Methods in Molecular Biology, vol.66, Humana Press, Totowa, NJ (1996).

[0428] En un ensayo de competencia ejemplar, se incuba tau(pS422) humana inmovilizada en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une a tau(pS422) humana y un segundo anticuerpo no marcado que se somete a prueba para determinar su capacidad de competir con el primer anticuerpo por su unión a tau(pS422) humana. Como control, se incuba tau(pS422) humana inmovilizada en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado, pero no el segundo anticuerpo no marcado. Después de su incubación, en condiciones que permitan la unión del primer anticuerpo a tau(pS422) humana, se retira el anticuerpo no unido en exceso y se mide la cantidad de marcador asociado con tau(pS422) humana inmovilizada. Si se reduce sustancialmente la cantidad de marcador asociado con tau(pS422) humana inmovilizada en la muestra de prueba en relación con la muestra de control, a continuación, eso indica que el segundo anticuerpo está compitiendo con el primer anticuerpo por su unión a tau(pS422) humana (véase, por ejemplo, Harlow, E. y Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, capítulo 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988)).

[0429] 2. Ensayos de actividad

[0430] Se proporcionan ensayos para identificar anticuerpos anti-tau(pS422) humana de la misma que tengan actividad biológica. La actividad biológica puede incluir, por ejemplo, protección frente a/reducción de/inhibición de la citotoxicidad inducida por tau(pS422) y/o protección frente a/reducción de/inhibición de la transmisión célula a célula de tau(pS422) humana oligomérica, y/o reducción de la actividad caspasa inducida por tau(pS422) en células LUHMES. También se proporcionan anticuerpos que tienen dicha actividad biológicain vivoy/oin vitro. En determinados modos de realización se somete a prueba un anticuerpo de la invención para determinar dicha actividad biológica.

[0431] La actividad biológica protectora se puede evaluar añadiendo medio acondicionado que contenga tau(pS422) segregada, lo que provoca la muerte celular en las células neuronales receptoras. Esta toxicidad se puede invertir añadiendo anticuerpos protectores como se describe en el presente documento. La naturaleza tóxica de tau(pS422) segregada se ha establecido previamente (Emmanouilidou, E.,et al., J. Neurosci., 30 (2010) 6838-6851).

[0432] D. Procedimientos y composiciones para diagnóstico y detección

[0433] Cualquiera de los anticuerpos anti-tau(pS422) humana proporcionados en el presente documento es útil para detectar la presencia de tau(pS422) humana en una muestra biológica. El término "detectar", como se usa en el presente documento, engloba la detección cuantitativa o cualitativa. En determinados modos de realización, una muestra biológica comprende una célula o tejido, tal como tejido cerebral.

[0434] Se proporciona un anticuerpo anti-tau(pS422) humana para su uso en un procedimiento de diagnóstico o detección. Se proporciona un procedimiento de detección de la presencia de tau(pS422) humana en una muestra biológica. El procedimiento comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-tau(pS422) humana como se describe en el presente documento en condiciones que permitan la unión del anticuerpo antitau(pS422) humana a tau(pS422) humana, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-tau(pS422) humana y tau(pS422) humana. Dicho procedimiento puede ser un procedimientoin vitrooin vivo. Se usa un anticuerpo anti-tau(pS422) humana para seleccionar sujetos elegibles para tratamiento con un anticuerpo antitau(pS422) humana, por ejemplo, donde Tau(pS422) humana es un biomarcador para la selección de pacientes. Los trastornos ejemplares que se pueden diagnosticar usando un anticuerpo de la invención incluyen neurodegeneración con acumulación de hierro en el cerebro de tipo 1 (NAHC1), insuficiencia neurovegetativa pura, síndrome de Down, complejo de Guam y varios trastornos por cuerpos de Lewy, tales como enfermedad difusa con cuerpos de Lewy (EDCL), la variante con cuerpos de Lewy de la enfermedad de Alzheimer (vCLEA), determinadas formas de enfermedad de Gaucher y la demencia de la enfermedad de Parkinson (DEP).

[0435] Se proporcionan anticuerpos anti-tau(pS422) humana marcados. Los marcadores incluyen, pero no se limitan a, marcadores o restos que se detectan directamente (tales como marcadores fluorescentes, cromóforos, electrodensos, quimioluminiscentes y radioactivos), así como restos, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, a través de una reacción enzimática o interacción molecular. Los marcadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, los radioisótopos<32>P,<14>C,<125>I,<3>H y<131>I, fluoróforos, tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (documento US 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalacindionas, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, β-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacáridos, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte, tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de espín, marcadores de bacteriófagos, radicales libres estables y similares.

[0436] E. Formulaciones farmacéuticas

[0437] Las formulaciones farmacéuticas de un anticuerpo anti-tau(pS422) humana como se describe en el presente documento se preparan mezclando dicho anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16.ª edición, Osol, A. (ed.) (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos farmacéuticamente aceptables, en general, no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen, pero no se limitan a: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como poli(vinilpirrolidona); aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; glúcidos tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG).

[0438] Los vehículos farmacéuticamente aceptables ejemplares en el presente documento incluyen además agentes de dispersión intersticial de fármacos, tales como glucoproteínas de hialuronidasa activa a pH neutro soluble (sHASEGP), por ejemplo, glucoproteínas de hialuronidasa PH-20 soluble humana, tales como rhuPH20 (HYLENEX<®>, Baxter International, Inc.). Determinadas sHASEGP ejemplares y procedimientos de uso, incluyendo rhuPH20, se describen en los documentos US 2005/0260186 y US 2006/0104968. En un modo de realización, una sHASEGP se combina con una o más glucosaminoglucanasas adicionales, tales como condroitinasas.

[0439] Las formulaciones de anticuerpo liofilizadas ejemplares se describen en el documento US 6.267.958. Las formulaciones de anticuerpo acuosas incluyen las descritas en los documentos US 6.171.586 y WO 2006/044908, incluyendo las últimas formulaciones un tampón histidina-acetato.

[0440] La formulación en el presente documento también puede contener más de un ingrediente activo según sea necesario para la indicación particular que se trata, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se vean afectadas de forma adversa entre sí. Dichos ingredientes activos están presentes de forma adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito previsto.

[0441] Se pueden atrapar ingredientes activos en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de administración de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16.ª edición, Osol, A. (ed.) (1980).

[0442] Se pueden preparar preparaciones de liberación mantenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, estando dichas matrices en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Las formulaciones que se van a usar para su administraciónin vivoson, en general, estériles. La esterilidad se puede lograr fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles.

[0443] Por ejemplo, cuando la indicación que se trata es la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Alzheimer prodrómica, la formulación farmacéutica también puede contener uno o más ingredientes activos adicionales, tales como donepezilo, memantina, rivastigmina, galantamina, rivastigmina, ergoloides mesilatos, un anticuerpo anti-Abeta y un anticuerpo anti-sinucleína alfa.

[0444] F. Procedimientos y composiciones terapéuticos

[0445] Se puede usar cualquiera de los anticuerpos anti-tau(pS422) humana proporcionados en el presente documento en procedimientos terapéuticos.

[0446] En un aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-tau(pS422) humana para su uso como medicamento. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores es preferentemente un ser humano. En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un anticuerpo anti-tau(pS422) humana en la fabricación o preparación de un medicamento. En un modo de realización, el medicamento es para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. En otro modo de realización, el medicamento es para inhibir la citotoxicidad inducida por tau(pS422) en neuronas y neurogliocitos humanos, o para inhibir la transmisión célula a célula de tau(pS422) humana oligomérica entre neuronas y neurogliocitos, o para reducir la actividad caspasa inducida por tau(pS422). En otro modo de realización, el medicamento es para su uso en un procedimiento de inhibición de la citotoxicidad inducida por tau(pS422) en neuronas y neurogliocitos humanos, o inhibición de la transmisión célula a célula de tau(pS422) humana oligomérica entre neuronas y neurogliocitos, o reducción de la actividad caspasa inducida por tau(pS422) en un individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del medicamento para inhibir la citotoxicidad inducida por tau(pS422) en neuronas y neurogliocitos humanos, o para inhibir la transmisión célula a célula de tau(pS422) humana oligomérica entre neuronas y neurogliocitos, o para reducir la actividad caspasa inducida por tau(pS422). Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede ser un ser humano.

[0447] En otro aspecto, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos anti-tau(pS422) humana de acuerdo con la invención, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los procedimientos terapéuticos anteriores. En un modo de realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-tau(pS422) humana de acuerdo con la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro modo de realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-tau(pS422) humana de acuerdo con la invención y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación.

[0448] Los anticuerpos de la invención se pueden usar solos o bien en combinación con otros agentes en un tratamiento. Por ejemplo, se puede administrar conjuntamente un anticuerpo de la invención con al menos un agente terapéutico adicional.

[0449] Dichas politerapias indicadas anteriormente engloban la administración combinada (donde se incluyen dos o más agentes terapéuticos en la misma formulación o en formulaciones separadas) y la administración separada, caso en el que la administración del anticuerpo de la invención se puede producir antes de, simultáneamente a y/o tras, la administración del agente o agentes terapéuticos adicionales. En un modo de realización, la administración del anticuerpo anti-tau(pS422) humana y la administración de un agente terapéutico adicional se produce en aproximadamente un mes, o en aproximadamente una, dos o tres semanas, o en aproximadamente uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis días, entre sí.

