ES3060419T3 - Tau-binding antibodies - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos que se unen a la proteína Tau y a fragmentos de unión de los mismos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Anticuerpos de unión a Tau

[0003] Campo de la invención

[0004] La presente invención se refiere, entre otros, a anticuerpos de unión a Tau terapéuticos y de diagnóstico y fragmentos de unión de los mismos, métodos para fabricar dichos anticuerpos y los anticuerpos para usar en métodos para tratar y/o diagnosticar tauopatías tales como la enfermedad de Alzheimer; complejo de esclerosis lateral amiotrófica/parkinsonismo-demencia; enfermedad argirofílica granulosa; encefalopatía traumática crónica; degeneración corticobasal; ovillos neurofibrilares difusos con calcificación; síndrome de Down; demencia británica familiar; demencia danesa familiar; demencia frontotemporal y parkinsonismo ligados al cromosoma 17 causados por mutaciones en MAPT; enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker; parkinsonismo guadalupeño; distrofia miotónica; neurodegeneración con acumulación de hierro en el cerebro; enfermedad de Niemann-Pick, tipo C; enfermedad de la motoneurona no guameña con ovillos neurofibrilares; enfermedad de Pick; parkinsonismo postencefalítico; angiopatía amiloide cerebral por proteínas priónicas; gliosis subcortical progresiva; parálisis supranuclear progresiva; retraso mental relacionado con SLC9A6; panencefalitis esclerosante subaguda; demencia con ovillos únicamente; tauopatía de la sustancia blanca con inclusiones gliales globulares (Clavagueraet al.Brain Pathology 23 (2013) 342-349). La presente invención también se refiere a los anticuerpos proporcionados para usar en métodos de tratamiento de un sujeto humano que padece o se sospecha que es propenso a las tauopatías descritas anteriormente, en particular tauopatías tales como la enfermedad de Alzheimer y la parálisis supranuclear progresiva.

[0005] Antecedentes de la invención

[0006] La enfermedad de Alzheimer (EA) y la parálisis supranuclear progresiva (PSP) son enfermedades neurodegenerativas con grandes necesidades médicas no cubiertas, alto coste para los sistemas sanitarios de las sociedades y alta carga para las familias afectadas. Los signos clínicos de la EA incluyen pérdida de memoria, cognición, razonamiento, sentido de la realidad y estabilidad emocional y, en última instancia, muerte. La PSP implica problemas graves y progresivos de control de la marcha y el equilibrio, caídas, alteraciones del movimiento vertical de los ojos, problemas cognitivos, depresión, apatía y demencia leve. Los síntomas tardíos incluyen visión borrosa, movimiento incontrolado de los ojos, habla farfullante, dificultad para tragar y muerte.

[0007] Durante más de una década, los programas de modificación de la EA se han centrado en el péptido beta-amiloide a través de diversos mecanismos. Por el contrario, se ha avanzado mucho menos en el tratamiento de la patología intracelular de Tau, la segunda característica principal de la EA. Las inclusiones u ovillos neurofibrilares que contienen Tau agregada, hiperfosforilada son características definitorias de la patología de la EA y de varias otras tauopatías, incluyendo PSP.

[0008] En estas enfermedades existe una fuerte correlación entre la progresión sintomática y el nivel y la distribución de los agregados intraneurales de Tau. En la EA, los ovillos neuronales de Tau aparecen por primera vez en la corteza transentorrinal, desde donde se propagan al hipocampo y a la neocorteza. Los ovillos observados en las neuronas de la EA consisten en Tau insoluble agregada hiperfosforilada. Se ha propuesto que los efectos tóxicos directos de la especie de Tau patológica y/o pérdida de transporte axónico debido al secuestro de Tau funcional en formas hiperfosforiladas y agregadas, que ya no son capaces de soportar el transporte axonal, contribuyen a la enfermedad. En su estado no patológico, la Tau es una proteína citoplasmática de unión a microtúbulos muy soluble, que se produce en el sistema nervioso central (SNC) humano en 6 isoformas principales debido al corte y empalme alternativo, que varían entre 352 y 441 aminoácidos de longitud. Estas isoformas pueden tener cero, una o dos inserciones aminoterminales (0N, 1N, 2N), y tres o cuatro secuencias "repetidas" carboxiterminales (3R o 4R). Estas secuencias de repetidas carboxiterminales de 30-32 aminoácidos, R1, R2, R3 y R4, juntas constituyen la región de unión a microtúbulos (MTBR) de Tau. De hecho, se cree que la principal función de Tau es el ensamblaje y la estabilización de los microtúbulos axónicos. Los microtúbulos forman vías para el transporte axónico y elementos citoesqueléticos para el crecimiento celular (Clavagueraet al., Brain Pathology 23 (2013) 342-349). Se ha demostrado que tres isoformas de Tau contienen tres regiones de unión a microtúbulos (MTBR):

[0009] - isoforma 4, también denominada 3R0N, secuencia de referencia del NCBI NP_058525.1 (352 aminoácidos), - isoforma 7, también denominada 3R1N, secuencia de referencia del NCBI NP_001190180.1 (381 aminoácidos) - isoforma 8, también denominada 3R2N, secuencia de referencia del NCBI NP_001190181.1 (410 aminoácidos).

[0010] Mientras que las otras tres isoformas de Tau contienen cuatro MTBR:

[0011] - isoforma 2, también denominada 4R2N, secuencia de referencia del NCBI NP_005901.2 (441 aminoácidos), - isoforma 3, también denominada 4R0N, secuencia de referencia del NCBI NP_058518.1 (383 aminoácidos), e - isoforma 5, también denominada 4R1N, secuencia de referencia del NCBI NP_001116539.1 (412 aminoácidos).

[0012] Actualmente solo se dispone de tratamientos sintomáticos para estas enfermedades, con una eficacia leve o nula. Actualmente no se dispone de ningún tratamiento para ralentizar o, en el mejor de los casos, detener el desarrollo de la enfermedad. Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad en la técnica de nuevos compuestos y composiciones útiles en el tratamiento de las tauopatías.

[0013] Se mencionan también los siguientes documentos:

[0014] • WO 2013/096380, que se refiere a anticuerpos anti-FHE y sus usos; y

[0015] • WO 2014/028777, que se refiere a métodos de tratamiento de una tauopatía.

[0016] Objetivos y sumario de la invención

[0017] Es un objetivo de la presente invención, entre otros, proporcionar anticuerpos para usar en métodos de tratamiento o diagnóstico de tauopatías, tales como la enfermedad de Alzheimer (EA) o la parálisis supranuclear progresiva (PSP). Estos y otros objetivos, como se desprenderá de la descripción que sigue a continuación, se alcanzan mediante la materia objeto de las reivindicaciones independientes. Algunos de los aspectos específicos y realizaciones de los mismos contemplados por la presente invención constituyen la materia objeto de las reivindicaciones dependientes. Otros aspectos más y realizaciones de los mismos contemplados en la presente invención pueden extraerse de la descripción a continuación.

[0018] La presente invención proporciona un anticuerpo aislado de unión a Tau o un fragmento de unión del mismo, en donde dicho anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo comprende

[0019] una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 seleccionada de la SEQ ID NO: 1, una CDR2 seleccionada de la SEQ ID NO: 2 y una CDR3 seleccionada de la SEQ ID NO: 3; y

[0020] una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 seleccionada de la SEQ ID NO: 4, una CDR2 seleccionada de la SEQ ID NO: 5 y una CDR3 seleccionada de la SEQ ID NO: 6.

[0021] La presente invención proporciona además una molécula o moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican la cadena ligera y pesada de un anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo de la presente invención, en donde dichas cadenas ligera y pesada están codificadas por la misma molécula de ácido nucleico aislada o por moléculas de ácido nucleico separadas.

[0022] La presente invención también proporciona un vector o vectores de clonación o expresión que comprenden uno o más secuencias de ácido nucleico de la presente invención.

[0023] La presente invención proporciona además un vector o vectores de clonación o expresión que comprenden uno o más secuencias de ácido nucleico de la presente invención.

[0024] La presente invención proporciona además una célula hospedadora que comprende una o más secuencias de ácido nucleico de la presente invención o uno o más vectores de clonación o expresión de la presente invención.

[0025] La presente invención también proporciona un método para producir un anticuerpo de unión a Tau o un fragmento de unión del mismo de la presente invención, que comprende al menos las etapas de

[0026] a) cultivar una célula hospedadora de la presente invención, y

[0027] b) aislar dicho anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo.

[0028] La presente invención también proporciona un anticuerpo de unión a Tau aislado o un fragmento de unión del mismo de la presente invención, para usar como agente terapéuticamente activo.

[0029] La presente invención proporciona además un anticuerpo de unión a Tau aislado o un fragmento de unión del mismo de la presente invención, para su uso en el tratamiento de una tauopatía.

[0030] La presente invención también proporciona un anticuerpo aislado de unión a Tau o fragmento de unión del mismo de la presente invención para usar en un método de diagnósticoin vivo.

[0031] La presente invención proporciona además un anticuerpo de unión a Tau aislado o un fragmento de unión del mismo de la presente invención, para usar en un métodoin vivode diagnóstico de una tauopatía.

[0032] La presente invención también prevé el uso de anticuerpo de unión a Tau aislado o fragmento de unión de la presente invención en el diagnósticoin vitro.

[0033] En una realización, el anticuerpo aislado de unión a Tau o fragmento de unión del mismo proporcionado puede ser un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión del mismo, que puede ser un anticuerpo quimérico, humanizado o totalmente humano o un fragmento de unión del mismo.

[0035] En una realización, el anticuerpo aislado de unión a Tau o fragmento de unión del mismo proporcionado puede ser un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión del mismo, que puede ser un anticuerpo quimérico o un fragmento de unión del mismo.

[0037] En una realización, el anticuerpo aislado de unión a Tau o fragmento de unión del mismo proporcionado puede ser un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión del mismo, que puede ser un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión del mismo.

[0039] En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la presente invención puede ser un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión del mismo, que puede ser un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión del mismo.

[0041] Los anticuerpos y fragmentos de unión del mismo de la presente invención pueden unirse a formas solubles de Tau humana, filamentos helicoidales emparejados (FHE) de Tau humana o tanto a formas solubles de Tau humana como a filamentos helicoidales emparejados (FHE) de Tau humana.

[0043] Leyendas de las figuras

[0045] Figura 1: A) representa el VL donante de AB1 (VL_AB1) de la SEQ ID NO: 7 con las CDR 1 (SEQ ID NO: 1), 2

[0046] (SEQ ID NO: 2) y 3 (SEQ ID NO: 3) subrayadas. B) representa la secuencia de VL de la región aceptora humana IGKV2-29 de la SEQ ID NO: 31 con las CDR aceptoras 1, 2 y 3 subrayadas. C) representa la secuencia injertada con CDR gVL3_AB1 de la SEQ NO: 9 con las CDR 1 (SEQ ID NO: 1), 2 (SEQ ID NO: 2) y 3 (SEQ ID NO: 3) subrayadas.

[0047] Figura 2: A) representa el VH donante de AB1 (VHAB1) de la SEQ ID NO: 8 con las CDR 1 (SEQ ID NO: 4), 2

[0048] (SEQ ID NO: 36) y 3 (SEQ ID NO: 6) subrayadas. B) representa la secuencia de VH de la región aceptora humana IGHV4-59 de la SEQ ID NO: 32 con las CDR aceptoras 1, 2 y 3 subrayadas. C) representa la secuencia con injertos de CDR gVH17_AB1 de la SEQ NO: 12 con las CDR 1 (SEQ ID NO: 4), 2 (SEQ ID NO: 37) y 3 (SEQ ID NO: 6) subrayadas. Los restos donantes se muestran en cursiva y resaltados: M48. Se destacan las mutaciones en el armazón (E1). La CDR2 comprende una sustitución S61A en comparación con VH_AB1. D) representa la secuencia con injertos de CDR gVH18_AB1 de la SEQ NO: 13 con las CDR 1 (SEQ ID NO: 4), 2 (SEQ ID NO: 38) y 3 (SEQ ID NO: 6) subrayadas. Los restos donantes se muestran en cursiva y resaltados (M48). Se destacan las mutaciones en el armazón (E1). La CDR2 comprende una sustitución S61T en comparación con VH AB1.

[0049] Figura 3: Diagrama que ilustra el ensayo de agregación celular del experimento 3.1.

[0050] Figura 4: Eficacia de los anticuerpos de unión a Tau con una cadena ligera de la SEQ ID NO: 14 y una cadena pesada de la SEQ ID NO: 18 (A), y de un anticuerpo de unión a Tau con una cadena ligera de la SEQ ID NO: 14 y una cadena pesada de la SEQ ID NO: 17 (B), o un anticuerpo IgG4 de control negativo A33 (C) en un ensayo de agregación celular de Tau utilizando fibrillas patológicas de Tau humanas recuperadas de pacientes humanos con EA (AD-PHF8) como semillas.

[0051] Figura 5: Transferencia de Western que muestra las propiedades de unión de un anticuerpo de unión a Tau AB1 que tiene el VL de la SEQ ID NO: 7 y el VH de la SEQ ID NO: 8 (A), y anticuerpos humanizados que tienen una cadena ligera de la SEQ ID NO: 14 y la cadena pesada de la SEQ ID 17 (B), de un anticuerpo de unión a Tau con una cadena ligera de la SEQ ID NO: 14 y una cadena pesada de la SEQ ID NO: 18 (C), a Tau recuperada de muestras de la fracción 8 de la EA humana, PSP o pacientes de control. El anticuerpo A33 se usó como control negativo.

[0052] Figura 6: Superposición de termogramas para el anticuerpo de unión a Tau que tiene una cadena ligera de la SEQ ID NO: 14 y una cadena pesada de la SEQ ID 17, de un anticuerpo de unión a Tau que tiene una cadena ligera de la SEQ ID NO: 14 y una cadena pesada de la SEQ ID NO: 18, de un anticuerpo de unión a Tau con una cadena ligera de la SEQ ID NO: 14 y una cadena pesada de la SEQ ID NO: 54, y de un anticuerpo de unión a Tau que tiene una cadena ligera de la SEQ ID NO: 14 y una cadena pesada de la SEQ ID NO: 55.

[0053] Figura 7: Construcción de ADN que codifica la isoforma 2 de Tau humana para su expresión enE. coli(pET 6His TEV-hTau iso 2 (1-441)) (ID BioReg: D0003105) (SEQ ID NO: 39. El inserto BamHI/XhoI que codifica la secuencia de aminoácidos se subclonó en un vector pET32 modificado y cortado con BamHI/XhoI. (Secuencia de codificación 6His-TEV-Tau en negrita y cursiva).

[0054] Figura 8: A) Secuencia de aminoácidos expresada de pET 6His TEV-hTau iso 2 (1-441) (SEQ ID NO: 40); B) secuencia final de aminoácidos expresada de pET 6His TEV-hTau iso 2 (1-441) tras la escisión de TEV (SEQ ID NO: 41).

[0055] Figura 9: Construcción de ADN que codifica la isoforma 3 de Tau humana para su expresión enE. coli(pET 6His TEV-hTau iso 3 (1-383)) (ID BioReg: D0003104) (SEQ ID NO: 42. El inserto BamHI/XhoI que codifica la secuencia de aminoácidos se subclonó en un vector pET32 modificado y cortado con BamHI/XhoI. (Secuencia de codificación 6His-TEV-Tau en negrita y cursiva).

[0056] Figura 10: A) Secuencia de aminoácidos expresada de pET 6His TEV-hTau iso 3 (1-383) (SEQ ID NO: 43); B) secuencia final de aminoácidos expresada de pET 6His TEV-hTau iso 3 (1-383) tras la escisión de TEV (SEQ ID NO: 44).

[0057] Figura 11: Construcción de ADN que codifica la isoforma 4 de Tau humana para su expresión enE. coli(pET 6His TEV-hTau iso 4 (1-352)) (ID BioReg: D0003093) (SEQ ID NO: 45. El inserto BamHI/XhoI que codifica la secuencia de aminoácidos se subclonó en un vector pET32 modificado y cortado con BamHI/XhoI. (Secuencia de codificación 6His-TEV-Tau en negrita y cursiva).

[0058] Figura 12: A) Secuencia de aminoácidos expresada de pET 6His TEV-hTau iso 4 (1-352) (SEQ ID NO: 46); B) secuencia final de aminoácidos expresada de pET 6His TEV-hTau iso 4 (1-352) tras la escisión de TEV (SEQ ID NO: 47).

[0059] Figura 13: Construcción de ADN que codifica la isoforma 5 de Tau humana para su expresión enE. coli(pET 6His TEV-hTau iso 5 (1-412)) (ID BioReg: D0003103) (SEQ ID NO: 48. El inserto BamHI/XhoI que codifica la secuencia de aminoácidos se subclonó en un vector pET32 modificado y cortado con BamHI/XhoI. (Secuencia de codificación 6His-TEV-Tau en negrita y cursiva).

[0060] Figura 14: A) Secuencia de aminoácidos expresada de pET 6His TEV-hTau iso 5 (1-412) (SEQ ID NO: 49); B) secuencia final de aminoácidos expresada de pET 6His TEV-hTau iso 5 (1-412) tras la escisión de TEV (SEQ ID NO: 50).

[0061] Figura 15: Construcción de ADN que codifica la isoforma 2 de Tau humana para su expresión en células HEK293

[0062] (pMH-10His-TEV-hTau iso2 (1-441)) (ID de BioReg: D0003109) (SEQ ID NO: 51. El inserto BamHI/XhoI que codifica la secuencia de aminoácidos se subclonó en el vector de expresión de mamíferos pMH-10HisTEV cortado con BamHI/XhoI. (Secuencia de codificación 10His-TEV-Tau en negrita y cursiva, mutación puntual silenciosa A1032T para eliminar el sitio de restricción subrayado). Figura 16: A) Secuencia de aminoácidos expresada de pMH-10His-TEV-hTau iso2 (1-441) (SEQ ID NO: 52); B) secuencia final de aminoácidos expresada de pMH-10His-TEV-hTau iso2 (1-441) tras la escisión de TEV (SEQ ID NO: 53).

[0063] Figura 17: Eficacia de los anticuerpos de unión a Tau que tienen una cadena ligera de la SEQ ID NO: 14 y una cadena pesada de la SEQ ID NO: 18 en un ensayo de agregación celular de Tau usando fibrillas patológicas de Tau humanas recuperadas de pacientes humanos con EA, o pacientes humanos con PSP o pacientes humanos con DFT como semillas.

[0064] Descripción detallada de la invención

[0065] La presente divulgación, como se describe de forma ilustrativa a continuación, puede practicarse adecuadamente en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones, no divulgados específicamente en el presente documento.

[0066] La presente invención se describirá con respecto a aspectos y realizaciones particulares de la misma y con referencia a determinadas figuras y ejemplos, pero la invención no está limitada a los mismos sino únicamente por las reivindicaciones.

[0067] Las expresiones técnicas se utilizan en su sentido habitual salvo que se indique lo contrario. Si se imparte un significado específico a determinadas expresiones, a continuación se dan las definiciones de las expresiones en el contexto en el que se utilizan.

