ES3057446T3

ES3057446T3 - Alk7: actriib heteromultimers and uses thereof

Info

Publication number: ES3057446T3
Application number: ES20206064T
Authority: ES
Inventors: John Knopf; Ravindra Kumar; Asya Grinberg; Dianne S Sako; Robert Pearsall; Roselyne Castonguay; Gang Li; Yossi Dagon
Original assignee: Acceleron Pharma Inc
Current assignee: Acceleron Pharma Inc
Priority date: 2015-04-06
Filing date: 2016-04-06
Publication date: 2026-03-02
Anticipated expiration: 2036-04-06
Also published as: EP3280435A4; AU2020281136A1; EP3889171B1; EP4599888A3; EA201792222A1; EP3280435B1; WO2016164503A1; MX391964B; US11028145B2; CN115073610A; JP2018513147A; CN107847561B; EP3828199A1; MA41920B1; BR112017021510A2; JP7055636B2; US20190375820A1; EP3280435A2; MA41920A; CN107709358A

Abstract

En ciertos aspectos, la divulgación proporciona complejos polipeptídicos heteroméricos solubles que comprenden un dominio extracelular de un receptor ALK7 y un dominio extracelular de ActRIIB. En ciertos aspectos, estos heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden usarse para mejorar los parámetros metabólicos en un paciente que lo necesite. En ciertos aspectos, estos heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden usarse para tratar o prevenir una o más enfermedades o afecciones renales en un paciente que lo necesite. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Heteromultímeros ALK7: ActRIIB y usos de los mismos

[0003] Antecedentes de la invención

[0004] La superfamilia del factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta) contiene una variedad de factores de crecimiento que comparten elementos de secuencia y motivos estructurales comunes. Se sabe que estas proteínas ejercen efectos biológicos en una gran variedad de tipos de células tanto en vertebrados como en invertebrados. Los miembros de la superfamilia realizan funciones importantes durante el desarrollo embrionario en la formación de patrones y la especificación de tejidos y pueden influir en una variedad de procesos de diferenciación, que incluyen adipogénesis, miogénesis, condrogénesis, cardiogénesis, hematopoyesis, neurogénesis y diferenciación de células epiteliales. La familia se divide en dos clados filogenéticos generales: los miembros más recientemente evolucionados de la superfamilia, que incluye TGF-betas, activinas y nodales y el clado de proteínas más distantemente relacionadas de la superfamilia, que incluye varias BMP y GDF [Hinck (2012) FEBS Letters 586:1860-1870]. Los miembros de la familia TGF-beta tienen efectos biológicos diversos, a menudo complementarios. Mediante la manipulación de la actividad de un miembro de la familia TGF-beta, a menudo es posible provocar cambios fisiológicos significativos en un organismo. Por ejemplo, las razas de ganado Piedmontese y Belgian Blue portan una mutación de pérdida de función en el gen GDF8 (también llamado miostatina) que provoca un marcado aumento en la masa muscular [Grobetet al. (1997) Nat Genet 17(1):71-4]. Además, en humanos, los alelos inactivos de GDF8 se asocian con una mayor masa muscular y, según se informa, una fuerza excepcional [Schuelkeet al. (2004) N Engl J Med 350:2682-8].

[0005] Sako D,et al(2010) J Biol Chem 285(27): 21037-48 describe la caracterización de la funcionalidad de unión al ligando del dominio extracelular del receptor de activina tipo IIb. Koncarevic Aet al, Endocrinology (2010) 251(9): 4289-300 describe un receptor de activina soluble tipo IIb que previene los efectos de la privación de andrógenos en la composición corporal y la salud ósea. Calvaneseet al(2015) J Pept Sci 21(4):283-93 describe características conformacionales y afinidades de unión a Cripto, ALK7 y ALK4 de fragmentos sintéticos de Nodal. El documento WO2008/097541 describe variantes derivadas de ACTRIIB y usos de las mismas. El documento WO2005/084699 describe inhibidores de ALK7 y miostatina y usos de los mismos.

[0006] Los cambios en la fibrosis, músculo, hueso, grasa, glóbulos rojos y otros tejidos pueden lograrse potenciando o inhibiendo la señalización intracelular (por ejemplo, SMAD 1, 2, 3, 5 y/u 8) que está mediada por ligandos de la familia de TGF-beta. Por tanto, existe una necesidad de agentes que regulen la actividad de diversos ligandos de la superfamilia de TGF-beta.

[0007] Sumario de la invención

[0008] La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas. La información técnica que se expone a continuación puede, en algunos aspectos, ir más allá del alcance de la invención reivindicada actualmente. La información técnica adicional se proporciona para situar la invención real en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados. Las referencias en el presente documento a métodos de tratamiento del cuerpo humano o animal han de entenderse como referencias a compuestos, composiciones farmacéuticas, combinaciones y/o medicamentos para su uso en esos métodos.

[0009] En un primer aspecto, la invención proporciona un heteromultímero recombinante que comprende un polipéptido de ALK7 y un polipéptido de ActRIIB para su uso en un método para tratar un trastorno renal en un sujeto que lo necesita, en donde: (i) el polipéptido de ALK7 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90 %, 95 %, 98 % o el 100 % idéntica a los aminoácidos 28-92 de SEQ ID NO: 9, y (ii) el polipéptido de ActRIIB comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90 %, 95 %, 98 % o el 100 % idéntica a 29-109 SEQ ID NO: 1, en donde el heteromultímero se une a uno o más de: activina B, activina C y activina AC, y en donde el polipéptido de ALK7 y/o polipéptido de ActRIIB son proteínas de fusión que comprenden además un dominio heterólogo.

[0010] Como se describe en el presente documento, se ha descubierto que un complejo de proteína heterodímera ALK7:ActRIIB es un antagonista único de ligandos de la superfamilia de TGF-beta, que presenta un perfil/selectividad de unión a ligando diferente en comparación con los homodímeros ActRIIB y ALK7 correspondientes. En particular, un heterodímero de ALK7:ActRIIB de ejemplo muestra unión potenciada a activina AC, activina C y BMP5 en comparación con cualquiera de los homodímeros, conserva unión fuerte a activina B tal como se observa con homodímero de ActRIIB y muestra unión reducida a GDF11, GDF8, activina A, BMP10, BMP6, GDF3 y BMP9. En particular, el heterodímero ALK7:ActRIIB muestra baja o ninguna afinidad observable por BMP9, mientras que este ligando se une fuertemente al homodímero de ActRIIB. Véase, la figura 6. Por lo tanto, estos resultados demuestran que los heterodímeros ALK7:ActRIIB son antagonistas (inhibidores) más selectivos de determinados ligandos de la superfamilia TGF-beta en comparación con los homodímeros ActRIIB. Por consiguiente, un heterodímero de ALK7:ActRIIB será más útil que un homodímero de ActRIIB en determinadas aplicaciones donde dicho antagonismo selectivo es ventajoso. Los ejemplos incluyen aplicaciones terapéuticas en las que es deseable antagonizar uno o más de activina B, activina AC, activina C y BMP5 con antagonismo disminuido de uno o más de activina A, BMP10, BMP6, GDF3 y BMP9. Además, se demostró que un heterodímero ALK7:ActRIIB tiene efectos terapéuticos en un modelo de ratón de enfermedad renal, así como efectos catabólicos beneficiosos sobre las células adiposas. Por lo tanto, aunque no se desea limitarse a un mecanismo de acción particular, se espera que heteromultímeros ALK7:ActRIIB, así como variantes de los mismos, que se unen a/inhiben al menos uno o más de activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina AB, activina C, activina E, activina AC, activina AE, activina BC y activina BE), GDF8, GDF11, BMP10, BMP6, BMP5, GDF3 y/o ganglionar sean agentes útiles para tratar enfermedad renal, particularmente determinados trastornos de enfermedad renal tales como inflamación y fibrosis, y/o promover efectos catabólicos beneficiosos sobre tejido adiposo. Además, se espera que otros antagonistas (inhibidores), o combinaciones de antagonistas, que imitan las propiedades de unión/inhibidoras de los heterodímeros de ALK7:ActRIIB, así como agentes que antagonizan directa o indirectamente los receptores de ALK7 y/o ActRIIB, agentes que antagonizan directa o indirectamente los ligandos de unión de ALK7 y/o ActRIIB, agentes que antagonizan directa o indirectamente el mediador de señalización aguas abajo (por ejemplo, Smads) y/o agentes que antagonizan directa o indirectamente los correceptores de la superfamilia de TGFβ (por ejemplo, Cripto o Cryptic) tengan efectos biológicos similares. Estos miméticos antagonistas se denominan colectivamente en el presente documento "antagonistas ALK7:ActRIIB" o "inhibidores ALK7:ActRIIB".

[0012] Por lo tanto, la presente divulgación proporciona, en parte, complejos de heteromultímeros (heteromultímeros) que comprenden al menos un polipéptido de ALK7 y al menos un polipéptido de ActRIIB ( heteromultímeros de ALK7:ActRIIB). Preferiblemente, los polipéptidos de ALK7 comprenden un dominio de unión a ligando de un receptor de ALK7, por ejemplo, una porción del dominio extracelular de ALK7. De manera similar, los polipéptidos de ActRIIB generalmente comprenden un dominio de unión a ligando de un receptor ActRIIB, por ejemplo, una porción del dominio extracelular de ActRIIB. Preferiblemente, dichos polipéptidos de ALK7 y ActRIIB, así como los heteromultímeros resultantes de los mismos, son solubles.

[0014] En determinados aspectos, un heteromultímero de ALK7:ActRIIB comprende una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos el 70 % idéntica a un polipéptido que comienza en uno cualquiera de los aminoácidos 21-28 de SEQ ID NO: 9 (por ejemplo, los aminoácidos 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28) y termina en cualquiera de los aminoácidos 92-113 de SEQ ID NO: 9 (por ejemplo, los aminoácidos 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 o 113) de SEQ ID NO: 9. Por ejemplo, heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica a los aminoácidos 28-92 de SEQ ID NO: 9. En otras realizaciones, heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden comprender una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica a los aminoácidos 21-113 de SEQ ID NO: 9. En otras realizaciones, heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden comprender una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 10. En aún otras realizaciones, heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden comprender una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 20. En incluso otras realizaciones, heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden comprender una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 39. En realizaciones adicionales, heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden comprender una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 43. En realizaciones adicionales, heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden comprender una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 46.

[0016] En determinados aspectos, un heteromultímero de ALK7:ActRIIB comprende una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos el 70 % idéntica a un polipéptido que comienza en uno cualquiera de los aminoácidos 20-29 de SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29) y termina en uno cualquiera de los aminoácidos 109-134 de SEQ ID NO: 1 (109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134) de SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica a los aminoácidos 29-109 de SEQ ID NO: 1. En realizaciones adicionales, heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden comprender una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica a los aminoácidos 25-131. En otras realizaciones, heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden comprender una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 2. En aún otras realizaciones, heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden comprender una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 3. En incluso otras realizaciones, heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden comprender una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 5. En incluso otras realizaciones, heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden comprender una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 6. En determinadas realizaciones preferidas, heteromultímeros ALK7:ActRIIB no comprenden un polipéptido de ActRIIB que comprende un aminoácido ácido (por ejemplo, los aminoácidos de origen natural E o D o un aminoácido ácido artificial) en la posición correspondiente a L79 de SEQ ID NO: 1.

[0017] También se contemplan diversas combinaciones de los polipéptidos de ALK7 y ActRIIB descritos en el presente documento con respecto a los heteromultímeros ALK7:ActRIIB. Por ejemplo, en determinados aspectos, un heteromultímero de ALK7:ActRIIB puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en a) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica a los aminoácidos 28-92 de SEQ ID NO: 9; y b) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es de al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica a los aminoácidos 29-109 de SEQ ID NO: 1. En aspectos adicionales, un heteromultímero de ALK7:ActRIIB puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en a) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica a los aminoácidos 21-113 de SEQ ID NO: 9; y b) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es de al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica a los aminoácidos 25-131 de SEQ ID NO: 1. En otros aspectos adicionales, un heteromultímero de ALK7:ActRIIB puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en a) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 10; y b) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es de al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 2. En otros aspectos adicionales, un heteromultímero de ALK7:ActRIIB puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en a) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 20; y b) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es de al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 2. En otros aspectos adicionales, un heteromultímero de ALK7:ActRIIB puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en a) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 39; y b) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es de al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 2. En otros aspectos adicionales, un heteromultímero de ALK7:ActRIIB puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en a) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 43; y b) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es de al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 2. En otros aspectos adicionales, un heteromultímero de ALK7:ActRIIB puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en a) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 46; y b) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es de al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 2. Incluso en otros aspectos adicionales, un heteromultímero de ALK7:ActRIIB puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en a) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 10; y b) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es de al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 3. Incluso en otros aspectos adicionales, un heteromultímero de ALK7:ActRIIB puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en a) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 20; y b) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es de al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 3. Incluso en otros aspectos adicionales, un heteromultímero de ALK7:ActRIIB puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en a) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 39; y b) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es de al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 3. Incluso en otros aspectos adicionales, un heteromultímero de ALK7:ActRIIB puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en a) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 43; y b) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es de al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 3. En otros aspectos adicionales, un heteromultímero de ALK7:ActRIIB puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en a) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 46; y b) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es de al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 3. Incluso todavía otros aspectos adicionales, un heteromultímero de ALK7:ActRIIB puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en a) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 10; y b) un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es de al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 5. Incluso todavía en otros aspectos, un heteromultímero de ALK7:ActRIIB puede comprender, consisten esencialmente en o consisten en a) un polipéptido que comprende, que consiste esencialmente en, o que consiste en una secuencia de aminoácidos de ALK7 que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 10; y b) un polipéptido que comprende, o que consiste esencialmente en, o que consiste en una secuencia de aminoácidos de ActRIIB que es de al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 6.

[0019] Como se describe en el presente documento, las estructuras de heteromultímero de ALK7:ActRIIB incluyen, por ejemplo, heterodímeros, heterotrímeros, heterotetrámeros, heteropentámeros y complejos de heteromultímeros de orden superior. Véase, por ejemplo, las figuras 1, 2 y 8-10. En determinadas realizaciones preferidas, heteromultímeros ALK7:ActRIIB son heterodímeros.

[0021] En determinados aspectos, los polipéptidos de ALK7 y/o ActRIIB pueden ser proteínas de fusión. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un polipéptido de ALK7 puede ser una proteína de fusión que comprende un dominio polipeptídico de ALK7 y uno o más dominios polipeptídicos heterólogos (no de ALK7). De manera similar, en algunas realizaciones, un polipéptido ActRIIB puede ser una proteína de fusión que comprende un dominio polipeptídico ActRIIB y uno o más dominios polipeptídicos heterólogos (no ActRIIB). Opcionalmente, los polipéptidos de ALK7 están conectados directamente (fusionados) a uno o más dominios heterólogos, o una secuencia intermedia, tal como un enlazador, puede colocarse entre la secuencia de aminoácidos del polipéptido de ALK7 y el uno o más dominios heterólogos. De manera similar, el polipéptido ActRIIB puede estar conectado directamente (fusionado) a uno o más dominios heterólogos, o una secuencia intermedia, tal como un enlazador, puede estar situada entre la secuencia de aminoácidos del polipéptido ActRIIB y el uno o más dominios heterólogos. Los enlazadores pueden corresponder a la región no estructurada de aproximadamente 15 aminoácidos en el extremo carboxiterminal del dominio extracelular de ActRIIB o ALK7 (la "cola"), o puede ser una secuencia artificial de entre 5 y 15, 20, 30, 50, 100 o más aminoácidos que están relativamente libres de estructura secundaria. Un enlazador puede ser rico en residuos de glicina y prolina y puede contener, por ejemplo, secuencias repetidas de treonina/serina y glicinas. Los ejemplos de enlazadores incluyen, pero sin limitarse a, las secuencias TGGG (SEQ ID NO: 17), SGGG (SEQ ID NO: 18), TGGGG (SEQ ID NO: 15), SGGGG (SEQ ID NO: 16), GGGGS (SEQ ID NO: 58), GGGG (SEQ ID NO: 14) y GGG (SEQ ID NO: 13). En algunas realizaciones, el uno o más dominios heterólogos que proporcionan una propiedad deseable a las proteínas de fusión de ALK7 y/o ActRIIB incluyen, por ejemplo, farmacocinética mejorada, purificación más fácil, direccionamiento a tejidos particulares, etc. Por ejemplo, un dominio heterólogo de una proteína de fusión puede mejorar uno o más de estabilidadin vivo, semividain vivo, captación/administración, localización o distribución tisular, formación de complejos proteicos, multimerización de la proteína de fusión y/o purificación. Una proteína de fusión de ALK7 o ActRIIB puede incluir un dominio Fc de inmunoglobulina (de tipo natural o mutante) o una seroalbúmina. En algunas realizaciones, un polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB puede comprender una subsecuencia de purificación, tal como una etiqueta de epítopo, un marcador FLAG, una secuencia de polihistidina y una fusión de GST.

[0023] En determinadas realizaciones, heteromultímeros ALK7:ActRIIB descritos en el presente documento comprenden un polipéptido de ALK7 covalentemente, o no covalentemente, asociado con un polipéptido de ActRIIB en donde el polipéptido de ALK7 comprende un dominio de ALK7 y una secuencia de aminoácidos de un primer miembro (o segundo miembro) de un par de interacción y el polipéptido de ActRIIB comprende un polipéptido de ActRIIB y una secuencia de aminoácidos de un segundo miembro (o primer miembro) del par de interacción. Los pares de interacción descritos en el presente documento se diseñan para promover la dimerización o formar multímeros de orden superior. Véase, por ejemplo, las figuras 1, 2 y 8-10. En algunas realizaciones, el par de interacción puede ser cualquiera de dos secuencias de polipéptidos que interactúan para formar un complejo, particularmente un complejo heterodimérico, aunque las realizaciones operativas también pueden emplear un par de interacción que forma una secuencia homodimérica. Los miembros primero y segundo del par de interacción pueden ser un par asimétrico, lo que significa que los miembros del par se asocian preferiblemente entre sí en lugar de autoasociarse (es decir, pares de interacción guiada). Por consiguiente, los miembros primero y segundo de un par de interacción asimétrica pueden asociarse para formar un complejo heterodimérico. Alternativamente, el par de interacción puede ser no guiado, lo que significa que los miembros del par pueden asociarse entre sí o autoasociarse sin preferencia sustancial y, por lo tanto, pueden tener secuencias de aminoácidos iguales o diferentes. Por consiguiente, los miembros primero y segundo de un par de interacciones no guiadas pueden asociarse para formar un complejo de homodímero o un complejo heterodimérico. Opcionalmente, el primer miembro del par de acción de interacción (por ejemplo, un par asimétrico o un par de interacción no guiada) se asocia covalentemente con el segundo miembro del par de interacción. Opcionalmente, el primer miembro del par de acción de interacción (por ejemplo, un par asimétrico o un par de interacción no guiada) se asocia no covalentemente con el segundo miembro del par de interacción. Opcionalmente, el primer miembro del par de acción de interacción (por ejemplo, un par asimétrico o un par de interacción no guiada) se asocia a través de mecanismos covalentes y no covalentes con el segundo miembro del par de interacción.

[0025] En algunas realizaciones, los polipéptidos de ALK7 son proteínas de fusión que comprenden un dominio Fc de una inmunoglobulina. De manera similar, en algunas realizaciones, los polipéptidos de ActRIIB son proteínas de fusión que comprenden un dominio Fc de una inmunoglobulina. Las proteínas de fusión Fc tradicionales y los anticuerpos son ejemplos de pares de interacción no guiados, mientras que se han diseñado una variedad de dominios Fc modificados como pares de interacción asimétrica [Spiesset al(2015) Molecular Immunology 67(2A): 95-106]. Por lo tanto, un primer miembro y/o un segundo miembro de un par de interacción descrito en el presente documento puede comprender un dominio constante de una inmunoglobulina, que incluye, por ejemplo, la porción Fc de una inmunoglobulina. Por ejemplo, un primer miembro de un par de interacción puede comprender una secuencia de aminoácidos que se deriva de un dominio Fc de una inmunoglobulina IgG (IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), IgA (IgA1 o IgA2), IgE o IgM. Dichos dominios de inmunoglobulina pueden comprender una o más modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, deleciones, adiciones y/o sustituciones) que promueven la formación de heteromultímeros ALK7:ActRIIB. Por ejemplo, el primer miembro de un par de interacción puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % a una cualquiera de SEQ ID NO: 23-37. De manera similar, un primer miembro de un par de interacción puede comprender una secuencia de aminoácidos que se deriva de un dominio Fc de IgG (IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), IgA (IgA1 o IgA2), IgE o IgM. Dichos dominios de inmunoglobulina pueden comprender una o más modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, deleciones, adiciones y/o sustituciones) que promueven la formación de heteromultímeros ALK7:ActRIIB. Por ejemplo, el segundo miembro de un par de interacción puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % a una cualquiera de SEQ ID NO: 23-37. En algunas realizaciones, un primer miembro y un segundo miembro de un par de interacción comprenden dominios Fc derivados de la misma clase y subtipo de inmunoglobulina. En otras realizaciones, un primer miembro y un segundo miembro de un par de interacción comprenden dominios Fc derivados de diferentes clases o subtipos de inmunoglobulina.

[0027] En algunas realizaciones, un heterodímero de ALK7:ActRIIB comprende i) un polipéptido de ALK7 que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 76, y ii) un polipéptido ActRIIB que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 73. En otras realizaciones, un heterodímero de ALK7:ActRIIB comprende i) un polipéptido de ALK7 que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o el 100 % idéntico a SEQ ID NO: 80, y ii) un polipéptido ActRIIB que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o el 100 % idéntica con respecto a SEQ SEQ ID NO: 78.

[0029] Opcionalmente, un primer miembro y/o un segundo miembro de un par de interacción (por ejemplo, un par asimétrico o un par de interacción no guiada) comprende un dominio constante modificado de una inmunoglobulina, que incluye, por ejemplo, una porción Fc modificada de una inmunoglobulina. Por ejemplo, los complejos proteicos de la divulgación pueden comprender una primera porción Fc modificada de una IgG que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo: SEQ ID NO: 23-37 y una segunda porción Fc modificada de una IgG, que puede ser igual o diferente de la secuencia de aminoácidos de la primera porción Fc modificada de la IgG, que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo: SEQ ID NO: 23-37. En algunas realizaciones, heteromultímeros ALK7:ActRIIB comprenden, consisten esencialmente en o consisten en: a) una proteína de fusión de ALK7 (o ActRIIB) que comprende un dominio de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 23, opcionalmente en donde el dominio de inmunoglobulina comprende un aminoácido cargado positivamente (por ejemplo, K, R o H) en las posiciones correspondientes a los residuos 134 y 177 de SEQ ID NO: 23, y además opcionalmente en donde el dominio de inmunoglobulina no comprende un aminoácido cargado positivamente (por ejemplo, K, R o H) en la posición correspondiente al residuo 225 de SEQ ID NO: 23, y b) una proteína de fusión de ActRIIB (o ALK7) que comprende un dominio de inmunoglobulina que comprende, que consiste esencialmente en, o que consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 24, opcionalmente en donde el dominio de inmunoglobulina comprende un aminoácido cargado negativamente (por ejemplo, D o E) en las posiciones correspondientes a los residuos 170 y 187 de SEQ ID NO: 24, y además opcionalmente en donde el dominio de inmunoglobulina comprende un aminoácido cargado positivamente (por ejemplo, K, R o H) en la posición correspondiente al residuo 225 de SEQ ID NO: 24. En otras realizaciones, heteromultímeros ALK7:ActRIIB comprenden, consisten esencialmente en o consisten en: a) una proteína de fusión de ALK7 (o ActRIIB) que comprende un dominio de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica con respecto a SEQ ID NO: 27, opcionalmente en donde el dominio de inmunoglobulina comprende una C en la posición correspondiente al residuo 132 de SEQ ID NO: 27 y una W en la posición correspondiente al residuo 144 de SEQ ID NO: 27, y además opcionalmente en donde el dominio de inmunoglobulina no comprende un aminoácido cargado positivamente (por ejemplo, K, R o H) en la posición correspondiente al residuo 225 de SEQ ID NO: 27, y b) una proteína de fusión de ActRIIB (o ALK7) que comprende un dominio de inmunoglobulina que comprende, que consiste esencialmente en, o que consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a SEQ ID NO: 28, opcionalmente en donde el dominio de inmunoglobulina comprende una S en la posición correspondiente al residuo 144 de SEQ ID NO: 28, una A en la posición correspondiente al residuo 146 de SEQ ID NO: 28 y una V en la posición correspondiente al residuo 185 de SEQ ID NO: 28, y además opcionalmente en donde el dominio de inmunoglobulina no comprende un aminoácido cargado positivamente (por ejemplo, K, R o H) en la posición correspondiente al residuo 225 de SEQ ID NO: 28.

[0031] Opcionalmente, un polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB incluye uno o más residuos de aminoácidos modificados seleccionados de: un aminoácido glicosilado, un aminoácido PEGilado, un aminoácido farnesilado, un aminoácido acetilado, un aminoácido biotinilado, un aminoácido conjugado con un resto lipídico y un aminoácido conjugado con un agente de derivatización orgánico. Los polipéptidos de ALK7 y/o ActRIIB pueden comprender al menos un azúcar unido a N, y pueden incluir dos, tres o más azúcares unidos a N. Dichos polipéptidos también pueden comprender azúcares unidos a O. Los polipéptidos de ALK7 y/o ActRIIB pueden producirse en una variedad de líneas celulares que glicosilan la proteína de una manera que es adecuada para el uso del paciente, incluyendo células de insecto o levadura modificadas, y células de mamífero tales como células COS, células Cho, células HEK y células NSO. En algunas realizaciones, un polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB está glicosilado y tiene un patrón de glicosilación que se puede obtener de una línea celular de ovario de hámster chino. Preferiblemente los complejos de heteromultímeros ALK7:ActRIIB de la divulgación presentan una semivida en suero de al menos 4, 6, 12, 24, 36, 48 o 72 horas en un mamífero (por ejemplo, un ratón o un ser humano). Opcionalmente, heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden exhibir una semivida en suero de al menos 6, 8, 10, 12, 14, 20, 25 o 30 días en un mamífero (por ejemplo, un ratón o un ser humano).

[0033] En determinados aspectos, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB de la divulgación se unen a uno o más ligandos de la superfamilia TGF-beta. Opcionalmente, heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a uno o más de estos ligandos con una K<D>de menos de o igual a 10<-8>, 10<-9>, 10<-10>, 10<-11>o 10<-12>M. Por ejemplo, en algunas realizaciones, heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a activina. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a activina A. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a activina B. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a activina C. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a activina AB. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a activina AC. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a activina BC. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a activina E. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a activina AE. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a activina BE. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a GDF11. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a GDF8. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a BMP6. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a BMP10. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a BMP5. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a GDF3. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen al nodo. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB no se unen o no se unen sustancialmente a BMP9. En algunas realizaciones, el heteromultímero de ALK7:ActRIIB se une a BMP10 con afinidad más débil en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente. En algunas realizaciones, el heteromultímero de ALK7:ActRIIB se une a BMP9 con afinidad más débil en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente. En algunas realizaciones, el heteromultímero de ALK7:ActRIIB se une a GDF3 con afinidad más débil en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente. En algunas realizaciones, el heteromultímero de ALK7:ActRIIB se une a BMP6 con afinidad más débil en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente. En algunas realizaciones, el heteromultímero de ALK7:ActRIIB se une a GDF8 con afinidad más débil en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente. En algunas realizaciones, el heteromultímero de ALK7:ActRIIB se une a GDF11 con afinidad más débil en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente. En algunas realizaciones, el heteromultímero ALK7:ActRIIB se une a activina C con mayor afinidad en comparación con un homomultímero ActRIIB correspondiente. En algunas realizaciones, el heteromultímero ALK7:ActRIIB se une a activina AC con mayor afinidad en comparación con un homomultímero ActRIIB correspondiente. En algunas realizaciones, el heteromultímero de ALK7:ActRIIB se une a BMP5 con mayor afinidad en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente.

[0035] En general, heteromultímeros ALK7:ActRIIB de la divulgación antagonizan (inhiben) una o más actividades de al menos un ligando de la superfamilia de TGF-beta, y dichas alteraciones en la actividad pueden medirse usando diversos ensayos conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, un ensayo basado en células tal como los descritos en el presente documento. En determinados aspectos, heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden usarse para inhibir la señalización (por ejemplo, señalización de Smad 2/3 y/o Smad 1/5/8) mediada por uno o más ligandos de la superfamilia de TGFβ en, por ejemplo, un ensayo basado en células. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB inhiben la señalización de activina en un ensayo basado en células. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB inhiben la señalización de activina A en un ensayo basado en células. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB inhiben la señalización de activina B en un ensayo basado en células. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB inhiben la señalización de activina C en un ensayo basado en células. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB inhiben la señalización de activina AB en un ensayo basado en células. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB inhiben la señalización de AC de activina en un ensayo basado en células. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB inhiben la señalización de activina BC en un ensayo basado en células. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB inhiben la señalización de activina E en un ensayo basado en células. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB inhiben la señalización de AE de activina en un ensayo basado en células. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB inhiben la señalización de activina BE en un ensayo basado en células. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB inhiben la señalización de GDF 11 en un ensayo basado en células. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB inhiben la señalización de GDF8 en un ensayo basado en células. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB inhiben la señalización de BMP6 en un ensayo basado en células. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB inhiben la señalización de BMP10 en un ensayo basado en células. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB inhiben la señalización de BMP5 en un ensayo basado en células. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden inhibir la señalización de GDF3 en un ensayo basado en células. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden inhibir la señalización nodal en un ensayo basado en células. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB no inhiben o no inhiben sustancialmente la señalización de BMP9 en un ensayo basado en células. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB son inhibidores más débiles de la señalización de BMP9 en un ensayo basado en células en comparación con un homomultímero ActRIIB correspondiente. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB son inhibidores más débiles de la señalización de BMP10 en un ensayo basado en células en comparación con un homomultímero ActRIIB correspondiente. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB son inhibidores más débiles de la señalización de BMP6 en un ensayo basado en células en comparación con un homomultímero ActRIIB correspondiente. En algunas realizaciones, heteromultímeros ALK7:ActRIIB son inhibidores más débiles de la señalización de GDF3 en un ensayo basado en células en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente. En algunas realizaciones, heteromultímeros ALK7:ActRIIB son inhibidores más débiles de la señalización de GDF 11 en un ensayo basado en células en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente. En algunas realizaciones, heteromultímeros ALK7:ActRIIB son inhibidores más débiles de la señalización de GDF8 en un ensayo basado en células en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente. En algunas realizaciones, heteromultímeros ALK7:ActRIIB son inhibidores más débiles de la señalización de activina A en un ensayo basado en células en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente. En algunas realizaciones, heteromultímeros ALK7:ActRIIB son inhibidores más fuertes de la señalización de activina C en un ensayo basado en células en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente. En algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB son inhibidores más fuertes de la señalización de AC de activina en un ensayo basado en células en comparación con un homomultímero ActRIIB correspondiente. En algunas realizaciones, heteromultímeros ALK7:ActRIIB son inhibidores más fuertes de la señalización de BMP5 en un ensayo basado en células en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente.

[0037] Cualquiera de heteromultímeros ALK7:ActRIIB así como antagonistas ALK7:ActRIIB descritos en el presente documento puede formularse como una preparación farmacéutica (composiciones). En algunas realizaciones, las preparaciones farmacéuticas comprenden un portador farmacéuticamente aceptable. Una preparación farmacéutica estará preferiblemente libre de pirógenos (es decir, libre de pirógenos en la medida requerida por las regulaciones que rigen la calidad de los productos para uso terapéutico). Una preparación farmacéutica también puede incluir uno o más compuestos adicionales tal como un compuesto que se usa para tratar un trastorno/afección descrito en el presente documento. En general, las preparaciones farmacéuticas de heteromultímero de ALK7:ActRIIB están sustancialmente libres de homomultímeros de ALK7 y/o ActRIIB. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las preparaciones farmacéuticas de heteromultímero de ALK7:ActRIIB comprenden menos de aproximadamente el 10 %, el 9 %, el 8 %, el 7 %, el 6 %, el 5 %, el 4 %, el 3 %, el 2 % o menos de aproximadamente el 1 % de homomultímeros de ALK7. En algunas realizaciones, las preparaciones farmacéuticas de heteromultímero de ALK7:ActRIIB comprenden menos de aproximadamente 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, o menos de aproximadamente 1 % de homomultímeros de ActRIIB.

[0039] En determinados aspectos, la divulgación proporciona ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de ALK7 o ActRIIB como se describe en el presente documento. Por ejemplo, un ácido nucleico de ActRIIB puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en un ácido nucleico que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntico a la secuencia de 73-396 de SEQ ID NO: 7 o uno que se hibrida en condiciones rigurosas con el complemento de los nucleótidos 73-396 de SEQ ID NO: 7. Dicho ácido nucleico puede ser uno que comprenda la secuencia de SEQ ID NO: 8 o 72. En algunas realizaciones, un ácido nucleico de ActRIIB comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de nucleótidos que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 7, 8 y 72. De manera similar, un ácido nucleico de ALK7 puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en un ácido nucleico que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntico a la secuencia de 61-339 de SEQ ID NO: 11 o uno que se hibrida en condiciones rigurosas con el complemento de los nucleótidos 61-339 de SEQ ID NO: 11. Dicho ácido nucleico de ALK7 puede ser uno que comprenda la secuencia de SEQ ID NO: 12, 22, 41, 45 o 75. En algunas realizaciones, un ácido nucleico de ALK7 comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de nucleótidos que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 11, 12, 22, 41, 45 o 75.

[0041] En determinados aspectos, la presente divulgación proporciona una secuencia de ácidos nucleicos que comprende una secuencia codificante para un polipéptido de ALK7 y una secuencia codificante para el polipéptido de ActRIIB. Por ejemplo, en algunas realizaciones, ácidos nucleicos de la divulgación a) comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia de nucleótidos que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 11, 12, 21, 22, 40, 41, 44, 45, o 75, y b) comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia de nucleótidos que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 7, 8, o 72. Preferiblemente, los ácidos nucleicos de ALK7 y/o ActRIIB son ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes. Los ácidos nucleicos divulgados en el presente documento pueden estar unidos operativamente a un promotor para la expresión. La presente divulgación proporciona además vectores que comprenden dichos polinucleótidos de ALK7 y/o ActRIIB, así como células (por ejemplo, células Cho), preferiblemente células aisladas de una especie humana u otra especie de vertebrado, que comprenden dichos polinucleótidos de ALK7 y/o ActRIIB, así como vectores que comprenden dichos polinucleótidos de ALK7 y/o ActRIIB.

[0043] En determinados aspectos, los polipéptidos de ALK7 y/o polipéptidos de ActRIIB pueden expresarse en una línea celular de mamífero, opcionalmente una línea celular que media la glicosilación natural adecuada de la proteína ActRIIB o ALK7 para disminuir la probabilidad de una respuesta inmunitaria desfavorable en un paciente (incluida la posibilidad de pacientes veterinarios). Las líneas celulares humanas y CHO se han utilizado con éxito, y se espera que otros vectores de expresión de mamíferos comunes sean útiles. Por lo tanto, la divulgación proporciona células cultivadas que comprenden cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento. Dichas células pueden ser células de mamífero, que incluyen células CHO, células NSO, células HEK y células COS. Pueden elegirse otras células dependiendo de la especie del paciente previsto. En el presente documento se divulgan otras células. Se entiende que las células cultivadas significan células mantenidas en laboratorio u otras condiciones artificiales (por ejemplo, congeladas o en medios) y que no forman parte de un organismo vivo.

[0044] En determinados aspectos, la divulgación proporciona métodos para elaborar cualquiera de los polipéptidos de ALK7 y ActRIIB descritos en el presente documento, así como complejos de heteromultímeros ALK7:ActRIIB que comprenden dichos polipéptidos. Dicho método puede incluir expresar cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento en una célula adecuada (por ejemplo, célula Cho o una célula COS). Por ejemplo, en algunas realizaciones, un método de fabricación de un heteromultímero que comprende un polipéptido de ALK7 y un polipéptido de ActRIIB comprende: a) cultivar una célula en condiciones adecuadas para la expresión de un polipéptido de ALK7 y un polipéptido de ActRIIB, en donde la célula comprende un polinucleótido de ALK7 y un polinucleótido de ActRIIB; y b) recuperar el heteromultímero así expresado. Alternativamente, un método para elaborar un heteromultímero que comprende un polipéptido de ALK7 y un polipéptido de ActRIIB puede comprender: a) cultivar una primera célula en condiciones adecuadas para la expresión de un polipéptido de ALK7, en el que la primera célula comprende un polinucleótido de ALK7; b) recuperar el polipéptido de ALK7 así expresado; c) cultivar una segunda célula en condiciones adecuadas para la expresión de un polipéptido de ActRIIB, en el que la segunda célula comprende un polinucleótido de ActRIIB; d) recuperar el polipéptido de ActRIIB así expresado; e) combinar el polipéptido de ALK7 recuperado y el polipéptido de ActRIIB recuperado en condiciones adecuadas para la formación de heteromultímero de ALK7:ActRIIB; y f) recuperar el heteromultímero de ALK7:ActRIIB. En determinadas realizaciones, los polipéptidos de ALK7 y/o ActRIIB se expresan usando una secuencia líder de TPA (por ejemplo, SEQ ID NO: 70). En determinadas realizaciones, los polipéptidos de ALK7 y/o ActRIIB se expresan en una célula CHO. Los polipéptidos de ALK7 y ActRIIB descritos en el presente documento, así como los complejos proteicos de los mismos, pueden recuperarse como fracciones brutas, parcialmente purificadas o altamente purificadas usando cualquiera de las técnicas bien conocidas para obtener proteínas a partir de cultivos celulares. En general, tales métodos dan como resultado complejos ALK7:ActRIIB que están sustancialmente libres de homomultímeros ALK7 y/o ActRIIB. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los métodos para producir heteromultímeros de ALK7:ActRIIB dan como resultado menos de aproximadamente el 10 %, el 9 %, el 8 %, el 7 %, el 6 %, el 5 %, el 4 %, el 3 %, el 2 % o menos de aproximadamente el 1 % de homomultímeros de ALK7. En algunas realizaciones, los métodos para producir heteromultímeros de ALK7:ActRIIB dan como resultado menos de aproximadamente 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, o menos de aproximadamente 1 % de homomultímeros de ActRIIB. En algunas realizaciones, los métodos para producir heteromultímeros de ALK7:ActRIIB dan como resultado menos de aproximadamente 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, o menos de aproximadamente 1 % de homomultímeros de ALK7 y en algunas realizaciones, los métodos para producir heteromultímeros de ALK7:ActRIIB dan como resultado menos de aproximadamente 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, o menos de aproximadamente 1 % de homomultímeros de ActRIIB.

[0045] La divulgación proporciona además métodos y heteromultímeros de ALK7:ActRIIB para su uso en el tratamiento o la prevención de diversas enfermedades y afecciones asociadas con activina C. Por ejemplo, en algunas realizaciones, heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden usarse para aumentar la fertilidad, aumentar la producción de esperma, aumentar el volumen de los túbulos seminíferos, disminuir la inflamación de la próstata, disminuir la inflamación del hígado en un paciente que lo necesite. En algunas realizaciones, pueden usarse heteromultímeros de ALK7:ActRIIB para tratar o prevenir el cáncer hepático, el cáncer testicular o el cáncer de próstata. En algunas realizaciones, heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden usarse para disminuir los niveles (por ejemplo, niveles séricos) de activina C en un paciente que lo necesita.

[0047] La divulgación proporciona además métodos y antagonistas ALK7:ActRIIB (por ejemplo, heteromultímeros ALK7:ActRIIB) para su uso en el tratamiento o la prevención de diversas enfermedades y afecciones asociadas con ALK7:ActRIIB asociadas con, por ejemplo, riñón, grasa, fibrosis y otros tejidos. Dichas enfermedades o afecciones incluyen, por ejemplo, enfermedad o insuficiencia renal crónica, enfermedad o insuficiencia renal aguda, pacientes que tienen enfermedad renal en estadio 1, pacientes que tienen enfermedad renal en estadio 2, pacientes que tienen enfermedad renal en estadio 3, pacientes que tienen enfermedad renal en estadio 4, pacientes que tienen enfermedad renal en estadio 5, enfermedades renales no diabéticas, glomerulonefritis, nefritis intersticial, enfermedades renales diabéticas, nefropatía diabética, glomeruloesclerosis, glomerulonefritis progresiva rápida, fibrosis renal, síndrome de Alport, nefritis por IDDM, glomerulonefritis proliferativa mesangial, glomerulonefritis membranoproliferativa, glomerulonefritis creciente, fibrosis intersticial renal, glomeruloesclerosis segmentaria focal, nefropatía membranosa, enfermedad de cambio mínimo, glomerulonefritis progresiva rápida pauci-inmune, nefropatía por IgA, enfermedad renal poliquística, enfermedad de Dent, nefrocitinosis, nefritis de Heymann, enfermedad renal poliquística autosómica dominante (adulta), enfermedad renal poliquística autosómica recesiva (infantil), lesión renal aguda, síndrome nefrótico, isquemia renal, enfermedades o trastornos de los podocitos, proteinuria, enfermedades glomerulares, glomerulonefritis membranosa, glomerulonefritis focal segmentaria, preeclampsia, eclampsia, lesiones renales, enfermedades vasculares del colágeno, proteinuria ortostática benigna (postural), nefropatía por IgM, nefropatía membranosa, sarcoidosis, diabetes mellitus, daño renal debido a fármacos, enfermedad de Fabry, aminoaciduria, síndrome de Fanconi, nefroesclerosis hipertensiva, nefritis intersticial, anemia falciforme enfermedad celular, hemoglobinuria, mioglobinuria, granulomatosis de Wegener, enfermedad de almacenamiento de glucógeno tipo 1, enfermedad renal crónica, insuficiencia renal crónica, baja tasa de filtración glomerular (TFG), nefroangiosclerosis, nefritis lúpica, glomerulonefritis media inmune positiva para ANCA, nefropatía crónica por aloinjerto, nefrotoxicidad, toxicidad renal, necrosis renal, daño renal, lesión glomerular y tubular, disfunción renal, síndrome nefrítico, insuficiencia renal aguda, insuficiencia renal crónica, disfunción tubárica proximal, rechazo agudo de trasplante renal, rechazo crónico de trasplante renal, glomerulonefritis mesangioproliferativa no IgA, glomerulonefritis postinfecciosa, vasculitis con afectación renal de cualquier tipo, cualquier enfermedad renal hereditaria, cualquier nefritis intersticial, insuficiencia de trasplante renal, cáncer de riñón, enfermedad renal asociada con otras afecciones (por ejemplo, hipertensión, diabetes y enfermedad autoinmune), enfermedad de Dent, nefrocitinosis, nefritis de Heymann, una enfermedad renal primaria, una glomerulopatía colapsante, una enfermedad de depósito denso, una glomerulonefritis asociada a crioglobulinemia, una enfermedad de Henoch-Schonlein, una glomerulonefritis postinfecciosa, una endocarditis bacteriana, una poliangeítis microscópica, un síndrome de Churg-Strauss, una glomerulonefritis mediada por anticuerpos anti-GBM, amiloidosis, una enfermedad de deposición de inmunoglobulinas monoclonales, una glomerulonefritis fibrilar, una glomerulopatía inmunotactoide, lesión tubular isquémica, una nefritis tubulointersticial inducida por medicamentos, una nefritis tubulointersticial tóxica, una nefritis infecciosa tubulointersticial, una pielonefritis bacteriana, una nefritis tubulo-intersticial infecciosa viral que resulta de una infección por poliomavirus o una infección por VIH, una enfermedad tubulo-intersticial inducida metabólicamente, una enfermedad conectiva mixta, una nefropatía por yeso, una nefropatía por cristales que puede resultar de la deposición de cristales inducida por urato u oxalato o fármaco, un rechazo agudo del aloinjerto tubulo-intersticial celular, una enfermedad infiltrante tumoral que resulta de un linfoma o una enfermedad linfoproliferativa postrasplante, una enfermedad obstructiva del riñón, enfermedad vascular, una microangiopatía trombótica, una nefroangiosclerosis, una enfermedad ateroembólica, una enfermedad mixta del tejido conectivo, una poliarteritis nodosa, una enfermedad vascular inducida por un inhibidor de calcineurina, un rechazo agudo del aloinjerto vascular celular, un rechazo agudo de aloinjerto humoral, disminución temprana de la función renal (ERFD), enfermedad renal terminal (ESRD), trombosis venosa renal, necrosis tubular aguda, oclusión renal, nefritis intersticial aguda, enfermedad renal crónica establecida, estenosis de la arteria renal, nefropatía isquémica, uremia, nefritis tubulointersticial crónica inducida por fármacos y toxinas, nefropatía por reflujo, cálculos renales, síndrome de Goodpasture, anemia normocítica normocrómica, anemia renal, enfermedad renal crónica diabética, enfermedad relacionada con IgG4, síndrome de von Hippel-Lindau, esclerosis tuberosa, nefronoftisis, enfermedad renal quística medular, carcinoma de células renales, adenocarcinoma, nefroblastoma, linfoma, leucemia, hiposialilación trastorno, nefropatía crónica por ciclosporina, lesión por reperfusión renal, displasia renal, azotemia, oclusión arterial bilateral, nefropatía aguda por ácido úrico, hipovolemia, uropatía obstructiva bilateral aguda, nefropatía hipercalcémica, síndrome urémico hemolítico, retención urinaria aguda, nefroesclerosis maligna, glomeruloesclerosis posparto, esclerodermia, enfermedad anti-GBM no Goodpasture, poliarteritis nodosa microscópica, granulomatosis alérgica, nefritis por radiación aguda, glomerulonefritis posestreptocócica, macroglobulinemia de Waldenstrom, nefropatía analgésica, fístula arteriovenosa, injerto arteriovenoso, diálisis, riñón ectópico, riñón esponjoso medular, osteodistrofia renal, riñón solitario, hidronefrosis, microalbuminuria, uremia, hematuria, hiperlipidemia, hipoalbuminemia, lipiduria, acidosis e hipercalemia. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona además métodos y antagonistas ALK7:ActRIIB (por ejemplo, heteromultímeros ALK7:ActRIIB) para su uso en retrasar o prevenir la progresión de: enfermedad renal en estadio 1 a estadio 2, enfermedad renal en estadio 2 a estadio 3, enfermedad renal en estadio 3 a estadio 4, o enfermedad renal en estadio 4 a estadio 5. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona además métodos y antagonistas ALK7:ActRIIB (por ejemplo, heteromultímeros ALK7:ActRIIB) para su uso en la prevención o reducción de la inflamación renal. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona además métodos y antagonistas ALK7:ActRIIB (por ejemplo, heteromultímeros ALK7:ActRIIB) para su uso en la prevención o reducción del daño renal. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona además métodos y antagonistas ALK7:ActRIIB (por ejemplo, heteromultímeros ALK7:ActRIIB) para su uso en la prevención o reducción de la fibrosis renal.

[0049] En algunas realizaciones, la divulgación proporciona además métodos y antagonistas ALK7:ActRIIB (por ejemplo, heteromultímeros ALK7:ActRIIB) para su uso en la actividad de lipólisis en un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona además métodos y antagonistas ALK7:ActRIIB (por ejemplo, heteromultímeros ALK7:ActRIIB) para su uso en la disminución del contenido de grasa corporal o la reducción de la tasa de aumento del contenido de grasa corporal en un sujeto que lo necesita. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona además métodos y antagonistas ALK7:ActRIIB (por ejemplo, heteromultímeros ALK7:ActRIIB) para su uso en el tratamiento de un trastorno o afección asociada con aumento de peso corporal indeseable en un sujeto. Dichos trastornos incluyen, por ejemplo, obesidad (por ejemplo, obesidad abdominal); sobrepeso; resistencia a la insulina; síndrome metabólico y otras enfermedades o afecciones metabólicas; un trastorno lipídico tal como, niveles bajos de HDL, niveles altos de LDL, hiperlipidemia, hipertrigliceridemia o dislipidemia; aberraciones de lipoproteínas; disminución de triglicéridos; enfermedad de hígado graso; enfermedad de hígado graso no alcohólico; hiperglucemia; tolerancia alterada a la glucosa (IGT); hiperinsulinemia; colesterol alto (por ejemplo, niveles altos de LDL y/o hipercolesterolemia); enfermedad cardiovascular tal como, enfermedad cardiaca incluyendo enfermedad cardiaca coronaria, insuficiencia cardiaca congestiva, aterosclerosis; arteriosclerosis y/o hipertensión; síndrome X; reestenosis vascular; neuropatía; y/u otros trastornos/afecciones asociados con una o más de las enfermedades o afecciones anteriores, y/o con sobrepeso (por ejemplo, IMC de ≥25 kg/m<2>), o con demasiada grasa corporal. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona métodos para disminuir el contenido de grasa corporal o reducir la tasa de aumento en el contenido de grasa corporal en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de un antagonista ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas ALK7:ActRIIB. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona métodos para el tratamiento de un trastorno asociado con el aumento de peso corporal indeseable en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de un antagonista ALK7:ActRIIB, o una combinación de antagonistas ALK7:ActRIIB. En algunas realizaciones, el trastorno asociado con el aumento de peso corporal no deseado en un sujeto se selecciona del grupo que consiste en: obesidad, diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM), enfermedad cardiovascular, hipertensión, osteoartritis, accidente cerebrovascular, problemas respiratorios y enfermedad de la vesícula biliar. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona métodos para reducir el colesterol y/o los triglicéridos en un paciente, que comprenden administrar a un paciente sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de un antagonista ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas ALK7:ActRIIB.

[0050] En algunas realizaciones, la divulgación proporciona además métodos y antagonistas ALK7:ActRIIB (por ejemplo, heteromultímeros ALK7:ActRIIB) para su uso en el tratamiento y/o mejora del cáncer o una afección asociada con el cáncer. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un cáncer seleccionado del grupo que consiste en melanoma, cáncer de mama, de colon y de endometrio, de páncreas, gástrico y uterino. En algunas realizaciones, el sujeto tiene mieloma (por ejemplo, mieloma múltiple, plasmacitoma, mieloma localizado y mieloma extramedular). En algunas realizaciones, el antagonista de ALK7:ActRIIB se administra para tratar o prevenir metástasis linfáticas, metástasis del torrente sanguíneo, crecimiento tumoral o invasión tumoral.

[0052] En algunas realizaciones, la divulgación proporciona además métodos y antagonistas ALK7:ActRIIB (por ejemplo, heteromultímeros ALK7:ActRIIB) para su uso en el tratamiento o la prevención de fibrosis o un trastorno o afección asociada con fibrosis en un paciente que lo necesita. Dichos trastornos o afecciones incluyen, por ejemplo, fibrosis pulmonar, neumonitis por hipersensibilidad, fibrosis idiopática, tuberculosis, neumonía, fibrosis quística, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfisema, fibrosis renal (de riñón), insuficiencia renal (riñón), enfermedad renal crónica (riñón), fibrosis ósea, mielofibrosis, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, esclerodermia, sarcoidosis, granulomatosis con poliangeítis, enfermedad de Peyronie, fibrosis hepática, enfermedad de Wilson, enfermedades de almacenamiento de glucógeno (particularmente tipos III, IV, IX, y X), sobrecarga de hierro, enfermedad de Gaucher, síndrome de Zellweger, esteatohepatitis no alcohólica y alcohólica, cirrosis biliar, colangitis esclerosante, síndrome de Budd-Chiari, fibrosis asociada a cirugía, Enfermedad de Crohn, contractura de Duputren, fibrosis mediastínica, fibrosis nefrogénica, fibrosis retroperitoneal, fibrosis auricular, fibrosis endomiocárdica, fibrosis pancreática.

[0054] Breve descripción de las figuras

[0056] Las figuras 1A y 1B muestran dos ejemplos esquemáticos de complejos de proteínas heteroméricas que comprenden polipéptidos receptores de tipo I y receptores de tipo II. La figura 1A representa un complejo de proteína heterodimérica que comprende un polipéptido de fusión de receptor de tipo I y un polipéptido de fusión de receptor de tipo II, que puede ensamblarse covalentemente o no covalentemente mediante un dominio de multimerización contenido dentro de cada cadena polipeptídica. Dos dominios de multimerización ensamblados constituyen un par de interacción, que puede ser guiado o no guiado. La figura 1B representa un complejo de proteína heterotetramérica que comprende dos complejos heterodiméricos tal como se representa en la figura 1A. Pueden concebirse complejos de orden superior.

[0058] La figura 2 muestra un ejemplo esquemático de un complejo de proteínas heteroméricas que comprende un polipéptido receptor de tipo I (indicado como "I") (por ejemplo, un polipéptido que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntico a un dominio extracelular de una proteína ALK7 de seres humanos u otras especies tales como las descritas en la presente, por ejemplo, SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 38, 39, 42, 43, 46, 74, 76, 79 y 80) y un polipéptido receptor de tipo II (indicado como "II") (por ejemplo, un polipéptido que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntico a un dominio extracelular de una proteína ActRIIB de seres humanos u otras especies tales como las descritas en la presente, por ejemplo, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 71, 73, 77 y 78). En las realizaciones ilustradas, el polipéptido receptor de tipo I es parte de un polipéptido de fusión que comprende un primer miembro de un par de interacciones ("C<1>"), y el polipéptido receptor de tipo II es parte de un polipéptido de fusión que comprende un segundo miembro de un par de interacciones ("C<2>"). En cada polipéptido de fusión, puede situarse un enlazador entre el polipéptido receptor de tipo I o tipo II y el miembro correspondiente del par de interacción. El primer y segundo miembros del par de interacción pueden ser un par guiado (asimétrico), lo que significa que los miembros del par se asocian preferiblemente entre sí en lugar de autoasociarse, o el par de interacción puede ser no guiado, lo que significa que los miembros del par pueden asociarse entre sí o autoasociarse sin preferencia sustancial y pueden tener secuencias de aminoácidos iguales o diferentes. Las proteínas de fusión Fc tradicionales y los anticuerpos son ejemplos de pares de interacción no guiados, mientras que se han diseñado una variedad de dominios Fc modificados como pares de interacción guiados (asimétricos) [por ejemplo, Spiess et al (2015) Molecular Immunology 67(2A): 95-106].

[0060] La figura 3 muestra una alineación de dominios extracelulares de ActRIIA humano (SEQ ID NO: 49) y ActRIIB humano (SEQ ID NO: 2) con los residuos que se deducen en el presente documento, basándose en el análisis compuesto de múltiples estructuras cristalinas de ActRIIB y ActRIIA, para contactar directamente con el ligando indicado con recuadros.

[0062] La figura 4 muestra una alineación de secuencias múltiples de diversas proteínas precursoras de ActRIIB de vertebrados sin sus dominios intracelulares (SEQ ID NO: 50-55), proteína precursora de ActRIIA humana sin su dominio intracelular (SEQ ID NO: 56) y una proteína precursora de ActRII de consenso (SEQ ID NO: 57).

[0064] La figura 5 muestra la alineación de secuencias múltiples de dominios Fc de isotipos de IgG humana usando Clustal 2.1. Las regiones de bisagra se indican mediante subrayado punteado. El subrayado doble indica ejemplos de posiciones modificadas en IgG1 Fc para promover el emparejamiento asimétrico de cadenas y las posiciones correspondientes con respecto a otros isotipos IgG2, IgG3 e IgG4.

[0066] La figura 6 muestra datos de unión a ligando comparativos para un complejo de proteína heterodimérica ALK7-Fc:ActRIIB-Fc en comparación con el homodímero ActRIIB-Fc y el homodímero ALK7-Fc. Para cada complejo proteico, los ligandos se clasifican por k<off>, una constante cinética que se correlaciona bien con la inhibición de la señalización del ligando, y se enumeran en orden descendente de afinidad de unión (los ligandos unidos más estrechamente se enumeran en la parte superior). A la izquierda, las líneas amarillas, rojas, verdes y azules indican la magnitud de la constante de disociación. Las líneas negras continuas indican ligandos cuya unión al heterodímero está potenciada o sin cambios en comparación con el homodímero, mientras que las líneas rojas discontinuas indican una unión sustancialmente reducida en comparación con el homodímero. Como se muestra, cuatro de los cinco ligandos con unión fuerte al homodímero ActRIIB-Fc (activina A, BMP10, GDF8 y GDF11) presentan una unión reducida al heterodímero ActRIIB-Fc: ALK7-Fc, siendo la excepción la activina B que conserva una unión fuerte al heterodímero. De manera similar, tres de cuatro ligandos con unión intermedia al homodímero ActRIIB-Fc (GDF3, BMP6 y particularmente BMP9) exhiben una unión reducida al heterodímero ActRIIB-Fc: ALK7-Fc, mientras que la unión a activina AC aumenta para convertirse en la segunda interacción de ligando más fuerte con el heterodímero en general. Finalmente, la activina C y BMP5 se unen inesperadamente al heterodímero ActRIIB-Fc:ALK7 con fuerza intermedia a pesar de no unirse (activina C) o unirse débilmente (BMP5) al homodímero ActRIIB-Fc. Ningún ligando probado se une al homodímero ALK7-Fc.