[0450] Un anticuerpo de la invención (y cualquier agente terapéutico adicional) se puede administrar por cualquier medio adecuado, incluyendo administración parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para tratamiento local, intralesional. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. La dosificación puede ser por cualquier vía adecuada, por ejemplo, por inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo, en parte, de si la administración es breve o crónica. En el presente documento se contemplan diversas pautas posológicas incluyendo, pero sin limitarse a, administraciones únicas o múltiples durante diversos puntos temporales, administración por inyección intravenosa rápida e infusión pulsada.

[0451] Los anticuerpos de la invención se formularán, dosificarán y administrarán de forma consecuente con las buenas prácticas médicas. Los factores para su consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se trata, el mamífero particular al que se trata, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de suministro del agente, el procedimiento de administración, la programación de la administración y otros factores conocidos por los médicos. No es necesario, pero el anticuerpo se formula opcionalmente con uno o más agentes usados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, del tipo de trastorno o tratamiento y de otros factores analizados anteriormente. Estos se usan, en general, en las mismas dosificaciones y con las vías de administración como se describe en el presente documento, o aproximadamente de un 1 a un 99 % de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosificación y por cualquier vía que se determine empíricamente/clínicamente que es apropiada.

[0452] Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada de un anticuerpo de la invención (cuando se usa solo o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, el tipo de anticuerpo, la gravedad y evolución de la enfermedad, si se administra el anticuerpo con propósitos preventivos o terapéuticos, tratamiento previo, anamnesis del paciente y respuesta al anticuerpo y el criterio del médico especialista. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, de aproximadamente 1 µg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,5 mg/kg - 10 mg/kg) de anticuerpo puede ser una dosificación candidata inicial para su administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas o por infusión continua. Una dosificación diaria típica podría variar de aproximadamente 1 µg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento se mantendría, en general, hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de enfermedad. Una dosificación ejemplar del anticuerpo estaría en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Por tanto, se pueden administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). Dichas dosis se pueden administrar de forma intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el paciente recibe de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o por ejemplo, aproximadamente seis dosis del anticuerpo). Se puede administrar una dosis de carga mayor inicial, seguido de una o más dosis menores. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas posológicas. El progreso de este tratamiento se supervisa fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.

[0453] Por ejemplo, cuando la indicación que se trata es enfermedad de Alzheimer o enfermedad de Alzheimer prodrómica, el agente terapéutico adicional se puede seleccionar de donepezilo, memantina, rivastigmina, galantamina, rivastigmina, ergoloides mesilatos, un anticuerpo anti-Abeta y un anticuerpo anti-sinucleína alfa. Se entiende que se puede llevar a cabo cualquiera de las formulaciones o procedimientos terapéuticos anteriores usando un inmunoconjugado de la invención en lugar de o además de un anticuerpo anti-tau(pS422) humana.III. Artículos de fabricación

[0454] Se divulga un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una ficha técnica o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas, bolsas de solución i.v., etc. Los recipientes se pueden formar a partir de una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que, por sí misma o combinada con otra composición, es eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y puede tener una vía de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo de la invención. La ficha técnica o prospecto del envase indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un anticuerpo de la invención; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende otro agente citotóxico o de otro modo terapéutico. El artículo de fabricación puede comprender además un prospecto del envase que indica que las composiciones se pueden usar para tratar una afección particular. De forma alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyectables (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.

[0455] Se entiende que cualquiera de los artículos de fabricación anteriores puede incluir un inmunoconjugado de la invención en lugar de o además de un anticuerpo anti-tau(pS422) humana.

[0456] IV. Modos de realización específicos

[0457] 1. Un anticuerpo humanizado que se une específicamente a tau(pS422) humana, en el que el anticuerpo comprende

[0458] a) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 76 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 78, o

[0459] b) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 19 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 78, o

[0460] c) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 76 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 80.

[0461] 2. Un anticuerpo biespecífico humanizado que comprende

[0462] i) un primer sitio de unión seleccionado de

[0463] a) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 76 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 78, o

[0464] b) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 76 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 80,

[0465] y

[0466] ii) un segundo sitio de unión seleccionado de

[0467] a) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 82 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 85, o

[0468] b) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 83 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 85, o

[0469] c) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 84 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 85.

[0470] 3. El anticuerpo humanizado de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 2, en el que el anticuerpo es para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

[0471] 4. El anticuerpo humanizado de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 3, en el que el anticuerpo tiene una función efectora inactiva.

[0472] 5. El anticuerpo humanizado de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 4, en el que el anticuerpo no tiene función efectora.

[0473] 6. El anticuerpo humanizado de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 5, en el que el anticuerpo i) se une específicamente a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 03, y/o

[0474] ii) no se une a tau humana de longitud completa (SEQ ID NO: 01) a 1 µg/ml, y/o

[0475] iii) se une específicamente a tau humana de longitud completa fosforilada en la serina en la posición 422 (SEQ ID NO: 02), y/o

[0476] iv) se une específicamente a agregados de tau humana fosforilada en la serina en la posición 422 (SEQ ID NO: 02).

[0477] 7. El anticuerpo humanizado de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 6, en el que el anticuerpo tiene un valor de CE<50>para

[0478] a) el fragmento de tau(pS422) humana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 03 de 6 ng/ml o menos, y/o

[0479] b) la tau(pS422) humana de longitud completa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 02 de 4,5 ng/ml o menos, y/o

[0480] c) agregados de tau(pS422) humana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 02 de 30 ng/ml o menos, y/o

[0481] d) la tau humana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 01 y que tiene la mutación aminoacídica S422A de 125 ng/ml o menos.

[0482] 8. El anticuerpo humanizado de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 7, en el que el anticuerpo se une específicamente a tau(pS422) humana (SEQ ID NO: 02) y no se une a tau humana (SEQ ID NO: 01).

[0483] 9. El anticuerpo humanizado de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 8, en el que el anticuerpo tiene en el dominio variable de la cadena pesada en las posiciones 4, 24 y 78, un residuo de valina.

[0484] 10. El anticuerpo humanizado de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 9, en el que el anticuerpo tiene en el dominio variable de la cadena pesada en la posición 71 un residuo de arginina.

[0485] 11. El anticuerpo humanizado de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 10, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

[0486] 12. El anticuerpo humanizado de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 11, en el que el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo que se une a tau(pS422) humana y

[0487] i) se une específicamente a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 03, y/o

[0488] ii) no se une a tau humana de longitud completa (SEQ ID NO: 01) a 1 µg/ml, y/o

[0489] iii) se une específicamente a tau humana de longitud completa fosforilada en la serina en la posición 422 (SEQ ID NO: 02), y/o

[0490] iv) se une específicamente a agregados de tau humana fosforilada en la serina en la posición 422 (SEQ ID NO: 02), y/o

[0491] v) se une específicamente a tau humana de longitud completa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 01 y que tiene la mutación aminoacídica S422A, y/o

[0492] vi) tiene un valor de CE<50>para el fragmento de tau(pS422) humana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 03 de 6 ng/ml o menos, y/o

[0493] vii) tiene un valor de CE<50>para la tau(pS422) humana de longitud completa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 02 de 4,5 ng/ml o menos, y/o

[0494] viii) tiene un valor de CE<50>para agregados de tau(pS422) humana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 02 de 30 ng/ml o menos, y/o

[0495] ix) tiene un valor de CE<50>para la tau humana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 01 y que tiene la mutación aminoacídica S422A de 125 ng/ml o menos.

[0496] 13. El anticuerpo humanizado de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 11, en el que el anticuerpo es a) un anticuerpo de longitud completa de la subclase IgG1 humana, o

[0497] b) un anticuerpo de longitud completa de la subclase IgG4 humana, o

[0498] c) un anticuerpo de longitud completa de la subclase IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A y P329G,

[0499] d) un anticuerpo de longitud completa de la subclase IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E y P329G,

[0500] e) un anticuerpo de longitud completa de la subclase IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A y P329G en ambas cadenas pesadas y las mutaciones T366W y S354C en una cadena pesada y las mutaciones T366S, L368A, Y407V e Y349C en la otra cadena pesada respectiva, o

[0501] f) un anticuerpo de longitud completa de la subclase IgG4 humana con las mutaciones S228P y P329G en ambas cadenas pesadas y las mutaciones T366W y S354C en una cadena pesada y las mutaciones T366S, L368A, Y407V e Y349C en la otra cadena pesada respectiva.

[0502] 14. El anticuerpo humanizado de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 13, en el que el anticuerpo tiene en el dominio variable de la cadena ligera en la posición 32, un residuo aminoacídico lisina (K) (numeración de acuerdo con Kabat).

[0503] 15. Una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo humanizado de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 14 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

[0504] 16. La formulación farmacéutica de acuerdo con el punto 15, que comprende además un agente terapéutico adicional.

[0505] 17. La formulación farmacéutica de acuerdo con el punto 16, en la que el agente terapéutico adicional es un agente terapéutico antiamiloide.

[0506] 18. La formulación farmacéutica de acuerdo con el punto 17, en la que el agente terapéutico antiamiloide es un anticuerpo anti-sinucleína alfa humana o un anticuerpo anti-Abeta.

[0507] 19. El anticuerpo humanizado de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 14 para su uso como medicamento.

[0508] 20. El anticuerpo humanizado de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 14 para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

[0509] 21. El anticuerpo humanizado de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 14 para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer prodrómica.

[0510] 22. El anticuerpo humanizado de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 14 para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer leve.

[0511] 23. El anticuerpo humanizado de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 14, en el que el anticuerpo i) se une a tau(pS422) en cortes cerebrales de ratones transgénicos con tau(pS422) y pacientes con enfermedad de Alzheimer; y/o marcadores tau(pS422) en células transgénicas con tau(pS422).

