ES3058690T3

ES3058690T3 - Non-hemolytic llo fusion proteins and uses thereof

Info

Publication number: ES3058690T3
Application number: ES18213410T
Authority: ES
Inventors: Yvonne Paterson; Paulo Maciag
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 2008-06-23
Filing date: 2009-06-22
Publication date: 2026-03-12
Anticipated expiration: 2029-06-22
Also published as: US20090081248A1; ES2719832T3; HUE042819T2; DK2942355T3; JP5597197B2; EP2942355B1; JP2015017096A; PL2942355T3; DK2307049T3; US20140248304A1; US8771702B2; EP2942355A1; EP2307049B1; EP3530669C0; PL3530669T3; JP6114237B2; PT2307049T; EP2307049A4; EP2307049A1; HK1217341A1

Abstract

Una composición que comprende una mezcla de (a) una proteína recombinante que comprende una proteína listeriolisina O (LLO) que comprende una mutación dentro de su dominio de unión al colesterol (CBD), y en donde la proteína recombinante exhibe una reducción de más de 100 veces en la actividad hemolítica en relación con una proteína LLO de tipo salvaje; y (2) un péptido antigénico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Proteínas de fusión LLO no hemolíticas y sus usos

[0003] CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0004] La presente invención proporciona composiciones que comprenden proteínas recombinantes que incluyen una proteína listeriolisina O (LLO) mutada, que comprende una mutación de sustitución de aminoácidos específicos dentro del dominio de unión al colesterol, y péptidos antigénicos del VPH y composiciones de vacunas de los mismos. La presente invención también prevé el uso médico de estas composiciones y vacunas.

[0005] ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0006] La estimulación de una respuesta inmunitaria depende de la presencia de antígenos reconocidos como extraños por el sistema inmunitario del huésped. Los antígenos bacterianos comoSalmonella entericayMycobacterium bovisBCG permanecen en el fagosoma y estimulan los linfocitos T CD4+ a través de la presentación de antígenos mediante moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II. Por el contrario, los antígenos bacterianos comoListeria monocytogenessalen del fagosoma hacia el citoplasma. La fuga fagolisosomal deL. monocytogeneses un mecanismo único que facilita la presentación de antígenos de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad de antígenos deListeria. Este escape depende de la citolisina activada por sulfhidrilo formadora de poros, listeriolisina O (LLO).

[0007] La Patente WO 2008/008311 divulga métodos para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto contra una proteína de interés y para tratar y suprimir la formación de un tumor que comprende una proteína asociada a un tumor mediante la administración secuencial de fragmentos de la proteína.

[0008] Michelet aldivulgan mutantes atenuados de la bacteria intracelularListaria monocytogenesobtenida mediante sustituciones de un solo aminoácido en listeriolisina O (Microbiología molecular, 1990, vol.4, n.º 12, páginas 2167-2178, Wiley-Blackwell Publishing Ltd., GB). XP001007254, ISSN: 0950-382X, DOI: 10.1111/J.1365-2958.1990.TB00578.X).

[0009] La patente WO 2007/130455 divulga péptidos recombinantes que comprenden un receptor de células B (BCR) o un fragmento del mismo, moléculas de nucleótidos que codifican los péptidos recombinantes, vacunas y vectores que comprenden los péptidos recombinantes; y métodos para tratar, inducir una respuesta inmunitaria contra, inducir una regresión de y suprimir la formación de un linfoma, mediante la administración de los péptidos recombinantes. La Patente WO 2007/130455 también divulga métodos para inducir una respuesta inmunitaria humoral en un animal contra un antígeno mediante la administración de un péptido de fusión que comprende una proteína LLO o un fragmento de la misma fusionada o conjugada al antígeno.

[0010] Existe desde hace tiempo la necesidad de desarrollar composiciones para mejorar la inmunogenicidad de los antígenos, especialmente de aquellos útiles en la prevención y el tratamiento de tumores y patógenos intracelulares.

[0011] RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0012] La presente invención proporciona una composición que comprende una mezcla de (a) proteína recombinante que comprende una proteína listeriolisina O (LLO), en la que la proteína LLO comprende una mutación dentro del dominio de unión al colesterol (CBD) de la misma (SEQ ID NO: 18), en la que dicha mutación consiste en la sustitución de todos los residuos de aminoácidos en las posiciones 2, 9 y 10 de la SEQ ID NO: 18, y en la que la proteína recombinante presenta una reducción mayor de 100 veces en la actividad hemolítica con respecto a una proteína LLO de tipo silvestre; y (b) una proteína E7 del virus del papiloma humano (VPH).

[0013] En una realización, la secuencia de la proteína LLO se establece en la SEQ ID NO: 37.

[0014] En una realización, la proteína E7 del virus del papiloma humano (VPH) es un antígeno VPH-16-E7 o un antígeno VPH-18-E7.

[0015] En una realización, la proteína LLO mutada comprende además una deleción de la secuencia del péptido señal de la misma. En otra realización, la proteína LLO mutada comprende la secuencia del péptido señal de la misma.

[0016] La presente invención también proporciona una composición de vacuna que comprende la proteína recombinante de la presente invención y un adyuvante, en el que el adyuvante comprende una proteína del factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF), una molécula de nucleótido que codifica una proteína GM-CSF, saponina QS21, lípido A monofosforilado o un oligonucleótido que contiene CpG no metilado.

[0017] En una realización, la composición o la vacuna de la presente invención se utiliza como medicamento. En otra realización, la composición o la vacuna se utiliza para prevenir o tratar la infección por VPH en un sujeto. En otra realización, la presente invención proporciona una composición para su uso o una vacuna para su uso en el tratamiento, inhibición, supresión, inducción de la regresión, reducción de la incidencia o protección contra un tumor que expresa E7 del VPH en un sujeto. En una realización, el tumor que expresa E7 del VPH es un tumor cervical o un tumor de cabeza y cuello.

[0019] BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0021] Figura 1A-B. Estrategia de mutagénesis SOE. La disminución/reducción de la virulencia de LLO se logró mediante la mutación del cuarto dominio de LLO. Este dominio contiene un sitio de unión al colesterol que le permite unirse a las membranas donde oligomeriza para formar poros.

[0022] Figura 2. Expresión de proteínas LLO mutantes mediante tinción de Coomassie (A) y transferencia de Western (B). Figura 3. Actividad hemolítica de las proteínas LLO mutantes (mutLLO y ctLLO) a pH 5,5 (A) y 7,4 (B).

[0023] Figura 4. La capacidad de destoxificación de rLLO+rE7 conjugado químicamente y rLLO rE7 mezclado para impactar en el crecimiento de TC-1.

[0024] Figura 5. La capacidad de las proteínas rE7 y rLLO para influir en el crecimiento de TC-1.

[0025] Figura 6. La capacidad de LLOE7 destoxificada recombinante (rDTLLO-E7; secuencia completa) y rDTLLO-E7 (quimera) para influir en el crecimiento de TC-1.

[0026] Figura 7. Regresión del tumor TC-1 después de la inmunización con rE7, rLLO, rLLO+E7 y rDTLLO-E7.

[0027] Figura 8. Regresión del tumor TC-1 después de la inmunización con la quimera rDTLLO.

[0028] Figura 9. Regresión del tumor TC-1 después de la inmunización con rE7, rDTLLO, rDTLLO+rE7 y rDTLLO-E7. Figura 10. Regresión tumoral TC-1 inmunizada con ActA-E7 y proteína E7.

[0029] Figura 11. Regresión tumoral TC-1 inmunizada con ActA+E7 y proteína E7.

[0030] Figura 12. Regresión tumoral TC-1 inmunizada con ActA y proteína E7.

[0031] Figura 13. La LLO destoxificada induce la expresión de ARNm de citoquinas por los macrófagos de la médula ósea (MO). Se descongelaron 8e5 BMDC del día 7 durante la noche a 37 °C en medio RF10. A continuación, las BMDC se centrifugaron y se resuspendieron en 1 ml de RF10 fresco a 37 °C durante 1 hora. Las BMDC se trataron con 40 mcg/mL de LLOE7 y equivalentes molares de E7 y LLO (o con PBS como control negativo o 1 mcg/mL de LPS como control positivo). Después de 2 y 24 horas, las células se recogieron por centrifugación y el medio se guardó para ELISA. Se extrajo ARN de las células y se convirtió en ADNc. Posteriormente, el ADNc se sometió a un análisis de qPCR con cebadores para diversas citoquinas.

[0032] Figura 14. La LLO destoxificada induce la secreción de citoquinas por los macrófagos de la médula ósea. El mismo protocolo de tratamiento que el descrito en la Figura 13, excepto que los medios se sometieron a análisis ELISA después de los tratamientos.

[0033] Figura 15. La destoxificación LLO regula positivamente los marcadores de maduración de DC CD86, CD40 y MHCII en los grupos LLO, LLO+E7 y LLOE7.

[0034] Figura 16. Translocación nuclear de NFkappaB después de la estimulación con Dt-LLO. La línea celular de macrófagos J774 se utiliza como sistema modelo para células presentadoras de antígenos (APC). Se sembraron 5 x 10^5 células por pocillo (placa de 6 pocillos) en un volumen total de 1 ml. Las células se tiñeron con anti-NF-KB (P65) - FITC (fluorescencia verde) y DAPI para el núcleo (fluorescencia azul). En B, D y F, las células también se tiñeron después de 24 horas con anti-CD11B-PE (M1/170, eBioscence). La micrografía fluorescente se muestra con un aumento de 40X. Después del tratamiento de las células solo con medio (sin activación) NF-kappaB se encuentra en el citoplasma (A). Las células tratadas con medio muestran una tinción débil de Cd11b (B). Después de la estimulación nocturna (24 horas) con Dt-LLO (30 mcg), se movió NFkappaB del citoplasma al núcleo (C) y hay un aumento en la tinción de CD11b (D). De manera similar, después de la estimulación nocturna (24 horas) con LPS (10 mcg/ml, control positivo), NFkappaB se translocó al núcleo (E), lo cual es más discernible con el halo formado por el aumento de la tinción CD11b+ de la membrana plasmática (F).

[0036] DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0038] La presente invención proporciona una composición que comprende una mezcla de (a) proteína recombinante que comprende una proteína listeriolisina O (LLO), en la que la proteína LLO comprende una mutación dentro del dominio de unión al colesterol (CBD) de la misma (SEQ ID NO: 18), en la que dicha mutación consiste en la sustitución de todos los residuos de aminoácidos en las posiciones 2, 9 y 10 de la SEQ ID NO: 18, y en la que la proteína recombinante muestra una reducción mayor de 100 veces en la actividad hemolítica con respecto a una proteína LLO de tipo silvestre; y (b) una proteína E7 del virus del papiloma humano (VPH).

[0040] En una realización, la presente invención proporciona una proteína o polipéptido recombinante que comprende una proteína listeriolisina O (LLO), en la que dicha proteína LLO comprende una mutación de sustitución de los residuos C484, W491 y W492 del dominio de unión al colesterol (CBD) de dicha proteína LLO. En una realización, dichos residuos C484, W491 y W492 son los residuos C484, W491 y W492 de la SEQ ID NO: 37, mientras que en otra realización, son residuos correspondientes como puede deducirse utilizando alineamientos de secuencias.

[0042] En una realización, la proteína LLO en las composiciones de la presente invención es un fragmento N-terminal de LLO, que tiene al menos 492 aminoácidos (AA) de longitud. En otra realización, el fragmento LLO tiene una longitud de 492-528 AA.

[0043] En una realización, el polipéptido no LLO tiene la misma longitud que la región mutada. En otra realización, el polipéptido no LLO es más corto, o en otra realización, más largo, que la región mutada.

[0044] En una realización, la sustitución en la proteína LLO es una mutación inactivante con respecto a la actividad hemolítica.

[0045] Un péptido LLO recombinante para su uso en las composiciones de la presente invención muestra una reducción superior a 100 veces en la actividad hemolítica en comparación con la proteína LLO de tipo silvestre. En otra realización, el péptido LLO recombinante no es hemolítico.

[0046] Como se divulga en este documento, se creó una proteína LLO mutante en la que los residuos C484, W491 y W492 de LLO fueron sustituidos por residuos de alanina (Ejemplo 1). La proteína LLO mutada, mutLLO, podría expresarse y purificarse en un sistema de expresión deE. coli(Ejemplo 3) y mostró una actividad hemolítica sustancialmente reducida en comparación con el LLO de tipo silvestre (Ejemplo 4).

[0047] En otra realización, la proteína LLO recombinante no está unida covalentemente a la proteína E7 del VPH. Como se describe en el presente documento, los residuos C484, W491 y W492, cada uno de los cuales es un fragmento del CBD, se mutaron a residuos de alanina (Ejemplo 1). Además, como se divulga en el presente documento, un fragmento del CBD, residuos 484-492, fue reemplazado por una secuencia heteróloga de NY-ESO-1 (Ejemplo 2).

[0048] Cuando se hace referencia a la longitud de un fragmento LLO en este documento, se incluye la secuencia señal. Por lo tanto, la numeración de la primera cisteína en el CBD es 484 y el número total de residuos de AA es 529.

[0049] Como se divulga en el presente documento, se creó una proteína LLO mutante en la que los residuos C484, W491 y W492 de LLO fueron sustituidos por un epítopo CTL del antígeno NY-ESO-1 (Ejemplo 2). La proteína LLO mutada, mutLLO, podría expresarse y purificarse en un sistema de expresión deE. coli(Ejemplo 3) y mostró una actividad hemolítica sustancialmente reducida en comparación con el LLO de tipo silvestre (Ejemplo 4).

[0050] "Hemolítico" se refiere, en otra forma de realización, a la capacidad de lisar una célula eucariota. En otra realización, la célula eucariota es un glóbulo rojo. En otra realización, la célula eucariota es cualquier otro tipo de célula eucariota conocida en la técnica. En otra realización, la actividad hemolítica se mide a un pH ácido. En otra realización, la actividad hemolítica se mide a pH fisiológico. En otra realización, la actividad hemolítica se mide a pH 5,5. En otra realización, la actividad hemolítica se mide a pH 7,4. En otra realización, la actividad hemolítica se mide a cualquier otro pH conocido en la técnica.

[0051] En la presente invención, la proteína LLO recombinante muestra una reducción superior a 100 veces en la actividad hemolítica en comparación con la LLO de tipo silvestre. En otra realización, la reducción es superior a 120 veces. En otra realización, la reducción es superior a 150 veces. En otra realización, la reducción es superior a 200 veces. En otra realización, la reducción es superior a 250 veces. En otra realización, la reducción es superior a 300 veces. En otra realización, la reducción es superior a 400 veces. En otra realización, la reducción es superior a 500 veces. En otra realización, la reducción es superior a 600 veces. En otra realización, la reducción es superior a 800 veces. En otra realización, la reducción es superior a 1000 veces. En otra realización, la reducción es mayor que 1200 veces. En otra realización, la reducción es mayor que 1500 veces. En otra realización, la reducción es superior a 2000 veces. En otra realización, la reducción es superior a 3000 veces. En otra realización, la reducción es superior a 5000 veces.

