ES3057886T3 - Novel rsv rna molecules and compositions for vaccination - Google Patents

Novel rsv rna molecules and compositions for vaccination

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ES3057886T3
ES3057886T3 ES23164447T ES23164447T ES3057886T3 ES 3057886 T3 ES3057886 T3 ES 3057886T3 ES 23164447 T ES23164447 T ES 23164447T ES 23164447 T ES23164447 T ES 23164447T ES 3057886 T3 ES3057886 T3 ES 3057886T3
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Abstract

La presente invención se refiere a un ácido nucleico artificial, en particular a un ARN artificial, adecuado para su uso en el tratamiento y/o la profilaxis de una infección por el virus respiratorio sincitial (VRS) o un trastorno relacionado con dicha infección. La invención también se refiere a un método para tratar o prevenir un trastorno o enfermedad, así como a los usos médicos del ARN artificial, composiciones y vacunas. Asimismo, la invención se refiere a un kit, en particular a un kit de componentes, que comprende el ARN artificial, composiciones y vacunas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Nuevas moléculas y composiciones de ARN de VSR para la vacunación
[0003] Introducción
[0004] La presente invención está dirigida a un ARN artificial adecuado para su uso en el tratamiento o la profilaxis de una infección por el virus sincitial respiratorio (VSR) o de un trastorno relacionado con dicha infección. El ARN artificial de la invención comprende:
[0005] a) al menos una región 5’ no traducida (5’-UTR) heteróloga y/o al menos una región 3’ no traducida (3’-UTR) heteróloga y
[0006] b) al menos una secuencia codificante unida funcionalmente a dicha 3’-UTR y/o 5’-UTR que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de una proteína de fusión (F) de VSR, donde la al menos una región codificante codifica al menos una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la SEQ ID NO: 4957 o con una identidad de al menos el 97% con dicha secuencia,
[0007] donde el al menos un péptido o proteína antigénica es una proteína F con el C-terminal eliminado (F-del) y donde la proteína F de VSR está diseñada para estabilizar el antígeno en una conformación en pre-fusión, donde la proteína F de VSR comprende una mutación DSCav1 (S155C, S290C, S190F y V207L),
[0008] donde la proteína F de VSR comprende las dos subunidades F2 y F1 en una única cadena polipeptídica, estando conectados F2 y F1 mediante un elemento enlazador, preferentemente un enlazador GS, para generar una proteína estable F2-enlazador-F1, donde dicha proteína F2-enlazador-F1 no presenta aa104-aa144 y
[0009] donde la proteína de VSR comprende al menos una mutación seleccionada de (A149C, Y458C), donde la posición y la numeración de un residuo aminoácido se refiere a la posición del respectivo residuo aminoácido en la SEQ ID NO: 68.
[0010] El ARN artificial se caracteriza preferiblemente por una mayor eficacia de expresión de las regiones codificantes unidas operativamente a dichos elementos UTR. La presente invención también está dirigida a composiciones y vacunas que comprenden dicho ARN artificial, opcionalmente comprendiendo al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable u opcionalmente en asociación con un portador polimérico, una proteína o péptido policatiónico, o una nanopartícula lipídica (LNP) como se define en las reivindicaciones. Además, la invención se refiere a un kit, particularmente a un kit de partes, que comprende el ARN artificial o la composición o la vacuna como se definen en las reivindicaciones. La invención se dirige además al ARN artificial, la composición o la vacuna o los componentes del kit o kit de partes para su uso como un medicamento tal como se define en las reivindicaciones.
[0011] El virus sincitial respiratorio (VSR) es un ARN-virus de cadena negativa no segmentado con envoltura de la familia Paramyxoviridae, género Pneumovirus. Es la causa más común de bronquiolitis y neumonía entre los niños en su primer año de vida. El VSR también causa infecciones repetidas, incluida la enfermedad grave del tracto respiratorio inferior, que puede ocurrir a cualquier edad, especialmente entre los ancianos o aquellos con el sistema cardíaco, pulmonar o inmunológico comprometido. Actualmente, se emplea la inmunización pasiva para prevenir enfermedades graves causadas por la infección por VSR, especialmente en bebés prematuros, displasia broncopulmonar o cardiopatía congénita.
[0012] El tratamiento recomendado de la bronquiolitis por VSR consiste principalmente en asistencia respiratoria e hidratación. No se recomienda una terapia antiviral específica. El anticuerpo monoclonal neutralizante Palivizumab se utiliza para la profilaxis de los lactantes con mayor riesgo de infección grave, pero es demasiado caro y poco práctico para su uso universal. Actualmente, no existe una vacuna contra el VSR autorizada/aprobada y el desarrollo de una vacuna contra el VSR segura y eficaz es una prioridad de salud pública global.
[0013] En un ensayo vacunaL en la década de 1960, se inmunizó a bebés y niños pequeños con una preparación de RSV de virión completo inactivado con formalina (FIRSV) o una preparación de paramixovirus equivalente (FIPIV). El cinco por ciento de los sujetos que fueron inmunizados con FI-PIV y luego naturalmente infectados por VSR durante la siguiente temporada de VSR fueron hospitalizados; el 80% de los que fueron inmunizados con FI-RSV y luego infectados por VSR fueron hospitalizados y dos niños murieron. Este aumento de una infección por VSR debido a la vacunación es un problema específico para el desarrollo de vacunas contra las infecciones por VSR.
[0014] Por tanto, las infecciones por EL virus sincitial respiratorio (VSR) son la mayor necesidad de vacunas infantiles no satisfecha en los países desarrollados y una importante necesidad de vacuna infantil no satisfecha en todo el mundo.
[0015] Más de 40 años de esfuerzo aún no han dado como resultado una vacuna contra el VSR autorizada para humanos. A pesar del anticuerpo monoclonal humanizado Palivizumab mencionado anteriormente, se han desarrollado virus vacunales vivos atenuados que provocan una fuerte respuesta inmunitaria, pero que no se recomiendan para su uso en los grupos objetivo específicos (lactantes, niños, ancianos y pacientes inmunodeprimidos). Además, se utilizaron vectores de ADN que expresan la proteína F de VSR que porta epítopos de células B para inducir la producción de anticuerpos neutralizantes. En este contexto, la WO2008/077527 y la WO96/040945 describen vectores que comprenden secuencias de ADN que codifican la proteína F de VSR para su uso como vacunas. Sin embargo, el uso de ADN como vacuna puede ser peligroso debido a la inserción no deseada en el genoma, lo que posiblemente lleve a la interrupción de genes funcionales y cáncer o la formación de anticuerpos anti-ADN.
[0016] La WO2015/024668 describe secuencias de ARN que codifican péptidos y proteínas antigénicos de VSR seleccionados de la proteína de fusión F, la glicoproteína G, la proteína hidrófoba corta SH, la proteína de matriz M, la nucleoproteína N, la polimerasa grande L, la proteína M2-1, la proteína M2-2, la fosfoproteína P, la proteína no estructural NS1 o la proteína no estructural NS2, y una composición antigénica que comprende ARN complejado con protamina adecuado para la administración intradérmica.
[0017] La WO2017/070622 describe una vacuna que comprende un ARN que codifica péptidos antigénicos de VSR y proteínas seleccionadas entre la glicoproteína F y la glicoproteína G, donde el ARN se formula en nanopartículas lipídicas.
[0018] La WO2014/460463 se refiere a antígenos del virus sincitial respiratorio (VSR) que incluyen una proteína recombinante VSR F estabilizada en conformación de pre-fusión. También se mencionan ácidos nucleicos que codifican los antígenos y métodos de producir los antígenos. También se describen métodos para generar una respuesta inmune en un sujeto.
[0019] Aparte de algunos enfoques citados anteriormente, sigue existiendo una necesidad médica no satisfecha de una vacuna eficaz para la profilaxis o el tratamiento de las infecciones por VSR.
[0020] Así, el objeto subyacente de la invención es proporcionar un nuevo ARN artificial que codifique péptidos o proteínas antigénicos del VSR y composiciones/vacunas que comprendan dicho ARN para su uso como vacuna para la profilaxis o el tratamiento de infecciones por VSR, particularmente en bebés, recién nacidos, mujeres embarazadas, ancianos y pacientes inmunodeprimidos.
[0021] Además, sería deseable que una composición o vacuna basada en ARN tuviera algunas de las siguientes características ventajosas:
[0022] - Traducción mejorada de constructos de ARN en el sitio de inyección (por ejemplo, músculo)
[0023] - Inducción muy eficaz de respuestas inmunitarias específicas de antígeno de VSR contra el péptido o proteína antigénica codificada en dosis y régimen de dosificación muy bajos.
[0024] - Idoneidad para la inmunización maternal
[0025] - Idoneidad para la vacunación de lactantes y/o recién nacidos
[0026] - Idoneidad para la administración intramuscular
[0027] - Inducción de una respuesta inmune humoral funcional específica del VSR
[0028] - Inducción de células B de memoria específicas de VSR
[0029] - Inicio más rápido de la protección inmunitaria contra el VSR
[0030] - Longevidad de las respuestas inmunitarias inducidas contra el VSR
[0031] - Inducción de amplias respuestas celulares de las células T contra el VRS
[0032] - Inducción de un entorno proinflamatorio (local y transitorio)
[0033] - Sin inducción de respuesta sistémica de citocinas o quimiocinas después de la aplicación de la vacuna
[0034] - Buena tolerabilidad, sin efectos secundarios, no tóxico,
[0035] - Sin realce de una infección por VRS debido a la vacunación
[0036] - Características de estabilidad ventajosas de la vacuna.
[0037] - Velocidad, adaptabilidad, simplicidad y escalabilidad de la producción de vacunas contra el VSR
[0038] Los objetos descritos anteriormente se resuelven mediante la materia objeto reivindicada.
[0039] Definiciones
[0040] En aras de la claridad y la legibilidad, se proporcionan las siguientes definiciones. Cualquier característica técnica mencionada para estas definiciones puede leerse en todas y cada una de las formas de realización de la invención. Pueden proporcionarse específicamente definiciones y explicaciones adicionales en el contexto de estas realizaciones.
[0041] Los porcentajes en el contexto de los números deben entenderse como relativos al número total de los elementos respectivos. En otros casos, y salvo que el contexto indique lo contrario, los porcentajes deben entenderse como porcentajes en peso (% en peso).
[0042] Respuesta inmune adaptativa: El término "respuesta inmune adaptativa" como se usa aquí será reconocido y entendido por la persona experta en la técnica y, por ejemplo, se pretende referir a una respuesta específica de antígeno del sistema inmune (el sistema inmune adaptativo). La especificidad del antígeno permite generar respuestas que se adaptan a patógenos o células infectadas con patógenos específicas. La capacidad de montar estas respuestas personalizadas generalmente se mantiene en el cuerpo mediante "células de memoria" (células B). En el contexto de la invención, el antígeno es proporcionado por la secuencia de ARN artificial codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica.
[0043] Antígeno: El término "antígeno", como se usa aquí, será reconocido y entendido por la persona experta en la técnica y, por ejemplo, se pretende referir a una sustancia que puede ser reconocida por el sistema inmune, preferiblemente por el sistema inmune adaptativo, y que es capaz de desencadenar una respuesta inmune específica de antígeno, por ejemplo por formación de anticuerpos y/o células T específicas de antígeno como parte de una respuesta inmune adaptativa. Normalmente, un antígeno puede ser o puede comprender un péptido o proteína que puede ser presentada por MHC a las células T. También fragmentos, variantes y derivados de péptidos o proteínas derivados de, por ejemplo, la proteína VSR F que comprende al menos un epítopo se entiende como antígeno en el contexto de la invención. En el contexto de la presente invención, un antígeno puede ser el producto de la traducción de un ARN artificial proporcionado como se especifica en este documento.
[0044] Péptido o proteína antigénica: El término "péptido o proteína antigénica" será reconocido y entendido por el experto en la técnica y, por ejemplo, se pretende referir a un péptido, proteína (o poliproteína) derivado de una proteína/poliproteína (antigénica) que puede estimular el sistema inmune adaptativo del cuerpo para proporcionar una respuesta inmunitaria adaptativa. Por tanto, un "péptido o proteína antigénica" comprende al menos un epítopo (como se define aquí) o antígeno (como se define aquí) de la proteína de la que se deriva (por ejemplo, en el contexto de la invención, un péptido o proteína del VSR, preferiblemente la proteína F de VSR o variantes de la misma).
[0045] Ácido nucleico artificial: El término "ácido nucleico artificial" como se usa aquí será reconocido y entendido por la persona experta en la técnica y, por ejemplo, se pretende referir a un ácido nucleico artificial que no existe naturalmente. Un ácido nucleico artificial puede ser una molécula de ADN, una molécula de ARN o una molécula híbrida que comprende partes de ADN y ARN. Normalmente, los ácidos nucleicos artificiales pueden diseñarse y/o generarse mediante métodos de ingeniería genética para corresponderse con una secuencia artificial de nucleótidos deseada (secuencia heteróloga). En este contexto, una secuencia artificial normalmente es una secuencia que puede no existir de forma natural, es decir, se diferencia de la secuencia de tipo salvaje en al menos un nucleótido. El término "tipo salvaje" como se usa aquí será reconocido y entendido por la persona experta en la técnica y, por ejemplo, se pretende referir a una secuencia que existe en la naturaleza. Además, el término "ácido nucleico artificial" no se limita a "una sola molécula" sino que, típicamente, se entiende que comprende un conjunto de moléculas esencialmente idénticas.
[0046] ARN artificial: El término "ARN artificial" como se usa aquí se refiere a un ARN que no se produce de forma natural. En otras palabras, un ARN artificial puede entenderse como una molécula de ácido nucleico no natural. Tales moléculas de ARN pueden no ser naturales debido a su secuencia individual (que no ocurre naturalmente, por ejemplo, secuencia codificante modificada en el contenido en G/C, UTR) y/o debido a otras modificaciones, por ejemplo modificaciones estructurales de nucleótidos que no ocurren naturalmente. Normalmente, el ARN artificial puede diseñarse y/o generarse mediante métodos de ingeniería genética para corresponderse con una secuencia artificial de nucleótidos deseada (secuencia heteróloga). En este contexto, un ARN artificial es normalmente una secuencia que puede no existir de forma natural, es decir, se diferencia de la secuencia de tipo salvaje en al menos un nucleótido. El término "ARN artificial" no se limita a "una sola molécula" sino que, típicamente, se entiende que comprende un conjunto de moléculas esencialmente idénticas. Por consiguiente, puede referirse a una pluralidad de moléculas de ARN esencialmente idénticas contenidas en una alícuota o una muestra. En el contexto de la invención, el ARN de la invención es un ARN artificial como se define aquí.
[0047] Catiónico: A menos que se desprenda claramente del contexto específico un significado diferente, el término "catiónico" significa que la estructura respectiva lleva una carga positiva, ya sea de forma permanente o no permanente, pero en respuesta a ciertas condiciones tales como el pH. Por tanto, el término "catiónico" cubre tanto "catiónico permanente" como "cationizable".
[0048] Cationizable: El término "cationizable" como se usa aquí significa que un compuesto, grupo o átomo está cargado positivamente a un pH más bajo y no está cargado a un pH más alto de su entorno. También en entornos no acuosos donde no se puede determinar el valor de pH, un compuesto, grupo o átomo cationizable está cargado positivamente a una alta concentración de iones de hidrógeno y no cargado a una baja concentración o actividad de iones de hidrógeno. Depende de las propiedades individuales del compuesto cationizable o policatiónico, en particular el pKa del respectivo grupo o átomo cationizable, a qué pH o concentración de iones de hidrógeno está cargado o no cargado.
[0049] En entornos acuosos diluidos, la fracción de compuestos, grupos o átomos cationizables que llevan una carga positiva puede estimarse utilizando la denominada ecuación de Henderson-Hasselbalch, que es bien conocida por el experto en la técnica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, si un compuesto o resto es cationizable, se prefiere que se cargue positivamente a un valor de pH de aproximadamente 1 a 9, preferiblemente 4 a 9, 5 a 8 o incluso 6 a 8, más preferiblemente de un valor de pH igual o inferior a 9, igual o inferior a 8, igual o inferior a 7, con mayor preferencia a valores de pH fisiológicos, por ejemplo aproximadamente 7,3 a 7,4, es decir bajo condiciones fisiológicas, particularmente bajo condiciones fisiológicas salinas de la célulain vivo. En otras realizaciones, se prefiere que el compuesto o resto cationizable sea predominantemente neutro a valores de pH fisiológicos, por ejemplo aproximadamente 7,0-7,4, pero se carga positivamente a valores de pH más bajos. En algunas realizaiones, el intervalo preferido de pKa para el compuesto o resto cationizable es de aproximadamente 5 a aproximadamente 7.
[0050] Secuencia codificante/región codificante: Los términos "secuencia codificante" o "región codificante" y la abreviatura correspondiente "cds" como se usa aquí serán reconocidos y entendidos por la persona experta en la técnica, y están destinados, por ejemplo, a hacer referencia a una secuencia de varios tripletes de nucleótidos que puede traducirse en un péptido o proteína. Una secuencia codificante en el contexto de la presente invención es preferiblemente una secuencia de ARN, que consta de varios nucleótidos que pueden dividirse por tres, que comienza con un codón de inicio y que preferiblemente termina con un codón de parada.
[0052] Composición: En el contexto de la invención, una "composición" se refiere a cualquier tipo de composición en la que los ingredientes especificados (por ejemplo, ARN artificial de la invención en asociación con LNP) pueden incorporarse, opcionalmente junto con cualquier otro constituyente, generalmente con al menos un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Así, la composición puede ser una composición seca tal como un polvo o gránulos, o una unidad sólida como una forma liofilizada o una tableta. Alternativamente, la composición puede estar en forma líquida y cada constituyente puede incorporarse independientemente en forma disuelta o dispersa (por ejemplo suspendida o emulsionada).
[0054] Compuesto: Como se usa en este documento, un "compuesto" significa una sustancia química que es un material que consiste en moléculas que tienen esencialmente la misma estructura química y propiedades. Para un compuesto molecular pequeño, las moléculas son típicamente idénticas con respecto a su composición atómica y configuración estructural. Para un compuesto macromolecular o polimérico, las moléculas de un compuesto son muy similares, pero no todas son necesariamente idénticas. Por ejemplo, un segmento de un polímero que está diseñado para constar de 50 unidades monoméricas también puede contener moléculas individuales con, por ejemplo, 48 o 53 unidades monoméricas.
[0056] Derivado de: El término "derivado de" cómo se usa en toda la presente descripción en el contexto de un ácido nucleico, es decir, para un ácido nucleico "derivado de" (otro) ácido nucleico, significa que el ácido nucleico que se deriva de (otro) ácido nucleico comparte al menos el 50%, preferiblemente al menos 55%, preferiblemente al menos 60%, preferiblemente al menos 65%, preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, más preferiblemente al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89% incluso más preferiblemente al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, incluso más preferiblemente al menos 95%, 96%, 97 %, y particularmente preferiblemente al menos 98%, 99% de identidad de secuencia con el ácido nucleico del que se deriva. El experto en la técnica es consciente de que la identidad de secuencia se calcula típicamente para los mismos tipos de ácidos nucleicos, es decir, para secuencias de ADN o para secuencias de ARN. Por tanto, se entiende que si un ADN se "deriva de" un ARN o si un ARN se "deriva de" un ADN, en un primer paso la secuencia de ARN se convierte en la secuencia de ADN correspondiente (en particular, reemplazando los uracilos (U) por timidinas (T) a lo largo de la secuencia) o, viceversa, la secuencia de ADN se convierte en la secuencia de ARN correspondiente (en particular reemplazando las timidinas (T) por uracilos (U) a lo largo de la secuencia). De aquí en adelante, se determina la identidad de secuencia de las secuencias de ADN o la identidad de secuencia de las secuencias de ARN. Preferiblemente, un ácido nucleico "derivado de" un ácido nucleico también se refiere a un ácido nucleico que está modificado en comparación con el ácido nucleico del que se deriva, por ejemplo, para aumentar aún más la estabilidad del ARN y/o prolongar y/o aumentar la producción de proteínas. No hace falta decir que se prefieren aquellas modificaciones que no perjudican la estabilidad del ARN, por ejemplo en comparación con el ácido nucleico del que se deriva. En el contexto de las secuencias de aminoácidos (por ejemplo, péptidos antigénicos o proteínas), el término "derivado de" significa que la secuencia de aminoácidos que se deriva de (otra) secuencia de aminoácidos (por ejemplo, proteína RSV F), comparte al menos el 50%, preferiblemente al menos 55%, preferiblemente al menos 60%, preferiblemente al menos 65%, preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, más preferiblemente al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89% incluso más preferiblemente al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, incluso más preferiblemente al menos 95%, 96%, 97%, y con particular preferencia al menos el 98%, 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la que se deriva.
[0057] Así, se entiende que si un péptido o proteína antigénica se "deriva de" una proteína de fusión (F) del VSR, los péptidos o proteína antigénicos que se "derivan de" dicha proteína F del VSR pueden representar una variante o fragmento de la proteína F del VSR, por ejemplo F0 (precursor de larga duración), F-del, F0_DSCav1, F_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut3 (como se especifica en este documento). Además, los péptidos o proteínas antigénicos que se "derivan de" dichas proteínas F del VSR (por ejemplo, F0, F-del, F0_DSCav1, F_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut3) pueden diferir en la secuencia de aminoácidos compartiendo un cierto porcentaje de identidad como se define anteriormente. En la Tabla 1 se proporcionan ejemplos adicionales adecuados de proteínas F de VSR a partir de las cuales se puede "derivar" un péptido o proteína antigénica.
[0059] Epítopo: El término "epítopo" (también llamado "determinante de antígeno" en la técnica) como se usa aquí será reconocido y entendido por el experto en la técnica y, por ejemplo, se pretende referir a epítopos de células T y epítopos de células B. Los epítopos de células T o partes de los péptidos o proteínas antigénicos pueden comprender fragmentos que tienen preferiblemente una longitud de aproximadamente 6 a aproximadamente 20 o incluso más aminoácidos, por ejemplo fragmentos procesados y presentados por moléculas MHC de clase I, preferiblemente con una longitud de aproximadamente 8 a aproximadamente 10 aminoácidos, por ejemplo 8, 9 o 10 (o incluso 11 o 12 aminoácidos), o fragmentos procesados y presentados por moléculas MHC de clase II preferiblemente con una longitud de aproximadamente 13 a aproximadamente 20 o incluso más aminoácidos, donde estos fragmentos pueden seleccionarse de cualquier parte de la secuencia de aminoácidos. Estos fragmentos son típicamente reconocidos por las células T en forma de un complejo que consiste en el fragmento de péptido y una molécula MHC, es decir, los fragmentos típicamente no se reconocen en su forma nativa. Los epítopos de células B son típicamente fragmentos ubicados en la superficie externa de antígenos de proteínas o péptidos (nativos), preferiblemente con 5 a 15 aminoácidos, más preferiblemente de 5 a 12 aminoácidos, incluso más preferiblemente de 6 a 9 aminoácidos, que pueden ser reconocido por anticuerpos, es decir, en su forma nativa. Además, dichos epítopos de proteínas o péptidos pueden seleccionarse de cualquiera de las variantes mencionadas aquí de tales proteínas o péptidos. En este contexto, los determinantes antigénicos pueden ser epítopos conformacionales o discontinuos que están compuestos de segmentos de las proteínas o péptidos como se definen aquí que son discontinuos en la secuencia de aminoácidos de las proteínas o péptidos como se definen en este documento pero que se juntan en la estructura tridimensional o epítopos continuos o lineales que se componen de una sola cadena polipeptídica. En el contexto de la presente invención, un epítopo puede ser el producto de la traducción de un ARN artificial proporcionado como se especifica en este documento.
[0061] Fragmento: El término "fragmento" como se usa en toda la presente descripción en el contexto de una secuencia de ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos puede ser típicamente una porción más corta de una secuencia de longitud completa de, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos. Por consiguiente, un fragmento típicamente consiste en una secuencia que es idéntica al tramo correspondiente dentro de la secuencia de longitud completa. Un fragmento preferido de una secuencia en el contexto de la presente invención consiste en un tramo continuo de entidades, tales como nucleótidos o aminoácidos, correspondientes a un tramo continuo de entidades en la molécula de la que se deriva el fragmento que representa al menos el 5%, 10%, 20%, preferiblemente al menos 30%, más preferiblemente al menos 40%, más preferiblemente al menos 50%, incluso más preferiblemente al menos 60%, incluso más preferiblemente al menos 70% y con total preferencia al menos 80% del total (es decir, de la longitud total) de la molécula de la que se deriva el fragmento (por ejemplo, proteína F de VSR). El término "fragmento" como se usa en toda la presente descripción en el contexto de proteínas o péptidos puede comprender típicamente una secuencia de una proteína o péptido como se define aquí que, con respecto a su secuencia de aminoácidos (o su ácido nucleico codificado molécula), está truncada N-terminal y/o C-terminal en comparación con la secuencia de aminoácidos de la proteína original (nativa) (o su molécula de ácido nucleico codificada). Por tanto, tal truncamiento puede ocurrir a nivel de aminoácidos o correspondientemente a nivel de ácido nucleico. Así, una identidad de secuencia con respecto a tal fragmento como se define en este documento puede referirse preferiblemente a la proteína o péptido completo como se define en este documento o a la molécula de ácido nucleico completa (codificante) de dicha proteína o péptido. En el contexto de los antígenos, tal fragmento puede tener una longitud de aproximadamente 6 a aproximadamente 20 o incluso más aminoácidos, por ejemplo fragmentos procesados y presentados por moléculas MHC de clase I preferiblemente con una longitud de aproximadamente 8 a aproximadamente 10 aminoácidos, por ejemplo 8, 9 o 10 (o incluso 6, 7, 11 o 12 aminoácidos), o fragmentos procesados y presentados por moléculas MHC de clase II preferiblemente con una longitud de aproximadamente 13 o más aminoácidos, por ejemplo 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o incluso más aminoácidos, donde estos fragmentos pueden seleccionarse de cualquier parte de la secuencia de aminoácidos. Estos fragmentos son típicamente reconocidos por las células T en forma de un complejo que consiste en el fragmento de péptido y una molécula MHC, es decir, los fragmentos típicamente no se reconocen en su forma nativa. Los fragmentos de proteínas o péptidos (por ejemplo, en el contexto de antígenos) pueden comprender al menos un epítopo de esas proteínas o péptidos. Además, también se puede entender que los dominios de una proteína, como el dominio extracelular, el dominio intracelular o el dominio transmembrana y las versiones abreviadas o truncadas de una proteína comprenden un fragmento de una proteína.
[0063] Heteróloga: Los términos "heteróloga" o "secuencia heteróloga" tal como se utilizan en la presente especificación en el contexto de una secuencia de ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos se refiere a una secuencia (por ejemplo ADN, ARN, aminoácido) será reconocida y entendida por la persona experta en la técnica, y se pretende referir a una secuencia que se deriva de otro gen, de otro alelo, de otra especie. Normalmente, se entiende que dos secuencias son "heterólogas" si no son derivables del mismo gen o en el mismo alelo. Es decir, aunque las secuencias heterólogas pueden derivarse del mismo organismo, naturalmente (en la naturaleza) no ocurren en la misma molécula de ácido nucleico, por ejemplo en el mismo ARN o en la misma proteína.
[0065] Respuesta inmune humoral: Los términos "inmunidad humoral" o "respuesta inmune humoral" serán reconocidos y entendidos por la persona experta en la técnica y, por ejemplo, se refieren a producción de anticuerpos mediada por células B y opcionalmente a procesos accesorios que acompañan a la producción de anticuerpos. Una respuesta inmune humoral puede caracterizarse típicamente, por ejemplo, por la activación de Th2 y la producción de citocinas, la formación de centros germinales y el cambio de isotipo, maduración de afinidad y generación de células de memoria. La inmunidad humoral también puede referirse típicamente a las funciones efectoras de los anticuerpos, que incluyen la neutralización de patógenos y toxinas, la activación clásica del complemento y la promoción de la fagocitosis y la eliminación de patógenos por opsonina.
[0067] Identidad (de una secuencia): El término "identidad", como se usa en toda la presente especificación en el contexto de una secuencia de ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos, será reconocido y entendido por la persona experta en la técnica y, por ejemplo, se pretende referir al porcentaje al cual dos secuencias son idénticas. Para determinar el porcentaje en el que dos secuencias son idénticas, por ejemplo las secuencias de ácido nucleico o las secuencias de aminoácidos como se definen aquí, preferiblemente las secuencias de aminoácidos codificadas por la secuencia de ácido nucleico artificial como se define en este documento o las secuencias de aminoácidos en sí mismas, se pueden alinear para compararlas posteriormente entre sí. Por tanto, por ejemplo, una posición de una primera secuencia puede compararse con la posición correspondiente de la segunda secuencia. Si una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo componente (residuo) que en una posición en la segunda secuencia, las dos secuencias son idénticas en esta posición. Si este no es el caso, las secuencias difieren en esa posición. Si se producen inserciones en la segunda secuencia en comparación con la primera secuencia, se pueden insertar espacios en la primera secuencia para permitir una alineación adicional. Si se producen eliminaciones en la segunda secuencia en comparación con la primera secuencia, se pueden insertar espacios en la segunda secuencia para permitir una alineación adicional. El porcentaje en el que dos secuencias son idénticas es entonces función del número de posiciones idénticas dividido entre el número total de posiciones, incluidas aquellas posiciones que sólo están ocupadas en una secuencia. El porcentaje en el que dos secuencias son idénticas se puede determinar mediante un algoritmo matemático. Un ejemplo preferido, pero no limitativo, de algoritmo matemático que se puede usar es el algoritmo integrado en el programa BLAST. Las secuencias que son idénticas a las secuencias de la presente invención hasta cierto punto pueden identificarse mediante este programa.
[0069] Inmunógeno, inmunogénico: Los términos "inmunógeno" o "inmunogénico" serán reconocidos y comprendidos por el experto en la técnica y, por ejemplo, se refieren a un compuesto que es capaz de estimular/inducir una respuesta inmunitaria. Preferiblemente, un inmunógeno es un péptido, polipéptido o proteína. Un inmunógeno en el sentido de la presente invención es el producto de la traducción de un ácido nucleico artificial proporcionado, preferiblemente ARN, que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido, proteína antigénica derivada del VSR como se define en este documento. Típicamente, un inmunógeno provoca una respuesta inmune adaptativa.
[0071] Respuesta inmune: El término "respuesta inmune" será reconocido y entendido por la persona experta en la técnica y, por ejemplo, se refiere a una reacción específica del sistema inmune adaptativo a un antígeno particular (la llamada respuesta inmune específica o adaptativa) o a una reacción inespecífica del sistema inmune innato (denominada respuesta inmune innata o inespecífica), o a una combinación de las mismas.
[0073] Sistema inmune: El término "sistema inmune" será reconocido y entendido por el experto en la técnica y, por ejemplo, se pretende referir a un sistema del organismo que puede proteger a los organismos de la infección. Si un patógeno logra atravesar una barrera física de un organismo y entra en este organismo, el sistema inmune innato proporciona una respuesta inmediata, pero no específica. Si los patógenos evaden esta respuesta innata, los vertebrados poseen una segunda capa de protección, el sistema inmunológico adaptativo. Aquí, el sistema inmune adapta su respuesta durante una infección para mejorar su reconocimiento del patógeno. Esta respuesta mejorada se retiene después de que se ha eliminado el patógeno en forma de memoria inmunológica y permite que el sistema inmune adaptativo monte ataques más rápidos y más fuertes cada vez que se encuentra con este patógeno. Así, el sistema inmune comprende el sistema inmune innato y adaptativo. Cada una de estas dos partes contiene típicamente los llamados componentes humorales y celulares.
[0075] Sistema inmune innato: El término "sistema inmune innato" (también conocido como sistema inmune no específico o inespecífico) será reconocido y entendido por la persona experta en la técnica y, por ejemplo, está destinado a referirse a un sistema que típicamente comprende las células y los mecanismos que defienden al huésped de la infección por otros organismos de forma inespecífica. Esto significa que las células del sistema innato pueden reconocer y responder a los patógenos de forma genérica, pero, a diferencia del sistema inmune adaptativo, no confiere inmunidad protectora o de larga duración al huésped. El sistema inmune innato puede activarse, por ejemplo, por ligandos de receptores tipo Toll (TLR) u otras sustancias auxiliares como lipopolisacáridos, TNF-alfa, ligando CD40 o citocinas, monoquinas, linfocinas, interleucinas o quimiocinas, IL-1 a IL-33, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-beta, TNF-alfa, factores de crecimiento, y hGH, un ligando del receptor tipo Toll humano (p. e., TLR1 a TLR10), un ligando del receptor tipo Toll murino (por ejemplo, TLR1 a TLR13), un ligando de un receptor similar a NOD, un ligando de un receptor tipo RIG-I , un ácido nucleico inmunoestimulador, un ARN inmunoestimulador (isRNA), un CpG-ADN, un agente antibacteriano o un agente antivírico.
[0076] Compuesto lipidoide: Un compuesto lipidoide, también denominado simplemente lipidoide, es un compuesto similar a un lípido, es decir, un compuesto anfifílico con propiedades físicas similares a los lípidos. En el contexto de la presente invención, se considera que el término lípido incluye compuestos lipidoides.
[0077] Vacuna monovalente, composición monovalente: Los términos "vacuna monovalente", "composición monovalente", "vacuna univalente" o "composición univalente" serán reconocidos y comprendidos por la persona experta en la técnica y, por ejemplo, se refieren a una composición o una vacuna que comprende solo un antígeno de un virus. Por consiguiente, dicha vacuna o composición comprende solo una especie de ARN que codifica un solo antígeno para un solo organismo. El término "vacuna monovalente" incluye la inmunización contra una sola valencia. En el contexto de la invención, una vacuna o composición de VSR monovalente comprendería un ARN artificial que codifica un único péptido o proteína antigénica derivada de un VSR específico (por ejemplo F de VSR).
[0078] Ácido nucleico: Los términos "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" serán reconocidos y comprendidos por el experto en la técnica y, por ejemplo, se refieren a una molécula que comprende preferiblemente componentes de ácido nucleico. El término molécula de ácido nucleico se refiere preferiblemente a moléculas de ADN o ARN. Preferiblemente se usa como sinónimo del término polinucleótido. Preferiblemente, un ácido nucleico o una molécula de ácido nucleico es un polímero que comprende o consiste en monómeros nucleótidos que están unidos covalentemente entre sí mediante enlaces fosfodiéster de una cadena principal de azúcar/fosfato. El término "molécula de ácido nucleico" también abarca moléculas de ácido nucleico modificadas, tales como moléculas de ADN o ARN modificadas en bases, modificadas con azúcar o con estructura principal modificada como se define aquí.
[0079] Secuencia de ácido nucleico/secuencia de ARN/secuencia de aminoácidos: Los términos "secuencia de ácido nucleico", "secuencia de ARN" o "secuencia de aminoácidos" serán reconocidos y entendidos por el experto en la técnica, y, por ejemplo, hacen referencia al orden particular e individual de la sucesión de sus nucleótidos o aminoácidos respectivamente.
[0080] Permanentemente catiónico: El término "permanentemente catiónico" como se usa en este documento será reconocido y entendido por la persona con experiencia ordinaria en la técnica, y significa, por ejemplo, que el respectivo compuesto, grupo o átomo está cargado positivamente a cualquier valor de pH o actividad de ion de hidrógeno de su entorno. Típicamente, la carga positiva es el resultado de la presencia de un átomo de nitrógeno cuaternario. Cuando un compuesto porta una pluralidad de tales cargas positivas, puede denominarse policatiónico permanente, que es una subcategoría de catiónico permanente.
[0081] Cantidad farmacéuticamente efectiva: Los términos "cantidad farmacéuticamente efectiva" o "cantidad efectiva" serán reconocidos y comprendidos por el experto en la técnica y, por ejemplo, se refieren a una cantidad de un compuesto (por ejemplo, el ARN artificial de la invención) que es suficiente para inducir un efecto farmacéutico, tal como, en el contexto de la invención, una respuesta inmune (por ejemplo, contra un péptido, proteína, poliproteína antigénica como se define en este documento).
[0082] Vacuna polivalente/multivalente, composición polivalente/multivalente: Los términos "vacuna polivalente", "composición polivalente", "vacuna multivalente" o "composición multivalente" serán reconocidos y comprendidos por el experto en la técnica y, por ejemplo, se refieren a una composición o una vacuna que comprende antígenos de más de una cepa de un virus, o que comprenden diferentes antígenos del mismo virus, o cualquier combinación de ambas cosas. Los términos describen que dicha vacuna o composición tiene más de una valencia. En el contexto de la invención, una vacuna polivalente de VSR comprendería una vacuna que comprende un ARN artificial que codifica péptidos o proteínas antigénicos derivados de varias cepas de VSR diferentes o que comprende un ARN artificial que codifica diferentes antígenos de la misma cepa de VSR, o una combinación de ambas cosas. En una realización preferida, una vacuna o composición polivalente de VSR comprende más de una, preferiblemente 2, 3, 4 o incluso más especies de ARN artificiales diferentes, cada una de las cuales codifica al menos un péptido o proteína antigénica diferente de VSR (por ejemplo, F de VSR y M de VSR o F de VSR y N de VRS). Los métodos para producir vacunas de ARNm polivalente se describen en la solicitud PCT PCT/EP2016/082487 o en la solicitud de patente publicada WO2017/1090134A1.
[0083] Molécula de ácido nucleico estabilizado o ARN estabilizado: El término "molécula de ácido nucleico estabilizado" o "ARN estabilizado" se refiere a una molécula de ácido nucleico, preferiblemente una molécula de ARN que está modificada de tal manera que es más estable a la desintegración o degradación, por ejemplo, por factores ambientales o digestión enzimática, así como por una degradación por exo o endonucleasas, que la molécula de ácido nucleico no modificada. Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico estabilizada, por ejemplo el ARN estabilizado en el contexto de la presente invención, se estabiliza en una célula, como una célula procariota o eucariota, preferiblemente en una célula de mamífero, así como en una célula humana. El efecto de estabilización también se puede ejercer fuera de las células, por ejemplo, en una solución tampón, etc., por ejemplo, en un proceso de fabricación de una composición farmacéutica que comprende la molécula de ácido nucleico estabilizada.
[0085] Respuestas de células T: Los términos "inmunidad celular" o "respuesta inmune celular" o "respuestas celulares de células T" tal como se usan aquí serán reconocidos y comprendidos por la persona experta técnica y, por ejemplo, se refieren a la activación de macrófagos, células asesinas naturales (NK), linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno y la liberación de diversas citocinas en respuesta a un antígeno. En términos más generales, la inmunidad celular no se basa en anticuerpos, sino en la activación de células del sistema inmunológico. Típicamente, una respuesta inmune celular puede caracterizarse, por ejemplo, activando linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno que son capaces de inducir la apoptosis celular, por ejemplo células inmunes específicas, como células dendríticas u otras células, que muestran epítopos de antígenos extraños en su superficie. En el contexto de la invención, el antígeno es proporcionado por el ARN artificial que codifica al menos un péptido antigénico o una proteína derivada de VSR induciendo adecuadamente respuestas de células T. El ARN artificial, la composición y la vacuna de la invención inducen ventajosamente respuestas de células T celulares contra antígenos F de VSR.
[0087] Variante (de una secuencia): El término "variante", tal como se utiliza en toda la presente especificación en el contexto de una secuencia de ácido nucleico, será reconocido y entendido por la persona experta en la técnica y, por ejemplo, pretende referirse a una variante de una secuencia de ácido nucleico que forma la base de una secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico variante puede presentar una o más eliminaciones, inserciones, adiciones y/o sustituciones de nucleótidos en comparación con la secuencia de ácido nucleico de la que se deriva la variante. Preferiblemente, una variante de una secuencia de ácido nucleico tiene una identidad de al menos el 40%, preferiblemente al menos 50%, más preferiblemente al menos 60%, más preferiblemente al menos 70%, incluso más preferiblemente al menos 80%, incluso más preferiblemente al menos 90%, con total preferencia al menos un 95% con la secuencia de ácido nucleico de la que se deriva la variante. Preferiblemente, la variante es una variante funcional. Una "variante" de una secuencia de ácido nucleico puede tener al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad de nucleótidos en un tramo de 10, 20, 30, 50, 75 o 100 nucleótidos de dicha secuencia de ácido nucleico.
[0088] El término "variante", tal como se utiliza en toda la presente especificación en el contexto de proteínas o péptidos, será reconocido y entendido por la persona con conocimientos ordinarios en la técnica y, por ejemplo, se refiere a una variante de proteínas o péptidos que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia original en una o más mutaciones, tal como uno o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos. Preferiblemente, estos fragmentos y/o variantes tienen la misma función biológica o actividad específica en comparación con la proteína nativa de longitud completa, por ejemplo su propiedad antigénica específica. Las "variantes" de proteínas o péptidos como se definen en el contexto de la presente invención pueden comprender sustituciones de aminoácidos conservativas en comparación con su secuencia nativa, es decir fisiológica no mutada. Esas secuencias de aminoácidos, así como sus secuencias de nucleótidos codificantes, en particular, caen bajo el término variantes como se define en este documento. Las sustituciones en las que los aminoácidos que se originan en la misma clase se intercambian entre sí se denominan sustituciones conservativas. En particular, se trata de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas, cadenas laterales cargadas positiva o negativamente, grupos aromáticos en las cadenas laterales o aminoácidos cuyas cadenas laterales pueden entrar en puentes de hidrógeno, por ejemplo cadenas laterales con una función hidroxilo. Esto significa que, por ejemplo, un aminoácido que tiene una cadena lateral polar se reemplaza por otro aminoácido que tiene una cadena lateral también polar o, por ejemplo, un aminoácido caracterizado por una cadena lateral hidrófoba se sustituye por otro aminoácido que tiene una cadena lateral también hidrófoba (por ejemplo, serina (treonina) por treonina (serina) o leucina (isoleucina) por isoleucina (leucina)). Las inserciones y sustituciones son posibles, en particular, en aquellas posiciones de secuencia que no provocan una modificación de la estructura tridimensional o no afectan a la región de unión. Las modificaciones de una estructura tridimensional por inserción(es) o eliminación(es) pueden determinarse fácilmente, por ejemplo utilizando espectros CD (espectros de dicroísmo circular). Una "variante" de una proteína o péptido puede tener al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad de aminoácidos en un tramo de 10, 20, 30, 50, 75 o 100 aminoácidos de dicha proteína o péptido. Preferiblemente, una variante de una proteína comprende una variante funcional de la proteína, lo que significa que la variante ejerce el mismo efecto o funcionalidad que la proteína de la que se deriva.
[0090] 3'-región no traducida, elemento 3'-UTR, 3'-UTR: El término "3'-región no traducida" o "elemento 3'-UTR" será reconocido y entendido por el experto en la técnica y, por ejemplo, se pretende referir a una parte de una molécula de ácido nucleico situada 3' (es decir, "aguas abajo") de una secuencia codificante y que normalmente no se traduce en la proteína. En general, una 3'-UTR es la parte de un ARNm que se encuentra entre la secuencia codificante (cds) y la secuencia poli(A) del ARNm. En el contexto de la invención, el término 3'-UTR también puede comprender elementos que no están codificados en la plantilla de ADN a partir de los cuales se transcribe un ARN artificial, pero que se agregan después de la transcripción durante la maduración, por ejemplo una secuencia poli(A).
[0092] 5'-región no traducida, elemento 5'-UTR, 5'-UTR: El término "5'-región no traducida" (5'-UTR") será reconocido y entendido por el experto en la técnica y, por ejemplo, se pretende referir a una parte de una molécula de ácido nucleico situada 5' (es decir, "aguas arriba") de una secuencia codificante y que no se traduce en la proteína. En general, se entiende que una 5'-UTR es una sección particular de un ARN mensajero (ARNm) que se encuentra en 5’ de la secuencia codificante del ARNm. Normalmente, la 5'-UTR comienza con el sitio de inicio de la transcripción y termina un nucleótido antes del codón de inicio de la secuencia codificante. Preferiblemente, las 5'-UTR tienen una longitud de más de 20, 30, 40 o 50 nucleótidos. La 5'-UTR puede comprender elementos para controlar la expresión génica, también llamados elementos reguladores. Dichos elementos reguladores pueden ser, por ejemplo, sitios de unión ribosómica. La 5'-UTR puede modificarse postranscripcionalmente, por ejemplo, mediante la adición de una 5'-cap.
[0093] Tracto de oligopirimidina 5'-terminal (TOP), TOP-UTR: El término "tracto de oligopirimidina 5' terminal (TOP)” debe entenderse como un tramo de nucleótidos de pirimidina ubicado en la región terminal 5' de una molécula de ácido nucleico, como la región terminal 5’ de ciertas moléculas de ARNm o la región 5'-terminal de una entidad funcional, por ejemplo la región transcrita de ciertos genes. La secuencia comienza con una citidina, que generalmente corresponde al sitio de inicio de la transcripción, y es seguida por un tramo de aproximadamente 3 a 30 nucleótidos de pirimidina. Por ejemplo, el TOP puede comprender de 3 a 30 o incluso más nucleótidos. El tramo de pirimidina y, por tanto el 5'-TOP, termina con un nucleótido en 5‘ del primer nucleótido de purina ubicado aguas abajo del TOP. El ARN mensajero que contiene un tracto de oligopirimidina 5'-terminal a menudo se denomina ARNm TOP. Por consiguiente, los genes que proporcionan tales ARN mensajeros se denominan genes TOP. El término "motivo TOP" o "motivo 5'-TOP" debe entenderse como una secuencia de ácido nucleico que se corresponde con un 5'-TOP como se definió anteriormente. Por tanto, un motivo TOP en el contexto de la presente invención es preferiblemente un tramo de nucleótidos de pirimidina que tiene una longitud de 3-30 nucleótidos. Preferiblemente, el motivo TOP consiste en al menos 3 nucleótidos de pirimidina, preferiblemente al menos 4 nucleótidos de pirimidina, preferiblemente al menos 5 nucleótidos de pirimidina, más preferiblemente al menos 6 nucleótidos, más preferiblemente al menos 7 nucleótidos, más preferiblemente al menos 8 nucleótidos de pirimidina, donde el tramo de nucleótidos de pirimidina comienza preferiblemente en su extremo 5’ con un nucleótido citosina. En genes TOP y ARNm TOP, el motivo TOP preferiblemente comienza en su extremo 5‘ con el sitio de inicio de la transcripción y termina un nucleótido en 5' del primer residuo de purina en dicho gen o ARNm. Un motivo TOP en el sentido de la presente invención se ubica preferiblemente en el extremo 5‘ de una secuencia que representa una 5'-UTR o en el extremo 5‘ de una secuencia que codifica una 5'-UTR. Por tanto, preferiblemente, un tramo de 3 o más nucleótidos de pirimidina se denomina "motivo TOP" en el sentido de la presente invención si este tramo se encuentra en el extremo 5’ de una secuencia respectiva, como el ácido nucleico artificial, la 5'-UTR elemento del ácido nucleico artificial o la secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 5'-UTR de un gen TOP como se describe en este documento. En otras palabras, un tramo de 3 o más nucleótidos de pirimidina que no está ubicado en el extremo 5’ de un elemento 5'-UTR o 5'-UTR sino en cualquier lugar dentro de un 5'-UTR o un elemento 5'-UTR preferiblemente no se denomina "motivo TOP". En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico del elemento 5'-UTR que se deriva de una 5'-UTR de un gen TOP termina en su extremo 3‘ con un nucleótido ubicado en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aguas arriba del codón de inicio (por ejemplo, A (U/T) G) del gen o ARN del que se deriva. Por lo tanto, el elemento 5'-UTR no comprende ninguna parte de la secuencia de codificación de la proteína. Así, preferiblemente, la única proteína que codifica parte de la al menos una secuencia de ácido nucleico, particularmente de la secuencia de ARN, es proporcionada por la secuencia codificante.
[0095] BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
[0097] La presente invención se basa en el sorprendente descubrimiento del inventor de que al menos un péptido o proteína derivado de una proteína F del virus sincitial respiratorio (VSR) codificada por el ARN artificial de la invención puede expresarse eficazmente en una célula de mamífero. Aún de forma más inesperada, los inventores demostraron que el ARN artificial de la invención puede inducir respuestas inmunitarias funcionales y protectoras específicas en, por ejemplo, ratas algodoneras (ver, por ejemplo, el Ejemplo 2, 3). A través de diferentes optimizaciones en el diseño del antígeno F de VSR, las respuestas inmunes podrían mejorarse aún más. Además, la expresión del antígeno F de RSV codificado por el ARN nucleico artificial podría aumentarse seleccionando regiones 5’ no traducidas (UTR) heterólogas adecuadas y regiones 3’ no traducidas (UTR) heterólogas adecuadas (ver, por ejemplo, Ejemplo 4). Ventajosamente, dicho ARN artificial de la invención que comprende combinaciones ventajosas de 3'-UTR/5'-UTR induce respuestas inmunes específicas de antígeno muy eficientes contra F de VSR codificada. Además, el ARN artificial de la invención comprendido en nanopartículas lipídicas (LNP) induce de manera muy eficiente respuestas inmunes específicas de antígeno contra F de VSR a dosis y régimen de dosificación muy bajos (ver, por ejemplo, Ejemplo 3). Además, por ejemplo, el Ejemplo 8 y el Ejemplo 12 proporcionan composiciones/vacunas que comprenden un ARN artificial adicional que codifica un antígeno adicional en el que dicho ARN artificial que codifica un antígeno adicional provoca o mejora adecuadamente la respuesta de células T y resulta en una respuesta inmune sesgada por Th1, que se considera un requisito previo importante para una posible vacuna contra el VSR (las respuestas con sesgo Th2 se han asociado con una enfermedad respiratoria mejorada (ERD) en modelos animales). Además, las composiciones son adecuadas para inducir respuestas de células T. Por consiguiente, el ARN artificial y la composición/vacuna que comprende dicho ARN artificial de la invención son adecuados para provocar una respuesta inmune contra F de VSR en un sujeto mamífero. Así, el ARN artificial y la composición/vacuna que comprende dicho ARN artificial son adecuados para su uso como vacuna, por ejemplo como vacuna humana, por ejemplo como vacuna para mujeres embarazadas o lactantes.
[0099] En un primer aspecto, la presente invención proporciona un ARN artificial que comprende:
[0100] a) al menos una región 5’ no traducida (5’-UTR) heteróloga y/o al menos una región 3’ no traducida (3’-UTR) heteróloga y
[0101] b) al menos una secuencia codificante unida funcionalmente a dicha 3’-UTR y/o 5’-UTR que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de una proteína de fusión (F) de VSR, donde la al menos una región codificante codifica al menos una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la SEQ ID NO: 4957 o con una identidad de al menos el 97% con dicha secuencia,
[0102] donde el al menos un péptido o proteína antigénica es una proteína F con el C-terminal eliminado (F-del) y donde la proteína F de VSR comprende una mutación DSCav1 (S155C, S290C, S190F y V207L),
[0103] donde la proteína F de VSR comprende las dos subunidades F2 y F1 en una única cadena polipeptídica, estando conectados F2 y F1 mediante un elemento enlazador, preferentemente un enlazador GS, para generar una proteína estable F2-enlazador-F1, donde dicha proteína F2-enlazador-F1 no presenta aa104-aa144 y
[0104] donde la proteína de VSR comprende al menos una mutación seleccionada de (A149C, Y458C), donde la posición y la numeración de un residuo aminoácido se refiere a la posición del respectivo residuo aminoácido en la SEQ ID NO: 68.
[0105] En realizaciones preferidas, el ARN artificial comprende al menos una secuencia de ácido nucleico derivada de una 3'-UTR de un gen seleccionado de un gen ALB7, un gen de alfa-globina, PSMB3, CASP1, COX6B1, GNAS, NDUFA1 y RPS9, o de un homólogo, fragmento o variante de cualquiera de estos genes
[0106] En realizaciones preferidas, el ARN artificial comprende al menos una secuencia de ácido nucleico derivada de una 5'-UTR de un gen seleccionado de un gen RPL32, HSD17B4, ASAH1, ATP5A1, MP68, NDUFA4, NOSIP, RPL31, SLC7A3, TUBB4B y UBQLN2, o de un homólogo, fragmento o variante de cualquiera de estos genes.
[0107] De manera adecuada, el ARN artificial de la invención comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de una proteína de F de VSR ligada operativamente a una 3'-UTR y una 5'-UTR seleccionada de a-1 (HSD17B4/PSMB3), a-2 (Ndufa4/PSMB3), a-3 (SLC7A3/PSMB3), a-4 (NOSIP/PSMB3), a-5 (MP68/PSMB3), b-1 (UBQLN2/RPS9), b-2 (ASAH1/RPS9), b-3 (HSD17B4/RPS9), b-4 (HSD17B4/CASP1), b-5 (NOSIP/COX6B1), c-1 (NDUFA4/RPS9), c-2 (NOSIP/NDUFA1), c-3 (NDUFA4/COX6B1), c-4 (NDUFA4 /NDUFA1), c-5 (ATP5A1/PSMB3), d-1 (Rpl31/PSMB3), d-2 (ATP5A1/CASP1), d-3 (SLC7A3/GNAS), d-4 (HSD17B4/NDUFA1), d-5 (Slc7a3/Ndufa1), e-1 (TUBB4B/RPS9), e-2 (RPL31/RPS9), e-3 (MP68/RPS9), e-4 (NOSIP/RPS9), e-5 (ATP5A1/RPS9), e-6 (ATP5A1/COX6B1), f-1 (ATP5A1/GNAS), f-2 (ATP5A1/NDUFA1), f-3 (HSD17B4/COX6B1), f-4 (HSD17B4/GNAS), f-5 (MP68/COX6B1), g-1 (MP68/NDUFA1), g-2 (NDUFA4/CASP1), g-3 (NDUFA4/GNAS), g-4 (NOSIP/CASP1), g-5 (RPL31/CASP1), h-1 (RPL31/COX6B1), h-2 (RPL31/GNAS), h-3 (RPL31/NDUFA1), h-4 (Slc7a3/CASP1), h-5 (SLC7A3/COX6B1), i-1 (SLC7A3/RPS9), i-2 (RPL32/ALB7), o i-3 (-gen globina), en donde a-1 (HSD17B4/PSMB3), a-4 (NDUFA4/PSMB3), c-1 (NDUFA4/RPS9), e-4 ( NOSIP/RPS9), g-2 (NDUFA4/CASP1), i-2 (RPL32/ALB7) o i-3 (alfa-globina) son particularmente preferidos.
[0108] El al menos un péptido o proteína antigénico es una proteína F con el extremo C eliminado (denominado "F-del”, aa 1-553).
[0109] El al menos un péptido o proteína antigénica comprende adicionalmente una mutación que estabiliza el antígeno en el estado de preconformación/conformación en pre-fusión, preferiblemente una mutación DSCav1 (S155C, S290C, S190F y V207L) (referida como "DSCav1", por ejemplo, "F0_DSCav1" o "F-del_DSCav1").
[0110] El al menos un péptido o proteína antigénica es una proteína de fusión que comprende las dos subunidades F1 y F2 de la F madura en una sola cadena, conectada a través de un enlazador (GS) para mejorar la estabilidad de la proteína (F(1-103)-GS-F(145-574); F(1-103)-GS-F(145-553)).
[0111] La proteína que comprende las dos subunidades de F madura en una sola cadena (denominada "enlazador F2-F1"), por ejemplo (F(1-103)-GS-F(145-574); F (1-103)-GS-F(145-553) comprende adicionalmente una mutación DSCav1 (en este documento denominada "mut0").
[0112] La proteína que comprende las dos subunidades de F madura en una sola cadena (denominada "F2-enlazador-F1") comprende, además de la mutación DSCav1, al menos una mutación adicional seleccionada de (A149C, Y458C, aquí referida como “mut4”) que promueve enlaces disulfuro entre protómeros. Además, pueden seleccionarse otras mutaciones adicionales de (S46G, A149C, S215P, Y458C, K465Q; en este documento referidas como “mut1”), (S46G, E92D, A149C, S215P, Y458C, K465Q; en este documento referidas como “mut2”) o (S46G, N67I, E92D, A149C, S215P, Y458C, K465Q; en este documento referidas como “mut3”), (N183GC, N428C; en este documento referidas como “mut5”), (Q98C, Q361C, S46G, E92D, L95M, S215P, I217P, I221M, R429K, K465Q; en este documento referidas como “mut6”), (Q98C, Q361C, L95M, I221M, R429K; en este documento referidas como “mut7”) o (N183GC, N428C, S46G, N67I, E92D, S215P, K465Q; en este documento referidas como “mut8”) o un fragmento o una variante, o una variante funcional de las mismas.