[0512] 24. El anticuerpo humanizado de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 14, en el que el anticuerpo se une específicamente a/reconoce formas pertinentes para la enfermedad en fase precoz y tardía de tau(pS422) humana.

[0513] V. Ejemplos

[0514] Los siguientes son ejemplos de procedimientos y composiciones de la invención. Se entiende que se pueden poner en práctica otros modos de realización diversos, dada la descripción general proporcionada anteriormente.

[0515] Materiales y procedimientos

[0516] Técnicas de ADN recombinante

[0517] Se usaron procedimientos estándar para manipular el ADN como se describe en Sambrook, J.et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Se usaron los reactivos biológicos moleculares de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

[0518] Síntesis génica y oligonucleotídica

[0519] Se prepararon segmentos de genes deseados por síntesis química en Geneart GmbH (Ratisbona, Alemania). Los fragmentos de genes sintetizados se clonaron en un plásmido enE. colipara su propagación/amplificación. Las secuencias de ADN de los fragmentos de genes subclonados se verificaron por secuenciación de ADN. De forma alternativa, se ensamblaron fragmentos cortos de ADN sintético por hibridación de oligonucleótidos sintetizados químicamente o por medio de PCR. Se prepararon los oligonucleótidos respectivos por metabion GmbH (Planegg-Martinsried, Alemania).

[0520] Reactivos

[0521] Todos los productos químicos, anticuerpos y kits comerciales se usaron como se proporcionaron de acuerdo con el protocolo del fabricante, si no se establece de otro modo.

[0522] Ejemplo 1

[0523] Preparación y purificación de anticuerpos de conejo

[0524] Inmunización

[0525] Se usaron conejos blancos de Nueva Zelanda (NZW) de Charles River Laboratories International, Inc. para la inmunización. Se disolvió el péptido fosforilado de tau (416-430)[pS422] acoplado en hemocianina de lapa californiana (KLH) en tampón de K<3>PO<4>, pH 7,0, a una concentración de 1 mg/ml y se mezcló (1:1) con adyuvante de Freund completo (CFA) hasta la generación de una emulsión estable. Tres conejos recibieron una inyección intradérmica (i.d.) de 2 ml de emulsión seguida de una segunda inyección intramuscular (i.m.) y una tercera subcutánea (s.c.), cada una de 1 ml, en un intervalo de una semana. La cuarta inyección i.m. de 1 ml se realizó dos semanas después, seguida de otras dos inyecciones s.c. de 1 ml en un intervalo de cuatro semanas. Se recogieron muestras de sangre completa periférica de 10 ml de cada animal 4-6 días después de la tercera, cuarta, quinta y sexta inyección y se usaron para la separación de células individuales en FACS. Se recogieron 0,5 ml adicionales de suero de cada animal al mismo tiempo y se usaron para la determinación de la producción de anticuerpos específicos contra tau (416-463)[pS422].

[0526] Producción de anticuerpos

[0527] Se determinó la producción de anticuerpos frente a la inmunización por dilución sucesiva de sueros usando un ELISA, en el que se incubaron 30 ng por pocillo de tau (416-430)[pS422] biotinilada en PBS 1x a 4 °C durante la noche en placas de microvaloración de 96 pocillos recubiertas previamente con estreptavidina (MC1347, Micro Coat Biotechnologie GmbH, Bernried, Alemania). Para la detección, se usó anticuerpo anti-IgG de conejo caprino enlazado a una peroxidasa de rábano picante (The Jackson laboratory) a una dilución 1:16000. Se usó sustrato BM Blue POD, que precipita tetrametilbencidina (TMB), solución lista para su uso de Roche Diagnostics GmbH para la visualización. Se detuvo la reacción por medio de HCl 1 N y se midió en Tecan Infinite por 450/690 nm.

[0528] Clonación de linfocitos B

[0529] Recubrimiento de placas

[0530] Se incubaron placas estériles de 6 pocillos recubiertas con estreptavidina (calidad para cultivo celular) con una mezcla de 3 péptidos de control biotinilados (tau (416-430) no fosforilada, MCAK_humana (88-102)[95-pSer] y MAP2_humana (1802-1816)[pSer-1802]) o bien con el péptido fosforilado de tau (416-430)[pS422] biotinilada cada uno en una concentración a 0,5-1 µg/ml en PBS a temperatura ambiente durante 1 h. Se lavaron las placas en PBS estéril tres veces antes de su uso. Se recubrieron placas de 6 pocillos de cultivo celular con 2 µg/ml de KLH (hemocianina de lapa californiana) en tampón carbonato (bicarbonato de sodio 0,1 M, hidrogenocarbonato de disodio 34 mM, pH 9,55) durante la noche a 4 °C. Se lavaron las placas en PBS estéril tres veces antes de su uso.

[0531] Aislamiento de leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) de conejo

[0532] Se diluyó dos veces EDTA que contenía sangre completa con PBS 1x antes de la centrifugación por densidad en Lympholyte Mammal (Cedarlane Laboratories) que se realizó para aislar PBMC de conejo. Se lavaron los PBMC dos veces antes de la tinción con anticuerpos.

[0533] Medio EL-4 B5

[0534] RPMI 1640 (Pan Biotech, Aidenbach, Alemania) complementado con FCS al 10 % (Hyclone, Logan, UT, EE. UU.), glutamina 2 mM, solución de penicilina/estreptomicina al 1 % (PAA, Pasching, Austria), piruvato de sodio 2 mM, HEPES 10 mM (PAN Biotech, Aidenbach, Alemania) y β-mercaptoetanol 0,05 mM (Gibco, Paisley, Escocia).

[0535] Disminución de macrófagos/monocitos

[0536] Se usaron placas de 6 pocillos estériles (calidad para cultivo celular) para disminuir los macrófagos y monocitos a través de adhesión inespecífica. Se recubrieron los pocillos con KLH (hemocianina de lapa californiana) o bien con estreptavidina y los péptidos de control. Se llenó cada pocillo como máximo con 4 ml de medio y hasta 6x10<6>linfocitos monomorfonucleares en la sangre periférica del conejo inmunizado y se dejó que se unieran durante 1 h a 37 °C en la estufa de incubación. Se usaron el 50 % de las células en el sobrenadante para la etapa de fijación; el 50 % de células restantes se sometieron directamente a tinción inmunofluorescente y separación de células individuales.

[0537] Fijación de linfocitos B en péptidos

[0538] Se sembraron placas de cultivo hístico de 6 pocillos recubiertas con estreptavidina y el péptido de tau (416-430)[pS422] biotinilado con hasta 6x10<6>células por 4 ml de medio y se dejó que se unieran durante 1 h a 37 °C en la estufa de incubación. Se retiraron las células no adheridas lavando cuidadosamente los pocillos 1-2 veces con PBS 1x. Se desprendieron las células adheridas restantes por tripsina durante 10 min a 37 °C en la estufa de incubación y, a continuación, se lavaron dos veces en los medios. Se mantuvieron las células en hielo hasta la tinción con inmunofluorescencia.

[0539] Tinción inmunofluorescente y separación de células individuales

[0540] El anticuerpo anti-IgG de conejo FITC usado para la separación de células individuales era de AbD Serotec (STAR121F, Düsseldorf, Alemania). Para la tinción de superficie, se incubaron las células de la etapa de disminución y fijación con anticuerpo anti-IgG de conejo conjugado con FITC en PBS durante 30 min de rodamiento en la cámara frigorífica a 4 °C en la oscuridad. Tras la centrifugación, se retiraron los sobrenadantes por aspiración. Se sometieron los PBMC a 2 ciclos de centrifugación y lavado con PBS enfriada con hielo. Finalmente, se resuspendieron los PBMC en PBS enfriada con hielo y se sometieron de inmediato a análisis por FACS. Se añadió yoduro de propidio a una concentración de 5 µg/ml (BD Pharmingen, San Diego, CA, EE. UU.) antes de los análisis por FACS para discriminar entre células muertas y vivas. La FACS se realizó usando un Becton Dickinson FACSAria equipado con el programa informático FACSDiva (BD Biosciences, EE. UU.) y se depositaron células vivas individuales marcadas con FITC en placas de 96 pocillos.

[0541] Cultivo de linfocitos B

[0542] Se prepararon cultivos de linfocitos B por un procedimiento similar al descrito por Zubler, R.H.et al., J. Immunol.

[0543] 134 (1985) 3662-3668. En resumen, se cultivaron linfocitos B separados individuales en placas de 96 pocillos con 210 μl/pocillo de medio EL-4 B5 con células Pansorbin (1:20000) (Calbiochem (Merck), Darmstadt, Alemania), sobrenadante de timocitos de conejo al 5 % y células de timoma murino EL-4-B5 irradiadas con radiación gamma (2 × 10<4>/pocillo) durante 7 días a 37 °C en una atmósfera de CO<2>al 5 % en la estufa de incubación. Se retiraron los sobrenadantes de cultivo de linfocitos B para cribado y se recogieron las células de inmediato para la clonación o congelación del gen de la región variable a -80 °C en 100 μl de tampón RLT (Qiagen, Hilden, Alemania).