[0052] En otra realización, la reducción de la actividad hemolítica en relación con la LLO de tipo silvestre es de al menos 120 veces. En otra realización, la reducción es de al menos 150 veces. En otra realización, la reducción es de al menos 200 veces. En otra realización, la reducción es de al menos 250 veces. En otra realización, la reducción es de al menos 300 veces. En otra realización, la reducción es de al menos 400 veces. En otra realización, la reducción es de al menos 500 veces. En otra realización, la reducción es de al menos 600 veces. En otra realización, la reducción es de al menos 800 veces. En otra realización, la reducción es de al menos 1000 veces. En otra realización, la reducción es de al menos 1200 veces. En otra realización, la reducción es de al menos 1500 veces. En otra realización, la reducción es de al menos 2000 veces. En otra realización, la reducción es de al menos 3000 veces. En otra realización, la reducción es de al menos 5000 veces.

[0053] Los métodos para determinar la actividad hemolítica son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en los ejemplos que se incluyen en la presente, y en Portnoy DA et al, (J Exp Med Vol 167:1459-1471, 1988) y Dancz CE et al (J Bacteriol.184: 5935-5945, 2002).

[0054] En otra realización, la "mutación inactivadora" con respecto a la actividad hemolítica se refiere a una mutación que elimina la actividad hemolítica detectable. En otra realización, el término se refiere a una mutación que elimina la actividad hemolítica a pH 5,5. En otra realización, el término se refiere a una mutación que elimina la actividad hemolítica a pH 7,4. En otra realización, el término se refiere a una mutación que reduce significativamente la actividad hemolítica a pH 5,5. En otra realización, el término se refiere a una mutación que reduce significativamente la actividad hemolítica a pH 7,4. En otra realización, el término se refiere a una mutación que reduce significativamente la actividad hemolítica a pH 5,5. En otra realización, el término se refiere a cualquier otro tipo de mutación inactivadora con respecto a la actividad hemolítica.

[0055] La secuencia del dominio de unión al colesterol de LLO se establece en la SEQ ID NO: 18.

[0056] En una realización, la proteína LLO mutada comprende su péptido señal de la misma. En otra realización, la proteína LLO mutada o un fragmento de la misma comprende un péptido señal de una proteína LLO de tipo silvestre. En otra realización, el péptido señal es una cadena peptídica corta (de 3 a 60 aminoácidos de longitud) que dirige el transporte postraduccional de una proteína. En otra realización, los péptidos de señal también son señales de direccionamiento, secuencias de señal, péptidos de tránsito o señales de localización. En otra realización, las secuencias de aminoácidos de los péptidos señal dirigen las proteínas a ciertos orgánulos como el núcleo, la matriz mitocondrial, el retículo endoplásmico, el cloroplasto, el apoplasto o el peroxisoma. En otra realización, la proteína LLO mutada contiene una secuencia señal de una proteína LLO de tipo silvestre. En otra realización, la proteína LLO mutada carece de un péptido señal. En otra realización, la proteína LLO mutada carece de una secuencia señal. En otra realización, el péptido señal no se altera con respecto a la proteína LLO de tipo silvestre de la que se derivó la proteína LLO mutada o un fragmento de la misma. En otra realización, el péptido señal se encuentra en el extremo N-terminal de la proteína o polipéptido recombinante.

[0057] En otra realización, la proteína LLO mutada comprende una secuencia peptídica similar a PEST. En otra realización, la secuencia peptídica similar a PEST es una secuencia peptídica similar a LLO PEST. En otra realización, la secuencia de aminoácidos de la secuencia peptídica similar a PEST se presenta en la SEQ ID NO: 63.

[0058] Las secuencias PEST son secuencias ricas en prolinas (P), ácidos glutámicos (E), serinas (S) y treoninas (T), generalmente, pero no siempre, flanqueadas por grupos que contienen varios aminoácidos cargados positivamente, tienen vidas medias intracelulares rápidas (Rogers et al., 1986, Science 234:364-369). Las secuencias PEST dirigen la proteína a la vía ubiquitina-proteasoma para su degradación (Rechsteiner y Rogers TIBS 199621:267-271), una vía que también utilizan las células eucariotas para generar péptidos inmunogénicos que se unen al MHC de clase I. Las secuencias PEST son abundantes entre las proteínas eucariotas que dan lugar a péptidos inmunogénicos (Realini et al. FEBS Lett.1994348:109-113). Aunque las secuencias PEST se encuentran habitualmente en proteínas eucariotas, se identificó una secuencia similar a PEST rica en los aminoácidos prolina (P), ácido glutámico (E), serina (S) y treonina (T) en el extremo amino de la proteína procariota LLO deListeriaha demostrado ser esencial para la patogenicidad de L. monocytogenes (Decatur, AL y Portnoy, DA Science 2000290:992-995). La presencia de esta secuencia similar a PEST en LLO dirige la proteína a la destrucción por la maquinaria proteolítica de la célula huésped, de modo que una vez que LLO ha cumplido su función y facilitado el escape deL. monocytogenesde la vacuola fagolisosomal, se destruye antes de que dañe las células.

[0059] La identificación de secuencias similares a PEST es bien conocida en la técnica, y se describe, por ejemplo, en Rogers S et al (Secuencias de aminoácidos comunes a proteínas rápidamente degradadas: la hipótesis PEST). Science 1986; 234(4774):364-8) y Rechsteiner M et al (Secuencias PEST y regulación por proteólisis. Trends Biochem Sci 1996; 21(7):267-71). En otra realización, "secuencia similar a PEST" se refiere a una región rica en residuos de prolina (P), ácido glutámico (E), serina (S) y treonina (T). En otra realización, la secuencia similar a PEST está flanqueada por uno o más grupos que contienen varios aminoácidos cargados positivamente. En otra realización, la secuencia similar a PEST media la degradación intracelular rápida de las proteínas que la contienen. En otra realización, la secuencia similar a PEST se ajusta a un algoritmo divulgado en Rogers et al. En otra realización, la secuencia similar a PEST se ajusta a un algoritmo divulgado en Rechsteiner et al. En otra realización, la secuencia similar a PEST contiene uno o más sitios de fosforilación internos, y la fosforilación en estos sitios precede a la degradación de la proteína.

[0060] En una realización, las secuencias similares a PEST de organismos procariotas se identifican de acuerdo con métodos como los descritos, por ejemplo, por Rechsteiner y Rogers (1996, Trends Biochem. Sci. 21:267-271) paraLMy en Rogers S et al (Science 1986; 234(4774):364-8). Como alternativa, también pueden identificarse secuencias de aminoácidos similares a PEST de otros organismos procariotas basándose en este método. Otros organismos procariotas en los que cabría esperar que se incluyeran secuencias de aminoácidos similares a PEST, otras especies deListeria. En una realización, la secuencia similar a PEST se ajusta a un algoritmo divulgado en Rogers et al. En otra realización, la secuencia similar a PEST se ajusta a un algoritmo divulgado en Rechsteiner et al. En otra realización, la secuencia similar a PEST se identifica utilizando el programa PEST-find.

[0061] En otra realización, la identificación de los motivos PEST se logra mediante un escaneo inicial de AAR, H y K cargados positivamente dentro de la secuencia de proteína especificada. Se cuentan todos los aminoácidos entre los flancos cargados positivamente y solo se consideran aquellos motivos que contienen un número de aminoácidos igual o superior al parámetro de tamaño de ventana. En otra realización, una secuencia similar a PEST debe contener al menos 1 P, 1 D o E y al menos 1 S o T.

[0062] En otra realización, la calidad de un motivo PEST se refina mediante un parámetro de puntuación basado en el enriquecimiento local de aminoácidos críticos, así como en la hidrofobicidad del motivo. El enriquecimiento de D, E, P, S y T se expresa en porcentaje de masa (p/p) y se corrige por 1 equivalente de Dor E, 1 de P y 1 de S o T. En otra realización, el cálculo de la hidrofobicidad sigue en principio el método de J. Kyte y R.F. Doolittle (Kyte, J y Doolittle, RF. J. Mol. Biol. 157, 105 (1982). Para simplificar los cálculos, los índices de hidropatía de Kyte-Doolittle, que originalmente iban de -4,5 para la arginina a 4,5 para la isoleucina, se convierten en números enteros positivos, utilizando la siguiente transformación lineal, que produjo valores de 0 para la arginina a 90 para la isoleucina.

[0063] Índice de hidropatía = 10 * Índice de hidropatía de Kyte-Doolittle 45.

[0064] En otra realización, la hidrofobicidad de un posible motivo PEST se calcula como la suma de los productos del porcentaje molar y el índice de hidrofobicidad para cada especie de AA. La puntuación PEST deseada se obtiene como la combinación del término de enriquecimiento local y el término de hidrofobicidad, tal como se expresa mediante la siguiente ecuación:

[0065] Puntuación PEST = 0,55 * DEPST - 0,5 * índice de hidrofobicidad.

[0066] En otra realización, "secuencia PEST", "secuencia similar a PEST" o "péptido de secuencia similar a PEST" se refiere a un péptido que tiene una puntuación de al menos 5, utilizando el algoritmo anterior. En otra realización, el término se refiere a un péptido que tiene una puntuación de al menos 6. En otra realización, el péptido tiene una puntuación de al menos 7. En otra realización, la puntuación es de al menos 8. En otra realización, la puntuación es de al menos 9. En otra realización, la puntuación es de al menos 10. En otra realización, la puntuación es de al menos 11. En otra realización, la puntuación es de al menos 12. En otra realización, la puntuación es de al menos 13. En otra realización, la puntuación es de al menos 14. En otra realización, la puntuación es de al menos 15. En otra realización, la puntuación es de al menos 16. En otra realización, la puntuación es de al menos 17. En otra realización, la puntuación es de al menos 18. En otra realización, la puntuación es de al menos 19. En otra realización, la puntuación es de al menos 20. En otra realización, la puntuación es de al menos 21. En otra realización, la puntuación es de al menos 22. En otra realización, la puntuación es de al menos 22. En otra realización, la puntuación es de al menos 24. En otra realización, la puntuación es de al menos 24. En otra realización, la puntuación es de al menos 25. En otra realización, la puntuación es de al menos 26. En otra realización, la puntuación es de al menos 27. En otra realización, la puntuación es de al menos 28. En otra realización, la puntuación es de al menos 29. En otra realización, la puntuación es de al menos 30. En otra realización, la puntuación es de al menos 32. En otra realización, la puntuación es de al menos 35. En otra realización, la puntuación es de al menos 38. En otra realización, la puntuación es de al menos 40. En otra realización, la puntuación es de al menos 45.

[0067] En otra realización, la secuencia similar a PEST se identifica utilizando cualquier otro método o algoritmo conocido en la técnica, por ejemplo, el predictor CaS (Garay-Malpartida HM, Occhiucci JM, Alves J, Belizario JE). Bioinformatics. Jun de 2005;21 Supl 1:i169-76). En otra realización, se utiliza el siguiente método:

[0068] Se calcula un índice PEST para cada tramo de longitud apropiada (por ejemplo, un tramo de 30-35 AA) asignando un valor de 1 al AA Ser, Thr, Pro, Glu, Asp, Asn o Gln. El valor del coeficiente (CV) para cada uno de los residuos de PEST es 1 y para cada uno de los otros AA (no PEST) es 0.

[0069] La mejora observada en la inmunidad celular mediada y la inmunidad antitumoral de la proteína de fusión resulta de la secuencia similar a PEST presente en LLO, que dirige el antígeno para su procesamiento.

[0070] La presente invención proporciona una composición de vacuna que comprende la composición de la presente invención y un adyuvante, en el que el adyuvante comprende una proteína del factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF), una molécula de nucleótido que codifica una proteína GM-CSF, saponina QS21, lípido A monofosforilado o un oligonucleótido que contiene CpG no metilado.

[0071] También se ha divulgado una cepa deListeriarecombinante que comprende, codifica y expresa una proteína recombinante de la presente invención. En otra realización, la cepa deListeriarecombinante comprende un nucleótido recombinante que codifica un polipéptido recombinante de la presente invención. En otra realización, la cepa deListeriade la vacuna es la especieListeria monocytogenes(LM).

[0072] En otra realización, el adyuvante utilizado en las composiciones de vacunas de la presente invención es una proteína del factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF). En otra realización, el adyuvante comprende una proteína GM-CSF. En otra realización, el adyuvante es saponina QS21. En otra realización, el adyuvante comprende saponina QS21. En otra realización, el adyuvante es lípido A monofosforilado. En otra realización, el adyuvante comprende lípido A monofosforilado. En otra realización, el adyuvante es un oligonucleótido que contiene CpG no metilado. En otra realización, el adyuvante comprende un oligonucleótido que contiene CpG no metilado.

[0073] Las composiciones de la presente invención pueden administrarse a un sujeto que padezca un linfoma, una célula cancerosa o una enfermedad infecciosa que exprese E7 de VPH. En otra realización, las composiciones pueden administrarseex vivoa las células de un sujeto. En otra realización, las composiciones pueden administrarse a un donante de linfocitos; luego, en otra realización, los linfocitos del donante se administran a un sujeto. En otra realización, las composiciones pueden administrarse a un donante de anticuerpos o linfocitos; el antisuero o los linfocitos del donante se administran luego, en otra realización, a un sujeto.

[0074] En el presente documento también se divulga un método para producir una proteína recombinante de la presente invención que comprende el paso de conjugar químicamente un péptido que comprende dicha proteína LLO mutada o fragmento LLO N-terminal mutado a un péptido que comprende dicho péptido heterólogo E7 del VPH de interés. En el presente documento también se divulga un método para producir una proteína recombinante de la presente invención que comprende la etapa de traducir dicha proteína recombinante a partir de una molécula de nucleótidos que la codifica.

[0075] El péptido antigénico utilizado en la presente invención es una proteína E7 del virus del papiloma humano (VPH). En una realización, el péptido antigénico es una proteína E7 completa. En otra realización, el péptido antigénico es un fragmento de una proteína E7.