[0113] El al menos un péptido o proteína antigénicos derivados de la proteína F de VSR codificada por el ARN artificial de la invención se selecciona de F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut4, tal como se define en las reivindicaciones.
[0114] La al menos una secuencia codificante codifica al menos las secuencias de aminoácidos que son idénticas o al menos un 97%, 98% o 99% idénticas con las SEQ ID NO: 2005, 2743, 3481, 4957, 16523.
[0115] Preferiblemente, el ARN artificial puede comprender una secuencia codificante idéntica o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 2006-2013, 2744-2751, 3482-3489, 4958-4965, 16524-16531, 21370, 21372, 21376, 21402.
[0116] El ARN artificial puede comprender una secuencia codificante modificada con codón seleccionada de una secuencia codificante maximizada en C, una secuencia codificante maximizada CAI, una secuencia codificante adaptada al uso del codón humano, una secuencia codificante modificada en contenido G/C y secuencia codificante optimizada en G/C, o cualquier combinación de las mismas.
[0117] El ARN artificial puede ser un ARNm, un ARN viral, un ARN autorreplicante, un ARN circular o un ARN replicón. En realizaciones preferidas, el ARN artificial es un ARNm.
[0118] El ARN artificial, preferiblemente ARNm, puede comprender además al menos uno seleccionado de una estructura cap, una secuencia poli(A), una secuencia poli(C), un tallo-bucle de histona y/o un elemento de secuencia 3'-terminal. El ARN artificial como se define en las reivindicaciones preferiblemente comprende o consiste en una secuencia de ARN que es idéntica o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo consistente en las SEQ ID NO: 2014-2373, 21436-21438, 21582-21584 o un fragmento o variante de cualquiera de estas (que codifica F-del_DSCav1_mut1), las SEQ ID NO: 2752-3111, 21442-21444, 21588-21590 o un fragmento o variante de cualquiera de estas (que codifica F-del_DSCav1_mut2), las SEQ ID NO: 3490-3849, 21448-21450, 21594-21596 o un fragmento o variante de cualquiera de estas (que codifica F-del_DSCav1_mut3), las SEQ ID NO: 4966-5325, 16532-16891, 21454-21456, 21600-21602, 21526-21528, 21672 -21674 o un fragmento o variante de cualquiera de estas (que codifica F-del_DSCav1_mut4).
[0119] En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende el ARN artificial del primer aspecto y tal como se define en las reivindicaciones.
[0120] En realizaciones preferidas, la composición que comprende el ARN artificial del primer aspecto tal como se define en las reivindicaciones comprende al menos un ARN artificial adicional que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de VSR seleccionada de proteína de matriz M, nucleoproteína N, M2-1 proteína y/o fosfoproteína P o combinaciones de las mismas.
[0121] La proteína de matriz M, la nucleoproteína N, la proteína M2-1, la proteína M2-2 y/o la fosfoproteína P son antígenos de células T adecuados y pueden promover respuestas eficaces de células T de la composición o vacuna cuando se administran a un sujeto.
[0122] El ARN artificial adicional puede comprender una secuencia de codificación idéntica o con al menos una identidad del 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con cualquiera de las SEQ ID NO: 9685-9692, 10135-10142, 10638-10645, 11184-11191, 21385-21388, 19845-19852, 20214-20221, 20583-20590, 20952-20959, 21411-21414 o un fragmento o variante de cualquiera de estas secuencias.
[0123] Adecuadamente, dicho ARN artificial adicional comprende o consiste en una secuencia de ARN que es idéntica o que tiene al menos una identidad del 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con una secuencia de ácido nucleico seleccionada de las SEQ ID NO: 9693-10052, 10143-10502, 10646-11005, 11192-11551, 19853-20212, 20222-20581, 20591-20950, 20960-21319, 21481-21488, 21627-21634, 21553-21560, 21699-21706 o un fragmento o variante de cualquiera de estas secuencias.
[0124] De forma adecuada, la composición puede comprender el ARN artificial de la invención complejado, encapsulado o asociado con uno o más lípidos, formando así nanopartículas lipídicas.
[0125] La composición puede comprender preferiblemente el ARN artificial de la invención complejado con uno o más lípidos formando así nanopartículas lipídicas (LNP), donde las LNP consisten esencialmente en
[0126] i. al menos un lípido catiónico como se define aquí, preferiblemente un lípido de fórmula (III), más preferiblemente un lípido III-3;
[0127] ii. un lípido neutro como se define aquí, preferiblemente 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC);
[0128] iii. un esteroide o análogo de esteroide como se define aquí, preferiblemente colesterol; y
[0129] iv. un PEG-lípido como se define aquí, por ejemplo PEG-DMG o PEG-cDMA, preferiblemente un lípido PEGilado de fórmula (IVa);
[0130] donde (i) a (iv) están en una proporción molar de aproximadamente 20-60% lípido catiónico:5-25% lípidos neutros:25-55% esterol:0,5-15% PEG-lípido.
[0131] La presente invención también se refiere a una vacuna contra el VSR que comprende dicho ARN artificial o dicha composición.
[0132] La presente invención también está dirigida al ARN artificial, a la composición y a la vacuna para su uso en el tratamiento o la profilaxis de una infección por VSR.
[0133] En particular, la presente invención está dirigida al ARN artificial, a la composición y a la vacuna para su uso en el tratamiento o la profilaxis de una infección por VSR o un trastorno relacionado con dicha infección.
[0134] La invención se refiere además a un primer y un segundo uso médico del ARN artificial, de las composiciones y de las vacunas como se definen en las reivindicaciones. Además, la invención está dirigida a un kit, particularmente a un kit de partes, que comprende el ARN artificial, las composiciones y las vacunas tal como se definen en las reivindicaciones.
[0135] DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0136] La presente descripción se presenta junto con una lista de secuencias en formato electrónico, que es parte de la descripción de la presente solicitud (norma ST.25 de la OMPI). La información contenida en el formato electrónico de la lista de secuencias presentada junto con esta solicitud se incorpora en este documento como referencia en su totalidad. Cuando aquí se hace referencia a una "SEQ ID NO", se hace referencia a la correspondiente secuencia de ácido nucleico o secuencia de aminoácidos (aa) en el listado de secuencias que tiene el respectivo identificador. Para muchas secuencias, el listado de secuencias también proporciona información detallada adicional, por ejemplo, con respecto a ciertas características estructurales, optimizaciones de secuencia, identificadores de GenBank o información adicional detallada sobre su capacidad de codificación. En particular, dicha información se proporciona con el identificador numérico <223> en la lista de secuencias de la norma ST.25 de la OMPI. Por consiguiente, la información proporcionada bajo dicho identificador numérico <223> se incluye en este documento explícitamente en su totalidad y debe entenderse como parte integral de la descripción de la invención subyacente.
[0137] Las siguientes secuencias de aminoácidos de la proteína de fusión (F) de VRS y de ácidos nucleicos (que codifican la proteína de fusión (F) de VSR) no se reivindican y sirven tan solo como secuencias de referencia:
[0140]
[0142] Ácido nucleico artificial:
[0143] En un primer aspecto, la invención se refiere a un ácido nucleico artificial que comprende
[0144] a) al menos una región de 5’ no traducida (5'-UTR) heteróloga y/o al menos una región de 3' no traducida (3'-UTR) heteróloga y
[0145] b) al menos una secuencia codificante ligada operativamente a dicha 3'-UTR y/o 5'-UTR que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de una proteína de fusión (F) de VSR, donde la al menos una secuencia codificante codifica al menos una secuencia de aminoácidos que es idéntica o al menos un 97% idéntica a la SEQ ID NO: 4957,
[0146] donde el al menos un péptido o proteína antigénica es una proteína F sin el C-terminal (F-del) y
[0147] donde la proteína F de VSR comprende una mutación DSCav1 (S155C, S290C, S190F y V207L),
[0148] donde la proteína F de VSR comprende las dos subunidades F2 y F1 en una única cadena polipeptídica, donde F2 y F1 están unidos mediante un enlazador, preferentemente un enlazador GS, para generar una proteína F2-enlazador-F1 estable, donde dicha proteína F2-enlazador-F1 carece de aa104-aa144, y
[0149] donde la proteína F de VSR comprende al menos una mutación adicional seleccionada de (A149C, Y458C), donde la posición de un residuo aminoácido y la numeración se refieren a la posición del aminoácido respectivo en la SEQ ID NO: 68.
[0150] En una realización preferida del primer aspecto, la invención se refiere a un ARN artificial, preferiblemente un ARN adecuado para la vacunación, que comprende:
[0151] a) al menos una región de 5’ no traducida (5'-UTR) heteróloga y/o al menos una región de 3' no traducida (3'-UTR) heteróloga y
[0152] b) al menos una secuencia codificante ligada operativamente a dicha 3'-UTR y/o 5'-UTR que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de una proteína de fusión (F) de VSR, donde la al menos una secuencia codificante codifica al menos una secuencia de aminoácidos que es idéntica o al menos un 97% idéntica a la SEQ ID NO: 4957,
[0153] donde el al menos un péptido o proteína antigénica es una proteína F sin el C-terminal (F-del) y
[0154] donde la proteína F de VSR comprende una mutación DSCav1 (S155C, S290C, S190F y V207L),
[0155] donde la proteína F de VSR comprende las dos subunidades F2 y F1 en una única cadena polipeptídica, donde F2 y F1 están unidos mediante un enlazador, preferentemente un enlazador GS, para generar una proteína F2-enlazador-F1 estable, donde dicha proteína F2-enlazador-F1 carece de aa104-aa144, y
[0156] donde la proteína F de VSR comprende al menos una mutación adicional seleccionada de (A149C, Y458C), donde la posición de un residuo aminoácido y la numeración se refieren a la posición del aminoácido respectivo en la SEQ ID NO: 68.
[0157] En general, el ARN de la invención puede estar compuesto por una región codificante de proteína y regiones no traducidas (UTR) 5’ y/o 3'. La 3′-UTR es variable en secuencia y tamaño; se extiende entre el codón de parada y la cola poli(A). Es importante destacar que la secuencia 3'-UTR alberga varios motivos reguladores que determinan el recambio, la estabilidad y la localización del ARN y, por tanto, gobierna muchos aspectos de la regulación postranscripcional. En la aplicación médica de ARN (por ejemplo, aplicaciones de inmunoterapia, vacunación), la regulación de la traducción del ARN en la proteína es de suma importancia para la seguridad y eficacia terapéuticas. Los presentes inventores descubrieron sorprendentemente que ciertas combinaciones de 3'-UTR y/o 5'-UTR actúan en concierto para mejorar sinérgicamente la expresión de secuencias de ácido nucleico ligadas operativamente que codifican péptidos o proteínas antigénicos de VSR. Las moléculas de ARN artificial que albergan las combinaciones de UTR de la invención permiten ventajosamente la expresión rápida y transitoria de altas cantidades de péptidos o proteínas antigénicos de VSR derivadas de VSR F. En consecuencia, el ARN artificial proporcionado aquí es particularmente útil y adecuado para diversas aplicacionesin vivo, incluida la vacunación contra VSR.
[0158] De forma adecuada, el ARN artificial puede comprender al menos una 5'-UTR heteróloga y/o al menos una 3'-UTR heteróloga. En este contexto, una UTR de la invención comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico derivada de una 5'-UTR o una 3'-UTR de cualquier gen natural o un fragmento, un homólogo o una variante del mismo. Preferiblemente, una 5'-UTR o una 3'-UTR de la invención es heteróloga a la al menos una secuencia codificante que codifica el al menos un péptido antigénico o proteína derivada de F de VSR. Las 5'-UTR heterólogas o 3'-heterólogas adecuadas se derivan de genes naturales (que no se derivan de VSR). En otras realizaciones, pueden emplearse las 5'-UTR o 3'-UTR modificadas por ingeniería sintética en el contexto de la presente invención.
[0159] En realizaciones preferidas, el al menos un ARN artificial comprende al menos una 3'-UTR heteróloga.
[0160] Preferiblemente, la al menos una 3'-UTR heteróloga comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico derivada de una 3'-UTR de un gen de cordado, preferiblemente un gen de vertebrado, más preferiblemente un gen de mamífero, con mayor preferencia un gen humano, o de una variante de una 3'-UTR de un gen de cordado, preferiblemente un gen de vertebrado, más preferiblemente un gen de mamífero, con mayor preferencia un gen humano.
[0161] Preferiblemente, el ARN artificial de la presente invención comprende una 3'-UTR que puede derivarse de un gen que se relaciona con un ARN con una vida media mejorada (que proporciona un ARN estable), por ejemplo una 3'-UTR como se define y se describe a continuación.
[0162] Preferiblemente, la al menos una 3'-UTR heteróloga comprende una secuencia de ácido nucleico derivada de una 3'-UTR de un gen que preferiblemente codifica un ARNm estable o de un homólogo, fragmento o variante de dicho gen. En realizaciones preferidas del primer aspecto, el ARN artificial de la invención comprende al menos una 3'-UTR heteróloga donde la al menos una 3'-UTR heteróloga comprende una secuencia de ácido nucleico derivada de una 3'-UTR de un gen seleccionado de PSMB3, ALB7, alfa-globina (denominada "muag"), CASP1, COX6B1, GNAS, NDUFA1 y RPS9, o de un homólogo, fragmento o variante de cualquiera de estos genes.
[0163] 3'-UTR derivada de ALB7:En realizaciones preferidas, la 3'-UTR comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3'-UTR de un gen de albúmina de vertebrado o de una variante del mismo, preferiblemente de la 3'-UTR de un gen de albúmina de mamífero o de una variante del mismo, más preferiblemente de la 3'-UTR de un gen de albúmina humana o de una variante del mismo, incluso más preferiblemente de la 3'-UTR del gen de albúmina humana con el número de acceso GenBank NM_000477.5, o de un homólogo, fragmento o variante del mismo. Por consiguiente, el ARN artificial de la invención puede comprender una 3'-UTR derivada de un gen ALB7, donde dicha 3'-UTR derivada de un gen ALB7 comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que es idéntica o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la SEQ ID NO: 35 o 36 o un fragmento o variante de la misma.
[0165] 3'-UTR derivada del gen de alfa-globina:En realizaciones preferidas, la 3'-UTR comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de la 3'-UTR de un gen de la alfa-globina de vertebrado (denominado "muag") o de una variante del mismo, preferiblemente de la 3'-UTR de una alfa-globina de mamífero o de una variante de la misma, más preferiblemente de la 3'-UTR de un gen de alfa-globina humana o de una variante del mismo, incluso más preferiblemente de la 3'-UTR del gen de alfa-globina humana. Por consiguiente, el ARN de la invención puede comprender una 3'-UTR derivada de un gen alfa globina donde dicha 3'-UTR derivada de un gen alfa globina comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que es idéntica o tiene una identidad de al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con las SEQ ID NO: 37 o 38 o un fragmento o variante de la misma.
[0167] 3'-UTR derivada PSMB3:El ARN artificial de la invención puede comprender una 3'-UTR que se deriva de una 3'-UTR de un gen que codifica una proteína de la subunidad beta del proteasoma tipo 3 (PSMB3), o un homólogo, variante, fragmento o derivado de la misma. Dichas 3'-UTR preferiblemente comprenden o consisten en secuencias de ácido nucleico derivadas de 3'-UTR de un gen de la subunidad beta del proteasoma tipo 3 (PSMB3), preferiblemente de un vertebrado, más preferiblemente un mamífero, con mayor preferencia un gen de la subunidad beta de tipo 3 del proteasoma humano (PSMB3), o un homólogo, variante, fragmento o derivado del mismo. Dicho gen puede codificar preferiblemente una proteína de la subunidad beta de proteasoma tipo 3 (PSMB3) correspondiente a una proteína de la subunidad beta de proteasoma de tipo 3 (PSMB3) humano (UniProt Ref. No. P49720, versión de entrada # 183 del 30 de agosto de 2017). Por consiguiente, el ARN artificial de la invención puede comprender una 3'-UTR derivada de un gen PSMB3 donde dicha 3'-UTR derivada de un gen PSMB3 comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que es idéntica o tiene una identidad de al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con las SEQ ID NO: 23 o 24 o un fragmento o variante de la misma.
[0169] 3'-UTR derivada de CASP1:El ARN artificial de la invención puede comprender una 3'-UTR que se deriva de una 3'-UTR de un gen que codifica una proteína Caspasa-1 (CASP1), o un homólogo, variante, fragmento o derivado de la misma. Dichas 3'-UTR preferiblemente comprenden o consisten en secuencia de ácido nucleico derivada de 3'-UTR de un gen de Caspasa-1 (CASP1), preferiblemente de vertebrado, más preferiblemente de mamífero, con mayor preferencia un gen Caspasa-1 (CASP1) humano, o un homólogo, variante, fragmento o derivado del mismo. Por consiguiente, el ARN de la invención puede comprender una 3'-UTR derivada de un gen CASP1 donde dicha 3'-UTR derivada de un gen CASP1 comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que es idéntica o tiene una identidad de al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con las SEQ ID NO: 25 o 26 o un fragmento o variante de la misma.
[0171] 3'-UTR derivada de COX6B1:El ARN artificial de la invención puede comprender una 3'-UTR que se deriva de una 3'-UTR de un gen COX6B1 que codifica una proteína de la subunidad 6B1 (COX6B1) de la citocromo c oxidasa, o un homólogo, variante, fragmento o derivado de la misma. Dichas 3'-UTR preferiblemente comprenden o consisten en secuencia de ácido nucleico que se deriva de un gen de la subunidad 6B1 (COX6B1) del citocromo c oxidasa, preferiblemente de un vertebrado, más preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un gen de la subunidad 6B1 (COX6B1) del citocromo c oxidasa humano, o un homólogo, variante, fragmento o derivado del mismo. Dicho gen puede codificar preferiblemente una proteína de la subunidad de citocromo c oxidasa 6B1 (COX6B1) correspondiente a una proteína de la subunidad de citocromo c oxidasa 6B1 (COX6B1) humana (UniProt Ref. No. P14854, versión de entrada # 166 del 30 de agosto de 2017). Por consiguiente, el ARN artificial de la invención puede comprender una 3'-UTR derivada de un gen COX6B1 donde dicha 3'-UTR derivada de un gen COX6B1 comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que es idéntica o tiene una identidad de al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con las SEQ ID NO: 27 o 28 o un fragmento o variante de la misma.
[0173] 3'-UTR derivada GNAS:El ARN artificial de la invención puede comprender una 3'-UTR que se deriva de una 3'-UTR de un gen GNAS que codifica una proteína corta de la isoforma alfa de la subunidad G(s) de la proteína de unión a nucleótidos guanina (GNAS), o un homólogo, variante, fragmento o derivado de la misma. Dichas 3'-UTR preferiblemente comprenden o consisten en secuencia de ácido nucleico que se deriva de un gen corto de la isoforma alfa de la subunidad alfa de la proteína de unión a nucleótidos guanina (GNAS), preferiblemente de un gen corto de la isoformas alfa de la subunidad G (s) de la proteína G (s) de unión a nucleótidos de guanina de vertebrado, más preferiblemente (GNAS) de mamífero, o un homólogo, variante, fragmento o derivado del mismo. Dicho gen puede codificar preferiblemente una proteína de unión a nucleótidos de guanina subunidad G (s) subunidad alfa de la isoforma de la proteína corta (GNAS) correspondiente a una proteína de unión de nucleótidos de guanina G(s) proteína corta de subunidad alfa de la isoformas corta (GNAS) (UniProt Ref. No. P63092, versión de entrada no.153 del 30 de agosto de 2017). Por consiguiente, el ARN artificial de la invención puede comprender una 3'-UTR derivada de un gen GNAS donde dicha 3'-UTR derivada de un gen GNAS comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que es idéntica o tiene una identidad de al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con las SEQ ID NO: 29 o 30 o un fragmento o variante de la misma.
[0174] 3'-UTR derivada de NDUFA1:El ARN artificial de la invención puede comprender una 3'-UTR que se deriva de una 3'-UTR de un gen que codifica una proteína NADH deshidrogenasa [ubiquinona] 1 subcomplejo alfa subunidad 1 (NDUFA1). o un homólogo, variante, fragmento o derivado de la misma. Dichas 3'-UTR preferiblemente comprenden o consisten en una secuencia de ácido nucleico derivada de la 3'-UTR de un gen de la subunidad 1 del subcomplejo alfa de NADH deshidrogenasa [ubiquinona] 1 (NDUFA1), preferiblemente de un vertebrado, más preferiblemente de un mamífero, más preferiblemente un gen de la subunidad 1 del subcomplejo alfa 1 de la NADH deshidrogenasa [ubiquinona] 1 de mamífero (NDUFA1), o un homólogo, variante, fragmento o derivado del mismo. Dicho gen puede codificar preferiblemente una proteína de la subunidad 1 del subcomplejo alfa de la NADH deshidrogenasa [ubiquinona] 1 (NDUFA1) correspondiente a una proteína de la subunidad 1 del subcomplejo alfa de la NADH deshidrogenasa [ubiquinona] 1 humana (NDUFA1) (UniProt Ref. No. O15239, versión de entrada # 152 de 30 de agosto de 2017). Por consiguiente, el ARN artificial de la invención puede comprender una 3'-UTR derivada de un gen NDUFA1 donde dicha 3'-UTR derivada de un gen NDUFA1 comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que es idéntica o tiene una identidad de al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con las a SEQ ID NO: 31 o 32 o un fragmento o variante de la misma.
[0175] 3'-UTR derivada de RPS9:El ARN artificial de la invención puede comprender una 3'-UTR que se deriva de una 3'-UTR de un gen que codifica una proteína 40S ribosomal proteína S9 (RPS9), o un homólogo, variante, fragmento o derivado de la misma. Dichas 3'-UTR preferiblemente comprenden o consisten en secuencia de ácido nucleico derivada de 3'-UTR de un gen de la proteína S9 ribosómica 40S (RPS9), preferiblemente de un vertebrado, más preferiblemente un mamífero, con mayor preferencia un gen de la proteína S9 ribosómica 40S humana (RPS9), o un homólogo, variante, fragmento o derivado del mismo. Dicho gen puede codificar preferiblemente una proteína S9 (RPS9) ribosomal 40S correspondiente a una proteína S9 (RPS9) ribosomal 40S humana (UniProt Ref. No. P46781, versión de entrada # 179 del 30 de agosto de 2017). Por consiguiente, el ARN artificial de la invención puede comprender una 3'-UTR derivada de un gen RPS9 donde dicha 3'-UTR derivada de un gen RPS9 comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que es idéntica o tiene una identidad de al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con las SEQ ID NO: 33 o 34 o un fragmento o variante de la misma.
[0176] 3’-UTR adicionales:En realizaciones, el ARN artificial como se define aquí comprende una 3'-UTR como se describe en la WO2016/107877. Las 3'-UTR particularmente adecuadas son las SEQ ID NO: 1 a 24 y las SEQ ID NO: 49 a 318 de la solicitud de patente WO2016/107877, o fragmentos o variantes de estas secuencias. Por consiguiente, las 3'-UTR del ARN artificial de la presente invención pueden comprender o consistir en una secuencia de ARN correspondiente de la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con las SEQ ID NO: 1 a 24 y las SEQ ID NO: 49 a 318 de la solicitud de patente WO2016/107877. En otras realizaciones, el ARN artificial como se define aquí comprende una 3'-UTR como se describe en WO2017/036580. Las 3'-UTR particularmente adecuadas son las SEQ ID NO: 152 a 204 de la solicitud de patente WO2017/036580, o fragmentos o variantes de estas secuencias. Por consiguiente, la 3'-UTR del ARN artificial de la presente invención pueden comprender o consistir en una secuencia de ARN correspondiente a la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con las SEQ ID NO: 152 a 204 de la solicitud de patente WO2017/036580.
[0177] De acuerdo con realizaciones preferidas, el ARN artificial comprende al menos una 5'-UTR heteróloga.
[0178] En realizaciones preferidas, el al menos un ácido nucleico artificial como se define aquí, particularmente el ARN como se define aquí, puede comprender al menos una 5'-UTR heteróloga.
[0179] Preferiblemente, la al menos una 5'-UTR comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico derivada de una 5'-UTR de un gen de cordado, preferiblemente un gen de vertebrado, más preferiblemente un gen de mamífero, con mayor preferencia un gen humano, o de una variante de una 5'-UTR de un gen de cordado, preferiblemente un gen de vertebrado, más preferiblemente un gen de mamífero, con mayor preferencia un gen humano.
[0180] Preferiblemente, el ARN artificial de la presente invención comprende una 5'-UTR que puede derivarse de un gen que se relaciona con un ARN con una vida media mejorada (que proporciona un ARN estable), por ejemplo una 5'-UTR como se define y se describe a continuación.
[0181] Preferiblemente, la al menos una 5'-UTR heteróloga comprende una secuencia de ácido nucleico derivada de una 5'-UTR de un gen que preferiblemente codifica un ARNm estable, o de un homólogo, fragmento o variante de dicho gen. En realizaciones preferidas del primer aspecto, el ARN artificial de la invención comprende al menos una 5'-UTR heteróloga donde la al menos una 5'-UTR heteróloga comprende una secuencia de ácido nucleico derivada de una 5'-UTR de un gen seleccionado de HSD17B4, RPL32, ASAH1, ATP5A1, MP68, NDUFA4, NOSIP, RPL31, SLC7A3, TUBB4B y UBQLN2, o de un homólogo, fragmento o variante de cualquiera de estos genes.
[0183] 5'-UTR derivada de RPL32:El ARN artificial de la invención puede comprender una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen que codifica una proteína L32 ribosómica 60S, o un homólogo, variante, fragmento o derivado de la misma, donde dicha 5'-UTR preferiblemente carece del motivo 5'TOP. Dichas 5'-UTR preferiblemente comprenden o consisten en secuencia de ácido nucleico derivada de la 5'-UTR de un gen de la proteína L32 ribosómica 60S (RPL32), preferiblemente de vertebrado, más preferiblemente de mamífero, con mayor preferencia un gen de la proteína L32 ribosómica 60S humana (RPL32), o un homólogo, variante, fragmento o derivado del mismo, donde la 5'-UTR preferiblemente no comprende el 5'TOP de dicho gen. Dicho gen puede codificar preferiblemente una proteína L32 (RPL32) ribosomal 60S correspondiente a una proteína L32 (RPL32) ribosomal 60S humana (UniProt Ref. No. P62899, versión de entrada #138 del 30 de agosto de 2017). Por consiguiente, el ARN artificial de la invención puede comprender una 5'-UTR derivada de un gen RPL32 donde dicha 5'-UTR derivada de un gen RPL32 comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que es idéntica o tiene una identidad de al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con las SEQ ID NO: 21 o 22 o un fragmento o variante de la misma.
[0185] 5'-UTR derivada de HSD17B4:El ARN artificial de la invención puede comprender una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen que codifica una 17-beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa 4, o un homólogo, variante, fragmento o derivado de la misma, preferiblemente sin el motivo 5'TOP. Dichas 5'-UTR preferiblemente comprenden o consisten en una secuencia de ácido nucleico derivada de la 5'-UTR de un gen de 17-beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa 4 (también conocido como enzima peroxisomal multifuncional tipo 2) preferiblemente de vertebrado, más preferiblemente de mamífero, con mayor preferencia un gen humano 17-beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa 4 (HSD17B4), o un homólogo, variante, fragmento o derivado del mismo, donde preferiblemente la 5'-UTR preferiblemente no comprende el 5'TOP de dicho gen. Dicho gen puede codificar preferiblemente una proteína 17-beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa 4 correspondiente a la 17-beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa 4 humana (UniProt Ref. No. Q9BPX1, versión de entrada #139 del 30 de agosto de 2017), o un homólogo, variante, fragmento o derivado de la misma. Por consiguiente, el ARN artificial de la invención puede comprender una 5'-UTR derivada de un gen HSD17B4 donde dicha 5'-UTR derivada de un gen HSD17B4 comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que es idéntica o tiene una identidad de al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con las SEQ ID NO: 1 o 2 o un fragmento o variante de la misma.
[0186] 5'-UTR derivada de ASAH1:El ARN artificial de la invención puede comprender una 5'-UTR derivado de una 5'-UTR de un gen que codifica ceramidasa ácida (ASAH1), o un homólogo, variante, fragmento o derivado del mismo. Dichas 5'-UTR preferiblemente comprenden o consisten en secuencia de ácido nucleico derivada de 5'-UTR de una ceramidasa ácida (ASAH1), preferiblemente de vertebrado, más preferiblemente de mamífero, con mayor preferencia un gen de ceramidasa ácida humana (ASAH1), o un homólogo, variante, fragmento o derivado del mismo. Dicho gen puede codificar preferiblemente una proteína ceramidasa ácida (ASAH1) correspondiente a ceramidasa ácida humana (ASAH1) (UniProt Ref. No. Q13510, versión de entrada #177 del 7 de junio de 2017), o un homólogo, variante, fragmento o derivado de la misma. Por consiguiente, el ARN artificial de la invención puede comprender una 5'-UTR derivada de un gen ASAH1 donde dicha 5'-UTR derivada de un gen ASAH1 comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que es idéntica o tiene una identidad de al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con las SEQ ID NO: 3 o 4 o un fragmento o variante de la misma.
[0188] 5'-UTR derivada de ATP5A1:El ARN artificial de la invención puede comprender una 5'-UTR que se deriva de una 5'-UTR de un gen que codifica subunidad alfa de la ATP sintasa mitocondrial (ATP5A1), o un homólogo, variante, fragmento o derivado de la misma, donde dicha 5'-UTR preferiblemente carece de del motivo 5'TOP. Dichas 5'-UTR preferiblemente comprenden o consisten en secuencia de ácido nucleico derivada del 5'-UTR de un gen de la subunidad alfa de la ATP sintasa mitocondrial (ATP5A1) preferiblemente de vertebrado, más preferiblemente de mamífero y con mayor preferencia un gen de la subunidad alfa de la ATP sintasa mitocondrial humana (ATP5A1), o un homólogo, variante, fragmento o derivado del mismo, donde la 5'-UTR preferiblemente no comprende el 5'TOP de dicho gen. Dicho gen puede codificar una proteína alfa de la subunidad de ATP sintasa mitocondrial correspondiente a la subunidad alfa de ATP sintasa mitocondrial de ácido humana (UniProt Ref. No. P25705, versión de entrada #208 del 30 de agosto de 2017), o un homólogo, variante, fragmento o derivado de la misma. Por consiguiente, el ARN artificial de la invención puede comprender una 5'-UTR derivada de un gen ATP5A1 donde dicha 5'-UTR derivada de un gen ATP5A1 comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que es idéntica o tiene una identidad de al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con las SEQ ID NO: 5 o 6 o un fragmento o variante de la misma.
[0190] 5'-UTR derivada de MP68:El ARN artificial de la invención puede comprender una 5'-UTR que se deriva de una 5'-UTR de un gen que codifica MP68), o un homólogo, variante, fragmento o derivado del mismo. Dichas 5'-UTR preferiblemente comprenden o consisten en secuencia de ácido nucleico derivada de un gen de proteolípido mitocondrial (MP68) de 6,8 kDa, preferiblemente de vertebrado, más preferiblemente de mamífero, con mayor preferencia un gen proteolípido mitocondrial (MP68) de mamífero de 6,8 kDa, o un homólogo, variante, fragmento o derivado del mismo. Dicho gen puede codificar una proteína proteolípida mitocondrial (MP68) de 6,8 kDa correspondiente a una proteína proteolípida mitocondrial (MP68) humana de 6.8 kDa (UniProt Ref. No. P56378, versión de entrada # 127 del 30 de agosto de 2017). Por consiguiente, el ARN artificial de la invención puede comprender una 5'-UTR derivada de un gen MP68 donde dicha 5'-UTR derivada de un gen MP68 comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que es idéntica o tiene una identidad de al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con las SEQ ID NO: 7 o 8 o un fragmento o variante de la misma.
[0192] 5'-UTR derivada de NDUFA4:El ARN artificial de la invención puede comprender una 5'-UTR que se deriva de una 5'-UTR de un gen que codifica una subunidad de citocromo c oxidasa (NDUFA4), o un homólogo, variante, fragmento o derivado del mismo. Dichas 5'-UTR preferiblemente comprenden o consisten en secuencia de ácido nucleico derivada de un gen de la subunidad oxidasa del citocromo c (NDUFA4), preferiblemente de vertebrado, más preferiblemente de mamífero, con mayor preferencia un gen de la subunidad de la oxidasa del citocromo c (NDUFA4) de mamífero, o un homólogo, variante, fragmento o derivado del mismo. Dicho gen puede codificar preferiblemente una proteína de la subunidad oxidasa del citocromo c (NDUFA4) correspondiente a una proteína de la subunidad de la oxidasa del citocromo c humano (NDUFA4) (UniProt Ref. No. O00483, versión de entrada # 149 del 30 de agosto de 2017). Por consiguiente, el ARN artificial de la invención puede comprender una 5'-UTR derivada de un gen NDUFA4 donde dicha 5'-UTR derivada de un gen NDUFA4 comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que es idéntica o tiene una identidad de al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con las SEQ ID NO: 9 o 10 o un fragmento o variante de la misma.
[0194] 5'-UTR derivada de NOSIP:El ARN artificial de la invención puede comprender una 5'-UTR que se deriva de una 5'-UTR de un gen que codifica una interacción de óxido nítrico sintasa (NOSIP), o un homólogo, variante, fragmento o derivado de la misma. Dichas 5'-UTR preferiblemente comprenden o consisten en secuencia de ácido nucleico derivada de 5'-UTR de un gen de la proteína que interactúa con la óxido nítrico sintasa (NOSIP), preferiblemente de vertebrado, más preferiblemente de mamífero, con mayor preferencia un gen de una proteína humana que interactúa con la óxido nítrico sintasa (NOSIP), o un homólogo, variante, fragmento o derivado del mismo. Dicho gen puede codificar preferiblemente una proteína de interacción con óxido nítrico sintasa (NOSIP) correspondiente a una proteína humana con interacción con óxido nítrico sintasa (NOSIP) (UniProt Ref. No. Q9Y314, versión de entrada #130 del 7 de junio de 2017). Por consiguiente, el ARN artificial de la invención puede comprender una 5'-UTR derivada de un gen NOSIP donde dicha 5'-UTR derivada de un gen NOSIP comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que es idéntica o tiene una identidad de al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con las SEQ ID NO: 11 o 12 o un fragmento o variante de la misma.
[0196] 5'-UTR derivada de RPL31:El ARN artificial de la invención puede comprender una 5'-UTR que se deriva de una 5'-UTR de un gen que codifica una proteína L31 ribosómica 60S, o un homólogo, variante, fragmento o derivado de la misma, donde dicha 5'-UTR preferiblemente carece de del motivo 5'TOP. Dicha 5'-UTR preferiblemente comprende o consiste en secuencia de ácido nucleico derivada de 5'-UTR de un gen de la proteína L31 ribosómica 60S (RPL31), preferiblemente de vertebrado, más preferiblemente un gen de la proteína ribosomal 60S L31 (RPL31) de mamífero, o un homólogo, variante, fragmento o derivado del mismo, donde la 5'- UTR preferiblemente no comprende el 5'TOP de dicho gen. Dicho gen puede codificar preferiblemente una proteína L31 (RPL31) ribosomal 60S correspondiente a una proteína L31 (RPL31) ribosomal 60S humana (UniProt Ref. No. P62899, versión de entrada #138 del 30 de agosto de 2017). Por consiguiente, el ARN artificial de la invención puede comprender una 5'-UTR derivada de un gen RPL31 donde dicha 5'-UTR derivada de un gen RPL31 comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que es idéntica o tiene una identidad de al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con las SEQ ID NO: 13 o 14 o un fragmento o variante de la misma.
[0198] 5'-UTR derivada de SLC7A3:El ARN artificial de la invención puede comprender una 5'-UTR que se deriva de una 5'-UTR de un gen que codifica una proteína transportadora de aminoácidos catiónicos 3 (miembro 3 de la familia de portadores de solutos 7, SLC7A3), o un homólogo, variante, fragmento o derivado de la misma. Dichas 5'-UTR preferiblemente comprenden o consisten en secuencia de ácido nucleico derivada de 5'-UTR de un gen del portador de aminoácidos catiónico 3 (SLC7A3), preferiblemente de vertebrado, más preferiblemente un gen portador de aminoácidos catiónicos de mamífero 3 (SLC7A3), o un homólogo, variante, fragmento o derivado del mismo. Dicho gen puede codificar una proteína transportadora de aminoácidos catiónicos 3 (SLC7A3) correspondiente a una proteína portadora de aminoácidos catiónicos 3 humana (SLC7A3) (UniProt Ref. No. Q8WY07, versión de entrada # 139 del 30 de agosto de 2017). Por consiguiente, el ARN artificial de la invención puede comprender una 5'-UTR derivada de un gen SLC7A3 donde dicha 5'-UTR derivada de un gen SLC7A3 comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que es idéntica o tiene una identidad de al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con las SEQ ID NO: 15 o 16 o un fragmento o variante de la misma.
[0200] 5'-UTR derivada de TUBB4B:El ARN artificial de la invención puede comprender una 5'-UTR que se deriva de una 5'-UTR de un gen que codifica una proteína de la cadena tubulina beta-4B (TUBB4B), o un homólogo, variante, fragmento o derivado del mismo. Dichas 5'-UTR preferiblemente comprenden o consisten en secuencia de ácido nucleico derivada de 5'-UTR de un gen de la cadena tubulina beta-4B (TUBB4B), preferiblemente de vertebrado, más preferiblemente de mamífero, con mayor preferencia un gen de la cadena beta-4B de tubulina humana (TUBB4B), o un homólogo, variante, fragmento o derivado del mismo. Dicho gen puede codificar una proteína de la cadena beta-4B de tubulina (TUBB4B) correspondiente a la proteína de la cadena beta-4B de tubulina humana (TUBB4B) (UniProt Ref. No. Q8WY07, versión de entrada # 142 del 30 de agosto de 2017). Por consiguiente, el ARN artificial de la invención puede comprender una 5'-UTR derivada de un gen TUBB4B donde dicha 5'-UTR derivada de un gen TUBB4B comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que es idéntica o tiene una identidad de al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con las SEQ ID NO: 17 o 18 o un fragmento o variante de la misma.
[0201] 5'-UTR derivada de UBQLN2:El ARN artificial de la invención puede comprender una 5'-UTR que se deriva de una 5'-UTR de un gen que codifica una proteína ubiquilina-2 (UBQLN2), o un homólogo, variante, fragmento o derivado de la misma. Dichas 5'-UTR preferiblemente comprenden o consisten en secuencia de ácido nucleico derivada de 5'-UTR de un gen de ubiquilina-2 (UBQLN2), preferiblemente de vertebrado, más preferiblemente un gen de ubiquilina-2 de mamífero (UBQLN2), o un homólogo, variante, fragmento o derivado del mismo. Dicho gen puede codificar una proteína de ubiquilina-2 (UBQLN2) correspondiente a UniProt Ref. No. Q9UHD9, versión de entrada #151 del 30 de agosto de 2017). Por consiguiente, el ARN artificial de la invención puede comprender una 5'-UTR derivada de un gen UBQLN2 donde dicha 5'-UTR derivada de un gen UBQLN2 comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que es idéntica o tiene una identidad de al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con las SEQ ID NO: 19 o 20 o un fragmento o variante de la misma.
[0202] 5’-UTR adicionales:En realizaciones, el ARN artificial como se define aquí comprende una 5'-UTR como se describe en la WO2013/143700. Las 5'-UTR particularmente preferidas son las secuencias de ácido nucleico derivadas de las SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 y SEQ ID NO: 1422 de la solicitud de patente WO2013/143700, o fragmentos o variantes de estas secuencias. En este contexto, se prefiere que la 5'-UTR del ARN artificial de acuerdo con la presente invención comprenda o consista en una secuencia de ARN correspondiente a la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con las SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 y SEQ ID NO: 1422 de la solicitud de patente WO2013/143700. En otras realizaciones, el ARN artificial de la invención comprende una 5'-UTR como se describe en la WO2016/107877. Las 5'-UTR particularmente preferidas son las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con las SEQ ID NO: 25 a 30 y SEQ ID NO: 319 a 382 de la solicitud de patente WO2016/107877, o fragmentos o variantes de estas secuencias. En este contexto, se prefiere particularmente que la 5'-UTR del ARN artificial comprenda o consista en una secuencia de ARN correspondiente de la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con las SEQ ID NO: 25 a 30 y SEQ ID NO: 319 a 382 de la solicitud de patente WO2016/107877. En otras realizaciones, el ARN artificial de la invención comprende una 5'-UTR como se describe en la WO2017/036580. Las 5'-UTR particularmente preferidas son las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con las SEQ ID NO: 1 a 151 de la solicitud de patente WO2017/036580, o fragmentos o variantes de estas secuencias. En este contexto, se prefiere particularmente que la 5'-UTR del ARN artificial comprenda o consista en una secuencia de ARN correspondiente a la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con las SEQ ID No: 1 a 151 de la solicitud de patente WO2017/036580.
[0203] Los inventores observaron que ciertas combinaciones de al menos una 5'-UTR heteróloga y/o al menos una 3'-UTR heteróloga aumentan ventajosamente la traducción de al menos una secuencia codificante ligada operativamente a dicha 3'-UTR y/o 5 '-UTR que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de una proteína F de VSR en el tejido objetivo (por ejemplo, músculo, dermis).
[0204] Por consiguiente, se prefiere que la al menos una 5'-UTR heteróloga y la al menos una 3'-UTR heteróloga como se definen aquí actúen sinérgicamente para aumentar la producción (es decir, la traducción) del péptido o la proteína antigénica del ARN artificial de la invención. Estas combinaciones ventajosas de 5'-UTR y 3'-UTR se especifican a continuación. Cada una de las abreviaturas que se presentan a continuación, es decir “a-1”, “a-2”, “a-3”, “a-4”, “a-5”, “b-1”, “b-2”, “b-3”, “b-4”, “b-5”, “c-1”, “c-2”, “c-3”, “c-4”, “c-5”, “d-1”, “d-2”, “d-3”, “d-4”, “d-5”, “e-1”, “e-2”, “e-3”, “e-4”, “e-5”, “e-6”, “f-1”, “f-2”, “f-3”, “f-4”, “f-5”, “g-1”, “g-2”, “g-3”, “g-4”, “g-5”, “h-1”, “h-2”, “h-3”, “h-4”, “h-5”, “i-1”, “i-2”, “i-3”, se utilizan en toda la descripción de la presente invención y representan una combinación ventajosa de 5'-UTR y/o 3'UTR de la invención.
[0205] Por consiguiente, en realizaciones preferidas del primer aspecto, el ARN artificial de la invención comprende a-1. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen HSD17B4, o de una secuencia de ARN correspondiente, un homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen PSMB3, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0206] a-2. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen NDUFA4, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen PSMB3, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0207] a-3. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen SLC7A3, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen PSMB3, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0208] a-4. al menos una 5'-UTR de una 5'-UTR de un gen NOSIP, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen PSMB3, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0209] a-5. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen MP68, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen PSMB3, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0210] b-1. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen UBQLN2, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen RPS9, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0211] b-2. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen ASAH1, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen RPS9, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0212] b-3. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen HSD17B4, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen RPS9, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0213] b-4. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen HSD17B4, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen CASP1, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0214] b-5. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen NOSIP, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen COX6B1, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0215] c-1. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen NDUFA4, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen RPS9, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0216] c-2. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen NOSIP, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen NDUFA1, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0217] c-3. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen NDUFA4, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen COX6B1, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0218] c-4. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen NDUFA4, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen NDUFA1, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0219] c-5. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen ATP5A1, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen PSMB3, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0220] d-1. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen RPL31, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen PSMB3, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0221] d-2. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen ATP5A1, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen CASP1, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0222] d-3. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen SLC7A3, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen GNAS, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0223] d-4. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen HSD17B4, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen NDUFA1, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0224] d-5. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen SLC7A3, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen NDUFA1, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0225] e-1. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen TUBB4B, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen RPS9, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0226] e-2. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen RPL31, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen RPS9, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0227] e-3. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen MP68, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen RPS9, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0228] e-4. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen NOSIP, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen RPS9, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0229] e-5. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen ATP5A1, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen RPS9, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0230] e-6. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen ATP5A1, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen COX6B1, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0231] f-1. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen ATP5A1, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen GNAS, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0232] f-2. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen ATP5A1, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen NDUFA1, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0233] f-3. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen HSD17B4, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen COX6B1, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0234] f-4. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen HSD17B4, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen GNAS, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0235] f-5. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen MP68, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen COX6B1, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0236] g-1. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen MP68, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen NDUFA1, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0237] g-2. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen NDUFA4, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen CASP1, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0238] g-3. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen NDUFA4, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen GNAS, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0239] g-4. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen NOSIP, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen CASP1, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0240] g-5. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen RPL31, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen CASP1, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0241] h-1. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen RPL31, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen COX6B1, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0242] h-2. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen RPL31, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen GNAS, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma;
[0243] h-3. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen RPL31, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen NDUFA1, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0244] h-4. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen SLC7A3, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen CASP1, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0245] h-5. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen SLC7A3, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen COX6B1, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma; o
[0246] i-1. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen SLC7A3, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen RPS9, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma.
[0247] i-2. al menos una 5'-UTR derivada de una 5'-UTR de un gen RPL32, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma y al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen ALB7, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma.
[0248] i-3. al menos una 3'-UTR derivada de una 3'-UTR de un gen del gen de la alfa-globina, o de una secuencia de ARN correspondiente, homólogo, fragmento o variante de la misma.
[0249] De manera adecuada, el ARN artificial de la invención comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de una proteína de F de VSR como se especifica aquí ligada operativamente a una 3'-UTR y una 5'-UTR seleccionada de a-1 (HSD17B4/PSMB3), a-2 (Ndufa4/PSMB3), a-3 (SLC7A3/PSMB3), a-4 (NOSIP/PSMB3), a-5 (MP68/PSMB3), b-1 (UBQLN2/RPS9), b-2 (ASAH1/RPS9), b-3 (HSD17B4/RPS9), b-4 (HSD17B4/CASP1), b-5 (NOSIP/COX6B1), c-1 (NDUFA4/RPS9), c-2 (NOSIP/NDUFA1), c-3 (NDUFA4/COX6B1), c-4 (NDUFA4 /NDUFA1), c-5 (ATP5A1/PSMB3), d-1 (Rpl31/PSMB3), d-2 (ATP5A1/CASP1), d-3 (SLC7A3/GNAS), d-4 (HSD17B4/NDUFA1), d-5 (Slc7a3/Ndufa1), e-1 (TUBB4B/RPS9), e-2 (RPL31/RPS9), e-3 (MP68/RPS9), e-4 (NOSIP/RPS9), e-5 (ATP5A1/RPS9), e-6 (ATP5A1/COX6B1), f-1 (ATP5A1/GNAS), f-2 (ATP5A1/NDUFA1), f-3 (HSD17B4/COX6B1), f-4 (HSD17B4/GNAS), f-5 (MP68/COX6B1), g-1 (MP68/NDUFA1), g-2 (NDUFA4/CASP1), g-3 (NDUFA4/GNAS), g-4 (NOSIP/CASP1), g-5 (RPL31/CASP1), h-1 (RPL31/COX6B1), h-2 (RPL31/GNAS), h-3 (RPL31/NDUFA1), h-4 (Slc7a3/CASP1), h-5 (SLC7A3/COX6B1), i-1 (SLC7A3/RPS9), i-2 (RPL32/ALB7), o i-3 (alfa-gen globina).
[0250] En realizaciones particularmente preferidas del primer aspecto, el ARN artificial de la invención comprende elementos UTR de acuerdo con a-1 (HSD17B4/PSMB3), a-4 (NDUFA4/PSMB3), c-1 (NDUFA4/RPS9), e-4 (NOSIP/RPS9), g-2 (NDUFA4/CASP1), i-2 (RPL32/ALB7), o i-3 (alfa-globina (muag)).
[0251] En una realizaciones particularmente preferida del primer aspecto, el ARN artificial de la invención comprende elementos UTR de acuerdo con a-1 (HSD17B4/PSMB3).
[0252] La invención se refiere a un ARN artificial, preferiblemente un ARN adecuado para vacunación, que comprende al menos una 5'-UTR heteróloga como se definió anteriormente y/o al menos una 3'-UTR heteróloga como se definió anteriormente y al menos una secuencia codificante ligada operativamente a dicha 3'-UTR y/o 5'-UTR, donde dicha secuencia codificante codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de un virus sincitial respiratorio ("VSR"), o un fragmento o variante del mismo.
[0253] Como se usa aquí, el término " virus sincitial respiratorio" o la abreviatura correspondiente "VSR" no se limita a una cepa, variante, serotipo o aislado de virus particular, comprendiendo cualquier virus sincitial respiratorio de cualquier origen.
[0254] De acuerdo con varias reaizaciones, el ARN artificial, preferiblemente la secuencia codificante del ARN artificial comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que se deriva de los virus con el ID de taxonomía NCBI (“NCBI-ID”) proporcionado en la Lista 1 siguiente.
[0255] Lista 1: Cepas del virus VSR:
[0256] Ortoneumovirus humano, HRSV (NCBI-ID 11250); virus sincitial respiratorio A, HRSV-A, virus sincitial respiratorio grupo A (NCBI-ID 208893); virus sincitial respiratorio humano cepa A Long, virus sincitial respiratorio humano (subgrupo A/cepa Long) (NCBI-ID 11260); virus sincitial respiratorio humano A2, virus sincitial respiratorio humano (cepa A2), HRSVA (NCBI-ID 11259); virus sincitial respiratorio humano (cepa RSB1734), (NCBI-ID 11253); virus sincitial respiratorio humano (cepa RSB5857) (NCBI-ID 11254); virus sincitial respiratorio humano (cepa RSB6190), (NCBI-ID 11255); virus sincitial respiratorio humano (cepa RSB6256), (NCBI-ID 11256); virus sincitial respiratorio humano (cepa RSB642), (NCBI-ID 11252); virus sincitial respiratorio humano (cepa RSB6614), (NCBI-ID 11257); virus sincitial respiratorio humano B, HRSV-B, virus sincitial respiratorio grupo B, (NCBI-ID 208895); virus sincitial respiratorio humano 9320 (NCBI-ID 253182); virus sincitial respiratorio humano B1 (NCBI-ID 79692); virus sincitial respiratorio humano (subgrupo B/cepa 18537), (NCBI-ID 11251); virus sincitial respiratorio humano (subgrupo B/cepa 8/60), (NCBI-ID 11258); virus sincitial respiratorio humano S2, (NCBI-ID 410078); virus sincitial respiratorio humano cepa RSS-2 (NCBI-ID 11261); virus sincitial respiratorio humano no clasificado, (NCBI-ID 410233); virus sincitial respiratorio humano (cepa RSP112/Suecia/02-03), (NCBI-ID 410237); virus sincitial respiratorio humano (cepa RSP120/Suecia/02-03), (NCBI-ID 410238); virus sincitial respiratorio humano (cepa RSP121/Suecia/02-03), (NCBI-ID 410239); virus sincitial respiratorio humano (cepa RSP122/Suecia/02-03), (NCBI-ID 410247); virus sincitial respiratorio humano (cepa RSP13/Suecia/02-03), (NCBI-ID 410241); virus sincitial respiratorio humano (cepa RSP140/Suecia / 02-03), (NCBI-ID 410248); virus sincitial respiratorio humano (cepa RSP16/Suecia/02-03), (NCBI-ID 410242); virus sincitial respiratorio humano (cepa RSP171/Suecia/02-03), (NCBI-ID 410246); virus sincitial respiratorio humano (cepa RSP183/Suecia/02-03), (NCBI-ID 410249); virus sincitial respiratorio humano (cepa RSP191/Suecia/02-03), (NCBI-ID 410240); virus sincitial respiratorio humano (cepa RSP199/Suecia/02-03), (NCBI-ID 410250); virus sincitial respiratorio humano (cepa RSP212/Suecia/02-03), (NCBI-ID 410251); virus sincitial respiratorio humano (cepa RSP41/Suecia/02-03), (NCBI-ID 410234); virus sincitial respiratorio humano (cepa RSP45/Suecia/02-03), (NCBI-ID 410235); virus sincitial respiratorio humano (cepa RSP56/Suecia/02-03), (NCBI-ID 410243); virus sincitial respiratorio humano (cepa RSP58/Suecia/02-03), (NCBI-ID 410236); virus sincitial respiratorio humano (cepa RSP67/Suecia/02-03), (NCBI-ID 410244); virus sincitial respiratorio humano (cepa RSP94/Suecia/02-03) (NCBI-ID 410245); aislado de virus sincitial respiratorio VSR Memphis-37, (cepa Memphis-37) (NCBI-ID 12814). En realizaciones preferidas de la invención, el al menos un péptido o proteína antigénica se deriva de un aislado de virus sincitial respiratorio VSR Memphis-37 (cepa Memphis-37) (NCBI-ID: 12814. A lo largo de la presente invención, incluida la información contenida en el listado de secuencias ST25, se usa la abreviatura “HRSV (Memphis-37)” para dicho virus VSR particularmente preferido.
[0257] En realizaciones preferidas de la invención, el al menos un péptido o proteína antigénica se deriva de un virus sincitial respiratorio humano A2, virus sincitial respiratorio humano (cepa A2) (NCBI-ID: 11259. A lo largo de la presente invención, incluida la información contenida en el listado de secuencias de ST25, se usa la abreviatura “HRSV(A2)” para dicho virus VSR particularmente preferido.
[0258] Debe entenderse que el experto también puede usar secuencias de aminoácidos y secuencias de ácidos nucleicos derivadas de cualquier cepa de VSR proporcionada en la Lista 1 para adaptar las enseñanzas de la presente invención y obtener constructos de ARN, composiciones y vacunas de acuerdo con la invención.
[0259] En varias realizaciones, el al menos un péptido o proteína antigénica puede seleccionarse de proteína de fusión (F), glicoproteína G, proteína hidrófoba corta SH, proteína de matriz M, nucleoproteína N, polimerasa grande L, proteína M2-1, proteína M2-2, fosfoproteína P, proteína no estructural NS1, o proteína no estructural NS2 del virus sincitial respiratorio (VSR) o un fragmento, variante o derivado de la misma.
[0260] En realizaciones particularmente preferidas del primer aspecto, el al menos un péptido o proteína antigénica se deriva de una proteína de fusión (F) de VSR. En este contexto, la secuencia de aminoácidos del al menos un péptido o proteína antigénica puede seleccionarse de cualquier péptido o proteína derivado de la proteína de fusión F del VSR o de un fragmento, variante o derivado de la misma.
[0261] La proteína F de VSR se expresa inicialmente (después de la infección de una célula huésped) como un único precursor de polipéptido, denominado proteína F de fusión de longitud completa (en este documento denominada "F0"). F0 forma un trímero en el retículo endoplásmico y es procesado por una proteasa similar a furina celular/huésped en dos sitios conservados, generando polipéptidos F1, F2 y Pep27. El polipéptido Pep27 se escinde y no forma parte de la proteína F madura. El polipéptido F2 se origina en la porción N-terminal del precursor F0 y se une al polipéptido F1 a través de dos enlaces disulfuro. El polipéptido F1 se origina en la porción C-terminal del precursor F0 y ancla la proteína F madura en la membrana a través de un dominio transmembrana, que está ligado a una cola citoplasmática. Tres unidades heterodímeras F2-F1 ("protómeros") se ensamblan para formar una proteína F madura. Inicialmente, la proteína F madura se encuentra en una forma metaestable (denominada en este documento "conformación prefusión"). Al activarse, sufre un cambio conformacional espectacular e irreversible (denominado en este documento "conformación postfusión") que fusiona las membranas viral y de la célula objetivo.
[0263] Por consiguiente, el ARN artificial del primer aspecto, preferiblemente el ARN artificial adecuado para vacunación, codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de una proteína F de VSR o un fragmento o variante de la misma.
[0265] En realizaciones preferidas, al menos un péptido o proteína antigénica derivado de una proteína F de VSR puede derivarse de cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos (números de acceso de proteína NCBI) proporcionados en la Lista 2 a continuación.