[0544] Cribado de clones de linfocitos B

[0545] Se cribaron sobrenadantes de cultivo de linfocitos B para determinar su unión a tau (416-430)[pS422] biotinilada por ELISA. Se usaron tau (416-430) no fosforilada, KLH (hemocianina de lapa californiana) y el péptido fosforilado no relacionado MCAK_humana (88-102)[95-pSer] como antígenos de control. Para la preparación de placas de ELISA, se incubaron placas de microvaloración recubiertas previamente con estreptavidina con tau (415-430)[pS422] biotinilada a 50 ng/ml durante 1 hora a temperatura ambiente. El recubrimiento con KLH o péptidos de control se realizó a 1 µg/ml. Se diluyeron los sobrenadantes de linfocitos B de 1:5 a 1:10 y se incubaron en las placas de microvaloración recubiertas con antígeno durante 60 min. Después de lavado intensivo, se detectó la unión de los anticuerpos de conejo usando un anticuerpo de detección anti-IgG de conejo ovino conjugado con digoxigenina (Chemicon AQ301D). Después de la incubación con TMB a temperatura ambiente, se midió la absorbancia a 370 nm-492 nm. Los clones de linfocitos B que proporcionan señales por encima del fondo con tau (416-430)[pS422] biotinilada pero no con KLH y MCAK_humana (88-102)[95-pSer] se consideraron adicionalmente y se sometieron a clonación génica de la región variable.

[0546] Amplificación por PCR de dominios V y secuenciación

[0547] Se preparó ARN total usando el kit de ARN NucleoSpin<®>8/96 (Macherey y Nagel; 740709.4, 740698) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se realizaron todas las etapas en un sistema de manipulación de líquidos epMotion 5075 (Eppendorf). Se eluyó el ARN con 60 µl de agua sin RNasa. Se usaron 6 µl de ARN para generar ADNc por reacción de retrotranscriptasa usando la SuperMix de síntesis de primera hebra Superscript III (Invitrogen 18080-400) y un cebador oligo dT de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usaron 4 µl de ADNc para amplificar las regiones variables de la cadena pesada y ligera de inmunoglobulina (VH y VL) con el AccuPrime SuperMix (Invitrogen 12344-040) en un volumen final de 50 µl usando los cebadores rbHCfinal.up y rbHCfinal.do para la cadena pesada y rbLCfinal.up y rbLCfinal.do para la cadena ligera (véase la tabla a continuación). Las condiciones de PCR fueron como sigue: inicio en caliente a 94 °C durante 5 min; 35 ciclos de 20 s a 94 °C, 20 s a 70 °C, 45 s a 68 °C y una extensión final a 68 °C durante 7 min.

[0549] Tabla:

[0551]

[0554] Se cargaron 8 µl de la solución de PCR de 50 µl en un E-Gel 48 al 2 % (Invitrogen G8008-02). Se limpiaron las reacciones de PCR positivas usando el kit NucleoSpin<®>Extract II (Macherey y Nagel; 740609250) de acuerdo con el protocolo del fabricante y se eluyeron en 50 µl de tampón de elución. Se secuenciaron directamente 12 µl de productos de PCR purificados en ambas direcciones usando rbHCfinal.up y rbHCfinal.do para las cadenas pesadas y rbLCfinal.up y rbLCfinal.do para las cadenas ligeras (véase la tabla anterior).

[0556] Expresión recombinante de anticuerpos monoclonales de conejo y anticuerpos quiméricos de conejo/ratón

[0558] Para la expresión recombinante de anticuerpos monoclonales de conejo, se clonaron productos de PCR que codifican VH o VL como ADNc en vectores de expresión por el procedimiento de clonación de extremos cohesivos (Haun, R.S.et al., BioTechniques 13 (1992) 515-518; Li, M.Z.,et al., Nature Methods 4 (2007) 251-256). Los plásmidos de expresión linealizados que codifican la región constante kappa o gamma de conejo e insertos de VL o VH se amplificaron por PCR usando cebadores superpuestos. Se incubaron los productos de PCR purificados con ADN-polimerasa T4, lo que generó extremos cohesivos monocatenarios. Se detuvo la reacción por adición de dCTP. En la siguiente etapa, se combinaron el plásmido y el inserto y se incubaron con RecA, lo que indujo la recombinación específica de sitio. Los plásmidos recombinados se transformaron enE. coli. Al día siguiente, se recogieron las colonias cultivadas y se sometieron a prueba para determinar el plásmido recombinado correcto por preparación de plásmidos, análisis de restricción y secuenciación de ADN. Para la expresión de anticuerpos, se cotransfectaron de forma transitoria los plásmidos de HC y LC aislados en células HEK293 y se recogieron los sobrenadantes después de 1 semana. Para la clonación y expresión de anticuerpos quiméricos de conejo y ratón, se amplificaron las regiones VH y VL por PCR y se subclonaron en vectores de expresión que contenían la región constante kappa de ratón o constante gamma 1 de ratón. Se aislaron los plásmidos de HC y LC quiméricos de conejo/ratón, se sometieron a prueba por análisis de restricción y secuenciación de ADN para una inserción correcta y se transfectaron de forma transitoria en células HEK293. Se recogieron los sobrenadantes una semana después de la transfección.

[0560] Purificación de anticuerpo

[0562] Se purificaron anticuerpos de conejo expresados de forma recombinante a partir de sobrenadantes de cultivo celular en columnas MabSelectSuRe™ (GE Healthcare). Antes de cargar la muestra, se equilibró la columna con 25 mmol/l de tris-HCl, 25 mmol/l de NaCl, pH 7,4. Se logró la elución del anticuerpo con 50 mmol/l de acetato, pH 3,14. Se cargó de inmediato la muestra eluida en una columna de desalación (Sephadex G25, GE Healthcare) y se eluyó en 20 mmol/l de His-HCl, 140 mmol/l de NaCl, pH 6,0. Se usó también este tampón para el almacenamiento del anticuerpo purificado. La temperatura general de almacenamiento fue de 4 °C, temperatura ambiente durante el procedimiento de purificación y -80 °C después de la alicuotación. Se purificaron los anticuerpos de quimeras de conejo/ratón expresados de forma recombinante a partir de sobrenadantes de cultivo celular en columnas MabSelectSuRe™ (GE Healthcare). Antes de cargar la muestra, se equilibró la columna con PBS 1x, pH 7,4. Se logró la elución de los anticuerpos con 100 mmol/l de citrato, pH 3,0. Se neutralizó de inmediato la muestra eluida con 2 mol/l de tris/HCl, pH 9,0. Posteriormente, se cargaron los anticuerpos en una columna de exclusión por tamaño (Superdex 200, GE Healthcare) y se eluyeron en 20 mmol/l de His-HCl, 140 mmol/l de NaCl, pH 6,0. Se usó también este tampón para el almacenamiento de los anticuerpos purificados. La temperatura general de almacenamiento fue de 4 °C, temperatura ambiente durante el procedimiento de purificación y -80 °C después de la alicuotación.

[0563] Ejemplo 2

[0564] Los anticuerpos de conejo monoclonales anti-tau pS422 son altamente selectivos para tau fosforilada en pS422 y se unen a agregados fibrilares de tau pS422

[0565] ELISA

[0566] Se expresaron de forma recombinante anticuerpos monoclonales de conejo en células HEK 293. Se sometieron a prueba sobrenadantes de cultivo celular o anticuerpos de conejo purificados para determinar su unión a tau (416-430)[pS422] biotinilada, tau (416-430) no fosforilada, KLH y el péptido fosforilado no relacionado MCAK_humana (88-102)[95-pSer] por ELISA. Para la preparación de las placas de ELISA, se incubaron placas de microvaloración recubiertas previamente con estreptavidina con tau (415-430)[pS422] biotinilada a 50 ng/ml durante 1 hora a temperatura ambiente. El recubrimiento con KLH o péptidos de control se realizó a 1 µg/ml. Se incubaron sobrenadantes que contenían el anticuerpo anti-tau pS422 de conejo (Abcam AB51071) o el anticuerpo de conejo en las placas de microvaloración marcadas con antígeno durante 60 min a diversas concentraciones. Después de lavado intensivo, se detectó la unión de los anticuerpos de conejo usando un anticuerpo de detección anti-IgG de conejo ovino conjugado con digoxigenina (Chemicon AQ301D). Después de incubación con TMB a temperatura ambiente se midió la absorbancia a 370 nm - 492 nm. Se caracterizó la unión de anticuerpo por sus valores de CE50. Se caracterizó la unión de anticuerpo a tau (416-430)[pS422] biotinilada y péptidos de tau (416-430) no fosforilada por sus valores de CE50. Se estimó la reactividad cruzada con el péptido fosforilado de KLH o MCAK por medición de un único punto a altas concentraciones, es decir, a una dilución 1:5 de los sobrenadantes de cultivo celular. Los resultados se muestran en la tabla a continuación. Se descubrió que los valores de CE50 de unión al péptido fosforilado de tau eran más de 100 veces menores que los valores de CE50 de unión al péptido de tau, lo que indica una selectividad de al menos 100 veces para el fragmento de tau fosforilada en comparación con el péptido de tau no fosforilada. La unión al péptido fosforilado de control de KLH y MCAK estaba al nivel de fondo con todos los anticuerpos, que es aproximadamente 1<3 % de las medidas de valor máximo con péptido fosforilado de tau.

[0567] Tabla:

[0569]

[0571] También se sometió a prueba la especificidad para tau pS422 de longitud completa soluble y agregada. Se recubrió con agregados fibrilares de tau pS422 (300 µg/ml) una placa de microvaloración Maxisorb (Nunc) basada en poliestireno durante la noche a temperatura ambiente (t.a.). De manera similar, se recubrió con tau de longitud completa y tau pS422 solubles una placa de microvaloración Maxisorb. Se añadieron control de anticuerpo anti-tau pS422 de conejo (Abcam AB51071) o anticuerpos de conejo purificados y se incubaron durante 60 min en concentraciones de hasta 1000 ng/ml. Después de lavado intensivo, se detectó la unión de los anticuerpos de conejo usando un anticuerpo de detección anti-IgG de conejo ovino conjugado con digoxigenina (Chemicon AQ301D). Después de incubación con TMB a temperatura ambiente se midió la absorbancia a 370 nm - 492 nm. Se caracterizó la unión de anticuerpo por sus valores de CE50. Los resultados se muestran en la siguiente tabla.