[0076] Las proteínas E6 y E7 son dos de las siete proteínas no estructurales tempranas, algunas de las cuales desempeñan una función en la replicación del virus (E1, E2, E4) y/o en la maduración del virus (E4). Las proteínas E6 y E7 son oncoproteínas que son fundamentales para la replicación viral, así como para la inmortalización y transformación de la célula huésped. Las proteínas virales E6 y E7 no se expresan en el epitelio escamoso cervical normal. La expresión de los genes E6 y E7 en las células madre epiteliales de la mucosa es necesaria para iniciar y mantener la carcinogénesis cervical. Además, la progresión de lesiones preneoplásicas a cánceres cervicales invasivos está asociada con una expresión continua y aumentada de las oncoproteínas E6 y E7. Por lo tanto, E6 y E7 se expresan en los cánceres cervicales. El potencial oncogénico de E6 y E7 puede surgir de sus propiedades de unión a las proteínas de la célula huésped. Por ejemplo, E6 se une a la proteína supresora de tumores p53, lo que conduce a la degradación de la proteína dependiente de ubiquitina, y E7 se une y promueve la degradación de la proteína supresora de tumores retinoblastoma (pRb). Por lo tanto, las composiciones de la presente invención que comprenden E7 del VPH son particularmente útiles en la prevención o el tratamiento de los cánceres antes mencionados.

[0077] Como se divulga en el presente documento, la administración de la proteína recombinante a un sujeto induce una respuesta inmunitaria contra un epítopo E7 del VPH en dicho sujeto.

[0078] En una realización, un epítopo E7 de VPH para su uso en las composiciones de la presente invención es TLHEYMLDL: 7-15 (B8), YMLDLQPETT: 11-20 (A2), LLMGTLGIV: 82-90 (A2), TLGIVCPI: 86-93 (A2), u otro epítopo E7 del VPH conocido en la técnica.

[0079] La presente invención puede ser útil para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto contra un antígeno E7 del VPH mediante la administración al sujeto de una proteína recombinante de la presente invención que contiene E7 del VPH, induciendo así una respuesta inmunitaria contra un antígeno E7 del VPH.

[0080] La presente invención puede ser útil para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto contra una célula diana que exprese E7 del VPH mediante la administración al sujeto de una proteína recombinante de la presente invención que contiene E7 del VPH, induciendo así una respuesta inmunitaria contra una célula diana que expresa E7 del VPH.

[0081] La presente invención puede ser útil para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto contra una célula diana que exprese E7 del VPH mediante la administración al sujeto de un vector de vacuna que codifica una proteína recombinante que contiene E7 del VPH de la presente invención, induciendo así una respuesta inmunitaria contra una célula diana que expresa E7 del VPH.

[0082] En una realización, la célula diana es una célula de cáncer cervical. En otra realización, la célula diana es una célula cancerosa de cabeza y cuello. En otra realización, la célula diana es cualquier otro tipo de célula que exprese E7 del VPH conocida en la técnica.

[0083] La presente invención proporciona la composición o vacuna de la presente invención para su uso como medicamento. La presente invención también proporciona la composición o una vacuna para su uso en la prevención o el tratamiento de la infección por VPH en un sujeto. La presente invención proporciona la composición o una vacuna para su uso en el tratamiento, inhibición, supresión, inducción de la regresión, reducción de la incidencia o protección contra un tumor que expresa E7 del VPH en un sujeto. En una realización, el tumor que expresa E7 del VPH es un tumor cervical o un tumor de cabeza y cuello.

[0084] En una realización, el tumor es un tumor cervical. En otra variante, el tumor es un tumor de cabeza y cuello. En otra realización, el tumor es cualquier otro tipo de tumor que expresa E7 del VPH conocido en la técnica.

[0085] En otra realización, el tumor cervical al que se dirigen las composiciones de la presente invención es un carcinoma de células escamosas. En otra realización, el tumor cervical es un adenocarcinoma. En otra realización, el tumor cervical es un carcinoma adenoescamoso. En otra realización, el tumor cervical es un carcinoma de células pequeñas. En otra realización, el tumor cervical es cualquier otro tipo de tumor cervical conocido en la técnica.

[0086] En una realización, el tumor al que se dirigen las composiciones de la presente invención es un carcinoma de cabeza y cuello. En otra realización, el tumor es un carcinoma anal. En otra realización, el tumor es un carcinoma vulvar. En otra realización, el tumor es un carcinoma vaginal.

[0087] En una realización, las composiciones proporcionadas en la presente pueden utilizarse junto con otras vías para tratar, inhibir o suprimir el cáncer de cuello uterino, incluyendo: entre otros, cirugía, radioterapia, quimioterapia, vigilancia, tratamiento adyuvante (adicional) o una combinación de estos tratamientos.

[0088] En otra realización, la proteína E7 que se utiliza (ya sea entera o como fuente de los fragmentos) en la presente invención tiene la siguiente secuencia:

[0091]

[0093] MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAH YNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR-TLEDLLMGTLGIVCPICSQKP (SEQ ID NO: 17). En otra realización, la proteína E7 es un homólogo de la SEQ ID NO: 17. En otra realización, la proteína E7 es una variante de la SEQ ID NO: 17. En otra realización, la proteína E7 es un isómero de la SEQ ID NO: 17. En otra realización, la proteína E7 es un fragmento de la SEQ ID NO: 17. En otra realización, la proteína E7 es un fragmento de un homólogo de la SEQ ID NO: 17. En otra realización, la proteína E7 es un fragmento de una variante de la SEQ ID NO: 17. En otra realización, la proteína E7 es un fragmento de un isómero de la SEQ ID NO: 17.

[0094] En una realización, el dominio de unión al colesterol de LLO (ECTGLAWEWWR; SEQ ID NO: 18) se sustituye con un epítopo de E7 (RAHYNIVTF; SEQ ID NO: 19).

[0095] En otra realización, la secuencia de la proteína E7 es:

[0096] MHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLCHEQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAE QRHTMLCMCCKCEARIELVVES SADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWCASQQ (SEQ ID NO: 20). En otra realización, la proteína E7 es un homólogo de la SEQ ID NO: 20. En otra realización, la proteína E7 es una variante de la SEQ ID NO: 20. En otra realización, la proteína E7 es un isómero de la SEQ ID NO: 20. En otra realización, la proteína E7 es un fragmento de la SEQ ID NO: 20. En otra realización, la proteína E7 es un fragmento de un homólogo de la SEQ ID NO: 20. En otra realización, la proteína E7 es un fragmento de una variante de la SEQ ID NO: 20. En otra realización, la proteína E7 es un fragmento de un isómero de la SEQ ID NO: 20.

[0097] En otra realización, la proteína E7 tiene una secuencia establecida para una de las siguientes entradas de GenBank: M24215, NC_004500, V01116, X62843 o M14119. En otra realización, la proteína E7 es un homólogo de una secuencia de una de las entradas de GenBank mencionadas anteriormente. En otra realización, la proteína E7 es una variante de una secuencia de una de las entradas de GenBank mencionadas anteriormente. En otra realización, la proteína E7 es un isómero de una secuencia de una de las entradas de GenBank mencionadas anteriormente. En otra realización, la proteína E7 es un fragmento de una secuencia de una de las entradas de GenBank mencionadas anteriormente. En otra realización, la proteína E7 es un fragmento de un homólogo de una secuencia de una de las entradas de GenBank mencionadas anteriormente. En otra realización, la proteína E7 es un fragmento de una variante de una secuencia de una de las entradas de GenBank mencionadas anteriormente. En otra realización, la proteína E7 es un fragmento de un isómero de una secuencia de una de las entradas de GenBank mencionadas anteriormente.

[0098] En una realización, el antígeno E7 del VPH16 es un péptido que tiene la siguiente secuencia: TLGIVCPI (SEQ ID NO: 21). En otra realización, el antígeno E7 del VPH16 es un péptido que tiene la siguiente secuencia: LLMGTLGIV (SEQ ID NO: 22). En otra realización, el antígeno E7 del VPH16 es un péptido que tiene la siguiente secuencia: YMLDLQPETT (SEQ ID NO: 23). En una realización, el antígeno E7 del VPH16 es un péptido que comprende las posiciones 86-93 del antígeno E7 del VPH16 de tipo silvestre. En una realización, el antígeno E7 del VPH16 es un péptido que comprende las posiciones 82-90 del antígeno E7 del VPH16 de tipo silvestre. En una realización, el antígeno E7 del VPH16 es un péptido que comprende las posiciones 11-20 del antígeno E7 del VPH16 de tipo silvestre. En otra realización, el antígeno E7 del VPH16 es un péptido que consiste en las posiciones 86-93, 82-90 u 11-20 del antígeno E7 del VPH16 de tipo silvestre. En otra realización, el antígeno E7 del VPH16 es una variante de un péptido E7 del VPH16 de tipo silvestre. En otra realización, el antígeno E7 del VPH16 es cualquier antígeno E7 del VPH16 descrito en Ressing et al., J Immunol 1995154(11):5934-43.

[0099] El VPH que es la fuente del antígeno heterólogo de la presente invención puede ser un VPH 16. En otra realización, el VPH es un VPH-18. En otra realización, el VPH se selecciona entre VPH-16 y VPH-18. En otra realización, el VPH es un VPH-31. En otra realización, el VPH es un VPH-35. En otra realización, el VPH es un VPH-39. En otra realización, el VPH es un VPH-45. En otra realización, el VPH es un VPH-51. En otra realización, el VPH es un VPH-52. En otra realización, el VPH es un VPH-58. En otra realización, el VPH es un tipo de VPH de alto riesgo. En otra realización, el VPH es un tipo de VPH mucosal.

[0100] Un factor etiológico importante en la génesis del carcinoma cervical es la infección por papilomavirus humanos (VPH), que son pequeños virus de ADN que infectan las células epiteliales de la piel o de las mucosas. Las neoplasias malignas relacionadas con el VPH incluyen cánceres orales, cervicales, anogenitales y de cuello uterino, así como papilomatosis respiratoria. El VPH expresa seis o siete proteínas no estructurales y dos proteínas estructurales, cada una de las cuales puede servir como objetivo en los enfoques inmunoprofilácticos o inmunoterapéuticos que se describen en este documento. Las proteínas de la cápside viral L1 y L2 son proteínas estructurales tardías. L1 es la principal proteína de la cápside, cuya secuencia de aminoácidos está altamente conservada entre los diferentes tipos de VPH.

[0101] Como se divulga en la sección de Detalles Experimentales de este documento, la fusión de LLO a un antígeno aumenta su inmunogenicidad. Además, la administración de dichas proteínas de fusión resulta en protección contra el desafío tumoral.

[0102] Además, como se divulga en el presente documento, la presente solicitud describe una proteína de fusión conformacionalmente intacta que comprende una proteína LLO y un idiotipo BCR, describe metodologías precisas y efectivas para probar vacunas contra el linfoma en ratones y modelos animales, y ha demostrado la eficacia de las vacunas para proteger contra el linfoma y su superioridad sobre las vacunas contra el linfoma actualmente aceptadas (sección Detalles experimentales).

[0103] En una realización, una composición de vacuna de la presente invención es una composición que, tras su administración, estimula la producción de anticuerpos o la inmunidad celular contra un antígeno E7 del VPH.

[0104] En una realización, las vacunas comprenden antígenos naturales o modificados genéticamente. En una realización, las vacunas efectivas estimulan el sistema inmunitario para promover el desarrollo de anticuerpos que pueden atacar rápida y eficazmente las células, microorganismos o virus que producen el antígeno contra el cual se vacunó al sujeto, cuando estos se producen en el sujeto, previniendo así el desarrollo de la enfermedad.

[0105] En una realización, una composición de vacuna de la presente invención es profiláctica, mientras que en otra realización, una composición de vacuna de la presente invención es terapéutica. En una realización, una composición de vacuna profiláctica se administra a una población susceptible de desarrollar o contraer una enfermedad o afección particular, ya sea por exposición ambiental o predisposición genética. Estos factores de susceptibilidad dependen de la enfermedad y son bien conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, en la técnica se sabe que la población compuesta por fumadores (en una realización, cigarrillos, puros, pipas, etc.) es susceptible de desarrollar cáncer de pulmón. Se sabe que la población que presenta una mutación en BRCA-1 y BRCA-2 es susceptible a padecer cáncer de mama y/o de ovario. En la técnica se sabe que la población que comprende polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) particulares en el cromosoma 15 dentro de una región que contiene genes para las subunidades alfa 3 y 5 del receptor nicotínico de acetilcolina es susceptible al cáncer de pulmón. En la técnica se conocen otros factores de susceptibilidad similares, y en una realización se prevé que dichas poblaciones susceptibles sean una población para la cual una vacuna profiláctica de la presente invención sería de gran utilidad.

[0106] En otra realización, "tolerancia" se refiere a la falta de respuesta del huésped a un antígeno. En otra realización, el término se refiere a la falta de respuesta detectable del huésped a un antígeno. En otra realización, el término se refiere a la falta de inmunogenicidad de un antígeno en un huésped. En otra realización, la tolerancia se mide por la falta de respuesta en un ensayo de eliminaciónin vitrode CTL. En otra realización, la tolerancia se mide por la falta de respuesta en un ensayo de hipersensibilidad de tipo retardado. En otra realización, la tolerancia se mide por la falta de respuesta en cualquier otro ensayo adecuado conocido en la técnica. En otra realización, la tolerancia se determina o mide como se representa en los ejemplos descritos en la presente.

[0107] En otra forma de realización, "superar" se refiere a una reversión de la tolerancia por una vacuna. En otra realización, el término se refiere a la generación de una respuesta inmunitaria detectable por una vacuna. En otra realización, la superación de la tolerancia inmunitaria se determina o mide como se representa en los ejemplos aquí descritos.

[0108] En otra realización, la proteína E7 del virus del papiloma humano (VPH) utilizada en la presente invención es una proteína antigénica. En otra realización, la proteína E7 es un fragmento de una proteína antigénica. En otra realización, la proteína E7 es un péptido inmunogénico derivado de un tumor. En otra realización, la proteína E7 es un péptido inmunogénico derivado de una metástasis. En otra realización, la proteína E7 es un péptido inmunogénico derivado de células cancerosas. En otra realización, la proteína E7 es un péptido inmunogénico proangiogénico. En una realización, el antígeno del virus del papiloma humano-E7 (E7 del VPH) proviene del VPH16 (en una realización, número de acceso GenBank AAD33253) y en otra realización, del HPV18 (en una realización, número de acceso GenBank P06788).

[0109] El antígeno E7 del VPH puede ser uno de los siguientes antígenos tumorales: Antígenos 16/18 y E7 del VPH asociados con cánceres cervicales. Por lo tanto, las composiciones de la presente invención pueden utilizarse como inmunoterapéuticos para cánceres, incluyendo el cáncer de cuello uterino, de mama, colorrectal, de próstata, de pulmón y para melanomas.

[0110] En la técnica se conocen métodos para evaluar la producción de una respuesta inmunitaria por parte de un sujeto a un antígeno, y en una realización, se describen a continuación en la sección de Ejemplos.

