MD3319983T2 - Anticorpi de legare a TAU - Google Patents

Abstract

Prezenta invenţie se referă la anticorpi de legare TAU şi fragmente de legare ale acestora. Invenţia se referă, de asemenea, la molecule izolate de acid nucleic care codifică lanţul uşor şi/sau greu al anticorpilor respectivi, la un vector de clonare sau expresie, la o celulă gazdă care produce anticorpii respectivi şi la o metodă de producere a anticorpilor respectivi şi a fragmentelor lor de legare. Un obiectiv al prezentei invenţii este, printre altele, de a furniza agenţi pentru tratarea sau diagnosticarea tauopatiilor, cum ar fi boala Alzheimer (BA) sau paralizia supranucleară progresivă (PSP).

Description

[0001] DOMENIUL INVENŢIEI

[0002] Prezenta invenţie se referă, printre altele, la anticorpi terapeutici şi diagnostici care leagă proteinele Tau şi la fragmente de legare ale acestora, la metode de fabricare a acestor anticorpi şi la utilizarea lor pentru tratarea şi/sau diagnosticarea tauopatiilor precum boala Alzheimer; scleroza laterală amiotrofică/complexul parkinsonism-demenţă; boala argirofilic a granulelor; encefalopatia traumatică cronică; degenerarea corticobazală; încurcături neurofibrilare difuze cu calcificare; sindromul Down; demenţă britanică familială; demenţă daneză familială; demenţă frontotemporală şi parkinsonism legate de cromozomul 17 cauzate de mutaţii MAPT; boala Gerstmann-Straussler-Scheinker; parkinsonism guadelupean; distrofie miotonică; neurodegenerare cu acumulare de fier în creier; boala Niemann-Pick, tip C; boala neuronului motor non-guamanian cu încurcături neurofibrilare; boala Pick; parkinsonism postencefalitic; angiopatie amiloidă cerebrală cauzată de proteine prionice; glioză subcorticală progresivă; paralizie supranucleară progresivă; Retard mintal asociat cu SLC9A6; Panencefalită sclerozantă subacută; Demenţă cu gene încurcate; Tauopatie a substanţei albe cu incluziuni gliale globulare (Clavaguera et al. Brain Pathology 23 (2013) 342-349). Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la metode de tratare a unui subiect uman care suferă de sau este suspectat a fi predispus la tauopatiile descrise mai sus, în special tauopatii precum boala Alzheimer şi paralizia supranucleară progresivă.

[0003] STADIUL TEHNICII AL INVENŢIEI

[0004] Boala Alzheimer (AD) şi boala supranucleară progresivă (PSP) sunt boli neurodegenerative cu nevoi medicale neacoperite ridicate, costuri ridicate pentru sistemele de sănătate ale societăţii şi povară mare pentru familiile afectate. Semnele clinice ale bolii Alzheimer includ pierderea memoriei, a cogniţiei, a raţionamentului, a judecăţii şi a stabilităţii emoţionale şi, în cele din urmă, decesul. PSP implică probleme grave şi progresive de control al mersului şi echilibru, căderi, tulburări de mişcare verticală a ochilor, probleme cognitive, depresie, apatie şi demenţă uşoară. Simptomele tardive includ vedere înceţoşată, mişcări oculare necontrolate, vorbire neclară, dificultăţi la înghiţire şi moarte.

[0005] Timp de mai bine de un deceniu, programele de modificare a bolii AD au vizat beta-peptida amiloidă prin diverse mecanisme. În schimb, s-au înregistrat mult mai puţine progrese în abordarea patologiei intracelulare a proteinei Tau, a doua caracteristică majoră a bolii AD. Incluziunile neurofibrilare sau încurcăturile care conţin proteine Tau agregate, hiperfosforilate, sunt caracteristici definitorii ale patologiei Alzheimer şi ale unei serii de alte tauopatii, inclusiv a proteinei proteice prostatice.

[0006] În aceste boli există o corelaţie puternică între progresia simptomatică şi nivelul şi distribuţia agregatelor Tau intraneurale. În boala Alzheimer, încurcăturile neuronale Tau apar mai întâi în cortexul transentorinal, de unde se răspândesc în hipocampus şi neocortex. Încurcăturile observate în neuronii AD constau din Tau insolubil agregat, hiperfosforilat. S-a propus că efectele toxice directe ale speciilor patologice de Tau şi/sau pierderea transportului axonal din cauza sechestrării Tau funcţionale în forme hiperfosforilate şi agregate, care nu mai sunt capabile să susţină transportul axonal, contribuie la boală.

[0007] În starea sa non-patologică, Tau este o proteină citoplasmatică de legare a microtubulilor, extrem de solubilă, care apare în sistemul nervos central (SNC) uman în 6 izoforme principale datorită splicingului alternativ, cu o lungime cuprinsă între 352 şi 441 de aminoacizi. Aceste izoforme pot avea zero, unul sau două inserţii N-terminale (0N, 1N, 2N) şi fie trei, fie patru secvenţe „repetate» C-terminale (3R sau 4R). Aceste secvenţe repetitive C-terminale de 30-32 de aminoacizi, R1, R2, R3 şi R4, constituie împreună regiunea de legare a microtubulilor Tau (MTBR). Într-adevăr, se crede că rolul principal al proteinei Tau este în asamblarea şi stabilizarea microtubulilor axonali. Microtubulii formează căi pentru transportul axonal şi elemente citoscheletale pentru creşterea celulară (Clavaguera et al, Brain Pathology 23 (2013) 342-349). S-a demonstrat că trei izoforme Tau conţin trei regiuni de legare a microtubulilor (MTBR):

[0008] - izoforma 4, denumită şi 3R0N, secvenţa de referinţă NCBI NP_058525.1 (352 aminoacizi),

[0009] - izoforma 7, denumită şi 3R1N, secvenţa de referinţă NCBI NP_001190180.1 (381 aminoacizi)

[0010] - izoforma 8, denumită şi 3R2N, secvenţa de referinţă NCBI NP_ 001190181.1 (410 aminoacizi).

[0011] În timp ce celelalte trei izoforme Tau conţin patru MTBR-uri:

[0012] - izoforma 2, denumită şi 4R2N, secvenţa de referinţă NCBI NP_005901.2 (441 aminoacizi),

[0013] - izoforma 3, denumită şi 4R0N, secvenţa de referinţă NCBI NP_058518.1 (383 aminoacizi) şi

[0014] - izoforma 5, denumită şi 4R1N, secvenţa de referinţă NCBI NP_001116539.1 (412 aminoacizi).

[0015] În prezent, pentru aceste boli sunt disponibile doar tratamente simptomatice cu eficacitate uşoară sau inexistentă. În prezent, nu există niciun tratament disponibil pentru încetinirea sau, în mod ideal, oprirea dezvoltării bolii. Prin urmare, există în continuare o nevoie în domeniu de noi compuşi şi compoziţii utile în tratamentul tauopatiilor.

[0016] Sunt menţionate şi următoarele documente:

[0017] • WO 2013/096380, care se referă la anticorpi anti-PHF şi utilizările acestora;

[0018] şi

[0019] • WO 2014/028777, care se referă la metode de tratare a tauopatiei.

[0020] OBIECTIVE ŞI REZUMATUL INVENŢIEI

[0021] Un obiectiv al prezentei invenţii este, printre altele, de a furniza agenţi pentru tratarea sau diagnosticarea tauopatiilor, cum ar fi boala Alzheimer (BA) sau paralizia supranucleară progresivă (PSP).

[0022] Aceste obiective şi altele, aşa cum vor deveni evidente din descrierea care urmează, sunt atinse prin obiectul revendicărilor independente. Unele dintre aspectele şi formele de realizare specifice ale acestora, avute în vedere în prezenta dezvăluire, formează obiectul revendicărilor dependente. Alte aspecte şi forme de realizare ale acestora, aşa cum sunt avute în vedere în prezenta dezvăluire, pot fi preluate din descrierea care urmează.

[0023] Prezenta invenţie oferă un anticorp izolat care se leagă de Tau sau un fragment de legare al acestuia, în care anticorpul sau fragmentul de legare al acestuia cuprinde

[0024] o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde o CDR1 selectată din SEQ ID No.: 1, , o CDR2 selectată din SEQ ID No.: 2 şi o CDR3 selectată din SEQ ID No.: 3 ;

[0025] şi

[0026] o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde o CDR1 selectată din SEQ ID NO.:4,

[0027] o CDR2 selectată din SEQ ID No.: şi o CDR3 selectată din SEQ ID No.: 6.

[0028] Prezenta invenţie oferă în plus o moleculă sau molecule izolate de acid nucleic care codifică lanţul uşor şi greu al unui anticorp care se leagă de Tau sau al unui fragment de legare al acestuia din prezenta invenţie, în care lanţul uşor şi greu menţionat sunt codificate de aceeaşi moleculă izolată de acid nucleic sau de molecule separate de acid nucleic.

[0029] Prezenta invenţie oferă, de asemenea, un vector sau mai mulţi vectori de clonare sau expresie care cuprind una sau mai multe secvenţe de acid nucleic ale prezentei invenţii.

[0030] Prezenta invenţie oferă, de asemenea, un vector sau mai mulţi vectori de clonare sau expresie care cuprind una sau mai multe secvenţe de acid nucleic ale prezentei invenţii.

[0031] Prezenta invenţie oferă, de asemenea, o celulă gazdă care cuprinde una sau mai multe secvenţe de acid nucleic ale prezentei invenţii sau unul sau mai mulţi vectori de clonare sau expresie ai prezentei invenţii.

[0032] Prezenta invenţie oferă, de asemenea, o metodă de producere a unui anticorp de legare a Tau-ului sau a unui fragment de legare al acestuia, conform prezentei invenţii, cuprinzând cel puţin etapele de

[0033] a) cultivare a unei celule gazdă conform prezentei invenţii şi

[0034] b) izolare a anticorpului de legare a Tau-ului sau a fragmentului de legare al acestuia.

[0035] Prezenta invenţie oferă, de asemenea, un anticorp izolat de legare a Tau-ului sau un fragment de legare al acestuia, conform prezentei invenţii, pentru utilizare ca agent terapeutic activ.

[0036] Prezenta invenţie oferă, de asemenea, un anticorp izolat de legare a Tau-ului sau un fragment de legare al acestuia, conform prezentei invenţii, pentru utilizare în tratarea unei taupatii.

[0037] Prezenta invenţie oferă, de asemenea, un anticorp izolat care se leagă de Tau sau un fragment de legare al acestuia, conform prezentei invenţii, pentru utilizare într-o metodă de diagnostic in vivo.

[0038] Prezenta invenţie oferă în plus un anticorp izolat care leagă Tau sau un fragment de legare al acestuia, conform prezentei invenţii, pentru utilizare într-o metodă in vivo pentru diagnosticarea unei tauopatii.

[0039] Prezenta invenţie oferă, de asemenea, utilizarea anticorpului izolat care leagă Tau sau a fragmentului de legare al acestuia, conform prezentei invenţii, în diagnosticul in vitro.

[0040] Într-un exemplu de realizare, anticorpul izolat care leagă Tau sau fragmentul de legare al acestuia furnizat poate fi un anticorp monoclonal sau un fragment de legare al acestuia, care poate fi un anticorp himeric, umanizat sau complet uman sau un fragment de legare al acestuia.

[0041] Într- un exemplu de realizare, anticorpul izolat care leagă Tau sau fragmentul de legare al acestuia furnizat poate fi un anticorp monoclonal sau un fragment de legare al acestuia, care poate fi un anticorp himeric sau un fragment de legare al acestuia.

[0042] Într- un exemplu de realizare, anticorpul izolat care leagă Tau sau fragmentul de legare al acestuia furnizat poate fi un anticorp monoclonal sau un fragment de legare al acestuia, care poate fi un anticorp umanizat sau un fragment de legare al acestuia.

[0043] Într- un exemplu de realizare, anticorpul sau fragmentul de legare al acestuia din prezenta invenţie poate fi un anticorp monoclonal sau un fragment de legare al acestuia, care poate fi un anticorp umanizat sau un fragment de legare al acestuia.

[0044] Anticorpii şi fragmentele de legare ale acestora din prezenta invenţie pot fi capabili să se lege de forme solubile de Tau umană, filamente helicoidale pereche (PHF) de Tau umană sau atât de forme solubile de Tau umană, cât şi de filamente helicoidale pereche (PHF) de Tau umană.

[0045] LEGENDEE FIGURILOR

[0046] Figura 1: A) ilustrează VL-ul donor al AB1 (VL_AB1) din SEQ ID nr.: 7 cu CDR-urile 1 (Nr. ID SEC: 1), 2 (Nr. ID SEC: 2) şi 3 (Nr. ID SEC: 3) fiind subliniate. B) reprezintă secvenţa VL a regiunii acceptoare umane IGKV2-29 din SEQ ID nr.: 31, cu CDR-urile acceptoare I, 2 şi 3 subliniate. C) reprezintă secvenţa grefată pe CDR gVL3_AB l din SEQ nr.: 9, cu CDR-urile 1 (ID SEQ nr.: 1), 2 (ID SEQ nr.: 2) şi 3 (ID SEQ nr.: 3) subliniate.

[0047] Figura 2: A) prezintă VH-ul donor al ABl (VH_AB1) cu SEQ ID nr.: 8, cu CDR-urile 1 (SEQ ID nr.: 4), 2 (SEQ ID nr.: 36) şi 3 (SEQ ID nr.: 6) subliniate. B) reprezintă secvenţa VH a regiunii acceptoare umane IGHV4-59 din SEQ ID nr.: 32, cu CDR-urile acceptoare 1, 2 şi 3 subliniate. C) ilustrează secvenţa grefată pe CDR gVH17_ABl a SEQ nr.: 12, cu CDR-urile 1 (SEQ ID nr.: 4), 2 (SEQ ID nr.: 37) şi 3 (SEQ ID nr.: 6) subliniate. Reziduurile donatoare sunt prezentate cu caractere italice şi evidenţiate: M48. Mutaţiile din cadru sunt evidenţiate (El). CDR2 cuprinde o substituţie S61A în comparaţie cu VH_ AB1. D) reprezintă secvenţa grefată pe CDR gVH18_AB1 a SEQ nr.: 13, cu CDR-urile 1 (SEQ ID nr.: 4), 2 (SEQ ID nr.: 38) şi 3 (SEQ ID nr.: 6) subliniate. Reziduurile donatoare sunt afişate cu caractere italice şi evidenţiate (M48). Mutaţiile din cadru sunt evidenţiate (El). CDR2 cuprinde o substituţie S61T în comparaţie cu VH_AB1.

