PT2307049T

PT2307049T - Proteínas de fusão llo não hemolíticas e métodos para a sua utilização

Info

Publication number: PT2307049T
Application number: PT97984504T
Authority: PT
Inventors: Paterson Yvonne; Maciag Paulo
Original assignee: Univ Pennsylvania
Priority date: 2008-06-23
Filing date: 2009-06-22
Publication date: 2017-02-10
Also published as: US20090081248A1; ES2719832T3; HUE042819T2; DK2942355T3; JP5597197B2; EP2942355B1; ES3058690T3; JP2015017096A; PL2942355T3; DK2307049T3; US20140248304A1; US8771702B2; EP2942355A1; EP2307049B1; EP3530669C0; PL3530669T3; JP6114237B2; EP2307049A4; EP2307049A1; HK1217341A1

Description

DESCRIÇÃO

PROTEÍNAS DE FUSÃO LLO NÃO HEMOLÍTICAS E MÉTODOS PARA A SUA

UTILIZAÇÃO

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona proteínas ou péptidos recombinantes compreendendo uma proteína de listeriolisina 0 (LLO) mutada ou um seu fragmento, compreendendo uma substituição do domínio de ligação ao colesterol por um péptido antigénico, proteínas de fusão ou péptidos compreendendo as mesmas moléculas nucleotídicas que codificam as mesmas e vetores de vacinas compreendendo ou codificando o mesmo. A presente invenção também proporciona as proteínas recombinantes, péptidos, moléculas de nucleótidos e vetores de vacinas da presente invenção para utilização na indução de uma resposta imunitária ao péptido antigénico.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A estimulação de uma resposta imunitária depende da presença de antigénios reconhecidos como estranhos pelo sistema imunitário do hospedeiro. Antigénios bacterianos, tais como Salmonella enterica e Mycobacterium bovis BCG permanecem no fagossoma e estimulam células CD4+ T através de apresentação de antigénio através de moléculas principais de histocompatibilidade da classe II. Em contraste, os antigénios bacterianos, tais como Listeria monocytogenes saem do fagossoma no citoplasma. A fuga fagolisossomal de L. monocytogenes é um mecanismo único, que facilita a apresentação de antigénio de histocompatibilidade principal da classe I de antigénios de Listerial. Esta fuga é dependente da formação de poros de citolisina ativada com sulfidrilo, listeriolisina 0 (LLO). A WO 2008/008311 descreve a utilização de uma proteína LLO não hemolítica mutada e uma proteína antigénica de interesse fundida ou incorporada dentro da proteína LLO não hemolítica mutada para induzir uma resposta imunitária contra a proteína antigénica de interesse.

Existe uma necessidade há muito sentida de desenvolver composições e métodos para aumentar a imunogenicidade de antigénios, especialmente antigénios úteis na prevenção e tratamento de tumores e patogénios intracelulares.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona uma proteína recombinante compreendendo uma proteína de listeriolisina O (LLO), em que a referida proteína LLO compreende uma mutação dentro do domínio de ligação ao colesterol (CBD) localizado nos resíduos 483-493 da referida proteína LLO como apresentado na SEQ ID NO: 37, em que a referida mutação consiste numa substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 484-492 conforme estabelecido na SEQ ID NO: 37 com um péptido não LLO de 8-50 resíduos de aminoácidos compreendendo uma porção imunogénica de um péptido antigénico, em que o referido péptido antigénico é um antigénio E7 do vírus do papiloma humano (HPV), um antigénio E6 de HPV, um antigénio NY-ESO-1, um recetor de células B (BCR), um antigénio específico da próstata (PSA), um antigénio de células estaminais da próstata PSCA), um antígeno de enzima quimiotróptica de Stratum Corneum (SCCE), um antígeno 1 de tumor de Wilms (WT-1), transcriptase reversa de telomerase humana (hTERT), Proteinase 3, Proteína Relacionada à Tirosinase 2 (TRP2), antigénio associado a Melanoma de Alto Peso Molecular -MAA), sarcoma sinovial X (SSX)-2, antigénio carcinoembrionário (CEA), MAGE-A, recetor alfa da interleucina-13 (IL13-R alfa), anidrase carbónica IX (CAIX), survivina, GP100 ou Testisina; e em que a referida proteína recombinante exibe uma reduçãosuperior a 100 vezes na atividade hemolítica em relação ao LLO de tipo selvagem da SEQ ID NO: 37.

Numa forma de realização, a proteína LLO mutada compreende uma deleção da sua sequência peptídica sinal. Noutra forma de realização, a proteína LLO mutada compreende a sua sequência peptídica de sinal.

Numa forma de realização, o antigénio E7 de HPV é um antigénio HPV-16-E7 ou um antigénio HPV-18-E7. Numa forma de realização, o péptido antigénico compreende um epítopo de HPV E7. Numa forma de realização, o antigénio E6 de HPV é um antigénio HPV-16-E6 ou um antigénio HPV-18-E6.

Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona uma vacina que compreende a proteína recombinante e um adjuvante. Noutra forma de realização, o adjuvante compreende uma proteína de fator de estimulação de colónias de granulócitos/macrófagos (GM-CSF), uma molécula nucleotídica que codifica uma proteína GM-CSF, saponina QS21, monofosforil lípido A ou um oligonucleótido não metilado contendo CpG.

Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona um vetor de vacina recombinante que codifica a proteína recombinante. Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona uma molécula nucleotídica que codifica a proteína recombinante. Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona uma vacina compreendendo a molécula nucleotídica. Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma estirpe recombinante de Listeria compreendendo a proteína ou péptido recombinante. A presente invenção proporciona a proteína recombinante, ou a molécula de nucleótido, ou o vetor de vacina recombinante, ou a estirpe de Listeria recombinante da invenção para utilização como medicamento. A presente invenção proporciona uma proteína recombinante, ou uma molécula de nucleótido, ou um vetor de vacina recombinante, ou uma estirpe de Listeria recombinante da invenção, em que o péptido antigénico é um péptido HPV E7 ou um E6 de HPV, para utilização na indução de uma resposta imunitária ao péptido antigénico HPV E7 ou E6 de HPV num indivíduo. A presente invenção proporciona uma proteína recombinante, ou uma molécula de nucleótido, ou um vetor de vacina recombinante, ou uma estirpe de Listeria recombinante da invenção, em que o péptido antigénico é um péptido NY-ESO-1, para utilização no tratamento, inibição, supressão, Induzindo a regressão de, reduzindo a incidência de, ou protegendo contra um tumor que expressa NY-ESO-1 num sujeito.

Noutra forma de realização, o tumor que expressa NY-ESO-1 é um tumor de melanoma ovariano ou um tumor de cancro do pulmão. A presente invenção proporciona uma proteína recombinante, ou uma molécula de nucleótido, ou um vetor de vacina recombinante, ou uma estirpe de Listeria recombinante da invenção, em que o péptido antigénico é um péptido E7 de HPV, para utilização no tratamento, inibição, supressão, indução da regressão de, reduzindo a incidência de, ou protegendo contra um tumor que expressa HPV-E7 num indivíduo.

Noutra forma de realização, o tumor que expressa o HPV E7 é selecionado de um tumor de cancro cervical e um tumor de cancro da cabeça e pescoço. A presente invenção proporciona uma proteína recombinante, ou uma molécula de nucleótido, ou um vetor de vacina recombinante, ou uma estirpe de Listeria recombinante da invenção, em que o péptido antigénico é um BCR, para utilização no tratamento, inibição, supressão, indução da regressão de, reduzindo a incidência de, ou protegendo contra um linfoma expressando BCR num sujeito.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1A-B. Estratégia de mutagénese SOE. A diminuição/ diminuição da virulência de LLO foi conseguida por mutação do 4o domínio de LLO. Este domínio contém um local de ligação ao colesterol que lhe permite ligar-se a membranas onde se oligomeriza para formar poros.

Figura 2. Expressão de proteínas LLO mutantes por coloração com Coomassie (A) e Western blot (B).

Figura 3. Atividade hemolítica de proteínas LLO mutantes (mutLLO e ctLLO) a pH 5,5 (A) e 7,4 (B).

Figura 4. A capacidade do detox rLLO + rE7 quimicamente conjugado e rLLO + rE7 misturados em conjunto para impacto no crescimento de TC-1.

Figura 5. A capacidade da proteína rE7 e rLLO de afetar o crescimento de TC-1.

Figura 6. A capacidade de LL0E7 destoxifiçado recombinante (rDTLL0-E7; sequência completa) e rDTLL0-E7 (quimera) para afetar o crescimento de TC-1.

Figura 7. Regressão tumoral TC-1 após imunização com rE7, rLLO, rLLO + E7 e rDTLL0-E7.

Figura 8. Regressão tumoral TC-1 após imunização com quimera rDTLLO.

Figura 9. Regressão tumoral TC-1 após imunização com rE7, rDTLLO, rDTLLO + rE7 e rDTLL0-E7.

Figura 10. Regressão tumoral TC-1 imunizada com a proteína ActA-E7 e E7.

Figura 11. Regressão tumoral TC-1 imunizada com ActA + E7 e proteína E7.

Figura 12. Regressão tumoral TC-1 imunizada com proteína ActA e E7.

Figura 13. DetoxLLO induz a expressão de mRNA de citoquina por macrófagos de medula óssea (BM) . 8e5 Dia 7 as BMDCs foram descongeladas durante a noite a 37 °C em meio RF10. Em seguida, as BMDC foram centrifugadas e ressuspensas em 1 mL de RF10 fresco a 37°C durante 1 hora. As BMDCs foram tratadas com LmEg/ml de LLOE7 e equivalentes molares de E7 e LLO (ou com PBS como controlo negativo ou lmcg/mL de LPS como controlo positivo) . Após 2 e 24 horas, as células foram recolhidas por centrifugação e o meio foi guardado para ELISA. O ARN foi extraído das células e convertido em cADN. O cADN foi então sujeito a análise de qPCR com iniciadores para várias citoquinas.

Figura 14. Desintoxicação LLO induz secreção de citoquinas por macrófagos BM. O mesmo protocolo de tratamento que o descrito para a Figura 13, exceto que o meio foi sujeito a análise ELISA após os tratamentos.

Figura 15. Detox LLO sobre-regula os marcadores de maturação DC CD86, CD40 e MHCII nos grupos LLO, LLO + E7 e LLOE7.

Figura 16. Translocação nuclear de NFkappaB após estimulação com Dt-LLO. Linha de células de macrófagos J774 utilizada como sistema modelo para células apresentadoras de antigénio (APCs). Foram plaqueadas 5 x 10“5 células por poço (placa de 6 poços) num volume total de 1 ml. As células foram coradas com anti-NF-kB (P65) -FITC (fluorescência verde) e DAPI para o núcleo (fluorescência azul). Em B, D e F, as células foram também coradas após 24 horas com anti-CDUB-PE (Ml/170, eBioscence). A micrografia fluorescente é mostrada com uma ampliação de 40X. NF-kappaB está localizado no citoplasma após o tratamento de células com meios isolados (sem ativação) (A) . As células tratadas com meios demonstram a fraca coloração com Cdllb (B). Após estimulação de uma noite (24 horas) com Dt-LLO (30mcg), NFkappaB saiu do citoplasma para dentro do núcleo (C) e há um aumento na coloração de CDllb (D). De modo semelhante, após a estimulação durante a noite (24 horas) com LPS (10mcg/ml, controlo positivo), NFkappaB foi translocado para o núcleo (E) , que é mais discernivel com o halo produzido pelo aumento da coloração CDllb+ da membrana de plasma (F).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona uma proteína recombinante compreendendo uma proteína de listeriolisina 0 (LLO), em que a referida proteína LLO compreende uma mutação dentro do domínio de ligação ao colesterol (CBD) localizado nos resíduos 483-493 da referida proteína LLO como apresentado na SEQ ID NO: 37, em que a referida mutação consiste numa substituição dos resíduos de aminoácidos nas posições 484-492 como apresentado na SEQ ID NO: 37 com um péptido não-LLO de 8-50 resíduos de aminoácidos compreendendo uma porção imunogénica de um péptido antigénico, em que o referido péptido antigénico é um antigénio do vírus do papiloma humano (HPV) E7, um antigénio E6 de HPV, um antigénio NY-ESO-1, um recetor de células B (BCR), um antígeno específico da próstata (PSA), um antigénio de células estaminais da próstata (PSCA), um antígeno de enzima quimiotróptica de Stratum Corneum (SCCE), antígeno 1 de tumor de Wilms (WT-1), transcriptase reversa de telomerase humana (hTERT), Proteinase 3, Proteína Relacionada à Tirosinase 2 (TRP2), Antigénio Associado a Melanoma de Alto Peso Molecular (HMW-MAA) , sarcoma sinovial X (SSX)-2, antigénio carcinoembrionário (CEA), MAGE-A, recetor alfa da interleucina-13 (IL13-R alfa), anidrase carbónica IX (CAIX), survivina, GP100 ou Testisina; e em que a referida proteína recombinante exibe uma redução superior a 100 vezes na atividade hemolítica em relação ao LLO de tipo selvagem da SEQ ID NO: 37.

Numa forma de realização, o polipéptido não LLO tem o mesmo comprimento que a região mutada. Noutra forma de realização, o polipéptido não LLO é mais curto, ou noutra forma de realização, mais longo do que a região mutada.

Numa forma de realização, a substituição na proteína LLO é uma mutação de inativação em relação à atividade hemolítica. Um péptido recombinante da presente invenção exibe uma redução na atividade hemolítica relativamente ao LLO de tipo selvagem. Noutra forma de realização, o péptido recombinante é não hemolítico.

Como aqui divulgado, foi criada uma proteína LLO mutante em que os resíduos C484, W491 e W492 de LLO foram substituídos com resíduos de alanina (Exemplo 1). A proteína LLO mutada, mutLLO, pode ser expressa e purificada num sistema de expressão E. coli (Exemplo 3) e exibiu substancialmente atividade hemolítica reduzida relativamente ao LLO de tipo selvagem (Exemplo 4).

Assim, a região mutada da proteína LLO da presente invenção compreende os resíduos C484, W491 e W492 da SEQ ID NO: 37.

Além disso, como aqui proporcionado, um fragmento dos resíduos CBD, 484-492, foi substituído por uma sequência heteróloga de NY-ESO-1 (Exemplo 2). Noutra forma de realização, um único péptido pode ter uma deleção na sequência de sinal e uma substituição na CBD. A mutação de substituição da proteína recombinante da presente invenção é, noutra forma de realização, uma mutação em que a região mutada da proteína LLO é substituída por um número igual de AA heterólogo. Noutra forma de realização, é introduzido um número maior de AA heterólogo do que o tamanho da região mutada. Noutra forma de realização, é introduzido um número menor de AA heterólogo do que o tamanho da região mutada.

Nesta invenção, o comprimento do péptido não LLO que substitui a região mutada da proteína recombinante da presente invenção é 8-50 AA. Numa forma de realização, o comprimento é 8-11 AA. Numa outra forma de realização, o comprimento é 9-11 AA. Numa outra forma de realização, o comprimento é 10-11 AA. Noutra forma de realização, o comprimento é 11-50 AA. Noutra forma de realização, o comprimento é 12-50 AA. Numa outra forma de realização, o comprimento é 11-15 AA. Noutra forma de realização, o comprimento é 11-20 AA. Noutra forma de realização, o comprimento é 11-25 AA. Noutra forma de realização, o comprimento é 11-30 AA. Noutra forma de realização, o comprimento é 11-35 AA. Numa outra forma de realização, o comprimento é 11-40 AA. Noutra forma de realização, o comprimento é 15-20 AA. Noutra forma de realização, o comprimento é 15-25 AA. Noutra forma de realização, o comprimento é 15-30 AA. Noutra forma de realização, o comprimento é 15-35 AA. Numa outra forma de realização, o comprimento é 15-40 AA. Noutra forma de realização, o comprimento é 20-25 AA. Noutra forma de realização, o comprimento é de 20-30 AA. Noutra forma de realização, o comprimento é 20-35 AA. Noutra forma de realização, o comprimento é 20-40 AA. Noutra forma de realização, o comprimento é 30-35 AA. Noutra forma de realização, o comprimento é 30-40 AA.

Quando se refere ao comprimento de um fragmento LLO aqui, a sequência sinal é incluída. Assim, a numeração da primeira cisteína no CDB é 484, e o número total de resíduos AA é 529.

Como aqui divulgado, foi criada uma proteína LLO mutante em que os resíduos C484, W491 e W492 de LLO foram substituídos com um epítopo CTL a partir do antigénio NY-ESO-1 (Exemplo 2) . A proteína LLO mutada, mutLLO, pode ser expressa e purificada de um sistema de expressão de E. coli (Exemplo 3) e exibiu atividade hemolítica substancialmente reduzida em relação ao LLO de tipo selvagem (Exemplo 4).

Noutra forma de realização, a proteína LLO mutada da presente invenção que compreende uma deleção interna é de comprimento total exceto para a deleção interna. Nesta invenção, a deleção interna da proteína LLO compreende os resíduos C484, W491 e W492. Especificamente, nesta invenção, a deleção interna consiste nos resíduos 484-492 do CDB de SEQ ID NO: 37. "Hemolítico" refere-se, noutra forma de realização, à capacidade de lisar uma célula eucariótica. Noutra forma de realização, a célula eucariótica é um glóbulo vermelho. Noutra forma de realização, a célula eucariótica é qualquer outro tipo de célula eucariótica conhecida na técnica. Noutra forma de realização, a atividade hemolítica é medida a um pH ácido. Noutra forma de realização, a atividade hemolítica é medida a pH fisiológico. Noutra forma de realização, a atividade hemolítica é medida a pH 5,5. Noutra forma de realização, a atividade hemolítica é medida a pH 7,4. Noutra forma de realização, a atividade hemolítica é medida a qualquer outro pH conhecido na técnica.

Noutra forma de realização, uma proteína ou polipéptido recombinante de métodos e composições da presente invenção exibe uma redução superior a 100 vezes na atividade hemolítica relativamente ao LLO de tipo selvagem. Noutra forma de realização, a redução é superior a 90 vezes. Noutra forma de realização, a redução é superior a 120 vezes. Noutra forma de realização, a redução é superior a 150 vezes. Noutra forma de realização, a redução é superior a 200 vezes. Noutra forma de realização, a redução é superior a 250 vezes. Noutra forma de realização, a redução é superior a 300 vezes. Noutra forma de realização, a redução é superior a 400 vezes. Noutra forma de realização, a redução é superior a 500 vezes. Noutra forma de realização, a redução é superior a 600 vezes. Noutra forma de realização, a redução é superior a 800 vezes. Noutra forma de realização, a redução é superior a 1000 vezes. Noutra forma de realização, a redução é superior a 1200 vezes. Noutra forma de realização, a redução é superior a 1500 vezes. Noutra forma de realização, a redução é superior a 2000 vezes. Noutra forma de realização, a redução é superior a 3000 vezes. Noutra forma de realização, a redução é superior a 5000 vezes.

Noutra forma de realização, a redução é, pelo menos, 120 vezes. Noutra forma de realização, a redução é, pelo menos, 150 vezes. Noutra forma de realização, a redução é, pelo menos, 200 vezes. Noutra forma de realização, a redução é, pelo menos, 250 vezes. Noutra forma de realização, a redução é, pelo menos, 300 vezes. Noutra forma de realização, a redução é, pelo menos, 400 vezes. Noutra forma de realização, a redução é, pelo menos, 500 vezes. Noutra forma de realização, a redução é, pelo menos, 600 vezes. Noutra forma de realização, a redução é, pelo menos, 800 vezes. Noutra forma de realização, a redução é, pelo menos, 1000 vezes. Noutra forma de realização, a redução é, pelo menos, 1200 vezes. Noutra forma de realização, a redução é, pelo menos, 1500 vezes. Noutra forma de realização, a redução é, pelo menos, 2000 vezes. Noutra forma de realização, a redução é, pelo menos, 3000 vezes. Noutra forma de realização, a redução é, pelo menos, 5000 vezes.

Os métodos para determinar a atividade hemolitica são bem conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, nos Exemplos aqui e em Portnoy DA et ai., (J Exp Med Vol. 167: 1459-1471, 1988) e Dancz CE et al (J Bacteriol, 184: 5935-5945, 2002) . "Inativação da mutação" em relação à atividade hemolitica refere-se, noutra forma de realização, a uma mutação que elimina a atividade hemolitica detetável. Noutra forma de realização, o termo refere-se a uma mutação que elimina a atividade hemolitica a pH 5,5. Noutra forma de realização, o termo refere-se a uma mutação que elimina a atividade hemolitica a pH 7,4. Noutra forma de realização, o termo refere-se a uma mutação que reduz significativamente a atividade hemolitica a pH 5,5. Noutra forma de realização, o termo refere-se a uma mutação que reduz significativamente a atividade hemolitica a pH 7,4. Noutra forma de realização, o termo refere-se a uma mutação que reduz significativamente a atividade hemolitica a pH 5,5. Noutra forma de realização, o termo refere-se a qualquer outro tipo de mutação de inativação relativamente à atividade hemolitica. A sequência do domínio de ligação ao colesterol LLO é apresentada na SEQ ID NO: 18.