[0111] En otra realización, la proteína LLO utilizada para construir las composiciones de vacunas de la presente invención tiene la siguiente secuencia:

[0112] MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKH ADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGD AVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADI QVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPG MTNQDNKIVVKNAT KSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYPNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNS LNVNFG AISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPP AYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKV KAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGG SAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDN ELAVIKNNSEYIETTS KAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYDPEGNEIVQHKNWSENNKSKLAHFTSSIYL PGNA RNINVYAKECTGLAWEWWRTVIDDRNLPLVKNRNISIWGTTLYPKYSNKVDNPIE (Número de acceso de GenBank P13128; SEQ ID NO: 37; la secuencia de ácido nucleico se encuentra en el número de acceso GenBank X15127). Los primeros 25 aminoácidos de la proproteína correspondientes a esta secuencia son la secuencia señal y se escinden de LLO cuando es secretada por la bacteria. Así, en esta realización, la proteína LLO activa de longitud completa tiene 504 residuos. En otra realización, la proteína LLO es un homólogo, variante o fragmento de la SEQ ID NO: 37, un fragmento de un homólogo de la SEQ ID NO: 37 o un fragmento de una variante de la SEQ ID NO: 37. En otra realización, la proteína LLO utilizada para construir vacunas y composiciones de la presente invención tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 46 (Ejemplo 1 a continuación). En otra realización, la proteína LLO es una variante o fragmento de la SEQ ID NO:46, o un fragmento de un homólogo de la SEQ ID NO:46 o de una variante de la SEQ ID NO: 46.

[0113] En otra realización, la proteína LLO utilizada para construir composiciones de vacunas y composiciones como se proporciona en la presente es una LLO destoxificada (DTLLO). En otra realización, el DTLLO es un fragmento de la proteína completa. En una realización, la LLO se destoxifica eliminando la porción de secuencia señal del LLO.

[0114] La región de unión al colesterol o dominio de unión al colesterol se conoce como LLO o puede deducirse utilizando métodos conocidos en la técnica (revisado en Alouf, Int J Med Microbiol. 2000 Oct;290(4-5):351-6), incluyendo mutagénesis dirigida al sitio, seguido de un ensayo de unión al colesterol o conservación de secuencia de proteínas con funciones de unión al colesterol similares.

[0115] Como se utiliza en el presente documento, ctLLO es LLO de longitud completa en la que el CBD ha sido reemplazado por un péptido antigénico o un epítopo del mismo. Como se utiliza en el presente documento, mutLLO es aquel en el que el CBD ha sido mutado; por ejemplo, mutLLO es aquel en el que los aminoácidos del CBD han sido mutados, por ejemplo, mediante una mutación puntual, una deleción, una inversión, una sustitución o una combinación de las mismas. La proteína LLO mutada puede comprender cualquier combinación de deleciones, sustituciones o mutaciones puntuales en el CBD y/o deleciones de la secuencia señal de LLO. En otra realización, la mutación del CBD reduce la actividad hemolítica del LLO. En otra variante, el CBD se reemplaza por epítopos restringidos conocidos de clase I del HLA para ser utilizados como vacuna. En otra realización, el LLO mutado se expresa y purifica a partir de sistemas de expresión deE. coli.

[0116] Como se utiliza en el presente documento, "LLO destoxificada" o "DTLLO" se refieren a un LLO como se describe en el presente documento con mutaciones puntuales en el dominio de unión al colesterol.

[0117] Como se utiliza en el presente documento, "fragmento de LLO" o "ΔLLO" se refiere a un fragmento de LLO que comprende el dominio similar a PEST del mismo. En otra realización, los términos se refieren a un fragmento de LLO que comprende una secuencia PEST.

[0118] En otra realización, la proteína recombinante comprende además un polipéptido marcador detectable. En otra realización, no se incluye un polipéptido marcador detectable. En otras realizaciones, el polipéptido marcador es la proteína fluorescente verde (GFP), myc, la piruvato quinasa myc (myc-PK), His<6>, proteína de unión a maltosa (MBP), un polipéptido marcador de hemaglutinina del virus de la influenza, un polipéptido marcador flag (FLAG) y un polipéptido marcador de glutatión-S-transferasa (GST). Sin embargo, no debe interpretarse en modo alguno que la invención está limitada a los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos marcadores enumerados anteriormente. En otra realización, la presente invención utiliza cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique un polipéptido que funcione de manera sustancialmente similar a estos polipéptidos marcadores.

[0120] Tal como se divulga en el presente documento, la presente solicitud proporciona un método para mejorar la inmunogenicidad de un antígeno, que comprende la fusión de una proteína LLO o un fragmento de la misma al antígeno. Como demuestran los datos divulgados en la presente, la fusión de una proteína LLO mutada a un antígeno aumenta la inmunogenicidad del antígeno.

[0122] En otra realización divulgada, una secuencia de AA similar a PEST está contenida en una proteína de fusión LLO. Como se divulga en el presente documento, se demostró una inmunidad celular mejorada para las proteínas de fusión que comprenden un antígeno y un LLO que contiene la secuencia de aminoácidos similar a PEST KENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDK (SEQ ID NO: 63). Como se divulga en el presente documento, la fusión de un antígeno a un LLO no hemolítico que incluye la secuencia de AA similar a PEST, SEQ ID NO: 1, puede potenciar la inmunidad celular y antitumoral del antígeno.

[0124] Una proteína LLO no hemolítica o un fragmento de la misma no tiene por qué ser exactamente la que se describe en las secuencias aquí expuestas, sino que pueden realizarse otras alteraciones, modificaciones o cambios que conserven las características funcionales de una LLO fusionada a un antígeno, tal como se describe en otra parte del presente documento. En otra realización, la presente invención utiliza un análogo de una proteína LLO o un fragmento de la misma. En otra realización, los análogos difieren de las proteínas o péptidos naturales por diferencias de secuencia de AA conservadoras o por modificaciones que no afectan la secuencia, o por ambas.

[0126] La presente solicitud divulga una composición o método en el que se incrementa la expresión de citoquinas (véase, por ejemplo, el Ejemplo 9). En una opción, la citoquina es TNF-alfa, mientras que en otra opción, la citoquina es IL-12, mientras que en otra opción, la citoquina es ISG15, mientras que en otra opción, la citoquina es una citoquina diferente conocida en la técnica. En una opción, el aumento puede darse en la expresión del ARNm de las citoquinas, mientras que en otra opción puede darse en la secreción de citoquinas, mientras que en otra opción, el aumento puede darse tanto en la expresión del ARNm como en la secreción de citoquinas. En otra opción, las composiciones y métodos divulgados en el presente documento pueden aumentar los marcadores de maduración de células dendríticas, que en una opción es CD86, en otra opción, CD40, y en otra opción MHCII, en otra opción, otro marcador de maduración de células dendríticas conocido en la técnica, o, en otra opción, una combinación de los mismos (véase, por ejemplo, el Ejemplo 10). En otra opción, las composiciones y métodos divulgados en el presente documento pueden causar la translocación nuclear de factores de transcripción, que en una opción es NF-kappa-B (véase, por ejemplo, el Ejemplo 11), o en otra opción es un factor de transcripción diferente conocido en la técnica. En otra posibilidad, las composiciones y métodos aquí divulgados pueden provocar la regulación al alza de marcadores de superficie celular, que en una opción podrían ser CD11b, que en otra es la integrina alfa M (ITGAM); el grupo de la molécula de diferenciación 11B; el receptor del complemento 3A (CR3A); o el antígeno 1 de macrófagos (MAC-1A). En otra posibilidad, podría regularse al alza un marcador de superficie celular diferente, expresado por células inmunitarias, tal como lo comprendería un experto en la materia.

[0128] Debe entenderse que, en una realización, un componente de las composiciones de la presente invención, como en una realización, una secuencia de LLO, una secuencia de dominio de unión al colesterol o una secuencia de E7, puede tener homología con una secuencia específica descrita en el presente documento. En una realización, "homología" se refiere a una identidad superior al 70 %. En otra realización, "homología" se refiere a una identidad superior al 72 %. En otra realización, "homología" se refiere a una identidad superior al 75%. En otra realización, "homología" se refiere a una identidad superior al 78%. En otra realización, "homología" se refiere a una identidad superior al 80%. En otra realización, "homología" se refiere a una identidad superior al 82%. En otra realización, "homología" se refiere a una identidad superior al 83%. En otra realización, "homología" se refiere a una identidad superior al 85%. En otra realización, "homología" se refiere a una identidad superior al 87%. En otra realización, "homología" se refiere a una identidad superior al 88%. En otra realización, "homología" se refiere a una identidad superior al 90%. En otra realización, "homología" se refiere a una identidad superior al 92%. En otra realización, "homología" se refiere a una identidad superior al 93%. En otra realización, "homología" se refiere a una identidad superior al 95%. En otra realización, "homología" se refiere a una identidad superior al 96%. En otra realización, "homología" se refiere a una identidad superior al 97%. En otra realización, "homología" se refiere a una identidad superior al 98%. En otra realización, "homología" se refiere a una identidad superior al 99%. En otra realización, "homología" se refiere a una identidad del 100 %.

[0130] Como se utiliza en el presente documento, "ácidos nucleicos" o "nucleótido" se refiere a una cadena de al menos dos combinaciones de base-azúcar-fosfato. El término incluye, en una realización, el ADN y el ARN. En una realización, el término "nucleótidos" se refiere a las unidades monoméricas de los polímeros de ácido nucleico. En una realización, el ARN se presenta como ARNt (ARN de transferencia), ARNsn (ARN nuclear pequeño), ARNr (ARN ribosomal), ARNm (ARN mensajero), ARN antisentido, ARN inhibidor pequeño (ARNip), microARN (miARN) y ribozimas. El uso de ARNsi y ARNmi ha sido descrito (Caudy AA et al, Genes & Devel 16: 2491-96 y las referencias citadas en el mismo). En otras realizaciones, el ADN puede estar en forma de ADN plasmídico, ADN viral, ADN lineal o ADN cromosómico o derivados de esos grupos. Además, estas formas de ADN y ARN pueden ser de cadena simple, doble, triple o cuádruple. En otra realización, el término también incluye ácidos nucleicos artificiales que contienen otros tipos de estructuras principales pero las mismas bases. En una realización, el ácido nucleico artificial es un PNA (ácido nucleico peptídico). Los PNA contienen esqueletos peptídicos y bases nucleotídicas y son capaces de unirse, en una de sus realizaciones, tanto a moléculas de ADN como de ARN. En otra realización, el nucleótido es oxetano modificado. En otra realización, el nucleótido se modifica mediante el reemplazo de uno o más enlaces fosfodiéster con un enlace fosforotioato. En otra realización, el ácido nucleico artificial contiene cualquier otra variante del esqueleto de fosfato de ácidos nucleicos nativos conocidos en la técnica. El uso de ácidos nucleicos de fosfotiorato y PNA es conocido por los expertos en la materia y se describe, por ejemplo, en Neilsen PE, CurrOpin Struct Biol 9:353-57; y Raz NKetal Biochem Biophys Res Commun.297:1075-84. La producción y el uso de ácidos nucleicos es conocido por los expertos en la materia y se describe, por ejemplo, en Molecular Cloning, (2001), Sambrook y Russell, eds. y en Methods in Enzymology: Methods for molecular cloning in eukaryotic cells (Métodos en Enzimología: Métodos para la clonación molecular en células eucariotas) (2003) Purchio y G. C. Fareed.

[0131] En una realización, la homología de proteínas y/o péptidos para cualquier secuencia de AA que se enumera en este documento se determina mediante métodos bien descritos en la técnica, incluyendo el análisis de inmunotransferencia, o mediante el análisis de algoritmos informáticos de secuencias de AA, utilizando cualquiera de los diversos paquetes de software disponibles, a través de métodos establecidos. Algunos de estos paquetes incluyen los paquetes FASTA, BLAST, MPsrch o Scanps, y, en otras realizaciones, emplean el uso de los algoritmos de Smith y Waterman, y/o alineamientos globales/locales o BLOCKS para el análisis, por ejemplo.

[0132] Una proteína recombinante puede elaborarse mediante un proceso que comprende la etapa de conjugación química de un péptido que contiene la proteína LLO o un fragmento de la misma a un péptido que contiene el antígeno E7. Como alternativa, una proteína LLO o un fragmento de la misma se conjuga químicamente a un péptido que comprende el antígeno. Como alternativa, un péptido que comprende la proteína LLO o un fragmento de la misma se conjuga químicamente al antígeno. Como alternativa, la proteína LLO o fragmento del mismo se conjuga químicamente al antígeno.

[0133] "Péptido" como se utiliza en el presente documento se refiere a una cadena de AA conectada mediante enlaces peptídicos. En una realización, un péptido es una cadena corta de AA. En otra realización, el término se refiere a una molécula de péptido variante, que contiene cualquier modificación divulgada o enumerada en el presente documento. En otra realización, el término se refiere a una molécula que contiene una o más fracciones introducidas por un agente reticulante químico. En otra realización, el término se refiere a una molécula mimética de péptidos. En otra realización, el término se refiere a cualquier otro tipo de variante de una molécula peptídica conocida en la técnica.

[0134] El término "proteína" o "polipéptido" se refiere a una cadena de aminoácidos compuesta por múltiples subunidades peptídicas, incluyendo una proteína completa, oligopéptidos y fragmentos de los mismos, en la que los residuos de aminoácidos están unidos por enlaces peptídicos covalentes. En una realización, una proteína descrita en la presente invención puede ser alternativamente un polipéptido de la presente invención.

[0135] Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva y en la sección de ejemplos que sigue, el término "péptido" incluye péptidos nativos (ya sean productos de degradación, péptidos sintetizados sintéticamente o péptidos recombinantes) y peptidomiméticos (típicamente, péptidos sintetizados sintéticamente), tales como peptoides y semipeptoides, que son análogos de péptidos y que pueden tener, por ejemplo, modificaciones que hacen que los péptidos sean más estables dentro de un cuerpo o más capaces de penetrar en las células bacterianas. Dichas modificaciones incluyen, pero sin limitación, la modificación del extremo N terminal, la modificación del extremo C terminal, la modificación del enlace peptídico, incluyendo, pero sin limitación, CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, O=C-NH, CH2-O, CH2-CH2, S=C-NH, CH=CH o CF=CH, modificaciones de la cadena principal y modificación de residuos. Los métodos para preparar compuestos peptidomiméticos son bien conocidos en la técnica y se especifican, por ejemplo, en Quantitative Drug Design (Diseño Cuantitativo de Fármacos) (Quantitative Drug Design, CA). Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992). A continuación se proporcionan más detalles al respecto.