[0048] Figura 3: Diagramă care ilustrează testul de agregare celulară din Experimentul 3.1.

[0049] Figura 4: Eficacitatea anticorpilor care leagă Tau având un lanţ uşor al SEQ ID Nr.: 14 şi un lanţ greu cu SEQ ID Nr.: 18 (A) şi un anticorp care leagă Tau având un lanţ uşor cu SEQ ID Nr.: 14 şi un lanţ greu cu SEQ ID Nr.: 17 (B) sau un anticorp IgG4 de control negativ A33 (C) într-un test de agregare celulară Tau utilizând fibrile patologice Tau umane recuperate de la pacienţi cu AD umană (AD-PHF8) ca seminţe.

[0050] Figura 5: Western blot care prezintă proprietăţile de legare ale unui anticorp care se leagă de Tau AB1l având VL cu SEQ ID nr.: 7 şi VH cu SEQ ID nr.: 8 (A) şi anticorpi umanizaţi având un lanţ uşor cu SEQ ID nr.: 14 şi un lanţ greu cu SEQ ID nr.: 17 (B), ai unui anticorp care leagă Tau având un lanţ uşor cu SEQ ID nr.: 14 şi un lanţ greu cu SEQ ID nr.: 18 (C), la Tau recuperat din probele fracţiei 8 de la pacienţi umani cu AD, PSP sau control. Anticorpul A33 a fost utilizat ca şi control negativ.

[0051] Figura 6: Suprapunere de termograme pentru un anticorp care leagă Tau având un lanţ uşor cu SEQ ID nr.: 14 şi un lanţ greu cu SEQ ID nr.: 17, un anticorp care leagă Tau având un lanţ uşor cu SEQ ID nr.: 14 şi un lanţ greu cu SEQ ID nr.: 18, un anticorp care leagă Tau având un lanţ uşor cu SEQ ID nr.: 14 şi un lanţ greu cu SEQ ID nr.: 54 şi un anticorp care leagă Tau având un lanţ uşor cu SEQ ID nr.: 14 şi un lanţ greu cu SEQ ID nr.: 55.

[0052] Figura 7: Constructul de ADN care codifică izoforma 2 a genei Tau umane pentru exprimarea în E. coli (pET 6His TEV-hTau izo 2 (1-441)) (ID BioReg: D0003105) (Nr. ID SEC: 39). Insertul BamHI/XhoI care codifică secvenţa de aminoacizi a fost subclonat într-un vector pET32 modificat, tăiat cu BamHI/XhoI. (Secvenţa care codifică 6His-TEV-Tau este scrisă cu caractere italice îngroşate).

[0053] Figura 8: A) Secvenţa de aminoacizi exprimată din pET 6His TEV-hTau iso 2 (1-441) (SEQ ID No.: 40); B) secvenţa finală de aminoacizi exprimată din pET 6His TEV-hTau iso 2 (1-441) după scindarea TEV (SEQ ID No.: 41).

[0054] Figura 9: Constructul de ADN care codifică izoforma 3 a genei Tau umane pentru exprimarea în E. coli (pET 6His TEV-hTau izo 3 (1-383)) (ID BioReg: D0003104) (Nr. ID SEC: 42). Insertul BamHI/XhoI care codifică secvenţa de aminoacizi a fost subclonat într-un vector pET32 modificat, tăiat cu BamHI/XhoI. (Secvenţa care codifică 6His-TEV-Tau este scrisă cu caractere italice îngroşate).

[0055] Figura 10: A) Secvenţa de aminoacizi exprimată din pET 6His TEV-hTau iso 3 (1-383) (SEQ ID No.: 43); B) secvenţa finală de aminoacizi exprimată din pET 6His TEV-hTau iso 3 (1-383) după scindarea TEV (SEQ ID No.: 44).

[0056] Figura 11: Constructul de ADN care codifică izoforma 4 a genei Tau umane pentru exprimarea în E. coli (pET 6His TEV-hTau izo 4 (1-352)) (ID BioReg: D0003093) (Nr. ID SEC: 45). Insertul BamHI/XhoI care codifică secvenţa de aminoacizi a fost subclonat într-un vector pET32 modificat, tăiat cu BamHI/XhoI. (Secvenţa care codifică 6His-TEV-Tau este scrisă cu caractere italice îngroşate).

[0057] Figura 12: A) Secvenţa de aminoacizi exprimată din pET 6His TEV-hTau iso 4 (1-352) (SEQ ID No.: 46); B) secvenţa finală de aminoacizi exprimată din pET 6His TEV-hTau iso 4 (1-352) după scindarea TEV (SEQ ID No.: 47).

[0058] Figura 13: Constructul de ADN care codifică izoforma 5 a genei Tau umane pentru exprimarea E. coli (ET 6His TEV-hTau izo 5 (1-412)) (ID BioReg: D0003103) (Nr. ID SEC: 48). Insertul BamHI/XhoI care codifică secvenţa de aminoacizi a fost subclonat într-un vector pET32 modificat, tăiat cu BamHI/XhoI. (Secvenţa care codifică 6His-TEV-Tau este scrisă cu caractere italice îngroşate).

[0059] Figura 14: A) Secvenţa de aminoacizi exprimată din pET 6His TEV-hTau iso 5 (1-412) (SEQ ID No.: 49); B) secvenţa finală de aminoacizi exprimată din pET 6His TEV-hTau iso 5 (1-412) după scindarea TEV (SEQ ID No.: 50).

[0060] Figura 15. Constructul de ADN care codifică izoforma 2 a genei Tau umane pentru exprimare în celule HEK293 (pMH-10His-TEV-hTau izo2 (1-441)) (ID BioReg: D0003109) (Nr. ID SEC: 51).Insertul BamHI/XhoI care codifică secvenţa de aminoacizi a fost subclonat în vectorul de expresie la mamifere pMH-10HisTEV tăiat cu BamHI/XhoI. (secvenţa care codifică lOHis-TEV-Tau este scrisă cu caractere italice îngroşate, mutaţia punctuală silenţioasă A1032T pentru eliminarea situsului de restricţie este subliniată).

[0061] Figura 16: A) Secvenţa de aminoacizi exprimată din pMH-10His-TEV-hTau iso2 (1-441) (SEQ ID No.: 52); B) secvenţa finală de aminoacizi exprimată din pMH-10His-TEV-hTau iso2 (1-441) după scindarea TEV (SEQ ID No.: 53).

[0062] Figura 17: Eficacitatea anticorpilor care leagă Tau având un lanţ uşor cu SEQ ID NO: 14 şi un lanţ greu cu SEQ ID NO: 18 într-un test de agregare celulară Tau care conţine fibrile patologice Tau umane recuperate de la pacienţi cu AD umană sau pacienţi cu PSP umană sau pacienţi cu FTD umană ca seminţe.

[0063] DESCRIEREA DETALIATĂ A INVENŢIEI

[0064] Prezenta dezvăluire, aşa cum este descrisă ilustrativ în cele ce urmează, poate fi pusă în practică în mod corespunzător în absenţa oricărui element sau elemente, limitări sau limitări care nu sunt dezvăluite în mod specific aici.

[0065] Prezenta dezvăluire va fi descrisă cu privire la aspecte şi exemple particulare ale acesteia şi cu referire la anumite figuri şi exemple, dar invenţia nu este limitată la acestea, ci doar la revendicări.

[0066] Termenii tehnici sunt folosiţi conform bunului simţ, cu excepţia cazului în care se specifică altfel. Dacă anumitor termeni li se atribuie un înţeles specific, în cele ce urmează vor fi date definiţiile termenilor în contextul în care sunt utilizaţi termenii respectivi.

[0067] Atunci când termenul „cuprinzând» este utilizat în prezenta descriere şi revendicări, acesta nu exclude alte elemente. În sensul prezentei dezvăluiri, termenul „constând din» este considerat a fi o formă de realizare preferată a termenului „cuprinzând din». Dacă în continuare se defineşte un grup ca cuprinzând cel puţin un anumit număr de exemple de realizare, aceasta trebuie înţeleasă şi ca dezvăluind un grup care constă, de preferinţă, doar din aceste exemple de realizare.

[0068] În sensul prezentei dezvăluiri, termenul „obţinut» este considerat a fi o formă de realizare preferată a termenului „optenabil». Dacă în continuare, de exemplu, un anticorp este definit ca putând fi obţinut dintr-o sursă specifică, aceasta trebuie înţeleasă şi ca dezvăluind un anticorp care este obţinut din această sursă.

[0069] Atunci când se foloseşte un articol nehotărât sau hotărât atunci când se face referire la un substantiv la singular, de exemplu „o», „ul» sau „el/ea», aceasta include şi pluralul substantivului respectiv, cu excepţia cazului în care se specifică altceva. Termenii „aproximativ» sau „aproximativ» denotă un interval de precizie pe care persoana de specialitate în domeniu îl va înţelege pentru a asigura în continuare efectul tehnic al caracteristicii în cauză. Termenul indică de obicei o abatere de la valoarea numerică indicată de ±10% şi, de preferinţă, de ±5%.

[0070] Trebuie înţeles că orice referire la un anticorp care leagă Tau sau la un fragment de legare al acestuia, ca o realizare preferată a diverselor aspecte, are în vedere anticorpi monoclonali care leagă Tau sau fragmente de legare ale acestora.

[0071] Pentru diverse aspecte, prezenta dezvăluire menţionează anticorpi şi fragmente de legare ale acestora care cuprind CDR-uri şi regiuni variabile ale regiunilor respective ale lanţului uşor şi/sau lanţului greu. Anticorpii sau fragmentele de legare ale acestora care cuprind doar o regiune variabilă a lanţului uşor sau o regiune variabilă a lanţului greu pot fi utili, de exemplu, pentru metode de fabricaţie sau, de exemplu, pentru screening-ul regiunilor variabile care se pot asocia eficient cu o altă regiune variabilă corespunzătoare. Totuşi, trebuie înţeles că ori de câte ori se face referire la anticorpi şi fragmente de legare ale acestora care cuprind CDR-uri şi regiuni variabile ale regiunilor respective ale lanţului uşor şi/sau lanţului greu, aceasta are întotdeauna în vedere, ca o formă de realizare preferată, anticorpi şi fragmente de legare ale acestora care cuprind CDR-uri şi regiuni variabile ale regiunilor respective ale lanţului uşor şi lanţului greu.

[0072] Aşa cum sunt utilizaţi aici, termenii „tratament», „tratare» şi alţii similari se referă la obţinerea unui efect farmacologic şi/sau fiziologic dorit. Efectul poate fi profilactic în ceea ce priveşte prevenirea completă sau parţială a unei boli sau a unui simptom al acesteia şi/sau poate fi terapeutic în ceea ce priveşte vindecarea parţială sau completă a unei boli şi/sau a unui efect advers atribuibil bolii. Prin urmare, tratamentul acoperă orice tratament al unei boli la un mamifer, în special la un om, şi include: (a) prevenirea apariţiei bolii la un subiect care poate fi predispus la boală, dar care nu a fost încă diagnosticat cu aceasta; (b) inhibarea bolii, adică oprirea dezvoltării acesteia; şi (c) ameliorarea bolii, adică provocarea regresiei bolii.

[0073] O referire la un anticorp care leagă Tau sau la un fragment de legare al acestuia ca „agent activ terapeutic» se referă la utilizarea unui anticorp care leagă Tau sau a unui fragment de legare al acestuia în tratamentul unei boli.

[0074] O „cantitate eficientă din punct de vedere terapeutic» se referă la cantitatea unui anticorp care leagă Tau sau a unui fragment de legare al acestuia care, atunci când este administrată unui mamifer sau altui subiect pentru tratarea unei boli, este suficientă pentru a efectua un astfel de tratament pentru boală.

[0075] Cantitatea eficientă terapeutic va varia în funcţie de anticorpul care leagă Tau sau fragmentul de legare al acestuia, de boală şi severitatea acesteia, precum şi de vârsta, greutatea etc. a subiectului care urmează să fie tratat.

[0076] O referire la un anticorp care leagă Tau sau la un fragment de legare al acestuia ca „agent activ din punct de vedere diagnostic» se referă la utilizarea unui anticorp care leagă Tau sau a unui fragment de legare al acestuia în diagnosticarea in vitro unei boli sau anticorpul sau fragmentul de legare al acestuia pentru utilizare într-o metodă de diagnosticare in vivo a unei taupatii.

[0077] O „cantitate eficientă din punct de vedere diagnostic» se referă la cantitatea unui anticorp care leagă Tau sau a unui fragment de legare al acestuia care, atunci când este utilizată într-un test de diagnostic pe o probă biologică, este suficientă pentru a permite identificarea unei boli sau monitorizarea cantităţii de ţesut bolnav ca mijloc de monitorizare a eficacităţii intervenţiei terapeutice.

[0078] Prezenta cerere se bazează parţial pe identificarea unui anticorp denumit ABl care se leagă de Tau uman. Aşa cum este obişnuit în domeniu, numerotarea reziduurilor Tau în acest text se referă la izoforma Tau 2 a SEQ ID nr.: 35 (secvenţa de referinţă NCBI: NP_005901.2). Aşa cum va fi prezentat în continuare, ABl, care a fost izolat de la un şobolan imunizat, recunoaşte un epitop care cuprinde cel puţin reziduurile de aminoacizi ale S238, A239, S241, T245, A246 din SEQ ID No.: 35. Această regiune se află chiar înainte de prima regiune repetitivă MTBR prezentă în toate cele 6 izoforme de Tau care pot fi găsite în sistemul nervos central.

[0079] Exemplele stabilesc că ABl este capabil să se lege atât de formele solubile de Tau uman, cât şi de filamentele elicoidale pereche (PHF) de Tau uman (vezi Exemplul 2.3) şi că AB1 a fost capabil să detecteze încurcături neurofibrilare intraneuronale (NFT), NFT extraneuronale, structuri asemănătoare plăcilor neuritice şi fire de neurofile în criosecţiunile probelor umane (vezi Exemplul 3.2). În unele dintre testele şi modelele testate, AB1 a prezentat un IC50 mai mic decât anticorpii din stadiul tehnicii. Pare rezonabil să presupunem că acest comportament este cel puţin parţial mediat de regiunile care determină complementaritatea (CDR) ale regiunii lanţului uşor variabil (VL) şi regiunii lanţului greu variabil (VH) ale AB1.

[0080] În acest context, prezenta dezvăluire oferă anticorpi care leagă Tau sau fragmente de legare ale acestora, care cuprind CDR-urile sau reziduurile de determinare a specificităţii din regiunea VL a AB1 (SEQ ID No.: 7) şi/sau CDR-urile din regiunea VH a AB1 (SEQ ID No.: 8).