[0267] Lista 2: Números de acceso de la proteína NCBI de proteínas de fusión (F) de VSR:
[0268] Proteína No. de acceso, AJF44801.1, AJF44759.1, AJF44661.1, AJF44602.1, 2207424A, AAB38520.1, AAB38517.1, AAB38519.1, AAB38518.1, AVQ93587.1, AVQ93599.1, AVQ93571.1, AVQ93568.1, AVQ93589.1, AVQ93597.1, AVQ93563.1, AVQ93594.1, AVQ93606.1, AVQ93601.1, AVQ93562.1, AVQ93561.1, AVQ93607.1, AVQ93588.1, AVQ93575.1, AVQ93468.1, AVQ93467.1, AVQ93590.1, AVQ93552.1, AVQ93556.1, AVQ93471.1, AVQ93458.1, AVQ93494.1, AVQ93470.1, AVQ93489.1, AVQ93542.1, AVQ93472.1, AVQ93514.1, AVQ93485.1, AVQ93533.1, AVQ93481.1, AVQ93546.1, AVQ93512.1, AVQ93554.1, AVQ93551.1, AVQ93547.1, AVQ93558.1, AVQ93461.1, AVQ93500.1, AVQ93426.1, AVQ93398.1, AVQ93401.1, AVQ93361.1, AVQ93408.1, AVQ93443.1, AVQ93429.1, AVQ93359.1, AVQ93365.1, AVQ93366.1, AVQ93402.1, AVQ93377.1, AVQ93412.1, AVQ93391.1, AVQ93457.1, AVQ93372.1, AVQ93455.1, AVQ93364.1, AVQ93378.1, AVQ93393.1, AVQ93362.1, AVQ93585.1, ART28504.1, AVQ93404.1, AOS49123.1, AOS48496.1, AMT78271.1, AHX57174.1, AHW81390.1, AHV81506.1, AFX60128.1, AFX60129.1, AEQ63389.1, ARB66328.1, ANZ80034.1, AMN91253.1, P03420.1, AIO08046.1, NP_056863.1, AFX60234.1, AFX60231.1, AFX60232.1, AFX60222.1, AFX60219.1, AFX60215.1, AFX60214.1, AFX60212.1, AFX60208.1, AFX60202.1, AFX60220.1, AFX60213.1, AFX60190.1, AFX60187.1, AFX60201.1, AFX60173.1, AFX60169.1, AFX60162.1, AFX60156.1, AFX60151.1, AFX60150.1, AFX60148.1, AFX60141.1, AFX60127.1, AFX60137.1, AFX60135.1, AFV46420.1, AFX60200.1, AFV46419.1, AFV46417.1, AFV46413.1, AFV46414.1, AFV46410.1, AFV46403.1, AFV46409.1, AFP99061.1, AFM95400.1, AFV46401.1, AFP99064.1, AFM95376.1, AFX60138.1, AFP99060.1, AFM95365.1, AFM55563.1, AFM55530.1, AFM55442.1, AFM55420.1, AFM55552.1, AFM55365.1, AFP99059.1, AFM95385.1, AFM55354.1, AFM55343.1, AFM55387.1, AFM55299.1, AFM55288.1, AFM55266.1, AFM55277.1, AFM55255.1, AFM55222.1, AFM55211.1, AFI25262.1, AFD34266.1, AFM55332.1, AFD34264.1, AFD34262.1, AFD34265.1, AFD34261.1, AFD34260.1, AFD34259.1, AEQ63641.1, AEQ63487.1, AEQ63520.1, AEQ63378.1, AEQ63367.1, 4CCF_A, AEQ63334.1, AEO45949.1, AEO45939.1, AEQ63312.1, AEQ63586.1, AEO45919.1, AEO45909.1, AEO45889.1, AEO45879.1, AEO45869.1, AEO45929.1, AEO45850.1, AEO45859.1, AEQ63444.1, AEO23054.1, AEO23052.1, AEO23051.1, AEC32087.1, ADZ95785.1, AEC32085.1, ADZ95784.1, ADZ95783.1, ADZ95782.1, ADZ95781.1, ADZ95779.1, ADZ95780.1, ADZ95777.1, ADZ95778.1, ADZ95776.1, ADZ95775.1, ACY68435.1, ACO83302.1, ABI35685.1, AFI25251.1, AAX23994.1, AAQ97026.1, AAR14266.1, AAQ97027.1, AAQ97030.1, AAQ97028.1, AAC57027.1, AAQ97029.1, AAQ97031.1, AAM68160.1, AAM44851.1, P11209.2, P13843.1, AAO72325.1, AAM68157.1, CAA26143.1, 1512372A, AAB86664.1, AAO72324.1, AAB82446.1, AAO72323.1, AAM68154.1, AAA47410.1, P12568.1, ARB07894.1, AGG39517.1, BBC54612.1, BBC54636.1, BBC54627.1, BBC54621.1, BBC54570.1, BBC54579.1, BBC54595.1, BBC54555.1, BBC54552.1, BBC54564.1, BBC54581.1, BBC54571.1, BBC54553.1, BBC54565.1, BBC54245.1, BBC54243.1, BBC54238.1, BBC54242.1, BBC54239.1, BBC54235.1, BBC54234.1, BBC54236.1, BBC54244.1, BBC54186.1, BBC54178.1, BBC54202.1, BBC54151.1, BBC54142.1, BBC54134.1, BBC54170.1, BBC54210.1, BBC54169.1, BBC54213.1, BBC54203.1, BBC54160.1, BBC54163.1, BBC54215.1, BBC54156.1, BBC54179.1, BBC54150.1, BBC54207.1, BBC54194.1, BBC54149.1, BBC54138.1, BBC54199.1, BBC54220.1, BBC54181.1, BBC54132.1, BBC54146.1, BBC54122.1, BBC54124.1, BBB35202.1, BBB35201.1, BBB35192.1, BBB35193.1, BBB35199.1, BBB35184.1, BBB35126.1, BBB35133.1, BBB35130.1, BBB35160.1, BBB35162.1, BBB35181.1, BBB35165.1, BBB35121.1, BBB35138.1, BBB35176.1, BBB35142.1, BBB35136.1, BBB35153.1, BBB35115.1, BBB35150.1, BBB35097.1, BBB35109.1, BBB35094.1, BBB35183.1, BBB35104.1, BBB35099.1, BBB35188.1, AKA45871.1, ASV65838.1, AGG39373.1, AII22107.1, AGG39400.1, AGG39457.1, ARR29240.1, ARR29251.1, ARR29189.1, ARR29207.1, AUH15164.1, ATV81343.1, AUC68654.1, AUC68577.1, AUC68566.1, AUC68555.1, AUC68478.1, AUC68445.1, AUC68500.1, AUC68522.1, AUC68291.1, AUC68149.1, AUC68094.1, AMA67097.1, AMA66866.1, AMA66580.1, AIZ95750.1, AIZ95541.1, AIZ95519.1, AHY21419.1, AHY21331.1, AHY21165.1, AHY21143.1, AHY21132.1, AGG39478.1, ATV93506.1, ATV93509.1, AIZ95717.1, ATV81354.1, ART28317.1, BBA57890.1, BBA57901.1, ASZ70099.1, ART28361.1, AQX36844.1, ASK05520.1, ART28427.1, ART28339.1, ART28297.1, ART28328.1, ARQ15966.1, ARN61507.1, ARA15413.1, AGG39394.1, APW78845.1, APW78867.1, APW78900.1, APW78878.1, APW78779.1, APW78702.1, APW78713.1, APW78680.1, APW78658.1, APW78647.1, APW78636.1, AOS48870.1, APW78614.1, AMT78905.1, AMT77402.1, AOZ15479.1, AGN28484.1, AHX57240.1, AHX57031.1, AOS48980.1, AOS48848.1, AOS48815.1, AOS48738.1, AOS49068.1, AOS48727.1, AOS48716.1, AOS48683.1, AOS48551.1, AOS48485.1, AOS48518.1, AOS48441.1, AOS48397.1, AOS48375.1, AOS48353.1, AOS48287.1, AOS48320.1, AOS48265.1, AOS48254.1, AOS48221.1, ANZ79638.1, ALC74025.1, AHV81286.1, AOD40888.1, AOD40516.1, AOD40214.1, AOD40125.1, AOD40104.1, AOD40082.1, AOD39908.1, AJF44826.1, AJF44506.1, AJF44535.1, ANZ80463.1, ANZ80408.1, ANZ80397.1, ANZ80386.1, ANZ80331.1, ANZ80320.1, ANZ80364.1, ANZ80276.1, ANZ80221.1, ANZ80188.1, ANZ80144.1, ANZ80133.1, ANZ80111.1, ANZ80122.1, ANZ80056.1, ANZ80012.1, ANZ80067.1, ANZ79979.1, ANZ79935.1, ANZ79990.1, ANZ79902.1, ANZ79759.1, ANZ79715.1, ANZ79671.1, AMT79718.1, AMT79586.1, AMT79553.1, AMT79542.1, AMT79476.1, AMT79388.1, AMT79201.1, AMT79190.1, AMT79157.1, AMT79124.1, AMT79091.1, AMT79047.1, AMT79014.1, AMT79003.1, AMT78872.1, AMT78832.1, AMT78689.1, AMT78645.1, AMT78513.1, AMT78480.1, AMT78447.1, AMT78392.1, AMT78194.1, AMT78084.1, AMT78051.1, AMT77963.1, AMT77908.1, AMT77776.1, AMT77710.1, AMT77424.1, AMN91385.1, AMN91264.1, AMN91242.1, AHX57504.1, CUS01881.1, CUS01880.1, CUS01877.1, CUS01874.1, CUS01870.1, CUS01875.1, AMA67350.1, AMA67251.1, AMA67262.1, AMA67229.1, AMA67196.1, AMA67130.1, AMA67185.1, AMA67163.1, AMA67086.1, AMA67075.1, AMA66998.1, AMA66987.1, AMA66976.1, AMA66965.1, AMA66921.1, AMA66844.1, AMA66833.1, AMA66624.1, AMA66613.1, AMA66591.1, AMA66569.1, AMA66547.1, AMA66503.1, AMA66492.1, AMA66481.1, AMA66448.1, AMA66415.1, AMA66393.1, AMA66360.1, AGG39553.1, AGG39469.1, AJZ70144.1, AJZ70166.1, AJZ70155.1, AJZ70133.1, AJZ70067.1, AJZ70001.1, AJZ69990.1, AJZ69968.1, AJZ69946.1, AJZ69913.1, AJZ69880.1, AJZ69847.1, AJZ69869.1, AJZ69770.1, AJZ69748.1, AJZ69726.1, AJZ69682.1, AJZ69671.1, AJZ69704.1, AJZ69660.1, AJZ69715.1, AJZ69627.1, AJZ69616.1, AJZ69638.1, AJO16077.1, AJO16055.1, AKE31881.1, AKE31882.1, AKE31878.1, AJF44835.1, AJF44790.1, AJF44737.1, AJF44716.1, AJF44725.1, AJF44643.1, AJF44628.1, AJF44624.1, AJF44613.1, AJF44566.1, AJF44555.1, AJF44526.1, AJF44517.1, AKA45882.1, AKA45849.1, AHA83913.1, AGN28715.1, AHA83902.1, AHA83837.1, AHA83826.1, AHA83705.1, AHA83630.1, AGG39505.1, AIY70242.1, AIY70198.1, AII30203.1, AHY21463.1, AHY21397.1, AHY21320.1, AHY21298.1, AHY21287.1, AHY21276.1, AHY21254.1, AHY21199.1, AHY21176.1, AHX57537.1, AHX57471.1, AHX57427.1, AHX57042.1, AIZ95981.1, AIZ95893.1, AIZ95871.1, AIZ95816.1, AIZ95772.1, AIZ95629.1, AIZ95673.1, AIZ95596.1, AIZ95585.1, AIZ95552.1, AEQ63553.2, AEQ63542.2, AEQ63575.1, AEQ63531.1, AEQ63498.1, AEQ63422.1, AEQ63411.1, AHX57570.1, AHX57152.1, AHX57064.1, AHX57009.1, AHX56987.1, AHV82100.1, AHV82001.1, AHV81891.1, AHV81880.1, AHV81836.1, AHV81682.1, AHV81649.1, AHV81484.1, AHV81462.1, AHV81385.1, AHV81363.1, AHV81330.1, AHV81253.1, AHV81154.1, AHV81122.1, AHV81089.1, AHV81012.1, AHV80957.1, AHV80880.1, AHV80869.1, AHV80836.1, AHV80803.1, AGG39559.1, AGG39562.1, AGG39556.1, AGG39550.1, AGG39547.1, AGG39544.1, AGG39541.1, AGG39529.1, AGG39526.1, AGG39523.1, AGG39514.1, AGG39502.1, AGG39499.1, AGG39496.1, AGG39493.1, AGG39484.1, AGG39490.1, AGG39487.1, AGG39475.1, AGG39472.1, AGG39466.1, AGG39463.1, AGG39454.1, AGG39442.1, AGG39439.1, AGG39436.1, AGG39415.1, AGG39403.1, AGG39397.1, AGG39391.1, AGG39379.1, AHL84194.1, AHA84012.1, AHJ60043.1, BAO49770.1, BAO49766.1, BAO49767.1, AHA84034.1, AHA84023.1, AHA83990.1, AHA83957.1, AHA83924.1, AHA83891.1, AHA83880.1, AHA83782.1, AHA83760.1, AHA83694.1, AGT75357.1, AGN92848.1, AGN28792.1, AGN28781.1, AGN28759.1, AGN28748.1, AGN28693.1, AGN28638.1, AGN28627.1, AGN28539.1, AGN28528.1, AGN28462.1, AGN28440.1, AGL96787.1, AGL96786.1, AGL96784.1, AAS93662.1, AAS93657.1, AAS93656.1, AAS93659.1, AAS93660.1, AAS93663.1, AAS93664.1, AAS93655.1, CUS01869.1, AHG54517.1, ASF87348.1, ASF87341.1, ASF87344.1, ASF87351.1, ASF87338.1, ASF87342.1, ASF87352.1, ASF87337.1, ASF87336.1, AEQ98756.1, AEQ98757.1, AEQ98755.1, AEQ98752.1, AEQ98753.1, AEQ98747.1, ASF87325.1, ASF87326.1, 5W23_A, 5EA3_F, 5UDD_A, 5EA8_F, AHG54458.1, AEN74947.1, AHG54485.1, AHG54477.1, AHG54451.1, AHG54463.1, AHG54445.1, AEO12131.1, AEN74945.1, AEN74944.1, ASF87335.1, AHG54515.1, AHA61605.1, AHV81660.1, AHG54441.1 o AIY60640.1.
[0270] En el contexto de la presente invención, "proteína F de VSR", "proteína de fusión (F) de VSR", "F de VSR" o "F" se pueden entender en su sentido más amplio y se refiere a F0 (precursor del polipéptido F), F1, polipéptidos F2 y Pep27, heterodímero F2-F1 o la proteína F madura (que comprende tres heterodímeros F2-F1), o fragmentos y variantes de cualquiera de estos. Por consiguiente, el término "péptido o proteína derivado de una proteína de fusión (F) de RSV" se refiere a un péptido, proteína, fragmento o variante derivado de, por ejemplo, F0 (precursor del polipéptido de la proteína F), polipéptidos F1, F2 y Pep27, heterodímero F2-F1 o la proteína F madura. Además, el término "péptido o proteína derivada de una proteína de fusión (F) de VSR" se refiere a un péptido, proteína, fragmento o variante derivado de "proteína F de VSR" o "proteína de fusión de (F) VSR" como se definió anteriormente que puede ser genéticamente diseñado para, por ejemplo, carecer de ciertos elementos proteicos (por ejemplo, la cola citoplasmática, el sitio de escisión de la furina, Pep27) o por ejemplo comprenden elementos adicionales (por ejemplo, elementos ligadores, péptidos señal heterólogos, etc.). Por ejemplo, el término "péptido o proteína derivado de una proteína de fusión (F) de VSR" se refiere a péptido, proteína, fragmento o variante derivado de F0, F-del, F0_DSCav1, F_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F_DSCav1_mut3, F_DSCav1_mut4, F_DSCav1_mut5, F_DSCav1_mut6, F_DSCav1_mut7, F_DSCav1_mut8, F_DSCav1_mut0, F-del_DSCav1, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut4, F-del_DSCav1_mut5, F-del_DSCav1_mut6, F-del_DSCav1_mut7, F-del_DSCav1_mut8, F-del_DSCav1_mut0 (para explicación de los constructos ver la Tabla 1). Las variantes de proteína F particularmente adecuadas que pueden estar codificadas por el ARN del primer aspecto se especifican a continuación y se proporcionan en la Tabla 1.
[0271] Debe tenerse en cuenta que cuando se hace referencia a los residuos de aminoácidos (aa) y su posición en una proteína F de VSR, cualquier numeración utilizada en este documento, a menos que se indique lo contrario, se relaciona con la posición del residuo de aa respectivo en una proteína precursora F0 correspondiente de HRSV (A2) (SEQ ID NO: 68) o una proteína precursora F0 correspondiente de HRSV (Memphis-37) (SEQ ID NO: 8937 o 11726) donde la posición "1" corresponde al primer residuo de aa, es decir, el residuo de aa en el extremo N de una proteína precursora de HRSV (A2) F0 o una proteína precursora de HRSV (Memphis-37) F0.
[0272] En realizaciones preferidas, la al menos una secuencia codificante del ARN del primer aspecto codifica al menos un péptido o proteína antigénica de la proteína F de VSR, en donde la proteína F de VSR es una proteína F de longitud completa (F0) o una proteína F con deleción del C-terminal (F-del), o un fragmento o una variante de la misma. En este contexto, cualquier proteína F de VSR de longitud completa (proteína precursora, denominada "F0") puede usarse como antígeno adecuado y puede derivarse preferiblemente de cualquier número de acceso de proteína NCBI proporcionado en la Lista 2 o puede elegirse de cualquiera de las SEQ ID NO: 68, 8279-8967 o 11726. En reaslizaciones preferidas de la invención, la proteína F de longitud completa (F0) de HRSV (A2) (SEQ ID NO: 68) se utiliza de forma adecuada, consulte la Tabla 1 del panorama general. En otras realizaciones preferidas de la invención, la proteína F de longitud completa (F0) de HRSV (Memphis-37) (SEQ ID NO: 8937 o 11726) se utiliza de forma adecuada, consulte la Tabla 1 del panorama general.
[0273] En este contexto, cualquier F de VSR sin el extremo C (F-del) puede usarse como antígeno adecuado y puede derivarse preferiblemente de cualquier número de acceso de proteína NCBI proporcionado en la Lista 2 o puede elegirse de cualquiera de las SEQ ID NO: 483, 8968-9683 o 12095. Un ejemplo de tal mutante por deleción es la proteína RSV-Fdel554-574 de acuerdo con (Oomens et al. 2006. J. Virol. 80(21):10465-77) donde se elimina un residuo 554-574 de la proteína F0 de longitud completa. La eliminación de la parte principal de la cola citoplásmica (aa 554-574) de F0 conduce a un mejor tráfico intracelular/transporte de superficie celular in vitro y aumenta significativamente la expresión de F de VSR en la superficie celular. El aumento de la presentación de la superficie celular da como resultado un mejor reconocimiento de las células B (en línea con los datos publicados; ver WO2015024668). En realizaciones preferidas de la invención, la proteína F sin extremo C, en este documento denominada "F-del" (SEQ ID NO: 483, 9653 o 12095), se utiliza de forma adecuada, ver la Tabla 1 del panorama general. A la luz del alto nivel de conservación estructural de la proteína F de VSR entre diferentes cepas de VSR (ver, por ejemplo, Hause et al., 2017, PLOS ONE 12 (6): e0180623), la eliminación de los aa 554-574 es aplicable a diferentes secuencias de la proteína F de VSR de diferentes aislados de VSR.+
[0274] En realizaciones particularmente preferidas, el ARN artificial del primer aspecto codifica al menos un péptido o proteína antigénico derivado de la proteína de F de VSR, donde dicha proteína F de VSR está diseñada para estabilizar el antígeno en la conformación previa a la fusión. Una conformación en pre-fusión es particularmente ventajosa en el contexto de una vacuna de VSR efectiva, ya que varios epítopos potenciales para neutralizar anticuerpos están accesibles en dicha conformación proteica.
[0275] En diversas realizaciones, la proteína F de VSR incluye una o más sustituciones de aminoácidos que estabilizan la proteína F en la conformación en pre-fusión, por ejemplo sustituciones que estabilizan la porción distal de la membrana de la proteína F (incluida la región N-terminal del polipéptido F1) en la conformación pre-fusión. Por ejemplo, la sustitución de aminoácidos puede introducir un enlace disulfuro no natural o puede ser una sustitución de aminoácidos que llene la cavidad.
[0276] Así, una proteína F de VSR preferida, que no se reivindicaper se, incluye sustituciones S155C y S290C que forman un enlace disulfuro no natural que estabiliza la proteína en una conformación previa a la fusión; es decir, en una conformación que se une específicamente a uno o más anticuerpos de especificación de pre-fusión, y/o presenta un sitio antigénico adecuado que está presente en la conformación de pre-fusión, pero no en la conformación de postfusión de la proteína F de VSR. En realizaciones adicionales, la proteína F de VSR recombinante puede incluir adicionalmente la sustitución F, L, W, Y, H o M en la posición 190, la posición 207 o las posiciones 190 y 207.
[0277] Un ejemplo de una proteína F de VSR diseñada para estabilizar el antígeno en la conformación pre-fusión es la proteína F de VSR que comprende una mutación DSCav1 (S155C, S290C, S190F y V207L), o un fragmento o una variante de la misma. Tales proteínas F de VSR DSCav1 se han descrito en la técnica (WO2014160463).
[0278] Por consiguiente, en realizaciones particularmente preferidas, el ARN artificial del primer aspecto codifica al menos un péptido o proteína antigénico derivado de la proteína de F de VSR, donde la proteína F de VSR comprende una mutación DSCav1 (S155C, S290C, S190F y V207L), o un fragmento o una variante de la misma.
[0279] Debe entenderse en el contexto de la invención que cualquier F de VSR está mutado en las posiciones S155C, S290C, S190F y V207L para estabilizar la proteína en la conformación pre-fusión y puede usarse adecuadamente en el contexto de la invención. Por consiguiente, cualquier número de acceso de proteína NCBI proporcionado anteriormente, o cualquier proteína seleccionada de las SEQ ID NO: 68, 8279-8967, 483, 8968-9683, 12095 o 11726 o fragmentos o variantes de las mismas pueden ser elegidos por el experto para introducir dichos cambios de aminoácidos de acuerdo con S155C, S290C, S190F y V207L para generar diversas proteínas F de VSR DSCav1. En realizaciones preferidas de la invención, la proteína de longitud completa F de VSR (proteína precursora, "F0") de HRSV (A2) (SEQ ID NO: 68) se utiliza para introducir cambios de aminoácidos de S155C, S290C, S190F y V207L, lo que conduce a una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 898. Tal proteína F de VSR se denomina aquí "FO_DSCav1" a lo largo de la presente invención (ver la Tabla 1 de panorama general (diseños de antígeno de proteína F de VSR preferidos)).
[0280] En otras realizaciones preferidas, la proteína RSV F_del (sin la cola citoplasmática (aa 554-574)) de HRSV (A2) (SEQ ID NO: 483) se utiliza para introducir cambios de aminoácidos de S155C, S290C, S190F y V207L, lo que conduce a una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1267. Tal proteína F de VSR se denomina aquí "F-del_DSCav1" a lo largo de la presente invención (ver la Tabla 1 de panorama general (diseños de antígeno de proteína F de VSR preferidos)).
[0281] En realizaciones preferidas de la invención, la proteína de longitud completa F de VSR (proteína precursora, "F0") de HRSV (Memphis-37) (SEQ ID NO: 8937 o 11726) se utiliza para introducir cambios de aminoácidos de S155C, S290C, S190F y V207L, lo que conduce a una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 12464. Tal proteína F de VSR se denomina aquí "FO_DSCav1" a lo largo de la presente invención (ver la Tabla 1 de panorama general (diseños de antígeno de proteína F de VSR preferidos)).
[0282] En otras realizaciones preferidas, la proteína RSV F_del (sin la cola citoplasmática (aa 554-574)) de HRSV (Memphis-37) (SEQ ID NO: 9653 o 12095) se utiliza para introducir cambios de aminoácidos de S155C, S290C, S190F y V207L, lo que conduce a una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 12833. Tal proteína F de VSR se denomina aquí "F- del_DSCav1" a lo largo de la presente invención (ver la Tabla 1 de panorama general (diseños de antígeno de proteína F de VSR preferidos).
[0283] En realizaciones preferidas, el al menos un péptido o proteína antigénica puede ser una proteína manipulada que comprende las dos subunidades F1 y F2 de la F madura como única cadena polipeptídica, donde F2 y F1 están preferiblemente unidas mediante un enlazador (GS). Ejemplos de dichas proteínas de fusión F2-enlazador-F1 manipuladas (por ejemplo F(1-103)-GS-F(145-574) o F (1-103)-GS-F(145-553)) se han descrito en la técnica (Joyce, M. Gordon, et al. "Iterative structure-based improvement of a fusion-glycoprotein vaccine against RSV." Nature structural & molecular biology 23.9 (2016): 811; WO2017172890). Dichas proteínas F F2-enlazador-F1 de VSR carecen de los aa104-144 (que comprende el sitio de escisión de furina y Pep27) y comprenden un elemento enlazador entre el polipéptido F2 y el polipéptido F1 (por ejemplo, el enlazador GS). Dichas proteínas F2-enlazador-F1 pueden mostrar propiedades superiores en términos de estabilidad y/o antigenicidad.
[0284] La proteína F de VSR comprende las dos subunidades F2 y F1 fusionadas en una única cadena polipeptídica donde F2 y F1 están conectadas mediante un elemento enlazador, preferiblemente un enlazador GS como se especifica en este documento, generando preferentemente proteínas F2-enlazador-F1 estables.
[0285] Dichas proteínas de fusión F2-enlazador-F1, por ejemplo F(1-103)-GS-F(145-574) o F(1-103)-GS-F(145-553) comprenden además una mutación DScav1 como se describe anteriormente (S155C, S290C, S190F y V207L). La proteína F de VSR comprende además al menos una mutación adicional seleccionada de (A149C, Y458C). En realizaciones particularmente preferentes, la proteína F de VSR puede comprender además al menos una mutación adicional seleccionada de (S46G, A149C, S215P, Y458C, K465Q), (S46G, E92D, A149C, S215P, Y458C, K465Q), (S46G, N67I, E92D, A149C, S215P, Y458C, K465Q), (N183GC, N428C), (Q98C, Q361C, S46G, E92D, L95M, S215P, I217P, I221M, R429K, K465Q), (Q98C, Q361C, L95M, I221M, R429K) o (N183GC, N428C, S46G, N67I, E92D, S215P, K465Q) o un fragmento o variante de la misma.
[0286] En realizaciones particularmente preferidas, dichas proteínas F2-enlazador-F1(F(1-103)-GS-F(145-574) o F(1-103)-GS-F(145-553)) pueden comprender adicionalmente, además de la mutación DSCav1, al menos una mutación seleccionada de S46G, A149C, S215P, Y458C, K465Q, denominada aquí "mut1", por ejemplo de las SEQ ID NO: 1636, 2005, o 14678, 15047; o S46G, E92D, A149C, S215P, Y458C, K465Q, aquí referida como “mut2”, por ejemplo las SEQ ID NO: 2374, 2743 o 15416, 15785; o S46G, N67I, E92D, A149C, S215P, Y458C, K465Q, aquí referida como “mut3”, por ejemplo las SEQ ID NO: 3112, 3481 o 13202, 13571, o un fragmento o una variante de cualquiera de estas (ver la tabla 1 del panorama general (diseños de antígeno de proteína F de VSR preferidos)).
[0287] En otras realizaciones, dichas proteínas F2-enlazador-F1 (F(1-103)-GS-F(145-574) o F(1-103)-GS-F(145-553)) pueden comprender, además de la mutación DSCav1, al menos una mutación seleccionada de A149C, Y458C; o N183GC, N428C; o Q98C, Q361C, S46G, E92D, L95M, S215P, I217P, I221M, R429K, K465Q; o Q98C, Q361C, L95M, I221M, R429K; o N183GC, N428C, S46G, N67I, E92D, S215P, K465Q, o un fragmento o una variante de la misma.
[0288] Debe entenderse en el contexto de la invención que cualquier F de VSR puede adaptarse de manera que las dos subunidades F1 y F2 estén comprendidas en una única cadena polipeptídica, estando F2 y F1 conectados mediante un enlazador, por ejemplo un enlazador (GS), para mejorar la estabilidad de la proteína como se explica para las mutaciones "mut1", "mut2" y "mut3", eliminando los aa104-144 de la cadena polipeptídica F0 (como se explicó anteriormente), introduciendo un elemento enlazador entre F2 y F1 como se explicó anteriormente, e introduciendo sustituciones de aminoácidos adecuadas como se explicó anteriormente. Por consiguiente, cualquier número de acceso de proteína NCBI proporcionado anteriormente (ver Lista 2), o cualquier proteína seleccionada de las SEQ ID NO: 68, 8279-8967, 483, 8968-9683, 11726, 12095 o fragmentos o variantes de las mismas pueden ser adaptados por el experto para generar las proteínas de fusión F2-enlazador-F1 como se describe aquí, y adicionalmente pueden adaptarse introduciendo sustituciones de aa (S46G, A149C, S215P, Y458C, K465Q), (S46G, E92D, A149C, S215P, Y458C, K465Q), (S46G, N67I, E92D, A149C, S215P, Y458C, K465Q), (A149C, Y458C), (N183GC, N428C), (Q98C, Q361C, S46G, E92D, L95M, S215P, I217P, I221M, R429K, K465Q), (Q98C, Q361C, L95M, I221M, R429K) o (N183GC, N428C, S46G, N67I, E92D, S215P, K465Q) y/o una mutación DSCav1. Además, aparte de usar un enlazador GS como se describe anteriormente, el experto en la materia puede, por supuesto, elegir entre varios elementos enlazadores conocidos para llegar a variantes de proteína F de VSR similares igualmente adecuadas (por ejemplo seleccionadas de las SEQ ID NO: 117-162 de la solicitud de patente WO2017/172890 o fragmentos o variantes de estas secuencias, o seleccionados de las SEQ ID NO¡: 1509-1565 de la solicitud de patente WO2017/081082, o fragmentos o variantes de estas secuencias).
[0290] En realizaciones preferidas, las proteínas F2-enlazador-F1 (F(1-103)-GS-F(145-574) o F(1-103)-GS-F(145-553) comprenden una mutación DSCav-1 tal como se reivindica, y además una sustitución de aminoácidos mut1 como se define anteriormente, aquí referida como F-del_DSCav1_mut0. En realizaciones preferidas, las proteínas F2-enlazador-F1 (F(1-103)-GS-F(145-574) o F(1-103)-GS-F(145-553) comprenden una mutación DSCav-1 como se reivindica y además una sustitución de aminoácidos mut2 como se definió anteriormente, aquí referida como F-del_DSCav1_mut2. En realizaciones preferidas, las proteínas F2-enlazador-F1 (F(1-103)-GS-F(145-574) o F(1-103)-GS-F(145-553) comprenden una mutación DSCav-1 como se reivindica y además una sustitución de aminoácidos mut3 como se definió anteriormente, aquí referida como F-del_DSCav1_mut3. En realizaciones preferidas, las proteínas F2-enlazador-F1 (F(1-103)-GS-F(145-574) o F(1-103)-GS-F(145-553) comprenden una mutación DSCav-1 como se reivindica y además una sustitución de aminoácidos mut4 como se definió anteriormente, aquí referida como F-del_DSCav1_mut4.
[0292] En la Tabla 1 se proporciona una descripción detallada de las proteínas F de VSR reivindicadas y adicionales.
[0293] En la Tabla 1, todas las referencias hechas a residuos de aminoácidos (aa) y su posición en una proteína F de VSR se refieren a la posición del residuo aa respectivo en una proteína precursora F0 correspondiente de HRSV (A2) (SEQ ID NO: 68) o HRSV(Memphis-37) (SEQ ID NO: 8937 o 11726). Además, las abreviaturas para diseños de antígenos de proteína F de VSR adecuados en la Tabla 1 se utilizan en toda la descripción de la invención (por ejemplo, “F0“, „F-del“, „F0_DSCav1“, „F-del_ DSCav1“, „F_DSCav1_mut1“, „F-del_DSCav1_mut1“, „F_DSCav1_mut2“, „F-del_DSCav1_mut2“, “F_DSCav1_mut3“, „F-del_DSCav1_mut3“, „F_DSCav1_mut4“, „F-del_DSCav1_mut4“, „F_DSCav1_mut5“, „F-del_DSCav1_mut5“, „F_DSCav1_mut6“, „F-del_DSCav1_mut6“, „F_DSCav1_mut7“, „F-del_DSCav1_mut7 “, „F_DSCav1_mut8“, „F-del_DSCav1_mut8“, „F_DSCav1_mut0“, „F-del_DSCav1_mut0“). La columna A de la Tabla 1 proporciona las SEQ ID NO de las proteína de los respectivos diseños de antígeno de proteína F de RSV derivados de HRSV (A2); la columna B de la Tabla 1 proporciona las SEQ ID NO de proteína de los respectivos diseños de antígeno de proteína F de VSR derivados de HRSV (Memphis-37). En particular, la descripción de la invención incluye explícitamente la información proporcionada bajo el identificador <223> del listado de secuencias ST25 de la presente solicitud.
[0295] Tabla 1:Diseños de antígeno de proteína F de VSR reivindicados y adicionales
[0297]
[0298]
[0299]
[0302] En realizaciones particularmente preferidas, el ARN artificial de acuerdo con el primer aspecto codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de una proteína de fusión (F) de VSR donde la proteína F de VSR se selecciona de F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut4 (ver por ejemplo la Tabla 1).
[0304] Particularmente preferidas y ventajosas en el contexto de la invención son las proteínas F de VSR seleccionadas de F-del_DSCav1, F-del_DSCav1_mut0, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut4, F-del_DSCav1_mut5, F-del_DSCav1_mut6, F-del_DSCav1_mut7, F-del_DSCav1_mut8 , o un fragmento o una variante de la misma (ver por ejemplo, Tabla 1).
[0306] En realizaciones preferidas, el ARN artificial del primer aspecto comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica que comprende o consiste en al menos una secuencia de aminoácidos que es idéntica o al menos un 97%, 98% o 99% idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 2005, 2743, 3481, 4957, 16523. La información adicional con respecto a cada una de estas secuencias de aminoácidos reivindicadas que codifican proteínas VSR también puede derivarse del listado de secuencias, en particular de los detalles proporcionados en el mismo bajo el identificador <223> como se explica a continuación.
[0308] De acuerdo con otra realización preferida, el ARN artificial de la invención codifica al menos un péptido o proteína antigénica como se reivindica y puede codificar adicionalmente al menos otro péptido o elemento proteico heterólogo.
[0309] De manera adecuada, el al menos otro péptido o elemento proteico puede promover la secreción del péptido o proteína antigénica codificada de la invención (por ejemplo, a través de secuencias señal secretoras), promover el anclaje del péptido o proteína antigénica codificada de la invención en la membrana plasmática (por ejemplo, a través de elementos transmembrana), promover la formación de complejos de antígenos (por ejemplo, mediante dominios de multimerización), promover la formación de partículas similares a virus (secuencia formadora de VLP). Además, la secuencia de ácido nucleico artificial de acuerdo con la presente invención puede codificar adicionalmente elementos ligadores de péptidos, péptidos de autoescisión, secuencias de adyuvantes inmunológicos o secuencias de direccionamiento de células dendríticas. Los dominios de multimerización adecuados pueden seleccionarse de la lista de secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEQ ID NO: 1116-1167 de la solicitud de patente WO2017/081082, o fragmentos o variantes de estas secuencias. Los elementos de trimerización y tetramerización se pueden seleccionar de, por ejemplo, cremalleras de leucina diseñadas (péptido helicoidal en espiral α diseñado que adopta un estado trimérico paralelo), dominio de pliegue de fibritina del fago de enterobacterias T4, GCN4pII, GCN4-pLI y p53. En ese contexto, se prefieren el dominio de pliegue de fibritina del fago T4 de enterobacterias, GCN4pII, GCN4-pLI y p53. Los elementos transmembrana adecuados pueden seleccionarse de la lista de secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEQ ID NO: 1228-1343 de la solicitud de patente WO2017/081082, o fragmentos o variantes de estas secuencias. Las secuencias formadoras de VLP adecuadas pueden seleccionarse de la lista de secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEQ ID NO: 1168-1227 de la solicitud de patente WO2017/081082, o fragmentos o variantes de estas secuencias. Los ligadores peptídicos adecuados pueden seleccionarse de la lista de secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEQ ID NO: 1509-1565 de la solicitud de patente WO2017/081082, o fragmentos o variantes de estas secuencias. Los péptidos autodescindibles adecuados pueden seleccionarse de la lista de secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEQ ID NO: 1434-1508 de la solicitud de patente WO2017/081082, o fragmentos o variantes de estas secuencias. Las secuencias adyuvantes inmunológicas adecuadas pueden seleccionarse de la lista de secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEQ ID NO: 1360-1421 de la solicitud de patente WO2017/081082, o fragmentos o variantes de estas secuencias. Las secuencias de direccionamiento de células dendríticas (DC) adecuadas pueden seleccionarse de la lista de secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEQ ID NO: 1344-1359 de la solicitud de patente WO2017/081082, o fragmentos o variantes de estas secuencias. Los péptidos señal secretores adecuados pueden seleccionarse de la lista de secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEQ ID NO: 1-1115 y la SEQ ID NO: 1728 de la solicitud de patente WO2017/081082, o fragmentos o variantes de estas secuencias. A nivel de ácido nucleico, puede seleccionarse cualquier secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, una secuencia de ARN) que codifique tales secuencias de aminoácidos. La secuencia señal secretora heteróloga puede aumentar la secreción del péptido o proteína antigénica codificada.
[0310] De acuerdo con realizaciones, la secuencia señal secretora comprende una secuencia de codificación idéntica o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 21329-21362 o un fragmento o variante de cualquiera de estas secuencias. La información adicional con respecto a cada una de estas secuencias de aminoácidos adecuadas que codifican secuencias de señal secretoras también puede derivarse del listado de secuencias, en particular de los detalles proporcionados en el mismo bajo el identificador <223>.
[0311] Debe entenderse que, a nivel de ácido nucleico, puede seleccionarse cualquier secuencia de ARN que codifica una secuencia de aminoácidos idéntica a las SEQ ID NO: 2005, 2743, 3481, 4957, 16523, o cualquier secuencia de ácido nucleico (por ejemplo secuencia de ADN o de ARN) que codifica secuencias de aminoácidos un 97%, 98% o 99% idénticas a las SEQ ID NO: 2005, 2743, 3481, 4957, 16523 y así se entiende que son secuencias codificantes adecuadas y pueden así estar comprendidas en el ARN artificial del primer aspecto.
[0312] De manera adecuada, en realizaciones particularmente preferidas, el ARN artificial del primer aspecto comprende una secuencia codificante ubicada entre dicha 5'-UTR y dicha 3'-UTR, preferiblemente aguas abajo de dicha 5'-UTR y aguas arriba de dicha 3'-UTR.
[0313] En realizaciones preferidas, el ARN artificial del primer aspecto comprende una secuencia codificante que comprende al menos una de las secuencias de ácido nucleico que es idéntica o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92% , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a las SEQ ID NO: 2006-2013, 2744-2751, 3482-3489, 4958-4965, 16524-16531, 21370, 21372, 21374, 21376, 21402 (ver las tablas 3-6). La información adicional con respecto a cada una de estas secuencias de ácido nucleico reivindicadas codificantes también puede derivarse del listado de secuencias, en particular de los detalles proporcionados en el mismo bajo el identificador <223>.
[0314] De acuerdo con realizaciones preferidas, el ARN artificial es un ARN artificial modificado y/o estabilizado.
[0315] De acuerdo con realizaciones preferidas, el ARN artificial de la presente invención puede proporcionarse como un "ARN artificial estabilizado", es decir, un ARN que muestra una resistencia mejorada a la degradaciónin vivoy/o un ARN artificial que muestra una estabilidad mejoradain vivoy/o un ARN artificial que muestra traducibilidad mejoradain vivo. A continuación, se describen modificaciones específicas adecuadas en este contexto que son adecuadamente para "estabilizar" el ARN artificial.
[0316] Tal estabilización puede conseguirse proporcionando un "ARN seco" y/o un "ARN purificado" como se especifica en este documento. Alternativamente o además, dicha estabilización puede efectuarse, por ejemplo, mediante una estructura principal de fosfato modificada del ARN artificial de la presente invención. Una modificación de la estructura principal en relación con la presente invención es una modificación en la que los fosfatos de la estructura principal de los nucleótidos contenidos en el ARN se modifican químicamente. Los nucleótidos que se pueden usar preferiblemente a este respecto contienen, por ejemplo, una estructura principal de fosfato modificado con fosforotioato, preferiblemente al menos uno de los oxígenos de fosfato contenidos en la estructura principal de fosfato se reemplaza por un átomo de azufre. Los ARN estabilizados pueden incluir, además, por ejemplo: análogos de fosfato no iónicos, tales como, por ejemplo, alquilo y arilfosfonatos, en los que el oxígeno fosfonato cargado se reemplaza por un grupo alquilo o arilo, o fosfodiésteres y alquilfosfotriésteres, en los que el residuo de oxígeno está presente en forma alquilada. Tales modificaciones de la estructura principal incluyen típicamente, sin implicar ninguna limitación, modificaciones del grupo que consiste en metilfosfonatos, fosforamidatos y fosforotioatos (por ejemplo, citidina-5´-O-(1-tiofosfato)).
[0317] A continuación, se describen modificaciones adecuadas que son capaces de "estabilizar" el ARN artificial de la invención.
[0318] De acuerdo con realizaciones, el ARN artificial de acuerdo con la invención es un ARN artificial modificado, donde la modificación se refiere a modificaciones químicas que comprenden modificaciones de la estructura principal, así como modificaciones de azúcares o modificaciones de bases.
[0319] En este contexto, un ARN artificial modificado como se define aquí puede contener análogos/modificaciones de nucleótidos, por ejemplo modificaciones del esqueleto principal, modificaciones de azúcar o modificaciones de bases. Una modificación de la estructura principal en relación con la presente invención es una modificación en la que los fosfatos de la estructura principal de los nucleótidos contenidos en un ácido nucleico, por ejemplo un ARN artificial, se modifican químicamente. Una modificación de azúcar en relación con la presente invención es una modificación química del azúcar de los nucleótidos del ARN como se define aquí. Además, una modificación de base en relación con la presente invención es una modificación química de las bases de los nucleótidos del ARN. En este contexto, los análogos o modificaciones de nucleótidos se seleccionan preferiblemente de análogos de nucleótidos que son aplicables para transcripción y/o traducción.
[0321] En realizaciones particularmente preferidas de la presente invención, los análogos/modificaciones de nucleótidos que pueden incorporarse en un ácido nucleico modificado o particularmente en un ARN modificado como se describe aquí se seleccionan preferiblemente de 2-amino-6-cloropurineribósido-5'-trifosfato, 2-Aminopurina-ribósido-5'-trifosfato; 2-aminoadenosina-5'-trifosfato, 2'-Amino-2'-desoxicitidina-trifosfato, 2-tiocitidina-5'-trifosfato, 2-tiouridina-5'-trifosfato, 2'-Fluorotimidina-5'-trifosfato, 2'-O-Metil-inosina-5'-trifosfato 4-tiouridina-5'-trifosfato, 5-aminoalilcitidina-5'-trifosfato, 5-aminoaliluridina-5'-trifosfato, 5-bromocitidina-5'-trifosfato, 5-bromouridina-5'-trifosfato, 5-bromo-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato, 5-bromo-2'-desoxiuridina-5'-trifosfato, 5-yodocitidina-5'-trifosfato, 5-yodo-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato, 5-yodouridina-5'-trifosfato, 5-yodo-2'-desoxiuridina-5'-trifosfato, 5-metilcitidina-5'-trifosfato, 5-metiluridina-5'-trifosfato, 5-propinil-2'-desoxicitidina-5'-trifosfato, 5-propinil-2'-desoxiuridina-5'-trifosfato, 6-azacitidina-5'-trifosfato, 6-azauridina-5'-trifosfato, 6-cloropurineribósido-5'-trifosfato, 7-desazaadenosina-5'-trifosfato, 7-deazaguanosina-5'-trifosfato, 8-azaadenosina-5'-trifosfato, 8-azidoadenosina-5'-trifosfato, bencimidazol-ribósido-5'-trifosfato, N1-metiladenosina-5'-trifosfato, N1-metilguanosina-5'-trifosfato, N6-metiladenosina-5'-trifosfato, O6-metilguanosina-5'-trifosfato, pseudouridina-5'-trifosfato o puromicina-5'-trifosfato, xantosina-5'-trifosfato. Se da preferencia particular a los nucleótidos para modificaciones de bases seleccionados del grupo de nucleótidos modificados por bases que consisten en 5-metilcitidina-5'-trifosfato, 7-desazaguanosina-5'-trifosfato, 5-bromocitidina-5'-trifosfato y pseudouridina-5'-trifosfato, piridin-4-ona ribonucleósido, 5-aza-uridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2-tiouridina, 4-tio-pseudouridina, 2-tiopseudouridina, 5-hidroxiuridina, 3-metiluridina, 5-carboximetil-uridina, 1-carboximetil-pseudouridina, 5-propinil-uridina, 1-propinil-pseudouridina, 5-taurinometiluridina, 1-taurinometil-pseudouridina, 5-taurinometil-2-tio-uridina, 1-taurinometil-4-tio-uridina, 5-metil-uridina, 1-metil-pseudouridina, 4-tio-1-metil-pseudouridina, 2-tio-1-metilpseudouridina, 1-metil-1-deaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridina, dihidrouridina, dihidropseudouridina, 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-metoxiuridina, 2-metoxi-4-tio-uridina, 4-metoxi-pseudouridina y 4-metoxi-2-tio-pseudouridina, 5-aza-citidina, pseudoisocitidina, 3-metil-citidina, N4-acetilcitidina, 5-formilcitidina, N4-metilcitidina, 5-hidroximetilcitidina, 1-metil-pseudoisocitidina, pirrolo-citidina, pirrolopseudoisocitidina, 2-tio-citidina, 2-tio-5-metil-citidina, 4-tio-pseudoisocitidina, 4-tio-1-metil-pseudoisocitidina, 4-tio-1-metil-1-deaza-pseudoisocitidina, 1-metil-1-deaza-pseudoisocitidina, zebularina, 5-aza-zebularina, 5-metil-zebularina, 5-aza-2-tio-zebularina, 2-tio-zebularina, 2-metoxi-citidina, 2-metoxi-5-metil-citidina, 4-metoxi-pseudoisocitidina y 4-metoxi-1-metil-pseudoisocitidina, 2-aminopurina, 2, 6-diaminopurina, 7-deaza-adenina, 7-deaza-8-aza-adenina, 7-deaza-2-aminopurina, 7-deaza-8-aza-2-aminopurina, 7-deaza-2,6-diaminopurina, 7-deaza-8-aza-2,6-diaminopurina, 1-metiladenosina, N6-metiladenosina, N6-isopenteniladenosina, N6- (cis-hidroxiisopentenil) adenosina, 2-metiltio-N6-(cis-hidroxiisopentenil) adenosina, N6-glicinilcarbamoiladenosina, N6-treonilcarbamoiladenosina, 2-metiltio-N6-treonilcarbamoiladenosina, N6, N6-dimetiladenosina, 7-metiladenina, 2-metiltio-adenina y 2-metoxi-adenina, inosina, 1-metil-inosina, wyosina, wybutosina, 7-deaza-guanosina, 7-deaza-8-aza-guanosina, 6-tio-guanosina, 6-tio-7-deazaguanosina, 6-tio-7-deaza-8-aza-guanosina, 7-metil-guanosina, 6-tio-7-metil-guanosina, 7-metilinosina, 6-metoxiguanosina, 1-metilguanosina, N2-metilguanosina, N2, N2-dimetilguanosina, 8-oxo-guanosina, 7-metil-8-oxoguanosina, 1-metil-6-tio-guanosina, N2-metil-6-tio-guanosina y N2, N2-dimetil-6-tio-guanosina, 5'-O- (1-tiofosfato) -adenosina, 5'-O - (1-tiofosfato) -citidina, 5'-O- (1-tiofosfato) -guanosina, 5'-O- (1-tiofosfato) -uridina, 5'-O- (1-tiofosfato) -pseudouridina, 6-aza-citidina, 2-tio-citidina, alfa-tio-citidina, pseudo-iso-citidina, 5-aminoalil-uridina, 5-yodo-uridina, N1-metil-pseudouridina, 5,6-dihidrouridina, alfa-tio-uridina, 4-tio-uridina, 6-aza-uridina, 5-hidroxi-uridina, desoxitimidina, 5-metil-uridina, pirrolo-citidina, inosina, alfa-tio-guanosina, 6-metil-guanosina, 5-metil-citidina, 8-oxoguanosina, 7-deaza-guanosina, N1-metil-adenosina, 2-amino-6-cloro-purina, N6-metil- 2-amino-purina, pseudo-isocitidina, 6-cloro-purina, N6-metil-adenosina, alfa-tio-adenosina, 8-azido-adenosina, 7-deaza-adenosina. Particularmente preferidas y adecuadas en el contexto de la invención son pseudouridina (ψ), N1-metilpseudouridina (m1ψ), 5-metilcitosina y 5-metoxiuridina. Por consiguiente, el ARN artificial como se define en este documento puede comprender al menos un nucleótido modificado seleccionado entre pseudouridina (ψ), N1-metilpseudouridina (m1ψ), 5-metilcitosina y 5-metoxiuridina.
[0323] En realizaciones preferidas, el ARN artificial de la invención comprende al menos una secuencia codificante donde la al menos una secuencia codificante es una secuencia codificante modificada con pseudouridina (ψ).
[0325] Así, en realizaciones preferidas, el ARN artificial de la invención, o la al menos una secuencia codificante, comprende una secuencia de ácido nucleico donde al menos uno o más de uno, preferiblemente donde todos los nucleótidos uracilo están reemplazados por nucleótidos pseudouridina (ψ)
[0327] En otras realizaciones adicionales, el ARN artificial de la invención comprende al menos una secuencia codificante donde la al menos una secuencia codificante es una secuencia codificante modificada con N1-metilpseudouridina (m1ψ).
[0329] Así, en realizaciones preferidas, el ARN artificial de la invención, o la al menos una secuencia codificante, comprende una secuencia de ácido nucleico donde al menos uno o más de uno, preferiblemente donde todos los nucleótidos uracilo están reemplazados por nucleótidos N1-metilpseudouridina (m1ψ).
[0330] En realizaciones preferidas, el ARN artificial de la invención comprende al menos una secuencia codificante donde la al menos una secuencia codificante es una secuencia codificante modificada por codón.
[0332] En realizaciones preferidas, la al menos una secuencia codificante de la invención es una secuencia codificante modificada por codón, donde la secuencia de aminoácidos codificada por la al menos una secuencia codificante modificada por codón preferiblemente no está modifica en comparación con la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia codificante de tipo salvaje correspondiente.
[0334] El término "secuencia codificante modificada por codón" se refiere a secuencias codificantes que difieren en al menos un codón (tripletes de nucleótidos que codifican un aminoácido) en comparación con la secuencia codificante de tipo salvaje correspondiente. De manera adecuada, una secuencia codificante modificada con codón en el contexto de la invención puede mostrar una resistencia mejorada a la degradaciónin vivoy/o una estabilidad mejoradain vivoy/o una traducibilidad mejoradain vivo. Las modificaciones de codón en el sentido más amplio hacen uso de la degeneración del código genético, donde múltiples codones pueden codificar el mismo aminoácido y pueden usarse indistintamente (ver Tabla 2) para optimizar/modificar la secuencia codificante para aplicacionesin vivocomo se describe anteriormente.
[0336] En realizaciones particularmente preferidas del primer aspecto, la al menos una secuencia es una secuencia codificante modificada con codón, donde la secuencia codificadora modificada con codón se selecciona de una secuencia codificante maximizada en C, una secuencia codificante maximizada CAI, una secuencia codificante adaptada al uso del codón humano, una secuencia de codificación con contenido en G/C modificado y una secuencia de codificación optimizada para G/C, o cualquier combinación de las mismas, o cualquier combinación de las mismas.
[0337] De acuerdo con realizaciones preferidas, el ARN artificial de la invención puede estar modificado, donde el contenido de C de la al menos una secuencia codificante puede incrementarse, preferiblemente maximizarse, en comparación con el contenido de C de la secuencia codificante de tipo salvaje correspondiente (aquí denominada "secuencia de codificación maximizada en C"). La secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de codificación maximizada en C del ARN preferiblemente no está modificada en comparación con la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de codificación de ácido nucleico de tipo salvaje respectiva. La generación de secuencias de ácido nucleico maximizadas en C puede llevarse a cabo de forma adecuada usando un método de modificación de acuerdo con la WO2015/062738. A lo largo de la descripción de la invención, incluido el identificador <223> del listado de secuencias, las secuencias de codificación maximizadas en C de las secuencias de ácido nucleico de VSR adecuadas se indican mediante la abreviatura "opt2".
[0339] De acuerdo con realizaciones, el ARN artificial de la invención puede estar modificado, donde el contenido de G/C de la al menos una secuencia codificante puede modificarse en comparación al contenido de G/C de la secuencia codificante de tipo salvaje correspondiente (aquí denominada "secuencia de codificación modificada por contenido de G/C"). En este contexto, los términos "optimización de G/C" o "modificación del contenido de G/C" se refieren a un ácido nucleico, preferiblemente un ácido nucleico artificial de la invención, que comprende un número modificado, preferiblemente aumentado, de nucleótidos guanosina y/o citosina en comparación con la correspondiente secuencia de ácido nucleico de tipo salvaje. Dicho número aumentado puede generarse mediante la sustitución de codones que contienen nucleótidos adenosina o timidina por codones que contienen nucleótidos guanosina o citosina. Si el contenido de G/C enriquecido ocurre en una secuencia de codificación de ADN o ARN, se hace uso de la degeneración del código genético. En particular, en el caso del ARN, las secuencias que tienen un contenido aumentado de G (guanosina)/C (citosina) son más estables que las secuencias que tienen un contenido aumentado de A (adenosina)/U (uracilo). La secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de codificación modificada del contenido de G/C de la secuencia de ácido nucleico preferiblemente no está modificada en comparación con la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de codificación de ácido nucleico de tipo salvaje respectiva. Preferiblemente, el contenido de G/C de la secuencia de codificación de la secuencia de ácido nucleico artificial, por ejemplo la secuencia de ARN de la presente invención, aumenta en al menos un 10%, preferiblemente en al menos un 20%, más preferiblemente en al menos un 30%, con mayor preferencia en al menos un 40% en comparación con el contenido de G/C de la secuencia de codificación de la secuencia de ácido nucleico de tipo salvaje correspondiente (por ejemplo, secuencia de ARN) que codifica un antígeno de VSR como se define aquí o un fragmento o variante del mismo.
[0340] De acuerdo con realizaciones preferidas, el ARN artificial de la invención puede modificarse, donde el contenido de G/C de la al menos una secuencia de codificación puede optimizarse en comparación al contenido de G/C de la secuencia de codificación de tipo salvaje correspondiente (aquí denominada "secuencia de codificación optimizada por contenido de G/C"). "Optimizado" en ese contexto se refiere a una secuencia de codificación donde el contenido de G/C se aumenta, preferiblemente al contenido de G/C esencialmente más alto posible. La secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de codificación optimizada en el contenido de G/C de la secuencia de ácido nucleico preferiblemente no está modificada en comparación con la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de codificación de ácido nucleico de tipo salvaje respectiva. La generación de una secuencia de ARN nucleico con contenido optimizado de G/C se puede llevar a cabo de manera adecuada usando un método de optimización del contenido de G/C de acuerdo con el documento WO2002/098443. A lo largo de la descripción de la invención, incluido el identificador <223> del listado de secuencias, las secuencias de codificación optimizadas en G/C de las secuencias de ácido nucleico de VSR adecuadas se indican mediante la abreviatura "opt1, opt5, opt6, opt11".
[0341] De acuerdo con realizaciones, el ARN artificial de la invención puede modificarse, donde los codones de la al menos una secuencia codificante de la invención pueden adaptarse al uso de codones humanos (denominada aquí "secuencia codificante adaptada al uso de codones humanos"). Los codones que codifican el mismo aminoácido ocurren a diferentes frecuencias en un sujeto, por ejemplo un humano. Por consiguiente, la secuencia codificante del ARN artificial se modifica preferiblemente de modo que la frecuencia de los codones que codifican el mismo aminoácido corresponda a la frecuencia natural de ese codón de acuerdo con el uso del codón humano, por ejemplo como se muestra en la Tabla 2. Por ejemplo, en el caso del aminoácido Ala, la secuencia codificante de tipo salvaje se adapta preferiblemente de manera que el codón "GCC" se use con una frecuencia de 0,40, el codón "GCT" se use con una frecuencia de 0,28, el codón "GCA" se utiliza con una frecuencia de 0,22 y el codón "GCG" con una frecuencia de 0,10, etc. (ver Tabla 2). Por consiguiente, tal procedimiento (como se ejemplifica para Ala) se aplica para cada aminoácido codificado por la secuencia codificante del ácido nucleico artificial de la invención para obtener secuencias adaptadas al uso de codones humanos. A lo largo de la descripción de la invención, incluido el identificador <223> del listado de secuencias, las secuencias de codificación adaptadas al uso de codones humanos de secuencias de ácido nucleico de VSR adecuadas se indican mediante la abreviatura "opt3".