[0136] Los enlaces peptídicos (-CO-NH-) dentro del péptido pueden estar sustituidos, por ejemplo, por enlaces N-metilados (-N(CH3)-CO-), enlaces éster (-C(R)HCOOC(R)-N-), enlaces cetometileno (-CO-CH2-), enlaces α-aza (-NH-N(R)-CO-), donde R es cualquier alquilo, por ejemplo, metilo, enlaces carba (-CH2-NH-), enlaces hidroxietileno (-CH(OH)-CH2-), enlaces tioamida (-CS-NH-), dobles enlaces olefínicos (-CH=CH-), enlaces retroamida (-NH-CO-), derivados peptídicos (-N(R)-CH2-CO-), donde R es la cadena lateral "normal", presentada naturalmente en el átomo de carbono.

[0137] Estas modificaciones pueden producirse en cualquiera de los enlaces a lo largo de la cadena peptídica e incluso en varios (2-3) al mismo tiempo.

[0138] Los aminoácidos aromáticos naturales, Trp, Tyr y Phe, pueden sustituir a ácidos sintéticos no naturales como TIC, naftilelanina (Nol), derivados metilados en el anillo de Phe, derivados halogenados de Phe o o-metil-Tyr.

[0139] Además de lo anterior, los péptidos también pueden incluir uno o más aminoácidos modificados o uno o más monómeros no aminoácidos (por ejemplo, ácidos grasos, carbohidratos complejos, etc.).

[0140] Como se utiliza en la presente memoria descriptiva y en la sección de reivindicaciones que figura a continuación, se entiende que el término "aminoácido" o "aminoácidos" incluye los 20 aminoácidos de origen natural; aquellos aminoácidos que a menudo se modifican postraduccionalmentein vivo, incluyendo, por ejemplo, la hidroxiprolina, la fosfoserina y la fosfotreonina; y otros aminoácidos inusuales incluyendo, pero sin limitación, el ácido 2-aminoadípico, la hidroxilisina, la isodesmosina, la norvalina, la norleucina y la ornitina. Además, el término "aminoácido" incluye tanto los aminoácidos D como los L.

[0141] En una realización, un aminoácido en las composiciones y para su uso en la presente invención puede ser un aminoácido natural o un aminoácido no convencional o modificado, que se conocen en la técnica.

[0142] En el Ejemplo 11 se describe un método utilizado para conjugar la proteína LLO no hemolítica o un fragmento de la misma al antígeno. Los métodos para la conjugación química de péptidos entre sí son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en (Biragyn, A y Kwak, LW (2001) Mouse models for lymphoma (Modelos de ratón para linfoma) en "Current Protocols in Immunology" 20.6.1-20.6.30) y (Collawn, JF y Paterson, Y. (1989) (Preparation of Anti-peptide antibodies) Preparación de anticuerpos anti-péptido. En Current Protocols in Molecular Biology. Suplemento 6. Ed. F.M. Ausubel et.al. Greene Publishing/Wiley 11.14.1 -11.15.3).

[0143] En otra realización, la proteína LLO no hemolítica se une al antígeno E7 o a un fragmento del mismo mediante conjugación química. En otra realización, para la conjugación se utiliza glutaraldehído. En otra realización, la conjugación se realiza utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica.

[0144] En otra realización, las proteínas de fusión se preparan mediante cualquier método adecuado, incluyendo, por ejemplo, la clonación y restricción de secuencias apropiadas o la síntesis química directa mediante métodos que se describen a continuación. En otra realización, las subsecuencias se clonan y las subsecuencias adecuadas se escinden utilizando enzimas de restricción adecuadas. Después, en otra realización, los fragmentos se ligan para producir la secuencia de ADN deseada. En otra realización, el ADN que codifica la proteína de fusión se produce utilizando métodos de amplificación de ADN, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Primero, los segmentos del ADN nativo a cada lado del nuevo extremo se amplifican por separado. El extremo 5' de una de las secuencias amplificadas codifica el conector peptídico, mientras que el extremo 3' de la otra secuencia amplificada también codifica el conector peptídico. Dado que el extremo 5' del primer fragmento es complementario al extremo 3' del segundo fragmento, los dos fragmentos (después de una purificación parcial, por ejemplo, en agarosa LMP) pueden utilizarse como plantilla superpuesta en una tercera reacción de PCR. La secuencia amplificada contendrá codones, el segmento en el lado carboxilo del sitio de apertura (que ahora forma la secuencia amino), el conector y la secuencia en el lado amino del sitio de apertura (que ahora forma la secuencia carboxilo). A continuación, el inserto se liga a un plásmido.

[0145] En otra realización, una proteína recombinante de la presente invención se sintetiza utilizando técnicas estándar de síntesis química de péptidos. En otra realización, la molécula quimérica se sintetiza como un único polipéptido contiguo. En otra realización, la proteína LLO no hemolítica o un fragmento de la misma y el antígeno se sintetizan por separado y después se fusionan por condensación del extremo terminal amino de una molécula con el extremo terminal carboxilo de la otra molécula, formando así un enlace peptídico. En otra realización, la proteína LLO y el antígeno se condensan cada uno con un extremo de una molécula espaciadora peptídica, formando así una proteína de fusión contigua.

[0146] En otra realización, las proteínas de la presente invención se preparan mediante síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) como lo describen Stewart et al. en Solid Phase Peptide Synthesis, 2.ª edición, 1984, Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.; o como lo describen Bodanszky y Bodanszky (The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag, Nueva York). En otra realización, un residuo de AA adecuadamente protegido se une a través de su grupo carboxilo a un soporte polimérico insoluble derivado, como poliestireno reticulado o resina de poliamida. "Debidamente protegido" se refiere a la presencia de grupos protectores tanto en el grupo alfa-amino del aminoácido como en cualquier grupo funcional de la cadena lateral. Los grupos protectores de las cadenas laterales son generalmente estables a los disolventes, reactivos y condiciones de reacción utilizados durante la síntesis, y pueden eliminarse en condiciones que no afecten al producto peptídico final. La síntesis gradual del oligopéptido se realiza mediante la eliminación del grupo N-protector del AA inicial y el acoplamiento a este del extremo carboxilo del siguiente AA en la secuencia del péptido deseado. Este AA también está debidamente protegido. El grupo carboxilo del AA entrante puede activarse para reaccionar con el extremo terminal N del AA unido al soporte mediante la formación de un grupo reactivo, como una carbodiimida, un anhídrido de ácido simétrico o un grupo "éster activo" como el hidroxibenzotriazol o los ésteres de pentafluorofenilo.

[0147] Entre los ejemplos de métodos de síntesis de péptidos en fase sólida se incluyen el método BOC, que utiliza terc-butiloxcarbonilo como grupo protector alfa-amino, y el método FMOC, que utiliza 9-fluorenilmetiloxcarbonilo para proteger el alfa-amino de los residuos de AA; ambos métodos son bien conocidos por los expertos en la materia.

[0148] En otra realización, la incorporación de grupos bloqueadores N y/o C se logra utilizando protocolos convencionales para los métodos de síntesis de péptidos en fase sólida. Para la incorporación de grupos bloqueadores C-terminales, por ejemplo, la síntesis del péptido deseado se realiza normalmente utilizando, como fase sólida, una resina de soporte que ha sido modificada químicamente de manera que la escisión de la resina dé como resultado un péptido que tenga el grupo bloqueador C-terminal deseado. Para obtener péptidos en los que el extremo C-terminal tenga un grupo bloqueador amino primario, por ejemplo, la síntesis se realiza utilizando una resina de pmetilbenzidrilamina (MBHA) de modo que, una vez completada la síntesis del péptido, el tratamiento con ácido fluorhídrico libera el péptido amidado en el extremo C-terminal deseado. De manera similar, la incorporación de un grupo bloqueante N-metilamina en el extremo C-terminal se logra utilizando resina DVB derivatizada con N-metilaminoetilo, que tras el tratamiento con HF libera un péptido que porta un extremo C-terminal N-metilamidado. El bloqueo del extremo C-terminal mediante esterificación también puede lograrse utilizando procedimientos convencionales. Esto implica el uso de una combinación de resina/grupo bloqueante que permite la liberación del péptido de cadena lateral de la resina, para permitir la reacción posterior con el alcohol deseado, para formar la función éster. Para este fin puede utilizarse el grupo protector FMOC, en combinación con resina DVB derivatizada con alcohol metoxialcoxibencílico o un conector equivalente, y la escisión del soporte se efectúa mediante TFA en diclorometano. La esterificación de la función carboxílica adecuadamente activada, por ejemplo con DCC, puede proceder luego mediante la adición del alcohol deseado, seguido de la desprotección y el aislamiento del producto peptídico esterificado.

[0149] La incorporación de grupos bloqueantes N-terminales puede lograrse mientras el péptido sintetizado aún está unido a la resina, por ejemplo, mediante tratamiento con un anhídrido y nitrilo adecuados. Para incorporar un grupo bloqueador de acetilo en el extremo N-terminal, por ejemplo, el péptido acoplado a la resina puede tratarse con anhídrido acético al 20 % en acetonitrilo. El producto peptídico bloqueado con N puede entonces escindirse de la resina, desprotegerse y posteriormente aislarse.

[0150] Puede realizarse un análisis de la composición del péptido para verificar la identidad del péptido producido. En otra realización, el análisis de la composición de AA se lleva a cabo utilizando espectrometría de masas de alta resolución para determinar el peso molecular del péptido. Como alternativa, o adicionalmente, el contenido de AA del péptido se confirma hidrolizando el péptido en ácido acuoso y separando, identificando y cuantificando los componentes de la mezcla utilizando HPLC o un analizador de AA. Los secuenciadores de proteínas, que degradan secuencialmente el péptido e identifican los aminoácidos en orden, también pueden utilizarse para determinar definitivamente la secuencia del péptido.

[0151] Antes de su uso, el péptido puede purificarse para eliminar contaminantes. El péptido puede purificarse para cumplir con los estándares establecidos por las agencias reguladoras y las directrices pertinentes. Para alcanzar el nivel de pureza requerido, puede emplearse cualquiera de los diversos procedimientos de purificación convencionales, tales como, por ejemplo, la cromatografía líquida de alta resolución de fase reversa (HPLC) utilizando una columna de sílice alquilada, tal como sílice C<4>, C<8>o C<18>. Para lograr la purificación, generalmente se utiliza una fase móvil con gradiente de contenido orgánico creciente; por ejemplo, acetonitrilo en un tampón acuoso que suele contener una pequeña cantidad de ácido trifluoroacético. La cromatografía de intercambio iónico también puede utilizarse para separar péptidos en función de su carga.

[0152] En otra realización, se utiliza para la síntesis química de los péptidos la síntesis en fase sólida en la que el AA C-terminal de la secuencia se une a un soporte insoluble, seguido de la adición secuencial de los AA restantes de la secuencia. Barany y Merrifield describen las técnicas para la síntesis en fase sólida en Solid-Phase Peptide Synthesis; pp.3-284 en The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol.2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A., Merrifield, et al. J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2156(1963) y Stewart et.al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª ed. Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. (1984).

[0153] En otra realización, las proteínas de fusión se sintetizan utilizando la metodología del ADN recombinante. En otra realización, el ADN que codifica la proteína de fusión se prepara mediante cualquier método adecuado, incluyendo, por ejemplo, la clonación y restricción de secuencias apropiadas o la síntesis química directa mediante métodos como el método fosfotriéster de Narang et al. (1979, Meth. Enzymol.68: 90-99); el método fosfodiéster de Brown et al. (1979, Meth. Enzymol 68: 109-151); el método de dietilfosforamidita de Beaucage et al. (1981, Tetra. Lett., 22:1859-1862); y el método de soporte sólido de la patente de Estados Unidos N.º 4.458.066.

[0154] En otra realización, los péptidos incorporan residuos de AA que se modifican sin afectar la actividad. En otra realización, los extremos terminales se derivatizan para que incluyan grupos bloqueantes, es decir, sustituyentes químicos adecuados para proteger y/o estabilizar los extremos N y C terminales de la "degradación indeseable", un término que abarca cualquier tipo de descomposición enzimática, química o bioquímica del compuesto en sus extremos que pueda afectar a la función del compuesto, es decir, la degradación secuencial del compuesto en un extremo terminal del mismo.

[0155] En otra realización, los grupos bloqueadores incluyen grupos protectores utilizados convencionalmente en el campo de la química de péptidos que no afectarán negativamente a las actividadesin vivodel péptido. Por ejemplo, pueden introducirse grupos bloqueadores N-terminales adecuados mediante alquilación o acilación del extremo N-terminal. Entre los ejemplos de grupos bloqueadores N-terminales adecuados se incluyen grupos alquilo C<1>-C<5>ramificados o no ramificados, grupos acilo, tales como los grupos formilo y acetilo, así como formas sustituidas de los mismos, como el grupo acetamidometilo (Acm). Los análogos de aminoácidos desamino también son grupos bloqueadores N-terminales útiles y pueden acoplarse al extremo N-terminal del péptido o utilizarse en lugar del residuo N-terminal. Entre los grupos bloqueadores C-terminales adecuados, en los que el grupo carboxilo del extremo C-terminal está incorporado o no, se incluyen ésteres, cetonas o amidas. Grupos alquilo formadores de ésteres o cetonas, particularmente grupos alquilo inferiores como metilo, etilo y propilo, y grupos amino formadores de amidas como las aminas primarias (-NH<2>), y los grupos mono- y di-alquilamino, tales como metilamino, etilamino, dimetilamino, dietilamino, metiletilamino y similares, son ejemplos de grupos bloqueadores C-terminales. Los análogos de AA descarboxilados, tales como la agmatina, también son grupos bloqueadores C-terminales útiles y pueden acoplarse al residuo C-terminal del péptido o utilizarse en su lugar. En otra realización, los grupos amino y carboxilo libres en los extremos terminales se eliminan por completo del péptido para obtener formas desamino y descarboxiladas del mismo sin afectar a la actividad del péptido.

[0156] También pueden incorporarse otras modificaciones sin que ello afecte negativamente a la actividad. Dichas modificaciones incluyen la sustitución de uno o más aminoácidos en la forma isomérica L natural por aminoácidos isoméricos D. En otra realización, el péptido incluye uno o más residuos de aminoácidos D, o comprende AA que están todos en la forma D. También se contemplan formas retroinversas de péptidos, por ejemplo, péptidos invertidos en los que todos los aminoácidos se sustituyen por formas de D-aminoácidos.

[0157] En otra realización, se utilizan sales de adición de ácidos de los péptidos como equivalentes funcionales de los mismos. En otra realización, un péptido se trata con un ácido inorgánico como clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico y similares, o un ácido orgánico como acético, propiónico, glicólico, pirúvico, oxálico, málico, malónico, succínico, maleico, fumárico, tartárico, cítrico, benzoico, cinámico, mandélico, metanosulfónico, etanosulfónico, ptoluenosulfónico, salicicíclico y similares, para proporcionar una sal soluble en agua del péptido.