[0068] Cuando se usa la expresión "que comprende" en la presente descripción y en las reivindicaciones, esta no excluye otros elementos. Para los fines de la presente divulgación, se considera que la expresión "que consiste/n en" es una realización preferida de la expresión "que comprende/n". Si en lo sucesivo en el presente documento se define un grupo que comprende al menos un determinado número de realizaciones, se debe entender que esto también divulga un grupo que consiste, preferentemente, únicamente en estas realizaciones.

[0069] Para los fines de la presente divulgación, el término "obtenido" se considera una realización preferida del término "obtenible". Si en lo sucesivo en el presente documento se define, p. ej., que un anticuerpo puede obtenerse de una fuente específica, también debe entenderse que se divulga un anticuerpo que se obtiene de esta fuente.

[0070] Cuando se utiliza un artículo indefinido o definido al referirse a un sustantivo en singular, p. ej., "un", "uno/una" o "el/la", este incluye un plural de ese sustantivo a menos que se indique específicamente lo contrario. Las expresiones "aproximadamente" y "de forma aproximada" indican un intervalo de precisión que el experto en la materia entenderá que garantiza aún el efecto técnico de la característica en cuestión. La expresión indica normalmente una desviación del valor numérico indicado de ±10 %, y preferentemente de ±5 %.

[0071] Debe entenderse que cualquier referencia a un anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo como realización preferida de los diversos aspectos contempla anticuerpos monoclonales de unión a Tau o fragmentos de unión de los mismos.

[0072] En diversos aspectos, la presente divulgación menciona anticuerpos y fragmentos de unión de los mismos que comprenden CDR y regiones variables de las respectivas regiones de cadena ligera y/o cadena pesada. Los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos que comprenden solo una región variable de cadena ligera o una región variable de cadena pesada pueden ser útiles, p. ej., para métodos de fabricación o, p. ej., para la exploración de regiones variables que puedan asociarse eficazmente con otra región variable correspondiente. Debe entenderse, no obstante, que siempre que se haga referencia a anticuerpos y fragmentos de unión de los mismos que comprendan CDR y regiones variables de las respectivas regiones de cadena ligera y/o cadena pesada, los anticuerpos y fragmentos de unión de los mismos de la presente invención comprenden CDR y regiones variables de las respectivas regiones de cadena ligera y cadena pesada.

[0073] Como se utilizan en el presente documento, los términos "tratamiento", "tratar" y similares, se refieren a obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en lo referente a prevenir completa o parcialmente una enfermedad o un síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en lo referente a una cura parcial o completa para una enfermedad y/o un efecto adverso atribuible a la enfermedad. El tratamiento abarca por tanto cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente en un ser humano, e incluye: (a) evitar que se produzca la enfermedad en un sujeto que pueda tener predisposición a la enfermedad, pero al que aún no se le haya diagnosticado; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; y (c) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad.

[0074] Una referencia a un anticuerpo de unión a Tau o a un fragmento de unión del mismo como "un agente terapéuticamente activo" se refiere a que el anticuerpo de unión a Tau o el fragmento de unión del mismo se proporciona para usar en un método de tratamiento de una enfermedad.

[0075] Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de un anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo que, cuando se administra a un mamífero u otro sujeto para tratar una enfermedad, es suficiente para realizar dicho tratamiento para la enfermedad. La cantidad terapéuticamente eficaz variará en función del anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo, la enfermedad y su gravedad y la edad, el peso, etc., del sujeto que se va a tratar.

[0076] Una referencia a un anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo como "un agente activo para el diagnóstico" se refiere al uso de un anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo en el diagnósticoin vitrode una enfermedad o el anticuerpo o fragmento de unión del mismo para usar en un métodoin vivode diagnóstico de una enfermedad.

[0077] Una "cantidad eficaz para el diagnóstico" se refiere a la cantidad de un anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo que, cuando se utiliza en una prueba diagnóstica sobre una muestra biológica es suficiente para permitir la identificación de una enfermedad o controlar la cantidad de tejido patológico como medio para controlar la eficacia de una intervención terapéutica.

[0078] La presente solicitud se basa en parte en la identificación de un anticuerpo designado AB1 que se une a Tau humana. Como es habitual en el campo, la numeración de los restos de Tau en este texto se refiere a la isoforma 2 de Tau de la SEQ ID NO: 35 (secuencia de referencia del NCBI: NP_005901.2). Como se expondrá en lo sucesivo en el presente documento, AB1, que se aisló de una rata inmunizada y reconoce un epítopo que comprende al menos los restos de aminoácidos de S238, A239, S241, T245, A246 de la SEQ ID NO: 35. Esta región se encuentra justo antes de la primera región de repetición MTBR presente en las 6 isoformas de Tau que pueden encontrarse en el sistema nervioso central.

[0079] Los ejemplos establecen que el AB1 es capaz de unirse tanto a formas solubles de Tau humana como a filamentos helicoidales emparejados (FHE) de Tau humana (véase el ejemplo 2.3) y que el AB1 era capaz de detectar ovillos neurofibrilares intraneuronales (NFT), NFT extraneuronales, estructuras de tipo placas neuríticas e hilos neurófilos en criosecciones de muestras humanas (véase el ejemplo 3.2). En algunos de los ensayos y modelos probados, el AB1 mostró una CI50 inferior a la de los anticuerpos de la técnica anterior. Parece razonable suponer que este comportamiento está mediado al menos en parte por las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la región variable de cadena ligera (VL) y de la región variable de cadena pesada (VH) del AB1.

[0080] En este contexto, la presente invención proporciona anticuerpos de unión a Tau o fragmentos de unión de los mismos que comprenden las CDR o restos determinantes de la especificidad de la región VL de AB1 (SEQ ID NO: 7) y/o las CDR de la región VH del AB1 (SEQ ID NO: 8).

[0081] Los restos en los dominios variables de anticuerpos se numeran convencionalmente según un sistema ideado por Kabatet al.Este sistema se expone en Kabatet al., 1987, en Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, EE. UU. (en lo sucesivo en el presente documento "Kabatet al.(mencionado anteriormente)"). Este sistema de numeración se usa en la presente memoria descriptiva, excepto cuando se indique lo contrario.

[0082] Las designaciones de restos de Kabat no siempre se corresponden directamente con la numeración lineal de los restos de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales que en la numeración de Kabat estricta, lo que corresponde a un acortamiento de, o inserción en, un componente estructural, ya sea una región marco o región determinante de la complementariedad (CDR), de la estructura básica del dominio variable. La numeración de Kabat correcta de los restos puede determinarse para un anticuerpo dado por alineación de restos de homología en la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada por IMGT "patrón". Sin embargo, según Chothia (Chothia, C. y Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)) el bucle equivalente a la CDR-H1 se extiende desde el resto 26 hasta el 32.

[0083] De este modo, se identificó que las CDR1, CDR2 y CDR3 de VL del AB1 correspondían a las SEQ ID NO: 1, 2 y 3, respectivamente. De este modo, se identificó que las CDR1, CDR2 y CDR3 de VH del AB1 correspondían a las SEQ ID NO: 4, 36 y 6, respectivamente. Es habitualmente conocido que pueden realizarse una o más sustituciones, adiciones y/o supresiones de aminoácidos en las CDR proporcionadas por la invención de la presente divulgación sin alterar significativamente la capacidad del anticuerpo para unirse a Tau. El efecto de cualquier sustitución, adición y/o supresión de aminoácidos puede ser analizado fácilmente por un experto en la materia, por ejemplo, usando los métodos descritos en los ejemplos o los del conocimiento general común. En la CDR2 originalmente identificada de VH (CDRH2), en concreto la SEQ ID NO: 36, por ejemplo, se identificó un sitio potencial de desamidación de asparagina y se modificó sustituyendo el resto contiguo de serina por alanina o treonina. Esto condujo a las secuencias SEQ ID NO: 37 y 38 respectivamente para CDRH2. Para mayor brevedad, las tres secuencias para CDRH2, en concreto las SEQ ID NO: 36, 37 y 38 se combinaron como SEQ ID NO: 5.

[0084] En este contexto, la presente invención proporciona, en un aspecto, un anticuerpo aislado de unión a Tau o un fragmento de unión del mismo, en donde dicho anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo comprende una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 seleccionada de la SEQ ID NO: 1, una CDR2 seleccionada de la SEQ ID NO: 2 y una CDR3 seleccionada de la SEQ ID NO: 3; y

[0085] una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 seleccionada de la SEQ ID NO: 4, una CDR2 seleccionada de la SEQ ID NO: 5 y una CDR3 seleccionada de la SEQ ID NO: 6.

[0086] "Identidad", como se utiliza en el presente documento, indica que en cualquier posición concreta de las secuencias alineadas, el resto de aminoácido es idéntico entre las secuencias. Los grados de identidad pueden calcularse fácilmente, p. ej., usando el software BLAST™ disponible en el NCBI (Altschul, S.F.et al., 1990, J. Mol. Biol.215:403-410;Gish, W & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L.et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F.et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. y Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656).

[0087] En este contexto, la divulgación considera específicamente anticuerpos de unión a Tau o fragmentos de unión de los mismos que comprenden un VL con CDRL1, CDRL2 y CDRL3 de las SEQ ID NO: 1, 2, 3 respectivamente y un VH con CDRH1, CDRH2 y CDRH3 de las SEQ ID NO: 4, 5 y 6, respectivamente. La divulgación considera también anticuerpos de unión a Tau o fragmentos de unión de los mismos que comprenden un VL con CDRL1, CDRL2 y CDRL3 de las SEQ ID NO: 1, 2, 3 respectivamente y un VH con CDRH1, CDRH2 y CDRH3 de las SEQ ID NO: 4, 36 y 6, respectivamente, anticuerpos de unión a Tau o fragmentos de unión de los mismos que comprenden un VL con CDRL1, CDRL2 y CDRL3 de las SEQ ID NO: 1, 2, 3 respectivamente y un VH con CDRH1, CDRH2 y CDRH3 de las SEQ ID NO: 4, 37 y 6 respectivamente, y anticuerpos de unión a Tau o fragmentos de unión de los mismos que comprenden un VL con CDRL1, CDRL2 y CDRL3 de las SEQ ID NO: 1, 2, 3 respectivamente y un VH con CDRH1, CDRH2 y CDRH3 de las SEQ ID NO: 4, 38 y 6, respectivamente.

[0088] Los anticuerpos de unión a Tau o fragmentos de unión de los mismos contemplados en dicho primer aspecto pueden comprender estas CDR incrustadas en regiones estructurales de diferente origen. Por lo tanto, las CDR pueden estar comprendidas dentro de las regiones estructurales originales de AB1, en concreto la región VL de rata de la SEQ ID NO: 7 y la región VH de rata de la SEQ ID NO: 8. Sin embargo, las CDR también pueden estar incrustadas en regiones estructurales de origen de especies diferentes, tales como regiones estructurales de ratones o humanas. Según el origen de las regiones estructurales y las regiones constantes, que pueden combinarse con tales regiones estructurales, se pueden obtener anticuerpos quiméricos, humanizados o totalmente humanos de unión a Tau o fragmentos de unión de los mismos.

[0089] Los anticuerpos quiméricos de unión a Tau o fragmentos de unión de los mismos comprenderán las CDR dentro de regiones estructurales de origen no humano junto con regiones constantes de origen humano. Los anticuerpos humanizados de unión a Tau o fragmentos de unión de los mismos comprenderán las CDR dentro de regiones estructurales de origen humano junto con regiones constantes de origen humano.

[0090] En este contexto, en otro aspecto, un anticuerpo de unión a Tau aislado o un fragmento de unión del mismo de la presente invención puede comprender

[0091] una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 7, y/o

[0092] una región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 8.

[0093] En este contexto, la invención considera específicamente anticuerpos de unión a Tau o fragmentos de unión de los mismos que comprenden un VL de la SEQ ID NO: 7 y un VH de la SEQ ID NO: 8.

[0094] Los anticuerpos humanizados de unión a Tau o fragmentos de unión de los mismos están contemplados particularmente en la presente invención.

[0096] Con este objetivo, las CDR pueden injertarse en regiones estructurales humanas. Se apreciará que la identificación de dicho anticuerpo humanizado de unión a Tau con injertos de CDR o fragmento de unión del mismo puede lograrse siguiendo enfoques establecidos de la técnica. Cuando se injertan las CDR o los restos determinantes de la especificidad, se puede utilizar cualquier secuencia estructural de la región variable humana aceptora adecuada teniendo en cuenta la clase/tipo del anticuerpo donante del que proceden las CDR (véase, p. ej., Cabillyet al., pat. de EE. UU. n.º 4816567; Cabillyet al., patente europea n.º 0125023 BI; Bosset al., pat. de EE. UU. n.º 4816397; Bosset al., patente europea n.º 0120694 B1; Neuberger, M. S.et al., documento WO 86/01533; Neuberger, M. S.et al., patente europea n.º 0194276 B1; Winter, Pat. de EE. UU. n.º 5225539; Winter, patente europea n.º 0239400 B1; Padlan, E. A.et al., solicitud de patente europea n.º 0519596 A1).

[0098] Además, en una región variable de anticuerpo con injertos de CDR de la presente invención, no es necesario que las regiones estructurales tengan exactamente la misma secuencia que las del anticuerpo aceptor. Por lo tanto, las CDR pueden injertarse con o sin cambios en el armazón. La introducción de cambios en el armazón en función de una comparación entre las regiones estructurales de las regiones variables donantes y las regiones estructurales aceptoras puede permitir conservar, p. ej., la afinidad de un anticuerpo que, de otro modo, podría reducirse como consecuencia de la humanización. Por ejemplo, los restos inusuales pueden cambiarse por restos más frecuentes para esa clase o tipo de cadena aceptora. Como alternativa, los restos seleccionados en las regiones estructurales aceptoras se pueden cambiar para que correspondan al resto que se encuentra en la misma posición en el anticuerpo donante (véase Reichmannet al., 1998, Nature, 332, 323-324). Estos cambios deben mantenerse al mínimo necesario para recuperar la afinidad del anticuerpo donante. Los restos para cambiar pueden seleccionarse utilizando el protocolo descrito por Adairet al.(1991) (Humanised antibodies. documento WO91/09967). En un anticuerpo con injertos de CDR de la presente invención, no es preciso que las cadenas ligeras y pesadas aceptoras procedan necesariamente del mismo anticuerpo y, si se desea, pueden comprender cadenas compuestas con regiones estructurales procedentes de diferentes cadenas.

[0100] Los ejemplos de armazones aceptores humanos que se pueden utilizar en la presente invención son KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY y POM (Kabatet al., mencionado anteriormente). Por ejemplo, KOL y NEWM pueden utilizarse para la cadena pesada, REI puede utilizarse para la cadena ligera y EU, LAY y POM pueden utilizarse tanto para la cadena pesada como para la cadena ligera. Como alternativa, pueden utilizarse secuencias de la estirpe germinal humana; estas están disponibles en: http://vbase.mrc-ce.cam.ac.uk/ o http://www.imgt.org). La presente divulgación considera específicamente para usar la región V humana IGKV2-29 más la región J de JK2 de la SEQ ID NO: 31 (IMGT, http://www.imgt.org/) como región estructural aceptora para las CDR de la cadena ligera y la región V humana IGHV4-59 más la región J de JH3 SEQ ID NO: 32 (IMGT, http://www.imgt.org/) como región estructural aceptora de las CDR de cadena pesada. En la SEQ ID NO: 32, las posiciones 1 y 48 pueden, p. ej., considerarse para cambios de restos en las regiones estructurales. El resto de glutamina en la posición 1 puede cambiarse por glutamato o aspartato. El resto de isoleucina en la posición 48 puede cambiarse por metionina. Otras posiciones en la SEQ ID NO: 32 para los cambios de restos en las regiones estructurales pueden ser las posiciones 37 y/o 71. Por ejemplo, el resto de isoleucina en la posición 37 de la SEQ ID NO: 32 puede cambiarse por valina. El resto de valina en la posición 71 puede cambiarse por arginina. Las posiciones en la SEQ ID NO: 31 para los cambios de restos en las regiones estructurales pueden ser la posición 68. El resto de serina en la posición 68 de la SEQ ID NO: 31 puede cambiarse por isoleucina.

[0102] En este contexto, la divulgación proporciona en otro aspecto un anticuerpo aislado de unión a Tau o fragmento de unión del mismo, en donde dicho anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo comprende

[0103] una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 9, y/o

[0104] una región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 12 o 13.

[0106] En este contexto, la solicitud considera específicamente anticuerpos de unión a Tau o fragmentos de unión de los mismos que comprenden un VL de la SEQ ID NO: 9 y un VH de la SEQ ID NO: 11, anticuerpos de unión a Tau o fragmentos de unión de los mismos que comprenden un VL de la SEQ ID NO: 9 y un VH de la SEQ ID NO: 12 y anticuerpos de unión a Tau o fragmentos de unión de los mismos que comprenden un VL de la SEQ ID NO: 9 y un VH de la SEQ ID NO: 13.

[0108] Los anticuerpos humanizados de unión a Tau con injertos de CDR o fragmentos de unión de los mismos pueden comprender regiones constantes de origen humano. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos o inmunoglobulinas se dividen en las clases: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas pueden dividirse además en subclases (subtipos), p. ej., IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, IgA1 e IgA2. En particular, se pueden utilizar los dominios de la región constante de IgG humana, especialmente de los isotipos IgG1 e IgG3 cuando la molécula de anticuerpo está destinada a usos terapéuticos y se requieren las funciones efectoras del anticuerpo. Como alternativa, los isotipos IgG2 e IgG4 pueden utilizarse cuando la molécula de anticuerpo está destinada a fines terapéuticos y no se requieren las funciones efectoras del anticuerpo. La presente divulgación considera específicamente los anticuerpos humanizados de los subtipos IgG1 e IgG4.

[0109] Se apreciará que también pueden utilizarse modificaciones de secuencia de estos dominios de región constante. Por ejemplo, también pueden realizarse una o más sustituciones, adiciones y/o supresiones de aminoácidos, tales como de 1 o 2 aminoácidos, en los dominios constantes del anticuerpo sin alterar significativamente la capacidad del anticuerpo para unirse a Tau. También se pueden utilizar las moléculas de IgG4 en las que la serina en la posición 241 se ha cambiado por prolina como se describe en Angalet al., Molecular Immunology, 1993, 30 (I), 105-108. Las funciones efectoras de los anticuerpos incluyen la ADCC y la CDC. ADCC se refiere a la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. Para determinar si un anticuerpo es, en principio, capaz de mediar en la ADDC, la ADCC puede medirsein vitromediante, p. ej., los denominados ensayos de liberación de Cr<51>, Eu y S<35>. Una célula diana que contiene el antígeno de interés, es decir, Tau, puede marcarse con estos compuestos. Tras la unión del anticuerpo terapéutico, las células se lavan y las células efectoras que expresan receptores de Fc tales como FcγRIII se coincuban con las células diana marcadas con anticuerpos y la lisis de las células diana puede monitorizarse mediante la liberación de los marcadores. Otro enfoque utiliza el denominado ensayo aCella TOX™. CDC se refiere a la citotoxicidad celular dependiente del complemento. Para determinar si un anticuerpo es, en principio, capaz de mediar en la CDC, la CDC puede medirsein vitrocomo se describe, p. ej., en Delobel Aet al., Methods Mol Biol. (2013); 988:115-43 o Current Protocols in Immunology, Capítulo 13 Complement (ISSN de impresión: 1934-3671).