[0343] Tabla 2:Tabla de uso de codones humanos con frecuencias indicadas para cada aminoácido
[0345]
[0346]
[0348] *: codón humano más frecuente
[0350] De acuerdo con realizaciones, el ARN artificial de la presente invención puede modificarse, donde el índice de adaptación de codones (CAI) puede aumentarse o preferiblemente maximizarse en al menos una secuencia codificante de la invención (denominada aquí "secuencia de codificación maximizada por CAI"). Por consiguiente, se prefiere que todos los codones de la secuencia de ácido nucleico de tipo salvaje que son relativamente raros, por ejemplo en una célula humana, se intercambian por un codón respectivo que es frecuente en, por ejemplo una célula humana, donde el codón frecuente codifica el mismo aminoácido que el codón relativamente raro. De forma adecuada, se utilizan los codones más frecuentes para cada aminoácido codificado (ver la Tabla 2, los codones humanos más frecuentes están marcados con asterisco). De forma adecuada, el ARN artificial de la invención comprende al menos una secuencia codificante donde el índice de adaptación de codones (CAI) de la al menos una secuencia codificante es al menos 0,5, al menos 0,8, al menos 0,9 o al menos 0,95. Con mayor preferencia, el índice de adaptación de codones (CAI) de la al menos una secuencia codificante es 1. Por ejemplo, en el caso del aminoácido Ala, la secuencia codificante de tipo salvaje está adaptada de manera que el codón humano más frecuente “GCC” se usa siempre para dicho aminoácido. Por consiguiente, tal procedimiento (como se ejemplifica para Ala) se aplica para cada aminoácido codificado por la secuencia codificante del ARN artificial de la invención para obtener secuencias de codificación maximizadas por CAI. A lo largo de la descripción de la invención, incluido el identificador <223> del listado de secuencias, las secuencias de codificación maximizadas en CAI de las secuencias de ácido nucleico de VSR adecuadas se indican mediante la abreviatura "opt4".
[0352] Así, en una realización particularmente preferida, el ARN artificial del primer aspecto comprende al menos una secuencia codificante que comprende una secuencia de ácido nucleico modificada con codón que es idéntica o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de ácido nucleico modificada por codón seleccionada del grupo consistente en las SEQ ID NO: 2006-2013, 2744-2751, 3482-3489, 4958-4965, 16524-16531, 21370, 21372, 21374, 21376, 21402 o un fragmento o variante de cualquiera de estas secuencias (ver también la Tabla 3 y 4), donde únicamente el ARN artificial definido en las reivindicaciones adjuntas es parte de la presente invención. La información adicional con respecto a cada una de estas secuencias de ácido nucleico adecuadas codificantes también puede derivarse del listado de secuencias, en particular de los detalles proporcionados en el mismo bajo el identificador <223>.
[0354] En realizaciones particularmente preferidas, el ARN artificial del primer aspecto comprende al menos una secuencia codificante que comprende una secuencia de ácido nucleico modificada por codón que es idéntica o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92% , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a cualquiera de las secuencias de ácido nucleico optimizadas para G/C o modificadas por contenido de G/C de acuerdo con las SEQ ID NO: 2006, 2007, 2011, 2013, 2744, 2745, 2749, 2751, 3482, 3483, 3487, 3488, 3489, 4958, 4959, 4963, 4964, 4965, 16524, 16525, 16529, 16530, 16531, 21370, 21372, 21374, 21376, 21402 o un fragmento o variante de cualquiera de estas secuencias (ver también Tabla 3 y 4; opt1, 5, 6, 11), donde únicamente el ARN artificial definido en las reivindicaciones adjuntas es parte de la presente invención. La información adicional con respecto a cada una de estas secuencias de ácido nucleico adecuadas codificantes también puede derivarse del listado de secuencias, en particular de los detalles proporcionados en el mismo bajo el identificador <223>.
[0356] En una realización preferida, el ARN artificial de la invención comprende al menos una secuencia codificante que comprende una secuencia de ácido nucleico modificada por codón que es idéntica o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92% , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a cualquiera de las secuencias de ácido nucleico adaptadas al uso de codón humano de acuerdo con las SEQ ID NO: 2009, 2747, 3485, 4961, 16527, o un fragmento o variante de cualquiera de estas secuencias (ver también Tabla 3 y 4; opt3), donde únicamente el ARN artificial definido en las reivindicaciones adjuntas es parte de la presente invención. La información adicional con respecto a cada una de estas secuencias de ácido nucleico adecuadas codificantes también puede derivarse del listado de secuencias, en particular de los detalles proporcionados en el mismo bajo el identificador <223>.
[0358] En realizaciones particularmente preferidas, el ARN artificial del primer aspecto comprende al menos una secuencia codificante que comprende una secuencia de ácido nucleico modificada por codón que es idéntica o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92% , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a cualquiera de las secuencias de ácido nucleico maximizadas en C de acuerdo con las SEQ ID NO: 2008, 2746, 3484, 4960, 16526 o un fragmento o variante de cualquiera de estas secuencias (ver también Tabla 3 y 4; opt2), donde únicamente el ARN artificial definido en las reivindicaciones adjuntas es parte de la presente invención. La información adicional con respecto a cada una de estas secuencias de ácido nucleico adecuadas codificantes también puede derivarse del listado de secuencias, en particular de los detalles proporcionados en el mismo bajo el identificador <223>.
[0360] En una realización preferida, el ARN artificial de la invención comprende al menos una secuencia codificante que comprende una secuencia de ácido nucleico modificada con codón que es idéntica o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a cualquiera de las secuencias de ácido nucleico maximizadas por CAI de acuerdo con las SEQ ID NO: 2010, 2748, 3486, 4962, 16528, o un fragmento o variante de cualquiera de estas secuencias (ver también Tabla 3 y 4; opt4), donde únicamente el ARN artificial definido en las reivindicaciones adjuntas es parte de la presente invención. La información adicional con respecto a cada una de estas secuencias de ácido nucleico adecuadas codificantes también puede derivarse del listado de secuencias, en particular de los detalles proporcionados en el mismo bajo el identificador <223>.
[0362] En realizaciones, el contenido de A/U en el entorno del sitio de unión del ribosoma del ácido nucleico artificial, en particular el ARN artificial de la invención, puede aumentarse en comparación con el contenido de A/U en el entorno del sitio de unión del ribosoma de su respectivo ácido nucleico de tipo salvaje. Esta modificación (un contenido aumentado de A/U alrededor del sitio de unión del ribosoma) aumenta la eficacia de la unión del ribosoma al ácido nucleico, preferiblemente al ARN. Una unión efectiva de los ribosomas al sitio de unión de los ribosomas tiene a su vez el efecto de una traducción efectiva del ARN. Por consiguiente, en una realización particularmente preferida, el ácido nucleico artificial de la invención comprende un sitio de unión al ribosoma, también denominado "secuencia Kozak" idéntica o al menos un 80%, 85%, 90%, 95% idéntica a cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 41, 42 o fragmentos o variantes de las mismas.
[0364] Las secuencias codificantes de ácido nucleico y polipéptido de VSR preferidas ("cds") se proporcionan en la Tabla 3A y 3B y la Tabla 4A y 4B.
[0366] En la Tabla 3A y 3B, las columnas A a J representan constructos específicos adecuados de la invención derivados de la proteína (F) fusión de VSR, donde la columna A proporciona secuencias adecuadas para F0, la columna B proporciona secuencias adecuadas para F-del, la columna C proporciona secuencias adecuadas para F0_DSCav1, la columna D proporciona secuencias adecuadas para F-del_DSCav1, la columna E proporciona secuencias adecuadas para F_DSCav1_mut1, la columna F proporciona secuencias adecuadas para F-del_DSCav1_mut1, la columna G proporciona secuencias adecuadas para F_DSCav1_mut2, la columna H proporciona secuencias adecuadas para F-del_DSCav1_mut2, la columna I proporciona secuencias adecuadas para F_DSCav1_mut3, la columna J proporciona secuencias adecuadas para F-del_DSCav1_mut3. Las SEQ ID NO de proteínas específicas que se proporcionan en el listado de secuencias están en la fila 2 ("PRT"). Las SEQ ID NO de las correspondientes secuencias codificantes de tipo salvaje/no modificadas se proporcionan en la fila 3 ("wt"). Las SEQ ID NO de las correspondientes secuencias codificantes modificadas con codones para cada constructo proteico se proporcionan en la fila 4 a la fila 10 ("opt1", "opt2", "opt3", "opt4", "opt5", "opt6", "opt11" ). En la Tabla 3A, se proporcionan secuencias codificantes derivadas de HRSV (A2), en la Tabla 3B se proporcionan secuencias codificantes derivadas de HRSV (Memphis-37). Se proporciona información adicional en el identificador <223> para cada una de las respectivas SEQ ID NO en el listado de secuencias.
[0368] Tabla 3A:Secuencias de codificación reivindicadas y adicionales que codifican F de VSR (columnas A-J), derivadas de HRSV (A2)
[0370]
[0371] Tabla 3B:Secuencias de codificación reivindicadas y adicionales que codifican F de VSR (columnas A-J), derivadas de HRSV (Memphis-37)
[0373]
[0376] En la Tabla 4A y 4B, las Columnas K a V representan constructos específicos adecuados de la invención derivados de la proteína (F) fusión de VSR, donde la columna K proporciona secuencias adecuadas para F_DSCav1_mut0, la columna L proporciona secuencias adecuadas para F-del_DSCav1_mut0, la columna M proporciona secuencias adecuadas para F_DSCav1_mut4, la columna N proporciona secuencias adecuadas para F-del_DSCav1_mut4, la columna O proporciona secuencias adecuadas para F_DSCav1_mut5, la columna P proporciona secuencias adecuadas para F-del_DSCav1_mut5, la columna Q proporciona secuencias adecuadas para F_DSCav1_mut6, la columna R proporciona secuencias adecuadas para F-del_DSCav1_mut6, la columna S proporciona secuencias adecuadas para F_DSCav1_mut7, la columna T proporciona secuencias adecuadas para F-del_DSCav1_mut7, la columna U proporciona secuencias adecuadas para F_DSCav1_mut8, la columna V proporciona secuencias adecuadas para F-del_DSCav1_mut8. Las SEQ ID NO de proteínas específicas que se proporcionan en el listado de secuencias están en la fila 2 ("PRT"). Las SEQ ID NO de las correspondientes secuencias codificantes modificadas con codones para cada constructo proteico se proporcionan en la fila 3 a la fila 9 ("opt1", "opt2", "opt3", "opt4", "opt5", "opt6", "opt11"). En la Tabla 4A, se proporcionan secuencias codificantes derivadas de HRSV (A2), en la Tabla 4B se proporcionan secuencias codificantes derivadas de HRSV (Memphis-37). Se proporciona información adicional en el identificador <223> para cada una de las respectivas SEQ ID NO en el listado de secuencias.
[0378] Tabla 4A:Secuencias de codificación reivindicadas y adicionales que codifican F de VSR (columnas K-V), derivadas de HRSV (A2)
[0380]
[0383] Tabla 4B:Secuencias de codificación reivindicadas y adicionales que codifican F de VSR (columnas K-V) derivadas de HRSV (Memphis-37)
[0385]
[0386]
[0388] En realizaciones, el ARN artificial del primer aspecto es monocistrónico, bicistrónico o multicistrónico.
[0389] En realizaciones preferidas, el ARN artificial de la invención es monocistrónico.
[0390] El término "ácido nucleico monocistrónico" o "ácido nucleico monocistrónico" será reconocido y entendido por el experto en la técnica y, por ejemplo, se pretende referir a un ARN artificial que comprende solo una secuencia codificante como se define aquí. Los términos "ácido nucleico bicistrónico, ácido nucleico multicistrónico" o "ARN monocistrónico", como se usan en este documento, serán reconocidos y comprendidos por el experto en la técnica, y están destinados, por ejemplo, a referirse a un ARN artificial que puede tener dos (bicistrónico) o incluso más secuencias codificantes (multicistrónico).
[0391] En realizaciones, el ARN artificial de la invención es monocistrónico y la secuencia codificante de dicho ARN artificial monocistrónico codifica al menos dos péptidos o proteínas antigénicos diferentes derivados de F de VSR como se define aquí, o un fragmento o variante de los mismos. Por consiguiente, la al menos una secuencia codificante del ARN artificial monocistrónico puede codificar al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho y más péptidos o proteínas antigénicos derivados de un VSR, preferiblemente una F de VSR como se define aquí unida con o sin una secuencia enlazadora de aminoácidos, donde dicha secuencia enlazadora puede comprender enlazadores rígidos, flexibles, escindibles (por ejemplo péptidos que se autoescinden) como se define anteriormente, o una combinación de los mismos (denominada aquí "constructos de múltiples antígenos/ácido nucleico”).
[0392] En realizaciones, el ARN artificial de la invención es bicistrónico o multicistrónico y comprende al menos dos secuencias de codificación, donde las al menos dos secuencias de codificación codifican dos o más péptidos antigénicos o proteínas diferentes derivados del VSR, preferiblemente F de VSR como se define en este documento, o un fragmento o variante de cualquiera de estos. Por consiguiente, las secuencias codificantes en un ARN artificial bicistrónico o multicistrónico codifican adecuadamente proteínas o péptidos antigénicos distintos como se definen en este documento o un fragmento o variante de los mismos. Preferiblemente, las secuencias codificantes en dicho ARN artificial bicistrónico o multicistrónico pueden estar separadas por al menos una secuencia IRES (sitio de entrada ribosómico interno). Por tanto, el término "que codifica dos o más péptidos o proteínas antigénicos" puede significar, sin limitarse a ello, que el ARN artificial bicistrónico o multicistrónico codifica por ejemplo al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis o más (preferiblemente diferentes) péptidos o proteínas antigénicos de diferentes VSR o sus fragmentos o variantes dentro de las definiciones proporcionadas en este documento. Alternativamente, el ARN artificial bicistrónico o multicistrónico puede codificar, por ejemplo, al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis o más péptidos o proteínas antigénicos (preferiblemente diferentes) derivados del mismo VSR o fragmentos o variantes dentro de las definiciones proporcionadas en este documento. En ese contexto, las secuencias IRES adecuadas pueden seleccionarse de la lista de secuencias de ácido nucleico de acuerdo con las SEQ ID NO: 1566-1662 de la solicitud de patente WO2017/081082, o fragmentos o variantes de estas secuencias.
[0393] Debe entenderse que, en el contexto de la invención, determinadas combinaciones de secuencias de codificación pueden generarse mediante cualquier combinación de ácidos nucleicos artificiales monocistrónicos, bicistrónicos y multicistrónicos y/o constructos de múltiples antígenos/ácido nucleico para obtener una composición de ácido nucleico que codifica múltiples péptidos o proteínas antigénicos como se define en este documento.
[0394] Preferiblemente, el ARN artificial que comprende al menos una secuencia codificante como se define aquí comprende típicamente una longitud de aproximadamente 50 a aproximadamente 20000, o de 500 a aproximadamente 20000 nucleótidos, o de aproximadamente 500 a aproximadamente 20000 nucleótidos, o de aproximadamente 500 a aproximadamente 10000 nucleótidos, o de aproximadamente 1000 a aproximadamente 10000 nucleótidos, o preferiblemente de aproximadamente 1000 a aproximadamente 5000 nucleótidos, o incluso más preferiblemente de aproximadamente 1000 a aproximadamente 2500 nucleótidos.
[0395] De acuerdo con realizaciones preferidas, el ARN artificial del primer aspecto puede ser un ARNm, un ARN autorreplicante, un ARN circular o un ARN replicón.
[0396] En realizaciones, el ARN artificial es un ARN circular. Como se usa en este documento, "ARN circular" o "ARNcirc" debe entenderse como un polinucleótido circular que puede codificar al menos un péptido o proteína antigénica como se define aquí. Por consiguiente, en realizaciones preferidas, dicho ARN circular comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de VSR o un fragmento o variante del mismo como se define en este documento. La producción de los ARNcirc se puede realizar usando varios métodos proporcionados en la técnica. Por ejemplo, el documento US6210931 enseña un método para sintetizar los ARNcirc mediante la inserción de fragmentos de ADN en un plásmido que contiene secuencias que tienen la capacidad de escisión espontánea y autocircularización. La US5773244 enseña la producción de los ARNcirc haciendo un constructo de ADN que codifica una ARN ciclasa ribozima, expresando el constructo de ADN como un ARN y luego permitiendo que el ARN se auto-empalme, lo que produce un ARNcirc libre de intrónin vitro. La WO1992/001813 enseña un proceso de fabricación de ácidos nucleicos circulares de hebra única sintetizando un polinucleótido lineal, combinando el nucleótido lineal con un oligonucleótido de ligadura complementaria en condiciones de hibridación y ligando el polinucleótido lineal. El experto en la técnica también puede utilizar los métodos proporcionados en WO2015/034925 o WO2016/011222 para producir ARN circular.
[0397] En realizaciones, el ARN artificial es un replicón de ARN. El término "replicón de ARN" será reconocido y entendido por el experto en la técnica y, por ejemplo, se pretende que sean constructos de ARN artificial autorreplicantes optimizados. Tales constructos incluyen elementos de replicación (replicasa) derivados de alfavirus y la sustitución de las proteínas del virus estructural con el ácido nucleico artificial de interés (en el contexto de la invención, un ácido nucleico artificial que comprende al menos una secuencia de codificación que codifica al menos un péptido antigénico o proteína derivada de VSR). Alternativamente, la replicasa puede proporcionarse en un constructo independiente que comprende una secuencia de ARN de replicasa derivada de, por ejemplo virus del bosque Semliki (SFV), virus Sindbis (SIN), virus de la encefalitis equina venezolana (EEV), virus Ross-River (RRV) u otros virus pertenecientes a la familia de los alfavirus. Aguas abajo de la replicasa se encuentra un promotor subgenómico que controla la replicación del ácido nucleico artificial de la invención, es decir, un ácido nucleico artificial que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido antigénico o proteína derivada del VSR.
[0398] En realizaciones preferidas el ARN artificial del primer aspecto es un ARNm.
[0399] Los términos "ARN" y "ARNm" serán reconocidos y entendidos por el experto en la técnica y, por ejemplo, se pretende que sean una molécula de ácido ribonucleico, es decir, un polímero que consiste en nucleótidos. Estos nucleótidos suelen ser monómeros de monofosfato de adenosina, monofosfato de uridina, monofosfato de guanosina y monofosfato de citidina, que están unidos entre sí a lo largo de una denominada estructura principal. La estructura principal está formada por enlaces fosfodiéster entre el azúcar, es decir, la ribosa, de una primera y un resto de fosfato de un segundo monómero adyacente. La sucesión específica de los monómeros se denomina secuencia de ARN. El ARNm (ARN mensajero) generalmente proporciona la secuencia de nucleótidos que puede traducirse en una secuencia de aminoácidos de un péptido o proteína en particular.
[0400] El ARN artificial, preferiblemente el ARNm de la invención se puede preparar usando cualquier método conocido en la técnica, incluida la síntesis química, por ejemplo síntesis de ARN en fase sólida, así como métodosin vitro, como reacciones de transcripciónin vitrode ARN.
[0401] En una realización preferida, el ARN artificial, preferiblemente el ARNm, se obtiene mediante transcripción deARN in vitro.
[0402] Por consiguiente, el ARN de la invención es preferiblemente un ARN transcritoin vitro.
[0403] Los términos "transcripciónin vitrode ARN" o "transcripciónin vitro" se refieren a un proceso en el que el ARN se sintetiza en un sistema libre de células(in vitro). El ARN se puede obtener mediante la transcripciónin vitrodependiente de ADN de un molde de ADN apropiado, que de acuerdo con la presente invención es un molde de ADN plasmídico linealizado o un molde de ADN amplificado por PCR. El promotor para controlar la transcripción de ARNin vitropuede ser cualquier promotor de cualquier ARN polimerasa dependiente de ADN. Los ejemplos particulares de ARN polimerasas dependientes de ADN son las ARN polimerasas T7, T3, SP6 o Syn5. En una realización preferida de la presente invención, el molde de ADN se linealiza con una enzima de restricción adecuada antes de someterlo a la transcripción de ARNin vitro.
[0404] Los reactivos utilizados en la transcripción de ARNin vitrogeneralmente incluyen: una plantilla de ADN (ADN plasmídico linealizado o producto de PCR) con una secuencia promotora que tiene una alta afinidad de unión por su respectiva ARN polimerasa, como las ARN polimerasas codificadas por bacteriófagos (T7, T3, SP6, o Syn5); trifosfatos de ribonucleótidos (NTP) para las cuatro bases (adenina, citosina, guanina y uracilo); opcionalmente, un análogo de caperuza como se define en este documento (por ejemplo, m7G (5') ppp (5') G (m7G, m7G (5') ppp (5') (2'OMeG) pG o m7G (5') ppp (5') (2'OMeA) pG)); opcionalmente, nucleótidos modificados adicionales como se define en este documento; una ARN polimerasa dependiente de ADN capaz de unirse a la secuencia promotora dentro de la plantilla de ADN (por ejemplo, ARN polimerasa T7, T3, SP6 o Syn5); opcionalmente, un inhibidor de ribonucleasa (RNasa) para inactivar cualquier RNasa potencialmente contaminante; opcionalmente, una pirofosfatasa para degradar el pirofosfato, que puede inhibir la transcripción del ARN in vitro; MgCl2, que suministra iones Mg2 como cofactor para la polimerasa; una solución amortiguadora (TRIS o HEPES) para mantener un valor de pH adecuado, que también puede contener antioxidantes (por ejemplo, DTT) y/o poliaminas como espermidina en concentraciones óptimas, por ejemplo, un sistema de solución amortiguadora que comprende TRIS-Citrato como se describe en la WO2017/109161. En realizaciones, la mezcla de nucleótidos usada en la transcripción de ARNin vitropuede contener adicionalmente nucleótidos modificados como se define en este documento. En ese contexto, los nucleótidos modificados preferidos comprenden pseudouridina (ψ), N1-metilpseudouridina (m1ψ), 5-metilcitosina y/o 5-metoxiuridina.
[0405] En realizaciones preferidas, la mezcla de nucleótidos (es decir, la fracción de cada nucleótido en la mezcla) usada para reacciones de transcripción de ARNin vitropuede optimizarse para la secuencia de ARN dada, preferiblemente como se describe en la WO2015/188933.
[0406] En una realización donde tiene que producirse más de un ARN artificial diferente como se define aquí, por ejemplo donde deben producirse 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o incluso más ARN artificiales diferentes (por ejemplo, que codifiquen diferentes antígenos de F de VSR, o por ejemplo una combinación de F de VSR y G de VSR; ver segundo aspecto), los procedimientos descritos en la WO2017/109134 pueden usarse de manera adecuada.
[0407] En el contexto de la producción de vacunas de ARN, puede ser necesario proporcionar un ARN de grado GMP. El ARN de grado GMP se puede producir mediante un proceso de fabricación aprobado por las autoridades reguladoras. Por consiguiente, en una realización particularmente preferida, la producción de ARN se realiza según las buenas prácticas de fabricación (GMP) actuales, implementando varios pasos de control de calidad a nivel de ADN y ARN, preferiblemente de acuerdo con WO2016/180430. En realizaciones preferidas, el ARN de la invención es un ARN de grado GMP, particularmente un ARNm de grado GMP.
[0408] Los productos de ARN obtenidos se purifican preferiblemente usando PureMessenger® (CureVac, Tübingen, Alemania; RP-HPLC de acuerdo con WO2008/077592) y/o filtración de flujo tangencial (como se describe en WO2016/193206).
[0409] En una realización preferida adicional, el ARN, particularmente el ARN purificado, se liofiliza de acuerdo con WO2016/165831 o WO2011/069586 para producir un ARN artificial seco (polvo) estable a la temperatura como se define en este documento. El ARN de la invención, particularmente el ARN purificado, también se puede secar usando secado por pulverización o secado por congelación por pulverización de acuerdo con WO2016/184575 o WO2016184576 para producir un ARN (polvo) estable a la temperatura como se define aquí.
[0410] Por consiguiente, en realizaciones preferidas, el ARN es un ARN seco, particularmente un ARNm seco.
[0411] El término "ARN seco" tal como se usa aquí debe entenderse como un ARN que se ha liofilizado o secado por pulverización o liofilizado por pulverización como se definió anteriormente para obtener un ARN seco (polvo) estable a la temperatura.
[0412] En realizaciones preferidas, el ARN artificial de la invención es un ARN purificado, particularmente un ARNm purificado. El término "ARN purificado" o "ARNm purificado" tal como se usa aquí debe entenderse como un ARN que tiene una pureza más alta después de ciertos pasos de purificación (por ejemplo, HPLC, TFF, purificación de Oligo d (T), pasos de precipitación) que el material de partida (por ejemplo, ARN transcritoin vitro). Las impurezas típicas que esencialmente no están presentes en el ARN purificado comprenden péptidos o proteínas (por ejemplo, enzimas derivadas de la transcripciónin vitrodel ARN dependiente de ADN, por ejemplo ARN polimerasas, ARNasas, pirofosfatasa, endonucleasa de restricción, ADNasa), espermidina, BSA, secuencias de ARN abortivas, fragmentos de ARN (fragmentos cortos de ARN bicatenario, secuencias abortivas, etc.), nucleótidos libres (nucleótidos modificados, NTP convencionales, análogo de cap), fragmentos de plantilla de ADN, componentes de solución tampón (HEPES, TRIS, MgCl2), etc. Otras impurezas potenciales que pueden derivarse de, por ejemplo, los procedimientos de fermentación comprenden impurezas bacterianas (biocarga, ADN bacteriano) o impurezas derivadas de los procedimientos de purificación (disolventes orgánicos, etc.). Por consiguiente, es deseable a este respecto que el "grado de pureza del ARN" sea lo más cercano posible al 100%. También es deseable para el grado de pureza del ARN que la cantidad de transcriptos de ARN de longitud completa sea lo más cercana posible al 100%. En consecuencia, el "ARN purificado", tal como se usa aquí, tiene un grado de pureza de más del 75%, 80%, 85%, muy particularmente del 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% y más favorablemente del 99% o más. El grado de pureza puede determinarse, por ejemplo, mediante una HPLC analítica, donde los porcentajes proporcionados anteriormente corresponden a la relación entre el área del pico para el ARN objetivo y el área total de todos los picos que representan los subproductos. Alternativamente, el grado de pureza puede determinarse, por ejemplo, mediante electroforesis analítica en gel de agarosa o electroforesis capilar en gel.
[0413] Debe entenderse que "ARN seco" y "ARN purificado" o "ARNm de grado GMP" como se definen en este documento pueden tener características de estabilidad superiores (in vitro, in vivo) y eficiencia mejorada (por ejemplo, mejor traducibilidad del ARNmin vivo) y, por lo tanto, son particularmente adecuados en el contexto de la invención. Además, "ARN seco" y "ARN purificado" o "ARNm de grado GMP" como se definen aquí pueden ser particularmente adecuados para uso médico.
[0414] El ARN artificial puede modificarse de forma adecuada mediante la adición de una estructura 5'-cap, que preferiblemente estabiliza el ácido nucleico aquí descrito. Así, en realizaciones preferidas, el ARN artificial del primer aspecto comprende una estructura 5'-cap, preferiblemente m7G, cap0 (por ejemplo, m7G(5')ppp(5')G), cap1 (por ejemplo, m7G(5') ppp(5')(2'OMeG) o m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)), cap2, una cap0 modificada o una estructura cap1 modificada (generada utilizando un análogo de cap como se define a continuación).
[0415] El término "estructura 5’cap'" tal como se usa aquí será reconocido y entendido por el experto en la técnica y, por ejemplo, se pretende referir a un nucleótido modificado (análogo de cap), particularmente un nucleótido de guanina, añadido al extremo 5’ de una molécula de ARN, por ejemplo una molécula de ARNm. Preferiblemente, la 5’-cap se agrega usando una ligadura 5'-5'-trifosfato (también llamada m7GpppN). Otros ejemplos de estructuras 5'-cap incluyen glicerilo, residuo desoxi abásico invertido (resto), 4', 5’-netilen nucleótido, 1-(beta-D-eritrofuranosil)nucleótido, 4'-tio nucleótido, nucleótido carbocíclico, 1,5-anhidrohexitol-nucleótido, L-nucleótidos, alfa-nucleótido, nucleótido de base modificado, nucleótido treopentofuranosilo, nucleótido acíclico 3’,4’-seco, 3,4-dihidroxibutil nucleótido acíclico, 3,5 dihidroxipentil nucleótido acíclico, resto de nucleótido invertido 3’-3’, resto abásico invertido 3’-3’, resto de nucleótido invertido 3’-2’, fracción abásica invertida 3’-2’, fosfato de 1,4-butanodiol, fosforamidato de 3’, hexilfosfato, aminohexil fosfato, 3'-fosfato, 3'-fosforotioato, fosforoditioato o resto metilfosfonato puente o no puente.
[0416] Otras estructuras 5’-cap que pueden ser adecuadas en el contexto de la presente invención son cap1 (metilación adicional de la ribosa del nucleótido adyacente de m7GpppN), cap2 (metilación adicional de la ribosa del segundo nucleótido aguas abajo de m7GpppN), cap3 (metilación adicional de la ribosa del tercer nucleótido aguas abajo del m7GpppN), cap4 (metilación adicional de la ribosa del cuarto nucleótido aguas abajo del m7GpppN), ARCA (análogo anti-cap inverso), ARCA modificado (por ejemplo, ARCA modificado con fosfotioato), inosina, N1-metil-guanosina, 2'-fluoro-guanosina, 7-deaza-guanosina, 8-oxo-guanosina, 2-amino-guanosina, LNA-guanosina y 2-azido -guanosina. También se puede formar una estructura 5'-cap (cap0 o cap1) en la síntesis química de ARN o, preferiblemente, en la transcripciónin vitrode ARN (taponamiento co-transcripcional) usando análogos de cap.
[0417] El término "análogo de cap", tal como se usa aquí, será reconocido y entendido por el experto en la técnica y, por ejemplo, se pretende referir a un di-nucleótido no polimerizable que tiene la funcionalidad de cap porque facilita la traducción o localización y/o previene la degradación de una molécula de ácido nucleico, en particular de una molécula de ARN, cuando se incorpora en el extremo 5' de la molécula de ácido nucleico. No polimerizable significa que el análogo de cap se incorporará solo en el extremo 5’ porque no tiene un trifosfato 5' y, por tanto, no puede extenderse en la dirección 3' mediante una polimerasa dependiente de la plantilla, en particular por la ARN polimerasa dependiente de la plantilla. Ejemplos de análogos de cap incluyen, pero no se limitan a, una estructura química seleccionada del grupo que consiste en m7GpppG, m7GpppA, m7GpppC; análogos de cap no metilados (por ejemplo, GpppG); análogo de cap dimetilado (por ejemplo, m2,7GpppG), análogo de cap trimetilado (por ejemplo, m2,2,7GpppG), análogos de cap simétricos dimetilados (por ejemplo, m7Gpppm7G) o análogos de cap antiinversa (por ejemplo, ARCA; m7,2'OmeGpppG, m7,2'dGpppG, m7,3'OmeGpppG, m7,3'dGpppG y sus derivados tetrafosfato). Previamente se han descrito otros análogos de cap (WO2008/016473, WO2008/157688, WO2009/149253, WO2011/015347 y WO2013/059475).
[0418] La estructura 5’-cap se puede añadir de forma adecuada co-transcripcionalmente usando análogos de cap como se define aquí en una reacción de transcripciónin vitrode ARN como se define en este documento.
[0419] En realizaciones preferidas, se genera una estructura cap1 modificada usando un análogo de cap como se describe en la WO2017/053297, WO2017/066793, WO2017/066781, WO2017/066791, WO2017/066789, WO2017/066782, WO2018075827 y WO2017/066797. En particular, cualquier estructura cap derivable de la estructura descrita en la reivindicación 1-5 de la WO2017/053297 se puede utilizar de forma adecuada para generar cotranscripcionalmente una estructura cap modificada. Además, cualquier estructura cap derivable de la estructura definida en la reivindicación 1 o la reivindicación 21 de la WO2018075827 se puede utilizar de forma adecuada para generar cotranscripcionalmente una estructura cap1 modificada.
[0420] Los análogos de cap preferidos son los análogos de cap de di-nucleótidos m7G(5')ppp(5')G (m7G) o 3´-O-Mem7G(5')ppp(5')G para generar co-transcripcionalmente estructuras cap0. Los análogos de cap particularmente preferidos son los análogos de cap de trinucleótidos m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG o m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG para generar co-transcripcionalmente estructuras cap1.
[0421] En ese contexto, se prefiere que el ARN de la invención comprenda una estructura Cap1 como se define anteriormente, que preferiblemente da como resultado una expresión de proteína aumentada a través de, por ejemplo, altas eficiencias de limitación y mayores eficiencias de traducción. Además, de forma adecuada, el ARN de la invención que comprende una estructura cap1 muestra una estimulación disminuida del sistema inmunitario innato en comparación con los constructos cap0 de la misma secuencia de ácido nucleico. La persona con conocimientos ordinarios sabe cómo determinar la eficacia de la traducción, el grado de limitación y la estimulación inmunológica.
[0422] En una realización particularmente preferida, el ARN artificial del primer aspecto de la invención comprende una estructura cap1, donde dicha estructura cap1 puede formarse enzimáticamente o co-transcripcionalmente (por ejemplo, usando m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG o análogos de m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG).
[0423] En realizaciones preferidas, el ARN artificial del primer aspecto comprende una estructura cap m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG. En tales realizaciones, el ARN codificante comprende una cap m7G 5’ terminal y una metilación adicional de la ribosa del nucleótido adyacente a m7GpppN, en ese caso una 2’O-adenosina metilada. En otras realizaciones preferidas, el ARN artificial del primer aspecto comprende una estructura cap m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG. En tales realizaciones, el ARN codificante comprende una cap m7G 5’-terminal y una metilación adicional de la ribosa del nucleótido adyacente, en ese caso una guanosina 2'O metilada.
[0424] Así, siempre que se haga referencia a secuencias de ARN o ARNm adecuadas en el contexto de la invención, el primer nucleótido de dicha secuencia de ARN o ARNm, es decir, el nucleótido aguas abajo de la estructura m7G(5')ppp puede ser una guanosina 2'O metilada o una adenosina 2'O metilada.
[0425] Por consiguiente, en otras realizaciones, el ARN artificial de la invención puede comprender un elemento de secuencia 5’-cap de acuerdo con las SEQ ID NO: 43 o 21321, o un fragmento o variante de las mismas.
[0426] En otras realizaciones, la estructura 5'-cap se añade mediante protección enzimática utilizando enzimas de protección (por ejemplo, enzimas de protección del virus vaccinia, kits de protección disponibles comercialmente) para generar estructuras cap0 o cap1 o cap2. En otras realizaciones, la estructura 5'-cap (cap0, cap1) se añade mediante una colocación de caperuza enzimática usando enzimas de cap inmovilizadas, por ejemplo usando un reactor de colocación de caperuza (WO2016/193226).
[0427] En realizaciones preferidas, el ARN artificial de la invención comprende al menos una secuencia poli(A), que preferiblemente comprende de 30 a 150 nucleótidos de adenosina.
[0428] En realizaciones preferidas, la secuencia poli(A), ubicada adecuadamente en el término 3', comprende de 10 a 500 nucleótidos de adenosina, de 10 a 200 nucleótidos de adenosina, de 40 a 200 nucleótidos de adenosina o de 40 a 150 nucleótidos de adenosina. En una realización particularmente preferida, la secuencia poli(A) comprende aproximadamente 64 nucleótidos de adenosina. En realizaciones adicionales particularmente preferidas, la secuencia poli(A) comprende aproximadamente 75 nucleótidos de adenosina. En realizaciones adicionales particularmente preferidas, la secuencia poli(A) comprende aproximadamente 100 nucleótidos de adenosina.
[0429] Los términos "secuencia poli(A)", "cola poli(A)" o "cola 3'-poli(A)" tal como se usan aquí serán reconocidos y entendidos por el experto en la técnica y por ejemplo pretende ser una secuencia de nucleótidos de adenosina típicamente localizados en el extremo 3’ de un ARN, de hasta aproximadamente 1000 nucleótidos de adenosina. Preferiblemente, dicha secuencia poli(A) es esencialmente homopolimérica, por ejemplo una secuencia poli(A) de por ejemplo 100 nucleótidos de adenosina tienen esencialmente una longitud de 100 nucleótidos. En otras realizaciones, la secuencia poli(A) puede estar interrumpida por al menos un nucleótido diferente a un nucleótido de adenosina, por ejemplo una secuencia poli(A) de, por ejemplo, 100 nucleótidos de adenosina pueden tener una longitud de más de 100 nucleótidos (que comprenden 100 nucleótidos de adenosina y además dicho al menos un nucleótido diferente a un nucleótido de adenosina).
[0430] En el contexto de la presente invención, una secuencia poli(A) puede estar ubicada dentro de un ARNm o de cualquier otra molécula de ácido nucleico, por ejemplo en un vector de ADN, por ejemplo en un vector que sirve como molde para la generación de un ARN, preferiblemente un ARNm, por ejemplo, mediante transcripción de dicho vector de ADN.
[0431] Preferiblemente, la secuencia poli(A) del ARN artificial se obtiene a partir de una plantilla de ADN durante la transcripción del ARNin vitro. En otras realizaciones, la secuencia poli(A) se obtienein vitromediante métodos comunes de síntesis química sin que necesariamente se transcriba a partir de una plantilla de ADN. En otras realizaciones, las secuencias poli(A) se generan mediante poliadenilación enzimática del ARN (después de la transcripción del ARNin vitro) usando kits de poliadenilación disponibles comercialmente y los protocolos correspondientes conocidos en la técnica, o alternativamente usando poli(A)polimerasas inmovilizadas, por ejemplo utilizando un reactor de poliadenilación (como se describe en la WO2016/174271).
[0432] En realizaciones, el ARN artificial de la invención puede contener una secuencia poli(A) derivada de un vector y puede comprender al menos una secuencia poli(A) adicional generada por poliadenilación enzimática, por ejemplo, como se describe en la WO2016/091391.
[0433] En realizaciones preferidas, el ARN artificial de la invención comprende al menos una secuencia poli(C), que comprende preferiblemente de 10 a 40 nucleótidos de citosina.
[0434] En realizaciones preferidas, la secuencia poli(C), ubicada en el término 3', comprende de 10 a 200 nucleótidos de citosina, de 10 a 100 nucleótidos de citosina, de 20 a 70 nucleótidos de citosina, de 20 a 60 nucleótidos de citosina o de 10 a 40 nucleótidos de citosina. En una realización particularmente preferida, la secuencia poli(C) comprende aproximadamente 30 nucleótidos de citosina.
[0435] El término "secuencia poli(C)" tal como se usa aquí será reconocido y entendido por el experto en la técnica y por ejemplo pretende ser una secuencia de nucleótidos de citosina, típicamente localizada en el extremo 3’ de un ARN, de hasta aproximadamente 200 nucleótidos de citosina. En el contexto de la presente invención, una secuencia poli(C) puede estar ubicada dentro de un ARNm o de cualquier otra molécula de ácido nucleico, por ejemplo en un vector de ADN, por ejemplo en un vector que sirve como molde para la generación de un ARN, preferiblemente un ARNm, por ejemplo mediante la transcripción del vector.
[0436] Preferiblemente, la secuencia poli(C) en la secuencia de ARN de la presente invención se deriva de una plantilla de ADN mediante transcripción de ARNin vitro. En otras realizaciones, la secuencia poli(C) se obtienein vitromediante métodos comunes de síntesis química sin que necesariamente se transcriba a partir de una plantilla de ADN.
[0437] En otras realizaciones, el ARN artificial de la invención no comprende una secuencia poli(C) como se define aquí. En realizaciones preferidas, el ARN artificial del primer aspecto comprende al menos un tallo-bucle de histona. El término "tallo-bucle de histona", tal como se usa en este documento, será reconocido y entendido por el experto en la técnica y, por ejemplo, se pretende referir a secuencias de ácido nucleico que se encuentran predominantemente en los ARNm de histonas. Se describen ejemplos de secuencias tallo-bucle de histona en Lopez et al. (Davila Lopez et al, (2008), RNA, 14(1)). Los tallos-bucle en los pre-ARNm de histonas suelen ir seguidos de una secuencia rica en purina conocida como elemento histona aguas abajo (HDE). Estos pre-ARNm se procesan en el núcleo mediante una sola escisión endonucleolítica aproximadamente 5 nucleótidos aguas abajo del tallo-bucle, catalizados por snRNP de U7 mediante el apareamiento de bases del ARN nuclear pequeño de U7 con el HDE.
[0438] Las secuencias/estructuras tallo-bucle de histona pueden seleccionarse adecuadamente de secuencias tallo-bucle de histona como se describe en la WO2012/019780. Una secuencia tallo-bucle de histona que puede usarse dentro de la presente invención puede derivarse preferiblemente de las fórmulas (I) o (II) de la solicitud de patente WO2012/019780. De acuerdo con una realización preferida adicional, el ARN tal como se define aquí puede comprender al menos una secuencia tallo-bucle de histona derivada de al menos una de las fórmulas específicas (Ia) o (IIa) de la solicitud de patente WO2012/019780.
[0439] En una realización particularmente preferida, el ARN artificial de la invención comprende al menos un tallo-bucle de histona, donde dicho tallo-bucle de histona comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 39 o 40 o un fragmento o variante de la misma.
[0440] En otras realizaciones, el ARN artificial del primer aspecto no comprende un tallo-bucle de histona como se define aquí.
[0441] En realizaciones adicionales, el ARN artificial de la invención comprende un elemento de secuencia 3'-terminal. Dicho elemento de secuencia 3'-terminal debe entenderse como un elemento de secuencia que comprende una secuencia poli(A) y una secuencia tallo-bucle de histona, donde dicho elemento de secuencia se ubica en el término 3' del ARN artificial de la invención.
[0442] En otras realizaciones, el ARN artificial de la invención puede comprender un elemento de secuencia 3’-terminal de acuerdo con las las SEQ ID NO: 44-63 o 21322-21328, o un fragmento o una variante de las mismas.
[0443] En realizaciones preferidas, el ARN artificial de la invención comprende al menos una secuencia codificante modificada con pseudouridina (ψ).
[0444] Así, en realizaciones preferidas, el ARN artificial de la invención, o la al menos una secuencia codificante, comprende una secuencia de ácido nucleico donde al menos uno o más de uno, preferiblemente donde todos los nucleótidos de uracilo están reemplazados por nucleótidos de pseudouridina (ψ).
[0445] En realizaciones preferidas adicionales, el ARN artificial de la invención comprende al menos una secuencia codificante modificada con N1-metilpseudouridina (m1ψ).
[0447] Así, en realizaciones preferidas, el ARN artificial de la invención, o la al menos una secuencia codificante, comprende una secuencia de ácido nucleico donde al menos uno o más de uno, preferiblemente donde todos los nucleótidos de uracilo están reemplazados por nucleótidos N1-metilpseudouridina (m1ψ).
[0449] En realizaciones preferidas del primer aspecto, el ARN artificial, preferiblemente el ARNm, comprende preferiblemente en la dirección 5' a 3' los siguientes elementos a) -i):
[0450] a) estructura 5'-cap, preferiblemente como se especifica aquí;
[0451] b) opcionalmente, 5'-UTR como se especifica aquí, preferiblemente al menos una seleccionada de las SEQ ID NO: 1-22;
[0452] c) un sitio de unión a ribosoma, preferiblemente como se especifica aquí
[0453] d) al menos una secuencia codificante como se define en las reivindicaciones, preferiblemente como se especifica en la Tabla 3 y la Tabla 4;
[0454] e) 3'-UTR como se especifica aquí, preferiblemente al menos una seleccionada de las SEQ ID NO: 23-38; f) opcionalmente, una secuencia poli(A), preferiblemente como se especifica en este documento;
[0455] g) opcionalmente, una secuencia poli(C), preferiblemente como se especifica en este documento;
[0456] h) opcionalmente, un tallo-bucle de histona, preferiblemente como se especifica en este documento; i) opcionalmente, un elemento de secuencia 3'-terminal como se especifica en este documento, preferiblemente de acuerdo con las SEQ ID NO: 44-63 o 21322-21328; y
[0457] donde opcionalmente al menos uno o más de uno, preferiblemente donde todos los nucleótidos de uracilo se reemplazan por nucleótidos de pseudouridina (ψ) o nucleótidos de N1-metilpseudouridina (m1ψ).
[0459] En realizaciones preferidas adicionales del primer aspecto, el ARN artificial, preferiblemente ARNm, comprende los siguientes elementos preferiblemente en la dirección 5' a 3':
[0460] a) estructura 5'-cap, preferiblemente como se especifica aquí, más preferiblemente una estructura cap1; b) un elemento 3'-UTR y 5'-UTR de acuerdo con a-1, a-4, c-1, e-4, g-2, i-2 o i-3 como se especifica aquí; c) un sitio de unión a ribosoma, preferiblemente como se especifica en este documento;
[0461] d) al menos una secuencia de codificación como se define en las reivindicaciones, en donde dicha secuencia de codificación está ubicada entre dicha 5'-UTR y dicha 3'-UTR, preferiblemente aguas abajo de dicha 5'-UTR y aguas arriba de dicha 3'-UTR, donde la secuencia de codificación se selecciona preferiblemente de cualquiera de las especificadas en la Tabla 3 y la Tabla 4;
[0462] e) opcionalmente, una secuencia de poli(A), preferiblemente como se especifica en este documento; f) opcionalmente, una secuencia de poli(C), preferiblemente como se especifica en este documento; g) opcionalmente, un tallo-bucle de histona, preferiblemente como se especifica en este documento; h) opcionalmente, un elemento de secuencia 3'-terminal como se especifica aquí, preferiblemente de acuerdo con las SEQ ID NO: 44-63, 21322-21328, y
[0463] donde opcionalmente al menos uno o más de uno, preferiblemente donde todos los nucleótidos de uracilo se reemplazan por nucleótidos de pseudouridina (ψ) o nucleótidos de N1-metilpseudouridina (m1ψ).
[0465] En realizaciones preferidas adicionales del primer aspecto, el ARN artificial, preferiblemente ARNm, comprende los siguientes elementos preferiblemente en la dirección 5' a 3':
[0466] a) estructura 5'-cap, preferiblemente como se especifica aquí, más preferiblemente una estructura cap1; b) un elemento 3'-UTR y un 5'-UTR de acuerdo con a-1 o i-3 como se especifica en este documento; c) un sitio de unión a ribosoma, preferiblemente como se especifica en este documento
[0467] d) al menos una secuencia de codificación como se define en las reivindicaciones, donde dicha secuencia de codificación está ubicada entre dicha 5'-UTR y dicha 3'-UTR, preferiblemente aguas abajo de dicha 5'-UTR y aguas arriba de dicha 3'-UTR, donde la secuencia de codificación se selecciona preferiblemente de cualquiera de las especificadas en la Tabla 3 y la Tabla 4;
[0468] e) opcionalmente, un tallo-bucle de histona, preferiblemente como se especifica en este documento; f) una secuencia de poli(A), que preferiblemente comprende aproximadamente 100 nucleótidos de adenosina; g) opcionalmente, un elemento de secuencia 3'-terminal como se especifica aquí, preferiblemente de acuerdo con las SEQ ID NO: 21322-21328, y
[0469] donde opcionalmente al menos uno o más de uno, preferiblemente donde todos los nucleótidos de uracilo se reemplazan por nucleótidos de pseudouridina (ψ) o nucleótidos de N1-metilpseudouridina (m1ψ).
[0471] En realizaciones preferidas adicionales del primer aspecto, el ARN artificial, preferiblemente ARNm, comprende los siguientes elementos en la dirección 5’ a 3':
[0472] a) estructura 5'-cap, preferiblemente como se especifica aquí, más preferiblemente una estructura cap1; b) un elemento 3'-UTR y 5'-UTR de acuerdo con a-1, a-4, c-1, e-4, g-2, i-2 o i-3 como se especifica aquí; c) un sitio de unión a ribosoma, preferiblemente como se especifica en este documento;
[0473] d) al menos una secuencia de codificación como se define en las reivindicaciones, donde dicha región de codificación está ubicada entre dicha 5'-UTR y dicha 3'-UTR, preferiblemente aguas abajo de dicha 5'-UTR y aguas arriba de dicha 3'-UTR, donde la secuencia de codificación se selecciona preferiblemente de cualquiera de las SEQ ID NO: 2006-2013, 2744-2751, 3482-3489, 4958-4965, 16524-16531, 21370, 21372, 21374, 21376, 21402 (o fragmentos o variantes de las mismas);
[0474] e) una secuencia de poli(A) comprende aproximadamente 64 adenosina;
[0475] f) una secuencia de poli(C) que comprende aproximadamente 30 cisteínas;
[0476] g) un tallo-bucle de histona de acuerdo con SEQ ID NO: 39 o 40, y
[0477] donde opcionalmente al menos uno o más de uno, preferiblemente donde todos los nucleótidos de uracilo se reemplazan por nucleótidos de pseudouridina (ψ) o nucleótidos de N1-metilpseudouridina (m1ψ).
[0479] En realizaciones preferidas adicionales del primer aspecto, el ARN artificial, preferiblemente ARNm, comprende los siguientes elementos en la dirección 5’ a 3':
[0480] a) estructura 5'-cap, preferiblemente como se especifica aquí, más preferiblemente una estructura cap1; b) un elemento 3'-UTR y 5'-UTR de acuerdo con a-1, a-4, c-1, e-4, g-2, i-2 o i-3 como se especifica aquí; c) un sitio de unión a ribosoma, preferiblemente como se especifica en este documento;
[0481] d) al menos una secuencia de codificación como se define en las reivindicaciones, donde dicha región de codificación está ubicada entre dicha 5'-UTR y dicha 3'-UTR, preferiblemente aguas abajo de dicha 5'-UTR y aguas arriba de dicha 3'-UTR, donde la secuencia de codificación se selecciona preferiblemente de cualquiera de las SEQ ID NO: 2006-2013, 2744-2751, 3482-3489, 4958-4965, 16524-16531, 21370, 321372, 21374, 21376, 21402 (o fragmentos o variantes de las mismas);
[0482] e) una secuencia de poli(A) comprende aproximadamente 64 adenosina;
[0483] f) un tallo-bucle de histona de acuerdo con las SEQ ID NO: 39 o 40, y
[0484] donde opcionalmente al menos uno o más de uno, preferiblemente donde todos los nucleótidos de uracilo se reemplazan por nucleótidos de pseudouridina (ψ) o nucleótidos de N1-metilpseudouridina (m1ψ).
[0486] Las secuencias preferidas de polipéptido, ácido nucleico y ARNm de VSR se proporcionan en la Tabla 5A, 5B y la Tabla 6A, 6B.
[0488] En la Tabla 5A y 5B, los diseños de proteínas se indican en la fila 1. En este respecto, las columnas A a J representan constructos específicos adecuados de la invención derivados de la proteína (F) fusión de VSR, donde la columna A proporciona secuencias adecuadas para F0, la columna B proporciona secuencias adecuadas para F-del, la columna C proporciona secuencias adecuadas para F0_DSCav1, la columna D proporciona secuencias adecuadas para F-del_DSCav1, la columna E proporciona secuencias adecuadas para F_DSCav1_mut1, la columna F proporciona secuencias adecuadas para F-del_DSCav1_mut1, la columna G proporciona secuencias adecuadas para F_DSCav1_mut2, la columna H proporciona secuencias adecuadas para F-del_DSCav1_mut2, la columna I proporciona secuencias adecuadas para F_DSCav1_mut3, la columna J proporciona secuencias adecuadas para F-del_DSCav1_mut3.
[0490] Los diseños de proteínas se indican en la fila 1 (columnas A a J), las SEQ ID NO de proteína específicas, tal como se proporcionan en la lista de secuencias, están en la fila 2 ("proteína"). Las SEQ ID NO de las secuencias codificantes correspondientes para cada constructo proteico se proporcionan en la fila 3 ("cds", compárese con la Tabla 3 para diferentes optimizaciones de cds). Más información, por ejemplo, con respecto al tipo de secuencia de codificación modificada por codón (opt1, opt2, opt3, opt4, opt5, opt6, opt11, etc.) se proporciona en el identificador <223> de la SEQ ID NO respectiva en la lista de secuencias y en la Tabla 3. Las SEQ ID NO de los correspondientes constructos de ARNm que comprenden dichas secuencias codificantes y 3'-UTR y 5'-UTR adecuadas de acuerdo con la invención se proporcionan en las filas 4 a 47 (diseños de ARNm a-1 a i-3 como se especifica en este documento). En la Tabla 5A, se proporcionan secuencias de ARNm derivadas de HRSV(A2), en la Tabla 5B se proporcionan secuencias de ARNm derivadas de HRSV (Memphis-37). Más información, por ejemplo, con respecto al tipo de secuencia de codificación (wt, opt1, opt2, opt3, opt4, opt5, opt6, opt11, etc.) comprendida en los constructos de ARNm se proporciona en el identificador <223> de la SEQ ID NO respectiva en el listado de secuencias.
[0492] Tabla 5A:Constructos de ARNm reivindicacdos y adicionales que codifican F de VSR (columnas A-J), derivados de HRSV (A2)
[0494]
[0495]
[0496]
[0498] Tabla 5B:Constructos de ARNm reivindicados y adicionales que codifican F de VSR (columnas A-J), derivadas de HRSV (Memphis-37)
[0499]
[0500]
[0501]
[0504] En la Tabla 6A y 6B, los diseños de proteínas se indican en la fila 1. En este respecto, las columnas K a V representan constructos específicos adecuados de la invención derivados de la proteína (F) fusión de VSR, donde la columna K proporciona secuencias adecuadas para F_DSCav1_mut0, la columna L proporciona secuencias adecuadas para F-del_DSCav1_mut0, la Columna M proporciona secuencias adecuadas para F_DSCav1_mut4, la columna N proporciona secuencias adecuadas para F-del_DSCav1_mut4, la columna O proporciona secuencias adecuadas para F_DSCav1_mut5, la columna P proporciona secuencias adecuadas para F-del_DSCav1_mut5, la columna Q proporciona secuencias adecuadas para F_DSCav1_mut6, la columna R proporciona secuencias adecuadas para F-del_DSCav1_mut6, la columna S proporciona secuencias adecuadas para F_DSCav1_mut7, la columna T proporciona secuencias adecuadas para F-del_DSCav1_mut7, la columna U proporciona secuencias adecuadas para F_DSCav1_mut8, la columna V proporciona secuencias adecuadas para F-del_DSCav1_mut8.
[0506] Los diseños de proteínas se indican en la primera fila (columnas K a V), las SEQ ID NO de proteínas específicas que se proporcionan en la lista de secuencias están en la fila 2, "PRT". Las SEQ ID NO de las secuencias codificantes correspondientes para cada constructo proteico se proporcionan en la fila 3, "cds" (compárese con la Tabla 4 para diferentes optimizaciones de cds). Más información, por ejemplo, con respecto al tipo de secuencia de codificación modificada por codón (opt1, opt2, opt3, opt4, opt5, opt6, opt11, etc.) se proporciona en el identificador <223> de la SEQ ID NO respectiva en la lista de secuencias y en la Tabla 4. Las SEQ ID NO de los correspondientes constructos de ARNm que comprenden dichas secuencias codificantes y 3'-UTR y 5'-UTR adecuadas de acuerdo con la invención se proporcionan en cda una de las siguientes filas (diseños de ARNm “a-1” a “i-3” como se especifica en este documento). En la Tabla 6A, se proporcionan secuencias de ARNm derivadas de HRSV(A2), en la Tabla 6B se proporcionan secuencias de ARNm derivadas de HRSV (Memphis-37)
[0508] Más información, por ejemplo, con respecto al tipo de secuencia de codificación (wt, opt1, opt2, opt3, opt4, opt5, opt6, opt11, etc.) comprendida en los constructos de ARNm se proporciona en el identificador <223> de la SEQ ID NO respectiva en el listado de secuencias.