[0068] La figura 7 muestra un alineamiento de secuencia múltiple de dominios extracelulares de ALK7 derivados de diversas especies de vertebrados (SEQ ID NO: 59-64).

[0070] Las figuras 8A-8D muestran ejemplos esquemáticos de complejos de proteínas heteroméricas que comprenden un polipéptido de ALK7 (por ejemplo, un polipéptido que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntico a un dominio extracelular de una proteína ALK7 de seres humanos u otras especies tales como las descritas en el presente documento, por ejemplo, SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 38, 39, 42, 43, 46, 74, 76, 79, y 80) y un polipéptido ActRIIB (por ejemplo, un polipéptido que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntico a un dominio extracelular de una proteína ActRIIB de seres humanos u otras especies tales como las descritas en el presente documento, por ejemplo, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 71, 73, 77, y 78). En las realizaciones ilustradas, el polipéptido de ALK7 es parte de un polipéptido de fusión que comprende un primer miembro de un par de interacciones ("C<1>"), y el polipéptido de ActRIIB es parte de un polipéptido de fusión que comprende un segundo miembro de un par de interacciones ("C<2>"). Los pares de interacción adecuados incluyeron, por ejemplo, pares de interacción de inmunoglobulina de cadena pesada y/o cadena ligera, truncamientos y variantes de los mismos tales como los descritos en el presente documento [por ejemplo, Spiess et al (2015) Molecular Immunology 67(2A): 95-106]. En cada polipéptido de fusión, puede situarse un enlazador entre el polipéptido ALK7 o ActRIIB y el miembro correspondiente del par de interacción. Los miembros primero y segundo del par de interacción pueden ser no guiados, lo que significa que los miembros del par pueden asociarse entre sí o autoasociarse sin preferencia sustancial, y pueden tener las mismas o diferentes secuencias de aminoácidos. Véase la figura 8A. Alternativamente, el par de interacción puede ser un par guiado (asimétrico), lo que significa que los miembros del par se asocian preferiblemente entre sí en lugar de autoasociarse. Véase la figura 8B. Pueden concebirse complejos de orden superior. Véase la figura 8C y 8D.

[0071] Las figuras 9A-9G muestran ejemplos esquemáticos de complejos de proteínas heteroméricas que comprenden dos polipéptidos de ALK7 (por ejemplo, polipéptidos que son independientemente al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntico a un dominio extracelular de una proteína ALK7 de seres humanos u otras especies tales como las descritas en el presente documento, por ejemplo, SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 38, 39, 42, 43, 46, 74, 76, 79, y 80) y dos polipéptidos de ActRIIB (por ejemplo, dos polipéptidos que son independientemente al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntico a un dominio extracelular de una proteína ActRIIB de seres humanos u otras especies tales como las descritas en el presente documento, por ejemplo, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 71, 73, 77, y 78).

[0073] En la realización ilustrada 9A, el primer polipéptido de ALK7 (de izquierda a derecha) es parte de un polipéptido de fusión que comprende un primer miembro de un par de interacción ("C<1>") y comprende además un primer miembro adicional de un par de interacción ("A<1>"); y el segundo polipéptido de ALK7 es parte de un polipéptido de fusión que comprende un segundo miembro de un par de interacción ("C<2>") y comprende además un primer miembro de un par de interacción ("A<2>"). El primer polipéptido ActRIIB (de izquierda a derecha) es parte de un polipéptido de fusión que comprende un segundo miembro de un par de interacción ("B<1>"); y el segundo polipéptido ActRIIB es parte de un polipéptido de fusión que comprende un segundo miembro de un par de interacción ("B<2>"). A<1>y A<2>pueden ser iguales o diferentes; B<1>y B<2>pueden ser iguales o diferentes, y C<1>y C<2>pueden ser iguales o diferentes. En cada polipéptido de fusión, puede situarse un enlazador entre el polipéptido ALK7 o ActRIIB y el miembro correspondiente del par de interacción, así como entre pares de interacción. La figura 9A es un ejemplo de una asociación de pares de interacción no guiada, lo que significa que los miembros del par pueden asociarse entre sí o autoasociarse sin preferencia sustancial y pueden tener secuencias de aminoácidos iguales o diferentes.

[0074] En la realización ilustrada 9B, el primer polipéptido ActRIIB (de izquierda a derecha) es parte de un polipéptido de fusión que comprende un primer miembro de un par de interacciones ("C<1>") y comprende además un primer miembro adicional de un par de interacciones ("A<1>"); y el segundo polipéptido ActRIIB es parte de un polipéptido de fusión que comprende un segundo miembro de un par de interacciones ("B<2>"). El primer polipéptido de ALK7 (de izquierda a derecha) es parte de un polipéptido de fusión que comprende un segundo miembro de un par de interacciones ("B<1>"); y el segundo polipéptido de ALK7 es parte de un polipéptido de fusión que comprende un segundo miembro de un par de interacciones ("C<2>") y comprende además un primer miembro de un par de interacciones ("A<2>"). En cada polipéptido de fusión, puede situarse un enlazador entre el polipéptido ALK7 o ActRIIB y el miembro correspondiente del par de interacción, así como entre pares de interacción. La figura 9B es un ejemplo de una asociación de pares de interacción guiada (asimétrica), lo que significa que los miembros del par se asocian preferiblemente entre sí en lugar de autoasociarse.

[0076] Los pares de interacción adecuados incluyeron, por ejemplo, pares de interacción de inmunoglobulina de cadena pesada y/o cadena ligera, truncamientos y variantes de los mismos como se describe en el presente documento [por ejemplo, Spiess et al (2015) Molecular Immunology 67(2A): 95-106]. Pueden concebirse complejos de orden superior. Véase la figura 9C-9F. Usando métodos similares, particularmente aquellos que emplean inmunoglobulinas de cadena ligera y/o pesada, truncamientos o variantes de las mismas, pueden usarse pares de interacción para producir heterodímeros de ALK7:ActRIIB que se asemejan a complejos de anticuerpo Fab y F(ab')<2>[por ejemplo, Spiess et al (2015) Molecular Immunology 67(2A): 95-106]. Véase la figura 9G.

[0078] Las figuras 10A y 10B muestran ejemplos esquemáticos de un complejo de proteína heteromérica que comprende un polipéptido de ALK7 (por ejemplo, un polipéptido que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 97 % el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntico a un dominio extracelular de una proteína de ALK7 de seres humanos u otras especies como se describe en el presente documento, por ejemplo, SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 38, 39, 42, 43, 46, 74, 76, 79 y 80), un polipéptido de ActRIIB (por ejemplo, un polipéptido que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntico a un dominio extracelular de una proteína de ActRIIB de seres humanos u otras especies como las descritas en el presente documento, por ejemplo, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 71, 73, 77 y 78), y un dominio de unión a ligando de un anticuerpo (por ejemplo, un dominio de unión a ligando derivado de un anticuerpo que se une a uno o más ligandos de unión de ALK7: ActRIIB). En las realizaciones ilustradas, el polipéptido de ALK7 es parte de un polipéptido de fusión que comprende un primer miembro de un par de interacción ("C<1>"), y comprende además un primer miembro adicional de un par de interacción ("A<1>"). El polipéptido ActRIIB es parte de un polipéptido de fusión que comprende un segundo miembro de un par de interacción ("B<1>"). El polipéptido de cadena pesada variable (V<H>) es parte de un polipéptido de fusión que comprende un segundo miembro de un par de interacción ("C<2>"), y comprende además un primer miembro de un par de interacción ("A<2>"). El polipéptido de cadena pesada variable (V<L>) es parte de un polipéptido de fusión que comprende un segundo miembro de un par de interacción ("B<2>"). En cada polipéptido de fusión, se puede colocar un enlazador entre el polipéptido ALK7 o ActRIIB y el miembro correspondiente del par de interacción, entre pares de interacción y entre los polipéptidos V<H>y V<L>y un miembro del par de interacción. A<1>y A<2>pueden ser iguales o diferentes; B<1>y B<2>pueden ser iguales o diferentes, y C<1>y C<2>pueden ser iguales o diferentes. Los pares de interacción adecuados incluyeron, por ejemplo, pares de interacción de inmunoglobulina de cadena pesada y/o cadena ligera constantes, truncamientos y variantes de los mismos como se describe en el presente documento [por ejemplo, Spiess et al (2015) Molecular Immunology 67(2A): 95-106]. La figura 10A es un ejemplo de una asociación de pares de interacción guiada (asimétrica), lo que significa que los miembros del par se asocian preferiblemente entre sí en lugar de autoasociarse. La figura 10B es un ejemplo de una asociación de pares de interacción no guiada, lo que significa que los miembros del par pueden asociarse entre sí o autoasociarse sin preferencia sustancial y pueden tener las mismas o diferentes secuencias de aminoácidos.

[0080] Dichos complejos de anticuerpo-ALK7:ActRIIB pueden ser útiles en situaciones en las que es deseable unirse/antagonizar adicionalmente un agente que no es un ligando de ALK7:ActRIIB. De manera alternativa, dichos complejos de anticuerpo-ALK7:ActRIIB pueden ser útiles en situaciones en las que es deseable potenciar adicionalmente la unión/antagonismo de ligando de ALK7:ActRIIB. Por ejemplo, tal como se demuestra mediante los ejemplos en el presente documento, un heterodímero de ALK7:ActRIIB tiene alta afinidad por varios ligandos que incluyen, por ejemplo, activina B y activina AC. Además, los heterodímeros ALK7:ActRIIB se unen a GDF3 pero con una afinidad más débil. En determinadas situaciones en las que es deseable antagonizar la actividad de GDF3 además de uno o más de los ligandos de unión de alta afinidad (por ejemplo, activina B y activina AC), GDF3 puede ser superado por la unión a un heterodímero ALK7:ActRIIB. En estas situaciones, la adición de dominio de unión de un anticuerpo anti-GDF3 al complejo de heteromultímero ALK7:ActRIIB mejoraría la capacidad del complejo de proteína para antagonizar GDF3 además de uno o más de los ligandos de unión a ALK7:ActRIIB de mayor afinidad (por ejemplo, activina B y activina AC).

[0082] La figura 11 muestra ejemplos esquemáticos de polipéptidos de trampa única de ALK7:ActRIIB. los polipéptidos de trampa única de ALK7: ActRIIB pueden contener múltiples dominios de ALK7 (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más dominios), que tienen las mismas o diferentes secuencias, y múltiples dominios de ActRIIB (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más dominios), que tienen las mismas o diferentes secuencias. Estos dominios ALK7 y ActRIIB pueden estar dispuestos en cualquier orden y pueden comprender una o más posiciones de dominios enlazadores entre uno o más de los dominios ALK7 y ActRIIB. Dichas trampas de ligando pueden ser útiles como agentes terapéuticos para tratar o prevenir enfermedades o trastornos descritos en el presente documento.

[0084] Las figuras 12A-12D muestran ejemplos esquemáticos de complejos de proteínas multiméricas que comprenden al menos un polipéptido de trampa de cadena sencilla ALK7:ActRIIB. En las realizaciones ilustradas 12A Y 12B, un primer polipéptido trampa monocatenario ALK7:ActRIIB (de izquierda a derecha) es parte de un polipéptido de fusión que comprende un primer miembro de un par de interacción ("C<1>"); y un segundo polipéptido trampa monocatenario ALK7:ActRIIB es parte de un polipéptido de fusión que comprende un segundo miembro de un par de interacción ("C<2>"). C<1>y C<2>pueden ser iguales o diferentes. Los polipéptidos trampa monocatenarios de ALK7:ActRIIB primero y segundo pueden ser iguales o diferentes. En cada polipéptido de fusión, puede situarse un enlazador entre el polipéptido trampa monocatenario ALK7:ActRIIB y el miembro correspondiente del par de interacción. Los pares de interacción adecuados incluyeron, por ejemplo, pares de interacción de inmunoglobulina de cadena pesada y/o cadena ligera, truncamientos y variantes de los mismos como se describe en el presente documento [por ejemplo, Spiess et al (2015) Molecular Immunology 67(2A): 95-106]. La figura 12A es un ejemplo de una asociación de pares de interacción no guiada, lo que significa que los miembros del par pueden asociarse entre sí o autoasociarse sin preferencia sustancial y pueden tener las mismas o diferentes secuencias de aminoácidos. La figura 12B es un ejemplo de una asociación de pares de interacción guiada (asimétrica), lo que significa que los miembros del par se asocian preferiblemente entre sí en lugar de autoasociarse. Pueden concebirse complejos de orden superior. Además, dichos polipéptidos de trampa de cadena sencilla de ALK7:ActRIIB pueden estar asociados de manera similar, de manera covalente o no covalente, con uno o más polipéptidos de ALK7 y/o uno o más polipéptidos de ActRIIB. Véase la figura 12C. Además, dichos polipéptidos de captura de cadena sencilla de ALK7:ActRIIB pueden estar asociados de manera similar, de manera covalente o no covalente, con uno o más dominios de unión a ligando de un anticuerpo (por ejemplo, un dominio de unión a ligando de un anticuerpo que se une a uno o más ligandos de unión de ALK7:ActRIIB). Véase la figura 12D.

[0085] Las figuras 13A-13C muestran perfiles de expresión génica de genes fibróticos (Col1a1, Col3a1, fibronectina, PAI-1, CTGF y a-SMA), genes inflamatorios (Tnfa y MCP1), genes de citocinas (Tgfb 1, Tgfb2, Tgfb3 y activina A), gen de lesión renal (NGAL), factor 1-alfa inducible por hipoxia (HIF1a) y receptor de activina A (Acvr2A) de riñones de ratón sometidos a obstrucción ureteral unilateral (UUO). Como control se usaron muestras del riñón contralateral no quirúrgico (Ctrl). Los perfiles de expresión génica se obtuvieron a los 3 días y 17 días después de la cirugía. A los ratones se les administró PBS o un homodímero de ALK7-Fc:ActRIIB-Fc los días 3, 7, 10 y 14 después de la cirugía. Se realizó la estadística usando un ANOVA unidireccional seguido de un análisis de Tukey. (*) denota una diferencia estadística entre i) muestras de control en comparación con los riñones UUO a los 3 días o ii) muestras de control en comparación con los riñones UUO a los 17 días en ratones a los que se administró el homodímero ALK7-Fc:ActRIIB-Fc. ($) indica una diferencia estadística entre los riñones UUO a los 17 días en ratones a los que se administró solo PBS en comparación con los riñones UUO a los 17 días en ratones a los que se administró el homodímero ALK7-Fc:ActRIIB-Fc. El símbolo(@)indica que no se detectó transcripción.

[0087] Descripción detallada de la invención

[0088] 1. Resumen

[0090] En parte, la presente divulgación se refiere a heteromultímeros que comprenden un polipéptido receptor de tipo I de la superfamilia TGFβ y un polipéptido receptor de tipo II de la superfamilia TGFβ, usos de los mismos y métodos de elaboración de dichos heteromultímeros. Véase, por ejemplo, las figuras 1 y 2. En determinadas realizaciones preferidas, los heteromultímeros comprenden un dominio extracelular de un polipéptido receptor de tipo I de la superfamilia TGFβ y un dominio extracelular de un polipéptido receptor de tipo II de la superfamilia TGFβ. En particular, la divulgación proporciona heteromultímeros que comprenden un polipéptido ALK7 y un polipéptido ActRIIB. Preferiblemente, los polipéptidos de ALK7 comprenden un dominio de unión a ligando de un receptor de ALK7, y los polipéptidos de ActRIIB comprenden un dominio de unión a ligando de un receptor de ActRIIB. En determinadas realizaciones preferidas, heteromultímeros ALK7:ActRIIB tienen un perfil/especificidad de unión a ligando de superfamilia de TGFβ alterado en comparación con una muestra correspondiente de un homomultímero (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB en comparación con un homodímero de ActRIIB:ActRIIB o un homodímero de ALK7:ALK7).

[0092] La superfamilia TGF-β está compuesta por más de 30 factores secretados que incluyen TGF-betas, activinas, nodales, proteínas morfogenéticas óseas (BMP), factores de crecimiento y diferenciación (GDF) y hormona antimulleriana (AMH) [Weiss et al. (2013) Developmental Biology, 2(1): 47-63]. Los miembros de la superfamilia, que se encuentran tanto en vertebrados como en invertebrados, se expresan de forma ubicua en diversos tejidos y funcionan durante las primeras etapas de desarrollo a lo largo de la vida de un animal. De hecho, las proteínas de la superfamilia TGF-β son mediadores clave de la autorrenovación de células madre, la gastrulación, la diferenciación, la morfogénesis de órganos y la homeostasis de tejidos adultos. De manera consistente con esta actividad ubicua, la señalización aberrante de la superfamilia de TGF-beta se asocia con una amplia gama de patologías humanas que incluyen, por ejemplo, enfermedad autoinmunitaria, enfermedad cardiovascular, enfermedad fibrótica y cáncer.

[0094] Los ligandos de la superfamilia de TGF-beta comparten la misma estructura dimérica en la que la hélice de giro 3-1/2 central de un monómero se empaqueta contra la superficie cóncava formada por las cadenas beta del otro monómero. La mayoría de los miembros de la familia TGF-beta se estabilizan adicionalmente mediante un enlace disulfuro intermolecular. Estos enlaces disulfuro atraviesan un anillo formado por otros dos enlaces disulfuro generando lo que se ha denominado un motivo de 'nudo de cisteína' [Lin et al. (2006) Reproduction 132: 179-190; y Hinck et al. (2012) FEBS Letters 586: 1860-1870].

[0096] La señalización de la superfamilia de TGF-beta está mediada por complejos heteroméricos de receptores de serina/treonina cinasa de tipo I y tipo II, que fosforilan y activan proteínas SMAD aguas abajo (por ejemplo, proteínas SMAD 1, 2, 3, 5 y 8) tras la estimulación con ligando [Massagué (2000) Nat. Rev. Mol. Cell Biol.1:169-178]. Estos receptores de tipo I y tipo II son proteínas transmembrana, compuestas por un dominio extracelular de unión a ligando con región rica en cisteína, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático con especificidad de serina/treonina cinasa predicha. En general, los receptores de tipo I median la señalización intracelular, mientras que los receptores de tipo II son necesarios para la unión de ligandos de la superfamilia de TGF-beta. Los receptores de tipo I y II forman un complejo estable después de la unión del ligando, dando como resultado la fosforilación de los receptores de tipo I por los receptores de tipo II.

[0098] La familia TGF-beta puede dividirse en dos ramas filogenéticas en función de los receptores de tipo I a los que se unen y las proteínas SMAD que activan. Una es la rama evolucionada más recientemente, que incluye, por ejemplo, las TGF-betas, activinas, GDF8, GDF9, GDF11, BMP3 y nodal, que señalizan a través de receptores de tipo I que activan Smads 2 y 3 [Hinck (2012) FEBS Letters 586:1860-1870]. La otra rama comprende las proteínas más distantemente relacionadas de la superfamilia e incluye, por ejemplo, BMP2, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF1, GDF5, GDF6 y GDF7, que señalizan a través de Smads 1, 5 y 8.

[0100] Las isoformas de TGF-beta son los miembros fundadores de la superfamilia de TGF-beta, de la cual hay 3 isoformas conocidas en mamíferos designadas como TGF-beta1, TGF-beta2 y TGF-beta3. Los ligandos de TGF-beta bioactivos maduros funcionan como homodímeros y señalizan predominantemente a través del receptor de tipo I ALK5, pero también se ha encontrado que señalizan adicionalmente a través de ALK1 en células endoteliales [Goumans et al. (2003) Mol Cell 12(4): 817-828]. TGF-beta1 es la isoforma más abundante y expresada de forma ubicua. Se sabe que TGF-beta1 tiene un papel importante en la cicatrización de heridas, y los ratones que expresan un transgén de TGF-beta1 constitutivamente activo desarrollan fibrosis [Clouthier et al. (1997) J Clin. Invest.

[0101] 100(11): 2697-2713]. TGF-beta1 también está implicado en la activación de linfocitos T y el mantenimiento de linfocitos T reguladores [Li et al. (2006) Immunity 25(3): 455-471]. La expresión de TGF-beta2 se describió por primera vez en células de glioblastoma humano y se produce en neuronas y células astrogliales del sistema nervioso embrionario. Se sabe que el TGF-beta2 suprime el crecimiento de linfocitos T dependiente de interleucina-2. TGF-beta3 se aisló inicialmente a partir de una línea celular de rabdomiosarcoma humano y desde entonces se ha encontrado en líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón y carcinoma de riñón. Se sabe que el TGF-beta3 es importante para la morfogénesis del paladar y los pulmones [Kubiczkova et al. (2012) Journal of Translational Medicine 10: 183].

[0102] Las activinas son miembros de la superfamilia TGF-beta y se descubrieron inicialmente como reguladores de la secreción de la hormona foliculoestimulante, pero posteriormente se han caracterizado diversas funciones reproductivas y no reproductivas. Hay tres formas principales de activina (A, B y AB) que son homo/heterodímeros de dos subunidades β estrechamente relacionadas (β<A>β<A>, ββy β<A>β, respectivamente). El genoma humano también codifica una activina C y una activina E, que se expresan principalmente en el hígado, y también se conocen formas heterodiméricas que contienen β<C>o β<E>. En la superfamilia de TGF-beta, las activinas son factores únicos y multifuncionales que pueden estimular la producción de hormonas en células ováricas y placentarias, apoyar la supervivencia celular neuronal, influir positiva o negativamente en el progreso del ciclo celular dependiendo del tipo de célula e inducir la diferenciación mesodérmica al menos en embriones de anfibios [DePaolo et al. (1991) Proc Soc Ep Biol Med. 198:500-512; Dyson et al. (1997) Curr Biol. 7:81-84; y Woodruff (1998) Biochem Pharmacol. 55:953-963]. En varios tejidos, la señalización de activina es antagonizada por su heterodímero relacionado, la inhibina. Por ejemplo, en la regulación de la secreción de hormona foliculoestimulante (FSH) de la hipófisis, la activina promueve la síntesis y secreción de FSH, mientras que la inhibina reduce la síntesis y secreción de FSH. Otras proteínas que pueden regular la bioactividad de activina y/o unirse a activina incluyen folistatina (FS), proteína relacionada con folistatina (FSRP, también conocida como FLRG o FSTL3) y α<2>-macroglobulina.

[0104] Como se describe en el presente documento, los agentes que se unen a "activina A" son agentes que se unen específicamente a la subunidad β<A>, ya sea en el contexto de una subunidad β<A>aislada o como un complejo dimérico (por ejemplo, un homodímero β<A>β A o un heterodímero β<A>β). En el caso de un complejo heterodímero (por ejemplo, un heterodímero β<A>β), los agentes que se unen a "activina A" son específicos para epítopos presentes dentro de la subunidad β<A>, pero no se unen a epítopos presentes dentro de la subunidad no β<A>del complejo (por ejemplo, la subunidad βdel complejo). De manera similar, los agentes descritos en el presente documento que antagonizan (inhiben) "activina A" son agentes que inhiben una o más actividades mediadas por una subunidad β<A>, ya sea en el contexto de una subunidad β<A>aislada o como un complejo dimérico (por ejemplo, un homodímero β<A>β<A>o un heterodímero β<A>β). En el caso de los heterodímeros β<A>β, los agentes que inhiben la "activina A" son agentes que inhiben específicamente una o más actividades de la subunidad β<A>, pero no inhiben la actividad de la subunidad no β<A>del complejo (por ejemplo, la subunidad βdel complejo). Este principio se aplica también a agentes que se unen a y/o inhiben "activina B", "activina C" y "activina E". Los agentes descritos en el presente documento que antagonizan "activina AB" son agentes que inhiben una o más actividades mediadas por la subunidad β<A>y una o más actividades mediadas por la subunidad β. El mismo principio también se aplica a los agentes que se unen a y/o inhiben "activina AC", "activina AE", "activina BC" o "activina BE".

[0106] Las proteínas nodales tienen funciones en la inducción y formación del mesodermo y el endodermo, así como en la organización posterior de estructuras axiales como el corazón y el estómago en la embriogénesis temprana. Se ha demostrado que el tejido dorsal en un embrión de vertebrado en desarrollo contribuye predominantemente a las estructuras axiales de la notocorda y la placa precordal mientras recluta células circundantes para formar estructuras embrionarias no axiales. Nodal parece señalizar a través de receptores de tipo I y tipo II y efectores intracelulares conocidos como proteínas SMAD. Los estudios apoyan la idea de que ActRIIA y ActRIIB sirven como receptores de tipo II para los ganglios [Sakuma et al. (2002) Genes Cells. 2002, 7:401-12]. Se sugiere que los ligandos nodales interactúan con sus cofactores (por ejemplo, Crypto o Cryptic) para activar los receptores de activina tipo I y tipo II, que fosforilan SMAD2. Las proteínas ganglionares están implicadas en muchos eventos críticos para el embrión vertebrado temprano, incluida la formación del mesodermo, el patrón anterior y la especificación del eje izquierdo-derecho. La evidencia experimental ha demostrado que la señalización nodal activa pAR3-Lux, un indicador de luciferasa que previamente se demostró que responde específicamente a activina y TGF-beta. Sin embargo, nodal no puede inducir pTlx2-Lux, un indicador que responde específicamente a las proteínas morfogenéticas óseas. Resultados recientes proporcionan evidencia bioquímica directa de que la señalización nodal está mediada por SMAD2 y SMAD3, que también median la señalización por TGF-betas y activinas. Otra evidencia ha demostrado que la proteína extracelular Cripto o Cryptic es necesaria para la señalización ganglionar, lo que la distingue de la señalización de activina o TGF-beta.

[0108] Las BMP y los GDF juntos forman una familia de citocinas con nudo de cisteína que comparten el pliegue característico de la superfamilia TGF-beta [Rider et al. (2010) Biochem J., 429(1):1-12]. Esta familia incluye, por ejemplo, BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, BMP2a, BMP3, BMP3b (también conocido como GDF10), BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8, BMP8a, BMP8b, BMP9 (también conocido como GDF2), BMP10, BMP11 (también conocido como GDF11), BMP12 (también conocido como GDF7), BMP13 (también conocido como GDF6), BMP14 (también conocido como GDF5), BMP15, GDF1, GDF3 (también conocido como VGR2), GDF8 (también conocido como miostatina), GDF9, GDF15 y decapente-pléjico. Además de la capacidad de inducir la formación ósea, que dio nombre a las BMP, las BMP/GDF muestran actividades morfogenéticas en el desarrollo de una amplia gama de tejidos. Los homodímeros y heterodímeros de BMP/GDF interactúan con combinaciones de dímeros de receptores de tipo I y tipo II para producir múltiples complejos de señalización posibles, lo que conduce a la activación de uno de dos conjuntos competitivos de factores de transcripción de SMAD. Los BMP/GDF tienen funciones altamente específicas y localizadas. Estos están regulados de varias maneras, incluyendo la restricción del desarrollo de la expresión de BMP/GDF y a través de la secreción de varias proteínas antagonistas de BMP específicas que se unen con alta afinidad a las citocinas. Curiosamente, varios de estos antagonistas se asemejan a ligandos de la superfamilia de TGF-beta.

[0109] El factor de crecimiento y diferenciación 8 (GDF8) también se conoce como miostatina. GDF8 es un regulador negativo de la masa muscular esquelética y se expresa altamente en el músculo esquelético en desarrollo y adulto. La mutación nula de GDF8 en ratones transgénicos se caracteriza por una marcada hipertrofia e hiperplasia del músculo esquelético [McPherron et al. Nature (1997) 387:83-90]. Aumentos similares en la masa muscular esquelética son evidentes en mutaciones naturales de GDF8 en ganado y, sorprendentemente, en humanos [Ashmore et al. (1974) Growth, 38:501-507; Swatland y Kieffer, J. Anim. Sci. (1994) 38:752-757; McPherron y Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. usa (1997) 94:12457-12461; Kambadur et al. Genome Res. (1997) 7:910-915; y Schuelke et al. (2004) N Engl J Med, 350:2682-8]. Los estudios también han demostrado que el desgaste muscular asociado con la infección por VIH en humanos se acompaña de aumentos en la expresión de la proteína GDF8 [Gonzalez-Cadavid et al., PNAS (1998) 95:14938-43]. Además, GDF8 puede modular la producción de enzimas específicas del músculo (por ejemplo, creatina quinasa) y modular la proliferación de células de mioblastos [publicación de solicitud de patente internacional n.º WO 00/43781]. El propéptido GDF8 se puede unir de forma no covalente al dímero del dominio GDF8 maduro, inactivando su actividad biológica [Miyazono et al. (1988) J. Biol. Chem., 263: 6407-6415; Wakefield et al. (1988) J. Biol. Chem., 263; 7646-7654; y Brown et al. (1990) Growth Factors, 3: 35-43]. Otras proteínas que se unen a GDF8 o proteínas relacionadas estructuralmente e inhiben su actividad biológica incluyen folistatina, y potencialmente, proteínas relacionadas con la folistatina [Gamer et al. (1999) Dev. Biol., 208: 222-232].

[0111] GDF11, también conocida como BMP11, es una proteína secretada que se expresa en la yema de la cola, la yema de las extremidades, los arcos maxilares y mandibulares, y los ganglios de la raíz dorsal durante el desarrollo del ratón [McPherron et al. (1999) Nat. Genet., 22: 260-264; y Nakashima et al. (1999) Mech. Dev., 80: 185-189]. GDF11 desempeña un papel único en el modelado de tejidos mesodérmicos y neurales [Gamer et al. (1999) Dev Biol., 208:222-32]. Se demostró que GDF11 es un regulador negativo de la condrogénesis y la miogénesis en el desarrollo de la extremidad de pollo [Gamer et al. (2001) Dev Biol., 229:407-20]. La expresión de GDF11 en el músculo también sugiere su papel en la regulación del crecimiento muscular de una manera similar a GDF8. Además, la expresión de GDF11 en el cerebro sugiere que GDF11 también puede poseer actividades que se relacionan con la función del sistema nervioso. Curiosamente, se encontró que GDF11 inhibe la neurogénesis en el epitelio olfativo [Wu et al. (2003) Neuron., 37:197-207]. Por lo tanto, los inhibidores de GDF11 pueden tener aplicacionesin vitroein vivoen el tratamiento de enfermedades tales como enfermedades musculares y enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica).

[0113] Se sabe bien que BMP7, también llamada proteína osteogénica-1 (OP-1), induce la formación de cartílago y hueso. Además, BMP7 regula una amplia gama de procesos fisiológicos. Por ejemplo, BMP7 puede ser el factor osteoinductor responsable del fenómeno de la osteogénesis epitelial. También se ha descubierto que BMP7 desempeña un papel en la regulación del calcio y la homeostasis ósea. Al igual que la activina, BMP7 se une a los receptores tipo II, ActRIIA y ActRIIB. Sin embargo, BMP7 y activina reclutan receptores de tipo I distintos en complejos de receptores heteroméricos. El principal receptor de BMP7 tipo I observado fue ALK2, mientras que la activina se unió exclusivamente a ALK4 (ActRIIB). BMP7 y activina provocaron distintas respuestas biológicas y activaron diferentes vías de SMAD [Macias-Silva et al. (1998) J Biol Chem.273:25628-36].

[0115] Como se describe en el presente documento, los datos de unión comparativos demostraron que un heterodímero de ALK7:ActRIIB tiene un perfil de unión alterado (selectividad de ligando) en comparación con los homodímeros de ActRIIB o ALK7 correspondientes. En particular, el heterodímero ALK7:ActRIIB muestra una unión mejorada a activina C, activina AC y BMP5 en comparación con cualquiera de los homodímeros, y conserva una unión fuerte a activina B como se observa con el homodímero ActRIIB. Sin embargo, el heterodímero ALK7:ActRIIB presenta una unión reducida a GDF11, GDF8, activina A, BMP10, BMP6, GDF3 y BMP9 en comparación con el homodímero ActRIIB. En particular, BMP9 muestra baja o ninguna afinidad observable por el heterodímero ALK7:ActRIIB, mientras que este ligando se une fuertemente al homodímero ActRIIB.

[0117] Por lo tanto, estos resultados demuestran que los heterodímeros ALK7:ActRIIB son antagonistas más selectivos de activina B, activina C, activina AC y BMP5 en comparación con los homodímeros ActRIIB. Además, se espera que dichos heterodímeros se unan estrechamente a Activina BC, dada la unión a Activinas B y C. Además, se espera que dichos heterodímeros se unan a activina E, activina AE y activina BE dada la similitud estructural entre activina C y E. Por consiguiente, un heterodímero ALK7:ActRIIB puede ser más útil que un homodímero ActRIIB en determinadas aplicaciones en las que dicho antagonismo selectivo es ventajoso. Los ejemplos incluyen aplicaciones terapéuticas en las que es deseable retener el antagonismo de uno o más de activina B, activina C, activina AC, activina BC, activina E, activina AE, activina BE y BMP5, pero minimizar el antagonismo de uno o más de activina A, BMP9, BMP10, GDF3 y BMP6.

[0119] Además, los heterodímeros de ALK7:ActRIIB, tal como se describe en el presente documento, ejercen efectos catabólicos beneficiosos sobre el tejido adiposo. Además, se muestra que los heterodímeros de ALK7:ActRIIB descritos en el presente documento tienen potentes efectos protectores en un modelo de enfermedad renal crónica, con efectos que incluyen la inhibición de fibrosis e inflamación. Sin embargo, a diferencia del homodímero ActRIIB, un heterodímero ActRIIB:ALK7 exhibe solo baja afinidad o unión transitoria a BMP9 y, por lo tanto, tendrá poca o ninguna inhibición concurrente en los procesos mediados por BMP9, como la angiogénesis. Esta nueva selectividad será útil, por ejemplo, en el tratamiento de pacientes que necesitan efectos inhibidores sobre la grasa o efectos protectores sobre el riñón, pero que no necesitan una angiogénesis alterada.

[0120] Los términos usados en esta memoria descriptiva generalmente tienen sus significados ordinarios en la técnica, dentro del contexto de esta divulgación y en el contexto específico donde se usa cada término. Ciertos términos se discuten a continuación o en otra parte de la memoria descriptiva para proporcionar orientación adicional al profesional al describir las composiciones y métodos de la divulgación y cómo prepararlos y usarlos. El alcance o significado de cualquier uso de un término será evidente a partir del contexto específico en el que se utiliza. Los términos "heterómero" o "heteromultímero" son un complejo que comprende al menos una primera cadena de polipéptido y una segunda cadena de polipéptido, en donde la segunda cadena de polipéptido difiere en secuencia de aminoácidos de la primera cadena de polipéptido en al menos un residuo de aminoácido. El heterómero puede comprender un "heterodímero" formado por las cadenas polipeptídicas primera y segunda o puede formar estructuras de orden superior en las que están presentes una o más cadenas polipeptídicas además de las cadenas polipeptídicas primera y segunda. Las estructuras ejemplares para el heteromultímero incluyen heterodímeros, heterotrímeros, heterotetrámeros y estructuras oligoméricas adicionales. Los heterodímeros se designan en la presente como X:Y o equivalentemente como X-Y, donde X representa una primera cadena de polipéptido e Y representa una segunda cadena de polipéptido. Los heterómeros de orden superior y las estructuras oligoméricas se designan en el presente documento de una manera correspondiente. En determinadas realizaciones, un heteromultímero es recombinante (por ejemplo, uno o más componentes de polipéptido pueden ser una proteína recombinante), aislado y/o purificado.

[0121] “Homólogo”, en todas sus formas gramaticales y variaciones ortográficas, se refiere a la relación entre dos proteínas que poseen un “origen evolutivo común”, incluyendo proteínas de superfamilias en la misma especie de organismo, así como proteínas homólogas de diferentes especies de organismo. Dichas proteínas (y sus ácidos nucleicos codificantes) tienen homología de secuencia, como se refleja por su similitud de secuencia, ya sea en términos de porcentaje de identidad o por la presencia de residuos o motivos específicos y posiciones conservadas. Sin embargo, en el uso común y en la presente solicitud, el término “homólogo”, cuando se modifica con un adverbio tal como “altamente”, puede referirse a similitud de secuencia y puede referirse o no a un origen evolutivo común. El término "similitud de secuencia", en todas sus formas gramaticales, se refiere al grado de identidad o correspondencia entre secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos que pueden o no compartir un origen evolutivo común.

[0122] El "porcentaje (%) de identidad de secuencia" con respecto a una secuencia de polipéptido (o nucleótido) de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos (o ácidos nucleicos) en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos (o ácidos nucleicos) en la secuencia de polipéptido (nucleótido) de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede lograrse de diversas maneras que están dentro de la experiencia en la técnica, por ejemplo, usando software informático disponible al público tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima en toda la longitud de las secuencias que se comparan. Para los fines en el presente documento, sin embargo, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos (ácido nucleico) se generan usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 fue creado por Genentech, Inc., y el código fuente se ha archivado con la documentación del usuario en la Oficina de Derechos de Autor de EE. UU., Washington DC, 20559, donde está registrado con el número de registro de derechos de autor de EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente en Genentech, Inc., South San Francisco, California, o puede compilarse a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 debe compilarse para su uso en un sistema operativo Unix, incluido Unix V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias son establecidos por el programa ALIGN-2 y no varían.

[0123] "Agonizar", en todas sus formas gramaticales, se refiere al proceso de activar una proteína y/o gen (por ejemplo, activando o amplificando la expresión génica de esa proteína o induciendo una proteína inactiva para que entre en un estado activo) o aumentando la actividad de una proteína y/o gen.

[0124] "Antagonizar", en todas sus formas gramaticales, se refiere al proceso de inhibir una proteína y/o gen (por ejemplo, inhibiendo o disminuyendo la expresión génica de esa proteína o induciendo a una proteína activa a entrar en un estado inactivo) o disminuyendo la actividad de una proteína y/o gen.

[0125] Como se usa en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, "no se une sustancialmente aX" pretende significar que un agente tiene una K<D>que es mayor que aproximadamente 10<-7>, 10<-6>, 10<-5>, 10<-4>, o mayor (por ejemplo, unión no detectable mediante el ensayo usado para determinar la K<D>) para"X", en el que"X"es un agente especificado tal como proteína o ácido nucleico.

[0126] Los términos "alrededor de" y "aproximadamente" tal como se usan en relación con un valor numérico a lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones indican un intervalo de precisión, familiar y aceptable para un experto en la técnica. En general, dicho intervalo de precisión es de ± 10 %. De manera alternativa, y particularmente en sistemas biológicos, los términos “alrededor de” y “aproximadamente” pueden significar valores que están dentro de un orden de magnitud, preferiblemente ≤ 5 veces y más preferiblemente ≤ 2 veces de un valor dado.

[0127] Los intervalos numéricos divulgados en el presente documento incluyen los números que definen los intervalos. Los términos “un” y “una” incluyen referentes en plural a menos que el contexto en el que se usa el término indique claramente lo contrario. Los términos “un” (o “una”), así como los términos “uno o más” y “al menos uno” pueden usarse indistintamente en el presente documento. Además, cuando se usa en el presente documento “y/o”, debe tomarse como una divulgación específica de cada una de las dos o más características o componentes especificados con o sin el otro. Por lo tanto, el término "y/o" tal como se usa en una frase tal como "A y/o B" en la presente pretende incluir "A y B", "A o B", "A" (solo) y "B" (solo). Asimismo, se pretende que el término “y/o” tal como se usa en una frase tal como “A, B y/o C” abarque cada uno de los siguientes aspectos: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).

[0128] A lo largo de esta memoria descriptiva, se entenderá que la palabra "comprende" o variaciones tales como "que comprende" o "comprendiendo" implican la inclusión de un número entero o grupos de números enteros indicados pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de números enteros.

[0129] 2. ActRIIB: antagonistas de ALK7

[0130] Como se describe en el presente documento, se ha descubierto que los heterodímeros de ALK7:ActRIIB tienen un perfil/selectividad de unión a ligando único en comparación con los homodímeros de ActRIIB y ALK7 correspondientes. Curiosamente, cuatro de los cinco ligandos con la unión más fuerte al homodímero ActRIIB (activina A, BMP10, GDF8 y GDF11) exhiben una unión reducida al heterodímero ALK7:ActRIIB, siendo la excepción la activina B que retiene una unión fuerte al heterodímero. De manera similar, tres de los cuatro ligandos con unión intermedia al homodímero ActRIIB (GDF3, BMP6 y particularmente BMP9) exhiben una unión reducida al heterodímero ALK7:ActRIIB, mientras que la unión a activina AC aumenta para convertirse en la segunda interacción de ligando más fuerte con el heterodímero en general. Finalmente, la activina C y BMP5 se unen inesperadamente al heterodímero ALK7:ActRIIB con fuerza intermedia a pesar de no unirse (activina C) o unirse débilmente (BMP5) al homodímero ActRIIB. Dada la unión a activina B y activina C, se espera que el heterodímero ALK7:ActRIIB se una fuertemente a activina BC. El resultado neto es que el heterodímero ALK7:ActRIIB posee un perfil de unión a ligando claramente diferente del del homodímero ActRIIB u homodímero ALK7, que no se une a ninguno de los ligandos anteriores.

[0131] Por lo tanto, estos resultados indican que los heteromultímeros ALK7:ActRIIB son antagonistas más selectivos de activina B, activina AC y activina BC en comparación con los homomultímeros ActRIIB. Además, el heterodímero ALK7:ActRIIB exhibe la propiedad inusual de unión robusta a activina C. Por consiguiente, un heteromultímero ALK7:ActRIIB será más útil que un homomultímero ActRIIB en determinadas aplicaciones donde dicho antagonismo selectivo es ventajoso.

[0132] Además, heteromultímeros ALK7:ActRIIB son sorprendentemente eficaces para mejorar diversas complicaciones de enfermedad renal (por ejemplo, tratar o prevenir lesión, inflamación y daño renal) así como ejercer células adiposas anabólicas beneficiosas. Aunque heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden ejercer efectos biológicos a través de un mecanismo distinto de la inhibición de ligando [por ejemplo, la inhibición de uno o más de activina B, activina AC, activina C, GDF11, GDF8, activina A, BMP10, BMP6, BMP5, nodal y GDF3 puede ser un indicador de la tendencia de un agente a inhibir las actividades de un espectro de agentes adicionales, incluyendo, quizás, otros miembros de la superfamilia de TGF-beta, y dicha inhibición colectiva puede conducir a un efecto deseado sobre, por ejemplo, enfermedad renal o un trastorno metabólico], se espera que otros tipos de antagonistas de ligando de la superfamilia de TGF-beta, así como antagonistas de receptor de tipo I y tipo II (por ejemplo, trampas de ligando naturales tales como folistatina y Lefty, anticuerpos, ácidos nucleicos inhibidores y moléculas pequeñas inhibidoras), o combinaciones de tales antagonistas, sean útiles de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento, particularmente aquellos que imitan las propiedades de unión/inhibidoras de los heterodímeros de ALK7:ActRIIB, así como agentes que antagonizan directa o indirectamente receptores de ALK7 y/o ActRIIB, agentes que antagonizan directa o indirectamente y/o ligandos de unión a ActRIIB, agentes que antagonizan directa o indirectamente mediadores de señalización corriente abajo (por ejemplo, Smads), y/o agentes que antagonizan directa o indirectamente correceptores de la superfamilia de TGFβ (por ejemplo, Cripto o Cryptic) tendrán efectos biológicos similares. En conjunto, heteromultímeros ALK7:ActRIIB y estos antagonistas alternativos se denominan en el presente documento " antagonistas ALK7: ActRIIB" o " inhibidores ALK7:ActRIIB".

[0133] A. Heteromultímeros de ALK7:ActRIIB

[0134] En determinados aspectos, la presente divulgación se refiere a heteromultímeros que comprenden uno o más polipéptidos del receptor de ALK7 (por ejemplo, SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 38, 39, 42, 43, 46, 74, 76, 79 y 80) y uno o más polipéptidos del receptor de ActRIIB (por ejemplo, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 71, 73, 77 y 78), que generalmente se denominan en el presente documento "complejos de heteromultímeros ALK7:ActRIIB" o "heteromultímeros ALK7:ActRIIB". Preferiblemente, heteromultímeros ALK7:ActRIIB de la divulgación son solubles, por ejemplo, un heteromultímero puede comprender una parte soluble (dominio) de un receptor de ALK7 y una parte soluble (dominio) de un receptor de ActRIIB. En general, los dominios extracelulares de ALK7 y ActRIIB corresponden a una porción soluble de estos receptores. Por lo tanto, en algunas realizaciones, los heteromultímeros de la divulgación comprenden un dominio extracelular de un receptor ALK7 y un dominio extracelular de un receptor ActRIIB. En el presente documento se describen dominios extracelulares de ejemplo de receptores de ALK7 y ActRIIB y estas secuencias, así como fragmentos, variantes funcionales y formas modificadas de los mismos, pueden usarse de acuerdo con las invenciones de la divulgación (por ejemplo, heteromultímeros ALK7:ActRIIB y usos de los mismos). Los heteromultímeros ALK7:ActRIIB de la divulgación incluyen, por ejemplo, heterodímeros, heterotrímeros, heterotetrámeros y estructuras oligoméricas de orden superior. Véase, por ejemplo, las figuras 1, 2 y 8-10. En determinadas realizaciones preferidas, los heteromultímeros de la divulgación son heterodímeros de ALK7:ActRIIB.

[0136] Preferiblemente, heteromultímeros ALK7:ActRIIB de la divulgación se unen a uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-beta. En algunas realizaciones, heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a uno o más de activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC y activina BE), GDF8 y GDF11. Opcionalmente, en algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen adicionalmente a BMP6. Opcionalmente, en algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen adicionalmente a BMP10. Opcionalmente, en algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen adicionalmente a BMP5. Opcionalmente, en algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen adicionalmente a GDF3. Opcionalmente, en algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen adicionalmente al nodo. Opcionalmente, en algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen adicionalmente a BMP10. Opcionalmente, en algunas realizaciones, heteromultímeros ALK7:ActRIIB no se unen o no se unen sustancialmente a BMP9. En determinadas realizaciones preferidas, heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a uno o más de GDF11, GDF8, activina A, BMP10, BMP6, GDF3 y BMP9 con una afinidad más débil en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente. En otras realizaciones preferidas, heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen a uno o más de activina C, activina AC, activina BC y BMP5 con mayor afinidad en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente. Opcionalmente, heteromultímeros ALK7:ActRIIB se unen además a uno o más de BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP7, BMP8a, BMP8b, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF9b/BMP15, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), neurturina, artemina, persefina, mis y zurdo.

[0138] Los heteromultímeros ALK7:ActRIIB de unión a ligandos de la superfamilia TGF-beta pueden usarse para inhibir (antagonizar) la señalización (por ejemplo, señalización de Smad 2/3 y/o Smad 1/5/8) mediada por uno o más ligandos de la superfamilia de TGFβ. En particular, pueden usarse heteromultímeros ALK7:ActRIIB de la divulgación para inhibir la señalización mediante uno o más ligandos de la superfamilia de TGFβ en, por ejemplo, un ensayo basado en células tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, heteromultímeros ALK7:ActRIIB inhiben la señalización mediada por uno o más de, (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE), GDF11, GDF8, BMP10, BMP6, BMP5, nodal y GDF3 en un ensayo basado en células. Opcionalmente, en algunas realizaciones, heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden inhibir adicionalmente la señalización de BMP6 en un ensayo basado en células. Opcionalmente, en algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden inhibir adicionalmente la señalización de GDF3 en un ensayo basado en células. Opcionalmente, en algunas realizaciones, heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden inhibir adicionalmente la señalización nodal en un ensayo basado en células. Opcionalmente, en algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden inhibir adicionalmente la señalización de BMP5 en un ensayo basado en células. Opcionalmente, en algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden inhibir adicionalmente la señalización de BMP10 en un ensayo basado en células. Opcionalmente, en algunas realizaciones, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB no inhiben o no inhiben sustancialmente la señalización mediada por BMP9 en un ensayo basado en células. En determinadas realizaciones preferidas, heteromultímeros ALK7:ActRIIB tienen un efecto inhibidor más débil sobre la señalización mediada por uno o más de GDF11, GDF8, activina A, BMP10, BMP6, GDF3 y BMP9 en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente en un ensayo basado en células. En otras realizaciones preferidas, heteromultímeros ALK7:ActRIIB tienen un efecto inhibidor más fuerte sobre la señalización mediada por uno o más de activina AC, activina BC, activina C y BMP5 en comparación con un homomultímero de ActRIIB correspondiente en un ensayo basado en células. Opcionalmente, heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden inhibir adicionalmente la señalización por uno o más de BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP7, BMP8a, BMP8b, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF9b/BMP15, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), neurturina, artemina, persefina, mis y Lefty en un ensayo basado en células.

[0140] Como se usa en el presente documento, el término “ActRIIB” se refiere a una familia de proteínas de receptor de activina de tipo IIB (ActRIIB) de cualquier especie y variantes derivadas de tales proteínas ActRIIB mediante mutagénesis u otra modificación. Se entiende que la referencia a ActRIIB en el presente documento es una referencia a una cualquiera de las formas identificadas actualmente. Los miembros de la familia ActRIIB son generalmente proteínas transmembrana, compuestas por un dominio extracelular de unión a ligando que comprende una región rica en cisteína, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático con actividad serina/treonina cinasa predicha.

[0141] El término "polipéptido ActRIIB" incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido de origen natural de un miembro de la familia ActRIIB, así como cualquier variante del mismo (incluyendo mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas) que conservan una actividad útil. Se proporcionan ejemplos de dichos polipéptidos de ActRIIB variantes a lo largo de la presente divulgación, así como en las publicaciones de solicitud de patente internacional n.º WO 2006/012627, WO 2008/097541 y WO 2010/151426. La numeración de aminoácidos para todos los polipéptidos relacionados con ActRIIB descritos en el presente documento se basa en la numeración de la secuencia de la proteína precursora de ActRIIB humana proporcionada a continuación (SEQ ID NO: 1), a menos que se indique específicamente lo contrario.

[0142] La secuencia de proteína precursora de ActRIIB humano es tal como sigue:

[0145]

[0147] El péptido señal se indica con un solo subrayado; el dominio extracelular se indica en negrita; y los sitios de glicosilación unidos a N endógenos potenciales se indican con un subrayado doble.

[0148] La secuencia de polipéptido ActRIIB extracelular procesada (madura) es de la siguiente manera:

[0151]

[0153] En algunas realizaciones, la proteína puede producirse con una secuencia "SGR..." en el extremo N. La "cola" extremo carboxiterminal del dominio extracelular está indicada por un solo subrayado. La secuencia con la "cola" eliminada (una secuencia Δ15) es de la siguiente manera:

[0156]

[0158] También se informa en la literatura una forma de ActRIIB con una alanina en la posición 64 de SEQ ID NO: 1 (A64). Véase, por ejemplo, Hilden et al. (1994) Blood, 83(8): 2163-2170. Los solicitantes han determinado que una proteína de fusión ActRIIB-Fc que comprende un dominio extracelular de ActRIIB con la sustitución A64 tiene una afinidad relativamente baja por activina y GDF11. Por el contrario, la misma proteína de fusión ActRIIB-Fc con una arginina en la posición 64 (R64) tiene una afinidad por la activina y GDF11 en el intervalo de nanomolar bajo a picomolar alto. Por lo tanto, las secuencias con un R64 se usan como la secuencia de referencia de "tipo natural" para ActRIIB humano en esta divulgación.

[0159] La forma de ActRIIB con una alanina en la posición 64 es de la siguiente manera:

[0160]

[0162] El péptido señal se indica mediante un solo subrayado y el dominio extracelular se indica mediante una fuente en negrita.

[0163] La secuencia de polipéptido ActRIIB extracelular procesada (madura) de la forma alternativa A64 es de la siguiente manera:

[0166]

[0168] En algunas realizaciones, la proteína puede producirse con una secuencia "SGR..." en el extremo N. La "cola" extremo carboxiterminal del dominio extracelular se indica mediante un solo subrayado. La secuencia con la "cola" eliminada (una secuencia Δ15) es de la siguiente manera:

[0171]

[0174] A continuación se muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína precursora de ActRIIB humana (SEQ ID NO: 7), que representa los nucleótidos 25-1560 de la secuencia de referencia de Genbank NM_001106.3, que codifica para los aminoácidos 1-513 del precursor de ActRIIB. La secuencia como se muestra proporciona una arginina en la posición 64 y puede modificarse para proporcionar una alanina en su lugar. La secuencia señal está subrayada.

[0177]

[0178]

[0181] A continuación se muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido ActRIIB humano extracelular procesado (SEQ ID NO: 8). La secuencia como se muestra proporciona una arginina en la posición 64, y puede modificarse para proporcionar una alanina en su lugar.

[0184]

[0187] En la figura 3 se ilustra un alineamiento de las secuencias de aminoácidos del dominio extracelular de ActRIIB humano y el dominio extracelular de ActRIIA humano. Esta alineación indica residuos de aminoácidos dentro de ambos receptores que se cree que entran en contacto directamente con los ligandos de ActRII. Por ejemplo, las estructuras de ActRII compuestas indicaron que el bolsillo de unión a ligando de ActRIIB está definido, en parte, por los residuos Y31, N33, N35, L38 a T41, E47, E50, Q53 a K55, L57, H58, Y60, S62, K74, W78 a N83, Y85, R87, A92 y E94 a F101. En estas posiciones, se prevé que se tolerarán mutaciones conservadoras.

[0189] Además, ActRIIB está bien conservado entre los vertebrados, con grandes extensiones del dominio extracelular completamente conservadas. Por ejemplo, la figura 4 representa una alineación de múltiples secuencias de un dominio extracelular de ActRIIB humano en comparación con varios ortólogos de ActRIIB. Muchos de los ligandos que se unen a ActRIIB también están muy conservados. Por consiguiente, a partir de estos alineamientos, es posible predecir posiciones de aminoácidos clave dentro del dominio de unión a ligando que son importantes para las actividades de unión a ligando de ActRIIB normales, así como predecir posiciones de aminoácidos que es probable que sean tolerantes a la sustitución sin alterar significativamente las actividades de unión a ligando de ActRIIB normales. Por lo tanto, un polipéptido variante de ActRIIB humano activo útil de acuerdo con los métodos divulgados en el presente documento puede incluir uno o más aminoácidos en posiciones correspondientes de la secuencia de otro ActRIIB de vertebrado, o puede incluir un residuo que es similar al de las secuencias humanas o de otros vertebrados. Sin pretender ser limitativos, los siguientes ejemplos ilustran este enfoque para definir una variante activa de ActRIIB. L46 en el dominio extracelular humano (SEQ ID NO: 53) es una valina enXenopusActRIIB (SEQ ID NO: 55), y por lo tanto esta posición puede alterarse, y opcionalmente puede alterarse a otro residuo hidrófobo, tal como V, I o F, o un residuo no polar tal como A. E52 en el dominio extracelular humano es una K enXenopus, lo que indica que este sitio puede ser tolerante a una amplia variedad de cambios, que incluyen residuos polares, tales como E, D, K, R, H, S, T, P, G, Y y probablemente A. T93 en el dominio extracelular humano es una K enXenopus, lo que indica que se tolera una amplia variación estructural en esta posición, con residuos polares favorecidos, tales como S, K, R, E, D, H, G, P, G e Y. F108 en el dominio extracelular humano es una Y enXenopus, y por lo tanto Y u otro grupo hidrófobo, tal como I, V o L debe tolerarse. E111 en el dominio extracelular humano es K enXenopus, lo que indica que los residuos cargados serán tolerados en esta posición, incluyendo D, R, K y H, así como Q y N. R112 en el dominio extracelular humano es K enXenopus, lo que indica que los residuos básicos son tolerados en esta posición, incluyendo R y H. A en la posición 119 en el dominio extracelular humano está relativamente mal conservado, y aparece como P en roedores y V enXenopus, por lo tanto, esencialmente cualquier aminoácido debe ser tolerado en esta posición.

[0191] Además, las proteínas ActRII se han caracterizado en la técnica en términos de características estructurales y funcionales, particularmente con respecto a la unión a ligando [Attisano et al. (1992) Cell 68(1):97-108; Greenwald et al. (1999) Nature Structural Biology 6(1): 18-22; Allendorph et al. (2006) PNAS 103(20: 7643-7648; Thompson et al. (2003) The EMBO Journal 22(7): 1555-1566; así como las patentes estadounidenses n.<os>: 7.709.605, 7.612.041 y 7.842.663]. Además de las enseñanzas en el presente documento, estas referencias proporcionan una amplia orientación sobre cómo generar variantes de ActRIIB que conservan una o más actividades normales (por ejemplo, actividad de unión a ligando).