[0081] Reziduurile din domeniile variabile ale anticorpilor sunt numerotate în mod convenţional conform unui sistem conceput de Kabat şi colab. Acest sistem este prezentat în Kabat şi colab., 1987, în Secvenţe de proteine de interes imunologic, Departamentul de Sănătate şi Servicii Umane al SUA, NIH, SUA (denumit în continuare „Kabat şi colab. (supra)»). Acest sistem de numerotare este utilizat în prezenta specificaţie, cu excepţia cazurilor în care se specifică altfel.

[0082] Desemnările reziduurilor Kabat nu corespund întotdeauna direct cu numerotarea liniară a reziduurilor de aminoacizi. Secvenţa liniară de aminoacizi reală poate conţine mai puţini aminoacizi sau mai mulţi decât în numerotarea Kabat strictă corespunzătoare unei scurtări sau inserţii într-o componentă structurală, fie că este vorba de o regiune cadru sau de determinare a complementarităţii (CDR), a structurii domeniului variabil de bază. Numerotarea Kabat corectă a reziduurilor poate fi determinată pentru un anumit anticorp prin alinierea reziduurilor de omologie din secvenţa anticorpului cu o secvenţă numerotată Kabat „standard». Totuşi, conform lui Chothia (Chothia, C. şi Lesk, A.M. J. Mol. Biol, 196, 901-917 (1987)) bucla echivalentă cu CDR-H1 se extinde de la reziduul 26 la reziduul 32.

[0083] Astfel, CDR1, CDR2 şi CDR3 ale VL din AB1 au fost identificate ca corespunzătoare cu SEQ ID nr.: 1, 2 şi respectiv 3. Astfel, CDR1, CDR2 şi CDR3 ale VH ale AB1 au fost identificate ca corespunzătoare cu SEQ ID nr.: 4, 36 şi respectiv 6. Este cunoscut în mod obişnuit faptul că una sau mai multe substituţii, adăugiri şi/sau deleţii de aminoacizi pot fi făcute la CDR-urile furnizate de prezenta invenţie fără a altera semnificativ capacitatea anticorpului de a se lega de Tau. Efectul oricăror substituţii, adăugiri şi/sau deleţii de aminoacizi poate fi testat cu uşurinţă de către o persoană de specialitate în domeniu, de exemplu prin utilizarea metodelor descrise în exemple sau cunoscute din cunoştinţele generale. În CDR2 identificată iniţial a VH (CDRH2), şi anume SEQ ID No.: 36, de exemplu, a fost identificat şi modificat un potenţial situs de deamidare a asparaginei prin înlocuirea reziduului de serină contiguu fie cu alanină, fie cu treonină. Aceasta a condus la secvenţele SEQ ID nr.: 37 şi respectiv 38 pentru CDRH2. Pentru concizie, cele trei secvenţe pentru CDRH2, şi anume SEQ ID nr. 36, 37 şi 38, au fost combinate ca SEQ ID nr. 5.

[0084] În acest context, prezenta invenţie oferă, într-un aspect, un anticorp izolat care se leagă de Tau sau un fragment de legare al acestuia, în care anticorpul sau fragmentul de legare-Tau sau fragmentul de legare al acestuia cuprinde

[0085] o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde o CDR1 selectată din SEQ ID No.: 1, o CDR2 selectată din SEQ ID No.: 2 şi o CDR3 selectată din SEQ ID No.:3; şi o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde o CDR1 selectată din SEQ ID Nr.: 4, o CDR2 selectată din SEQ ID No.: 5 şi/sau o CDR3 selectată din SEQ ID No.: 6.

[0086] „Identitate», aşa cum este utilizat aici, indică faptul că în orice poziţie particulară din secvenţele aliniate, reziduul de aminoacid este identic între secvenţe. Gradele de identitate pot fi calculate cu uşurinţă, de exemplu, folosind software-ul BLAST™ disponibil de la NCBI (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. şi States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. şi colab., 1996, Metamfetamină. Enzimol. 266: 131- 141 Altschul, S.F. şi colab., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. k. Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656).

[0087] În acest context, dezvăluirea ia în considerare în mod specific anticorpii care leagă Tau sau fragmentele de legare ale acestora, care cuprind un VL cu CDRL1, CDRL2 şi CDRL3 cu SEQ ID nr.: 1, 2, respectiv 3 şi un VH cu CDRH1, CDRH2 şi CDRH3 cu SEQ ID nr.: 4, 5 şi respectiv 6.

[0088] Dezvăluirea ia în considerare, de asemenea, anticorpi care leagă Tau sau fragmente de legare ale acestora care cuprind un VL cu CDRL1, CDRL2 şi CDRL3 cu SEQ ID nr.: 1, 2, respectiv 3 şi un VH cu CDRH1, CDRH2 şi CDRH3 cu SEQ ID nr.: 4, 36 şi respectiv 6, anticorpi care leagă Tau sau fragmente de legare ale acestora care cuprind un VL cu CDRL1, CDRL2 şi CDRL3 cu SEQ ID nr.: 1, 2, respectiv 3 şi un VH cu CDRH1, CDRH2 şi CDRH3 cu SEQ ID nr.: 4, 37 şi respectiv 6, şi anticorpi care leagă Tau sau fragmente de legare ale acestora care cuprind un VL cu CDRL1, CDRL2 şi CDRL3 cu SEQ ID nr.: 1, 2, respectiv 3 şi un VH cu CDRH1, CDRH2 şi CDRH3 cu SEQ ID nr.: 4, 38 şi respectiv 6.

[0089] Anticorpii care leagă Tau sau fragmentele de legare ale acestora, aşa cum sunt prevăzuţi în primul aspect menţionat, pot cuprinde aceste CDR-uri încorporate în regiuni cadru de origine diferită. Astfel, CDR-urile pot fi cuprinse în regiunile cadru originale ale AB 1, şi anume regiunea VL de şobolan din SEQ ID nr. 7 şi regiunea VH de şobolan din SEQ ID nr. 8. Cu toate acestea, CDR-urile pot fi încorporate şi în regiuni cadru de origine a diferitelor specii, cum ar fi regiunile cadru ale şoarecilor sau oamenilor. În funcţie de originea regiunilor cadru şi a regiunilor constante, care pot fi combinate cu astfel de regiuni cadru, se pot obţine anticorpi himerici, umanizaţi sau complet umani care leagă Tau sau fragmente de legare ale acestora.

[0090] Anticorpii himerici care leagă Tau sau fragmentele de legare ale acestora vor cuprinde CDR-urile din regiunile cadru de origine non-umană combinate cu regiuni constante de origine umană. Anticorpii umanizaţi care leagă Tau sau fragmentele de legare ale acestora vor cuprinde CDR-urile din regiunile cadru de origine umană combinate împreună cu regiunile constante de origine umană.

[0091] În acest context, dezvăluirea oferă într-un alt aspect un anticorp izolat care se leagă de Tau sau un fragment de legare al acestuia, în care anticorpul sau fragmentul de legare al acestuia cuprinde

[0092] o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde SEQ ID No.: 7 şi/sau

[0093] o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde SEQ ID Nr.: 8.

[0094] În acest context, invenţia ia în considerare în mod specific anticorpii care leagă Tau sau fragmentele de legare ale acestora care cuprind un VL cu SEQ ID nr.: 7 şi un VH cu SEQ ID nr.: 8.

[0095] Anticorpii umanizaţi care leagă Tau sau fragmentele de legare ale acestora sunt avute în vedere în mod special de prezenta invenţie.

[0096] În acest scop, CDR-urile pot fi grefate pe regiuni ale cadrului uman. Se va aprecia că identificarea unui astfel de anticorp umanizat care se leagă de Tau grefat pe CDR sau a unui fragment de legare al acestuia poate fi realizată urmând abordări consacrate în domeniu. Când CDR-urile sau reziduurile care determină specificitatea sunt grefate, se poate utiliza orice secvenţă cadru a regiunii variabile umane acceptoare adecvată, având în vedere clasa/tipul anticorpului donor din care sunt derivate CDR-urile (a se vedea, de exemplu, Cabilly şi colab., brevetul SUA nr. 4.816.567; Cabilly şi colab., brevetul european nr. 0.125.023 Bl; Boss şi colab., brevetul SUA nr. 4.816.397; Boss şi colab., brevetul european nr. 0.120.694 Bl; Neuberger, M. S. şi colab., WO 86/01533; Neuberger, M. S. şi colab., brevetul european nr. 0.194.276 Bl; Winter, brevetul SUA nr. 5.225.539; Winter, brevetul european nr. 0.239.400 Bl; Padlan, E. A. şi colab., Cererea de brevet european nr. 0.519.596 A1).

[0097] De asemenea, într-o regiune variabilă a anticorpului grefat cu CDR conform prezentei invenţii, regiunile cadru nu trebuie să aibă exact aceeaşi secvenţă ca cele ale anticorpului acceptor. Prin urmare, CDR-urile pot fi altoite cu sau fără modificări ale cadrului. Introducerea modificărilor cadrului de dezvoltare pe baza unei comparaţii între regiunile cadrului de dezvoltare ale regiunilor variabile donoare şi regiunile cadrului acceptoare poate permite păstrarea, de exemplu, a afinităţii unui anticorp care altfel ar putea fi redusă ca o consecinţă a umanizării. De exemplu, reziduurile neobişnuite pot fi schimbate în reziduuri care apar mai frecvent pentru acea clasă sau tip de lanţ acceptor. Alternativ, reziduurile selectate din regiunile cadrului acceptorului pot fi modificate astfel încât să corespundă reziduului găsit în aceeaşi poziţie în anticorpul donor (vezi Reichmann şi colab., 1998, Nature, 332, 323-324). Astfel de modificări trebuie menţinute la minimul necesar pentru a recupera afinitatea anticorpului donator. Reziduurile pentru modificare pot fi selectate folosind protocolul descris de Adair şi colab. (1991) (Anticorpi umanizaţi. WO91/09967). Într-un anticorp grefat pe CDR conform prezentei invenţii, lanţurile grele şi uşoare acceptoare nu trebuie neapărat să fie derivate din acelaşi anticorp şi pot, dacă se doreşte, să cuprindă lanţuri compozite având regiuni cadru derivate din lanţuri diferite.

[0098] Exemple de structuri acceptoare umane care pot fi utilizate în prezenta invenţie sunt KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY şi POM (Kabat şi colab., supra). De exemplu, KOL şi NEWM pot fi utilizate pentru lanţul greu, REI poate fi utilizat pentru lanţul uşor, iar EU, LAY şi POM pot fi utilizate atât pentru lanţul greu, cât şi pentru lanţul uşor. Alternativ, se pot utiliza secvenţe germinale umane; acestea sunt disponibile la: http://vbase.mrc-ce.cam.ac.uk/ sau http://www.imgt.org). Prezenta dezvăluire are în vedere în mod specific utilizarea regiunii V umane IGKV2-29 plus regiunea J JK2 din SEQ ID No.: 31 (IMGT, http://www.imgt.org/) ca regiune cadru acceptoare pentru CDR-urile lanţului uşor şi a regiunii V umane IGHV4-59 plus regiunea J JH3 din SEQ ID No.: 32 (IMGT, http://www.imgt.org/) ca regiune cadru acceptoare pentru CDR-urile lanţului greu. În SEQ ID No.: 32, poziţiile 1 şi 48 pot fi luate în considerare, de exemplu, pentru modificările reziduurilor din regiunile cadru. Reziduul de glutamină din poziţia 1 poate fi transformat în glutamat sau aspartat. Reziduul de izoleucină din poziţia 48 poate fi transformat în metionină. Alte poziţii în SEQ ID nr.: 32 pentru modificările reziduurilor din regiunile cadru pot fi poziţiile 37 şi/sau 71. De exemplu, reziduul de izoleucină din poziţia 37 a SEQ ID NO: 32 poate fi schimbat în valină. Reziduul de valină din poziţia 71 poate fi transformat în arginină. Poziţiile din SEQ ID nr.: 31 pentru modificările reziduurilor din regiunile cadru pot fi poziţia 68. Reziduul de serină din poziţia 68 a SEQ ID NO: 31 poate fi schimbat în izoleucină.

[0099] În acest context, dezvăluirea oferă într-un alt aspect un anticorp izolat care se leagă de Tau sau un fragment de legare al acestuia, în care anticorpul sau fragmentul de legare al acestuia cuprinde

[0100] o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde SEQ ID No.: 9 şi/sau

[0101] o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde SEQ ID Nr.: 12 sau 13..

[0102] În acest context, cererea ia în considerare în mod specific anticorpii care leagă Tau sau fragmentele de legare ale acestora care cuprind o VL cu SEQ ID nr.: 9 şi o VH cu SEQ ID nr.: 11, anticorpii care leagă Tau sau fragmentele de legare ale acestora care cuprind o VL cu SEQ ID nr.: 9 şi o VH cu SEQ ID nr.: 12 şi anticorpii care leagă Tau sau fragmentele de legare ale acestora care cuprind o VL cu SEQ ID nr.: 9 şi o VH cu SEQ ID nr.: 13.

[0103] Anticorpii de legare a proteinei Tau grefaţi pe CDR umanizaţi sau fragmentele de legare ale acestora pot cuprinde regiuni constante de origine umană. În funcţie de secvenţa de aminoacizi a regiunii constante a lanţurilor lor grele, anticorpii sau imunoglobulinele sunt împărţite în clasele: IgA, IgD, IgE, IgG şi IgM, iar câteva dintre acestea pot fi împărţite în continuare în subclase (subtipuri), de exemplu IgGl, IgG2, IgG3 şi IgG4, IgAl şi IgA2. În particular, pot fi utilizate domenii ale regiunii constante IgG umane, în special ale izotipurilor IgGl şi IgG3, atunci când molecula de anticorp este destinată utilizărilor terapeutice şi sunt necesare funcţii efectoare ale anticorpilor. Alternativ, izotipurile IgG2 şi IgG4 pot fi utilizate atunci când molecula de anticorp este destinată scopurilor terapeutice şi funcţiile efectoare ale anticorpilor nu sunt necesare. Prezenta dezvăluire ia în considerare în mod specific anticorpii umanizaţi de subtip IgGl şi IgG4.

[0104] Se va înţelege că se pot utiliza de asemenea şi modificări de secvenţă ale acestor domenii regionale constante. De exemplu, se pot face, de asemenea, unul sau mai mulţi aminoacizi, cum ar fi substituţii cu 1 sau 2 aminoacizi, adăugiri şi/sau deleţii la domeniile constante ale anticorpilor fără a altera semnificativ capacitatea anticorpului de a se lega de Tau. Se pot utiliza, de asemenea, molecule de IgG4 în care serina din poziţia 241 a fost schimbată în prolină, aşa cum este descris în Angal şi colab., Molecular Immunology, 1993, 30 (I), 105-108.