[0110] En este contexto, la divulgación proporciona en otro aspecto un anticuerpo aislado de unión a Tau o fragmento de unión del mismo, en donde dicho anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo comprende una cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 14, y/o

[0111] una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 17 o 18.

[0112] En este contexto, la solicitud considera específicamente anticuerpos de unión a Tau o fragmentos de unión de los mismos que comprenden una cadena ligera de la SEQ ID NO: 14 y una cadena pesada de la SEQ ID NO: 16, anticuerpos de unión a Tau o fragmentos de unión de los mismos que comprenden una cadena ligera de la SEQ ID NO: 14 y una cadena pesada de la SEQ ID NO: 17 y anticuerpos de unión a Tau o fragmentos de unión de los mismos que comprenden una cadena ligera de la SEQ ID NO: 14 y una cadena pesada de la SEQ ID NO: 18.

[0113] Asimismo, la divulgación proporciona en otro aspecto un anticuerpo aislado de unión a Tau o fragmento de unión del mismo, en donde dicho anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo comprende

[0114] una cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 14, y/o

[0115] una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 54 o la SEQ ID NO: 55.

[0116] También se ha divulgado una región específica o epítopo de Tau humana al que se une un anticuerpo o fragmento de unión del mismo proporcionado por la presente invención, en particular un anticuerpo o fragmento de unión del mismo que comprende una cualquiera de las CDR-H1 (SEQ ID NO: 4), CDR-H2 (SEQ ID NO: 5), CDR-H3 (SEQ ID NO: 6), CDR-L1 (SEQ ID NO: 1), CDR-L2 (SEQ ID NO: 2) o CDR-L3 (SEQ ID NO: 3), por ejemplo, anticuerpos que comprenden el VL de la SEQ ID NO: 7 y el VL de la SEQ ID NO: 8.

[0117] Además, se ha divulgado una región específica o epítopo de Tau humana, en particular un epítopo dentro de los aminoácidos 235-250 de la SEQ ID NO: 35, al que se une un anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la presente invención, en particular un anticuerpo o fragmento de unión del mismo que comprende el VL de la SEQ ID NO: 7 y el VL de la SEQ ID NO: 8.

[0118] Esta región específica o epítopo de Tau puede identificarse mediante cualquier método adecuado de cartografía de epítopos conocido en la técnica junto con uno cualquiera de los anticuerpos proporcionados por la presente divulgación. Los ejemplos de tales métodos incluyen la exploración de péptidos de longitudes variables derivados de la SEQ ID NO: 35 para unirse a los anticuerpos de unión a Tau o fragmentos de unión de los mismos de la presente divulgación con el fragmento más pequeño que pueda unirse específicamente al anticuerpo que contiene la secuencia del epítopo reconocido por los anticuerpos de unión a Tau o fragmentos de unión de los mismos. Dada la existencia de diferentes isoformas de Tau en el sistema nervioso central, debe entenderse que cualquier isoforma de este tipo puede utilizarse en los métodos detallados en el presente documento. En un ejemplo específico, puede usarse la isoforma más larga de Tau, es decir, la isoforma 2 definida en la SEQ ID NO: 35. Los péptidos Tau de la SEQ ID NO: 35 pueden producirse de forma recombinante, sintética o por digestión proteolítica del polipéptido de Tau. Los péptidos que se unen al anticuerpo pueden identificarse mediante, por ejemplo, transferencia de Western o análisis de espectrometría de masas. En otro ejemplo, la espectroscopia de RMN o la cristalografía de rayos X pueden utilizarse para identificar el epítopo al que se une un anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo. Una vez identificado, puede usarse el fragmento epitópico que se une a un anticuerpo de la presente invención, si es necesario, como inmunógeno para obtener adicionalmente anticuerpos que se unen al mismo epítopo. Asimismo, el fragmento epitópico que se une a un anticuerpo de la presente invención puede usarse para obtener proteínas que se unen al mismo epítopo y, si es necesario, inhiben al menos una actividad biológica de Tau, tales como compuestos proteicos o polipeptídicos que comprenden más de 10 aminoácidos que se basan en estructuras de soporte proteicas, p. ej., de lipocalina ("anticalinas"), fibronectina ("adnectinas", trinectinas), dominios de Kunitz, lectina de tipo C, transferrina, gamma-cristalina, nudos de cisteína, repeticiones de anquirina ("DARPinas") o proteína A, ("affibodies") como es conocido en la técnica (Tomlinson, 2004; Mosaviet al., 2004; Gill y Damle, 2006; Nilsson y Tolmachev, 2007; Binzet al., 2004). Adicionalmente, las moléculas que se unen al mismo epítopo incluyen otras moléculas orgánicas, como péptidos y péptidos cíclicos que no comprenden más de 10 aminoácidos, así como peptidomiméticos. Los peptidomiméticos son compuestos basados en las secuencias de aminoácidos que se encuentran en los sitios de interacción proteína-proteína y son conocidos en la técnica (Sillerud y Larson, 2005).

[0119] En este contexto, también se ha divulgado un anticuerpo aislado de unión a Tau o un fragmento de unión del mismo, en donde dicho anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo se une a un epítopo que comprende al menos los restos de aminoácidos de S238, A239, S241, T245, A246 de la SEQ ID NO: 35. El epítopo general parece extenderse desde los aminoácidos 232 a 251 de la SEQ ID NO: 35. En un ejemplo, el epítopo de Tau humana al que se une un anticuerpo de la presente invención comprende los aminoácidos S238, A239, S241, T245, A246 y uno o más restos seleccionados de S235, S237, K240, R242, L243, Q244, V248 y M250 de la SEQ ID NO: 35.

[0120] También se desvela un anticuerpo de unión a Tau aislado o fragmento de unión del mismo en donde dicho anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo se une a un epítopo que comprende al menos los restos de aminoácidos de S235, S238, A239, K240, S241, Q244, T245 y A246 de la SEQ ID NO: 35. En un ejemplo, el epítopo de Tau humana al que se une un anticuerpo de la presente invención comprende los aminoácidos S235, S238, A239, K240, S241, Q244, T245, A246 y uno o más restos seleccionados de S237, R242, L243, V248 y M250 de la SEQ ID NO: 35.

[0121] También se desvela un anticuerpo de unión a Tau aislado o fragmento de unión del mismo en donde dicho anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo se une a un epítopo que comprende al menos los restos de aminoácidos de S235, S237, S238, A239, K240, S241, Q244, T245 y A246 de la SEQ ID NO: 35. En un ejemplo, el epítopo de Tau humana al que se une un anticuerpo de la presente invención comprende los aminoácidos S235, S237, S238, A239, K240, S241, Q244, T245, A246 y uno o más restos seleccionados de R242, L243, V248 y M250 de la SEQ ID NO: 35.

[0122] En un ejemplo, el epítopo de Tau humana al que se une un anticuerpo de la presente invención comprende los restos de aminoácidos S235, S237, S238, A239, K240, S241, R242, L243, Q244, T245, A246, V248 y M250 de la SEQ ID NO: 35.

[0123] Los anticuerpos de unión a Tau o fragmentos de unión de los mismos que comprenden un VL de la SEQ ID NO: 7 y un VH de la SEQ ID NO: 8 son representantes de anticuerpos de unión a Tau o fragmentos de unión de los mismos que se unen a los epítopos antes mencionados.

[0124] Dichos anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales quiméricos, humanizados o totalmente humanos o pueden usarse para obtener anticuerpos quiméricos, humanizados o monoclonales completamente humanos. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo neutralizante aislado de unión a Tau o fragmento de unión del mismo, en donde dicho anticuerpo neutralizante de unión a Tau o fragmento de unión del mismo se une a un epítopo de Tau que comprende los restos de aminoácidos S238, A239, S241, T245, A246 de la SEQ ID NO: 35. En un ejemplo, el epítopo de Tau humana al que se une un anticuerpo neutralizante de la presente invención comprende los aminoácidos S238, A239, S241, T245, A246 y uno o más restos seleccionados de S235, S237, K240, R242, L243, Q244, V248 y M250 de la SEQ ID NO: 35.

[0125] También se desvela un anticuerpo neutralizante de unión a Tau aislado o fragmento de unión del mismo en donde dicho anticuerpo neutralizante de unión a Tau o fragmento de unión del mismo se une a un epítopo que comprende al menos los restos de aminoácidos de S235, S238, A239, K240, S241, Q244, T245 y A246 de la SEQ ID NO: 35. En un ejemplo, el epítopo de Tau humana al que se une un anticuerpo neutralizante de la presente invención comprende los aminoácidos S235, S238, A239, K240, S241, Q244, T245 y A246 y uno o más restos seleccionados de S237, R242, L243, V248 y M250 de la SEQ ID NO: 35.

[0126] También se desvela un anticuerpo neutralizante de unión a Tau aislado o fragmento de unión del mismo en donde dicho anticuerpo neutralizante de unión a Tau o fragmento de unión del mismo se une a un epítopo que comprende al menos los restos de aminoácidos de S235, S237, S238, A239, K240, S241, Q244, T245 y A246 de la SEQ ID NO: 35. En un ejemplo, el epítopo de Tau humana al que se une un anticuerpo neutralizante de la presente invención comprende los aminoácidos S235, S237, S238, A239, K240, S241, Q244, T245, A246 y uno o más restos seleccionados de R242, L243, V248 y M250 de la SEQ ID NO: 35.

[0127] En un ejemplo, el epítopo de Tau humana al que se une un anticuerpo neutralizante de la presente invención comprende los restos de aminoácidos S235, S237, S238, A239, K240, S241, R242, L243, Q244, T245, A246, V248 y M250 de la SEQ ID NO: 35.

[0128] Los anticuerpos de unión a Tau o fragmentos de unión de los mismos que comprenden un VL de la SEQ ID NO: 7 y un VH de la SEQ ID NO: 8 son representantes de anticuerpos neutralizantes de unión a Tau o fragmentos de unión de los mismos que se unen a los epítopos antes mencionados.

[0129] Dichos anticuerpos neutralizantes pueden ser anticuerpos monoclonales quiméricos, humanizados o totalmente humanos o pueden usarse para obtener anticuerpos quiméricos, humanizados o monoclonales completamente humanos.

[0130] También se ha desvelado un anticuerpo aislado de unión a Tau o fragmento de unión del mismo, en donde dicho anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo se une sustancialmente al mismo epítopo de Tau que un anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo descrito anteriormente. La unión al epítopo puede determinarse como se describe para la cartografía de epítopos utilizando, p. ej., un anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo que comprende un VL de la SEQ ID NO: 7 y un VH de la SEQ ID NO: 8 como referencia. Dichos anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales quiméricos, humanizados o totalmente humanos o pueden usarse para obtener anticuerpos quiméricos, humanizados o monoclonales completamente humanos.

[0131] También se ha desvelado un anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo que se une específicamente a una región o epítopo de Tau humana, en particular un epítopo dentro de los aminoácidos 235-250 de la SEQ ID NO: 35, determinado por resonancia magnética nuclear de coherencia cuántica única heteronuclear (RMN HSQC). Dichos anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales quiméricos, humanizados o totalmente humanos o pueden usarse para obtener anticuerpos quiméricos, humanizados o monoclonales completamente humanos.

[0132] También se ha desvelado un anticuerpo aislado de unión a Tau o fragmento de unión del mismo, en donde dicho anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo compite por la unión a Tau con un anticuerpo de unión a Tau descrito anteriormente.

[0133] También se ha desvelado un anticuerpo aislado de unión a Tau o fragmento de unión del mismo, en donde dicho anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo compite por la unión a Tau con un anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo que comprende un VL de la SEQ ID NO: 7 y un VH de la SEQ ID NO: 8.

[0134] Dichos anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales quiméricos, humanizados o totalmente humanos o pueden usarse para obtener anticuerpos quiméricos, humanizados o monoclonales completamente humanos.

[0135] La competencia por la unión a Tau puede determinarse por una reducción en la unión del anticuerpo o fragmento de unión del mismo a Tau de al menos aproximadamente el 50 %, o al menos aproximadamente el 70 %, o al menos aproximadamente el 80 %, o al menos aproximadamente el 90 %, o al menos aproximadamente el 95 %, o al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % en presencia del anticuerpo de referencia o fragmento de unión del mismo que puede comprender un VL de la SEQ ID NO: 7 y un VH de la SEQ ID NO: 8. La unión puede medirse mediante resonancia de plasmones superficiales utilizando el equipo BIAcore®, diversas tecnologías de detección de fluorescencia (p. ej., espectroscopia de correlación de fluorescencia, correlación cruzada de fluorescencia, mediciones de fluorescencia en tiempo de vida, etc.) o diversos tipos de radioinmunoensayos u otros ensayos utilizados para seguir la unión de anticuerpos a una molécula diana.

[0136] La expresión "anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo" significa que el anticuerpo o los fragmentos de unión del mismo se unen específicamente a Tau por medio de sus regiones variables, es decir, se une al antígeno Tau con mayor afinidad que otros antígenos que no son homólogos de Tau. El "anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo" se une a Tau por medio de sus regiones variables con una afinidad al menos dos veces, al menos cinco veces, al menos 10, 20, 100, 10<3>, 10<4>, 10<5>o al menos 10<6>veces mayor que la de otros antígenos que no son homólogos de Tau. Se entenderá que los anticuerpos de unión a Tau y fragmentos de unión de los mismos pueden, no obstante, interaccionar también con otras proteínas (por ejemplo, la proteína A deS. aureusu otros anticuerpos en técnicas de ELISA) mediante interacciones con secuencias fuera de la región variable de los anticuerpos de unión a Tau y fragmentos de unión de los mismos. Estas últimas propiedades de unión que están mediadas por secuencias fuera de las regiones variables de los anticuerpos de unión a Tau y fragmentos de unión de los mismos y, en particular, por las regiones constantes de los anticuerpos de unión a Tau y fragmentos de unión de los mismos no están comprendidas en la expresión "anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo". Los ensayos de exploración para determinar la especificidad de unión de un anticuerpo son bien conocidos y se practican habitualmente en la técnica. Los anticuerpos de unión a Tau o fragmentos de unión de los mismos pueden tener una constante de disociación en equilibrio (Kd) para la afinidad de la unión del anticuerpo (o del fragmento de unión del mismo) a su antígeno en el intervalo nanomolar. Por lo tanto, la K<D>puede ser inferior a aproximadamente 1*10<-6>, p. ej., aproximadamente inferior a 5*10<-7>, tal como aproximadamente 2*10<-7>o menos y puede medirse utilizando, p. ej., resonancia de plasmones superficiales y el dispositivo BIAcore como se describe en los ejemplos.

[0137] Como se ha mencionado anteriormente, la presente invención proporciona anticuerpos de unión a Tau o fragmentos de unión de los mismos. Un anticuerpo de longitud completa incluye un dominio constante y una región variable. No es necesario que la región constante esté presente en toda su longitud en un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo. Debe entenderse, no obstante, que siempre que la solicitud considere el uso de anticuerpos mediadores de ADCC y/o CDC, un fragmento de unión debe comprender una región constante de longitud suficiente para seguir siendo capaz de mediar en la ADCC y/o la CDC.

[0139] Como se ha mencionado anteriormente, la presente divulgación también se refiere a anticuerpos humanos de unión a Tau o fragmentos de unión de los mismos, que pueden generarse como alternativa a la humanización. Por ejemplo, es posible producir animales transgénicos (p. ej., ratones) que son capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de anticuerpos murinos endógenos. Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homocigota del gen de la región de unión de la cadena pesada del anticuerpo (JH) en ratones quiméricos y mutantes en estirpe germinal da lugar a la inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. Transferir el conjunto de genes de inmunoglobulinas de la estirpe germinal humana a dichos ratones mutantes en estirpe germinal dará lugar a la producción de anticuerpos humanos con especificidad frente a un antígeno particular tras la inmunización del animal transgénico portador de los genes de inmunoglobulinas de la estirpe germinal humana con dicho antígeno. En la técnica se conoce tecnología para producir tales animales transgénicos y para aislar y producir los anticuerpos humanos de tales animales transgénicos (Lonberg, 2005; Green, 1999; Kellermann y Green, 2002; Nicholsonet al., 1999). Como alternativa, en el animal transgénico; p. ej., ratón, solo se sustituyen los genes de inmunoglobulina que codifican las regiones variables del anticuerpo de ratón por las correspondientes secuencias génicas variables de inmunoglobulina humana. Los genes de inmunoglobulina de la estirpe germinal del ratón que codifican las regiones constantes de los anticuerpos permanecen inalterados. De este modo, las funciones efectoras de los anticuerpos en el sistema inmunitario del ratón transgénico y, por consiguiente, el desarrollo de linfocitos B se mantienen prácticamente inalterados, lo que puede conducir a una mejora de la respuesta de los anticuerpos a la provocación antigénicain vivo. Una vez que los genes que codifican un anticuerpo particular de interés se han aislado de tales animales transgénicos, los genes que codifican las regiones constantes pueden sustituirse por genes de regiones constantes humanas para obtener un anticuerpo totalmente humano. Otros métodos para obtener fragmentos de anticuerpos humanosin vitrose basan en tecnologías de presentación, tales como la tecnología de presentación en fagos o la tecnología de presentación en ribosomas, en donde se usan bibliotecas de ADN recombinante generadas al menos en parte artificialmente o a partir de repertorios de genes de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donantes. Las tecnologías de presentación en fagos y ribosomas para generar anticuerpos humanos son bien conocidas en la técnica (Winteret al., 1994; Hoogenboom, 2002; Kretzschmar y von Ruden, 2002; Groves y Osbourn, 2005; Dufneret al., 2006).

[0141] También pueden generarse anticuerpos humanos a partir de linfocitos B humanos aislados que se inmunizanex vivocon un antígeno de interés y posteriormente se fusionan para generar hibridomas que luego pueden examinarse en busca del anticuerpo humano óptimo (Grassoet al., 2004; Liet al., 2006).

[0143] La expresión "anticuerpo de unión a Tau" o fragmento de unión del mismo como se utiliza en el presente documento se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión del mismo que se une e inhibe al menos una actividad biológica de Tau. Las actividades biológicas de Tau son conocidas en la técnica e incluyen, pero sin limitación, la agregación de moléculas de Tau formando diferentes tipos de agregados tales como ovillos o fibrillas descritos anteriormente. En una realización particular, un "anticuerpo neutralizante de unión a Tau" o fragmento de unión del mismo como se utiliza en el presente documento se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión del mismo que se une e inhibe la agregación de Tau en un ensayoin vitro, tal como, por ejemplo, en un ensayoin vitrotal como se describe en el experimento 3.1 más adelante.