[0572] Tabla:

[0574]

[0575]

[0578] Anticuerpos monoclonales de conejo unidos a proteína tau-pS422 con valores de CE50 inferiores a 1 ng/ml. Se detectó tau pS422 fibrilar con valores de CE50 que varían de 0,4 ng/ml a 14 ng/ml. Las señales para la unión a proteína tau de longitud completa no fosforilada no se distinguían de los niveles de fondo. Por lo tanto, se estimó que cada uno de los anticuerpos se une a tau pS422 y tau pS422 fibrilar con una selectividad de al menos 100 veces en comparación con tau.

[0580] BIAcore™

[0582] Se investigó además la unión a agregados de tau pS422 fibrilar y se confirmó por análisis BIAcore™. Se realizaron las mediciones usando el instrumento BIAcore 3000 a 37 °C. El sistema y el tampón de muestra fue HBS-EP (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3,4 mM, Polisorbato 20 al 0,005 % (v/v)). Se sometió un chip sensor CM5 BIAcore™ a un procedimiento de acondicionamiento previo. Se inyectaron secuencialmente SDS al 0,1 %, NaOH 50 mM, HCl 10 mM y H<3>PO<4>100 mM durante 30 s sobre las cubetas de lectura FC1, FC2, FC3 y FC4. El procedimiento de acoplamiento de aminas se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando el asistente BIAcore 3000™ v.4.1. Después de una activación con EDC/NHS de la superficie del sensor, se inmovilizó un anticuerpo anti-tau no fosfoselectivo mAb <TAU> M-4/53-IgG en las cubetas de lectura de sensor FC2, FC3 y FC4. Como control, se capturó un anticuerpo contra CK-MM (isotipo de creatina cinasa), que reconoce un antígeno no pertinente, en la cubeta de lectura FC1. Se diluyeron MAb <TAU>M-4/53-IgG y el anticuerpo contra CK-MM a 30 µg/ml en NaAc 10 mM, pH 5,0 y se inyectaron a 10 µl/min durante 7 min de tiempo de contacto para inmovilizar 10.000 UR del sistema de captura de anticuerpos. Se desactivó la superficie por saturación con etanolamina 1 M. Se acondicionó el sensor por 5 ciclos con proteína tau filamentosa fosforilada (solución madre de 0,3 mg/ml diluida 1:100 en HBS-EP) como analito en solución a 10 µl/min durante 2 min. Se realizó la regeneración con glicina 10 mM, pH 2,5 a 30 µl/min durante 3 min. Se supuso que la unión de analito al mAb 4/53 no disocia los filamentos de ptau, porque no se pudo observar una disociación de los filamentos de ptau del mAb 4/53. Para todos los otros ciclos de medición, se diluyeron 1:100 0,3 mg/ml de filamentos de ptau en tampón HBS-EP y se inyectaron a 10 µl/min durante 1 min para presentar ptau a los analitos de anticuerpo respectivos en un modo intercalado heterogéneo. Se diluyeron los analitos de anticuerpo en tampón HBS-EP a una concentración de 100 nM y se inyectaron en el sistema a 20 µl/min durante 3 min. Después de 3 min de disociación, se regeneró la superficie de sensor por 2 inyecciones de glicina 10 mM, pH 2,5 durante 1 min a 100 µl/min, seguido de un lavado con HBS durante 15 s a 100 µl/min. Se supervisaron la fase de asociación y disociación de las interacciones. Puesto que el analito de anticuerpo en solución es bivalente, se caracterizó la cinética de anticuerpo-ptau cargado de avidez por un modelo de disociación bifásica, que consiste en una etapa de disociación temprana basada en afinidad rápida seguida de una etapa cinética estabilizada por avidez, pero limitante de la velocidad en la disociación de este último complejo. 10 s (temprana) y 50 s (tardía) después del final de la inyección de analito, se cuantificaron la kd y t/2(dis), cuando fue posible. Se evaluaron las mediciones cinéticas usando un procedimiento de doble referencia. En primer lugar, se sustrajo la señal de la referencia FC1 para corregir el efecto global de tampón y la unión inespecífica. En segundo lugar, se sustrajo la inyección de analito 0 nM para corregir la disociación de los anticuerpos primarios del sistema de captura respectivo. Se evaluaron las velocidades cinéticas usando un modelo de ajuste de disociación de Langmuir 1.1 de acuerdo con el programa informático de evaluación BIAcore™ v. 4.1. Se calculó el semitiempo (min) de estabilidad de complejo antígeno/anticuerpo de acuerdo con la fórmula ln(2)/60*kd.

[0584] Los resultados se resumen en la siguiente tabla.

[0586] Tabla:

[0588]

[0589] Ejemplo 3

[0590] Unión de anticuerpos de conejo monoclonales anti-tau pS422 a ptau intracelular en cortes de cerebro de pacientes con enfermedad de Alzheimer

[0591] La detección inmunohistoquímica específica y sensible de una afección por ptau en tejido cerebral afectado por la enfermedad de Alzheimer por anticuerpos anti-tau pS422 de conejo monoclonales se investigó por experimentos de tinción de inmunofluorescencia usando criocortes de tejido cerebral humano de pacientes con EA. Se detectaron las IgG de conejo por anticuerpos secundarios anti-IgG de conejo caprinos conjugados con Alexa Fluor488<®>(Invitrogen/Molecular Probes A1 1034). La tinción específica y sensible de los depósitos y filamentos de ptau era evidente para los clones Mab 005, Mab 019, Mab 020, Mab 085, Mab 086 y Mab 097. Fueron apreciables depósitos de ptau intracelulares, como grandes ovillos neurofibrilares y hebras de neutrófilos alargadas. Se determinó una concentración eficaz mínima que varía entre 0,08 y 0,016 µg/ml para todos los clones investigados, lo que indica una unión altamente sensible a depósitos de ptau humana genuinos.

[0592] Ejemplo 4

[0593] Humanización de anticuerpos anti-tau(pS422) humana de conejo

[0594] El "dominio variable" (dominio variable de una cadena ligera (VL), dominio variable de una cadena pesada (VH)), como se usa en el presente documento, indica cada una del par de dominios de la cadena ligera y pesada que está implicado directamente en la unión del anticuerpo al antígeno tau(pS422). Los dominios de la cadena ligera y pesada variables tienen la misma estructura general y cada dominio comprende cuatro regiones estructurales (FR), con secuencias que están ampliamente conservadas, conectadas por tres "regiones hipervariables".

[0595] Se analizaron las estructuras del dominio VH y del VL del anticuerpo de conejo Mab 086 en el ordenador y se compararon con una base de datos estructural de dominios VH y VL humanos (IMGT). Se eligió un panel de dominios V estructuralmente lo más similares para injertar las CDR del anticuerpo de conejo en los dominios VH y VL humanos elegidos. Además, se tuvieron en cuenta las similitudes en la secuencia primaria para reducir la elección de los dominios V humanos alineando la secuencia primaria del dominio VH y VL del anticuerpo de conejo con el repertorio de dominios V humanos. En algunas variantes de humanización se introdujeron retromutaciones dentro de las regiones estructurales humanas para los residuos originales de conejo. De forma similar, se introdujeron mutaciones en las CDR en algunas variantes, cuando fue apropiado para incrementar potencialmente la afinidad por el antígeno, para mantener la estructura terciaria de la CDR y para retirar rasgos característicos no deseados como los residuos de cisteína o los residuos que pueden experimentar una modificación después de la purificación del anticuerpo.

[0596] Se cotransfectaron los vectores de la cadena pesada y ligera que contenían cada una de las variantes humanizadas en células HEK293 en suspensión en placas de cultivo de microvaloración de manera matricial para obtener cultivos celulares que expresan IgG de tamaño normal de todas las combinaciones posibles de la cadena ligera/pesada. Después de 5 días de cultivo a 37 °C, se recogieron los sobrenadantes y se purificaron por cromatografía de afinidad con proteína A en la escala de microvaloración.

[0597] Ejemplo 5

[0598] Generación de vectores de expresión recombinantes

[0599] a) Generación de vectores para la expresión de cadenas pesadas de inmunoglobulina usando la región constante de IgG1 humana

[0600] Se ensambló el gen de fusión que codifica la cadena pesada humanizada que comprende la región constante de IgG1 humana (CH1, bisagra, CH2, CH3) y un dominio VH de anticuerpo anti-tau(pS422) humana humanizado derivado del anticuerpo de conejo Mab 086 fusionando un fragmento de ADN que codifica el dominio VH de anticuerpo específico anti-tau(pS422) humana respectivo con un elemento de secuencia que codifica la región constante de IgG1 humana.

[0601] La región constante de IgG1 humana tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

[0602]

[0604] (SEQ ID NO: 58).

[0605] El vector de expresión también comprendía un origen de replicación del vector pUC18, lo que permite la replicación de este plásmido enE. coli, y un gen de beta-lactamasa que confiere resistencia a la ampicilina enE. coli.