[0193] Por ejemplo, un motivo estructural definitorio conocido como un pliegue de toxina de tres dedos es importante para la unión a ligando por receptores de tipo I y tipo II y está formado por restos de cisteína conservados ubicados en posiciones variables dentro del dominio extracelular de cada receptor monomérico [Greenwald et al. (1999) Nat Struct Biol 6:18-22; y Hinck (2012) FEBS Lett 586:1860-1870]. Por consiguiente, los dominios de unión al ligando central de ActRIIB humano, como se demarcan por la más externa de estas cisteínas conservadas, corresponden a las posiciones 29-109 de SEQ ID NO: 1 (precursor de ActRIIB). Por lo tanto, los aminoácidos estructuralmente menos ordenados que flanquean estas secuencias centrales demarcadas por cisteína pueden truncarse en aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, o 28 residuos en el extremo N y/o en aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25 residuos en el extremo C sin alterar necesariamente la unión del ligando. Los ejemplos de dominios extracelulares de ActRIIB para el truncamiento N-terminal y/o C-terminal incluyen SEQ ID NO: 2, 3, 5 y 6.

[0195] Attisanoet al.mostraron que una deleción del nudo de prolina en el extremo carboxiterminal del dominio extracelular de ActRIIB redujo la afinidad del receptor por la activina. Una proteína de fusión ActRIIB-Fc que contiene los aminoácidos 20-119 de la presente SEQ ID NO: 1, "ActRIIB(20-119)-Fc", tiene una unión reducida a GDF11 y activina con respecto a un ActRIIB(20-134)-Fc, que incluye la región de nudo de prolina y el dominio de yuxtamembrana completo (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 7.842.663). Sin embargo, una proteína ActRIIB(20-129)-Fc conserva una actividad similar, pero algo reducida, en relación con el tipo natural, a pesar de que la región del nudo de prolina está alterada.

[0197] Por lo tanto, se espera que todos los dominios extracelulares de ActRIIB que se detienen en los aminoácidos 134, 133, 132, 131, 130 y 129 (con respecto a SEQ ID NO: 1) sean activos, pero los constructos que se detienen en 134 o 133 pueden ser más activas. De manera similar, no se espera que las mutaciones en cualquiera de los residuos 129-134 (con respecto a SEQ ID NO: 1) alteren la afinidad de unión al ligando en grandes márgenes. En apoyo de esto, se sabe en la técnica que las mutaciones de P129 y P130 (con respecto a SEQ ID NO: 1) no disminuyen sustancialmente la unión al ligando. Por lo tanto, un polipéptido ActRIIB de la presente divulgación puede terminar tan pronto como el aminoácido 109 (la cisteína final), sin embargo, se espera que las formas que terminan en o entre 109 y 119 (por ejemplo, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 o 119) tengan una unión de ligando reducida. El aminoácido 119 (con respecto a la presente SEQ ID NO: 1) está mal conservado y, por lo tanto, se altera o trunca fácilmente. Los polipéptidos de ActRIIB que terminan en 128 (con respecto a SEQ ID NO: 1) o posteriores deben retener la actividad de unión al ligando. Los polipéptidos de ActRIIB que terminan en o entre 119 y 127 (por ejemplo, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126 o 127), con respecto a SEQ ID NO: 1, tendrán una capacidad de unión intermedia. Puede ser deseable utilizar cualquiera de estas formas, dependiendo del entorno clínico o experimental.

[0199] En el extremo N de ActRIIB, se espera que una proteína que comienza en el aminoácido 29 o antes (con respecto a SEQ ID NO: 1) retenga la actividad de unión al ligando. El aminoácido 29 representa la cisteína inicial. Una mutación de alanina a asparagina en la posición 24 (con respecto a SEQ ID NO: 1) introduce una secuencia de glicosilación unida a N sin afectar sustancialmente la unión al ligando [patente estadounidense n.º 7.842.663]. Esto confirma que las mutaciones en la región entre el péptido de escisión de señal y la región reticulada de cisteína, correspondientes a los aminoácidos 20-29, se toleran bien. En particular, los polipéptidos de ActRIIB que comienzan en la posición 20, 21, 22, 23 y 24 (con respecto a SEQ ID NO: 1) deben retener la actividad de unión a ligando general, y también se espera que los polipéptidos de ActRIIB que comienzan en las posiciones 25, 26, 27, 28 y 29 (con respecto a SEQ ID NO: 1) retengan la actividad de unión a ligando. Se ha demostrado, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 7.842.663, que, sorprendentemente, un constructo de ActRIIB que comienza a las 22, 23, 24 o 25 tendrá la mayor actividad.

[0201] En conjunto, una fórmula general para una porción activa (por ejemplo, porción de unión a ligando) de ActRIIB comprende los aminoácidos 29-109 de SEQ ID NO: 1. Por lo tanto, los polipéptidos de ActRIIB pueden, por ejemplo, comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en una secuencia de aminoácidos que es de al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica a una porción de ActRIIB que comienza en un residuo correspondiente a cualquiera de los aminoácidos 20-29 (por ejemplo, comenzando en cualquiera de los aminoácidos 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, o 29) de SEQ ID NO: 1 y que termina en una posición correspondiente a cualquiera de los aminoácidos 109-134 (por ejemplo, terminando en una cualquiera de los aminoácidos 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, o 134) de SEQ ID NO: 1. Otros ejemplos incluyen polipéptidos que comienzan en una posición de 20-29 (por ejemplo, una cualquiera de las posiciones 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, o 29) o 21-29 (por ejemplo, cualquiera de las posiciones 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, o 29) de SEQ ID NO: 1 y terminan en una posición de 119-134 (por ejemplo, una cualquiera de las posiciones 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, o 134), 119-133 (por ejemplo, cualquiera de las posiciones 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, o 133), 129-134 (por ejemplo, una cualquiera de las posiciones 129, 130, 131, 132, 133, o 134), o 129-133 (por ejemplo, una cualquiera de las posiciones 129, 130, 131, 132, o 133) de SEQ ID NO: 1. Otros ejemplos incluyen constructos que comienzan en una posición de 20-24 (por ejemplo, una cualquiera de las posiciones 20, 21, 22, 23, o 24), 21-24 (por ejemplo, cualquiera de las posiciones 21, 22, 23, o 24), o 22-25 (por ejemplo, una cualquiera de las posiciones 22, 22, 23, o 25) de SEQ ID NO: 1 y terminan en una posición de 109-134 (por ejemplo, una cualquiera de las posiciones 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, o 134), 119-134 (por ejemplo, una cualquiera de las posiciones 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, o 134) o 129-134 (por ejemplo, una cualquiera de las posiciones 129, 130, 131, 132, 133, o 134) de SEQ ID NO: 1. También se contemplan variantes dentro de estos intervalos, particularmente aquellas que tienen al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % de identidad con la porción correspondiente de SEQ ID NO: 1.

[0203] Las variaciones descritas en el presente documento pueden combinarse de diversas maneras. En algunas realizaciones, las variantes de ActRIIB comprenden no más de 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 15 cambios de aminoácidos conservativos en el bolsillo de unión a ligando, y cero, una o más alteraciones no conservativas en las posiciones 40, 53, 55, 74, 79 y/u 82 en el bolsillo de unión a ligando. Los sitios fuera del bolsillo de unión, en los que la variabilidad puede ser particularmente bien tolerada, incluyen los extremos amino y carboxi del dominio extracelular (como se señaló anteriormente), y las posiciones 42-46 y 65-73 (con respecto a SEQ ID NO: 1). Una alteración de asparagina a alanina en la posición 65 (N65A) en realidad mejora la unión del ligando en el fondo A64 y, por lo tanto, se espera que no tenga ningún efecto perjudicial sobre la unión del ligando en el fondo R64 [patente estadounidense n.º 7.842.663]. Este cambio probablemente elimina la glicosilación en N65 en el fondo A64, lo que demuestra que es probable que se tolere un cambio significativo en esta región. Si bien un cambio de R64A se tolera mal, R64K se tolera bien y, por lo tanto, otro residuo básico, como H, puede tolerarse en la posición 64 [patente estadounidense n.º 7.842.663]. Además, los resultados del programa de mutagénesis descrito en la técnica indican que hay posiciones de aminoácidos en ActRIIB que a menudo es beneficioso conservar. Con respecto a SEQ ID NO: 1, estas incluyen la posición 80 (aminoácido ácido o hidrófobo), la posición 78 (hidrófobo, y particularmente triptófano), la posición 37 (ácido, y particularmente ácido aspártico o glutámico), la posición 56 (aminoácido básico), la posición 60 (aminoácido hidrófobo, particularmente fenilalanina o tirosina). Por lo tanto, la divulgación proporciona un marco de aminoácidos que puede conservarse en polipéptidos de ActRIIB. Otras posiciones que puede ser deseable conservar son las siguientes: posición 52 (aminoácido ácido), posición 55 (aminoácido básico), posición 81 (ácido), 98 (polar o cargada, particularmente E, D, R o K), todas con respecto a SEQ ID NO: 1.

[0205] En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a heteromultímeros que comprenden al menos un polipéptido ActRIIB, que incluye fragmentos, variantes funcionales y formas modificadas de los mismos. Preferiblemente, los polipéptidos de ActRIIB para su uso según la divulgación son solubles (por ejemplo, un dominio extracelular de ActRIIB). En otras realizaciones preferidas, los polipéptidos de ActRIIB para su uso de acuerdo con la divulgación se unen a uno o más ligandos de la superfamilia TGF-beta. Por lo tanto, en algunas realizaciones, los polipéptidos de ActRIIB para su uso de acuerdo con la divulgación inhiben (antagonizan) la actividad (por ejemplo, inhibición de la señalización de SMAD) de uno o más ligandos de la superfamilia TGF-beta. En algunas realizaciones, los heteromultímeros de la divulgación comprenden al menos un polipéptido ActRIIB que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia de aminoácidos que es de al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica a una porción de ActRIIB que comienza en un residuo correspondiente a los aminoácidos 20-29 (por ejemplo, comenzando en cualquiera de los aminoácidos 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, o 29) de SEQ ID NO: 1 y que termina en una posición correspondiente a los aminoácidos 109-134 (por ejemplo, terminando en una cualquiera de los aminoácidos 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, o 134) de SEQ ID NO: 1. En determinadas realizaciones preferidas, los heteromultímeros de la divulgación comprenden al menos un polipéptido ActRIIB que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos que es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 % de aminoácidos idénticos 29-109 de SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones preferidas, los heteromultímeros de la divulgación comprenden al menos un polipéptido ActRIIB que comprende, consiste o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos que es al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 % de aminoácidos idénticos 25-131 de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, los heteromultímeros de la divulgación comprenden al menos un polipéptido de ActRIIB que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 71, 73, 77 y 78. En determinadas realizaciones, los heteromultímeros de la divulgación comprenden al menos un polipéptido ActRIIB en donde la posición de aminoácido correspondiente a L79 de SEQ ID NO: 1 no es un aminoácido ácido (es decir, no es un residuo de aminoácido D o E de origen natural o aminoácido ácido artificial).

[0207] En determinados aspectos, la presente divulgación se refiere a complejos proteicos que comprenden un polipéptido ALK7. Como se usa en el presente documento, el término “ALK7” se refiere a una familia de proteínas quinasa-7 de tipo receptor de activina de cualquier especie y variantes derivadas de tales proteínas ALK7 mediante mutagénesis u otra modificación. Se entiende que la referencia a ALK7 en el presente documento es una referencia a una cualquiera de las formas identificadas actualmente. Los miembros de la familia ALK7 son generalmente proteínas transmembrana, compuestas por un dominio extracelular de unión a ligando con una región rica en cisteína, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático con actividad de serina/treonina cinasa predicha.

[0208] El término "polipéptido ALK7" incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido de origen natural de un miembro de la familia ALK7, así como cualquier variante del mismo (incluyendo mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas) que conservan una actividad útil. La numeración de aminoácidos para todos los polipéptidos relacionados con ALK7 descritos en el presente documento se basa en la numeración de la secuencia de la proteína precursora de ALK7 humana a continuación (SEQ ID NO: 9), a menos que se indique específicamente lo contrario.

[0210] Existen diversas isoformas de origen natural de ALK7 humana. La secuencia de la proteína precursora de la isoforma 1 de ALK7 humana canónica (NCBI Ref Seq NP_660302.2) es de la siguiente manera:

[0213]

[0216] El péptido señal se indica mediante un solo subrayado y el dominio extracelular se indica ennegrita.

[0217] La secuencia de polipéptido de isoforma 1 de ALK7 extracelular procesada es tal como sigue:

[0220]

[0223] A continuación se muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína precursora de la isoforma 1 de ALK7 humana (SEQ ID NO: 11), correspondiente a los nucleótidos 244-1722 de la secuencia de referencia de Genbank NM_145259.2. La secuencia señal está subrayada y el dominio extracelular se indica ennegrita.

[0226]

[0229] Una secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido de ALK7 extracelular procesado (isoforma 1) es de la siguiente manera:

[0232]

[0235] La secuencia de aminoácidos de una isoforma alternativa de ALK7 humana, isoforma 2 (NCBI Ref Seq NP_001104501.1), se muestra en su forma procesada de la siguiente manera (SEQ ID NO: 19), donde el dominio extracelular se indica en negrita.

[0238]

[0240] La secuencia de aminoácidos del polipéptido de ALK7 extracelular (isoforma 2) es tal como sigue:

[0241] MLTNGKEQVIKSCVSLPELNAQVFCHSSNNVTKTECCFTDFCNNITLHLPTASPNAPKLGPME (SEQ ID NO: 20). A continuación se muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido de ALK7 procesado (isoforma 2) (SEQ ID NO: 21), correspondiente a los nucleótidos 279-1607 de la secuencia de referencia de NCBI NM_001111031.1. El dominio extracelular se indica ennegrita.

[0244]

[0245] Una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de ALK7 extracelular (isoforma 2) es la siguiente (SEQ ID NO: 22):

[0248]

[0250] La secuencia de aminoácidos de una proteína precursora de ALK7 humana alternativa, isoforma 3 (NCBI Ref Seq NP_001104502.1), se muestra a continuación (SEQ ID NO: 38), donde el péptido señal se indica mediante un único subrayado.

[0253]

[0255] La secuencia de aminoácidos del polipéptido de ALK7 procesado (isoforma 3) es tal como sigue (SEQ ID NO: 39). Esta isoforma carece de un dominio transmembrana y, por lo tanto, se propone que sea soluble en su totalidad (Roberts et al., 2003, Biol Reprod 68:1719-1726). Las variantes N-terminales de SEQ ID NO: 39 se predicen como se describe a continuación.

[0258]

[0260] A continuación se muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína precursora del polipéptido ALK7 no procesada (isoforma 3) (SEQ ID NO: 40), correspondiente a los nucleótidos 244-1482 de la secuencia de referencia del NCBI NM_001111032.1. La secuencia señal se indica con subrayado sólido.

[0261]

[0264] Una secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido de ALK7 procesado (isoforma 3) es la siguiente (SEQ ID NO: 41):

[0267]

[0270] La secuencia de aminoácidos de una proteína precursora de ALK7 humana alternativa, isoforma 4 (NCBI Ref Seq NP_001104503.1), se muestra a continuación (SEQ ID NO: 42), donde el péptido señal se indica mediante un único subrayado.

[0271]

[0274] La secuencia de aminoácidos del polipéptido de ALK7 procesado (isoforma 4) es tal como sigue (SEQ ID NO: 43). Al igual que la isoforma 3 de ALK7, la isoforma 4 carece de un dominio transmembrana y, por lo tanto, se propone que sea soluble en su totalidad (Roberts et al., 2003, Biol Reprod 68:1719-1726). Las variantes N-terminales de SEQ ID NO: 43 se predicen como se describe a continuación.

[0277]

[0280] A continuación se muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína precursora del polipéptido ALK7 no procesada (isoforma 4) (SEQ ID NO: 44), correspondiente a los nucleótidos 244-1244 de la secuencia de referencia de NCBI NM_001111033.1. La secuencia señal se indica con subrayado sólido.

[0281]

[0283] Una secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido de ALK7 procesado (isoforma 4) es la siguiente (SEQ ID NO: 45):

[0286]

[0288] Con base en la secuencia señal de ALK7 de longitud completa (isoforma 1) en la rata (véase la secuencia de referencia de NCBI NP_620790.1) y en el alto grado de identidad de secuencia entre ALK7 humana y de rata, se predice que una forma procesada de la isoforma 1 de ALK7 humana es la siguiente (SEQ ID NO: 46).

[0291]

[0293] Se predicen variantes activas de la isoforma 1 de ALK7 procesada en las que SEQ ID NO: 10 está truncada por 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 aminoácidos en el extremo N y SEQ ID NO: 46 está truncada por 1 o 2 aminoácidos en el extremo N. De acuerdo con SEQ ID NO: 46, se espera además que la leucina sea el aminoácido N-terminal en las formas procesadas de la isoforma 3 de ALK7 humana (SEQ ID NO: 39) y la isoforma 4 de ALK7 humana (SEQ ID NO: 43).

[0294] En determinadas realizaciones, la divulgación se refiere a heteromultímeros que comprenden al menos un polipéptido de ALK7, que incluye fragmentos, variantes funcionales y formas modificadas de los mismos. Preferiblemente, los polipéptidos de ALK7 para su uso de acuerdo con las invenciones de la divulgación (por ejemplo, heteromultímeros que comprenden un polipéptido de ALK7 y usos de los mismos) son solubles (por ejemplo, un dominio extracelular de ALK7). En otras realizaciones preferidas, los polipéptidos de ALK7 para su uso de acuerdo con la divulgación se unen a uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-beta. Por lo tanto, en algunas realizaciones preferidas, los polipéptidos de ALK7 para su uso de acuerdo con la divulgación inhiben (antagonizan) la actividad (por ejemplo, inducción de la señalización de Smad 2/3 y/o Smad 1/5/8) de uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-beta. En algunas realizaciones, los heteromultímeros de la divulgación comprenden al menos un polipéptido de ALK7 que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 38, 39, 42, 43, 46, 74, 75, 79 u 80. En algunas realizaciones, el heteromultímero de la divulgación consiste o consiste esencialmente en al menos un polipéptido de ALK7 que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 38, 39, 42, 43, 46, 74, 75, 79 y 80.

[0296] ALK7 está bien conservada entre los vertebrados, con grandes extensiones del dominio extracelular completamente conservadas. Por ejemplo, la figura 7 representa un alineamiento de múltiples secuencias de un dominio extracelular de ALK7 humano en comparación con diversos ortólogos de ALK7. Por consiguiente, a partir de estos alineamientos, es posible predecir posiciones de aminoácidos clave dentro del dominio de unión a ligando que son importantes para actividades de unión a ligando de ALK7 normales así como predecir posiciones de aminoácidos que probablemente sean tolerantes a sustitución sin alterar significativamente actividades de unión a ligando de ALK7 normales. Por lo tanto, un polipéptido variante de ALK7 humana activo útil de acuerdo con los métodos divulgados en el presente documento puede incluir uno o más aminoácidos en posiciones correspondientes de la secuencia de otro ALK7 de vertebrado, o puede incluir un residuo que es similar al de las secuencias humanas o de otros vertebrados. Sin pretender ser limitativos, los siguientes ejemplos ilustran este enfoque para definir una variante activa de ALK7. V61 en el dominio extracelular de ALK7 humana (SEQ ID NO: 59) es isoleucina enCallithrix jacchusALK7 (SEQ ID NO: 62), por lo que la posición puede alterarse y, opcionalmente, puede alterarse a otro residuo hidrófobo como L, I o F, o un residuo no polar como A. L32 en el dominio extracelular humano es R enTarsius syrichta(SEQ ID NO: 63) ALK7, lo que indica que este sitio puede ser tolerante a una amplia variedad de cambios, incluidos los residuos polares, como E, D, K, R, H, S, T, P, G, Y, y probablemente un residuo no polar como A. K37 en el dominio extracelular humano es R en Pantroglodytes ALK7 (SEQ ID NO: 60), lo que indica que se toleran residuos básicos en esta posición, incluidos R, K y H. P4 en el dominio extracelular humano está relativamente poco conservado, apareciendo como A en Pantroglodytes ALK7, lo que indica que una amplia variedad de aminoácidos debe tolerarse en esta posición.

[0298] Además, las proteínas ALK7 se han caracterizado en la técnica en términos de características estructurales y funcionales [por ejemplo, Romano et al (2012) Journal of Molecular Modeling 18(8): 3617-3625]. Por ejemplo, un motivo estructural definitorio conocido como un pliegue de toxina de tres dedos es importante para la unión a ligando por receptores de tipo I y tipo II y está formado por restos de cisteína conservados ubicados en posiciones variables dentro del dominio extracelular de cada receptor monomérico [Greenwald et al. (1999) Nat Struct Biol 6:18-22; y Hinck (2012) FEBS Lett 586:1860-1870]. Por consiguiente, los dominios de unión al ligando central de ALK7 humana, como se demarcan por la más externa de estas cisteínas conservadas, corresponden a las posiciones 28-92 de SEQ ID NO: 9. Los aminoácidos estructuralmente menos ordenados que flanquean estas secuencias centrales marcadas con cisteína pueden truncarse en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, o 27 residuos en el extremo N y por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o 21 residuos en el extremo C sin alterar necesariamente la unión del ligando. Los dominios extracelulares de ALK7 de ejemplo para el truncamiento N-terminal y/o C-terminal incluyen SEQ ID NO: 10, 20, 39 y 43.

[0300] Por consiguiente, una fórmula general para una porción activa (por ejemplo, una porción de unión a ligando) de ALK7 comprende los aminoácidos 28-92. Por lo tanto, los polipéptidos de ALK7 pueden, por ejemplo, comprenden, consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia de aminoácidos que es de al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica a una porción de ALK7 que comienza en un residuo correspondiente a cualquiera de los aminoácidos 20-28 (por ejemplo, comenzando en uno cualquiera de los aminoácidos 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, o 28) de SEQ ID NO: 9 y que termina en una posición correspondiente a uno cualquiera de los aminoácidos 92-113 (por ejemplo, terminando en uno cualquiera de los aminoácidos 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, o 113) de SEQ ID NO: 9.

[0302] Otros ejemplos incluyen constructos que comienzan en una posición de 21-28 (por ejemplo, cualquiera de las posiciones 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, o 28), 24-28 (por ejemplo, cualquiera de las posiciones 24, 25, 26, 27, o 28), o 25-28 (por ejemplo, cualquiera de las posiciones 25, 26, 27, o 28) de SEQ ID NO: 9 y terminan en una posición de 93-112 (por ejemplo, una cualquiera de las posiciones 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, o 112), 93-110 (por ejemplo, cualquiera de las posiciones 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, o 110), 93-100 (por ejemplo, una cualquiera de las posiciones 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100), o 93-95 (por ejemplo, una cualquiera de las posiciones 93, 94, o 95) de SEQ ID NO: 9. También se contemplan variantes dentro de estos intervalos, particularmente aquellas que tienen al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % de identidad con la porción correspondiente de SEQ ID NO: 9.

[0304] Las variaciones descritas en el presente documento pueden combinarse de diversas maneras. En algunas realizaciones, las variantes de ALK7 comprenden no más de 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 15 cambios conservadores de aminoácidos en el bolsillo de unión al ligando. Los sitios fuera del bolsillo de unión, en los que la variabilidad puede ser particularmente bien tolerada, incluyen los extremos amino y carboxi del dominio extracelular (como se señaló anteriormente).

[0306] En determinados aspectos, la presente divulgación se refiere a heteromultímeros que comprenden uno o más polipéptidos del receptor de ALK7 (por ejemplo, SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 38, 39, 42, 43, 46, 74, 76, 79 y 80) y uno o más polipéptidos receptores de ActRIIB (por ejemplo, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 71, 73, 77 y 78), que generalmente se denominan en el presente documento "complejos de heteromultímeros ALK7:ActRIIB" o "heteromultímeros ALK7:ActRIIB". Preferiblemente, heteromultímeros ALK7:ActRIIB son solubles, por ejemplo, un heteromultímero comprende una parte soluble (dominio) de un receptor de ALK7 y una parte soluble (dominio) de un receptor de ActRIIB. En general, los dominios extracelulares de ALK7 y ActRIIB corresponden a la parte soluble de estos receptores. Por lo tanto, en algunas realizaciones, los heteromultímeros comprenden un dominio extracelular de un receptor ALK7 y un dominio extracelular de un receptor ActRIIB. En la presente se describen dominios extracelulares de ejemplo de receptores de ALK7 y ActRIIB y dichas secuencias, así como fragmentos, variantes funcionales y formas modificadas de los mismos, pueden usarse según las invenciones de la divulgación (por ejemplo, composiciones de heteromultímeros ALK7:ActRIIB y usos de las mismas). En algunas realizaciones, heteromultímeros ALK7:ActRIIB comprenden al menos un polipéptido de ALK7 que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia que es idéntica en al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, 10, 19, 20, 38, 39, 42, 43, 46, 74, 76, 79 y 80. En algunas realizaciones, heteromultímeros ALK7:ActRIIB comprenden al menos un polipéptido de ALK7 que comprende, consiste esencialmente en, consiste en una secuencia que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 % el 95 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica a una porción de ALK7 que comienza en un residuo correspondiente a una cualquiera de los aminoácidos 21-28, 22-28, 23-28, 24-28, 25-28, 26-28 o 27-28 de SEQ ID NO: 9 y que termina en una posición de 93-112, 93, 110, 93-100, 93-95 de SEQ ID NO: 9. En algunas realizaciones, heteromultímeros ALK7:ActRIIB comprenden al menos un polipéptido de ALK7 que comprende, consiste esencialmente en, consiste en una secuencia que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica a los aminoácidos 28-92 de SEQ ID NO: 9. En algunas realizaciones, los heteromultímeros de ALK7-ActRIIB comprenden al menos un polipéptido de ActRIIB que comprende, consiste esencialmente en, consiste en, consiste en una secuencia que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 71, 73, 77 y 78. En algunas realizaciones, heteromultímeros ALK7:ActRIIB comprenden al menos un polipéptido de ActRIIB que comprende, consiste esencialmente en, consiste en una secuencia que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica a una porción de ActRIIB que comienza en un residuo correspondiente a uno cualquiera de los aminoácidos 20-29, 20-24, 21-24, 22-25 o 21-29 y termina en una posición de 109-134, 119-134, 119-133, 129-134 o 129-133 de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, heteromultímeros ALK7:ActRIIB comprenden al menos un polipéptido de ActRIIB que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica a los aminoácidos 29-109 de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, heteromultímeros ALK7:ActRIIB comprenden al menos un polipéptido de ActRIIB que comprende, consiste esencialmente en, consiste en una secuencia que es al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % idéntica a los aminoácidos 25-125 de SEQ ID NO: 1. En determinadas realizaciones preferidas, heteromultímeros ALK7:ActRIIB comprenden al menos un polipéptido de ActRIIB en donde la posición correspondiente a L79 de SEQ ID NO: 1 no es un aminoácido ácido (es decir, aminoácidos D o E de origen natural o un residuo de ácido ácido artificial). ALK7: Los heteromultímeros de ActRIIB incluyen, por ejemplo, heterodímeros, heterotrímeros, heterotetrámeros y estructuras oligoméricas de orden superior adicionales. Véase, por ejemplo, las figuras 1, 2 y 8-10. En determinadas realizaciones preferidas, los heteromultímeros de la divulgación son heterodímeros de ALK7:ActRIIB.

[0308] En algunas realizaciones, la presente divulgación contempla hacer variantes funcionales modificando la estructura de un polipéptido de ALK7 y/o un polipéptido de ActRIIB. Pueden producirse variantes mediante sustitución, deleción, adición de aminoácidos o combinaciones de las mismas. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina por una isoleucina o valina, un aspartato por un glutamato, una treonina por una serina o un reemplazo similar de un aminoácido por un aminoácido estructuralmente relacionado (por ejemplo, mutaciones conservadoras) no tendrá un efecto importante sobre la actividad biológica de la molécula resultante. Los reemplazos conservadores son aquellos que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Si un cambio en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la divulgación da como resultado un homólogo funcional puede determinarse fácilmente evaluando la capacidad del polipéptido variante para producir una respuesta en células de una manera similar al polipéptido de tipo natural, o para unirse a uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-beta que incluyen, por ejemplo, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC, activina BE, nodal, factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), neurturina, artemin, persefina, Mis, y Lefty.

[0310] En algunas realizaciones, la presente divulgación contempla hacer variantes funcionales modificando la estructura de un polipéptido de ALK7 y/o un polipéptido de ActRIIB con fines tales como mejorar la eficacia o estabilidad terapéutica (por ejemplo, vida útil y resistencia a la degradación proteolíticain vivo).

[0312] En algunas realizaciones, la presente divulgación contempla mutaciones específicas de un polipéptido ALK7 y/o un polipéptido ActRIIB para alterar la glicosilación del polipéptido. Dichas mutaciones pueden seleccionarse para introducir o eliminar uno o más sitios de glicosilación, tales como sitios de glicosilación unidos a O o unidos a N. Los sitios de reconocimiento de glicosilación unidos a asparagina generalmente comprenden una secuencia tripéptido, asparagina-X-treonina o asparagina-X-serina (donde "X" es cualquier aminoácido) que es reconocida específicamente por enzimas de glicosilación celular apropiadas. La alteración también puede realizarse mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del polipéptido (para sitios de glicosilación unidos a O). Una variedad de sustituciones o deleciones de aminoácidos en una o ambas de las posiciones de aminoácidos primera o tercera de un sitio de reconocimiento de glicosilación (y/o deleción de aminoácidos en la segunda posición) da como resultado no glicosilación en la secuencia de tripéptido modificada. Otro medio para aumentar el número de restos de hidratos de carbono en un polipéptido es mediante acoplamiento químico o enzimático de glucósidos al polipéptido. Dependiendo del modo de acoplamiento utilizado, el/los azúcar(es) pueden unirse a (a) arginina e histidina; (b) grupos carboxilo libres; (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de cisteína; (d) grupos hidroxilo libres tales como los de serina, treonina o hidroxiprolina; (e) residuos aromáticos tales como los de fenilalanina, tirosina o triptófano; o (f) el grupo amida de glutamina. La eliminación de uno o más restos de carbohidratos presentes en un polipéptido puede lograrse química y/o enzimáticamente. La desglicosilación química puede implicar, por ejemplo, la exposición de un polipéptido al compuesto ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado la escisión de la mayoría o todos los azúcares, excepto el azúcar de enlace (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), mientras que deja intacta la secuencia de aminoácidos. La escisión enzimática de restos de carbohidratos en polipéptidos puede lograrse mediante el uso de una variedad de endo- y exo-glicosidasas como se describe por Thotakura et al. [Meth. Enzymol. (1987) 138:350]. La secuencia de un polipéptido puede ajustarse, según corresponda, dependiendo del tipo de sistema de expresión utilizado, ya que las células de mamífero, levadura, insecto y planta pueden introducir patrones de glicosilación diferentes que pueden verse afectados por la secuencia de aminoácidos del péptido. En general, los complejos heteroméricos de la presente divulgación para su uso en seres humanos pueden expresarse en una línea celular de mamífero que proporcione la glicosilación adecuada, tal como líneas celulares HEK293 o CHO, aunque también se espera que sean útiles otras líneas celulares de expresión de mamífero.

[0314] La presente divulgación contempla además un método para generar mutantes, particularmente conjuntos de mutantes combinatorios de un polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB, así como mutantes de truncamiento. Los grupos de mutantes combinatorios son especialmente útiles para identificar secuencias de ALK7 y/o ActRIIB funcionalmente activas (por ejemplo, unión a ligando de la superfamilia de TGF-beta). El propósito de cribar tales bibliotecas combinatorias puede ser generar, por ejemplo, variantes de polipéptidos que tienen propiedades alteradas, tales como farmacocinética alterada o unión a ligando alterada. A continuación se proporciona una variedad de ensayos de selección, y dichos ensayos pueden usarse para evaluar variantes. Por ejemplo, las variantes del complejo ALK7:ActRIIB pueden analizarse para determinar la capacidad de unirse a uno o más ligandos de la superfamilia TGF-beta, para evitar la unión de un ligando de la superfamilia TGF-beta a un receptor de la superfamilia TGF-beta y/o para interferir con la señalización causada por un ligando de la superfamilia TGF-beta.

[0316] La actividad de un heteromultímero de ALK7:ActRIIB puede probarse, por ejemplo, en un ensayo basado en células oin vivo. Por ejemplo, se puede evaluar el efecto de un heteromultímero de ALK7:ActRIIB sobre la expresión de genes o la actividad de proteínas implicadas en el metabolismo de las grasas, el daño renal, la inflamación renal y/o la fibrosis renal. Esto puede realizarse, según sea necesario, en presencia de una o más proteínas de ligando de la superfamilia de TGF-beta recombinantes, y las células pueden transfectarse para producir un heteromultímero de ALK7:ActRIIB, y opcionalmente, un ligando de la superfamilia de TGF-beta. Del mismo modo, puede administrarse un heteromultímero de ALK7:ActRIIB a un ratón u otro animal, y pueden evaluarse una o más mediciones, tales como metabolismo de grasas o daño renal, inflamación, fibrosis y/o función usando métodos reconocidos en la técnica. De manera similar, la actividad de un heteromultímero de ALK7:ActRIIB, o variantes del mismo, puede ensayarse en, por ejemplo, adipocitos y/o células glomerulares para cualquier efecto sobre el crecimiento de estas células, por ejemplo, mediante los ensayos tal como se describen en el presente documento y los de conocimiento común en la técnica. Puede usarse un gen indicador sensible a SMAD en tales líneas celulares para monitorizar los efectos sobre la señalización aguas abajo.

[0318] Se pueden generar variantes derivadas de la combinación que tienen mayor selectividad o potencia generalmente mayor con respecto a un heteromultímero de ALK7:ActRIIB de referencia. Dichas variantes, cuando se expresan a partir de constructos de ADN recombinante, pueden usarse en protocolos de terapia génica. Del mismo modo, la mutagénesis puede dar lugar a variantes que tienen semividas intracelulares drásticamente diferentes del correspondiente heteromultímero de ALK7 no modificado:ActRIIB. Por ejemplo, la proteína alterada puede hacerse más estable o menos estable a la degradación proteolítica u otros procesos celulares que dan como resultado la destrucción, o inactivación de otro modo, de un polipéptido no modificado. Dichas variantes, y los genes que las codifican, pueden utilizarse para alterar los niveles de complejo polipeptídico mediante la modulación de la semivida del polipéptido. Por ejemplo, una semivida corta puede dar lugar a efectos biológicos más transitorios y, cuando forma parte de un sistema de expresión inducible, puede permitir un control más estricto de los niveles de complejo polipeptídico recombinante dentro de la célula. En una proteína de fusión Fc, pueden realizarse mutaciones en el enlazador (si lo hay) y/o la porción Fc para alterar una o más actividades del heteromultímero ALK7:ActRIIB incluyendo, por ejemplo, inmunogenicidad, semivida y solubilidad.

[0320] Una biblioteca combinatoria puede producirse por medio de una biblioteca degenerada de genes que codifican una biblioteca de polipéptidos que incluyen cada uno al menos una parte de posibles secuencias de ALK7 y/o ActRIIB. Por ejemplo, una mezcla de oligonucleótidos sintéticos puede ligarse enzimáticamente en secuencias génicas de modo que el conjunto degenerado de secuencias de nucleótidos que codifican ALK7 y/o ActRIIB potenciales sea expresable como polipéptidos individuales, o alternativamente, como un conjunto de proteínas de fusión más grandes (por ejemplo, para la presentación en fagos).

[0322] Hay muchas formas mediante las cuales puede generarse la biblioteca de homólogos potenciales a partir de una secuencia de oligonucleótidos degenerada. La síntesis química de una secuencia génica degenerada puede llevarse a cabo en un sintetizador de ADN automático, y los genes sintéticos pueden entonces ligarse en un vector apropiado para la expresión. La síntesis de oligonucleótidos degenerados es bien conocida en la técnica [Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273-289; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem.

[0323] 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; e Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477]. Dichas técnicas se han empleado en la evolución dirigida de otras proteínas [Scott et al., (1990) Science 249:386-390; Roberts et al. (1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin et al. (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al., (1990) PNAS USA 87: 6378-6382; así como las patentes estadounidenses n.<os>: 5.223.409, 5.198.346 y 5.096.815].

[0325] Alternativamente, pueden utilizarse otras formas de mutagénesis para generar una biblioteca combinatoria. Por ejemplo, pueden generarse heteromultímeros ALK7:ActRIIB y aislarse de una biblioteca mediante cribado usando, por ejemplo, mutagénesis de barrido de alanina [Ruf et al. (1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint et al. (1993) Gene 137:109-118; Grodberg et al. (1993) Eur. J. Biochem.

[0326] 218:597-601; Nagashima et al. (1993) J. Biol. Chem.268:2888-2892; Lowman et al. (1991) Biochemistry 30:10832-10838; y Cunningham et al. (1989) Science 244:1081-1085], mediante mutagénesis de barrido de enlazador [Gustin et al. (1993) Virology 193:653-660; y Brown et al. (1992) Mol. Cell Biol. 12: 2644-2652; McKnight et al. (1982) Science 232:316], por mutagénesis de saturación [Meyers et al., (1986) Science 232:613]; por mutagénesis por PCR [Leung et al. (1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19]; o por mutagénesis aleatoria, incluyendo mutagénesis química [Miller et al. (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; y Greener et al. (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34]. La mutagénesis de escaneo de enlazador, particularmente en un entorno combinatorio, es un método atractivo para identificar formas truncadas (bioactivas) de polipéptidos de ALK7 y/o ActRIIB.

[0328] En la técnica se conoce una amplia gama de técnicas para cribar productos génicos de bibliotecas combinatorias hechas por mutaciones puntuales y truncamientos, y, para el caso, para cribar bibliotecas de ADNc para productos génicos que tienen una determinada propiedad. Dichas técnicas serán generalmente adaptables para el cribado rápido de las bibliotecas de genes generadas por la mutagénesis combinatoria de los heteromultímeros ALK7:ActRIIB. Las técnicas más ampliamente utilizadas para el cribado de grandes bibliotecas de genes comprenden típicamente la clonación de la biblioteca de genes en vectores de expresión replicables, la transformación de células apropiadas con la biblioteca de vectores resultante y la expresión de los genes combinatorios en condiciones en las que la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento relativamente fácil del vector que codifica el gen cuyo producto se detectó. Los ensayos preferidos incluyen el ligando de la superfamilia TGF-beta (por ejemplo, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE, activina BE, nodal, factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), neurturina, artemina, persefina, mis y Lefty) ensayos de unión y/o ensayos de señalización celular mediados por ligando de la superfamilia TGF-beta.

[0329] En determinadas realizaciones, heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden comprender además modificaciones postraduccionales además de cualquiera que esté presente de forma natural en el polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación y acilación. Como resultado, heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden comprender elementos no aminoacídicos, tales como polietilenglicoles, lípidos, polisacáridos o monosacáridos, y fosfatos. Los efectos de dichos elementos no aminoacídicos sobre la funcionalidad de un complejo de heteromultímero pueden ensayarse tal como se describe en el presente documento para otras variantes de heteromultímero. Cuando un polipéptido de la divulgación se produce en células escindiendo una forma naciente del polipéptido, el procesamiento postraduccional también puede ser importante para el plegamiento y/o la función correctos de la proteína. Diferentes células (por ejemplo, Cho, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 o HEK293) tienen maquinaria celular específica y mecanismos característicos para tales actividades postraduccionales y pueden elegirse para garantizar la modificación y el procesamiento correctos del polipéptido ALK7 y/o ActRIIB, así como heteromultímeros que comprenden los mismos.

[0331] En determinadas realizaciones preferidas, los heteromultímeros divulgados en el presente documento comprenden al menos un polipéptido de ALK7 asociado, de forma covalente o no covalente, con al menos un polipéptido de ActRIIB. Preferiblemente, los polipéptidos descritos en el presente documento forman complejos heterodiméricos, aunque también se incluyen complejos heteromultiméricos de orden superior tales como, pero sin limitarse a, heterotrímeros, heterotetrámeros y estructuras oligoméricas adicionales (véase, por ejemplo, la figura 1, 2 y 8-10). En algunas realizaciones, los polipéptidos de ALK7 y/o ActRIIB comprenden al menos un dominio de multimerización. Como se describe en el presente documento, el término “dominio de multimerización” se refiere a un aminoácido o secuencia de aminoácidos que promueve la interacción covalente o no covalente entre al menos un primer polipéptido y al menos un segundo polipéptido. Los polipéptidos divulgados en el presente documento pueden unirse de manera covalente o no covalente a un dominio de multimerización. Preferiblemente, un dominio de multimerización promueve la interacción entre un primer polipéptido (por ejemplo, un polipéptido de ALK7) y un segundo polipéptido (por ejemplo, un polipéptido de ActRIIB) para promover la formación de heteromultímero (por ejemplo, formación de heterodímero), y opcionalmente dificulta o de otro modo desfavorece la formación de homomultímero (por ejemplo, formación de homodímero), aumentando de este modo el rendimiento de heteromultímero deseado (véase, por ejemplo, la figura 2).

[0333] Pueden usarse muchos métodos conocidos en la técnica para generar heteromultímeros de ALK7:ActRIIB. Por ejemplo, pueden construirse enlaces disulfuro de origen no natural reemplazando en un primer polipéptido (por ejemplo, un polipéptido de ALK7) un aminoácido de origen natural con un resto que contiene tiol libre, tal como cisteína, de manera que el tiol libre interacciona con otro resto que contiene tiol libre en un segundo polipéptido (por ejemplo, un polipéptido de ActRIIB) de manera que se forma un enlace disulfuro entre el primer y segundo polipéptidos. Los ejemplos adicionales de interacciones para promover la formación de heteromultímeros incluyen, pero no se limitan a, interacciones iónicas tal como se describe en Kjaergaard et al., WO2007147901; efectos de dirección electrostática tal como se describe en Kannan et al., US8,592,562; interacciones en espiral tal como se describe en Christensen et al., U.S.20120302737; cremalleras de leucina tal como se describe en Pack & Plueckthun,(1992) Biochemistry 31: 1579-1584; y motivos de hélice-giro-hélice tal como se describe en Pack et al., (1993) Bio/Technology 11: 1271-1277. El enlace de los diversos segmentos puede obtenerse mediante, por ejemplo, unión covalente tal como mediante reticulación química, enlazadores peptídicos, puentes disulfuro,etc., o interacciones de afinidad tales como mediante tecnología de cremallera de avidinbiotina o leucina.

[0335] En determinados aspectos, un dominio de multimerización puede comprender un componente de un par de interacciones. En algunas realizaciones, los polipéptidos divulgados en el presente documento pueden formar complejos de proteínas que comprenden un primer polipéptido asociado de forma covalente o no covalente con un segundo polipéptido, en donde el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de ALK7 y la secuencia de aminoácidos de un primer miembro de un par de interacción; y el segundo polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de ActRIIB y la secuencia de aminoácidos de un segundo miembro de un par de interacción. El par de interacción puede ser cualquiera de dos secuencias de polipéptidos que interactúan para formar un complejo, particularmente un complejo heterodimérico, aunque las realizaciones operativas también pueden emplear un par de interacción que puede formar un complejo homodimérico. Un miembro del par de interacción puede fusionarse con un polipéptido de ALK7 o ActRIIB como se describe en el presente documento, que incluye, por ejemplo, una secuencia polipeptídica que comprende, que consiste esencialmente en, o que consiste en una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % a la secuencia de una cualquiera de SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 10, 20, 39, 43 y 46. Puede seleccionarse un par de interacción para conferir una propiedad/actividad mejorada tal como semivida en suero aumentada, o para actuar como un adaptador al que se une otro resto para proporcionar una propiedad/actividad mejorada. Por ejemplo, un resto de polietilenglicol puede unirse a uno o ambos componentes de un par de interacción para proporcionar una propiedad/actividad mejorada tal como semivida en suero mejorada.

[0337] Los miembros primero y segundo del par de interacción pueden ser un par asimétrico, lo que significa que los miembros del par se asocian preferiblemente entre sí en lugar de autoasociarse. Por consiguiente, el primer y segundo miembros de un par de interacción asimétrica pueden asociarse para formar un complejo heterodimérico (véase, por ejemplo, la figura 2). Alternativamente, el par de interacción puede ser no guiado, lo que significa que los miembros del par pueden asociarse entre sí o autoasociarse sin preferencia sustancial y, por lo tanto, pueden tener secuencias de aminoácidos iguales o diferentes. Por consiguiente, los miembros primero y segundo de un par de interacciones no guiadas pueden asociarse para formar un complejo de homodímero o un complejo heterodimérico. Opcionalmente, el primer miembro del par de interacción (por ejemplo, un par asimétrico o un par de interacción no guiada) se asocia covalentemente con el segundo miembro del par de interacción. Opcionalmente, el primer miembro del par de interacción (por ejemplo, un par asimétrico o un par de interacción no guiada) se asocia de manera no covalente con el segundo miembro del par de interacción.

[0339] Como ejemplos específicos, la presente divulgación proporciona proteínas de fusión que comprenden ALK7 o ActRIIB fusionadas a un polipéptido que comprende un dominio constante de una inmunoglobulina, tal como un dominio CH1, CH2 o CH3 de una inmunoglobulina o un dominio Fc. Los dominios Fc derivados de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas se proporcionan en el presente documento. Se conocen otras mutaciones que disminuyen la actividad de CDC o ADCC, y colectivamente, cualquiera de estas variantes se incluyen en la divulgación y pueden usarse como componentes ventajosos de un complejo heteromultimérico de la divulgación. Opcionalmente, el dominio Fc de IgG1 de SEQ ID NO: 31 tiene una o más mutaciones en residuos tales como Asp-265, Lys-322 y Asn-434 (numerados de acuerdo con la IgG1 de longitud completa correspondiente). En determinados casos, el dominio Fc mutante que tiene una o más de estas mutaciones (por ejemplo, mutación Asp-265) tiene una capacidad reducida de unión al receptor Fcγ en relación con un dominio Fc de tipo natural. En otros casos, el dominio Fc mutante que tiene una o más de estas mutaciones (por ejemplo, mutación Asn-434) tiene una mayor capacidad de unión al receptor Fc relacionado con MHC de clase I (FcRN) en relación con un dominio Fc de tipo natural.

[0341] A continuación se muestra un ejemplo de una secuencia de aminoácidos nativa que puede usarse para la porción Fc de IgG1 humana (G1Fc) (SEQ ID NO: 31). El subrayado punteado indica la región bisagra, y el subrayado sólido indica posiciones con variantes de origen natural. En parte, la divulgación proporciona polipéptidos que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en secuencias de aminoácidos con el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % de identidad con SEQ ID NO: 31. Las variantes de origen natural en G1Fc incluirían E134D y M136L de acuerdo con el sistema de numeración utilizado en SEQ ID NO: 31 (véase Uniprot P01857).

[0344]

[0347] A continuación se muestra un ejemplo de una secuencia de aminoácidos nativa que puede usarse para la porción Fc de IgG2 humana (G2Fc) (SEQ ID NO: 32). El subrayado punteado indica la región de bisagra y el subrayado doble indica posiciones donde hay conflictos de base de datos en la secuencia (de acuerdo con UniProt P01859). En parte, la divulgación proporciona polipéptidos que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en secuencias de aminoácidos con el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % de identidad con SEQ ID NO: 32.

[0350]

[0353] A continuación, se muestran dos ejemplos de secuencias de aminoácidos que pueden usarse para la porción Fc de IgG3 humana (G3Fc). La región bisagra en G3Fc puede ser hasta cuatro veces más larga que en otras cadenas Fc y contiene tres segmentos idénticos de 15 residuos precedidos por un segmento similar de 17 residuos. La primera secuencia de G3Fc que se muestra a continuación (SEQ ID NO: 33) contiene una región bisagra corta que consiste en un único segmento de 15 residuos, mientras que la segunda secuencia de G3Fc (SEQ ID NO: 34) contiene una región bisagra de longitud completa. En cada caso, el subrayado punteado indica la región de la bisagra, y el subrayado sólido indica posiciones con variantes de origen natural de acuerdo con UniProt P01859. En parte, la divulgación proporciona polipéptidos que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en secuencias de aminoácidos con el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % de identidad con SEQ ID NO: 33 y 34.

[0356]

[0359] Las variantes de origen natural en G3Fc (por ejemplo, véase Uniprot P01860) incluyen E68Q, P76L, E79Q, Y81F, D97N, N100D, T124A, S169N, S169del, F221Y cuando se convierten al sistema de numeración utilizado en SEQ ID NO: 33, y la presente divulgación proporciona proteínas de fusión que comprenden dominios G3Fc que contienen una o más de estas variaciones. Además, el gen de inmunoglobulina IgG3 humana (IGHG3) muestra un polimorfismo estructural caracterizado por diferentes longitudes de bisagra [véase Uniprot P01859]. Específicamente, la variante WIS carece de la mayor parte de la región V y de toda la región CH1. Tiene un enlace disulfuro intercatenario adicional en la posición 7 además del 11 normalmente presente en la región de bisagra. La variante ZUC carece de la mayor parte de la región V, toda la región CH1 y parte de la bisagra. La variante OMM puede representar una forma alélica u otra subclase de cadena gamma. La presente divulgación proporciona proteínas de fusión adicionales que comprenden dominios G3Fc que contienen una o más de estas variantes.

[0360] A continuación se muestra un ejemplo de una secuencia de aminoácidos nativa que puede usarse para la porción Fc de IgG4 humana (G4Fc) (SEQ ID NO: 35). El subrayado punteado indica la región de la bisagra. En parte, la divulgación proporciona polipéptidos que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en secuencias de aminoácidos con el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % de identidad con SEQ ID NO: 35.

[0363]

[0366] En la presente se presenta una variedad de mutaciones modificadas en el dominio Fc con respecto a la secuencia de G1Fc (SEQ ID NO: 31), y se pueden derivar mutaciones análogas en G2Fc, G3Fc y G4Fc a partir de su alineación con G1Fc en la figura 5. Debido a las longitudes de bisagra desiguales, las posiciones de Fc análogas basadas en el alineamiento de isotipos (figura 5) poseen diferentes números de aminoácidos en SEQ ID NO: 31, 32, 33, 34 y 35. También se puede apreciar que una posición de aminoácido dada en una secuencia de inmunoglobulina que consiste en regiones bisagra, C<H>2 y C<H>3 (por ejemplo, SEQ ID NO: 31, 32, 33, 34 y 35) se identificarán por un número diferente al de la misma posición cuando la numeración abarque todo el dominio constante de cadena pesada de IgG1 (que consiste en las regiones C<H>1, bisagra, C<H>2 y C<H>3) como en la base de datos Uniprot. Por ejemplo, la correspondencia entre las posiciones C<H>3 seleccionadas en una secuencia G1Fc humana (SEQ ID NO: 31), el dominio constante de cadena pesada de IgG1 humana (Uniprot P01857) y la cadena pesada de IgG1 humana es la siguiente.

[0368]

[0369]

[0372] Un problema que surge en la producción a gran escala de proteínas asimétricas basadas en inmunoglobulina a partir de una única línea celular se conoce como el "problema de asociación de cadena". Como se enfrenta de manera prominente en la producción de anticuerpos biespecíficos, el problema de asociación de cadena se refiere al desafío de producir de manera eficiente una proteína multicatenaria deseada de entre las múltiples combinaciones que resultan inherentemente cuando se producen diferentes cadenas pesadas y/o cadenas ligeras en una sola línea celular [Klein et al (2012) mAbs 4:653-663]. Este problema es más agudo cuando se producen dos cadenas pesadas diferentes y dos cadenas ligeras diferentes en la misma célula, en cuyo caso hay un total de 16 combinaciones de cadenas posibles (aunque algunas de estas son idénticas) cuando normalmente solo se desea una. Sin embargo, el mismo principio explica la disminución del rendimiento de una proteína de fusión multicatenaria deseada que incorpora solo dos cadenas pesadas diferentes (asimétricas).

[0374] En la técnica se conocen diversos métodos que aumentan el emparejamiento deseado de cadenas de polipéptidos de fusión que contienen Fc en una única línea celular para producir una proteína de fusión asimétrica preferida a rendimientos aceptables [Klein et al (2012) mAbs 4:653-663; y Spiess et al (2015) Molecular Immunology 67(2A): 95-106]. Los métodos para obtener el emparejamiento deseado de cadenas que contienen Fc incluyen, pero sin limitarse a, emparejamiento basado en carga (dirección electrostática), emparejamiento estérico "botones en ojales", emparejamiento SEEDbody y emparejamiento basado en cremallera de leucina [Ridgway et ál (1996) Protein Eng 9:617-621; Merchant et ál (1998) Nat Biotech 16:677-681; Davis et ál (2010) Protein Eng Des Sel 23:195-202; Gunasekaran et ál (2010); 285:19637-19646; Wranik et ál (2012) J Biol Chem 287: 43331-43339; US5932448; WO 1993/011162; WO 2009/089004 y WO 2011/034605]. Como se describe en el presente documento, estos métodos pueden usarse para generar complejos de heteromultímero ALK7-Fc:ActRIIB-Fc. Véase, las figuras 8-10.

[0376] Por ejemplo, un medio mediante el cual puede promoverse la interacción entre polipéptidos específicos es mediante la modificación por ingeniería genética de regiones complementarias de protuberancia en cavidad (botón en ojales) tal como se describe en Arathoon et al., documentoUS7.183.076 y Carter et al.,US5.731.168. Las "protuberancias" se construyen reemplazando las cadenas laterales de aminoácidos pequeños de la interfaz del primer polipéptido (por ejemplo, un primer par de interacciones) con cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean opcionalmente "cavidades" complementarias de tamaño idéntico o similar a las protuberancias en la interfaz del segundo polipéptido (por ejemplo, un segundo par de interacciones) reemplazando cadenas laterales de aminoácidos grandes por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Cuando existe una protuberancia o cavidad adecuadamente posicionada y dimensionada en la interfaz del primer o segundo polipéptido, solo es necesario diseñar una cavidad o protuberancia correspondiente, respectivamente, en la interfaz adyacente.

[0378] A pH neutro (7,0), el ácido aspártico y el ácido glutámico están cargados negativamente y la lisina, la arginina y la histidina están cargadas positivamente. Estos residuos cargados se pueden utilizar para promover la formación de heterodímeros y al mismo tiempo dificultar la formación de homodímeros. Las interacciones atractivas tienen lugar entre cargas opuestas y las interacciones repulsivas entre cargas similares. En parte, los complejos de proteínas divulgados en el presente documento hacen uso de las interacciones atractivas para promover la formación de heteromultímeros (por ejemplo, formación de heterodímeros), y opcionalmente interacciones repulsivas para impedir la formación de homodímeros (por ejemplo, formación de homodímeros) llevando a cabo mutagénesis dirigida al sitio de residuos de interfaz cargados.

[0380] Por ejemplo, la interfaz de dominio CH3 de IgG1 comprende cuatro pares de residuos de carga únicos implicados en interacciones dominio-dominio: Asp356-Lys439', Glu357-Lys370', Lys392-Asp399'y Asp399-Lys409' [la numeración de residuos en la segunda cadena se indica mediante (')]. Debe observarse que el esquema de numeración utilizado en el presente documento para designar residuos en el dominio CH3 de IgG1 se ajusta al esquema de numeración de la UE de Kabat. Debido a la simetría doble presente en las interacciones de dominio CH3-CH3, cada interacción única se representará dos veces en la estructura (por ejemplo, Asp-399-Lys409' y Lys409-Asp399'). En la secuencia de tipo natural, K409-D399' favorece la formación de heterodímeros y homodímeros. Una única mutación que cambia la polaridad de carga (por ejemplo, K409E; carga positiva a negativa) en la primera cadena conduce a interacciones desfavorables para la formación del primer homodímero de cadena. Las interacciones desfavorables surgen debido a las interacciones repulsivas que ocurren entre las mismas cargas (negativo-negativo; K409E-D399' y D399-K409E'). Una mutación similar que cambia la polaridad de carga (D399K'; negativo a positivo) en la segunda cadena conduce a interacciones desfavorables (K409' -D399K' y D399K-K409') para la formación del segundo homodímero de cadena. Pero, al mismo tiempo, estas dos mutaciones (K409E y D399K') conducen a interacciones favorables (K409E-D399K' y D399-K409') para la formación de heterodímeros.

[0382] El efecto de dirección electrostática sobre la formación de heterodímeros y el desaliento de homodímeros puede mejorarse aún más mediante la mutación de residuos de carga adicionales que pueden o no estar emparejados con un residuo con carga opuesta en la segunda cadena que incluye, por ejemplo, Arg355 y Lys360. La siguiente tabla enumera posibles mutaciones de cambio de carga que pueden usarse, solas o en combinación, para mejorar la formación de heteromultímeros de ALK7:ActRIIB.