[0105] Funcţiile efectoare ale anticorpilor includ ADCC şi CDC. ADCC se referă la citotoxicitatea celulară dependentă de anticorpi. Pentru a determina dacă un anticorp este, în principiu, capabil să medieze ADDC, ADCC poate fi măsurat in vitro, de exemplu, prin aşa-numitele teste de eliberare a Cr51, Eu şi S35. O celulă ţintă care conţine antigenul de interes, adică Tau poate fi marcat cu aceşti compuşi. După legarea anticorpului terapeutic, celulele sunt spălate, iar celulele efectoare care exprimă receptori Fc, cum ar fi FcyRIII, sunt incubate împreună cu celulele ţintă marcate cu anticorpi, iar liza celulelor ţintă poate fi monitorizată prin eliberarea marcajelor. O altă abordare utilizează aşa-numitul test aCella TOX™. CDC se referă la citotoxicitate celulară dependentă de complement. Pentru a determina dacă un anticorp este, în principiu, capabil să medieze CDC, CDC poate fi măsurat in vitro, aşa cum este descris, de exemplu, în Delobel A şi colab., Methods Mol Biol. (2013); 988: 115-43 sau Current Protocols in Immunology, Capitolul 13 Complement (ISSN tipărit: 1934-3671).

[0106] În acest context, dezvăluirea oferă într-un alt aspect un anticorp izolat care se leagă de Tau sau un fragment de legare al acestuia, în care anticorpul sau fragmentul de legare al acestuia cuprinde

[0107] un lanţ uşor care cuprinde SEQ ID No.: 14 şi/sau

[0108] un lanţ greu care cuprinde SEQ ID Nr.: 17 sau 18.

[0109] În acest context, cererea ia în considerare în mod specific anticorpii care leagă Tau sau fragmentele de legare ale acestora care cuprind un lanţ uşor cu SEQ ID nr.: 14 şi un lanţ greu cu SEQ ID nr.: 16, anticorpii care leagă Tau sau fragmentele de legare ale acestora care cuprind un lanţ uşor cu SEQ ID nr.: 14 şi un lanţ greu cu SEQ ID nr.: 17 şi anticorpii care leagă Tau sau fragmentele de legare ale acestora care cuprind un lanţ uşor cu SEQ ID nr.: 14 şi un lanţ greu cu SEQ ID nr.: 18.

[0110] În plus, dezvăluirea oferă într-un alt aspect un anticorp izolat care se leagă de Tau sau un fragment de legare al acestuia, în care anticorpul sau fragmentul de legare al acestuia cuprinde

[0111] un lanţ uşor care cuprinde SEQ ID No.: 14 şi/sau

[0112] un lanţ greu care cuprinde SEQ ID No.: 54 sau SEQ ID No.: 55.

[0113] De asemenea, prezenta dezvăluire oferă o regiune specifică sau un epitop al proteinei Tau umane care este legat de un anticorp sau fragment de legare al acestuia furnizat de prezenta dezvăluire, în special un anticorp sau fragment de legare al acestuia care cuprinde oricare dintre CDR-H1 (SEQ ID No.:4), CDR-H2 (SEQ ID No.:5), CDR-H3 (SEQ ID No.:6), CDR-L1 (SEQ ID No.:1), CDR-L2 (SEQ ID No.:2) sau CDR-L3 (SEQ ID No.:3), de exemplu anticorpi care cuprind VL din SEQ ID No.:7 şi VL din SEQ ID No.:8.

[0114] Prezenta dezvăluire oferă în plus o regiune specifică sau un epitop al proteinei Tau umane, în special un epitop din aminoacizii 235-250 din SEQ ID NR.: 35, care este legat de un anticorp sau fragment de legare al acestuia furnizat în prezenta dezvăluire, în special un anticorp sau fragment de legare al acestuia care cuprinde VL din SEQ ID NR.: 7 şi VL din SEQ ID NR.: 8.

[0115] Această regiune specifică sau epitop al proteinei Tau poate fi identificat prin orice metodă adecvată de cartografiere a epitopilor cunoscută în domeniu, în combinaţie cu oricare dintre anticorpii furnizaţi de prezenta dezvăluire. Exemple de astfel de metode includ screening-ul peptidelor de lungimi variabile derivate din SEQ ID No.: 35 pentru legarea la anticorpii care leagă Tau sau la fragmentele de legare ale acestora din prezenta dezvăluire, cel mai mic fragment fiind cel care se poate lega specific la anticorpul care conţine secvenţa epitopului recunoscut de anticorpii care leagă Tau sau de fragmentele de legare ale acestora. Având în vedere existenţa diferitelor izoforme Tau în sistemul nervos central, trebuie înţeles că orice astfel de izoformă poate fi utilizată în metodele detaliate aici. Într-un exemplu specific, se poate utiliza cea mai lungă izoformă a Tau, adică izoforma 2, aşa cum este definită în SEQ ID No.: 35. Peptidele Tau cu SEQ ID nr.: 35 pot fi produse recombinant, sintetic sau prin digestie proteolitică a polipeptidei Tau. Peptidele care leagă anticorpul pot fi identificate, de exemplu, prin Western Blot sau analiză spectrometrică de masă. Într-un alt exemplu, spectroscopia RMN sau cristalografia cu raze X poate fi utilizată pentru a identifica epitopul legat de un anticorp care se leagă de Tau sau de un fragment de legare al acestuia. Odată identificat, fragmentul epitopic care leagă un anticorp conform prezentei invenţii poate fi utilizat, dacă este necesar, ca imunogen pentru a obţine anticorpi suplimentari care leagă acelaşi epitop. În plus, fragmentul epitopic care se leagă de un anticorp conform prezentei invenţii poate fi utilizat pentru a obţine proteine care se leagă de acelaşi epitop şi, dacă este necesar, inhibă cel puţin o activitate biologică a proteinei Tau, cum ar fi compuşi proteici sau polipeptidici care cuprind mai mult de 10 aminoacizi şi care se bazează pe schele proteice, de exemplu, din lipocalină („anticaline»), fibronectină („adnectine», trinectine), domenii kunitz, lectină de tip C, transferină, gamma-cristalină, cisteină-note, repetiţii ankirinice („DARPine») sau proteina A („affibodies»), aşa cum sunt cunoscute în domeniu (Tomlinson, 2004; Mosavi şi colab., 2004; Gill şi Damle, 2006; Nilsson şi Tolmachev, 2007; Binz şi colab., 2004). În plus, moleculele care leagă acelaşi epitop includ alte molecule organice, inclusiv peptide şi peptide ciclice care cuprind cel mult 10 aminoacizi, precum şi peptidomimetice. Peptidomimeticele sunt compuşi care se bazează pe secvenţele de aminoacizi găsite la locurile de interacţiune proteină-proteină şi sunt cunoscuţi în domeniu (Sillerud şi Larson, 2005).

[0116] În acest context, dezvăluirea oferă, într-un alt aspect, un anticorp izolat care leagă Tau sau un fragment de legare al acestuia, în care anticorpul sau fragmentul de legare al acestuia se leagă de un epitop care cuprinde cel puţin reziduurile de aminoacizi ale S238, A239, S241, T245, A246 din SEQ ID No.: 35. Epitopul general pare să se extindă de la aminoacizii 232 până la 251 din SEQ ID No.: 35. Într-un exemplu, epitopul proteinei Tau umane legat de un anticorp conform prezentei invenţii cuprinde aminoacizii S238, A239, S241, T245, A246 şi unul sau mai multe reziduuri selectate dintre S235, S237, K240, R242, L243, Q244, V248 şi M250 din SEQ ID No.: 35.

[0117] Într-un alt aspect, prezenta dezvăluire oferă un anticorp izolat care leagă Tau sau un fragment de legare al acestuia, în care anticorpul sau fragmentul de legare al acestuia se leagă de un epitop care cuprinde cel puţin reziduurile de aminoacizi ale S235, S238, A239, K240, S241, Q244, T245 şi A246 din SEQ ID No.: 35. Într-un exemplu de realizare, epitopul proteinei Tau umane legat de un anticorp conform prezentei invenţii cuprinde aminoacizii S235, S238, A239, K240, S241, Q244, T245, A246 şi unul sau mai multe reziduuri selectate dintre S237, R242, L243, V248 şi M250 din SEQ ID No.: 35.

[0118] De asemenea este dezvăluit un anticorp izolat care leagă Tau sau un fragment de legare al acestuia, în care anticorpul sau fragmentul de legare al acestuia se leagă de un epitop care cuprinde cel puţin reziduurile de aminoacizi ale S235, S237, S238, A239, K240, S241, Q244, T245 şi A246 din SEQ IDNo.: 35. Într-un exemplu, epitopul proteinei Tau umane legat de un anticorp conform prezentei invenţii cuprinde aminoacizii S235, S237, S238, A239, K240, S241, Q244, T245, A246 şi unul sau mai multe reziduuri selectate dintre R242, L243, V248 şi M250 din SEQ ID No.: 35.

[0119] Într-un exemplu, epitopul proteinei Tau umane legat de un anticorp conform prezentei invenţii cuprinde reziduuri de aminoacizi S235, S237, S238, A239, K240, S241, R242, L243, Q244, T245, A246, V248 şi M250 din SEQ ID No.: 35.

[0120] Anticorpii care leagă Tau sau fragmentele de legare ale acestora care cuprind un VL cu SEQ ID nr.: 7 şi un VH cu SEQ ID nr.: 8 sunt reprezentanţi ai anticorpilor care leagă Tau sau ai fragmentelor de legare ale acestora care se leagă de epitopii menţionaţi anterior.

[0121] Astfel de anticorpi pot fi anticorpi monoclonali himerici, umanizaţi sau complet umani sau pot fi utilizaţi pentru a obţine anticorpi monoclonali himerici, umanizaţi sau complet umani. Într-un alt aspect, prezenta dezvăluire oferă un anticorp neutralizant izolat care leagă Tau sau un fragment de legare al acestuia, în care anticorpul neutralizant sau fragmentul de legare al acestuia se leagă de un epitop de Tau care cuprinde reziduuri de aminoacizi S238, A239, S241, T245, A246 din SEQ ID No.: 35.

[0122] Într-un exemplu, epitopul Tau uman legat de un anticorp neutralizant conform prezentei invenţii cuprinde aminoacizii S238, A239, S241, T245, A246 şi unul sau mai multe reziduuri selectate dintre S235, S237, K240, R242, L243, Q244, V248 şi M250 din SEQ ID No.: 35.

[0123] De asemenea este dezvăluit un anticorp neutralizant izolat care leagă Tau sau un fragment de legare al acestuia, în care anticorpul neutralizant sau fragmentul de legare al acestuia se leagă de un epitop care cuprinde cel puţin reziduurile de aminoacizi ale S235, S238, A239, K240, S241, Q244, T245 şi A246 din SEQ ID No.: 35. Într-un exemplu, epitopul proteinei Tau umane legat de un anticorp neutralizant conform prezentei invenţii cuprinde aminoacizii S235, S238, A239, K240, S241, Q244, T245 şi A246 şi unul sau mai multe reziduuri selectate dintre S237, R242, L243, V248 şi M250 din SEQ ID No.: 35.

[0124] De asemenea este dezvăluit un anticorp neutralizant izolat care leagă Tau sau un fragment de legare al acestuia, în care anticorpul neutralizant sau fragmentul de legare al acestuia se leagă de un epitop care cuprinde cel puţin reziduurile de aminoacizi ale S235, S237, S238, A239, K240, S241, Q244, T245 şi A246 din SEQ IDNo.: 35. Într-un exemplu, epitopul proteinei Tau umane legat de un anticorp neutralizant conform prezentei invenţii cuprinde aminoacizii S235, S237, S238, A239, K240, S241, Q244, T245, A246 şi unul sau mai multe reziduuri selectate dintre R242, L243, V248 şi M250 din SEQ ID No.: 35.

[0125] Într-un exemplu, epitopul Tau uman legat de un anticorp neutralizant conform prezentei invenţii cuprinde reziduurile de aminoacizi S235, S237, S238, A239, K240, S241, R242, L243, Q244, T245, A246, V248 şi M250 din SEQ ID No.: 35.

[0126] Anticorpii care leagă Tau sau fragmentele de legare ale acestora care cuprind un VL cu SEQ ID nr.: 7 şi un VH cu SEQ ID nr.: 8 sunt reprezentativi pentru anticorpii neutralizanţi care leagă Tau sau fragmentele de legare ale acestora care se leagă de epitopii menţionaţi anterior.

[0127] Astfel de anticorpi neutralizanţi pot fi anticorpi monoclonali himerici, umanizaţi sau complet umani sau pot fi utilizaţi pentru a obţine anticorpi monoclonali himerici, umanizaţi sau complet umani.

[0128] De asemenea este dezvăluit un anticorp izolat care leagă Tau sau un fragment de legare al acestuia, în care anticorpul sau fragmentul de legare al acestuia se leagă în mod substanţial de acelaşi epitop de Tau ca un anticorp sau fragment de legare al acestuia care leagă Tau descris mai sus. Legarea la epitop poate fi determinată aşa cum este descris pentru cartografierea epitopilor, utilizând, de exemplu, un anticorp care leagă Tau sau un fragment de legare al acestuia, care cuprinde un VL cu SEQ ID nr.: 7 şi un VH cu SEQ ID nr.: 8 ca referinţă.

[0129] Astfel de anticorpi pot fi anticorpi monoclonali himerici, umanizaţi sau complet umani sau pot fi utilizaţi pentru a obţine anticorpi monoclonali himerici, umanizaţi sau complet umani.

[0130] De asemenea este dezvăluit un anticorp care leagă proteina Tau sau un fragment de legare al acestuia, care se leagă specific de o regiune sau un epitop al proteinei Tau umane, în special de un epitop din aminoacizii 235-250 ai SEQ ID NO.: 35, determinat prin rezonanţă magnetică nucleară cu coerenţă cuantică unică heteronucleară (RMN HSQC).

[0131] Astfel de anticorpi pot fi anticorpi monoclonali himerici, umanizaţi sau complet umani sau pot fi utilizaţi pentru a obţine anticorpi monoclonali himerici, umanizaţi sau complet umani.

[0132] De asemenea este dezvăluit un anticorp izolat care se leagă de Tau sau un fragment de legare al acestuia, în care anticorpul sau fragmentul de legare al acestuia concurează pentru legarea la Tau cu un anticorp care se leagă de Tau descris mai sus.