[0510] Tabla 6A:Constructos de ARNm reivindicados y adicionales que codifican F de VSR (columna K- V), derivados de HR V A2
[0513]
[0514]
[0515]
[0517] Tabla 6B:Constructos de ARNm reivindicados y adicionales que codifican F de VSR (columna K-V), derivados de HR VMm hi-7
[0518]
[0519]
[0521] En realizaciones preferidas, el ARN artificial comprende o consiste en una secuencia de ARN que es idéntica o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo consistente en las SEQ ID NO: 2014-2373, 2752-3111, 3490-3849, 4966-5325, 16532-16891, 21436-21438, 21442-21444, 21448-21450, 21454-21456, 21526-21528, 2182-21584, 21588-21590, 21594-21596, 21600-21602, 21672-2167 o un fragmento o variante de cualquiera de estas secuencias, en donde, opcionalmente, al menos uno o más de uno, o en donde todos los nucleótidos de uracilo están reemplazados por nucleótidos de pseudouridina (ψ) o nucleótidos de N1-metilpseudouridina (m1ψ).
[0522] En realizaciones preferidas, el ARN artificial comprende
[0523] (a) al menos una región no traducida 5' heteróloga (5'-UTR) y/o al menos una región no traducida 3' (3'-UTR) heteróloga y
[0524] (b) al menos una secuencia codificante ligada operativamente a dicha 3'-UTR y/o 5'-UTR que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de una proteína de F de VSR o un fragmento o variante de la misma, donde - dicho ARN artificial comprende o consiste en una secuencia de ARN que es idéntica o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 78-482, 11735-12094, 21415-21417, 21561-21563, 21489, 21490, 21635, 21636 (codificando F0) o un fragmento o variante de cualquiera de estas secuencias;
[0525] - dicho ARN artificial comprende o consiste en una secuencia de ARN que es idéntica o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2014-2373, 21436 21438, 21582-21584 (codificando F-del_DSCav1_mut1) o un fragmento o variante de cualquiera de estas secuencias;
[0526] - dicho ARN artificial comprende o consiste en una secuencia de ARN que es idéntica o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2752-3111, 21442-21444, 21588-21590, (codificando F-del_DSCav1_mut2) o un fragmento o variante de cualquiera de estas secuencias;
[0527] - dicho ARN artificial comprende o consiste en una secuencia de ARN que es idéntica o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3490-3849, 21448-21450, 21594-21596, (codificando F-del_DSCav1_mut3) o un fragmento o variante de cualquiera de estas. - dicho ARN artificial comprende o consiste en una secuencia de ARN que es idéntica o al menos 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 4966-5325, 16532-16891, 21454-21456, 21600-21602, 21526-21528, 21672-21674 (codificando F-del_DSCav1_mut4) o un fragmento o variante de cualquiera de estas secuencias;
[0528] - y
[0529] donde opcionalmente al menos uno o más de uno, o donde todos los nucleótidos de uracilo se reemplazan por nucleótidos de pseudouridina (ψ) o nucleótidos de N1-metilpseudouridina (m1ψ).
[0531] Como se describe a lo largo de la especificación, la información adicional con respecto a las secuencias de aminoácidos o secuencias de ácidos nucleicos adecuadas (secuencias de codificación, secuencias de ARNm) también puede derivarse del listado de secuencias, en particular de los detalles proporcionados en el mismo bajo el identificador <223> como se explica a continuación.
[0533] Por ejemplo, el identificador numérico <223> en el listado de secuencias de SEQ ID NO: 68 dice lo siguiente:
[0534] “Secuencia de proteína derivada y/o modificada (artificial) de HRSV (A2) _F0”. Cabe señalar que, en todo el listado de secuencias, la información proporcionada con el identificador numérico <223> sigue la misma estructura: “<SEQUENCE_DESCRIPTOR> de <CONSTRUCT_IDENTIFIER>”. El <SEQUENCE_DESCRIPTOR> se relaciona con el tipo de secuencia (por ejemplo, "secuencia de proteína derivada y/o modificada", "CDS derivado y/o modificado" "Diseño de producto de ARNm a-1 que comprende secuencia derivada y/o modificada", o "Diseño de producto de ARNm b-4 que comprende una secuencia derivada y/o modificada", o "Diseño de producto de ARNm c-5 que comprende una secuencia derivada y/o modificada", o "Diseño de producto de ARNm g-4 que comprende la secuencia derivada y/o modificada", etc.) y si la secuencia comprende o consiste en una secuencia de tipo salvaje ("wt") o si la secuencia comprende o consiste en una secuencia de secuencia optimizada (por ejemplo, "opt1", "opt2", "opt3", "opt4", "opt5 ”,“ Opt6 ”,“opt11”; las optimizaciones de secuencia se describen con más detalle a continuación). Por ejemplo, el <SEQUENCE_DESCRIPTOR> proporcionado con el identificador numérico <223> de SEQ ID NO: 68 dice lo siguiente: “Secuencia de proteína derivada y/o modificada (artificial)”. El <CONSTRUCT_IDENTIFIER> proporcionado con el identificador numérico <223> tiene las siguientes estructuras: ("organism__construct name" o "organism__accesion number__construct name") y está destinado a ayudar al experto en la técnica a derivar explícitamente secuencias de ácido nucleico adecuadas (por ejemplo, ARN, ARNm) que codifican la misma proteína VSR de acuerdo con la invención. Por ejemplo, el <CONSTRUCT_IDENTIFIER> proporcionado con el identificador numérico <223> de SEQ ID NO: 68 dice lo siguiente: “HRSV(A2)_F0”. En ese ejemplo, la secuencia de proteína respectiva se deriva de "HRSV(A2)" (organismo), en donde la proteína comprende los elementos estructurales "F0" (nombre del constructo, F de longitud completa). Si el experto usa el identificador de constructo de SEQ ID NO: 68, a saber "HRSV(A2)_F0", dicha persona llega fácilmente a un listado de secuencias codificantes de ácido nucleico adecuadas, por ejemplo, secuencias codificantes de ARN y secuencias de ARNm que se pueden recuperar fácilmente del listado de secuencias de la presente invención.
[0536] Composición:
[0538] Un segundo aspecto se refiere a una composición que comprende al menos un ARN artificial del primer aspecto.
[0539] En una realización preferida del segundo aspecto, la composición comprende al menos un ARN artificial del primer aspecto y, opcionalmente, al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.
[0541] El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" tal como se usa aquí preferiblemente incluye la base líquida o no líquida de la composición. Si la composición se proporciona en forma líquida, el vehículo será preferiblemente agua, típicamente agua libre de pirógenos; soluciones salinas isotónicas o tampón (acuosas), por ejemplo soluciones tampón fosfato, citrato, etc. Se puede utilizar agua o preferiblemente una solución tampón, más preferiblemente una solución tampón acuosa que contenga una sal de sodio, preferiblemente al menos 50 mM de una sal de sodio, una sal de calcio, preferiblemente al menos 0,01 mM de una sal de calcio y opcionalmente una sal de potasio, preferiblemente al menos 3 mM de una sal de potasio. De acuerdo con una realización preferida, las sales de sodio, calcio y opcionalmente potasio pueden presentarse en forma de sus haluros, por ejemplo cloruros, yoduros o bromuros, en forma de sus hidróxidos, carbonatos, hidrogenocarbonatos o sulfatos, etc. Sin limitarse a ello, ejemplos de sales de sodio incluyen, por ejemplo, NaCl, NaI, NaBr, Na<2>CO<3>, NaHCO<3>, Na<2>SO<4>, ejemplos de sales de potasio opcionales incluyen, por ejemplo, KCl, KI, KBr, K<2>CO<3>, KHCO<3>, K<2>SO<4>, y los ejemplos de sales de calcio incluyen por ejemplo CaCl<2>, CaI<2>, CaBr<2>, CaCO<3>, CaSO<4>, Ca(OH)<2>. Además, los aniones orgánicos de los cationes mencionados anteriormente pueden estar contenidos en el tampón.
[0542] En realizaciones, la composición como se define aquí puede comprender una pluralidad o al menos más de uno de los ARN artificiales como se define en el contexto del primer aspecto o el segundo aspecto de la invención.
[0543] En realizaciones, el al menos un ARN comprendido en la composición es un ácido nucleico bi- o multicistrónico, particularmente un ácido nucleico bi- o multicistrónico como se define en este documento, que codifica los al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve , diez, once o doce péptidos o proteínas antigénicos distintos derivados del mismo VSR y/o un VSR diferente.
[0544] En una realización, la composición puede comprender al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o incluso más ARN artificiales diferentes como se define en el contexto del primer aspecto de la invención, cada uno de los cuales codifica al menos un péptido o proteína antigénico derivado genéticamente del mismo VSR o un fragmento o variante del mismo. Los términos "mismo" o "mismo VSR" que se utilizan en el contexto de un virus, por ejemplo “mismo virus”, deben entenderse como el mismo genéticamente. En particular, dicho mismo virus (genéticamente) expresa las mismas proteínas o péptidos, donde todas las proteínas o péptidos tienen la misma secuencia de aminoácidos. Particularmente, dicho mismo VSR (genéticamente) expresa esencialmente las mismas proteínas, péptidos o poliproteínas, donde estas proteínas, péptidos o poliproteínas preferiblemente no difieren en su(s) secuencia(s) de aminoácidos. En la Lista 1 se proporciona una lista no limitante de virus VSR ejemplares.
[0545] En realizaciones, la composición comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o incluso más ARN diferentes como se define en el contexto del primer aspecto de la invención, cada uno de los cuales codifica al menos un péptido o proteína derivado de un VSR genéticamente diferente o un fragmento o variante del mismo. Los términos "diferente" o "VSR diferente" como se usan a lo largo de la presente especificación en el contexto de un virus, por ejemplo virus "diferente", deben entenderse como la diferencia entre al menos dos virus respectivos, donde la diferencia se manifiesta en el genoma de ARN del respectivo virus diferente. En particular, dicho VSR (genéticamente) diferente expresa al menos una proteína, péptido o poliproteína diferente, donde la al menos una proteína, péptido o poliproteína diferente preferiblemente difiere en al menos un aminoácido.
[0546] En otras realizaciones, la composición comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o incluso más constructos de ARN adicionales que codifican antígenos de VSR seleccionados de glicoproteína G, proteína hidrófoba corta SH, proteína de matriz M, nucleoproteína N, polimerasa grande L, proteína M2-1, proteína M2-2, fosfoproteína P, proteína no estructural NS1 o proteína no estructural NS2, o cualquier combinación de las mismas.
[0547] Para la producción de una composición que comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 constructos de ARN adicionales que codifican VSR, preferiblemente se utilizan los métodos descritos en la solicitud PCT/EP2016/082487 o en solicitud de la patente publicada WO2017/1090134A1 y se adaptan en consecuencia.
[0548] En realizaciones preferidas, la composición del segundo aspecto comprende al menos un ARN artificial del primer aspecto y al menos un ARN artificial adicional que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de VSR seleccionada de proteína de matriz M, nucleoproteína N, M2-1 proteína y/o fosfoproteína P o combinaciones de las mismas. La adición de un ARN artificial adicional que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de VSR M, N, M2-1 y/o fosfoproteína P (o combinaciones de los mismos) es particularmente ventajosa para, por ejemplo, promover una respuesta inmune de las células T.
[0549] En particular, las realizaciones relacionadas con el ARN artificial del primer aspecto también pueden leerse y entenderse como realizaciones adecuadas de al menos un ARN artificial adicional del segundo aspecto (por ejemplo, realizaciones relacionadas con combinaciones de UTR, optimizaciones de CD, tallo-bucle de histona, PoliA, PoliC, estructura cap, estructura de ARNm, producción de ARNm y purificación de ARNm, etc.).
[0550] Por consiguiente, la composición del segundo aspecto puede adecuadamente comprender al menos un ARN artificial del primer aspecto codificando F VSR y al menos un ARN artificial adicional que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de la proteína M de matriz de VSR. Alternativamente, la composición del segundo aspecto puede comprender adecuadamente al menos un ARN artificial del primer aspecto que codifica F VSR y al menos un ARN artificial adicional que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de N de VSR.
[0551] Alternativamente, la composición del segundo aspecto puede comprender adecuadamente al menos un ARN artificial del primer aspecto que codifica F VSR y al menos un ARN artificial adicional que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de VSR M2-1.
[0552] Alternativamente, la composición del segundo aspecto puede adecuadamente comprender al menos un ARN artificial del primer aspecto codificando F VSR y al menos un ARN artificial adicional que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido antigénico o proteína derivada de P de VSR.
[0553] En realizaciones preferidas, la composición del segundo aspecto comprende dos especies de ARN artificial adicionales, cada una de las cuales comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de VSR seleccionada entre proteína de matriz M, nucleoproteína N, M2-1 y fosfoproteína P.
[0554] Por consiguiente, la composición del segundo aspecto puede comprender adecuadamente al menos un ARN artificial del primer aspecto que codifica F VSR, al menos un ARN artificial adicional que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de M de VSR y al menos otro ARN artificial que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de N de VSR.
[0555] Por consiguiente, la composición del segundo aspecto puede comprender adecuadamente al menos un ARN artificial del primer aspecto que codifica F VSR, al menos un ARN artificial adicional que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido antigénico o proteína derivada de N de VSR y al menos otro ARN artificial que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de VSR M2-1.
[0556] Por consiguiente, la composición del segundo aspecto puede comprender adecuadamente al menos un ARN artificial del primer aspecto que codifica F VSR, al menos un ARN artificial adicional que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de P de VSR y al menos otro ARN artificial que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada del VSR M2-1.
[0557] Por consiguiente, la composición del segundo aspecto puede comprender adecuadamente al menos un ARN artificial del primer aspecto que codifica F VSR, al menos un ARN artificial adicional que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de P de VSR y al menos otro ARN artificial que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de N de VSR.
[0558] Por consiguiente, la composición del segundo aspecto puede comprender adecuadamente al menos un ARN artificial del primer aspecto que codifica F VSR, al menos un ARN artificial adicional que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido antigénico o proteína derivada de M de VSR, y al menos otro ARN artificial que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de VSR M2-1.
[0559] Por consiguiente, la composición del segundo aspecto puede comprender adecuadamente al menos un ARN artificial del primer aspecto que codifica F VSR, al menos un ARN artificial adicional que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de M de VSR, y al menos otro ARN artificial que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada del P de VSR.
[0560] En realizaciones preferidas, la composición del segundo aspecto comprende tres especies de ARN artificial adicionales, cada una de las cuales comprende tres especies de ARN artificial adicionales, cada una de las cuales comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de VSR seleccionada entre proteína de matriz M, nucleoproteína N, M2-1 y fosfoproteína P.
[0561] Por consiguiente, la composición del segundo aspecto puede comprender adecuadamente al menos un ARN artificial del primer aspecto que codifica F VSR, al menos un ARN artificial adicional que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido antigénico o proteína derivada de M de VSR, al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido antigénico o proteína derivada de N de VSR y al menos otro ARN artificial que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de P de VSR.
[0562] Por consiguiente, la composición del segundo aspecto puede comprender adecuadamente al menos un ARN artificial del primer aspecto que codifica F VSR, al menos otro ARN artificial que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de VSR M2-1, al menos otro ARN artificial que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de N de VSR y al menos otro ARN artificial que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada del P VSR.
[0563] Por consiguiente, la composición del segundo aspecto puede comprender adecuadamente al menos un ARN artificial del primer aspecto que codifica F VSR, al menos otro ARN artificial que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de VSR M2-1, al menos otro ARN artificial que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de M de VSR, y al menos otro ARN artificial que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada del P de VSR.
[0564] Por consiguiente, la composición del segundo aspecto puede comprender adecuadamente al menos un ARN artificial del primer aspecto que codifica F VSR, al menos otro ARN artificial que comprende al menos una secuencia de codificación que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de VSR M2-1, al menos otro ARN artificial que comprende al menos una secuencia de codificación que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de M de VSR y al menos otro ARN artificial que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de N de VSR.
[0565] Por consiguiente, la composición del segundo aspecto puede comprender adecuadamente al menos un ARN artificial del primer aspecto que codifica F VSR y al menos un ARN artificial adicional que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de VSR M2-1.
[0566] En realizaciones preferidas, la composición del segundo aspecto comprende cuatro especies de ARN artificial adicionales, cada una de las cuales comprende tres especies de ARN artificial adicionales, cada una de las cuales comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de VSR seleccionada entre proteína de matriz M, nucleoproteína N, M2-1 y fosfoproteína P.
[0567] Por consiguiente, la composición del segundo aspecto puede comprender adecuadamente al menos un ARN artificial del primer aspecto que codifica F VSR, al menos otro ARN artificial que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de M de VSR, al menos otro ARN artificial que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de N VSR, al menos otro ARN artificial que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de P VSR y al menos otro ARN artificial que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de VSR M2-1.
[0568] En realizaciones preferidas del segundo aspecto, la secuencia codificante del ARN artificial adicional codifica al menos una de las secuencias de aminoácidos que es idéntica o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92% , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a cualquiera de las SEQ ID NO: 9684, 10053-10133, 10134, 10503-10636, 10637, 11006-11182, 11183, 11552-11725, 19844, 20213, 20582, 20951 o un fragmento o variante de cualquiera de estas secuencias, donde únicamente el ARN artificial definido en las reivindicaciones es parte de la presente invención. La información adicional con respecto a cada una de estas secuencias de aminoácidos adecuadas que codifican proteínas VSR también puede derivarse del listado de secuencias, en particular de los detalles proporcionados en el mismo bajo el identificador <223> como se explica a continuación.
[0569] En realizaciones adicionales del segundo aspecto, la secuencia codificante del ARN artificial adicional codifica al menos un péptido o proteína antigénica como se define en este documento y adicionalmente una secuencia señal secretora heteróloga o péptido señal secretor heterólogo. La secuencia señal secretora heteróloga puede aumentar la secreción del péptido o proteína antigénica codificada.
[0570] Péptidos señal secretores adecuados pueden seleccionarse de la lista de secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEQ ID NO: 1-1115 y la SEQ ID NO: 1728 de la solicitud de patente WO2017/081082, o fragmentos o variantes de estas secuencias. A nivel de ácido nucleico, puede seleccionarse cualquier secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, secuencia de ARN) que codifique tales secuencias de aminoácidos.
[0571] De acuerdo con las realizaciones, la secuencia señal secretora comprende una secuencia de codificación idéntica o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 21329-21362 o un fragmento o variante de cualquiera de estas secuencias, donde únicamente el ARN artificial definido en las reivindicaciones adjuntas es parte de la presente invención. La información adicional con respecto a cada una de estas secuencias de aminoácidos adecuadas que codifican secuencias de señal secretoras también puede derivarse del listado de secuencias, en particular de los detalles proporcionados en el mismo bajo el identificador <223>.
[0572] En realizaciones preferidas, el ARN artificial adicional de la composición comprende
[0573] a) al menos una región 5’ no traducida (5'-UTR) heteróloga y/o al menos una región de 3' no traducida (3'-UTR) heteróloga; y
[0574] b) al menos una secuencia codificante ligada operativamente a dicha 3'-UTR y/o 5'-UTR que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de una M, N, M2-1 y/o fosfoproteína P de VSR o un fragmento o variante del mismo, preferiblemente que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 9684, 10053-10133, 10134, 10503-10636, 10637, 11006-11182, 11183, 11552-11725, 19844, 20213, 20582, 20951 o un fragmento o variante de cualquiera de estas secuencias.
[0575] En realizaciones preferidas, el ARN artificial adicional de la composición comprende
[0576] a) al menos una región 5’ no traducida (5'-UTR) heteróloga y/o al menos una región 3' no traducida (3'-UTR) heteróloga; y
[0577] b) al menos una secuencia codificante ligada operativamente a dicha 3'-UTR y/o 5'-UTR que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de VSR M2-1 o un fragmento o variante de la misma, que codifica preferiblemente una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 11183, 20953, 21414 o un fragmento o variante de cualquiera de estas secuencias.
[0578] De forma adecuada, el ARN artificial adicional de la composición comprende una secuencia codificante que está operativamente enlazada a una 3'-UTR y una 5'-UTR seleccionada de a-1, a-2, a-3, a-4, a-5, b-1, b-2, b-3, b-4, b-5, c-1, c-2, c-3, c-4, c-5, d-1, d-2, d-3, d-4, d-5, e-1, e-2, e-3, e-4, e-5, e-6, f-1, f-2, f-3, f-4, f-5, g-1, g-2, g-3, g-4, g-5, h-1, h-2, h-3, h-4, h-5, i-1, i-2, o i-3 (como se define en el contexto del primer aspecto).
[0579] De manera adecuada, el ARN artificial adicional de la composición comprende una secuencia codificante donde al menos uno o más de uno, o donde preferiblemente todos los nucleótidos uracilo están reemplazados por nucleótidos de pseudouridina (ψ) o nucleótidos de N1-metilpseudouridina (m1ψ).
[0580] Por consiguiente, en otras realizaciones, el ARN artificial adicional de la composición puede comprender un elemento de secuencia de 5’-cap de acuerdo con las SEQ ID NO: 43 o 21321, o un fragmento o variante de las mismas. En realizaciones preferidas del segundo aspecto, la secuencia de codificación del ARN adicional comprende al menos una de las secuencias de aminoácidos que es idéntica o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92% , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a las SEQ ID NO: 9685-9692, 10135-10142, 10638-10645, 11184-11119, 19845-19852, 20214-20221, 20583-20590, 20952-20959, 21385-21388, 21411-21414 o un fragmento o un fragmento o variante de cualquiera de estas secuencias (optimizaciones cds como se define en el contexto del primer aspecto), donde únicamente el ARN artificial definido en las reivindicaciones adjuntas es parte de la presente invención.
[0581] La información adicional con respecto a cada una de estas secuencias de aminoácidos adecuadas que codifican proteínas VSR también puede derivarse del listado de secuencias, en particular de los detalles proporcionados en el mismo bajo el identificador <223> como se explica a continuación.
[0582] En realizaciones preferidas del segundo aspecto, el ARN artificial adicional, preferiblemente el ARNm adicional de la composición comprende preferiblemente en la dirección 5' a 3' los siguientes elementos a) -i):
[0583] a) estructura 5'-cap, preferiblemente como se especifica en el contexto del primer aspecto, más preferiblemente una estructura cap1;
[0584] b) opcionalmente, 5'-UTR como se especifica en el contexto del primer aspecto, preferiblemente al menos una seleccionado de las SEQ ID NO: 1-22;
[0585] c) un sitio de unión a ribosoma, preferiblemente como se especifica en este documento;
[0586] d) al menos una secuencia de codificación seleccionada de las SEQ ID NO: 9685-9692, 10135-10142, 10638-10645, 11184-11119, 19845-19852, 20214-20221, 20583-20590, 20952-20959, 21385-21388, 21411-21414;
[0587] e) 3'-UTR como se especifica en el contexto del primer aspecto, preferiblemente al menos una seleccionada de las SEQ ID NO: 23-38;
[0588] f) opcionalmente, una secuencia poli(A), preferiblemente como se especifica en el contexto del primer aspecto; g) opcionalmente, una secuencia poli(C), preferiblemente como se especifica en el contexto del primer aspecto; h) opcionalmente, un tallo-bucle de histona, preferiblemente como se especifica en el contexto del primer aspecto; i) opcionalmente, un elemento de secuencia 3'-terminal como se especifica en el contexto del primer aspecto, preferiblemente de acuerdo con las SEQ ID NO: 44-63 o 21322-21328, y
[0589] donde opcionalmente al menos uno o más de uno, preferiblemente donde todos los nucleótidos de uracilo se reemplazan por nucleótidos de pseudouridina (ψ) o nucleótidos de N1-metilpseudouridina (m1ψ), donde únicamente el ARN artificial definido en las reivindicaciones adjuntas es parte de la invención.
[0590] En realizaciones particularmente preferidas del segundo aspecto, el ARN artificial adicional, preferiblemente el ARNm adicional de la composición comprende preferiblemente en la dirección 5' a 3' los siguientes elementos a) -i): a) estructura 5'-cap, preferiblemente como se especifica en el contexto del primer aspecto, más preferiblemente una estructura cap1;
[0591] b) opcionalmente, 5'-UTR como se especifica en el contexto del primer aspecto, preferiblemente al menos una seleccionada de las SEQ ID NO: 1-22;
[0592] c) un sitio de unión a ribosoma, preferiblemente como se especifica en este documento;
[0593] d) al menos una secuencia de codificación seleccionada de las SEQ ID NO: 11185-11191, 21388, 20952-20959, 21414;
[0594] e) 3'-UTR como se especifica en el contexto del primer aspecto, preferiblemente al menos una seleccionada de las SEQ ID NO: 23-38;
[0595] f) opcionalmente, una secuencia poli(A), preferiblemente como se especifica en el contexto del primer aspecto; g) opcionalmente, una secuencia poli(C), preferiblemente como se especifica en el contexto del primer aspecto; h) opcionalmente, un tallo-bucle de histona, preferiblemente como se especifica en el contexto del primer aspecto; i) opcionalmente, un elemento de secuencia 3'-terminal como se especifica en el contexto del primer aspecto, preferiblemente de acuerdo con las SEQ ID NO: 44-63 o 21322-21328, y
[0596] donde opcionalmente al menos uno o más de uno, preferiblemente donde todos los nucleótidos de uracilo se reemplazan por nucleótidos de pseudouridina (ψ) o nucleótidos de N1-metilpseudouridina (m1ψ), donde únicamente el ARN artificial definido en las reivindicaciones adjuntas es parte de la invención..
[0598] En ese contexto, las secuencias preferidas de polipéptidos, ácido nucleico y ARNm del VSR del segundo aspecto se proporcionan en la Tabla 7A.
[0600] En la Tabla 7A, las columnas A a D representan constructos adecuados específicos del segundo aspecto derivadas de la proteína VSR, donde la columna A proporciona secuencias adecuadas para M, la columna B proporciona secuencias adecuadas para N, la columna C proporciona secuencias adecuadas para P y la columna D proporciona secuencias adecuadas M2-1.
[0602] Los diseños/nombres de proteínas se indican en la fila 1 (columnas A a D), las SEQ ID NO de proteína específicas, tal como se proporcionan en el listado de secuencias, están en la fila 2 ("PRT"). Las SEQ ID NOs de proteína preferidas de HRSV(A2) se proporcionan en la fila 3 ("HRSV(A2) PRT"). Las SEQ ID NO de las secuencias codificantes correspondientes para cada proteína HRSV(A2) indicada se proporcionan en filas 4-11 (“cds wt”, “cds opt1”, “cds opt2”, “cds opt3”, “cds opt4”, “cds opt5”, “cds opt6”, “cds opt11”, respectivamente). Las SEQ ID NO de los correspondientes constructos de ARNm que comprenden dichas secuencias codificantes y 3'-UTR y 5'-UTR adecuadas de acuerdo con la invención se proporcionan en las filas 12 a 55 ("diseño de ARNm a-1" a "diseño de ARNm i-3" como se especifica en este documento).
[0604] Las SEQ ID NO de proteína preferidas de HRSV(Memphis-37) se proporcionan en la fila 56 (Memphis-37). Las SEQ ID NO de las secuencias codificantes correspondientes para cada proteína HRSV(Memphis 37) indicada se proporcionan en filas 57-64 (“cds wt”, “cds opt1”, “cds opt2”, “cds opt3”, “cds opt4”, “cds opt5”, “cds opt6”, “cds opt11”, respectivamente). Las SEQ ID NO de los correspondientes constructos de ARNm que comprenden dichas secuencias codificantes y 3'-UTR y 5'-UTR adecuadas de acuerdo con la invención se proporcionan en las filas 65 a 108 ("diseño de ARNm a-1" a "diseño de ARNm i-3" como se especifica en este documento).
[0606] Más información, por ejemplo, con respecto al tipo de secuencia codificante comprendida en los constructos de ARNm indicados se proporciona en el identificador <223> de la SEQ ID NO respectiva en el listado de secuencias.
[0608] T l 7A:n i ifi n i i n l r f ri n r ARNm l m i i n v n
[0610]
[0611]
[0612]
[0613]
[0614] Por consiguiente, en realizaciones preferidas, la composición del segundo aspecto comprende al menos un ARN artificial adicional que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de VSR seleccionada de proteína de matriz M, nucleoproteína N, proteína M2-1, fosfoproteína P, donde el ARN artificial adicional comprende o consiste en una secuencia de ARN que es idéntica o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a una secuencia de ácido nucleico seleccionada de las SEQ ID NO: 9693-10052, 10143-10502, 10646-11005, 11192-11551, 19853-20212, 20222-20581, 20591-20950, 20960-21319, 21481-21488, 21627-21634, 21553-21560, 21699-21706 o un fragmento o variante de cualquiera de estas secuencias, donde, opcionalmente, al menos uno o más de uno, o donde todos los nucleótidos de uracilo están reemplazados por nucleótidos de pseudouridina (ψ) o nucleótidos de N1-metilpseudouridina (m1ψ). La información adicional con respecto a cada una de estas secuencias de aminoácidos adecuadas que codifican proteínas VSR también puede derivarse del listado de secuencias, en particular de los detalles proporcionados en el mismo bajo el identificador <223> como se explica a continuación.
[0616] En realizaciones particularmente preferidas del segundo aspecto, la composición del segundo aspecto comprende - al menos un ARN artificial idéntico o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntico a una secuencia de ácido nucleico seleccionada de las SEQ ID NO: 2014-2373, 2752-3111, 3490-3849, 4966-5325, 16532-16891, 21436-21438, 21442-21444, 21448-21450, 21454-21456, 21526-21528, 21582-21584, 21588-21590, 21594-21596, 21600-21602, 21672-21674 (que codifica F de VSR como se define en el primer aspecto), donde únicamente el ARN artificial definido en las reivindicaciones adjuntas es parte de la invención, y un ARN artificial adicional que es idéntico o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 9693-10052, 19853-20212, 21481, 21482, 21627, 21628, 21553, 21554, 21699, 21700 (que codifica M de VSR); o
[0617] - al menos un ARN artificial idéntico o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntico a una secuencia de ácido nucleico seleccionada de las SEQ ID NO: 2014-2373, 2752-3111, 3490-3849, 4966-5325, 16532-16891, 21436-21438, 21442-21444, 21448-21450, 21454-21456, 21526-21528, 21582-21584, 21588-21590, 21594-21596, 21600-21602, 21672-21674 (que codifica F de VSR como se define en el primer aspecto) donde únicamente el ARN artificial definido en las reivindicaciones adjuntas es parte de la invención, y un ARN artificial adicional que es idéntico o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10143-10502, 20222-20581, 21483, 21484, 21629, 21630, 21555, 21556, 21701, 21702 (que codifica N de VSR); o
[0618] - al menos un ARN artificial idéntico o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntico a una secuencia de ácido nucleico seleccionada de las SEQ ID NO: 2014-2373, 2752-3111, 3490-3849, 4966-5325, 16532-16891, 21436-21438, 21442-21444, 21448-21450, 21454-21456, 21526-21528, 21582-21584, 21588-21590, 21594-21596, 21600-21602, 21672-21674 (que codifica F de VSR como se define en el primer aspecto) donde únicamente el ARN artificial definido en las reivindicaciones adjuntas es parte de la invención, y al menos un ARN artificial adicional que es idéntico o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10646-11005, 20591-20950, 21485, 21486, 21631, 21632, 21557, 21558, 21703, 21704 (que codifica P de VSR); o
[0619] - al menos un ARN artificial idéntico o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntico a una secuencia de ácido nucleico seleccionada de las SEQ ID NO: 2014-2373, 2752-3111, 3490-3849, 4966-5325, 16532-16891, 21436-21438, 21442-21444, 21448-21450, 21454-21456, 21526-21528, 21582-21584, 21588-21590, 21594-21596, 21600-21602, 21672-21674 (que codifica F de VSR como se define en el primer aspecto) donde únicamente el ARN artificial definido en las reivindicaciones adjuntas es parte de la invención, y al menos un ARN artificial adicional que es idéntico o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 11192-11551, 20960-21319, 21487, 21488, 21633, 21634, 21559, 21560, 21705, 21706 (que codifica VSR M2-1); o
[0620] - al menos un ARN artificial idéntico o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntico a una secuencia de ácido nucleico seleccionada de las SEQ ID NO: 2014-2373, 2752-3111, 3490-3849, 4966-5325, 16532-16891, 21436-21438, 21442-21444, 21448-21450, 21454-21456, 21526-21528, 21582-21584, 21588-21590, 21594-21596, 21600-21602, 21672-21674 (que codifica F de VSR como se define en el primer aspecto) donde únicamente el ARN artificial definido en las reivindicaciones adjuntas es parte de la invención, y al menos un ARN artificial adicional que es idéntico o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a una secuencia de ácido nucleico seleccionada de las SEQ ID NO: 9693-10052, 19853-20212, 21481, 21482, 21627, 21628, 21553, 21554, 21699, 21700 (que codifica M VSR) y un ARN artificial adicional que es idéntico o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a una secuencia de ácido nucleico seleccionada de las SEQ ID NO: 10646-11005, 20591-20950, 21485, 21486, 21631, 21632, 21557, 21558, 21703, 21704 (que codifica P de VSR);
[0621] - al menos un ARN artificial idéntico o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntico a una secuencia de ácido nucleico seleccionada de las SEQ ID NO: 2014-2373, 2752-3111, 3490-3849, 4966-5325, 16532-16891, 21436-21438, 21442-21444, 21448-21450, 21454-21456, 21526-21528, 21582-21584, 21588-21590, 21594-21596, 21600-21602, 21672-21674 (que codifica F de VSR como se define en el primer aspecto) donde únicamente el ARN artificial definido en las reivindicaciones adjuntas es parte de la invención, y al menos un ARN artificial adicional que es idéntico o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a una secuencia de ácido nucleico seleccionada de las SEQ ID NO: 9693-10052, 19853-20212, 21481, 21482, 21627, 21628, 21553, 21554, 21699, 21700 (que codifica M VSR) y un ARN artificial adicional que es idéntico o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a una secuencia de ácido nucleico seleccionada de las SEQ ID NO: 10646-11005, 20591-20950, 21485, 21486, 21631, 21632, 21557, 21558, 21703, 21704 (que codifica P VSR) y un ARN artificial adicional que es idéntico o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a una secuencia de ácido nucleico seleccionada de las SEQ ID NO: 10143-10502, 20222-20581, 21483, 21484, 21629, 21630, 21555, 21556, 21701, 21702 (que codifica N de VSR), o
[0622] - al menos un ARN artificial idéntico o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntico a una secuencia de ácido nucleico seleccionada de las SEQ ID NO: 2014-2373, 2752-3111, 3490-3849, 4966-5325, 16532-16891, 21436-21438, 21442-21444, 21448-21450, 21454-21456, 21526-21528, 21582-21584, 21588-21590, 21594-21596, 21600-21602, 21672-21674 (que codifica F de VSR como se define en el primer aspecto), donde únicamente el ARN artificial definido en las reivindicaciones adjuntas es parte de la invención, y al menos otro ARN artificial que es idéntico o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91% , 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 11192-11551, 20960-21319, 21487, 21488, 21633, 21634, 21559, 21560, 21705, 21706 (que codifica VSR M2-1),
[0623] donde opcionalmente al menos uno o más de uno, o donde todos los nucleótidos de uracilo se reemplazan por nucleótidos de pseudouridina (ψ) o nucleótidos de N1-metilpseudouridina (m1ψ).
[0625] En varias realizaciones, diferentes combinaciones de constructos F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut4 y constructos de ARN de antígeno de células T de VSR (M, N, M2-1 o P de VSR) están adecuadamente comprendidos en la composición (como se describe en la Tabla 7B; combinaciones 1-64). Se prefieren las combinaciones 49-64, la combinación 64 es particularmente preferida.
[0627] Tabla 7B:Combinaciones reivindicadas y adicionales de constructos de ARN que codifican F de VSR y constructos de ARN que codifican antígenos de células T
[0630]
[0631]
[0632] 64 5695
11183
[0633] La Tabla 7B describe composiciones del segundo aspecto que comprenden al menos un ARN que codifica F de VSR de la cepa A2 como se define en el primer aspecto y al menos un ARN artificial adicional que comprende al menos una secuencia codificante que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada del VSR de la cepa A2 seleccionada de la proteína de matriz M, nucleoproteína N, proteína M2-1, fosfoproteína P. En realizaciones adicionales de la invención, todas las composiciones descritas en la Tabla 7B también son aplicables para péptidos antigénicos o proteínas derivadas de un aislado de VSR Memphis-37 (cepa Memphis-37).
[0634] En una realización particularmente preferida, la composición comprende un constructo de ARN F de VSR (F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut4) y, además, un constructo de ARN VSR M2-1, preferiblemente F-del_DSCav1_mut5 y M2-1.
[0635] En varias realizaciones, el al menos un ARN artificial del primer aspecto y el al menos un ARN artificial adicional como se especifica en este documento se derivan del mismo virus VSR (por ejemplo, cualquier virus seleccionado de la Lista 1).
[0636] En realizaciones preferidas, el al menos un ARN artificial del primer aspecto se deriva de HRSV(A2) y el al menos un ARN artificial adicional como se especifica en este documento se deriva de HRSV(A2).
[0637] En realizaciones preferidas, el al menos un ARN artificial del primer aspecto se deriva de HRSV(Memphis-37) y el al menos un ARN artificial adicional como se especifica en este documento se deriva de HRSV(Memphis-37).
[0638] Debe entenderse que, en el contexto de la invención, determinadas combinaciones de secuencias de codificación pueden generarse mediante cualquier combinación de ácidos nucleicos artificiales monocistrónicos, bicistrónicos y multicistrónicos y/o constructos de múltiples antígenos/ácido nucleico para obtener una composición de ácido nucleico. que codifican múltiples péptidos o proteínas antigénicos como se define en este documento.
[0639] Además, también se pueden usar una o más cargas o diluyentes o compuestos encapsulantes sólidos o líquidos compatibles adecuados para la administración a una persona. El término "compatible" como se usa en este documento significa que los constituyentes de la composición son capaces de mezclarse con el al menos un ARN y, opcionalmente el ARN artificial adicional de la composición, de tal manera que no ocurra una interacción reduzca sustancialmente la actividad biológica o la eficacia farmacéutica de la composición en las condiciones de uso típicas. Los vehículos, cargas y diluyentes farmacéuticamente aceptables deben tener una pureza suficientemente alta y una toxicidad suficientemente baja para que sean adecuados para la administración a una persona a tratar. Los compuestos que pueden usarse como vehículos, cargas o constituyentes de los mismos farmacéuticamente aceptables son azúcares, por ejemplo lactosa, glucosa, trehalosa y sacarosa; almidones, por ejemplo almidón de maíz o de patata; dextrosa; celulosa y sus derivados, por ejemplo carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa, acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; sebo; deslizantes sólidos, por ejemplo ácido esteárico, estearato de magnesio; sulfato de calcio; aceites vegetales, por ejemplo aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de teobroma; polioles, por ejemplo polipropilenglicol, glicerol, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ácido algínico.
[0640] Otros aditivos que pueden incluirse en la composición son emulsionantes, por ejemplo Tween; agentes humectantes, por ejemplo lauril sulfato de sodio; agentes colorantes; agentes que imparten sabor, vehículos farmacéuticos; agentes formadores de comprimidos; estabilizadores; antioxidantes; conservantes.
[0641] Complejación:
[0642] En una realización preferida del segundo aspecto, el al menos un ARN artificial del primer aspecto y opcionalmente el ARN artificial adicional del segundo aspecto están complejados o asociados o al menos parcialmente complejados o parcialmente asociados con uno o más compuestos catiónicos o policatiónicos, preferiblemente polímeros catiónicos o policatiónicos, polisacáridos catiónicos o policatiónicos, lípidos catiónicos o policatiónicos, proteínas catiónicas o policatiónicas, péptidos catiónicos o policatiónicos, o cualquier combinación de los mismos.
[0643] El término "compuesto catiónico o policatiónico", tal como se usa aquí, será reconocido y entendido por aquel con conocimientos ordinarios en la técnica y, por ejemplo, se pretende referir a una molécula cargada, que está cargada positivamente a un valor de pH que varía de aproximadamente 1 a 9, a un valor de pH que varía de aproximadamente 3 a 8, a un valor de pH que varía de aproximadamente 4 a 8, a un valor de pH que varía de aproximadamente 5 a 8, más preferiblemente a un valor de pH que varía de aproximadamente 6 a 8, incluso más preferiblemente a un valor de pH que varía de aproximadamente 7 a 8, con mayor preferencia pH fisiológico, por ejemplo que varía desde aproximadamente 7,2 hasta aproximadamente 7,5. Por consiguiente, un componente catiónico, por ejemplo, un péptido catiónico, proteína catiónica, polímero catiónico, polisacárido catiónico, lípido catiónico puede ser cualquier compuesto o polímero cargado positivamente que esté cargado positivamente en condiciones fisiológicas. Un "péptido o proteína catiónico o policatiónico" puede contener al menos un aminoácido cargado positivamente, o más de un aminoácido cargado positivamente, por ejemplo seleccionado de Arg, His, Lys u Orn. Por consiguiente, los componentes "policatiónicos" también están dentro del alcance que exhiben más de una carga positiva en las condiciones dadas.
[0644] Los compuestos catiónicos o policatiónicos, que son particularmente preferidos en este contexto, pueden seleccionarse de la siguiente lista de péptidos catiónicos o policatiónicos o proteínas de fragmentos de los mismos: protamina, nucleolina, espermina o espermidina, u otros péptidos o proteínas catiónicos, como poli-L-lisina (PLL), poliarginina, polipéptidos básicos, péptidos de penetración celular (CPP), incluidos péptidos de unión al VIH, Tat del VIH-1 (VIH), péptidos derivados de Tat, Penetratina, péptidos derivados o análogos de VP22, HSV VP22 (Herpes simplex), MAP, KALA o dominios de transducción de proteínas (PTSd), PpT 620, péptidos ricos en prolina, péptidos ricos en arginina, péptidos ricos en lisina, péptido(s) de MPG, Pep-1, oligómeros L, péptido(s) de calcitonina, péptidos derivados de Antennapedia, pAntp, pIsl, FGF, Lactoferrina, Transportan, Buforin-2, Bac715-24, SynB, SynB (1), pVEC, péptidos derivados de hCT, SAP o histonas. Más preferiblemente, el ácido nucleico como se define en este documento, preferiblemente el ARNm como se define en este documento, forma complejo con uno o más policationes, preferiblemente con protamina u oligofectamina, con mayor preferencia con protamina.
[0645] En una realización preferida del segundo aspecto, el al menos un ARN artificial del primer aspecto y, opcionalmente, el ARN artificial adicional del segundo aspecto están complejados con protamina.
[0646] Otros compuestos catiónicos o policatiónicos preferidos, que se pueden usar como agentes de transfección o complejación, pueden incluir polisacáridos catiónicos, por ejemplo quitosano, polibreno, etc.; lípidos catiónicos, por ejemplo DOTMA, DMRIE, di-C14-amidina, DOTIM, SAINT, DC-Chol, BGTC, CTAP, DOPC, DODAP, DOPE: Dioleil fosfatidiletanol amina, DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS, DIMRI, DOTAP, DC-6-14, CLIP1, CLIP6, CLIP9, oligofectamina; o polímeros catiónicos o policatiónicos, por ejemplo poliaminoácidos modificados, como polímeros de beta-aminoácidos o poliamidas invertidas, etc., polietilenos modificados, como PVP, etc., acrilatos modificados, como pDMAEMA, etc., amidoaminas modificadas como pAMAM, etc., polibetaaminoéster modificado (PBAE), como polímeros de diacrilato-co-5-amino-1-pentanol de 1,4-butanodiol modificados en el extremo de diamina, etc. dendrímeros, como dendrímeros de polipropilamina o dendrímeros basados en pAMAM, etc., poliimina(s), como PEI, poli (propilenimina), etc. polialilamina, polímeros a base de estructura principal de azúcar, tales como polímeros a base de ciclodextrina, polímeros a base de dextrano, etc., polímeros basados en la estructura principal de silan, tales como copolímeros PMOXA-PDMS, etc., polímeros de bloque que consisten en una combinación de uno o más bloques catiónicos (por ejemplo, seleccionados de un polímero catiónico como se mencionó anteriormente) y de uno o más bloques hidrófilos o hidrófobos (por ejemplo, polietilenglicol); etc.
[0647] En este contexto, se prefiere particularmente que el al menos un ARN artificial como se define en este documento y opcionalmente el ARN artificial adicional del segundo aspecto, estén complejados o al menos parcialmente complejados con un compuesto catiónico o policatiónico y/o un portador polimérico, preferiblemente proteínas o péptidos catiónicos. Parcialmente significa que sólo una parte del ácido nucleico artificial forma un complejo con un compuesto catiónico y que el resto del ácido nucleico artificial está (comprendido en la composición (farmacéutica) de la invención) en forma no complejada ("libre").
[0648] En una realización preferida del segundo aspecto, el al menos un ARN artificial del primer aspecto y opcionalmente, el ARN artificial adicional del segundo aspecto están complejados con uno o más compuestos catiónicos o policatiónicos, preferiblemente protamina, y al menos un ARN artificial libre del primer aspecto y opcionalmente el ARN adicional del segundo aspecto.
[0649] En este contexto, se prefiere particularmente que el al menos un ARN artificial como se define en este documento y opcionalmente el ARN artificial adicional del segundo aspecto estén complejados o al menos parcialmente complejados con protamina. Preferiblemente, la proporción molar del ácido nucleico, particularmente el ARN del ARN complejado con protamina al ARN libre se puede seleccionar de una proporción molar de aproximadamente 0,001:1 a aproximadamente 1:0,001, incluida una proporción de aproximadamente 1:1. De forma adecuada, el ARN complejado se compleja con protamina mediante la adición de una solución de protamina-trehalosa a la muestra de ARN en una proporción en peso ARN:protamina (p/p) de 2:1.
[0650] Otras proteínas o péptidos catiónicos o policatiónicos preferidos que pueden usarse para la complejación se pueden derivar de la fórmula (Arg)l; (Lys)m; (His)n; (Orn)o; (Xaa)x de la solicitud de patente WO2009/030481 o WO2011/026641.
[0651] En una realización preferida del segundo aspecto, el al menos un ARN artificial del primer aspecto y opcionalmente el ARN artificial adicional del segundo aspecto, están complejados o al menos parcialmente complejados con al menos una proteína catiónica o policatiónica o péptidos preferiblemente seleccionados de las SEQ ID NO: 64-67, 21320 o cualquier combinación de las mismas.
[0652] De acuerdo con las realizaciones, la composición de la presente invención comprende el ARN como se define en este documento y un portador polimérico.
[0653] El término "portador polimérico" como se usa en este documento será reconocido y entendido por el experto en la técnica y, por ejemplo, se pretende referir a un compuesto que facilita el transporte y/o complejación de otro compuesto (carga). Un portador polimérico es típicamente un portador que está formado por un polímero. Un portador polimérico puede asociarse a su carga (ácido nucleico, ARN) mediante interacción covalente o no covalente.
[0654] Un portador polimérico adecuado puede ser un portador polimérico formado por compuestos catiónicos reticulados con disulfuro. Los compuestos catiónicos reticulados con disulfuro pueden ser iguales o diferentes entre sí. El portador polimérico también puede contener otros componentes. El portador polimérico usado de acuerdo con la presente invención puede comprender mezclas de péptidos catiónicos, proteínas o polímeros y opcionalmente otros componentes como se define en este documento reticulados por enlaces disulfuro (a través de grupos -SH).
[0655] En este contexto, los portadores poliméricos de acuerdo con la fórmula {(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa’)x(Cys)y} y la fórmula Cys,{(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x}Cys<2>de la solicitud de patente WO2012/013326 son preferentes. En realizaciones, el portador polimérico usado para complejar el ARN como se define en este documento puede derivarse de una molécula portadora polimérica de acuerdo con la fórmula (L-P<1>-S-[S-P<2>-S]<n>-S-P<3>-L) de la solicitud de patente WO2011/026641.
[0656] En realizaciones, el compuesto portador polimérico está formado por o comprende o consiste en los elementos peptídicos CysArg12Cys (SEQ ID NO: 64) o CysArg12 (SEQ ID NO: 65) o TrpArg12Cys (SEQ ID NO: 66. En realizaciones particularmente preferidas, el compuesto portador polimérico consiste en un dímero (R<12>C)-(R<12>C), un dímero (WR<12>C)-(WR<12>C) o un trímero (CR<12>)-(CR<12>C)-(CR<12>), en donde los elementos peptídicos individuales en el dímero (por ejemplo, (WR12C)), o el trímero (por ejemplo, (CR12)), están unidos vía grupos -SH.
[0657] En una realización preferida del segundo aspecto, el al menos un ARN artificial del primer aspecto y opcionalmente, el ARN artificial adicional del segundo aspecto están complejados o asociados con un polímero polietilenglicol/péptido que comprende HO-PEG5000-S-(S-CHHHHHHRRRRHHHHHHC-S-)7-S-PEG5000-OH (SEQ ID NO: 67 como monómero peptídico).
[0658] En una realización preferida adicional del segundo aspecto, el al menos un ARN artificial del primer aspecto y opcionalmente el ARN artificial adicional del segundo aspecto están complejados o asociados con un polímero polietilenglicol/péptido que comprende HO-PEG5000-S-(S-CHHHHHHRRRRHHHHHHC-S-)4-S-PEG5000-OH (SEQ ID NO: 67 como monómero peptídico).
[0659] En una realización preferida adicional del segundo aspecto, el al menos un ARN artificial del primer aspecto y opcionalmente el ARN artificial adicional del segundo aspecto están complejados o asociados con un polímero de polietilenglicol/péptido que comprende HO-PEG5000-S-(S-CGHHHHHRRRRHHHHHGC-S-)7-S-PEG5000-OH (SEQ ID NO: 21320 como monómero peptídico).
[0660] En una realización preferida adicional del segundo aspecto, el al menos un ARN artificial del primer aspecto y opcionalmente el ARN artificial adicional del segundo aspecto están complejados o asociados con un polímero de polietilenglicol/péptido que comprende HO-PEG5000-S-(S-CGHHHHHRRRRHHHHHGC-S-)4-S-PEG5000-OH (SEQ ID NO: 21320 como monómero peptídico).
[0661] En otras realizaciones, la composición comprende al menos un ARN artificial como se describe en el presente documento, y opcionalmente el ARN artificial adicional del segundo aspecto, donde el al menos un ARN artificial y opcionalmente el ARN artificial adicional del segundo aspecto están complejados o asociados con portadores poliméricos y opcionalmente con al menos un componente lipídico como se describe en las solicitudes PCT publicadas WO2017/212008A1, WO2017/212006A1, WO2017/212007A1, y WO2017/212009A1.
[0662] En una realización particularmente preferida, el portador polimérico es un polímero peptídico, preferiblemente un polímero polietilenglicol/péptido como se definió anteriormente, y un componente lipídico, preferiblemente un componente lipidoide, más preferiblemente un componente lipidoide.
[0663] En una realización preferida del segundo aspecto, el al menos un ARN artificial del primer aspecto y, opcionalmente, el ARN artificial adicional del segundo aspecto, están complejados o asociados con un portador polimérico, preferiblemente con un polímero de polietilenglicol/péptido como se definió anteriormente, y un componente lipidoide, donde el componente lipidoide es un compuesto de acuerdo con la fórmula A
[0664]
[0666] (fórmula A)
[0667] donde
[0668] - R<A>se selecciona independientemente para cada aparición de un grupo alifático C<1-20>no sustituido, cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado; un grupo heteroalifático C<1-20>, ramificado o no ramificado, cíclico o acíclico, sustituido o no sustituido; un arilo sustituido o no sustituido; un heteroarilo sustituido o no sustituido;
[0671]
[0673] donde al menos un R<A>es
[0675]
o
[0676] - R<5>se selecciona independientemente para cada aparición de un alifático C<8-16>no sustituido, cíclico o acíclico, ramificado o no ramificado; un arilo sustituido o no sustituido; o un heteroarilo sustituido o no sustituido;
[0677] - cada aparición de x es un número entero de 1 a 10;
[0678] - cada aparición de y es un número entero de 1 a 10;
[0679] o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
[0680] En una realización preferida, el componente lipidoide es 3-C12-OH de acuerdo con la fórmula B
[0682]
[0684] (fórmula B)
[0685] En realizaciones preferidas, el polímero peptídico que comprende el lípido 3-C12-OH como se especifica anteriormente se usa para complejar el ARN del primer aspecto y, opcionalmente, el ARN artificial adicional del segundo aspecto, para formar complejos que tienen una proporción N/P de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 20, o de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 15, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 15, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 12, donde la proporción N/P se define como la proporción molar entre los átomos de nitrógeno de los grupos básicos del péptido catiónico o polímero y los grupos fosfato del ácido nucleico artificial.
[0686] Encapsulación/complejación en LNP:
[0687] En realizaciones preferidas del segundo aspecto, el ARN artificial del primer aspecto y, opcionalmente, el ARN artificial adicional del segundo aspecto, están complejados o asociados con uno o más lípidos (por ejemplo lípidos catiónicos y/o lípidos neutros), formando así liposomas, nanopartículas lipídicas (LNP), lipoplejos y/o nanoliposomas.
[0688] Para composiciones que comprenden más de un constructo de ARN artificial como se define aquí (por ejemplo, F-del y M2-1), dichos constructos pueden coformularse en, por ejemplo, LNP para formar la respectiva composición.
[0689] Alternativamente, dichos más de un constructo de ARN artificial pueden formularse por separado y pueden combinarse posteriormente para formar la respectiva composición.
[0690] En este contexto, los términos "complejado" o "asociado" se refieren a la combinación esencialmente estable del ARN artificial del primer aspecto y opcionalmente el ARN artificial adicional del segundo aspecto con uno o más lípidos en conjuntos o conjuntos más grandes sin unión covalente.
[0691] El término "nanopartícula lipídica", también denominada "LNP", no está restringido a ninguna morfología particular e incluye cualquier morfología generada cuando se combinan un lípido catiónico y opcionalmente uno o más lípidos adicionales, por ejemplo en un ambiente acuoso y/o en presencia de ARN. Por ejemplo, un liposoma, un complejo lipídico, un lipoplejo y similares están dentro del alcance de una nanopartícula lipídica (LNP).
[0692] Por consiguiente, en realizaciones preferidas del segundo aspecto, el ARN artificial del primer aspecto y, opcionalmente, el ARN artificial adicional del segundo aspecto, se compleja con uno o más lípidos formando así nanopartículas lipídicas (LNP).
[0693] Las LNP comprenden típicamente un lípido catiónico y uno o más excipientes seleccionados entre lípidos neutros, lípidos cargados, esteroides y lípidos conjugados con polímero (por ejemplo lípido PEGilado). El ARN puede estar encapsulado en la porción lipídica de la LNP o en un espacio acuoso envuelto por parte o toda la porción lipídica completa de la LNP. El ARN o parte del mismo también se puede asociar y formar complejos con la LNP. Una LNP puede comprender cualquier lípido capaz de formar una partícula a la que se unen los ácidos nucleicos o en la que uno o más ácidos nucleicos están encapsulados. Preferiblemente, las LNP que comprenden ácidos nucleicos comprenden uno o más lípidos catiónicos y uno o más lípidos estabilizantes. Los lípidos estabilizadores incluyen lípidos neutros y lípidos PEGilados.
[0694] El lípido catiónico de una LNP puede ser cationizable, es decir, se protona cuando el pH desciende por debajo del pK del grupo ionizable del lípido, pero es progresivamente más neutro a valores de pH más altos. A valores de pH por debajo del pK, el lípido puede entonces asociarse con ácidos nucleicos cargados negativamente. En ciertas realizaciones, el lípido catiónico comprende un lípido bipolar que asume una carga positiva al disminuir el pH.
[0695] Las LNP pueden comprender cualquier otro lípido catiónico o cationizable, es decir, cualquiera de una serie de especies de lípidos que llevan una carga neta positiva a un pH selectivo, como el pH fisiológico.