[0145] El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere en general a anticuerpos intactos (enteros, de longitud completa), es decir, que comprenden los elementos de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. El anticuerpo puede comprender además dominios de unión adicionales, por ejemplo, como la molécula DVD-Ig como se divulga en el documento WO 2007/024715, o la denominada (FabFv)2Fc descrita en el documento WO2011/030107. Por lo tanto, el anticuerpo, como se emplea en el presente documento, incluye anticuerpos bi, tri o tetravalentes de longitud completa.

[0147] Los fragmentos de unión de anticuerpos incluyen anticuerpos monocatenarios (es decir, una cadena pesada y una cadena ligera de longitud completa); Fab, Fab modificado, Fab', Fab' modificado, F(ab')<2>, Fv, Fab-Fv, Fab-dsFv, FabscFv, Fab-scFc, Fab-scFv estabilizado por disulfuro, anticuerpos de dominio único (p. ej., VH o VL o VHH), scFv, scFvscFc, dsscFv, dsscFv-scFc, anticuerpos bi, tri o tetravalentes, Bis-scFv, diacuerpos, tricuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, anticuerpos de dominio (dAb), tales como sdAb, fragmentos de VHH y VNAR y fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores (véase, por ejemplo, Holliger y Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9): 1126-1136; Adair y Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217). Los métodos para crear y fabricar estos fragmentos de anticuerpo son bien conocidos en la materia (véase, por ejemplo, Vermaet al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181). El formato Fab-Fv se divulgó por primera vez en el documento W02009/040562 y las versiones estabilizadas con disulfuro del mismo, el Fab-dsFv, se divulgó por primera vez en el documento W02010/035012. Una forma de Fab-scFv estabilizada con disulfuro se describió en el documento WO2013/068571. Los formatos de anticuerpos que comprenden formatos scFc se describieron por primera vez en el documento WO2008/012543. Otros fragmentos de anticuerpo para su uso en la presente invención incluyen los fragmentos Fab y Fab' descritos en las solicitudes de patente internacional WO2005/003169, WO2005/003170 y WO2005/003171.

[0149] Los anticuerpos multivalentes pueden comprender múltiples especificidades, p. ej. biespecíficos, o pueden ser monoespecíficos (véanse, por ejemplo, los documentos WO92/22583 y WO05/113605). Un ejemplo de esto último es un Tri-Fab (o TFM) como se describe en el documento WO92/22583.

[0150] En una realización, el fragmento aislado de unión del anticuerpo de unión a Tau de la presente invención es un fragmento Fab.

[0151] En una realización, el fragmento aislado de unión del anticuerpo de unión a Tau de la presente invención es un fragmento Fab’.

[0152] Una molécula Fab' clásica comprende un par de cadenas pesada y ligera en la que la cadena pesada comprende una región variable VH, un dominio constante CH1 y una región bisagra natural o modificada y la cadena ligera comprende una región variable VL y un dominio constante CL.

[0153] En una realización se proporciona un dímero de un Fab' de acuerdo con la presente invención para crear un F(ab')<2>, por ejemplo, la dimerización puede ser a través de la bisagra.

[0154] Se apreciará que la afinidad de los anticuerpos de unión a Tau o fragmentos de unión de los mismos proporcionados por la presente divulgación puede alterarse utilizando métodos adecuados conocidos en la técnica. La presente invención también se refiere a variantes de las moléculas de anticuerpo de la presente invención, que tienen una mejor afinidad por Tau, siempre que sigan siendo un anticuerpo aislado de unión a Tau o un fragmento de unión del mismo que comprenda

[0155] una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 seleccionada de la SEQ ID NO: 1, una CDR2 seleccionada de la SEQ ID NO: 2 y una CDR3 seleccionada de la SEQ ID NO: 3; y

[0156] una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 seleccionada de la SEQ ID NO: 4, una CDR2 seleccionada de la SEQ ID NO: 5 y una CDR3 seleccionada de la SEQ ID NO: 6.

[0157] Dichas variantes se pueden obtener mediante varios protocolos de maduración de la afinidad que incluyen la mutación de las CDR (Yanget al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), reordenamiento de cadenas (Markset al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), uso de cepas mutantes deE. coli(Lowet al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), reordenamiento de ADN (Pattenet al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), presentación en fagos (Thompsonet al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) y PCR sexual (Crameriet al., Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughanet al.(mencionado anteriormente) analiza estos métodos de maduración de la afinidad.

[0158] De este modo, los anticuerpos de unión a Tau y fragmentos de unión de los mismos también pueden abarcar cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras o pesadas, p. ej., mencionadas específicamente anteriormente, con una o más sustituciones conservadoras (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 sustituciones conservadoras) siempre que sigan siendo un anticuerpo aislado de unión a Tau o un fragmento de unión del mismo, en donde dicho anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo comprende

[0159] una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 seleccionada de la SEQ ID NO: 1, una CDR2 seleccionada de la SEQ ID NO: 2 y una CDR3 seleccionada de la SEQ ID NO: 3; y

[0160] una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 seleccionada de la SEQ ID NO: 4, una CDR2 seleccionada de la SEQ ID NO: 5 y una CDR3 seleccionada de la SEQ ID NO: 6.

[0161] Se pueden determinar las posiciones de una secuencia de aminoácidos que son candidatas a sustituciones conservadoras, y se pueden seleccionar aminoácidos sintéticos y naturales que efectúen sustituciones conservadoras para cualquier aminoácido en particular. Las consideraciones para seleccionar sustituciones conservadoras incluyen el contexto en el que se realiza cualquier sustitución de aminoácidos en particular, la hidrofobia o polaridad de la cadena lateral, el tamaño general de la cadena lateral y el valor pK de las cadenas laterales con carácter ácido o básico en condiciones fisiológicas. Por ejemplo, la lisina, la arginina y la histidina suelen sustituirse convenientemente entre sí. Como es conocido en la técnica, esto se debe a que los tres aminoácidos tienen cadenas laterales básicas, mientras que los valores pK de las cadenas laterales de la lisina y la arginina están mucho más cerca entre sí (aproximadamente 10 y 12) que el de la histidina (aproximadamente 6). De manera similar, la glicina, la alanina, la valina, la leucina y la isoleucina suelen sustituirse convenientemente entre sí, con la salvedad de que la glicina no suele sustituir adecuadamente a los demás miembros del grupo. Otros grupos de aminoácidos frecuentemente sustituidos de forma adecuada incluyen, pero sin limitación, el grupo que consiste en los ácidos glutámico y aspártico; el grupo que consiste en fenilalanina, tirosina y triptófano; y el grupo que consiste en serina, treonina y, opcionalmente, tirosina.

[0162] Los anticuerpos de unión a Tau y fragmentos de unión de los mismos, como se mencionan en el contexto de la presente invención, pueden abarcar derivados de los anticuerpos ilustrativos, fragmentos y secuencias divulgados en el presente documento. Los "derivados" incluyen anticuerpos de unión a Tau y fragmentos de unión de los mismos, que se han modificado químicamente. Algunos ejemplos de modificación química incluyen la unión covalente de uno o más polímeros, tales como polímeros hidrosolubles, hidratos de carbono con enlaces N o enlaces O, azúcares, fosfatos y/u otras moléculas tales como marcadores detectables, tales como fluoróforos.

[0163] Si se desea, un anticuerpo de unión a Tau o un fragmento de unión del mismo para usar en la presente invención puede conjugarse con una o más moléculas efectoras. Se apreciará que la molécula efectora puede comprender una única molécula efectora o dos o más moléculas de este tipo unidas de tal manera que formen un único resto que pueda unirse a los anticuerpos de la presente invención. Cuando se desea obtener un fragmento de anticuerpo unido a una molécula efectora, este puede prepararse mediante procedimientos químicos convencionales o de ADN recombinante en los que el fragmento de anticuerpo se une directamente o mediante un agente de acoplamiento a la molécula efectora. Las técnicas para conjugar tales moléculas efectoras con anticuerpos son bien conocidas en la técnica (véase, Hellstromet al., Controlled Drug Delivery, 2.ª Ed., Robinsonet al., eds., 1987, págs. 623-53; Thorpeet al., 1982, Immunol. Rev., 62:119-58 y Dubowchiket al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123). Estas técnicas de conjugación de moléculas efectoras pueden incluir conjugación específica de sitio o conjugación inespecífica de sitio o aleatoria. Los procedimientos químicos en particular incluyen, por ejemplo, los descritos en los documentos WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 y WO 03/031581. Como alternativa, cuando la molécula efectora es una proteína o un polipéptido, el enlace puede realizarse mediante procedimientos de ADN recombinante, por ejemplo, como se describe en los documentos WO 86/01533 y EP0392745. Como alternativa, en el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención puede introducirse por genomodificación un sitio de unión particular para la molécula efectora, por ejemplo, como se describe en el documento WO 2008/038024. Asimismo, puede utilizarse un agente de acoplamiento para unir la molécula efectora al anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención, por ejemplo, como se describe en el documento WO 2005/113605. El experto entenderá que las posibilidades mencionadas pueden usarse solas o combinadas.

[0165] La expresión molécula efectora como se utiliza en el presente documento incluye, por ejemplo, fármacos, toxinas, proteínas biológicamente activas, por ejemplo, enzimas, otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, polímeros sintéticos o naturales, ácidos nucleicos y fragmentos de los mismos, p. ej. ADN, ARN y fragmentos de los mismos, radionúclidos, en particular radioyoduro, radioisótopos, metales quelados, nanopartículas y grupos indicadores, tales como compuestos fluorescentes o compuestos que pueden detectarse mediante espectroscopia de RMN o RPE. La molécula efectora como se utiliza en el presente documento también incluye agentes terapéuticos tales como agentes quimioterápicos, polipéptidos terapéuticos, nanopartículas, liposomas o ácidos nucleicos terapéuticos.

[0167] Otras moléculas efectoras pueden incluir radionúclidos quelados, tales como<111>In y<90>Y, Lu<177>, bismuto<213>, californio<252>, iridio<192>y wolframio<188>/renio<188>; o fármacos, tales como, pero sin limitación, alquilfosfolcolinas, inhibidores de la topoisomerasa I, taxoides y suramina.

[0169] Otras moléculas efectoras incluyen proteínas, péptidos y enzimas. Entre las enzimas de interés se incluyen, pero sin limitación, enzimas proteolíticas, hidrolasas, liasas, isomerasas, transferasas. Las proteínas, polipéptidos y péptidos de interés incluyen, pero sin limitación, inmunoglobulinas, toxinas, tales como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas o toxina diftérica, una proteína, tal como insulina, factor de necrosis tumoral, interferón α, interferón β, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas o activador de plasminógeno tisular, un agente trombótico o un agente antiangiogénico, p. ej., angiostatina o endostatina, o un modificador de la respuesta biológica tal como una linfocina, interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de las colonias de granulocitos (G-CSF), factor de crecimiento nervioso (NGF) u otro factor de crecimiento e inmunoglobulinas, u otros compuestos proteicos o polipeptídicos que comprendan más de 10 aminoácidos y que estén basados en estructuras de soporte proteicas, p. ej., de lipocalina ("anticalinas"), fibronectina ("adnectinas", trinectinas), dominios de Kunitz, lectina de tipo C, transferrina, gammacristalina, nudos de cisteína, repeticiones de anquirina ("DARPinas"), dominios Fyn SH3 ("fynómeros") o proteína A ("affibodies") como es conocido en la técnica (Tomlinson, 2004; Mosaviet al., 2004; Gill y Damle, 2006; Nilsson y Tolmachev, 2007; Binzet al., 2004; Silacciet al.2014). Otras moléculas efectoras incluyen péptidos y proteínas que mejoran o facilitan la penetración de la barrera hematoencefálica. Por ejemplo, los documentos WO2010/043047, WO2010/063122, WO2010/063123 o WO2011/041897 describen péptidos o polipéptidos que pueden actuar como vectores capaces de transportar una molécula terapéutica a través de la barrera hematoencefálica y métodos para conjugarlos con una molécula terapéutica. Entre los péptidos y proteínas de interés en el contexto de la penetración de la barrera hematoencefálica se incluyen, pero sin limitación, péptidos y proteínas que se unen a un receptor de la barrera hematoencefálica, tal como un receptor de transferrina, receptor de glucosa, receptor de insulina, receptor del factor de crecimiento de tipo insulina, proteína 8 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad, proteína 1 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad y factor de crecimiento de tipo factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina. Como alternativa, la molécula efectora es un fragmento de anticuerpo, tal como un anticuerpo de dominio, anticuerpo de camélido o anticuerpo procedente de tiburón (VNAR) que se une específicamente a uno de los receptores de la barrera hematoencefálica anteriores.

[0171] Otras moléculas efectoras pueden incluir sustancias detectables útiles, por ejemplo, en diagnóstico. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, núclidos radiactivos, metales emisores de positrones, tales como los que pueden usarse en tomografía por emisión de positrones o en tomografía computarizada por emisión monofotónica, e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos. Véase, en general, la patente de EE. UU. n.º 4741900 para iones metálicos que se pueden conjugar con anticuerpos para su uso como diagnóstico. Entre las enzimas adecuadas se incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; entre los grupos prostéticos adecuados se incluye la estreptavidina, avidina y biotina; entre los materiales fluorescentes adecuados se incluyen la umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo y ficoeritrina; entre los materiales luminiscentes adecuados se incluye el luminol; entre los materiales bioluminiscentes adecuados se incluyen la luciferasa, luciferina y aecuorina; y los núclidos radiactivos adecuados incluyen<124>I<125>I,<131>I,<111>In,<99>Tc,<89>Zr,<90>Y,<64>Cu,<68>Ga y<18>F. Un tipo particular de moléculas efectoras adecuadas como sustancias detectables útiles para el diagnóstico incluyen las tetrazinas deficientes en electrones y el trans-cicloocteno (TCO), como se describe en Wyffelset al.2014, Nuclear Medicine and biology 41 (2014):513-523, donde puede administrarse un anticuerpo de unión a Tau de la invención ligado a tetrazina y dejarse que alcance la máxima captación y una eliminación suficiente desde sitios no diana, seguido de la administración posterior de TCO o de un análogo optimizado de TCO marcado con un núclido radiactivo adecuado, de modo que el TCO se una covalentemente a la tetrazina en el anticuerpo de unión a Tau de la invención, y permita su detección, por ejemplo, mediante tomografía por emisión de positrones o tomografía computarizada por emisión monofotónica.

[0172] En una realización se proporciona un Fab, Fab' o scFv de unión a Tau ligados a un núclido radiactivo o a tetrazina. Los enlaces a un núclido radiactivo o a la tetrazina pueden realizarse mediante la unión a través de cualquier cadena lateral de aminoácidos disponible o grupo funcional aminoácido terminal situado en el fragmento de anticuerpo, por ejemplo, cualquier grupo amino, imino, tiol, hidroxilo o carboxilo libre. Dichos aminoácidos pueden encontrarse de forma natural en el fragmento de anticuerpo o pueden introducirse por genomodificación en el fragmento utilizando métodos de ADN recombinante (véanse, por ejemplo, los documentos US 5219996; US 5667425; WO98/25971, WO2008/038024). En un ejemplo, el anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo de la presente invención es un fragmento Fab modificado en donde la modificación es la adición al extremo C-terminal de su cadena pesada de uno o más aminoácidos para permitir la unión de una molécula efectora. Convenientemente, los aminoácidos adicionales forman una región bisagra modificada que contiene uno o más restos de cisteína a los que puede unirse la molécula efectora. En una realización, si el radionúclido es un ion metálico tal como<111>In,<99>Tc,<89>Zr,<90>Y,<64>Cu o<68>Ga, puede unirse a este un quelante macrocíclico, por ejemplo, como se describe en Turneret al.(Br. J. Cancer, 1994, 70:35-41;Comparative biodistribution of indium-111-labelled macrocycle chimeric B72.3 antibody conjugates in tumour-bearing mice) de modo que este último está a su vez unido covalentemente a la cadena lateral de aminoácidos antes mencionada o al grupo o grupos funcionales de aminoácidos terminales del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En una realización adicional, el último quelato macrocíclico con radionúclido unido puede ser la molécula efectora descrita en el documento WO05/113605 que forma parte de un reticulador que une dos o más anticuerpos anti-Tau o fragmentos de los mismos.

[0173] En otro ejemplo, la molécula efectora puede aumentar la semivida del anticuerpoin vivo, y/o reducir la inmunogenicidad del anticuerpo y/o mejorar la administración de un anticuerpo a través de una barrera epitelial al sistema inmunitario. Los ejemplos de moléculas efectoras adecuadas de este tipo incluyen polímeros, albúmina y proteínas de unión a albúmina o compuestos de unión a albúmina tales como los descritos en el documento WO05/117984.

[0174] Cuando dicha molécula efectora es un polímero puede, en general, ser un polímero sintético o natural, por ejemplo, un polímero de polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituidos, o un polisacárido ramificado o no ramificado, p. ej., un homo o hetero-polisacárido.

[0175] Los sustituyentes específicos opcionales que pueden estar presentes en los polímeros sintéticos antes mencionados incluyen uno o más grupos hidroxi, metilo o metoxi.

[0176] Entre los ejemplos específicos de polímeros sintéticos se incluyen el poli(etilenglicol), poli(propilenglicol) poli(alcohol vinílico) de cadena recta o ramificada opcionalmente sustituidos o derivados de los mismos, especialmente el poli(etilenglicol) opcionalmente sustituido, tal como el metoxipoli(etilenglicol) o derivados del mismo.

[0177] Entre los polímeros naturales específicos se incluye la lactosa, amilosa, dextrano, glucógeno o derivados de los mismos.

[0178] En una realización, el polímero es albúmina o un fragmento de la misma, tal como la seroalbúmina humana o un fragmento de la misma.

[0179] El tamaño del polímero se puede modificar según se desee, pero generalmente estará en un intervalo de peso molecular promedio de entre 500 y 50000 Da, por ejemplo, entre 5000 y 40000 Da, tal como entre 20000 y 40000 Da. El tamaño del polímero puede seleccionarse en particular en función del uso previsto del producto, por ejemplo, la capacidad de ubicarse en determinados tejidos, tales como el cerebro, o de prolongar la semivida en circulación (para una revisión, véase Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). Por lo tanto, por ejemplo, cuando se pretende que el producto salga de la circulación y entre en el tejido.

[0180] Los polímeros adecuados incluyen un polímero de polialquileno, tal como un poli(etilenglicol) o, especialmente, un metoxipoli(etilenglicol) o un derivado de los mismos, y especialmente con un peso molecular en el intervalo de entre aproximadamente 15000 y aproximadamente 40000 Da.