Noutra forma de realização, a proteína LLO mutada da presente invenção compreende o seu péptido de sinal. Noutra forma de realização, a proteína LLO mutada ou o seu fragmento compreende um péptido de sinal de uma proteína LLO de tipo selvagem. Noutra forma de realização, o péptido de sinal é uma cadeia peptídica curta (3-60 aminoácidos de comprimento) que direciona o transporte pós-translacional de uma proteína. Numa outra forma de realização, os péptidos de sinal são também sinais de direcionamento, sequências de sinal, péptidos de trânsito ou sinais de localização. Noutra forma de realização, as sequências de aminoácidos de péptidos de sinal dirigem proteínas para certas organelas, tais como, o núcleo, matriz mitocondrial, retículo endoplasmático, cloroplasto, apoplasto ou peroxissoma. Noutra forma de realização, a proteína LLO mutada contém uma sequência de sinal de uma proteína LLO de tipo selvagem. Noutra forma de realização, a proteína LLO mutada carece de um péptido de sinal. Noutra forma de realização, a proteína LLO mutada carece de uma sequência de sinal. Noutra forma de realização, o péptido de sinal é inalterado em relação à proteína LLO de tipo selvagem a partir da qual a proteína LLO mutada ou o seu fragmento foi derivado. Noutra forma de realização, o péptido de sinal está na extremidade do terminal N da proteína recombinante ou polipéptido.

Como aqui divulgado, a proteína LLO mutada da presente invenção compreende uma sequência peptídica do tipo PEST. Noutra forma de realização, a sequência peptídica do tipo PEST é uma sequência peptídica LLO do tipo PEST. Noutra forma de realização, a sequência de aminoácidos da sequência peptídica semelhante a PEST é exposta na SEQ ID NO: 63.

As sequências PEST são sequências ricas em prolinas (P) , ácidos glutâmicos (E), serinas (S) e treoninas (T), geralmente, mas nem sempre, flanqueadas por aglomerados contendo vários aminoácidos carregados positivamente, tendo meias-vidas intracelulares rápidas (Rogers et al., 1986,

Science 234: 364-369) . As sequências PEST direcionam a proteína para a via ubiquitina-proteossoma para degradação (Rechsteiner e Rogers TIBS 1996 21: 267-271), que é uma via utilizada, também, pelas células eucarióticas para gerar péptidos imunogénicos que se ligam à classe I do MHC. As sequências PEST são abundantes entre proteínas eucarióticas que dão origem a péptidos imunogénicos (Realini et al. FEBS Lett. 1994 348: 109-113) . Embora as sequências PEST sejam normalmente encontrados em proteínas eucarióticas, uma sequência PEST semelhante rica em aminoácidos prolina (P) , ácido glutâmico (E), serina (S) e treonina (T) foi identificada no terminal amino da procariota da proteína Listeria LLO e demonstrou ser essencial para a patogenicidade de L. monocytogenes (Decatur, A.L. e Portnoy, D.A. Science 2000 290: 992-995). A presença desta sequência semelhante a PEST na LLO tem como alvo a proteína para destruição por maquinaria proteolítica da célula hospedeira de modo que uma vez que a LLO tenha cumprido a sua função e facilitado a fuga de L. monocytogenes do vacúolo fagolisossómico, é destruída antes de danificar as células. A identificação de sequências semelhantes a PEST é bem conhecida na técnica e é descrita, por exemplo em Rogers S et al (Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science 1986; 234(4774):364-8) e Rechsteiner M et al (PEST sequences and regulation by proteolysis. Trends Biochem Sci 1996; 21(7):267-71), Sequência "tipo PEST" refere-se, noutra forma de realização, a uma região rica em resíduos de prolina (P) , ácido glutâmico (E) , serina (S) e treonina (T) . Noutra forma de realização, a sequência semelhante a PEST é flanqueada por um ou mais agrupamentos contendo vários aminoácidos carregados positivamente. Noutra forma de realização, a sequência semelhante a PEST medeia a degradação intracelular rápida de proteínas que a contêm. Noutra forma de realização, a sequência semelhante a PEST ajusta-se a um algoritmo revelado em Rogers et al. Noutra forma de realização, a sequência semelhante a PEST ajusta-se a um algoritmo descrito em Rechsteiner et al. Noutra forma de realização, a sequência semelhante a PEST contém um ou mais locais de fosforilação interna, e a fosforilação nestes locais precede a degradação da proteína.

Numa forma de realização, as sequências semelhantes a PEST de organismos procarióticos são identificadas de acordo com métodos tal como descrito por, por exemplo, Rechsteiner and Rogers (1996, Trends Biochem, Sei. 21: 267-271) para LM e, em Rogers S et al (Science 1986; 234 (4774) :364-8) . Em alternativa, as sequências AA semelhantes a PEST de outros organismos procarióticos podem também ser identificadas com base neste método. Outros organismos procariotas em que seriam esperadas serem incluídas sequências semelhantes a PEST AA, mas não estão limitados a, outrAs espécies DE Listeria . Numa forma de realização, a sequência semelhante a PEST encaixa num algoritmo revelado em Rogers et al. Noutra forma de realização, a sequência semelhante a PEST ajusta-se a um algoritmo descrito em Rechsteiner et al. Noutra forma de realização, a sequência semelhante a PEST é identificada utilizando o programa PEST-find.

Noutra forma de realização, a identificação de motivos PEST é conseguida por uma varredura inicial para AA R, H, e K carregados positivamente dentro da sequência de proteína especificada. Todos os AA entre os flancos carregados positivamente são contados e apenas esses motivos são considerados mais adiante, os quais contêm um número de AA igual ou superior ao parâmetro do tamanho da janela. Noutra forma de realização, uma sequência semelhante a PEST deve conter pelo menos 1 P, 1 D ou E, e pelo menos 1 S ou T.

Noutra forma de realização, a qualidade de um motivo PEST é refinado por meio de um parâmetro de pontuação com base no enriquecimento local de AA crítico bem como na hidrofobicidade dos motivos. 0 enriquecimento de D, E, P, S e T é expresso em percentagem de massa (p/p) e corrigido para 1 equivalente de D ou E, 1 de P e 1 de S ou T. Noutra forma de realização, o cálculo da hidrofobicidade segue em princípio o método de J. Kyte e R.F. Doolittle (Kyte, J e Doolittle, RF. J. Mol. Biol. 157, 105 (1982) . Para cálculos simplificados, os índices de hidratação de Kyte-Doolittle, que originalmente variaram de -4,5 para a arginina a +4,5 para a isoleucina, são convertidos em números inteiros positivos, usando a seguinte transformação linear, que rendeu valores de 0 para a arginina a 90 para a isoleucina. índice de hidropatia=10* índice de hidropatia de Kyte-Doolittle + 45

Noutra forma de realização, a hidrofobicidade de um motivo PEST potencial é calculada como a soma sobre os produtos de percentagem molar e índice de hidrofobicidade para cada espécie AA. A pontuação PEST desejada é obtida como uma combinação de termo de enriquecimento local e termo de hidrofobicidade como expresso pela seguinte equação: pontuação PEST =0,55*DEPST-0,5*índice de hidrofobicidade.

Noutra forma de realização, "sequência PEST", "sequência semelhante a PEST" ou "péptido de sequência semelhante a PEST" refere-se a um péptido possuindo uma pontuação de, pelo menos, +5, utilizando o algoritmo acima. Noutra forma de realização, o termo refere-se a um péptido com uma pontuação de, pelo menos, 6. Numa outra forma de realização, o péptido tem uma pontuação de, pelo menos, 7. Noutra forma de realização, a pontuação é de, pelo menos, 8. Noutra forma de realização, a pontuação é, pelo menos, 9. Numa outra forma de realização, a pontuação é, pelo menos, 10. Numa outra forma de realização, a pontuação é, pelo menos, 11. Noutra forma de realização, a pontuação é, pelo menos, 12. Noutra forma de realização, a pontuação é, pelo menos, 13. Noutra forma de realização, a pontuação é de, pelo menos, 14. Numa outra forma de realização, a pontuação é de, pelo menos, 15. Numa outra forma de realização, a pontuação é de, pelo menos, 16. Numa outra forma de realização, a pontuação é de, pelo menos, 17. Numa outra forma de realização, a pontuação é de, pelo menos, 18. Numa outra forma de realização, a pontuação é de, pelo menos, 19. Numa outra forma de realização, a pontuação é de, pelo menos, 20. Numa outra forma de realização, a pontuação é de, pelo menos, 21. Noutra forma de realização, a pontuação é de, pelo menos, 22. Noutra forma de realização, a pontuação é de, pelo menos, 24. Noutra forma de realização, a pontuação é de, pelo menos, 24. Noutra forma de realização, a pontuação é de, pelo menos, 25. Noutra forma de realização, a pontuação é, pelo menos, 26. Numa outra forma de realização, a pontuação é de, pelo menos, 27. Numa outra forma de realização, a pontuação é de, pelo menos, 28. Numa outra forma de realização, a pontuação é de, pelo menos, 29. Noutra forma de realização, a pontuação é de, pelo menos, 30. Numa outra forma de realização, a pontuação é de pelo menos 30. Em outra forma de realização, a pontuação é de, pelo menos, 32. Numa outra forma de realização, a pontuação é de, pelo menos, 35. Numa outra forma de realização, a pontuação é de, pelo menos, 38. Numa outra forma de realização, a pontuação é de, pelo menos, 40. Numa outra forma de realização, a pontuação é de, pelo menos, 45.

Noutra forma de realização, a sequência semelhante a PEST é identificada utilizando qualquer outro método ou algoritmo conhecido na técnica, por exemplo, o CaSPredictor (Garay-Malpartida HM, Occhiucci JM, Alves J, Belizario JE. Bioinformatics. 2005 Jun; 21 Suppl 1: Í169-76). Noutra forma de realização, utiliza-se o seguinte método:

Um indice PEST é calculado para cada extensão de comprimento apropriado (por exemplo um estiramento de 30-35 AA) atribuindo um valor de 1 ao AA Ser, Thr, Pro, Glu, Asp, Asn ou Gin. O valor do coeficiente (CV) para cada um dos resíduos PEST é 1 e para cada um dos outros AA (não PEST) é 0.

Tal como aqui divulgado, a resposta imunitária a um antigénio pode ser aumentada por fusão do antigénio a uma forma truncada não hemolítica de listeriolisina O (ALLO). A imunidade melhorada mediada por células observada e a imunidade antitumoral da proteína de fusão resultam da sequência semelhante a PEST presente em LLO que alveja o antigénio para processamento.

Nesta invenção, o péptido não LLO que substitui a região mutada da proteína ou polipéptido recombinante compreende uma porção imunogénica do péptido antigénico de interesse. Noutra forma de realização, o péptido antigénico é um epítopo de linfócitos citotóxicos T (CTL) . Numa outra forma de realização, o péptido antigénico é um epítopo CD4+ de células T. Noutra forma de realização, o péptido antigénico é qualquer outro tipo de péptido conhecido na técnica.

Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona uma vacina que compreende um adjuvante e uma proteína ou polipéptido recombinante da presente invenção, em que um péptido antigénico de interesse substitui a região mutada. Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição imunogénica compreendendo a proteína ou polipéptido recombinante.

Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona uma molécula nucleotídica que codifica uma proteína ou polipéptido recombinante da presente invenção, em que um péptido antigénico de interesse substitui a região mutada.

Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona uma molécula de nucleótido que codifica uma proteína ou polipéptido recombinante da presente invenção.

Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona uma vacina compreendendo uma molécula de nucleótido da presente invenção e um adjuvante.

Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona um vetor de vacina recombinante compreendendo uma molécula de nucleótido da presente invenção.

Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona um vetor de vacina recombinante que codifica uma proteína ou polipéptido recombinante da presente invenção.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma estirpe recombinante de Listeria compreendendo uma proteína recombinante ou polipéptido da presente invenção. Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma estirpe recombinante de Listeria que expressa uma proteína recombinante ou polipéptido da presente invenção. Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma estirpe recombinante de Listeria que codifica uma proteína recombinante ou polipéptido da presente invenção. Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma estirpe recombinante de Listeria compreendendo um nucleótido recombinante que codifica um polipéptido recombinante da presente invenção. Numa outra forma de realização, a estirpe de Listeria da vacina é a espécie de Listeria monocytogenes (LM).

Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona uma célula compreendendo um vetor da presente invenção. Os métodos para produzir células compreendendo vetores e/ou ácidos nucleicos exógenos são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), e ern Ausubel et al. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York).

Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona uma vacina compreendendo uma molécula de nucleótido da presente invenção. Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição imunogénica compreendendo a molécula de nucleótido. 0 adjuvante utilizado nas composições de vacina da presente invenção é, noutra forma de realização, uma proteína de fator de estimulação de colónias de granulócitos/macrófagos (GM-CSF). Noutra forma de realização, o adjuvante compreende uma proteína GM-CSF. Noutra forma de realização, o adjuvante é uma molécula nucleotídica que codifica GM-CSF. Noutra forma de realização, o adjuvante compreende uma molécula de nucleótido que codifica GM-CSF. Noutra forma de realização, o adjuvante é a saponina QS21. Noutra forma de realização, o adjuvante compreende saponina QS21. Noutra forma de realização, o adjuvante é monofosforil lípido A. Noutra forma de realização, o adjuvante compreende monofosforil lípido A. Noutra forma de realização, o adjuvante é SBAS2. Noutra forma de realização, o adjuvante compreende SBAS2. Noutra forma de realização, o adjuvante é um oligonucleótido não metilado contendo CpG. Noutra forma de realização, o adjuvante compreende um oligonucleótido não metilado contendo CpG. Noutra forma de realização, o adjuvante é uma citoquina estimuladora imune. Noutra forma de realização, o adjuvante compreende uma citocina estimuladora imune. Noutra forma de realização, o adjuvante é uma molécula nucleotídica que codifica uma citoquina estimuladora imune. Noutra forma de realização, o adjuvante compreende uma molécula nucleotídica que codifica uma citoquina estimuladora imune. Noutra forma de realização, o adjuvante é ou compreende um glicosídeo quill. Noutra forma de realização, o adjuvante é ou compreende um mitogénio bacteriano. Noutra forma de realização, o adjuvante é ou compreende uma toxina bacteriana. Noutra forma de realização, o adjuvante é ou compreende qualquer outro adjuvante conhecido na técnica. A presente invenção descreve um método para induzir uma resposta imunitária num indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma proteína recombinante ou polipéptido da presente invenção, em que a proteína ou polipéptido recombinante contém um péptido antigénico de interesse, induzindo assim uma resposta imunitária contra um péptido antigénico de interesse. 0 presente pedido também descreve um método para induzir uma resposta imunitária num indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo um vetor de vacina recombinante da presente invenção, em que o vetor de vacina recombinante compreende ou codifica uma proteína ou polipéptido recombinante que compreende um péptido antigénico heterólogo de interesse induzindo, assim, uma resposta imune contra o péptido antigénico de interesse. 0 presente pedido também descreve um método para induzir uma resposta imune num sujeito, compreendendo a administração ao sujeito de uma estirpe recombinante de Listeria da presente invenção, em que a estirpe recombinante de Listeria compreende ou codifica uma proteína recombinante ou polipéptido que compreende um péptido antigénico heterólogo de interesse induzindo, assim, uma resposta imune contra o péptido heterólogo de interesse. A presente invenção proporciona a proteína recombinante, ou a molécula de nucleótido, ou o vetor de vacina recombinante, ou a estirpe recombinante de Listeria da invenção para utilização como medicamento.

Como aqui divulgado, um péptido ou molécula de nucleótido da presente invenção pode ser administrado a um indivíduo que tem um linfoma, uma célula cancerosa ou uma doença infeciosa que expressa um antigénio alvo da presente invenção. Numa outra forma de realização, a molécula de péptido ou de nucleótido podem ser administrados ex vivo a células de um indivíduo. Noutra forma de realização, o péptido pode ser administrado a um dador de linfócitos; os linfócitos do dador são então administrados, noutra forma de realização, a um indivíduo. Noutra forma de realização, o péptido pode ser administrado a um dador de anticorpos ou de linfócitos; antissoro ou linfócitos do dador são então administrados, noutra forma de realização, a um indivíduo. 0 presente pedido de patente descreve um método de produção de uma proteína ou polipéptido recombinante da presente invenção compreendendo o passo de traduzir a referida proteína ou polipéptido recombinante de uma molécula de nucleótido que codifica a mesma. Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona um produto feito por um ou mais dos processos aqui descritos.

Como aqui divulgado, o péptido heterólogo de interesse pode ser uma proteína de comprimento total que, numa forma de realização, compreende um péptido antigénico. Numa forma de realização, a proteína é uma proteína NY-ESO-1. Noutra forma de realização, a proteína é uma proteína E7 do vírus do papiloma humano (HPV). Noutra forma de realização, a proteína é uma proteína do recetor de células B (BCR) . Como aqui divulgado, o péptido heterólogo de interesse é um péptido antigénico. 0 péptido antigénico de interesse na presente invenção é, noutra forma de realização, um péptido NY-ESO-1.

Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona uma molécula de nucleótido recombinante que codifica um péptido contendo NY-ESO-1 da presente invenção. Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição compreendendo uma proteína ou polipéptido recombinante contendo LLO mutante da presente invenção e um péptido NY-ESO-1. Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona um vetor de vacina recombinante que codifica um péptido contendo NY-ESO-1 da presente invenção. Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma estirpe recombinante de Listeria que codifica um peptídeo contendo NY-ESO-1 da presente invenção. NY-ESO-1 é um antigénio "cancro-testículo" expresso em cancro epitelial do ovário (EOC). 0 NY-ESO-1 é expresso em melanoma metastático, cancro da mama, cancro do pulmão, cancro do esófago, que numa forma de realização, é carcinoma de células escamosas esofágicas, ou uma combinação destes. Numa forma de realização, NY-ESO-1 é um dos antígenos de cancro dos testículos mais imunogénicos. Noutra forma de realização, o NY-ESO-1 é capaz de induzir respostas imunes humorais fortes (anticorpos) e celulares (células T) em pacientes com cancros que expressam NY-ESO-1 quer através de indução natural ou espontânea pelo tumor do doente ou após vacinação específica utilizando epítopos peptídicos definidos. Noutra forma de realização, os epítopos peptídicos de NY-ESO-1 são apresentados por moléculas MHC de classe II. Por conseguinte, numa forma de realização, as composições e métodos da presente invenção compreendendo NY-ESO-1 são particularmente úteis na prevenção ou tratamento dos cancros acima mencionados. 0 presente pedido de patente descreve um método para induzir uma resposta imunitária num indivíduo contra uma célula cancerígena que expressa NY-ESO-1, compreendendo o passo de administrar ao indivíduo um péptido, proteína ou polipéptido recombinante contendo o antigénio NY-ESO-1, ou um vetor de vacina que expressa os antigénios NY-ESO-1, ou uma molécula de nucleótidos de antigénio de codificação NY-ESO-1, ou um antigénio recombinante NY-ESO-1 que expressa a estirpe de Listeria da presente invenção, induzindo assim uma resposta imunitária contra uma célula cancerígena que expressa NY-ESO-1. Noutra forma de realização, a célula cancerosa é uma célula de melanoma ovariano. Noutra forma de realização, a célula cancerosa é uma célula de cancro do pulmão. Noutra forma de realização, a célula cancerígena é qualquer outra célula cancerígena que expressa NY-ESO-1 conhecida na técnica. A presente invenção proporciona, assim, uma proteína recombinante, ou uma molécula de nucleótido, ou um vetor de vacina recombinante, ou uma estirpe de Listeria recombinante da invenção, em que o péptido antigénico é um péptido NY-ESO-1, para utilização no tratamento, inibição, supressão, induzindo a regressão de, reduzindo a incidência de, ou protegendo contra um tumor que expressa NY-ESO-1 num sujeito.

Numa forma de realização, o tumor é um tumor de melanoma ovariano. Noutra forma de realização, o tumor é um tumor de cancro do pulmão. Noutra forma de realização, o tumor é qualquer outro tumor que expressa NY-ESO-1 conhecido na técnica. 0 presente pedido também descreve um método para induzir uma resposta imunitária contra um epítopo NY-ESO-1, compreendendo o passo de administrar ao indivíduo um péptido, proteína ou polipéptido recombinante contendo o antigénio NY-ESO-1 da presente invenção, induzindo uma resposta imunitária contra um epítopo NY-ESO-1.

Como aqui divulgado, o presente pedido de patente proporciona um método para induzir uma resposta imunitária contra um antigénio NY-ESO-1, compreendendo o passo de administrar ao indivíduo um péptido, proteína ou polipéptido recombinante da presente invenção contendo o referido antigénio NY-ESO-1, induzindo assim uma resposta imunitária contra um epítopo NY-ESO-1.

Numa forma de realização, um epítopo NY-ESO-1 para utilização na presente invenção é ASGPGGGAPR: 53-62 (A31), ARGPESRLL: 80-88 (Cw6), LAMPFATPM: 92-100 (CW3), MPFATPMEA: 94-102 (B35, B51), TVSGNILTR: 127-136 (A68), TVSGNILT: 127-135 (Cwl5), SLLMWITQC: 157-165 (A2; Exemplo 2), ou outro epítopo NY-ESO-1 conhecido na técnica.