[0158] En otra realización, las modificaciones (que normalmente no alteran la secuencia primaria) incluyen derivatización químicain vivooin vitrode polipéptidos, por ejemplo, acetilación o carboxilación. También se incluyen modificaciones de la glicosilación, por ejemplo, aquellas realizadas al modificar los patrones de glicosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento o en etapas de procesamiento posteriores; por ejemplo, al exponer el polipéptido a enzimas que afectan a la glicosilación, por ejemplo, enzimas glicosilantes o deglicosilantes de mamíferos. También se incluyen secuencias que tienen residuos de AA fosforilados, por ejemplo, fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina.

[0159] Los polipéptidos pueden modificarse utilizando técnicas de biología molecular convencionales para mejorar su resistencia a la degradación proteolítica, optimizar sus propiedades de solubilidad o hacerlos más adecuados como agente terapéutico. Entre los análogos de dichos polipéptidos se incluyen aquellos que contienen residuos distintos de los L-aminoácidos de origen natural, por ejemplo, D-aminoácidos o aminoácidos sintéticos de origen no natural.

[0160] En esta solicitud también se divulga un kit que comprende una proteína LLO no hemolítica o un fragmento de la misma, como se describe en el presente documento, fusionada a un antígeno E7, un aplicador y material instructivo que describe su uso. Aunque a continuación se describen los kits de modelos, el contenido de otros kits útiles resultará evidente para los expertos en la materia a la luz de la presente información.

[0161] En una realización, las composiciones y usos como se describen en el presente documento comprenden elementos o etapas particulares, como se describe en el presente documento, mientras que en otra realización consisten esencialmente en dichos elementos o etapas, mientras que en otra realización consisten en dichos elementos o etapas. En algunas realizaciones, el término "comprende" se refiere a la inclusión del agente activo indicado, así como a la inclusión de otros agentes activos y portadores, excipientes, emolientes, estabilizadores, etc. farmacéuticamente aceptables, como se conocen en la industria farmacéutica. En algunas realizaciones, el término "que consiste esencialmente en" se refiere a una composición cuyo único ingrediente activo es el ingrediente activo indicado; sin embargo, pueden incluirse otros compuestos que sirven para estabilizar, conservar, etc., la formulación, pero que no participan directamente en el efecto terapéutico del ingrediente activo indicado. En algunas realizaciones, el término "que consiste esencialmente en" puede referirse a componentes que facilitan la liberación del ingrediente activo. En algunas realizaciones, el término "que consiste en" se refiere a una composición que contiene el ingrediente activo y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

[0162] En una realización, "tratar" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas, cuyo objetivo es prevenir o disminuir la condición o trastorno patológico objetivo, tal como se ha descrito anteriormente en la presente. Así, en una realización, el tratamiento puede incluir afectar o curar directamente, suprimir, inhibir, prevenir, reducir la gravedad de, retrasar la aparición de, reducir los síntomas asociados con la enfermedad, trastorno o afección, o una combinación de los mismos. Así, en una realización, "tratar" se refiere, entre otros, a retrasar la progresión, acelerar la remisión, inducir la remisión, aumentar la remisión, acelerar la recuperación, aumentar la eficacia o disminuir la resistencia a terapias alternativas, o una combinación de las mismas. En una realización, "prevenir" se refiere, entre otras cosas, a retrasar la aparición de los síntomas, prevenir la recaída de una enfermedad, disminuir el número o la frecuencia de los episodios de recaída, aumentar la latencia entre los episodios sintomáticos o una combinación de los mismos. En una realización, "suprimir" o "inhibir" se refiere, entre otras cosas, a reducir la gravedad de los síntomas, reducir la gravedad de un episodio agudo, reducir el número de síntomas, reducir la incidencia de síntomas relacionados con la enfermedad, reducir la latencia de los síntomas, aliviar los síntomas, reducir los síntomas secundarios, reducir las infecciones secundarias, prolongar la supervivencia del paciente o una combinación de los mismos.

[0164] En una realización, "funcional", dentro del significado de la invención, se utiliza en la presente para referirse a la capacidad innata de una proteína, péptido, ácido nucleico, fragmento o una variante del mismo para mostrar una actividad o función biológica. En una realización, dicha función biológica es su propiedad de unión a un socio de interacción, por ejemplo, un receptor asociado a la membrana, y en otra realización, su propiedad de trimerización. En el caso de los fragmentos funcionales y las variantes funcionales de la invención, estas funciones biológicas pueden, de hecho, modificarse, por ejemplo, en cuanto a su especificidad o selectividad, pero conservando la función biológica básica.

[0166] En una realización, la "fusión genética" tal como se proporciona en la presente tiene como objetivo dar como resultado un ADN quimérico que contiene, cada uno en su propia realización discreta, un promotor y una secuencia codificante que no están asociados en la naturaleza.

[0168] SECCIÓN DE DETALLES EXPERIMENTALES

[0169] MATERIALES Y MÉTODOS EXPERIMENTALES

[0171] Líneas celulares

[0173] El tumor singénico C57BL/6 TC-1 fue inmortalizado con E6 y E7 de VPH-16 y transformado con el oncogén c-Haras. TC-1 expresa bajos niveles de E6 y E7 y es altamente tumorigénico. TC-1 se cultivó en RPMI 1640, FCS al 10 %, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina, 100 μM de aminoácidos no esenciales, 1 mM de piruvato de sodio, 50 micromolar (mcM) 2-ME, 400 microgramos (mcg)/ml G418 y 10 % de medio de la Colección Nacional de Cultivos Tipo 109 a 37° con 10 % de CO<2>. C3 es una célula embrionaria de ratón de ratones C57BL/6 inmortalizada con el genoma completo del HPV 16 y transformada con pEJ-ras. EL-4/E7 es el timoma EL-4 transducido retroviralmente con E7.

[0175] Cepas y propagación de L. monocitogenes

[0177] Las cepas deListeriautilizadas fueron Lm-LLO-E7 (gen de fusión hly-E7 en un sistema de expresión episomal; Figura 1), Lm-E7 (casete del gen E7 de copia única integrado en genoma deListeria), Lm-LLO-NP ("DP-L2028"; gen de fusión hly-NP en un sistema de expresión episomal) y Lm-Gag ("ZY-18"; casete del gen Gag del VIH-1 de copia única integrado en el cromosoma). E7 se amplificó mediante PCR utilizando los cebadores 5’-GGCTCGAGCATGGAGATACACC-3’ (SEQ ID NO: 38; el sitio XhoI está subrayado) y 5’-GGGGACTAGTTTATGGTTTCTGAGAACA-3’ (SEQ ID NO: 39; el sitio SpeI está subrayado) y se ligó en pCR2.1 (Invitrogen, San Diego, CA). E7 se escindió de pCR2.1 mediante digestión con XhoI/SpeI y se ligó en pGG-55. El gen de fusión hly-E7 y el factor de transcripción pluripotencial prfA se clonaron en pAM401, un plásmido lanzadera multicopia (Wirth Ret al, J Bacteriol, 165:831,1986), generando pGG-55. El promotor hly dirige la expresión de los primeros 441 aminoácidos del producto del gen hly (que carece del extremo C terminal hemolítico, denominado a continuación "ΔLLO", y que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 17), que se une mediante el sitio XhoI al gen E7, dando como resultado un gen de fusión hly-E7 que se transcribe y secreta como LLO-E7. Transformación de una cepa prfA negativa deListeria,XFL-7 (proporcionado por el Dr. Hao Shen, Universidad de Pensilvania), con pGG-55 seleccionado para la retención del plásmidoin vivo(Figuras 1A-B). El promotor hly y el fragmento del gen se generaron utilizando cebadores 5’-GGGGGCTAGCCCTCCTTTGATTAGTATATTC-3’ (SEQ ID NO: 40; el sitio NheI está subrayado) y 5'-CTCCCTCGAGATCATAATTTACTTCATC-3' (SEQ ID NO: 41; el sitio XhoI está subrayado). El gen prfA se amplificó mediante PCR utilizando cebadores 5'-GACTACAAGGACGATGACCGACAAGTGATAACCCGGGATCTAAATAAA TCCGTTT-3' (SEQ ID NO: 42; el sitio XbaI está subrayado) y 5'-CCCGTCGACCAGCTCTTCTTGGTGAAG-3' (SEQ ID NO: 43; el sitio SalI está subrayado). Lm-E7 se generó introduciendo un casete de expresión que contenía el promotor hly y la secuencia señal que dirige la expresión y la secreción de E7 en el dominio orfZ del genoma LM. E7 se amplificó mediante PCR utilizando los cebadores 5'-GCGGATCCCATGGAGATACACCTAC-3' (SEQ ID NO: 44; el sitio BamHI está subrayado) y 5'-GCTCTAGATTATGGTTTCTGAG-3' (SEQ ID NO: 45; el sitio XbaI está subrayado). Después, E7 se ligó al vector lanzadera pZY-21. La cepa LM 10403S se transformó con el plásmido resultante, pZY-21-E7, que incluye un casete de expresión insertado en medio de una secuencia de 1,6 kb que corresponde al dominio orfX, Y, Z del genoma LM. El dominio de homología permite la inserción del casete del gen E7 en el dominio orfZ mediante recombinación homóloga. Se analizaron clones para detectar la integración del casete del gen E7 en el dominio orfZ. Las bacterias se cultivaron en medio de infusión cerebro-corazón con (Lm-LLO-E7 y Lm-LLO-NP) o sin (Lm-E7 y ZY-18) cloranfenicol (20 μg/ml). Las bacterias se congelaron en alícuotas a -80 °C. La expresión se verificó mediante transferencia de Western (Figura 2).

[0178] Transferencia de Western

[0179] Las cepas deListeriase cultivaron en medio Luria-Bertoni a 37 °C y se recogieron a la misma densidad óptica medida a 600 nm. Los sobrenadantes se precipitaron con TCA y se resuspendieron en tampón de muestra 1x suplementado con NaOH 0,1 N. Se cargaron cantidades idénticas de cada sedimento celular o de cada sobrenadante precipitado con TCA en geles SDS-PAGE de Tris-glicina al 4-20 % (NOVEX, San Diego, CA). Los geles se transfirieron a difluoruro de polivinilideno y se sondearon con un anticuerpo monoclonal anti-E7 (mAb) (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA), después se incubaron con un anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con HRP (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, Reino Unido), se divulgaron con reactivos de detección Amersham ECL y se expusieron a Hyperfilm (Amersham Pharmacia Biotech).

[0180] Medición del crecimiento tumoral

[0181] Los tumores se midieron cada dos días con un calibrador que abarcaba los diámetros superficiales más corto y más largo. La media de estas dos mediciones se representó gráficamente como el diámetro medio del tumor en milímetros frente a varios puntos temporales. Los ratones se sacrificaron cuando el diámetro del tumor alcanzó los 20 mm. Las mediciones del tumor para cada punto temporal se muestran solo para los ratones supervivientes.Efectos de los recombinantes de Listeria sobre el crecimiento de tumores establecidos

[0182] Ratones C57BL/6 de seis a ocho semanas de edad (Charles River) recibieron 2 x 10<5>células TC-1 por vía subcutánea en el costado izquierdo. Una semana después de la inoculación del tumor, los tumores habían alcanzado un tamaño palpable de 4-5 mm de diámetro. Posteriormente, se trató a grupos de ocho ratones con 0,1 LD<50>i.p. Lm-LLO-E7 (10<7>UFC), Lm- E7 (10<6>UFC), Lm-LLO-NP (10<7>UFC) o Lm-Gag (5 x 10<5>UFC) en los días 7 y 14.

[0183] Ensayo de liberación de 51Cr

[0184] Se inmunizaron ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad por vía intraperitoneal con 0,1 LD<50>Lm-LLO-E7, Lm-E7, Lm-LLO-NP o Lm-Gag. Diez días después de la inmunización, se extrajeron los bazos. Los esplenocitos se establecieron en cultivo con células TC-1 irradiadas (100:1, esplenocitos:TC-1) como células alimentadoras; estimuladosin vitrodurante 5 días, después se utiliza en un ensayo de liberación de<51>Cr estándar, utilizando los siguientes objetivos: EL-4, EL-4/E7 o EL-4 pulsado con el péptido E7 H-2b (RAHYNIVTF; SEQ ID NO: 19). Las proporciones de células Efectoras:Diana, realizadas por triplicado, fueron 80:1, 40:1, 20:1, 10:1, 5:1 y 2,5:1. Después de una incubación de 4 h a 37 °C, las células se centrifugaron y se extrajeron 50 μl de sobrenadante de cada pocillo. Las muestras se analizaron con un contador de centelleo Wallac 1450 (Gaithersburg, MD). El porcentaje de lisis específica se determinó como [(recuentos experimentales por minuto - recuentos espontáneos por minuto)/(recuentos totales por minuto - recuentos espontáneos por minuto)] x 100.

[0185] Proliferación específica de TC-1

[0186] Se inmunizaron ratones C57BL/6 con 0,1 LD<50>y se reforzaron mediante inyección intraperitoneal 20 días después con 1 LD<50>Lm-LLO-E7, Lm-E7, Lm-LLO-NP o Lm-Gag. Seis días después de la administración de la dosis de refuerzo, se extrajeron los bazos de ratones inmunizados y no inmunizados. Los esplenocitos se establecieron en cultivo a una concentración de 5 x 10<5>/pocillos en placas de 96 pocillos de fondo plano con dimensiones de 2,5 x 10<4>, 1,25 x 10<4>, 6 x 10<3>o 3 x 10<3>células TC-1 irradiadas/pocillo como fuente de E7 Ag, o sin células TC-1 o con 10 μg/ml de A Con. Las células se pulsaron 45 h después con 0,5 μCi [<3>[H]timidina/pocillo. Las placas se recogieron 18 h después utilizando un recolector Tomtec 96 (Orange, CT) y la proliferación se evaluó con un contador de centelleo Wallac 1450. El cambio en los recuentos por minuto se calculó como recuentos experimentales por minuto - recuentos sin Ag por minuto.

[0187] Análisis citométrico de flujo

[0188] Se inmunizaron ratones C57BL/6 por vía intravenosa (i.v.) con 0,1 LD<50>Lm-LLO-E7 o Lm-E7 y se reforzaron 30 días después. Se realizó citometría de flujo de tres colores para CD8 (53-6.7, conjugado con PE), ligando CD62 (CD62L; MEL-14, conjugado con APC) y tetrámero E7 H-2Db utilizando un citómetro de flujo FACSCalibur® con el software CellQuest® (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Los esplenocitos recogidos 5 días después del refuerzo se tiñeron a temperatura ambiente (t) con tetrámeros H-2Db cargados con el péptido E7 (RAHYNIVTF; SEQ ID NO: 19) o un péptido de control (VIH-Gag). Los tetrámeros se utilizaron en una dilución de 1/200 y fueron proporcionados por el Dr. Larry R. Pease (Mayo Clinic, Rochester, MN) y por el Centro de Tetrámeros del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas y el Programa de Reactivos de Referencia e Investigación del SIDA de los Institutos Nacionales de Salud. Se analizaron células Tetramero<+>, CD8<+>, CD62L<bajo>.