[0181] En un ejemplo, los anticuerpos para usar en la presente invención están unidos a restos de poli(etilenglicol) (PEG). En un ejemplo particular, el anticuerpo es un anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo y las moléculas de PEG pueden unirse a través de cualquier cadena lateral de aminoácidos disponible o grupo funcional de aminoácidos terminal situado en el fragmento de anticuerpo, por ejemplo, cualquier grupo amino, imino, tiol, hidroxilo o carboxilo libre. Dichos aminoácidos pueden encontrarse de forma natural en el fragmento de anticuerpo o pueden introducirse por genomodificación en el fragmento utilizando métodos de ADN recombinante (véanse, por ejemplo, los documentos US 5219996; US 5667425; WO98/25971, WO2008/038024). En un ejemplo, el anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo de la presente invención es un fragmento Fab modificado en donde la modificación es la adición al extremo C-terminal de su cadena pesada de uno o más aminoácidos para permitir la unión de una molécula efectora. Convenientemente, los aminoácidos adicionales forman una región bisagra modificada que contiene uno o más restos de cisteína a los que puede unirse la molécula efectora. Se pueden usar múltiples sitios para unir dos o más moléculas de PEG.

[0182] Convenientemente, las moléculas de PEG se unen covalentemente a través de un grupo tiol de al menos un resto de cisteína ubicado en el fragmento de anticuerpo. Cada molécula de polímero unida al fragmento de anticuerpo modificado puede estar unida covalentemente al átomo de azufre de un resto de cisteína situado en el fragmento. El enlace covalente será generalmente un enlace disulfuro o, en particular, un enlace azufre-carbono. Cuando se utiliza un grupo tiol como punto de unión se activan adecuadamente las moléculas efectoras, por ejemplo, pueden usarse derivados selectivos de tiol, tales como maleimidas y derivados de cisteína. Un polímero activado puede usarse como material de partida en la preparación de fragmentos de anticuerpos modificados con polímeros como se ha descrito anteriormente. El polímero activado puede ser cualquier polímero que contenga un grupo reactivo tiol, tal como un ácido α-halocarboxílico o un éster, p. ej., yodoacetamida, una imida, p. ej., maleimida, una sulfona vinílica o un disulfuro. Tales materiales de partida pueden obtenerse comercialmente (por ejemplo, de Nektar, anteriormente Shearwater Polymers Inc, Huntsville, AL, EE. UU.) o pueden prepararse a partir de materiales de partida disponibles en el mercado utilizando procedimientos químicos convencionales. Las moléculas de PEG en particular incluyen metoxi-PEG-amina 20K (que puede obtenerse de Nektar, antes Shearwater; Rapp Polymere; y SunBio) y M-PEG-SPA (que puede obtenerse de Nektar, antes Shearwater).

[0183] En otro aspecto, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican anticuerpos de unión a Tau y fragmentos de unión de los mismos de la presente invención. En particular, la presente invención proporciona una molécula o moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican la cadena ligera y pesada de un anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo de la presente invención, en donde dichas cadenas ligera y pesada están codificadas por la misma molécula de ácido nucleico aislada o por moléculas de ácido nucleico separadas

[0184] A modo de ejemplo, la VL de AB1 (SEQ ID NO: 7) puede estar codificada por la SEQ ID NO: 19). La VH de AB1 (SEQ ID NO: 8) puede estar codificada por la SEQ ID NO: 20).

[0185] La VL humanizada de la SEQ ID NO: 9 puede estar codificada por la SEQ ID NO: 21. La VH humanizada de la SEQ ID NO: 12 puede estar codificada por la SEQ ID NO: 22 y la VH humanizada de la SEQ ID NO: 13 puede estar codificada por la SEQ ID NO: 23.

[0186] La cadena ligera humanizada de la SEQ ID NO: 14 puede estar codificada por la SEQ ID NO: 24. La cadena pesada humanizada de la SEQ ID NO: 17 puede estar codificada por la SEQ ID NO: 25 y la cadena pesada humanizada de la SEQ ID NO: 18 puede estar codificada por la SEQ ID NO: 26. La cadena pesada humanizada de la SEQ ID NO: 54 puede estar codificada por la SEQ ID NO: 56 y la cadena pesada humanizada de la SEQ ID NO: 55 puede estar codificada por la SEQ ID NO: 57.

[0187] Los anticuerpos de unión a Tau y fragmentos de unión de los mismos pueden estar codificados por un único ácido nucleico (p. ej., un único ácido nucleico que comprende secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos de cadena ligera y pesada del anticuerpo), o por dos o más ácidos nucleicos separados, cada uno de los cuales codifica una parte diferente del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. A este respecto, la invención proporciona uno o más ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los anticuerpos anteriores, o fragmentos de unión. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser ADN, ADNc, ARN y similares.

[0188] Por ejemplo, las secuencias de ADN que codifican parte o la totalidad de las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo pueden sintetizarse según se desee a partir de las secuencias de ADN determinadas o basándose en las correspondientes secuencias de aminoácidos. El ADN que codifica las secuencias estructurales aceptoras está ampliamente disponible para los expertos en la materia y puede sintetizarse fácilmente a partir de sus secuencias de aminoácidos conocidas.

[0189] Pueden usarse técnicas convencionales de biología molecular para preparar secuencias de ADN que codifiquen la molécula de anticuerpo de la presente invención. Las secuencias de ADN deseadas pueden sintetizarse total o parcialmente mediante técnicas de síntesis de oligonucleótidos. Según convenga, pueden utilizarse técnicas de mutagénesis dirigida y de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

[0190] Preferentemente, las secuencias de ácido nucleico codificantes están unidas operativamente a secuencias de control de la expresión que permiten la expresión en células procariotas o eucariotas. La expresión de dicho polinucleótido comprende la transcripción del polinucleótido en un ARNm traducible. Los elementos reguladores que garantizan la expresión en las células eucariotas, preferentemente, células de mamífero, son bien conocidos por los expertos en la materia. Normalmente comprenden secuencias reguladoras que garantizan el inicio de la transcripción y, opcionalmente, señales poli-A que garantizan la terminación de la transcripción y la estabilización del transcrito. Los elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores transcripcionales y traduccionales y/o regiones promotoras heterólogas o asociadas de forma natural.

[0191] De este modo, la presente invención en un aspecto adicional proporciona vectores de clonación o expresión que comprenden tales secuencias de ácido nucleico que codifican anticuerpos de unión a Tau y fragmentos de unión a los mismos de la presente invención.

[0192] Un "vector" es cualquier molécula o composición que tiene la capacidad de transportar una secuencia de ácido nucleico a una célula hospedadora adecuada donde, p. ej., puede tener lugar la síntesis del polipéptido codificado. Normalmente, y preferentemente, un vector es un ácido nucleico que se ha genomodificado, usando técnicas de ADN recombinante que se conocen en la técnica, para incorporar una secuencia de ácido nucleico deseada (p. ej., un ácido nucleico de la invención). Los vectores de expresión contienen normalmente uno o más de los siguientes componentes (si no los aportan ya las moléculas de ácido nucleico): un promotor, una o más secuencias potenciadoras, un origen de replicación, una secuencia de terminación de la transcripción, una secuencia de intrones completa que contiene un sitio de corte y empalme donante y aceptor, una secuencia líder para la secreción, un sitio de unión al ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una región de poliligador para insertar el ácido nucleico que codifica el polipéptido a expresar, y un elemento marcador seleccionable.

[0193] Los vectores se seleccionan normalmente para que sean funcionales en la célula hospedadora en la que se va a usar el vector (el vector es compatible con la maquinaria de la célula hospedadora de modo que pueda producirse la amplificación del gen y/o la expresión del gen).

[0194] De este modo, la presente invención proporciona, en un aspecto adicional, células hospedadoras que comprenden vectores de clonación o expresión como se ha descrito anteriormente y/o secuencias de ácido nucleico que codifican anticuerpos de unión a Tau y fragmentos de unión de los mismos como se ha descrito anteriormente.

[0195] La célula hospedadora puede ser cualquier tipo de célula capaz de transformarse con el ácido nucleico o el vector para producir un anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo codificado de este modo. La célula hospedadora que comprende el ácido nucleico o el vector puede utilizarse para producir el anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo, o una parte del mismo (p. ej., una secuencia de cadena pesada, o una secuencia de cadena ligera codificada por el ácido nucleico o el vector). Después de introducir el ácido nucleico o el vector en la célula, la célula se cultiva en condiciones adecuadas para la expresión de la secuencia codificada. El anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o parte del anticuerpo puede entonces aislarse de la célula.

[0196] Las células hospedadoras pueden ser células hospedadoras procariotas (tales comoE. coli)o eucariotas (tales como una célula de levadura, una célula de insecto o una célula de vertebrado). La célula hospedadora, cuando se cultiva en condiciones adecuadas, expresa un anticuerpo o fragmento de unión del mismo que posteriormente se puede recoger del medio de cultivo (si la célula hospedadora lo secreta al medio) o directamente de la célula hospedadora que la produce (si no se secreta). La selección de una célula hospedadora adecuada dependerá de diversos factores, tales como los niveles de expresión deseados, las modificaciones polipeptídicas deseables o necesarias para la actividad, tales como la glicosilación o la fosforilación, y la facilidad de plegamiento en una molécula biológicamente activa. La selección de la célula hospedadora dependerá en parte de si el anticuerpo o fragmento de unión del mismo se va a modificar postranscripcionalmente (p. ej., glicosilar y/o fosforilar). Si es así, son preferibles las células hospedadoras de levaduras, insectos o mamíferos.

[0197] Las células hospedadoras de mamífero adecuadas incluyen células CHO, de mieloma o de hibridoma. Los tipos adecuados de células de ovario de hámster chino (células CHO) para usar en la presente invención pueden incluir células CHO y CHO-K1, incluidas células dhfr-CHO, tales como células CHO-DG44 y CHODXB11 y que pueden usarse con un marcador seleccionable de DHFR o células CHOKI-SV que pueden usarse con un marcador seleccionable de glutamina sintetasa. Muchas están disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Manassas, Va. Los ejemplos incluyen células de mamíferos, tales como células de ovario de hámster chino (CHO) (n.º de ATCC CCL61), células de riñón embrionario humano (HEK) 293 o 293T (n.º de ATCC CRL1573), células 3T3 (n.º de ATCC CCL92), o células PER.C6. Otros tipos celulares para usar en la expresión de anticuerpos incluyen las líneas celulares linfocíticas, p. ej., células de mieloma NSO y células SP2, células COS.

[0198] Otro aspecto de la presente invención proporciona un proceso para la producción de un anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo que comprende cultivar una célula hospedadora que contiene, p. ej., un vector en condiciones adecuadas para conducir a la expresión de un anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo a partir, p. ej., de ADN que codifica el anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo, y aislar la molécula de anticuerpo. En particular, la presente invención proporciona un método para producir un anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo de la presente invención, que comprende al menos las etapas de a) cultivar una célula hospedadora de la presente invención; y b) aislar dicho anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo. Para la fabricación de productos que comprenden cadenas tanto pesadas como ligeras, la línea celular puede transfectarse con dos vectores, un primer vector que codifica un polipéptido de cadena ligera y un segundo vector que codifica un polipéptido de cadena pesada. Como alternativa, puede usarse un único vector, incluyendo el vector secuencias que codifican polipéptidos de cadena ligera y de cadena pesada.

[0199] El anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo de acuerdo con la presente invención se expresan a buenos niveles en células hospedadoras. De este modo, las propiedades de los anticuerpos y/o fragmentos son propicias para su transformación comercial.

[0200] De este modo, se proporciona un proceso para cultivar una célula hospedadora y expresar el anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo, aislar este último y opcionalmente purificarlo para proporcionar un anticuerpo de unión a Tau aislado o fragmento de unión del mismo. En una realización, el proceso comprende además la etapa de conjugar una molécula efectora con el anticuerpo o fragmento aislado, por ejemplo, conjugar con un polímero de PEG en particular como se describe en el presente documento.

[0201] El anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo puede formularse en composiciones, especialmente composiciones farmacéuticas o de diagnóstico. Las composiciones farmacéuticas comprenden una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo en mezcla con un vehículo adecuado, p. ej., un agente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones de diagnóstico comprenden una cantidad diagnósticamente eficaz de un anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo en mezcla con un vehículo adecuado, p. ej., un agente aceptable para el diagnóstico.

[0202] Los agentes farmacéuticamente aceptables para usar en las presentes composiciones farmacéuticas incluyen vehículos, excipientes, diluyentes, antioxidantes, conservantes, agentes colorantes, aromatizantes y diluyentes, agentes emulsionantes, agentes de suspensión, disolventes, cargas, agentes espesantes, tampones, vehículos de suministro, agentes de tonicidad, cosolventes, agentes humectantes, agentes formadores de complejos, agentes tamponantes, antimicrobianos y tensioactivos.

[0203] La composición puede estar en forma líquida o en forma liofilizada o criodesecada y puede incluir uno o más licoprotectores, excipientes, tensioactivos, aditivos estructurales y/o espesantes de alto peso molecular (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU 6685940, 6566329 y 6372716).

[0204] Las composiciones pueden ser adecuadas para la administración parenteral. Las composiciones ilustrativas son adecuadas para inyección o infusión en un animal por cualquier vía disponible para el trabajador experto, tales como las vías intraarticular, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimatosa), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial o intralesional. Una formulación parenteral normalmente será una solución acuosa isotónica estéril, apirógena, que contiene opcionalmente conservantes farmacéuticamente aceptables.

[0205] Son ejemplos de disolventes no acuosos propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo solución salina y medio tamponado. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro sódico, solución de Ringer con glucosa, glucosa y cloruro sódico, lactato de Ringer o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de líquidos y nutrientes, reponedores de electrolitos, tales como los basados en la solución de Ringer con glucosa, y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y similares. Véase, en general, Remington's Pharmaceutical Science, 16.ª ed., Mack Eds., 1980.

[0206] Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden formularse para una administración controlada o prolongada de manera que proporcionen una concentración local del producto (p. ej., embolada, efecto de depósito) y/o mayor estabilidad o semivida en un entorno local en particular. Las composiciones pueden incluir la formulación de anticuerpos, fragmentos de unión, ácidos nucleicos o vectores de la invención con preparaciones en partículas de compuestos poliméricos, tales como el ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc., así como agentes tales como una matriz biodegradable, microesferas inyectables, partículas microcapsulares, microcápsulas, perlas de partículas biodegradables, liposomas y dispositivos de administración implantables que posibilitan la liberación controlada o prolongada del principio activo, que a continuación puede administrarse como inyección de liberación prolongada.

[0207] Como alternativa o adicionalmente, las composiciones pueden administrarse localmente mediante implantación en la zona afectada de una membrana, esponja u otro material adecuado sobre el que se ha absorbido o encapsulado un anticuerpo, fragmento de unión, ácido nucleico o vector de la invención. Cuando se usa un dispositivo de implantación, el dispositivo puede implantarse en cualquier tejido u órgano adecuado, y la administración de un anticuerpo, fragmento de unión, ácido nucleico o vector de la invención puede ser directamente a través del dispositivo mediante embolada, o mediante administración continua, o mediante un catéter usando infusión continua.

[0208] Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo puede formularse para inhalación, tal como, por ejemplo, en forma de polvo seco. Las soluciones para inhalación también pueden formularse en un propulsor licuado para su administración en aerosol. En otra formulación más, las soluciones pueden nebulizarse.

[0210] Un aspecto de la presente divulgación se refiere a usar anticuerpos de unión a Tau y fragmentos de unión de los mismos como agente terapéuticamente activo en el tratamiento de enfermedades. En particular, la presente invención proporciona un anticuerpo de unión a Tau aislado o fragmento de unión del mismo de la presente invención para usar como agente terapéuticamente activo.

[0212] Otro aspecto de la presente divulgación se refiere al uso de anticuerpos de unión a Tau y fragmentos de unión de los mismos en el tratamiento de tauopatías. En particular, la presente invención proporciona un anticuerpo de unión a Tau aislado o fragmento de unión del mismo de la presente invención para usar en el tratamiento de una tauopatía. Entre las tauopatías que se ha descrito que contienen inclusiones de Tau (Clavagueraet al.Brain Pathology 23 (2013) 342-349) se incluye la enfermedad de Alzheimer (EA); complejo de esclerosis lateral amiotrófica/parkinsonismo-demencia; enfermedad argirofílica granulosa; encefalopatía traumática crónica; degeneración corticobasal; ovillos neurofibrilares difusos con calcificación; síndrome de Down; demencia británica familiar; demencia danesa familiar; demencia frontotemporal y parkinsonismo ligados al cromosoma 17 causados por mutaciones en MAPT; enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker; parkinsonismo guadalupeño; distrofia miotónica; neurodegeneración con acumulación de hierro en el cerebro; enfermedad de Niemann-Pick, tipo C; enfermedad de la motoneurona no guameña con ovillos neurofibrilares; enfermedad de Pick; parkinsonismo postencefalítico; angiopatía amiloide cerebral por proteínas priónicas; gliosis subcortical progresiva; parálisis supranuclear progresiva (PSP); retraso mental relacionado con SLC9A6; panencefalitis esclerosante subaguda; demencia con ovillos únicamente; y tauopatía de la sustancia blanca con inclusiones gliales globulares.

[0214] Por tanto, otro aspecto de la presente divulgación se refiere a un anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo para usar en métodos de tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y/o parálisis supranuclear progresiva. Los métodos comprenden administrar una cantidad terapéuticamente activa de un anticuerpo de unión a Tau o un fragmento de unión del mismo a un sujeto que lo necesite.

[0216] En otro aspecto, el anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo de la presente invención puede usarse solo o junto con otros agentes en una terapia. Por ejemplo, el anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo puede coadministrarse con al menos un agente terapéutico adicional. En determinados aspectos, un agente terapéutico adicional es un agente terapéutico eficaz para tratar el mismo trastorno o un trastorno diferente que para el que se usa el anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo. Los agentes terapéuticos adicionales ilustrativos incluyen, pero sin limitación: inhibidores de colinesterasa (tales como donepezilo, galantamina, rovastigmina y tacrina), antagonistas del receptor de NMDA (tales como memantina), inhibidores de la agregación del péptido beta amiloide, antioxidantes, moduladores de gamma-secretasa, miméticos del factor de crecimiento nervioso (NGF) o terapia génica con NGF, agonistas de PPARy, inhibidores de la HMS-CoA reductasa (estatinas), ampakinas, bloqueantes de los canales de calcio, antagonistas de receptores de GABA, inhibidores de la glucógeno sintasa cinasa, inmunoglobulina intravenosa, agonistas de receptores muscarínicos, moduladores de receptores nicotínicos, inmunización con péptido beta amiloide activo o pasivo, inhibidores de fosfodiesterasa, antagonistas de los receptores de serotonina y anticuerpos antipéptido beta amiloide o anticuerpos antitau adicionales. Pueden seleccionarse ejemplos adicionales de fármacos neurológicos de entre una hormona del crecimiento o un factor neurotrófico; los ejemplos incluyen, pero sin limitación, el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), factor de crecimiento nervioso (NGF), neurotrofina-4/5, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF)-2 y otros FGF, neurotrofina (NT)-3, eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento transformante (TGF)-alfa, TGF beta, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-lra), factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF), neurturina, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), herregulina, neurregulina, artemina, persefina, interleucinas, factor neurotrófico derivado de la estirpe de células gliales (GFR), factor estimulante de colonias (CSF) de granulocitos, CSF de granulocitos-macrófagos, netrinas, cardiotrofina-1, hedgehogs, factor inhibidor de leucemia (LIF), midquina, pleiotrofina, proteínas morfogenéticas óseas (BMP), netrinas, saposinas, semaforinas y factor de células madre (SCF). En determinadas realizaciones, el al menos un agente terapéutico adicional se selecciona por su capacidad para mitigar uno o más efectos secundarios del fármaco neurológico. Dichas combiterapias mencionadas anteriormente abarcan el anticuerpo o fragmento de unión de la presente invención que se proporciona para usar en la administración combinada (donde se incluyen dos o más agentes terapéuticos en la misma formulación o en formulaciones separadas), y la administración por separado, en cuyo caso, la administración del anticuerpo anti-Tau o fragmento de unión del mismo se puede realizar antes de, simultáneamente y/o después de la administración del agente terapéutico y/o adyuvante adicional. También se proporcionan anticuerpos de unión a Tau o fragmentos de unión de los mismos para usar junto con otras terapias de intervención, tales como, pero sin limitación, radioterapia, terapia conductual u otras terapias conocidas en la técnica y adecuadas para el trastorno neurológico que se va a tratar o prevenir.