[0133] De asemenea este dezvăluit un anticorp izolat care se leagă de Tau sau un fragment de legare al acestuia, în care anticorpul sau fragmentul de legare al acestuia concurează pentru legarea la Tau cu un anticorp sau fragment de legare al acestuia care cuprinde un VL cu SEQ ID No.: 7 şi un VH cu SEQ ID No.: 8.

[0134] Astfel de anticorpi pot fi anticorpi monoclonali himerici, umanizaţi sau complet umani sau pot fi utilizaţi pentru a obţine anticorpi monoclonali himerici, umanizaţi sau complet umani.

[0135] Competiţia pentru legarea la Tau poate fi determinată printr-o reducere a legării anticorpului sau a fragmentului de legare al acestuia la Tau cu cel puţin aproximativ 50%, sau cel puţin aproximativ 70%, sau cel puţin aproximativ 80%, sau cel puţin aproximativ 90%, sau cel puţin aproximativ 95%, sau cel puţin aproximativ 99% sau aproximativ 100% în prezenţa anticorpului de referinţă sau a fragmentului de legare al acestuia, care poate cuprinde o VL cu SEQ ID nr.: 7 şi o VH cu SEQ ID nr.: 8. Legarea poate fi măsurată folosind rezonanţa plasmonică de suprafaţă folosind echipamentul BIAcore®, diverse tehnologii de detectare a fluorescenţei (de exemplu, Spectroscopia de corelare a fluorescenţei, corelaţia încrucişată a fluorescenţei, măsurători ale duratei de viaţă a fluorescenţei etc.) sau diverse tipuri de radioimunoteste sau alte teste utilizate pentru a urmări legarea anticorpilor la o moleculă ţintă.

[0136] Termenul „anticorp care se leagă de Tau sau fragment de legare al acestuia» înseamnă că anticorpul sau fragmentele de legare ale acestuia se leagă specific de Tau prin intermediul regiunilor sale variabile, adică se leagă de antigenul Tau cu o afinitate mai mare decât alţi antigeni care nu sunt omologi ai Tau. „Anticorpul care leagă Tau sau fragmentul de legare al acestuia se leagă de Tau prin regiunile sale variabile cu o afinitate de cel puţin două, cel puţin cinci, cel puţin 10, 20, 100, 103, 104, 105 sau cel puţin 106 ori mai mare decât alte antigene care nu sunt omologi ai Tau.» Se va înţelege că anticorpii care leagă Tau şi fragmentele de legare ale acestora pot, totuşi, interacţiona şi cu alte proteine (de exemplu, proteina A de la S. aureus sau alţi anticorpi în tehnicile ELISA) prin interacţiuni cu secvenţe din afara regiunii variabile a anticorpilor care leagă Tau şi a fragmentelor de legare ale acestora. Astfel de proprietăţi de legare din urmă, care sunt mediate de secvenţe din afara regiunilor variabile ale anticorpilor care leagă Tau şi fragmentelor de legare ale acestora şi, în special, de regiunile constante ale anticorpilor care leagă Tau şi fragmentelor de legare ale acestora, nu sunt menite să fie incluse în termenul „anticorp care leagă Tau sau fragment de legare al acestuia». Testele de screening pentru determinarea specificităţii de legare a unui anticorp sunt bine cunoscute şi practicate în mod curent în domeniu. Anticorpii care leagă proteina Tau sau fragmentele de legare ale acestora pot avea o constantă de disociere de echilibru (KD) pentru afinitatea de legare a anticorpului (sau a fragmentului de legare al acestuia) la antigenul său în intervalul nanomolar. Astfel, ¾ poate fi sub aproximativ 1*10-6, de exemplu, aproximativ sub 5*10-7, cum ar fi aproximativ 2*10-7 sau mai puţin şi poate fi măsurată folosind, de exemplu, rezonanţa plasmonică de suprafaţă şi dispozitivul BIAcore, aşa cum este descris în exemple.

[0137] Aşa cum s-a menţionat mai sus, prezenta dezvăluire oferă anticorpi care leagă Tau sau fragmente de legare ale acestora. Un anticorp de lungime completă include un domeniu constant şi o regiune variabilă. Este posibil să nu fie nevoie ca regiunea constantă să fie prezentă pe întreaga sa lungime într-un fragment de legare a antigenului al unui anticorp. Totuşi, trebuie înţeles că, oriunde cererea ia în considerare utilizarea anticorpilor care mediază ADCC şi/sau CDC, un fragment de legare trebuie să cuprindă o regiune constantă de lungime suficientă pentru a fi încă capabil să medieze ADCC şi/sau CDC.

[0138] Aşa cum s-a menţionat mai sus, prezenta dezvăluire se referă, de asemenea, la anticorpi umani care leagă Tau sau fragmente de legare ale acestora, care pot fi generaţi ca alternativă la umanizare. De exemplu, este posibil să se producă animale transgenice (de exemplu, şoareci) care sunt capabile, după imunizare, să producă un repertoriu complet de anticorpi umani în absenţa producerii de anticorpi murini endogeni. De exemplu, s-a descris că deleţia homozigotă a genei regiunii de unire a lanţului greu al anticorpului (JH) la şoarecii himerici şi mutanţi din linia germinală are ca rezultat inhibarea completă a producţiei endogene de anticorpi. Transferul matricei de gene ale imunoglobulinei germinale umane la astfel de şoareci mutanţi din linia germinală va duce la producerea de anticorpi umani cu specificitate împotriva unui anumit antigen la imunizarea animalului transgenic purtător al genelor imunoglobulinei germinale umane cu antigenul respectiv. Tehnologiile pentru producerea unor astfel de animale transgenice şi tehnologiile pentru izolarea şi producerea anticorpilor umani din astfel de animale transgenice sunt cunoscute în domeniu (Lonberg, 2005; Green, 1999; Kellermann şi Green, 2002; Nicholson şi colab., 1999). Alternativ, la animalul transgenic; de exemplu, şoarecele, doar genele imunoglobulinelor care codifică regiunile variabile ale anticorpului de şoarece sunt înlocuite cu secvenţe genetice corespunzătoare ale imunoglobulinei variabile umane. Genele imunoglobulinelor din linia germinală de şoarece care codifică regiunile constante ale anticorpilor rămân neschimbate. În acest fel, efectorul de anticorpi funcţionează în sistemul imunitar al şoarecelui transgenic şi, în consecinţă, dezvoltarea celulelor B rămâne în esenţă neschimbată, ceea ce poate duce la un răspuns anticorp îmbunătăţit la provocarea antigenică in vivo. Odată ce genele care codifică un anumit anticorp de interes au fost izolate de la astfel de animale transgenice, genele care codifică regiunile constante pot fi înlocuite cu gene umane din regiunea constantă pentru a obţine un anticorp complet uman. Alte metode de obţinere a fragmentelor de anticorpi umani in vitro se bazează pe tehnologii de afişare, cum ar fi afişarea pe fagi sau tehnologia de afişare pe ribozomi, în care se utilizează biblioteci de ADN recombinant care sunt fie generate cel puţin parţial artificial, fie din repertorii de gene ale domeniului variabil (V) al imunoglobulinei de la donatori. Tehnologiile de afişare pe fagi şi ribozomi pentru generarea de anticorpi umani sunt bine cunoscute în domeniu (Winter şi colab., 1994; Hoogenboom, 2002; Kretzschmar şi von Ruden, 2002; Groves şi Osbourn, 2005; Dufner şi colab., 2006).

[0139] Anticorpii umani pot fi generaţi şi din celule B umane izolate care sunt imunizate ex vivo cu un antigen de interes şi ulterior fuzionate pentru a genera hibridoame care pot fi apoi testate pentru anticorpul uman optim (Grasso şi colab., 2004; Li şi colab., 2006).

[0140] Termenul „anticorp de legare a proteinei Tau» sau fragment de legare al acestuia, aşa cum este utilizat aici, se referă la un anticorp sau fragment de legare al acestuia care se leagă de şi inhibă cel puţin o activitate biologică a proteinei Tau. Activităţile biologice ale proteinei Tau sunt cunoscute în domeniu şi includ, dar nu se limitează la, agregarea moleculelor de Tau care formează diferite tipuri de agregate, cum ar fi încurcăturile sau fibrilele descrise mai sus. Într-o formă de realizare particulară, un „anticorp neutralizant care leagă Tau» sau un fragment de legare al acestuia, aşa cum este utilizat aici, se referă la un anticorp sau un fragment de legare al acestuia care se leagă şi inhibă agregarea Tau într-un test in vitro, cum ar fi, de exemplu, un test in vitro, aşa cum este descris în experimentul 3.1 de mai jos.

[0141] Termenul „anticorp», aşa cum este utilizat aici, se referă în general la anticorpi intacţi (întregi, de lungime completă), adică care cuprind elementele a două lanţuri grele şi două lanţuri uşoare. Anticorpul poate cuprinde domenii de legare suplimentare, de exemplu, conform moleculei DVD-Ig descrise în WO 2007/024715 sau aşa-numitul (FabFv)2Fc descris în WO201 1/030107. Astfel, anticorpul utilizat aici include anticorpi bi, tri sau tetravalenţi de lungime completă.

[0142] Fragmentele de legare ale anticorpilor includ anticorpi cu un singur lanţ (adică un lanţ greu complet şi un lanţ uşor); Fab, Fab modificat, Fab', Fab' modificat, F(ab')2, Fv, Fab-Fv, Fab-dsFv, Fab-scFv, Fab-scFc, Fab-scFv stabilizat cu disulfură, anticorpi cu un singur domeniu (de exemplu, VH sau VL sau VHH), scFv, scFv-scFc, dsscFv, dsscFv-scFc, anticorpi bi, tri sau tetravalenţi, Bis-scFv, diacorpi, tricorpi, triacorpi, tetracorpi, anticorpi de domeniu (dAb), cum ar fi sdAb, fragmente VHH şi V AR şi fragmente de legare a epitopilor ale oricăruia dintre cele de mai sus (vezi, de exemplu, Holliger şi Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9): 1126-1136; Adair şi Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217). Metodele de creare şi fabricare a acestor fragmente de anticorpi sunt bine cunoscute în domeniu (vezi, de exemplu, Verma şi colab., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181). Formatul Fab-Fv a fost descris pentru prima dată în WO2009/040562, iar versiunile sale stabilizate cu disulfură, Fab-dsFv, au fost descrise pentru prima dată în WO2010/035012. O formă stabilizată cu disulfură de Fab-scFv a fost descrisă în WO2013/068571. Formatele de anticorpi care cuprind formate scFc au fost descrise pentru prima dată în WO2008/012543. Alte fragmente de anticorpi pentru utilizare în prezenta invenţie includ fragmentele Fab şi Fab' descrise în cererile de brevet internaţionale WO2005/003169, WO2005/003170 şi WO2005/003171.

[0143] Anticorpii multivalenţi pot cuprinde specificităţi multiple, de exemplu, bispecifici sau pot fi monospecifici (vezi, de exemplu, W092/22583 şi WO05/113605). Un astfel de exemplu în acest ultim caz este un Tri-Fab (sau TFM) aşa cum este descris în W092/22583.

[0144] Într-un exemplu de realizare, fragmentul izolat de legare a anticorpului de legare Tau din prezenta invenţie este un fragment Fab.

[0145] Într-un exemplu de realizare, fragmentul izolat de legare a anticorpului de legare Tau din prezenta invenţie este un fragment Fab'.

[0146] O moleculă Fab' tipică cuprinde o pereche de lanţuri grele şi un lanţ uşor, în care lanţul greu cuprinde o regiune variabilă VH, un domeniu constant CH1 şi o regiune balama naturală sau modificată, iar lanţul uşor cuprinde o regiune variabilă VL şi un domeniu constant CL.

[0147] Într-un exemplu de realizare, este prevăzut un dimer al unui Fab' conform prezentei dezvăluiri pentru a crea un F(ab')2, de exemplu, dimerizarea se poate face prin balama.

[0148] Se va aprecia că afinitatea anticorpilor care leagă Tau sau a fragmentelor de legare ale acestora, prevăzută în prezenta dezvăluire, poate fi modificată folosind metode adecvate cunoscute în domeniu. Prin urmare, prezenta invenţie se referă şi la variante ale moleculelor de anticorpi din prezenta invenţie, care au o afinitate îmbunătăţită pentru Tau, cu condiţia ca acestea să fie încă un anticorp izolat care leagă Tau sau un fragment de legare al acestuia, care cuprinde

[0149] o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde un CDRI selectat din SEQ ID No.: 1, un CDR2 selectat din SEQ ID No.: 2 şi un CDR3 selectat din SEQ ID No.: 3; şi o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde un CDRI selectat din SEQ ID No.: 4, un CDR2 selectat din SEQ ID No.: 5 şi un CDR3 selectat din SEQ ID No.: 6.

[0150] Astfel de variante pot fi obţinute printr-o serie de protocoale de maturare a afinităţii, inclusiv mutarea CDR-urilor (Yang şi colab., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), amestecarea lanţului (Marks şi colab., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), utilizarea tulpinilor mutatoare de E. E. coli (Low şi colab., J. Mal.Biol., 250, 359-368, 1996), amestecarea ADN-ului (Patten şi colab., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), expunerea fagică (Thompson şi colab., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) şi PCR sexuală (Crameri şi colab., Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan şi colab. (supra) discută aceste metode de maturare a afinităţii.

[0151] Anticorpii care leagă Tau şi fragmentele de legare ale acestora pot, prin urmare, să cuprindă oricare dintre secvenţele de aminoacizi menţionate în mod specific, de exemplu, anterior, ale lanţurilor uşoare sau grele cu una sau mai multe substituţii conservative (de exemplu, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 sau 15 substituţii conservative), cu condiţia ca acestea să fie totuşi un anticorp izolat care leagă Tau sau un fragment de legare al acestuia, în care anticorpul sau fragmentul de legare al acestuia cuprinde o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde

[0152] o CDR1 selectată din SEQ ID No.: 1, o CDR2 selectată din SEQ ID No.: 2 şi o CDR3 selectată din SEQ ID No.: 3; şi o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde o CDR1 selectată din SEQ ID No.: 4, o CDR2 selectată din SEQ ID No.: 5 şi o CDR3 selectată din SEQ ID No.: 6.