[0189] Depleción de componentes inmunitarios específicos

[0190] Se realizó la depleción de las células CD8+, las células CD4+ y el IFN en ratones portadores de TC-1 mediante la inyección de 0,5 mg por ratón de mAb: 2,43, GK1,5 o xmg1,2, respectivamente, en los días 6, 7, 8, 10, 12 y 14 posteriores al desafío tumoral. Las poblaciones de células CD4+ y CD8+ se redujeron en un 99 % (análisis de citometría de flujo). La depleción de las células CD25+ se realizó mediante inyección intraperitoneal de 0,5 mg/ratón de mAb anti-CD25 (PC61, proporcionado por Andrew J. Caton) los días 4 y 6. La depleción del TGF se realizó mediante inyección intraperitoneal del mAb anti-TGF- (2G7, proporcionado por HI Levitsky) en ratones portadores de TC-1 los días 6, 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18 y 20. Los ratones fueron tratados con 10<7>Lm-LLO-E7 o Lm-E7 el día 7 después del desafío tumoral.

[0191] Transferencia adoptiva

[0192] Se inmunizaron ratones donantes C57BL/6 y recibieron una dosis de refuerzo 7 días después con 0,1 LD<50>Lm-E7 o Lm-Gag. Los esplenocitos del donante se recogieron y se pasaron a través de columnas de lana de nailon para enriquecerlos con células T. Las células T CD8+ se agotaronin vitroincubando con 0,1 μg de mAb anti-CD82,43 durante 30 min a temperatura ambiente. Posteriormente, las células marcadas se trataron con complemento de conejo. Los esplenocitos del donante contenían >60 % de linfocitos T CD4+ (análisis de citometría de flujo). Los ratones receptores portadores de tumores TC-1 fueron inmunizados con 0,1 LD<50>7 días después del desafío tumoral. Los esplenocitos de donantes enriquecidos con CD4+ (10<7>) fueron transferidos 9 días después de la inoculación del tumor a ratones receptores mediante inyección intravenosa.

[0193] Experimento B16F0-Ova

[0194] Se inoculó a 24 ratones C57BL/6 con 5 x 10<5>células B16F0-Ova. Los días 3, 10 y 17, se inmunizaron grupos de 8 ratones con 0,1 LD<50>Lm-OVA (10<6>ufc), Lm-LLO-OVA (10<8>ufc) y ocho animales quedaron sin tratamiento.Estadísticas

[0195] Para comparar los diámetros tumorales, se determinaron la media y la desviación estándar del tamaño tumoral para cada grupo, y la significación estadística se determinó mediante la prueba t de Student. Se consideró significativo un valor p ≤ 0,05.

[0196] EJEMPLO 1: MUTAGÉNESIS DIRIGIDA AL SITIO DEL DOMINIO DE UNIÓN AL COLESTEROL LLO

[0197] Se realizó mutagénesis dirigida al sitio en LLO para introducir mutaciones puntuales inactivadoras en el CBD, utilizando la siguiente estrategia. La proteína resultante se denomina "mutLLO":

[0198] Subclonación de LLO en pET29b

[0199] La secuencia de aminoácidos de la LLO de tipo silvestre es:

[0202]

[0204] El péptido señal y el dominio de unión al colesterol (CBD) están subrayados, con 3 residuos críticos en el CBD (C484, W491 y W492) en negrita cursiva.

[0205] Se agregó una etiqueta A6xHis (HHHHHH) a la región C-terminal de LLO. La secuencia de aminoácidos de LLO con etiqueta His es:

[0208]

[0211] Un gen que codifica una proteína LLO etiquetada con His se digirió con NdeI/BamHI, y el NdeI/BamHI se subclonó en el vector de expresión pET29b, entre los sitios NdeI y BamHI. La secuencia del gen que codifica la proteína LLO es:

[0214]

[0217] Las secuencias subrayadas son, comenzando desde el inicio de la secuencia, el sitio Ndel, el sitio Nhel, la región codificante de CBG, la etiqueta 6x His y el sitio BamHI. Los residuos de CBD que se mutarán en la siguiente etapa están en negrita cursiva.

[0218] PCR por empalme mediante extensión de solapamiento (SOE)

[0219] Etapa 1: Las reacciones de PCR n.º 1 y n.º 2 se realizaron en la plantilla pET29b-LLO. La reacción de PCR n.º 1, utilizando los cebadores n.º 1 y n.º 2, amplificó el fragmento entre el sitio NheI y el CBD, inclusive, introduciendo una mutación en el CBD. La reacción de PCR n.° 2, utilizando los cebadores n.° 3 y n.° 4, amplificó el fragmento entre el CBD y el sitio BamHI, inclusive, introduciendo la misma mutación en el CBD (Figura 1A).

[0220] Reacción PCR n.º 1 ciclo: A) 94 °C 2 min 30 s, B) 94 °C 30 s, C) 55 °C 30 s, D) 72 °C 1 min, Repetir los pasos B a D 29 veces (30 ciclos en total), E) 72 °C 10 min.

[0221] Reacción PCR n.º 2 ciclo: A) 94 °C 2 min 30 s, B) 94 °C 30 s, C) 60°C 30 s, D) 72 °C 1 min, Repetir los pasos B a D 29 veces (30 ciclos en total), E) 72 °C 10 min.

[0222] Etapa 2: Los productos de las reacciones de PCR n.° 1 y n.° 2 se mezclaron, se dejaron hibridar (en la región codificante de CBD mutada) y se realizó la PCR con los cebadores n.° 1 y n.° 4 durante 25 ciclos más (Figura 1B). Ciclo de reacción PCR: A) 94 °C 2 min 30 s, B) 94 °C 30 s, C) 72 °C 1 min Repetir etapas B a C 9 veces (10 ciclos en total), Agregar los cebadores n.º 1 y n.º 4, D) 94 °C 30 segundos, E) 55 °C 30 segundos, F) 72 °C 1 minuto, Repetir los pasos D a F 24 veces (25 ciclos en total), G) 72 °C 10 minutos.

[0223] Secuencias de cebadores:

[0224] Cebador 1: GCTAGCTCATTTCACATCGT (SEQ ID NO: 49; la secuencia NheI está subrayada).

[0225] Cebador 2: TCTTGCAGCTTCCCAAGCTAAACCAGTCGCTTCTTTAGCGTAAACATTAATATT (SEQ ID NO: 50; la secuencia codificante de CBD está subrayada; los codones mutados están en negrita cursiva).

[0226] Cebador 3: GAAGCGACTGGTTTAGCTTGGGAAGCTGCAAGAACGGTAATTGATGACCGGA AC (SEQ ID NO: 51; la secuencia codificante de CBD está subrayada; los codones mutados están en negrita cursiva).

[0227] Cebador 4: GGATCCTTATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCGATTGG (SEQ ID NO: 52; la secuencia BamHI está subrayada).

[0228] La secuencia de CBD de tipo silvestre es ECTGLAWEWWR (SEQ ID NO: 18).

[0229] La secuencia de CBD mutada es EATGLAWEAAR (SEQ ID NO: 53).

[0230] La secuencia del fragmento NheI-BamHI mutado es:

[0233]

[0235] EJEMPLO DE REFERENCIA 2: SUSTITUCIÓN DE PARTE DEL CBD DE LLO POR UN EPÍPOTO CTL

[0236] Se realizó una mutagénesis dirigida al sitio en LLO para reemplazar 9 aminoácidos (AA) del CBD con un epítopo CTL del antígeno NY-ESO-1. La secuencia del CBD (SEQ ID NO: 18) se reemplazó con la secuencia ESLLMWITQCR (SEQ ID NO: 55; residuos mutados subrayados), que contiene el epítopo restringido por HLA-A2157-165 de NY-ESO-1, denominado "ctLLO".

[0237] La estrategia de subclonación utilizada fue similar al Ejemplo anterior.

[0238] Los cebadores utilizados fueron los siguientes:

[0239] Cebador 1: GCTAGCTCATTTCACATCGT (SEQ ID NO: 56; la secuencia NheI está subrayada).

[0240] Cebador 2: TCTGCACTGGGTGATCCACATCAGCAGGCTTTCTTTAGCGTAAACATTAATATT (SEQ ID NO: 57; la secuencia codificante de CBD está subrayada; los codones mutados (NY-ESO-1) están en negrita cursiva). Cebador 3: GAAAGCCTGCTGATGTGGATCACCCAGTGCAGAACGGTAATTGATGACCGGAAC (SEQ ID NO: 58; la secuencia codificante de CBD está subrayada; los codones mutados (NY-ESO-1) están en negrita cursiva).

[0241] Cebador 4: GGATCCTTATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCGATTGG (SEQ ID NO: 59; la secuencia BamHI está subrayada).

[0242] La secuencia del fragmento NheI/BamHI resultante es la siguiente:

[0245]

[0247] EJEMPLO 3: mutLLO Y ctLLO PUEDEN EXPRESARSE Y PURIFICARSE EN SISTEMAS DE EXPRESIÓN de E. coli

[0248] Para demostrar que mutLLO y ctLLO podrían expresarse enE. coli, E. colifueron transformadas con pET29b y se indujeron con 0,5 mM de IPTG, después se recogieron los lisados celulares 4 horas después y las proteínas totales se separaron en un gel SDS-PAGE y se sometieron a tinción de Coomassie (Figura 2A) y transferencia de Western anti-LLO, utilizando el anticuerpo monoclonal B3-19 (Figura 2B). De este modo, las proteínas LLO que contienen mutaciones puntuales o sustituciones en el CBD pueden expresarse y purificarse en sistemas de expresión deE. coli.

[0249] EJEMPLO 4: mutLLO Y ctLLO MUESTRAN UNA REDUCCIÓN SIGNIFICATIVA DE LA ACTIVIDAD HEMOLÍTICA MATERIALES Y MÉTODOS EXPERIMENTALES

[0250] Ensayo de hemólisis

[0251] 1. Las LLO de tipo silvestre y mutadas se diluyeron a las diluciones indicadas en las Figuras 3A-B en 900 μl de PBS-cisteína 1x (PBS ajustado a pH 5,5 con clorhidrato de cisteína 0,5 M o se ajustó a 7,4).2. La LLO se activó mediante incubación a 37 °C durante 30 minutos.3. Los glóbulos rojos de oveja (200 μl/muestra) se lavaron dos veces con PBS-cisteína y de 3 a 5 veces con PBS 1x hasta que el sobrenadante quedó relativamente claro.4. El sedimento final de glóbulos rojos de oveja se resuspendió en PBS-cisteína y a los 900 μl de la solución LLO se les añadieron 100 μl de la suspensión celular (solución final al 10 %).5. Se añadieron 50 μl de glóbulos rojos de oveja a 950 μl de agua 10 % de Tween 20 (control positivo para lisis, contendrá el 50 % de la cantidad de células lisadas respecto a la cantidad total de células añadidas a los otros tubos; "control al 50 %").6. Todos los tubos se mezclaron suavemente y se incubaron a 37 °C durante 45 minutos.7. Los glóbulos rojos se centrifugaron en una microcentrífuga durante 10 minutos a 1500 rpm.8. Se transfirió una alícuota de 200 μl del sobrenadante a una placa ELISA de 96 pocillos y se leyó a 570 nm para medir la concentración de hemoglobina liberada después de la hemólisis, y las muestras se titularon de acuerdo con el control del 50 %.

[0252] RESULTADOS

[0253] Se determinó la actividad hemolítica de mutLLO y ctLLO mediante un ensayo con glóbulos rojos de oveja. mutLLO mostró un título hemolítico significativamente reducido (entre 100 y 1000 veces) a pH 5,5 (Figura 3A) y actividad hemolítica indetectable a pH 7,4 (Figura 3B). ctLLO no presentó actividad hemolítica detectable a ninguno de los dos pH (Figuras 3A-B).

[0254] Por lo tanto, la mutación puntual (mutLLO) o de sustitución (ctLLO) de los residuos CBD de LLO, incluidos C484, W491 y W492, elimina o reduce severamente la actividad hemolítica. Además, la sustitución del CBD por un péptido antigénico heterólogo es un medio eficaz para crear un portador inmunogénico de un epítopo heterólogo, con una actividad hemolítica significativamente reducida en comparación con el LLO de tipo salvaje.

[0255] EJEMPLO DE REFERENCIA 5: CONSTRUCCIÓN Y PRUEBAS DE LAS VACUNAS mutLLO-38C13 BCR Y ctLLO-38C13 BCR

[0256] Las vacunas mutLLO-38C13 BCR y ctLLO-38C13 BCR se construyen a partir de ADN que codifica mutLLO, ctLLO y 38C13, como se describe en la Publicación de patente de Estados Unidos 2006-0269561. Las vacunas se prueban como se describe en la Publicación de Patente de Estados Unidos 2006-0269561 y se ha comprobado que muestran actividad protectora contra el linfoma.

[0257] EJEMPLO 6: CONSTRUCCIÓN Y PRUEBAS DE LAS VACUNAS mutLLO-E7 Y ctLLO-E7

[0258] Las vacunas mutLLO-E7 y ctLLO-E7 se construyen a partir de ADN que codifica mutLLO, ctLLO y E7 como se describe en la Publicación de Patente de Estados Unidos 2006-0269561. Las vacunas se prueban como se describe en la Publicación de Patente de Estados Unidos 2006-0269561 y muestran actividad antitumoral protectora.

[0259] EJEMPLO 7: EL IMPACTO DE LA INMUNIZACIÓN CON LLO DESTOXIFICADA-E7 COMPARADO CON LOS CONTROLES SOBRE EL CRECIMIENTO DE TC-1

[0260] Preparación de la vacuna.

[0261] Se purificaron E7 recombinante y LLO destoxificada que comprenden mutaciones o deleciones en CBD en una columna de níquel y el LPS se eliminó en una columna Norgen Proteospin de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El E7 se conjugó químicamente con LLO mezclando 2 mg de LLO destoxificada con 500 μg de E7 y agregando paraformaldehído hasta una concentración final del 1 %. La mezcla se agitó en un rotador durante 40 minutos a temperatura ambiente y luego se dializó a 4 °C durante la noche en PBS.

[0262] Regresión tumoral

[0263] Se establecieron 1 x 10<5>células TC-1 en el costado de cada ratón, y los días 3 y 10, los ratones se inmunizaron subcutáneamente a lo largo de la espalda con 250 μl de PBS que contiene 50 μg de E7, 200 μg de LLO destoxificada mezclada con 50 μg de E7, 250 μg de conjugado LLO destoxificada-E7 o solo PBS (sin tratamiento).