[0384]

[0387] En algunas realizaciones, uno o más residuos que forman la interfaz CH3-CH3 en una proteína de fusión de la presente solicitud se reemplazan con un aminoácido cargado de modo que la interacción se vuelve electrostáticamente desfavorable. Por ejemplo, un aminoácido cargado positivamente en la interfaz (por ejemplo, una lisina, arginina o histidina) se reemplaza con un aminoácido cargado negativamente (por ejemplo, ácido aspártico o ácido glutámico). Alternativamente, o en combinación con la sustitución anterior, un aminoácido cargado negativamente en la interfaz se reemplaza con un aminoácido cargado positivamente. En determinadas realizaciones, el aminoácido se reemplaza con un aminoácido de origen no natural que tiene la característica de carga deseada. Debe observarse que la mutación de residuos cargados negativamente (Asp o Glu) a His conducirá a un aumento en el volumen de la cadena lateral, lo que puede causar problemas estéricos. Además, su forma donante y aceptora de protones depende del entorno localizado. Estas cuestiones deben tenerse en cuenta con la estrategia de diseño. Debido a que los residuos de interfaz están altamente conservados en las subclases de IgG humanas y de ratón, los efectos de dirección electrostática divulgados en el presente documento pueden aplicarse a IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas y de ratón. Esta estrategia también puede extenderse a la modificación de residuos no cargados a residuos cargados en la interfaz del dominio CH3.

[0389] En parte, la divulgación proporciona el emparejamiento deseado de cadenas polipeptídicas que contienen Fc asimétricas usando secuencias de Fc modificadas genéticamente para ser complementarias basándose en el emparejamiento de carga (dirección electrostática). Una de un par de secuencias de Fc con complementariedad electrostática puede fusionarse arbitrariamente al polipéptido de ALK7 o ActRIIB del constructo, con o sin un enlazador opcional, para generar un heteromultímero de ALK7:ActRIIB. Esta cadena única puede coexpresarse en una célula de elección junto con la secuencia de Fc complementaria al primer Fc para favorecer la generación del constructo multicatenario deseado (por ejemplo, ALK7: heteromultímero de ActRIIB). En este ejemplo basado en la dirección electrostática, SEQ ID NO: 23 [G1Fc humana (E134K/D177K)] y SEQ ID NO: 24 [G1Fc humana (K170D/K187D)] son ejemplos de secuencias de Fc complementarias en las que las sustituciones de aminoácidos modificadas genéticamente están doblemente subrayadas, y el polipéptido del receptor de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta del constructo puede fusionarse con SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24, pero no con ambas. Dado el alto grado de identidad de secuencia de aminoácidos entre hG1Fc nativo, hG2Fc nativo, hG3Fc nativo y hG4Fc nativo, se puede apreciar que las sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes en hG2Fc, hG3Fc o hG4Fc (véase la figura 5) generarán pares de Fc complementarios que se pueden usar en lugar del par de hG1Fc complementario a continuación (SEQ ID NO: 23 y 24).

[0390]

[0393] En parte, la divulgación proporciona el emparejamiento deseado de cadenas polipeptídicas que contienen Fc asimétricas usando secuencias de Fc modificadas por ingeniería genética para complementariedad estérica. En parte, la divulgación proporciona el emparejamiento de perillas en ojales como un ejemplo de complementariedad estérica. Una de un par de secuencias de Fc con complementariedad estérica puede fusionarse arbitrariamente al polipéptido de ALK7 o ActRIIB de la construcción, con o sin un enlazador opcional, para generar un heteromultímero de ALK7:ActRIIB. Esta cadena simple puede coexpresarse en una célula de elección junto con la secuencia de Fc complementaria a la primera Fc para favorecer la generación de la construcción multicatenaria deseada. En este ejemplo basado en el emparejamiento de botones en ojales, SEQ ID NO: 25 [G1Fc humano (T144Y)] y SEQ ID NO: 26 [G1Fc humano (Y185T)] son ejemplos de secuencias de Fc complementarias en las que las sustituciones de aminoácidos modificadas genéticamente están doblemente subrayadas, y el polipéptido ALK7 o ActRIIB de la construcción puede fusionarse con SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 26, pero no con ambas. Dado el alto grado de identidad de secuencia de aminoácidos entre hG1Fc nativo, hG2Fc nativo, hG3Fc nativo y hG4Fc nativo, puede apreciarse que las sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes en hG2Fc, hG3Fc o hG4Fc (véase la figura 5) generarán pares de Fc complementarios que pueden usarse en lugar del par de hG1Fc complementario a continuación (SEQ ID NO: 25 y 26).

[0396]

[0399] Un ejemplo de complementariedad de Fc basada en el emparejamiento de botones en ojales combinado con un enlace disulfuro modificado se describe en SEQ ID NO: 27 [hG1Fc (S132C/T144W)] y SEQ ID NO: 28 [hG1Fc (Y127C/T144S/L146A/Y185V)]. Las sustituciones de aminoácidos modificadas en estas secuencias están doblemente subrayadas, y el polipéptido de tipo I o tipo II de la superfamilia de TGF-beta de la construcción se puede fusionar a SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO: 28, pero no a ambas. Dado el alto grado de identidad de secuencia de aminoácidos entre hG1Fc nativo, hG2Fc nativo, hG3Fc nativo y hG4Fc nativo, puede apreciarse que las sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes en hG2Fc, hG3Fc o hG4Fc (véase la figura 5) generarán pares de Fc complementarios que pueden usarse en lugar del par de hG1Fc complementario a continuación (SEQ ID NO: 27 y 28).

[0402]

[0403]

[0406] En parte, la divulgación proporciona el emparejamiento deseado de cadenas polipeptídicas que contienen Fc asimétricas usando secuencias de Fc modificadas genéticamente para generar segmentos de cadena β interdigitantes de dominios C<H>3 de IgG e IgA humana. Dichos métodos incluyen el uso de heterodímeros C<H>3 de dominio modificado por intercambio de cadena (SEED) que permiten la formación de proteínas de fusión de SEEDbody [Davis et al. (2010) Protein Eng Design Sel 23:195-202]. Una de un par de secuencias de Fc con complementariedad de SEEDbody puede fusionarse arbitrariamente a ALK7 o ActIIB de la construcción, con o sin un enlazador opcional, para generar un polipéptido de fusión de ALK7 o ActRIIB. Esta cadena simple puede coexpresarse en una célula de elección junto con la secuencia de Fc complementaria a la primera Fc para favorecer la generación de la construcción multicatenaria deseada. En este ejemplo basado en el emparejamiento de SEEDbody (Sb), SEQ ID NO: 29 [hG1Fc (Sb<AG>)] y SEQ ID NO: 30 [hG1Fc (Sb<GA>)] son ejemplos de secuencias de Fc de IgG complementarias en las que las sustituciones de aminoácidos modificadas de Fc de IgA están doblemente subrayadas, y el polipéptido ALK7 o ActRIIB de la construcción puede fusionarse con SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 30, pero no con ambas. Dado el alto grado de identidad de secuencia de aminoácidos entre hG1Fc nativo, hG2Fc nativo, hG3Fc nativo y hG4Fc nativo, puede apreciarse que las sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes en hG1Fc, hG2Fc, hG3Fc o hG4Fc (véase la figura 5) generarán un monómero de Fc que puede usarse en el par de IgG-IgA complementario a continuación (SEQ ID NO: 29 y 30).

[0409]

[0412] En parte, la divulgación proporciona el emparejamiento deseado de cadenas polipeptídicas que contienen Fc asimétricas con un dominio de cremallera de leucina escindible unido al extremo carboxiterminal de los dominios Fc C<H>3. La unión de una cremallera de leucina es suficiente para provocar el ensamblaje preferencial de cadenas pesadas de anticuerpos heterodiméricos [Wranik et al (2012) J Biol Chem 287:43331-43339]. Como se describe en el presente documento, una de un par de secuencias de Fc unidas a una cadena formadora de cremallera de leucina puede fusionarse arbitrariamente con el polipéptido de ALK7 o ActRIIB de la construcción, con o sin un enlazador opcional, para generar un polipéptido de fusión de ALK7 o ActRIIB. Esta cadena simple puede coexpresarse en una célula de elección junto con la secuencia Fc unida a una cadena formadora de cremallera de leucina complementaria para favorecer la generación de la construcción multicatenaria deseada. La digestión proteolítica de la construcción con la endoproteinasa bacteriana Lys-C después de la purificación puede liberar el dominio de cremallera de leucina, dando como resultado una construcción Fc cuya estructura es idéntica a la de Fc natural. En este ejemplo basado en el emparejamiento de cremallera de leucina, SEQ ID NO: 36 [hG1Fc-Ap1 (ácida)] y SEQ ID NO: 37 [hG1Fc-Bp1 (básica)] son ejemplos de secuencias de Fc de IgG complementarias en las que las secuencias de cremallera de leucina complementarias modificadas están subrayadas, y el polipéptido de ALK7 o ActRIIB de la construcción puede fusionarse con SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37, pero no con ambas. Dado el alto grado de identidad de secuencia de aminoácidos entre hG1Fc nativo, hG2Fc nativo, hG3Fc nativo y hG4Fc nativo, puede apreciarse que las secuencias formadoras de cremallera de leucina unidas, con o sin un enlazador opcional, a hG1Fc, hG2Fc, hG3Fc o hG4Fc (véase la figura 5) generarán un monómero de Fc que puede usarse en el par formador de cremallera de leucina complementario a continuación (SEQ ID NO: 36 y 37).

[0413]

[0416] Como se describió anteriormente, se conocen diversos métodos en la técnica que aumentan el emparejamiento deseado de cadenas de polipéptido de fusión que contienen Fc en una única línea celular para producir una proteína de fusión asimétrica preferida con rendimientos aceptables [Klein et al (2012) mAbs 4:653-663; y Spiess et al (2015) Molecular Immunology 67(2A): 95-106]. Además, pueden generarse heteromultímeros de ALK7:ActRIIB usando una combinación de proteínas de fusión de cadena pesada y ligera que comprenden un polipéptido de ALK7 o ActRIIB. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un polipéptido de ALK7 puede fusionarse, con o sin un dominio enlazador, a una cadena pesada de inmunoglobulina (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1 o IgA2) que comprende al menos una porción del dominio CH1. De manera similar, un polipéptido ActRIIB puede fusionarse, con o sin un dominio enlazador, a una cadena ligera de inmunoglobulina (kappa o lambda) que comprende al menos una porción del dominio constante de cadena ligera (C<L>). En realizaciones alternativas, un polipéptido ActRIIB puede fusionarse, con o sin un dominio enlazador, a una cadena pesada de inmunoglobulina (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1 o IgA2) que comprende al menos una porción del dominio CH1, y un polipéptido ALK7 puede fusionarse, con o sin un dominio enlazador, a una cadena ligera de inmunoglobulina (kappa o lambda) que comprende al menos una porción del dominio constante de cadena ligera (C<L>). Este diseño se aprovecha de la capacidad natural de las cadenas pesadas para heterodimerizarse con cadenas ligeras. En particular, la heterodimerización de una cadena pesada y ligera se produce entre el C<H>1 con el C<L>, que generalmente se estabiliza mediante unión covalente de los dos dominios a través de un puente disulfuro. Los constructos que emplean la cadena pesada de longitud completa, o al menos una parte de la cadena pesada que comprende la región bisagra, podrían dar lugar a moléculas similares a anticuerpos que comprenden dos "cadenas ligeras" y dos "cadenas pesadas". Véase, la figura 9. Una ventaja potencial de este diseño es que puede imitar más de cerca el complejo ALK7-ligando-ActRIIB de origen natural y puede mostrar mayor afinidad por el ligando que los heterodímeros individuales comparables. En algunas realizaciones, este diseño puede modificarse incorporando diversos truncamientos de cadena pesada que incluyen, por ejemplo, truncamientos que comprenden el dominio C<H>1 y parte o la totalidad del dominio de bisagra (dando lugar a moléculas de tipo F(ab')<2>) así como truncamientos que solo comprenden el dominio C<H>1 o un fragmento del mismo (dando lugar a moléculas de tipo Fab). Véase la figura 9G. Varios métodos para diseñar tales constructos de heteromultímeros se describen en el documento US 2009/0010879, Klein et al [(2012) mAbs 4:653-663], y Spiess et al [(2015) Molecular Immunology 67(2A): 95-106].

[0417] En algunas realizaciones, es deseable generar heterodímeros de ALK7:ActRIIB de tipo anticuerpo que comprenden al menos una rama del complejo que comprende un par de heterodímeros de ALK7-C<L>: ActRIIB-C<H>1 y al menos una segunda rama que comprende un par de heterodímeros de ActRIIB-C<L>: ALK7-C<H>1. Véase, por ejemplo, la figura 9B. Dichos complejos de heterodímeros pueden generarse, por ejemplo, usando combinaciones de tecnologías de emparejamiento asimétrico de cadena pesada y cadena ligera [Spiess et al (2015) Molecular Immunology 67(2A): 95-106]. Por ejemplo, en la tecnología CrossMab, [Schaefer et al (2011). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.108: 11187-11192] el emparejamiento erróneo de la cadena ligera se supera usando cruces de dominio y cadenas pesadas heterodimerizadas usando botones en ojales [Merchant et al (1998) Nat. Biotechnol.16: 677-681]. Para los cruces de dominios, los dominios variables o los dominios constantes se intercambian entre cadenas ligeras y pesadas para crear dos brazos Fab asimétricos que impulsan el emparejamiento de cadenas ligeras afines al tiempo que preservan la integridad estructural y funcional del dominio variable [Fenn et al (2013) PLoS ONE 8: e61953]. Un enfoque alternativo para superar el emparejamiento erróneo de cadenas ligeras es diseñar cadenas pesadas y ligeras con interfaces Fab ortogonales [Lewis (2014) Nat. Biotechnol.32: 191-198]. Esto se ha logrado mediante el modelado computacional [Das et al (2008) Annu. Rev. Biochem.77: 363-382] en combinación con cristalografía de rayos X para identificar mutaciones en las interfaces V<H>/V<L>y C<H>1/C<L>. Para los heterodímeros generados utilizando esta metodología, puede resultar necesario diseñar mutaciones en las interfaces V<H>/V<L>y C<H>1/C<L>para minimizar el emparejamiento erróneo de cadenas pesadas/ligeras. La interfaz Fab ortogonal diseñada puede usarse junto con una estrategia de heterodimerización de cadena pesada para facilitar la producción eficiente de IgG en una única célula hospedadora. La dirección electrostática también puede usarse para generar interfaces Fab ortogonales para facilitar la construcción de dichos heterodímeros. Los enlazadores peptídicos pueden usarse para asegurar el emparejamiento afín de cadenas ligeras y pesadas en un formato conocido como "LUZ-Y" [Wranik et al (2012) J. Biol. Chem.287: 43331-43339], en donde la heterodimerización de cadena pesada se logra usando cremalleras de leucina que pueden eliminarse posteriormente mediante proteólisisin vitro. Alternativamente, heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden comprender una o más trampas de ligando monocatenario como se describe en la presente, opcionalmente que pueden estar asociadas covalentemente o no covalentemente con uno o más polipéptidos de ALK7 o ActRIIB, así como trampas de ligando monocatenario de ALK7:ActRIIB adicionales [US 2011/0236309 y US2009/0010879]. Véase, la figura 12. Como se describe en el presente documento, las trampas de ligando monocatenario no requieren fusión a ningún dominio de multimerización tal como dominios Fc de superenrollamiento para ser multivalentes. En general, las trampas de ligando monocatenario de la presente divulgación comprenden al menos un dominio polipeptídico de ALK7 y un dominio polipeptídico de ActRIIB. Los dominios polipeptídicos de ALK7 y ActRIIB, generalmente denominados en el presente documento dominios de unión (BD), pueden unirse opcionalmente mediante una región enlazadora. Por ejemplo, en un aspecto, la presente divulgación proporciona heteromultímeros que comprenden un polipéptido que tiene la siguiente estructura:

[0418] (<BD1>-enlazador1)<k>-[<BD2>-enlazador2-{<BD3>-enlazador3}<f>]<n>-(<BD4>)<m>-(enlazador4-BD5><d>)<h>donde: n y h son independientemente mayores o iguales a uno; d, f, m y k son independientemente iguales o mayores que cero; BD1, BD2, BD3, BD4 y BD5 son independientemente dominios polipeptídicos ALK7 o ActRIIB, donde al menos uno de BD1, BD2, BD3 y BD4 es un dominio polipeptídico ALK7, y donde al menos uno de BD1, BD2, BD3 y BD4 es un dominio polipeptídico ActRIIB, y enlazador1, enlazador2, enlazador3 y enlazador 4 son independientemente mayores o iguales a cero. En alguna realización, las trampas monocatenarias de ALK7:ActRIIB comprenden al menos dos polipéptidos de ALK7 diferentes. En algunas realizaciones, las trampas monocatenarias ALK7:ActRIIB comprenden al menos dos polipéptidos de ActRIIB diferentes. En alguna realización, las trampas monocatenarias ALK7:ActRIIB comprenden al menos dos enlazadores diferentes. Dependiendo de los valores de seleccionados para d, f, h, k, m y n, la estructura de heteromultímero puede comprender un gran número de unidades de repetición en diversas combinaciones o puede ser una estructura relativamente simple.

[0419] En otro aspecto, la presente divulgación proporciona heteromultímeros que comprenden un polipéptido que tiene la siguiente estructura:

[0420] <BD1>-enlazador1-<BD2>

[0421] En aún otro aspecto, la presente divulgación proporciona heteromultímeros que comprenden un polipéptido que tiene la siguiente estructura:

[0422] <BD1>-(enlazador2-<BD2>)<n>donde n es mayor que o igual a uno.

[0423] Otro aspecto de la invención proporciona heteromultímeros que comprenden un polipéptido que tiene la siguiente estructura:

[0424] (<BD1>-enlazador1-<BD1>)<f>-enlzadador2-(<BD2>-enlazador3-<BD3>)<g>en donde f y g son mayores que o iguales a uno.

[0425] En una realización en la que BD2 y BD3 son iguales, y f y g son el mismo número, esto puede dar como resultado una estructura sustancialmente simétrica especular alrededor del enlazador 2, sujeta a diferencias en los enlazadores. En los casos en que BD2 es diferente de BD3 y/o donde f y g son números diferentes, se producirán diferentes estructuras. Está dentro de la capacidad de un experto habitual en la técnica seleccionar dominios de unión, enlazadores y frecuencias de repetición adecuados a la luz de la divulgación en el presente documento y el conocimiento en la técnica. Los ejemplos no limitantes específicos de dichas trampas de ligando monocatenario según la presente divulgación se representan esquemáticamente en la figura 11.

[0426] Los enlazadores (1, 2, 3 y 4) pueden ser iguales o diferentes. La región enlazadora proporciona un segmento que es distinto de los dominios de unión a ligando estructurados de ALK7 y ActRIIB y, por lo tanto, puede usarse para la conjugación con moléculas accesorias (por ejemplo, moléculas útiles para aumentar la estabilidad, tales como restos de PEGilación) sin tener que modificar químicamente los dominios de unión. El enlazador puede incluir una secuencia de aminoácidos no estructurada que puede ser la misma que o derivarse de modificaciones conservativas a la secuencia de una región no estructurada natural en la porción extracelular del receptor para el ligando de interés u otro receptor en la superfamilia de TGF-β. En otros casos, dichos enlazadores pueden ser completamente artificiales en composición y origen, pero contendrán aminoácidos seleccionados para proporcionar un enlazador flexible no estructurado con una baja probabilidad de encontrar complicaciones de impedimento electrostático o estérico cuando se ponen muy cerca del ligando de interés. La longitud del enlazador se considerará aceptable cuando permita que los dominios de unión ubicados en cada uno de los extremos N y C del enlazador se unan a sus sitios de unión naturales en su ligando natural de tal manera que, con ambos dominios de unión unidos de esta manera, el ligando se una con una afinidad mayor de la que se uniría mediante la unión de solo uno de los dominios de unión. En algunos casos, la cantidad de residuos de aminoácidos en el enlazador de origen natural o artificial se selecciona para que sea igual o mayor que la distancia mínima requerida para la unión simultánea (puenteada) a dos sitios de unión en el ligando de ALK7 y/o ActRIIB. Por ejemplo, y sin desear estar limitado de ninguna manera, la longitud del enlazador puede estar entre aproximadamente 1- 10 aminoácidos, 10-20 aminoácidos, 18-80 aminoácidos, 25-60 aminoácidos, 35-45 aminoácidos o cualquier otra longitud adecuada.

[0428] Los enlazadores pueden diseñarse para facilitar la purificación del polipéptido. El esquema de purificación exacto elegido determinará qué modificaciones se necesitan, por ejemplo y sin desear ser limitante, se contemplan adiciones de "etiquetas" de purificación tales como etiquetas de His; en otros ejemplos, el enlazador puede incluir regiones para facilitar la adición de moléculas de carga o accesorias. Cuando dichas adiciones afectan a la naturaleza no estructurada del enlazador o introducen posibles problemas electrostáticos o estéricos, se realizarán aumentos apropiados de la longitud del enlazador para garantizar que los dos dominios de unión sean capaces de unirse a sus respectivos sitios en el ligando. A la luz de los métodos y enseñanzas del presente documento, un experto en la técnica podría realizar dichas determinaciones de forma rutinaria.

[0430] Además, el presente diseño permite la unión de otras moléculas de carga (por ejemplo, agentes de formación de imágenes como moléculas fluorescentes), toxinas, etc. Por ejemplo, y sin desear limitarse de ninguna manera, los polipéptidos monocatenarios pueden modificarse para añadir una o más moléculas de carga y/o accesorias (denominadas colectivamente en el presente documento por R1, R2, R3, R4, etc.):

[0433]

[0436] Sin limitar la generalidad de los sustituyentes R disponibles, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, pueden estar presentes o no; cuando están presentes, pueden ser iguales o diferentes, y pueden ser independientemente uno o más de: una proteína de fusión para dirigirse, por ejemplo, pero sin limitarse a, tal como un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, Fv monocatenario) y/o un anticuerpo de dominio único (sdAb); un agente de radioterapia y/o formación de imágenes, por ejemplo, pero sin limitarse a, un radionucleótido (por ejemplo,<123>I,<111>In,<18>F,<64>C,<68>Y,<124>I,<131>I,<90>Y,<177>Lu,<57>Cu,<213>Bi,<211>At), un colorante fluorescente (por ejemplo, Alexa Fluor, colorante Cy) y/o una etiqueta de proteína fluorescente (por ejemplo, GFP, DsRed); un agente citotóxico para quimioterapia, por ejemplo, pero sin limitarse a, doxorrubicina, caliqueamicina, un derivado de maitansinoide (por ejemplo, DM1, DM4), una toxina (por ejemplo, endotoxina A de Pseudomonas truncada, toxina de difteria); un portador basado en nanopartículas, por ejemplo, pero sin limitarse a, polietilenglicol (PEG), un polímero conjugado con fármaco, nanoportador o agente de formación de imágenes (por ejemplo, de un polímero de N-(2-hidrorxilpropil) metacrilamida (HPMA), ácido glutámico, PEG, dextrano); un fármaco (por ejemplo, pero no limitado a doxorrubicina, camptotecina, paclitaxel, palatinato); un nanovehículo, por ejemplo, pero no limitado a una nanoenvoltura o liposoma; un agente de formación de imágenes, por ejemplo, pero no limitado a Óxido de Hierro Supermagnético (SPIO); un dendrímero; y/o un soporte sólido para su uso en la purificación, concentración o secuestro de ligandos (por ejemplo, nanopartículas, resinas inertes, soportes de sílice adecuados).

[0438] En general, no será preferible tener moléculas de carga o accesorias en todas las posiciones posibles, ya que esto puede causar complicaciones estéricas o electrostáticas. Sin embargo, los efectos de añadir una molécula de carga o accesoria a cualquier posición o posiciones dadas en la estructura pueden determinarse de forma rutinaria a la luz de la divulgación en el presente documento modelando el enlazador entre los dominios de unión y llevando a cabo simulaciones de dinámica molecular para minimizar sustancialmente la energía mecánica molecular y reducir la incompatibilidad estérica y electrostática entre el enlazador y los polipéptidos de ALK7 y ActRIIB tal como se enseña en el presente documento.

[0440] Puede ser preferible añadir la carga o molécula accesoria a la porción enlazadora del agente, en lugar del dominio de unión, para reducir la probabilidad de interferencia en la función de unión. Sin embargo, la adición al dominio de unión es posible y podría ser deseable en algunos casos y el efecto de dicha adición puede determinarse de forma rutinaria por adelantado modelando el agente de unión y el enlazador con la adición propuesta tal como se describe en el presente documento.

[0442] Las metodologías de conjugación pueden realizarse usando kits comerciales que permiten la conjugación a través de grupos reactivos comunes tales como aminas primarias, ésteres de succinimidilo (NHS) y grupos sulfhidrales reactivos. Algunos ejemplos no limitativos son: Kit de etiquetado de proteínas Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, tecnologías de detección de Invitrogen) y kits de PEGilación (Pierce Biotechnology Inc.).

[0443] En determinados aspectos, las trampas monocatenarias de ALK7:ActRIIB pueden estar asociadas covalentemente o no covalentemente con uno o más polipéptidos de ALK7 o ActRIIB, así como trampas de ligando monocatenario de ALK7:ActRIIB adicionales para formar heteromultímeros de orden superior, que pueden usarse de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento. Véase, por ejemplo, la figura 12. Por ejemplo, una trampa de ligando de cadena sencilla de ALK7:ActRIIB puede comprender además un dominio de multimerización tal como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, las trampas de ligando de cadena sencilla ALK7:ActRIIB comprenden un dominio constante de una inmunoglobulina Ig. Dichos dominios constantes de inmunoglobulinas pueden seleccionarse para promover complejos simétricos o asimétricos que comprenden al menos una trampa de ALK7:ActRIIB de cadena sencilla.

[0445] En determinados aspectos, una trampa monocatenaria ALK7:ActRIIB, o combinaciones de dichas trampas, pueden usarse como antagonistas ALK7:ActRIIB para tratar o prevenir un trastorno o enfermedad de ALK7:ActRIIB como se describe en el presente documento (por ejemplo, enfermedad renal y/o un trastorno o afección metabólica).

[0446] Se entiende que diferentes elementos de las proteínas de fusión (por ejemplo, proteínas de fusión Fc de inmunoglobulina) pueden disponerse de cualquier manera que sea consistente con la funcionalidad deseada. Por ejemplo, un dominio polipeptídico de ALK7 y/o ActRIIB puede colocarse C-terminal a un dominio heterólogo, o alternativamente, un dominio heterólogo puede colocarse C-terminal a un dominio polipeptídico de ALK7 y/o ActRIIB. No es necesario que el dominio polipeptídico de ALK7 y/o ActRIIB y el dominio heterólogo sean adyacentes en una proteína de fusión, y pueden incluirse dominios o secuencias de aminoácidos adicionales en el extremo C o N a cualquiera de los dominios o entre los dominios.

[0448] Por ejemplo, una proteína de fusión del receptor ALK7 y/o ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos como se expone en la fórmula A-B-C. La porción B corresponde a un dominio de polipéptido ALK7 o ActRIIB. Las porciones A y C pueden ser independientemente cero, uno o más de un aminoácido, y ambas porciones A y C, cuando están presentes, son heterólogas a B. Las porciones A y/o C pueden unirse a la porción B a través de una secuencia enlazadora. Un enlazador puede ser rico en glicina (por ejemplo, 2-10, 2-5, 2-4, 2-3 residuos de glicina) o residuos de glicina y prolina y puede, por ejemplo, contener una única secuencia de treonina/serina y glicinas o secuencias de repetición de treonina/serina y/o glicinas, por ejemplo, GGG (SEQ ID NO: 13), GGGG (SEQ ID NO: 14), TGGGG (SEQ ID NO: 15), SGGGG (SEQ ID NO: 16), TGGG (SEQ ID NO: 17), SGGG (SEQ ID NO: 18), o GGGGS (SEQ ID NO: 58) singletes, o repeticiones. En determinadas realizaciones, una proteína de fusión de ALK7 y/o ActRIIB comprende una secuencia de aminoácidos tal como se expone en la fórmula A-B-C, en la que A es una secuencia líder (señal), B consisteenun dominio polipeptídico de ALK7 y/o ActRIIB y C es una parte polipeptídica que potencia una o más de estabilidadin vivo,semividain vivo, captación/administración, localización o distribución tisular, formación de complejos proteicos y/o purificación. En determinadas realizaciones, una proteína de fusión de ALK7 y/o ActRIIB comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la fórmula A-B-C, en donde A es una secuencia líder de TPA, B es un dominio de polipéptido del receptor de ALK7 o ActRIIB, y C es un dominio Fc de inmunoglobulina. Las proteínas de fusión preferidas comprenden la secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de SEQ ID NO: 71, 73, 74, 76, 77, 78, 79 y 80.

[0450] En algunas realizaciones, heteromultímeros ALK7:ActRIIB comprenden además una o más porciones heterólogas (dominios) para conferir una propiedad deseada. Por ejemplo, algunos dominios de fusión son particularmente útiles para el aislamiento de las proteínas de fusión mediante cromatografía de afinidad. Ejemplos bien conocidos de tales dominios de fusión incluyen, pero no se limitan a, polihistidina, Glu-Glu, glutatión S-transferasa (GST), tiorredoxina, proteína A, proteína G, una región constante de cadena pesada (Fc) de inmunoglobulina, proteína de unión a maltosa (MBP) o albúmina de suero humano. Con el fin de la purificación por afinidad, se utilizan matrices relevantes para la cromatografía de afinidad, tales como resinas conjugadas con glutatión, amilasa y níquel o cobalto. Muchas de estas matrices están disponibles en forma de "kit", tales como el sistema de purificación Pharmacia GST y el sistema QIAexpress<™>(Qiagen) útil con (SUS<6>) compañeros de fusión. Como otro ejemplo, se puede seleccionar un dominio de fusión para facilitar la detección de los polipéptidos de captura de ligando. Los ejemplos de dichos dominios de detección incluyen las diversas proteínas fluorescentes (por ejemplo, GFP) así como "etiquetas de epítopo", que normalmente son secuencias peptídicas cortas para las que está disponible un anticuerpo específico. Las etiquetas de epítopos bien conocidas para las cuales los anticuerpos monoclonales específicos están fácilmente disponibles incluyen FLAG, hemaglutinina (HA) del virus de la influenza y etiquetas cmyc. En algunos casos, los dominios de fusión tienen un sitio de escisión de proteasa, tal como para el factor Xa o la trombina, que permite que la proteasa relevante digiera parcialmente las proteínas de fusión y, por lo tanto, libere las proteínas recombinantes de las mismas. Las proteínas liberadas pueden aislarse entonces del dominio de fusión mediante separación cromatográfica posterior.

[0452] En determinadas realizaciones, los polipéptidos de ALK7 y/o ActRIIB pueden contener una o más modificaciones que son capaces de estabilizar los polipéptidos. Por ejemplo, dichas modificaciones potencian la semividain vitrode los polipéptidos, potencian la semivida circulatoria de los polipéptidos y/o reducen la degradación proteolítica de los polipéptidos. Dichas modificaciones estabilizantes incluyen, pero no se limitan a, proteínas de fusión (incluyendo, por ejemplo, proteínas de fusión que comprenden un dominio polipeptídico de ALK7 y/o ActRIIB y un dominio estabilizante), modificaciones de un sitio de glicosilación (incluyendo, por ejemplo, la adición de un sitio de glicosilación a un polipéptido de la divulgación) y modificaciones del resto de carbohidrato (incluyendo, por ejemplo, la eliminación de restos de carbohidrato de un polipéptido de la divulgación). Como se usa en el presente documento, el término “dominio estabilizador” no solo se refiere a un dominio de fusión (por ejemplo, un dominio Fc de inmunoglobulina) como en el caso de proteínas de fusión, sino que también incluye modificaciones no proteicas tales como un resto de carbohidrato, o un resto no proteico, tal como polietilenglicol.

[0454] En realizaciones preferidas, los heteromultímeros ALK7:ActRIIB que van a usarse según los métodos descritos en el presente documento son complejos aislados. Como se usa en el presente documento, una proteína (o complejo proteico) o polipéptido (o complejo polipeptídico) aislado es uno que se ha separado de un componente de su entorno natural. En algunas realizaciones, un heteromultímero de la divulgación se purifica a más del 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de pureza como se determina, por ejemplo, por electroforesis (por ejemplo, SDS-PAGE, enfoque isoeléctrico (IEF), electroforesis capilar) o cromatográfico (por ejemplo, intercambio iónico o HPLC de fase inversa). En la técnica se conocen bien métodos para la evaluación de la pureza de anticuerpos [Flatman et al., (2007) J. Chromatogr. B 848:79-87]. En algunas realizaciones, las preparaciones de heteromultímeros de ALK7:ActRIIB están sustancialmente libres de homomultímeros de ALK7 y/o ActRIIB. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las preparaciones de heteromultímeros de ALK7:ActRIIB comprenden menos de aproximadamente el 10 %, el 9 %, el 8 %, el 7 %, el 6 %, el 5 %, el 4 %, el 3 %, el 2 % o menos de aproximadamente el 1 % de homomultímeros de ALK7. En algunas realizaciones, las preparaciones de heteromultímeros de ALK7:ActRIIB comprenden menos de aproximadamente 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, o menos de aproximadamente 1 % de homomultímeros de ActRIIB. En algunas realizaciones, las preparaciones de heteromultímeros de ALK7:ActRIIB comprenden menos de aproximadamente 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, o menos de aproximadamente 1 % de homomultímeros de ALK7 y menos de aproximadamente 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, o menos de aproximadamente 1 % de homomultímeros de ActRIIB.

[0455] En determinadas realizaciones, los polipéptidos de ALK7 y/o ActRIIB, así como los heteromultímeros que los comprenden, pueden producirse mediante una variedad de técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los polipéptidos se pueden sintetizar usando técnicas estándar de química de proteínas tales como las descritas en Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlín (1993) y Grant G. A. (ed.), péptidos sintéticos: A User's Guide, W. H. Freeman and Company, Nueva York (1992). Además, los sintetizadores de péptidos automatizados están disponibles en el mercado (Advanced ChemTech Modelo 396; Milligen/Biosearch 9600). Alternativamente, los polipéptidos y complejos, incluyendo fragmentos o variantes de los mismos, pueden producirse de forma recombinante usando diversos sistemas de expresión [E. coli, células de ovario de hámster chino (Cho), células COS, baculovirus] como se conoce bien en la técnica. En una realización adicional, los polipéptidos modificados o no modificados pueden producirse por digestión de polipéptidos de ALK7 y/o ActRIIB de longitud completa producidos de manera recombinante usando, por ejemplo, una proteasa, por ejemplo, tripsina, termolisina, quimotripsina, pepsina o enzima convertidora de aminoácidos básicos emparejados (PACE). El análisis informático (usando software disponible comercialmente, por ejemplo, MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) puede usarse para identificar sitios de escisión proteolítica.

[0457] B. Ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de ALK7 y/o ActRIIB

[0459] En determinadas realizaciones, la presente divulgación proporciona ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes que codifican los receptores ALK7 y/o ActRIIB (que incluyen fragmentos, variantes funcionales y proteínas de fusión de los mismos) divulgados en el presente documento. Por ejemplo, SEQ ID NO: 11 codifica un polipéptido precursor de ALK7 humano de origen natural, mientras que SEQ ID NO: 12 codifica un dominio extracelular maduro de ALK7. Los ácidos nucleicos de la invención pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Dichos ácidos nucleicos pueden ser moléculas de ADN o ARN. Estos ácidos nucleicos pueden usarse, por ejemplo, en métodos para preparar heteromultímeros ALK7:ActRIIB como se describe en el presente documento.

[0461] Como se usa en el presente documento, ácido(s) nucleico (s) aislado (s) se refiere (n) a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que normalmente contienen la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente extracromosómicamente o en una ubicación cromosómica que es diferente de su ubicación cromosómica natural.

[0463] En determinadas realizaciones, se entiende que los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de ALK7 y/o ActRIIB de la presente divulgación incluyen una cualquiera de SEQ ID NO: 7, 8, 11, 12, 21, 22, 40, 41, 44, 45, 72 o 75, así como variantes de las mismas. Las secuencias de nucleótidos variantes incluyen secuencias que difieren en una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos que incluyen variantes alélicas y, por lo tanto, incluirán secuencias codificantes que difieren de la secuencia de nucleótidos designada en una cualquiera de SEQ ID NO: 7, 8, 11, 12, 21, 22, 40, 41, 44, 45, 72 o 75.

[0465] En determinadas realizaciones, los polipéptidos de la superfamilia ALK7 y/o ActRIIB de TGFβ de la presente divulgación están codificados por secuencias de ácido nucleico aisladas o recombinantes que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en una secuencia que es idéntica en al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % con respecto a SEQ ID NO: 7, 8, 11, 12, el 21, el 22, el 40, el 41, el 44, el 45, el 72 o el 75. Un experto en la técnica apreciará que las secuencias de ácido nucleico que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en una secuencia complementaria a una secuencia que es idéntica en al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % a con respecto a SEQ ID NO: 7, 8, el 11, el 12, el 21, el 22, el 40, el 41, el 44, el 45, el 72 o el 75 también se encuentran dentro del alcance de la presente divulgación. En realizaciones adicionales, las secuencias de ácido nucleico de la divulgación pueden aislarse, recombinarse y/o fusionarse con una secuencia de nucleótidos heteróloga o en una biblioteca de ADN.

[0467] En otras realizaciones, los ácidos nucleicos de la presente divulgación también incluyen secuencias de nucleótidos que se hibridan en condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos designada en SEQ ID NO: 7, 8, 11, 12, 21, 22, 40, 41, 44, 45, 72 o 75, la secuencia complementaria de SEQ ID NO: 7, 8, 11, 12, 21, 22, 40, 41, 44, 45, 72 o 75, o fragmentos de las mismas. Un experto habitual en la técnica entenderá fácilmente que pueden variarse las condiciones de rigurosidad apropiadas que promueven la hibridación de ADN. Por ejemplo, se podría realizar la hibridación a 6,0 x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguido de un lavado de 2,0 x SSC a 50 °C. Por ejemplo, la concentración de sal en la etapa de lavado puede seleccionarse desde una baja rigurosidad de aproximadamente 2,0 x SSC a 50 °C hasta una alta rigurosidad de aproximadamente 0,2 x SSC a 50 °C. Además, la temperatura en la etapa de lavado puede aumentarse desde condiciones de baja rigurosidad a temperatura ambiente, aproximadamente 22 °C, hasta condiciones de alta rigurosidad a aproximadamente 65 °C. Tanto la temperatura como la sal pueden variarse, o la temperatura o la concentración de sal pueden mantenerse constantes mientras se cambia la otra variable. En una realización, la divulgación proporciona ácidos nucleicos que se hibridan en condiciones de baja rigurosidad de 6 x SSC a temperatura ambiente seguido de un lavado a 2 x SSC a temperatura ambiente.

[0469] Los ácidos nucleicos aislados que difieren de los ácidos nucleicos tal como se exponen en SEQ ID NO: 7, 8, 11, 12, 21, 22, 40, 41, 44, 45, 72 o 75 a degeneración en el código genético también están dentro del alcance de la divulgación. Por ejemplo, un número de aminoácidos se designa por más de un triplete. Los codones que especifican el mismo aminoácido o sinónimos (por ejemplo, CAU y CAC son sinónimos de histidina) pueden dar como resultado mutaciones "silenciosas" que no afectan a la secuencia de aminoácidos de la proteína. Sin embargo, se espera que existan polimorfismos de secuencia de ADN que conduzcan a cambios en las secuencias de aminoácidos de las proteínas de la invención entre las células de mamífero. Un experto en la técnica apreciará que estas variaciones en uno o más nucleótidos (hasta aproximadamente el 3-5 % de los nucleótidos) de los ácidos nucleicos que codifican una proteína particular pueden existir entre individuos de una especie dada debido a la variación alélica natural. Todas y cada una de dichas variaciones de nucleótidos y polimorfismos de aminoácidos resultantes se encuentran dentro del alcance de esta divulgación.

[0471] En determinadas realizaciones, los ácidos nucleicos recombinantes de la divulgación pueden estar unidos operativamente a una o más secuencias de nucleótidos reguladoras en una construcción de expresión. Las secuencias de nucleótidos reguladoras serán generalmente apropiadas para la célula huésped utilizada para la expresión. En la técnica se conocen numerosos tipos de vectores de expresión apropiados y secuencias reguladoras adecuadas para una variedad de células huésped. Típicamente, dicha una o más secuencias de nucleótidos reguladoras pueden incluir, pero no se limitan a, secuencias promotoras, secuencias líder o señal, sitios de unión ribosómica, secuencias de inicio y terminación de la transcripción, secuencias de inicio y terminación de la traducción y secuencias potenciadoras o activadoras. La divulgación contempla promotores constitutivos o inducibles tal como se conocen en la técnica. Los promotores pueden ser promotores de origen natural o promotores híbridos que combinan elementos de más de un promotor. Una construcción de expresión puede estar presente en una célula en un episoma, tal como un plásmido, o la construcción de expresión puede insertarse en un cromosoma. En algunas realizaciones, el vector de expresión contiene un gen marcador seleccionable para permitir la selección de células huésped transformadas. En la técnica se conocen bien genes marcadores seleccionables y variarán con la célula hospedadora usada.

[0473] En determinados aspectos, el ácido nucleico de la invención se proporciona en un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB y unido operativamente a al menos una secuencia reguladora. Las secuencias reguladoras están reconocidas en la técnica y se seleccionan para dirigir la expresión del polipéptido ALK7 y/o ActRIIB. Por consiguiente, el término secuencia reguladora incluye promotores, potenciadores y otros elementos de control de expresión. Se describen ejemplos de secuencias reguladoras en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990). Por ejemplo, cualquiera de una amplia variedad de secuencias de control de expresión que controlan la expresión de una secuencia de ADN cuando está unida operativamente a ella puede usarse en estos vectores para expresar secuencias de ADN que codifican un polipéptido ALK7 y/o ActRIIB. Dichas secuencias de control de la expresión útiles incluyen, por ejemplo, los promotores tempranos y tardíos de SV40, el promotortet, el promotor temprano inmediato de adenovirus o citomegalovirus, los promotores de RSV, el sistema lac, el sistematrp, el sistema TAC o TRC, el promotor T7 cuya expresión está dirigida por la ARN polimerasa T7, las regiones operadora y promotora principales del fago lambda , las regiones de control para la proteína de la cubierta fd, el promotor para la 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glicolíticas, los promotores de la fosfatasa ácida, por ejemplo, Pho5, los promotores de los factores de apareamiento α de levadura, el promotor poliedrónico del sistema de baculovirus y otras secuencias que se sabe que controlan la expresión de genes de células procariotas o eucariotas o sus virus, y diversas combinaciones de los mismos. Debe entenderse que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora a transformar y/o el tipo de proteína que se desea expresar. Además, también se debe considerar el número de copias del vector, la capacidad de controlar ese número de copias y la expresión de cualquier otra proteína codificada por el vector, como marcadores de antibióticos.

[0475] Un ácido nucleico recombinante de la presente divulgación puede producirse ligando el gen clonado, o una porción del mismo, en un vector adecuado para la expresión en células procariotas, células eucariotas (levadura, ave, insecto o mamífero), o ambas. Los vehículos de expresión para la producción de polipéptidos de ALK7 y/o ActRIIB recombinantes incluyen plásmidos y otros vectores. Por ejemplo, los vectores adecuados incluyen plásmidos de los siguientes tipos: plásmidos derivados de pBR322, plásmidos derivados de pEMBL, plásmidos derivados de pEX, plásmidos derivados de pBTac y plásmidos derivados de pUC para la expresión en células procariotas, tales comoE. coli.

[0477] Algunos vectores de expresión de mamífero contienen tanto secuencias procariotas para facilitar la propagación del vector en bacterias, como una o más unidades de transcripción eucariotas que se expresan en células eucariotas. Los vectores derivados de pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo y pHyg son ejemplos de vectores de expresión de mamífero adecuados para la transfección de células eucariotas. Algunos de estos vectores se modifican con secuencias de plásmidos bacterianos, tales como pBR322, para facilitar la replicación y la selección de resistencia a fármacos tanto en células procariotas como eucariotas. Alternativamente, se pueden usar derivados de virus tales como el virus del papiloma bovino (BPV-1) o el virus de Epstein-Barr (pHEBo, derivado de pREP y p205) para la expresión transitoria de proteínas en células eucariotas. Los ejemplos de otros sistemas de expresión virales (incluidos los retrovirales) se pueden encontrar a continuación en la divulgación de los sistemas de administración de terapia génica. Los diversos métodos empleados en la preparación de los plásmidos y en la transformación de organismos hospedadores se conocen bien en la técnica. Para otros sistemas de expresión adecuados para células procariotas y eucariotas, así como procedimientos recombinantes generales [Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3ª Ed., ed. por Sambrook, Fritsch and Maniatis Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001]. En algunos casos, puede ser deseable expresar los polipéptidos recombinantes mediante el uso de un sistema de expresión de baculovirus. Los ejemplos de dichos sistemas de expresión de baculovirus incluyen vectores derivados de pVL (tales como pVL1392, pVL1393 y pVL941), vectores derivados de pAcUW (tales como pAcUW1) y vectores derivados de pBlueBac (tales como el pBlueBac III que contiene β-gal).

[0479] En una realización preferida, se diseñará un vector para la producción de los polipéptidos de ALK7 y/o ActRIIB de la invención en células CHO, tal como un vector Pcmv-Script (Stratagene, La Jolla, CA), vectores pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y vectores pCI-neo (Promega, Madison, Wisc.). Como será evidente, los constructos génicos de la presente invención pueden usarse para provocar la expresión del polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB de la presente invención en células propagadas en cultivo, por ejemplo, para producir proteínas, incluyendo proteínas de fusión o proteínas variantes, para purificación.

[0481] La presente divulgación también se refiere a una célula hospedadora transfectada con un gen recombinante que incluye una secuencia codificante para uno o más de los polipéptidos de ALK7 y/o ActRIIB de la invención. La célula hospedadora puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, un polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB puede expresarse en células bacterianas tales comoE. coli, células de insecto (por ejemplo, usando un sistema de expresión de baculovirus), levadura o células de mamífero [por ejemplo, una línea celular de ovario de hámster chino (Cho)]. Otras células huéspedes adecuadas son conocidas por los expertos en la técnica.

[0483] Por consiguiente, la presente divulgación se refiere además a métodos para producir los polipéptidos de ALK7 y/o ActRIIB de la invención. Por ejemplo, una célula hospedadora transfectada con un vector de expresión que codifica un polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB puede cultivarse en condiciones apropiadas para permitir que se produzca la expresión del polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB. El polipéptido puede secretarse y aislarse de una mezcla de células y medio que contiene el polipéptido. Alternativamente, el polipéptido ALK7 y/o ActRIIB puede aislarse de una fracción citoplasmática o de membrana obtenida de células recolectadas y lisadas. Un cultivo celular incluye células huésped, medios y otros subproductos. En la técnica se conocen bien medios adecuados para el cultivo celular. Los polipéptidos objeto pueden aislarse de medio de cultivo celular, células huésped o ambos, usando técnicas conocidas en la técnica para purificar proteínas, incluyendo cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel, ultrafiltración, electroforesis, purificación por inmunoafinidad con anticuerpos específicos para epítopos particulares de polipéptidos de ALK7 y/o ActRIIB y purificación por afinidad con un agente que se une a un dominio fusionado a polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB (por ejemplo, puede usarse una columna de proteína A para purificar proteínas de fusión de ALK7-Fc y/o ActRIIB-Fc). En algunas realizaciones, el polipéptido ALK7 y/o ActRIIB es una proteína de fusión que contiene un dominio que facilita su purificación.

[0485] En algunas realizaciones, la purificación se logra mediante una serie de etapas de cromatografía en columna, que incluyen, por ejemplo, tres o más de las siguientes, en cualquier orden: cromatografía de proteína A, cromatografía de Q sefarosa, cromatografía de fenilsefarosa, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio catiónico. La purificación podría completarse con filtración viral e intercambio de tampón. Un polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB, así como proteínas de fusión y complejos heteroméricos de los mismos, puede purificarse hasta una pureza de >90 %, > 95 %, > 96 %, > 98 % o >99 % como se determina mediante cromatografía de exclusión por tamaño y >90 %, >95 %, >96 %, >98 % o >99 % como se determina mediante SDS PAGE. El nivel objetivo de pureza debe ser uno que sea suficiente para lograr resultados deseables en sistemas de mamíferos, particularmente primates no humanos, roedores (ratones) y humanos.

[0487] En otra realización, un gen de fusión que codifica una secuencia líder de purificación, tal como una secuencia de sitio de escisión de poli-(His)/enteroquinasa en el extremo N de la parte deseada del polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB recombinante, puede permitir la purificación de la proteína de fusión expresada mediante cromatografía de afinidad usando una resina metálica de Ni<2+>. La secuencia líder de purificación puede retirarse posteriormente mediante tratamiento con enteroquinasa para proporcionar el polipéptido de ALK7 y/o ActRIIB purificado, así como heteromultímeros de los mismos [Hochuli et al. (1987) J. Chromatography 411:177; y Janknecht et al. (1991) PNAS usa 88:8972].

[0489] Las técnicas para hacer genes de fusión se conocen bien. Esencialmente, la unión de varios fragmentos de ADN que codifican diferentes secuencias polipeptídicas se realiza de acuerdo con técnicas convencionales, empleando extremos romos o extremos escalonados para la ligación, digestión con enzimas de restricción para proporcionar extremos apropiados, relleno de extremos cohesivos según sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar una unión indeseable y ligación enzimática. En otra realización, el gen de fusión puede sintetizarse mediante técnicas convencionales que incluyen sintetizadores de ADN automatizados. Alternativamente, la amplificación por PCR de fragmentos génicos puede llevarse a cabo usando cebadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos génicos consecutivos que pueden hibridarse posteriormente para generar una secuencia génica quimérica. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992.

[0491] C. Antagonistas de anticuerpos

[0493] En determinados aspectos, un antagonista de ALK7:ActRIIB es un anticuerpo (ALK7: anticuerpo antagonista de ActRIIB) o una combinación de anticuerpos. Un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinación de anticuerpos, puede unirse a, por ejemplo, uno o más ligandos de ALK7, ligandos de ActRIIB, ligandos de unión de ALK7: ActRIIB, un receptor de ALK7, un receptor de ActRIIB y/o un correceptor de la superfamilia de TGF-beta (por ejemplo, Cripto o Críptico). Como se describe en el presente documento, pueden usarse anticuerpos antagonistas de ALK7:ActRIIB, solos o en combinación con una o más terapias de apoyo o agentes activos, para tratar a un paciente que lo necesita (por ejemplo, pacientes que tienen enfermedad renal y/o un trastorno o afección metabólica).

[0495] En determinados aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe uno o más de los ligandos unidos o probablemente unidos por un heteromultímero de ALK7:ActRIIB, tal como activina B, GDF11, activina A, BMP10, BMP6, BMP5, GDF3, activina C, activina E, activina AC, activina BC, activina AE, nodal o activina BE. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinación de anticuerpos, se une a al menos uno de dichos ligandos. Como ejemplo, tal como se usa en el presente documento, un anticuerpo de activina C (o anticuerpo anti-activina C) se refiere generalmente a un anticuerpo que puede unirse a activina C con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para dirigirse a activina C. En determinadas realizaciones, el grado de unión de un anticuerpo de activina C a una proteína no activina C no relacionada es inferior a aproximadamente el 10 %, el 9 %, el 8 %, el 7 %, el 6 %, el 5 %, el 4 %, el 3 %, el 2 % o inferior a aproximadamente el 1 % de la unión del anticuerpo a activina C tal como se mide, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA), Biacore u otro ensayo de interacción o afinidad de unión de proteínas. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de activina C se une a un epítopo de activina C que se conserva entre activina C de diferentes especies. En determinadas realizaciones preferidas, un anticuerpo anti-activina C se une a activina C humana. En algunas realizaciones, un anticuerpo de activina C puede inhibir la unión de activina C a un receptor de tipo I y/o de tipo II (por ejemplo, ActRIIB y/o ALK7) y por tanto inhibir la señalización mediada por activina C (por ejemplo, señalización de SMAD). En algunas realizaciones, un anticuerpo de activina C puede inhibir la unión de activina C a un correceptor y, por lo tanto, inhibir la señalización mediada por activina C (por ejemplo, señalización de SMAD). Cabe señalar que la activina C comparte cierta homología de secuencia con la activina A, B y E y, por lo tanto, los anticuerpos que se unen a la activina C, en algunos casos, también pueden unirse y/o inhibir otra activina. En algunas realizaciones, la divulgación se refiere a un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, anticuerpo biespecífico), y usos del mismo, que se une a, por ejemplo, activina C y se une además a, por ejemplo, uno o más ligandos de la superfamilia TGF-β adicionales que se unen a ALK7: heteromultímero de ActRIIB [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE o activina BE), GDF11, GDF8, BMP10, BMP6, BMP5, nodal y GDF3], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (por ejemplo, ActRIIB y/o ALK7), y/o uno o más correceptores. En algunas realizaciones, un anticuerpo multiespecífico que se une a activina C no se une o no se une sustancialmente a BMP9 (por ejemplo, se une a BMP9 con una K<D>de más de 1 x 10<-7>M o tiene una unión relativamente modesta, por ejemplo, aproximadamente 1 x 10<-8>M o aproximadamente 1 x 10<-9>M). En algunas realizaciones, la divulgación se refiere a combinaciones de anticuerpos, y usos de los mismos, en las que la combinación de anticuerpos comprende una combinación de anticuerpos que se unen a, por ejemplo, dos o más ligandos de la superfamilia de TGF-β que se unen a ALK7: heteromultímero de ActRIIB [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE o activina BE), GDF11, GDF8, BMP10, BMP6, BMP5, nodal y GDF], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (por ejemplo, ActRIIB y/o ALK7), y/o uno o más correceptores. En algunas realizaciones, una combinación de anticuerpos no comprende un anticuerpo BMP9.

[0496] En determinados aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos GDF8. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinación de anticuerpos, se une a al menos GDF8. Como se usa en el presente documento, un anticuerpo de GDF8 (o anticuerpo anti-GDF8) se refiere generalmente a un anticuerpo que se une a GDF8 con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para dirigirse a GDF8. En determinadas realizaciones, el grado de unión de un anticuerpo GDF8 a una proteína no GDF8 no relacionada es inferior a aproximadamente el 10 %, el 9 %, el 8 %, el 7 %, el 6 %, el 5 %, el 4 %, el 3 %, el 2 % o inferior a aproximadamente el 1 % de la unión del anticuerpo a GDF8 medida, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA), Biacore u otro ensayo de interacción o afinidad de unión de proteínas. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de GDF8 se une a un epítopo de GDF8 que se conserva entre GDF8 de diferentes especies. En determinadas realizaciones preferidas, un anticuerpo anti-GDF8 se une a GDF8 humano. En algunas realizaciones, un anticuerpo de GDF8 puede inhibir la unión de GDF8 a un receptor de tipo I y/o de tipo II (por ejemplo, ActRIIB y/o ALK7) y por tanto inhibir la señalización mediada por GDF8 (por ejemplo, señalización de SMAD). En algunas realizaciones, un anticuerpo de GDF8 puede inhibir la unión de GDF8 a un correceptor y, por lo tanto, inhibir la señalización mediada por GDF8 (por ejemplo, señalización de SMAD). Cabe señalar que GDF8 tiene una alta homología de secuencia con GDF11 y, por lo tanto, los anticuerpos que se unen a GDF8, en algunos casos, también pueden unirse a y/o inhibir GDF11. En algunas realizaciones, la divulgación se refiere a un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, anticuerpo biespecífico), y usos del mismo, que se une a GDF8 y se une además a, por ejemplo, uno o más ligandos de superfamilia de TGF-β adicionales [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE, activina BE), GDF11, BMP10, BMP6, BMP5, nodal y GDF3], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (por ejemplo, ActRIIB y/o ALK7), y/o uno o más correceptores. En algunas realizaciones, un anticuerpo multiespecífico que se une a GDF8 no se une o no se une sustancialmente a BMP9 (por ejemplo, se une a BMP9 con una K<D>mayor que 1 x 10<-7>M o tiene una unión relativamente modesta, por ejemplo, aproximadamente 1 x 10<-8>M o aproximadamente 1 x 10<-9>M). En algunas realizaciones, la divulgación se refiere a combinaciones de anticuerpos, y usos de los mismos, en las que la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo de GDF8 y uno o más anticuerpos adicionales que se unen a, por ejemplo, uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-β adicionales [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE, activina BE), GDF11, GDF3, BMP6, BMP10, nodal y BMP5], uno o más receptores de tipo I y/o de tipo II (por ejemplo, ActRIIB y/o ALK7), y/o uno o más correceptores. En algunas realizaciones, una combinación de anticuerpos que comprende un anticuerpo GDF8 no comprende un anticuerpo BMP9.