[0606] La unidad de transcripción de la cadena pesada de anticuerpo comprende los siguientes elementos funcionales en la dirección 5' a 3':

[0607] - el potenciador y promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (P-CMV), incluyendo el intrón A,

[0608] - una región no traducida en 5' (5'UTR) de inmunoglobulina de la cadena pesada humana,

[0609] - una secuencia señal de la cadena pesada de inmunoglobulina murina,

[0610] - un ácido nucleico que codifica el dominio variable de la cadena pesada (VH),

[0611] - un ácido nucleico que codifica la región constante de IgG1 humana, y

[0612] - la secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (pA BGH).

[0613] b) Generación de vectores para la expresión de cadenas ligeras de inmunoglobulina usando la región constante kappa de Ig humana

[0614] Se ensambló el gen de fusión que codifica la cadena ligera kappa humanizada que comprende la región constante kappa de Ig humana (CL-kappa) y un dominio VL (kappa) de anticuerpo anti-tau(pS422) humana derivado del anticuerpo de conejo Mab 086 fusionando un fragmento de ADN que codifica el dominio VL (kappa) de anticuerpo anti-tau(pS422) humana respectivo con un elemento de secuencia que codifica la región constante kappa de Ig humana.

[0615] La región constante kappa de Ig humana tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

[0617]

[0619] (SEQ ID NO: 59).

[0620] El vector de expresión también comprendía un origen de replicación del vector pUC18, lo que permite la replicación de este plásmido enE. coli, y un gen de beta-lactamasa que confiere resistencia a la ampicilina enE. coli.

[0621] La unidad de transcripción de la cadena ligera kappa de anticuerpo comprende los siguientes elementos funcionales en la dirección 5' a 3':

[0622] - el potenciador y promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (P-CMV), incluyendo el intrón A,

[0623] - una región no traducida en 5' (5'UTR) de inmunoglobulina de la cadena pesada humana,

[0624] - una secuencia señal de la cadena pesada de inmunoglobulina murina,

[0625] - un ácido nucleico que codifica el dominio variable de la cadena ligera (VL),

[0626] - un ácido nucleico que codifica la región constante kappa de Ig humana, y

[0627] - la secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (pA BGH).

[0628] c) Generación de vectores para la expresión de cadenas ligeras de inmunoglobulina usando la región constante lambda de Ig humana

[0629] Se ensambló el gen de fusión que codifica la cadena ligera lambda humanizada que comprende la región constante lambda de Ig humana (CL-lambda) y un dominio VL (lambda) de anticuerpo anti-tau(pS422) humana derivado del anticuerpo de conejo Mab 086 fusionando un fragmento de ADN que codifica el dominio VL (lambda) de anticuerpo anti-tau(pS422) humana respectivo con un elemento de secuencia que codifica la región constante lambda de Ig humana.

[0630] La región constante lambda de Ig humana tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

[0632]

[0634] (SEQ ID NO: 60).

[0635] El vector de expresión también comprendía un origen de replicación del vector pUC18, lo que permite la replicación de este plásmido enE. coli, y un gen de beta-lactamasa que confiere resistencia a la ampicilina enE. coli.

[0636] La unidad de transcripción de la cadena ligera lambda de anticuerpo comprende los siguientes elementos funcionales en la dirección 5' a 3':

[0637] - el potenciador y promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (P-CMV), incluyendo el intrón A,

[0638] - una región no traducida en 5' (5'UTR) de inmunoglobulina de la cadena pesada humana,

[0639] - una secuencia señal de la cadena pesada de inmunoglobulina murina,

[0640] - un ácido nucleico que codifica el dominio variable de la cadena ligera (VL),

[0641] - un ácido nucleico que codifica la región constante lambda de Ig humana, y

[0642] - la secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (pA BGH).

[0643] d) Generación de vectores para la expresión de cadenas ligeras kappa de inmunoglobulina usando la región constante kappa de Ig humana

[0644] Se ensambló el gen de fusión que codifica la cadena ligera kappa de Ig humana que comprende la región constante kappa de Ig humana (CL-kappa) y un dominio VL (kappa) de anticuerpo anti-tau(S422) humana derivado del anticuerpo de conejo Mab 086 fusionando un fragmento de ADN que codifica el dominio VL (kappa) de anticuerpo anti-tau(pS422) humana respectivo con un elemento de secuencia que codifica la región constante kappa de Ig humana. La construcción estaba en una organización genómica, es decir, estaban presentes intrones en el péptido señal y entre los dominios VL (kappa) y el CL-kappa.

[0645] El vector de expresión también comprendía un origen de replicación del vector pUC18, lo que permite la replicación de este plásmido enE. coli, y un gen de beta-lactamasa que confiere resistencia a la ampicilina enE. coli.

[0646] La unidad de transcripción de la cadena ligera kappa de anticuerpo comprende los siguientes elementos funcionales en la dirección 5' a 3':

[0647] - el potenciador y promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (P-CMV),

[0648] - una región no traducida en 5' (5'UTR) de inmunoglobulina de la cadena pesada humana,

[0649] - una secuencia señal de la cadena pesada de inmunoglobulina murina,

[0650] - un ácido nucleico que codifica el dominio variable de la cadena ligera (VL),

[0651] - una región constante kappa de IgG humana, y

[0652] - la secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (pA BGH).

[0653] e) Generación de vectores para la expresión de las cadenas ligeras lambda de inmunoglobulina usando la región constante lambda de Ig humana

[0654] Se ensambló el gen de fusión que codifica la cadena ligera lambda de Ig humana que comprende la región constante lambda de Ig humana (CL-lambda) y un dominio VL (lambda) de anticuerpo anti-tau(S422) humana derivado del anticuerpo de conejo Mab 086 fusionando un fragmento de ADN que codifica el dominio VL (lambda) de anticuerpo anti-tau(pS422) humana respectivo con un elemento de secuencia que codifica la región constante lambda de Ig humana. La construcción estaba en una organización genómica, es decir, estaban presentes intrones en el péptido señal y entre los dominios VL (lambda) y el CL-lambda.

[0655] El vector de expresión también comprendía un origen de replicación del vector pUC18, lo que permite la replicación de este plásmido enE. coli, y un gen de beta-lactamasa que confiere resistencia a la ampicilina enE. coli.

[0656] La unidad de transcripción de la cadena ligera lambda de anticuerpo comprende los siguientes elementos funcionales en la dirección 5' a 3':

[0657] - el potenciador y promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (P-CMV),

[0658] - una región no traducida en 5' (5'UTR) de inmunoglobulina de la cadena pesada humana,

[0659] - una secuencia señal de la cadena pesada de inmunoglobulina murina,

[0660] - un ácido nucleico que codifica el dominio variable de la cadena ligera (VL),

[0661] - una región constante lambda de IgG humana, y

[0662] - la secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (pA BGH).

[0663] Ejemplo 6

[0664] Producción recombinante de anticuerpos anti-tau(pS422) humana

[0665] Se produjeron anticuerpos en células HEK293 transfectadas de forma transitoria (derivadas de la línea celular de riñón embrionario humano 293) cultivadas en medio F17 (Invitrogen Corp.). Para la transfección de los vectores respectivos como se describe en el ejemplo 5, se usó el reactivo de transfección "293-Free" (Novagen). Los anticuerpos se expresaron a partir de plásmidos de expresión individuales. Se realizaron las transfecciones como se especifica en las instrucciones del fabricante. Se recogieron sobrenadantes de cultivo celular que contenían anticuerpo recombinante de tres a siete días después de la transfección. Se almacenaron los sobrenadantes a temperatura reducida (por ejemplo, -80 °C) hasta su purificación.

[0666] La información general con respecto a la expresión recombinante de inmunoglobulinas humanas, por ejemplo, en células HEK293, se da en: Meissner, P.et al., Biotechnol. Bioeng.75 (2001) 197-203.

[0667] Ejemplo 7

[0668] Purificación de anticuerpos anti-tau(pS422) humana recombinantes

[0669] Se filtraron y se purificaron los sobrenadantes de cultivo que contenían anticuerpo por dos etapas cromatográficas.

[0670] Se capturaron los anticuerpos por cromatografía de afinidad usando HiTrap MabSelectSuRe (GE Healthcare) equilibrada con PBS (KH<2>PO<4>1 mM, Na<2>HPO<4>10 mM, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM), pH 7,4. Se retiraron las proteínas no unidas por lavado con tampón de equilibrado, y se recuperó el anticuerpo con tampón de citrato 25 M, pH 3,1, que de inmediato después de la elución se ajustó a pH 6,0 con tris-base 1 M, pH 9,0.

[0671] Se usó cromatografía de exclusión por tamaño en Superdex 200™ (GE Healthcare) como segunda etapa de purificación. Se realizó la cromatografía de exclusión por tamaño en tampón histidina 20 mM, NaCl 0,14 M, pH 6,0. Se concentraron las soluciones que contenían anticuerpo con una unidad de filtro centrífugo Ultrafree-CL equipada con una membrana Biomax-SK (Millipore, Billerica, MA, EE. UU.) y se almacenaron a -80 °C.