[0218] Otro aspecto de la presente invención se refiere a un anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo de la misma de la presente invención para usar como método de diagnósticoin vivo.

[0219] Un aspecto de la presente invención también se refiere a los anticuerpos de unión a Tau y fragmentos de unión del mismo de la presente invención para usar en el diagnóstico de tauopatías, en particular de la enfermedad de Alzheimer y/o de la parálisis supranuclear progresiva.

[0220] Las pruebas de diagnóstico pueden realizarse preferentemente con muestras biológicas. Una "muestra biológica" abarca diversos tipos de muestras obtenidas a partir de un individuo y puede utilizarse en un ensayo de diagnóstico o de supervisión. La definición incluye el líquido cefalorraquídeo, la sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejido sólido, tales como una muestra de biopsia o cultivos de tejido o células obtenidas de los mismos, y la descendencia de las mismas. La definición también incluye muestras que se han manipulado de alguna manera después de su obtención, tal como mediante tratamiento con reactivos, solubilización o enriquecimiento respecto a determinados componentes, tales como polinucleótidos. La expresión "muestra biológica" abarca una muestra clínica y también incluye células en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, líquido biológico y muestras de tejido. La expresión "muestra biológica" incluye la orina, saliva, líquido cefalorraquídeo, fracciones sanguíneas tales como plasma y suero, y similares.

[0221] Las pruebas de diagnóstico pueden realizarse preferentemente con muestras biológicas que no estén en contacto con el cuerpo humano o animal. Tales pruebas de diagnóstico también se denominan pruebasin vitro.

[0222] Las pruebas de diagnósticoin vitropueden basarse en un métodoin vitrode detección de Tau en una muestra biológica que se ha obtenido de un individuo que comprende las etapas de i) poner la muestra biológica en contacto con un anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo como se describe en el presente documento; y ii) detectar la unión a Tau del anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo, como se describe en el presente documento. Comparando el nivel de Tau detectado con un control adecuado, a continuación, se puede diagnosticar la presencia o probable aparición de una tauopatía tal como la enfermedad de Alzheimer y/o la parálisis supranuclear progresiva. De este modo, un método de detección de este tipo puede utilizarse para determinar si un sujeto tiene, o corre el riesgo de desarrollar, una tauopatía, incluyendo la determinación del estadio (gravedad) de una tauopatía. La presente invención proporciona de este modo un métodoin vitropara diagnosticar una tauopatía tal como la enfermedad de Alzheimer y/o la parálisis supranuclear progresiva en un sujeto que comprende las etapas de i) evaluar el nivel o estado de Tau en una muestra biológica obtenida del sujeto usando un anticuerpo de unión a Tau o un fragmento de unión del mismo como se describe en el presente documento; y ii) comparar el nivel o estado de Tau con una referencia, un patrón o un valor de control normal que indica el nivel o el estado de Tau en sujetos de control normales. Una diferencia significativa entre el nivel y/o el estado del polipéptido Tau en la muestra biológica y el valor de control normal indica que el individuo tiene una tauopatía tal como enfermedad de Alzheimer y/o parálisis supranuclear progresiva.

[0223] La invención se describe ahora con respecto a algunos ejemplos que, sin embargo, no deben considerarse limitativos.

[0224] Experimentos

[0225] Experimento 1 - Generación de anticuerpos de unión a Tau

[0226] 1.1 Expresión de Tau recombinante

[0227] La proteína Tau humana se expresó en dos sistemas hospedadores,E. coliBL21 (DE3) y células HEK293 (línea celular de riñón embrionario humano). Se produjeron cuatro isoformas diferentes de Tau enE. coli, isoformas 2, 3, 4 y 5, y una isoforma en células HEK293, isoforma 2. La secuencia completa de todos los vectores de expresión y proteínas producidas se incluye en las figuras 5 a 14.

[0228] Producción de Tau enE. coli

[0229] Los genes que codifican las distintas isoformas de Tau se generaron sintéticamente y se optimizaron los codones para su expresión enE. coli. Se utilizaron técnicas convencionales de biología molecular para subclonar en un vector pET32 genomodificado para producir Tau con un marcador N-terminal 6His-TEV.

[0230] Se transformaron células deE. coliBL 21 (DE3) con el vector anterior y se expresó la proteína mediante técnicas convencionales.

[0231] A continuación, las células deE. colise recuperaron por centrifugación, se lisaron y la proteína Tau se capturó de la fracción soluble mediante cromatografía de afinidad utilizando NiNTA (Qiagen). El marcador 6His se eliminó utilizando proteasa TEV seguida de una segunda etapa de cromatografía NiNTA. La Tau purificada se cambió a tampones adecuados en función de la aplicación. Se eliminó la endotoxina de las muestras generadas para inmunizaciones mediante columnas Proteus NoEndo<™>(Vivaproducts).

[0232] Generación de Tau marcada isotópicamente para estudios de resonancia magnética nuclear (RMN):

[0233] La expresión de la proteína se realizó como se ha descrito anteriormente, salvo que se utilizó un medio mínimo para la incorporación de<15>N,<13>C y<2>H en la proteína. Se lisaron los sedimentos de célulasE. coliy la proteína Tau se purificó utilizando una etapa de cromatografía de afinidad NiNTA (Qiagen), el marcador 6His se eliminó con proteasa TEV y la proteína Tau se purificó a continuación por filtración en gel utilizando una unidad Superdex 200 (GE-Healthcare). Producción de Tau en HEK293

[0234] Se generó sintéticamente un gen que codifica la isoforma 2 de Tau utilizando la secuencia de ADN natural. Se utilizaron técnicas convencionales de biología molecular para subclonarlo en el vector de expresión pMV-10HisTEV (que contiene un promotor de CMV) diseñado para producir Tau con un marcador N-terminal 10His-TEV (SEQ ID NO: 51). El vector resultante se transfectó utilizando el Expi293™ Expression System (Invitrogen) según los protocolos del fabricante. Este sistema usa células humanas Expi293F procedentes de la línea celular HEK293

[0235] La proteína Tau se acumuló en los medios de cultivo, de donde se recuperó utilizando la cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados Ni Sepharose Excel (GE Healthcare). A continuación, se eliminó el marcador 10His utilizando proteasa TEV antes de volver a aplicar a la columna de Ni Sepharose y recoger la Tau escindida en el flujo continuo. La Tau purificada se cambió a tampones adecuados en función de la aplicación.

[0236] Formación de fibrillas

[0237] La proteína Tau a 450 µM se esterilizó por filtración y se agitó en un tubo Eppendorf de 1,5 ml utilizando un termomezclador (Eppendorf) a 750 rpm, 37 °C durante 310 horas. La formación de fibrillas se supervisó utilizando colorante tioflavina-T y leyendo la absorbancia en un espectrofotómetro Fluostar Omega (BMG Labtech). La formación de filamentos helicoidales emparejados (FHE) se confirmó mediante microscopia electrónica con tinción negativa. 1.2 Inmunización

[0238] Se inmunizaron 10 ratas hembra Sprague Dawley (260-280 g) por vía subcutánea con 50 µg de proteína Tau recombinante, emulsionada en un volumen igual de adyuvante completo de Freund (CFA) mezclando enérgicamente con una jeringa. Se administraron a las ratas 3 inyecciones de refuerzo a intervalos de 14 días utilizando adyuvante incompleto de Freund (IFA) y también se tomaron muestras de sangre de la cola. Se sacrificaron 14 días después del refuerzo final y se prepararon y congelaron suspensiones de células individuales de bazo y médula ósea en dimetilsulfóxido (DMSO) al 10 % en suero bovino fetal (FCS) a -80 °C. La proteína Tau humana recombinante se expresó enE. coli, se purificó y se agregóin vitroantes de la inmunización. Para la inmunización se utilizó una muestra final de una mezcla equimolar de cuatro isoformas (2, 3, 4 y 5) de Tau que contenía una mezcla de Tau soluble y Tau fibrilar insoluble.

[0239] 1.3 Cultivo de linfocitos B

[0240] Los cultivos de linfocitos B se prepararon utilizando un método similar al descrito por Zubleret al. (1985). En resumen, los linfocitos B procedentes de las PBMC de ratas inmunizadas se cultivaron a una densidad de aproximadamente 3000 células por pocillo en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos con código de barras con 200 µl/pocillo de medio RPMI 1640 (Gibco BRL) complementado con FCS al 10 % (PAA laboratories ltd), HEPES al 2 % (Sigma Aldrich), L-Glutamina al 1 % (Gibco BRL), solución de penicilina/estreptomicina al 1 % (Gibco BRL), β-mercaptoetanol al 0,1 % (Gibco BRL), sobrenadante de cultivo de esplenocitos activados al 3 % y células de timoma murino mutante EL4 irradiadas con rayos gamma (5 x 10<4>/pocillo) durante siete días a 37 °C en una atmósfera de CO<2>al 5 %. En total, se muestrearon aproximadamente 1,2 x 10<8>linfocitos B.

[0241] 1.4 Exploración primaria

[0242] La presencia de anticuerpos de unión a Tau en sobrenadantes de cultivos de linfocitos B se determinó mediante un ensayo de unión homogéneo basado en fluorescencia utilizando perlas de Superavidin™ (Bangs Laboratories) recubierto con Tau soluble o insoluble biotinilada obtenida como se describe en la sección 1.1. La Tau generada tuvo una fracción soluble y otra insoluble. La Tau insoluble se eliminó de la mezcla mediante centrifugación utilizando una centrifugadora Eppendorf mini-spin plus de sobremesa a 14500 RPM durante 10 minutos. Cada fracción se biotiniló por separado utilizando el kit de biotinilación EZ-link sulfo-NHS-LC según las instrucciones del fabricante. La fracción soluble biotinilada se separó de la biotina libre utilizando columnas Zeba de desalinización por centrifugación según las instrucciones del fabricante. La fracción insoluble se separó de la biotina libre centrifugando la mezcla en una centrifugadora Eppendorf mini-spin plus a 14500 RPM durante 10 minutos, recuperando el precipitado que contiene Tau y volviéndolo a suspender en 1,5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y repitiendo este proceso 5 veces. El ensayo permitió cribar el sobrenadante que mostraba unión a formas de Tau solubles o insolubles. Se transfirieron 10 µl de sobrenadante desde placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos con código de barras a placas de ensayo de 384 pocillos con código de barras y paredes negras que contenían Tau soluble o insoluble inmovilizada en perlas (10 µl/pocillo) utilizando un manipulador de líquidos Matrix Platemate. La unión se reveló con un conjugado Cy-5 específico para Fcγ de cabra anti-IgG de rata (Jackson). Las placas se leyeron en un sistema de detección celular Applied Biosystems 8200.

[0243] 1.5 Exploración secundaria

[0244] Después de la exploración primaria, los sobrenadantes positivos se consolidaron en placas maestras de 96 pocillos con código de barras utilizando un robot de selección de aciertos Aviso Onyx y los linfocitos B en placas de cultivo celular se congelaron a -800 °C. A continuación, las placas maestras se exploraron en un ensayo ELISA con la fracción soluble de Tau. Esto se hizo para determinar, en una exploración más estricta, la capacidad de los anticuerpos para unirse a Tau y comprobar que no se unían a las perlas en las exploraciones primarias. El ensayo ELISA implicó la aplicación de Tau soluble sobre placas Maxisorp de 384 pocillos (ThermoScientific/Nunc) a 3 µg/ml en un tampón de recubrimiento de carbonato (dH<2>O Na<2>CO<3>al 0,16 % NaHCO3 al 0,3 %). Las placas se bloquearon con caseína al 1 % p/v BSA al 1 % p/v en PBS y, a continuación, se incubaron con 10 µl/pocillo de sobrenadante de cultivo de linfocitos B. Se añadió a las placas un anticuerpo secundario Fc de cabra anti-IgG de rata conjugado con HRP (Stratech Scientific Ltd/ Jackson ImmunoResearch), seguido de visualización de la unión con sustrato TMB (3,3',5,5'-Tetrametilbencidina, de EMD Millipore; 10 µl/pocillo). La densidad óptica se midió a 630 nM utilizando el lector de microplacas BioTek Synergy 2. Los sobrenadantes de linfocitos B que demostraron especificidad para Tau se seleccionaron para la recuperación de regiones variables.

[0245] 1.6 Recuperación de regiones variables

[0246] Para permitir la recuperación de los genes de la región variable del anticuerpo de una selección de pocillos de interés, se realizó una etapa de desconvolución para permitir la identificación de linfocitos B específicos del antígeno en un pocillo dado que contenía una población heterogénea de linfocitos B. Esto se logró utilizando el método de focos fluorescentes (Clargoet al., 2014). En resumen, los linfocitos B secretores de inmunoglobulina de un pocillo positivo se mezclaron con perlas de estreptavidina (New England Biolabs) recubierto con Tau soluble biotinilada y una dilución final 1:1200 de un conjugado de FITC específico de fragmento Fcγ de cabra antirrata (Jackson). Después de la incubación estática a 37 °C durante 1 hora, los linfocitos B específicos del antígeno pudieron identificarse debido a la presencia de un halo fluorescente alrededor de ese linfocito B. Estos linfocitos B individuales, identificados con un microscopio Olympus, se recogieron, a continuación, con un micromanipulador Eppendorf y se depositaron en un tubo de PCR.

[0247] Los genes de la región variable de los anticuerpos se recuperaron a partir de células individuales mediante PCR de transcripción inversa (RT) utilizando cebadores específicos de región variable de cadena pesada y ligera. Se realizaron dos ciclos de PCR en un robot de manipulación de líquidos Aviso Onyx, incorporando la segunda PCR anidada sitios de restricción en los extremos 3’ y 5’, lo que permite la clonación de la región variable en un vector de expresión de mamífero γl IgG (VH) de ratón o kapppa (VL) de ratón. Las construcciones de cadena pesada y ligera se cotransfectaron en células HEK-293 utilizando Fectin 293 (Invitrogen) y el anticuerpo recombinante se expresó en un matraz de Erlenmeyer de 125 ml en un volumen de 30 ml. Después de 5-7 días de cultivo, se recogieron los sobrenadantes y se purificó el anticuerpo mediante cromatografía de afinidad.

[0248] Experimento 2 - Exploración adicional de los anticuerpos identificados

[0249] 2.1 Preparación de FHE

[0250] La proteína Tau de filamentos helicoidales emparejados (FHE) se purificó a partir de muestras cerebrales de donantes con enfermedad de Alzheimer o parálisis supranuclear progresiva o demencia frontotemporal según el protocolo publicado por Ksiezak-Reding y Wall (Neurobiology of Aging 15, 11-19, 1994). Las fracciones 8 (equivalente a la FHE-Tau en bruto antes de la centrifugación en gradiente de sacarosa en esta referencia) y 11 (equivalente a la fracción A2, FHE soluble en SDS como se describe en esta referencia) que se han descrito previamente como enriquecidas en FHE-Tau se recuperaron y se usaron para el ensayo BIAcore y el ensayo celular del experimento 3.

[0251] 2.2 Exploración por ELISA

[0252] El ensayo ELISA implicó la captura de Tau soluble en placas Maxisorp de 384 pocillos (ThermoScientific/Nunc) a 3 µg/ml en un tampón de recubrimiento de carbonato (dH<2>O Na<2>CO<3>al 0,16 % NaHCO<3>al 0,3 %). Las placas se bloquearon con caseína al 1 % p/v BSA al 1 % p/v en PBS y, a continuación, se incubaron con 10 µl/pocillo de anticuerpo purificado. Se añadió a las placas un anticuerpo secundario Fc de cabra anti-IgG de ratón conjugado con HRP (Stratech Scientific Ltd/ Jackson ImmunoResearch), seguido de la visualización de la unión con el sustrato TMB de HRP (3,3',5,5'-Tetrametilbencidina, de EMD Millipore; 10 µl/pocillo). La densidad óptica se midió a 630 nM utilizando el lector de microplacas BioTek Synergy 2.

[0253] 2.3 Exploración por BIAcore

[0254] Los fragmentos Fab monoclonales (mFab) seleccionados se prepararon a partir de anticuerpos mIgG1 quiméricos utilizando el kit de escisión Ficin de Pierce (n.º de cat.44980, Thermo Scientific) según el protocolo del fabricante. Se utilizó absorción a 280 nm para determinar la concentración de las disoluciones madre de Fab para el análisis por BIAcore. Una preparación de proteína Tau insoluble de pacientes con enfermedad de Alzheimer (EA-FHE, fracción 11), los monómeros de la isoforma-2 de Tau derivados de HEK (aminoácidos 1-441) y los monómeros de la isoforma-2 expresados enE. colise inmovilizaron con amina en el chip CM5, y la unión de mFab anti-Tau se midió con el instrumento Biacore T200. Para las inmovilizaciones se usó el tampón HBS-EP de GE Healthcare, excepto para la EA-FHE, para la que se usó ácido acético 10 mM (pH 3,0). El tampón HBS-EP+ se complementó con NaCl 300 mM y CM-Dextrano al 1,25 % (Sigma) y se usó como tampón de ensayo. Mientras que la celda de flujo (Fc) 1 se utilizó como referencia, se obtuvieron los siguientes valores de UI para Fc2-4: 44 UR con 5 µg/ml de Tau deE. coli, 56 UR con 5 µg/m de Tau HEK y 500 UR con una solución diluida 1:20 del material de EA-FHE. Para la regeneración se usaron dos ciclos de 60 s de glicina 10 mM (pH 1,7). Se usaron caudales de 10 µl/min para la inmovilización y la regeneración, mientras que para la unión del analito se usó un caudal de 30 µl/min. Para EA-FHE, se aplicaron múltiples inyecciones manuales para alcanzar las 500 UR, incluyendo EDC/NHS y recubrimiento con EtoA. Se aplicaron cinco ciclos de arranque y 12 ciclos por muestra de mFab o control de tampón, usando inyecciones de analito de 90 µl durante 180 s o 300 s para la disociación. Para cada mFab se utilizaron diluciones 111:3 de una solución de 600 nM más tampón. AB 1 se analizó utilizando la prueba de BIAcore.