[0498] En determinados aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos GDF11. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinación de anticuerpos, se une a al menos GDF11. Como se usa en el presente documento, un anticuerpo de GDF11 (o anticuerpo anti-GDF11) se refiere generalmente a un anticuerpo que se une a GDF11 con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para dirigirse a GDF11. En determinadas realizaciones, el grado de unión de un anticuerpo de GDF11 a una proteína no GDF11 no relacionada es inferior a aproximadamente el 10 %, el 9 %, el 8 %, el 7 %, el 6 %, el 5 %, el 4 %, el 3 %, el 2 % o inferior a aproximadamente el 1 % de la unión del anticuerpo a GDF11 tal como se mide, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA), Biacore u otro ensayo de interacción o afinidad de unión de proteínas. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de GDF11 se une a un epítopo de GDF11 que se conserva entre GDF11 de diferentes especies. En determinadas realizaciones preferidas, un anticuerpo anti-GDF11 se une a GDF11 humano. En algunas realizaciones, un anticuerpo de GDF11 puede inhibir la unión de GDF11 a un receptor de tipo I y/o de tipo II (por ejemplo, ActRIIB y/o ALK7) y por tanto inhibir la señalización mediada por GDF11 (por ejemplo, señalización de SMAD). En algunas realizaciones, un anticuerpo de GDF11 puede inhibir la unión de GDF11 a un correceptor y, por lo tanto, inhibir la señalización mediada por GDF11 (por ejemplo, señalización de SMAD). Cabe señalar que GDF11 tiene una alta homología de secuencia con GDF8 y, por lo tanto, los anticuerpos que se unen a GDF11, en algunos casos, también pueden unirse a y/o inhibir GDF8. En algunas realizaciones, la divulgación se refiere a un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, anticuerpo biespecífico), y usos del mismo, que se une a GDF11 y se une además a, por ejemplo, uno o más ligandos de superfamilia de TGF-β adicionales [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE, activina BE), GDF11, BMP10, BMP6, BMP5, ganglionar y GDF3], uno o más receptores de receptor de tipo I y/o de tipo II (por ejemplo, ActRIIB y/o ALK7), y/o uno o más correceptores. En algunas realizaciones, un anticuerpo multiespecífico que se une a GDF11 no se une o no se une sustancialmente a BMP9 (por ejemplo, se une a BMP9 con una K<D>mayor que 1 x 10<-7>M o tiene una unión relativamente modesta, por ejemplo, aproximadamente 1 x 10<-8>M o aproximadamente 1 x 10<-9>M). En algunas realizaciones, la divulgación se refiere a combinaciones de anticuerpos, y usos de los mismos, en las que la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo de GDF11 y uno o más anticuerpos adicionales que se unen a, por ejemplo, uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-β adicionales [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE, activina BE), GDF8, GDF3, BMP6, BMP10, nodal y BMP5], uno o más receptores de tipo I y/o de tipo II (por ejemplo, ActRIIB y/o ALK7), y/o uno o más correceptores. En algunas realizaciones, una combinación de anticuerpos que comprende un anticuerpo GDF11 no comprende un anticuerpo BMP9.

[0500] En determinados aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos la activina (activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC y/o activina BE). Por lo tanto, en algunas realizaciones, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinación de anticuerpos, se une a al menos activina (activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC y/o activina BE). Como se usa en el presente documento, un anticuerpo de activina (o anticuerpo anti-activina) se refiere generalmente a un anticuerpo que puede unirse a una forma de activina con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para dirigirse a esa forma de activina. En determinadas realizaciones, el grado de unión de un anticuerpo de activina a una proteína no activina no relacionada es inferior a aproximadamente el 10 %, el 9 %, el 8 %, el 7 %, el 6 %, el 5 %, el 4 %, el 3 %, el 2 % o inferior a aproximadamente el 1 % de la unión del anticuerpo a activina medida, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA), Biacore u otro ensayo de interacción o afinidad de unión de proteínas. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de activina se une a un epítopo de activina que se conserva entre activina de diferentes especies. En determinadas realizaciones preferidas, un anticuerpo anti-activina se une a activina humana. En otras realizaciones preferidas, un anticuerpo de activina puede inhibir la unión de activina a un receptor de tipo I y/o de tipo II (por ejemplo, ActRIIB y/o ALK7) y por lo tanto inhiben la señalización mediada por activina (por ejemplo, señalización de SMAD). En algunas realizaciones, un anticuerpo de activina se une a activina B. En algunas realizaciones, un anticuerpo de activina se une a activina A. En algunas realizaciones, un anticuerpo de activina se une a activina A y activina B. En algunas realizaciones, un anticuerpo de activina se une a activina AB. En algunas realizaciones, un anticuerpo de activina se une a activina C. En algunas realizaciones, un anticuerpo de activina se une a activina E. En algunas realizaciones, un anticuerpo de activina se une a activina A y activina C. En algunas realizaciones, un anticuerpo de activina se une a activina AC. En algunas realizaciones, un anticuerpo de activina se une a activina A y activina E. En algunas realizaciones, un anticuerpo de activina se une a activina AE. En algunas realizaciones, un anticuerpo de activina se une a activina B y activina C. En algunas realizaciones, un anticuerpo de activina se une a activina BC. En algunas realizaciones, un anticuerpo de activina se une a activina B y activina E. En algunas realizaciones, un anticuerpo de activina se une a activina BE. En algunas realizaciones, un anticuerpo de activina se une a activina A, activina B y activina C. En algunas realizaciones, un anticuerpo de activina se une a activina A, activina B y activina E. Opcionalmente, un anticuerpo de activina que se une a uno o más de activina A, activina B y activina C puede unirse adicionalmente a activina E. En algunas realizaciones, la divulgación se refiere a un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, anticuerpo biespecífico) y usos del mismo, que se une a activina y se une adicionalmente a, por ejemplo, uno o más ligandos de superfamilia de TGF-β adicionales [por ejemplo, GDF11, GDF8, BMP10, BMP6, BMP5, nodal y GDF3], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (por ejemplo, ActRIIB y/o ALK7) y/o uno o más correceptores. En algunas realizaciones, un anticuerpo multiespecífico que se une a activina no se une o no se une sustancialmente a BMP9 (por ejemplo, se une a BMP9 con una K<D>de más de 1 x 10<-7>M o tiene una unión relativamente modesta, por ejemplo, aproximadamente 1 x 10<-8>M o aproximadamente 1 x 10<-9>M. En algunas realizaciones, la divulgación se refiere a combinaciones de anticuerpos y usos de estos, en donde la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo de activina y uno o más anticuerpos adicionales que se unen a, por ejemplo, uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-β adicionales [por ejemplo, GDF11, GDF8, GDF3, BMP6, BMP10, nodal y BMP5], uno o más receptores de tipo I y/o de tipo II (por ejemplo, ActRIIB y/o ALK7), y/o uno o más correceptores. En algunas realizaciones, una combinación de anticuerpos que comprende un anticuerpo de activina no comprende un anticuerpo BMP9.

[0502] En determinados aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos BMP6. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinación de anticuerpos, se une a al menos BMP6. Como se usa en el presente documento, un anticuerpo contra BMP6 (o anticuerpo anti-BMP6) se refiere generalmente a un anticuerpo que puede unirse a BMP6 con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para dirigirse a BMP6. En determinadas realizaciones, el grado de unión de un anticuerpo BMP6 a una proteína no BMP6 no relacionada es inferior a aproximadamente el 10 %, el 9 %, el 8 %, el 7 %, el 6 %, el 5 %, el 4 %, el 3 %, el 2 % o inferior a aproximadamente el 1 % de la unión del anticuerpo a BMP6 medida, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA), Biacore u otro ensayo de interacción o afinidad de unión de proteínas. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de BMP6 se une a un epítopo de BMP6 que se conserva entre BMP6 de diferentes especies. En determinadas realizaciones preferidas, un anticuerpo anti-BMP6 se une a BMP6 humana. En algunas realizaciones, un anticuerpo frente a BMP6 puede inhibir la unión de BMP6 a un receptor de tipo I y/o de tipo II (por ejemplo, ActRIIB y/o ALK7) y por tanto inhibir la señalización mediada por BMP6 (por ejemplo, señalización de SMAD). En algunas realizaciones, un anticuerpo frente a BMP6 puede inhibir la unión de BMP6 a un correceptor y, por lo tanto, inhibir la señalización mediada por BMP6 (por ejemplo, señalización Smad). En algunas realizaciones, la divulgación se refiere a un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, anticuerpo biespecífico), y usos del mismo, que se une a BMP6 y se une además a, por ejemplo, uno o más ligandos de superfamilia de TGF-β adicionales [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE, activina BE), GDF8, BMP10, GDF11, BMP5, nodal y GDF3], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (por ejemplo, ActRIIB y/o ALK7), y/o uno o más correceptores. En algunas realizaciones, un anticuerpo multiespecífico que se une a BMP6 no se une o no se une sustancialmente a BMP9 (por ejemplo, se une a BMP9 con una K<D>mayor que 1 x 10<-7>M o tiene una unión relativamente modesta, por ejemplo, aproximadamente 1 x 10<-8>M o aproximadamente 1 x 10<-9>M). En algunas realizaciones, la divulgación se refiere a combinaciones de anticuerpos, y usos de los mismos, en las que la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo de BMP6 y uno o más anticuerpos adicionales que se unen a, por ejemplo, uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-β adicionales [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE, activina BE), GDF8 GDF3, GDF11, BMP10, nodal y BMP5], uno o más receptores de tipo I y/o de tipo II (por ejemplo, ActRIIB y/o ALK7), y/o uno o más correceptores. En algunas realizaciones, una combinación de anticuerpos que comprende un anticuerpo BMP6 no comprende un anticuerpo BMP9.

[0504] En determinados aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos GDF3. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinación de anticuerpos, se une a al menos GDF3. Como se usa en el presente documento, un anticuerpo de GDF3 (o anticuerpo anti-GDF3) se refiere generalmente a un anticuerpo que se une a GDF3 con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para dirigirse a GDF3. En determinadas realizaciones, el grado de unión de un anticuerpo de GDF3 a una proteína no GDF3 no relacionada es inferior a aproximadamente el 10 %, el 9 %, el 8 %, el 7 %, el 6 %, el 5 %, el 4 %, el 3 %, el 2 % o inferior a aproximadamente el 1 % de la unión del anticuerpo a GDF3 medida, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA), Biacore u otro ensayo de interacción o afinidad de unión de proteínas. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de GDF3 se une a un epítopo de GDF3 que se conserva entre GDF3 de diferentes especies. En determinadas realizaciones preferidas, un anticuerpo de GDF3 se une a GDF3 humano. En algunas realizaciones, un anticuerpo frente a GDF3 puede inhibir la unión de GDF3 a un receptor de tipo I y/o tipo II (por ejemplo, ActRIIB y/o ALK7) y por lo tanto inhiben la señalización mediada por GDF3 (por ejemplo, señalización de SMAD). En algunas realizaciones, un anticuerpo de GDF3 puede inhibir la unión de GDF3 a un correceptor y, por lo tanto, inhibir la señalización mediada por GDF3 (por ejemplo, señalización de SMAD). En algunas realizaciones, la divulgación se refiere a un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, anticuerpo biespecífico), y usos del mismo, que se une a GDF3 y se une además a, por ejemplo, uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-β adicionales [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE, activina BE), GDF11, BMP10, BMP6, BMP5, y nodal , uno o más receptores de tipo I y/o de tipo II (por ejemplo, ActRIIB y/o ALK7), y/o uno o más correceptores. En algunas realizaciones, un anticuerpo multiespecífico que se une a GDF3 no se une o no se une sustancialmente a BMP9 (por ejemplo, se une a BMP9 con una K<D>mayor que 1 x 10<-7>M o tiene una unión relativamente modesta, por ejemplo, aproximadamente 1 x 10<-8>M o aproximadamente 1 x 10<-9>M). En algunas realizaciones, la divulgación se refiere a combinaciones de anticuerpos, y usos de los mismos, en las que la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo de GDF3 y uno o más anticuerpos adicionales que se unen a, por ejemplo, uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-β adicionales [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE, activina BE), GDF11, BMP10, BMP6, BMP5, y nodal , uno o más receptores de tipo I y/o de tipo II (por ejemplo, ActRIIB y/o ALK7), y/o uno o más correceptores. En algunas realizaciones, una combinación de anticuerpos que comprende un anticuerpo GDF3 no comprende un anticuerpo BMP9.

[0506] En determinados aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos BMP5. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinación de anticuerpos, se une a al menos BMP5. Como se usa en el presente documento, un anticuerpo de BMP5 (o anticuerpo anti-BMP5) se refiere generalmente a un anticuerpo que se une a BMP5 con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para dirigirse a BMP5. En determinadas realizaciones, el grado de unión de un anticuerpo BMP5 a una proteína no BMP5 no relacionada es inferior a aproximadamente el 10 %, el 9 %, el 8 %, el 7 %, el 6 %, el 5 %, el 4 %, el 3 %, el 2 % o inferior a aproximadamente el 1 % de la unión del anticuerpo a BMP5 medida, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA), Biacore u otro ensayo de interacción o afinidad de unión de proteínas. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de BMP5 se une a un epítopo de BMP5 que se conserva entre BMP5 de diferentes especies. En determinadas realizaciones preferidas, un anticuerpo anti-BMP5 se une a BMP5 humana. En algunas realizaciones, un anticuerpo frente a BMP5 puede inhibir la unión de BMP5 a un receptor de tipo I y/o de tipo II (por ejemplo, ActRIIB y/o ALK7) y por tanto inhibir la señalización mediada por BMP5 (por ejemplo, señalización de SMAD). En algunas realizaciones, un anticuerpo frente a BMP5 puede inhibir la unión de BMP5 a un correceptor y, por lo tanto, inhibir la señalización mediada por BMP5 (por ejemplo, señalización de SMAD). En algunas realizaciones, la divulgación se refiere a un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, anticuerpo biespecífico), y usos del mismo, que se une a BMP5 y se une además a, por ejemplo, uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-β adicionales [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE), GDF8, BMP10, BMP6, GDF11, nodal y GDF3], uno o más receptores de receptor de tipo I y/o de tipo II (por ejemplo, ActRIIB y/o ALK7), y uno o más correceptores. En algunas realizaciones, un anticuerpo multiespecífico que se une a BMP5 no se une o no se une sustancialmente a BMP9 (por ejemplo, se une a BMP9 con una K<D>mayor que 1 x 10<-7>M o tiene una unión relativamente modesta, por ejemplo, aproximadamente 1 x 10<-8>M o aproximadamente 1 x 10<-9>M). En algunas realizaciones, la divulgación se refiere a combinaciones de anticuerpos y usos de los mismos, en las que la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo BMP5 y uno o más anticuerpos adicionales que se unen a, por ejemplo, uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-β adicionales [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE), GDF8 GDF3, BMP6, BMP10, nodal y GDF11], receptor de tipo I y/o receptores de tipo II (por ejemplo, ActRIIB y/o ALK7) y/o correceptor. En algunas realizaciones, una combinación de anticuerpos que comprende un anticuerpo BMP5 no comprende un anticuerpo BMP9.

[0508] En determinados aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos BMP10. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinación de anticuerpos, se une a al menos BMP10. Como se usa en el presente documento, un anticuerpo contra BMP10 (o anticuerpo anti-BMP10) se refiere generalmente a un anticuerpo que puede unirse a BMP10 con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para dirigirse a BMP10. En determinadas realizaciones, el grado de unión de un anticuerpo BMP10 a una proteína no BMP10 no relacionada es inferior a aproximadamente el 10 %, el 9 %, el 8 %, el 7 %, el 6 %, el 5 %, el 4 %, el 3 %, el 2 % o inferior a aproximadamente el 1 % de la unión del anticuerpo a BMP10 medida, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA), Biacore u otro ensayo de interacción o afinidad de unión de proteínas. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de BMP10 se une a un epítopo de BMP10 que se conserva entre BMP10 de diferentes especies. En determinadas realizaciones preferidas, un anticuerpo anti-BMP10 se une a BMP10 humana. En algunas realizaciones, un anticuerpo frente a BMP10 puede inhibir la unión de BMP10 a un receptor de tipo I y/o de tipo II (por ejemplo, ActRIIB y/o ALK7) y por tanto inhibir la señalización mediada por BMP10 (por ejemplo, señalización de SMAD). En algunas realizaciones, un anticuerpo frente a BMP10 puede inhibir la unión de BMP10 a un correceptor y, por lo tanto, inhibir la señalización mediada por BMP10 (por ejemplo, señalización de SMAD). En algunas realizaciones, la divulgación se refiere a un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, anticuerpo biespecífico), y usos del mismo, que se une a BMP10 y se une además a, por ejemplo, uno o más ligandos de superfamilia de TGF-β adicionales [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE), GDF8, GDF11, BMP6, BMP5, ganglionar y GDF3], uno o más receptores de receptor de tipo I y/o de tipo II (por ejemplo, ActRIIB y/o ALK7), y/o uno o más correceptores. En algunas realizaciones, un anticuerpo multiespecífico que se une a BMP10 no se une o no se une sustancialmente a BMP9 (por ejemplo, se une a BMP9 con una K<D>mayor que 1 x 10<-7>M o tiene una unión relativamente modesta, por ejemplo, aproximadamente 1 x 10<-8>M o aproximadamente 1 x 10<-9>M). En algunas realizaciones, la divulgación se refiere a combinaciones de anticuerpos, y usos de los mismos, en las que la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo BMP10 y uno o más anticuerpos adicionales que se unen a, por ejemplo, uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-β adicionales [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE), GDF8 GDF3, BMP6, GDF11, nodal y BMP5], uno o más receptores de tipo I y/o de tipo II (por ejemplo, ActRIIB y/o ALK7), y/o uno o más correceptores. En algunas realizaciones, una combinación de anticuerpos que comprende un anticuerpo BMP10 no comprende un anticuerpo BMP9.

[0510] En determinados aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos ganglionar. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinación de anticuerpos, se une a al menos un nodo. Como se usa en el presente documento, un anticuerpo ganglionar (o anticuerpo antinodal) se refiere generalmente a un anticuerpo que puede unirse al ganglio con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para dirigirse al ganglio. En determinadas realizaciones, el grado de unión de un anticuerpo ganglionar a una proteína no ganglionar no relacionada es inferior a aproximadamente el 10 %, el 9 %, el 8 %, el 7 %, el 6 %, el 5 %, el 4 %, el 3 %, el 2 % o inferior a aproximadamente el 1 % de la unión del anticuerpo al ganglio tal como se mide, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA), Biacore u otro ensayo de interacción o afinidad de unión de proteínas. En determinadas realizaciones, un anticuerpo ganglionar se une a un epítopo de ganglionar que se conserva entre ganglios de diferentes especies. En determinadas realizaciones preferidas, un anticuerpo antinodal se une al ganglio humano. En algunas realizaciones, un anticuerpo ganglionar puede inhibir la unión del ganglio a un receptor de tipo I y/o tipo II (por ejemplo, ActRIIB y/o ALK7) y, por lo tanto, inhibir la señalización mediada por ganglios (por ejemplo, señalización de SMAD). En algunas realizaciones, un anticuerpo ganglionar puede inhibir la unión del ganglio a un correceptor y, por lo tanto, inhibir la señalización mediada por ganglios (por ejemplo, señalización de SMAD). En algunas realizaciones, la divulgación se refiere a un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, anticuerpo biespecífico), y usos del mismo, que se une a nodal y se une además a, por ejemplo, uno o más ligandos de superfamilia de TGF-β adicionales [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE), GDF8, GDF11, BMP6, BMP5, BMP10 y GDF3], uno o más receptores de tipo I y/o receptores de tipo II (por ejemplo, ActRIIB y/o ALK7), y/o uno o más correceptores. En algunas realizaciones, un anticuerpo multiespecífico que se une al ganglio no se une o no se une sustancialmente a BMP9 (por ejemplo, se une a BMP9 con una K<D>mayor que 1 x 10<-7>M o tiene una unión relativamente modesta, por ejemplo, aproximadamente 1 x 10<-8>M o aproximadamente 1 x 10<-9>M). En algunas realizaciones, la divulgación se refiere a combinaciones de anticuerpos, y usos de los mismos, en las que la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo nodal y uno o más anticuerpos adicionales que se unen a, por ejemplo, uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-β adicionales [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE), GDF8 GDF3, BMP6, GDF11, BMP10 y BMP5], uno o más receptores de tipo I y/o de tipo II (por ejemplo, ActRIIB y/o ALK7), y/o uno o más correceptores. En algunas realizaciones, una combinación de anticuerpos que comprende un anticuerpo ganglionar no comprende un anticuerpo BMP9.

[0512] Con respecto a anticuerpos que se unen a y antagonizan ligandos que se unen a ALK7:ActRIIB, [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE), GDF8 GDF3, BMP6, GDF11, BMP10 y BMP5], se contempla que un anticuerpo puede diseñarse como un anticuerpo biespecífico que comprende una primera porción que se une a un epítopo de dicho ligando, de modo que la primera porción del anticuerpo compite por la unión con un receptor de tipo I y que comprende una segunda porción que se une a un epítopo de dicho ligando, de modo que la segunda porción del anticuerpo compite por la unión con un receptor de tipo II. De esta manera, puede diseñarse un anticuerpo biespecífico dirigido a un único ligando para imitar el bloqueo de unión al receptor de tipo I-tipo II dual que puede conferirse por un heteromultímero de ALK7:ActRIIB. De manera similar, se contempla que se podría lograr el mismo efecto usando una combinación de dos o más anticuerpos en donde al menos un primer anticuerpo se une a un epítopo de dicho ligando, de manera que el primer anticuerpo compite por la unión con un receptor de tipo I y al menos un segundo anticuerpo se une a un epítopo de dicho ligando, de manera que el segundo anticuerpo compite por la unión con un receptor de tipo II.

[0514] En determinados aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o una combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos ActRIIB. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinación de anticuerpos, se une a al menos ActRIIB. Como se usa en el presente documento, un anticuerpo de ActRIIB (anticuerpo anti-ActRIIB) se refiere generalmente a un anticuerpo que se une a ActRIIB con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para dirigirse a ActRIIB. En determinadas realizaciones, el grado de unión de un anticuerpo anti ActRIIB a una proteína no ActRIIB no relacionada es inferior a aproximadamente el 10 %, el 9 %, el 8 %, el 7 %, el 6 %, el 5 %, el 4 %, el 3 %, el 2 % o inferior a aproximadamente el 1 % de la unión del anticuerpo a ActRIIB tal como se mide, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA), Biacore u otro ensayo de interacción proteína-proteína o de afinidad de unión. En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-ActRIIB se une a un epítopo de ActRIIB que se conserva entre ActRIIB de diferentes especies. En determinadas realizaciones preferidas, un anticuerpo anti-ActRIIB se une a ActRIIB humano. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ActRIIB puede inhibir uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-β [por ejemplo, GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE) GDF3, BMP6, BMP10, nodal y BMP9] de la unión a ActRIIB y/o ALK7. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ActRIIB es un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, anticuerpo biespecífico) que se une a ActRIIB y uno o más ligandos de la superfamilia TGF-β [por ejemplo, GDF11, GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC) GDF3, BMP6, BMP10, nodal y BMP9], receptor de tipo I (por ejemplo, ALK7), correceptor y/o un receptor de tipo II adicional. En algunas realizaciones, la divulgación se refiere a combinaciones de anticuerpos, y usos de los mismos, en las que la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo anti-ActRIIB y uno o más anticuerpos adicionales que se unen a, por ejemplo, uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-β [por ejemplo, GDF11, GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE) GDF3, BMP6, BMP10, nodal y BMP9], correceptores, receptores de tipo I (por ejemplo, ALK7) y/o receptores de tipo II adicionales. Cabe señalar que ActRIIB tiene similitud de secuencia con ActRIIA y, por lo tanto, los anticuerpos que se unen a ActRIIB, en algunos casos, también pueden unirse y/o inhibir ActRIIA.

[0515] En determinados aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos ALK7. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinación de anticuerpos, se une a al menos ALK7. Como se usa en el presente documento, un anticuerpo de ALK7 (anticuerpo anti-ALK7) se refiere generalmente a un anticuerpo que se une a ALK7 con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para dirigirse a ALK7. En determinadas realizaciones, el grado de unión de un anticuerpo anti-ALK7 a una proteína no ALK7 no relacionada es inferior a aproximadamente el 10 %, el 9 %, el 8 %, el 7 %, el 6 %, el 5 %, el 4 %, el 3 %, el 2 % o inferior a aproximadamente el 1 % de la unión del anticuerpo a ALK7 medida, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA), Biacore u otro ensayo de interacción proteína-proteína o de afinidad de unión. En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-ALK7 se une a un epítopo de ALK7 que se conserva entre ALK7 de diferentes especies. En determinadas realizaciones preferidas, un anticuerpo anti-ALK7 se une a ALK7 humana. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ALK7 puede inhibir uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-β [por ejemplo, GDF11, GDF8, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE) GDF3, BMP5, BMP6 y BMP10] de la unión a un receptor de tipo I (por ejemplo, ALK7), receptor de tipo II (por ejemplo, ActRIIB) o correceptor. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-ALK7 es un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, anticuerpo biespecífico) que se une a ALK7 y uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-β [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE), GDF11, GDF8, BMP10, BMP6, BMP5, nodal y GDF3, receptores de tipo II (por ejemplo, ActRIIB), correceptores y/o un receptor de tipo I adicional. En algunas realizaciones, la divulgación se refiere a combinaciones de anticuerpos, y usos de los mismos, en las que la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo anti-ALK7 y uno o más anticuerpos adicionales que se unen a, por ejemplo, uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-β [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE), GDF11, GDF8, BMP10, BMP6, BMP5, nodal y GDF3], correceptores, un receptor de tipo I adicional y/o receptores de tipo II (por ejemplo, ActRIIB).

[0517] En determinados aspectos, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinación de anticuerpos, es un anticuerpo que inhibe al menos Cripto o Críptico. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un anticuerpo antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinación de anticuerpos, se une a al menos Cripto o Cryptic. Como se usa en el presente documento, un anticuerpo Cripto (anticuerpo anti-Cripto) se refiere generalmente a un anticuerpo que se une a Cripto con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para dirigirse a Cripto. En determinadas realizaciones, el grado de unión de un anticuerpo anti-Cripto a una proteína no-Cripto no relacionada es inferior a aproximadamente el 10 %, el 9 %, el 8 %, el 7 %, el 6 %, el 5 %, el 4 %, el 3 %, el 2 % o inferior a aproximadamente el 1 % de la unión del anticuerpo a Cripto medida, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA), Biacore u otro ensayo de interacción proteína-proteína o de afinidad de unión. En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-Cripto se une a un epítopo de Cripto que se conserva entre Cripto de diferentes especies. En determinadas realizaciones preferidas, un anticuerpo anti-Cripto se une a Cripto humano. Como se usa en el presente documento, un anticuerpo críptico (anticuerpo anticríptico) se refiere generalmente a un anticuerpo que se une a Críptico con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico para dirigirse a Críptico. En determinadas realizaciones, el grado de unión de un anticuerpo anti-Cripto a una proteína no críptica no relacionada es inferior a aproximadamente el 10 %, el 9 %, el 8 %, el 7 %, el 6 %, el 5 %, el 4 %, el 3 %, el 2 % o inferior a aproximadamente el 1 % de la unión del anticuerpo a Cryptic medida, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA), Biacore u otro ensayo de interacción proteína-proteína o de afinidad de unión. En determinadas realizaciones, un anticuerpo anticríptico se une a un epítopo de Críptico que se conserva entre Crípticos de diferentes especies. En determinadas realizaciones preferidas, un anticuerpo anti-Críptico se une a Críptico humano. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-Cripto o Críptico puede inhibir uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-β [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE), GDF11, GDF8, BMP10, BMP6, BMP5, nodal y GDF3] de la unión a Cripto o Críptico, respectivamente, o a ActRIIB y/o ALK7. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-Cripto o Críptico puede inhibir la unión del ganglio a un receptor de tipo I y/o tipo II. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-Cripto o Críptico es un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, anticuerpo biespecífico) que se une a Cripto o Críptico y una o más superfamilias de TGF-β [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE), GDF11, GDF8, BMP10, BMP6, BMP5, nodal y GDF3] , receptor de tipo I (por ejemplo, ALK7), correceptor adicional y/o receptor de tipo II. En algunas realizaciones, un anticuerpo puede unirse tanto a Cripto como a Cryptic. En algunas realizaciones, la divulgación se refiere a combinaciones de anticuerpos, y usos de los mismos, en las que la combinación de anticuerpos comprende un anticuerpo anti-Cripto o Críptico y uno o más anticuerpos adicionales que se unen a, por ejemplo, uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-β [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE), GDF11, GDF8, BMP10, BMP6, BMP5, nodal y GDF3], correceptores adicionales, receptores de tipo I (por ejemplo, ALK7) y/o receptores de tipo II.

[0519] Como se describe en la presente, hay una variedad de métodos para generar complejos heteromultiméricos. Dichos métodos pueden usarse para generar complejos de heteromultímeros que comprenden un dominio de unión a anticuerpo (por ejemplo, un complejo de cadenas V<L>y V<H>) y uno o más polipéptidos seleccionados de un polipéptido de ALK7, un polipéptido de ActRIIB, un heterómero de ALK7:ActRIIB o un polipéptido de trampa única de ALK7:ActRIIB. Véase la figura 10A, 10B y 12D. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la divulgación proporciona complejos proteicos que comprenden un dominio de unión a ligando de un anticuerpo que se une a un ligando de unión a ALK7: ActRIIB [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE), GDF11, GDF8, BMP10, BMP6, BMP5, nodal y GDF3] que está asociado covalentemente o no covalentemente con un polipéptido de ALK7. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona complejos de proteínas que comprenden un dominio de unión a ligando de un anticuerpo que se une a un ligando de unión a ALK7: ActRIIB [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE), GDF11, GDF8, BMP10, BMP6, BMP5, nodal y GDF3] que está asociado covalentemente o no covalentemente con un polipéptido ActRIIB. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona complejos de proteínas que comprenden un dominio de unión a ligando de un anticuerpo que se une a un ligando de unión a ALK7: ActRIIB [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE), GDF11, GDF8, BMP10, BMP6, BMP5, nodal y GDF3] que está asociado covalentemente o no covalentemente con una trampa de ligando monocatenario de ALK7:ActRIIB. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona complejos de proteínas que comprenden un dominio de unión a ligando de un anticuerpo que se une a un ligando de unión a ALK7: ActRIIB [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y activina BE), GDF11, GDF8, BMP10, BMP6, BMP5, nodal y GDF3] que está asociado covalentemente o no covalentemente con el heteromultímero de ALK7:ActRIIB.

[0521] El término anticuerpo se usa en el presente documento en el sentido más amplio y abarca diversas estructuras de anticuerpo, incluyendo pero sin limitarse a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que muestren la actividad de unión a antígeno deseada. Un fragmento de anticuerpo se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')<2>; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena sencilla (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo [véase, por ejemplo, Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134; Plückthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., (Springer-Verlag, Nueva York), pp. 269-315 (1994); WO 93/16185; y patente las patentes estadounidense de n.º 5.571.894; 5.587.458; y 5.869.046]. Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos [véanse, por ejemplo, el documento EP 404.097; WO 1993/01161; Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448]. También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134. Los anticuerpos de dominio único son fragmentos de anticuerpo que comprenden la totalidad o una porción del dominio variable de cadena pesada o la totalidad o una porción del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano [véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 6.248.516]. Los anticuerpos divulgados en el presente documento pueden ser anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales. En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la presente divulgación comprenden un marcador unido a los mismos y que puede detectarse (por ejemplo, el marcador puede ser un radioisótopo, compuesto fluorescente, enzima o cofactor enzimático). En algunas realizaciones preferidas, los anticuerpos de la presente divulgación son anticuerpos aislados. En determinadas realizaciones preferidas, los anticuerpos de la presente divulgación son anticuerpos recombinantes.

[0523] Los anticuerpos de la presente pueden ser de cualquier clase. La clase de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que posee su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varios de estos se pueden dividir adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG<1>, IgG<2>, IgG<3>, IgG<4>, IgA<1>e IgA<2>. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma y mu.

[0525] En general, un anticuerpo para su uso en los métodos descritos en el presente documento se une específicamente a su antígeno diana, preferiblemente con alta afinidad de unión. La afinidad puede expresarse como un valor K<D>y refleja la afinidad de unión intrínseca (por ejemplo, con efectos de avidez minimizados). Típicamente, la afinidad de unión se midein vitro, ya sea en un entorno libre de células o asociado a células. Puede usarse cualquiera de una serie de ensayos conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento, para obtener mediciones de afinidad de unión incluyendo, por ejemplo, Biacore, ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA) y ELISA. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente divulgación se unen a sus antígenos diana (por ejemplo, ALK7, ActRIIB, activina, GDF11, GDF8, BMP10, BMP6, GDF3, nodal y/o BMP5) con al menos una K<D>de 1x10<-7>o más fuerte, 1x10<-8>o más fuerte, 1x10<-9>o más fuerte, 1x10<-10>o más fuerte, 1x10<-11>o más fuerte, 1x10<-12>o más fuerte, 1x10<-13>o más fuerte, o 1x10<-14>o más fuerte.

[0527] En determinadas realizaciones, K<D>se mide mediante RIA realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno diana tal como se describe mediante el siguiente ensayo. La afinidad de unión a solución de Fab por el antígeno se mide equilibrando Fab con una concentración mínima de antígeno radiomarcado (por ejemplo, marcado con<125>I) en presencia de una serie de titulación de antígeno no marcado, capturando después el antígeno unido con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab [véase, por ejemplo, Chen et al. (1999) J. Mol. Biol.

[0528] 293:865-881]. Para establecer las condiciones para el ensayo, las placas de múltiples pocillos (por ejemplo, MICROTITER<®>de Thermo Scientific) se recubren (por ejemplo, durante la noche) con un anticuerpo anti-Fab de captura (por ejemplo, de Cappel Labs) y posteriormente se bloquean con albúmina de suero bovino, preferiblemente a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). En una placa no adsorbente, el antígeno radiomarcado se mezcla con diluciones en serie de un Fab de interés [por ejemplo, consistente con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., (1997) Cancer Res.57:4593-4599]. El Fab de interés se incuba entonces, preferiblemente durante la noche, pero la incubación puede continuar durante un periodo más largo (por ejemplo, aproximadamente 65 horas) para asegurar que se alcanza el equilibrio. A continuación, las mezclas se transfieren a la placa de captura para su incubación, preferiblemente a temperatura ambiente durante aproximadamente una hora. La solución se retira y la placa se lava varias veces, preferiblemente con una mezcla de polisorbato 20 y PBS. Cuando las placas se han secado, se añade centelleante (por ejemplo, MICROSCINT<®>de Packard), y las placas se cuentan en un contador gamma (por ejemplo, TOPCOUNT<®>de Packard).

[0530] Según otra realización, la K<D>se mide usando ensayos de resonancia de plasmón superficial usando, por ejemplo, un BIACORE<®>2000 o un BIACORE<®>3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) con chips CM5 de antígeno inmovilizado a aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU). En resumen, los chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) se activan con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Por ejemplo, un antígeno se puede diluir con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, hasta 5 µg/ml (aproximadamente 0,2 µM) antes de la inyección a una velocidad de flujo de 5 µl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Después de la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para las mediciones de cinética, se inyectan diluciones en serie de dos veces de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con tensioactivo de polisorbato 20 (TWEEN-20<®>) al 0,05 % (PBST) a una velocidad de flujo de aproximadamente 25 µl/min. Las tasas de asociación (k<on>) y las tasas de disociación (k<off>) se calculan usando, por ejemplo, un modelo de unión de Langmuir uno a uno simple (BIACORE<®>Evaluation Software versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (K<D>) se calcula como la relación k<off>/ k<on>[véase, por ejemplo, Chen et al., (1999) J. Mol. Biol.293:865-881]. Si la velocidad de asociación supera, por ejemplo, 10<6>M<-1>s<-1>mediante el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces la velocidad de asociación puede determinarse usando una técnica de inactivación fluorescente que mide el aumento o la disminución de la intensidad de emisión de fluorescencia (por ejemplo, excitación=295 nm; emisión=340 nm, paso de banda de 16 nm) de un anticuerpo antiantígeno 20 nM (forma Fab) en PBS en presencia de concentraciones crecientes de antígeno tal como se mide en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con detención de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO<®>de la serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.

[0532] Los fragmentos de anticuerpo pueden prepararse mediante diversas técnicas, que incluyen, pero no se limitan a, digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como producción por células huésped recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), como se describe en el presente documento. Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de ActRIIB humano, activina (activina A, activina B, activina C y activina E), GDF11, GDF8, BMP10, BMP6, GDF3, nodal y/o BMP5 se conocen en la técnica. Además, se conocen bien en la técnica numerosos métodos para generar anticuerpos, algunos de los cuales se describen en el presente documento. Por lo tanto, el experto en la técnica puede preparar de forma rutinaria antagonistas de anticuerpos para su uso de acuerdo con la presente divulgación basándose en el conocimiento en la técnica y las enseñanzas proporcionadas en el presente documento.

[0534] En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo quimérico. Un anticuerpo quimérico se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie diferente. Se describen determinados anticuerpos quiméricos, por ejemplo, en la patente estadounidense n.º 4.816.567; y Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855. En algunas realizaciones, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En algunas realizaciones, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo de "clase cambiada" en el que la clase o subclase se ha cambiado de la del anticuerpo original. En general, los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión al antígeno de estos.

[0536] En determinadas realizaciones, un anticuerpo quimérico proporcionado en el presente documento es un anticuerpo humanizado. Un anticuerpo humanizado se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos de aminoácidos de regiones hipervariables no humanas (HVR) y residuos de aminoácidos de regiones marco humanas (FR). En determinadas realizaciones, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano, y todas o sustancialmente todas las FR corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender al menos una parte de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización. Los anticuerpos humanizados y los métodos para producirlos se revisan, por ejemplo, en Almagro y Fransson (2008) Front. Biosci. 13:1619-1633 y se describen adicionalmente, por ejemplo, en Riechmann et al., (1988) Nature 332:323-329; Queen et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. EE. UU.86:10029-10033; patente estadounidense n.º 5.821.337; 7.527.791; 6.982.321; y 7.087.409; Kashmiri et al., (2005) Methods 36:25-34 [que describe el injerto de SDR (a-CDR)]; Padlan, Mol. Immunol. (1991) 28:489-498 (que describe "resurfacing"); Dall' Acqua et al. (2005) Methods 36:43-60 (que describe "FR shuffling"); Osbourn et al. (2005) Methods 36:61-68; y Klimka et al. Br. J. Cancer (2000) 83:252-260 (que describe el enfoque de "selección guiada" para el barajado de FR). Las regiones marco humanas que pueden usarse para la humanización incluyen, pero no se limitan a: regiones marco seleccionadas usando el método de "mejor ajuste" [véase, por ejemplo, Sims et al. (1993) J. Immunol.151:2296 ]; regiones marco derivadas de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena ligera o pesada [véase, por ejemplo, Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; y Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623]; regiones marco maduras humanas (mutadas somáticamente) o regiones marco de la línea germinal humana [véase, por ejemplo, Almagro y Fransson (2008) Front. Biosci. 13:1619-1633]; y regiones marco derivadas del cribado de bibliotecas de FR [véase, por ejemplo, Baca et al., (1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684; y Rosok et al., (1996) J. Biol. Chem. 271:22611-22618].

[0538] En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente es un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos pueden producirse usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Los anticuerpos humanos se describen generalmente en van Dijk y van de Winkel (2008) Curr. Opin. Pharmacol.5: 368-74 (2001) y Lonberg, Curr. Opin. Immunol.20:450-459. Por ejemplo, los anticuerpos humanos pueden prepararse mediante la administración de un inmunógeno (por ejemplo, un polipéptido GDF11, un polipéptido de activina B, un polipéptido ActRIIA o un polipéptido ActRIIB) a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a la exposición antigénica. Dichos animales típicamente contienen todos o una parte de los loci de inmunoglobulina humana, que reemplazan los loci de inmunoglobulina endógena, o que están presentes extracromosómicamente o integrados aleatoriamente en los cromosomas del animal. En tales animales transgénicos, los loci de inmunoglobulina endógena generalmente se han inactivado. Para una revisión de métodos para obtener anticuerpos humanos de animales transgénicos véase, por ejemplo, Lonberg (2005) Nat. Biotech. 23:1117-1125; patente estadounidense n.º 6.075.181 y 6.150.584 (que describen la tecnología XENOMOUSE™); la patente estadounidense n.º 5.770.429 (que describe la tecnología HuMab®); patente estadounidense n.º 7.041.870 (que describe la tecnología K-M MOUSE<®>); y la publicación de solicitud de patente estadounidense n.º 2007/0061900 (que describe la tecnología VelociMouse<®>). Las regiones variables humanas de anticuerpos intactos generados por dichos animales pueden modificarse adicionalmente, por ejemplo, combinándose con una región constante humana diferente.

[0540] Los anticuerpos humanos proporcionados en la presente también pueden prepararse mediante métodos basados en hibridomas. Se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos [véase, por ejemplo, Kozbor J. Immunol., (1984) 133: 3001; Brodeur et al. (1987) Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63, Marcel Dekker, Inc., Nueva York; y Boerner et al. (1991) J. Immunol., 147: 86]. Los anticuerpos humanos generados mediante tecnología de hibridoma de células B humanas también se describen en Li et al., (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. usa, 103:3557-3562. Los métodos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en la patente estadounidense n.º 7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos IgM humanos monoclonales a partir de líneas celulares de hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue (2006) 26(4):265-268 (2006) (que describe hibridomas humanos-humanos). La tecnología de hibridoma humano (tecnología Trioma) también se describe en Vollmers y Brandlein (2005) Histol. Histopathol., 20(3):927-937 (2005) y Vollmers y Brandlein (2005) Methods Find Exp. Clin. Pharmacol., 27(3):185-91. Los anticuerpos humanos proporcionados en el presente documento también pueden generarse aislando secuencias de dominio variable de clon de Fv seleccionadas de bibliotecas de expresión en fagos derivadas de seres humanos. Dichas secuencias de dominio variable pueden combinarse con un dominio constante humano deseado. En la técnica se conocen y se describen en el presente documento técnicas para seleccionar anticuerpos humanos de bibliotecas de anticuerpos.

[0542] Por ejemplo, los anticuerpos de la presente divulgación pueden aislarse mediante el cribado de bibliotecas combinatorias para anticuerpos con la actividad o actividades deseadas. En la técnica se conoce una variedad de métodos para generar bibliotecas de presentación en fagos y cribar dichas bibliotecas en busca de anticuerpos que posean las características de unión deseadas. Dichos métodos se revisan, por ejemplo, en Hoogenboom et al. (2001) en Methods in Molecular Biology 178:1-37, O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.J. y se describe adicionalmente, por ejemplo, en McCafferty et al. (1991) Nature 348:552-554; Clackson et al., (1991) Nature 352: 624-628; Marks et al. (1992) J. Mol. Biol.222:581-597; Marks y Bradbury (2003) en Methods in Molecular Biology 248:161-175, Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ; Sidhu et al. (2004) J. Mol. Biol.338(2):299-310; Lee et al. (2004) J. Mol. Biol.340(5):1073-1093; Fellouse (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. usa 101(34):12467-12472; y Lee et al. (2004) J. Immunol. Métodos 284(1-2): 119-132.

[0544] En determinados métodos de presentación de fagos, los repertorios de genes VH y VL se clonan por separado mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en bibliotecas de fagos, que luego se pueden cribar para fagos de unión a antígeno como se describe en Winter et ál. (1994) Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455. Los fagos típicamente presentan fragmentos de anticuerpo, ya sea como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o como fragmentos Fab. Las bibliotecas de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad para el inmunógeno (por ejemplo, ALK7, ActRIIB, activina, GDF11, GDF8, BMP10, BMP6, GDF3 y/o BMP5) sin el requisito de construir hibridomas. De manera alternativa, el repertorio sin tratamiento previo puede clonarse (por ejemplo, de ser humano) para proporcionar una única fuente de anticuerpos para una amplia gama de antígenos no propios y también propios sin ninguna inmunización como se describe por Griffiths et al. (1993) EMBO J, 12: 725-734. Finalmente, las bibliotecas ingenuas también pueden hacerse sintéticamente clonando segmentos de genes V no reordenados a partir de células madre, y usando cebadores de PCR que contienen secuencia aleatoria para codificar las regiones CDR3 altamente variables y para lograr la reordenaciónin vitro, como se describe por Hoogenboom y Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381-388. Las publicaciones de patentes que describen bibliotecas de fagos de anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: la patente estadounidense n.º 5.750.373 y publicaciones de patentes estadounidenses n.º 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 y 2009/0002360.

[0546] En determinadas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en la presente es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. Anticuerpos multiespecíficos (típicamente anticuerpos monoclonales) que tienen especificidades de unión para al menos dos epítopos diferentes (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o seis o más) en uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más) antígenos.

[0548] Las técnicas para producir anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina que tienen diferentes especificidades [véase, por ejemplo, Milstein y Cuello (1983) Nature 305: 537; publicación de patente internacional no. WO 93/08829; y Traunecker et al. (1991) EMBO J. 10: 3655, y la patente estadounidense N.º 5.731.168 (ingeniería de "botón en ojal")]. También pueden prepararse anticuerpos multiespecíficos modificando por ingeniería genética efectos de dirección electrostática para preparar moléculas heterodiméricas de Fc de anticuerpo (véase, por ejemplo, el documento WO 2009/089004A1); reticulando dos o más anticuerpos o fragmentos [véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 4.676.980; y Brennan et al. (1985) Science, 229: 81]; usando cremalleras de leucina para producir anticuerpos biespecíficos [véase, por ejemplo, Kostelny et al. (1992) J. Immunol., 148(5):1547-1553]; usando tecnología de "diacuerpo" para preparar fragmentos de anticuerpo biespecíficos [véase, por ejemplo, Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448]; usando dímeros de Fv de cadena sencilla (sFv) [véase, por ejemplo, Gruber et al. (1994) J. Immunol., 152:5368]; y preparando anticuerpos triespecíficos (véase, por ejemplo, Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147: 60. Pueden prepararse anticuerpos multiespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo. Los anticuerpos modificados genéticamente con tres o más sitios de unión a antígeno funcionales, que incluyen "anticuerpos de pulpo", también se incluyen en el presente documento [véase, por ejemplo, el documento US 2006/0025576A1].

[0550] En determinadas realizaciones, un anticuerpo descrito en la presente es un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo monoclonal se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones de origen natural o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpo monoclonal, dichas variantes generalmente están presentes en cantidades menores. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes epítopos, cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige contra un único epítopo en un antígeno. Por lo tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con los presentes métodos pueden prepararse mediante una variedad de técnicas, que incluyen, pero no se limitan a, el método del hibridoma, los métodos de ADN recombinante, los métodos de presentación en fagos y los métodos que utilizan animales transgénicos que contienen la totalidad o parte de los loci de inmunoglobulina humana, describiéndose en el presente documento dichos métodos y otros métodos ejemplares para preparar anticuerpos monoclonales.

[0552] Por ejemplo, mediante el uso de inmunógenos derivados de activina, pueden prepararse antisueros antiproteínicos/antipeptídicos o anticuerpos monoclonales mediante protocolos estándar [véase, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual ed. por Harlow y Lane (1988) Cold Spring Harbor Press: 1988]. Un mamífero, tal como un ratón, hámster o conejo, puede inmunizarse con una forma inmunogénica del polipéptido de activina, un fragmento antigénico que es capaz de provocar una respuesta de anticuerpo o una proteína de fusión. Las técnicas para conferir inmunogenicidad a una proteína o péptido incluyen conjugación con portadores u otras técnicas bien conocidas en la técnica. Una porción inmunogénica de un polipéptido de activina puede administrarse en presencia de adyuvante. El progreso de la inmunización puede monitorizarse mediante la detección de títulos de anticuerpos en plasma o suero. El ELISA estándar u otros inmunoensayos pueden usarse con el inmunógeno como antígeno para evaluar los niveles de producción de anticuerpos y/o el nivel de afinidad de unión.

[0554] Después de la inmunización de un animal con una preparación antigénica de activina, pueden obtenerse antisueros y, si se desea, pueden aislarse anticuerpos policlonales del suero. Para producir anticuerpos monoclonales, las células productoras de anticuerpos (linfocitos) pueden recogerse de un animal inmunizado y fusionarse mediante procedimientos estándar de fusión de células somáticas con células inmortalizantes tales como células de mieloma para producir células de hibridoma. Tales técnicas se conocen bien en la técnica, e incluyen, por ejemplo, la técnica de hibridoma [véase, por ejemplo, Kohler y Milstein (1975) Nature, 256: 495-497], la técnica de hibridoma de linfocitos B humanos [véase, por ejemplo, Kozbar et al. (1983) Immunology Today, 4:72], y la técnica de hibridoma de VEB para producir anticuerpos monoclonales humanos [Cole et al. (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs.77-96]. Las células de hibridoma pueden cribarse inmunoquímicamente para la producción de anticuerpos específicamente reactivos con un polipéptido de activina, y anticuerpos monoclonales aislados de un cultivo que comprende dichas células de hibridoma.

[0556] En determinadas realizaciones, pueden introducirse una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fc de un anticuerpo proporcionado en el presente documento generando de este modo una variante de región Fc. La variante de la región Fc puede comprender una secuencia de la región Fc humana (por ejemplo, una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación de aminoácidos (por ejemplo, una sustitución, deleción y/o adición) en una o más posiciones de aminoácidos.

[0558] Por ejemplo, la presente divulgación contempla una variante de anticuerpo que posee algunas pero no todas las funciones efectoras, lo que la convierte en un candidato deseable para aplicaciones en las que la semivida del anticuerpoin vivoes importante, pero determinadas funciones efectoras [por ejemplo, citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC)] son innecesarias o perjudiciales.Sepueden realizar ensayos de citotoxicidadin vitroy/oin vivopara confirmar la reducción/agotamiento de las actividades de CDC y/o ADCC. Por ejemplo, se pueden realizar ensayos de unión al receptor de Fc (FcR) para garantizar que el anticuerpo carece de unión a FcγR (por lo tanto, probablemente carece de actividad de ADCC), pero conserva la capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para mediar ADCC, células NK, expresan FcγRIII solamente, mientras que los monocitos expresan FcγRI, FcγRII y FcyRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en, por ejemplo, Ravetch y Kinet (1991) Annu. Rev. Immunol.9:457-492. Los ejemplos no limitantes de ensayosin vitropara evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés se describen en la patente estadounidense n.º 5.500.362; Hellstrom, I. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7059-7063]; Hellstrom, I et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1499-1502; patente estadounidense n.º 5.821.337; Bruggemann, M. et al. (1987) J. Exp. Med. 166:1351-1361. Alternativamente, se pueden emplear métodos de ensayos no radiactivos (por ejemplo, ACTI<™>, ensayo de citotoxicidad no radiactivo para citometría de flujo; CellTechnology, Inc. Mountain View, Calif.; y ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96<®>, Promega, Madison, Wes.). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células citolíticas naturales (NK). Alternativamente, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede evaluarsein vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el descrito en Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. usa 95:652-656. También pueden llevarse a cabo ensayos de unión a C1q para confirmar que el anticuerpo no puede unirse a C1q y, por lo tanto, carece de actividad de CDC [véase, por ejemplo, ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos WO 2006/029879 y WO 2005/100402]. Para evaluar la activación del complemento, puede realizarse un ensayo de CDC [véase, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al. (1996) J. Immunol. Methods 202:163; Cragg, M. S. et al. (2003) Blood 101:1045-1052; y Cragg, M. S, and M. J. Glennie (2004) Blood 103:2738-2743]. La unión a FcRn y las determinaciones de eliminación/semividain vivotambién pueden realizarse usando métodos conocidos en la técnica [véase, por ejemplo, Petkova, S. B. et al. (2006) Intl. Immunol. 18(12):1759-1769]. Los anticuerpos de la presente divulgación con función efectora reducida incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos de la región Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente estadounidense n.º 6.737.056). Dichos mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácidos 265, 269, 270, 297 y 327, incluido el llamado mutante de Fc "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 por alanina (patente estadounidense n.º 7.332.581).

[0560] En determinadas realizaciones, puede ser deseable crear anticuerpos modificados genéticamente con cisteína, por ejemplo, "tioMAb", en los que uno o más residuos de un anticuerpo se sustituyen con residuos de cisteína. En realizaciones particulares, los residuos sustituidos se producen en sitios accesibles del anticuerpo. Al sustituir esos residuos con cisteína, los grupos tiol reactivos se colocan de este modo en sitios accesibles del anticuerpo y pueden usarse para conjugar el anticuerpo con otros restos, tales como restos de fármaco o restos de enlazador-fármaco, para crear un inmunoconjugado, tal como se describe adicionalmente en el presente documento. En determinadas realizaciones, uno cualquiera o más de los siguientes residuos pueden estar sustituidos con cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración de la UE) de la cadena pesada; y S400 (numeración de la UE) de la región Fc de la cadena pesada. Los anticuerpos modificados genéticamente con cisteína pueden generarse como se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense n.º 7.521.541.

[0562] Además, las técnicas utilizadas para seleccionar anticuerpos con el fin de identificar un anticuerpo deseable pueden influir en las propiedades del anticuerpo obtenido. Por ejemplo, si se va a utilizar un anticuerpo para unirse a un antígeno en solución, puede ser deseable probar la unión a la solución. Una variedad de diferentes técnicas están disponibles para probar interacciones entre anticuerpos y antígenos para identificar anticuerpos particularmente deseables. Dichas técnicas incluyen ELISA, ensayos de unión por resonancia de plasmón superficial (por ejemplo, el ensayo de unión de Biacore, Biacore AB, Uppsala, Suecia), ensayos de sándwich (por ejemplo, el sistema de perlas paramagnéticas de IGEN International, Inc., Gaithersburg, Maryland), transferencias de Western, ensayos de inmunoprecipitación e inmunohistoquímica.

[0564] En determinadas realizaciones, se contemplan variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos y/o los polipéptidos de unión proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo y/o polipéptido de unión. Pueden prepararse variantes de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo y/o polipéptidos de unión introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica para el anticuerpo y/o polipéptido de unión, o mediante síntesis de péptidos. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo y/o polipéptido de unión. Se puede realizar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión a diana (por ejemplo, y activina tal como unión a activina E y/o activina C).

[0566] Se pueden realizar alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en las HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad del anticuerpo. Dichas alteraciones pueden realizarse en "puntos calientes" de HVR, es decir, residuos codificados por codones que experimentan mutación a alta frecuencia durante el proceso de maduración somática [véase, por ejemplo, Chowdhury (2008) Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)], y/o SDR (a-CDR), con la variante VH o VL resultante sometida a prueba para determinar la afinidad de unión. En la técnica se ha descrito la maduración por afinidad mediante la construcción y reselección a partir de bibliotecas secundarias [véase, por ejemplo, Hoogenboom et al., en Methods in Molecular Biology 178:1-37, O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.J., (2001). En algunas realizaciones de maduración por afinidad, la diversidad se introduce en los genes variables elegidos para la maduración por cualquiera de una variedad de métodos (por ejemplo, PCR propensa a errores, barajado de cadenas o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). Entonces se crea una biblioteca secundaria. A continuación, se analiza la biblioteca para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro método para introducir diversidad implica enfoques dirigidos a HVR, en los que varios residuos de HVR (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez) se aleatorizan. Los residuos de HVR implicados en la unión a antígeno pueden identificarse específicamente, por ejemplo, usando mutagénesis de barrido de alanina o modelado. CDR-H3 y CDR-L3 en particular a menudo se dirigen.

[0568] En determinadas realizaciones, pueden ocurrir sustituciones, inserciones o eliminaciones dentro de una o más HVR siempre que dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo para unirse al antígeno. Por ejemplo, pueden realizarse alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras tal como se proporciona en el presente documento) que no reducen sustancialmente la afinidad de unión en las HVR. Dichas alteraciones pueden estar fuera de los "puntos calientes" de HVR o SDR. En determinadas realizaciones de las secuencias de VH y VL variantes proporcionadas anteriormente, cada HVR está inalterada o no contiene más de una, dos o tres sustituciones de aminoácidos.

[0570] Un método útil para la identificación de residuos o regiones del anticuerpo y/o el polipéptido de unión que puede seleccionarse como diana para mutagénesis se denomina "mutagénesis de barrido de alanina" tal como se describe por Cunningham y Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En este método, se identifica un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados tales como Arg, Asp, His, Lys y Glu) y se reemplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo-antígeno se ve afectada. Pueden introducirse sustituciones adicionales en las ubicaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. De manera alternativa o adicional, se determina una estructura cristalina de un complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos vecinos pueden dirigirse o eliminarse como candidatos para la sustitución. Se pueden examinar las variantes para determinar si contienen las propiedades deseadas.