Também aqui divulgado é um método para induzir uma resposta imunitária contra uma célula alvo que expressa NY-ESO-1, compreendendo o passo de administrar ao sujeito um péptido, proteína ou polipéptido recombinante contendo o antigénio NY-ESO-1 da presente invenção induzindo, assim, uma resposta imunitária contra uma célula alvo que expressa NY-ESO-1. Noutra forma de realização, a célula alvo é uma célula de melanoma ovariano. Noutra forma de realização, a célula alvo é uma célula de cancro do pulmão. Noutra forma de realização, a célula alvo é qualquer outra célula expressando NY-ESO-1 conhecida na técnica. A célula ou tumor de cancro que expressa NY-ESO-1 alvo pode ser uma célula ou tumor de cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC). Noutra forma de realização, a célula cancerígena que expressa NY-ESO-1 é uma célula ou tumor de adenocarcinoma de pulmão. Noutra forma de realização, a célula cancerosa que expressa NY-ESO-1 é uma célula ou tumor de carcinoma bronquioloalveolar (BAC). Noutra forma de realização, a célula cancerígena que expressa NY-ESO-1 é uma célula ou tumor de um adenocarcinoma com características bronquioloalveolares (AdenoBAC). Noutra forma de realização, a célula ou tumor de cancro que expressa NY-ESO-1 é de um carcinoma de células escamosas do pulmão. 0 péptido NY-ESO-1 pode ser um péptido de uma proteína NY-ESO-1, em que a sequência da proteína é: MQAEGRGTGGSTGDADGPGGPGIPDGPGGNAGGPGEAGATGGRGPRGAGAA RASGPGGGAPRGPHGGAASGLNGCCRCGARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARR SLAQDAPPLPVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHRQLQLSISSCLQQLSLLMWITQCF LPVFLAQPPSGQRR (SEQ ID NO: 1; número de acesso GenBank NM 001327). Noutra forma de realização, a proteína NY-ESO-1 é um homólogo da SEQ ID NO: 1. Numa outra forma de realização, a proteína NY-ESO-1 é uma variante da SEQ ID NO: 1. Numa outra forma de realização, NY-ESO-1 é um isómero da SEQ ID NO: 1. Numa outra forma de realização, a proteína NY-ESO-1 é um fragmento da SEQ ID NO: 1. Numa outra forma de realização, a proteína NY-ESO-1 é um fragmento de um homólogo da SEQ ID NO: 1. Noutra forma de realização, a proteína NY-ESO-1 é um fragmento de uma variante da SEQ ID NO: 1. Numa outra forma de realização, a proteína NY-ESO-1 é um fragmento de um isómero da SEQ ID NO: 1.

Noutra forma de realização, o péptido NY-ESO-1 da presente invenção é derivado de qualquer outra proteína NY-ESO-1 conhecida na técnica. Noutra forma de realização, o antigénio NY-ESO-1 é um péptido possuindo a sequência: SLLMWITQC (SEQ ID NO: 2). Noutra forma de realização, a sequência é SLLMWITQCFL (SEQ ID NO: 3) . Noutra forma de realização, a sequência é SLLMWITQCFLP (SEQ ID NO: 4) . Noutra forma de realização, a sequência é SLLMWITQCFLPV (SEQ ID NO: 5) . Noutra forma de realização, a sequência é SLLMWITQCFLPVF (SEQ ID NO: 6) . Noutra forma de realização, a sequência é SLLMWITQCFLPVFL (SEQ ID NO: 7). Noutra forma de realização, a sequência é WITQCFLPVFLAQPPSGQRR (SEQ ID NO: 8). Noutra forma de realização, a sequência é YLAMPFATPMEAELARRSLA (SEQ ID NO: 9). Noutra forma de realização, a sequência é ASGPGGGAPR (SEQ ID NO: 10) . Noutra forma de realização, a sequência é MPFATPMEA (SEQ ID NO: 11) . Noutra forma de realização, a sequência é LAMPFATPM (SEQ ID NO: 12). Noutra forma de realização, a sequência é ARGPESRLL (SEQ ID NO: 13) . Noutra forma de realização, a sequência é LLMWITQCF (SEQ ID NO: 14). Noutra forma de realização, a sequência é SLLMWITQV (SEQ ID NO: 15) . Numa forma de realização, o antigénio NY-ESO-1 é um péptido compreendendo as posições 157-165 do péptido NY-ESO-1 do tipo selvagem. Noutra forma de realização, o antigénio NY-ESO-1 é um péptido compreendendo as posições 53-62 do péptido NY-ESO-1 de tipo selvagem. Noutra forma de realização, o antigénio NY-ESO-1 é um péptido compreendendo as posições 94-102 do péptido NY-ESO-1 do tipo selvagem. Noutra forma de realização, o antigénio NY-ESO-1 é um péptido compreendendo as posições 92-100 do péptido NY-ESO-1 do tipo selvagem. Noutra forma de realização, o antigénio NY-ESO-1 é um péptido compreendendo as posições 80-88 do péptido NY-ESO-1 do tipo selvagem. Noutra forma de realização, o antigénio NY-ESO-1 é um péptido compreendendo as posições 158-166 do péptido NY-ESO-1 do tipo selvagem. Noutra forma de realização, o antigénio NY-ESO-1 é uma variante de um péptido NY-ESO-1 de tipo selvagem. Um exemplo de uma variante é SLLMWITQV (SEQ ID NO: 16) .

Noutra forma de realização, o péptido antigénico utilizado na presente invenção é um péptido E7 de virus do papiloma humano (HPV). Noutra forma de realização, o péptido antigénico é uma proteína E7 completa. Noutra forma de realização, o péptido antigénico é um fragmento de uma proteína E7.

As proteínas E6 e E7 são duas das sete proteínas não estruturais precoces, algumas das quais desempenham um papel na replicação do vírus (El, E2, E4) e/ou na maturação do vírus (E4). Noutra forma de realização, as proteínas E6 e E7 são oncoproteínas que são críticas para a replicação virai, bem como, para a imortalização e transformação de células hospedeiras. Numa forma de realização, as proteínas virais E6 e E7 não são expressas em epitélios escamosos cervicais normais. Noutra forma de realização, a expressão dos genes E6 e E7 em células estaminais epiteliais da mucosa é necessária para iniciar e manter a carcinogénese cervical. Além disso e em algumas formas de realização, a progressão de lesões pré-neoplásicas para cancros cervicais invasivos está associada com uma expressão aumentada contínua da oncoproteína E6 e E7. Assim, noutra forma de realização, E6 e E7 são expressas em cancros cervicais. Noutra forma de realização, o potencial oncogénico de E6 e E7 pode surgir das suas propriedades de ligação a proteínas de células hospedeiras. Por exemplo e numa forma de realização, E6 liga-se à proteína supressora de tumor p53 conduzindo à degradação dependente da ubiquitina da proteína e, noutra forma de realização, E7 liga-se e promove a degradação da proteína retinoblastoma supressora de tumor (pRb). Deste modo, numa forma de realização, as composições e utilizações da presente invenção compreendendo HPV-E7 são particularmente úteis na prevenção ou tratamento dos cancros acima mencionados.

Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona uma molécula de nucleótido recombinante que codifica um péptido contendo E7 da presente invenção. Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição compreendendo um péptido recombinante, proteína ou polipéptido recombinante LLO mutante da presente invenção e um péptido E7. Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona um vetor de vacina recombinante que codifica um péptido contendo E7 da presente invenção. Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma estirpe recombinante de Listeria que codifica um peptídeo contendo E7 da presente invenção.

Noutra forma de realização, a presente invenção revela um método para induzir uma resposta imunitária num sujeito contra um epitopo E7 de HPV, compreendendo o passo de administrar ao indivíduo o péptido, proteína ou polipéptido recombinante da presente invenção, induzindo assim uma resposta imunitária contra um epitopo E7 de HPV.

Numa forma de realização, um epitopo E7 de HPV para utilização na presente invenção é TLHEYMLDL: 7-15 (B8), YMLDLQPETT: 11-20 (A2), LLMGTLGIV: 82-90 (A2), TLGIVCPI: 86-93 (A2) ou outro epitopo de HPV E7 conhecido na técnica.

Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona uma proteína recombinante, ou uma molécula de nucleótido, ou um vetor de vacina recombinante, ou uma estirpe recombinante de Listeria da invenção, em que o péptido antigénico é um péptido E7 de HPV, para utilização na indução de uma resposta imunitária ao péptido antigénico E7 de HPV num indivíduo. O presente pedido de patente descreve também um método para induzir uma resposta imunitária num indivíduo contra uma célula alvo que expressa E7 de HPV, compreendendo o passo de administrar ao indivíduo um péptido, proteína ou polipéptido recombinante contendo HPV-E7 da presente invenção ou um de nucleótidos ou um vetor de vacina ou uma estirpe de Listeria que codifica para a E7 de VPH contendo o péptido recombinante, proteína ou polipéptido da presente invenção, induzindo assim uma resposta imunitária contra uma célula-alvo que expressa E7 de VPH. A célula alvo pode ser uma célula de cancro do colo do útero, ou uma célula de cancro de cabeça e pescoço, ou qualquer outro tipo de célula de expressão de E7 de HPV conhecida na técnica. A presente invenção proporciona uma proteína recombinante, ou uma molécula de nucleótido, ou um vetor de vacina recombinante, ou uma estirpe recombinante de Listeria da invenção, em que o péptido antigénico é um péptido E7 de HPV, para utilização no tratamento, inibição, supressão, induzindo a regressão de, reduzindo a incidência de, ou protegendo contra um tumor que expressa HPV-E7 num indivíduo.

Numa forma de realização, o tumor é um tumor cervical. Noutra forma de realização, o tumor é um tumor de cabeça e pescoço. Noutra forma de realização, o tumor é qualquer outro tipo de tumor que expressa E7 de HPV conhecido na técnica. 0 tumor cervical visado pelas proteínas, nucleótidos, vetores de vacinas ou estirpes de Listeria da presente invenção é, noutra forma de realização, um carcinoma de células escamosas. Noutra forma de realização, o tumor cervical é um adenocarcinoma. Noutra forma de realização, o tumor cervical é um carcinoma adenoescamoso. Noutra forma de realização, o tumor cervical é um carcinoma de células pequenas. Noutra forma de realização, o tumor cervical é qualquer outro tipo de tumor cervical conhecido na técnica.

Numa forma de realização, o tumor alvo das proteínas, nucleótidos, vetores de vacinas ou estirpes de Listeria da presente invenção é um carcinoma de cabeça e pescoço. Noutra forma de realização, o tumor é um carcinoma anal. Noutra forma de realização, o tumor é um carcinoma vulvar. Noutra forma de realização, o tumor é um carcinoma vaginal.

Numa forma de realização, as proteínas, nucleótidos, vetores de vacina ou estirpes de Listeria aqui proporcionadas podem ser usadas em conjunção com outros métodos de tratamento, inibição ou supressão de cancro do colo do útero, incluindo, entre outras, cirurgia, radioterapia, quimioterapia, vigilância, adjuvante (adicional), ou uma combinação destes tratamentos. A proteína E7 que é utilizado (inteira ou como fonte dos fragmentos) tem, noutra forma de realização, a sequência MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHY NIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP (SEQ ID NO: 17). Noutra forma de realização, a proteína E7 é um homólogo da SEQ ID NO: 17. Noutra forma de realização, a proteína E7 é uma variante da SEQ ID NO: 17. Noutra forma de realização, a proteína E7 é um isómero da SEQ ID NO: 17 Noutra forma de realização, a proteína E7 é um fragmento da SEQ ID NO: 17. Numa outra forma de realização, a proteína E7 é um fragmento de um homólogo da SEQ ID NO: 17. Noutra forma de realização, a proteína E7 é um fragmento de uma variante da SEQ ID NO: 17. Noutra forma de realização, a proteína E7 é um fragmento de um isómero da SEQ ID NO: 17.

Numa forma de realização, o domínio de ligação de colesterol de LLO (ECTGLAWEWWR; SEQ ID NO: 18) é substituído com um epítopo E7 (RAHYNIVTF; SEQ ID NO: 19).

Noutra forma de realização, a sequência da proteína E7 é: MHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLCHEQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARR AEPQRHTMLCMCCKCEARIELWESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWCASQQ (SEQ ID NO: 20). Noutra forma de realização, a proteína E7 é um homólogo da SEQ ID NO: 20. Noutra forma de realização, a proteína E7 é uma variante da SEQ ID NO: 20. Noutra forma de realização, a proteína E7 é um isómero da SEQ ID NO: 20. Noutra forma de realização, a proteína E7 é um fragmento da SEQ ID NO: 20. Noutra forma de realização, a proteína E7 é um fragmento de um homólogo de SEQ ID NO: 20. Noutra forma de realização, a proteína E7 é um fragmento de uma variante da SEQ ID NO: 20. Noutra forma de realização, a proteína E7 é um fragmento de um isómero da SEQ ID NO: 20.

Noutra forma de realização, a proteína E7 tem uma sequência estabelecida numa das seguintes entradas do GenBank: M24215, NC 004500, V01116, X62843 ou M14119. Noutra forma de realização, a proteína E7 é um homólogo de uma sequência de uma das entradas doGenBank acima. Noutra forma de realização, a proteína E7 é uma variante de uma sequência de uma das entradas do GenBank acima. Noutra forma de realização, a proteína E7 é um isómero de uma sequência de uma das entradas do GenBank acima. Noutra forma de realização, a proteína E7 é um fragmento de uma sequência de uma das entradas acima mencionadas do GenBank. Noutra forma de realização, a proteína E7 é um fragmento de um homólogo de uma sequência de uma das entradas do GenBank acima. Noutra forma de realização, a proteína E7 é um fragmento de uma variante de uma sequência de uma das entradas do GenBank acima. Noutra forma de realização, a proteína E7 é um fragmento de um isómero de uma sequência de uma das entradas acima do GenBank.

Numa forma de realização, o antigénio E7 de HPV16 é um péptido possuindo a sequência: TLGIVCPI (SEQ ID NO: 21) . Noutra forma de realização, o antigénio E7 de HPV16 é um péptido possuindo a sequência: LLMGTLGIV (SEQ ID NO: 22) . Noutra forma de realização, o antigénio E7 de HPV16 é um péptido possuindo a sequência: YMLDLQPETT (SEQ ID NO: 23) . Numa forma de realização, o antigénio E7 de HPV16 é um péptido compreendendo as posições 86-93 do antigénio E7 de HPV16 de tipo selvagem. Numa forma de realização, o antigénio E7 de HPV16 é um péptido compreendendo as posições 82-90 do antigénio E7 de HPV16 de tipo selvagem. Numa forma de realização, o antigénio E7 de HPV16 é um péptido compreendendo as posições 11-20 do antigénio E7 de HPV16 de tipo selvagem. Noutra forma de realização, o antigénio E7 de HPV16 é um péptido que consiste nas posições 86-93, 82-90 ou 11-20 do antigénio E7 de HPV16 de tipo selvagem. Noutra forma de realização, o antigénio E7 de HPV16 é uma variante de um péptido E7 de HPV16 de tipo selvagem. Noutra forma de realização, o antigénio E7 de HPV16 é qualquer antigénio E7 de HPV16 descrito em Ressing at ai ., J Immunol 1995 154 (11) : 5934-43.

Noutra forma de realização, o péptido antigénico utilizado na presente invenção é um péptido E6 de HPV. Noutra forma de realização, o péptido antigénico é uma proteína E6 completa. Noutra forma de realização, o péptido antigénico é um fragmento de uma proteína E6.

Deste modo, a presente invenção proporciona uma proteína recombinante, ou uma molécula de nucleótido, ou um vetor de vacina recombinante, ou uma estirpe recombinante de Listeria da invenção, em que o péptido antigénico é um péptido E6 de HPV, para utilização na indução de uma resposta imunitária ao HPV E6 num indivíduo. A proteína E6 que é utilizado (inteira ou como fonte dos fragmentos) tem, noutra forma de realização, a sequência MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFA FRDLCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCI NCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL (SEQ ID NO: 24). Noutra forma de realização, a proteína E6 é um homólogo da SEQ ID NO: 24. Noutra forma de realização, a proteína E6 é uma variante da SEQ ID NO: 24. Noutra forma de realização, a proteína E6 é um isómero da SEQ ID NO: 24 Noutra forma de realização, a proteína E6 é um fragmento da SEQ ID NO: 24. Noutra forma de realização, a proteína E6 é um fragmento de um homólogo da SEQ ID NO: 24. Noutra forma de realização, a proteína E6 é um fragmento de uma variante da SEQ ID NO: 24. Noutra forma de realização, a proteína E6 é um fragmento de um isómero da SEQ ID NO: 24.

Noutra forma de realização, a sequência da proteína E6 é:

MARFEDPTRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDLFV VYRDSIPHAACHKCIDFYSRIRELRHYSDSVYGDTLEKLTNTGLYNLLIRCLRCQKPL NPAEKLRHLNEKRRFHNIAGHYRGQCHSCCNRARQERLQRRRETQV (SEQ ID NO: 25) . Numa outra forma de realização, a proteína E6 é um homólogo da ID SEQ NO: 25. Em outra forma de realização, a proteína E6 é uma variante da SEQ ID NO: 25. Em outra forma de realização, a proteína E6 é um isómero da SEQ ID NO: 25. Numa outra forma de realização, a proteína E6 é um fragmento da SEQ ID NO: 25. Em outra forma de realização, a proteína E6 é um fragmento de um homólogo da SEQ ID NO: 25. Em outra forma de realização, a proteína E6 é um fragmento de uma variante da SEQ ID NO: 25. Noutra forma de realização, a proteína E6 é um fragmento de um isómero da SEQ ID NO: 25.

Noutra forma de realização, a proteína E6 tem uma sequência estabelecida numa das seguintes entradas do GenBank: M24215, Ml4119, NC_004500, V01116, X62843 ou M14119. Noutra forma de realização, a proteína E6 é um homólogo de uma sequência de uma das entradas do GenBank acima. Noutra forma de realização, a proteína E6 é uma variante de uma sequência de uma das entradas do GenBank acima. Noutra forma de realização, a proteína E6 é um isómero de uma sequência de uma das entradas acima mencionadas do GenBank. Noutra forma de realização, a proteína E6 é um fragmento de uma sequência de uma das entradas do GenBank acima. Noutra forma de realização, a proteína E6 é um fragmento de um homólogo de uma sequência de uma das entradas do GenBank acima. Noutra forma de realização, a proteína E6 é um fragmento de uma variante de uma sequência de uma das entradas do GenBank acima. Noutra forma de realização, a proteína E6 é um fragmento de um isómero de uma sequência de uma das entradas do GenBank acima. 0 HPV que é a fonte do antigénio heterólogo de métodos da presente invenção é, em outro modelo de realização, um de HPV-16. Numa outra forma de realização, o HPV é um HPV-18. Noutra forma de realização, o HPV é selecionado entre HPV-16 e HPV-18. Noutra forma de realização, o HPV é um HPV-31. Noutra forma de realização, o HPV é um HPV-35. Noutra forma de realização, o HPV é um HPV-39. Noutra forma de realização, o HPV é um HPV-45. Noutra forma de realização, o HPV é um HPV-51. Noutra forma de realização, o HPV é urn HPV-52. Noutra forma de realização, o HPV é um HPV-58. Noutra forma de realização, o HPV é um tipo de HPV de alto risco. Noutra forma de realização, o HPV é urn tipo de HPV mucoso .

Numa forma de realização, um fator etiológico principal na génese do carcinoma cervical é a infeção por papilomavirus humano (HPVs), os quais, numa forma de realização, são pequenos virus de ADN que infetam células epiteliais quer da pele quer da mucosa. Numa forma de realização, as neoplasias malignas relacionadas com HPV incluem cancros orais, cervicais, anogenitais e cervicais, bem como papilomatose respiratória. Numa forma de realização, o HPV expressa seis ou sete proteínas não estruturais e duas proteínas estruturais, cada uma das quais pode servir como alvo nas abordagens imunoprofiláticas ou imunoterapêuticas aqui descritas. Numa forma de realização, as proteínas da cápside viral LI e L2 são proteínas estruturais tardias. Numa forma de realização, LI é a proteína principal da cápside, cuja sequência de aminoácidos é altamente conservada entre os diferentes tipos de HPV.

Noutra forma de realização, o péptido antigénico de interesse utilizado na presente invenção é um idiótipo de BCR.

Numa forma de realização, os "recetores de células B" ou "BCR" são o recetor da superfície celular das células B para um antigénio específico. Noutra forma de realização, o BCR é composto por uma molécula de imunoglobulina transmembranar associada com as cadeias invariantes Igo; e IgP num complexo não covalente. Noutra forma de realização, a sinalização do recetor de células B (BCR) regula várias decisões de destino de células B ao longo do desenvolvimento. Noutra forma de realização, a expressão continuada das subunidades de sinalização do BCR é necessária para a sobrevivência de células B maduras. Noutra forma de realização, as alterações na sinalização de BCR podem suportar a linfomagénese. Numa forma de realização, as células têm a proteína CD20 no exterior da célula. Noutra forma de realização, as células B cancerosas também transportam a proteína CD20. Noutra forma de realização, a CD20 é altamente expressa em pelo menos 95% de linfomas de células B. Numa forma de realização, o BCR é expresso em linfomas de células B. Em outra modalidade, o BCR é expressa em linfoma folicular, linfoma de não pequenas células clivadas, linfoma da zona marginal, linfoma esplénico com linfócitos nas vilosidades, linfoma de células do manto, linfoma de células grandes difuso em grandes células, linfoma de pequenos linfócitos, linfoma de endémicas Burkitt, esporádica linfoma de Burkitt, linfoma de não-Burkitt, linfóide do tecido associado à mucosa MALT/ MALToma (extranodal), monocitóides de células B, linfoma (nodal) de célula mista difusa, linfoma de células B imunoblástico primário do mediastino, linfoma angiocêntrico-pulmonar de células B. Em outra modalidade, o CD20 é expresso na BCR é expressa em linfoma folicular, linfoma de não pequenas células clivadas, linfoma da zona marginal, linfoma esplénico com linfócitos nas vilosidades, linfoma de células do manto, linfoma de células grandes difuso em grandes células, linfoma de pequenos linfócitos, linfoma de endémicas Burkitt, esporádica linfoma de Burkitt, linfoma de não-Burkitt, linfóide do tecido associado à mucosa MALT/ MALToma (extranodal), monocitóides de células B, linfoma (nodal) de célula mista difusa, linfoma de células B imunoblástico primário do mediastino, linfoma angiocêntrico-pulmonar de células B. Por conseguinte, numa forma de realização, as composições e utilizações médicas da presente invenção compreendendo BCR são particularmente úteis na prevenção ou tratamento dos cancros acima mencionados.