[0153] Se pot determina poziţiile unei secvenţe de aminoacizi care sunt candidate pentru substituţii conservative şi se pot selecta aminoacizi sintetici şi naturali care efectuează substituţii conservative pentru orice aminoacid particular. Consideraţiile pentru selectarea substituţiilor conservative includ contextul în care se face orice substituţie particulară de aminoacid, hidrofobicitatea sau polaritatea lanţului lateral, dimensiunea generală a lanţului lateral şi valoarea pK a lanţurilor laterale cu caracter acid sau bazic în condiţii fiziologice. De exemplu, lizina, arginina şi histidina sunt adesea substituite în mod corespunzător una cu cealaltă. După cum se ştie în domeniu, acest lucru se datorează faptului că toţi cei trei aminoacizi au lanţuri laterale bazice, în timp ce valoarea pK pentru lanţurile laterale ale lizinei şi argininei este mult mai apropiată una de cealaltă (aproximativ 10 şi 12) decât pentru histidina (aproximativ 6). În mod similar, glicina, alanina, valina, leucina şi izoleucina sunt adesea substituite în mod corespunzător unele cu altele, cu condiţia ca glicina să nu fie frecvent substituită în mod corespunzător cu ceilalţi membri ai grupului. Alte grupe de aminoacizi frecvent substituiţi în mod corespunzător unul cu celălalt includ, dar fără a se limita la, grupa constând din acizi glutamic şi aspartic; grupa constând din fenilalanină, tirozină şi triptofan; şi grupa constând din serină, treonină şi, opţional, tirozină.

[0154] Anticorpii care leagă Tau şi fragmentele de legare ale acestora, aşa cum sunt menţionaţi în contextul prezentei invenţii, pot cuprinde derivaţi ai anticorpilor, fragmentelor şi secvenţelor exemplificative descrise aici. „Derivaţii» includ anticorpi care leagă Tau şi fragmente de legare ale acestora, care au fost modificaţi chimic. Exemple de modificare chimică includ ataşarea covalentă a unuia sau mai multor polimeri, cum ar fi polimerii solubili în apă, carbohidraţii legaţi la N sau la O, zaharurile, fosfaţii şi/sau alte astfel de molecule, cum ar fi etichetele detectabile, cum ar fi fluoroforii.

[0155] Dacă se doreşte, un anticorp care se leagă de Tau sau un fragment de legare al acestuia pentru utilizare în prezenta invenţie poate fi astfel conjugat cu una sau mai multe molecule efectoare. Se va înţelege că molecula efectoare poate cuprinde o singură moleculă efectoare sau două sau mai multe astfel de molecule legate astfel încât să formeze o singură grupare care poate fi ataşată la anticorpii prezentei invenţii. Acolo unde se doreşte obţinerea unui fragment de anticorp legat de o moleculă efectoare, acesta poate fi preparat prin proceduri chimice standard sau de ADN recombinant, în care fragmentul de anticorp este legat fie direct, fie prin intermediul unui agent de cuplare la molecula efectoare. Tehnicile de conjugare a unor astfel de molecule efectoare cu anticorpi sunt bine cunoscute în domeniu (vezi Hellstrom şi colab., Controlled Drug Delivery, ediţia a 2-a, Robinson şi colab., eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe şi colab., 1982, Imunol. Rev., 62: 119-58 şi Dubowchik şi colab., 1999, Farmacologie şi Terapeutică, 83, 67-123). Aceste tehnici de conjugare a moleculelor efectoare pot include conjugare specifică unui loc sau conjugare nespecifică unui loc sau aleatorie. Procedurile chimice particulare includ, de exemplu, cele descrise în WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 şi WO 03/031581. Alternativ, acolo unde molecula efectoare este o proteină sau o polipeptidă, legarea poate fi realizată folosind proceduri de ADN recombinant, de exemplu aşa cum este descris în WO 86/01533 şi EP0392745. Alternativ, un anumit situs de ataşare pentru molecula efectoare poate fi introdus prin inginerie în anticorpul sau fragmentul de legare a antigenului acestuia conform invenţiei, de exemplu aşa cum este descris în WO 2008/038024. În plus, se poate utiliza un agent de cuplare pentru a lega molecula efector la anticorpul sau fragmentul de legare a antigenului acestuia conform invenţiei, de exemplu aşa cum este descris în WO 2005/1 13605. Un specialist în domeniu va înţelege că posibilităţile menţionate mai sus pot fi utilizate individual sau în combinaţie.

[0156] Termenul moleculă efector, aşa cum este utilizat aici, include, de exemplu, medicamente, toxine, proteine biologic active, de exemplu enzime, alţi anticorpi sau fragmente de anticorpi, polimeri sintetici sau naturali, acizi nucleici şi fragmente ale acestora, de exemplu. ADN, ARN şi fragmente ale acestora, radionuclizi, în special iodură radioactivă, radioizotopi, metale chelate, nanoparticule şi grupuri reporter, cum ar fi compuşi fluorescenţi sau compuşi care pot fi detectaţi prin spectroscopie RMN sau ESR. Molecula efectoare aşa cum este utilizată aici include, de asemenea, agenţi terapeutici, cum ar fi agenţi chimioterapeutici, polipeptide terapeutice, nanoparticule, lipozomi sau acizi nucleici terapeutici.

[0157] Alte molecule efectoare pot include radionuclizi chelaţi, cum ar fi 90Y, Lu177, Bismut213, Californiu252, Iridiu192 şi Tungsten188/Reniu188; sau medicamente, cum ar fi, dar fără a se limita la, alchilfosfocoline, inhibitori de topoizomerază I, taxoizi şi suramină.

[0158] Alte molecule efectoare includ proteine, peptide şi enzime. Enzimele de interes includ, dar fără a se limita la, enzime proteolitice, hidrolaze, liaze, izomeraze, transferaze. Proteinele, polipeptidele şi peptidele de interes includ, dar nu se limitează la, imunoglobuline, toxine precum abrina, ricina A, exotoxina Pseudomonas sau toxina difterică, o proteină precum insulina, factorul de necroză tumorală, α-interferonul, β-interferonul, factorul de creştere nervoasă, factorul de creştere derivat din trombocite sau activatorul plasminogenului tisular, un agent trombotic sau un agent anti-angiogenic, de exemplu angiostatină sau endostatină, sau un modificator al răspunsului biologic, cum ar fi o limfokină, interleukina-1 (IL-I), interleukina-2 (IL-2), factorul de stimulare a coloniilor de granulocite şi macrofage (GM-CSF), factorul de stimulare a coloniilor de granulocite (G-CSF), factorul de creştere nervoasă (NGF) sau alţi factori de creştere şi imunoglobuline, sau alţi compuşi proteici sau polipeptidici care cuprind mai mult de 10 aminoacizi şi care se bazează pe schele proteice, de exemplu... din lipocalină („anticaline»), fibronectină („adnectine», trinectine), domenii kunitz, lectină de tip C, transferină, gamma-cristalină, cisteinote, repetiţii de ankirină („DARPine»), domenii Fyn SH3 („fynomeri») sau proteina A („aficorpi»), aşa cum sunt cunoscute în domeniu (Tomlinson, 2004; Mosavi şi colab., 2004; Gill şi Damle, 2006; Nilsson şi Tolmachev, 2007; Binz şi colab., 2004; Silacci şi colab., 2014). Alte molecule efectoare includ peptide şi proteine care sporesc sau facilitează penetrarea barierei hematoencefalice. De exemplu, WO2010/043047, WO2010/063122, WO2010/063123 sau WO201 1/041897 descriu peptide sau polipeptide care pot acţiona ca vectori capabili să transporte o moleculă terapeutică prin bariera hematoencefalică şi o metodă de conjugare a acestora la o moleculă terapeutică. Peptidele şi proteinele de interes în contextul penetrării barierei hematoencefalice includ, dar nu se limitează la, peptide şi proteine care se leagă de un receptor al barierei hematoencefalice, cum ar fi receptorul de transferină, receptorul de glucoză, receptorul de insulină, receptorul factorului de creştere asemănător insulinei, proteina 8 legată de receptorul lipoproteinelor cu densitate mică, proteina 1 legată de receptorul lipoproteinelor cu densitate mică şi factorul de creştere asemănător factorului de creştere epidermal care se leagă de heparină. Alternativ, molecula efectoare este un fragment de anticorp, cum ar fi un anticorp de domeniu, un anticorp de camelide sau un anticorp derivat de rechin (VNAR), care se leagă specific de unul dintre receptorii barierei hematoencefalice de mai sus.

[0159] Alte molecule efectoare pot include substanţe detectabile utile, de exemplu în diagnosticare. Exemple de substanţe detectabile includ diverse enzime, grupuri prostetice, materiale fluorescente, materiale luminescente, materiale bioluminescente, nuclizi radioactivi, metale emiţătoare de pozitroni, cum ar fi cele utilizate în tomografia cu emisie de pozitroni sau tomografia computerizată cu emisie de fotoni unici şi ioni metalici paramagnetici neradioactivi. Vezi în general brevetul american nr. 4.741.900 pentru ionii metalici care pot fi conjugaţi cu anticorpi pentru utilizare ca instrumente de diagnostic. Enzimele adecvate includ peroxidaza de hrean, fosfataza alcalină, beta-galactozidaza sau acetilcolinesteraza; grupările prostetice adecvate includ streptavidina, avidina şi biotina; materialele fluorescente adecvate includ umbeliferona, fluoresceina, izotiocianat de fluoresceină, rodamina, fluoresceina de diclorotriazinilamină, clorura de dansil şi ficoeritrina; materialele luminescente adecvate includ luminolul; materialele bioluminescente adecvate includ luciferaza, luciferina şi aequorina; iar nuclizii radioactivi adecvaţi includ 124I 125I, 131I,111In, 99Tc, 89Zr, 90Y, 64Cu, 68Ga şi 18F. Un anumit tip de molecule efectoare potrivite ca substanţe detectabile utile pentru diagnostic includ tetrazine cu deficit de electroni şi trans-ciclooctenă (TCO), aşa cum este descris în Wyffels şi colab. 2014, Nuclear Medicine and biology 41 (2014):513-523, unde un anticorp de legare a Tau conform invenţiei, legat de tetrazină, poate fi administrat şi lăsat să atingă o absorbţie maximă şi o eliminare suficientă din situsurile neţintă, urmată de administrarea ulterioară de TCO sau un analog TCO optimizat, marcat cu un nuclid radioactiv adecvat, astfel încât TCO să se lege covalent de tetrazină pe anticorpul de legare a Tau conform invenţiei şi să permită detectarea acesteia, de exemplu, prin tomografie cu emisie de pozitroni sau tomografie computerizată cu emisie cu un singur foton.

[0160] Într-o formă de realizare, este prevăzut un Fab, Fab' sau scFv care leagă Tau, legat de un nuclid radioactiv sau de tetrazină. Legăturile la un nuclid radioactiv sau la tetrazină se pot face prin ataşare prin orice grup funcţional de aminoacid disponibil în catena laterală sau grup funcţional de aminoacid terminal situat în fragmentul de anticorp, de exemplu orice grup amino, imino, tiol, hidroxil sau carboxil liber. Astfel de aminoacizi pot apărea în mod natural în fragmentul de anticorp sau pot fi introduşi prin inginerie genetică în fragment folosind metode de ADN recombinant (a se vedea, de exemplu, US 5.219.996; US 5.667.425; W098/25971, WO2008/038024). Într-un exemplu, anticorpul care leagă Tau sau fragmentul de legare al acestuia din prezenta invenţie este un fragment Fab modificat, în care modificarea constă în adăugarea la capătul C-terminal al lanţului său greu a unuia sau mai multor aminoacizi pentru a permite ataşarea unei molecule efectoare. În mod convenabil, aminoacizii suplimentari formează o regiune balama modificată care conţine unul sau mai multe reziduuri de cisteină de care poate fi ataşată molecula efectoare. Într-o formă de realizare, dacă radionuclidul este un ion metalic, cum ar fi 99Tc, 89Zr, 90Y, 64Cu sau 68Ga, acesta poate fi legat de un chelator de macrocicluri, de exemplu aşa cum este descris de Turner şi colab. (Br. J. Cancer, 1994, 70:35-41; Biodistribuţia comparativă a conjugatelor de anticorpi himerici B72.3 macrociclici marcaţi cu indiu-III la şoareci purtători de tumori), acesta din urmă fiind la rândul său legat covalent de catena laterală de aminoacizi sau de gruparea sau grupurile funcţionale de aminoacizi terminale menţionate anterior ale anticorpului sau fragmentului de anticorp. Într-o altă realizare, ultimul chelat macrociclic cu radionuclid legat poate fi molecula efector descrisă în WO05/113605, care face parte dintr-un agent de reticulare ce leagă doi sau mai mulţi anticorpi anti-Tau sau fragmente ale acestora.

[0161] Într-un alt exemplu, molecula efectoare poate creşte timpul de înjumătăţire al anticorpului in vivo şi/sau poate reduce imunogenitatea anticorpului şi/sau poate îmbunătăţi livrarea unui anticorp printr-o barieră epitelială către sistemul imunitar. Exemple de molecule efectoare adecvate de acest tip includ polimeri, albumină şi proteine care leagă albumina sau compuşi care leagă albumina, cum ar fi cei descrişi în WO05/1 17984.

[0162] În cazul în care o astfel de moleculă efectoare este un polimer, aceasta poate fi, în general, un polimer sintetic sau natural, de exemplu un polimer polialchilen, polialchenilen sau polioxialchilen cu catenă liniară sau ramificată, opţional substituit, sau un polizaharid ramificat sau neramificat, de exemplu un homo- sau hetero-polisaharid.

[0163] Substituenţii opţionali specifici care pot fi prezenţi pe polimerii sintetici menţionaţi mai sus includ una sau mai multe grupări hidroxi, metil sau metoxi.

[0164] Exemple specifice de polimeri sintetici includ poli(etilenglicol) cu catenă liniară sau ramificată opţional substituită, poli(propilenglicol), poli(alcool vinilic) sau derivaţi ai acestora, în special poli(etilenglicol) opţional substituit, cum ar fi metoxipoli(etilenglicol) sau derivaţi ai acestuia.

[0165] Polimerii naturali specifici includ lactoza, amiloza, dextranul, glicogenul sau derivaţi ai acestora.

[0166] Într-o formă de realizare, polimerul este albumină sau un fragment al acesteia, cum ar fi albumina serică umană sau un fragment al acesteia.

[0167] Dimensiunea polimerului poate fi variată după cum se doreşte, dar, în general, va fi într-un interval de greutate moleculară medie de la 500Da la 50000Da, de exemplu de la 5000 la 40000Da, cum ar fi de la 20000 la 40000Da. Dimensiunea polimerului poate fi selectată în special pe baza utilizării preconizate a produsului, de exemplu, capacitatea de a se localiza în anumite ţesuturi, cum ar fi creierul, sau de a prelungi timpul de înjumătăţire circulant (pentru o analiză, vezi Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). Astfel, de exemplu, acolo unde produsul este destinat să părăsească circulaţia şi să pătrundă în ţesuturi.