[0672] Ejemplo 8

[0673] Cribado cinético

[0674] El cribado cinético se realizó de acuerdo con Schraemlet al. (Schraeml, M. y M. Biehl, Methods Mol. Biol. 901 (2012) 171-181) en un instrumento BIAcore 4000, montado con un sensor CM5 BIAcore. El instrumento BIAcore 4000 estaba bajo el control de la versión de programa informático V1.1. Se montó un chip CM5 serie S BIAcore en el instrumento y se dirigió de forma hidrodinámica y se acondicionó previamente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El tampón del instrumento era un tampón HBS-EP (HEPES 10 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, P20 al 0,05 % (p/v)). Se preparó un sistema de captura de anticuerpos en la superficie de sensor. Se inmovilizó un anticuerpo anti-Ig humana caprino policlonal con especificidad de Fc de IgG humana (Jackson Lab.) a 30 µg/ml en tampón de acetato de sodio 10 mM (pH 5) en los puntos 1, 2, 4 y 5 en las cubetas de lectura del instrumento 1, 2, 3 y 4 a 10.000 UR usando química de NHS/EDC. En cada cubeta de lectura, se capturaron los anticuerpos en el punto 1 y el punto 5. El punto 2 y el punto 4 se usaron como puntos de referencia. Se desactivó el sensor con una solución de etanolamina 1 M. Se aplicaron derivados de anticuerpo humanizado a concentraciones entre 44 nM y 70 nM en tampón del instrumento complementado con 1 mg/ml de CMD (carboximetildextrano). Se inyectaron los anticuerpos a un caudal de 30 μl/min durante 2 min. Se midió el nivel de captura (NC) de los anticuerpos presentados en la superficie en unidades de respuesta (UR) rel. Se inyectaron los analitos en solución, proteína tau humana fosforilada, proteína tau humana no fosforilada y la proteína mutante tau humana fosforilada T422S, a 300 nM durante 3 min, a un caudal de 30 µl/min. Se supervisó la disociación durante 5 min. Se regeneró el sistema de captura por una inyección de 1 min de tampón de glicina 10 mM, pH 1,7 a 30 µl/min sobre todas las cubetas de lectura. Se usaron dos puntos de informe, la señal registrada poco antes del final de la inyección de analito, indicada como unión tardía (BL), y la señal registrada poco antes del final del tiempo de disociación, estabilidad tardía (SL), para caracterizar el rendimiento del cribado cinético. Además, se calculó la constante de velocidad de disociación kd (1/s) de acuerdo con un modelo de Langmuir y se calculó la semivida del complejo anticuerpo/antígeno en minutos de acuerdo con la fórmula ln(2)/(60*kd). Se calculó la proporción molar (MR) de acuerdo con la fórmula MR = (unión tardía (UR)) / (nivel de captura (UR)) * (PM(anticuerpo) / (PM(antígeno)). En caso de que el sensor se configurara con una cantidad adecuada de nivel de captura de ligando de anticuerpo, cada anticuerpo se debería poder unir funcionalmente al menos a un analito en solución, que está representado por una proporción molar de MR = 1,0. Entonces, la proporción molar también es un indicador del modo de valencia de la unión de analito. La valencia máxima puede ser MR = 2 para un anticuerpo que se une a dos analitos, uno con cada valencia de Fab.

[0675] En otro modo de realización, se determinaron las velocidades cinéticas a 25 °C y 37 °C usando la misma configuración experimental, pero usando series de concentraciones múltiples de cada analito en solución a 0 nM (tampón), 1,2 nM, 3,7 nM, 11,1 nM, 33,3 nM, 100 nM y 300 nM. A partir del comportamiento de unión dependiente de la concentración, se calcularon los datos cinéticos usando el programa informático de evaluación BIAcore de acuerdo con las instrucciones del fabricante y un modelo de Langmuir 1.1 con RMAX global.

[0676] Ejemplo 9

[0677] ELISA

[0678] Se añadió péptido/proteína/agregado no biotinilado a placas Maxisorb no recubiertas, se añadió péptido/proteína/agregado biotinilado en PBS a placas Maxisorb recubiertas con estreptavidina y se incubaron las placas durante la noche. Se desechó el sobrenadante y se lavaron los pocillos tres veces con 90 µl de tampón de lavado (PBS 1x/Tween 20 al 0,1 %). Se bloquearon los puntos reactivos restantes con tampón de bloqueo (PBS 1x/BSA al 2 % (fracción V de seroalbúmina bovina, sin ácidos grasos, Roche, n.º de cat.: 10735078001)/Tween 20 al 0,05 %) incubando durante 1 h. Se desechó el sobrenadante y se lavaron los pocillos tres veces con 90 µl de tampón de lavado. Se prepararon las muestras y el anticuerpo de control en 12 diluciones (1:2) en tampón de ELISA (PBS 1x/BSA al 0,5 % (fracción V de seroalbúmina bovina, sin ácidos grasos, Roche, n.º de cat.: 10735078001)/Tween 20 al 0,05 %) con una concentración de partida de 500 ng/ml. El tiempo de incubación fue de 60 minutos a t.a. en un agitador. Se desechó el sobrenadante y se lavaron los pocillos tres veces con 90 µl de tampón de lavado. Se prepararon soluciones de anticuerpo secundario en tampón de ELISA. Se transfirió un total de 25 µl de mezcla de anticuerpo a todos los pocillos de la placa de ensayo y, después de esto, se incubó la placa en un agitador durante 60 minutos a t.a. Se desechó el sobrenadante y se lavaron los pocillos tres veces con 90 µl de tampón de lavado. Se añadieron 25 µl de solución ABTS a todos los pocillos. Se leyó la absorbancia a de 405 nm a 492 nm.

[0679] Ejemplo 10

[0680] Medición cinética de la unión de péptido ptau a anticuerpos anti-ptau (ensayo de captura)

[0681] Se investigó la unión del fragmento de ptau a anticuerpos anti-ptau por resonancia de plasmón superficial usando un instrumento BIACORE T200 (GE Healthcare). Se acoplaron alrededor 10.000 unidades de resonancia (UR) del sistema de captura (10 µg/ml de anticuerpo anti-Fc humano caprino; Jackson Immuno Research; código de pedido: JIR 109-005-098) a un chip CM5 (GE Healthcare BR-1005-30) a pH 5,0 usando un kit de acoplamiento de amina suministrado por GE Healthcare. Como tampón de migración, se usó HBS-N pH 7,4 (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, GE Healthcare). Para la medición de las muestras, el tampón de migración y dilución fue PBS-T (solución salina tamponada con fosfato 10 mM que incluía Tween-20 al 0,05 %), pH 7,4. Se estableció el bloque de muestras en 12 °C. Se estableció la cubeta de lectura en 25 °C y se purgó dos veces con tampón de migración.

[0682] Se capturó el anticuerpo anti-ptau inyectando una solución de 10 µg/ml durante 300 s a un caudal de 10 µl/min. Se midió la asociación por inyección de fragmento de ptau a diversas concentraciones en solución durante 180 s a un flujo de 30 µl/min, comenzando a partir de 300 nM en diluciones 1:3. Se supervisó la fase de disociación durante hasta 300 s y se activó cambiando de la solución de muestra al tampón de migración. Se regeneró la superficie por 60 s de lavado con una solución de ácido fosfórico al 0,85 % seguido de 60 s de lavado con solución de hidróxido de sodio 5 mM a un caudal de 10 µl/min. Se corrigieron las diferencias de índice de refracción aparente sustrayendo la respuesta obtenida de una superficie de anticuerpo anti-Fc humano caprino. También se sustrajeron las inyecciones de blanco (= doble referencia). Para el cálculo de la KD y otros parámetros cinéticos se usó el modelo de Langmuir 1:1.

[0683] Ejemplo 11

[0684] Medición cinética de la unión de fragmentos Fab de anticuerpo anti-ptau al fragmento de ptau (ensayo directo)

[0685] Se investigó la unión de muestras de fragmento Fab de anticuerpo anti-ptau al fragmento de ptau por resonancia de plasmón superficial usando un instrumento BIACORE T200 (GE Healthcare). Se acoplaron aproximadamente 20 unidades de resonancia (UR) del fragmento de ptau biotinilada (0,2 µg/ml; ptau(416-430)[Bi-XUUUU-416; pSer-422]amida) en un chip de SA serie S (GE Healthcare BR-1005-31). El tampón de migración y dilución para la inmovilización fue HBS-N, pH 7,4 (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, GE Healthcare). Para la siguiente caracterización cinética, el tampón de migración y dilución fue PBS-T (solución salina tamponada con fosfato 10 mM que incluía Tween20 al 0,05 %), pH 7,4. Se estableció el bloque de muestras en 12 °C. Se estableció la cubeta de lectura en 25 °C y se purgó dos veces con tampón de migración.

[0686] Se midió la asociación por inyección de las muestras de fragmento Fab de anticuerpo anti-ptau a diversas concentraciones en solución durante 180 s a un caudal de 30 µl/min, comenzando a partir de 100 nM en diluciones 1:3. Se supervisó la fase de disociación durante hasta 600 s y se activó cambiando de la solución de muestra al tampón de migración. Se regeneró la superficie lavando con una inyección de solución de glicina 10 mM, pH 1,7 durante 60 s a un caudal de 10 µl/min. Se corrigieron las diferencias de índice de refracción aparente sustrayendo la respuesta obtenida de una superficie de blanco. También se sustrajeron las inyecciones de blanco (= doble referencia). Para el cálculo de la KD y otros parámetros cinéticos se usó el modelo de Langmuir 1:1.

[0687] Ejemplo 12

[0688] Medición cinética de la unión de fragmentos Fab de anticuerpo anti-ptau a ptau de longitud completa (ensayo directo)

[0689] Se investigó la unión de muestras de fragmento Fab de anticuerpo anti-ptau a proteína ptau de longitud completa por resonancia de plasmón superficial usando un instrumento BIACORE T200 (GE Healthcare). Se acoplaron aproximadamente 200 unidades de resonancia (UR) de proteína ptau biotinilada (2 µg/ml) en un chip de SA serie S (GE Healthcare BR-1005-31). El tampón de migración y dilución para la inmovilización fue HBS-N, pH 7,4 (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, GE Healthcare). Para la siguiente caracterización cinética, el tampón de migración y dilución fue PBS-T (solución salina tamponada con fosfato 10 mM que incluía Tween20 al 0,05 %), pH 7,4. Se estableció el bloque de muestras en 12 °C. Se estableció la cubeta de lectura en 25 °C y se purgó dos veces con tampón de migración.