[0255] Los resultados se representan en la tabla 1 que muestra la unión de mFab AB1 que tiene un VL de rata de la SEQ ID NO: 7 y un VH de rata de la SEQ ID NO: 8 a la isoforma-2 monomérica de Tau expresada enE. coli, a la isoforma-2 monomérica de Tau derivada de células HEK293 de mamíferos y a fibrillas de FHE de Tau aisladas de pacientes con enfermedad de Alzheimer (Tau agregada). En la tabla 3 se muestra el perfil de unión de AB1 y los anticuerpos del estado de la técnica mencionados anteriormente.

[0256] Tabla 1

[0259]

[0261] s. u. = sin unión

[0262] * se muestran los valores de los principales componentes de unión

[0263] Experimento 3 - Caracterización adicional de los anticuerpos identificados

[0264] 3.1 Ensayo celular

[0265] Preparación de fracciones solubles e insolubles en bruto de ratones transgénicos para Tau para inducir la agregación de Tau

[0266] Para estos experimentos se utilizaron ratones transgénicos que expresaban Tau humana P301S (Allenet al., 2002 J. Neurosci. 22(21):9340-51) y P301L (Lewiset al., 2000 Nat Genet. (4):402-5; Götz J,et al., 2001 J Biol Chem.

[0267] 276(l):529-34).

[0268] Se prepararon fracciones solubles e insolubles en bruto del cerebro de ratones transgénicos para Tau P301S y P301L mediante centrifugación diferencial. En resumen, los tejidos cerebrales de ratones transgénicos para tau P301S (médula espinal y tronco encefálico) y P301L (mesencéfalo y tronco encefálico) se homogeneizaron en TBS helado (Fisher Scientific) utilizando el homogeneizador manual Pellet Pestle Motor (Kontes) en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml en hielo. A continuación, los homogeneizados (H) se centrifugaron a 4000 g durante 10 min a 4 °C para eliminar los residuos de tejido. Los sobrenadantes resultantes (S0) se centrifugaron a 20000 g durante 20 min a 4 °C para proporcionar sobrenadantes correspondientes a la fracción soluble en bruto (S1). Los sedimentos restantes (P1) se resuspendieron en 1 ml de solución de sarcosilo al 1 % preparada en TBS, se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente y, a continuación, se centrifugaron a 100000 g durante 1 h a 4 °C. Los sobrenadantes (S2) se desecharon. Los sedimentos (P2) se lavaron con 5 ml de TBS helado y, a continuación, se resuspendieron en TBS para obtener la fracción insoluble en bruto (P2').

[0269] Preparación de células HEK-293-F que expresan tau humana con mutación P301S

[0270] Se transfectaron células HEK-293-F (Life Technologies) con el vector pcDNA3.1(+) que expresa la isoforma 2 de Tau humana con una mutación P301S, utilizando 293fectin (Life Technologies) según las instrucciones del fabricante. Las alícuotas de células transfectadas se almacenaron en nitrógeno líquido.

[0271] Inducción de la agregación de Tau

[0272] La figura 3 ilustra las diferentes etapas del ensayo de agregación celular utilizado para caracterizar la actividad de los anticuerpos terapéuticos contra Tau. El día 1, las células HEK-293-F que expresan la isoforma 2 de Tau humana con la mutación P301S (P301S-tau) se descongelaron a 37 °C y se diluyeron en medio de expresión 293 (Life Technologies) que contenía un 10 % de suero bovino fetal y un 1 % de penicilina-estreptomicina (FFBS). Las células se contaron utilizando un contador celular automático (Vi-CELL XR, Beckman Coulter) y, a continuación, se sembraron en placas de 96 pocillos recubiertas de poli-D-lisina (Greiner Bio-One) a una densidad de 25000 células vivas por pocillo. Las células se mantuvieron a 37 °C en CO<2>al 5 %. El mismo día, se incubó Tau insoluble humana sonicada procedente de pacientes con enfermedad de Alzheimer (EA-FHE, fracción 8) o parálisis supranuclear progresiva (PSP-FHE, fracción 8) o demencia frontotemporal (DFT-FHE, fracción 8) o fracciones cerebrales de cerebros de ratones transgénicos P301S o P301L, (utilizadas como semillas para inducir la agregación de Tau), con o sin anticuerpos anti-Tau en medio FFBS a 4 °C con agitación suave durante una noche. EA-FHE, fracción 8, se utilizó a 80 ng/µl y 60 ng/µl para las muestras de EA y PSP, respectivamente; la fracción cerebral soluble de los ratones transgénicos P301S y P301L se usó a 0,1 µg/µl y 1,2 µg/µl, respectivamente. El día 2, se aplicaron semillas o mezclas de semillas y anticuerpos durante 24 h. El día 3, el medio de cultivo se sustituyó por medio FFBS nuevo que contenía anticuerpo y las células se mantuvieron en cultivo durante 24 h adicionales. El día 4, la agregación de Tau se midió utilizando un kit de ensayo de agregación de tau (Cisbio) basado en la transferencia de energía de fluorescencia con resolución temporal homogénea (HTRF), según las instrucciones del fabricante. La fluorescencia se midió con SpectraMax Paradigm (Molecular Devices). La agregación se expresó como porcentaje de agregación en relación con el control (-), que corresponde a la respuesta de agregación máxima inducida por fibrillas o fracciones exógenas en ausencia del anticuerpo.

[0273] Se probó el efecto de AB1 y otros anticuerpos de unión a Tau de la técnica anterior sobre la agregación inducida de Tau. Los anticuerpos de la técnica anterior eran IPN002 del documento WO2014/028777A2, PT3 del documento WO2013/096380A2, mAb2.10.3 del documento WO2010/142423A2 y HJ8.5 del documento WO 2014/008404. Los resultados de este ensayo se resumen en la tabla 2 y la figura 4.

[0274] La tabla 2 resume la potencia (CI<50>) y la eficacia máxima (I<máx>a 300 nM) de AB1 que tiene un VL de rata de la SEQ ID NO: 7 y un VH de rata de la SEQ ID NO: 8, de un anticuerpo de unión a Tau que tiene la cadena ligera de la SEQ ID NO: 14 y la cadena pesada de la SEQ ID NO: 17 (L14H17), un anticuerpo de unión a Tau que tiene una cadena ligera de la SEQ ID NO: 14 y la cadena pesada de la SEQ ID NO: 18 (L14H18), y anticuerpos competidores contra una serie de semillas de Tau procedentes de diversos extractos cerebrales. Mientras que la figura 4 muestra la eficacia de un anticuerpo de unión a Tau que tiene la cadena ligera de la SEQ ID NO: 14 y la cadena pesada de la SEQ ID NO: 17 (L14H17), y de un anticuerpo de unión a Tau que tiene la cadena ligera de la SEQ ID NO: 14 y la cadena pesada de la SEQ ID NO: 18 (L14H18) en un ensayo de agregación celular en que se utilizan fibrillas patológicas de Tau humana procedentes de pacientes humanos con EA.

[0275] 3.2 Análisis histológico

[0276] El AB1 con un VL de rata de la SEQ ID NO: 7 y un VH de rata de la SEQ ID NO: 8 y los anticuerpos IPN002, PT3 y Mab2.10.3 de la técnica anterior se ensayaron y se determinó su concentración óptima utilizando criosecciones de hipocampo humano de un donante con enfermedad de Alzheimer que previamente había demostrado contener estructuras patológicas de Tau utilizando inmunotinción de AT8 (como se describe en Braak y Braak, 1995, Neurobiol Aging; 16(3):271-8). El AB1 y todos los anticuerpos de la técnica anterior presentaban una inmunorreactividad específica y dependiente de la concentración, aparte del 101.4 (anticuerpo de control negativo). A partir de estos datos, se seleccionó una única concentración óptima de anticuerpo y se usó para analizar un panel de seis muestras de cerebro humano. Tres muestras procedían de donantes con enfermedad de Alzheimer o de donantes de edad muy avanzada que presentaban niveles elevados de patología de Tau (patología de Tau positiva detectada mediante inmunotinción de AT8), y tres de donantes sin patología de Tau (patología de Tau negativa detectada mediante inmunotinción de AT8).

[0277] AB1 y IPN002 mostraron inmunotinción específica de ovillos neurofibrilares (NFT intraneuronales), tinción citoplasmática de ovillos neurofibrilares (NFT extraneuronales), estructuras de tipo placa neurítica e hilos neurófilos dentro de las muestras patológicas positivas para Tau. También mostraron inmunotinción en las muestras clasificadas con patología Tau negativa.

[0278] Los resultados de los experimentos 2 y 3 se resumen en las tablas 2 y 3:

[0279] Tabla 2

[0282]

[0284] Tabla 3

[0287]

[0289] <1>significa detección de Tau en muestras de patología de Tau confirmada.

[0290] <2>significa detección de Tau en muestras de patología de Tau negativa.

[0291] <3>significa la forma de Tau monomérica de la isoforma-2 de Tau monomérica expresada enE. coliy la isoforma-2 de Tau monomérica derivada de células HEK293 de mamífero.

[0292] <4>significa forma de Tau agregada de fibrillas FHE de Tau aisladas de pacientes con enfermedad de Alzheimer. N. d.: no determinado.

[0293] (*) eficacia máxima a 100 nM

[0294] 3.3 Transferencia de Western

[0295] Transferencias de Western realizadas mediante lectura quimioluminiscente: se cargaron homogeneizados preparados a partir de seres humanos con EA, PSP o de control en geles de poliacrilamida al 10 % (20 µg de proteína por carril). Las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico) y se electrotransfirieron a una membrana de PVDF (fluoruro de polivinilideno). Las membranas se bloquearon en BSA (seroalbúmina bovina) al 4 % en TBST: Tris 50 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,05 %, ajustar el pH con HCl a pH 7,6). Las membranas se incubaron durante una noche a 4 °C con anticuerpo primario o anticuerpo de control IgG no inmunitario, se aclararon en TBST, se incubaron con anticuerpo secundario durante 1 hora (de ratón anti-biotina), se aclararon en TBST, se incubaron con anticuerpo terciario durante 1 hora (IgG-peroxidasa anti-ratón), se aclararon en TBST y se revelaron utilizando exposiciones de película de ECL (quimioluminiscencia mejorada) de 2 a 5 minutos. Como alternativa, las transferencias de Western se realizaron mediante lectura fluorescente: homogeneizados (H), fracciones solubles (S1) e insolubles (P2') de ratones transgénicos para tau o la fracción 8 de EA-FHE se cargaron en geles NuPAGE® Novex de Bis-Tris 4-12 % (Life Technologies) y, a continuación, se separaron mediante SDS-PAGE. Las proteínas separadas se electrotransfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno utilizando el sistema de transferencia Trans-Blot® Turbo™ (Bio-Rad). Las membranas se bloquearon con tampón de bloqueo Odyssey® (LI-COR) y se incubaron durante una noche a 4 °C con diferentes anticuerpos primarios diluidos en el mismo tampón que contenía Tween-20 al 0,1 %. Los anticuerpos secundarios IRDye se diluyeron en tampón de bloqueo Odyssey® que contenía Tween-20 al 0,1 % y SDS al 0,01 % (1:5000; LI-COR) y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente, y la visualización se realizó utilizando el sistema de captura de imágenes Odyssey CLx (LI-COR). Los anticuerpos VR4295 (UCB Biopharma S.P.R.L), IPN002, PTR3 y Mab2.10.3 se utilizaron a 0,1-1 µg/ml. Anti-tau pS202/T205 (AT8; Thermo Scientific), anti-Tau pThr231 (AT180; Thermo Scientific) y anti-Tau total (HT7; Thermo Scientific) se utilizaron a una dilución de 1:200. Para controlar la carga, se analizaron las manchas de transferencia para β-actina (1:2000; Sigma). Las intensidades de las señales se cuantificaron con Image Studio 3.1 (Li-COR).

[0297] El AB1 con un VL de rata de la SEQ ID NO: 7 y un VH de rata de la SEQ ID NO: 8 y versiones humanizadas con una cadena ligera de la SEQ ID NO: 14 y una cadena pesada de la SEQ ID NO: 17 o una cadena ligera de la SEQ ID NO: 14 y una cadena pesada de la SEQ ID NO: 18 se unen a la Tau patológica de ratones transgénicos P301S y P301L y de muestras de pacientes humanos con EA, PSP y de control. Los tres anticuerpos muestran un patrón de unión similar mediante transferencia de Western y revelan en la EA y la PSP un patrón de bandas típico entre 50 y 75 kDa correspondiente a la Tau patológica de la EA y la PSP (véase la figura 5). El IPN002 mostró un comportamiento similar, mientras que los anticuerpos PTR3 y Mab2.10.3 se unen a la Tau patológica de ratones transgénicos P301S y P301L y se unen débilmente a la EA humana, pero presentan un patrón diferente por transferencia de Western. Los anticuerpos de control negativo 101.4 y A33 no revelaron ninguna señal significativa. Se utilizó actina como control de carga.

[0299] 3.4 Definición del epítopo de AB1

[0301] La unión al epítopo del anticuerpo AB1 con un VL de la SEQ ID NO: 7 y un VH de la SEQ ID NO: 8 se determinó mediante resonancia magnética nuclear de coherencia cuántica única heteronuclear (RMN HSQC) utilizando un fragmento Fab del anticuerpo.

[0303] Asignación de la cadena principal de la isoforma 4 de Tau

[0305] Las muestras de RMN tenían normalmente un volumen de 350 µl con una concentración de proteína de 270 µM de la isoforma 4 de Tau humana marcada con<2>H/<13>C/<15>N en tubos Shigemi de 5 mm. Las condiciones de tampón fueron NaCl 100 mM, fosfato sódico 25 mM, pH 6,4, AEBSF 10 µM, NaN<3>al 0,02 %. Todos los experimentos se registraron a 20 °C en espectrómetros Bruker DRX de 600 MHz o Bruker Avance de 800 MHz equipados con sondas refrigeradas criogénicamente. Las conexiones secuenciales entre las señales de RMN de la cadena principal de los restos de la proteína, H<N>(i)-N(i)-N(i±1), se realizaron utilizando un experimento 3D (H)N(CA)NNH (Weisemannet al., 1993 3D Triple-resonance NMR techniques for the sequential assignment of NH and 15N resonances in 15N- and 13C-labelled proteins. J. Biomol. NMR 3. doi:10.1007/BF00242479) registrado con anchuras espectrales de 1640, 1640 y 7000 Hz y tiempos de adquisición de 120 (F1), 120 (F2) y 150 (F3) ms en las dimensiones<15>N,<15>N y<1>H, respectivamente, con 8 exploraciones por incremento y un retardo de relajación de 1,5 s. Se empleó un muestreo no uniforme con una densidad de muestreo del 13 % (5200 de 40000 puntos hipercomplejos), lo que supuso un tiempo total de adquisición de 3,5 días. Se confirmaron las conexiones secuenciales y se identificaron los tipos de residuos mediante experimentos HNCA (Grzesiek y Bax, 1992 Improved 3D triple-resonance NMR techniques applied to a 31 kDa protein. J. Magn. Reson. 96, 432-440. doi:10.1016/0022-2364(92)90099-S) y HNCACB (Wittekind y Mueller, 1993 HNCACB, a High-Sensitivity 3D NMR Experiment to Correlate Amide-Proton and Nitrogen Resonances with the Alpha- and Beta-Carbon Resonances in Proteins. J. Magn. Reson. Ser. B 101, 201-205. doi:10.1006/jmrb.1993.1033). El experimento HNCA se registró con anchuras espectrales de 1640, 4830 y 6600 Hz y tiempos de adquisición de 24 (FI), 6,6 (F2) y 80 (F3) ms en las dimensiones<15>N,<13>C y<1>H respectivamente (8 exploraciones por incremento, retardo de relajación de 1,5 s, 19 horas de tiempo total de adquisición) mientras que el HNCACB se registró con anchuras espectrales de 9800, 1640 y 6600 Hz y tiempos de adquisición de 6 (F1), 24 (F2) y 80 (F3) ms en las dimensiones<13>C,<15>N y<1>H respectivamente (8 exploraciones por incremento, retardo de relajación de 1,5 s, 1,5 días de tiempo total de adquisición). Los espectros de RMN se procesaron utilizando NMRPipe (Delaglioet al., 1995 NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR 6, 277-93) con reconstrucción de los datos de NUS realizada mediante el método iterativo de umbrales suaves de Harvard (Hybertset al., 2012). El análisis de los datos se realizó mediante Sparky (Goddard y Kneller, D. G. SPARKY 3. In., Universidad de California, San Francisco), lo que dio lugar a la asignación de las resonancias del protón de amida y del nitrógeno de 304 restos, correspondiente al 96 % de los restos (excluidos los restos de prolina y la glicina N-terminal).

[0307] Cartografía del sitio de unión de AB1:

[0309] La cartografía del sitio de unión de AB1 se llevó a cabo utilizando muestras de<2>H/<13>C/<15>N marcadas con la isoforma 4 de Tau humana, con una concentración que varía entre 80 y 150 µM y con un exceso molar del 10 % del Fab de AB1 correspondiente. Las muestras se prepararon en el mismo tampón como se ha descrito anteriormente para la asignación de cadena principal de la Tau. Los cambios de desplazamiento químico<1>H,<15>N y<13>C se determinaron a partir de espectros de HNCO (Grzesiek y Bax, 1992 Improved 3D triple-resonance NMR techniques applied to a 31 kDa protein. J. Magn. Reson. 96, 432-440. doi:10.1016/0022-2364(92)90099-S) registrados en las muestras del complejo Tau/Fab, así como en una muestra de la Tau libre (como se ha descrito anteriormente). Los experimentos HNCO se registraron con anchuras espectrales de 2190, 2210 y 8800 Hz y tiempos de adquisición de 25 (F1), 29 (F2) y 80 (F3) ms en las dimensiones<15>N,<13>C y<1>H respectivamente (8 exploraciones por incremento, retardo de relajación de 1,8 s), con NUS empleado utilizando densidades de muestreo del 25-35 %, reduciendo el tiempo total de adquisición de 60 a 15-21 horas. Los cambios de desplazamiento químico se analizaron utilizando el enfoque de desplazamiento mínimo (Williamsonet al., 1997 Mapping the binding site for matrix metalloproteinase on the N-terminal domain of the tissue inhibitor of metalloproteinases-2 by NMR chemical shift perturbation. Biochemistry 36, 13882-9. doi: 10.1021/bi9712091), prácticamente como se ha descrito anteriormente (Veverkaet al., 2008 Structural characterization of the interaction of mTOR with phosphatidic acid and a novel class of inhibitor: compelling evidence for a central role of the FRB domain in small molecule-mediated regulation of mTOR. Oncogene 27, 585-95. doi: 10.1038/sj.onc.1210693), con la excepción de una modificación de la ecuación utilizada para calcular el cambio de desplazamiento químico combinado (Δδ) para incluir el desplazamiento químico del carbonilo, lo que da lugar a la siguiente ecuación:

[0312]

[0314] donde Δδ<HN>, Δδ<N>y Δδ<C>son las diferencias en los desplazamientos químicos de<1>H,<15>N y<13>C respectivamente. αN y αC corresponden a factores de escala de 0,2 y 0,35, respectivamente, utilizados para tener en cuenta las diferencias en los intervalos de los desplazamientos químicos del protón de amida, el nitrógeno y el carbonilo.