Numa forma de realização, estudos citogénicos mostraram que alguns subtipos histológicos e imunológicos de LNH têm anomalias cromossómicas com translocações recíprocas, envolvendo frequentemente genes para o recetor de células B e um oncogene. A linfomagese resulta na expansão clonal da célula B transformada, com cada célula filha expressando o BCR na superfície celular assim como péptidos derivados de BCR associados com moléculas MHC de classe I e II. 0 BCR tem uma conformação única formada pelas regiões hipervariáveis da cadeia pesada e leve, isto é referido como o "idiótipo", é o mesmo para cada célula filha dentro do tumor, e não está presente em números significativos de células normais. Portanto, o idiótipo é um antigénio tumoral específico e um alvo para a terapia do linfoma.

Tal como aqui descrito, a presente invenção produziu uma proteína de fusão conformacionalmente intacta compreendendo uma proteína LLO e um idiótipo BCR (secção de Detalhes Experimentais). 0 presente pedido descreve um método para induzir uma resposta imunitária contra um linfoma num sujeito, compreendendo a etapa de administrar ao sujeito idiótipo BCR contendo um péptido recombinante, proteína ou polipéptido da presente invenção, ou uma molécula de nucleótidos, vetor de vacina ou estirpe de Listeria codificando ou expressando o idiótipo BCR contendo o péptido recombinante, proteína ou polipéptido da presente invenção, induzindo assim uma resposta imunitária contra um linfoma. A presente invenção proporciona uma proteína recombinante, ou uma molécula de nucleótido, ou um vetor de vacina recombinante, ou uma estirpe recombinante de Listeria da invenção, em que o péptido antigénico é um BCR, para utilização no tratamento, inibição, supressão, induzindo a regressão de, reduzindo a incidência de, ou protegendo contra um linfoma expressando BCR num sujeito.

Tal como descrito na secção de Detalhes Experimentais, a fusão de LLO com um antigénio aumenta a sua imunogenicidade. Além disso, a administração de proteínas de fusão da presente invenção resulta na proteção contra a provocação tumoral.

Além disso, como aqui descrito, a presente invenção produziu uma proteína de fusão conformacionalmente intacta compreendendo uma proteína LLO e um idiótipo BCR, demonstrando metodologias precisas e eficazes para testar vacinas anti-linfoma em modelos de ratos e animais e mostrou a eficácia das vacinas da presente invenção na proteção contra o linfoma e a sua superioridade relativamente às vacinas anti-linfoma atualmente aceites (secção de Detalhes Experimentais).

Numa forma de realização, uma vacina da presente invenção é uma composição que, após administração, estimula a produção de anticorpos ou imunidade celular contra um antigénio.

Numa forma de realização, as vacinas são administradas como microrganismos mortos ou atenuados, enquanto noutra forma de realização, as vacinas compreendem antigénios naturais ou geneticamente modificados. Numa forma de realização, as vacinas eficazes estimulam o sistema imunitário para promover o desenvolvimento de anticorpos que possa rapidamente e efetivamente atacar as células, os microrganismos ou os vírus que produzem o antigénio contra o qual o sujeito foi vacinado, quando são produzidos no sujeito, impedindo assim o desenvolvimento da doença.

Numa forma de realização, uma vacina da presente invenção é profilática, enquanto noutra forma de realização, uma vacina da presente invenção é terapêutica. Numa forma de realização, é administrada uma vacina profilática a uma população que é suscetível de desenvolver ou contrair uma doença ou condição particular, quer através de exposição ambiental ou predisposição qenética. Tais fatores de suscetibilidade são dependentes da doença e são bem conhecidos dos especialistas na técnica. Por exemplo, a população que compreende fumantes (numa forma de realização, cigarro, charuto, cachimbo, etc.) é conhecida na especialidade como sendo suscetível ao desenvolvimento de cancro do pulmão. A população que compreende uma mutação em BRCA-1 e BRCA-2 é conhecida na técnica como sendo suscetível ao cancro da mama e/ou do ovário. A população que compreende polimorfismos de nucleótidos individuais (SNPs) no cromossoma 15 dentro de uma região que contém genes para as subunidades alfa 3 e 5 do recetor nicotínico de acetilcolina é conhecida na técnica como suscetível ao cancro do pulmão. Outros fatores de suscetibilidade semelhantes são conhecidos na técnica e tais populações suscetíveis são consideradas, numa forma de realização, para serem uma população para a qual uma vacina profilática da presente invenção seria mais útil.

Assim, as vacinas da presente invenção são eficazes na indução de uma resposta imune a, prevenção, tratamento e indução de remissão de linfoma. Assim, o presente pedido de patente descreve um método para superar uma tolerância imunitária a um linfoma num indivíduo, compreendendo o passo de administrar ao indivíduo um péptido da presente invenção, superando assim uma tolerância imunitária a um linfoma. 0 presente pedido também descreve um método para superar uma tolerância imunológica a um linfoma num sujeito, que compreende o passo de administração ao indivíduo de uma molécula de nucleótidos da presente invenção, superando, assim, uma tolerância imunológica a um linfoma. "Tolerância" refere-se, noutra forma de realização, a uma falta de resposta do hospedeiro a um antigénio. Noutra forma de realização, o termo refere-se a uma falta de capacidade de resposta detetável do hospedeiro a um antigénio. Noutra forma de realização, o termo refere-se a uma falta de imunogenicidade de um antigénio num hospedeiro. Numa outra forma de realização, a tolerância é medida pela falta de capacidade de resposta em e num ensaio de morte por CTL. Noutra forma de realização, a tolerância é medida por falta de resposta num ensaio de hipersensibilidade de tipo retardado. Noutra forma de realização, a tolerância é medida por falta de capacidade de resposta em qualquer outro ensaio adequado conhecido na técnica. Noutra forma de realização, a tolerância é determinada ou medida conforme ilustrado nos Exemplos aqui apresentados. "Superado" refere-se, noutra forma de realização, a uma inversão da tolerância por uma vacina. Noutra forma de realização, o termo refere-se a conferência de resposta imunitária detetável por uma vacina. Noutra forma de realização, a superação da tolerância imunitária é determinada ou medida como representado nos Exemplos aqui.

Deste modo, o presente pedido de patente descreve um método para reduzir uma incidência de recaída de um linfoma num sujeito em remissão do linfoma, compreendendo o passo de administrar ao indivíduo um péptido ou molécula de nucleótido da presente invenção, reduzindo assim a incidência de recaída de um linfoma num indivíduo em remissão do linfoma. 0 presente pedido de patente descreve, também, um método para suprimir uma formação de um linfoma, compreendendo o passo de administração de um péptido recombinante, proteína ou polipéptido ou molécula de nucleótido da presente invenção, suprimindo assim a formação de um linfoma. 0 presente pedido descreve, também, um método de induzir a remissão de uma doença residual de linfoma de células B, compreendendo a administração de uma molécula de péptido ou de nucleótidos da presente invenção, induzindo assim uma remissão de uma doença residual do linfoma de células B. 0 presente pedido descreve, também, um método de eliminação da doença residual minima do linfoma de células B, compreendendo a administração de uma molécula de péptido ou de nucleótidos da presente invenção, eliminando, assim, doença residual minima do linfoma de células B. 0 presente pedido de patente também descreve um método para reduzir o tamanho ou volume de um linfoma de células B, compreendendo a administração de um péptido ou molécula de nucleótido da presente invenção, reduzindo desse modo o tamanho de um linfoma de células B.

Noutra forma de realização, o linfoma que é um alvo das proteínas, nucleótidos, vetores de vacina ou estirpes de Listeria da presente invenção é um não-Hodgkin. Noutra forma de realização, um linfoma é um linfoma de células B. Noutra forma de realização, um linfoma é um linfoma de baixo grau. Noutra forma de realização, um linfoma é um NHL de baixo grau. Noutra forma de realização, um linfoma é doença residual de um dos tipos acima de linfoma. Noutra forma de realização, o linfoma é qualquer outro tipo de linfoma conhecido na técnica. Noutra forma de realização, o linfoma é um linfoma de Burkitt. Noutra forma de realização, o linfoma é um linfoma folicular. Noutra forma de realização, o linfoma é um linfoma da zona marginal. Noutra forma de realização, o linfoma é um linfoma de zona marginal esplénica. Noutra forma de realização, o linfoma é um linfoma de células do manto. Noutra forma de realização, o linfoma é um linfoma de células do manto indolente. Noutra forma de realização, o linfoma é qualquer outro tipo conhecido de linfoma que expresse um BCR.

Noutra forma de realização, as células do tumor que são alvo de proteínas, nucleótidos, vetores de vacinas ou estirpes de Listeria da presente invenção expressam um BCR. Noutra forma de realização, o tumor está associado a um BCR. Noutra forma de realização, o BCR tem um idiótipo que é característico do tumor. Noutra forma de realização, o BCR expresso por uma célula tumoral é o alvo das respostas imunes induzidas por métodos e composições da presente invenção.

Noutra forma de realização, o BCR expresso pela célula alvo é necessário para um fenótipo de tumor. Noutra forma de realização, o BCR é necessário para a transformação de uma célula tumoral. Noutra forma de realização, as células tumorais que perdem a expressão do BCR perdem o seu crescimento descontrolado, invasividade ou outra característica da malignidade.

As proteínas, nucleótidos, vetores de vacina ou estirpes de Listeria aplicam-se igualmente a qualquer BCR de um linfoma não Hodgkin e um qualquer seu idiótipo. As sequências de BCR são bem conhecidas na técnica e são prontamente obtidas a partir de amostras de linfoma.

Uma sequência exemplar de um precursor de cadeia pesada de imunoglobulina BCR (Ig) é: MKLWLNWIFLVTLLNGIQCEVKLVESGGGLVQPGGSLSLSCAASGFTFTDYY MSWVRQPPGKALEWLALIRNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMNALRA EDSATYYCARDPNYYDGSYEGYFDYWAQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 26; N° de Acesso GenBank X14096).

Uma sequência exemplar de um precursor de cadeia leve de Ig de BCR é: LLLISVTVIVSNGEIVLTQSPTTMAASPGEKITITCSASSSISSNYLHWYQQKPGF SPKLLIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGSSIPRGVTFG SGTKLEIKR (SEQ ID NO: 27; N° de Acesso GenBank X14097).

Outra sequência exemplar de um precursor de cadeia leve de Ig de BCR é: GFLLISVTVILTNGEIFLTQSPAIIAASPGEKVTITCSASSSVSYMNWYQQKPGSS PKIWIYGISNLASGVPARFSGSGSGTSFSFTINSMEAEDVATYYCQQRSSYPFTFGSGT KLEIKRADAAPTVSHLP (SEQ ID NO: 28; N° de Acesso GenBank X14098).

Outra sequência exemplar de um precursor de cadeia leve de Ig de BCR é: LLLISVTVIVSNGEIVLTQSPTTMAASPGEKITITCSASSSISSNYLHWYQQKPGF SPKLLIYRTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGSSIPRTFGSG TKLEIKRA (SEQ ID NO: 29; N° de Acesso GenBank X14099).

Outra sequência exemplar de uma cadeia pesada de Ig de BCR é:

MEFGLSWVFLVAILKGVQCEMQLVESGGGLVQPGESLKLSCAASGFSFSGSTI HWVRQASGRGLEWVGRSRSKADNFMTSYAPSIKGKFIISRDDSSNMLYLQMNNLKT EDTAVYFCTRNFTSLDSTGNSFGPWGQGTLVTVSSGSASAPTLFPLVS (SEQ ID NO: 30; linfoma folicular humano de cadeia pesada de IgM; N° de Acesso GenBank X70200).

Outra sequência exemplar de uma cadeia pesada de Ig de BCR é:

MEFGLSWVFLVAILKGVQCEMQLVESGGGLVQPGESFKLSCAASGFSFSGSTI HWVRQASGRGLEWVGRSRSKADNFMTSYAPSIKGKFIISRDDSSNMMYLQMNNLKN EDTAVYFCTRNFTSLDSTGNSFGPWGQGTLVTVSSGSASAPTLFPLVS (SEQ ID NO: 31; linfoma folicular humano de cadeia pesada de IgM; N° de Acesso GenBank X70199).

Outra sequência exemplar de uma cadeia pesada de Ig de BCR é: MEFGLSWVFLVAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSNY MSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCARHTVRGGHCAPRHKPSLQERWGNQRQGALRS (SEQ ID NO: 32; linfoma folicular humano de cadeia pesada de IgM; N° de Acesso GenBank X70208).

Outra sequência exemplar de uma cadeia pesada de Ig de BCR é: MEFGLSWVFLVAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSGSA MHWVRQASGKGLEWVGHIRDKANSYATTYAASVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNSL KIEDTAVYFCTRNFTSLDSTGNSFGPW (SEQ ID NO: 33; linfoma folicular humano de cadeia pesada de IgM; N° de Acesso GenBank X70207).

Outra sequência exemplar de uma cadeia leve de Ig de BCR é: SELTQDPWSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNR PSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNLPLFGGGTKLTVLG (SEQ ID NO: 34; cadeia leve humana de imunocitoma linfoplasmacitica/linfoplasmacitóide; N° de Acesso GenBank AAD14088).

Outra sequência exemplar de uma cadeia leve de Ig de BCR é: DIQMTQSPDSLTVSLGERATINCKSSQSILYSSNDKNYLAWYQQKAGQPPKLLI YWASTRESGVPDRFSGSGSATDFTLTISSLQAEDVAIYYCQQYYSTPLTFGGGTKVEI KR (SEQ ID NO: 35, cadeia leve de linfoma folicular humano, N° de Acesso GenBank Y09250).

Outra sequência exemplar de uma cadeia leve de Ig de BCR é:

DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYEASSL ESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFVTYYCQQYNTFSSYTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 36; cadeia leve de linfoma esplénico de zona marginal humano; número de acesso GenBank AAX93805).

As sequências de outras cadeias leves de BCR Ig exemplares encontram-se nos Números de Acesso GenBank AAX93769-93802, CAA25477, AAB31509, CAE52 8 2 9-CAE52 832, AAF79132-79143 e outras sequências encontradas no GenBank.

As sequências de outras cadeias pesadas de Ig BCR exemplares encontram-se nos Números de Acesso GenBank CAA73044-73059, AAX 938 0 9-AAX 938 4 2, AAQ74129, CAC39369, AAB52590-AAB52597 e outras sequências encontradas no GenBank.

Os métodos para determinar regiões determinantes de complementaridade (cdr) de um BCR são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a CDR1 da SEQ ID NO: 26 consiste nos resíduos 50-54; a CDR2 consiste nos resíduos 66-87; o segmento D consiste nos resíduos 120-130; e o segmento J é constituído pelos resíduos 131-145. A CDR1 da SEQ ID NO: 30 consiste nos resíduos 148-162; o FR2 consiste nos resíduos 163-204; a CDR2 consiste nos resíduos 205-261; o FR3 consiste nos resíduos 262-357; a CDR3 consiste nos resíduos 358-432; e o CHI consiste nos resíduos 433-473. Noutra forma de realização, as regiões estruturais (regiões não cdr) são determinadas por homologia com regiões estruturais conhecidas de outras moléculas de imunoglobulina da mesma espécie.

Noutra forma de realização, identifica-se um idiótipo determinando a cdr de um BCR de métodos e composições da presente invenção.

Noutra forma de realização, um BCR completo está contido ou utilizado na presente invenção. Noutra forma de realização, um fragmento de um BCR é contido ou utilizado. Noutra forma de realização, o fragmento BCR contém o seu idiótipo. Noutra forma de realização, o fragmento BCR contém um epítopo de células T. Noutra forma de realização, o fragmento BCR contém um epltopo de anticorpo. Noutra forma de realização, "antigénio" é aqui utilizado para se referir ao BCR ou seu fragmento que é o alvo das respostas imunes induzidas pelas composições da presente invenção.

Noutra forma de realização, o fragmento de um BCR contido em péptidos da presente invenção é um fragmento de cadeia única das regiões variáveis (scFv) do BCR. Noutra forma de realização, o fragmento BCR está conformacionalmente intacto. Noutra forma de realização, o fragmento BCR contém o idiótipo do BCR. Noutra forma de realização, o idiótipo BCR é conformacionalmente intacto. "Idiótipo" refere-se, noutra forma de realização, à estrutura formada pela região de determinação da complementaridade (cdr) de um BCR. Noutra forma de realização, o termo refere-se à região única de um BCR. Noutra forma de realização, o termo refere-se ao local de ligação ao antigénio do BCR. "Conformacionalmente intacto" refere-se, noutra forma de realização, a uma conformação que não é significativamente alterada em relação à conformação nativa. Noutra forma de realização, o termo refere-se a uma reatividade de anticorpos que não é significativamente alterada em relação à proteína nativa. Noutra forma de realização, o termo refere-se a uma reatividade de anticorpo que se sobrepõe substancialmente com a proteína nativa.

Noutra forma de realização, um péptido utilizado na presente invenção compreende um idiótipo que é homólogo a um idiótipo expresso por células do linfoma. Noutra forma de realização, o péptido compreende um idiótipo que é idêntico a um idiótipo expresso por células do linfoma.

Numa outra forma de realização, uma molécula de nucleótido utilizado na presente invenção codifica um idiótipo que é homólogo a um idiótipo expresso por células do linfoma. Noutra forma de realização, a molécula nucleotidica codifica um idiótipo que é idêntico a um idiótipo expresso por células do linfoma. Noutra forma de realização, o antigénio é altamente homólogo ao antigénio expresso pela célula tumoral. "Altamente homólogo" refere-se, noutra forma de realização, a uma homologia superior a 90%. Noutra forma de realização, o termo refere-se a uma homologia superior a 92%. Noutra forma de realização, o termo refere-se a uma homologia superior a 93%. Noutra forma de realização, o termo refere-se a uma homologia superior a 94%. Numa outra forma de realização, o termo refere-se a uma homologia superior a 95%. Numa outra forma de realização, o termo refere-se a uma homologia superior a 96%. Noutra forma de realização, o termo refere-se a uma homologia superior a 97%. Noutra forma de realização, o termo refere-se a uma homologia superior a 98%. Noutra forma de realização, o termo refere-se a uma homologia superior a 99%. Noutra forma de realização, o termo refere-se a uma homologia de 100%.

Numa outra forma de realização, a doença do linfoma de células B residual ou doença residual minima de linfoma de células B tratados por uma proteína, nucleótidos, vetor de vacina ou estirpe de Listeria da presente invenção é que a resta após a terapia cito redução. Os métodos para a realização da terapia de cito redução são bem conhecidos na técnica e estão descritos, por exemplo, em Winter JN et al (Low-grade lymphoma. Hematology (Am Soc Hematol Educ Program). 2004;:203-20) e Buske C et al (Current status and perspective of antibody therapy in follicular lymphoma. Haematologica. 2006 Jan;91(1):104-12). 0 péptido antigénico heterólogo utilizado na presente invenção é, noutra forma de realização, uma proteína antigénica. Noutra forma de realização, o péptido antigénico é um fragmento de uma proteína antigénica. Noutra forma de realização, o péptido antigénico é um péptido imunogénico derivado de um tumor. Noutra forma de realização, o péptido antigénico é um péptido imunogénico derivado de metástase. Noutra forma de realização, o péptido antigénico é um péptido imunogénico derivado de células cancerosas. Noutra forma de realização, o péptido antigénico é um péptido imunogénico pró-angiogénese.