[0264] EL IMPACTO DE LA INMUNIZACIÓN CON LLO DESTOXIFICADA CONJUGADA QUÍMICAMENTE A E7 Y LLO DESTOXIFICADA+E7 SOBRE EL CRECIMIENTO DE TC-1

[0265] Se inmunizaron ratones por vía subcutánea a lo largo del lomo con 250 μl de PBS que contenía: E7 (50 µg), LLO destoxificada (200 µg) mezclado con E7 (50 µg), conjugado LLO destoxificada-E7 (250 µg) o solo PBS (sin tratamiento).

[0266] Los ratones a los que se administró LLO-E7 conjugado mostraron un aumento atenuado del tamaño del tumor en comparación con los controles no tratados. Los ratones a los que se administró la mezcla LLO+E7 también mostraron un aumento atenuado en el tamaño del tumor (Figura 4). Mientras que todos los animales no tratados tenían tumores para el día 7, 2/8 ratones estaban libres de tumores después de la administración del conjugado LLO destoxificada-E7 y 4/8 ratones estaban libres de tumores después de la administración de LLO destoxificada mezclada con E7 en el día 49 (Figura 4, Tabla 1).

[0267] EL IMPACTO DE LA INMUNIZACIÓN CON LA PROTEÍNA E7 O LLO SOBRE EL CRECIMIENTO DE TC-1

[0268] Se inmunizaron ratones por vía subcutánea a lo largo del lomo con 250 μl de PBS que contenía: E7 (50 μg), LLO destoxificada (250 μg) o solo PBS (sin tratamiento).

[0269] No se observó regresión tumoral en los ratones que fueron inmunizados con LLO destoxificada o E7 solos, donde en cada caso respectivo, 0/8 y 1/8 ratones estaban libres de tumores el día 45 de los grupos LLO y E7, respectivamente. La inmunización con LLO destoxificada, y en mayor medida con E7, retrasó el tiempo de aparición del tumor (Figura 5).

[0270] IMPACTO DE LA INMUNIZACIÓN CON DTLLO FUSIONADO GENÉTICAMENTE A LA SECUENCIA E7 COMPLETA Y LLO DESTOXIFICADA MEDIANTE LA SUSTITUCIÓN DE LA REGIÓN DE UNIÓN AL COLESTEROL CON EL EPÍPOTO E7 SOBRE EL CRECIMIENTO DE TC-1

[0271] Los ratones fueron inmunizados subcutáneamente a lo largo del lomo con 250 μl de PBS que contenía: DTLLO-E7 recombinante completo (secuencia E7 completa fusionada genéticamente a DTLLO; 250 μg), quimera DTLLO-E7 (LLO destoxificada mediante la sustitución de CBD por el epítopo E7; 250 μg) o solo PBS (sin tratamiento).

[0272] El DTLLO-E7 completo y la quimera DTLLO-E7 retrasaron la aparición de tumores en comparación con los controles sin tratamiento (Figura 6). La quimera DTLLO-E7 demostró una inhibición más fuerte del crecimiento tumoral (8/8 libres de tumor al día 49 después de la inoculación del tumor) en comparación con DTLLO-E7 completo (5/8 libres de tumor al día 49 después de la inoculación del tumor; Figura 6 y Tabla 1). Se obtuvieron resultados comparables en experimentos repetidos (Figuras 7-9). Se establecieron 2<X>10^5 células tumorales TC-1 subcutáneamente en 8 ratones por grupo de vacuna. Los ratones fueron inmunizados por vía subcutánea con 50 μg de E7, 200 μg de DTLLO, 250 μg de DTLLOE7 o 50 μg de E7 más 200 μg de DTLLO en los días 3 y 10 (Figura 9). Los ratones a los que se administró DTLLO-E7 conjugado mostraron un aumento atenuado del tamaño del tumor en comparación con los controles sin tratamiento. Los ratones a los que se administró DTLLO solo o DTLLO+E7 mezclado también demostraron un aumento atenuado en el tamaño del tumor (Figura 9). Mientras que todos los animales sin tratamiento tenían tumores para el día 75, 5/8 ratones tratados con DTLLO+E7 y 7/8 ratones tratados con DTLLOE7 estaban libres de tumores en el día 75 (Figura 9).

[0273] EJEMPLO 8: REGRESIÓN DEL TUMOR TC-1 TRAS LA INMUNIZACIÓN CON ACTA, E7 O ACTA E7 MEZCLADOS O ACTA-E7 FUSIONADO GENÉTICAMENTE

[0274] Preparación de la vacuna.

[0275] Las proteínas recombinantes E7 y ActA o de fusión ActA-E7 se purificaron en una columna de níquel y el LPS se eliminó en una columna Norgen Proteospin según las instrucciones del fabricante.

[0276] Regresión tumoral

[0277] Se establecieron 1 x 10<5>TC-1 en el costado de cada ratón y, en los días 6 y 13, los ratones fueron inmunizados subcutáneamente a lo largo de la espalda con 250 μl de PBS que contenía E7 (50 μg), ActA (200 μg) mezclado con E7 (50 μg), ActA-E7 fusionado genéticamente (250 μg) o solo PBS (sin tratamiento).

[0278] RESULTADOS

[0279] Los ratones inmunizados con ActA solo, E7 solo, ActA-E7 o ActA+E7 demostraron una mayor latencia hasta la aparición de tumores en comparación con los controles (Figuras 10-12). Los ratones inmunizados con ActA-E7 (fusionado genéticamente) demostraron una fuerte regresión tumoral, con 7/8 ratones libres de tumores el día 55 después de la inmunización (Figura 10, Tabla 1). Los ratones inmunizados con ActA+E7 demostraron una regresión tumoral superior en comparación con los controles E7 y los controles sin tratamiento, con 7/8 ratones libres de tumores el día 55 después de la inoculación del tumor (Figura 11, Tabla 1). Los ratones inmunizados solo con ActA demostraron una regresión tumoral superior en comparación con los ratones inmunizados con E7 o los controles a los que se les inyectó PBS (3/8 ratones libres de tumores después de la inmunización en comparación con ninguno de los ratones en los grupos E7 o sin tratamiento; Figura 12, Tabla 1).

[0280] T l 1. R m n l r n li r m r : E m l 7-

[0283]

[0285] EJEMPLO 9: LLO DESTOXIFICADA INDUCE LA EXPRESIÓN DE ARNm DE CITOQUINAS Y LA SECRECIÓN DE CITOQUINAS POR MACRÓFAGOS DE LA MÉDULA ÓSEA (MO)

[0286] Se descongelaron 8e5 los BMDC del día 7 durante la noche a 37 °C en medio RF10. A continuación, las BMDC se centrifugaron y se resuspendieron en 1 ml de RF10 fresco a 37 °C durante 1 hora. Las BMDC se trataron con 40 mcg/ml de LLOE7 y equivalentes molares de E7 y LLO (o con PBS como control negativo o 1 mcg/mL de LPS como control positivo). Después de 2 y 24 horas, las células se recogieron mediante centrifugación y el medio se guardó para ELISA y se analizó la secreción de citoquinas. Se extrajo ARN de las células y se convirtió en ADNc. Posteriormente, el ADNc se sometió a un análisis de qPCR con cebadores para diversas citoquinas, y se evaluaron los niveles de expresión del ARNm de las citoquinas.

[0287] RESULTADOS

[0288] La LLO destoxificada, administrada sola, con E7 o fusionada a E7, indujo la expresión de ARNm de TNF-α (Figuras 13A-B), IL-12 (Figuras 13C-D) e ISG15 (Figura 13E) por macrófagos de médula ósea después de 2 (Figuras 13A y 13C) y 24 horas (Figuras 13B, 13D y 13E) en comparación con los controles. De manera similar, la LLO destoxificada indujo la secreción de TNF-α (Figura 14A) e IL-12 (Figura 14B) por los macrófagos de la médula ósea después de 2 y 24 horas.

[0289] EJEMPLO 10: LA LLO DESTOXIFICADA AUMENTA LOS MARCADORES DE MADURACIÓN DE LAS CÉLULAS DENDRÍTICAS

[0290] Se recogió médula ósea de los fémures de ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad. Se agruparon células de médula ósea de cuatro ratones y las células se cultivaron en medio RPM11640 que contenía 10 % de FCS y 100 U/ml de penicilina/estreptomicina en placas de Petri de 100 x 15 mm. Después de 2 horas de incubación a 37 °C en 10 % de CO<2>, las células no adherentes se eliminaron mediante lavado con medio tibio. Las células adherentes restantes se recogieron mediante raspado con un raspador celular estéril. Después del lavado, las células se ajustaron a 0,5 x 10^6/ml y se colocaron en una placa de 24 pocillos con 20 ng/ml de GM-CSF murino recombinante (R&D Systems, Minneapolis, MN). El medio se cambiaba cada 2-3 días. Después de 7 días de cultivo, se recogieron las células no adherentes, se lavaron y se utilizaron en los experimentos.

[0291] Estas células dendríticas derivadas de la médula ósea (día 7) se sembraron a una densidad de 2x10^6/ml y después se pulsaron con E7 (10 mcg/ml), LLO (40 mcg/ml) o LLOE7 (50 mcg/ml) más LLO (40 mcg/ml) durante 16 horas a 37 °C y 5 % de CO<2>. El fenotipo de las DC obtenidas utilizando este protocolo se analizó mediante análisis FACS. Las DC se recogieron después de 16 h como se ha descrito anteriormente. Las células se tiñeron con mAb marcados con APC específicos para CD11c de ratón, o con mAb marcados con FITC específicos para CD86, MHC clase II y CD40 de ratón. Se utilizó IgG de ratón del mismo isotipo como control negativo y se restó del fondo. Las células se incubaron con mAbs durante 30 min a 4 °C en la oscuridad. Después de dos lavados con PBS, se añadieron 10 μl de 7AAD (Beckman Coulter, Marsella, Francia) 10 minutos antes de que las células se analizaran en un citómetro de flujo FACS.

[0292] RESULTADOS

[0293] Se recogió médula ósea de los fémures de ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad. Después de 7 días de cultivo, se recogieron las células no adherentes, se lavaron y se sembraron a 2x10^6/ml y después se pulsaron con E7 (10 mcg/ml), LLO (40 mcg/ml) o LLOE7 (50 mcg/ml) más LLO (40 mcg/ml) durante 16 horas a 37 °C y 5 % de CO<2>. Las células se tiñeron con mAb marcados con APC específicos para CD11c de ratón, o con mAb marcados con FITC específicos para CD86, MHC clase II y CD40 de ratón. Se utilizó IgG de ratón del mismo isotipo como control negativo y se restó del fondo. Las células se incubaron con mAbs durante 30 min a 4 °C en la oscuridad. Después de dos lavados con PBS, se añadieron 10 μl de 7AAD (Beckman Coulter, Marsella, Francia) 10 minutos antes de que las células se analizaran en un citómetro de flujo FACS. La población de células vivas se muestra como porcentaje de células CD11c positivas. La administración de LLO destoxificada(en los grupos LLO, LLO+E7 y LLOE7) aumentó (Figuras 15A-C) en comparación con los controles.

[0294] EJEMPLO DE REFERENCIA 11: TRANSLOCACIÓN NUCLEAR DE NF-κB TRAS LA ESTIMULACIÓN CON DT-LLO

[0295] La línea celular de macrófagos J774 se utiliza como sistema modelo para células presentadoras de antígenos (APC). Se sembraron 5 x 10^5 células por pocillo (placa de 6 pocillos) en un volumen total de 1 ml. Las células se tiñeron con anti-NF-κB (P65) - FITC (fluorescencia verde) y DAPI para el núcleo (fluorescencia azul). En las Figuras 17B, D y F, las células también se tiñeron después de 24 horas con anti-CD11B-PE (M1/170, eBioscence), que se expresa en la superficie celular de las células de macrófagos y está involucrado en las interacciones celulares adhesivas.

[0296] RESULTADOS

[0297] El NF-kappaB se localiza en el citoplasma después del tratamiento de las células solo con medio (sin activación) (Figura 16A). Las células tratadas con medio muestran una tinción débil de Cd11b (Figura 16B). Después de la estimulación nocturna (24 horas) con Dt-LLO (30 mcg), NFkappaB se movió del citoplasma al núcleo (Figura 16C) y hubo un aumento en la tinción de CD11b (Figura 16D). De manera similar, después de la estimulación nocturna (24 horas) con LPS (10 mcg/ml, control positivo), NFkappaB se translocó al núcleo (Figura 16E), lo que se destaca por el aumento de la tinción CD11b+ de la membrana plasmática (Figura 16F).

[0298] Así, en una realización, los datos demuestran la capacidad del LLO destoxificada para estimular la inmunidad innata a través de macrófagos y células dendríticas.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende una mezcla de:

(a) proteína recombinante que comprende una proteína listeriolisina O (LLO), en la que la proteína LLO comprende una mutación dentro del dominio de unión al colesterol (CBD) de la misma (SEQ ID NO: 18), en la que dicha mutación consiste en la sustitución de todos los residuos de aminoácidos en las posiciones 2, 9 y 10 de la SEQ ID NO: 18, y en la que la proteína recombinante muestra una reducción mayor de 100 veces en la actividad hemolítica en relación con una proteína LLO de tipo silvestre; y (b) una proteína E7 del virus del papiloma humano (VPH).

2. La composición, según la reivindicación 1, en donde dicha secuencia de proteína LLO se establece en la SEQ ID NO: 37.

3. La composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde dicha proteína E7 es un antígeno del virus del papiloma humano (VPH)-16-E7 o un antígeno de VPH-18-E7.

4. La composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la proteína LLO comprende además una deleción de la secuencia del péptido señal, o en la que la proteína LLO comprende la secuencia del péptido señal de la misma.

5. Una composición de vacuna que comprende la composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la composición comprende además un adyuvante, en donde el adyuvante comprende una proteína del factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF), una molécula de nucleótido que codifica una proteína GM-CSF, saponina QS21, lípido A monofosforilado o un oligonucleótido que contiene CpG no metilado.

6. La composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o la vacuna, según la reivindicación 5, para su uso como medicamento.

7. La composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o la vacuna, según la reivindicación 5, para su uso en la prevención o el tratamiento de la infección por VPH en un sujeto.

8. La composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o la vacuna, según la reivindicación 5, para su uso en el tratamiento, inhibición, supresión, inducción de la regresión, reducción de la incidencia o protección contra un tumor que expresa E7 del VPH en un sujeto.

9. La composición para su uso o la vacuna para su uso, según la reivindicación 8, en donde el tumor que expresa E7 del VPH es un tumor cervical o un tumor de cabeza y cuello.