[0572] Las inserciones de secuencia de aminoácidos incluyen fusiones de extremo amino y/o carboxilo que varían en longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones dentro de la secuencia de residuos de aminoácidos individuales o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N-terminal. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión del extremo N o C del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que aumenta la semivida en suero del anticuerpo.

[0574] En determinadas realizaciones, un anticuerpo y/o polipéptido de unión proporcionado en la presente puede modificarse adicionalmente para contener restos no proteicos adicionales que se conocen en la técnica y están fácilmente disponibles. Los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo y/o polipéptido de unión incluyen, pero no se limitan a, polímeros solubles en agua. Los ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (ya sea homopolímeros o copolímeros aleatorios), y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), alcohol polivinílico, y mezclas de los mismos. El polietilenglicol propionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o no ramificado. La cantidad de polímeros unidos al anticuerpo y/o polipéptido de unión puede variar, y si se une más de un polímero, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización puede determinarse basándose en consideraciones que incluyen, pero no se limitan a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo y/o polipéptido de unión a mejorar, si el derivado de anticuerpo y/o derivado de polipéptido de unión se usará en una terapia en condiciones definidas.

[0576] D. Antagonistas de moléculas pequeñas

[0578] En otros aspectos, un antagonista de ALK7:ActRIIB es una molécula pequeña (ALK7: antagonista de molécula pequeña de ActRIIB), o combinación de antagonistas de molécula pequeña. Un antagonista de molécula pequeña de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de molécula pequeña, puede inhibir, por ejemplo, uno o más ligandos de unión a ALK7: ActRIIB, un receptor de tipo I (por ejemplo, ALK7), un receptor de tipo II (por ejemplo, ActRIIB) y/o correceptor (por ejemplo, Cripto o Cryptic). En algunas realizaciones, ALK7: antagonista de molécula pequeña de ActRIIB, o combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe la señalización mediada por uno o más ligandos de unión a ALK7: ActRIIB, por ejemplo, tal como se determina en un ensayo basado en células tal como se describe en el presente documento. Como se describe en el presente documento, pueden usarse antagonistas de molécula pequeña de ALK7:ActRIIB, solos o en combinación con una o más terapias de apoyo o agentes activos, para tratar a un paciente que lo necesita (por ejemplo, pacientes que tienen enfermedad renal y/o un trastorno metabólico).

[0580] En algunas realizaciones, un antagonista de molécula pequeña de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos GDF11. En algunas realizaciones, un antagonista de molécula pequeña de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos GDF8. En algunas realizaciones, un antagonista de molécula pequeña de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos la activina (activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina BC, activina AE y/o activina BE). En algunas realizaciones, un antagonista de molécula pequeña de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos GDF11, GDF8 y activina. En algunas realizaciones, un antagonista de molécula pequeña de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos ALK7. En algunas realizaciones, un antagonista de molécula pequeña de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos ActRIIB. En algunas realizaciones, un antagonista de molécula pequeña de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos Cripto o Cryptic. En algunas realizaciones, un antagonista de molécula pequeña de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos BMP6. En algunas realizaciones, un antagonista de molécula pequeña de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos GDF3. En algunas realizaciones, un antagonista de molécula pequeña de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos BMP5. En algunas realizaciones, un antagonista de molécula pequeña de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos BMP10. En algunas realizaciones, un antagonista de molécula pequeña de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de molécula pequeña, inhibe al menos nodal. En algunas realizaciones, un antagonista de molécula pequeña de ALK7:ActRIIB, o una combinación de antagonistas de molécula pequeña, como se divulga en el presente documento, no inhibe o no inhibe sustancialmente BMP9.

[0582] ALK7: Los antagonistas de molécula pequeña de ActRIIB pueden ser inhibidores directos o indirectos. Por ejemplo, un antagonista indirecto de molécula pequeña, o combinación de antagonistas de moléculas pequeñas, puede inhibir la expresión (por ejemplo, transcripción, traducción, secreción celular, o combinaciones de los mismos) de al menos uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-β [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina B, activina BC, activina AE, o Activin BE), GDF11, BMP10, BMP9, BMP6, BMP5, GDF3, activina C, activina E, Activina AC, GDF8, BMP10, BMP6, BMP5, nodal, y GDF3, receptor de tipo I (por ejemplo, ALK7), receptores de tipo II (por ejemplo, ActRIIB), correceptor (por ejemplo, Cripto o Críptico), y/o uno o más componentes de señalización aguas abajo (por ejemplo, Smads). Alternativamente, un antagonista de molécula pequeña directo, o combinación de antagonistas de molécula pequeña, puede unirse directamente a e inhibir, por ejemplo, uno o más ligandos de la superfamilia de TGF-β [por ejemplo, activina (por ejemplo, activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina B, activina BC, activina AE o activina BE), GDF11, BMP10, BMP9, BMP6, BMP5, GDF3, activina C, activina E, activina AC, GDF8, BMP10, BMP6, BMP5, nodal y GDF3, receptores de tipo I (por ejemplo, ALK7), receptores de tipo II (por ejemplo, ActRIIB), correceptores (por ejemplo, Cripto o Cryptic) y/o componentes de señalización aguas abajo (por ejemplo, Smads). Pueden usarse combinaciones de uno o más antagonistas de molécula pequeña de ALK7:ActRIIB indirectos y uno o más directos de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento.

[0583] Los antagonistas de molécula pequeña de unión de la presente divulgación pueden identificarse y sintetizarse químicamente usando metodología conocida (véase, por ejemplo, las publicaciones PCT n.<os>WO 00/00823 y WO 00/39585). En general, los antagonistas de molécula pequeña de la divulgación son habitualmente menores de aproximadamente 2000 daltons de tamaño, alternativamente menores de aproximadamente 1500, 750, 500, 250 o 200 daltons de tamaño, en donde dichas moléculas pequeñas orgánicas que son capaces de unirse, preferiblemente específicamente, a un polipéptido tal como se describe en el presente documento. Estos antagonistas de moléculas pequeñas pueden identificarse sin experimentación indebida utilizando técnicas bien conocidas. A este respecto, se observa que las técnicas para el cribado de bibliotecas de moléculas pequeñas orgánicas para moléculas que son capaces de unirse a una diana polipeptídica se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, las publicaciones de patentes internacionales n.<os>WO00/00823 y WO00/39585).

[0585] Las moléculas pequeñas orgánicas de unión de la presente divulgación pueden ser, por ejemplo, aldehídos, cetonas, oximas, hidrazonas, semicarbazonas, carbazidas, aminas primarias, aminas secundarias, aminas terciarias, Hidrazinas N-sustituidas, hidrazidas, alcoholes, éteres, tioles, tioéteres, disulfuros, ácidos carboxílicos, ésteres, amidas, ureas, carbamatos, carbonatos, cetales, tiocetales, acetales, tioacetales, haluros de arilo, arilsulfonatos, haluros de alquilo, alquilsulfonatos, compuestos aromáticos, compuestos heterocíclicos, anilinas, alquenos, alquinos, dioles, aminoalcoholes, oxazolidinas, oxazolinas, tiazolidinas, tiazolinas, enaminas, sulfonamidas, epóxidos, aziridinas, isocianatos, cloruros de sulfonilo, compuestos diazo, y cloruros de ácido.

[0586] E. Antagonistas de polinucleótidos

[0588] En otros aspectos, un antagonista de ALK7:ActRIIB es un polinucleótido (ALK7: antagonista de polinucleótido de ActRIIB), o combinación de polinucleótidos. Un antagonista de polinucleótido de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de polinucleótido, puede inhibir, por ejemplo, uno o más ligandos de unión a ALK7: ActRIIB, receptores de tipo I (por ejemplo, ALK7), receptores de tipo II (por ejemplo, ActRIIB), correceptor (por ejemplo, Cripto o Cryptic) y/o componente de señalización aguas abajo (por ejemplo, Smads). En algunas realizaciones, ALK7: antagonista de polinucleótido de ActRIIB, o combinación de antagonistas de polinucleótido, inhibe la señalización mediada por uno o más ligandos de unión a ALK7:ActRIIB, por ejemplo, tal como se determina en un ensayo basado en células tal como se describe en el presente documento. Como se describe en el presente documento, los antagonistas de polinucleótido de ALK7:ActRIIB pueden usarse, solos o en combinación con una o más terapias de apoyo o agentes activos, para tratar a un paciente que lo necesita (por ejemplo, pacientes que tienen enfermedad renal y/o un trastorno metabólico).

[0590] En algunas realizaciones, un antagonista de polinucleótido de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de polinucleótido, inhibe al menos GDF11. En algunas realizaciones, un antagonista de polinucleótido de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de polinucleótido, inhibe al menos GDF8. En algunas realizaciones, un antagonista polinucleotídico de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas polinucleotídicos, inhibe al menos la activina (activina A, activina B, activina C, activina E, activina AB, activina AC, activina AE, activina BC y/o activina BE). En algunas realizaciones, un antagonista de polinucleótido de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de polinucleótido, inhibe al menos GDF11, GDF8 y activina. En algunas realizaciones, un antagonista de polinucleótido de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de polinucleótido, inhibe al menos ALK7. En algunas realizaciones, un antagonista de polinucleótido de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de polinucleótido, inhibe al menos ActRIIB. En algunas realizaciones, un antagonista de polinucleótido de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de polinucleótido, inhibe al menos Crypto o Cryptic. En algunas realizaciones, un antagonista de polinucleótido de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de polinucleótido, inhibe al menos ActRIIB. En algunas realizaciones, un antagonista de polinucleótido de ALK7:ActIIB, o combinación de antagonistas de polinucleótido, inhibe al menos BMP6. En algunas realizaciones, un antagonista de polinucleótido de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de polinucleótido, inhibe al menos GDF3. En algunas realizaciones, un antagonista de polinucleótido de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de polinucleótido, inhibe al menos BMP10. En algunas realizaciones, un antagonista de polinucleótido de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas de polinucleótido, inhibe al menos BMP5. En algunas realizaciones, un antagonista de polinucleótido de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonista de polinucleótido, inhibe al menos nodal. En algunas realizaciones, un antagonista polinucleotídico de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas polinucleotídicos, tal como se divulga en el presente documento, no inhibe o no inhibe sustancialmente BMP9.

[0591] En algunas realizaciones, los antagonistas polinucleotídicos de la divulgación pueden ser un ácido nucleico antisentido, una molécula de ARNi [por ejemplo, ARN de interferencia pequeño (ARNip), ARN de horquilla pequeña (ARNhc), microARN (miARN)], un aptámero y/o una ribozima. Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de GDF11, GDF8, activina (activina A, activina B, activina C y activina E humanas), BMP6, GDF3, BMP5, ALK7, ActRIIB, Cripto, Cryptic, Nodal y BMP10 se conocen en la técnica. Además, en la técnica se conocen muchos métodos diferentes para generar antagonistas de polinucleótidos. Por lo tanto, el experto en la técnica puede preparar de forma rutinaria antagonistas de polinucleótidos para su uso de acuerdo con esta divulgación basándose en el conocimiento en la técnica y las enseñanzas proporcionadas en el presente documento.

[0593] La tecnología antisentido puede usarse para controlar la expresión génica a través de ADN o ARN antisentido, o a través de la formación de triple hélice. Las técnicas antisentido se discuten, por ejemplo, en Okano (1991) J. Neurochem.56:560; Oligodeoxinucleótidos como inhibidores antisentido de la expresión génica, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988). La formación de triple hélice se discute en, por ejemplo, Cooney et al. (1988) Science 241:456; y Dervan et al., (1991) Science 251:1300. Los métodos se basan en la unión de un polinucleótido a un ADN o ARN complementario. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos antisentido comprenden una secuencia de ARN o ADN monocatenaria que es complementaria a al menos una porción de un transcrito de ARN de un gen descrito en la presente. Sin embargo, no se requiere complementariedad absoluta, aunque se prefiere.

[0595] Una secuencia "complementaria a al menos una porción de un ARN", a la que se hace referencia en el presente documento, significa una secuencia que tiene suficiente complementariedad para poder hibridarse con el ARN, formando un dúplex estable; en el caso de ácidos nucleicos antisentido bicatenarios de un gen descrito en el presente documento, puede probarse así una sola cadena del ADN dúplex, o puede ensayarse la formación de tríplex. La capacidad para hibridarse dependerá tanto del grado de complementariedad como de la longitud del ácido nucleico antisentido. Generalmente, cuanto más grande sea el ácido nucleico de hibridación, más desapareamientos de bases con un ARN puede contener y aún formar un dúplex estable (o tríplex según sea el caso). Un experto en la técnica puede determinar un grado tolerable de emparejamiento erróneo mediante el uso de procedimientos estándar para determinar el punto de fusión del complejo hibridado.

[0597] Los polinucleótidos que son complementarios al extremo 5’ del mensaje, por ejemplo, la secuencia 5’ no traducida hasta e incluyendo el codón de inicio AUG, deberían funcionar de la manera más eficiente para inhibir la traducción. Sin embargo, se ha demostrado que las secuencias complementarias a las secuencias no traducidas en 3’ de los ARNm también son eficaces para inhibir la traducción de los ARNm [véase, por ejemplo, Wagner, R., (1994) Nature 372:333-335]. Por lo tanto, los oligonucleótidos complementarios a las regiones no codificantes no traducidas 5' o 3' de un gen de la divulgación, podrían usarse en un enfoque antisentido para inhibir la traducción de un ARNm endógeno. Los polinucleótidos complementarios a la región 5' no traducida del ARNm deben incluir el complemento del codón de inicio AUG. Los polinucleótidos antisentido complementarios a las regiones codificantes de ARNm son inhibidores menos eficaces de la traducción, pero podrían usarse según los métodos de la presente divulgación. Ya sea que estén diseñados para hibridarse con la región 5', 3' o codificante de un ARNm de la divulgación, los ácidos nucleicos antisentido deben tener al menos seis nucleótidos de longitud y son preferiblemente oligonucleótidos que varían de 6 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En aspectos específicos, el oligonucleótido tiene al menos 10 nucleótidos, al menos 17 nucleótidos, al menos 25 nucleótidos o al menos 50 nucleótidos.

[0599] En una realización, el ácido nucleico antisentido de la presente divulgación se produce intracelularmente mediante transcripción a partir de una secuencia exógena. Por ejemplo, se transcribe un vector o una porción del mismo, produciendo un ácido nucleico antisentido (ARN) de un gen de la divulgación. Dicho vector contendría una secuencia que codifica para el ácido nucleico antisentido deseado. Dicho vector puede permanecer episómico o integrarse cromosómicamente, siempre que pueda transcribirse para producir el ARN antisentido deseado. Dichos vectores pueden construirse mediante métodos de tecnología de ADN recombinante estándar en la técnica. Los vectores pueden ser plásmidos, virales u otros conocidos en la técnica, utilizados para la replicación y expresión en células de vertebrados. La expresión de la secuencia que codifica genes deseados de la presente divulgación, o fragmentos de los mismos, puede ser mediante cualquier promotor conocido en la técnica que actúe en células de vertebrados, preferiblemente humanas. Dichos promotores pueden ser inducibles o constitutivos. Dichos promotores incluyen, pero no se limitan a, la región promotora temprana de SV40 [véase, por ejemplo, Benoist y Chambon (1981) Nature 290:304-310], el promotor contenido en la repetición terminal larga 3’ del virus del sarcoma de Rous [véase, por ejemplo, Yamamoto et al. (1980) Cell 22:787-797], el promotor de timidina del herpes [véase, por ejemplo, Wagner et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445], y las secuencias reguladoras del gen de la metalotioneína [véase, por ejemplo, Brinster, et al. (1982) Nature 296:39-42].

[0601] En algunas realizaciones, los antagonistas de polinucleótidos son moléculas de ARN de interferencia (ARNi) que se dirigen a la expresión de uno o más de: GDF11, GDF8, activina (activina A, activina B, activina C y activina E), BMP6, GDF3, BMP5, ALK7, ActRIIB, Cripto, Cryptic, nodal y BMP10. El ARNi se refiere a la expresión de un ARN que interfiere con la expresión del ARNm diana. Específicamente, el ARNi silencia un gen diana mediante la interacción con el ARNm específico a través de un ARNip (ARN de interferencia pequeño). A continuación, el complejo de ARNbc se dirige a la degradación por parte de la célula. Una molécula de ARNip es un dúplex de ARN bicatenario de 10 a 50 nucleótidos de longitud, que interfiere con la expresión de un gen diana que es suficientemente complementario (por ejemplo, al menos 80 % de identidad con el gen). En algunas realizaciones, la molécula de ARNip comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos el 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o el 100 % idéntica a la secuencia de nucleótidos del gen diana.

[0603] Las moléculas de ARNi adicionales incluyen ARN de horquilla corta (ARNhc); también horquilla de interferencia corta y microARN (miARN). La molécula de ARNhc contiene secuencias sentido y antisentido de un gen diana conectadas por un bucle. El ARNhc se transporta desde el núcleo al citoplasma y se degrada junto con el ARNm. Los promotores de Pol III o U6 pueden usarse para expresar ARN para ARNi. Paddison et al. [Genes & Dev. (2002) 16:948-958, 2002] han utilizado pequeñas moléculas de ARN plegadas en horquillas como medio para afectar a el ARNi. Por consiguiente, dichas moléculas de ARN de horquilla corta (ARNhc) también se usan ventajosamente en los métodos descritos en el presente documento. La longitud del tallo y el bucle de los ARNhc funcionales varía; las longitudes del tallo pueden variar entre alrededor de 25 y alrededor de 30 nt, y el tamaño del bucle puede variar entre 4 y alrededor de 25 nt sin afectar la actividad de silenciamiento. Aunque no se desea limitarse a ninguna teoría particular, se cree que estos ARNhc se asemejan a los productos de ARN bicatenario (ARNbc) de la ARNasa DICER y, en cualquier caso, tienen la misma capacidad para inhibir la expresión de un gen específico. El ARNhc puede expresarse a partir de un vector lentiviral. Un miARN es un ARN monocatenario de aproximadamente 10 a 70 nucleótidos de longitud que se transcriben inicialmente como pre-miARN caracterizado por una estructura de "tallo-bucle", que posteriormente se procesan en miARN maduro después de un procesamiento adicional a través del RISC.

[0605] Las moléculas que median en el ARNi, incluyendo pero sin limitarse a ARNip, pueden producirsein vitromediante síntesis química (Hohjoh, FEBS Lett 521:195-199, 2002), hidrólisis de ARNbc (Yang et al., Proc Natl Acad Sci usa 99:9942-9947, 2002), mediante transcripciónin vitrocon ARN polimerasa de T7 (Donzeet et al., Nucleic Acids Res 30:e46, 2002; Yu et al., Proc Natl Acad Sci usa 99:6047-6052, 2002), y por hidrólisis de ARN bicatenario usando una nucleasa tal como ARNasa III de E. coli (Yang et al., Proc Natl Acad Sci usa 99:9942-9947, 2002).

[0607] De acuerdo con otro aspecto, la divulgación proporciona antagonistas de polinucleótidos que incluyen, pero no se limitan a, un ADN señuelo, un ADN bicatenario, un ADN monocatenario, un ADN complejado, un ADN encapsulado, un ADN viral, un ADN plasmídico, un ARN desnudo, un ARN encapsulado, un ARN viral, un ARN bicatenario, una molécula capaz de generar interferencia de ARN, o combinaciones de los mismos.

[0609] En algunas realizaciones, los antagonistas polinucleotídicos de la divulgación son aptámeros. Los aptámeros son moléculas de ácido nucleico, que incluyen ADN bicatenario y moléculas de ARN monocatenario, que se unen y forman estructuras terciarias que se unen específicamente a una molécula diana. La generación y el uso terapéutico de aptámeros están bien establecidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 5.475.096). Puede encontrarse información adicional sobre los aptámeros en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.º 20060148748. Los aptámeros de ácido nucleico se seleccionan usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante el proceso de evolución sistemática de ligandos mediante enriquecimiento exponencial (SELEX). SELEX es un método para la evoluciónin vitrode moléculas de ácido nucleico con unión altamente específica a moléculas diana tal como se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense n.º 5.475.096; 5.580.737; 5.567.588; 5.707.796; 5.763.177; 6.011.577; y 6.699.843. Otro método de selección para identificar aptámeros se describe en la patente estadounidense n.º 5.270.163. El proceso SELEX se basa en la capacidad de los ácidos nucleicos para formar una variedad de estructuras bidimensionales y tridimensionales, así como la versatilidad química disponible dentro de los monómeros de nucleótidos para actuar como ligandos (formar pares de unión específicos) con prácticamente cualquier compuesto químico, ya sea monomérico o polimérico, incluyendo otras moléculas de ácido nucleico y polipéptidos. Las moléculas de cualquier tamaño o composición pueden servir como dianas. El método SELEX implica la selección a partir de una mezcla de oligonucleótidos candidatos e iteraciones por etapas de unión, partición y amplificación, usando el mismo esquema de selección general, para lograr la afinidad y selectividad de unión deseadas. A partir de una mezcla de ácidos nucleicos, que puede comprender un segmento de secuencia aleatorizada, el método SELEX incluye las etapas de poner en contacto la mezcla con la diana en condiciones favorables para la unión; dividir los ácidos nucleicos no unidos de aquellos ácidos nucleicos que se han unido específicamente a las moléculas diana; disociar los complejos de ácido nucleico-diana; amplificar los ácidos nucleicos disociados de los complejos de ácido nucleico-diana para producir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida con ligando. Las etapas de unión, partición, disociación y amplificación se repiten a través de tantos ciclos como se desee para producir ligandos de ácido nucleico que se unen con alta afinidad y especificidad a la molécula diana.

[0611] Típicamente, tales moléculas de unión se administran por separado al animal [véase, por ejemplo, O'Connor (1991) J. Neurochem.56:560], pero tales moléculas de unión también pueden expresarsein vivoa partir de polinucleótidos captados por una célula huésped y expresadosin vivo[véase, por ejemplo, Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988)].

[0613] F. Antagonistas de folistatina y FLRG

[0615] Se sabe que los miembros del grupo de proteínas folistatina y FLRG antagonizan ligandos que señalizan a través de la vía ALK7:ActRIIB. Por consiguiente, en otros aspectos, un antagonista de ALK7:ActRIIB es una folistatina o polipéptido FLRG, que puede usarse solo o en combinación con una o más terapias de apoyo adicionales y/o agentes activos como se describe en el presente documento para lograr un efecto deseado (por ejemplo, tratar pacientes que tienen enfermedad renal y/o un trastorno metabólico).

[0617] El término "polipéptido de folistatina" incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido de folistatina de origen natural, así como cualquier variante del mismo (incluyendo mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas) que conservan una actividad útil, e incluye además cualquier monómero o multímero funcional de folistatina. En determinadas realizaciones preferidas, los polipéptidos de folistatina de la divulgación se unen a y/o inhiben la actividad de activina y/o GDF8. Pueden identificarse variantes de polipéptidos de folistatina que conservan propiedades de unión a activina basándose en estudios previos que implican interacciones de folistatina y activina. Por ejemplo, el documento WO2008/030367 describe dominios específicos de folistatina ("FSD") que muestran ser importantes para la unión a activina. Como se muestra a continuación en SEQ ID NO: 90-94, el dominio N-terminal de folistatina ("FSND" SEQ ID NO: 92), FSD2 (SEQ ID NO: 94) y, en menor medida, FSD1 (SEQ ID NO: 93) representan dominios de ejemplo dentro de folistatina que son importantes para la unión a activina. Además, los métodos para elaborar y probar bibliotecas de polipéptidos se describieron anteriormente en el contexto de los polipéptidos ActRII, y dichos métodos también se refieren a la elaboración y prueba de variantes de folistatina. Los polipéptidos de folistatina incluyen polipéptidos derivados de la secuencia de cualquier folistatina conocida que tiene una secuencia al menos aproximadamente el 80 % idéntica a la secuencia de un polipéptido de folistatina, y opcionalmente al menos el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o mayor identidad. Los ejemplos de polipéptidos de folistatina incluyen el polipéptido de folistatina maduro o isoformas más cortas u otras variantes del polipéptido precursor de folistatina humano (SEQ ID NO: 90) como se describe, por ejemplo, en el documento WO2005/025601.

[0619] La isoforma de polipéptido precursor de folistatina humano FST344 es tal como sigue:

[0622]

[0624] (SEQ ID NO:90; NCBI Referencia: NP_03754.1)

[0625] El péptido señal está subrayado; también están subrayados anteriormente los últimos 27 residuos que representan la extensión C-terminal que distingue esta isoforma de folistatina de la isoforma de folistatina más corta FST317 que se muestra a continuación.

[0626] La isoforma de polipéptido precursor de folistatina humano FST317 es tal como sigue:

[0629]

[0631] El péptido señal está subrayado.

[0632] La secuencia del dominio N-terminal de folistatina (FSND) es la siguiente:

[0635]

[0637] Las secuencias de FSD1 y FSD2 son tal como sigue:

[0638] ETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCV (SEQ ID NO: 93; FSD1)

[0639] KTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVT (SEQ ID NO: 94; FSD2)

[0640] En otros aspectos, un antagonista de ALK7:ActRIIB es un gen relacionado similar a folistatina (FLRG), también conocido como proteína 3 relacionada con folistatina (FSTL3). El término "polipéptido FLRG" incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido de origen natural de FLRG así como cualquier variante del mismo (incluyendo mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas) que conservan una actividad útil. En determinadas realizaciones, los polipéptidos de FLRG de la divulgación se unen a y/o inhiben la actividad de activina, particularmente activina A. Las variantes de polipéptidos de FLRG que conservan propiedades de unión a activina pueden identificarse usando métodos de rutina para ensayar interacciones de FLRG y activina (véase, por ejemplo, el documento US 6.537.966). Además, los métodos para elaborar y probar bibliotecas de polipéptidos se describen anteriormente en el contexto de los polipéptidos ActRII y ALK7 y dichos métodos también se refieren a la elaboración y prueba de variantes de FLRG. Los polipéptidos FLRG incluyen polipéptidos derivados de la secuencia de cualquier FLRG conocido que tenga una secuencia idéntica en al menos aproximadamente el 80 % a la secuencia de un polipéptido FLRG, y opcionalmente una identidad de al menos el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 97 %, el 99 % o mayor.

[0641] El polipéptido precursor de FLRG humano (precursor de proteína 3 relacionado con folistatina) es de la siguiente manera:

[0642]

[0644] El péptido señal está subrayado.

[0645] En determinadas realizaciones, las variantes funcionales o formas modificadas de los polipéptidos de folistatina y polipéptidos FLRG incluyen proteínas de fusión que tienen al menos una porción del polipéptido de folistatina o polipéptido FLRG y uno o más dominios de fusión, tales como, por ejemplo, dominios que facilitan el aislamiento, detección, estabilización o multimerización del polipéptido. Los dominios de fusión adecuados se analizan en detalle anteriormente con referencia a los polipéptidos ActRII. En alguna realización, un agente antagonista de la divulgación es una proteína de fusión que comprende una porción de unión a activina de un polipéptido de folistatina fusionado a un dominio Fc. En otra realización, un agente antagonista de la divulgación es una proteína de fusión que comprende una porción de unión a activina de un polipéptido FLRG fusionado a un dominio Fc.G. Lefty A y B

[0646] Se sabe que las proteínas Lefty A y B regulan Nodal y otras proteínas que señalizan a través de la vía ALK7:ActRIIB. Por consiguiente, en otros aspectos, un antagonista de ALK7:ActRIIB es un polipéptido de Lefty A o Lefty B, que puede usarse solo o en combinación con una o más terapias de apoyo adicionales y/o agentes activos como se divulga en el presente documento para lograr un efecto deseado (por ejemplo, tratar enfermedad renal y/o una afección o trastorno metabólico).

[0647] El término "polipéptido Lefty A" incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido de origen natural de Lefty A, así como cualquier variante de los mismos (incluyendo mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas) que retienen una actividad útil, e incluye además cualquier monómero o multímero funcional de Lefty A. En determinadas realizaciones preferidas, los polipéptidos Lefty A de la divulgación se unen a y/o inhiben la actividad nodal. Además, los métodos para elaborar y probar bibliotecas de polipéptidos se describen anteriormente en el contexto de los polipéptidos ActRII y ALK7, y dichos métodos también se refieren a la elaboración y prueba de variantes de Lefty A. Los polipéptidos Lefty A incluyen polipéptidos derivados de la secuencia de cualquier Lefty A conocido que tiene una secuencia al menos aproximadamente un 80 % idéntica a la secuencia de un polipéptido Lefty A, y opcionalmente al menos el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más de identidad. Los ejemplos de polipéptidos Lefty A incluyen el polipéptido Lefty A maduro o isoformas más cortas u otras variantes del polipéptido precursor Lefty A humano (SEQ ID NO: 96).

[0648] El polipéptido precursor de Lefty A humano es tal como sigue:

[0651]

[0653] El péptido señal está subrayado.

[0654] El término "polipéptido Lefty B" incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido de origen natural de Lefty B, así como cualquier variante de los mismos (incluyendo mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas) que conservan una actividad útil, e incluye además cualquier monómero o multímero funcional de Lefty B. En determinadas realizaciones preferidas, los polipéptidos Lefty B de la divulgación inhiben la actividad nodal. Además, los métodos para elaborar y probar bibliotecas de polipéptidos se describen anteriormente en el contexto de los polipéptidos ActRII y ALK7, y dichos métodos también se refieren a la elaboración y prueba de variantes de Lefty B. Los polipéptidos Lefty B incluyen polipéptidos derivados de la secuencia de cualquier Lefty B conocido que tiene una secuencia al menos aproximadamente el 80 % idéntica a la secuencia de un polipéptido Lefty B, y opcionalmente al menos el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más de identidad. Los ejemplos de polipéptidos Lefty B incluyen el polipéptido Lefty B maduro o isoformas más cortas u otras variantes del polipéptido precursor Lefty B humano (SEQ ID NO: 97).

[0655] El polipéptido precursor de Lefty B humano es tal como sigue:

[0658]

[0660] El péptido señal está subrayado.

[0661] En determinadas realizaciones, las variantes funcionales o formas modificadas de los polipéptidos Lefty A y polipéptidos Lefty B incluyen proteínas de fusión que tienen al menos una porción del polipéptido Lefty A o polipéptido Lefty y uno o más dominios de fusión, tales como, por ejemplo, dominios que facilitan el aislamiento, detección, estabilización o multimerización del polipéptido. Los dominios de fusión adecuados se analizan en detalle anteriormente con referencia a los polipéptidos ActRII y ALK7. En alguna realización, un agente antagonista de la divulgación es una proteína de fusión que comprende una porción de unión nodal de un polipéptido de Lefty A y/o Lefty B fusionado a un dominio Fc.

[0662] H. Proteínas relacionadas con DAN

[0663] Se sabe que los miembros de la familia de proteínas DAN regulan los ligandos que señalizan a través de la vía ALK7:ActRIIB. Por consiguiente, en otros aspectos, un antagonista de ALK7:ActRIIB es una proteína relacionada con DAN (por ejemplo, Cerberus y Coco), que puede usarse sola o en combinación con una o más terapias de apoyo adicionales y/o agentes activos tal como se divulgan en el presente documento para lograr un efecto deseado (por ejemplo, tratar pacientes que tienen enfermedad renal y/o un trastorno metabólico).

[0664] El término "polipéptido de Cerberus" incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido de origen natural de Cerberus así como cualquier variante del mismo (incluyendo mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas) que conservan una actividad útil, e incluye además cualquier monómero o multímero funcional de Cerberus. En determinadas realizaciones preferidas, los polipéptidos de Cerberus de la divulgación se unen a y/o inhiben la actividad ganglionar. Además, los métodos para elaborar y probar bibliotecas de polipéptidos se describieron anteriormente en el contexto de los polipéptidos ActRII y ALK7, y dichos métodos también se refieren a la elaboración y prueba de variantes de Cerberus. Los polipéptidos de Cerberus incluyen polipéptidos derivados de la secuencia de cualquier Cerberus conocido que tiene una secuencia al menos aproximadamente el 80 % idéntica a la secuencia de un polipéptido de Cerberus, y opcionalmente al menos el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o mayor identidad. Los ejemplos de polipéptidos de Cerberus incluyen el polipéptido de Cerberus maduro o isoformas más cortas u otras variantes del polipéptido precursor de Cerberus humano (SEQ ID NO: 98).

[0665] El polipéptido precursor de Cerberus humano es tal como sigue:

[0668]

[0670] (SEQ ID NO:98; NCBI Referencia: NP_005445.1)

[0671] El péptido señal está subrayado.

[0672] El término "polipéptido de coco" incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido de origen natural de coco, así como cualquier variante del mismo (incluyendo mutantes, fragmentos, fusiones y formas peptidomiméticas) que conservan una actividad útil, e incluye además cualquier monómero o multímero funcional de coco. En determinadas realizaciones preferidas, los polipéptidos de coco de la divulgación se unen a y/o inhiben la actividad nodal. Además, los métodos para elaborar y probar bibliotecas de polipéptidos se describieron anteriormente en el contexto de los polipéptidos ActRII y ALK7, y dichos métodos también se refieren a la elaboración y prueba de variantes de coco. Los polipéptidos de coco incluyen polipéptidos derivados de la secuencia de cualquier coco conocido que tiene una secuencia al menos aproximadamente el 80 % idéntica a la secuencia de un polipéptido de coco, y opcionalmente al menos el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o mayor identidad. Los ejemplos de polipéptidos de coco incluyen el polipéptido de coco maduro o isoformas más cortas u otras variantes del polipéptido precursor de coco humano (SEQ ID NO: 99).

[0673] El polipéptido precursor de coco humano es tal como sigue:

[0676]

[0678] El péptido señal está subrayado.

[0679] En determinadas realizaciones, las variantes funcionales o formas modificadas de los polipéptidos de Cerberus y polipéptidos de coco incluyen proteínas de fusión que tienen al menos una parte del polipéptido de Cerberus y/o polipéptido de coco y uno o más dominios de fusión, tales como, por ejemplo, dominios que facilitan el aislamiento, detección, estabilización o multimerización del polipéptido. Los dominios de fusión adecuados se analizan en detalle anteriormente con referencia a los polipéptidos ActRII y ALK7. En alguna realización, un agente antagonista de la divulgación es una proteína de fusión que comprende una porción de unión nodal de un polipéptido de Cerberus y/o Coco fusionado a un dominio Fc.

[0680] 3. Ensayos de cribado

[0681] En determinadas realizaciones, pueden usarse heteromultímeros de receptores ALK7:ActRIIB (por ejemplo, heterodímeros de ALK7:ActRIIB) para generar y/o cribar inhibidores de ALK7:ActRIIB, particularmente inhibidores que interfieren con la interacción de ligando de ALK7 y/o receptor de tipo II de ALK7 (por ejemplo, ActRIIB) (por ejemplo, anticuerpos anti-ALK7).

[0682] Como se comenta en el presente documento, las señales de ligando de la superfamilia de TGF-beta están mediadas por complejos de receptores de cinasa de tipo I y tipo II, que fosforilan y activan proteínas SMAD cadena abajo tras la estimulación del ligando [véase, por ejemplo, Massague (2000) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol.1: 169-178]. Si bien son esenciales para la señalización, los receptores de tipo I generalmente tienen una afinidad muy débil por los ligandos de la superfamilia de TGF-beta. En cambio, los receptores de tipo II generalmente se unen a ligandos con alta afinidad. Esta unión al ligando promueve la formación de complejos estables entre los receptores de tipo I y II, dando como resultado la fosforilación de los receptores de tipo I por los receptores de tipo II y, por lo tanto, la activación de las proteínas SMAD. En vista de la afinidad más débil, generalmente es difícil observar la actividad de unión al ligando de los receptores de tipo I de forma aislada.

[0683] De hecho, los ejemplos en el presente documento demuestran que un homodímero de ActRIIB se une a muchos ligandos diferentes, muchos con alta afinidad. Por el contrario, un homodímero de ALK7 no mostró afinidad por ninguno de los ligandos examinados. Como los ligandos no se unen de forma detectable a ALK7, es difícil detectar/identificar agentes que puedan inhibir la actividad de ALK7. Sin embargo, como lo demuestran los ejemplos en la presente, la actividad de unión al ligando de ALK7 se vuelve medible cuando se empareja con un receptor tipo II. Por lo tanto, heteromultímeros ALK7:ActRIIB (por ejemplo, heterodímeros) son una herramienta útil para identificar inhibidores de ALK7 usando diversos ensayos de cribado tales como los descritos en el presente documento, así como los conocidos en la técnica. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere al uso de heteromultímeros ALK7: receptor de tipo II (por ejemplo, heteromultímeros ALK7:ActRIIB) para identificar (detectar) inhibidores de ALK7.

[0684] Por ejemplo, los heteromultímeros ALK7: receptor de tipo II (por ejemplo, heteromultímeros ALK7:ActRIIB) pueden ser particularmente útiles para generar/identificar anticuerpos que se unen a ALK7, particularmente anticuerpos que se unen a e inhiben ALK7. Si bien los polipéptidos de ALK7, que incluyen homodímeros de ALK7 tal como se describe en el presente documento, pueden usarse para generar/identificar anticuerpos que se unen a ALK7, la unión simple no es suficiente para demostrar que un anticuerpo de ALK7 dado puede inhibir una actividad de ALK7 (por ejemplo, interferir con interacciones de ligando de ALK7 o receptor de tipo II de ALK7). Como se demuestra en el presente documento, los polipéptidos de ALK7 no muestran actividad de unión a ligando en ausencia de un receptor de tipo II, haciendo que sea difícil identificar anticuerpos que puedan inhibir ALK7. Heteromultímeros de receptores ALK7:ActRIIB de tipo II (por ejemplo, heteromultímeros ALK7:ActRIIB) resuelven este problema proporcionando una lectura funcional para la actividad de ALK7. Además, sin querer limitarse a ningún mecanismo de acción particular, la asociación con un receptor tipo II (por ejemplo, ActRIIB) puede mejorar la capacidad de generar anticuerpos que inhiben la actividad de ALK7. Por ejemplo, la asociación con un receptor de tipo II puede ayudar a estabilizar ALK7 de tal manera que optimice el procesamiento y la presentación de epítopos importantes de ALK7 que median las actividades de unión al ligando y, por lo tanto, mejoran el desarrollo de anticuerpos inhibidores de ALK7. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere al uso de heteromultímeros ALK7:Tipo II (por ejemplo, heteromultímeros ALK7:ActRIIB) para generar anticuerpos que se unen a e inhiben ALK7. Los métodos para generar y detectar anticuerpos se conocen bien en la técnica y se describen en la presente, y se pueden usar heteromultímeros ALK7-Tipo II (por ejemplo, heteromultímeros ALK7:ActRIIB) de acuerdo con uno o más de estos métodos para generar/identificar anticuerpos que se unen a e inhiben la actividad de ALK7.

[0686] En determinadas realizaciones, pueden usarse heteromultímeros de receptores ALK7:ActRIIB Tipo II (por ejemplo, heteromultímeros ALK7:ActRIIB tales como heterodímeros) para identificar inhibidores de activina C, particularmente inhibidores que se unen a activina C e interfieren con la interacción del receptor de tipo I/II de activina C.

[0688] Sorprendentemente, los datos presentados en la presente demuestran que los heterodímeros ALK7:ActRIIB se unen a activina C. La comprensión de esta interacción novedosa proporciona una oportunidad para desarrollar/identificar inhibidores de activina C. Además, dada la similitud estructural entre la activina C y la activina E, se espera que la activina E también se una a ALK7:ActRIIB y, por lo tanto, esta nueva interacción también se puede utilizar para identificar antagonistas de la activina E. Los ligandos heterodiméricos, tales como activina AC, AE, BC y BE también se incluyen en la referencia a activina C o E, respectivamente en esta sección de la divulgación. También se contemplan agentes que afectan tanto a la activina C como a la E. Se espera que diversos tipos de antagonistas de activina C o E sean útiles según los métodos descritos en el presente documento incluyendo, por ejemplo, moléculas pequeñas, anticuerpos y ácidos nucleicos inhibidores, particularmente aquellos que alteran la interacción de activina C (o E) -ALK7:ActRIIB. Un agente (por ejemplo, un anticuerpo o molécula pequeña) que es específicamente reactivo con activina C o E y que se une a activina C o E para competir con su unión a ALK7 y/o ActRIIB o de otro modo inhibe la señalización mediada por activina C o E puede usarse como un antagonista de activina C o E. Del mismo modo, un agente que es específicamente reactivo con ALK7 y/o ActRIIB y que interrumpe la unión de activina C o E puede usarse como un antagonista. Con respecto a los anticuerpos, los inmunógenos pueden derivarse de un polipéptido de activina C o E, polipéptido de ALK7 o polipéptido de ActRIIB y usarse para generar anticuerpos usando métodos convencionales conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Anticuerpos: A Laboratory Maneal ed. por Harlow y Lane, Cold Spring Harbor Press, 1988. Usando diversos ensayos de selección conocidos en la técnica tales como los descritos en el presente documento, pueden usarse heterodímeros de ALK7: receptor de tipo II (por ejemplo, heteromultímeros ALK7:ActRIIB tales como heterodímeros) para identificar inhibidores de activina C o E.

[0690] En determinados aspectos, la presente divulgación se refiere al uso de complejos de heteromultímeros ALK7:ActRIIB para identificar compuestos (agentes) que son agonistas o antagonistas de los receptores de la superfamilia de TGFβ. Los compuestos identificados a través de este cribado pueden ensayarse para evaluar su capacidad para modular el crecimiento de tejido, tal como hueso, cartílago, músculo, grasa y/o neuronas, crecimientoin vivooin vitro. Estos compuestos pueden ensayarse, por ejemplo, en modelos animales.

[0692] Existen numerosos enfoques para el cribado de agentes terapéuticos para modular el crecimiento tisular dirigiéndose a la señalización del ligando de la superfamilia de TGFβ (por ejemplo, señalización SMAD). En determinadas realizaciones, puede llevarse a cabo un cribado de alto rendimiento de compuestos para identificar agentes que perturban los efectos mediados por el receptor de la superfamilia de TGFβ en una línea celular seleccionada. En determinadas realizaciones, el ensayo se lleva a cabo para cribar e identificar compuestos que inhiben o reducen específicamente la unión de un heteromultímero de ALK7:ActRIIB a un compañero de unión (por ejemplo, activina, GDF11, GDF8, BMP6, GDF3, BMP5, nodal y BMP10). Alternativamente, el ensayo puede usarse para identificar compuestos que potencian la unión de un heteromultímero de ALK7:ActRIIB a un ligando. En una realización adicional, los compuestos pueden identificarse por su capacidad para interactuar con un heteromultímero de ALK7:ActRIIB.

[0694] En algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere al uso de un heteromultímero de ALK7:ActRIIB y polipéptidos de activina C o E para identificar compuestos que son agonistas o antagonistas de la vía de señalización de activina C (o E) -ALK7:ActRIIB. Los compuestos identificados a través de este ensayo de selección se pueden analizar para evaluar su capacidad para modular la actividad de señalización de activina C o Ein vitro. Opcionalmente, estos compuestos pueden probarse adicionalmente en modelos animales para evaluar su capacidad para modular el crecimiento tisularin vivo. Existen numerosos enfoques para la detección de agentes terapéuticos para modular el crecimiento tisular al dirigirse a la activina C o E y a heteromultímeros ALK7:ActRIIB. En determinadas realizaciones, puede llevarse a cabo un cribado de alto rendimiento de compuestos para identificar agentes que perturban la señalización celular mediada por activina C o E o ALK7:ActRIIB. En determinadas realizaciones, el ensayo se lleva a cabo para cribar e identificar compuestos que inhiben o reducen específicamente la unión de un heteromultímero de ALK7:ActRIIB a activina C o E. De manera alternativa, el ensayo puede usarse para identificar compuestos que potencian la unión de un heteromultímero de ALK7:ActRIIB a activina C o E. En una realización adicional, los compuestos pueden identificarse por su capacidad para interaccionar con activina C o E o un heteromultímero de ALK7:ActRIIB.

[0696] Será suficiente una variedad de formatos de ensayo y, a la luz de la presente divulgación, los que no se describen expresamente en el presente documento serán comprendidos sin embargo por un experto habitual en la técnica. Como se describe en el presente documento, los compuestos de prueba (agentes) de la invención pueden crearse mediante cualquier método químico combinatorio. Alternativamente, los compuestos de la invención pueden ser biomoléculas de origen natural sintetizadasin vivooin vitro. Los compuestos (agentes) que van a someterse a prueba para determinar su capacidad para actuar como moduladores del crecimiento tisular pueden producirse, por ejemplo, mediante bacterias, levaduras, plantas u otros organismos (por ejemplo, productos naturales), producirse químicamente (por ejemplo, moléculas pequeñas, incluyendo peptidomiméticos) o producirse de manera recombinante. Los compuestos de prueba contemplados por la presente invención incluyen moléculas orgánicas no peptídicas, péptidos, polipéptidos, peptidomiméticos, azúcares, hormonas y moléculas de ácido nucleico. En determinadas realizaciones, el agente de ensayo es una molécula orgánica pequeña que tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 2000 Daltons.

[0698] Los compuestos de prueba de la divulgación pueden proporcionarse como entidades individuales y discretas, o proporcionarse en bibliotecas de mayor complejidad, tal como las preparadas mediante química combinatoria. Estas bibliotecas pueden comprender, por ejemplo, alcoholes, haluros de alquilo, aminas, amidas, ésteres, aldehídos, éteres y otras clases de compuestos orgánicos. La presentación de los compuestos de prueba al sistema de prueba puede ser en forma aislada o como mezclas de compuestos, especialmente en las etapas de selección iniciales. Opcionalmente, los compuestos pueden derivatizarse opcionalmente con otros compuestos y tener grupos de derivatización que facilitan el aislamiento de los compuestos. Los ejemplos no limitantes de grupos de derivatización incluyen biotina, fluoresceína, digoxigenina, proteína fluorescente verde, isótopos, polihistidina, perlas magnéticas, glutatión S-transferasa (GST), reticulantes fotoactivables o cualquier combinación de los mismos.

[0700] En muchos programas de cribado de fármacos que prueban bibliotecas de compuestos y extractos naturales, son deseables ensayos de alto rendimiento con el fin de maximizar el número de compuestos estudiados en un periodo de tiempo dado. Los ensayos que se realizan en sistemas sin células, tales como los que pueden derivarse con proteínas purificadas o semipurificadas, a menudo se prefieren como cribados "primarios" porque pueden generarse para permitir el desarrollo rápido y la detección relativamente fácil de una alteración en una diana molecular que está mediada por un compuesto de prueba. Además, los efectos de la toxicidad celular o la biodisponibilidad del compuesto de prueba pueden ignorarse generalmente en el sistemain vitro, centrándose en cambio el ensayo principalmente en el efecto del fármaco sobre la diana molecular tal como puede manifestarse en una alteración de la afinidad de unión entre un complejo de heteromultímero de ALK7:ActRIIB y un compañero de unión (por ejemplo, activina C o E).

[0702] Simplemente para ilustrar, en un ensayo de cribado a modo de ejemplo de la presente divulgación, el compuesto de interés se pone en contacto con un heteromultímero de ALK7:ActRIIB aislado y purificado que normalmente puede unirse a activina C, según sea apropiado para la intención del ensayo. A la mezcla del compuesto y ALK7: El complejo de heteromultímero de ActRIIB se agrega luego a una composición que contiene activina C o E. La detección y cuantificación de complejos de ALK7: heteromultímero de ActRIIB-activina C o E proporciona un medio para determinar la eficacia del compuesto para inhibir (o potenciar) la formación del complejo entre el heteromultímero de ALK7:ActRIIB y activina C o E. La eficacia del compuesto puede evaluarse generando curvas de dosis-respuesta a partir de los datos obtenidos usando varias concentraciones del compuesto de prueba. Además, también puede realizarse un ensayo de control para proporcionar una referencia para comparación. Por ejemplo, en un ensayo de control, se añade activina C o E aislada y purificada a una composición que contiene el heteromultímero de ALK7:ActRIIB, y se cuantifica la formación de activina C o E de heteromultímero de ALK7:ActRIIB en ausencia del compuesto de prueba. Se entenderá que, en general, el orden en el que pueden mezclarse los reactivos puede variarse y puede mezclarse simultáneamente. Además, en lugar de proteínas purificadas, pueden usarse extractos y lisados celulares para producir un sistema de ensayo libre de células adecuado.

[0704] La unión de un complejo de heteromultímero de ALK7:ActRIIB a otra proteína (por ejemplo, activina C o E) puede detectarse por una variedad de técnicas. Por ejemplo, la modulación de la formación de complejos puede cuantificarse usando, por ejemplo, proteínas marcadas de manera detectable tales como un complejo heteromérico de ALK7:ActRIIB radiomarcado (por ejemplo,<32>P,<35>S,<14>C o<3>H), marcado de manera fluorescente (por ejemplo, FITC) o marcado enzimáticamente y/o un compañero de unión (por ejemplo, activina C o E), mediante inmunoensayo o mediante detección cromatográfica.

[0706] En determinadas realizaciones, la presente divulgación contempla el uso de ensayos de polarización de fluorescencia y ensayos de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) en la medición, ya sea directa o indirectamente, del grado de interacción entre un heteromultímero de ALK7:ActRIIB y una proteína de unión (por ejemplo, activina C o E). Además, otros modos de detección, tales como los basados en guías de onda ópticas (publicación PCT WO 96/26432 y patente estadounidense n.º 5.677.196), resonancia de plasmón superficial (SPR), sensores de carga superficial y sensores de fuerza superficial, son compatibles con muchas realizaciones de la divulgación.

[0708] Además, la presente divulgación contempla el uso de un ensayo de trampa de interacción, también conocido como el "ensayo de dos híbridos", para identificar agentes que interrumpen o potencian la interacción entre un heteromultímero de ALK7:ActRIIB y un compañero de unión (por ejemplo, activina C o E). Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 5.283.317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; e Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696). En una realización específica, la presente divulgación contempla el uso de sistemas de dos híbridos inversos para identificar compuestos (por ejemplo, moléculas pequeñas o péptidos) que disocian interacciones entre un heteromultímero de ALK7:ActRIIB y una proteína de unión (por ejemplo, activina C o E) [Vidal y Legrain, (1999) Nucleic Acids Res 27:919-29; Vidal y Legrain, (1999) Trends Biotechnol 17:374-81; y patente estadounidense n.º 5.525.490; 5.955.280; y 5.965.368].

[0710] En determinadas realizaciones, los compuestos de la invención se identifican por su capacidad para interactuar con un heteromultímero de ALK7:ActRIIB o activina C o E de la divulgación. La interacción entre el compuesto y un heteromultímero de ALK7:ActRIIB o activina C o E puede ser covalente o no covalente. Por ejemplo, dicha interacción puede identificarse a nivel de proteína usando métodos bioquímicosin vitro, incluyendo fotorreticulación, unión a ligando radiomarcado y cromatografía de afinidad [Jakoby WB et al. (1974) Methods in Enzymology 46:1]. En determinados casos, los compuestos pueden analizarse en un ensayo basado en mecanismos, tal como un ensayo para detectar compuestos que se unen a un heteromultímero de ALK7:ActRIIB o activina C o E. Esto puede incluir un evento de unión en fase sólida o en fase fluida. Alternativamente, el gen que codifica un heteromultímero de ALK7:ActRIIB o activina C o E se puede transfectar con un sistema indicador (por ejemplo, β-galactosidasa, luciferasa o proteína fluorescente verde) en una célula y cribarse frente a la biblioteca preferiblemente mediante cribado de alto rendimiento o con miembros individuales de la biblioteca. Pueden usarse otros ensayos de unión basados en mecanismos; por ejemplo, ensayos de unión que detectan cambios en la energía libre. Los ensayos de unión pueden realizarse con la diana fijada a un pocillo, perla o chip o capturada por un anticuerpo inmovilizado o resuelta por electroforesis capilar. Los compuestos unidos pueden detectarse normalmente usando puntos finales colorimétricos o fluorescencia o resonancia de plasmón superficial.

[0712] 4. Usos terapéuticos a modo de ejemplo

[0714] En determinadas realizaciones, un antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinaciones de dichos antagonistas, de la presente divulgación pueden usarse para tratar o prevenir una enfermedad o afección que está asociada con la actividad anormal de un ligando de unión a ALK7: ActRIIB. En general, en el presente documento se hace referencia a estas enfermedades, trastornos o afecciones como "ALK7:afecciones asociadas a ActRIIB" o "ALK7: trastornos asociados a ActRIIB". En determinadas realizaciones, la presente divulgación proporciona métodos para tratar o prevenir una afección asociada a ALK7:ActRIIB en un individuo mediante la administración a un individuo que lo necesita de una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heteromultímero de ALK7:ActRIIB tal como un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o combinaciones de dichos antagonistas, como se describe en el presente documento. Los términos “sujeto”, “individuo” o “paciente” son intercambiables a lo largo de la memoria descriptiva. Cualquiera de los antagonistas ALK7:ActRIIB de la divulgación puede emplearse potencialmente de forma individual o en combinación para los usos terapéuticos divulgados en el presente documento. Estos métodos están dirigidos particularmente a tratamientos terapéuticos y profilácticos de mamíferos que incluyen, por ejemplo, roedores, primates y seres humanos.

[0716] Como se usa en el presente documento, un agente terapéutico que “previene” un trastorno o afección se refiere a un compuesto que, en una muestra estadística, reduce la aparición del trastorno o afección en la muestra tratada con respecto a una muestra de control no tratada, o retrasa el inicio o reduce la gravedad de uno o más síntomas del trastorno o afección con respecto a la muestra de control no tratada. El término “tratar” tal como se usa en el presente documento incluye mejora o eliminación de la afección una vez que se ha establecido. En cualquier caso, la prevención o el tratamiento pueden discernirse en el diagnóstico proporcionado por un médico u otro proveedor de atención médica y el resultado previsto de la administración del agente terapéutico.

[0718] En general, el tratamiento o prevención de una enfermedad o afección como se describe en la presente divulgación se logra administrando un antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinaciones de dichos antagonistas, de la presente divulgación en una "cantidad eficaz". Una cantidad eficaz de un agente se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente de la presente divulgación puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del agente para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado.

[0720] Los riñones mantienen muchas características de la sangre, incluido el volumen, el equilibrio del pH, las concentraciones de electrolitos y la presión arterial, además de ser responsables de la filtración de toxinas y desechos. Estas funciones dependen de la intrincada estructura de las nefronas renales, el flujo constante de sangre a través de los diversos capilares del riñón y la regulación del riñón por señales del resto del cuerpo, incluidas las hormonas endocrinas. Los problemas con la función renal se manifiestan por mecanismos directos (por ejemplo, defectos genéticos, infección o exposición a toxinas) y por mecanismos indirectos que proceden progresivamente de factores estresantes a largo plazo como la hipertrofia y la hiperfiltración (a menudo como resultado de ataques más directos a la función renal). Debido al papel central del riñón en el mantenimiento de la sangre y la secreción de desechos, las manifestaciones de enfermedades asociadas al riñón son muchas y variadas; pueden revisarse en Harrison's Principles of Internal Medicine, 18ª edición, McGraw Hill, Nueva York, Parte 13, Cap.277-289.

[0722] Como se describe en el presente documento, un antagonista de ALK7:ActRIIB tuvo diversos efectos beneficiosos en un modelo de enfermedad renal. En particular, el tratamiento con un heteromultímero ALK7:ActRIIB redujo el daño tisular renal, la inflamación y la fibrosis en sujetos que tenían obstrucción ureteral unilateral. Estos datos indican que el antagonista de ALK7:ActRIIB puede usarse para tratar o prevenir la enfermedad renal, particularmente para tratar o prevenir diversas complicaciones (manifestaciones) de la enfermedad renal incluyendo, por ejemplo, daño tisular renal, inflamación y/o fibrosis.