[0168] Polimerii adecvaţi includ un polimer polialchilenic, cum ar fi un poli(etilenglicol) sau, în special, un metoxipoli(etilenglicol) sau un derivat al acestuia, şi în special cu o greutate moleculară în intervalul de la aproximativ 15000 Da la aproximativ 40000 Da.

[0169] Într-un exemplu, anticorpii pentru utilizare în prezenta invenţie sunt ataşaţi la grupări de poli(etilenglicol) (PEG). Într-un exemplu particular, anticorpul este un anticorp care se leagă de Tau sau un fragment de legare al acestuia, iar moleculele de PEG pot fi ataşate prin orice grup funcţional de aminoacid disponibil în catena laterală sau prin orice grup funcţional de aminoacid terminal situat în fragmentul de anticorp, de exemplu orice grup amino, imino, tiol, hidroxil sau carboxil liber. Astfel de aminoacizi pot apărea în mod natural în fragmentul de anticorp sau pot fi introduşi prin inginerie genetică în fragment folosind metode de ADN recombinant (a se vedea, de exemplu, US 5.219.996; US 5.667.425; W098/25971, WO2008/038024). Într-un exemplu, anticorpul care leagă Tau sau fragmentul de legare al acestuia din prezenta invenţie este un fragment Fab modificat, în care modificarea constă în adăugarea la capătul C-terminal al lanţului său greu a unuia sau mai multor aminoacizi pentru a permite ataşarea unei molecule efectoare. În mod convenabil, aminoacizii suplimentari formează o regiune balama modificată care conţine unul sau mai multe reziduuri de cisteină de care poate fi ataşată molecula efectoare. Se pot utiliza mai multe situsuri pentru a ataşa două sau mai multe molecule de PEG.

[0170] În mod adecvat, moleculele de PEG sunt legate covalent printr-o grupare tiol a cel puţin unui reziduu de cisteină situat în fragmentul de anticorp. Fiecare moleculă de polimer ataşată la fragmentul de anticorp modificat poate fi legată covalent de atomul de sulf al unui reziduu de cisteină situat în fragment. Legătura covalentă va fi, în general, o legătură disulfidică sau, în special, o legătură sulf-carbon. În cazul în care o grupare tiol este utilizată ca punct de ataşare, se pot utiliza molecule efectoare activate corespunzător, de exemplu, derivaţi selectivi de tiol, cum ar fi maleimidele şi derivaţii de cisteină. Un polimer activat poate fi utilizat ca material de pornire în prepararea fragmentelor de anticorpi modificaţi cu polimer, aşa cum s-a descris mai sus. Polimerul activat poate fi orice polimer care conţine o grupare tiol reactivă, cum ar fi un acid α-halocarboxilic sau un ester, de exemplu iodoacetamidă, o imidă, de exemplu maleimidă, o vinilsulfonă sau o disulfură. Astfel de materii prime pot fi obţinute comercial (de exemplu de la Nektar, fosta Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, SUA) sau pot fi preparate din materii prime disponibile comercial folosind proceduri chimice convenţionale. Moleculele PEG particulare includ metoxi-PEG-amina 20K (obţinută de la Nektar, fosta Shearwater; Rapp Polymere; şi SunBio) şi M-PEG-SPA (obţinut de la Nektar, fosta Shearwater).

[0171] Într-un alt aspect, prezenta dezvăluire oferă molecule de acid nucleic care cuprind secvenţe de acid nucleic care codifică anticorpi care leagă Tau şi fragmente de legare ale acestora, molecule de acid nucleic care cuprind secvenţe de acid nucleic care codifică lanţurile variabile uşoare şi/sau grele ale acestora şi molecule de acid nucleic care cuprind secvenţe de acid nucleic care codifică CDR1, CDR2 şi/sau CDR3 ale lanţurilor variabile uşoare şi/sau grele ale acestora.

[0172] De exemplu, VL-ul lui AB1 (SEQ ID No.: 7) poate fi codificat de SEQ ID No.: 19). VH-ul lui AB1 (SEQ ID No.: 8) poate fi codificat de SEQ ID No.: 20).

[0173] VL umanizat al SEQ ID nr.: 9 poate fi codificat de SEQ ID nr.: 21. VH-ul umanizat al SEQ ID nr. 12 poate fi codificat de SEQ ID nr. 22, iar VH-ul umanizat al SEQ ID nr. 13 poate fi codificat de SEQ ID nr. 23.

[0174] Lanţul uşor umanizat al SEQ ID nr.: 14 poate fi codificat de SEQ ID nr.: 24. Lanţul greu umanizat al SEQ ID nr.: 17 poate fi codificat de SEQ ID nr.: 25, iar lanţul greu umanizat al SEQ ID nr.: 18 poate fi codificat de SEQ ID nr.: 26. Lanţul greu umanizat al SEQ ID nr.: 54 poate fi codificat de SEQ ID nr.: 56, iar lanţul greu umanizat al SEQ ID nr.: 55 poate fi codificat de SEQ ID nr.: 57.

[0175] Anticorpii care leagă Tau şi fragmentele de legare ale acestora pot fi codificaţi de un singur acid nucleic (de exemplu, un singur acid nucleic care cuprinde secvenţe de nucleotide care codifică polipeptidele lanţului uşor şi greu ale anticorpului) sau de doi sau mai mulţi acizi nucleici separaţi, fiecare dintre aceştia codificând o parte diferită a anticorpului sau fragmentului de anticorp. În acest sens, dezvăluirea oferă unul sau mai mulţi acizi nucleici care codifică oricare dintre anticorpii sau fragmentele de legare menţionate anterior. Moleculele de acid nucleic pot fi ADN, ADNc, ARN şi altele asemenea.

[0176] De exemplu, secvenţele de ADN care codifică o parte sau toate lanţurile grele şi uşoare ale anticorpilor pot fi sintetizate după cum se doreşte, din secvenţele de ADN determinate sau pe baza secvenţelor de aminoacizi corespunzătoare. Codificarea ADN-ului pentru secvenţele cadrului acceptorului este disponibilă pe scară largă specialiştilor în domeniu şi poate fi sintetizată cu uşurinţă pe baza secvenţelor de aminoacizi cunoscute.

[0177] Tehnicile standard de biologie moleculară pot fi utilizate pentru a prepara secvenţe de ADN care codifică molecula de anticorp a prezentei invenţii. Secvenţele de ADN dorite pot fi sintetizate complet sau parţial folosind tehnici de sinteză a oligonucleotidelor. Se pot utiliza, după caz, tehnici de mutageneză direcţionată şi reacţie în lanţ a polimerazei (PCR).

[0178] De preferinţă, secvenţele de acid nucleic care codifică sunt legate operativ de secvenţe de control al expresiei care permit exprimarea în celule procariote sau eucariote. Exprimarea polinucleotidului menţionat cuprinde transcripţia polinucleotidului într-un ARNm translabil. Elementele de reglare care asigură exprimarea în celulele eucariote, de preferinţă în celulele mamiferelor, sunt bine cunoscute de către specialiştii în domeniu. Acestea cuprind de obicei secvenţe reglatoare care asigură iniţierea transcripţiei şi, opţional, semnale poli-A care asigură terminarea transcripţiei şi stabilizarea transcriptului. Elementele de reglare suplimentare pot include amplificatori transcripţionali, precum şi translaţionali şi/sau regiuni promotoare asociate natural sau heteroloage.

[0179] Prezenta invenţie, într-un alt aspect, oferă astfel vectori de clonare sau expresie care cuprind astfel de secvenţe de acid nucleic care codifică anticorpi care leagă Tau şi fragmente de legare ale acestora ai prezentei invenţii.

[0180] Un „vector» este orice moleculă sau compoziţie care are capacitatea de a transporta o secvenţă de acid nucleic într-o celulă gazdă adecvată, unde poate avea loc, de exemplu, sinteza polipeptidei codificate. De obicei şi de preferinţă, un vector este un acid nucleic care a fost modificat genetic, folosind tehnici de ADN recombinant cunoscute în domeniu, pentru a încorpora o secvenţă de acid nucleic dorită (de exemplu, un acid nucleic conform invenţiei). Vectorii de expresie conţin de obicei una sau mai multe dintre următoarele componente (dacă nu sunt deja furnizate de moleculele de acid nucleic): un promotor, una sau mai multe secvenţe enhancer, o origine de replicări, o secvenţă de terminare transcripţională, o secvenţă intron completă care conţine un situs de îmbinare donor şi acceptor, o secvenţă lider pentru secreţie, un situs de legare a ribozomilor, o secvenţă de poliadenilare, o regiune polilinker pentru inserarea acidului nucleic care codifică polipeptida care urmează să fie exprimată şi un element marker selectabil.

[0181] Vectorii sunt de obicei selectaţi pentru a fi funcţionali în celula gazdă în care va fi utilizat vectorul (vectorul este compatibil cu mecanismul celulei gazdă astfel încât să poată avea loc amplificarea genei şi/sau exprimarea genei).

[0182] Prezenta invenţie, într-un alt aspect, oferă astfel celule gazdă care cuprind vectori de clonare sau expresie aşa cum sunt descrişi mai sus şi/sau secvenţe de acid nucleic care codifică anticorpi de legare a proteinei Tau şi fragmente de legare ale acestora aşa cum sunt descrise mai sus.

[0183] Celula gazdă poate fi orice tip de celulă capabilă să fie transformată cu acidul nucleic sau vectorul astfel încât să producă un anticorp care se leagă de Tau sau un fragment de legare al acestuia, codificat de acesta. Celula gazdă care cuprinde acidul nucleic sau vectorul poate fi utilizată pentru a produce anticorpul de legare a proteinei Tau sau un fragment de legare al acestuia sau o porţiune a acestuia (de exemplu, o secvenţă de lanţ greu sau o secvenţă de lanţ uşor codificată de acidul nucleic sau vector). După introducerea acidului nucleic sau a vectorului în celulă, celula este cultivată în condiţii adecvate pentru exprimarea secvenţei codificate. Anticorpul, fragmentul de legare a antigenului sau porţiunea de anticorp poate fi apoi izolată din celulă.

[0184] Celulele gazdă pot fi celule gazdă procariote (cum ar fi E. coli) sau celule gazdă eucariote (cum ar fi o celulă de drojdie, o celulă de insectă sau o celulă de vertebrate). Celula gazdă, atunci când este cultivată în condiţii adecvate, exprimă un anticorp sau un fragment de legare al acestuia, care poate fi ulterior colectat din mediul de cultură (dacă celula gazdă îl secretă în mediu) sau direct din celula gazdă care îl produce (dacă nu este secretat). Selecţia unei celule gazdă adecvate va depinde de diverşi factori, cum ar fi nivelurile de expresie dorite, modificările polipeptidice dezirabile sau necesare pentru activitate, cum ar fi glicozilarea sau fosforilarea, şi uşurinţa plierii într-o moleculă biologic activă. Selecţia celulei gazdă va depinde parţial de dacă anticorpul sau fragmentul de legare al acestuia urmează să fie modificat post-transcripţional (de exemplu, glicozilat şi/sau fosforilat). Dacă da, sunt preferabile celulele gazdă de la drojdie, insecte sau mamifere.

[0185] Celulele gazdă de mamifere adecvate includ celule CHO, celule de mielom sau hibridom. Tipurile adecvate de ovari de hamster chinezesc (celule CHO) pentru utilizare în prezenta invenţie pot include celule CHO şi CHO-K1, inclusiv celule dhfr-CHO, cum ar fi celulele CHO-DG44 şi celulele CHODXB11 şi care pot fi utilizate cu un marker selectabil DHFR sau celule CHOKI-SV care pot fi utilizate cu un marker selectabil de glutamină sintetază. Multe sunt disponibile de la American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Virginia. Exemplele includ celule de mamifere, cum ar fi celulele ovariene de hamster chinezesc (CHO) (nr. ATCC CCL61), celulele renale embrionare umane (HEK) 293 sau 293T (nr. ATCC CRL1573), celulele 3T3 (nr. ATCC CCL92) sau celulele PER.C6. Alte tipuri de celule utilizate în exprimarea anticorpilor includ liniile celulare limfocitare, de exemplu Celule de mielom NSO şi celule SP2, celule COS.

[0186] Un alt aspect al prezentei invenţii oferă un procedeu pentru producerea unui anticorp care leagă Tau sau a unui fragment de legare al acestuia, cuprinzând cultivarea unei celule gazdă care conţine, de exemplu, un vector, în condiţii adecvate pentru a conduce la exprimarea unui anticorp care leagă Tau sau a unui fragment de legare al acestuia, de exemplu, din ADN care codifică anticorpul care se leagă de Tau sau fragmentul de legare al acestuia şi izolarea moleculei de anticorp. În particular, prezenta invenţie oferă o metodă de producere a unui anticorp care leagă Tau sau a unui fragment de legare al acestuia, conform prezentei invenţii, cuprinzând cel puţin etapele de a) cultivare a unei celule gazdă conform prezentei invenţii; şi b) izolare a respectivului anticorp care leagă Tau sau a fragmentului de legare al acestuia.

[0187] Pentru producerea de produse care cuprind atât lanţuri grele, cât şi lanţuri uşoare, linia celulară poate fi transfectată cu doi vectori, un prim vector care codifică o polipeptidă cu lanţ uşor şi un al doilea vector care codifică o polipeptidă cu lanţ greu. Alternativ, se poate utiliza un singur vector, vectorul incluzând secvenţe care codifică polipeptide cu lanţ uşor şi lanţ greu.

[0188] Anticorpul care leagă Tau sau fragmentul de legare al acestuia, anticorpii şi fragmentele conform prezentei dezvăluiri, sunt exprimate la niveluri bune din celulele gazdă. Astfel, proprietăţile anticorpilor şi/sau fragmentelor sunt favorabile procesării comerciale.

[0189] Astfel, este furnizat un procedeu pentru cultivarea unei celule gazdă şi exprimarea anticorpului care leagă Tau sau a fragmentului de legare al acestuia, izolarea acestuia din urmă şi, opţional, purificarea acestuia pentru a furniza un anticorp izolat care leagă Tau sau un fragment de legare al acestuia. Într-o formă de realizare, procesul cuprinde în plus etapa de conjugare a unei molecule efectoare la anticorpul sau fragmentul izolat, de exemplu conjugarea la un polimer PEG în special aşa cum este descris aici.