[0690] Se midió la asociación por inyección de las muestras de fragmento Fab de anticuerpo anti-ptau a diversas concentraciones en solución durante 180 s a un caudal de 30 µl/min, comenzando a partir de 300 nM en diluciones 1:3. Se supervisó la fase de disociación durante hasta 600 s y se activó cambiando de la solución de muestra al tampón de migración. Se regeneró la superficie lavando con una inyección de solución de glicina 10 mM, pH 1,7 durante 60 s a un caudal de 10 µl/min. Se corrigieron las diferencias de índice de refracción aparente sustrayendo la respuesta obtenida de una superficie de blanco.

[0691] También se sustrajeron las inyecciones de blanco (= doble referencia). Para el cálculo de la KD y otros parámetros cinéticos se usó el modelo de Langmuir 1:1.

[0692] Ejemplo 13

[0693] Efecto del anticuerpo anti-tau(pS422) (VH35H5/VL31A1) y el anticuerpo anti-tau(pS422) (VH35H5/VL49G1) en la afección por tau en ratones que sobreexpresan tau humana

[0694] Se trataron ratones transgénicos TauPS2APP que sobreexpresan la isoforma de tau humana más larga (Grüningeret al., Neurobiol. Dis. 37 (2010) 294) con anticuerpo 1 (VH35H5/VL31A1), anticuerpo 2 (VH35H5/VL49G1) o bien vehículo durante un período de 16 semanas. Justo antes del tratamiento, todos los ratones se inmunosuprimieron por administración de una dosis única de un anticuerpo anti-CD4 (0,5 mg/ratón). Posteriormente, los ratones recibieron inyecciones i.p. semanales del anticuerpo o vehículo respectivo comenzando a partir de los 9 meses de edad. Para cada uno de los dos anticuerpos, se sometieron a prueba tres dosis separadas, a saber, 1,7 mg/kg, 5 mg/kg y 15 mg/kg. Se sacrificaron los ratones 4-6 días después de la última inyección, se perfundieron de forma transcardial y se extirparon los cerebros para su análisis. Se sacrificó un grupo de ratones no tratados (9 meses de edad) al inicio del experimento y se usó como comparador de referencia.

[0695] Se cortó de forma sagital cada cerebro y se ultracongelaron los hemisferios individuales en hielo seco. Se usó el hemisferio izquierdo para cuantificación bioquímica de tau, tau(pS422) y agregados de tau por inmunoanálisis. Se usó el hemisferio cerebral derecho para análisis inmunohistoquímico cuantitativo de tau neurofibrilar que contiene tau(pS422).

[0696] Procedimientos

[0697] Preparación de homogeneizados cerebrales

[0698] Se pesó un hemisferio cerebral de cada ratón y se añadió a 10 volúmenes de tampón de extracción enfriado con hielo (tris-HCl 25 mM, NaCl 800 mM, sacarosa al 10 %, EGTA 1 mM, pH 7,5, complementado con una solución combinada de inhibidor de proteasa al 1 % (Calbiochem n.º 539134) y solución combinada de inhibidor de fosfatasa al 1 % (Sigma n.º P0044)). A continuación, se homogeneizó el tejido en un homogeneizador Dounce de vidrio de 2 ml. Se centrifugó el homogeneizado a 20.000 x g durante 20 min a 4 °C. Se desechó el material sedimentado, se alicuotó el homogeneizado y se almacenó a -20 °C hasta su uso posterior.

[0699] Cuantificación con AlphaLISA de tau y tau(pS422) en homogeneizados cerebrales

[0700] Las microesferas de donante recubiertas con estreptavidina AlphaLISA® y de aceptador no conjugadas se adquirieron de Perkin Elmer. Se acoplaron las microesferas de aceptador al anticuerpo anti-tau o bien al anticuerpo anti-tau(pS422).

[0701] Se biotiniló el anticuerpo anti-tau 5A6 (DSHB) en grupos amina primaria usando biotina-N-hidroxisuccinamida (Thermo Fischer).

[0702] Se realizó la medición de tau en tampón de ensayo HiBlock 1x (Perkin Elmer) usando anticuerpo 5A6 biotinilado, microesferas de donante con estreptavidina y microesferas de aceptador de anticuerpo anti-tau.

[0703] Se realizó la medición de tau(pS422) en tampón de ensayo B (Hepes 25 mM, pH 7,4, Triton X-100 al 0,5 %, TopBlock al 0,1 % (LuBioscience), 1 mg/ml de dextrano 500, reactivo de bloqueo 1/10 (Roche)) usando anticuerpo 5A6 biotinilado, microesferas de donante con estreptavidina y microesferas de aceptador de anticuerpo anti-tau(pS422).

[0704] Se prepararon muestras para el ensayo en ½ AreaPlate-96 (Perkin Elmer) mezclando 5 µl de patrón o muestra con 10 µl de anticuerpo 5A6 biotinilado y 10 µl de microesferas de aceptador acopladas a anticuerpo, incubando a continuación durante 1 h a t.a. con agitación. A continuación, se complementó la mezcla con 25 µl de microesferas de donante con estreptavidina y se incubó durante otros 30 min a t.a. en la oscuridad con agitación. A continuación, se midieron las placas en un lector de placas de microvaloración Envision (Perkin Elmer) usando excitación de láser a 680 nm y un filtro de emisión a 615 nm. Se generaron curvas estándar usando tau (la isoforma más larga) humana recombinante y tau fosforilada por ERK.

[0705] Análisis inmunohistoquímico cuantitativo de la afección por ptau

[0706] Se prepararon criocortes sagitales (10 µm de espesor) en un criostato y se tiñeron por inmunofluorescencia cuatro cortes por animal con un anticuerpo contra tau(S422) conjugado con anticuerpo anti-Ig de ratón caprino/AlexaFluor555 a una concentración de 10 µg/ml.

[0707] Se realizó la adquisición de imágenes de cortes cerebrales completas con un sistema de barrido de portaobjetos Metafer 4 (MetaSystems GmbH, Altlussheim, Alemania). Se midió el área inmunopositiva de tau(pS422) dentro del hipocampo y la región neocortical y el área de la señal de inmunofluorescencia positiva para ptau determinada por un procedimiento morfométrico no sesgado por medio de análisis de imágenes asistido por ordenador. Se realizó la cuantificación del área positiva de ptau con el programa informático de análisis de imágenes Definiens (Definiens AG, Múnich, Alemania).

[0708] Resultados

[0709] El tratamiento de ratones TauPS2APP con el anticuerpo 1 o bien el anticuerpo 2 dio como resultado una reducción dependiente de la dosis en la acumulación de tau(pS422) en homogeneizados cerebrales (figura 7). Usando el anticuerpo 1 (VH35H5/VL31AS1), la reducción fue estadísticamente significativa a 15 mg/kg. Para el anticuerpo 2 (VH35H5/VU49G1) se acumuló significativamente menos tau(pS422) en todos los grupos de dosis. El nivel global de tau no cambió en todos los grupos de dosis para ambos anticuerpos (figura 8). Se realizó el análisis inmunohistoquímico cuantitativo para detectar agregados neurofibrilares que contenían tau(pS422) en los cerebros de ratones con anticuerpo 1 (figura 9). Aunque no hubo una disminución estadísticamente significativa de la afección por tau en ningún grupo de dosis, se observó una tendencia a una menor afección con el incremento de la dosis. Esto fue más evidente en la región cortical de los cerebros.

[0710] Aunque se han descrito en el presente documento modos de realización ilustrativos de la presente invención, se debe entender que la invención no se limita a los descritas, y que se pueden realizar otros cambios o modificaciones diversos por un experto en la técnica.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo humanizado que se une específicamente a tau humana que comprende una Ser fosforilada en la posición 422 (tau(pS422)), en el que el anticuerpo comprende

a) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 19 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 78; o

b) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 76 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 78; o

c) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 76 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 80.

2. El anticuerpo humanizado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo tiene su función efectora inactiva.

3. El anticuerpo humanizado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el anticuerpo es

a) un anticuerpo de longitud completa de la subclase IgG1 humana, o

b) un anticuerpo de longitud completa de la subclase IgG4 humana, o

c) un anticuerpo de longitud completa de la subclase IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A y P329G,

d) un anticuerpo de longitud completa de la subclase IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E y P329G,

e) un anticuerpo de longitud completa de la subclase IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A y P329G en ambas cadenas pesadas y las mutaciones T366W y S354C en una cadena pesada y las mutaciones T366S, L368A, Y407V e Y349C en la otra cadena pesada respectiva, o f) un anticuerpo de longitud completa de la subclase IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E y P329G en ambas cadenas pesadas y las mutaciones T366W y S354C en una cadena pesada y las mutaciones T366S, L368A, Y407V e Y349C en la otra cadena pesada respectiva.

4. Un anticuerpo biespecífico que comprende

i) un primer sitio de unión seleccionado de

a) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 76 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 78; o

b) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 76 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 80;

y

ii) un segundo sitio de unión seleccionado de

a) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 82 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 85; o

b) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 83 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 85; o

c) un dominio variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 84 y un dominio variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 85.

5. Una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.

6. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso como medicamento.

7. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

8. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer prodrómica.