Numa forma de realização, o polipéptido antigénico é o antigénio do vírus do papiloma humano E7 (HPV-E7), que, numa forma de realização, é a partir de HPV16 (numa forma de realização, N° de Acesso GenBank AAD33253) e noutra forma de realização, a partir de HPV18, N° de Acesso GenBank P06788). Noutra forma de realização, o polipéptido antigénico é HPV-E6, que numa forma de realização, é a partir de HPV16 (numa forma de realização, N° de Acesso GenBank AAD33252, AAM51854, AAM51853 ou AAB67615) e noutra forma de realização, de HPV18 (numa forma de realização, N° de Acesso GenBank P06463) . Noutra forma de realização, o polipéptido antigénico é um anticorpo específico da Próstata (PSA) (numa forma de realização, N° de Acesso GenBank CAD30844, CAD54617, AAA58802 ou NP 001639). Noutra forma de realização, o polipéptido antigénico é um antigénio de enzima quimotrópica de Stratum Corneum (SCCE) (numa forma de realização, N° de Acesso GenBank AAK69652, AAK69624, AAG33360, AAF01139 ou AAC37551) . Noutra forma de realização, o polipéptido antigénico é o antigénio 1 de tumor de Wilms, o qual, noutra forma de realização, é a telomerase WT-1 (N° de Acesso GenBank P49952, P22561, NP_659032, CAC39220.2 ou EAW68222.1). Noutra forma de realização, o polipéptido antigénico é hTERT ou Telomerase (N° de Acesso GenBank NM003219 (variante 1), NM198255 (variante 2), NM 198253 (variante 3) ou NM 198254 (variante 4) . Noutra forma de realização, o antigénio polipéptido é Proteinase 3 (numa forma de realização, N° de Acesso GenBank M29142, M75154, M96839, X55668, NM 00277, M96628 ou X56606). Noutra forma de realização, o polipéptido antigénico é a proteína relacionada à Tirosinase 2 (TRP2) (numa forma de realização, N° de Acesso GenBank NP_001913, ABI73976, AAP33051 ou Q95119) Noutra forma de realização, o polipéptido antigénico é um anticorpo Associado a Melanoma de Alto Peso Molecular (HMW-MAA) (numa forma de realização, N° de Acesso GenBank NP_001888, AAI28111 ou AAQ62842). Uma outra forma de realização, o polipéptido antigénico é Testisina (numa forma de realização, N° de Acesso GenBank AAF79020, AAF79019, AAG02255, AAK29360, AAD41588 ou NP 659206). Noutra forma de realização, o polipéptido antigénico é antigénio NY-ESO-1 (numa forma de realização, N° de Acesso GenBank CAA05908, P78358, AAB49693 ou NP 640343). Noutra forma de realização, o polipéptido antigénico é PSCA (numa forma de realização, N° de Acesso GenBank AAH65183, NP_005663, NP_082492, 043653 ou CAB97347). Noutra forma de realização, o polipéptido antigénico é o recetor alfa de Interleucina (IL) 13 (numa forma de realização, N° de Acesso GenBank NP 000631, NP_0 01551, NP_032382, NP_598751, NP_001003075 ou NP 999506). Noutra forma de realização, o polipéptido antigénico é anidrase carbónica IX (CAIX) (numa forma de realização, N° de Acesso GenBank CAI13455, CAI10985, EAW5835 9, NP_001207, NP_647466 ou NP_001101426) . Noutra forma de realização, o polipéptido antigénico é o antigénio carcinoembrionário (CEA) (numa forma de realização, N° de Acesso GenBank AAA66186, CAA79884, CAA66955, AAA51966, AAD15250 ou AAA51970). Noutra forma de realização, o polipéptido antigénico é MAGE-A (numa forma de realização, N° de Acesso GenBank NP 786885, NP 786884, NP 005352, NP 004979, NP 005358 ou NP 005353) . Noutra forma de realização, o polipéptido antigénico é survivina (numa forma de realização, N° de Acesso GenBank AAC51660, AAY15202, ABF60110, NP 001003019, ou NP 001082350) . Noutra forma de realização, o polipéptido antigénico é GP100 (numa forma de realização, N° de Acesso GenBank AAC60634, YP_655861 ou AAB31176). Noutra forma de realização, o péptido antigénico da presente invenção compreende uma porção imunogénica do polipéptido antigénico.

Noutras formas de realização, o antigénio é derivado de um virus. Noutras formas de realização aqui descritas, o antigénio é um dos seguintes antigénios: os antigénios HPV 16/18 e E6/E7 associados a cancros cervicais, NY-ESO-1 (N° de Acesso GenBank U87459), WT-1 NM000378 (variante A), NM024424 (variante B) , NM 024425 (variante C) e NM024426 (variante D)), sarcoma sinovial X (SSX)-2; (N° de Acesso

GenBank NP_003138, NP_783629, NP_783729, NP_066295) e enzima quimotriptica de estrato córneo (SCCE, N° de Acesso GenBank NM_00504 6 e NM_139277) .

Numa forma de realização, os métodos de avaliação da produção de uma resposta imunitária por um indivíduo a um antigénio são conhecidos na técnica e, numa forma de realização, são descritos a seguir na secção de Exemplos. A proteína LLO utilizada para construir vacinas da presente invenção tem, noutra forma de realização, a sequência:

MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHAD E

IDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIWEKKKKSINQNNADIQ WNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIWKNA TKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYPNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAV NNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVN AENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSF KAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIK NNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYDPEGNEIVQHKNWSENNK SKLAHFTSSIYLPGNARNINVYAKECTGLAWEWWRTVIDDRNLPLVKNRNISIWGTT LYPKYSNKVDNPIE (N° de Acesso GenBank P13128; SEQ ID NO: 37; a sequência de ácido nucleico é apresentada em N° de Acesso GenBank X15127) . Os primeiros 25 AA da proproteina correspondendo a esta sequência são a sequência de sinal e são clivados a partir de LLO quando são segregados pela bactéria. Deste modo, nesta forma de realização, a proteína LLO ativa de comprimento total tem 504 resíduos de comprimento. Noutra forma de realização, a proteína LLO é um homólogo da SEQ ID NO: 37. Noutra forma de realização, a proteína LLO é uma variante da SEQ ID NO: 37.

Noutra forma de realização, a proteína LLO utilizada para construir vacinas de métodos e composições da presente invenção tem a sequência como apresentada em SEQ ID NO: 46 (Exemplo 1 abaixo). Noutra forma de realização, a proteína LLO é uma variante da SEQ ID NO: 46.

Noutra forma de realização, a proteína LLO da invenção utilizada para construir vacinas como aqui proporcionado é uma LLO destoxifiçada (DTLLO). Noutra forma de realização, a LLO é destoxifiçada substituindo a região de ligação ao colesterol por um péptido antigénico ou epítopo do mesmo. Noutra forma de realização, a LLO é destoxifiçada substituindo a região de ligação ao colesterol pelo epítopo E7. Noutra forma de realização, a LLO é destoxifiçada suprimindo a porção de sequência de sinal de LLO. Noutra forma de realização, DTLLO é utilizado em fusões genéticas para direcionar antigénios para aumentar a imunogenicidade do antigénio. Noutra forma de realização, o detoxLLO é fundido com um antigénio. Noutra forma de realização, o DTLLO é fundido com um péptido antigénico como aqui descrito. A região de ligação ao colesterol ou o domínio de ligação ao colesterol é conhecido como LLO ou pode ser deduzido utilizando métodos conhecidos na técnica (revisto em Alouf, Int J Med Microbiol. 2000 Oct; 290 (4-5):351-6), incluindo a mutagénese dirigida ao local seguido por um ensaio de ligação ao colesterol ou conservação da sequência de proteínas com funções semelhantes de ligação ao colesterol.

Na presente invenção, a proteína de LLO é um ctLLO, que é LLO de comprimento completo em que o CBD foi substituído por um péptido de antigénio ou epítopo do mesmo através de uma mutação de substituição.

Também são aqui revelados exemplos em que a proteína LLO é um mutLLO. Um mutLLO é um em que o CBD foi mutado, por exemplo, o mutLLO é um em que os aminoácidos no CBD foram mutados, por exemplo, por uma mutação pontual, uma deleção, uma inversão, uma substituição ou uma combinação dos mesmos. A mutação pode ser qualquer mutação conhecida na técnica e pode compreender qualquer combinação de deleções, substituições ou mutações pontuais no CBD e/ou deleções da sequência de sinal de LLO. Noutra forma de realização, a mutação da CBD reduz a atividade hemolítica de LLO. Noutra forma de realização, o CBD é substituído por epítopos restritos de HLA da classe I conhecidos para serem utilizados como uma vacina. Noutra forma de realização, a LLO mutada é expressa e purificada a partir de sistemas de expressão de E. coli.

Como aqui descrito, "detox LLO" ou "DTLLO" referem-se a um LLO como aqui descrito com mutações pontuais no domínio de ligação ao colesterol.

Tal como aqui descrito, "fragmento LLO" ou "ALLO" refere-se a um fragmento de LLO que compreende o seu domínio semelhante a PEST. Noutra forma de realização, os termos referem-se a um fragmento LLO que compreende uma sequência PEST.

Noutra forma de realização, um péptido, proteína ou polipéptido recombinante da presente invenção compreende ainda um polipéptido marcado detetável. Noutra forma de realização, não está incluído um polipéptido marcador detetável. Em outras formas de realização, o polipéptido marcador é a proteína verde fluorescente (GFP), myc, cinase myc-piruvato (myc-PK), His6, proteína de ligação a maltose (MBP), polipéptido marcador de hemaglutinina dum vírus da gripe, um polipéptido marcador FLAG (FLAG) e um polipéptido marcador de glutationa-S-transferase (GST). No entanto, a invenção não deve de modo algum ser considerada como estando limitada aos ácidos nucleicos que codificam os polipéptidos marcados acima. Noutra forma de realização, a presente invenção utiliza qualquer sequência de ácido nucleico que codifica um polipéptido que funcione de uma forma substancialmente semelhante a estes polipéptidos marcadores.

Noutra forma de realização, o vetor de vacina recombinante da presente invenção é um plasmídeo. Noutra forma de realização, a presente invenção proporciona a introdução de uma molécula nucleotídica da presente invenção numa célula. Os métodos para construir e utilizar vetores recombinantes são bem conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), and i.n Brent et al. (2003, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York). Noutra forma de realização, o vetor é um vetor bacteriano. Em outras formas de realização, o vetor é seleccionado a partir de Salmonella sp., Shigella sp., BCG, L. Monocytogenes e S. Gordon!!. Numa outra forma de realização, as proteínas de fusão são administradas por vetores bacterianos recombinantes modificados para escapar da fusão fagolisossómica e viver no citoplasma da célula. Noutra forma de realização, o vetor é um vector viral. Noutras formas de realização, o vetor é selecionado de Vaccinia, Avipox, Adenovirus, AAV, virus Vaccinia NYVAC, estirpe de vaccinia modificada Ankara (MVA), virus da Floresta Semliki, virus da encefalite equina venezuelana, virus do herpes e retrovirus. Noutra forma de realização, o vetor é urn vector de ADN nu. Noutra forma de realização, o vetor é qualquer outro vetor conhecido na técnica.

Noutra forma de realização, um nucleótido da presente invenção está operacionalmente ligado a uma sequência promotora/reguladora que impulsiona a expressão do péptido codificado em células nas quais o vetor é introduzido. Promotores/sequências reguladoras úteis para comandar a expressão constitutiva de um gene de uma célula procariótica são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, o promotor P60 deLístería, o inla (codifica internalina), o promotor Hly, e o promotor ActA. Noutra forma de realização, é utilizado qualquer outro promotor gram positivo. As sequências promotoras/reguladoras úteis para dirigir a expressão constitutiva de um gene numa célula eucariótica (por exemplo, para uma vacina de ADN) são bem conhecidas na técnica e incluem, mas não estão limitadas a, por exemplo, a sequência estimuladora do promotor precoce imediato do citomegalovirus SV40, e o promotor do virus do sarcoma de Rous. Noutra forma de realização, a expressão específica induzível e específica do tecido nucleico que codifica um péptido da presente invenção é realizada colocando o ácido nucleico codificando o péptido sob o controlo de uma sequência promotora/reguladora específica ou específica de tecido. Exemplos de sequências promotoras/reguladoras específicas de tecido ou induzíveis que são úteis para esta finalidade incluem, mas não estão limitados ao promotor induzível de LTR de MMTV, e ao estimulador/promotor tardio de SV40. Noutra forma de realização, é utilizado um promotor que é induzido em resposta a agentes indutores tais como metais, glucocorticoides e semelhantes. Assim, será apreciado que a invenção inclui a utilização de qualquer sequência promotora/reguladora, que seja conhecida ou desconhecida, e que seja capaz de conduzir a expressão da proteína desejada ligada operativamente a ela.

Noutra forma de realização, um péptido da presente invenção ativa uma APC (por exemplo, uma DC) , mediando pelo menos parte da sua imunogenicidade aumentada. Como aqui divulgado, a LLO inativada não necessita de ser ligada à proteína que contém o idiótipo para aumentar a sua imunogenicidade.

Conforme aqui divulgado, o presente pedido de patente proporciona um método para aumentar a imunogenicidade de um antigénio, compreendendo a fusão de uma proteína LLO ou um seu fragmento com o antigénio. Conforme demonstrado pelos dados aqui revelados, a fusão de uma proteína LLO mutada com um antigénio aumenta a imunogenicidade do antigénio.

Noutra forma de realização divulgada, uma sequência AA tipo PEST está contida numa proteína de fusão LLO. Tal como aqui divulgado, demonstrou-se uma imunidade mediada por células melhorada para proteínas de fusão compreendendo um antigénio e LLO contendo a sequência AA tipo PEST KENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDK (SEQ ID NO: 63) . Noutra forma de realização, a fusão de um antigénio para umza LLO não hemolítica incluindo a sequência AA de tipo PEST, SEQ ID NO: 1, pode aumentar a imunidade mediada por células e antitumoral do antigénio.

Noutra forma de realização, a proteína LLO não hemolítica ou um seu fragmento não necessita ser a que está exposta exatamente nas sequências aqui apresentadas, mas sim que podem ser feitas outras alterações, modificações ou variações que retêm as características funcionais de uma LLO fundida com um antigénio, tal como aqui apresentado. Noutra forma de realização, a presente invenção utiliza um análogo de uma proteina LLO ou um seu fragmento da presente invenção. Os análogos diferem, noutra forma de realização, de proteínas ou péptidos de ocorrência natural por diferenças de seguência de AA conservadoras ou por modificações gue não afetam a sequência, ou por ambas. 0 presente pedido de patente descreve uma composição ou método no qual a expressão de citoquinas é aumentada (ver por exemplo, Exemplo 9). Numa opção, a citoquina é TNF-alfa, enquanto em outra opção, a citoquina é IL-12, enquanto em outra opção, a citoquina é ISG15, enquanto em outra opção, a citoquina é uma citoquina diferente conhecida na técnica. Numa opção, o aumento pode estar na expressão de mARN de citoquinas, enquanto numa outra opção, pode estar na secreção de citoquinas, enquanto numa outra opção, o aumento pode estar tanto na expressão de mARN como na secreção de citoquinas. Numa outra opção, as composições e métodos aqui revelados podem aumentar os marcadores de maturação de células dendríticas, que numa opção são CD86, numa outra opção, CD40 e numa outra opção MHCII, noutra opção, outro marcador de maturação de células dendríticas conhecido na técnica, Ou, noutra opção, uma sua combinação (ver, por exemplo, o Exemplo 10). Numa outra opção, as composições e métodos aqui revelados podem causar translocação nuclear de fatores de transcrição, que numa opção é NF-kappa-B (ver, por exemplo, o Exemplo 11), ou noutra opção, é um fator de transcrição diferente conhecido na técnica. Numa outra opção, as composições e métodos aqui divulgados podem causar a regulação positiva dos marcadores de superfície das células, que numa opção, pode ser CD 11b, que numa opção é integrina-alfa M (ITGAM); agrupamento de molécula de diferenciação 11B; recetor complemento 3A (CR3A); ou macrófago 1 (MAC-1) . Numa outra opção, um marcador de superfície celular diferente, expresso por células imunitárias, pode ser regulado positivamente como seria entendido por um especialista na matéria.

Deve ser entendido que, numa forma de realização, um componente das composições da presente invenção, tal como numa forma de realização, uma sequência LLO, uma sequência de domínio de ligação ao colesterol ou uma sequência de antigénio, tal como, numa forma de realização, uma NY-ESO-1, uma sequência E7, ou uma sequência BCR, pode ter homologia com uma sequência específica aqui descrita. Numa forma de realização, "homologia" refere-se a uma identidade superior a 70%. Noutra forma de realização, "homologia" refere-se a uma identidade superior a 72%. Noutra forma de realização, "homologia" refere-se a uma identidade superior a 75%. Noutra forma de realização, "homologia" refere-se a uma identidade superior a 78%. Noutra forma de realização, "homologia" refere-se a uma identidade superior a 80%. Noutra forma de realização, "homologia" refere-se a uma identidade superior a 82%. Noutra forma de realização, "homologia" refere-se a uma identidade superior a 83%. Noutra forma de realização, "homologia" refere-se a uma identidade superior a 85%. Noutra forma de realização, "homologia" refere-se a uma identidade superior a 87%. Noutra forma de realização, "homologia" refere-se a uma identidade superior a 88%. Noutra forma de realização, "homologia" refere-se a uma identidade superior a 90%. Noutra forma de realização, "homologia" refere-se a uma identidade superior a 92%. Noutra forma de realização, "homologia" refere-se a uma identidade superior a 93%. Noutra forma de realização, "homologia" refere-se a uma identidade superior a 95%. Noutra forma de realização, "homologia" refere-se a uma identidade superior a 96%. Noutra forma de realização, "homologia" refere-se a uma identidade superior a 97%. Noutra forma de realização, "homologia" refere-se a uma identidade superior a 98%. Noutra forma de realização, "homologia" refere-se a uma identidade superior a 99%. Noutra forma de realização, "homologia" refere-se a uma identidade de 100%.

Noutra forma de realização da presente invenção, "ácidos nucleicos" ou "nucleótidos" referem-se a uma cadeia de, pelo menos, duas combinações de base de açúcar-fosfato. O termo inclui, numa forma de realização, ADN e ARN. "Nucleótidos" refere-se, numa forma de realização, às unidades monoméricas de polímeros de ácido nucleico. O ARN é, numa forma de realização, na forma de um ARNt (ARN de transferência) , ARNnc (ARN nuclear pequeno), ARNr (ARN ribossómico), ARNm (ARN mensageiro), ARN antessentido, ARNic pequeno inibitório (siRNA), micro ARN (miARN) e ribozimas. Foi descrito o uso de siARN e miARN (Caudy AA et al, Genes & Devei 16: 2491-96 e referências aqui citadas). Noutras formas de realização, o ADN pode estar na forma de ADN plasmídico, ADN virai, ADN linear ou ADN cromossómico ou derivados destes grupos. Além disso, estas formas de ADN e ARN podem ser simples, duplas, triplas ou quádruplas. O termo também inclui, noutra forma de realização, ácidos nucleicos artificiais que contêm outros tipos de estruturas principais mas as mesmas bases. Numa forma de realização, o ácido nucleico artificial é um PNA (ácido nucleico peptídico). PNA contêm estruturas peptídicas e bases nucleotídicas e são capazes de ligar, numa forma de realização, tanto a moléculas de ADN como de ARN. Noutra forma de realização, o nucleótido é modificado com oxetano. Noutra forma de realização, o nucleótido é modificado por substituição de uma ou mais ligações fosfodiéster com uma ligação fosforotioato. Noutra forma de realização, o ácido nucleico artificial contém qualquer outra variante da estrutura principal de fosfato de ácidos nucleicos nativos conhecidos na técnica. A utilização de ácidos nucleicos fosfotioato e PNA são conhecidos dos especialistas na técnica e são descritos, por exemplo, em Neilsen PE, Curr Opin Struct Biol 9:353-57; e Raz NK et al

Biochem Biophys Res Commun. 297:1075-84. A produção e utilização de ácidos nucleicos é conhecida pelos especialistas na técnica e é descrita, por exemplo, em Molecular Cloning, (2001), Sambrook and Russell, eds. and Methods in Enzymology: Methods for molecular cloning in eukaryotic cells (2003) Purchio and G. C. Fareed. A homologia de proteína e/ou péptido para qualquer sequência de AA aqui listada é determinada, numa forma de realização, por métodos bem descritos na técnica, incluindo análise de imunotransferência, ou por análise de algoritmo de computador de sequências de AA, utilizando qualquer um de um número de pacotes de software disponíveis, através de métodos estabelecidos. Alguns destes pacotes incluem os pacotes FASTA, BLAST, MPsrch ou Scanps e empregam, noutras formas de realização, a utilização dos algoritmos Smith e Waterman e/ou alinhamentos globais/locais ou BLOCKS para análise, por exemplo. "Péptido" refere-se, noutra forma de realização, a uma cadeia de AA ligada a ligações peptídicas. Numa forma de realização, um péptido é uma cadeia curta de AAs. Noutra forma de realização, o termo refere-se a uma molécula de péptido variante, contendo qualquer modificação revelada ou aqui enumerada. Noutra forma de realização, o termo refere-se a uma molécula contendo uma ou mais porções introduzidas por um agente de reticulação químico. Noutra forma de realização, o termo refere-se a uma molécula mimética peptídica. Noutra forma de realização, o termo refere-se a qualquer outro tipo de variante de uma molécula peptídica conhecida na técnica.

Numa forma de realização, o termo "proteína" ou "polipéptido" é uma cadeia de aminoácidos compreendendo múltiplas subunidades peptídicas, incluindo uma proteína de comprimento completo, oligopéptidos e seus fragmentos, em que os resíduos de aminoácidos estão ligados por ligações peptídicas covalentes. Numa forma de realização, uma proteína descrita na presente invenção pode ser alternativamente um polipéptido da presente invenção.

Tal como aqui utilizado na descrição e na secção de exemplos que se segue, o termo "péptido" inclui péptidos nativos (produtos de degradação, peptídeos sinteticamente sintetizados ou peptídeos recombinantes) e peptidomiméticos (tipicamente, péptidos sinteticamente sintetizados), tais como peptóides e semipeptóides que são análogos peptídicos, os quais podem ter, por exemplo, modificações que tornam os péptidos mais estáveis enquanto se encontram num corpo ou mais capazes de penetrarem nas células bacterianas. Estas modificações incluem, mas não estão limitadas a, modificação do terminal N, modificação do terminal C, modificação da ligação peptídica, incluindo, mas não se limitando a, CH2-NH, CH2-S, CH2-S = 0, 0 = C-NH, 0, CH2-CH2, S = C-NH, CH = CH ou CF = CH, modificações da estrutura e modificação de resíduo. Os métodos para preparar compostos peptidomiméticos são bem conhecidos na técnica e são especificados, por exemplo, em Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992). Mais detalhes a este respeito são fornecidos abaixo.

As ligações peptídicas (-C0-NH-) dentro do péptido podem ser substituídas, por exemplo, por ligações N-metiladas (-N (CH3)-C0-), ligações éster (-C(R)HCOOC(R)), ligações cetometileno (-C0-CH2-), ligações oí-aza (-NH-N (R)-C0-) , em que R é qualquer alquilo, por exemplo metilo, carba (-CH2-NH-), hidroxietileno (-CH = CH-), ligações retro-amida (-NH-C0-), derivados peptídicos (-N(CH2)R)-CH2-C0-) , em que R é a cadeia lateral "normal", apresentada naturalmente no átomo de carbono.