[0696] Dichos lípidos incluyen, pero no se limitan a, cloruro de N, N-dioleil-N, N-dimetilamonio (DODAC), bromuro de N, N-diestearil-N, N-dimetilamonio (DDAB), cloruro de 1,2-dioleoiltrimetilamonio propano (DOTAP) (también conocido como cloruro de N-(2,3-dioleoiloxi)propil)-N,N, N-trimetilamonio y sal de cloruro de 1,2-dioleiloxi-3-trimetilaminopropano), cloruro de N-(1-(2,3-dioleiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio(DOTMA), N,N-dimetil-2,3- dioleiloxi)propilamina (DODMA), 1,2-DiLinoleiloxi-N,N-dimetilaminopropano(DLinDMA), 1,2-Dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano(DLenDMA), 1,2-diy-linoleniloxi-N, N-dimetilaminopropano (γ-DLenDMA), 1,2-Dilinoleilcarbamoiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-C-DAP), 1,2-Dilinoleyoxi-3-(dimetilamino)acetoxipropano (DLin-DAC), 1,2-Dilinoleyoxi-3-morfolinopropano(DLin-MA), 1,2-Dilinoleoil-3-dimetilaminopropano(DLinDAP), 1,2-Dilinoleiltio-3-dimetilaminopropano(DLin-S-DMA), 1-Linoleoil-2-linoleiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-2-DMAP), sal de cloruro de 1,2-dilinoleiloxi-3-trimetilaminopropano(DLin-TMA.Cl), sal de cloruro de 1,2-dilinoleoil-3-trimetilaminopropano(DLin-TAP.Cl), 1,2-Dilinoleiloxi-3-(N-metilpiperazino)propano(DLin-MPZ), o 3-(N,N-Dilinoleilamino)-1,2-propanodiol(DLinAP), 3- (N,N-Dioleilamino)-1,2-propanodio(DOAP), 1,2-Dilinoleiloxo-3-(2-N, N-dimetilamino)etoxipropano(DLin-EG-DMA), 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano(DLin-K-DMA ) o análogos de los mismos, (3aR, 5s, 6aS) -N, N-dimetil-2,2-di ((9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dienil)tetrahidro-3aH-ciclopenta[d][1,3] dioxol-5-amina, (6Z, 9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-il-4-(dimetilamino)butanoato(MC3),1,1´-(2-(4-(2-)((2-(bis(2-hidroxidodecil)amino)etil)(2-hidroxidodecil)amino)etil)piperazin-1-il)etilazanodiil)didodecan-2-ol(C12-200),2,2-dilinoleil-4-(2-dimetilaminoetil)-[1,3]-dioxolano(DLin-K-C2-DMA),2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano(DLin-K-DMA), (6Z,9Z,28Z,31Z) -heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-ilo4-(dimetilamino) butanoato (DLin-M-C3-DMA), 3-((6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-iloxi)-N, N-dimetilpropan-1-amina (éter MC3), 4-((6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-iloxi)-N, N-dimetilbutan-1-amina (éter MC4), LIPOFECTIN® (liposomas catiónicos disponibles comercialmente que comprenden DOTMA y 1,2-dioleoil-sn-3fosfoetanolamina (DOPE), de GIBCO/BRL, Grand Island, N.Y.); LIPOFECTAMINE® (liposomas catiónicos disponibles comercialmente que comprenden trifluoroacetato de N-(1-(2,3dioleiloxi)-N-(2-(esperminecarboxamido)etil)-N,N-dimetilamonio (DOSPA) y (DOPE), de GIBCO/BRL); y TRANSFECTAM® (lípidos catiónicos disponibles comercialmente que comprenden dioctadecilamidoglicilcarboxispermina (DOGS) en etanol de Promega Corp., Madison, Wis.) o cualquier combinación de cualquiera de los anteriores.
[0697] En algunas realizaciones, el lípido se selecciona del grupo que consiste en 98N12-5, C12-200 y ckk-E12.
[0698] En una realización, el lípido catiónico adicional es un amino lípido.
[0699] Aminoácidos representativos incluyen, entre otros, 1,2-dilinoleyoxi-3-(dimetilamino)acetoxipropano (DLin-DAC), 1,2-dilinoleyoxi-3morfolinopropano (DLin-MA), 1,2-dilinoleoil-3-dimetilaminopropano (DLinDAP), 1,2-dilinoleiltio-3-dimetilaminopropano (DLin-S-DMA), 1-linoleoil-2-linoleiloxi-3dimetilaminopropano (DLin-2-DMAP), sal cloruro de 1,2-dilinoleiloxi-3-trimetilaminopropano (DLin-TMA.Cl), sal cloruro de 1,2-dilinoleoil-3-trimetilaminopropano (DLin-TAP.Cl), 1,2-dilinoleiloxi-3-(N-metilpiperazino)propano (DLin-MPZ), 3-(N,Ndilinoleilamino)-1,2-propanodiol (DLinAP), 3- (N, N-dioleilamino)-1,2-propanodiol (DOAP), 1,2-dilinoleiloxo-3-(2-N,N-dimetilamino)etoxipropano (DLin-EG-DMA), y 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA), 2,2-dilinoleil-4-(2-dimetilaminoetil)-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA); dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (DLin-MC3-DMA); MC3 (US20100324120).
[0700] En una realización, el ARN artificial del primer aspecto y, opcionalmente, el ARN artificial adicional del segundo aspecto, se pueden formular en un aminoalcohol lipidoide. Los lípidoides de aminoalcohol que pueden usarse en la presente invención pueden prepararse mediante los métodos descritos en la patente de US. 8.450.298. Los lípidos (ionizables) adecuados también pueden ser los compuestos que se describen en las Tablas 1, 2 y 3 y que se definen en las reivindicaciones 1-24 del documento WO2017/075531A1.
[0701] En otra realización, los lípidos ionizables también pueden ser los compuestos descritos en la WO2015/074085A1 (es decir, ATX-001 a ATX-032 o los compuestos especificados en las reivindicaciones 1-26), las solicitudes US 61/905,724 y 15/614,499 o las patentes US 9,593,077 y 9,567,296.
[0702] En ese contexto, cualquier lípido derivado de la fórmula genérica (X1)
[0704]
[0706] donde, R1 y R2 son iguales o diferentes, siendo cada uno un alquilo lineal o ramificado de 1 a 9 carbonos, un alquenilo o alquinilo de 2 a 11 carbonos, L1 y L2 son iguales o diferentes, siendo cada uno de ellos un alquileno o alquenileno lineal de 5 a 18 carbonos, o formando un heterociclo con N, X1 es un enlace o es -CO-O- por lo que se forma -L2-CO-O-R2, X2 es S u O, L3 es un enlace o un alquileno lineal o ramificado de 1 a 6 carbonos o que forma un heterociclo con N, R3 es un alquileno lineal o ramificado de 1 a 6 carbonos y R4 y R5 son iguales o diferentes, en cada caso hidrógeno o un alquilo lineal o ramificado de 1 a 6 carbonos; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo puede usarse de manera adecuada.
[0707] En otras realizaciones, los lípidos catiónicos adecuados también pueden ser los compuestos descritos en la WO2017/117530A1 (es decir, lípidos 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o los compuestos especificados en las reivindicaciones).
[0708] En ese contexto, cualquier lípido derivado de la fórmula genérica (X2)
[0710]
[0712] donde
[0713] X es un alquileno o alquenileno lineal o ramificado, un areno o heteroareno monocíclico, bicíclico o tricíclico;
[0714] Y es un enlace, un eteno o un anillo aromático o heteroaromático sustituido o no sustituido; Z es S o 0;
[0715] L es un alquileno lineal o ramificado de 1 a 6 carbonos;
[0716] R-3 y R4 son independientemente un alquilo lineal o ramificado de 1 a 6 carbonos;
[0717] R1 y R2 son independientemente un alquilo o alquenilo lineal o ramificado de 1 a 20 carbonos; r es de 0 a 6; y m, n, p y q son independientemente de 1 a 18;
[0718] donde cuando n= q, m= p, y R1 = R2, entonces X e Y difieren;
[0719] donde cuando X=Y, n=q, m=p, entonces R1 y R2 difieren;
[0720] donde cuando X=Y, n=q, y R1=R2, entonces m y p difieren; y
[0721] donde cuando X=Y, m= p y R1=R2, entonces n y q difieren;
[0722] o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
[0723] En realizaciones preferidas, se puede usar un lípido derivado de la fórmula (X2) donde X es un enlace, alquileno, alquenileno lineal o ramificado, o areno o heteroareno monocíclico, bicíclico o tricíclico; Y es un areno o heteroareno monocíclico, bicíclico o tricíclico; Z es S u O; L es un alquileno lineal o ramificado de 1 a 6 carbonos; R3 y R4 son independientemente un alquilo lineal o ramificado de 1 a 6 carbonos; R1 y R2 son independientemente un alquilo o alquenilo lineal o ramificado de 1 a 20 carbonos; r es de 0 a 6; y m, n, p y q son independientemente de 1 a 18; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo puede usarse de manera adecuada.
[0724] En realizaciones preferidas, los lípidos ionizables también pueden seleccionarse de los compuestos lipídicos descritos en la solicitud PCT/EP2017/077517 (es decir, compuestos lipídicos derivados de la fórmula I, II y III de la PCT/EP2017/077517, o compuestos lipídicos como se especifica en las reivindicaciones 1 a 12 de la PCT/EP2017/077517). En ese contexto, los compuestos lipídicos descritos en la Tabla 7 de la PCT/EP2017/077517 (por ejemplo, compuestos lipídicos derivados de la fórmula I-1 a I-41) y los compuestos lipídicos descritos en la Tabla 8 de la PCT/EP2017/077517 (por ejemplo, compuestos lipídicos derivados de fórmula II-1 a II-36) se puede utilizar adecuadamente en el contexto de la invención. Por consiguiente, la fórmula I-1 a la fórmula I-41 y la fórmula II-1 a la fórmula II-36 de la PCT/EP2017/077517, y la descripción específica se relacionan con la misma.
[0725] En realizaciones particularmente preferidas del segundo aspecto, un lípido adecuado puede ser un lípido catiónico de acuerdo con la fórmula (III)
[0727]
[0729] o una sal, tautómero, profármaco o estereoisómero farmacéuticamente aceptable de la misma, donde R1, R2, R3, L1, L2, G1, G2 y G3 son como sigue.
[0730] La fórmula (III) se define además en que:
[0731] uno de L<1>o L<2>es -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)<x>-, -S-S-, -C(=O)S-, SC(=O)-, -NR<a>C(=O)-, -C(=O)NR<a>-, -NR<a>C(=O)NR<a>-, -OC(=O)NR<a>- o -NR<a>C(=O)O-, y el otro de L<1>o L<2>es -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)<x>-, -S-S-, -C(=O)S-, SC(=O)-, -NR<a>C(=O)-, -C(=O)NR<a>-, -NR<a>C(=O)NR<a>-, -OC(=O)NR<a>- o -NR<a>C(=O)O- o un enlace directo; G<1>y G<2>son cada uno independientemente alquileno C<1>-C<12>o alquenileno C<1>-C<12>;
[0732] G<3>es alquileno C<1>-C<24>, alquenileno C<1>-C<24>, cicloalquileno C<3>-C<8>, cicloalquenileno C<3>-C<8>;
[0733] R<a>es H o alquilo C<1>-C<12>;
[0734] R<1>y R<2>son cada uno independientemente alquilo C<6>-C<24>o alquenilo C<6>-C<24>;
[0735] R<3>es H, OR<5>, CN, -C(=O)OR<4>, -OC(=O)R<4>o –NR<5>C(=O)R<4>;
[0736] R<4>es alquilo C<1>-C<12>;
[0737] R<5>es H o alquilo C<1>-C<6>; y
[0738] x es 0, 1 o 2.
[0739] En algunas de las realizaciones anteriores de fórmula (III), el lípido tiene una de las siguientes estructuras (IIIA) o (IIIB):
[0741]
[0743] donde:
[0744] A es un anillo cicloalquilo o cicloalquileno de 3 a 8 miembros; R<6>es, en cada caso, independientemente H, OH o alquilo C<1>-C<24>; n es un número entero comprendido entre 1 y 15.
[0745] En algunas de las realizaciones anteriores de fórmula (III), el lípido tiene estructura (IIIA), y en otras realizaciones, el lípido tiene estructura (IIIB).
[0746] En otras realizaciones anteriores de fórmula (III), el lípido tiene una de las siguientes estructuras (IIIC) o (IIID):
[0748] donde y y z son cada uno independientemente números enteros que varían de 1 a 12.
[0749] En cualquiera de las realizaciones anteriores de fórmula (III), una de L<1>o L<2>es -O(C=O)-. Por ejemplo, en algunas realizaciones cada uno de L<1>y L<2>son -O(C=O)-. En algunas realizaciones diferentes de cualquiera de los anteriores, L<1>y L<2>son cada uno independientemente -(C=O)O- o -O(C=O)-. Por ejemplo, en algunas realizaciones cada uno de L<1>y L<2>es -(C=O)O-.
[0750] En realizaciones preferidas del segundo aspecto, el lípido catiónico de la LNP es un compuesto de fórmula III, donde: L<1>y L<2>son cada uno independientemente -O(C=O)- o (C=O)-O-;
[0751] G<3>es alquileno C<1>-C<24>o alquenileno C<1>-C<24>; y
[0752] R<3>es H o OR<5>.
[0753] En algunas realizaciones diferentes de fórmula (III), el lípido tiene una de las siguientes estructuras (IIIE) o (IIIF):
[0756]
[0758] En algunas de las realizaciones anteriores de fórmula (III), el lípido tiene una de las siguientes estructuras (IIIG), (IIIH), (IIII), o (IIIJ):
[0761]
[0763] En algunas de las realizaciones anteriores de fórmula (III), n es un número entero que varía de 2 a 12, por ejemplo de 2 a 8 o de 2 a 4. En algunas realizaciones, n es 3, 4, 5 o 6. En algunas realizaciones, n es 3. En algunas realizaciones, n es 4. En algunas realizaciones, n es 5. En algunas realizaciones, n es 6. En algunas otras de las realizaciones anteriores de fórmula (III), y y z son cada uno independientemente un número entero que varía de 2 a 10. Por ejemplo, en algunas realizaciones, y y z son cada uno independientemente un número entero que varía de 4 a 9 o de 4 a 6. En algunas de las realizaciones anteriores de la fórmula (III), R<6>es H. En otras de las realizaciones anteriores, R<6>es alquilo C<1>-C<24>. En otras realizaciones, R<6>es OH. En algunas realizaciones de fórmula (III), G<3>no está sustituido. En otras realizaciones, G3 está sustituido. En varias realizaciones diferentes, G<3>es alquileno lineal C<1>-C<24>o alquenileno lineal C<1>-C<24>. En algunas otras realizaciones anteriores de fórmula (III), R<1>o R<2>, o ambos, es alquenilo C<6>-C<24>. Por ejemplo, en algunas realizaciones, cada uno de R<1>y R<2>tiene independientemente la siguiente estructura:
[0764] ,
[0765] donde:
[0766] R<7a>y R<7b>son, en cada caso, independientemente H o alquilo C<1>-C<12>; y a es un número entero de 2 a 12, donde R<7a>, R<7b>y a se seleccionan cada uno de modo que R<1>y R<2>comprendan cada uno independientemente de 6 a 20 átomos de carbono. Por ejemplo, en algunas realizaciones a es un número entero comprendido entre 5 y 9 o entre 8 y 12. En algunas de las realizaciones anteriores de fórmula (III), al menos una aparición de R<7a>es H. Por ejemplo, en algunas realizaciones, R<7a>es H en cada aparición. En otras realizaciones diferentes de lo anterior, al menos una aparición de R<7b>es alquilo C<1>-C<8>. Por ejemplo, en algunas realizaciones, alquilo C<1>-C<8>es metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, iso-butilo, terc-butilo, n-hexilo o n-octilo.
[0768] En diferentes realizaciones de fórmula (III), R<1>o R<2>o ambos tienen una de las siguientes estructuras:
[0771]
[0774] En realizaciones preferidas del segundo aspecto, el lípido catiónico de la LNP es un compuesto de fórmula III, donde: L<1>y L<2>son cada uno independientemente -O(C=O)- o (C=O)-O-; y
[0775] R<1>y R<2>tienen cada uno independientemente una de las siguientes estructuras:
[0778]
[0781] En algunas de las realizaciones anteriores de fórmula (III), R<3>es OH, CN, -C(=O)OR<4>, -OC(=O)R<4>o -NHC(=O)R<4>. En algunas realizaciones, R<4>es metilo o etilo.
[0783] En realizaciones preferidas del segundo aspecto, el lípido catiónico de la LNP es un compuesto de fórmula III donde R<3>es OH.
[0785] En una realización particularmente preferida del segundo aspecto, el ARN artificial del primer aspecto y, opcionalmente, el ARN artificial adicional del segundo aspecto, se compleja con uno o más lípidos formando así nanopartículas lipídicas (LNP), donde la LNP se selecciona de las estructuras III-1 a III-36 ( ver Tabla 8).
[0787]
[0788]
[0789]
[0790]
[0791]
[0792]
[0795] En algunas realizaciones, las LNP comprenden un lípido de fórmula (III), un ARN artificial del primer aspecto y, opcionalmente, el ARN artificial adicional del segundo aspecto, y uno o más excipientes seleccionados entre lípidos neutros, esteroides y lípidos PEGilados. En algunas realizaciones, el lípido de fórmula (III) es el compuesto III-3. En algunas realizaciones, el lípido de fórmula (III) es el compuesto III-7.
[0797] En realizaciones preferidas, la LNP comprende un lípido catiónico seleccionado entre:
[0799]
[0800]
[0802] En una realización particularmente preferida del segundo aspecto, el ARN artificial del primer aspecto y, opcionalmente, el ARN artificial adicional del segundo aspecto, se compleja con uno o más lípidos formando así nanopartículas lipídicas (LNP), en donde la LNP comprende el siguiente lípido catiónico (lípido de acuerdo con la fórmula III-3 de la Tabla 8):
[0804]
[0806] En ciertas realizaciones, el lípido catiónico como se define aquí, preferiblemente como se describe en la Tabla 8, más preferiblemente el compuesto lipídico catiónico III-3, está presente en la LNP en una cantidad de aproximadamente 30 a aproximadamente 95 por ciento en moles, con respecto al contenido total de lípidos de la LNP. Si se incorpora más de un lípido catiónico dentro de la LNP, tales porcentajes se aplican a los lípidos catiónicos combinados.
[0807] En una realización, el lípido catiónico está presente en la LNP en una cantidad de aproximadamente 30 a aproximadamente 70 por ciento en moles. En una realización, el lípido catiónico está presente en la LNP en una cantidad de aproximadamente 40 a aproximadamente 60 por ciento en moles, como aproximadamente 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 , 54, 55, 56, 57, 58, 59 o 60 por ciento en moles, respectivamente. En realizaciones, el lípido catiónico está presente en la LNP en una cantidad de aproximadamente 47 a aproximadamente 48 por ciento en moles, tal como aproximadamente 47,0, 47,1, 47,2, 47,3, 47,4, 47,5, 47,6, 47,7, 47,8, 47,9, 50,0 por ciento en moles, respectivamente, siendo 47,7 por ciento en moles particularmente preferido.
[0808] En algunas realizaciones, el lípido catiónico está presente en una proporción de aproximadamente 20 mol% a aproximadamente 70 o 75 mol% o de aproximadamente 45 a aproximadamente 65 mol% o aproximadamente 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o aproximadamente 70 mol% del lípido total presente en la LNP. En realizaciones adicionales, las LNP comprenden de aproximadamente el 25% a aproximadamente el 75% en una base molar de lípido catiónico, por ejemplo de aproximadamente el 20 a aproximadamente el 70%, de aproximadamente el 35 a aproximadamente el 65%, de aproximadamente el 45 a aproximadamente el 65%, aproximadamente 57.5%, aproximadamente 57.1%, aproximadamente 50% o aproximadamente 40% sobre una base molar (basado en el 100% de moles totales de lípido en la nanopartícula lipídica). En algunas realizaciones, la proporción de lípido catiónico a ácido nucleico, preferiblemente al ARN artificial del primer aspecto y, opcionalmente, el ARN artificial adicional del segundo aspecto, es de aproximadamente 3 a aproximadamente 15, tal como de aproximadamente 5 a aproximadamente 13 o de alrededor de 7 a alrededor de 11.
[0809] En algunas realizaciones de la invención, la LNP comprende una combinación o mezcla de cualquiera de los lípidos descritos anteriormente.
[0810] Otros lípidos (catiónicos) adecuados se describen en WO2009/086558, WO2009/127060, WO2010/048536, WO2010/054406, WO2010/088537, WO2010/129709, WO2011/153493, US2011/0256175, US2012/0128760, US2012/0027803, US8158601, WO2016/118724, WO2016/118725, WO2017/070613, WO2017/070620, WO2017/099823, y WO2017/112865.
[0811] En algunas realizaciones, el lípido se selecciona del grupo que consiste en 98N12-5, C12-200 y ckk-E12.
[0812] En algunas realizaciones, los lípidos amino o catiónicos como se definen aquí tienen al menos un grupo protonable o desprotonable, de modo que el lípido está cargado positivamente a un pH igual o inferior al pH fisiológico (por ejemplo, pH 7,4), y neutro a un segundo pH, preferiblemente a un pH fisiológico o superior. Por supuesto, se entenderá que la adición o eliminación de protones en función del pH es un proceso de equilibrio y que la referencia a un lípido cargado o neutro se refiere a la naturaleza de la especie predominante y no requiere que todos de lípidos tienen que estar presentes en forma cargada o neutra. Los lípidos que tienen más de un grupo protonable o desprotonable o que son bipolares no están excluidos y también pueden ser adecuados en el contexto de la presente invención.
[0813] En algunas realizaciones, los lípidos protonables tienen un pKa del grupo protonable en el intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 11, por ejemplo un pKa de aproximadamente 5 a aproximadamente 7. Las LNP pueden comprender dos o más lípidos catiónicos (diferentes). Los lípidos catiónicos se pueden seleccionar para aportar diferentes propiedades ventajosas. Por ejemplo, los lípidos catiónicos que difieren en propiedades como el pKa de amina, la estabilidad química, la vida media en la circulación, la vida media en el tejido, la acumulación neta en el tejido o la toxicidad pueden usarse en la LNP. En particular, los lípidos catiónicos se pueden elegir de modo que las propiedades de la LNP mixta sean más deseables que las propiedades de una LNP única de lípidos individuales. La cantidad del lípido o lipidoide permanentemente catiónico puede seleccionarse teniendo en cuenta la cantidad de carga de ácido nucleico. En una realización, estas cantidades se seleccionan de modo resulten en una proporción N/P de la(s) nanopartícula(s) o de la composición en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 20. En este contexto, la proporción N/P se define como la proporción molar entre los átomos de nitrógeno ("N") de los grupos que contienen nitrógeno básico del lípido o lípido y los grupos fosfato ("P") del ARN que es utilizado como carga. La proporción N/P puede calcularse sobre la base de que, por ejemplo, 1 µg de ARN contiene típicamente aproximadamente 3 nmol de residuos de fosfato, siempre que el ARN muestre una distribución estadística de bases. El valor "N" del lípido o lipidoide puede calcularse sobre la base de su peso molecular y el contenido relativo de grupos catiónicos permanentes y, si están presentes, cationizables.
[0814] Las características y el comportamiento de las LNPin vivose pueden modificar mediante la adición de un recubrimiento de polímero hidrófilo, por ejempl polietilenglicol (PEG), a la superficie de la LNP para conferir estabilización estérica. Además, las LNP se pueden usar para el direccionamiento específico adjuntando ligandos (por ejemplo anticuerpos, péptidos y carbohidratos) a su superficie o al extremo terminal de las cadenas de PEG adjuntadas (por ejemplo, a través de lípidos PEGilados).
[0815] En algunas realizaciones, las LNP comprenden un lípido conjugado con un polímero. El término "lípido conjugado con polímero" se refiere a una molécula que comprende tanto una parte de lípido como una parte de polímero. Un ejemplo de lípido conjugado con un polímero es un lípido PEGilado. El término "lípido PEGilado" se refiere a una molécula que comprende tanto una porción lipídica como una porción de polietilenglicol. Los lípidos PEGilados son conocidos en la técnica e incluyen 1-(monometoxi-polietilenglicol)-2,3-dimiristoilglicerol (PEG-s-DMG) y similares.
[0816] En ciertas realizaciones, la LNP comprende un lípido estabilizador adicional que es un lípido de polietilenglicol (lípido PEGilado). Los polietilenglicol-lípidos adecuados incluyen fosfatidiletanolamina modificada con PEG, ácido fosfatídico modificado con PEG, ceramidas modificadas con PEG (por ejemplo, PEG-CerC14 o PEG-CerC20), dialquilaminas modificadas con PEG, diacilgliceroles modificados con PEG, dialquilgliceroles modificados con PEG. Los lípidos de polietilenglicol representativos incluyen PEG-c-DOMG, PEG-c-DMA y PEG-s-DMG. En una realización, el polietilenglicol-lípido es N-[(metoxi poli(etilenglicol)2000) carbamil]-1,2-dimiristiloxilpropil-3-amina(PEG-c-DMA). En una realización, el polietilenglicol-lípido es PEG-2000-DMG. En una realización, el polietilenglicol-lípido es PEG-c-DOMG). En otras realizaciones, las LNP comprenden un diacilglicerol PEGilado (PEG-DAG) tal como 1-(monometoxipolietilenglicol)-2,3-dimiristoilglicerol (PEG-DMG), una fosfatidiletanoloamina PEGilada (PEG-PE), un diacilglicerol succinato de PEG (PEG-S-DAG) tal como 4-O-(2', 3'-di(tetradecanoiloxi)propil-1-O-(ωmetoxi(polietoxi)etil)butanodioato(PEG-S-DMG), una ceramida PEGilada (PEG-cer), o un dialcoxipropilcarbamato de PEG como ω-metoxi(polietoxi)etil-N-(2,3di(tetradecanoxi)propil)carbamato o 2,3-di(tetradecanoxi)propil-N-(ωmetoxi(polietoxi)etil)carbamato.
[0817] En realizaciones preferidas del segundo aspecto, el ARN artificial del primer aspecto y, opcionalmente, el ARN artificial adicional del segundo aspecto, está complejado con uno o más lípidos formando así nanopartículas lipídicas (LNP), donde la LNP además comprende un lípido PEGilado de fórmula (IV):
[0819]
[0821] (IV)
[0822] o una sal, tautómero o estereoisómero farmacéuticamente aceptable de la misma, donde R<8>y R<9>son cada uno independientemente una cadena de alquilo lineal o ramificada, saturada o insaturada de 10 a 30 átomos de carbono, donde la cadena de alquilo está opcionalmente interrumpida por uno o más enlaces éster; y w tiene un valor medio que varía de 30 a 60.
[0823] En algunas de las realizaciones anteriores del lípido PEGilado de acuerdo con la fórmula (IV), R<8>y R<9>no son ambos n-octadecilo cuando w es 42. En algunas otras realizaciones, R<8>y R<9>son cada uno independientemente una cadena de alquilo lineal o ramificada, saturada o insaturada que contiene de 10 a 18 átomos de carbono. En algunas realizaciones, R<8>y R<9>son cada uno independientemente una cadena de alquilo lineal o ramificada, saturada o insaturada que contiene de 12 a 16 átomos de carbono. En algunas realizaciones, R<8>y R<9>son cada uno independientemente una cadena de alquilo lineal o ramificada, saturada o insaturada que contiene 12 átomos de carbono. En algunas realizaciones, R<8>y R<9>son cada uno independientemente una cadena de alquilo lineal o ramificada, saturada o insaturada que contiene 14 átomos de carbono. En otras realizaciones, R<8>y R<9>son cada uno independientemente una cadena de alquilo lineal o ramificada, saturada o insaturada que contiene 16 átomos de carbono. En aún más realizaciones, R<8>y R<9>son cada uno independientemente una cadena de alquilo lineal o ramificada, saturada o insaturada que contiene 18 átomos de carbono. En aún otras realizaciones, R<8>es una cadena de alquilo lineal o ramificada, saturada o insaturada que contiene 12 átomos de carbono y R<9>es una cadena de alquilo lineal o ramificada, saturada o insaturada que contiene 14 átomos de carbono.
[0825] En varias realizaciones, w abarca un intervalo que se selecciona de modo que la porción de PEG del lípido PEGilado de acuerdo con la fórmula (IV) tenga un peso molecular medio de aproximadamente 400 a aproximadamente 6000 g/mol. En algunas realizaciones, el w promedio es de aproximadamente 50.
[0827] En realizaciones preferidas del segundo aspecto, R<8>y R<9>del lípido PEGilado de acuerdo con la fórmula (IV) son cadenas de alquilo saturadas.
[0829] En una realización particularmente preferida del segundo aspecto, el ARN artificial del primer aspecto y, opcionalmente, el ARN artificial adicional del segundo aspecto, está complejado con uno o más lípidos formando así nanopartículas lipídicas (LNP), en donde la LNP además comprende un lípido PEGilado, donde el lípido PEG es de la fórmula (IVa)
[0831]
[0832] (IVa),
[0833] donde n tiene un valor medio que varía de 30 a 60, tal como aproximadamente 28 a aproximadamente 32, aproximadamente 30 a aproximadamente 34, 32 a aproximadamente 36, aproximadamente 34 a aproximadamente 38, 36 a aproximadamente 40, aproximadamente 38 a aproximadamente 42, 40 a aproximadamente 44, aproximadamente 42 a aproximadamente 46, 44 a aproximadamente 48, aproximadamente 46 a aproximadamente 50, 48 a aproximadamente 52, aproximadamente 50 a aproximadamente 54, 52 a aproximadamente 56, aproximadamente 54 a aproximadamente 58, 56 a aproximadamente 60, aproximadamente 58 a aproximadamente alrededor de 62. En realizaciones preferidas, n es aproximadamente 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54. En una realización más preferida, n tiene un valor medio de 49.
[0835] En otras realizaciones, el lípido PEGilado tiene una de las siguientes estructuras:
[0838]
[0840] donde n es un número entero seleccionado de modo que el peso molecular medio del lípido PEGilado sea aproximadamente 2500 g/mol, con mayor preferencia n es aproximadamente 49.
[0842] En la US2015/0376115A1 y la WO2015/199952 se proporcionan más ejemplos de PEG-lípidos adecuados en ese contexto.
[0843] En algunas realizaciones, las LNP incluyen menos de aproximadamente 3, 2 o 1 por ciento en moles de PEG o lípido modificado con PEG, basado en los moles totales de lípido en la LNP. En realizaciones adicionales, las LNP comprenden de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 20% del lípido modificado con PEG en una base molar, por ejemplo aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10%, aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 5%, aproximadamente 3,5%, aproximadamente 3% , aproximadamente un 2,5%, aproximadamente un 2%, aproximadamente un 1,5%, aproximadamente un 1%, aproximadamente un 0,5% o aproximadamente un 0,3% sobre una base molar (basado en el 100% de moles totales de lípidos en la LNP). En realizaciones preferidas, las LNP comprenden de aproximadamente 1,0% a aproximadamente 2,0% del lípido modificado con PEG en una base molar, por ejemplo aproximadamente 1,2 a aproximadamente 1,9%, aproximadamente 1,2 a aproximadamente 1,8%, aproximadamente 1,3 a aproximadamente 1,8%, aproximadamente 1,4 a aproximadamente 1,8%, aproximadamente 1,5 a aproximadamente 1,8%, aproximadamente 1,6 a aproximadamente 1.8%, en particular aproximadamente 1.4%, aproximadamente 1.5 %, aproximadamente 1.6%, aproximadamente 1,7%, aproximadamente 1,8%, aproximadamente 1,9%, con mayor preferencia 1,7% (basado en el 100% de moles totales de lípidos en la LNP). En varias realizaciones, la proporción molar entre el lípido catiónico y el lípido PEGilado varía de aproximadamente 100:1 a aproximadamente 25:1.
[0844] En realizaciones preferidas, la LNP comprende adicionalmente uno o más lípidos adicionales que estabilizan la formación de partículas durante su formación (por ejemplo, un lípido neutro y/o uno o más esteroides o análogos de esteroides).
[0845] En realizaciones preferidas del segundo aspecto, el ARN artificial del primer aspecto y, opcionalmente, el ARN artificial adicional del segundo aspecto, está complejado con uno o más lípidos formando así nanopartículas lipídicas (LNP), comprendiendo la LNP además uno o más lípidos neutros y/o uno o más esteroides o análogos de esteroides. Los lípidos estabilizadores adecuados incluyen lípidos neutros y lípidos aniónicos. El término "lípido neutro" se refiere a una cualquiera de una serie de especies de lípidos que existen en forma de ion híbrido no cargada o neutra a pH fisiológico. Los lípidos neutros representativos incluyen diacilfosfatidilcolinas, diacilfosfatidiletanolaminas, ceramidas, esfingomielinas, dihidroesfingomielinas, cefalinas y cerebrósidos.
[0846] En realizaciones del segundo aspecto, la LNP comprende adicionalmente uno o más lípidos neutros, seleccionándose el lípido neutro del grupo que comprende diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamina (POPE) y dioleoil-fosfatidiletanolamina 4- (N-maleimidometil) -ciclohexano-1carboxilato (DOPE-mal), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE), diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE), 16-O-monometil PE, 16-O-dimetil PE, 18-1-trans PE, 1-estearioil-2-oleoilfosfatidiletanolamina (SOPE) y 1,2-dielaidoilsn-glicero-3-fosfoetanolamina (transDOPE).
[0847] En algunas realizaciones, las LNP comprenden un lípido neutro seleccionado de DSPC, DPPC, DMPC, DOPC, POPC, DOPE y SM. En varias realizaciones, la proporción molar entre el lípido catiónico y el lípido neutro varía de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 8:1.
[0848] En realizaciones preferidas del segundo aspecto, el lípido neutro es 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC). La proporción molar entre el lípido catiónico y DSPC puede estar en el intervalo de aproximadamente 2:1 a 8:1. En realizaciones preferidas del segundo aspecto, el esteroide es colesterol. La proporción molar entre el lípido catiónico y el colesterol puede estar en el intervalo de aproximadamente 2:1 a 1:1.
[0849] El esterol puede ser de aproximadamente un 10% en moles a aproximadamente un 60% en moles o de aproximadamente un 25% en moles a aproximadamente un 40% en moles de la partícula lipídica. En una realización, el esterol es aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, o aproximadamente 60% en moles del lípido total presente en la partícula lipídica. En otra realización, las LNP incluyen de aproximadamente 5% a aproximadamente 50% en una base molar del esterol, por ejemplo, aproximadamente 15% a aproximadamente 45%, aproximadamente 20% a aproximadamente 40%, aproximadamente 48%, aproximadamente 40%, aproximadamente 38.5%, aproximadamente 35%, aproximadamente el 34.4%, aproximadamente el 31.5% o aproximadamente el 31% sobre una base molar (basado en el 100% de moles totales de lípido en la nanopartícula lipídica).
[0850] Preferiblemente, las nanopartículas lipídicas (LNP) comprenden: (a) al menos un ARN artificial del primer aspecto y, opcionalmente, el ARN artificial adicional del segundo aspecto, (b) un lípido catiónico, (c) un agente reductor de la agregación (tal como un lípido de polietilenglicol (PEG) o un lípido modificado con PEG), (d) opcionalmente un lípido no catiónico (tal como un lípido neutro) y (e) opcionalmente, un esterol.
[0851] En otras realizaciones preferidas, las nanopartículas lipídicas (LNP) comprenden: a) al menos un ARN artificial que codifica F del primer aspecto o un derivado o fragmento del mismo y al menos un ARN artificial que codifica N, M, P o M2-1 del segundo aspecto o un derivado o fragmento del mismo, (b) un lípido catiónico, (c) un agente reductor de la agregación (tal como un lípido - polietilenglicol (PEG) o lípido modificado con PEG), (d) opcionalmente un lípido no catiónico (tal como un lípido neutro) y (e) opcionalmente, un esterol.
[0852] En algunas realizaciones, las LNP comprenden un lípido de fórmula (III), un ARN artificial como se define en este documento, un lípido neutro, un esteroide y un lípido PEGilado. En realizaciones preferidas, el lípido de fórmula (III) es el compuesto lipídico III-3, el lípido neutro es DSPC, el esteroide es colesterol y el lípido PEGilado es el compuesto de fórmula (IVa).
[0853] En una realización preferida del segundo aspecto, la LNP consiste esencialmente en (i) al menos un lípido catiónico; (ii) un lípido neutro; (iii) un esterol, por ejemplo colesterol; y (iv) un PEG-lípido, por ejemplo PEG-DMG o PEG-cDMA, en una proporción molar de aproximadamente 20-60% lípidos catiónicos:5-25% lípidos neutros:25-55% esterol:0,5-15% PEG-lípido.
[0854] En realizaciones particularmente preferidas del segundo aspecto, el ARN artificial del primer aspecto y, opcionalmente, el ARN artificial adicional del segundo aspecto, está complejado con uno o más lípidos formando así nanopartículas lipídicas (LNP), donde la LNP consiste esencialmente en
[0855] (i) al menos un lípido catiónico como se define aquí, preferiblemente un lípido de fórmula (III), más preferiblemente un lípido III-3;
[0856] (ii) un lípido neutro como se define aquí, preferiblemente 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC);
[0857] (iii) un esteroide o análogo de esteroide como se define aquí, preferiblemente colesterol; y
[0858] (iv) un PEG-lípido como se define aquí por ejemplo PEG-DMG o PEG-cDMA, preferiblemente un lípido PEGilado de fórmula (IVa),
[0859] donde (i) a (iv) están en una proporción molar de aproximadamente 20-60% lípido catiónico:5-25% lípidos neutros:25-55% esterol:0,5-15% PEG-lípido.
[0860] En una realización preferida, la nanopartícula lipídica comprende: un lípido catiónico de fórmula (III) y/o un lípido PEG de fórmula (IV), opcionalmente un lípido neutro, preferiblemente 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) y opcionalmente un esteroide, preferiblemente colesterol, donde la proporción molar entre el lípido catiónico y DSPC está opcionalmente en el intervalo de aproximadamente 2:1 a 8:1, donde la proporción molar entre el lípido catiónico y el colesterol está opcionalmente en el intervalo de aproximadamente 2:1 a 1:1.
[0861] En una realización particular preferida, la composición del segundo aspecto que comprende el ARN artificial del primer aspecto y, opcionalmente, el ARN artificial adicional del segundo aspecto, comprende nanopartículas lipídicas (LNP), que tienen una proporción molar de aproximadamente 50:10:38,5:1,5, preferiblemente 47,5:10:40,8:1,7 o más preferiblemente 47,4:10:40,9:1,7 (es decir, proporción (mol%) de lípido catiónico (preferiblemente lípido III-3), DSPC, colesterol y PEG-lípido ((preferiblemente PEG-lípido de fórmula (IVa) con n= 49); solubilizado en etanol).
[0862] En una realización particularmente preferida, la composición del segundo aspecto comprende nanopartículas lipídicas (LNP) que tienen una proporción molar de aproximadamente 50:10:38,5:1,5, preferiblemente 47,5:10:40,8:1,7 o más preferiblemente 47,4:10:40,9:1,7 (es decir, proporción (mol%) de lípido catiónico (preferiblemente lípido III-3), DSPC, colesterol y PEG-lípido ((preferiblemente PEG-lípido de Fórmula (IVa) con n= 49); solubilizado en etanol), donde las nanopartículas lipídicas comprenden al menos un ARN que codifica F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut4 y además nanopartículas lipídicas (LNP), en una proporción molar de aproximadamente 50:10:38,5:1,5, preferiblemente 47,5:10:40,8:1,7 o más preferiblemente 47,4:10:40,9:1,7 (es decir, proporción (mol%) de lípido catiónico (preferiblemente lípido III-3), DSPC, colesterol y PEG-lípido ((preferiblemente PEG-lípido de fórmula (IVa) con n= 49); solubilizado en etanol), donde las nanopartículas lipídicas comprenden al menos un ARN que codifica M, N , M2-1 o P.
[0863] En una realización particularmente preferida, la composición del segundo aspecto comprende nanopartículas lipídicas (LNP) que tienen una proporción molar de aproximadamente 50:10:38,5:1,5, preferiblemente 47,5:10:40,8:1,7 o más preferiblemente 47,4:10:40,9:1,7 (es decir, proporción (mol%) de lípido catiónico (preferiblemente lípido III-3), DSPC, colesterol y PEG-lípido ((preferiblemente PEG-lípido de Fórmula (IVa) con n= 49); solubilizado en etanol), donde las nanopartículas lipídicas comprenden al menos un ARN que codifica F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut4, y al menos un ARN que codifica M, N, M2-1 o P.
[0864] La cantidad total de ARN en las nanopartículas lipídicas puede variar y se define dependiendo de, por ejemplo, la proporción p/p entre el ARN y los lípidos totales. En una realización de la invención, la proporción entre el ARN artificial y los lípidos totales es inferior a 0,06 p/p, preferiblemente entre 0,03 p/p y 0,04 p/p.
[0865] En varias realizaciones, las LNP como se definen aquí tienen un diámetro medio de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 200 nm, de aproximadamente 60 nm a aproximadamente 200 nm, de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 200 nm, de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 200 nm, de aproximadamente 90 nm a aproximadamente 200 nm, de aproximadamente 90 nm a aproximadamente 190 nm, de aproximadamente 90 nm a aproximadamente 180 nm, de aproximadamente 90 nm a aproximadamente 170 nm, de aproximadamente 90 nm a aproximadamente 160 nm, de aproximadamente 90 nm a aproximadamente 150 nm, de aproximadamente 90 nm a aproximadamente 140 nm, de aproximadamente 90 nm a aproximadamente 130 nm, de aproximadamente 90 nm a aproximadamente 120 nm, de aproximadamente 90 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 80 nm o de aproximadamente 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75nm, 80nm, 85nm, 90nm, 95nm, 100nm, 105nm, 110nm, 115nm, 120nm, 125nm, 130nm, 135nm, 140nm, 145nm, 150nm, 160nm, 170nm, 180nm, 190nm o 200nm y son sustancialmente no tóxicas. Tal como se usa aquí, el diámetro medio puede representarse por el promedio z determinado por la dispersión dinámica de luz como se conoce comúnmente en la técnica.
[0866] En otra realización preferida de la invención las nanopartículas lipídicas tienen un diámetro hidrodinámico en el intervalo de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 300 nm, o de aproximadamente 60 nm a aproximadamente 250 nm, de aproximadamente 60 nm a aproximadamente 150 nm, o de aproximadamente 60 nm a aproximadamente 120 nm, respectivamente.
[0867] De acuerdo con realizaciones adicionales, la composición del segundo aspecto puede comprender al menos un adyuvante. De forma adecuada, el adyuvante se añade preferiblemente para mejorar las propiedades inmunoestimuladoras de la composición.
[0868] El término "adyuvante" tal como se usa aquí será reconocido y entendido por el experto en la técnica y, por ejemplo, pretende referirse a un agente farmacológico y/o inmunológico que puede modificar, por ejemplo potenciar, el efecto de otros agentes (en este documento: el efecto del ácido nucleico artificial de la invención) o que pueda ser adecuado para apoyar la administración y liberación de la composición. El término "adyuvante" se refiere a un amplio espectro de sustancias. Normalmente, estas sustancias pueden aumentar la inmunogenicidad de los antígenos. Por ejemplo, los adyuvantes pueden ser reconocidos por el sistema inmunológico innato y, por ejemplo, pueden provocar una respuesta inmune innata (es decir, una respuesta inmune no específica). Los "adyuvantes" normalmente no provocan una respuesta inmunitaria adaptativa. En el contexto de la invención, los adyuvantes pueden potenciar el efecto del péptido o proteína antigénica proporcionada por el ácido nucleico artificial como se define en este documento o la poliproteína como se define aquí.
[0869] En este contexto, el al menos un adyuvante puede seleccionarse de cualquier adyuvante conocido por un experto y adecuado para el presente caso, es decir, apoyando la inducción de una respuesta inmune en un sujeto, por ejemplo en un sujeto humano.
[0870] Por consiguiente, la composición del segundo aspecto puede comprender al menos un adyuvante, donde el al menos un adyuvante puede seleccionarse adecuadamente de cualquier adyuvante proporcionado en la solicitud PCT publicada WO2016/203025. Los adyuvantes descritos en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 17 de la WO2016/203025, preferiblemente los adyuvantes descritos en la reivindicación 17 de la WO2016/203025 son particularmente adecuados.
[0871] a composición del segundo aspecto puede comprender, además de los componentes especificados en este documento, al menos un componente adicional que puede seleccionarse del grupo consistente en otros antígenos (por ejemplo en forma de péptido o proteína) u otros ácidos nucleicos que codifican antígenos; un agente inmunoterapéutico adicional; una o más sustancias auxiliares (citocinas, tales como monoquinas, linfocinas, interleucinas o quimiocinas); o cualquier otro compuesto, conocido como inmunoestimulante debido a su afinidad de unión (como ligando) a los receptores de tipo Toll humanos; y/o un ácido nucleico adyuvante, preferiblemente un ARN inmunoestimulador (un ARN interferente pequeño), por ejemplo CpG-ARN, etc.
[0872] Polipéptido y composición que comprende el polipéptido, no reivindicados
[0873] En un tercer aspecto, la presente descripción proporciona un polipéptido, preferiblemente un polipéptido antigénico, donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos o un fragmento de la misma codificada por el ARN artificial del primer aspecto.
[0874] En realizaciones, el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a cualquiera a las SEQ ID NO: 68, 483, 898, 1267, 1636, 2005, 2374, 2743, 3112, 3481, 3850, 4219, 4588, 4957, 5326, 5695, 6064, 6433, 6802, 7171, 7540, 7909, 11726, 12095, 12464, 12833, 13940, 14309, 14678, 15047, 15416, 15785, 13202, 13571, 16154, 16523, 16892, 17261, 17630, 17999, 18368, 18737, 19106, 19475 o una variante de cualquiera de estos polipéptidos. En realizaciones preferidas, el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 1267, 2005, 2743, 3481, 4219, 4957, 5695, 6433, 7171, 7909, 12833, 14309, 15047, 15785, 13571, 16523, 17261, 17999, 18737, 19475 o una variante de cualquiera de estos polipéptidos.
[0875] En un cuarto aspecto, la descripción se refiere a una composición inmunogénica que comprende el polipéptido del tercer aspecto. En realizaciones preferidas, la composición del cuarto aspecto puede comprender adicionalmente al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable como se define aquí. En realizaciones preferidas, la composición del cuarto aspecto puede comprender además al menos un ARN artificial del primer aspecto y, opcionalmente, al menos un ARN artificial adicional del segundo aspecto, o una composición de ARN del segundo aspecto.
[0876] Vacuna:
[0877] En un quinto aspecto, la presente invención proporciona una vacuna, donde que la vacuna comprende el ARN del primer aspecto y, opcionalmente, la composición del segundo aspecto, el polipéptido del tercer aspecto o la composición del cuarto aspecto.
[0878] En particular, las realizaciones relacionadas con la composición del segundo aspecto o la composición del cuarto aspecto pueden igualmente leerse y entenderse como realizaciones adecuadas de la vacuna del quinto aspecto. Además, las realizaciones relacionadas con la vacuna del quinto aspecto también se pueden leer y entender como realizaciones adecuadas de la composición del segundo aspecto (que comprende el ARN del primer aspecto y, opcionalmente, el ARN artificial adicional del segundo aspecto). o la composición del cuarto aspecto (que comprende el polipéptido del tercer aspecto).
[0879] El término "vacuna" será reconocido y entendido por el experto en la técnica y, por ejemplo, se refiere a un material profiláctico o terapéutico que proporciona al menos un epítopo o antígeno, preferiblemente un inmunógeno. En el contexto de la invención, el antígeno o la función antigénica es proporcionada por el ARN inventivo del primer aspecto (dicho ARN comprende una secuencia codificante que codifica un péptido o proteína antigénica derivada de la proteína F de VSR), la composición del segundo aspecto (que comprende el ARN del primer aspecto y, opcionalmente, el ARN artificial adicional del segundo aspecto), el polipéptido del tercer aspecto o la composición del cuarto aspecto (que comprende dicho polipéptido).
[0880] En realizaciones preferidas del quinto aspecto, la vacuna comprende el ARN del primer aspecto, la composición del segundo aspecto (que comprende el ARN del primer aspecto y, opcionalmente, el ARN artificial adicional del segundo aspecto), el polipéptido del tercer aspecto o la composición del cuarto aspecto, donde dicho ARN, dicha composición del segundo aspecto, dicho polipéptido o dicha composición del cuarto aspecto (que comprende dicho polipéptido) provoca una respuesta inmune adaptativa.
[0881] En realizaciones particularmente preferidas, la vacuna comprende el ARN del primer aspecto o la composición del segundo aspecto, donde dicho ARN o dicha composición provoca una respuesta inmune adaptativa, preferiblemente una respuesta inmune adaptativa contra el VSR.
[0882] En realizaciones particularmente preferidas, la vacuna comprende el ARN del primer aspecto y como se define en las reivindicaciones o la composición del segundo aspecto, donde dicho ARN o dicha composición induce una respuesta inmune de las células T,
[0883] De acuerdo con una realización preferida del quinto aspecto, la vacuna tal como se define aquí puede comprender además un vehículo farmacéuticamente aceptable y opcionalmente al menos un adyuvante tal como se especifica en el contexto del segundo aspecto.
[0884] Los adyuvantes adecuados en ese contexto pueden seleccionarse de los adyuvantes descritos en la reivindicación 17 de WO2016/203025.
[0885] En una realización preferida, la vacuna es una vacuna monovalente
[0886] En realizaciones, la vacuna es una vacuna polivalente que comprende una pluralidad o al menos más de uno de los ARN artificiales como se define en el contexto del primer aspecto y como se define en las reivindicaciones, y, opcionalmente, al menos más de uno de los ARN artificiales adicionales como se define en el contexto de la segundo aspecto. Las realizaciones relativas a una composición polivalente como se describe en el contexto del segundo aspecto pueden igualmente leerse y entenderse como realizaciones adecuadas de la vacuna polivalente del quinto aspecto.
[0887] La vacuna del quinto aspecto comprende típicamente una cantidad segura y eficaz del ARN como se define en las reivindicaciones y, opcionalmente, el ARN adicional del segundo aspecto. Tal como se usa aquí, "cantidad segura y eficaz" significa una cantidad de ARN que es suficiente para inducir significativamente una modificación positiva de una enfermedad o trastorno relacionado con una infección por VSR. Al mismo tiempo, una "cantidad segura y eficaz" es lo suficientemente pequeña como para evitar efectos secundarios graves. En relación con la vacuna o composición de la presente invención, la expresión "cantidad segura y eficaz" significa preferiblemente una cantidad de ARN que es adecuada para estimular el sistema inmunológico adaptativo de tal manera que no se logren reacciones inmunes excesivas o dañinas, pero, preferiblemente, tampoco tales reacciones inmunes por debajo de un nivel medible.
[0888] Una "cantidad segura y eficaz" del ARN de la composición o vacuna como se define anteriormente variará además en relación con la afección particular a tratar y también con la edad y la condición física del paciente a tratar, la gravedad de la afección, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia acompañante, del vehículo particular farmacéuticamente aceptable utilizado y factores similares, dentro del conocimiento y la experiencia del médico acompañante. Además, la "cantidad segura y eficaz" del ARN, la composición, la vacuna puede depender de la vía de administración (intradérmica, intramuscular), del dispositivo de aplicación (inyección a chorro, inyección con aguja, parche de microagujas) y/o la complejación (complejación de protamina o encapsulación de LNP). Además, la "cantidad segura y eficaz" del ARN artificial, la composición, la vacuna pueden depender de la condición del sujeto tratado (lactante, mujeres embarazadas, sujeto humano inmunodeprimido, etc.). Por consiguiente, la "cantidad segura y eficaz" adecuada debe adaptarse en consecuencia y será elegida y definida por el experto en la técnica.
[0890] La vacuna se puede usar de acuerdo con la invención para fines médicos humanos y también para fines médicos veterinarios (mamíferos, vertebrados, especies de aves), como composición farmacéutica o como vacuna.
[0892] En una realización preferida, el ARN, la composición (que comprende dicho ARN y, opcionalmente, otro ARN), el polipéptido, la composición (comprendiendo dicho polipéptido) o la vacuna se proporciona en forma liofilizada (usando, por ejemplo, métodos de liofilización como se describen en WO2016/165831, WO2011/069586, WO2016/184575 o WO2016/184576). Preferiblemente, el ARN liofilizado, la composición liofilizada, el polipéptido liofilizado, la composición liofilizada que comprende el polipéptido o la vacuna liofilizada se reconstituye en una solución tampón adecuada, ventajosamente basada en un vehículo acuoso, antes de la administración, por ejemplo solución de Ringer-Lactato o solución tampón fosfato.
[0894] Así, el vehículo farmacéuticamente aceptable como se usa aquí incluye preferiblemente la base líquida o no líquida de la vacuna de la invención. Si la vacuna de la invención se proporciona en forma líquida, el vehículo será agua, típicamente agua libre de pirógenos; soluciones salinas isotónicas o tampón (acuosas), por ejemplo soluciones tampón fosfato, citrato, etc. Preferiblemente, la solución de Ringer-Lactato se usa como base líquida para la vacuna o la composición de acuerdo con la invención como se describe en WO2006/122828.
[0896] La elección de un vehículo farmacéuticamente aceptable como se define aquí está determinada, en principio, por la forma en que se administra la o las composiciones farmacéuticas o la vacuna de acuerdo con la invención. La vacuna se puede administrar, por ejemplo, sistémica o localmente. Las vías para la administración sistémica en general incluyen, por ejemplo, las vías transdérmica, oral, parenteral, incluyendo las vías de administración subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intradérmica e intraperitoneal y/o intranasal. Las vías de administración local en general incluyen, por ejemplo, vías de administración tópica pero también inyecciones intradérmicas, transdérmicas, subcutáneas o intramusculares o inyecciones intralesionales, intracraneales, intrapulmonares, intracardiales, intraarticulares y sublinguales. Más preferiblemente, la composición o las vacunas de acuerdo con la presente invención pueden administrarse vía intradérmica, subcutánea o intramuscular, preferiblemente por inyección, que puede ser sin aguja y/o inyección con aguja. Por tanto, las composiciones/vacunas se formulan preferiblemente en forma líquida o sólida. La cantidad adecuada de vacuna o composición de acuerdo con la invención a administrar se puede determinar mediante experimentos de rutina, por ejemplo utilizando modelos animales. Dichos modelos incluyen, sin que ello implique limitación alguna, modelos de conejo, oveja, ratón, rata, perro y primates no humanos. Las formas de dosis unitarias preferidas para inyección incluyen soluciones estériles de agua, solución salina fisiológica o mezclas de las mismas. El pH de tales soluciones debe ajustarse a aproximadamente 7,4. Los vehículos adecuados para la inyección incluyen hidrogeles, dispositivos de liberación controlada o retardada, ácido poliláctico y matrices de colágeno. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados para la aplicación tópica incluyen aquellos adecuados para su uso en lociones, cremas, geles y similares. Si la composición o vacuna de la invención se va a administrar vía oral, las tabletas, cápsulas y similares son la forma de dosis unitaria preferida. Los vehículos farmacéuticamente aceptables para la preparación de formas de dosis unitarias que pueden usarse para la administración oral son bien conocidos en la técnica. Su elección dependerá de consideraciones secundarias tales como el sabor, los costes y la capacidad de almacenamiento, que no son críticas para los fines de la presente invención y pueden ser realizadas sin dificultad por un experto en la técnica.
[0898] La vacuna o composición de la invención tal como se define aquí puede contener adicionalmente una o más sustancias auxiliares tal como se definieron anteriormente para aumentar aún más la inmunogenicidad. Con ello se consigue preferiblemente una acción sinérgica del ácido nucleico contenido en la composición de la invención y de una sustancia auxiliar, que opcionalmente se puede co-formular (o formular por separado) con la vacuna o composición de la invención como se describe anteriormente. Dichos agentes o compuestos que aumentan la inmunogenicidad pueden proporcionarse por separado (no formularse junto con la vacuna o composición de la invención) y administrarse individualmente.
[0899] Otros aditivos que pueden incluirse en la vacuna o composición inventiva son emulsionantes, por ejemplo Tween; agentes humectantes, por ejemplo lauril sulfato de sodio; agentes colorantes; agentes que imparten sabor, vehículos farmacéuticos; agentes formadores de comprimidos; estabilizadores; antioxidantes; conservantes.
[0900] Kit o kit de partes, aplicación, usos médicos, método de tratamiento:
[0901] En un sexto aspecto, la presente invención proporciona un kit o kit de partes, donde el kit o kit de partes comprende el ARN del primer aspecto, la composición del segundo aspecto (que comprende dicho ARN), el polipéptido del tercer aspecto, la composición del cuarto aspecto (que comprende dicho polipéptido) y/o la vacuna del quinto aspecto, tal como se define en las reivindicaciones, comprendiendo opcionalmente un vehículo líquido para solubilizar y opcionalmente instrucciones técnicas que proporcionan información sobre la administración y dosificación de los componentes.