[0724] Por lo tanto, los métodos de la presente invención pueden aplicarse a diversas enfermedades o afecciones asociadas con el riñón. Como se usa en el presente documento, “enfermedad o afección asociada a riñón” puede referirse a cualquier enfermedad, trastorno o afección que afecte a los riñones o al sistema renal. Los ejemplos de enfermedades o afecciones asociadas con el riñón incluyen, pero no se limitan a, enfermedades renales crónicas (o insuficiencia), enfermedades renales agudas (o insuficiencia), enfermedades renales primarias, enfermedades renales no diabéticas, glomerulonefritis, nefritis intersticial, enfermedades renales diabéticas, nefropatía diabética, glomeruloesclerosis, glomerulonefritis progresiva rápida, fibrosis renal, síndrome de Alport, nefritis IDDM, glomerulonefritis proliferativa mesangial, glomerulonefritis membranoproliferativa, glomerulonefritis creciente, fibrosis intersticial renal, glomeruloesclerosis segmentaria focal, nefropatía membranosa, enfermedad de cambio mínimo, glomerulonefritis progresiva rápida pauci-inmune, nefropatía IgA, enfermedad renal poliquística, enfermedad de Dent, nefrocitinosis, nefritis de Heymann, enfermedad renal poliquística autosómica dominante (adulta), recesiva autosómica (niñez) enfermedad renal poliquística, lesión renal aguda, síndrome nefrótico, isquemia renal, enfermedades o trastornos de podocitos, proteinuria, enfermedades glomerulares, glomerulonefritis membranosa, glomerulonefritis focal segmentaria, preeclampsia, eclampsia, lesiones renales, enfermedades vasculares del colágeno, proteinuria ortostática benigna (postural), nefropatía por IgM, nefropatía membranosa, sarcoidosis, diabetes mellitus, daño renal debido a medicamentos, enfermedad de Fabry, aminoaciduria, síndrome de Fanconi, nefroesclerosis hipertensiva, nefritis intersticial, enfermedad de células falciformes, hemoglobinuria, mioglobinuria, granulomatosis de Wegener, enfermedad de almacenamiento de glucógeno tipo 1, enfermedad renal crónica, insuficiencia renal crónica, baja tasa de filtración glomerular (GFR), nefroangiosclerosis, nefritis lúpica, ANCA-positiva glomerulonefritis media luna pauci-inmune, nefropatía crónica por aloinjerto, nefrotoxicidad, toxicidad renal, necrosis renal, daño renal, lesión glomerular y tubular, disfunción renal, síndrome nefrítico, insuficiencia renal aguda, insuficiencia renal crónica, disfunción tubárica proximal, rechazo agudo de trasplante de riñón, rechazo crónico de trasplante de riñón, glomerulonefritis mesangioproliferativa no IgA, glomerulonefritis postinfecciosa, vasculitis con afectación renal de cualquier tipo, cualquier enfermedad renal hereditaria, cualquier nefritis intersticial, insuficiencia de trasplante renal, cáncer de riñón, enfermedad renal asociada con otras afecciones (por ejemplo, hipertensión, diabetes y enfermedad autoinmune), enfermedad de Dent, nefrocitinosis, nefritis de Heymann, enfermedad renal primaria, una glomerulopatía colapsante, una enfermedad de depósito denso, una glomerulonefritis asociada a crioglobulinemia, una enfermedad de Henoch-Schonlein, una glomerulonefritis postinfecciosa, una endocarditis bacteriana, una poliangeítis microscópica, un síndrome de Churg-Strauss, una glomerulonefritis mediada por anticuerpos anti-GBM, amiloidosis, una enfermedad de depósito de inmunoglobulina monoclonal, una glomerulonefritis fibrilar, una glomerulopatía inmunotactoide, una lesión tubular isquémica, una nefritis tubulo-intersticial inducida por medicamentos, una nefritis tubulo-intersticial tóxica, una nefritis tubulo-intersticial infecciosa, una pielonefritis bacteriana, una nefritis tubulo-intersticial infecciosa viral que resulta de una infección por poliomavirus o una infección por VIH, una enfermedad tubulo-intersticial inducida metabólicamente, una enfermedad conectiva mixta, una nefropatía enyes, un cristal nefropatía que puede resultar de la deposición de cristales inducida por urato u oxalato o fármaco, un rechazo de aloinjerto tubulo-intersticial celular agudo, una enfermedad infiltrante tumoral que resulta de un linfoma o una enfermedad linfoproliferativa postrasplante, una enfermedad obstructiva del riñón, enfermedad vascular, una microangiopatía trombótica, una nefroangioesclerosis, una enfermedad ateroembólica, una enfermedad mixta del tejido conjuntivo, una poliarteritis nodosa, una enfermedad vascular inducida por inhibidor de calcineurina, un rechazo de aloinjerto vascular celular agudo, un rechazo de aloinjerto humoral agudo, disminución temprana de la función renal (ERFD), enfermedad renal en etapa terminal (ESRD), trombosis de la vena renal, necrosis tubular aguda, nefritis intersticial aguda, enfermedad renal crónica establecida, estenosis de la arteria renal, nefropatía isquémica, uremia, nefritis tubulointersticial crónica inducida por fármacos y toxinas, nefropatía por reflujo, cálculos renales, síndrome de Goodpasture, anemia normocítica normocrómica, anemia renal, enfermedad renal crónica diabética, enfermedad relacionada con IgG4, síndrome de von Hippel-Lindau, esclerosis tuberosa, nefrófisis, enfermedad renal quística medular, carcinoma de células renales, adenocarcinoma, nefroblastoma, linfoma, leucemia, trastorno de hiposialilación, nefropatía crónica por ciclosporina, lesión por reperfusión renal, displasia renal, azotemia, oclusión arterial bilateral, nefropatía aguda por ácido úrico, hipovolemia, uropatía obstructiva bilateral aguda, nefropatía hipercalcémica, síndrome urémico hemolítico, retención, nefroesclerosis maligna, glomeruloesclerosis posparto, esclerodermia, enfermedad anti-GBM no Goodpasture, poliarteritis nodosa microscópica, granulomatosis alérgica, nefritis por radiación aguda, glomerulonefritis posestreptocócica, macroglobulinemia de Waldenstrom, nefropatía analgésica, fístula arteriovenosa, injerto arteriovenoso, diálisis, riñón ectópico, riñón de esponja medular, osteodistrofia renal, riñón solitario, hidronefrosis, microalbuminuria, uremia, hematuria, hiperlipidemia, hipoalbuminemia, lipiduria, acidosis, hiperpotasemia y edema.

[0726] En algunas realizaciones, un antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinaciones de dichos antagonistas, de la presente divulgación (por ejemplo, heteromultímeros ALK7:ActRIIB tales como un heterodímero de ALK7:ActRIIB) puede usarse para tratar o prevenir la enfermedad renal crónica, opcionalmente en combinación con una o más terapias de apoyo para tratar la enfermedad renal crónica. En algunas realizaciones, un antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinaciones de dichos antagonistas, de la presente divulgación (por ejemplo, heteromultímeros ALK7:ActRIIB tales como un heterodímero de ALK7:ActRIIB) puede usarse para tratar o prevenir una o más complicaciones (síntomas o manifestaciones) de enfermedad renal crónica (por ejemplo, daño tisular, inflamación y/o fibrosis), opcionalmente en combinación con una o más terapias de apoyo para tratar enfermedad renal crónica. En algunas realizaciones, un antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinaciones de tales antagonistas, de la presente divulgación (por ejemplo, heteromultímeros ALK7:ActRIIB tales como un heterodímero de ALK7:ActRIIB) puede usarse para tratar o prevenir la insuficiencia renal en fase terminal, opcionalmente en combinación con una o más terapias de apoyo para tratar la enfermedad renal en fase terminal. La enfermedad renal crónica (ERC), también conocida como enfermedad renal crónica, es una pérdida progresiva de la función renal durante un período de meses o años. Los síntomas de empeoramiento de la función renal pueden incluir sentirse generalmente mal y experimentar una reducción del apetito. A menudo, la enfermedad renal crónica se diagnostica como resultado de la detección de personas que se sabe que están en riesgo de problemas renales, como aquellos con presión arterial alta o diabetes y aquellos con un pariente de sangre con ERC. Esta enfermedad también puede identificarse cuando conduce a una de sus complicaciones reconocidas, como enfermedad cardiovascular, anemia o pericarditis. Las pautas profesionales recientes clasifican la gravedad de la ERC en cinco etapas, siendo la etapa 1 la más leve y generalmente causando pocos síntomas y siendo la etapa 5 una enfermedad grave con poca esperanza de vida si no se trata. La ERC en estadio 5 a menudo se denomina enfermedad renal terminal, enfermedad renal terminal o insuficiencia renal terminal, y es en gran medida sinónimo de los términos ahora obsoletos insuficiencia renal crónica o insuficiencia renal crónica; y generalmente significa que el paciente requiere terapia de reemplazo renal, que puede implicar una forma de diálisis, pero idealmente constituye un trasplante de riñón. La ERC inicialmente no tiene síntomas específicos y generalmente solo se detecta como un aumento en la creatinina o proteína sérica en la orina. A medida que la función renal disminuye, pueden manifestarse varios síntomas como se describe a continuación. La presión arterial puede aumentar debido a la sobrecarga de líquidos y la producción de hormonas vasoactivas creadas por el riñón a través del sistema renina-angiotensina, lo que aumenta el riesgo de desarrollar hipertensión y/o sufrir insuficiencia cardíaca congestiva. La urea puede acumularse, lo que lleva a la azotemia y, en última instancia, a la uremia (síntomas que van desde el letargo hasta la pericarditis y la encefalopatía). Debido a su alta circulación sistémica, la urea se excreta en el sudor ecrino en altas concentraciones y cristaliza en la piel a medida que el sudor se evapora ("escarcha urémica"). El potasio puede acumularse en la sangre (hiperpotasemia con una serie de síntomas que incluyen malestar y arritmias cardíacas potencialmente mortales). La hiperpotasemia generalmente no se desarrolla hasta que la tasa de filtración glomerular cae a menos de 20-25 ml/min/1,73 m2, momento en el que los riñones tienen una capacidad disminuida para excretar potasio. La hiperpotasemia en la ERC puede verse exacerbada por la acidemia (que conduce al cambio extracelular del potasio) y por la falta de insulina. La síntesis de eritropoyetina puede disminuir causando anemia. Pueden producirse síntomas de sobrecarga de volumen de líquido, que van desde edema leve hasta edema pulmonar potencialmente mortal. La hiperfosfatemia, debido a la reducción de la excreción de fosfato, puede ocurrir generalmente después de la disminución de la filtración glomerular. La hiperfosfatemia se asocia con un mayor riesgo cardiovascular, siendo un estímulo directo para la calcificación vascular. Puede manifestarse hipocalcemia, que generalmente está causada por la estimulación del factor de crecimiento de fibroblastos-23. Los osteocitos son responsables del aumento de la producción de FGF23, que es un potente inhibidor de la enzima 1-alfa-hidroxilasa (responsable de la conversión de 25-hidroxicolecalciferol en 1,25 dihidroxivitamina D3). Más tarde, esto progresa a hiperparatiroidismo secundario, osteodistrofia renal y calcificación vascular que deteriora aún más la función cardíaca. La acidosis metabólica (debido a la acumulación de sulfatos, fosfatos, ácido úrico, etc.) puede ocurrir y causar una actividad enzimática alterada por el exceso de ácido que actúa sobre las enzimas; y también una mayor excitabilidad de las membranas cardíacas y neuronales por la promoción de hiperpotasemia debido al exceso de ácido (acidemia). La acidosis también se debe a la disminución de la capacidad para generar suficiente amoníaco a partir de las células del túbulo proximal. La anemia por deficiencia de hierro, que aumenta en prevalencia a medida que disminuye la función renal, es especialmente prevalente en aquellos que requieren hemodiálisis. Es de causa multifactorial, pero incluye aumento de la inflamación, reducción de la eritropoyetina e hiperuricemia que conduce a la supresión de la médula ósea. Las personas con ERC sufren de aterosclerosis acelerada y son más propensas a desarrollar enfermedades cardiovasculares que la población general. Los pacientes que padecen ERC y enfermedades cardiovasculares tienden a tener un pronóstico significativamente peor que los que solo padecen esta última.

[0728] En otra realización, puede usarse un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o combinaciones de dichos antagonistas, en pacientes con trastorno óseo mineral de enfermedad renal crónica (ERC-MBD), un síndrome amplio de trastornos esqueléticos, cardiovasculares y mineral-metabólicos interrelacionados que surgen de enfermedad renal. La CKD-MBD abarca diversas patologías esqueléticas a menudo denominadas osteodistrofia renal (ROD), que es una realización preferida para el tratamiento con un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB) o combinaciones de dichos antagonistas. Dependiendo de la contribución relativa de diferentes factores patógenos, ROD se manifiesta como diversos patrones patológicos de remodelación ósea (Hruska et al., 2008, Chronic kidney disease mineral bone disorder (CKD-MBD); en Rosen et al. (ed) Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism, 7a ed. American Society for Bone and Mineral Research, Washington D.C., págs. 343-349). En un extremo del espectro se encuentra ROD con osteodistrofia urémica y baja renovación ósea, caracterizada por un bajo número de sitios de remodelación activos, formación ósea profundamente suprimida y baja reabsorción ósea. En el otro extremo se encuentra ROD con hiperparatiroidismo, alto recambio óseo y osteítis fibrosa. Dado que un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o combinaciones de dichos antagonistas, pueden ejercer efectos tanto anabólicos como antirresortivos, estos agentes pueden ser útiles en pacientes en todo el espectro de patología de ROD.

[0730] En otras realizaciones, un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o combinaciones de dichos antagonistas, puede usarse para regular el contenido de grasa corporal en un animal y para tratar o prevenir afecciones relacionadas con el mismo, y particularmente, afecciones que comprometen la salud relacionadas con el mismo. De acuerdo con la presente divulgación, regular (controlar) el peso corporal puede referirse a reducir o aumentar el peso corporal, reducir o aumentar la tasa de aumento de peso, o aumentar o reducir la tasa de pérdida de peso, y también incluye mantener activamente, o no cambiar significativamente el peso corporal (por ejemplo, frente a influencias externas o internas que de otro modo pueden aumentar o disminuir el peso corporal). Una realización de la presente divulgación se refiere a la regulación del peso corporal mediante la administración a un animal (por ejemplo, un ser humano) que lo necesite de un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o combinaciones de dichos antagonistas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se puede usar un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o combinaciones de dichos antagonistas, para tratar o prevenir un trastorno o afección seleccionado de obesidad (por ejemplo, obesidad abdominal); sobrepeso; resistencia a la insulina; síndrome metabólico y otras enfermedades o afecciones metabólicas; un trastorno lipídico tal como, niveles bajos de HDL, niveles altos de LDL, hiperlipidemia, hipertrigliceridemia o dislipidemia; aberraciones de lipoproteínas; disminución de triglicéridos; inflamación (por ejemplo, inflamación del hígado y/o inflamación del tejido adiposo), enfermedad del hígado graso; enfermedad del hígado graso no alcohólico; hiperglucemia; tolerancia alterada a la glucosa (IGT); hiperinsulinemia; colesterol alto (por ejemplo, niveles altos de LDL e hipercolesterolemia); enfermedad cardiovascular tal como, enfermedad cardíaca incluyendo enfermedad cardíaca coronaria, insuficiencia cardíaca congestiva, accidente cerebrovascular, enfermedad vascular periférica, aterosclerosis; arteriosclerosis e hipertensión; Síndrome X; reestenosis vascular; neuropatía; retinopatía; enfermedad neurodegenerativa; disfunción endotelial, disfunción respiratoria; pancreatitis; síndrome de ovario poliquístico; niveles elevados de ácido úrico; hemocromatosis (sobrecarga de hierro); acantosis nigricans (parches oscuros en la piel); o cáncer (por ejemplo, cáncer de ovario, mama, endometrio y colon); u otros trastornos/afecciones asociados con una o más de las enfermedades o afecciones anteriores. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección tratada usando un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o combinaciones de dichos antagonistas, se asocia con sobrepeso (por ejemplo, IMC de ≥25 kg/m2), o con demasiada grasa corporal.

[0731] En una realización, la divulgación proporciona un método para reducir el peso corporal que comprende administrar a un sujeto que desea reducir el peso corporal, o que lo necesita, una cantidad eficaz de un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o combinaciones de dichos antagonistas. En algunas realizaciones, el sujeto tiene sobrepeso (por ejemplo, preobeso). En algunas realizaciones, el sujeto tiene un índice de masa corporal (IMC) de 25 kg/m<2>o mayor. En realizaciones adicionales, el sujeto tiene un IMC de 25 kg/m<2>a 29,9 kg/m<2>, 30 kg/m<2>a 39,9 kg/m<2>, 25 kg/m<2>a 39,9 kg/m<2>, o 25 kg/m<2>a 50 kg/m<2>. En algunas realizaciones, el sujeto es obeso. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un IMC de 30 kg/m<2>o mayor (por ejemplo, de 30 a 39,9 kg/m<2>o de 30 kg/m<2>a 50 kg/m<2>). En algunas realizaciones, el sujeto es obeso mórbido. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un IMC de 40 kg/m<2>o mayor. En realizaciones adicionales, el sujeto tiene un IMC de 40 kg/m<2>a 45 kg/m<2>, o de 40 kg/m<2>a 50 kg/m<2>. En algunas realizaciones, el sujeto tiene obesidad central (por ejemplo, exceso de adiposidad en la región abdominal, incluyendo grasa abdominal y/o grasa visceral). En algunas realizaciones, el sujeto tiene una relación de circunferencia cintura/cadera (WHR) de 0,85 o mayor. En algunas realizaciones, el sujeto tiene obesidad periférica (por ejemplo, exceso de adiposidad en las caderas). En algunas realizaciones, el sujeto tiene diabetes mellitus tipo 2. El antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinación de antagonistas, puede administrarse solo o como terapia de combinación de otro tipo de terapia de apoyo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la terapia de apoyo es dieta y/o ejercicio.

[0733] En una realización, la divulgación proporciona un método para reducir el aumento de peso que comprende administrar a un sujeto que desea reducir el aumento de peso, o que lo necesita, una cantidad eficaz de un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o combinación de tales antagonistas. En algunas realizaciones, el sujeto tiene sobrepeso (por ejemplo, preobeso). En algunas realizaciones, el sujeto tiene un IMC de 25 kg/m<2>o mayor. En realizaciones adicionales, el sujeto tiene un IMC de 25 kg/m<2>a 29,9 kg/m<2>, 30 kg/m<2>a 39,9 kg/m<2>, 25 kg/m<2>a 39,9 kg/m<2>, o 25 kg/m<2>a 50 kg/m<2>. En algunas realizaciones, el sujeto es obeso. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un IMC de 30 kg/m<2>o mayor (por ejemplo, de 30 a 39,9 kg/m<2>o de 30 kg/m<2>a 50 kg/m<2>). En algunas realizaciones, el sujeto es obeso mórbido. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un IMC de 40 kg/m<2>o mayor. En realizaciones adicionales, el sujeto tiene un IMC de 40 kg/m<2>a 45 kg/m<2>, o de 40 kg/m<2>a 50 kg/m<2>. En algunas realizaciones, el sujeto tiene diabetes mellitus tipo 2.

[0735] También se proporciona un método de tratamiento o prevención de una enfermedad o afección asociada con exceso de peso corporal, que comprende administrar a un sujeto que necesita tratamiento o prevención, una cantidad eficaz de un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o combinación de dichos antagonistas. En una realización, la enfermedad o afección tratada o prevenida es la obesidad. En una realización, la enfermedad o afección tratada o prevenida es resistencia a la insulina. En una realización, la enfermedad o afección tratada o prevenida es un miembro seleccionado del grupo que consiste en: dislipidemia, hiperlipidemia (nivel de colesterol total >240 mg/dl), hipercolesterolemia (por ejemplo, nivel de colesterol total de >200 mg/dl, >220 mg/dl, >240 mg/dl, >250 mg/dl o >275 mg/dl), nivel sérico bajo de HDL (por ejemplo, <40 mg/dl, <45 mg/dl o <50 mg/dl), nivel sérico alto de LDL (por ejemplo, ≥ 100 mg/dl, ≥ 130 mg/dl, ≥ 160 mg/dl o ≥ 190 mg/dl) e hipertrigliceridemia (por ejemplo, un nivel de TG en ayunas de ≥ 150 mg/dl, ≥ 175 mg/dl, ≥ 200 mg/dl, ≥ 300 mg/dl, ≥ 400 mg/dl o ≥ 499 mg/dl). En determinados casos, el tratamiento con antagonistas ALK7:ActRIIB es un complemento de la dieta y/o el ejercicio.

[0737] En otra realización, la divulgación proporciona un método para reducir el peso corporal en un sujeto que tiene sobrepeso. El método incluye administrar a un sujeto con sobrepeso una cantidad eficaz de un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o una combinación de dichos antagonistas. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un índice de masa corporal (IMC) de 25 kg/m<2>o mayor. En realizaciones adicionales, el sujeto tiene un IMC de 25 kg/m<2>a 29,9 kg/m<2>, 30 kg/m<2>a 39,9 kg/m<2>, 25 kg/m<2>a 39,9 kg/m<2>, o 25 kg/m<2>a 50 kg/m<2>, o 27 a 40 kg/m<2>. En algunas realizaciones, el sujeto es obeso. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un IMC de 30 kg/m<2>o mayor (por ejemplo, de 30 a 39,9 kg/m<2>o de 30 kg/m<2>a 50 kg/m<2>). La proteína de unión a ALK7 se administra sola o como terapia de combinación. En algunas realizaciones, el tratamiento con antagonista de ALK7:ActRIIB es un complemento de la dieta y/o el ejercicio.

[0739] En una realización, la divulgación proporciona un método para reducir el peso corporal en un sujeto obeso. El método incluye administrar al sujeto una cantidad eficaz de un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o una combinación de dichos antagonistas. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un IMC de 30 kg/m<2>o mayor (por ejemplo, de 30 a 39,9 kg/m<2>o de 30 kg/m<2>a 50 kg/m<2>). En algunas realizaciones, el sujeto tiene un IMC de 40 kg/m<2>o mayor. En algunas realizaciones, el sujeto tiene obesidad central (por ejemplo, exceso de adiposidad en la región abdominal, incluyendo grasa abdominal y/o grasa visceral). En algunas realizaciones, el sujeto tiene una relación de circunferencia cintura/cadera (WHR) de 0,85 o mayor. En algunas realizaciones, el sujeto tiene obesidad periférica (por ejemplo, exceso de adiposidad en las caderas). En algunas realizaciones, el tratamiento con antagonista de ALK7:ActRIIB es un complemento de la dieta y/o el ejercicio.

[0741] En otra realización, la divulgación proporciona un método para tratar y/o mejorar la obesidad o una enfermedad o afección asociada con la obesidad, que comprende administrar a un sujeto obeso, una cantidad eficaz de un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o combinación de dichos antagonistas. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un IMC de 30 kg/m<2>o mayor. En realizaciones adicionales, el sujeto tiene un IMC de 30 a 39,9 kg/m<2>o de 30 kg/m<2>a 50 kg/m<2>. En algunas realizaciones, el sujeto es obeso mórbido. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un IMC corporal de 40 kg/m<2>o mayor. En realizaciones adicionales, el sujeto tiene un IMC de 40 kg/m<2>a 45 kg/m<2>, o de 40 kg/m<2>a 50 kg/m<2>En algunas realizaciones, el sujeto tiene diabetes mellitus tipo 2. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un IMC de 30 kg/m<2>o mayor (por ejemplo, de 30 a 39,9 kg/m<2>). En algunas realizaciones, el sujeto tiene un IMC de al menos 40 kg/m<2>. En algunas realizaciones, el sujeto tiene obesidad central (por ejemplo, exceso de adiposidad en la región abdominal, incluyendo grasa abdominal y/o grasa visceral). En algunas realizaciones, el sujeto tiene una relación de circunferencia cintura/cadera (WHR) de 0,85 o mayor. En algunas realizaciones, el sujeto tiene obesidad periférica (por ejemplo, exceso de adiposidad en las caderas). En algunas realizaciones, el tratamiento con antagonista de ALK7:ActRIIB es un complemento de la dieta y/o el ejercicio.

[0743] También se proporciona un método de tratamiento o prevención de una enfermedad o afección asociada con la obesidad, que comprende administrar a un sujeto que necesita tratamiento o prevención, una cantidad eficaz de un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o combinación de dichos antagonistas. En una realización, la enfermedad o afección tratada o prevenida es un miembro seleccionado del grupo que consiste en: dislipidemia, hiperlipidemia (nivel de colesterol total >240 mg/dl), hipercolesterolemia (por ejemplo, nivel de colesterol total de >200 mg/dl, >220 mg/dl, >240 mg/dl, >250 mg/dl o >275 mg/dl), nivel sérico bajo de HDL (por ejemplo, <40 mg/dl, <45 mg/dl o <50 mg/dl), nivel sérico alto de LDL (por ejemplo, ≥ 100 mg/dl, ≥ 130 mg/dl, ≥ 160 mg/dl o ≥ 190 mg/dl) e hipertrigliceridemia (por ejemplo, un nivel de TG en ayunas de ≥ 150 mg/dl, ≥ 175 mg/dl, ≥ 200 mg/dl, ≥ 300 mg/dl, ≥ 400 mg/dl o ≥ 499 mg/dl). En una realización, la enfermedad o afección tratada o prevenida es una enfermedad cardiovascular. En una realización adicional, la enfermedad o afección tratada o prevenida es hipertensión (presión arterial alta), infarto de miocardio, enfermedad arterial periférica, disfunción de vasorregulación, arteriosclerosis, insuficiencia cardíaca congestiva, aterosclerosis, enfermedad cardíaca coronaria o enfermedad microvascular. En una realización, la enfermedad o afección tratada o prevenida es una enfermedad hepática. En una realización, la enfermedad o afección hepática tratada o prevenida es NAFLD. En una realización, la enfermedad hepática es hígado graso. En una realización, la enfermedad hepática es NASH. En otra realización, la enfermedad o afección tratada o prevenida es un miembro seleccionado del grupo: esteatohepatitis, esteatosis, fibrosis y/o cirrosis. En determinados casos, el tratamiento con antagonistas de ALK7:ActRIIB es un complemento de la dieta y/o el ejercicio.

[0745] En otra realización, la divulgación proporciona un método para tratar, mejorar y/o prevenir la diabetes mellitus tipo 2 o una enfermedad o afección asociada con la diabetes que comprende administrar a un sujeto que tiene diabetes mellitus tipo 2, o en riesgo de desarrollar diabetes tipo 2, una cantidad eficaz de un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o combinación de dichos antagonistas. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un índice de masa corporal IMC de 30 kg/m<2>o mayor (por ejemplo, de 30 a 39,9 kg/m<2>). En algunas realizaciones, el sujeto tiene un IMC de al menos 40 kg/m<2>. En algunas realizaciones, el sujeto tiene obesidad central (por ejemplo, exceso de adiposidad en la región abdominal, incluyendo grasa abdominal y/o grasa visceral). En algunas realizaciones, el sujeto tiene una WHR de 0,85 o mayor. En algunas realizaciones, el sujeto tiene obesidad periférica (por ejemplo, exceso de adiposidad en las caderas). En algunas realizaciones, el tratamiento con antagonista de ALK7:ActRIIB es un complemento de la dieta y/o el ejercicio.

[0747] También se proporciona un método para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o afección asociada con diabetes, que comprende administrar a un sujeto que tiene diabetes, una cantidad eficaz de un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o combinación de dichos antagonistas. En una realización, la enfermedad o afección tratada o prevenida es un miembro seleccionado del grupo que consiste en: dislipidemia, hiperlipidemia (nivel de colesterol total >240 mg/dl), hipercolesterolemia (por ejemplo, nivel de colesterol total de >200 mg/dl, >220 mg/dl, >240 mg/dl, >250 mg/dl o >275 mg/dl), nivel sérico bajo de HDL (por ejemplo, <40 mg/dl, <45 mg/dl o <50 mg/dl), nivel sérico alto de LDL (por ejemplo, ≥ 100 mg/dl, ≥ 130 mg/dl, ≥ 160 mg/dl o ≥ 190 mg/dl) e hipertrigliceridemia (por ejemplo, un nivel de TG en ayunas de ≥ 150 mg/dl, ≥ 175 mg/dl, ≥ 200 mg/dl, ≥ 300 mg/dl, ≥ 400 mg/dl o ≥ 499 mg/dl). En una realización, la enfermedad o afección tratada o prevenida es una enfermedad cardiovascular. En una realización adicional, la enfermedad o afección tratada o prevenida es hipertensión (presión arterial alta), infarto de miocardio, enfermedad arterial periférica, disfunción de vasorregulación o arteriosclerosis. En una realización, la enfermedad o afección tratada o prevenida es una enfermedad hepática. En otra realización, la enfermedad o afección tratada o prevenida es un miembro seleccionado del grupo: enfermedad del hígado graso, esteatohepatitis, esteatosis y/o cirrosis. En una realización, la enfermedad o afección tratada o prevenida es un miembro seleccionado del grupo que consiste en: cataratas, apnea obstructiva del sueño, flebitis, gota, osteoartritis, enfermedad de la vesícula biliar y colesterol alto. En determinados casos, el tratamiento con antagonistas de ALK7:ActRIIB es un complemento de la dieta y/o el ejercicio.

[0749] La divulgación también proporciona un método para mejorar el perfil de lípidos en sangre en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto que necesita dicho tratamiento una cantidad eficaz de un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o combinación de dichos antagonistas. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para reducir los niveles de colesterol LDL o aumentar los niveles de colesterol HDL. En una realización, el sujeto tiene dislipidemia. En otra realización, el sujeto tiene lípidos séricos elevados (por ejemplo, colesterol (hipercolesterolemia) y/o triglicéridos (por ejemplo, hipertrigliceridemia). En una realización, el sujeto tiene un LDL-C ≥ 100 mg/dl, ≥ 130 mg/dl o ≥ 160 mg/dl). En una realización el sujeto tiene un TG ≥ 150 mg/dl, ≥ 160 mg/dl, ≥ 170 mg/dl). En una realización, el sujeto tiene niveles de insulina en plasma elevados (hiperinsulinemia; por ejemplo, el nivel de insulina en ayunas de >20 ug/ml puede exceder 100). En algunas realizaciones, el sujeto tiene diabetes tipo II.

[0751] De acuerdo con una realización, la divulgación proporciona un método de tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno metabólico o una afección asociada con una enfermedad o trastorno metabólico, que comprende administrar un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o combinación de dichos antagonistas, a un sujeto que lo necesita. En una realización, la enfermedad, trastorno o afección metabólica tratada es hiperglucemia (por ejemplo, > 130 mg/dL en estado de ayuno o después de la administración de glucosa durante una prueba de tolerancia a la glucosa oral). En una realización, la enfermedad, trastorno o afección metabólica tratada es una enfermedad, trastorno o afección del metabolismo lipídico. En una realización, la enfermedad, trastorno o afección metabólica tratada es dislipidemia. En una realización adicional, la enfermedad, trastorno o afección del metabolismo lipídico es un miembro seleccionado de: niveles bajos de HDL, niveles altos de LDL, niveles altos de triglicéridos, hiperlipidemia y una aberración de lipoproteínas. En una realización, el sujeto tiene un nivel de colesterol total de >200 mg/dl, >220 mg/dl, >240 mg/dl, >250 mg/dl o >275 mg/dl. En una realización, el sujeto tiene un nivel sérico de HDL de <40 mg/dL, <45 mg/dL o <50 mg/dL). En una realización, el sujeto tiene un nivel sérico de LDL ≥ 100 mg/dl, ≥ 130 mg/dl, ≥ 160 mg/dl o ≥ 190 mg/dl. En una realización, el sujeto tiene un nivel de TG en ayunas de ≥ 150 mg/dl, ≥ 175 mg/dl, ≥ 200 mg/dl, ≥ 300 mg/dl, ≥ 400 mg/dl o ≥ 499 mg/dl. En una realización, la enfermedad, trastorno o afección metabólica tratada es una enfermedad, trastorno o afección del metabolismo de la glucosa. En una realización adicional, la enfermedad, trastorno o afección del metabolismo de la glucosa es un miembro seleccionado de: intolerancia a la glucosa, resistencia a la insulina, tolerancia alterada a la glucosa (IGT), glucosa en ayunas alterada (IFG). En una realización, la enfermedad, trastorno o afección metabólica tratada es un miembro seleccionado del grupo que consiste en: niveles altos de ácido úrico, NAFLD, hígado graso, NASH y síndrome de ovario poliquístico. En una realización, el sujeto tratado tiene hiperinsulinemia. En una realización, el sujeto tratado es obeso (por ejemplo, el sujeto tiene obesidad abdominal). En otra realización, el sujeto tratado tiene diabetes de tipo II.

[0753] El síndrome metabólico es una afección que implica un conjunto de trastornos que aumentan el riesgo de enfermedad cardíaca. Los principales componentes del síndrome metabólico son el exceso de peso, los parámetros cardiovasculares (presión arterial alta, dislipidemia, niveles altos de triglicéridos y/o niveles bajos de HDL en la sangre), aterosclerosis, diabetes y/o resistencia a la insulina. Un sujeto que tiene varios de estos componentes, es decir, el síndrome metabólico, es altamente propenso a la enfermedad cardíaca, aunque cada componente es un factor de riesgo. La divulgación también proporciona un método para tratar o prevenir 1, 2, 3 o más de los componentes anteriores del síndrome metabólico, que comprende administrar a un sujeto que necesita tratamiento una cantidad eficaz de un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o combinación de dichos antagonistas.

[0755] Además, se proporciona un procedimiento de tratamiento, prevención o mejora de una enfermedad o afección cardiovascular, que comprende administrar un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o una combinación de dichos antagonistas, a un sujeto que lo necesita. En una realización, la enfermedad o afección cardiovascular tratada, prevenida o mejorada es aterosclerosis. En una realización, la enfermedad o afección cardiovascular tratada, prevenida o mejorada es hipertensión (por ejemplo, presión arterial >130/80 mmHg o >140/90 mmHg, en un estado de reposo. En una realización, la enfermedad cardiovascular es aterosclerosis (enfermedad coronaria).

[0757] En una realización, la divulgación proporciona un método para tratar y/o mejorar una enfermedad o afección hepática inflamatoria que comprende administrar un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o una combinación de dichos antagonistas, a un sujeto que lo necesita. En una realización, la enfermedad o afección es NAFLD. En una realización adicional, la enfermedad o afección es hígado graso. En una realización adicional, la enfermedad o afección es esteatosis (por ejemplo, esteatohepatitis no alcohólica (NASH)). En una realización adicional, la enfermedad o afección es enfermedad de hígado graso alcohólico.

[0759] Esta divulgación también proporciona un método para mejorar el control glucémico, que comprende administrar a un sujeto que necesita tratamiento una cantidad eficaz de un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB). En una realización, el sujeto al que se le administra tiene un nivel de azúcar en sangre en ayunas de >130, > 135, > 140, > 145 o >150 mg/dL. En una realización, el sujeto al que se le administra tiene un nivel de azúcar en sangre posprandial de >180, > 185, > 190, >195 o >200 mg/dL 2 horas después de comer. En determinados casos, el tratamiento con antagonistas de ALK7:ActRIIB es un complemento de la dieta y/o el ejercicio. La administración también puede reducir el peso corporal o tratar la obesidad. En determinados casos, el sujeto tiene diabetes mellitus tipo 2. En determinados casos, el sujeto tiene un IMC de 27 a 40 kg/m2. En determinados casos, el sujeto tiene un IMC de 30 a 39,9 kg/m2. En determinados casos, el sujeto tiene un IMC de al menos 40. En determinados casos, el sujeto tiene sobrepeso. En determinados casos, el sujeto es obeso. Una mejora en el control glucémico puede evaluarse usando técnicas conocidas en la técnica tales como una prueba de comidas mixtas.

[0761] La divulgación también proporciona composiciones y métodos para tratar, prevenir o mejorar la hiperglucemia o una afección asociada con la hiperglucemia en un sujeto que comprende administrar a un sujeto que necesita dicho tratamiento una cantidad eficaz de un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB). En una realización, el sujeto al que se le administra tiene un nivel de azúcar en sangre en ayunas de >130, > 135, > 140, > 145 o >150 mg/dL. En una realización, el sujeto al que se le administra tiene un nivel de azúcar en sangre posprandial de >180, > 185, > 190, >195 o >200 mg/dL 2 horas después de comer. En una realización, el resultado del tratamiento, prevención o mejora es un miembro seleccionado del grupo que consiste en: una disminución en los niveles séricos de glucosa, una disminución en los niveles séricos de triglicéridos, una disminución en los niveles séricos de insulina y/o una disminución en los niveles séricos de ácidos grasos no esterificados, en comparación con los niveles séricos en el sujeto antes del tratamiento. En una realización, el resultado del tratamiento, prevención o mejora es un aumento de la temperatura corporal de aproximadamente 0,4 °C a 1 °C en comparación con la temperatura corporal del sujeto antes del tratamiento. En algunas realizaciones, el tratamiento con ALK7:ActRIIB también reduce el peso corporal del sujeto.

[0763] En otra realización, la divulgación proporciona un método para disminuir los niveles de insulina en plasma en un sujeto, que comprende administrar una cantidad eficaz de un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), a un sujeto que necesita dicho tratamiento. En una realización, el sujeto tiene un nivel de azúcar en sangre en ayunas de >130, > 135, > 140, >145 o >150 mg/dL. En una realización, el sujeto tiene un nivel de azúcar en sangre posprandial de >180, >185, >190, >195 o >200 mg/dL 2 horas después de comer. En una realización, el sujeto tiene sobrepeso. En una realización, el sujeto es obeso. En otra realización, el sujeto tiene diabetes de tipo 2.

[0765] La divulgación también proporciona composiciones y métodos para tratar, prevenir o mejorar la hiperglucemia o una afección asociada con la hiperglucemia en un sujeto que comprende administrar a un sujeto que necesita dicho tratamiento una cantidad eficaz de un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB). En una realización, el sujeto tiene un nivel de azúcar en sangre en ayunas de >130, > 135, > 140, >145 o >150 mg/dL. En una realización, el sujeto tiene un nivel de azúcar en sangre posprandial de >180, >185, >190, >195 o >200 mg/dL 2 horas después de comer. En una realización, el resultado del tratamiento, prevención o mejora es un miembro seleccionado del grupo que consiste en: una disminución en los niveles séricos de glucosa, una disminución en los niveles séricos de triglicéridos, una disminución en los niveles séricos de insulina y/o una disminución en los niveles séricos de ácidos grasos no esterificados, en comparación con los niveles séricos en el sujeto antes del tratamiento. En una realización, el resultado del tratamiento, prevención o mejora es un aumento de la temperatura corporal de aproximadamente 0,4 °C a 1 °C en comparación con la temperatura corporal del sujeto antes del tratamiento. En algunas realizaciones, el tratamiento con antagonista de ALK7:ActRIIB también reduce el peso corporal del sujeto.

[0767] En otra realización, la divulgación proporciona un método para disminuir los niveles de insulina en plasma en un sujeto, que comprende administrar una cantidad eficaz de un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o una combinación de dichos antagonistas, a un sujeto que necesita dicho tratamiento. En una realización, el sujeto tiene un nivel de azúcar en sangre en ayunas de >130, > 135, > 140, >145 o >150 mg/dL. En una realización, tiene un nivel de azúcar en sangre posprandial de >180, >185, >190, >195 o >200 mg/dL 2 horas después de comer. En una realización, el sujeto tiene sobrepeso. En una realización, el sujeto es obeso. En otra realización, el sujeto tiene diabetes de tipo 2.

[0769] En otra realización, la divulgación proporciona un método para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad hepática en un sujeto, que comprende administrar una cantidad eficaz de un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o combinación de dichos antagonistas, a un sujeto que tiene una enfermedad hepática. En una realización, el sujeto tiene inflamación del hígado. En una realización, el sujeto tiene NAFLD. En una realización, el sujeto tiene hígado graso. En otra realización, el sujeto tiene NASH. En una realización, el sujeto tiene hígado graso. En otra realización, el sujeto tiene enfermedad de hígado graso alcohólico. En una realización, la enfermedad hepática tratada, prevenida o mejorada es fibrosis, cicatrización, cirrosis o insuficiencia hepática. En otra realización, la enfermedad hepática tratada, prevenida o mejorada es cáncer de hígado. En una realización, el sujeto tiene sobrepeso. En otra realización, el sujeto es obeso. En otra realización, el sujeto tiene diabetes de tipo 2.

[0771] En una realización, la divulgación proporciona un método para aumentar la lipólisis en una célula (por ejemplo, células o tejido adiposo blanco o marrón) que comprende administrar una cantidad eficaz de un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o combinación de dichos antagonistas. En algunas realizaciones, la célula se pone en contactoin vitro. En algunas realizaciones, la célula se pone en contactoin vivo. En una realización, el método se lleva a caboin vivo, por ejemplo, en un sujeto mamífero (por ejemplo, un modelo animal). En una realización adicional, el sujeto es un ser humano. En algunas realizaciones, el método conduce a una mayor producción de glicerol. En realizaciones adicionales, el método conduce a un aumento de glicerol y/o ácido graso libre en un cultivo de adipocitos. En algunas realizaciones, el método conduce a una disminución del contenido de triglicéridos (TG) en la célula o tejido. En algunas realizaciones, el método conduce a una disminución del nivel de TG en plasma en un sujeto.

[0773] En otra realización, la divulgación proporciona un método para aumentar la señalización del receptor adrenérgicoβ (ADRB) en una célula o tejido (por ejemplo, células o tejido adiposo blanco o marrón). El método comprende poner en contacto una célula o tejido con un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o una combinación de dichos antagonistas, en una cantidad suficiente para aumentar la señalización de ADRB. En algunas realizaciones, la célula o tejido se pone en contactoin vitro. En algunas realizaciones, la célula o tejido se pone en contactoin vivo. En una realización, el método se lleva a caboin vivo, por ejemplo, en un sujeto mamífero (por ejemplo, un modelo animal). En una realización adicional, el sujeto es un ser humano. En algunas realizaciones, el método conduce a una mayor producción de glicerol. En realizaciones adicionales, el método conduce a un aumento de glicerol y/o ácido graso libre en un cultivo de adipocitos. En algunas realizaciones, el método conduce a una disminución del contenido de TG en la célula o tejido. En algunas realizaciones, el método conduce a una disminución del nivel de TG en plasma en un sujeto. En algunas realizaciones, el método conduce a un aumento de la señalización de ADRB en un adipocito o tejido adiposo durante la sobrecarga de nutrientes.

[0775] En otra realización, la divulgación proporciona un método para disminuir la señalización del receptor gamma activado por el proliferador de peroxisomas (PPAR gamma) en una célula o tejido (por ejemplo, célula o tejido adiposo blanco y/o marrón). El método incluye poner en contacto una célula o tejido con un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o una combinación de dichos antagonistas, en una cantidad eficaz para disminuir la actividad de PPAR gamma. En algunas realizaciones, las células o el tejido se ponen en contactoin vitro. En algunas realizaciones, las células o tejidos diferenciados se ponenencontactoin vivo. En una realización, el método se lleva a caboin vivo, por ejemplo, en un sujeto mamífero (por ejemplo, un modelo animal). En una realización adicional, el sujeto es un ser humano. En algunas realizaciones, el método conduce a una mayor producción de glicerol. En realizaciones adicionales, el método conduce a un aumento de glicerol y/o ácido graso libre en un cultivo de adipocitos. En algunas realizaciones, el método conduce a una disminución del contenido de TG en las células o tejidos. En algunas realizaciones, el método conduce a una disminución del nivel de TG en plasma en un sujeto.

[0777] En otra realización, la divulgación proporciona un método para disminuir la resistencia a la insulina en una célula o tejido (por ejemplo, célula o tejido adiposo blanco y/o marrón). El método incluye poner en contacto una célula o tejido con un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o una combinación de dichos antagonistas, en una cantidad eficaz para reducir la resistencia a la insulina. En algunas realizaciones, la célula o tejido se pone en contactoin vitro. En algunas realizaciones, la célula o tejido se pone en contactoin vivo. En una realización, el método se lleva a caboin vivo, por ejemplo, en un sujeto mamífero (por ejemplo, un modelo animal). En una realización adicional, el sujeto es un ser humano.

[0779] En otra realización, la divulgación proporciona un método para aumentar la tasa metabólica de una célula o tejido (por ejemplo, célula o tejido adiposo blanco y/o marrón). El método incluye poner en contacto una célula o tejido con un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o una combinación de dichos antagonistas, en una cantidad eficaz para aumentar el metabolismo de la célula o tejido. En algunas realizaciones, la célula o tejido se pone en contacto in vitro. En algunas realizaciones, la célula o tejido se pone en contactoin vivo. En una realización, el método se lleva a caboin vivo, por ejemplo, en un sujeto mamífero (por ejemplo, un modelo animal). En una realización adicional, el sujeto es un ser humano.

[0781] La divulgación proporciona métodos que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o una combinación de dichos antagonistas, solo o en combinación con una o más terapias adicionales (por ejemplo, uno o más agentes terapéuticos adicionales y/o de apoyo) a un sujeto que tiene, o está en riesgo de desarrollar, una enfermedad y/o afección mediada por ALK7 tal como, obesidad (por ejemplo, obesidad abdominal); sobrepeso; resistencia a la insulina; síndrome metabólico y otras enfermedades o afecciones metabólicas; un trastorno lipídico tal como, niveles bajos de HDL, niveles altos de LDL, hiperlipidemia, hipertrigliceridemia o dislipidemia; aberraciones de lipoproteínas; disminución de triglicéridos; enfermedad del hígado graso; enfermedad del hígado graso no alcohólico; hiperglucemia; tolerancia alterada a la glucosa (IGT); hiperinsulinemia; colesterol alto (por ejemplo, niveles altos de LDL y/o hipercolesterolemia); enfermedad cardiovascular tal como, enfermedad cardiaca incluyendo enfermedad cardiaca coronaria, insuficiencia cardiaca congestiva, aterosclerosis; arteriosclerosis, y/o hipertensión; síndrome de X; restenosis vascular; neuropatía; y/u otros trastornos/o afecciones asociados con una o más de las enfermedades anteriores, y/o con sobrepeso (por ejemplo, IMC de ≥25 kg/m<2>), o con demasiada grasa corporal.

[0783] En realizaciones adicionales, la divulgación proporciona métodos para tratar y/o mejorar el cáncer o una afección asociada con el cáncer, que comprende administrar un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o una combinación de dichos antagonistas. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un cáncer seleccionado del grupo que consiste en melanoma, cáncer de mama, de colon y de endometrio, de páncreas, gástrico y uterino. En algunas realizaciones, el sujeto tiene mieloma (por ejemplo, mieloma múltiple, plasmacitoma, mieloma localizado y mieloma extramedular). En algunas realizaciones, el antagonista de ALK7:ActRIIB se administra para tratar o prevenir metástasis linfáticas, metástasis del torrente sanguíneo, crecimiento tumoral o invasión tumoral.

[0785] La fibrosis generalmente se refiere a una deposición excesiva tanto de fibras de colágeno como de matriz extracelular combinada con una disminución relativa del número de células en un órgano o tejido. Si bien este proceso es una característica importante de la cicatrización natural de heridas después de una lesión, la fibrosis puede provocar daños patológicos en diversos tejidos y órganos, incluidos, por ejemplo, los pulmones, los riñones, el hígado, los huesos, los músculos y la piel. El papel de TGF-beta en la fibrosis ha sido ampliamente estudiado. Sin embargo, otros ligandos de la superfamilia TGF-beta también se han implicado en la fibrosis incluyendo, por ejemplo, activinas (por ejemplo, activina A y activina B) y GDF8 [Hedger et al (2013) Cytokine and Growth Factor Reviews 24:285-295; Hardy et al. (2015) 93: 567-574; y Cantini et al. (2008) J Sex Med 5:1607-1622]. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o combinaciones de dichos antagonistas, de la presente divulgación pueden usarse para tratar fibrosis, particularmente trastornos y afecciones asociados a fibrosis. Por ejemplo, un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o combinaciones de tales antagonistas, puede usarse para tratar o prevenir uno o más de: fibrosis pulmonar, neumonitis por hipersensibilidad, fibrosis idiopática, tuberculosis, neumonía, fibrosis quística, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfisema, fibrosis renal (de riñón), insuficiencia renal (de riñón), enfermedad renal (de riñón) crónica, fibrosis ósea, mielofibrosis, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, esclerodermia, sarcoidosis, granulomatosis con poliangeítis, enfermedad de Peyronie, fibrosis hepática, enfermedad de Wilson, enfermedades de almacenamiento de glucógeno (particularmente tipos III, IV, IX y X), sobrecarga de hierro, enfermedad de Gaucher, síndrome de Zellweger, esteatohepatitis no alcohólica y alcohólica, cirrosis biliar, colangitis esclerosa, síndrome de Budd-Chiari, fibrosis asociada a cirugía, enfermedad de Crohn, contractura de Dupenutren, fibrosis mediinal, fibrosis nefrogénica, fibrosis retroperitoneal, fibrosis auricular, fibrosis pancreática, fibrosis.

[0787] En parte, la presente divulgación se refiere al descubrimiento sorprendente de que heteromultímeros ALK7:ActRIIB pueden unirse a activina C. Por lo tanto, heteromultímeros ALK7:ActRIIB representan una nueva clase de inhibidores de activina C que pueden usarse para tratar o prevenir trastornos o afecciones relacionados con activina C. En algunas realizaciones, pueden usarse heteromultímeros de ALK7:ActRIIB para inhibir la actividad de activina C en un paciente que lo necesita. La sobreexpresión de activina C se ha implicado en enfermedades y trastornos asociados con el hígado, los testículos y la próstata, en particular con el cáncer en dichos tejidos. Véase, por ejemplo, Gold et al. Am J Pathol (2009) 174(1): 184-195. En algunas realizaciones, pueden usarse heteromultímeros de ALK7:ActRIIB para aumentar la fertilidad masculina, aumentar la producción de esperma, aumentar el volumen de túbulos seminíferos, disminuir la inflamación hepática, tratar el cáncer de hígado (hepático), tratar el cáncer testicular, tratar el cáncer de próstata, disminuir la inflamación de próstata y/o tratar la hipertrofia de próstata.

[0789] En algunas realizaciones, las afecciones asociadas a ALK7:ActRIIB incluyen trastornos neuromusculares (por ejemplo, distrofia muscular y atrofia muscular), enfermedad pulmonar obstructiva congestiva (y desgaste muscular asociado con EPOC), síndrome de desgaste muscular, sarcopenia, caquexia, trastornos del tejido adiposo (por ejemplo, obesidad), diabetes tipo 2 (NIDDM, diabetes de inicio en el adulto) y enfermedad degenerativa ósea (por ejemplo, osteoporosis). Otros ejemplos de ALK7: Las afecciones asociadas a ActRIIB incluyen trastornos musculodegenerativos y neuromusculares, reparación de tejidos (por ejemplo, cicatrización de heridas), enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica) y trastornos inmunológicos (por ejemplo, trastornos relacionados con la proliferación o función anormal de linfocitos).

[0791] En determinadas realizaciones, puede usarse un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o combinaciones de dichos antagonistas, de la divulgación como parte de un tratamiento para una distrofia muscular. El término "distrofia muscular" se refiere a un grupo de enfermedades musculares degenerativas caracterizadas por el debilitamiento y deterioro gradual de los músculos esqueléticos y, a veces, del corazón y los músculos respiratorios. Las distrofias musculares son trastornos genéticos caracterizados por desgaste muscular progresivo y debilidad que comienzan con cambios microscópicos en el músculo. A medida que los músculos se degeneran con el tiempo, la fuerza muscular de la persona disminuye. Los ejemplos de distrofias musculares que pueden tratarse con un régimen que incluye los complejos de heteromultímeros de la superfamilia de TGF-beta de la presente invención incluyen: Distrofia muscular de Duchenne (DMD), distrofia muscular de Becker (BMD), distrofia muscular de Emery-Dreifuss (EDMD), distrofia muscular de cinturas (LGMD), distrofia muscular facioescapulohumeral (FSH o FSHD) (también conocida como Landouzy-Dejerina), distrofia miotónica (MMD; también conocida como enfermedad de Steinert), distrofia muscular oculofaríngea (OPMD), distrofia muscular distal (DD), distrofia muscular congénita (CMD).

[0793] La distrofia muscular de Duchenne (DMD) fue descrita por primera vez por el neurólogo francés Guillaume Benjamin Amand Duchenne en la década de 1860. La distrofia muscular de Becker (DMO) lleva el nombre del médico alemán Peter Emil Becker, quien describió por primera vez esta variante de la DMD en la década de 1950. La DMD es una de las enfermedades hereditarias más frecuentes en los hombres, afectando a uno de cada 3.500 niños. La DMD se produce cuando el gen de la distrofina, ubicado en el brazo corto del cromosoma X, es defectuoso. Dado que los machos solo portan una copia del cromosoma X, solo tienen una copia del gen de la distrofina. Sin la proteína distrofina, el músculo se daña fácilmente durante los ciclos de contracción y relajación. Mientras que al principio de la enfermedad el músculo se compensa mediante la regeneración, más adelante las células progenitoras musculares no pueden mantenerse al día con el daño en curso y el músculo sano es reemplazado por tejido fibrograso no funcional.

[0795] La DMO resulta de diferentes mutaciones en el gen de la distrofina. Los pacientes con DMO tienen algo de distrofina, pero es de cantidad insuficiente o de mala calidad. La presencia de alguna distrofina evita que los músculos de los pacientes con DMO se degeneren tan grave o rápidamente como los de los pacientes con DMD.

[0796] Los estudios en animales indican que la inhibición de la ruta de señalización de GDF8 puede tratar eficazmente diversos aspectos de la enfermedad en pacientes con DMD y BMD (Bogdanovich et al., 2002, Nature 420:418-421; Pistilli et al., 2011, Am J Pathol 178:1287-1297). Por lo tanto, los antagonistas ALK7:ActRIIB de la divulgación pueden actuar como inhibidores de GDF8 (antagonistas) y constituir un medio alternativo de bloqueo de la señalización por GDF8 y/o ligandos de la superfamilia de TGFβ relacionadosin vivoen pacientes con DMD y BMD.

[0797] De manera similar, los antagonistas ALK7:ActRIIB de la divulgación pueden proporcionar un medio eficaz para aumentar la masa muscular en otras afecciones de enfermedad que necesitan crecimiento muscular. Por ejemplo, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), también llamada enfermedad de Lou Gehrig o enfermedad de las neuronas motoras, es un trastorno crónico, progresivo e incurable del SNC que ataca a las neuronas motoras, que son componentes del sistema nervioso central necesarios para el inicio de la contracción del músculo esquelético. En la ELA, las neuronas motoras se deterioran y finalmente mueren, y aunque el cerebro de una persona normalmente permanece en pleno funcionamiento y alerta, el inicio de la contracción muscular se bloquea a nivel espinal. Las personas que desarrollan ELA suelen tener entre 40 y 70 años, y las primeras neuronas motoras en degenerar son las que inervan los brazos o las piernas. Los pacientes con ELA pueden tener problemas para caminar, pueden dejar caer cosas, caerse, hablar mal y reír o llorar incontrolablemente. A medida que la enfermedad progresa, los músculos de las extremidades comienzan a atrofiarse por el desuso. La debilidad muscular se vuelve debilitante y los pacientes eventualmente requieren una silla de ruedas o se quedan confinados en la cama. La mayoría de los pacientes con ELA mueren por insuficiencia respiratoria o por complicaciones de la asistencia respiratoria, como la neumonía, 3-5 años desde el inicio de la enfermedad.

[0799] Promoción del aumento de la masa muscular por antagonistas ALK7:ActRIIB también podrían beneficiar a quienes padecen enfermedades de desgaste muscular. González-Cadavidet al.(supra) informaron que la expresión de GDF8 se correlaciona inversamente con la masa libre de grasa en humanos y que el aumento de la expresión del gen GDF8 está asociado con la pérdida de peso en hombres con síndrome de emaciación por SIDA. Al inhibir la función de GDF8 en pacientes con SIDA, al menos determinados síntomas del SIDA pueden aliviarse, si no eliminarse por completo, mejorando así significativamente la calidad de vida en pacientes con SIDA.

[0801] Dado que la pérdida de la función de GDF8 también está asociada con la pérdida de grasa sin disminución de la ingesta de nutrientes (Zimmers et al., citado anteriormente; McPherron y Lee, citado anteriormente), los antagonistas ALK7:ActRIIB objeto pueden usarse además como agente terapéutico para ralentizar o prevenir el desarrollo de obesidad y diabetes tipo 2.

[0803] El síndrome de anorexia-caquexia del cáncer se encuentra entre los aspectos más debilitantes y potencialmente mortales del cáncer. Este síndrome es una característica común de muchos tipos de cáncer, presente en aproximadamente el 80 % de los pacientes con cáncer al morir, y es responsable no solo de una mala calidad de vida y una mala respuesta a la quimioterapia, sino también de un tiempo de supervivencia más corto que el que se encuentra en pacientes con tumores comparables pero sin pérdida de peso. La caquexia suele sospecharse en pacientes con cáncer si se produce una pérdida de peso involuntaria de más del cinco por ciento del peso premórbido en un periodo de seis meses. Asociada con la anorexia, el desgaste de la grasa y el tejido muscular, y la angustia psicológica, la caquexia surge de una interacción compleja entre el cáncer y el huésped. La caquexia del cáncer afecta a la producción de citocinas, a la liberación de factores de movilización de lípidos e inductores de proteólisis, y a las alteraciones en el metabolismo intermedio. Aunque la anorexia es común, una disminución de la ingesta de alimentos por sí sola no puede explicar los cambios en la composición corporal observados en pacientes con cáncer, y el aumento de la ingesta de nutrientes no puede revertir el síndrome de desgaste. Actualmente, no existe ningún tratamiento para controlar o revertir el proceso caquexico. Dado que se encontró que la sobreexpresión sistémica de GDF8 en ratones adultos induce una pérdida profunda de músculo y grasa análoga a la observada en síndromes de caquexia humana (Zimmers et al., citado anteriormente), los antagonistas ALK7:ActRIIB objeto pueden usarse de manera beneficiosa para prevenir, tratar o aliviar los síntomas del síndrome de caquexia, en el que se desea el crecimiento muscular. Un ejemplo de un complejo heteromérico útil para prevenir, tratar o aliviar la pérdida muscular tal como se describió anteriormente es un heterodímero de ALK7:ActRIIB.