Estas modificações podem ocorrer em qualquer das ligações ao longo da cadeia peptidica e mesmo em várias (2-3) ao mesmo tempo.

Os aminoácidos aromáticos naturais, Trp, Tyr e Phe, podem ser substituídos por ácidos sintéticos não naturais tais como TIC, naftilamina (Nol), derivados metilados no anel de Phe, derivados halogenados de Phe ou o-metil-Tyr.

Para além do acima, os péptidos da presente invenção também podem incluir um ou mais aminoácidos modificados ou um ou mais monómeros não aminoácidos (por exemplo, ácidos gordos, hidratos de carbono complexos, etc.).

Tal como aqui utilizado na memória descritiva e na secção de reivindicações abaixo, o termo "aminoácido" ou "aminoácidos" entende-se que inclui os 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente; os aminoácidos frequentemente modificado pós-tradução in vivo, incluindo, por exemplo, hidroxiprolina, fosfosserina e fosfotreonina; e outros aminoácidos incomuns incluindo, mas não se limitando a, ácido 2-aminoadípico, hidroxilisina, isodesmosina, nor-valina, nor-leucina e ornitina. Além disso, o termo "aminoácido" inclui tanto aminoácidos D como L.

Numa forma de realização, um aminoácido nas composições e para utilização na presente invenção pode ser aminoácidos que ocorrem naturalmente ou aminoácidos não convencionais ou modificados, que são conhecidos na técnica.

Noutra forma de realização, o método utilizado para conjugar a proteína LLO não hemolítica ou seu fragmento com o antigénio é aquele descrito no Exemplo 11. Noutra forma de realização, utiliza-se outro método conhecido na técnica. Os métodos para a conjugação química de péptidos entre si são bem conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em (Biragyn, A e Kwak, LW (2001) . Modelos de rato para linfoma em "Current Protocols in Immunology" 20.6.1-20.6.30) and (Collawn, J. F. and Paterson, Y. (1989) Preparation of Antipeptide antibodies. In Current Protocols in Molecular Biology. Supplement 6. Ed. F.M. Ausubel et.al. Greene Publishing/Wiley 11.14.1 - 11.15.3).

Noutra forma de realização, a proteína LLO não hemolitica está ligada ao antigénio ou seu fragmento por conjugação química. Noutra forma de realização, a proteína LLO não hemolitica está ligada ao péptido heterólogo por conjugação química. Noutra forma de realização, o glutaraldeído é utilizado para a conjugação. Noutra forma de realização, a conjugação é realizada utilizando qualquer método adequado conhecido na técnica.

Como aqui divulgado, um péptido de fusão pode ser sintetizado utilizando técnicas de síntese de peptídeo químico padrão. Noutra forma de realização, a molécula quimérica é sintetizada como um único polipéptido contíguo. Noutra forma de realização, a proteína LLO e o BCR ou seu fragmento são sintetizados separadamente, depois fundidos por condensação do terminal amino de uma molécula com o terminal carboxilo da outra molécula, formando assim uma ligação peptídica. Noutra forma de realização, a proteína LLO e o antigénio são condensados cada um com uma extremidade de uma molécula espaçadora peptídica, formando assim uma proteína de fusão contígua.

Noutra forma de realização, as proteínas de fusão da presente invenção são preparadas por qualquer método adequado, incluindo, por exemplo, clonagem e restrição de sequências apropriadas ou síntese química direta por métodos discutidos abaixo. Numa outra forma de realização, as subsequências são clonadas e as subsequências apropriadas clivadas utilizando enzimas de restrição apropriadas. Os fragmentos são então ligados, noutra forma de realização, para produzir a sequência de ADN desejada. Noutra forma de realização, o ADN que codifica a proteína de fusão é produzido utilizando métodos de amplificação de ADN, por exemplo, reação em cadeia da polimerase (PCR). Primeiro, os segmentos do ADN nativo de cada lado do novo terminal são amplificados separadamente. A extremidade 5' da sequência amplificada codifica o ligante peptídico, enquanto a extremidade 3' da outra sequência amplificada também codifica o ligante peptídico. Uma vez que a extremidade 5' do primeiro fragmento é complementar à extremidade 3' do segundo fragmento, os dois fragmentos (após purificação parcial, por exemplo, em LMP agarose) podem ser utilizados como um modelo sobreposto numa terceira reação de PCR. A sequência amplificada conterá codões, o segmento no lado carboxilo do local de abertura (que agora forma a sequência amino), o ligante e a sequência no lado amino do local de abertura (que agora forma a sequência carboxilo). 0 inserto é então ligado a um plasmídeo.

Noutra forma de realização, um péptido, proteína ou polipéptido recombinante da presente invenção é sintetizado utilizando técnicas de síntese de peptídeo químico padrão. Noutra forma de realização, a molécula quimérica é sintetizada como um único polipéptido contíguo. Noutra forma de realização, a proteína LLO não hemolítica ou um seu fragmento e o antigénio são sintetizados separadamente, depois fundidos por condensação do terminal amino de uma molécula com o terminal carboxilo da outra molécula, formando assim uma ligação peptídica. Noutra forma de realização, a proteína LLO e o antigénio são condensados cada um com uma extremidade de uma molécula espaçadora peptídica, formando assim uma proteína de fusão contígua.

Noutra forma de realização, os péptidos e proteínas da presente invenção são preparados por síntese de péptidos em fase sólida (SPPS) como descrito por Stewart et al. em Solid

Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, 1984, Pierce Chemical Company, Rockford, 111.; ou como descrito por Bodanszky e Bodanszky (The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag, New York) . Noutra forma de realização, urn resíduo AA adequadamente protegido está ligado através do seu grupo carboxilo a um suporte polimérico insolúvel derivado, tal como poliestireno reticulado ou resina de poliamida. "Adequadamente protegido" refere-se à presença de grupos protetores tanto no grupo alfa-amino do aminoácido como em quaisquer grupos funcionais de cadeias laterais. Os grupos protetores da cadeia lateral são geralmente estáveis em relação aos solventes, reagentes e condições de reação utilizados ao longo da síntese, e são removíveis sob condições que não irão afetar o produto peptídico final. A síntese passo a passo do oligopéptido é levada a cabo pela remoção do grupo protetor de N do AA inicial e acoplam-se à extremidade carboxilo do AA seguinte na sequência do péptido desejado. Este AA também é adequadamente protegido. 0 carboxilo do AA de entrada pode ser ativado para reagir com o terminal N do AA ligado ao suporte por formação num grupo reativo tal como a formação de uma carbodiimida, um anidrido de ácido simétrico ou um grupo "éster ativo" tal como ésteres de hidroxibenzotriazole ou pentafluorofenilo.

Exemplos de métodos de síntese de péptidos em fase sólida incluem o método BOC que utilizou terc-butiloxicarbonilo como o grupo protetor alfa-amino e o método FMOC que utiliza 9-fluorenilmetiloxicarbonilo para proteger o alfa-amino dos resíduos AA, ambos os métodos são bem conhecidos pelos especialistas na técnica.

Noutra forma de realização, a incorporação de grupos bloqueadores N- e/ou C- é conseguida utilizando protocolos convencionais para métodos de síntese de péptidos em fase sólida. Para a incorporação de grupos bloqueadores do terminal C, por exemplo, a síntese do péptido desejado é tipicamente realizada utilizando, como fase sólida, uma resina de suporte que foi quimicamente modificada de modo que a clivagem da resina resulta num péptido possuindo o grupo de bloqueio do terminal C desejado. Para proporcionar péptidos nos quais o terminal C suporta um grupo bloqueador de amino primário, por exemplo, a síntese é realizada utilizando uma resina de p-metilbenzidrilamina (MBHA) de modo que, quando a síntese de péptidos está completa, o tratamento com ácido fluorídrico liberta o terminal C amidado desejado. De modo semelhante, a incorporação de um grupo de bloqueio de N-metilamina no terminal C é conseguida utilizando a resina de DVB derivatizada com N-metilaminoetilo, que após tratamento com HF liberta um péptido com um terminal C N-metilamidado. 0 bloqueio do terminal C por esterificação também pode ser conseguido utilizando procedimentos convencionais. Isto implica o uso de uma combinação do grupo resina/bloqueador que permite a libertação do péptido de cadeia lateral a partir da resina, para permitir a reação subsequente com o álcool desejado, para formar a função éster. 0 grupo protetor FMOC, em combinação com a resina DVB derivada com álcool metoxialcoxibenzílico ou agente de ligação equivalente, pode ser utilizado para este fim, sendo a clivagem do suporte efectuada por TFA em diclorometano. A esterificação da função carboxilo adequadamente ativada, por exemplo, com DCC, pode prosseguir por adição do álcool desejado, seguido por desproteção e isolamento do produto peptídico esterifiçado. A incorporação de grupos bloqueadores do terminal N- pode ser conseguida enquanto o péptido sintetizado ainda está ligado à resina, por exemplo por tratamento com um anidrido e nitrilo adequados. Para incorporar um grupo bloqueador de acetilo no terminal N, por exemplo, o péptido acoplado a resina pode ser tratado com anidrido acético a 20% em acetonitrilo. 0 produto peptídico bloqueado em N pode então ser clivado da resina, desprotegido e subsequentemente isolado.

Noutra forma de realização, é conduzida a análise da composição peptídica para verificar a identidade do péptido produzido. Noutra forma de realização, é conduzida a análise de composição de AA utilizando espectrometria de massa de alta resolução para determinar o peso molecular do péptido. Em alternativa ou adicionalmente, o teor de AA do péptido é confirmado por hidrólise do péptido em ácido aquoso e separação, identificação e quantificação dos componentes da mistura utilizando HPLC ou um analisador AA. Os sequenciadores de proteínas, que degradam sequencialmente o péptido e identificam o AA por ordem, podem também ser utilizados para determinar definitivamente a sequência do péptido.

Noutra forma de realização, antes da sua utilização, o péptido é purificado para remover contaminantes. Noutra forma de realização, o péptido é purificado de modo a satisfazer os padrões estabelecidos pelas agências e diretrizes reguladoras apropriadas. Qualquer um de um número de procedimentos de purificação convencionais podem ser utilizados para atingir o nível desejado de pureza, incluindo, por exemplo, cromatografia líquida de alta pressão de fase inversa (HPLC) utilizando uma coluna de silica alquilada tal como sílica C4-, Cs- ou Ci8~. É geralmente utilizada uma fase móvel de gradiente de teor orgânico crescente para conseguir a purificação, por exemplo, acetonitrilo num tampão aquoso, habitualmente contendo uma pequena quantidade de ácido trifluoroacético. A cromatografia de permuta iónica pode também ser utilizada para separar péptidos com base na sua carga. É utilizada a síntese em fase sólida na qual o terminal C AA da sequência está ligado a um suporte insolúvel seguido por adição sequencial do AA remanescente na sequência, noutra forma de realização, para a síntese química dos péptidos desta invenção. As técnicas para a síntese em fase sólida são descritas por Barany e Merrifield em Solid-Phase Peptide Synthesis; pp. 3-284 in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A., Merrifield, et al. J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963), e Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chem. Co., Rockford, 111. (1984).

Numa outra forma de realização, as proteínas de fusão da presente invenção são sintetizadas utilizando metodologia de ADN recombinante. Noutra forma de realização, o ADN que codifica a proteína de fusão da presente invenção é preparado por qualquer método adequado, incluindo, por exemplo, clonagem e restrição de sequências apropriadas ou síntese química direta por métodos tais como o método de fosfotriéster de Narang et al. (1979, Meth. Enzymol., 68: 90-99); O método fosfodiéster de Brown et al. (1979, Meth. Enzymol 68:109-151); o método da dietilfosforamidite de Beaucage et al. (1981, Tetra, Lett., 22: 1859-1862); e o método de suporte sólido da Patente US 4458066.

Noutra forma de realização, os péptidos da presente invenção incorporam resíduos de AA que são modificados sem afetar a atividade. Noutra forma de realização, os terminais são derivados para incluir grupos de bloqueio, isto é, substituintes químicos adequados para proteger e/ou estabilizar os terminais N e C de "degradação indesejável", um termo destinado a abranger qualquer tipo de degradação enzimática, química ou bioquímica do composto nos seus terminais que é suscetível de afetar a função do composto, isto é, a degradação sequencial do composto numa sua extremidade terminal.

Numa outra forma de realização, os grupos de bloqueio incluem grupos de proteção convencionalmente utilizados na arte da química de péptidos que não vai afetar de forma adversa as atividades in vivo do péptido. Por exemplo, grupos de bloqueio do terminal N adequados podem ser introduzidos por alquilação ou acilação do terminal N. Exemplos de grupos de bloqueio do terminal N adequados incluem C1-C5 ramificados ou não ramificados, grupos alquilo, grupos acilo, tais como, grupos formilo e acetilo, assim como as formas substituídos dos mesmos, tais como o grupo acetamidometilo (ACM). Os análogos desamino AA são tambémgrupos de bloqueio do terminal N úteis, e podem ser acoplados ao terminal N do péptido ou utilizados no lugar do terminal N. Os grupos bloqueadores do terminal C adequados, nos quais o grupo carboxilo do terminal C está incorporado ou não, incluem ésteres, cetonas ou amidas. Éster ou grupos alquilo de formação de cetona, particularmente, grupos alquilo inferior, tais como, metilo, etilo e propilo, grupos amina formadores de amida, tais como, as aminas primárias (-NH2) , e grupos amino mono- e di-alquilo, tal como amino metil, etilamino, dimetilamino, dietilamino, metiletilamino e semelhantes são exemplos de grupos de bloqueio do terminal C. Os análogos de AA descarboxilados, tais como, a agmatina são também grupos de bloqueio do terminal C úteis e podem ser acoplados ao resíduo do terminal C do péptido ou utilizados em vez dele. Noutra forma de realização, os grupos amino e carboxilo livres nos terminais são removidos completamente do péptido para produzir formas desamino e descarboxiladas destes sem afetar a atividade peptídica.

Noutra forma de realização, são incorporadas outras modificações sem afetar negativamente a atividade. Noutra forma de realização, tais modificações incluem, mas não estão limitadas a, substituição de um ou mais dos AA na forma L-isomérica natural com AA D-isomérica. Noutra forma de realização, o péptido inclui um ou mais resíduos de D-aminoácido, ou compreende AA que estão todos na forma D. As formas retro inversas de péptidos de acordo com a presente invenção estão também contempladas, por exemplo, péptidos invertidos em que todos os aminoácidos são substituídos por formas de D-aminoácidos.

Noutra forma de realização, os péptidos de sais de adição de ácido da presente invenção são utilizados como equivalentes funcionais dos mesmos. Noutra forma de realização, um péptido de acordo com a presente invenção tratado com um ácido inorgânico, tal como, ácido clorídrico, bromídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico e semelhantes, ou um ácido orgânico tal como um ácido acético, propiónico, glicólico, pirúvico, oxálico, málico, malónico, sucínico, maleico, fumárico, tartárico, cítrico, benzoico, cinâmico, mandélico, metanossulfónico, etanossulfónico, p-toluenossulfónico, salicílico e semelhantes, para proporcionar um sal solúvel em água do péptido é adequado para utilização na invenção.

Numa outra forma de realização, as modificações (que normalmente não alteram a sequência primária) incluem a derivação química de polipéptidos in vivo, ou in vitro, por exemplo, acetilação ou carboxilação. Estão também incluídas as modificações da glicosilação, por exemplo, aquelas feitas por modificação dos padrões de glicosilação de um polipéptido durante a sua síntese e processamento ou em etapas de processamento adicionais; por exemplo, expondo o polipéptido a enzimas que afetam a glicosilação, por exemplo, enzimas glicosilantes ou desglicosilantes de mamíferos. Também são incluídas sequências que têm resíduos de AA fosforilados, por exemplo, fosfotirosina, fosfoserina ou fosfotreonina.

Numa outra forma de realização, os polipéptidos são modificados utilizando técnicas de biologia molecular ordinária de modo a melhorar a sua resistência à degradação proteolitica ou a otimizar as propriedades de solubilidade ou torná-los mais adequados como um agente terapêutico. Os análogos desses polipéptidos incluem os que contêm resíduos diferentes dos L-aminoácidos que ocorrem naturalmente, por exemplo, D-aminoácidos ou aminoácidos sintéticos que não ocorrem naturalmente. Os péptidos da invenção não se limitam a produtos de qualquer dos processos exemplificativos específicos aqui listados.

Também é aqui descrito um kit compreendendo uma proteína LLO não hemolítica ou um seu fragmento, como aqui descrito, fundido com um antigénio, um aplicador e material de instruções que descreve a utilização dos métodos aqui descritos. Embora os kits modelo sejam descritos abaixo, o conteúdo de outros kits úteis será evidente para o especialista na técnica à luz da presente divulgação.

Numa outra forma de realização, a estirpe de Listeria da presente invenção é uma estirpe recombinante de Listeria seeligeri. Numa outra forma de realização, a estirpe recombinante de Listeria é uma estirpe de Listeria grayi. Numa outra forma de realização, a estirpe recombinante de Listeria é uma estirpe de Listeria ivanovii. Numa outra forma de realização, a estirpe recombinante de Listeria é uma estirpe de Listeria murrayi. Numa outra forma de realização, a estirpe recombinante de Listeria é uma estirpe de Listeria welshimeri. Numa outra forma de realização, a estirpe de Listeria é uma estirpe recombinante de quaisquer outras espécies de Listeria conhecidas na técnica.

Numa outra forma de realização, uma estirpe recombinante de Listeria da presente invenção foi passada através de um animal hospedeiro. Noutra forma de realização, a passagem maximiza a eficácia da estirpe como um vetor de vacina. Numa outra forma de realização, a passagem estabiliza a imunogenicidade da estirpe de Listeria. Numa outra forma de realização, a passagem estabiliza a virulência da estirpe de Listeria. Numa outra forma de realização, a passagem aumenta a imunogenicidade da estirpe de Listeria. Numa outra forma de realização, a passagem aumenta a virulência da estirpe de Listeria. Numa outra forma de realização, a passagem remove subestirpes instáveis da estirpe de Listeria. Numa outra forma de realização, a passagem reduz a prevalência de subestirpes instáveis da estirpe de Listeria. Numa outra forma de realização, a estirpe de Listeria contém uma inserção genómica do gene que codifica para um péptido recombinante, a proteína ou polipéptido da presente invenção. Numa outra forma de realização, a estirpe de Listeria transporta um plasmídeo compreendendo o gene que codifica para um péptido recombinante, a proteína ou polipéptido da presente invenção. Métodos para a passagem duma estirpe recombinante de Listeria através de um hospedeiro animal são bem conhecidos na técnica, e são descritos, por exemplo, no Pedido de Patente US 2006/0233835. Noutra forma de realização, a passagem é realizada por qualquer outro método conhecido na técnica.

Numa outra forma de realização, a estirpe recombinante de Listeria utilizada na presente invenção foi armazenada num banco de células congeladas. Numa outra forma de realização, a estirpe recombinante de Listeria foi armazenada num banco de células liofilizadas. Os métodos para produzir, cultivar e preservar vetores de vacinas de listeria são bem conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, na Publicação Internacional PCT WO 2007/061848.

Numa forma de realização, as composições e utilizações da presente invenção, tal como aqui descritas, compreendem elementos ou passos particulares, como aqui descrito, enquanto noutra forma de realização, consistem essencialmente nos referidos elementos ou passos, enquanto que noutra forma de realização, consistem nos referidos elementos ou passos. Em algumas formas de realização, o termo "compreender" refere-se à inclusão do agente ativo indicado, bem como à inclusão de outros agentes ativos e veículos, excipientes, emolientes, estabilizadores, etc., farmaceuticamente aceitáveis, como são conhecidos na indústria farmacêutica. Em algumas formas de realização, o termo "consistindo essencialmente em" refere-se a uma composição, cujo único ingrediente ativo é o ingrediente ativo indicado, contudo, podem ser incluídos outros compostos para estabilizar, preservar, etc. a formulação, mas não estão diretamente envolvidos no efeito terapêutico do ingrediente ativo indicado. Em algumas formas de realização, o termo "consistindo essencialmente em" pode referir-se a componentes que facilitam a libertação do ingrediente ativo. Em algumas formas de realização, o termo "consistindo" refere-se a uma composição, que contém o ingrediente ativo e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

Numa forma de realização "tratar" refere-se quer ao tratamento terapêutico, quer a medidas profiláticas ou preventivas, em que o objetivo é prevenir ou diminuir a condição patológica ou distúrbio alvo tal como descrito acima. Assim, numa forma de realização, o tratamento pode incluir a afetação direta ou a cura, a supressão, a inibição, a prevenção, a redução da gravidade, o atraso do início da doença, a redução dos sintomas associados à doença, distúrbio ou estado ou uma combinação destes. Assim, numa forma de realização, "tratamento" refere-se, inter alia, a retardar a progressão, acelerar remir, induzir a remissão, aumentar a remissão, acelerando a recuperação, aumentando a eficácia do ou diminuindo a resistência à terapêutica alternativa, ou uma combinação dos mesmos. Numa forma de realização, "prevenção" refere-se, inter alia, a atrasar o aparecimento dos sintomas, prevenção da recaída de uma doença, reduzir o número ou a frequência de episódios de recorrência, o aumento da latência entre os episódios sintomáticos, ou uma combinação dos mesmos. Numa forma de realização, "supressão" ou "inibição", refere-se, inter alia, a reduzir a gravidade dos sintomas, a redução da gravidade de um episódio agudo, reduzindo o número dos sintomas, reduzindo a incidência de sintomas relacionados com a doença, reduzir a latência dos sintomas, melhorar os sintomas, reduzir sintomas secundários, reduzir infeções secundárias, prolongar a sobrevivência do doente, ou uma combinação dos mesmos

Numa forma de realização, "funcional" dentro do significado da invenção, é aqui utilizado para referir à capacidade inata de uma proteína, péptido, ácido nucleico, fragmento ou uma variante deste para exibir uma atividade ou função biológica. Numa forma de realização, tal função biológica é a sua propriedade de ligação a um parceiro de interação, por exemplo, um recetor associado à membrana, e noutra forma de realização, a sua propriedade de trimerização. No caso de fragmentos funcionais e das variantes funcionais da invenção, estas funções biológicas podem de facto ser alteradas, por exemplo, no que diz respeito à sua especificidade ou seletividade, mas com retenção da função biológica básica.