[0902] En una realización preferida, el kit del sexto aspecto comprende al menos los siguientes componentes
[0903] a) al menos un ARN del primer aspecto tal como se define en las reivindicaciones, donde dicho ARN artificial preferiblemente está complejado con uno o más lípidos formando así nanopartículas lipídicas (LNP); y b) al menos uno, dos o tres ARN artificiales adicionales que codifican un péptido o una proteína antigénica derivada de VSR seleccionada entre M, N, M2-1 o P (secuencias de ARN seleccionadas preferiblemente de la Tabla 7A), donde dicho ARN adicional preferiblemente está complejado con uno o más lípidos formando así nanopartículas lipídicas (LNP), donde los componentes a) y b) se proporcionan como entidades separadas o como una única entidad, donde el kit de la invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
[0904] En una realización preferida, el kit del sexto aspecto comprende al menos los siguientes componentes
[0905] a) al menos un ARN del primer aspecto como se define en las reivindicaciones, que codifica preferiblemente al menos un péptido o proteína antigénica derivada de una proteína de fusión (F) de RSV (secuencias de ARN seleccionadas preferiblemente de la Tabla 5 o 6), donde dicho ARN artificial preferiblemente está complejado con uno o más lípidos formando así nanopartículas lipídicas (LNP); y
[0906] b) al menos un ARN artificial adicional que codifica un péptido antigénico o una proteína derivada del VSR seleccionada entre M (secuencias de ARN seleccionadas preferiblemente de la Tabla 7A, Columna A), donde dicho ARN adicional preferiblemente está complejado con uno o más lípidos formando así nanopartículas lipídicas (LNP); y
[0907] c) al menos un ARN artificial adicional que codifica un péptido antigénico o una proteína derivada de VSR seleccionada de P (secuencias de ARN seleccionadas preferiblemente de la Tabla 7A, Columna C), donde dicho ARN adicional preferiblemente está complejado con uno o más lípidos formando así nanopartículas lipídicas (LNP), donde los componentes a) b) y c) se proporcionan como entidades separadas o como una sola entidad, donde el kit es como se define en las reivindicaciones adjuntas.
[0908] En una realización preferida, el kit del sexto aspecto tal como se define en las reivindicaciones comprende al menos los siguientes componentes
[0909] a) al menos un ARN del primer aspecto como se define en las reivindicaciones, que codifica preferiblemente al menos un péptido o proteína antigénica derivada de una proteína de fusión (F) de RSV (secuencias de ARN seleccionadas preferiblemente de la Tabla 5 o 6), donde dicho ARN artificial preferiblemente está complejado con uno o más lípidos formando así nanopartículas lipídicas (LNP); y
[0910] b) al menos un ARN artificial adicional que codifica un péptido o una proteína antigénica derivada de VSR seleccionada de M (secuencias de ARN seleccionadas preferiblemente de la Tabla 7A, Columna A), donde dicho ARN adicional preferiblemente está complejado con uno o más lípidos formando así nanopartículas lipídicas (LNP); y
[0911] c) al menos un ARN artificial adicional que codifica un péptido o una proteína antigénica derivada de VSR seleccionada de P (secuencias de ARN seleccionadas preferiblemente de la Tabla 7A, Columna C), donde dicho ARN adicional preferiblemente está complejado con uno o más lípidos formando así nanopartículas lipídicas (LNP); y
[0912] d) al menos un ARN artificial adicional que codifica un péptido o una proteína antigénica derivada de VSR seleccionada de P (secuencias de ARN seleccionadas preferiblemente de la Tabla 7A, Columna B), donde dicho ARN adicional preferiblemente está complejado con uno o más lípidos formando así nanopartículas lipídicas (LNP), donde los componentes a), b), c) y d) se proporcionan como entidades separadas o como una sola entidad, donde el kit de la invención está definido en las reivindicaciones adjuntas.
[0913] El kit puede comprender además componentes adicionales como se describe en el contexto de la composición del segundo aspecto, el polipéptido del tercer aspecto, la composición del cuarto aspecto y/o la vacuna del quinto aspecto. Las instrucciones técnicas de dicho kit pueden contener información sobre la administración y dosis y grupos de pacientes. Dichos kits, preferiblemente kits de partes, pueden aplicarse, por ejemplo, para cualquiera de las aplicaciones o usos mencionados en este documento, preferiblemente para el uso del ARN del primer aspecto, la composición del segundo aspecto, el polipéptido del tercer aspecto, la composición del cuarto aspecto o la vacuna del quinto aspecto, para el tratamiento o la profilaxis de una infección o enfermedades causadas por VSR o trastornos relacionados con el mismo. Preferiblemente, el ARN del primer aspecto, la composición del segundo aspecto, el polipéptido del tercer aspecto, la composición del cuarto aspecto o la vacuna del quinto aspecto se proporciona en una parte separada del kit, donde el ARN del primer aspecto, la composición del segundo aspecto, el polipéptido del tercer aspecto, la composición del cuarto aspecto o la vacuna del quinto aspecto está preferiblemente liofilizada. El kit puede contener además como una parte un vehículo (por ejemplo una solución tampón) para solubilizar el ARN del primer aspecto, la composición del segundo aspecto, el polipéptido del tercer aspecto, la composición del cuarto aspecto o la vacuna del quinto aspecto.
[0914] En realizaciones preferidas, el kit o kit de partes como se define aquí comprende una solución lactato de Ringer. Cualquiera de los kits anteriores puede usarse en un tratamiento o profilaxis como se define en este documento. Más preferiblemente, cualquiera de los kits anteriores puede usarse como vacuna, preferiblemente una vacuna contra infecciones causadas por VSR como se define aquí.
[0915] Uso médico:
[0916] En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al primer uso médico del ARN del primer aspecto, la composición del segundo aspecto, la vacuna del quinto aspecto o el kit o kit de partes del sexto aspecto, todos ellos definidos en las reivindicaciones.
[0917] Así, el ARN del primer aspecto, la composición del segundo aspecto, la vacuna del quinto aspecto o el kit o kit de partes del sexto aspecto es para su uso como medicamento, tal como se define en las reivindicaciones.
[0918] Además, la presente invención proporciona varias aplicaciones y usos del ARN del primer aspecto, la composición del segundo aspecto, la vacuna del quinto aspecto o el kit o kit de partes del sexto aspecto, todos ellos definidos en las reivindicaciones.
[0919] En particular, dicho ARN, dicha composición (que comprende dicho ARN), dicha vacuna o el kit o kit de partes se puede utilizar con fines médicos humanos y también con fines médicos veterinarios, preferiblemente con fines médicos humanos.
[0920] En particular, dicho ARN, dicha composición (que comprende dicho ARN), la vacuna o el kit o kit de partes pueden ser para su uso como un medicamento para fines médicos humanos, donde dicho ARN, la composición (que comprende dicho ARN), la vacuna o el kit o kit de partes pueden ser particularmente adecuados para lactantes pequeños, recién nacidos, receptores inmunodeprimidos, así como mujeres embarazadas y lactantes y ancianos.
[0921] En aún otro aspecto, la presente invención se refiere al segundo uso médico del ARN del primer aspecto, la composición del segundo aspecto, la vacuna del quinto aspecto o el kit o kit de partes del sexto aspecto tal como se definen en las reivindicaciones.
[0922] Así, el ARN del primer aspecto, la composición del segundo aspecto, la vacuna del quinto aspecto o el kit o kit de partes del sexto aspecto son para su uso en el tratamiento o la profilaxis de una infección con un patógeno (por ejemplo, un virus), en particular por el virus sincitial respiratorio (VSR), o un trastorno relacionado con dicha infección, tal como se define en las reivindicaciones.
[0923] En particular, el ARN del primer aspecto, la composición del segundo aspecto, la vacuna del quinto aspecto o el kit o kit de partes del sexto aspecto, todos ellos como se definen en las reivindicaciones, pueden usarse en el tratamiento o la profilaxis de una infección con un virus, en particular con VSR, o un trastorno relacionado con dicha infección para humanos y también para fines médicos veterinarios, preferiblemente para fines médicos humanos, tal como se define en las reivindicaciones.
[0924] En particular, dicho ARN, composición (que comprende dicho ARN), vacuna o kit o kit de partes como se definen en las reivindicaciones pueden ser particularmente adecuados para lactantes pequeños, recién nacidos, receptores inmunodeprimidos, así como a mujeres embarazadas y en período de lactancia y ancianos para su uso en el tratamiento o profilaxis de una infección por VSR.
[0925] Tal como se usa aquí, "un trastorno relacionado con una infección por VSR" puede comprender preferiblemente un síntoma típico o una complicación de una infección por VSR.
[0926] En particular, el ARN artificial del primer aspecto, la composición del segundo aspecto, la vacuna del quinto aspecto o el kit o kit de partes del sexto aspecto tal como se definen en las reivindicaciones se pueden utilizar en un método de profilaxis (profilaxis preexposición o profilaxis posexposición) y/o tratamiento terapéutico de infecciones causadas por VSR.
[0927] Preferiblemente, la composición o la vacuna como se definen aquí se pueden administrar localmente. En particular, la composición o las vacunas se pueden administrar vía intradérmica, subcutánea, intranasal o intramuscular. Por tanto, las composiciones o vacunas de la invención se formulan preferiblemente en forma líquida (o algunas veces sólida). En realizaciones, la vacuna de la invención puede administrarse mediante inyección con aguja convencional o inyección a chorro sin aguja. En ese contexto, se prefiere el ARN, la composición, la vacuna se administra mediante inyección con aguja intramuscular.
[0928] El término "inyección a chorro", como se usa en este documento, se refiere a un método de inyección sin aguja donde un fluido (vacuna, composición de la invención) que contiene por ejemplo, al menos un ARN del primer aspecto, se fuerza a través de un orificio, generando así una corriente de líquido ultrafino de alta presión que es capaz de penetrar la piel de los mamíferos y, dependiendo de los ajustes de inyección, el tejido subcutáneo o el tejido muscular. En principio, la corriente de líquido perfora la piel, a través de la cual la corriente de líquido se introduce en el tejido objetivo. Preferiblemente, la inyección a chorro se usa para la inyección intradérmica, subcutánea o intramuscular del ARN, las composiciones y las vacunas aquí descritas.
[0929] En realizaciones, el ARN comprendido en una composición o vacuna como se define aquí se proporciona en una cantidad de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 500 µg, en una cantidad de aproximadamente 1 µg a aproximadamente 200 µg, en una cantidad de aproximadamente 1 µg a aproximadamente 100 µg, en una cantidad de aproximadamente 5 µg a aproximadamente 100 µg, preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 10 µg a aproximadamente 50 µg, específicamente, en una cantidad de aproximadamente 5 µg, 10 µg, 15 µg, 20 µg, 25 µg, 30 µg, 35 µg, 40 µg, 45 µg, 50 µg, 55 µg, 60 µg, 65 µg, 70 µg, 75 µg, 80 µg, 85 µg, 90 µg, 95 µg o 100 µg.
[0930] Dependiendo de la vía de administración (intradérmica, intramuscular, intranasal), dispositivo de administración (inyección a chorro, inyección con aguja, parche de microagujas) y/o complejación (preferiblemente encapsulación en LNP), la cantidad adecuada debe adaptarse en consecuencia y será elegida y definida por los expertos.
[0931] El protocolo de inmunización para el tratamiento o la profilaxis de una infección como se define aquí, es decir, la inmunización de un sujeto contra un VSR, típicamente comprende una serie de dosis o dosis únicas de la composición o la vacuna. Una dosis única, como se usa aquí, se refiere a la dosis inicial/primera, una segunda dosis o cualquier dosis adicional, respectivamente, que se administran preferiblemente para "reforzar" la reacción inmunitaria.
[0932] En una realización, el protocolo de inmunización para el tratamiento o la profilaxis de una infección como se define aquí, es decir, la inmunización de un sujeto contra un VSR, comprende dosis únicas de la composición o la vacuna. En realizaciones preferidas, el protocolo de inmunización para la profilaxis de una infección por VSR comprende al menos una dosis única de la composición o la vacuna como se define aquí, donde dicha al menos una dosis única se administra a una mujer embarazada para la inmunización materna, logrando así la inmunización del feto y/o donde dicha al menos una dosis única se administra a una mujer lactante para lograr así la inmunización pasiva del niño amamantado.
[0933] El tratamiento o profilaxis como se definió anteriormente puede comprender la administración de un ingrediente farmacéutico activo adicional. En el caso de la vacuna o composición de la invención, que se basa en el ARN artificial del primer aspecto, puede coadministrarse un polipéptido, preferiblemente del tercer aspecto, como ingrediente farmacéutico activo adicional.
[0934] Por ejemplo, al menos una proteína o péptido de VSR como se describe aquí, o un fragmento o variante del mismo, puede coadministrarse para inducir o mejorar una respuesta inmune. Además, se pueden administrar dos ARN artificiales distintos del primer aspecto y, opcionalmente, otros ARN del segundo aspecto en diferentes puntos de tiempo, preferiblemente en un escenario de estimulación-impulso, por ejemplo, utilizando una composición que comprende al menos un polipéptido del VSR como vacunación primaria y una composición/vacuna que comprende al menos un ARN artificial del primer aspecto como vacunación de refuerzo.
[0935] De manera adecuada, el tratamiento o profilaxis como se definió anteriormente comprende la administración de un ingrediente farmacéutico activo adicional, donde el ingrediente farmacéutico activo adicional puede ser un agente inmunoterapéutico que puede seleccionarse entre inmunoglobulinas, preferiblemente IgG, anticuerpos monoclonales o policlonales, suero o sueros policlonales, etc., con mayor preferencia inmunoglobulinas dirigidas contra una proteína o péptido de VSR como se define aquí. Preferiblemente, dicho agente inmunoterapéutico adicional puede proporcionarse como un péptido/proteína o puede estar codificado por un ácido nucleico, preferiblemente por un ADN o un ARN, más preferiblemente un ARNm. Tal agente inmunoterapéutico permite proporcionar una vacunación pasiva adicional a la vacunación activa desencadenada por el ARN artificial de la invención o por el polipéptido de la invención.
[0936] Uso médico:
[0937] En otro aspecto, la presente invención se refiere al objeto reivindicado para su uso médico en el tratamiento o la prevención de un trastorno.
[0938] En realizaciones preferidas, la presente invención se refiere al objeto reivindicado para uso médico para tratar o prevenir un trastorno, donde el método comprende aplicar o administrar a un sujeto que lo necesite el ARN del primer aspecto, la composición del segundo aspecto, la vacuna del quinto aspecto o el kit o kit de partes del sexto aspecto, todos ellos definidos en las reivindicaciones.
[0939] En realizaciones preferidas, el trastorno es una infección por el virus sincitial respiratorio (VSR) o un trastorno relacionado con dicha infección.
[0940] En realizaciones preferidas, la presente invención se refiere al uso médico del objeto reivindicado a un método para tratar o prevenir un trastorno, donde el método comprende aplicar o administrar a un sujeto que lo necesite el ARN del primer aspecto, la composición del segundo aspecto, el polipéptido del tercer aspecto, la composición del cuarto aspecto, la vacuna del quinto aspecto o el kit o kit de partes del sexto aspecto, todo como se define en las reivindicaciones, donde el sujeto que lo necesita es preferiblemente un sujeto mamífero. En realizaciones particularmente preferidas, el sujeto mamífero es un sujeto humano, particularmente un bebé, un recién nacido, una mujer embarazada, una mujer lactante, un anciano o un sujeto humano inmunodeprimido.
[0941] En particular, el objeto reivindicado para tal uso médico puede comprender preferiblemente las etapas de:
[0942] a) proporcionar el ARN del primer aspecto, la composición del segundo aspecto, la vacuna del quinto aspecto o el kit o kit de partes del sexto aspecto, tal como se definen en las reivindicaciones;
[0943] b) aplicar o administrar dicho ARN del primer aspecto, composición del segundo aspecto, vacuna del quinto aspecto o kit o kit de partes del sexto aspecto, todos como se definen en las reivindicaciones, a un tejido u organismo; c) opcionalmente, administrar inmunoglobulina (IgG) contra un VSR;
[0944] d) opcionalmente, administrar una sustancia adicional (adyuvante, sustancia auxiliar, antígeno adicional).
[0945] También se describe, pero no se reivindica, un método para la expresión de al menos un polipéptido que comprende al menos un péptido o proteína derivada de un VSR, o un fragmento o variante del mismo, donde el método comprende preferiblemente las siguientes etapas:
[0946] a) proporcionar el ARN del primer aspecto o la composición del segundo aspecto; y
[0947] b) aplicar o administrar dicho ARN o composición a un sistema de expresión (células), un tejido, un organismo. El método puede aplicarse para laboratorio, investigación, diagnóstico, producción comercial de péptidos o proteínas y/o con fines terapéuticos. Además, el método puede llevarse a cabo en el contexto del tratamiento de una enfermedad específica, particularmente en el tratamiento de enfermedades infecciosas, particularmente infecciones por VSR. Asimismo, se describe, pero no se reivindica, el uso del ARN artificial del primer aspecto, la composición del segundo aspecto, el polipéptido del tercer aspecto, la composición del cuarto aspecto, la vacuna del quinto aspecto, o el kit o kit de partes del sexto aspecto preferiblemente con fines diagnósticos o terapéuticos, por ejemplo para la expresión de un péptido o proteína antigénico de VSR codificado, por ejemplo aplicando o administrando dicho ARN, composición que comprende dicho ARN, vacuna que comprende dicho ARN, por ejemplo, a un sistema de expresión libre de células, una célula (por ejemplo, una célula huésped de expresión o una célula somática), un tejido o un organismo. En realizaciones específicas, aplicar o administrar dicho ARN, la composición que comprende dicho ARN, la vacuna que comprende dicho ARN a un tejido u organismo va seguida, por ejemplo, de, por ejemplo, una etapa de obtención de anticuerpos inducidos contra F de VSR, por ejemplo anticuerpos (monoclonales) específicos de F de VSR.
[0948] El uso se puede aplicar para un laboratorio (de diagnóstico), para la investigación, para el diagnóstico, para la producción comercial de péptidos, proteínas o anticuerpos del VSR y/o con fines terapéuticos. El uso puede llevarse a caboin vitro,in vivooex vivo. Además, el uso se puede llevar a cabo en el contexto del tratamiento de una enfermedad específica, particularmente en el tratamiento de una infección por VSR o un trastorno relacionado. En una realización particularmente preferida, la invención proporciona el ARN del primer aspecto, la composición del segundo aspecto, la vacuna del quinto aspecto o el kit o kit de partes del sexto aspecto tal como se definen en las reivindicaciones para su uso como medicamento, para su uso en el tratamiento o la profilaxis, preferiblemente en el tratamiento o la profilaxis de una infección por VSR o un trastorno relacionado, o para uso como vacuna.
[0949] Breve descripción de listas y tablas
[0950] Lista 1:Cepas adecuadas del virus VSR
[0951] Lista 2:Números de acceso adecuados de la proteína NCBI de proteínas de fusión (F) de RSV
[0952] Tabla 1:Diseños preferidos de antígeno de proteína F de VSR
[0953] Tabla 2:Tabla de uso de codones humanos con frecuencias indicadas para cada aminoácido
[0954] Tabla 3A:Secuencias de codificación preferidas que codifican F de VSR (columnas A-J), derivadas de HRSV (A2)Tabla 3B:Secuencias de codificación preferidas que codifican F de VSR (columnas A-J), derivadas de HRSV (Memphis-37)
[0955] Tabla 4A:Secuencias de codificación preferidas que codifican F de VSR (columnas K-V), derivadas de HRSV (A2)Tabla 4B:Secuencias de codificación preferidas que codifican F de VSR (columnas K-V) derivadas de HRSV (Memphis-37)
[0956] Tabla 5A:Constructos de ARNm preferidos que codifican F de VSR (columnas A-J), derivados de HRSV (A2)Tabla 5B:Constructos de ARNm preferidos que codifican F de VSR (columnas A-J), derivadas de HRSV (Memphis-37)
[0957] Tabla 6A:Constructos de ARNm preferidos que codifican F de VSR (columna K- V), derivados de HRSV(A2)Tabla 6B:Constructos de ARNm preferidos que codifican F de VSR (columna K-V), derivados de HRSV(Memphis-37)Tabla 7A:Secuencias codificantes adicionales preferidas y constructos de ARNm de la composición o vacunaTabla 7B:Combinaciones adecuadas de constructos de ARN
[0958] Tabla 8:Compuestos lipídicos representativos derivados de la fórmula (III)
[0959] Tabla 9:Constructos de ARNm utilizados en los presentes ejemplos (ver la sección de Ejemplos)
[0960] Tabla 10:Grupos de animales y calendario de vacunación del Ejemplo 2 (ver sección de Ejemplos)
[0961] Tabla 11:Grupos de animales y calendario de vacunación del Ejemplo 3 (ver sección de Ejemplos)
[0962] Tabla 12:Constructos de ARNm con diferentes combinaciones de UTR del Ejemplo 4 (ver la sección de Ejemplos)Tabla 13:Grupos de animales y calendario de vacunación del Ejemplo 5 (ver sección de Ejemplos)
[0963] Tabla 14:Grupos de animales y calendario de vacunación del Ejemplo 6 (ver sección de Ejemplos)
[0964] Tabla 15:Grupos de animales y calendario de vacunación del Ejemplo 7 (ver sección de Ejemplos)
[0965] Tabla 15:Grupos de animales y calendario de vacunación del Ejemplo 7 (ver sección de Ejemplos)
[0966] Tabla 16:Panorama general de los constructos de ARNm usados en el Ejemplo 8 (ver sección de Ejemplos)Tabla 17:Grupos de animales y calendario de vacunación del Ejemplo 9 (ver sección de Ejemplos)
[0967] Tabla 18:Grupos de animales y calendario de vacunación del Ejemplo 10 (ver sección de Ejemplos)
[0968] Tabla 19:Panorama general de los constructos de ARNm usados en el Ejemplo 11 (ver sección de Ejemplos)Tabla 20:Grupos de animales y calendario de vacunación del Ejemplo 12 (ver sección de Ejemplos)
[0970] Breve descripción de las figuras
[0972] Figura 1:muestra que el ARNm formulado con LNP que codifica la proteína F de RSV (F-del_DSCav1) induce altos títulos de neutralización de virus (VNT) en suero de ratas algodoneras después de vacunas i.m. y i.d. La vacunación con ARNm formulado con protamina solo induce respuestas débiles. Calendario de vacunación ver Tabla 10. En el ejemplo 2 se proporcionan más detalles.
[0973] Figura 2:muestra que el ARNm formulado con LNP que codifica la proteína F del RSV(F-del_DSCav1) reduce la infección por VSR del pulmón en ratas algodoneras después de la vacunación i.m. y i.d. Calendario de vacunación ver Tabla 10. En el ejemplo 2 se proporcionan más detalles.
[0974] Figura 3:muestra los resultados de un análisis de histopatología pulmonar del estudio de provocación con rata algodonera con VSR descrito en el Ejemplo 2. Los animales vacunados con ARNm formulado con LNP no muestran una histopatología pulmonar aumentada/inflamación mejorada después de la exposición viral, en contraste con la vacunación con la vacuna del virus RSV inactivado con formalina. Calendario de vacunación ver Tabla 10. En el ejemplo 2 se proporcionan más detalles.
[0975] Figura 4:muestra que el ARNm formulado con LNP que codifica la proteína F del RSV (F0, F-del, y F-del_DSCav1) induce VNT altos (títulos de neutralización del virus) en el suero de ratas algodoneras después de dos vacunas i.m. Los VNT determinados se realizaron el día 48. Calendario de vacunación ver Tabla 11. En el ejemplo 3 se proporcionan más detalles.
[0976] Figura 5:muestra que el ARNm formulado con LNP que codifica la proteína F del RSV (F0, F-del, y F-del_DSCav1) induce respuestas inmunes humorales específicas en ratas algodoneras contra la proteína F de VSR. El experimento se realizó como se describe en el Ejemplo 3 y los títulos de IgG totales de anticuerpos se determinaron mediante ELISA. Las vacunas de F de VSR (formuladas en LNP) y F de VSR-del (formulada en LNP) inducen títulos más altos de IgG específicas de F de VSR ya después de la vacunación principal (día 28) que los virus vivos. Figura 5a: Los títulos de anticuerpos determinados el día 49; Figura 5b y Figura 5c: títulos de IgG dependientes del tiempo en suero con 10 µg de ARNm (Figura 5b) o 100 µg de ARNm (Figura 5c) que codifica la proteína F de RSV (F, F-del y F-del_DSCav1). Calendario de vacunación ver Tabla 11. En el ejemplo 3 se proporcionan más detalles.
[0977] Figura 6: muestra que el ARNm formulado con LNP que codifica la proteína F del RSV (F0, F-del y F-del_DSCav1) reduce la infección por VSR del pulmón en ratas algodoneras después de vacunación i.m. El experimento se realizó como se describe en el Ejemplo 3. Todos los grupos de animales vacunados con vacunas de ARNm mostraron títulos de virus por debajo del nivel de detección, lo que demuestra la protección de las ratas algodoneras vacunadas en términos de títulos de pulmón viral. En comparación con las vacunas de ARNm, la vacuna basada en virus inactivados con formalina no pudo prevenir los títulos de virus en el pulmón. Calendario de vacunación ver Tabla 11. En el ejemplo 3 se proporcionan más detalles.
[0978] Figura 7:muestra que el ARNm formulado con LNP que codifica la proteína F del RSV (F0, F-del y F-del_DSCav1) reduce los títulos de VSR en la nariz de ratas algodoneras después de la vacunación i.m. El experimento se realizó como se describe en el Ejemplo 3. Todos los grupos de animales vacunados con vacunas de ARNm muestran títulos virales fuertemente reducidos en el tejido nasal en experimentos de infección por provocación viral. En comparación con las vacunas de ARNm, la vacuna basada en virus inactivado con formalina no pudo reducir los títulos de virus nasales. Calendario de vacunación ver Tabla 11. En el ejemplo 3 se proporcionan más detalles.
[0979] Figura 8:muestra los resultados de un análisis de histopatología pulmonar del estudio de provocación con rata algodonera con VSR descrito en el Ejemplo 3. Los animales vacunados con ARNm formulado con LNP no muestran una histopatología pulmonar aumentada/inflamación mejorada después de la exposición viral, en contraste con la vacunación con la vacuna del virus RSV inactivado con formalina. Calendario de vacunación ver Tabla 11. En el ejemplo 3 se proporcionan más detalles.
[0980] Figura 9:muestra que las combinaciones de UTR de acuerdo con la invención aumentan la expresión de la proteína F de VSRin vitro. Se transfectaron células HEK 293T con diferentes constructos de ARNm formulados con lipofectamina, todas las cuales contienen la misma secuencia codificante que codifica F de VSR truncado estabilizado pre-fusión (F-del_DSCav1) pero utilizan diferentes combinaciones de 5 'y 3'-UTR (ver la Tabla 12). La expresión de F de VSD se analizó mediante citometría de flujo. Los valores muestran el % de la señal F de VSR detectada. Valores normalizados al 100% de acuerdo con la expresión del constructo de ARNm de referencia (combinación UTR RPL32/ALB7). El agua para inyección (WFI) sirve como control. N=2. En el ejemplo 4 se proporcionan más detalles.
[0981] Figura 10:muestra que los constructos de ARNm usados que codifican la proteína F de VSR (Figura 10a: F0, F-del, F0_DSCav1, F-del_DSCav1, F_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut2, F_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut3, Fig10b: F0, F-del, F0_DSCav1, F-del_DSCav1, F_DSCav1_mut0, F-del_DSCav1_mut0, F_DSCav1_mut4, F-del_DSCav1_mut4, F_DSCav1_mut5, F-del_DSCav1_mut5) condujeron a una expresión de proteína F de VSR intracelular detectable así como a una expresión de proteína detectable en la superficie celular. Se proporcionan más detalles en la Tabla 16 y el Ejemplo 8.
[0982] Figura 11:muestra que todos los constructos de ARNm formulados con LNP probados que codifican diferentes proteínas RSV F (F0, F0_DSCav1, F_DSCav1_mut3, F_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F-del, F-del_DSCav1, F-del_DSCav1_DSCav1, F-del_DSCav1_DSCav1, F-del_DSCav1_DSCav1, F-del_DSCav1_DSCav1, F-del_DSCav1_DSCav1, F-del_DSCav1_DSCav1 inducen respuestas en ratas algodoneras contra la proteína F de VSR. Los títulos de anticuerpos IgG totales se determinaron mediante ELISA. Calendario de vacunación ver Tabla 17. En el ejemplo 9 se proporcionan más detalles.
[0983] Figura 12:muestra que todas las vacunas de ARNm F VSR formuladas por LNP (F0, F0_DSCav1, F_DSCav1_mut3, F_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F-del, F-del_DSCav1, F-del_DSCav1_mut3, F-delut_DSCav1_mut3, F-delut_DSCav1-mut3-delut_DSCav1_mut2 específicos de la vacuna) indujeron la formación de anticuerpos funcionales específicos de VSR en ratas algodoneras, como lo demuestran los altos títulos de anticuerpos neutralizantes de virus. Calendario de vacunación ver Tabla 17. En el ejemplo 9 se proporcionan más detalles.
[0984] Figura 13:muestra el análisis de histopatología pulmonar del estudio de provocación con rata algodonera contra VSR. Ninguno de los grupos vacunados con ARNm mostró una patología pulmonar mejorada, como es el caso del grupo que fue vacunado usando la vacuna contra el VSR inactivada con formalina. Calendario de vacunación, ver Tabla 17. En el ejemplo 9 se proporcionan más detalles.
[0985] Figura 14:muestra los resultados del análisis de los títulos virales pulmonares (Figura 14a) y de los títulos virales nasales (Figura 14b) en ratas algodoneras desafiadas con el virus VSR. Calendario de vacunación ver Tabla 17. En el ejemplo 9 se proporcionan más detalles.
[0986] Figura 15:muestra que todos los constructos de ARNm formulados por LNP probados que codifican diferentes proteínas RSV F (F-del, F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut0, F-del_DSCav1_mut5, F-del_DSCav1_mut4) inducen respuestas inmunes humorales en ratas algodoneras contra F de VSR . Los títulos de anticuerpos IgG totales se determinaron mediante ELISA. Calendario de vacunación ver Tabla 18. En el ejemplo 10 se proporcionan más detalles.
[0987] Figura 16:muestra que todas las vacunas de ARNm de F de VSR (F-del, F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut0, F-del_DSCav1_mut5, F-del_DSCav1_mut4) formuladas con LNP indujeron la formación de anticuerpos funcionales específicos del VSR en ratas algodoneras como lo demuestran los altos títulos de anticuerpos neutralizantes de virus. Las constructos formulados con LNP para la estabilización previa a la fusión inducen respuestas mayores o comparables que F-del. Calendario de vacunación, ver Tabla 18. En el ejemplo 10 se proporcionan más detalles.Figura 17:muestra el análisis de histopatología pulmonar del estudio de provocación con rata algodonera contra VSR. Ninguno de los grupos vacunados con ARNm mostró una patología pulmonar mejorada, como es el caso del grupo que fue vacunado usando la vacuna contra el VSR inactivada con formalina. Calendario de vacunación, ver Tabla 18. En el ejemplo 10 se proporcionan más detalles.
[0988] Figura 18:muestra los resultados del análisis de los títulos virales pulmonares y de los títulos virales nasales en ratas algodoneras desafiadas con el virus VSR. Calendario de vacunación ver Tabla 18. En el ejemplo 10 se proporcionan más detalles.
[0989] Figura 19:muestra que los constructos de ARNm utilizados que codifican la proteína M de la matriz del VSR la fosfoproteína P, la nucleoproteína N y la proteína M2-1 de la matriz condujeron a una expresión de proteína detectable usando un sistema de lisado de reticulocitos de conejo. Se proporcionan más detalles en la Tabla 19 y el Ejemplo 11.
[0990] Figura 20:muestra los resultados del estudio de inmunogenicidad en ratones (ELISA). Las respuestas inmunes humorales pueden verse en la Figura 20a: IgG anti-F de VSRy en la Figura 20b: IgG2a anti-RSV F. Todos los grupos indujeron respuestas inmunes humorales. En general, los títulos de IgG2a son 10 veces más altos que los de IgG1, lo que indica una respuesta Th1 predominante. Calendario de vacunación ver Tabla 20. En el ejemplo 12 se proporcionan más detalles.
[0991] Figura 21:muestra que se detectaron IgG de antígeno específico en sueros de ratones inmunizados, lo que indica que los constructos de ARNm aplicados son adecuados para inducir respuestas inmunes humorales específicas. Calendario de vacunación ver Tabla 20. En el ejemplo 12 se proporcionan más detalles.
[0992] Figura 22:muestra que todas las vacunas de ARNm formuladas con LNP (F, M+F, P+F, N+F, M2-1+F) indujeron la formación de anticuerpos funcionales específicos de VSR en ratones, como se muestra por títulos altos de anticuerpos neutralizantes de virus. Calendario de vacunación ver Tabla 20. En el ejemplo 12 se proporcionan más detalles.Figura 23:muestra que todas las vacunas que contienen F de VSR, VSR M2-1, o ambos indujeron sorprendentemente una respuesta de células T de memoria residente en tejido (TRM) en el pulmón tras la inmunización intramuscular (Figura 23a). El análisis de esplenocitos reveló que una inmunización con F de VSR y especialmente VSR M2-1 conduce a un aumento de células T CD8+ y CD4+ específicas de antígeno que secretan IFN-y TNF, lo que indica la inducción de una respuesta sistémica de células T además de una respuesta específica de sitio (Figura 23b y Figura 23c).
[0993] Ejemplos
[0994] A continuación, se presentan ejemplos particulares que ilustran diversas realizaciones y aspectos de la invención como se define en las reivindicaciones. Sin embargo, el alcance de la presente invención no estará limitado por las realizaciones específicas descritas en este documento. Las siguientes preparaciones y ejemplos se proporcionan para permitir que los expertos en la técnica comprendan y practiquen más claramente la presente invención. Sin embargo, el alcance de la presente invención no está limitado por las realizaciones ejemplificadas, que se pretende que sean ilustraciones de aspectos individuales de la invención únicamente. De hecho, varias modificaciones de la invención además de las descritas aquí resultarán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior, las figuras adjuntas y los siguientes ejemplos. Tales modificaciones son parte de la invención sólo en cuanto están caracterizadas según las reivindicaciones adjuntas.
[0995] Ejemplo 1: Preparación de constructos y composiciones de ADN y ARNm para experimentos in vitro e in vivoEl presente ejemplo proporciona métodos para obtener el ARN artificial de la invención, así como métodos para generar una composición o una vacuna de la invención.
[0996] 1.1. Preparación de constructos de ADN y ARNm:
[0997] Para los presentes ejemplos, se prepararon secuencias de ADN que codifican diferentes proteínas F de VSR (por ejemplo, F0, F-del, F-del_DSCav1, F-del_DSCav1_mut5, etc.) y se usaron para posteriores reacciones de transcripción de ARN in vitro. Dichas secuencias de ADN se prepararon modificando las secuencias de ADN que codifican de tipo salvaje mediante la introducción de una secuencia de codificación optimizada para G/C (por ejemplo, "cds opt1") para la estabilización. Las secuencias se introdujeron en un vector derivado de pUC19 para comprender secuencias estabilizadoras de 3'-UTR derivadas de una 3'-UTR de un gen seleccionado de secuencias PSMB3, ALB7, alfa-globina, CASP1, COX6B1, GNAS, NDUFA1 y RPS9 y 5'-UTR derivadas de una 5'-UTR de un gen seleccionado de HSD17B4, RPL32, ASAH1, ATP5A1, MP68, NDUFA4, NOSIP, RPL31, SLC7A3, TUBB4B y UBQLN2, que además comprenden un tramo de adenosinas (por ejemplo, 64A o A100), y una estructura de histona-tallo-bucle (hSL) y, opcionalmente, un tramo de 30 citosinas (por ejemplo, C30) como se lista en la Tabla 9.
[0998] Los constructos de ADN plasmídico obtenidos se transformaron y propagaron en bacterias usando protocolos comunes conocidos en la técnica. Eventualmente, los constructos de ADN plasmídico se extrajeron, purificaron y utilizaron para la posterior transcripción de ARN in vitro (ver sección 1.2).
[0999] Alternativamente, los plásmidos de ADN preparados de acuerdo con el párrafo 1 se utilizan como molde de ADN para la amplificación basada en PCR. Eventualmente, los productos de PCR generados se purifican y se utilizan para la posterior transcripción de ARNin vitro(ver sección 1.3.).
[1000] 1.2. Transcripción de ARNin vitroa partir de plantillas de ADN plasmídico:
[1001] Los plásmidos de ADN preparados de acuerdo con el párrafo 1.1 se linealizaron enzimáticamente usando EcoRI o SapI y se usaron para la transcripción in vitro de ARN dependiente de ADN usando la ARN polimerasa T7 en presencia de una mezcla de nucleótidos (ATP/GTP/CTP/UTP) y un análogo de la caperuza (por ejemplo, m7GpppG, m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG)), o m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG)) en condiciones de solución amortiguadora adecuadas. Los constructos de ARNm obtenidos se purificaron usando RP-HPLC (PureMessenger®, CureVac AG, Tübingen, Alemania; WO2008/077592) y se usaron para experimentos in vitro e in vivo. El ARN para el desarrollo clínico (véase el Ejemplo 6) se produce según las buenas prácticas de fabricación actuales, por ejemplo, de acuerdo con WO2016/180430, implementando varias etapas de control de calidad a nivel de ADN y ARN. Las secuencias/constructos de ARN generados se proporcionan en la Tabla 9 con la proteína F codificada y los elementos UTR respectivos indicados en la misma. Además de la información proporcionada en la Tabla 9, se puede derivar información adicional relacionada con las SEQ ID NO de constructos de ARNm específicos a partir de la información proporcionada bajo el identificador <223> proporcionado en el listado de secuencias ST.25.
[1002] Alternativamente, el ADN linealizado EcoRI o SapI se usa para la transcripciónin vitrodel ARN dependiente de ADN usando una ARN polimerasa en presencia de una mezcla de nucleótidos modificada (ATP, GTP, CTP, N(1)-metilpseudouridina (m1Ψ) o pseudouridina (Ψ)) y análogo de cap (m7GpppG, m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG, o m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG) en condiciones de solución tampón adecuadas. Los ARNm modificados con m1Ψ o Ψ obtenidos se purifican usando RP-HPLC (PureMessenger®, CureVac, Tübingen, Alemania; WO2008/077592) y se usan para experimentos adicionales.
[1003] Algunos constructos de ARNm se transcribenin vitroen ausencia de un análogo de cap. La estructura cap (cap1) se añade enzimáticamente usando enzimas de protección como se conoce comúnmente en la técnica. En síntesis, el ARNm transcritoin vitrose protege con un kit de protección de m7G con 2'-O-metiltransferasa para obtener ARNm con cap 1. Los ARNm con cap Cap1 se purifican usando RP-HPLC (PureMessenger®, CureVac, Tübingen, Alemania; WO2008/077592) y se usan para experimentos adicionales.
[1004] 1.3. Transcripción de ARNin vitroa partir de plantillas de ADN amplificadas por PCR:
[1005] Las plantillas de ADN amplificadas por PCR purificadas preparadas de acuerdo con el párrafo 1.1 se transcribenin vitrousando ARN polimerasa de T7 dependiente de ADN en presencia de una mezcla de nucleótidos (ATP/GTP/CTP/UTP) y análogo de cap (m7GpppG) en condiciones de solución tampón adecuadas. Alternativamente, el ADN amplificado por PCR se transcribein vitroutilizando ARN polimerasa de T7 dependiente de ADN en presencia de una mezcla de nucleótidos modificados (ATP, GTP, CTP, N(1)-metilpseudouridina (m1Ψ)) y análogo de cap (m7GpppG) en condiciones de solución tampón adecuadas. Algunos constructos de ARNm se transcribenin vitroen ausencia de un análogo de cap y la estructura cap (cap1) se añade enzimáticamente usando enzimas de protección como se conoce comúnmente en la técnica, por ejemplo, utilizando un kit de protección de m7G con 2'-O-metiltransferasa. Los ARNm obtenidos se purificaron, por ejemplo, usando RP-HPLC (PureMessenger®, CureVac AG, Tübingen, Alemania; WO2008/077592) y se usaron para experimentosin vitroein vivo.
[1007]
[1008]
[1009]
[1011] 1.4. Preparación de una composición de ARNm formulado con LNP:
[1012] Las nanopartículas de lípidos (LNP), los lípidos catiónicos y los lípidos conjugados con polímeros (PEG-lípido) se prepararon y ensayaron esencialmente de acuerdo con los procedimientos generales descritos en WO2015/199952, WO2017/004143 y WO2017/075531. El ARNm formulado con LNP se preparó usando un amino lípido ionizable (lípido catiónico), fosfolípido, colesterol y un lípido PEGilado. Brevemente, el compuesto lipídico catiónico de fórmula III-3, DSPC, colesterol y PEG-lípido de fórmula IVa se solubilizaron en etanol en una proporción molar (%) de aproximadamente 50:10:38,5:1,5 o 47,4:10:40,9:1,7. Se prepararon las LNP que comprendían el compuesto lipídico catiónico de fórmula III-3 y el compuesto PEG-lipídico de fórmula IVa en una proporción de ARNm a lípido total de 0,03-0,04 p/p. El ARNm se diluyó de 0.05 mg/ml a 0,2 mg/ml en solución tampón citrato de 10 mM a 50 mM, pH 4. Se utilizaron bombas de jeringa para mezclar la solución de lípidos etanólica con la solución acuosa de ARNm en una proporción de aproximadamente 1:5 a 1:3 (vol/vol) con tasas de flujo totales superiores a 15 ml/min. A continuación, se eliminó el etanol y se reemplazó la solución tampón externa por una solución tampón PBS que comprendía sacarosa mediante diálisis. Finalmente, las nanopartículas lipídicas se filtraron a través de un filtro estéril de poros de 0,2 um y la composición de ARNm formulada con LNP se ajustó a aproximadamente 1 mg/ml de ARNm total. El tamaño del diámetro de las partículas de las nanopartículas lipídicas fue de 60-90 nm como se determinó mediante dispersión de luz cuasi elástica usando un Malvern Zetasizer Nano (Malvern, Reino Unido). Para otros compuestos lipídicos catiónicos mencionados en la presente especificación, el proceso de formulación es esencialmente similar. La composición de ARNm formulada con LNP obtenida (1 mg/ml de ARNm total) se diluyó hasta la concentración diana deseada usando solución salina antes de la aplicaciónin vivo.
[1013] 1.5. Preparación de una composición de ARNm complejado con protamina:
[1014] Los constructos de ARNm se complejaron con protamina antes de su uso en experimentos de inmunizaciónin vivo. La formulación de ARNm consistía en una mezcla de 50% de ARNm libre y 50% de ARNm complejado con protamina en una proporción en peso de 2:1. Primero, el ARNm se complementó con protamina mediante la adición de una solución de lactato de protamina-Ringer al ARNm. Luego de una incubación de 10 minutos, cuando los complejos se generaron de manera estable, se agregó ARNm libre y se ajustó la concentración final con solución de lactato de Ringer.
[1015] Ejemplo 2: Vacunación de ratas algodoneras con ARNm formulado con LNP que codifica F de VSR y estudio de provocación de VSR en ratas algodoneras
[1016] El presente ejemplo muestra que el ARNm formulado con LNP que codifica F de VSR induce respuestas inmunes fuertes y funcionales en ratas algodoneras.
[1017] Para el desarrollo de vacunas contra el VSR, la rata algodonera es un modelo animal aceptado, especialmente para la infección provocada. Las ratas algodoneras que han recibido preparaciones de vacuna contra el virus VSR inactivado con formalina responden a la infección por VSR con una patología pulmonar mejorada. Esto permite la evaluación de la seguridad de una vacuna en términos de aumento del fenómeno de la enfermedad.
[1018] Para optimizar la respuesta inmune específica del VSR, se prepararon vacunas de ARNm que codifican la proteína F-del_DSCav del VSR estabilizada antes de la fusión, de acuerdo con el Ejemplo 1, formuladas con LNP (ver Ejemplo 1.4.) o con protamina (ver Ejemplo 1.5.) y se aplicaron los días 0 y 28 vía intramuscular (im) o intradérmica (id) con diferentes dosis de ARN como se muestra en la Tabla 10. Los animales de control recibieron una única vacunación el día 0 con 105 ufp de virus VSR/A2 vivo por vía intranasal o dos vacunaciones los días 0 y 28 con virus VSR inactivado con formalina (FI-RSV) por vía intramuscular. Los animales de control adicionales recibieron sólo solución amortiguadora. Para el presente ejemplo, se utilizó una combinación de UTR HSD17B4/ALB7, denominada en el presente documento "i-4".
[1020]
[1022] Determinación de títulos de neutralización de virus:
[1023] El suero se recogió el día 49 y se midieron los títulos de neutralización del virus VSR (VNT) usando una prueba de neutralización por reducción de placa (PRNT). Las muestras de suero diluido se incubaron con VSR/A2 durante 1 hora a temperatura ambiente y se inocularon por duplicado en monocapas de HEp-2 confluentes en placas de 24 pocillos. Después de una hora de incubación a 37 °C en una incubadora de CO<2>al 5%, los pocillos se recubrieron con medio de metilcelulosa al 0.75%. Después de 4 días de incubación, se retiraron las superposiciones y las células se fijaron y tiñeron. Los correspondientes títulos de anticuerpos neutralizantes recíprocos se determinaron en el punto final de reducción del 60% del control del virus.
[1024] Estudio de desafío con ratas algodoneras:
[1025] Los animales vacunados se expusieron por vía intranasal el día 63 con 105 pfu de virus VSR/A2 vivo en 100 µl. Un grupo de control permaneció sin tratamiento ni infectado (grupo 10). Todos los animales se sacrificaron el día 68 y se recogieron tejido nasal y pulmonar.
[1026] Títulos de VSR en los pulmones de ratas algodoneras desafiadas:
[1027] Los pulmones de los animales se recogieron el día 68 (es decir, 5 días después de la exposición intranasal con 105 pfu de virus VSR/A2 vivo) y se cuantificaron los títulos de VSR/A2 en un lóbulo mediante ensayo de placa. Los homogeneizados de pulmón se clarificaron mediante centrifugación y se diluyeron en EMEM. Se infectaron monocapas de HEp-2 confluentes por duplicado con homogeneizados diluidos en placas de 24 pocillos. Después de una hora de incubación a 37°C en una incubadora de CO al 5%, los pocillos se recubrieron con medio de metilcelulosa al 0,75%. Después de 4 días de incubación, se retiraron las superposiciones y se fijaron las células y se tiñeron con violeta cristal al 0,1% durante una hora y luego se enjuagaron y se secaron al aire. Se contaron las placas y los títulos de virus se expresaron como unidades formadoras de placa por gramo de tejido. Los títulos virales se calcularon como media geométrica ± error estándar para todos los animales de un grupo en un momento dado.
[1028] Histopatología pulmonar de ratas algodoneras desafiadas:
[1029] Los pulmones de los animales se recogieron el día 68 (es decir, 5 días después de la exposición intranasal con 10<5>pfu de virus VSR/A2 vivo) y se analizó un lóbulo por histopatología. Los pulmones se diseccionaron e inflaron con formalina amortiguada neutra al 10% hasta su volumen normal y luego se sumergieron en la misma solución fijadora. Después de la fijación, los pulmones se incrustaron en parafina, se seccionaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E). Se evaluaron cuatro parámetros de inflamación pulmonar: peribronquiolitis (infiltración de células inflamatorias alrededor de los bronquiolos), perivasculitis (infiltración de células inflamatorias alrededor de los vasos sanguíneos pequeños), neumonía intersticial (infiltración de células inflamatorias y engrosamiento de las paredes alveolares) y alveolitis (células dentro de los espacios alveolares). Los portaobjetos se puntuaron a ciegas en una escala de gravedad de 0 a 4. Posteriormente, las puntuaciones se convirtieron a una escala de histopatología del 0 al 100%.
[1030] Resultados:
[1031] Como puede verse en la Figura 1, las vacunas de ARNm de F de VSR (F-del_DSCav1) formuladas con LNP inducen la formación de anticuerpos funcionales específicos de VSR en ratas algodoneras, como se muestra por los títulos altos de anticuerpos neutralizantes de virus (grupos 1-4). La vacunación con ARNm formulado con protamina solo induce respuestas débiles.
[1032] Como puede verse en la Figura 2, las vacunas de ARNm de F de VSR (F-del_DSCav1) formuladas con LNP reducen los títulos virales pulmonares en ratas algodoneras expuestas al virus VSR y, por lo tanto, limitan la infección pulmonar por VSR (grupos 1-4). Todos los grupos de animales vacunados con ARNm formulado en vacunas de las LNP mostraron títulos de virus por debajo del nivel de detección de la titulación de virus realizada, demostrando protección de ratas algodoneras vacunadas en términos de títulos virales pulmonares. Por el contrario, las vacunas de ARNm formuladas con protamina (administradas por vía intramuscular) y la vacuna de virus inactivado con formalina redujeron sólo mínimamente el título de virus de pulmón en comparación con el grupo de control de solución amortiguadora.
[1033] Como puede verse en la Figura 3, el análisis de histopatología pulmonar del estudio de desafío con ratas algodoneras con VSR revela diferentes puntuaciones de patología para los diversos grupos de animales. A partir de la histopatología se puede concluir que ninguno de los grupos vacunados con ARNm mostró una patología pulmonar mejorada como es el caso del grupo que fue vacunado usando la vacuna VSR inactivada con formalina. Las puntuaciones patológicas promedio para peribronquiolitis, perivasculitis, neumonía instersticial y alveolitis son mucho más bajas para todos los grupos vacunados con ARNm (grupos 1-6) en comparación con el grupo con VSR inactivado con formalina (grupo 8).
[1034] Ejemplo 3: Vacunación de ratas algodoneras con ARNm formulado con LNP que codifica F de VSR y estudio de provocación de VSR en ratas algodoneras
[1035] El presente Ejemplo muestra que el ARNm formulado con LNP que codifica diferentes antígenos de F de VSR induce respuestas inmunes fuertes y funcionales en ratas algodoneras para constructos de ARNm que tienen la combinación de UTR RPL32/ALB7 (i-2).
[1036] Este experimento comparó ARNm-LNP que codifican tres variantes de F de VSR diferentes: VSR F0 de longitud completa, F de VSR-del truncado y F-del_DSCav1 truncado estabilizado previo a la fusión. Las vacunas de ARNm-LNP se prepararon de acuerdo con el Ejemplo 1. Las ratas algodoneras recibieron dos vacunaciones intramusculares con vacunas de ARNm-LNP los días 0 y 28. Cada dosis comprendía 10 µg o 100 µg de ARNm-LNP. Los animales de control recibieron una única vacunación el día 0 con 105 ufp de virus VSR/A2 vivo por vía intranasal o dos vacunaciones los días 0 y 28 con virus VSR inactivado con formalina (FIRSV) vía intramuscular. Los animales de control adicionales recibieron sólo solución amortiguadora (ver Tabla 11).
[1037] T l 11:r nim l r r m v n i n l m l
[1039]
[1041] Determinación de anticuerpos anti-proteína F de VSR por ELISA:
[1042] Se recogieron muestras de sangre los días 28, 49 y 63 para la determinación de los títulos de anticuerpos anti-F de VSR. Las placas de ELISA se recubren con glicoproteína de fusión de VSR humano recombinante (dominio extracelular de la glicoproteína de fusión de VSR humano (529) fusionada con una etiqueta de polihistidina en el extremo C-terminal, expresada en Baculovirus-Insect Cells, proporcionada como polvo liofilizado). Las placas recubiertas se incuban usando las diluciones de suero dadas. La unión de anticuerpos específicos a la proteína F se detecta usando anticuerpos anti-ratón específicos de isotipo biotinilados en combinación con estreptavidina-HRP (peroxidasa de rábano picante) con sustrato ABTS.
[1043] Determinación de títulos de neutralización de virus:
[1044] El suero se recogió el día 49 y se midieron los títulos de neutralización del virus VSR (VNT) usando una prueba de neutralización por reducción de placa (PRNT). Las muestras de suero diluido se incubaron con VSR/A2 durante 1 hora a temperatura ambiente y se inocularon por duplicado en monocapas de HEp-2 confluentes en placas de 24 pocillos. Después de una hora de incubación a 37 °C en una incubadora de CO<2>al 5%, los pocillos se recubrieron con medio de metilcelulosa al 0,75%. Después de 4 días de incubación, se retiraron las superposiciones y las células se fijaron y tiñeron. Los correspondientes títulos de anticuerpos neutralizantes recíprocos se determinaron en el punto final de reducción del 60% del control del virus.
[1045] Estudio de desafío con ratas algodoneras:
[1046] Los animales vacunados se expusieron por vía intranasal el día 63 con 10<5>pfu de virus VSR/A2 vivo en 100 µl. Un grupo de control permaneció sin tratamiento ni infectado. Todos los animales se sacrificaron el día 68 y se recogieron tejido nasal y pulmonar.
[1047] Títulos de VSR en los pulmones de ratas algodoneras desafiadas:
[1048] Los pulmones de los animales se recogieron el día 68 (es decir, 5 días después de la exposición intranasal con 10<5>pfu de virus VSR/A2 vivo) y se cuantificaron los títulos de VSR/A2 en un lóbulo mediante ensayo de placa como se describió anteriormente.
[1049] Títulos de VSR en tejido nasal de ratas algodoneras desafiadas
[1050] El tejido nasal de los animales se recogió el día 68 (es decir, 5 días después de la exposición intranasal con 10<5>pfu de virus VSR/A2 vivo). Los homogeneizados de la nariz se clarificaron como homogeneizados de pulmón mediante centrifugación y se diluyeron en EMEM. Se infectaron monocapas de HEp-2 confluentes por duplicado con homogeneizados diluidos en placas de 24 pocillos. Después de una hora de incubación a 37°C en una incubadora de CO al 5%, los pocillos se recubrieron con medio de metilcelulosa al 0,75%. Después de 4 días de incubación, se retiraron las superposiciones y se fijaron las células y se tiñeron con violeta cristal al 0.1% durante una hora y luego se enjuagaron y se secaron al aire. Se contaron las placas y los títulos de virus se expresaron como unidades formadoras de placa por gramo de tejido. Los títulos virales se calcularon como media geométrica ± error estándar para todos los animales de un grupo en un momento dado.
[1051] Histopatología pulmonar de ratas algodoneras desafiadas:
[1052] Los pulmones de los animales se recogieron el día 68 (es decir, 5 días después de la exposición intranasal con 105 pfu de virus VSR/A2 vivo) y se analizó un lóbulo por histopatología como se describió anteriormente.
[1053] Resultados:
[1054] Como puede verse en la Figura 4, todas las vacunas de ARNm de F de VSR (F0, F-del, F-del_DSCav1) formuladas con LNP indujeron la formación de anticuerpos funcionales específicos de VSR en ratas algodoneras, como se muestra por los títulos altos de anticuerpos neutralizantes de virus.
[1055] Las Figuras 5a, 5b y 5c muestran que el ARNm formulado con LNP que codifica la proteína F del RSV (F0, F-del, y F-del_DSCav1) induce respuestas inmunes humorales en ratas algodoneras contra la proteína F de VSR. Los títulos de anticuerpos IgG totales se determinaron mediante ELISA. Figura 5a: Los títulos de anticuerpos determinados el día 49; Figura 5b y 5c: títulos de igG dependientes del tiempo en suero con 10 µg de ARNm (Figura 5b) o 100 µg de ARNm (Figura 5c) que codifican la proteína F de RSV (F, F-del y F-del_DSCav1). Con ambas dosis, 10 µg y 100 µg, las vacunas F0 y F-del inducen títulos más altos de IgG específicas de F de VSR ya después de la vacunación principal (día 28) en comparación con la vacunación con el virus vivo. Después de la vacunación de refuerzo, todas las vacunas de ARNm de F de VSR (F0, F-del, F-del_DSCav1) formuladas con LNP probadas inducen respuestas inmunes humorales medidas con ELISA que son más prominentes que las respuestas de las vacunas de control.
[1056] Como puede verse en la Figura 6, las vacunas de ARNm de F de VSR (F0, F-del, F-del_DSCav1) formuladas con LNP redujeron los títulos virales pulmonares en ratas algodoneras expuestas al virus VSR y, por lo tanto, limitan la infección pulmonar por VSR. Todos los grupos de animales vacunados con ARNm formulado en vacunas de las LNP mostraron títulos de virus por debajo del nivel de detección de la titulación de virus realizada. Los resultados demuestran la protección de ratas algodoneras vacunadas en términos de títulos pulmonares virales. Por el contrario, la vacuna de virus inactivado con formalina (FI RSV) redujo sólo mínimamente el título del virus pulmonar en comparación con el grupo de control de solución amortiguadora.