[0315] Para identificar los sitios de unión de Fab (epítopos) en Tau, se utilizó un histograma del desplazamiento mínimo combinado frente a la secuencia proteica para revelar las regiones de Tau que contienen señales significativamente alteradas. Si el tamaño del cambio de desplazamiento químico combinado para los aminoácidos individuales superaba un valor umbral de la media del cambio de desplazamiento químico combinado para todos los aminoácidos más una desviación típica desde esa media, estos restos se seleccionaron para su posterior evaluación como posibles restos de contacto en el sitio de unión al Fab.

[0316] Se identificaron como restos significativamente perturbados aquellos cuyo desplazamiento mínimo era al menos mayor que la media más una desviación típica de todos los desplazamientos calculados. Se aplicaron cuatro umbrales diferentes para identificar los restos a los que se une el Fab. Los restos que intervienen en el sitio de unión se puntúan con un rigor cada vez mayor como: aquellos cuyo desplazamiento mínimo supera la media más una desviación típica de todos los desplazamientos calculados (que es >0,009817); aquellos cuyo desplazamiento mínimo supera la media más dos desviaciones típicas de todos los desplazamientos calculados (que es >0,016913); aquellos cuyo desplazamiento mínimo supera la media más tres desviaciones típicas de todos los desplazamientos calculados (que es >0,024009); aquellos cuyo desplazamiento mínimo supera la media más cuatro desviaciones típicas de todos los desplazamientos calculados (que es >0,031105). En este análisis, los restos de prolina no pueden identificarse, ya que no contienen ningún protón de amida.

[0317] Por lo tanto, el epítopo de Fab AB1 se define con mayor rigor como la media más una desviación típica de todos los desplazamientos calculados: A246, A239, S241, T245, S238, S235, K240, Q244, S237, V248, L243, M250, R242; media más dos desviaciones típicas de todos los desplazamientos calculados: A246, A239, S241, T245, S238, S235, K240, Q244, S237; media más tres desviaciones típicas de todos los desplazamientos calculados: A246, A239, S241, T245, S238, S235, K240, Q244; media más cuatro desviaciones típicas de todos los desplazamientos calculados: A246, A239, S241, T245, S238.

[0318] Utilizando la numeración de aminoácidos empleada en la secuencia de referencia del NCBI NP_005901.2 (SEQ ID NO: 35) se observó que el AB1 se unía al menos a los siguientes restos (media 3 DT) A246, A239, S241, T245, S238, S235, K240, Q244. El anticuerpo puede unirse a todos los restos siguientes (media 1 DT) A246, A239, S241, T245, S238, S235, K240, Q244, S237, V248, L243, M250, R242.

[0319] Experimento 4 - Humanización de anticuerpos identificados

[0320] El anticuerpo AB1 con un VL de la SEQ ID NO: 7 y un VH de la SEQ ID NO: 8 se humanizó injertando las CDR de las regiones V de los anticuerpos de rata en los armazones de las regiones V de los anticuerpos de la estirpe germinal humana.

[0321] Para recuperar la actividad del anticuerpo, en la secuencia humanizada también se conservaron algunos restos estructurales de las regiones V de rata o conejo. Estos restos se seleccionaron siguiendo el protocolo descrito por Adairet al.(1991) (Humanised antibodies. WO91/09967). En las figuras 1 y 2 se muestran las alineaciones de las secuencias de la región V del anticuerpo de rata (donantes) con las secuencias de la región V de la estirpe germinal humana (aceptoras), junto con las secuencias humanizadas diseñadas. Las CDR injertadas de la secuencia donante a la aceptora son las definidas por Kabat (Kabatet al., 1987), con la excepción de la CDR-H1, donde se utiliza la definición combinada de Chothia/Kabat (véase Adairet al., 1991 Humanised antibodies, WO91/09967).

[0322] La región V humana IGRV2-29 más región JR2 (IMGT, http://www.imgt.org/) (SEQ ID NO: 31) se eligió como aceptora de las CDR de la cadena ligera del anticuerpo AB1. Los restos estructurales de la cadena ligera en el injerto gVL3_AB1 (SEQ ID NO: 14) proceden todos del gen de la estirpe germinal humana.

[0323] La región V humana IGHV4-59 más región J de JH3 (IMGT, http://www.imgt.org/) (SEQ ID NO: 32) se eligió como aceptora de las CDR de la cadena pesada del anticuerpo AB1. Los restos estructurales de la cadena pesada en los injertos gVH17_ABl (SEQ ID NO: 17) y gVH18_AB1 (SEQ ID NO: 18) proceden todos del gen de la estirpe germinal humana, a excepción del resto 48 (numeración de Kabat), donde se conservó el resto donante metionina (M48). La conservación del resto M48 permitió la plena potencia del anticuerpo humanizado. El resto de glutamina en la posición 1 del armazón humano se sustituyó por ácido glutámico (E1) para permitir la expresión y purificación de un producto homogéneo: la conversión de glutamina en piroglutamato en el extremo N de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos está ampliamente descrita. La CDRH2 de las SEQ ID NO: 37 y 38 se mutó en los injertos gVH17_AB1 y gVH18_AB1 respectivamente para modificar un posible sitio de desamidación.

[0325] Los genes que codifican una serie de variantes de las secuencias de las regiones V de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo se diseñaron y construyeron mediante un método de síntesis automática por DNA2.0 Inc. Se crearon otras variantes de las regiones V de las cadenas pesada y ligera modificando los genes VH y VK mediante mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, incluyendo, en algunos casos, mutaciones dentro de las CDR para modificar posibles sitios de desamidación. Para expresión transitoria en células de mamífero, los genes de la región V de la cadena ligera humanizada se clonaron en el vector de expresión de la cadena ligera humana de UCB pMhCK, que contiene ADN que codifica la región constante de la cadena Kappa humana (alotipo Km3). Los genes humanizados de la región V de la cadena pesada se clonaron en el vector de expresión de la cadena pesada gamma-4 humana de UCB pMhγ4P FL, que contiene ADN que codifica la región constante de la cadena pesada gamma-4 humana con la mutación estabilizadora de bisagra S241P (Angalet al., Mol Immunol. 1993, 30(1): 105-8). Como alternativa, los genes humanizados de VH se clonaron en el vector de expresión de la cadena pesada gamma-1 humana de UCB pMhγ1FL, que contiene ADN que codifica la región constante de la cadena pesada gamma-1 humana (alotipo G1m17, 1). Para evaluar la cinética de unión monovalente de los anticuerpos humanizados, los genes VH humanizados también se clonaron en el vector de expresión de Fab-HIS humano de UCB pMhFab10HIS, que contiene ADN que codifica el dominio de CH1-bisagra gamma-1 humano con un marcador C-terminal de diez restos de histidina: el marcador de histidina facilita la purificación de los Fab expresados mediante cromatografía de afinidad. La cotransfección de los vectores de cadena pesada y ligera resultantes en células en suspensión HEK293 se consiguió utilizando 293 Fectin (12347-019 Invitrogen), y dio lugar a la expresión de los anticuerpos recombinantes humanizado en los formatos IgG4P, IgG1 o Fab-HIS humanos.

[0327] Las cadenas de anticuerpos humanizados variantes, y combinaciones de los mismos, se expresaron y se evaluó su potencia en relación con el anticuerpo original, sus propiedades biofísicas y su idoneidad para el procesamiento posterior.

[0329] Para la expresión estable de los anticuerpos recombinantes humanizados en células de mamífero, el gen de la región V de la cadena ligera humanizada se unió a una secuencia de ADN que codifica la región constante C-Kappa humana (alotipo Km3), para crear un gen contiguo de la cadena ligera. Los genes humanizados de la cadena pesada se unieron al ADN que codifica la región constante de la cadena pesada humana gamma-4P, o la región constante de la cadena pesada humana gamma-1 (alotipo G1m17, 1), para crear genes de cadena pesada contiguos. Los genes de las cadenas pesada y ligera se clonaron en un vector de expresión de mamíferos.

[0331] Experimento 5 - Medición de la estabilidad térmica

[0333] La temperatura de fusión (Tm), o temperatura en el punto medio de desplegamiento, se determinó mediante el ensayo Thermofluor. En este método, se utilizó el colorante fluorescente SYPRO orange para supervisar el proceso de desplegamiento de la proteína mediante su unión a regiones hidrófobas que quedan expuestas a medida que aumenta la temperatura.

[0335] La mezcla de reacción contenía 5 µl de colorante SYPRO® Orange 30x (Invitrogen), diluido con PBS a partir de una disolución madre 5000X y 45 µl de muestra a 0,12 mg/ml, (en PBS a pH 7,4). Se dispensaron 10 µl de la mezcla por cuadruplicado en una placa de 384 pocillos ópticos de PCR y se procesaron en un sistema de PCR en tiempo real rápida 7900HT (Applied Biosystems). El dispositivo de calentamiento del sistema de PCR se ajustó entre 20 °C y 99 °C con una velocidad de aumento de 1,1 °C/min. Se supervisaron los cambios de fluorescencia en los pocillos con un dispositivo de carga acoplada. Se trazaron los aumentos de intensidad y se utilizó el punto de inflexión de la(s) pendiente(s) para calcular la Tm como se describe a continuación.

[0337] El análisis de anticuerpos que contienen la cadena ligera de la SEQ ID NO: 14 y una cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 12 o la SEQ ID NO: 13 para los isotipos IgG1 (cadena ligera de la SEQ ID NO: 14 y cadena pesada de la SEQ ID NO: 54 (L14/H54), o cadena ligera de la SEQ ID NO: 14 y cadena pesada de la SEQ ID NO: 55 (L14/H55)) e IgG4 (cadena ligera de la SEQ ID NO: 14 y cadena pesada de la SEQ ID NO: 17 (L14/H17), o cadena ligera de la SEQ ID NO: 14 y cadena pesada de la SEQ ID NO: 18 (L14/H18)) se muestra en la figura 6 y en la tabla 3 a continuación. Se observaron dos dominios de desplegamiento para ambos isotipos. El primero puede atribuirse a la Tm del dominio CH2; en el caso del isotipo IgG1, resultó ser superior (más estable) al formato IgG4, de acuerdo con la bibliografía (Garber E, Demarest SJ. Biochem Biophys Res Commun. 13 abril de 2007;355(3):751-7). El segundo dominio de desplegamiento puede atribuirse a un promedio de la Tm del dominio de desplegamiento Fab y del dominio CH3.

[0338]

[0340] Experimento 6 - Cristalografía de rayos X

[0341] La interacción entre un anticuerpo de unión a Tau que tiene la cadena ligera de la SEQ ID NO: 14 y la cadena pesada de la SEQ ID NO: 18 (L14H18) y un péptido que consiste en los restos 234 a 250 de Tau como se define en la SEQ ID NO: 35 (péptido, N-acetil-KSPSSAKSRLQTAPVPM-amida definido en la SEQ ID NO: se estudió mediante cristalografía de rayos X.

[0342] Cristalización, determinación de la estructura y refinamiento de la estructura cristalina del péptido tau en complejo con Fab L14H18.

[0343] Cristalización

[0344] El complejo Fab L14H18/péptido tau 234-250 cristalizó a partir de una gota en reposo a través de la fase de vapor frente a un depósito que contenía 30 % p/v de polietilenglicol 4000, HEPES 0,1 M, pH 7,5, cloruro cálcico 0,2 M deshidratado durante 1-2 semanas en placas MRC.

[0345] Las gotas contenían 400 nl de proteína Fab L14H18 a 11 mg/ml con un exceso molar de 2 de péptido tau 234-250 y 400 nl de solución de reserva.

[0346] Los cristales pertenecen al grupo espacial P 3121, con dos copias del Fab L14H18/péptido tau 234-250 en la unidad asimétrica.

[0347] Recopilación de difracción de rayos X

[0348] Se recopilaron los datos de difracción de rayos X a través de un único cristal de Fab L14H18/péptido tau 234-250. El cristal se suspendió en un LithoLoop y se congeló instantáneamente con nitrógeno líquido, tras pasar brevemente por una solución crioprotectora que contenía 30 % de polietilenglicol 4000, cloruro de calcio 0,2 M, tampón HEPES 0,1 M a pH 7,5 y 10 % de etilenglicol. Los datos de difracción se recogieron en un Pilatis 6M en la estación de la línea de luz 104-1 del sincrotrón Diamond, Didcot, Oxfordshire, Reino Unido. La longitud de onda del haz monocromático de rayos X fue de 0,92819Å<ሖ>. El espacio recíproco se muestreó en pasos de oscilación de 0,2° alrededor del eje φ goniostático. El archivo XIA de datos procesados proporcionado por la instalación de sincrotrón se usó para determinar la estructura Determinación de la estructura

[0349] La posición de Fab se localizó mediante el programa de sustitución molecular Phaser (Read, RJ, Acta Cryst. D57, 1373-1382 (2001)), usando el Fab con código PDB 4HIX. El coeficiente de Matthews indicaba un peso molecular probable de 100 kDa en la celda unitaria, la solución encontró 2 copias del Fab en la unidad asimétrica.

[0350] Creación y perfeccionamiento del modelo

[0351] Mediante mapas de densidad electrónica 2Fo-Fc y Fo-Fc, los restos de la molécula Fab se sustituyeron según la secuencia del Fab L14H18 con las posiciones guiadas por los mapas de densidad electrónica.

[0352] Las cadenas C y D del Fab para la segunda copia del Fab tenían una densidad más clara que la primera copia (cadenas H y L).

[0353] Se observó una densidad electrónica adicional adyacente a las CDR de una copia del Fab (cadenas C y D). Esto reveló una cadena peptídica con una estructura helicoidal en la que podía incorporarse parte de la secuencia del péptido 234-250. El péptido se alineó utilizando una densidad clara para los residuos de arginina y lisina y, a continuación, se construyó según la secuencia conocida. Otros ciclos de construcción y refinamiento del modelo mejoraron la densidad para la región peptídica y mostraron cierta densidad para un péptido unido a la otra copia del Fab (cadenas H y L).

[0354] Para la construcción del modelo se utilizó el programa informático Coot (Emsley P., Lohkamp B., Scott W.G., Cowton K. Acta Crystallography D Biol Crystallography, abril de 2010; 66 (Pt 4): 486 - 501). El refinamiento se llevó a cabo utilizando el programa REFMAC (Murshudov G.N., Skubak P., Lebedev A.A., Pannu N.S., Steiner R.A., Nicholls R.A., Winn M.D., Long F., Vagin A.A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr abril de 2011; 67 (Pt 4): 355-67).

[0355] El modelo del complejo de Fab L14H18/péptido Tau 234-250 consiste en los restos 234-244 del péptido Tau definido en la SEQ ID NO: 35, los restos 2-219 de la cadena pesada y 1-219 de la cadena ligera.

[0356] El factor R del modelo es 0,234 y el R-libre es 0,291 para 36483 reflejos. La desviación rms de la geometría estándar es de 0,0145 para las longitudes de enlace y de 1,93 para los ángulos de enlace.

[0357] El epítopo

[0358] La interacción entre el anticuerpo L14H18 y el péptido tau, N-acetil-KSPSSAKSRLQTAPVPM-amida (basada en la secuencia 234 a 250 de la isoforma 2 de tau humana), se estudió mediante cristalografía de rayos X utilizando un cocomplejo preparado a partir del fragmento Fab L14H18 incubado con el péptido. La estructura resultante reveló los principales sitios de contacto entre el Fab L14H18 y el péptido tau, y se identificaron como agrupados principalmente en los bucles de CDR del anticuerpo y los restos del péptido SPSSAKSRLQ correspondientes a los restos 235-244 de la proteína tau. Según la secuencia de numeración, como se muestra en la SEQ ID NO: 35, los restos que interactúan más estrechamente con la región CDR del Fab L14H18 en un intervalo de 5,0 A son S235, P236, S237, S238, A239, K240, R242, L243, Q244 y T245.

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado de unión a Tau o fragmento de unión del mismo, en donde dicho anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo comprende

una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 seleccionada de la SEQ ID NO: 1, una CDR2 seleccionada de la SEQ ID NO: 2 y una CDR3 seleccionada de la SEQ ID NO: 3; y

una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 seleccionada de la SEQ ID NO: 4, una CDR2 seleccionada de la SEQ ID NO: 5 y una CDR3 seleccionada de la SEQ ID NO: 6.

2. Un anticuerpo aislado de unión a Tau o fragmento de unión del mismo de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo comprende

una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 9 y

una región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 12 o 13.

3. Un anticuerpo aislado de unión a Tau o fragmento de unión del mismo de la reivindicación 2, en donde dicho anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo comprende

una cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 14, y/o

una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 17 o 18.

4. Un anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo de la reivindicación 2 o 3, en donde dicho anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo comprende

una cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 14 y

una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 18.

5. Un anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo es un anticuerpo monoclonal humanizado.

6. Un anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 o 5, en donde dicho anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo se une tanto a filamentos solubles humanos como a filamentos helicoidales emparejados (FHE) de tau humana.

7. Una molécula o moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican la cadena ligera y pesada de un anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5 o 6, en donde dichas cadenas ligera y pesada están codificadas por la misma molécula de ácido nucleico aislada o por moléculas de ácido nucleico separadas.

8. Un vector o vectores de clonación o de expresión que comprenden la o las secuencias de ácido nucleico de la reivindicación 7.

9. Una célula hospedadora que comprende la o las secuencias de ácido nucleico de la reivindicación 7 o el o los vectores de clonación o expresión de la reivindicación 8.

10. Un método para producir un anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 o 5, que comprende al menos las etapas de

a) cultivar una célula hospedadora de la reivindicación 9, y

b) aislar dicho anticuerpo de unión a Tau o fragmento de unión del mismo.

11. Un anticuerpo aislado de unión a Tau o fragmento de unión del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5 o 6, para usar como agente terapéuticamente activo.

12. Un anticuerpo aislado de unión a Tau o fragmento de unión del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5 o 6, para su uso en el tratamiento de una tauopatía.

13. Un anticuerpo aislado de unión a Tau o fragmento de unión del mismo para el uso de la reivindicación 12, en donde dicha tauopatía es la enfermedad de Alzheimer o la parálisis supranuclear progresiva.

14. Un anticuerpo aislado de unión a Tau o fragmento de unión del mismo de cualquiera de la reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5 o 6 para usar en un método de diagnósticoin vivo.

15. Un anticuerpo aislado de unión a Tau o fragmento de unión del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5 o 6, para usar en un métodoin vivode diagnóstico de una tauopatía.

16. Un anticuerpo aislado de unión a Tau o fragmento de unión del mismo para el uso de la reivindicación 15, en donde dicha tauopatía es la enfermedad de Alzheimer o la parálisis supranuclear progresiva.

17. Uso del anticuerpo de unión a Tau aislado o fragmento de unión del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5 o 6 en el diagnósticoin vitro.