Numa forma de realização, "fundido geneticamente", tal como aqui proporcionado, pretende dar origem a um ADN quimérico contendo, cada um na sua própria forma de realização discreta, um promotor e uma sequência de codificação que não estão associados na natureza.

Na medida em que os Exemplos seguintes não se referem a uma proteína LLO mutada na qual os aminoácidos 484-492 do CBD foram substituídos por uma proteína antigénica não LLO, conforme reivindicado, são Exemplos comparativos. DETALHES EXPERIMENTAIS MATERIAIS E MÉTODOS EXPERIMENTAIS Linhas celulares 0 tumor TC-1 singeneico C57BL/6 foi imortalizado com E6 e E7 de HPV-16 e transformado com o oncogene c-Ha-ras. TC-1 expressa baixos níveis de E6 e E7 e é altamente tumorigénico. TC-1 cresceu em RPMI 1640, 10% de FCS, 2 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, 100 μΜ de aminoácidos não essenciais, 1 mM de piruvato de sódio, 50 micromolar (mcM) 2-ME, 400 microgramas (meg)/ml de G418, e 10% de maeio da Coleção Nacional de Culturas Tipo 109 a 37°C com 10% de CO2. C3 é uma célula de embrião de ratinho a partir de ratinhos C57BL/6 imortalizados com o genoma completo de HPV 16 e transformados com pEJ-ras. EL-4/E7 é o timoma EL-4 retroviralmente transduzido com E7.

Estirpes L. monocytogenes e propagação

As estirpes de Listeria utilizadas foram LM-LLO-E7 (E7-Hly gene de fusão num sistema de expressão epissómico; Figura 1), LM-E7 (E7 de cópia única da cassete do gene integrado no genoma de Listeria), LM-LLO-NP ("DP- L2028", gene de fusão hly-NP num sistema de expressão episomal), e Lm-Gag ("ZY-18", fita de gene Gag de HIV-1 de cópia única integrada no cromossoma). E7 foi amplificado por PCR utilizando os iniciadores 5'-GGCTCGAGCATGGAGATACACC-3' (SEQ ID NO: 38; o sítio Xhol está sublinhado) e 5'- GGGGACTAGTTTATGGTTTCTGAGAACA-3' (SEQ ID NO: 39; o sítio Spel está sublinhado) e ligado em PCR2.1 (Invitrogen, San Diego, CA) . E7 foi excisado a partir de pCR2.1 por digestão com

Xhol/Spel e ligado a pGG-55. 0 gene de fusão hly-E7 e o fator de transcrição pluripotencial prfA foram clonados em pAM401, um plasmídeo transportador multicópia (Wirth R et al., J. Bacterid, 165: 831, 1986), gerando pGG-55. 0 promotor hly dirige a expressão do primeiro 441 AA do produto do gene hly, (faltando o terminal C hemolítico, referido a seguir como "ALLO" e tendo a sequência apresentada em SEQ ID NO: 17), que é unida pelo sitio Xhol ao gene E7, produzindo um gene de fusão hly-E7 que é transcrito e segregado como LLO-E7. A transformação de uma estirpe negativa prfA de Listeria, XFL-7 (fornecida pelo Dr. Hao Shen, University of Pennsylvania), com PGG-55 selecionado para a manutenção do plasmideo in vivo (Figuras 1A-B) . 0 promotor hly e o fragmento de gene foram gerados utilizando os iniciadores 5'-GGGGGCTAGCCCTCCTTTGATTAGTATATTC-3' (SEQ ID NO: 40, o sitio Nhel está sublinhado) e 5'-CTCCCTCGAGATCATAATTTACTTCATC-3' (SEQ ID NO: 41; 0 gene prfA foi amplificado por PCR utilizando os iniciadores 5'-GACTACAAGGACGATGACCGACAAGTGATA ACCCGGG ATCTAAATAAATCCGTT T-3' (SEQ ID NO: 42; o sitio Xbal está sublinhado) e 5'-CCC GTCGAC CAGCTCTTCTTGGTGAAG-3' (SEQ ID NO: 43; o sitio Sail está sublinhado). Lm-E7 foi gerado pela introdução de uma cassete de expressão contendo o promotor hly e sequência de sinal dirigindo a expressão e secreção de E7 para o domínio orfZ do genoma LM. E7 foi amplificado por PCR utilizando os iniciadores 5'-CG GGATCC CATGGAGATACACCTAC-3' (SEQ ID NO: 44; o sítio BamHI está sublinhado) e 5'-CG TCTAGA TTATGGTTTCTGAG-3' (SEQ ID NO: 45; o sítio Xbal está sublinhado). E7 foi então ligado ao vetor lançador pZY- 21. A estirpe LM 10403S foi transformada com o plasmídeo resultante, pZY-21-E7, que inclui uma cassete de expressão inserida no meio de uma sequência de 1,6 kb que corresponde ao domínio orfX, Y, Z do genoma LM. O domínio de homologia permite a inserção da cassete do gene E7 no domínio orfZ por recombinação homóloga. Os clones foram rastreados para a integração da cassete do gene E7 no domínio orfZ. As bactérias foram cultivadas em meio de infusão de coração-cérebro com (Lm-LL0-E7 e Lm-LLO-NP) ou sem (Lm-E7 e ZY-18) cloranfenicol (20 pg/ml). As bactérias foram congeladas em alíquotas a -80°C. A expressão foi verificada por transferência de Western (Figura 2)

Transferência de Western

As estirpes de Listeria foram cultivadas em meio de Luria-Bertoni a 37°C e foram colhidas com a mesma densidade ótica medida a 600 nm. Os sobrenadantes foram precipitados com TCA e ressuspensos em lx tampão de amostra suplementado com NaOH 0,1 N. Quantidades idênticas de cada pelote de células ou cada sobrenadante precipitado com TCA foram carregadas em géis de SDS-PAGE de Tris-glicina a 4-20% (NOVEX, San Diego, CA) . Os geles foram transferidos para difluoreto de polivinilideno e sondados com um anticorpo monoclonal anti-E7 (mAb) (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA), depois incubados com anticorpo anti-rato conjugado com HRP, Ab (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK), desenvolvido com reagentes de deteção ECL de Amersham e expostos a Hyperfilm (Amersham Pharmacia Biotech).

Medição do crescimento tumoral

Os tumores foram medidos a cada dois dias com compassos abrangendo os diâmetros de superfície mais curtos e mais longos. A média destas duas medições foi traçada como o diâmetro médio do tumor em milímetros contra vários pontos de tempo. Os ratinhos foram sacrificados quando o diâmetro do tumor atingiu 20 mm. As medições de tumor para cada ponto de tempo são mostradas apenas para ratinhos sobreviventes.

Efeitos dos recombinantes de Listeria sobre o crescimento do tumor estabelecido

Ratinhos C57BL/6 de seis a oito semanas de idade (Charles River) receberam 2 x 105 TC-1 sc células no flanco esquerdo. Uma semana após a inoculação do tumor, os tumores tinham atingido um tamanho palpável de 4-5 mm de diâmetro. Grupos de oito ratinhos foram, em seguida, tratados com 0,1 LDso IP LM-LLO-E7 (107 CFU) , Lm- E7 (106 CFU) , LM-LLO-NP (107 CFU), ou LM-gag (5 x 105 CFU) nos dias 7 e 14.

Ensaio de libertação de 51Cr

Ratinhos C57BL/6, ip 6-8 semanas de idade, foram imunizados com 0,1LD5o Lm-LLO-E7, Lm-E7, Lm-LLO-NP, ou Lm-Gag. Dez dias após a imunização, os baços foram colhidos. Os esplenócitos foram estabelecidos em cultura com células TC-1 irradiadas (100:1, esplenócitos:TC-1) como células alimentadoras; estimuladas in vitro durante 5 dias, em seguida, utilizado num padrão de ensaio de libertação de 51Cr, utilizando os seguintes alvos: EL-4, EL-4/E7, ou EL-4 pulsadas com o péptido E7 H-2b (RAHYNIVTF; SEQ ID NO: 19). As proporções de células E:T, realizadas em triplicado, foram de 80:1, 40:1, 20:1, 10:1, 5:1 e 2,5:1. Após uma incubação de 4 h a 37 °C, as células foram sedimentadas e 50 μΐ de sobrenadante foram removidos de cada poço. As amostras foram ensaiadas com um contador de cintilação Wallac 1450 (Gaithersburg, MD) . A percentagem de lise especifica foi determinada como [ (contagens experimentais por minuto contagens espontâneas por minuto)/(contagens totais por minuto - contagens espontâneas por minuto)] x 100.

Proliferação específica TC-1

Ratinhos C57BL/6 foram imunizados com 0,1 LD50 e impulsionados por injeção ip 20 dias mais tarde com um LD50 Lm-LLO-E7, Lm-E7, Lm-LLO-NP, ou Lm-Gag. Seis dias depois do reforço, os baços foram recolhidos a partir de ratinhos imunizados e ingénuos. Os esplenócitos foram estabelecidas em cultura de 5 x 105/poço em placas de 96 poços de fundo plano com 2,5 x 104, 1,25 x 104, 6 x 103, ou 3 x 103 irradiadas com células TC-l/poço como um fonte de E7 de Ag, ou sem células TC-1 ou com 10 pg/ml de Con A. As células foram pulsadas 45 h mais tarde com 0,5 pCi de [3H] timidina/poço. As placas foram colhidas 18 h mais tarde utilizando uma colheita Tomtec 96 (Orange, CT) e a proliferação foi avaliada com um contador de cintilação Wallac 1450. A alteração das contagens por minuto foi calculada como contagens experimentais por minuto - sem contagem de Ag por minuto.

Análise de citometria de fluxo

Ratinhos C57BL/6 foram imunizados por via intravenosa (IV) com 0,1 LD50 Lm-LLO-E7 ou LM-E7 e impulsionados 30 dias mais tarde. A citometria de fluxo em três cores para CD8 (53-6,7 conjugado com PE), ligando CD62 (CD62L, MEL-14 conjugado com APC) e tetrâmero E7H-2Db foi realizada utilizando um citómetro de fluxo FACSCalibur® com o software CellQuest® (Becton Dickinson, Mountain View, CA) . Esplenócitos colhidos 5 dias após o aumento foram corados à temperatura ambiente (rt) com tetrâmeros H-2Db carregados com o péptido E7 (RAHYNIVTF; SEQ ID NO: 19) ou um péptido de controlo (HIV-Gag). Os tetrâmeros foram utilizados numa diluição de 1/200 e foram fornecidos pelo Dr. Larry R. Pease (Clinica Mayo, Rochester, MN) e pelo Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infeciosas Tetramer Core Facility e os Institutos Nacionais de Pesquisas de SIDA de Saúde e Programa de Reagentes de Referência. As células do tetrâmero+ , CD8+ , CD62Lbaixo foram analisadas.

Depleção de componentes imunes específicos Células CD8+, células CD4+ e IFN foram esgotadas em ratinhos TC-1 injetando os ratos com 0,5 mg por rato de mAb: 2,43, GK1.5 ou XMG1.2, respetivamente, nos dias 6, 7, 8, 10, 12 e 14 após o desafio tumoral. As populações de células CD4+ e CD8+ foram reduzidas em 99% (análise por citometria de fluxo). As células CD25+ foram esgotadas por injeção ip de 0,5 mg/ratinho anti-CD25 mAb (PC61, fornecida por Andrew J. Caton) nos dias 4 e 6. TGF foi esgotada por injeção IP do mAb anti-TGF- (2G7, fornecida por Η. 1. Levitsky), em ratos portadores de TC-1 nos dias 6, 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18 e 20. Os ratinhos foram tratados com 107 Lm-LLO-E7 ou Lm- E7 no dia 7 após o desafio do tumor.

Transferência adotiva

Ratinhos doadores C57BL/6 foram imunizados e reforçados 7 dias mais tarde com 0,1 LD50 Lm-E7 ou Lm-Gag. Os esplenócitos dadores foram colhidos e passados sobre colunas de lã de nylon para enriquecerem para células T. As células CD8+ T foram esgotadas in vitro por incubação com 0,1 pg 2,43 anti-CD8 mAb, durante 30 minutos à temperatura ambiente. As células marcadas foram então tratadas com complemento de coelho. Os esplenócitos de dadores eram > 60% de células CD4+ T (análise de citometria de fluxo) . Ratos TC-1 destinatários do tumor foram imunizados com 0,1 LD50 7 dias após o desafio do tumor. Esplenócitos CD4+ enriquecidos de dadores (107) foram transferidos 9 dias após a inoculação do tumor para ratinhos recetores por injeção IV.

Experiência de B16FO-Ova 24 ratinhos C57BL/6 foram inoculados com 5 x 105 células B16FO-OVA. Nos dias 3, 10 e 17, grupos de 8 ratinhos foram imunizados com 0,1 LD50 Lm-OVA (106 ufc), LM-LLO OV-A (108 CFU) e oito animais foram deixados sem tratamento.

Estatísticas

Para as comparações dos diâmetros tumorais, determinou-se a média e a DP do tamanho do tumor para cada grupo e determinou-se a significância estatística através do teste t de Student. P ^ 0,05 foi considerado significativo.

EXEMPLO 1: MUTAGÉNESE DIRIGIDA AO SÍTIO DO DOMÍNIO DE LIGAÇÃO AO COLESTEROL DE LLO A mutagénese dirigida foi realizada em LLO para introduzir mutações pontuais inativadoras no CBD, utilizando a seguinte estratégia. A proteína resultante é denominada "mutLLO":

Subclonagem de LLO em pET29b A sequência de aminoácidos de LLO de tipo selvagem é:

MKKIMLVFITLILVSLPiAQQTEAKDASAFNKENSlSSVAPPASPPASPKTPlEKK

HAOEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIWEKKKKSINQNN

ADiQWNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKiW

KNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYSNVSAKIDYDDEMAYSESQUAKFGTAF

KAVNNSLNVNFGAISEGKMOEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQAL

GVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNÍIK

NSSFKAVIYGGSAKDEVQilDGNLGDLRDíLKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNEL

AVIKNNSEYIETTSKAYTDGKiNIDHSGGYVAQFNISWOEVNYDPEGNEIVQHKNWS

ENNKSKLAHFTSSIYLPGNARNINVYAKECTGLAWElVtVRTVIDDRNLPLVKNRNÍSl WGTTLYFKYSNKYBNBIE (SEQ ID NO: 46). O péptido de sinal e o domínio de ligação ao colesterol (CBD) estão sublinhados, com 3 resíduos críticos no CBD (C484, W491 e W492) em negrito-itálico.

Adicionou-se uma marca 6xHis (HHHHHH) à região C-terminal de LLO. A sequência de aminoácidos da LLO marcada com His é:

MmMLVEttmVSbPMÒOIPAKDASAFNKtNSISSVAPPASPPASPKITlEKKiiADiv) DKY10Gi,DYNK\NVLVYHCi!)AV í NVPPRKCjYKIXíNPYlVVfiRKKKSlNQMNADIOV V^AISSLTYPCiALVKANSELVENOPDVLPVKRDSLTLSlDLPGYÍTNQDNKIVVKNAT KSNVNNAVNTI.VbRWNHKYAOAYSNVSAKiDYDDhMAYSESQLlAKhXiTAFKAVN NSÍ.WNFGAISKGKMQHFVISFKQIYYNVNVNHPTRPSRFFGKAVTKHQI.QAI.GVNA ENPPAYlSSVAYGRQV\'LKLSTNSHS1'K.VKAAFDAAVSGKSVSGOVELTNnKNSSFK AY]YGGSAKDHVQniXiNil.GIJI.ROH.K.KGATFNRhTPGVPÍAY-ITNPÍ.KD\HLAVIKAi NSEYfKTT SKAYTDGKÍNIDÍ ÍSGGYY AQí'NÍSWDíA,’NYDP!,,GNblVQllKN\VSFNNKS KLAHPTSS1YLPGNARNINVYAKΧΙΓΟ]AWF^ΠΙΉ'ΓV1DDRNΙ.ΡΙΛ KNRMSIWG ITL YPKYSNKVDNPÍEHITi 1Η1ΙΓΙ (SEQ ID NO: 47).

Um gene que codifica uma proteína LLO marcada com His foi digerido com Ndel/BamHI, e o Ndel/BamHI foi subclonado no vetor de expressão pET29b, entre os sítios Ndel e BamHI. A sequência do gene que codifica a proteína LLO é: CATATG aaggatgcatctgcattcaataaagaaaattcaatttcatccgtggcaccac cagcatctccgcctgcaagtcctaagacgcca atcgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataagtatatacaaggattggattacaataa aaacaatgtattagtataccacggagatgc agtgacaaatgtgccgccaagaaaaggttacaaagatggaaatgaatatattgttgtgg agaaaaagaagaaatccatcaatcaaaata atgcagacattcaagttgtgaatgcaatttcgagcctaacctatccaggtgctctcgta aaagcgaattcggaattagtagaaaatcaacc agatgttctccctgtaaaacgtgattcattaacactcagcattgatttgccaggtatga ctaatcaagacaataaaatagttgtaaaaaatgc cactaaatcaaacgttaacaacgcagtaaatacattagtggaaagatggaatgaaaaat atgctcaagcttattcaaatgtaagtgcaaaa attgattatgatgacgaaatggcttacagtgaatcacaattaattgcgaaatttggtac agcatttaaagctgtaaataatagcttgaatgtaa acttcggcgcaatcagtgaagggaaaatgcaagaagaagtcattagttttaaacaaatt tactataacgtgaatgttaatgaacctacaag accttccagatttttcggcaaagctgttactaaagagcagttgcaagcgcttggagtga atgcagaaaatcctcctgcatatatctcaagt gtggcgtatggccgtcaagtttatttgaaattatcaactaattcccatagtactaaagt aaaagctgcttttgatgctgccgtaagcggaaaa tctgtctcaggtgatgtagaactaacaaatatcatcaaaaattcttccttcaaagccgt aatttacggaggttccgcaaaagatgaagttca aatcatcgacggcaacctcggagacttacgcgatattttgaaaaaaggcgctactttta atcgagaaacaccaggagttcccattgcttat acaacaaacttcctaaaagacaatgaattagctgttattaaaaacaactcagaatatat tgaaacaacttcaaaagcttatacagatggaaa aattaacatcgatcactctggaggatacgttgctcaattcaacatttcttgggatgaag taaattatgatcctgaaggtaacgaaattgttca acataaaaactggagcgaaaacaataaaagcaa gctagct catttcacatcgtccat ctatttgcctggtaacgcgagaaatattaatgttt acgctaaa GAA TGC actggtttagcttgggaa tggtgg AGA acggtaattgat gaccggaacttaccacttgtgaaaaatagaaatatct catctggggcaccacgctttatccgaaatatagtaataaagtagataatccaatcgaac ac caccaccaccaccac taataa GGATCC (SEQ ID NO: 48). As sequências sublinhadas são, a partir do inicio da sequência, o sitio Ndel, o sitio Nhel, a região codificadora de CBG, a marca 6x His e o sitio BamHI. 0 CBD que reside para ser mutado no próximo passo está em negrito-itálico.

Splicing por Extensão de Sobreposição (SOE) PCR

Passo 1: Reações de PCR # 1 e # 2 foram realizados no modelo de pET29b-LLO. A reação de PCR # 1, utilizando os iniciadores # 1 e # 2, amplificou o fragmento entre o sitio Nhel e o CBD, inclusive, introduzindo uma mutação no CBD. A reação de PCR # 2, utilizando os iniciadores # 3 e # 4, amplificou o fragmento entre o CBD e o sitio BamHI, inclusive, introduzindo a mesma mutação no CBD (Figura IA).

Ciclo de reação de PCR # 1: A) 94°C 2min30sec, B) 94°C 30seg, C) 55°C 30seg, D) 72°C 1 min, Repetir os passos B a D 29 vezes (30 ciclos no total), e) 72°C 10 min.

Ciclo de reação de PCR # 2: A) 94°C 2 min 30 seg, B) 94°C 30 seg, C) 60°C 30 seg, D) 72°C 1 min, Repetir os passos B a D 29 vezes (30 ciclos total) 72°C 10 min.

Passo 2: Os produtos das reações de PCR # 1 e # 2 foram misturados, deixados a recozerem (na região codificadora de CBD mutada) e a PCR foi realizada com os iniciadores # 1 e # 4 durante mais 25 ciclos (Figura 1B). Ciclo de reação PCR: A) 94°C 2min30sec, B) 94°C 30seg, C) 72°C lmin, Repita os passos B a C 9 vezes (10 ciclos no total) , Adicionar iniciadores # 1 e # 4, D) 94°C 30 seg, E) 55°C 30 seg, F) 72°C 1 min, Repetir os passos D a F 24 vezes (25 ciclos no total), G) 72°C 10 min.

Sequências de iniciadores:

Iniciador 1: GCTAGCTCATTTCACATCGT (SEQ ID NO: 49; a sequência Nhel está sublinhada).