[1057] Como puede verse en la Figura 7, las vacunas de ARNm de F de VSR (F0, F-del, F-del_DSCav1) formuladas con LNP redujeron fuertemente los títulos virales en el tejido nasal de ratas algodoneras desafiadas al virus VSR y, por lo tanto, limitan la infección nasal por VSR. En comparación con las vacunas de ARNm, la vacuna basada en virus inactivado con formalina (FI RSV) no pudo reducir los títulos de virus nasales.
[1058] Como puede verse en la Figura 8, el análisis de histopatología pulmonar del estudio de desafío con ratas algodoneras con VSR revela diferentes puntuaciones de patología para los diversos grupos de animales. A partir de la histopatología se puede concluir que ninguno de los grupos vacunados con ARNm mostró una patología pulmonar mejorada como es el caso del grupo que fue vacunado usando la vacuna VSR inactivada con formalina. Las puntuaciones patológicas promedio para peribronquiolitis, perivasculitis, neumonía instersticial y alveolitis son mucho más bajas para todos los grupos vacunados con ARNm en comparación con el grupo con VSR inactivado con formalina.
[1059] Para mejorar aún más la eficiencia de la vacuna basada en ARNm, se diseñaron varios constructos de ARNm de F de VSR alternativos que albergan diferentes combinaciones de UTR para aumentar potencialmente la eficiencia de traducción del ARNm. Estos constructos de ARNm se probaron como puede verse en el siguiente ejemplo.
[1060] Ejemplo 4: Cribado de expresión in vitro de constructos de ARNm de F de VSR
[1061] El presente ejemplo muestra que las combinaciones de UTR de acuerdo con la invención mejoran fuertemente el rendimiento de expresión de dichos constructos de ARNm en comparación con un constructo de ARNm de referencia (que alberga UTR de RPL32/ALB7) utilizado, por ejemplo, en el Ejemplo 3 (combinación de UTR RPL32/ALB7 (i-2)). Para mejorar aún más el rendimiento de expresión del ARNm de F de VSR, se llevó a cabo un experimento de cribado para identificar combinaciones de UTR ventajosas de acuerdo con la invención. Para determinar el rendimiento de expresión de proteínas de constructos de ARNm de F de VSR que comprenden diferentes combinaciones de UTR, se transfectaron células HEK 293T con diferentes constructos de ARNm formulados con lipofectamina, todas las cuales contienen la misma secuencia codificante que codifica F-del_DSCav1 truncado estabilizado pre-fusión, pero utilizan diferentes 5’ y 3'-UTR (ver la Tabla 12). La expresión de F de VSR se analizó 24h después de la transfección por citometría de flujo.
[1062] Tabla 12:Panorama general de los constructos de ARNm con diferentes combinaciones de UTR usadas en el Ejemplo 4
[1064]
[1065]
[1067] Descripción detallada del análisis de transfección y citometría de flujo:
[1068] Se sembraron células 293T a una densidad de 200000 células/pocillo (200000 células/2 ml) en una placa de 6 pocillos. Cada ARN se complementó con Lipofectamine2000 en una proporción de 1/1,5 (p/v) durante 20 minutos en Opti-MEM. A continuación, se añadieron ARNm lipocomplejados a las células para transfección con 2µg de ARN por pocillo en un volumen total de 500 µl.4 h después del inicio de la transfección, la solución de transfección se cambió por 2000 ul/pocillo de medio completo. Las células se mantuvieron adicionalmente a 37 °C, 5% de CO<2>antes de realizar el análisis FACS.
[1069] 24 horas después de la transfección, se cuantificó la expresión del antígeno de interés mediante análisis FACS usando procedimientos estándar. Brevemente, las células se separaron (Tris HCl 40 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM en H2O; 5 min a TA), se lavaron con PBS y se tiñeron en la superficie con un anticuerpo de ratón contra F de VSR (Millipore, Cat: MAB8262) y un anticuerpo IgG anti-ratón de cabra marcado con fluorescencia (Sigma, Cat: F5262). Las células se resuspendieron en 100 µl de solución amortiguadora PFEA (PBS+FCS al 2%+EDTA 2 mM+NaN3 al 0.01%) y se analizaron usando un BD FACS Canto II. La tinción Live/Dead se realizó con colorante reactivo fluorescente Aqua (Invitrogen).
[1070] Los resultados se compararon con la expresión de un constructo de referencia del Ejemplo 3 que contiene la combinación RPL32/ALB7 UTR (SEQ ID NO: 1612) que se estableció en un nivel del 100%. Los resultados del análisis se muestran en la Figura 9.
[1071] Resultados
[1072] Como puede verse en la Figura 9, los rendimientos de expresión de los constructos de ARNm que comprenden combinaciones de UTR de acuerdo con la invención aumentaron considerablemente en comparación con el constructo que comprende la combinación de UTR de referencia (RPL32/ALB7; i-2).
[1073] Ejemplo 5: Vacunación de ratas algodoneras con ARNm formulado con LNP que codifica F de VSR y estudio de desafío en ratas algodoneras
[1074] En base a los resultados del cribado UTR del Ejemplo 4, en experimentos de vacunación se utilizan constructos de ARNm que tienen combinaciones de UTR para optimizar la expresión de ARNm.
[1075] En este experimento se comparan vacunas de ARNm que codifican F de VSR (F, F-del, o F-del_DSCav1) con diferentes combinaciones de UTR de acuerdo con la invención. Las vacunas de ARNm-LNP se prepararon de acuerdo con el Ejemplo 1. Las ratas algodoneras reciben dos vacunaciones intramusculares con vacunas de ARNm-LNP los días 0 y 28. Cada dosis comprende 2 µg o 10 µg de ARNm-LNP. Los animales de control reciben una única vacuna el día 0 con 10<5>pfu de virus VSR/A2 vivo por vía intranasal o virus VSR inactivado con formalina por vía intramuscular. Los animales de control adicionales reciben sólo solución amortiguadora (ver Tabla 13).
[1076]
[1078] Determinación de respuestas inmunes anti-VSR usando ELISA o PRNT
[1079] La inducción de respuestas inmunes anti-VSR se determina como se describió anteriormente.
[1080] Estudio de desafío con ratas algodoneras
[1081] Los animales vacunados se exponen por vía intranasal el día 63 con 10<5>pfu de virus VSR/A2 vivo en 100 µl. Un grupo de control permaneció sin tratamiento ni infectado. Todos los animales se sacrifican el día 68 y se recogen el tejido nasal y pulmonar.
[1082] Títulos de VSR en los pulmones de ratas algodoneras desafiadas
[1083] Los pulmones de los animales se recogen el día 68 (es decir, 5 días después de la exposición intranasal con 10<5>pfu de virus VSR/A2 vivo) y se cuantifican los títulos de VSR/A2 en un lóbulo mediante ensayo de placa como se describió anteriormente. Además, el número de copias del genoma viral del VSR (midiendo el número de copias del gen RSV NS-1) y los niveles de ARNm de citocinas se determinaron mediante la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (qRT-PCR).
[1084] Títulos de VSR en tejido nasal de ratas algodoneras desafiadas
[1085] El tejido nasal de los animales se recoge el día 68 (es decir, 5 días después de la exposición intranasal con 10<5>pfu de virus VSR/A2 vivo). Los títulos virales se cuantifican como se describió anteriormente. Además, el número de copias del genoma viral del VSR (midiendo el número de copias del gen RSV NS-1) y los niveles de ARNm de citocinas se determinaron mediante la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (qRT-PCR). Histopatología pulmonar de ratas algodoneras desafiadas
[1086] Los pulmones de los animales se recogen el día 68 (es decir, 5 días después de la exposición intranasal con 10<5>pfu de virus VSR/A2 vivo) y se analiza un lóbulo por histopatología como se describió anteriormente.
[1087] Ejemplo 6: Vacunación de ratas algodoneras con ARNm formulado con LNP que codifica F de VSR y estudiode desafío en ratas algodoneras
[1088] En este experimento, se comparan las vacunas de ARNm que codifican F de VSR (F_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut3 (y/o adicionalmente con F_DSCav1_mut0, _mut4, _mut5, _mut6, _mut7, _mut8 y/o F-del_DSCav1_mut0, _mut4, _mut5, _mut6, _mut7, _mut8) Las vacunas de ARNm-LNP se prepararon de acuerdo con el Ejemplo 1. Las ratas algodoneras reciben dos vacunaciones intramusculares con vacunas de ARNm-LNP los días 0 y 28. Cada dosis comprende 2µg o 10µg de ARNm-LNP. Los animales de control reciben una única vacuna el día 0 con 10<5>pfu de virus VSR/A2 vivo por vía intranasal o virus VSR inactivado con formalina por vía intramuscular. Los animales de control adicionales reciben sólo solución amortiguadora (ver Tabla 14).
[1090]
[1092] Determinación de respuestas inmunes anti-VSR usando ELISA o PRNT
[1093] La inducción de respuestas inmunes anti-VSR se determina como se describió anteriormente.
[1094] Estudio de desafío con ratas algodoneras
[1095] Los animales vacunados se exponen por vía intranasal el día 63 con 10<5>pfu de virus VSR/A2 vivo en 100 µl. Un grupo de control permaneció sin tratamiento ni infectado. Todos los animales se sacrifican el día 68 y se recogen el tejido nasal y pulmonar.
[1096] Títulos de VSR en los pulmones de ratas algodoneras desafiadas
[1097] Los pulmones de los animales se recogen el día 68 (es decir, 5 días después de la exposición intranasal con 10<5>pfu de virus VSR/A2 vivo) y se cuantifican los títulos de VSR/A2 en un lóbulo mediante ensayo de placa como se describió anteriormente. Además, el número de copias del genoma viral del VSR (midiendo el número de copias del gen RSV NS-1) y los niveles de ARNm de citocinas se determinaron mediante la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (qRT-PCR).
[1098] Títulos de VSR en tejido nasal de ratas algodoneras desafiadas
[1099] El tejido nasal de los animales se recoge el día 68 (es decir, 5 días después de la exposición intranasal con 10<5>pfu de virus VSR/A2 vivo). Los títulos virales se cuantifican como se describió anteriormente. Además, el número de copias del genoma viral del VSR (midiendo el número de copias del gen RSV NS-1) y los niveles de ARNm de citocinas se determinaron mediante la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (qRT-PCR). Histopatología pulmonar de ratas algodoneras desafiadas
[1100] Los pulmones de los animales se recogen el día 68 (es decir, 5 días después de la exposición intranasal con 10<5>pfu de virus VSR/A2 vivo) y se analiza un lóbulo por histopatología como se describió anteriormente.
[1101] Ejemplo 7: Vacunación de ratas algodoneras con ARNm formulado con LNP que codifica F de VSR y estudio adicional de desafío de VSR en ratas algodoneras
[1102] Para ampliar y optimizar la respuesta inmunitaria específica del VSR, especialmente para aumentar las respuestas inmunitarias dependientes de células T, las vacunas de ARNm que codifican diferentes proteínas del VSR (RSV F (F0, F, F-del, F_DSCav1 F-del_DSCav1 o F_DSCav1mut0-mut8 o F-del_DSCav1mut0-mut8) se preparan de acuerdo con el Ejemplo 1. Para evaluar el efecto de las vacunas únicas o combinadas, estas vacunas se administran solas o en combinación, como se muestra en la Tabla 9. Las ratas algodoneras reciben dos vacunaciones intramusculares (i.m.) con vacunas de ARNm-LNP los días 0 y 28 con 2 µg o 10 µg de ARNm para cada antígeno. Se inmunizan grupos adicionales vía intramuscular (i.m.) con VSR inactivado con formalina y/o RSV/A2 vivo para comparar su inmunogenicidad con las vacunas de ARNm. Los animales de control adicionales reciben sólo solución tampón (ver Tabla 15). Las respuestas inmunitarias específicas de VSR se determinan mediante tinción de Elisa o citocina intracelular (ICS).
[1104] Tabla 15:Grupos de animales del ejemplo 7
[1106]
[1109] Para los experimentos de vacunación del Ejemplo 7, se producen composiciones/vacunas de ARNm polivalente (por ejemplo, grupos 6-10) de acuerdo con los procedimientos descritos en la solicitud PCT WO2017/109134 usando al menos dos plantillas de ADN optimizadas de secuencia diferente (cada una de las cuales se generó como se describe en Ejemplo 1). En síntesis, una mezcla de constructos de ADN (cada uno de las cuales comprende una secuencia de codificación diferente y un promotor T7) se usa como plantilla para la transcripción simultánea de ARNin vitropara generar una mezcla de constructos de ARNm. Posteriormente, la mezcla de ARN obtenida se usa para la copurificación usando RP-HPLC. A continuación, la mezcla de ARN purificada obtenida se formula en LNP (como se describe en la sección 1.4.) Para generar una composición/vacuna de ARN polivalente formulada con LNP.
[1110] Determinación de respuestas inmunes anti-VSR usando ELISA PRNT:
[1111] La inducción de respuestas inmunes anti-RSV se determina como se describió anteriormente, con proteínas o péptidos recombinantes adecuados para su detección.
[1112] Tinción de citocinas intracelulares (ICS):
[1113] Los esplenocitos de ratones vacunados y de control se aíslan de acuerdo con un protocolo estándar. Brevemente, los bazos aislados se trituran a través de un filtro de células y se lavan en PBS/FBS al 1% seguido de lisis de glóbulos rojos. Después de una extensa etapa de lavado con PBS/1% de FBS, se siembran esplenocitos en placas de 96 pocillos (2x10<6>células/pocillo). Al día siguiente, las células se estimulan con un péptido VSR adecuado o un péptido de control irrelevante y 2,5 µg/ml de un anticuerpo anti-CD28 (BD Biosciences) durante 6 horas a 37 °C en presencia de la mezcla de GolgiPlug™/GolgiStop™. (Inhibidores del transporte de proteínas que contienen Brefeldin A y Monensin, respectivamente; BD Biosciences). Después de la estimulación, las células se lavan y se tiñen para detectar citocinas intracelulares utilizando el reactivo Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los siguientes anticuerpos se utilizan para la tinción: CD8-PECy7 (1:200), CD3-FITC (1:200), IL2-PerCP-Cy5.5 (1:100), TNFα-PE (1:100), IFNγ-APC (1:100) (eBioscience), CD4-BD Horizon V450 (1:200) (BD Biosciences) y se incubó con bloque Fcγ diluido 1:100. Aqua Dye se utiliza para distinguir células vivas/muertas (Invitrogen). Las células se recogen utilizando un citómetro de flujo Canto II (Becton Dickinson). Los datos de citometría de flujo se analizan utilizando el software FlowJo (Tree Star, Inc.).
[1114] Estudio de desafío con ratas algodoneras:
[1115] Los animales vacunados se exponen por vía intranasal el día 63 con 10<5>pfu de virus VSR/A2 vivo en 100 µl. Un grupo de control permaneció sin tratamiento ni infectado. Todos los animales se sacrifican el día 68 y se recogen el tejido nasal y pulmonar.
[1116] Estudio de desafío con ratas algodoneras:
[1117] Los animales vacunados se exponen por vía intranasal el día 63 con 10<5>pfu de virus VSR/A2 vivo en 100 µl. Un grupo de control permaneció sin tratamiento ni infectado. Todos los animales se sacrifican el día 68 y se recogen el tejido nasal y pulmonar. El suero se recoge el día 49 y se miden los títulos de neutralización del virus VSR (VNT) usando una prueba de neutralización por reducción de placa (PRNT) como se describe en el Ejemplo 2.
[1118] Títulos de VSR en los pulmones de ratas algodoneras desafiadas:
[1119] Los pulmones de los animales se recogen el día 68 (es decir, 5 días después de la exposición intranasal con 10<5>pfu de virus VSR/A2 vivo) y se cuantifican los títulos de VSR/A2 en un lóbulo mediante ensayo de placa como se describió anteriormente. Además, el número de copias del genoma viral del VSR (midiendo el número de copias del gen RSV NS-1) y los niveles de ARNm de citocinas se determinaron mediante la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (qRT-PCR).
[1120] Títulos de VSR en tejido nasal de ratas algodoneras desafiadas:
[1121] El tejido nasal de los animales se recoge el día 68 (es decir, 5 días después de la exposición intranasal con 10<5>pfu de virus VSR/A2 vivo). Los títulos virales se cuantifican como se describió anteriormente. Además, el número de copias del genoma viral del VSR (midiendo el número de copias del gen RSV NS-1) y los niveles de ARNm de citocinas se determinaron mediante la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (qRT-PCR). Histopatología pulmonar de ratas algodoneras desafiadas:
[1122] Los pulmones de los animales se recogen el día 68 (es decir, 5 días después de la exposición intranasal con 10<5>pfu de virus VSR/A2 vivo) y se analiza un lóbulo por histopatología como se describió anteriormente.
[1123] Ejemplo 8: Expresión de diferentes proteínas F de VSR en células HeLa y análisis por FACS
[1124] Para determinar la expresión de proteínain vitrode los constructos de ARNm, las células HeLa se transfectaron transitoriamente con ARNm que codifica antígenos F de RSV y se tiñeron para VSR fusionando anticuerpos antiproteína F adecuados (producidos en ratón), contrateñidos con un anticuerpo anti-ratón secundario acoplado a FITC (F5262 de Sigma). Se sembraron células HeLa en una placa de 6 pocillos a una densidad de 400.000 células/pocillo en medio de cultivo celular (RPMI, FCS al 10%, L-glutamina al 1%, Pen/Strep al 1%), 24 h antes de la transfección. Las células HeLa se transfectaron con 2 μg de ARNm sin formular usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Los constructos de ARNm preparados de acuerdo con el Ejemplo 1 y enumerados en la Tabla 16 se usaron en el experimento (ver también la Tabla 9), incluyendo un control negativo (agua para inyección).24 horas después de la transfección, las células HeLa se tiñeron con anticuerpos anti-F de VSR adecuados (criados en ratón; 1:500) y anticuerpo secundario marcado con FITC anti-ratón (1:500) y posteriormente se analizaron mediante citometría de flujo (FACS) en un BD FACS Canto II utilizando el software FACS Diva. El análisis cuantitativo de la señal de FITC fluorescente se realizó utilizando el paquete de software FlowJo (Tree Star, Inc.). Las células se tiñeron intracelularmente o alternativamente en la superficie celular. Los resultados se muestran en las Figuras 10a y 10b, que representan dos experimentos independientes diferentes.
[1126]
[1129] Resultados:
[1130] Los resultados muestran que los constructos de ARNm usados condujeron a una expresión de proteína F de VSR intracelular detectable, así como a una expresión de proteína detectable en la superficie celular. Los constructos F de VSR con el C-terminal eliminado (F-del) (por ejemplo, R6940, R5453, R6775, R6774, R6773, R7455, R7457, R7459) muestran un aumento de la expresión de la proteína de la superficie celular en comparación con los constructos F de longitud completa. El constructo que codifica F-del_DSCav1_mut0 (R7455) exhibe la expresión más alta.
[1131] Los resultados ejemplifican que el ARNm de la invención que codifica las proteínas F (F0, F-del, F0_DSCav1, F-del_DSCav1, F_DSCav1_mut0, F-del_DSCav1_mut0, F_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut2, F_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut3, F_DSCav1_mut4, F-del_DSCav1_mut4, F_DSCav1_mut5, F-del_DSCav1_mut5) se traduce en las células y están presentes en la superficie celular, lo cual es un requisito previo para una vacuna contra el VSR basada en ARNm.
[1133] Ejemplo 9: Vacunación de ratas algodoneras con ARNm formulado con LNP que codifica F de VSR y estudio de provocación de VSR en ratas algodoneras
[1135] El presente ejemplo muestra que el ARNm formulado con LNP de acuerdo con la invención que codifica diferentes antígenos de F de VSR estabilizados en pre-fusión induce respuestas inmunes fuertes, funcionales y protectoras en ratas algodoneras.
[1137] Este experimento comparó ARNm-LNP que codifican diferentes variantes de F de VSR estabilizadas en pre-fusión (mut 1, mut2, mut3) con F de longitud completa o con F truncado (F-del). Las vacunas de ARNm-LNP se prepararon de acuerdo con el Ejemplo 1. Las ratas algodoneras recibieron dos vacunaciones intramusculares con vacunas de ARNm-LNP los días 0 y 28. Cada dosis comprendía 100 µg de ARNm-LNP. Los animales de control recibieron una única vacunación el día 0 con 10<5>ufp de virus VSR/A2 vivo vía intranasal o dos vacunaciones los días 0 y 28 con virus VSR inactivado con formalina (FIRSV) por vía intramuscular. Los animales de control adicionales recibieron sólo solución amortiguadora (ver Tabla 17).
[1138] Tabla 17:Grupos de animales y programa de vacunación del ejemplo 9
[1140]
[1142] Determinación de anticuerpos anti-proteína F de VSR por ELISA:
[1143] Se recogieron muestras de sangre los días 0, 28, 49 y 63 para la determinación de los títulos de anticuerpos anti-F de VSR. Se revistieron placas de ELISA con proteína F purificada extraída de células HEp-2 infectadas con VSR/A2 o células HEp-2 infectadas con VSR/B fijadas con metanol/acetona. Las placas recubiertas se incubaron usando las diluciones de suero dadas. La unión de anticuerpos específicos a la proteína F se detectó usando anticuerpos antiratas algodoneras específicas de isotipo en combinación con estreptavidina-HRP (peroxidasa de rábano picante) con sustrato TMB.
[1144] Determinación de títulos de neutralización de virus:
[1145] El suero se recogió los días 0, 28, 49 y 63 y se midieron los títulos de neutralización del virus VSR (VNT) usando una prueba de neutralización por reducción de placa (PRNT). Las muestras de suero diluido se incubaron con VSR/A2 o RSV/B (25-50 PFU) durante 1 hora a temperatura ambiente y se inocularon por duplicado en monocapas de HEp-2 confluentes en placas de 24 pocillos. Después de una hora de incubación a 37 °C en una incubadora de CO<2>al 5%, los pocillos se recubrieron con medio de metilcelulosa al 0,75%. Después de 4 días de incubación, se retiraron las superposiciones y las células se fijaron y tiñeron. Los correspondientes títulos de anticuerpos neutralizantes recíprocos se determinaron en el punto final de reducción del 60% del control del virus.
[1146] Estudio de desafío con ratas algodoneras:
[1147] Los animales vacunados se expusieron por vía intranasal el día 63 con 10<5>pfu de virus VSR/A2 vivo en 100 µl. Un grupo de control permaneció sin tratamiento ni infectado. Todos los animales se sacrificaron el día 68 y se recogieron tejido nasal y pulmonar.
[1148] Títulos de VSR en tejido nasal de ratas algodoneras desafiadas
[1149] El tejido nasal y de los pulmones de los animales se recogió el día 68 (es decir, 5 días después de la exposición intranasal con 10<5>pfu de virus VSR/A2 vivo). Los homogeneizados de la nariz se clarificaron como homogeneizados de pulmón mediante centrifugación y se diluyeron en EMEM. Se infectaron monocapas de HEp-2 confluentes por duplicado con homogeneizados diluidos en placas de 24 pocillos. Después de una hora de incubación a 37°C en una incubadora de CO al 5%, los pocillos se recubrieron con medio de metilcelulosa al 0,75%. Después de 4 días de incubación, se retiraron las superposiciones y se fijaron las células y se tiñeron con violeta cristal al 0.1% durante una hora y luego se enjuagaron y se secaron al aire. Se contaron las placas y los títulos de virus se expresaron como unidades formadoras de placa por gramo de tejido.
[1151] Histopatología pulmonar
[1153] Los pulmones se diseccionaron e inflaron con formalina amortiguada neutra al 10% hasta su volumen normal y luego se sumergieron en la misma solución fijadora. Después de la fijación, los pulmones se incrustaron en parafina, se seccionaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E). Se evaluaron cuatro parámetros de inflamación pulmonar: peribronquiolitis (infiltración de células inflamatorias alrededor de los bronquiolos), perivasculitis (infiltración de células inflamatorias alrededor de los vasos sanguíneos pequeños), neumonía intersticial (infiltración de células inflamatorias y engrosamiento de las paredes alveolares) y alveolitis (células dentro de los espacios alveolares). Los portaobjetos se puntúan a ciegas en una escala de gravedad de 0 a 4. Posteriormente, las puntuaciones se convierten a una escala de histopatología del 0 al 100%.
[1154] Resultados:
[1155] La Figura 11 muestra que todos los constructos de ARNm formulados con LNP probados que codifican diferentes proteínas F de VSR (F0, F0_DSCav1, F_DSCav1_mut3, F_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F-del, F-del_DSCav1, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2) de acuerdo con la invención inducen respuestas inmunes humorales en ratas algodoneras contra la proteína F de VSR. Los títulos de anticuerpos IgG totales se determinaron mediante ELISA.
[1156] Los constructos de ARNm que codifican la F truncada (F-del) (F-del, F-del_DSCav1, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2) indujeron respuestas más altas y más rápidas que los constructos con la secuencia F de longitud completa en d28, no se detecta ninguna diferencia significativa en momentos posteriores. Los constructos estabilizados (F0_DSCav1, F_DSCav1_mut3, F_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2) inicialmente producen títulos de ELISA más bajos que los constructos de tipo salvaje (F0 y F-del). Los niveles no son significativamente diferentes en momentos posteriores.
[1157] Con una dosis de 100 µg, los constructos que codifican la proteína F estabilizada y truncada (F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2) inducen títulos más altos de IgG específicas de F de VSR ya después de la vacunación principal (día 28) en comparación con la vacunación con el virus vivo. Después de la vacunación de refuerzo, todas las vacunas de ARNm de F de F de VSR formuladas con LNP probadas inducen respuestas inmunes humorales medidas con ELISA que son más prominentes que las respuestas de las vacunas de control.
[1158] Como puede verse en la Figura 12 todas las vacunas de ARNm de F de VSR formuladas por LNP (F0, F0_DSCav1, F_DSCav1_mut3, F_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F-del, F-del_DSCav1, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2) indujeron la formación de anticuerpos funcionales específicos de VSR en ratas algodoneras, como lo demuestran los altos títulos de anticuerpos neutralizantes de virus. Los constructos truncados F de VSR formulados por LNP (F-del, F-del_DSCav1, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2) indujeron respuestas más altas y más rápidas que los constructos F de longitud completa. Los constructos para la estabilización pre-fusión de acuerdo con la invención (F_DSCav1_mut3, F_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2) inducen respuestas más altas que F0, F0_DSCav1, F-del, F-del_DSCav1.
[1159] Como puede verse en la Figura 13, el análisis de histopatología pulmonar del estudio de desafío con ratas algodoneras con VSR revela diferentes puntuaciones de patología para los diversos grupos de animales. A partir de la histopatología se puede concluir que ninguno de los grupos vacunados con ARNm mostró una patología pulmonar mejorada como es el caso del grupo que fue vacunado usando la vacuna VSR inactivada con formalina. Las puntuaciones patológicas promedio para peribronquiolitis son más bajas para todos los grupos vacunados con ARNm en comparación con el grupo con VSR inactivado con formalina. Los constructos truncados F de VSR formulados por LNP (F-del, F-del_DSCav1, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2) mostraron en general puntuaciones de patología más bajas que los constructos de longitud completa F. Los constructos para la estabilización pre-fusión de acuerdo con la invención (F_DSCav1_mut3, F_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2) arrojaron mejores respuestas (puntuaciones de patología más bajas) que F0, F0_DSCav1, F-del, F-del_DSCav1.
[1160] Como puede verse en la Figura 14a, todo en este experimento probó las vacunas de ARNm de F de VSR formuladas con LNP que redujeron los títulos virales pulmonares en ratas algodoneras expuestas al virus VSR y, por lo tanto, limitan la infección pulmonar por VSR. Todos los grupos de animales vacunados con ARNm formulado en vacunas de las LNP mostraron títulos de virus por debajo del nivel de detección de la titulación de virus realizada. Los resultados demuestran la protección de ratas algodoneras vacunadas en términos de títulos pulmonares virales. Por el contrario, la vacuna de virus inactivado con formalina (FI RSV) y el control del virus RSV/A2 inactivado por UV redujeron sólo mínimamente el título del virus pulmonar en comparación con el grupo de control de solución amortiguadora.
[1161] Como puede verse en la Figura 14b, las vacunas de ARNm de F de VSR formuladas con LNP redujeron fuertemente los títulos virales en el tejido nasal de ratas algodoneras desafiadas al virus VSR y, por lo tanto, limitan la infección nasal por VSR. En comparación con las vacunas de ARNm, la vacuna basada en virus inactivado con formalina (FI RSV) y el control del virus RSV/A2 inactivado por UV no pudo reducir los títulos de virus nasales. Una protección completa de la nariz solo se logró mediante la estabilización previa a la fusión de acuerdo con la invención (F_DSCav1_mut3, F_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2).
[1162] Para concluir, los resultados muestran que los constructos de ARN formulados con LNP que codifican proteínas truncadas de F de VSR (F-del, F-del_DSCav1, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2) son en general más inmunogénicos que los constructos de ARN que codifican proteínas F de longitud completa. Los constructos que presentan mutaciones de Ds-Cav1 solas (F0_DSCav1 y F-del_DSCav1) son subóptimas como vacuna basada en ARNm en comparación con los constructos que codifican las proteínas F estabilizadas adicionales de acuerdo con la invención (F_DSCav1_mut3, F_DSCav1_mut1, F_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut3, F-del_DSCav1_mut1, F-del_DSCav1_mut2).
[1163] Para mejorar aún más la eficiencia de la vacuna basada en ARNm, se diseñaron varios constructos de ARNm de F de VSR alternativos que albergan mutaciones adicionales que estabilizan la conformación previa a la fusión en combinación con la proteína F-del truncada beneficiosa. Estos constructos de ARNm se probaron como puede verse en el siguiente ejemplo.
[1164] Ejemplo 10: Vacunación de ratas algodoneras con ARNm formulado con LNP que codifica F de VSR y estudio de provocación de VSR en ratas algodoneras
[1165] El presente ejemplo muestra que el ARNm formulado con LNP de acuerdo con la invención que codifica diferentes antígenos de F de VSR estabilizados antes de la fusión induce respuestas inmunes fuertes, funcionales y protectoras en ratas algodoneras.
[1166] Las vacunas de ARNm-LNP se prepararon de acuerdo con el Ejemplo 1. Las ratas algodoneras recibieron una o dos vacunaciones intramusculares con vacunas de ARNm-LNP el día 0 o los días 0 y 28. Cada dosis comprendía 100 µg de ARNm-LNP. Los animales de control recibieron una única vacuna el día 28 con 10<5>pfu de virus VSR/A2 vivo o virus VSR inactivado con formalina (FI:RSV) vía intramuscular. Los animales de control adicionales recibieron sólo solución tampón (ver Tabla 18).
[1167] Tabla 18:Grupos de animales y programa de vacunación del ejemplo 10
[1170]
[1171] 14 no tratado/no infectado
i.m.
[1172] Determinación de anticuerpos anti-proteína F de VSR por ELISA y títulos de neutralización de virus
[1174] Se recolectaron muestras de sangre los días 0, 28, 49 y 63 para la determinación de los títulos de anticuerpos anti-F de VSR y los títulos de neutralización del virus VSR (VNT) medidos usando la prueba de neutralización por reducción de placa (PRNT) como se describió anteriormente (ver Ejemplo 9).
[1176] Estudio de desafío con ratas algodoneras:
[1178] Los animales vacunados se expusieron por vía intranasal el día 63 con 10<5>pfu de virus VSR/A2 vivo en 100 µl. Un grupo de control permaneció sin tratamiento ni infectado. Todos los animales se sacrificaron el día 68 y se recogieron tejido nasal y pulmonar. Los títulos de VSR en tejido nasal de ratas algodoneras expuestas y la histopatología pulmonar se analizan como se describió anteriormente (ver el Ejemplo 9).
[1179] Resultados:
[1180] La Figura 15 muestra que todos los constructos de ARNm formulados por LNP probados que codifican diferentes proteínas RSV F (F-del, F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut0, F-del_DSCav1_mut5, F-del_DSCav1_mut4) de acuerdo con la invención inducen respuestas inmunes humorales en ratas algodoneras contra F de VSR. Los títulos de anticuerpos IgG totales se determinaron mediante ELISA. Los constructos de ARN que codifican proteínas F estabilizadas (F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut0, F-del_DSCav1_mut5, F-del_DSCav1_mut4) inicialmente producen títulos de ELISA más bajos que el constructo que codifica la proteína F de tipo salvaje truncada, F-del. Esta tendencia también es detectable en puntos de tiempo posteriores al usar diluciones de suero más altas para el ELISA (datos no mostrados). La respuesta de IgG puede potenciarse significativamente con una segunda inmunización. Como puede verse en la Figura 16 todas las vacunas de ARNm de F de VSR formuladas por LNP (F-del, F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut0, F-del_DSCav1_mut5, F-del_DSCav1_mut4) indujeron la formación de anticuerpos funcionales específicos de VSR en ratas algodoneras, como lo demuestran los altos títulos de anticuerpos neutralizantes de virus. Los constructos formulados con LNP para la estabilización pre-fusión de acuerdo con la invención (F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut0, F-del_DSCav1_mut5, F-del_DSCav1_mut4) inducen respuestas más altas o comparables que F-del. El constructo de ARN R7457 que codifica la proteína estabilizada prefusión F-del_DSCav1_mut5 induce los VNT más altos (comparables a los mejores resultados inducidos por el mejor constructo estabilizado pre-fusión en el experimento anterior (Ejemplo 9, R6773).
[1181] El análisis de histopatología pulmonar muestra que ninguno de los grupos vacunados con ARNm mostró una patología pulmonar mejorada como es el caso del grupo que fue vacunado con la vacuna contra el VSR inactivada con formalina (ver Figura 17a (para peribronciolitis y perivasculitis) y Figura 17b (para Neumonía y Alveolitis)). Los constructos para la estabilización pre-fusión de acuerdo con la invención (F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut0, F-del_DSCav1_mut5, F-del_DSCav1_mut4) produjeron mejores respuestas (puntuaciones de patología más bajas) que F-del. Los animales que recibieron dos vacunas mostraron una puntuación de patología más baja en comparación con los animales que solo recibieron una vacuna.
[1182] Como puede verse en la Figura 18a, todo en este experimento probó las vacunas de ARNm de F de VSR formuladas con LNP que redujeron los títulos virales pulmonares en ratas algodoneras expuestas al virus VSR y, por lo tanto, limitan la infección pulmonar por VSR. Esto es cierto incluso para los grupos que reciben una sola vacuna. Los resultados demuestran la protección de ratas algodoneras vacunadas en términos de títulos pulmonares virales. Por el contrario, la vacuna de virus inactivado con formalina (FI RSV) redujo sólo mínimamente el título del virus pulmonar en comparación con el grupo de control de solución tampón.
[1183] Como puede verse en la Figura 18b, las vacunas de ARNm de F de VSR formuladas con LNP redujeron fuertemente los títulos virales en el tejido nasal de ratas algodoneras desafiadas al virus VSR y, por lo tanto, limitan la infección nasal por VSR. En comparación con las vacunas de ARNm, la vacuna basada en virus inactivado con formalina (FI RSV) no pudo reducir los títulos de virus nasales. Solo se logró una protección completa de la nariz para algunos grupos que recibieron dos vacunas (por ejemplo, para R7457 (F-del_DSCav_mut5) y R7459 (F-del_DSCav_mut4)). Para concluir, los resultados muestran que los constructos de ARN formulados con LNP que codifican proteínas truncadas de F de VSR estabilizados pre-fusión (F-del_DSCav1_mut2, F-del_DSCav1_mut0, F-del_DSCav1_mut5, F-del_DSCav1_mut4) produjeron en general títulos funcionales más altos y lograron una protección más pronunciada contra la infección en comparación con el constructo de ARN que codifica la proteína F truncada de tipo salvaje F_del. Los mejores resultados se obtuvieron mediante constructos de ARN que codifican F-del_DSCav1_mut2 o F-del_DSCav1_mut5 (R6773, R7457).
[1185] Ejemplo 11: Expresión de diferentes antígenos de células T de VSR utilizando un sistema de lisado de reticulocitos de conejo
[1187] Para determinar la expresión proteicain vitrode los constructos de ARNm de acuerdo con el segundo aspecto de la invención (constructos de ARNm que codifican la proteína M de la matriz del VSR, la fosfoproteína P, la nucleoproteína N y la proteína M2-1 de la matriz), ARN no formulados (preparados de acuerdo con el Ejemplo 1) se mezclaron con componentes del sistema de lisado de reticulocitos de conejo Promega de acuerdo con el protocolo de fabricación. El lisado contiene los componentes celulares necesarios para la síntesis de proteínas (ARNt, ribosomas, aminoácidos, factores de iniciación, alargamiento y terminación). Como control positivo se utilizó ARN de luciferasa del kit Lysate System. El resultado de la traducción se analizó mediante SDS-Page y análisis Western Blot (anticuerpo de estreptavidina IRDye 800CW (1:2000)).
[1188] La Tabla 19 resume los constructos de ARN probados.
[1190]
[1192] Resultados:
[1193] Los resultados (ver Figura 19) muestran que los constructos de ARNm usados condujeron a una expresión de proteína detectable, que es un requisito previo para una vacuna de VSR basada en ARNm (los cambios de tamaño de RSV P y M2-1 en el gel pueden deberse a la fosforilación como se describe, por ejemplo, en Richard et al., 2018 o en Hardy y Wertz, 2000 PMIDs: 29489893 y 10846068).
[1194] Ejemplo 12: Vacunación de ratones con ARNm formulado con LNP que codifica diferentes antígenos de células T del VSR solo y en combinación con F de VSR (F-del)
[1195] El presente Ejemplo analiza el ARNm formulado por LNP que codifica diferentes antígenos de células T del VSR de acuerdo con el segundo aspecto de la invención (RSV M, P, N y M2-1) solo o en combinación con ARNm formulado en LNP que codifica la F de VSR truncada (F-del). Las vacunas de ARNm-LNP se prepararon de acuerdo con el Ejemplo 1. Los ratones balb/c recibieron dos vacunaciones intramusculares con vacunas de ARNm-LNP los días 0 y 28. Cada dosis comprendía 5 µg, 2,5 µg o 2,5 µg 2,5 µg de ARNm-LNP (para los grupos que recibían ARNm que codifican diferentes antígenos, las LNP se formularon por separado y se mezclaron antes de la administración). Los animales de control recibieron sólo solución tampón (ver Tabla 20). Las respuestas inmunitarias humorales, así como las celulares y los anticuerpos neutralizantes se analizaron mediante ELISA, FACS, PRNT e ICS.
[1196] Tabla 20:Grupos de animales y programa de vacunación del ejemplo 12
[1198]
[1199] Determinación de anticuerpos anti-proteína F de VSR por ELISA:
[1201] Se recogieron muestras de sangre los días 0, 14, 28 y 49 para la determinación de los títulos de anticuerpos anti-F de VSR. Las placas de ELISA se recubrieron con glucoproteína de fusión de VSR humano recombinante (proteína F de hRSV (A2; His-tag; Sino Biological; Cat: 11049-V08B)). Las placas recubiertas se incubaron usando las diluciones de suero dadas. La unión de anticuerpos específicos a la proteína F se detectó usando anticuerpos anti-ratones específicos de isotipo en combinación con estreptavidina-HRP (peroxidasa de rábano picante) y el Amplex® UltraRed Reagent (Invitrogen (Ref. No. A36006).
[1203] Detección de respuestas de anticuerpos humorales específicos de antígeno medidas por FACS
[1204] Se transfectaron células Hela con 2 µg de constructos de ARNm de VSR (R7595, R7596, R7597, R7598) usando lipofectamina. Las células se recogieron 20 h después de la transfección y se sembraron a 1x10<5>por pocillo en una placa de 96 pocillos. Las células se incubaron con los correspondientes sueros de ratones vacunados (suero de los días 28 y 49, diluido 1:50) seguido de una tinción de anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado con FITC. Las células se adquirieron en BD FACS Canto II utilizando el software DIVA y se analizaron mediante FlowJo. Los resultados se muestran en la Figura 21a (día 28) y la Figura 21b (día 49). Como se lee, se utilizó el porcentaje de células positivas para FITC (fuera de las células vivas).
[1206] Determinación de títulos de neutralización de virus:
[1208] El suero se recogió el día 49 y se midieron los títulos de neutralización del virus VSR (VNT) usando una prueba de neutralización por reducción de placa (PRNT). Las muestras de suero diluido se incubaron con VSR/A2 (25-50 PFU) durante 1 hora a temperatura ambiente y se inocularon por duplicado en monocapas de HEp-2 confluentes en placas de 24 pocillos. Después de una hora de incubación a 37 °C en una incubadora de CO<2>al 5%, los pocillos se recubrieron con medio de metilcelulosa al 0,75%. Después de 4 días de incubación, se retiraron las superposiciones y las células se fijaron y tiñeron. Los correspondientes títulos de anticuerpos neutralizantes recíprocos se determinaron en el punto final de reducción del 60% del control del virus.
[1210] Determinación de respuestas inmunes celulares en ratones por ICS usando FACS
[1212] Los esplenocitos y células pulmonares de ratones vacunados y de control se aislaron de acuerdo con un protocolo estándar. Brevemente, los bazos aislados se trituraron a través de un filtro de células y se lavaron en PBS (FCS al 1%). Después de la centrifugación, el sedimento celular se resuspendió con el sobrenadante restante, se trató con solución tampón de lisis de glóbulos rojos y se lavó repetidamente con PBS (FCS al 1%). Finalmente, los esplenocitos se resuspendieron en FCS/DMSO al 10%, se transfirieron a un criovial y se almacenaron a -80°C. Los pulmones se perfundieron con medio RPMI-1640 (FCS al 10%; glutamina 2 mM; Pen/Strep al 1%), se recolectaron y luego se almacenaron en medio RPMI-1640 (FCS al 10%; glutamina 2 mM; Pen/Strep al 1%) a 4°C hasta que se aislaron las células pulmonares usando el Lung Dissociation Kit mouse de Miltenyi Biotec de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para ICS, se sembraron 2 x 10<6>células (esplenocitos o células pulmonares) por duplicado en placas de fondo redondo y se estimularon con péptidos VSR M2-1 específicos (VYNTVISYI, SYIGSINNI, SYIESNRKN, KSIDTLSEI), VSR F específicos (FYQSTCSAV, TYMLTNSEL, KYKNAVTEL, KIMTSKTDV), RSF M específico (KHTATRFAI, AQMPSKFTI, KYIKPQSQF, TYLRSISVR), RSV P específicos (SPITSNSTI, SYEEINDQT) o RSV N específicos (SYKKMLKEM, FYGHILNTINPK). Después del bloqueo de Golgi (GolgiPlug 1/1000) y la incubación para la acumulación de citocinas intracelulares, las células se sometieron a tinción viva/muerta usando Aqua-dye. Luego, las células se tiñeron en la superficie usando los anticuerpos α-CD8-APC-H7 (1/100), α-CD4-BD-Horizon V450 (1/200), α-Thy1.2-FITC (1/300), y α-CD107a PE-Cy7 (1/100) para esplenocitos y α-CD8-APC-H7 (1/100), α-CD4-BD-Horizon V450 (1/200), α-Thy1.2-FITC (1/300), α-CD69-PE (1/100), y α-CD103-PE-Cy7 (1/60) para células pulmonares. Después del tratamiento con Cytofix/Cytoperm, las células pulmonares se tiñeron intracelularmente con α-IFNg-APC (1/100) y esplenocitos adicionalmente con α-TNFα-PE (1/100). Finalmente, las células se adquirieron en BD FACS Canto II utilizando el software DIVA y se analizaron mediante FlowJo.
[1213] Resultados:
[1214] Los resultados del estudio de inmunogenicidad en ratones, por ejemplo, las respuestas inmunes humorales se pueden ver en la Figura 20 (Figura 20a: anti-F de VSR IgG, Figura 20b: anti-F de VSR IgG2a). En general, todos los grupos indujeron respuestas inmunes humorales sin diferencias significativas entre F-del solo y los grupos de antígenos de células F-del células T. La adición de los antígenos de células T M, P, N y M2-1 a la vacuna de ARNm que codifica F de VSR-del no influyó ni alteró la respuesta inmune contra F de VSR. Estos hallazgos indican que la coexpresión de los antígenos de células T no afectan las respuestas de anticuerpos inducidas por F de VSR. Las respuestas inmunes podrían reforzarse con la segunda inmunización (ver respuestas en el día 49). En general, los títulos de IgG2a son 10 veces más altos que los de IgG1, lo que indica una respuesta Th1 predominante. Se considera que una respuesta inmune con sesgo Th1 es un requisito previo importante para una posible vacuna contra el VSR, ya que las respuestas con sesgo Th2 se han asociado con una enfermedad respiratoria mejorada (ERD) en modelos animales.
[1215] Como se muestra en la Figura 21a y la Figura 21b se detectaron los IgG de antígeno específico en sueros de ratones inmunizados, lo que indica que los constructos de ARNm aplicados son adecuados para inducir respuestas inmunes humorales específicas. Además, los resultados revelan que la inducción de respuestas de anticuerpos específicos de antígeno para N y M2-1 ya puede detectarse en el día 28, mientras que para la inmunización M y P es necesaria una vacuna de refuerzo. La disminución de las respuestas de anticuerpos específicos de antígeno después de la coinmunización con F de VSR probablemente se deba a diferentes dosis de inmunización (5 µg frente a 2.5 µg). Como se puede ver en la Figura 22, todas las vacunas de ARNm formuladas con LNP (F, M+F, P F, N+F, M2-1+F) indujeron la formación de anticuerpos funcionales específicos de VSR en ratones como lo muestran los altos títulos de anticuerpos neutralizantes de virus. Los ensayos de títulos de anticuerpos neutralizantes en suero contra VSR/A2 no revelaron diferencias significativas entre los grupos de inmunización.
[1216] Como se puede ver en la Figura 23 (Figura 23a de pulmón ICS CD8, Figura 23b, bazo ICS CD8, Figura 23c bazo ICS CD4), todas las vacunas que contienen F de VSR, VSR M2-1, o ambos, sorprendentemente indujeron una célula T de memoria residente en el tejido (T<RM>) en el pulmón tras la inmunización intramuscular, ya que se pudo observar un aumento de células CD8<+>T<RM>específicas para F o especialmente para M2-1. La inducción de una respuesta de células T<RM>en el pulmón podría ser favorable para una posible vacuna contra VSR, ya que se propone que las células T<RM>pulmonares (CD69<+>y CD103<+>) protejan contra la infección por VSR. El análisis de esplenocitos reveló que una inmunización con F de VSR y especialmente VSR M2-1 conduce a un aumento de células T CD8<+>y CD4<+>específicas de antígeno que secretan IFNy TNF, lo que indica la inducción de una respuesta sistémica de células T además de una respuesta específica de sitio.
[1217] Para concluir, los resultados muestran que VSR M2-1 induce las respuestas inmunes de células T más prometedoras sin afectar las respuestas de anticuerpos inducidas por F de VSR. Por lo tanto, una vacuna que contenga ARNm que codifiquen F de VSR en combinación con VSR M2-1 podría aumentar la eficacia protectora contra la infección por VSR.
[1218] Ejemplo 13:Desarrollo clínico de una composición de vacuna de ARNm de VSR:
[1219] Para demostrar la seguridad y la eficacia de la composición de la vacuna de ARNm del VSR, se inicia un ensayo clínico (fase I). Para el desarrollo clínico, se usa ARN que se ha producido en condiciones GMP (por ejemplo, usando un procedimiento como se describe en WO2016/180430).
[1220] En el ensayo clínico, se inyecta por vía intramuscular a una cohorte de voluntarios humanos sanos con las respectivas composiciones de vacuna formuladas con LNP que comprenden combinaciones favorables de UTR.
[1221] Con el fin de evaluar el perfil de seguridad de las composiciones de vacuna de acuerdo con la invención, los sujetos se controlan después de la administración (señales vitales, evaluaciones de tolerabilidad del lugar de vacunación, análisis hematológico).
[1222] La eficacia de la inmunización se analiza mediante la determinación de títulos de neutralización de virus (VNT) en sueros de sujetos vacunados. Las muestras de sangre se recogen el día 0 como base y después de la vacunación completa. Los sueros se analizan en busca de anticuerpos neutralizantes de virus.

Claims (26)

1. REIVINDICACIONES
1. Un ARN artificial que comprende
a) al menos una región 5’ no traducida (5'-UTR) heteróloga y/o al menos una región 3' no traducida (3'-UTR) heteróloga; y
b) al menos una secuencia codificante ligada operativamente a dicha 3'-UTR y/o 5'-UTR que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de una proteína de fusión (F) de VSR, donde la al menos una secuencia codificante que codifica al menos una secuencia de aminoácidos es idéntica o al menos un 97% idéntica a la SEQ ID NO: 4957,
donde el al menos una péptido o proteína antigénica es una proteína F sin el terminal C (F_del) y
donde la proteína F de VSR comprende una mutación DSCav1 (S155C, S290C, S190F y V207L),
donde la proteína F de VSR comprende las dos subunidades F2 y F1 en una única cadena polipeptídica, donde F2 y F1 están unidas mediante un elemento enlazador, preferiblemente un enlazador GS, para generar una proteína F2-enlazador-F1 estable, donde dicha proteína F2-enlazador-F1 carece de los aa104-aa144 y donde la proteína F de VSR comprende al menos una mutación adicional seleccionada de (A149C, Y458C), donde la posición de un residuo aminoácido y su numeración se refiere a la posición del residuo aminoácido respectivo en la SEQ ID NO: 68.
2. ARN artificial según la reivindicación 1, donde la proteína F de VSR está diseñada para estabilizar el antígeno en la conformación pre-fusión.
3. ARN artificial según la reivindicación 1 o 2, donde la al menos una secuencia codificante codifica al menos una de las secuencias de aminoácidos que son idénticas o al menos un 98% o 99% idénticas a cualquiera de las SEQ ID NO: 2005, 2743, 3481, 4957 o 16523.
4. ARN artificial según las reivindicaciones 1 a 3, donde la al menos una secuencia codificante codifica al menos una de las secuencias de aminoácidos que son idénticas o al menos un 99% idénticas a cualquiera de las SEQ ID NO: 4957.
5. ARN artificial según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la al menos una secuencia codificante comprende al menos una secuencia de ácido nucleico que es idéntica o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a las SEQ ID NO: 2006-2013, 2744-2751, 3482-3489, 4958-4965, 16524-16531, 21370, 21372, 21374, 21376 o 21402.
6. ARN artificial según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la al menos una secuencia codificante comprende al menos una secuencia de ácido nucleico que es idéntica o al menos un 90% idéntica a las SEQ ID NO: 4958 o 4962.
7. ARN artificial según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la al menos una secuencia codificante es una secuencia modificada por codón, donde la secuencia de aminoácidos codificada por la al menos una secuencia codificante modificada en codón no está modificada en comparación con la secuencia de aminoácidos codificada por la correspondiente secuencia de tipo salvaje.
8. ARN artificial según la reivindicación 7, donde la al menos una secuencia codificante modificada por codón se selecciona de una secuencia codificante maximizada en C, una secuencia codificante maximizada CAI, una secuencia codificante adaptada al uso del codón humano, una secuencia codificante modificada en contenido G/C y una secuencia codificante optimizada G/C, o cualquier combinación de las mismas.
9. ARN artificial según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el ARN es un ARNm, un ARN autorreplicante, un ARN circular o un replicón de ARN.
10. ARN artificial según la reivindicación 9, donde el ARN es un ARNm.
11. ARN artificial según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el ARN comprende una estructura 5'-cap, preferiblemente m7G, cap0, cap1, cap2, una estructura cap0 modificada o una estructura cap1 modificada.
12. ARN artificial según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el ARN comprende al menos una secuencia poli(A), preferiblemente que comprende de 30 a 150 nucleótidos de adenosina, más preferiblemente que comprende 100 nucleótidos de adenosina y/o al menos una secuencia poli(C), preferiblemente de 10 a 40 nucleótidos de citosina.
13. ARN artificial según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende
a) al menos una región 5’ no traducida (5'-UTR) heteróloga y/o al menos una región 3' no traducida (3'-UTR) heteróloga; y
b) al menos una secuencia codificante ligada operativamente a dicha 3'-UTR y/o 5'-UTR que codifica al menos un péptido o proteína antigénica derivada de una proteína F de VSR, donde
dicho ARN artificial comprende o consiste en una secuencia de ARN que es idéntica o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo consistente en las SEQ ID NO: 2006-2013, 2744-2751, 3482-3489, 4958-4965, 16524-16531, 21370, 21372, 21374, 21376 o 21402, donde opcionalmente al menos uno o más de uno donde todos los nucleótidos de uracilo se reemplazan por nucleótidos de pseudouridina (ψ) o nucleótidos de N1-metilpseudouridina (m1ψ).
14. ARN artificial según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho ARN artificial comprende o consiste en una secuencia de ARN que es idéntica o al menos un 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo consistente en las SEQ ID NO: 2014-2373, 2752-3111, 3490-3849, 4966-5325, 16532-16891, 21436-21438, 21442-21444, 21448-21450, 21454-21456, 21526-21528, 21582-21584, 21588-21590, 21594-21596, 21600-21602, 21526-21528 o 21672-21674.
15. Composición que comprende al menos un ARN artificial según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, donde la composición comprende opcionalmente al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.
16. Composición según la reivindicación 15, donde el al menos un ARN artificial está complejado con uno o más lípidos, formando así nanopartículas lipídicas (LNP).
17. Composición según la reivindicación 15, donde la composición comprende LNP o donde la composición comprende el ARN artificial en asociación con un portador polimérico, una proteína o péptido policatiónico o una LNP.
18. Composición según la reivindicación 15, donde el ARN artificial está comprendido en LNP, o donde el ARN artificial o parte del mismo está asociado o complejado con LNP.
19. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, donde las LNP comprenden uno o más lípidos neutros y/o un esteroide.
20. Composición según la reivindicación 19, donde el lípido neutro se selecciona del grupo que comprende diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamina (POPE) y dioleoil-fosfatidiletanolamina 4- (N-maleimidometil)-ciclohexano-1carboxilato (DOPE-mal), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE), diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE), 16-O-monometil PE, 16-O-dimetil PE, 18-1-trans PE, 1-estearioil-2-oleoilfosfatidiletanolamina (SOPE) y 1,2-dielaidoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (transDOPE).
21. Composición según la reivindicación 19 o 20, donde el lípido neutro es 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) y donde la proporción molar entre el lípido catiónico y DSPC está opcionalmente en el intervalo de aproximadamente 2:1 a 8:1.
22. Composición según la reivindicación 19, donde el esteroide es colesterol y donde la proporción molar entre el lípido catiónico y el colesterol está opcionalmente en el intervalo de aproximadamente 2:1 a 1:1
23. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, donde las LNP consisten esencialmente en (i) al menos un lípido catiónico;
(ii) un lípido neutro, preferiblemente como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21;
(iii) un esteroide, preferiblemente como se define en la reivindicación 22; y
(iv) un PEG-lípido, por ejemplo PEG-DMG
donde (i) a (iv) están en una proporción molar de aproximadamente 20-60% lípido catiónico, 5-25% lípido neutro, 25 55% esterol y 0,5-15% de PEG-lípido.
24. Vacuna que comprende el ARN artificial como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, la composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 15 a 23, donde el ARN artificial como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, la composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 15 a
23 provoca una respuesta inmune adaptativa y/o donde la vacuna comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable y opcionalmente al menos un adyuvante.
25. Kit o kit de partes que comprende el ARN artificial como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, la composición como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 23 y/o la vacuna como se define en la las reivindicación 24, que opcionalmente comprende un vehículo líquido para la solubilización y opcionalmente instrucciones técnicas que proporcionan información sobre la administración y dosificación de los componentes.
26. ARN artificial como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, la composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 15 a 23 o la vacuna como se define en la reivindicación 24 o el kit o kit de partes como se define en la reivindicación 25 para su uso como medicamento, preferentemente para su uso en el método de tratamiento o la profilaxis de una infección por un virus, preferentemente VSR o de un trastorno relacionado con tal infección, donde el método de tratamiento comprende aplicar o administrar a un sujeto que lo necesite el ARN artificial como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, la composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 15 a 23, la vacuna como se define en la reivindicación 24 o los componentes del kit o kit de partes como se define en la reivindicación 25, donde el sujeto es preferentemente un sujeto mamífero, donde el sujeto mamífero es un sujeto humano, preferentemente un recién nacido, una mujer embarazada, una mujer lactante, un anciano y/o un sujeto inmunodeprimido.
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