[0805] En determinadas realizaciones, puede usarse un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o combinaciones de dichos antagonistas, de la presente divulgación en métodos para inducir la formación de hueso y/o cartílago, prevenir la pérdida ósea, aumentar la mineralización ósea, prevenir la desmineralización del hueso y/o aumentar la densidad ósea. Los antagonistas de ALK7:ActRIIB pueden ser útiles en pacientes que son diagnosticados con baja densidad ósea subclínica, como medida de protección contra el desarrollo de osteoporosis.

[0807] En algunas realizaciones, un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o combinaciones de dichos antagonistas, de la presente divulgación pueden encontrar utilidad médica en la curación de fracturas óseas y defectos de cartílago en seres humanos y otros animales. Los presentes métodos y composiciones también pueden tener uso profiláctico en la reducción de fracturas cerradas así como abiertas y también en la fijación mejorada de articulaciones artificiales. La formación ósea de novo inducida por un agente osteogénico es útil para la reparación de defectos craneofaciales que son congénitos, inducidos por traumatismos o causados por resección oncológica, y también es útil en cirugía plástica estética. Además, los métodos y composiciones de la divulgación pueden usarse en el tratamiento de la enfermedad periodontal y en otros procesos de reparación dental. En determinados casos, un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o combinaciones de dichos antagonistas, pueden proporcionar un entorno para atraer células formadoras de hueso, estimular el crecimiento de células formadoras de hueso o inducir la diferenciación de progenitores de células formadoras de hueso. Un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7: ActrIIB), o combinaciones de dichos antagonistas, de la divulgación también pueden ser útiles en el tratamiento de la osteoporosis. Además, pueden usarse antagonistas ALK7:ActRIIB en la reparación de defectos de cartílago y prevención/reversión de osteoartritis. Los ejemplos de complejos heteroméricos útiles para inducir la formación ósea, prevenir la pérdida ósea, aumentar la mineralización ósea, prevenir la desmineralización ósea y/o aumentar la densidad ósea como se describe en el presente documento son heterodímeros de ALK7:ActRIIB.

[0808] Rosen et al. (ed.) Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism, 7ª ed. La American Society for Bone and Mineral Research, Washington D.C. proporciona una extensa discusión de los trastornos óseos que pueden estar sujetos a tratamiento con un antagonista de ALK7:ActRIIB, o con combinaciones de dichos antagonistas. Aquí se proporciona un anuncio parcial. Los métodos y composiciones de la invención pueden aplicarse a afecciones caracterizadas por o que causan pérdida ósea, tales como osteoporosis (incluyendo osteoporosis secundaria), hiperparatiroidismo, enfermedad renal crónica, trastorno óseo mineral, privación o ablación de hormonas sexuales (por ejemplo, andrógeno y/o estrógeno), tratamiento con glucocorticoides, artritis reumatoide, quemaduras graves, hiperparatiroidismo, hipercalcemia, hipocalcemia, hipofosfatemia, osteomalacia (incluyendo osteomalacia inducida por tumor), hiperfosfatemia, deficiencia de vitamina D, hiperparatiroidismo (incluyendo hiperparatiroidismo familiar) y pseudohipoparatiroidismo, metástasis tumorales en el hueso, pérdida ósea como consecuencia de un tumor o quimioterapia, tumores del hueso y la médula ósea (por ejemplo, mieloma múltiple), trastornos óseos isquémicos, enfermedad periodontal y pérdida ósea oral, enfermedad de Cushing, enfermedad de Paget, tirotoxicosis, estado diarreico crónico o malabsorción, acidosis tubular renal o anorexia nerviosa. Los métodos y composiciones de la divulgación también pueden aplicarse a afecciones caracterizadas por un fallo de formación o cicatrización ósea, incluyendo fracturas no de unión, fracturas que de otro modo son de cicatrización lenta, displasias óseas fetales y neonatales (por ejemplo, hipocalcemia, hipercalcemia, defectos de receptores de calcio y deficiencia de vitamina D), osteonecrosis (incluyendo osteonecrosis de la mandíbula) y osteogénesis imperfecta. Adicionalmente, los efectos anabólicos harán que dichos antagonistas disminuyan el dolor óseo asociado con el daño óseo o la erosión. Como consecuencia de los efectos antirresortivos, dichos antagonistas pueden ser útiles para tratar trastornos de formación ósea anormal, tales como metástasis tumorales osteoblásticas (por ejemplo, asociadas con cáncer de próstata o de mama primario), osteosarcoma osteogénico, osteopetrosis, displasia diafisaria progresiva, hiperostosis endosteal, osteopoikilosis y melorreostosis. Otros trastornos que pueden tratarse incluyen displasia fibrosa y condrodisplasias.

[0810] En otra realización específica, la divulgación proporciona un método terapéutico y una composición para reparar fracturas y otras afecciones relacionadas con defectos de cartílago y/o hueso o enfermedades periodontales. La divulgación proporciona además métodos y composiciones terapéuticas para la cicatrización de heridas y la reparación de tejidos. Los tipos de heridas incluyen, pero no se limitan a, quemaduras, incisiones y úlceras. Véase, por ejemplo, la publicación PCT n .º WO 84/01106. Dichas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos uno de los antagonistas ALK7:ActRIIB de la divulgación en mezcla con un vehículo, portador o matriz farmacéuticamente aceptable.

[0812] En algunas realizaciones, un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o combinaciones de dichos antagonistas, de la divulgación pueden aplicarse a afecciones que causan pérdida ósea tales como osteoporosis, hiperparatiroidismo, enfermedad de Cushing, tirotoxicosis, malabsorción o estado diarreico crónico, acidosis tubular renal o anorexia nerviosa. Comúnmente se aprecia que ser mujer, tener un peso corporal bajo y llevar un estilo de vida sedentario son factores de riesgo para la osteoporosis (pérdida de densidad mineral ósea, lo que conlleva un riesgo de fractura). Sin embargo, la osteoporosis también puede resultar del uso a largo plazo de determinados medicamentos. La osteoporosis resultante de medicamentos u otra afección médica se conoce como osteoporosis secundaria. En la enfermedad de Cushing, el exceso de cortisol producido por el cuerpo provoca osteoporosis y fracturas. Los medicamentos más comunes asociados con la osteoporosis secundaria son los corticosteroides, una clase de medicamentos que actúan como el cortisol, una hormona producida naturalmente por las glándulas suprarrenales. Aunque se necesitan niveles adecuados de hormonas tiroideas para el desarrollo del esqueleto, el exceso de hormona tiroidea puede disminuir la masa ósea con el tiempo. Los antiácidos que contienen aluminio pueden provocar pérdida ósea cuando se toman en dosis altas por personas con problemas renales, particularmente aquellas que se someten a diálisis. Otros medicamentos que pueden causar osteoporosis secundaria incluyen fenitoína (Dilantin) y barbitúricos que se usan para prevenir convulsiones; metotrexato (Rheumatrex, Immunex, Folex PFS), un medicamento para algunas formas de artritis, cáncer y trastornos inmunitarios; ciclosporina (Sandimmune, Neoral), un medicamento utilizado para tratar algunas enfermedades autoinmunitarias y para suprimir el sistema inmunitario en pacientes con trasplante de órganos; agonistas de la hormona liberadora de hormona luteinizante (Lupron, Zoladex), utilizados para tratar el cáncer de próstata y la endometriosis; heparina (Calciparine, Liquaemin), un medicamento anticoagulante; y colestiramina (Questran) y colestipol (Colestid), utilizados para tratar el colesterol alto. La pérdida ósea resultante de la terapia contra el cáncer es ampliamente reconocida y se denomina pérdida ósea inducida por la terapia contra el cáncer (CTIBL, por sus siglas en inglés). Las metástasis óseas pueden crear cavidades en el hueso que pueden corregirse mediante tratamiento con un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB). La pérdida ósea también puede ser causada por la enfermedad de las encías, una infección crónica en la que las bacterias ubicadas en los huecos de las encías producen toxinas y enzimas dañinas.

[0814] En una realización adicional, la presente divulgación proporciona métodos y agentes terapéuticos para tratar enfermedades o trastornos asociados con el crecimiento óseo anormal o no deseado. Por ejemplo, los pacientes con el trastorno congénito de fibrodisplasia osificante progresiva (FOP) se ven afectados por el crecimiento óseo ectópico progresivo en tejidos blandos de forma espontánea o en respuesta a un traumatismo tisular, con un impacto importante en la calidad de vida. Además, puede producirse un crecimiento óseo anormal después de la cirugía de reemplazo de cadera y, por lo tanto, arruinar el resultado quirúrgico. Este es un ejemplo más común de crecimiento óseo patológico y una situación en la que los métodos y composiciones en cuestión pueden ser terapéuticamente útiles. Los mismos métodos y composiciones también pueden ser útiles para tratar otras formas de crecimiento óseo anormal (por ejemplo, crecimiento patológico de hueso después de traumatismo, quemaduras o lesión de la médula espinal), y para tratar o prevenir las afecciones indeseables asociadas con el crecimiento óseo anormal observado en relación con cáncer de próstata metastásico u osteosarcoma.

[0816] En determinadas realizaciones, puede usarse un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o combinaciones de dichos antagonistas, de la divulgación para promover la formación ósea en pacientes con cáncer. Los pacientes que tienen determinados tumores (por ejemplo, próstata, mama, mieloma múltiple o cualquier tumor que cause hiperparatiroidismo) tienen un alto riesgo de pérdida ósea debido a la pérdida ósea inducida por tumores, metástasis óseas y agentes terapéuticos. Dichos pacientes pueden tratarse con un complejo de heteromultímero de la superfamilia de TGF-beta, o una combinación de complejos, incluso en ausencia de evidencia de pérdida ósea o metástasis óseas. Los pacientes también pueden controlarse para detectar evidencia de pérdida ósea o metástasis óseas, y pueden tratarse con un antagonista de ALK7:ActRIIB en caso de que los indicadores sugieran un mayor riesgo. En general, las exploraciones DEXA se emplean para evaluar los cambios en la densidad ósea, mientras que los indicadores de remodelación ósea pueden usarse para evaluar la probabilidad de metástasis óseas. Pueden monitorizarse los marcadores séricos. La fosfatasa alcalina específica ósea (BSAP) es una enzima que está presente en los osteoblastos. Los niveles sanguíneos de BSAP aumentan en pacientes con metástasis ósea y otras afecciones que dan como resultado un aumento de la remodelación ósea. Los péptidos de osteocalcina y procolágeno también están asociados con la formación de hueso y metástasis óseas. Se han detectado aumentos en BSAP en pacientes con metástasis óseas causadas por cáncer de próstata y, en menor grado, en metástasis óseas por cáncer de mama. Los niveles de BMP7 son altos en el cáncer de próstata que ha metastatizado al hueso, pero no en las metástasis óseas debido al cáncer de vejiga, piel, hígado o pulmón. El telopéptido carboxi-terminal tipo I (ICTP) es una reticulación que se encuentra en el colágeno que se forma durante la reabsorción del hueso. Dado que el hueso se descompone y se reforma constantemente, el ICTP se encontrará en todo el cuerpo. Sin embargo, en el sitio de la metástasis ósea, el nivel será significativamente más alto que en un área de hueso normal. Se ha encontrado ICTP en niveles altos en metástasis óseas debido a cáncer de próstata, pulmón y mama. Otra reticulación de colágeno, el telopéptido N-terminal tipo I (NTx), se produce junto con ICTP durante el recambio óseo. La cantidad de NTx aumenta en la metástasis ósea causada por muchos tipos diferentes de cáncer, incluidos el cáncer de pulmón, próstata y mama. Además, los niveles de NTx aumentan con la progresión de la metástasis ósea. Por lo tanto, este marcador puede usarse tanto para detectar metástasis como para medir la extensión de la enfermedad. Otros marcadores de resorción incluyen piridinolina y desoxipiridinolina. Cualquier aumento en los marcadores de resorción o marcadores de metástasis óseas indica la necesidad de terapia con un antagonista de ALK7:ActRIIB en un paciente.

[0818] Un antagonista de ALK7:ActRIIB (por ejemplo, un heterodímero de ALK7:ActRIIB), o combinaciones de dichos antagonistas, de la divulgación pueden administrarse conjuntamente con otros agentes farmacéuticos activos para hueso. La administración conjunta puede lograrse mediante la administración de una única coformulación, mediante la administración simultánea o mediante la administración en momentos separados. Los antagonistas de ALK7:ActRIIB pueden ser particularmente ventajosos si se administran con otros agentes activos para los huesos. Un paciente puede beneficiarse de recibir conjuntamente un complejo antagonista de ALK7:ActRIIB y tomar suplementos de calcio, vitamina D, ejercicio apropiado y/o, en algunos casos, otros medicamentos. Ejemplos de otros medicamentos incluyen, bisfosfonatos (alendronato, ibandronato y risedronato), calcitonina, estrógenos, hormona paratiroidea y raloxifeno. Los bifosfonatos (alendronato, ibandronato y risedronato), la calcitonina, los estrógenos y el raloxifeno afectan al ciclo de remodelación ósea y se clasifican como medicamentos antirresortivos. La remodelación ósea consta de dos etapas distintas: resorción ósea y formación ósea. Los medicamentos antirresortivos ralentizan o detienen la parte de reabsorción ósea del ciclo de remodelación ósea, pero no ralentizan la parte de formación ósea del ciclo. Como resultado, la nueva formación continúa a una velocidad mayor que la resorción ósea, y la densidad ósea puede aumentar con el tiempo. La teriparatida, una forma de hormona paratiroidea, aumenta la tasa de formación ósea en el ciclo de remodelación ósea. El alendronato está aprobado tanto para la prevención (5 mg al día o 35 mg una vez a la semana) como para el tratamiento (10 mg al día o 70 mg una vez a la semana) de la osteoporosis posmenopáusica. El alendronato reduce la pérdida ósea, aumenta la densidad ósea y reduce el riesgo de fracturas de columna, muñeca y cadera. El alendronato también está aprobado para el tratamiento de la osteoporosis inducida por glucocorticoides en hombres y mujeres como resultado del uso a largo plazo de estos medicamentos (es decir, prednisona y cortisona) y para el tratamiento de la osteoporosis en hombres. Alendronato más vitamina D está aprobado para el tratamiento de la osteoporosis en mujeres posmenopáusicas (70 mg una vez a la semana más vitamina D) y para el tratamiento para mejorar la masa ósea en hombres con osteoporosis. El ibandronato está aprobado para la prevención y el tratamiento de la osteoporosis posmenopáusica. Tomado como una píldora una vez al mes (150 mg), el ibandronato debe tomarse el mismo día cada mes. El ibandronato reduce la pérdida ósea, aumenta la densidad ósea y reduce el riesgo de fracturas de la columna vertebral. El risedronato está aprobado para la prevención y el tratamiento de la osteoporosis posmenopáusica. Tomado diariamente (dosis de 5 mg) o semanalmente (dosis de 35 mg o dosis de 35 mg con calcio), el risedronato ralentiza la pérdida ósea, aumenta la densidad ósea y reduce el riesgo de fracturas de columna y no columna. El risedronato también está aprobado para su uso en hombres y mujeres para prevenir y/o tratar la osteoporosis inducida por glucocorticoides que resulta del uso a largo plazo de estos medicamentos (es decir, prednisona o cortisona). La calcitonina es una hormona natural involucrada en la regulación del calcio y el metabolismo óseo. En mujeres que han pasado más de 5 años de la menopausia, la calcitonina ralentiza la pérdida ósea, aumenta la densidad ósea espinal y puede aliviar el dolor asociado con las fracturas óseas. La calcitonina reduce el riesgo de fracturas espinales. La calcitonina está disponible como inyección (50-100 UI al día) o aerosol nasal (200 UI al día).

[0820] Un paciente también puede beneficiarse de recibir conjuntamente un antagonista de ALK7:ActRIIB, o combinaciones de dichos antagonistas, y medicamentos adicionales activos para los huesos. La terapia con estrógenos (ET)/terapia hormonal (HT) está aprobada para la prevención de la osteoporosis. Se ha demostrado que la TE reduce la pérdida ósea, aumenta la densidad ósea tanto en la columna vertebral como en la cadera y reduce el riesgo de fracturas de cadera y columna vertebral en mujeres posmenopáusicas. La ET se administra más comúnmente en forma de una píldora o parche cutáneo que administra una dosis baja de aproximadamente 0,3 mg al día o una dosis estándar de aproximadamente 0,625 mg al día y es eficaz incluso cuando se inicia después de los 70 años. Cuando el estrógeno se toma solo, puede aumentar el riesgo de una mujer de desarrollar cáncer del revestimiento uterino (cáncer de endometrio). Para eliminar este riesgo, los proveedores de atención médica recetan la hormona progestina en combinación con estrógeno (terapia de reemplazo hormonal o HT) para aquellas mujeres que tienen un útero intacto. ET/HT alivia los síntomas de la menopausia y se ha demostrado que tiene un efecto beneficioso sobre la salud ósea. Los efectos secundarios pueden incluir sangrado vaginal, sensibilidad en los senos, trastornos del estado de ánimo y enfermedad de la vesícula biliar. El raloxifeno, 60 mg al día, está aprobado para la prevención y el tratamiento de la osteoporosis posmenopáusica. Es de una clase de medicamentos llamados moduladores selectivos de receptores de estrógeno (SERM) que se han desarrollado para proporcionar los efectos beneficiosos de los estrógenos sin sus posibles desventajas. El raloxifeno aumenta la masa ósea y reduce el riesgo de fracturas de la columna vertebral. Todavía no se dispone de datos que demuestren que el raloxifeno puede reducir el riesgo de fracturas de cadera y otras fracturas no vertebrales. La teriparatida, una forma de hormona paratiroidea, está aprobada para el tratamiento de la osteoporosis en mujeres y hombres posmenopáusicas que tienen un alto riesgo de fractura. Este medicamento estimula la formación de hueso nuevo y aumenta significativamente la densidad mineral ósea. En las mujeres posmenopáusicas, se observó una reducción de la fractura en la columna vertebral, la cadera, el pie, las costillas y la muñeca. En los hombres, se observó una reducción de la fractura en la columna vertebral, pero no hubo datos suficientes para evaluar la reducción de la fractura en otros sitios. La teriparatida se autoadministra como una inyección diaria durante hasta 24 meses.

[0822] Como se usa en el presente documento, “en combinación con”, “combinaciones de” o “administración conjunta” se refiere a cualquier forma de administración de tal manera que las terapias adicionales (por ejemplo, segunda, tercera, cuarta, etc.) siguen siendo eficaces en el cuerpo (por ejemplo, múltiples compuestos son eficaces simultáneamente en el paciente, que puede incluir efectos sinérgicos de esos compuestos). La eficacia puede no correlacionarse con la concentración medible del agente en sangre, suero o plasma. Por ejemplo, los diferentes compuestos terapéuticos pueden administrarse en la misma formulación o en formulaciones separadas, ya sea de forma concomitante o secuencial, y en diferentes programas. Por tanto, un individuo que recibe dicho tratamiento puede beneficiarse de un efecto combinado de diferentes terapias. Uno o más antagonistas ALK7:ActRIIB de la divulgación pueden administrarse simultáneamente con, antes de, o después de, uno o más de otros agentes o terapias de apoyo adicionales. En general, cada agente terapéutico se administrará a una dosis y/o en un horario determinado para ese agente particular. La combinación particular a emplear en un régimen tendrá en cuenta la compatibilidad del antagonista de la presente divulgación con la terapia y/o la deseada.

[0824] 5. Composiciones farmacéuticas

[0826] En determinados aspectos, los antagonistas ALK7:ActRIIB (por ejemplo, heteromultímeros ALK7:ActRIIB), o combinaciones de dichos antagonistas, de la presente divulgación pueden administrarse solos o como un componente de una formulación farmacéutica (también denominada composición terapéutica o composición farmacéutica). Una formación farmacéutica se refiere a una preparación que está en una forma tal que permite que la actividad biológica de un principio activo (por ejemplo, un agente de la presente divulgación) contenido en la misma sea eficaz y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administraría la formulación. Los compuestos de la invención pueden formularse para su administración de cualquier manera conveniente para su uso en medicina humana o veterinaria. Por ejemplo, uno o más agentes de la presente divulgación pueden formularse con un portador farmacéuticamente aceptable. Un portador farmacéuticamente aceptable se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, que no sea un principio activo, que generalmente no es tóxico para un sujeto. Un portador farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizador y/o conservante. En general, las formulaciones farmacéuticas para su uso en la presente divulgación están en una forma fisiológicamente aceptable, libre de pirógenos cuando se administran a un sujeto. Los agentes terapéuticamente útiles distintos de los descritos en el presente documento, que pueden incluirse opcionalmente en la formulación tal como se describió anteriormente, pueden administrarse en combinación con los agentes en cuestión en los métodos de la presente divulgación.

[0828] En determinadas realizaciones, las composiciones se administrarán por vía parenteral [por ejemplo, mediante inyección intravenosa (I.V.), inyección intraarterial, inyección intraósea, inyección intramuscular, inyección intratecal, inyección subcutánea o inyección intradérmica]. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración parenteral pueden comprender uno o más agentes de la divulgación en combinación con una o más soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas isotónicas, estériles, farmacéuticamente aceptables, o polvos estériles que pueden reconstituirse en soluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes de su uso. Las soluciones o dispersiones inyectables pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos, agentes de suspensión, agentes espesantes o solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto. Los ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados que pueden usarse en las formulaciones farmacéuticas de la presente divulgación incluyen agua, etanol, polioles (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, etc.), aceites vegetales (por ejemplo, aceite de oliva), ésteres orgánicos inyectables (por ejemplo, oleato de etilo), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, (por ejemplo lecitina), mediante el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos.

[0830] En algunas realizaciones, un método terapéutico de la presente divulgación incluye administrar la composición farmacéutica de forma sistémica, o local, desde un implante o dispositivo. Además, la composición farmacéutica puede encapsularse o inyectarse en una forma para su administración a un sitio de tejido diana (por ejemplo, médula ósea o músculo). En determinadas realizaciones, las composiciones de la presente divulgación pueden incluir una matriz capaz de administrar uno o más de los agentes de la presente divulgación a un sitio de tejido diana (por ejemplo, médula ósea o músculo), proporcionar una estructura para el tejido en desarrollo y ser óptimamente capaz de reabsorberse en el cuerpo. Por ejemplo, la matriz puede proporcionar una liberación lenta de uno o más agentes de la presente divulgación. Dichas matrices pueden estar formadas de materiales actualmente en uso para otras aplicaciones médicas implantadas.

[0832] En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se administrarán al ojo incluyendo, por ejemplo, mediante administración tópica, inyección intraocular (por ejemplo, intravítrea), o mediante implante o dispositivo. Se puede inyectar una inyección intravítrea, por ejemplo, a través de la pars plana, 3 mm a 4 mm posterior al limbo. Las composiciones farmacéuticas para la administración al ojo pueden formularse en una variedad de formas que incluyen, por ejemplo, gotas para los ojos, soluciones oftálmicas, suspensiones oftálmicas, emulsiones oftálmicas, inyecciones intravítreas, inyecciones sub-Tenon, implante biodroducible oftálmico e insertos o depósitos oftálmicos no bioordenables.

[0834] La elección del material de matriz puede basarse en uno o más de: biocompatibilidad, biodegradabilidad, propiedades mecánicas, apariencia cosmética y propiedades de interfaz. La aplicación particular de las composiciones de la invención definirá la formulación apropiada. Las matrices potenciales para las composiciones pueden ser sulfato de calcio, fosfato tricálcico, hidroxiapatita, ácido poliláctico y polianhídridos biodegradables y químicamente definidos. Otros materiales potenciales son biodegradables y biológicamente bien definidos incluyendo, por ejemplo, colágeno óseo o dérmico. Otras matrices están compuestas por proteínas puras o componentes de matriz extracelular. Otras matrices potenciales no son biodegradables y se definen químicamente incluyendo, por ejemplo, hidroxiapatita sinterizada, biovidrio, aluminatos u otras cerámicas. Las matrices pueden comprender combinaciones de cualquiera de los tipos de material mencionados anteriormente que incluyen, por ejemplo, ácido poliláctico e hidroxiapatita o colágeno y fosfato tricálcico. Las biocerámicas pueden alterarse en composición (por ejemplo, aluminato-fosfato de calcio) y procesamiento para alterar uno o más de tamaño de poro, tamaño de partícula, forma de partícula y biodegradabilidad.

[0836] En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden administrarse por vía tópica. "Aplicación tópica" o "por vía tópica" significa el contacto de la composición farmacéutica con superficies corporales que incluyen, por ejemplo, la piel, los sitios de las heridas y las membranas mucosas. Las composiciones farmacéuticas tópicas pueden tener diversas formas de aplicación y típicamente comprenden una capa que contiene fármaco, que está adaptada para colocarse cerca de o en contacto directo con el tejido tras la administración tópica de la composición. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración tópica pueden comprender uno o más complejos de polipéptidos receptores de la superfamilia de TGFβ de tipo I y/o tipo II de la divulgación en combinación formulados como un líquido, un gel, una crema, una loción, una pomada, una espuma, una pasta, una masilla, un semisólido o un sólido. Las composiciones en forma de líquido, gel, crema, loción, ungüento, espuma, pasta o masilla se pueden aplicar esparciendo, pulverizando, untando, frotando o haciendo rodar la composición sobre el tejido objetivo. Las composiciones también pueden impregnarse en apósitos estériles, parches transdérmicos, emplastos y vendajes. Las composiciones de las formas de masilla, semisólidas o sólidas pueden ser deformables. Pueden ser elásticos o no elásticos (por ejemplo, flexibles o rígidos). En determinados aspectos, la composición forma parte de un compuesto y puede incluir fibras, partículas o múltiples capas con las mismas o diferentes composiciones.

[0838] Las composiciones tópicas en forma líquida pueden incluir soluciones, emulsiones, microemulsiones y suspensiones farmacéuticamente aceptables. Además del(s) ingrediente(s) activo(s), la forma farmacéutica líquida puede contener un diluyente inerte usado habitualmente en la técnica que incluye, por ejemplo, agua u otro disolvente, un agente solubilizante y/o emulsionante [por ejemplo, alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol o 1,3-butilenglicol, un aceite (por ejemplo, aceite de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurílico, un polietilenglicol, un éster de ácido graso de sorbitán y mezclas de los mismos].

[0840] Las composiciones tópicas de gel, crema, loción, pomada, semisólido o sólido pueden incluir uno o más agentes espesantes, tales como un polisacárido, polímero sintético o polímero a base de proteínas. En una realización de la invención, el agente gelificante de la presente es uno que es adecuadamente no tóxico y proporciona la viscosidad deseada. Los agentes espesantes pueden incluir polímeros, copolímeros, y monómeros de: vinilpirrolidonas, metacrilamidas, acrilamidas N-vinilimidazoles, carboxivinilos, ésteres de vinilo, éteres de vinilo, siliconas, óxidos de polietileno, polietilenglicoles, alcoholes vinílicos, acrilatos de sodio, acrilatos, ácidos maleicos, NN-dimetilacrilamidas, acrilamidas de diacetona, acrilamidas, acriloil morfolina, pluronic, colágenos, poliacrilamidas, poliacrilatos, alcoholes polivinílicos, polivinilenos, silicatos de polivinilo, poliacrilatos sustituidos con un azúcar (por ejemplo, sacarosa, glucosa, glucosaminas, galactosa, trehalosa, manosa, o lactosa), ácidos acilamidopropanosulfónicos, tetrametoxiortosilicatos, metiltrimetoxiortosilicatos, tetraalcoxiortosilicatos, trialcoxiortosilicatos, glicoles, propilenglicol, glicerina, polisacáridos, alginatos, dextranos, ciclodextrina, celulosas, celulosas modificadas, celulosas oxidadas, quitosanos, quitinas, guares, carragenanos, ácidos hialurónicos, inulina, almidones, almidones modificados, agarosa, metilcelulosas, gomas vegetales, hilaronanos, hidrogeles, gelatinas, glicosaminoglicanos, carboximetilcelulosas, hidroxietilcelulosas, hidroxipropilmetilcelulosas, pectinas, pectinas de bajo contenido en metoxi, dextranos reticulados, copolímeros de injerto de almidón-acrilonitrilo, poliacrilato sódico de almidón, metacrilatos de hidroxietilo, acrilatos de hidroxietilo, polivinileno, polietilviniléteres, metacrilatos de polimetilo, poliestirenos, poliuretanos, polialcanoatos, ácidos polilácticos, polilactatos, poli(3-hidroxibutirato), hidrogeles sulfonados, AMPS (ácido 2-acrilamido-2-metil-1-propanosulfónico), SEM (sulfoetilmetacrilato), SPM (metacrilato de sulfopropilo), SPA (acrilato de sulfopropilo), N, N-dimetil-N-metacriloxietil-N-(3-sulfopropil)amonio betaína, ácido metacrílico amidopropil-dimetilamonio sulfobetaína, SPI (ácido itacónico (1-propilzulfonácido-3) di-potasio), sal de itacónico, ácidos (AMido-3-metilbutano) beta-acrílico (acrilato), dímeros de ácido), y polímeros de anhídrido maleico-metilvinil éter, derivados de los mismos, sales de los mismos, ácidos de los mismos y combinaciones de los mismos. En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación se pueden administrar por vía oral, por ejemplo, cápsulas, obleas, comprimidos, tabletas, pastillas para chupar (utilizando una base aromatizada tal como sacarosa y acacia o tragacanto), polvos, gránulos, soluciones o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, una emulsión líquida de aceite en agua o de agua en aceite, o un elixir o jarabe, o pastilla (usando una base inerte, como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia), y/o un enjuague bucal, conteniendo cada uno una cantidad predeterminada de un compuesto de la presente divulgación y opcionalmente uno o más principios activos. Un compuesto de la presente divulgación y opcionalmente uno o más principios activos diferentes también se pueden administrar como un bolo, electuario o pasta.

[0842] En formas de dosificación sólidas para administración oral (por ejemplo, cápsulas, comprimidos, píldoras, grageas, polvos y gránulos), uno o más compuestos de la presente divulgación pueden mezclarse con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables que incluyen, por ejemplo, citrato de sodio, fosfato de dicalcio, una carga o extensor (por ejemplo, un almidón, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico), un aglutinante (por ejemplo, carboximetilcelulosa, un alginato, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y goma arábiga), un humectante (por ejemplo, glicerol), un agente disgregante (por ejemplo, agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, un silicato y carbonato de sodio), un agente retardante de la solución (por ejemplo, parafina), un acelerador de la absorción (por ejemplo, un compuesto de amonio cuaternario), un agente humectante (por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol), un absorbente (por ejemplo, caolín y arcilla de bentonita), un lubricante (por ejemplo, un talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, lauril sulfato de sodio), un agente colorante y mezclas de los mismos. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, la formulación farmacéutica (composición) también puede comprender un agente tamponante. Las composiciones sólidas de un tipo similar también pueden usarse como cargas en cápsulas de gelatina rellenas blandas y duras usando uno o más excipientes que incluyen, por ejemplo, lactosa o un azúcar de la leche, así como un polietilenglicol de alto peso molecular.

[0844] Las formas farmacéuticas líquidas para administración oral de la composición farmacéutica pueden incluir emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además del(los) principio(s) activo(s), la forma farmacéutica líquida puede contener un diluyente inerte usado habitualmente en la técnica que incluye, por ejemplo, agua u otro disolvente, un agente solubilizante y/o emulsionante [por ejemplo, alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol o 1,3-butilenglicol, un aceite (por ejemplo, aceite de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurílico, un polietilenglicol, un éster de ácido graso de sorbitán y mezclas de los mismos]. Además de los diluyentes inertes, la formulación oral también puede incluir un adyuvante que incluye, por ejemplo, un agente humectante, un agente emulsionante y de suspensión, un agente edulcorante, un agente aromatizante, un agente colorante, un agente perfumante, un agente conservante, y combinaciones de los mismos.

[0846] Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspensión como, por ejemplo, alcoholes isoestearílicos etoxilados, sorbitol polioxietilénico y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, y mezclas de los mismos.

[0848] La prevención de la acción de microorganismos puede garantizarse mediante la inclusión de diferentes agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenolsórbico y similares.

[0850] En determinadas realizaciones, puede ser deseable incluir un agente isotónico que incluye, por ejemplo, un azúcar o cloruro de sodio en las composiciones. Además, la absorción prolongada de una forma farmacéutica inyectable se puede conseguir mediante la inclusión de un agente que retrasa la absorción que incluye, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

[0851] Se entiende que el régimen de dosificación será determinado por el médico encargado considerando diversos factores que modifican la acción del uno o más de los agentes de la presente divulgación. En el caso de antagonistas de ALK7:ActRIIB que promueven la formación de glóbulos rojos, varios factores pueden incluir, pero no se limitan a, el recuento de glóbulos rojos del paciente, el nivel de hemoglobina, el recuento de glóbulos rojos objetivo deseado, la edad del paciente, el sexo del paciente, la dieta del paciente, la gravedad de cualquier enfermedad que pueda estar contribuyendo a un nivel de glóbulos rojos deprimido, el tiempo de administración y otros factores clínicos. La adición de otros agentes activos conocidos a la composición final también puede afectar a la dosificación. El progreso puede controlarse mediante la evaluación periódica de uno o más de los niveles de glóbulos rojos, niveles de hemoglobina, niveles de reticulocitos y otros indicadores del proceso hematopoyético. En determinadas realizaciones, la presente divulgación también proporciona terapia génica para la producciónin vivode uno o más de los agentes de la presente divulgación. Dicha terapia lograría su efecto terapéutico mediante la introducción de las secuencias del agente en células o tejidos que tienen uno o más de los trastornos enumerados anteriormente. La administración de las secuencias del agente puede lograrse, por ejemplo, mediante el uso de un vector de expresión recombinante tal como un virus quimérico o un sistema de dispersión coloidal. La administración terapéutica preferida de una o más de las secuencias de agentes de la divulgación es el uso de liposomas dirigidos.

[0852] Diversos vectores virales que pueden utilizarse para terapia génica como se enseña en el presente documento incluyen adenovirus, virus del herpes, vaccinia o un virus de ARN (por ejemplo, un retrovirus). El vector retroviral puede ser un derivado de un retrovirus murino o aviar. Ejemplos de vectores retrovirales en los que se puede insertar un único gen extraño incluyen, pero no se limitan a: Virus de la leucemia murina de Moloney (MoMuLV), virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), virus del tumor mamario murino (MuMTV) y virus del sarcoma de Rous (VSR). Varios vectores retrovirales adicionales pueden incorporar múltiples genes. Todos estos vectores pueden transferir o incorporar un gen para un marcador seleccionable de modo que las células transducidas puedan identificarse y generarse. Los vectores retrovirales pueden hacerse específicos de la diana uniendo, por ejemplo, un azúcar, un glicolípido o una proteína. El direccionamiento preferido se logra mediante el uso de un anticuerpo. Los expertos en la técnica reconocerán que pueden insertarse secuencias de polinucleótidos específicas en el genoma retroviral o unirse a una envoltura viral para permitir la administración específica de diana del vector retroviral que contiene uno o más de los agentes de la presente divulgación.

[0853] Alternativamente, las células de cultivo tisular pueden transfectarse directamente con plásmidos que codifican los genes estructurales retrovirales (gag, pol y env), mediante transfección convencional con fosfato de calcio. A continuación, estas células se transfectan con el plásmido vector que contiene los genes de interés. Las células resultantes liberan el vector retroviral en el medio de cultivo.

[0854] Otro sistema de administración dirigido para uno o más de los agentes de la presente divulgación es un sistema de dispersión coloidal. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen, por ejemplo, complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. En determinadas realizaciones, el sistema coloidal preferido de la presente divulgación es un liposoma. Los liposomas son vesículas de membrana artificial que son útiles como vehículos de administraciónin vitroein vivo. El ARN, el ADN y los viriones intactos pueden encapsularse dentro del interior acuoso y administrarse a las células en una forma biológicamente activa [Fraley, et al. (1981) Trends Biochem. Sci., 6:77]. En la técnica se conocen métodos para la transferencia génica eficaz usando un vehículo de liposoma [Mannino, et al. (1988) Biotechniques, 6:682, 1988].

[0855] La composición del liposoma suele ser una combinación de fosfolípidos, que puede incluir un esteroide (por ejemplo, colesterol). Las características físicas de los liposomas dependen del pH, la fuerza iónica y la presencia de cationes divalentes. También pueden usarse otros fosfolípidos u otros lípidos incluyendo, por ejemplo, un compuesto de fosfatidilo (por ejemplo, fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, un esfingolípido, un cerebrósido y un gangliósido), fosfatidilcolina de huevo, dipalmitoilfosfatidilcolina y diestearoilfosfatidilcolina. El direccionamiento de liposomas también es posible basándose en, por ejemplo, especificidad de órgano, especificidad de célula y especificidad de orgánulo y se conoce en la técnica.

[0856] Ejemplificación

[0857] La invención que ahora se describe en general, se entenderá más fácilmente por referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen simplemente con fines de ilustración de determinadas realizaciones y realizaciones de la presente invención, y no pretenden limitar la invención.

[0858] Ejemplo 1. Generación de un heterodímero ActRIIB-Fc: ALK7-Fc

[0859] Los solicitantes construyeron un complejo heteromérico ActRIIB-Fc: ALK7-Fc soluble que comprende los dominios extracelulares de ActRIIB humano y ALK7 humano, que se fusionan cada uno a un dominio Fc con un ligador posicionado entre el dominio extracelular y el dominio Fc. Los constructos individuales se denominan ActRIIB-Fc y ALK7-Fc, respectivamente.

[0860] Una metodología para promover la formación de complejos heteroméricos ActRIIB-Fc: ALK7-Fc, a diferencia de los complejos homodiméricos ActRIIB-Fc o ALK7-Fc, es introducir alteraciones en la secuencia de aminoácidos de los dominios Fc para guiar la formación de complejos heteroméricos asimétricos. En esta divulgación se describen muchos enfoques diferentes para hacer pares de interacción asimétrica usando dominios Fc.

[0861] En un enfoque, ilustrado en las secuencias de polipéptidos de ActRIIB-Fc y ALK7-Fc descritas a continuación, respectivamente, un dominio Fc se altera para introducir aminoácidos catiónicos en la cara de interacción, mientras que el otro dominio Fc se altera para introducir aminoácidos aniónicos en la cara de interacción. El polipéptido de fusión ActRIIB-Fc y el polipéptido de fusión ALK7-Fc emplean cada uno el líder del activador de plasminógeno tisular (TPA): MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (SEQ ID NO: 70).

[0862] La secuencia del polipéptido ActRIIB-Fc (SEQ ID NO: 71) se muestra a continuación:

[0865]

[0867] La secuencia líder (señal) y el enlazador están subrayados. Para promover la formación del heterodímero ActRIIB-Fc:ALK7-Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, pueden introducirse dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando aminoácidos ácidos con lisina) en el dominio Fc de la proteína de fusión ActRIIB tal como se indica mediante el subrayado doble anteriormente. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71 puede proporcionarse opcionalmente con lisina (K) eliminada del extremo carboxiterminal.

[0868] Esta proteína de fusión ActRIIB-Fc está codificada por la siguiente secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 72):

[0871]

[0873] El polipéptido de fusión ActRIIB-Fc maduro (SEQ ID NO: 73) es como sigue, y opcionalmente se puede proporcionar con lisina eliminada del extremo C.

[0874]

[0876] La forma complementaria de la proteína de fusión ALK7-Fc (SEQ ID NO: 74) es la siguiente:

[0879]

[0881] La secuencia señal y la secuencia enlazadora están subrayadas. Para promover la formación del heterodímero ActRIIB-Fc:ALK7-Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, pueden introducirse dos sustituciones de aminoácidos (que reemplazan lisinas con ácidos aspárticos) en el dominio Fc de la proteína de fusión tal como se indica mediante el subrayado doble anterior. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 puede proporcionarse opcionalmente con una lisina añadida en el extremo C.

[0882] Esta proteína de fusión ALK7-Fc está codificada por el siguiente ácido nucleico (SEQ ID NO: 75):

[0885]

[0887] Se espera que la secuencia de la proteína de fusión ALK7-Fc madura (SEQ ID NO: 76) sea la siguiente y opcionalmente se puede proporcionar con una lisina añadida en el extremo C.

[0890]

[0892] Las proteínas de fusión ActRIIB-Fc y ALK7-Fc de SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 74, respectivamente, pueden coexpresarse y purificarse a partir de una línea celular CHO para dar lugar a un complejo heteromérico que comprende ActRIIB-Fc:ALK7-Fc.

[0893] En otro enfoque para promover la formación de complejos de heteromultímeros usando proteínas de fusión de Fc asimétricas, los dominios Fc se alteran para introducir interacciones hidrófobas complementarias y un enlace disulfuro intermolecular adicional tal como se ilustra en las secuencias de polipéptidos de ActRIIB-Fc y ALK7-Fc descritas a continuación.

[0894] La secuencia del polipéptido ActRIIB-Fc (SEQ ID NO: 77) se muestra a continuación:

[0897]

[0899] La secuencia líder y el enlazador están subrayados. Para promover la formación del heterodímero ActRIIB-Fc:ALK7-Fc en lugar de cualquiera de los posibles complejos homodiméricos, pueden introducirse dos sustituciones de aminoácidos (reemplazando una serina por una cisteína y una treonina por un triptófano) en el dominio Fc de la proteína de fusión tal como se indica mediante el subrayado doble anterior. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 puede proporcionarse opcionalmente con lisina eliminada del extremo C.

[0900] El polipéptido de fusión ActRIIB-Fc maduro (SEQ ID NO: 78) es como sigue y opcionalmente se puede proporcionar con lisina eliminada del extremo carboxiterminal.

[0903]

[0905] La forma complementaria del polipéptido de fusión ALK7-Fc (SEQ ID NO: 79) es la siguiente:

[0908]

[0910] La secuencia líder y la secuencia enlazadora están subrayadas. Para guiar la formación de heterodímeros con el polipéptido de fusión ActRIIB-Fc de SEQ ID NO: 76 y 78 anteriores, se pueden introducir cuatro sustituciones de aminoácidos en el dominio Fc del polipéptido de fusión ALK7 como se indica por el subrayado doble anterior. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 puede proporcionarse opcionalmente con la lisina eliminada del extremo C.

[0911] Se espera que la secuencia de la proteína de fusión ALK7-Fc madura (SEQ ID NO: 80) sea la siguiente y opcionalmente se puede proporcionar con la lisina eliminada del extremo C.

[0914]

[0915] Las proteínas ActRIIB-Fc y ALK7-Fc de SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 79, respectivamente, pueden coexpresarse y purificarse a partir de una línea celular CHO, para dar lugar a un complejo heteromérico que comprende ActRIIB-Fc:ALK7-Fc.

[0916] La purificación de diversos complejos ActRIIB-Fc:ALK7-Fc podría lograrse mediante una serie de etapas de cromatografía en columna, incluyendo, por ejemplo, tres o más de las siguientes, en cualquier orden: cromatografía de proteína A, cromatografía de Q sefarosa, cromatografía de fenilsefarosa, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio catiónico. La purificación podría completarse con filtración viral e intercambio de tampón.

[0917] Ejemplo 2. Perfil de unión al ligando del heterodímero ActRIIB-Fc:ALK7-Fc en comparación con el homodímero ActRIIB-Fc y el homodímero ALK7-Fc

[0918] Se usó un ensayo de unión basado en Biacore<™>para comparar la selectividad de unión al ligando del complejo heterodimérico ActRIIB-Fc: ALK7-Fc descrito anteriormente con la de los complejos homodiméricos ActRIIB-Fc y ALK7-Fc. El heterodímero ActRIIB-Fc: ALK7-Fc, el homodímero ActRIIB-Fc y el homodímero ALK7-Fc se capturaron independientemente en el sistema utilizando un anticuerpo anti-Fc. Los ligandos se inyectaron y se dejaron fluir sobre la proteína receptora capturada. Los resultados se resumen en la tabla a continuación, en la que las velocidades de disociación del ligando (k<d>) más indicativas de trampas de ligando eficaces se indican mediante sombreado en gris.

[0921]

[0923] Estos datos de unión comparativos demuestran que el heterodímero ActRIIB-Fc: ALK7-Fc tiene un perfil de unión/selectividad alterado con respecto al homodímero ActRIIB-Fc o al homodímero ALK7-Fc. Curiosamente, cuatro de los cinco ligandos con la unión más fuerte al homodímero ActRIIB-Fc (activina A, BMP10, GDF8 y GDF11) exhiben una unión reducida al heterodímero ActRIIB-Fc:ALK7-Fc, siendo la excepción la activina B que retiene una unión fuerte al heterodímero. De manera similar, tres de los cuatro ligandos con unión intermedia al homodímero ActRIIB-Fc (GDF3, BMP6 y particularmente BMP9) exhiben una unión reducida al heterodímero ActRIIB-Fc: ALK7-Fc, mientras que la unión a activina AC aumenta para convertirse en la segunda interacción de ligando más fuerte con el heterodímero en general. Finalmente, la activina C y BMP5 se unen inesperadamente al heterodímero ActRIIB-Fc:ALK7 con fuerza intermedia a pesar de no unirse (activina C) o unirse débilmente (BMP5) al homodímero ActRIIB-Fc. El resultado neto es que el heterodímero ActRIIB-Fc:ALK7-Fc posee un perfil de unión a ligando claramente diferente del del homodímero ActRIIB-Fc o del homodímero ALK7-Fc, que no se une a ninguno de los ligandos anteriores. Véase, la figura 6.

[0924] Por lo tanto, estos resultados demuestran que el heterodímero ActRIIB-Fc: ALK7-Fc es un antagonista más selectivo de activina B y activina AC en comparación con el homodímero ActRIIB-Fc. Además, el heterodímero ActRIIB-Fc: ALK7-Fc exhibe la propiedad inusual de unión robusta a activina C. Por consiguiente, un heterodímero ActRIIB-Fc: ALK7-Fc será más útil que un homodímero ActRIIB-Fc en determinadas aplicaciones donde dicho antagonismo selectivo es ventajoso. Los ejemplos incluyen aplicaciones terapéuticas en las que es deseable retener el antagonismo de activina B o activina AC pero disminuir el antagonismo de uno o más de activina A, GDF3, GDF8, GDF11, BMP9 o BMP10. También se incluyen aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico o analíticas en las que es deseable antagonizar la activina C o, en función de la similitud entre la activina C y la activina E, la activina E.

[0925] Ejemplo 3. ALK7: El tratamiento con heteromultímero ActRIIB suprime la fibrosis y la inflamación renal y reduce la lesión renal.

[0926] Se evaluaron los efectos del heterodímero ALK7-Fc:ActRIIB-Fc descrito en el ejemplo 2 sobre la enfermedad renal en un modelo de obstrucción ureteral unilateral de ratón. Véase, por ejemplo, Klahr y Morrissey (2002) Am J Physiol Renal Physiol 283: F861-F875.

[0927] Veinticuatro ratones macho C57BL/6 de 12 semanas de edad se sometieron a ligadura ureteral unilateral izquierda dos veces a nivel del polo inferior del riñón. Después de 3 días, se sacrificaron por eutanasia ocho ratones y se recolectaron riñones de animales individuales para evaluar la lesión renal. Los ratones restantes se aleatorizaron en dos grupos: i) ocho ratones se inyectaron por vía subcutánea con el heterodímero ALK7-Fc:ActRIIB-Fc a una dosis de 10 mg/kg el día 3, el día 7, el día 10 y el día 14 después de la cirugía y a ii) ocho ratones se inyectaron por vía subcutánea con control de vehículo, solución salina tamponada con fosfato (PBS), el día 3, el día 7, el día 10 y el día 14 después de la cirugía. Ambos grupos se sacrificaron el día 17 de acuerdo con las Pautas de Cuidado Animal pertinentes. Se recolectaron la mitad de los riñones de animales individuales para el análisis histológico (H&E y tinción tricrómica de Masson), tanto del riñón UUO como del riñón contralateral, y se utilizaron 1/4 de los riñones para la extracción de ARN (RNeasy Midi Kit, Qiagen, IL).

[0928] Se realizó un análisis de expresión génica en muestras de riñón UUO para evaluar los niveles de varios genes. Se realizó QRT-PCR en un sistema de detección de PCR en tiempo real CFX Connect<™>(Bio-Rad, CA) para evaluar la expresión de diversos genes fibróticos (Col1a1, Col3a1, fibronectina, PAI-1, CTGF y a-SMA), genes inflamatorios (Tnfa y MCP1), citocinas (TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3 y activina A), genes de lesión renal (NGAL), factor 1 alfa inducible por hipoxia (HIF1a) y receptor de activina A (ActRIIA). Véase, la figura 13. El tratamiento de ratones con ALK7-Fc: heterodímero ActRIIB-Fc suprimió significativamente la expresión de genes fibróticos e inflamatorios, inhibió la regulación positiva de TGFβ 1/2/3, activina A y ActRIIa y redujo la lesión renal. Los datos histológicos confirmaron que el tratamiento con el heterodímero ALK7-Fc:ActRIIB-Fc inhibió significativamente la fibrosis renal y redujo la lesión renal en el modelo UUO.

[0929] En conjunto, estos datos demuestran que el tratamiento con el heteromultímero ALK7:ActRIIB suprime la fibrosis y la inflamación renales y reduce la lesión renal. Además, estos datos indican que otros antagonistas ALK7:ActRIIB pueden ser útiles en el tratamiento o la prevención de la enfermedad renal incluyendo, por ejemplo, antagonistas de ligandos de unión a ALK7 y/o ActRIIB (por ejemplo, anticuerpos de ligando y otras trampas de ligando tales como folistatina, Cerberus y Lefty), antagonistas de receptores de ALK7 y/o ActRIIB, antagonistas de mediadores de señalización aguas abajo de ALK7 y/o ActRIIB (por ejemplo, Smads) y antagonistas de correceptores de la superfamilia de TGFβ (por ejemplo, antagonistas de Crypto o Cryptic).

[0930] Ejemplo 4. ALK7: El heteromultímero ActRIIB aumenta la lipólisis en los adipocitos.

[0931] La lipólisis es la hidrólisis de triglicéridos dentro de la célula en glicerol y ácidos grasos libres. El glicerol y los ácidos grasos libres se liberan en el torrente sanguíneo o en los medios de cultivo. Si bien la lipólisis se produce esencialmente en todas las células, es más abundante en los adipocitos blancos y marrones. Se cree que la señalización de ALK7 suprime la lipólisis y, en consecuencia, conduce a la acumulación de grasa en los adipocitos y el tejido adiposo. Por consiguiente, se evaluaron los efectos del heterodímero ALK7-Fc:ActRIIB-Fc descrito en el ejemplo 2 sobre la lipólisis en adipocitos.

[0932] Específicamente, se hicieron crecer células 3T3-L1 (suministradas por ATCC; ATCC<®>CL-173<™>) en medio de Eagle modificado por Dulbecco (ATCC; ATCC<®>30-2002<™>) que contenía suero bovino al 10 % (Life Technologies; 16170-060) hasta alcanzar la confluencia. Para inducir la diferenciación, a los 2 días posteriores a la confluencia, el medio se reemplazó por medio Eagle modificado de Dulbecco fresco (ATCC; ATCC<®>30-2002<™>) que contenía suero bovino fetal al 10 % (Life Technologies; 10082147), dexametasona (Sigma, D8893), IBMX (Sigma, 17018) e insulina (Sigma, I0516) durante 2 semanas. Se utilizó la acumulación de gotitas de lípidos en las células, tal como se determinó mediante microscopía, para confirmar una diferenciación completa en células de adipocitos maduras. Los adipocitos se trataron durante la noche con vehículo (PBS), activina B (50 ng/ml) o se cotrataron con activina B (50 ng/ml) y heterodímero ALK7-Fc:ActRIIB-Fc (5 µg/ml). Se lavaron las células dos veces con PBS y se incubaron con tampón de ensayo de lipólisis (suministrado por Abcam; ab185433). Se recogió el tampón de ensayo de lipólisis después de 3 horas y se midieron los niveles de glicerol de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Abcam; ab185433). Se determinó que el heterodímero ALK7-Fc:ActRIIB-Fc aumentó significativamente la actividad de lipólisis en un 44,36 % en este ensayo basado en células.

[0934] Por consiguiente, estos datos demuestran que el heterodímero ALK7-Fc:ActRIIB-Fc puede usarse para antagonizar la supresión de lipólisis mediada por ALK7 y, por lo tanto, aumentar la degradación de ácidos grasos en adipocitos. Además, estos datos indican que los heterodímeros ALK7-Fc:ActRIIB-Fc así como otros antagonistas ALK7:ActRIIB, tales como los divulgados en el presente documento, pueden usarse para tratar una variedad de trastornos o afecciones asociadas con baja actividad de lipólisis y/o acumulación excesiva de ácidos grasos en células, particularmente adipocitos, incluyendo por ejemplo, obesidad, diabetes, resistencia a insulina; síndrome metabólico, enfermedad de hígado graso y otras enfermedades o afecciones metabólicas, particularmente las asociadas con niveles de exceso de grasa.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Heteromultímero recombinante que comprende un polipéptido de ALK7 y un polipéptido de ActRIIB para su uso en un método para tratar un trastorno renal en un sujeto que lo necesita, en donde:

(i) el polipéptido de ALK7 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 100 % idéntica a los aminoácidos 28-92 de SEQ ID NO: 9, y

(ii) el polipéptido ActRIIB comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90 %, el 95 %, el 98 % o el 100 % idéntica a 29-109 SEQ ID NO: 1,

en donde el heteromultímero se une a uno o más de: activina B, activina C y activina AC, y

en donde el polipéptido ALK7 y/o polipéptido ActRIIB son proteínas de fusión que comprenden además un dominio heterólogo.

2. Heteromultímero recombinante para su uso según la reivindicación 1, en donde el dominio heterólogo comprende un dominio de inmunoglobulina Fc.

3. Heteromultímero recombinante para su uso según la reivindicación 2, en donde el dominio de inmunoglobulina Fc comprende una o más modificaciones de aminoácidos que promueven la formación de heterodímeros y/o inhiben la formación de homodímeros.

4. Heteromultímero recombinante para su uso según la reivindicación 3, en donde el dominio heterólogo comprende un dominio de inmunoglobulina Fc de una inmunoglobulina IgG.

5. Heteromultímero recombinante para su uso según la reivindicación 4, en donde la proteína de fusión comprende además un dominio enlazador situado entre el dominio ALK7 y el dominio heterólogo y/o un dominio enlazador situado entre el dominio ActRIIB y el dominio heterólogo.

6. Heteromultímero recombinante para su uso de según la reivindicación 5, en donde el polipéptido ALK7 y/o polipéptido ActRIIB comprende uno o más residuos de aminoácidos modificados seleccionados del grupo que consiste en: un aminoácido glicosilado, un aminoácido PEGilado, un aminoácido farnesilado, un aminoácido acetilado, un aminoácido biotinilado y un aminoácido conjugado con un resto lipídico.

7. Heteromultímero recombinante para su uso según la reivindicación 6, en donde el polipéptido de ALK7 y/o polipéptido de ActRIIB está glicosilado y tiene un patrón de glicosilación que puede obtenerse a partir de una línea celular de ovario de hámster chino.

8. Heteromultímero recombinante para su uso según la reivindicación 7, en donde el heteromultímero es un heterodímero de ALK7:ActRIIB.

9. Heteromultímero recombinante para su uso según la reivindicación 1, en donde el polipéptido de ALK7 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90 %, el 95 % o el 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, y en donde el polipéptido de ActRIIB comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

10. Heteromultímero recombinante para su uso según la reivindicación 9, en donde el polipéptido de ALK7 y/o polipéptido de ActRIIB son proteínas de fusión que comprenden además un dominio heterólogo, en donde el dominio heterólogo es un dominio de inmunoglobulina Fc.

11. Heteromultímero recombinante para su uso según la reivindicación 10, en donde el dominio de inmunoglobulina Fc es un dominio de inmunoglobulina IgG1.

12. Heteromultímero recombinante para su uso según la reivindicación 11, en donde la proteína de fusión comprende además un dominio enlazador situado entre el dominio ALK7 y el dominio heterólogo y/o un dominio enlazador situado entre el dominio ActRIIB y el dominio heterólogo.

13. Heteromultímero recombinante para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde el trastorno renal se selecciona del grupo que consiste en fibrosis renal y supresión de la inflamación renal.