Iniciador 2: TCT TGCAGC TTCCCAAGCTAAACCAGT CGC TTC TTTAGCGTAAACATTAATATT (SEQ ID NO: 50; a sequência de codificação CBD está sublinhada; os codões mutantes estão em negrito itálico).

Iniciador 3: GAA GCG ACTGGTTTAGCTTGGGAA GCTGCA AGA ACGGTAATTGATGACCGGAAC (SEQ ID NO: 51; a sequência de codificação CBD está sublinhada; os codões mutantes estão em negrito itálico).

Iniciador 4: GGATCCTTATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCGATTGG (SEQ ID NO: 52; a sequência BamHI está sublinhada). A sequência de tipo selvagem CBD é E C TGLAW WWR (SEQ ID NO: 18) . A sequência mutada CBD é EAT TGLAWE AA R (SEQ ID NO: 53). A sequência do fragmento Nhel-BamHI mutado é:

GCTAGCrCáVnTCACATCÍ-irCCArCTATlTGCCIGGTAACGCGAGAAATAT TA ATGTTT ACGCTA A AG A \GCG ACTGGTTTAOCTTGGG A AGCTGCA AGA ACGGT A ATTGATCACCTjGAACITACCACTTGTGAAAAATAGAAATATCTCCATCTGGGGCA AGGt.TTTAT.(.X.:GAAA'TA.TAG'l AATAAAGTAGATAAia'AATCGAACACCACCA CCACCACf’ACTAATAAGGAJÍX (SFQ Π3 NQ: 5¾.

Exemplo 2: SUBSTITUIÇÃO DE PARTE DA LLO CBD COM UM EPÍTOPO DE CTL A mutagénese dirigida foi realizada em LLO para substituir 9 aminoácidos (AA) do CBD por um epitopo CTL do antigénio NY-ESO-1. A sequência do CBD (SEQ ID NO: 18) foi substituída com a sequência ESLLMWITQC R (SEQ ID NO: 55; resíduos mutados sublinhados), que contém o epitopo HLA-A2 restrito 157-165 de NY-ESO-1, denominado "ctLLO". A estratégia de subclonagem utilizada foi semelhante ao Exemplo anterior. Os iniciadores utilizados foram os seguintes:

Iniciador 1: GCTAGCTCATTTCACATCGT (SEQ ID NO: 56; a sequência Nhel está sublinhada).

Iniciador 2: TCT GCACTGGGTGATCCACATCAGCAGGCT TTC TTTAGCGTAAACATTAATATT (SEQ ID NO: 57; a sequência de codificação CBD está sublinhada; os codões mutados (NY-ESO-1) estão em negrito itálico) .

Iniciador 3: GAA AGCCTGCTGATGTGGATCACCCAGTGC AGA ACGGTAATTGATGACCGGAAC (SEQ ID NO: 58; a sequência de codificação CBD está sublinhada; os codões mutados (NY-ESO-1) estão em negrito itálico) .

Iniciador 4: GGATCCTTATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCGATTGG (SEQ ID NO: 59; a sequência BamHI está sublinhada). A sequência do fragmento Nhel/BamHI resultante é como se segue: gçtagctcatttcacatcotccatctatttgcctogtaacgcgaoaaatattaatg TTTA(:GWAAAG\A,iGCTmCTGATGTGGATCACCCÀGTGX\\a\A<:GGTA.\TTO.\

TOACCGGAACTTACCACTTaTGAAAAATAGA/\ATATCTCC:ATC.rrGGGGCACCACG CTTTATCCGAAATATAGTAATAAAGTAGATAATCCA.VICGAACACCACCACCACÍ' A('( A( TA -V Γ A A G( i A' 1 '< X ‘ (SEQ !!3 NO: 60).

Exemplo 3: MUTLLO E CTLLO SÃO CAPAZES DE SER EXPRESSAS E PURIFICADAS EM SISTEMAS DE EXPRESSÃO E. COLI

Para mostrar que mutLLO e ctLLO poderia ser expressa em E. coli, E. coli foram transformadas com pET29b e induzidas com IPTG 0,5 mM e, em seguida os lisados celulares foram recolhidos 4 horas mais tarde e as proteínas totais foram separadas num gel de SDS-PAGE e sujeitas à coloração de Coomassie (Figura 2A) e anti-LLO Western blot, utilizando o anticorpo monoclonal B3-19 (Figura 2B). Assim, as proteínas LLO contendo mutações pontuais ou substituições no CBD podem ser expressas e purificadas em sistemas de expressão de E. coli.

EXEMPLO 4: MUTLLO E CTLLO EXIBEM REDUÇÃO SIGNIFICATIVA NA

ATIVIDADE HEMOLÍTICA

MATERIAIS E MÉTODOS EXPERIMENTAIS

Ensaio de hemólise 1. 0 LLO de tipo selvagem e mutado foi diluído para as diluições indicadas nas Figuras 3A-B em 900 μΐ de lx PBS-cisteína (PBS ajustado a pH 5,5 com cloridrato de cisteína 0,5 M ou ajustado para 7,4). 2. LLO foi ativado por incubação a 37°C durante 30 minutos. 3. As células vermelhas de ovinos (200 μΐ/amostra) foram lavadas duas vezes em PBS-cisteína e 3 a 5 vezes em lx PBS até o sobrenadante estar relativamente claro. 4. O sedimento final de eritrócitos de ovelha foi ressuspenso em PBS-cisteína e adicionou-se 100 μΐ da suspensão celular aos 900 μΐ da solução LLO (solução final a 10%) . 5. 50 μΐ de glóbulos vermelhos de ovelha foram adicionados a 950 μΐ de água + 10% de Tween 2 0 (controlo positivo para lise, conterão 50% da quantidade de células lisadas à medida que a quantidade total de células é adicionada aos outros tubos; "50% de controlo") 6. Todos os tubos foram misturados suavemente e incubados a 37°C durante 45 minutos. 7. As células vermelhas do sangue foram centrifugadas numa micro centrifugadora durante 10 minutos a 1500 rpm. 8. Transferiu-se uma aliquota de 200 μΐ do sobrenadante para uma placa ELISA de 96 poços e leu-se a 570 nm para medir a concentração de hemoglobina libertada após hemólise e as amostras foram tituladas de acordo com o controlo a 50%.

RESULTADOS A atividade hemolitica de mutLLO e ctLLO foi determinada utilizando um ensaio de glóbulos vermelhos de ovelha. MutLLO exibiu um titulo hemolitico significativamente reduzido (entre 100 vezes e 1000 vezes) a pH 5,5 (Figura 3A) e atividade hemolitica indetetável a pH 7,4 (Figura 3B). CtLLO exibiu atividade hemolitica indetetável a qualquer pH (Figuras 3A-B).

Assim, a mutação pontual (mutLLO) ou de substituição (ctLLO) de resíduos LLO CBD, incluindo C484, W491 e W492, elimina ou reduz severamente a atividade hemolitica. Além disso, a substituição do CBD por um péptido antigénico heterólogo é um meio eficaz de criar um transportador imunogénico de um epítopo heterólogo, com atividade hemolitica significativamente reduzida em relação ao LLO de tipo selvagem. EXEMPLO 5: CONSTRUÇÃO E TESTES DE VACINAS DE BCR DE mutLLO-38C13 E ctLLO-38C13

As vacinas BCR MutLLO-38C13 e ctLLO-38C13 BCR são construídas a partir de ADN codificando mutLLO-, ctLLO- e 38C13 como descrito no Pedido de Patente US 2006-0269561. As vacinas são testadas como descrito no Pedido de Patente US 2006-0269561, e verifica que exibem atividade anti-linfoma protetora. EXEMPLO 6: CONSTRUÇÃO E TESTE DE VACINAS mutLLO-E7 E ctLLO-E7

As vacinas mutLLO-E7 e ctLLO-E7 são construídas a partir de ADN codificando mutLLO, ctLLO e E7 como descrito no Pedido de Patente Us 2006-0269561. As vacinas são testadas como descrito no Pedido de Patente US 2006-0269561, e exibem atividade antitumoral protetora. EXEMPLO 7: IMPACTO DA IMUNIZAÇÃO COM O DETOX LLO-E7 EM COMPARAÇÃO COM OS CONTROLOS NO CRESCIMENTO DE TC-1 Preparação da vacina. Ο E7 recombinante e o Detox LLO compreendendo mutações ou deleções em CBD foram purificados numa coluna de níquel e o LPS foi removido numa coluna Norgen Proteospin de acordo com as instruções do fabricante. E7 foi conjugado quimicamente com LLO misturando 2 mg de Detox LLO com 500 pg de E7 e adicionando paraformaldeído a uma concentração final de 1%. A mistura foi agitada num rotador durante 40 minutos à temperatura ambiente e depois dialisada a 4°C durante a noite em PBS.

Regressão tumoral 1 x 105 TC-1 foram estabelecidos no flanco de cada rato, e nos dias 3 e 10, os ratinhos foram imunizados por via subcutânea ao longo da parte traseira com 250 μΐ de PBS contendo 50 pg de E7, Detox LLO 200 pg misturada com 50 pg de E7, DetoxLLO-E7 conjugado 250 pg ou apenas PBS (ingénuo) . IMPACTO DA IMUNIZAÇÃO COM DETOX LLO CONJUGADO QUIMICAMENTE A E7 E DETOX LLO + E7 NO CRESCIMENTO DE TC-1

Os ratinhos foram imunizados subcutaneamente ao longo da parte de trás com 250 pl de PBS contendo: E7 (50 pg) , DetoxLLO (200 pg) misturado com E7 (50 pg) , conjugado DetoxLLO-E7 (250 pg) ou PBS apenas (ingénuo).

Os ratinhos administrados com conjugados de LLO-E7 demonstraram um aumento atenuado do tamanho do tumor em comparação com os controlos ingénuos. Os ratinhos administrados com LLO + E7 misturados também demonstraram um aumento atenuado no tamanho do tumor (Figura 4) . Embora todos os animais ingénuos tivessem tumores ao dia 7, 2/8 ratinhos eram livres de tumor após a administração de conjugado DetoxLLO-E7 e 4/8 ratinhos eram livres de tumor após a administração de DetoxLLO misturado com E7 no dia 49 (Figura 4, Tabela 1) . IMPACTO DA IMUNIZAÇÃO COM A PROTEÍNA E7 OU LLO NO CRESCIMENTO DE TC-1

Os ratinhos foram imunizados subcutaneamente ao longo da parte de trás com 250 μΐ de PBS contendo: E7 (50 pg), destox LLO (250 pg) ou PBS apenas (ingénuo). A regressão tumoral não foi observada em ratinhos que foram imunizados com detox LLO ou E7 sozinho em cada caso respetivo, 0/8 e l/8ratinhos estavam livres de tumor no dia 45 dos grupos LLO e E7, respetivamente. A imunização com detox LLO, e em maior extensão com E7 atrasou o tempo até ao inicio do tumor (Figura 5). IMPACTO DA IMUNIZAÇÃO COM DTLLO GENETICAMENTE FUNDIDO COM A SEQUÊNCIA E7 INTEIRA E LLO DESTOXIFICADAS ATRAVÉS DA SUBSTITUIÇÃO DA REGIÃO DE LIGAÇÃO DO COLESTEROL COM O EPÍTOPO E7 NO CRESCIMENTO DE TÇ-1

Os ratinhos foram imunizados subcutaneamente ao longo da parte de trás com 250 μΐ de PBS contendo: DTLLO-E7 inteiro recombinante (sequência E7 completa geneticamente fundida a DTLLO, 250 pg), quimera DTLLO-E7 (LLO destoxifiçada por substituição de CBD com epitopo E7; 250 pg) ou PBS apenas (ingénuo). A quimera DTLLO-E7 inteira e a DTLLO-E7 atrasaram o aparecimento de tumores em comparação com os controlos ingénuos (Figura 6) . A quimera DTLLO-E7 demonstrou uma inibição mais forte do crescimento tumoral (8/8 sem tumor ao dia 49 após a inoculação do tumor) em comparação com DTLLO-E7 inteiro (5/8 sem tumor ao dia 49 após a inoculação do tumor, Figura 6 e Tabela 1) . Resultados comparáveis foram obtidos em experiências repetidas (Figuras 7-9) . 2xl0“5 células tumorais TC-1 foram estabelecidas sc em 8 ratinhos por grupo de vacina. Os ratos foram imunizados com 50 pg de E7, 200 μg de DTLLO, 250 μg de DTLLOE7 ou 50 μg de E7 mais 200 μg de DTLLO nos dias 3 e 10 (Figura 9) . Os ratinhos administrados com DTLLO-E7 conjugado demonstraram um aumento atenuado do tamanho do tumor em comparação com os controlos ingénuos. Os ratinhos administrados com DTLLO sozinhos ou DTLLO + E7 misturados também demonstraram um aumento atenuado no tamanho do tumor (Figura 9) . Embora todos os animais ingénuos tivessem tumores ao dia 75, 5/8 ratinhos tratados com DTLLO + E7 e 7/8 ratinhos tratados com DTLLOE7 estavam livres de tumor no dia 75 (Figura 9). EXEMPLO 8: REGRESSÃO DO TUMOR TC-1 APÓS IMUNIZAÇÃO COM ACTA, E7, OU ACTA + E7 OU ACTA-E7 MISTURADA OU FUNDIDA GENETICAMENTE Preparação da vacina. E7 recombinante e ActA recombinante ou ActA-E7 foram purificados numa coluna de níquel e o LPS foi removido numa coluna Norgen Proteospin de acordo com as instruções do fabricante.

Regressão tumoral 1 x 105 TC-1 foram estabelecidos no flanco de cada rato, e nos dias 6 e 13, os ratinhos foram imunizados por via subcutânea ao longo da parte traseira com 250 μΐ de PBS contendo E7 (50 pg), Acta (200 pg) misturado com E7 (50 pg), ActA-E7 fundido geneticamente (250 pg) ou PBS apenas (ingénuo) .

RESULTADOS

Os ratinhos imunizados com ActA sozinho, E7 sozinho, ActA-E7 ou ActA + E7 demonstraram uma latência aumentada para o início dos tumores em comparação com os controlos (Figuras 10-12). Os ratinhos imunizados com ActA-E7 (geneticamente fundidos) demonstraram uma forte regressão tumoral, com ratinhos 7/8 sem tumor no dia 55 após imunização (Figura 10, Tabela 1). Os ratinhos imunizados com ActA + E7 demonstraram regressão tumoral superior em relação aos controlos E7 e não antes, com ratinhos 7/8 sem tumor no dia 55 após a inoculação do tumor (Figura 11, Tabela 1). Os ratinhos imunizados com ActA sozinho demonstraram regressão tumoral superior em comparação com ratinhos imunizados com controlos injetados com E7 ou PBS (3/8 ratinhos sem tumor após imunização comparados com nenhuns dos ratinhos nos grupos E7 ou ingénuos, Figura 12, Tabela 1).

Tabela 1. Resumo das taxas de ratinhos livres de tumor:

Exemplos 7-8

EXEMPLO 9: DETOXLLO INDUZ A EXPRESSÃO DE MARN DE CITOQUINAS E SECREÇÃO DE CITOQUINAS ATRAVÉS DE MACROFAGOS DA MEDULA ÓSSEA (BM)

No dia 5, 7 e 8 as BMDCs foram descongeladas durante a noite a 37°C em meio RF10. Em seguida, as BMDC foram centrifugadas e ressuspensas em 1 mL de RF10 fresco a 3o C durante 1 hora. As BMDCs foram tratadas com LmEg/mL de LL0E7 e equivalentes molares de E7 e LLO (ou com PBS como controlo negativo ou lmcg/mL de LPS como controlo positivo). Após 2 e 24 horas, as células foram recolhidas por centrifugação e o meio foi guardado para ELISA e analisado quanto à secreção de citoquinas. 0 ARN foi extraído das células e convertido em cADN. 0 ADNc foi então sujeito a análise de qPCR com iniciadores para várias citoquinas, e os níveis de expressão de mARN de citoquina foram avaliados.

RESULTADOS 0 DetoxLLO, administrado sozinho com E7, ou fundido com E7, induziu a expressão de ARNm de TNF-α (Figuras 13A-B), IL-12 (Figuras 13C-D) e ISG15 (Figura 13E) por meio de 2M (Figuras 13A E 13C) e 24 horas (Figuras 13B, 13D e 13E) em comparação com os controlos. De modo semelhante, a detoxLLO induziu a secreção de TNF-a (Figura 14A) e IL-12 (Figura 14B) por macrófagos BM após 2 e 24 horas.

EXEMPLO 10: DETOX LLO SOBRE-REGULA OS MARCADORES DE MATURAÇÃO DAS CÉLULAS DENDRÍTICAS A medula óssea foi recolhida a partir dos fémures de ratinhos C57BL/6 às 6-8 semanas de idade. As células de medula óssea de quatro ratinhos foram reunidas e as células foram cultivadas em meio RPMI 1640 contendo 10% de FCS e 100 U/ml de penicilina/estreptomicina em placas de Petri de 100 x 15 mm. Após 2 horas de incubação a 37 °C em 10% de CO2, as células não aderentes foram removidas por lavagem com meio morno. As restantes células aderentes foram recolhidas por raspagem com um raspador de células estéreis. Após lavagem, as células foram ajustadas para 0,5 x 10“6/ml e colocadas numa placa de 24 poços com GM-CSF murino recombinante 20 ng/ml (R & D Systems, Minneapolis, MN) . O meio foi trocado a cada 2-3 dias. Após 7 dias de cultura, as células não aderentes foram recolhidas, lavadas e utilizadas nas experiências.

Estas células dendríticas derivadas da medula óssea (dia 7) foram plaqueadas a 2xl0_6/ml e depois pulsadas com E7 (lOmcg/ ml), LLO (40mcg/ml) ou LLOE7 (50mcg/ml) mais LLO (40mcg/ml) durante 16 h a 37°C, 5% de CO2. O fenótipo dos DCs obtidos utilizando este protocolo foi analisado por análise FACS. As DC foram colhidas após 16 h como descrito acima. As células foram coradas com mAbs marcados com APC específicos para CDllc de ratinho ou mAb marcado com FITC específico para CD86 de ratinho, MHC de classe II, CD40. Utilizou-se IgG de ratinho correspondente ao isótipo como controlo negativo e subtraiu-se do fundo. As células foram incubadas com mAbs durante 30 min a 4°C no escuro. Após duas lavagens com PBS, adicionou-se 10 μΐ de 7AAD (Beckman Coulter, Marseille, França) 10 minutos antes de as células serem analisadas num citómetro de fluxo FACS.

RESULTADOS A medula óssea foi recolhida a partir dos fémures de ratinhos C57BL/6 às 6-8 semanas de idade. Após 7 dias de cultura, recolheram-se células não aderentes, lavaram-se e plaquearam-se a 2xl0_6/ml e depois pulsaram-se com E7 (lOmcg/ ml), LLO (40mcg/ml) ou LLOE7 (50mcg/ml) 40 meg / ml) durante 16 h a 37 °C, 5% de CO2. As células foram coradas com mAbs marcados com APC específicos para CDllc de ratinho ou mAb marcado com FITC específico para CD86 de ratinho, MHC de classe II, CD40. Utilizou-se IgG de ratinho correspondente ao isótipo como controlo negativo e subtraiu-se do fundo. As células foram incubadas com mAbs durante 30 min a 4°C no escuro. Após duas lavagens com PBS, adicionou-se 10 μΐ de 7AAD (Beckman Coulter, Marseille, França) 10 minutos antes das células serem analisadas num citómetro de fluxo FACS. A população de células vivas é apresentada como percentagem de células CDllc positivas. A administração de detoxLLO (nos grupos LLO, LLO + E7 e LLOE7) sobre-regulou (Figuras 15A-C) em comparação com os controlos.

EXEMPLO 11: TRANSLOCAÇÃO NUCLEAR DE NF-KAPPA-B APÓS

ESTIMULAÇÃO COM DT-LLO

Linha de células de macrófagos J774 utilizada como sistema modelo para células apresentadoras de antigénio (APCs). Foram plaqueadas 5 x 10“5 células por poço (placa de 6 poços) num volume total de 1 ml. As células foram coradas com anti-NF-kB (P65)-FITC (fluorescência verde) e DAPI para o núcleo (fluorescência azul). Nas Figuras 17B, D e F, as células foram também coradas após 24 horas com anti-CDUB-PE (Ml/170, eBioscência), que é expressa na superfície celular de células de macrófagos e está envolvida em interações de células adesivas.

RESULTADOS NF-kappaB está localizada no citoplasma após o tratamento de células com meio isolado (sem ativação) (Figura 16A) . As células tratadas com meios demonstram uma coloração com Cdllb fraca (Figura 16B). Após estimulação de uma noite (24 horas) com Dt-LLO (30mcg), NFkappaB saiu do citoplasma para dentro do núcleo (Figura 16C) e houve um aumento na coloração de CDllb (Figura 16D) . De forma semelhante, após estimulação durante a noite (24 h) com LPS (10mcg/ml, controlo positivo), NFkappaB foi translocada para o núcleo (Figura 16E), o que é enfatizado pelo aumento da coloração CDllb + da membrana plasmática.

Assim, numa forma de realização, os dados demonstram a capacidade do detox LLO para estimular a imunidade inata através de macrófagos e DCs.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <· 10-- The Trustees of Uíe Onivefsitysf PeHRsyltfaníà <P0> NDN.HEMGLYTie LLO FU.SIONFROTEINS.AND METHODS OF UT!LIZ!NO SAME. <130=· P~?m-PC4 <140> PCT/usogre&gggs <14T> 2009-06-22 <15G> 12/213,696 < 151 > 2008-06-23 <165= 63; <170* Pateofih version :3.6 :<210> 1 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens <400* 1

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