[0190] Anticorpul care leagă Tau sau fragmentul de legare al acestuia poate fi formulat în compoziţii, în special compoziţii farmaceutice sau de diagnostic. Compoziţiile farmaceutice cuprind o cantitate eficientă terapeutic sau profilactic dintr-un anticorp care leagă Tau sau un fragment de legare al acestuia în amestec cu un purtător adecvat, de exemplu, un agent acceptabil farmaceutic. Compoziţiile de diagnostic cuprind o cantitate eficientă din punct de vedere diagnostic dintr-un anticorp care leagă Tau sau un fragment de legare al acestuia în amestec cu un purtător adecvat, de exemplu, un agent acceptabil din punct de vedere diagnostic.

[0191] Agenţii farmaceutic acceptabili pentru utilizare în prezentele compoziţii farmaceutice includ purtători, excipienţi, diluanţi, antioxidanţi, conservanţi, coloranţi, agenţi de aromatizare şi diluare, agenţi de emulsionare, agenţi de suspendare, solvenţi, agenţi de umplutură, agenţi de încărcare, agenţi tampon, vehicule de livrare, agenţi de tonicitate, cosolvenţi, agenţi de umectare, agenţi de complexare, agenţi de tamponare, agenţi antimicrobieni şi surfactanţi.

[0192] Compoziţia poate fi sub formă lichidă sau sub formă liofilizată sau liofilizată şi poate include unul sau mai mulţi lioprotectori, excipienţi, surfactanţi, aditivi structurali cu greutate moleculară mare şi/sau agenţi de încărcare (a se vedea, de exemplu, brevetele SUA 6.685.940, 6.566.329 şi 6.372.716).

[0193] Compoziţiile pot fi potrivite pentru administrare parenterală. Compoziţiile exemplificative sunt potrivite pentru injectare sau perfuzie într-un animal prin orice cale disponibilă lucrătorului specializat, cum ar fi calea intraarticulară, subcutanată, intravenoasă, intramusculară, intraperitoneală, intracerebrală (intraparenchimatoasă), intracerebroventriculară, intramusculară, intraoculară, intraarterială sau intralezională. O formulare parenterală va fi de obicei o soluţie apoasă sterilă, apirogenă, izotonică, conţinând opţional conservanţi acceptabili farmaceutic.

[0194] Exemple de solvenţi neapoşi sunt propilen glicolul, polietilen glicolul, uleiurile vegetale, cum ar fi uleiul de măsline, şi esterii organici injectabili, cum ar fi oleatul de etil. Purtătorii apoşi includ apa, soluţiile alcoolice/apoase, emulsiile sau suspensiile, inclusiv soluţiile saline şi mediile tamponate. Vehiculele parenterale includ soluţie de clorură de sodiu, dextroză Ringer, dextroză şi clorură de sodiu, dextroză Ringer lactată sau uleiuri fixe. Vehiculele intravenoase includ agenţi de reaprovizionare cu fluide şi nutrienţi, agenţi de reaprovizionare cu electroliţi, cum ar fi cei pe bază de dextroză Ringer şi altele asemenea. Pot fi prezenţi şi conservanţi şi alţi aditivi, cum ar fi, de exemplu, antimicrobieni, antioxidanţi, agenţi de chelare, gaze inerte şi altele asemenea. Vezi în general, Remington's Pharmaceutical Science, ediţia a 16-a, Mack Eds., 1980.

[0195] Compoziţiile farmaceutice descrise în acest document pot fi formulate pentru administrare controlată sau susţinută într-un mod care asigură o concentraţie locală a produsului (de exemplu, bolus, efect de depot) şi/sau o stabilitate sau un timp de înjumătăţire crescut într-un anumit mediu local. Compoziţiile pot include formularea de anticorpi, fragmente de legare, acizi nucleici sau vectori ai invenţiei cu preparate particulare de compuşi polimerici, cum ar fi acidul polilactic, acidul poliglicolic etc., precum şi agenţi, cum ar fi o matrice biodegradabilă, microsfere injectabile, particule microcapsulare, microcapsule, sfere de particule bioerodabile, lipozomi şi dispozitive de administrare implantabile care asigură eliberarea controlată sau susţinută a agentului activ, care poate fi apoi administrat ca injecţie depot.

[0196] Alternativ sau suplimentar, compoziţiile pot fi administrate local prin implantare în zona afectată a unei membrane, burete sau alt material adecvat pe care a fost absorbit sau încapsulat un anticorp, un fragment de legare, un acid nucleic sau un vector al invenţiei. În cazul în care se utilizează un dispozitiv de implantare, acesta poate fi implantat în orice ţesut sau organ adecvat, iar administrarea unui anticorp, fragment de legare, acid nucleic sau vector al invenţiei se poate face direct prin dispozitiv, prin bolus, prin administrare continuă sau prin cateter, utilizând perfuzie continuă.

[0197] O compoziţie farmaceutică care cuprinde un anticorp care leagă Tau sau un fragment de legare al acestuia poate fi formulată pentru inhalare, cum ar fi, de exemplu, sub formă de pulbere uscată. Soluţiile de inhalare pot fi, de asemenea, formulate într-un agent propulsor lichefiat pentru administrare sub formă de aerosoli. Într-o altă formulare, soluţiile pot fi nebulizate.

[0198] Un aspect al prezentei dezvăluiri se referă la utilizarea anticorpilor care leagă Tau şi a fragmentelor de legare ale acestora ca agent terapeutic activ în tratamentul bolilor. În particular, prezenta invenţie oferă un anticorp izolat care se leagă de Tau sau un fragment de legare al acestuia, conform prezentei invenţii, pentru utilizare ca agent terapeutic activ.

[0199] Un alt aspect al prezentei dezvăluiri se referă la utilizarea anticorpilor care leagă Tau şi a fragmentelor de legare ale acestora în tratamentul tauopatiilor. În particular, prezenta invenţie oferă un anticorp izolat care leagă Tau sau un fragment de legare al acestuia, conform prezentei invenţii, pentru utilizare în tratarea unei taupatii. Tauopatiile despre care s-a descris că conţin incluziuni Tau (Clavaguera et al. Brain Pathology 23 (2013) 342-349) includ boala Alzheimer (BA); scleroză laterală amiotrofică/complex parkinsonism-demenţă; boala argirofilă a granulelor; encefalopatie traumatică cronică; degenerescenţă corticobazală; încurcături neurofibrilare difuze cu calcificare; sindrom Down; demenţă britanică familială; demenţă daneză familială; demenţă frontotemporală şi parkinsonism legate de cromozomul 17 cauzate de mutaţii MAPT; boala Gerstmann-Straussler-Scheinker; parkinsonism guadelupean; distrofie miotonică; neurodegenerare cu acumulare de fier în creier; boala Niemann-Pick, tip C; boala neuronului motor non-guamaniană cu încurcături neurofibrilare; boala Pick; parkinsonism postencefalitic; angiopatie amiloidă cerebrală cauzată de proteine prionice; glioză subcorticală progresivă; paralizie supranucleară progresivă (PSP); Retard mintal asociat cu SLC9A6; Panencefalită sclerozantă subacută; Demenţă numai cu noduli încurcaţi; şi Tauopatie a substanţei albe cu incluziuni gliale globulare.

[0200] Un alt aspect al prezentei dezvăluiri se referă astfel la un anticorp care leagă Tau sau la un fragment de legare al acestuia pentru utilizare în metodele de tratament al bolii Alzheimer şi/sau al paraliziei supranucleare progresive. Metodele includ administrarea unei cantităţi terapeutic active dintr-un anticorp care leagă Tau sau un fragment de legare al acestuia unui subiect care are nevoie de acesta.

[0201] Într-un alt aspect al prezentei dezvăluiri, anticorpul care leagă Tau sau fragmentul de legare al acestuia poate fi utilizat fie singur, fie în combinaţie cu alţi agenţi într-o terapie. De exemplu, anticorpul care leagă Tau sau fragmentul de legare al acestuia poate fi administrat concomitent cu cel puţin un agent terapeutic suplimentar. În anumite aspecte, un agent terapeutic suplimentar este un agent terapeutic eficient în tratarea aceleiaşi tulburări sau a unei tulburări diferite faţă de cea utilizată pentru tratarea anticorpului de legare a proteinei Tau sau a fragmentului de legare al acestuia. Printre agenţii terapeutici suplimentari exemplificaţi se numără, dar nu se limitează la: inhibitori de colinesterază (cum ar fi donepezil, galantamina, rovastigmina şi tacrina), antagonişti ai receptorilor NMDA (cum ar fi memantina), inhibitori ai agregării peptidei beta amiloide, antioxidanţi, modulatori ai gama-secretază, imitatori ai factorului de creştere nervoasă (GF) sau terapie genică NGF, agonişti PPARy, inhibitori ai HMS-CoA reductazei (statine), ampakine, blocante ale canalelor de calciu, antagonişti ai receptorilor GABA, inhibitori ai kinazei glicogen sintazei, imunoglobulină intravenoasă, agonişti ai receptorilor muscarinici, modulatori ai receptorilor nicotinici, imunizare activă sau pasivă cu peptidă beta amiloidă, inhibitori ai fosfodiesterazei, antagonişti ai receptorilor serotoninei şi anticorpi anti-peptidă beta amiloidă sau alţi anticorpi anti-tau. Alte medicamente neurologice exemplificative pot fi selectate dintre un hormon de creştere sau un factor neurotrofic; Exemplele includ, dar nu se limitează la, factorul neurotrofic derivat din creier (BDNF), factorul de creştere nervoasă (GF), neurotrofina-4/5, factorul de creştere a fibroblastelor (FGF)-2 şi alţi FGF, neurotrofina (NT)-3, eritropoietină (EPO), factorul de creştere a hepatocitelor (HGF), factorul de creştere epidermal (EGF), factorul de creştere transformant (TGF)-alha, TGF-beta, factorul de creştere endotelial vascular (VEGF), antagonist al receptorului de interleukină-1 (IL-lra), factorul neurotrofic ciliar (CNTF), factorul neurotrofic derivat din glie (GDNF), neurturină, factorul de creştere derivat din trombocite (PDGF), heregulină, neuregulină, artemină, persefină, interleukine, factor neurotrofic derivat din linia celulară glială (GFR), factorul de stimulare a coloniilor de granulocite (CSF), CSF granulocite-macrofage, netrine, cardiotrofină-1, hedgehogs, factorul inhibitor al leucemiei (LIF), midkină, pleiotrofină, os proteine morfogenetice (BMP), netrine, sapozine, semaforine şi factor de celule stem (SCF). În anumite variante de realizare, cel puţin un agent terapeutic suplimentar este selectat pentru capacitatea sa de a atenua unul sau mai multe efecte secundare ale medicamentului neurologic. Astfel de terapii combinate menţionate mai sus cuprind administrarea combinată (unde doi sau mai mulţi agenţi terapeutici sunt incluşi în aceleaşi formulări sau în formulări separate) şi administrarea separată, caz în care administrarea anticorpului care leagă Tau sau a fragmentului de legare al acestuia poate avea loc înainte, simultan şi/sau după administrarea agentului terapeutic suplimentar şi/sau adjuvantului. Anticorpii care leagă proteina Tau sau fragmentele de legare ale acestora pot fi, de asemenea, utilizaţi în combinaţie cu alte terapii intervenţionale, cum ar fi, dar fără a se limita la, radioterapia, terapia comportamentală sau alte terapii cunoscute în domeniu şi adecvate pentru tulburarea neurologică care urmează să fie tratată sau prevenită.

[0202] Un alt aspect al prezentei dezvăluiri se referă la utilizarea anticorpilor care leagă Tau şi a fragmentelor de legare ale acestora ca agent activ din punct de vedere metodic pentru diagnostic in vivo.

[0203] Un aspect al prezentei dezvăluiri se referă, de asemenea, la utilizarea anticorpilor care leagă Tau şi a fragmentelor de legare ale acestora în diagnosticarea tauopatiilor, în special a bolii Alzheimer şi/sau a paraliziei supranucleare progresive.

[0204] Teste diagnostice pot fi efectuate, de preferinţă, pe probe biologice. O „probă biologică» cuprinde o varietate de tipuri de probe obţinute de la un individ şi poate fi utilizată într-un test de diagnostic sau de monitorizare. Definiţia cuprinde lichidul cefalorahidian, sângele şi alte probe lichide de origine biologică, probele de ţesut solid, cum ar fi probele de biopsie sau culturile de ţesuturi sau celulele derivate din acestea, precum şi urmaşii acestora. Definiţia include şi probe care au fost manipulate în orice mod după prelevare, cum ar fi prin tratare cu reactivi, solubilizare sau îmbogăţire cu anumite componente, cum ar fi polinucleotidele. Termenul „probă biologică» cuprinde o probă clinică şi include, de asemenea, celule în cultură, supernatante celulare, lizate celulare, ser, plasmă, fluide biologice şi probe de ţesut. Termenul „probă biologică» include urina, saliva, lichidul cefalorahidian, fracţiunile de sânge, cum ar fi plasma şi serul, şi altele asemenea.

[0205] Testele de diagnostic pot fi efectuate, de preferinţă, pe probe biologice care nu intră în contact cu corpul uman sau animal. Un astfel de test de diagnostic este denumit şi test in vitro.

[0206] Testarea diagnostică in vitro se poate baza pe o metodă in vitro de detectare a proteinei Tau într-o probă biologică obţinută de la un individ, cuprinzând etapele de i) contactare a probei biologice cu un anticorp care leagă proteina Tau sau un fragment de legare al acestuia, aşa cum este descris aici; şi ii) detectarea legării anticorpului care leagă proteina Tau sau a fragmentului de legare al acestuia, aşa cum este descris aici, la proteina Tau. Prin compararea nivelului de Tau detectat cu un control adecvat, se poate diagnostica prezenţa sau probabila apariţie a unei taupatii, cum ar fi boala Alzheimer şi/sau paralizia supranucleară progresivă. O astfel de metodă de detectare poate fi astfel utilizată pentru a determina dacă un subiect are sau prezintă riscul de a dezvolta o tauopatie, inclusiv determinarea stadiului (severităţii) unei tauopatii.

[0207] Prezenta dezvăluire oferă astfel o metodă in vitro de diagnosticare a unei tauopatii, cum ar fi boala Alzheimer şi/sau paralizia supranucleară progresivă la un subiect, cuprinzând etapele de i) evaluare a nivelului sau stării de Tau într-o probă biologică obţinută de la subiect prin utilizarea unui anticorp care leagă Tau sau a unui fragment de legare al acestuia, aşa cum este descris aici; şi ii) compararea nivelului sau stării de Tau cu o valoare de referinţă, un standard sau o valoare normală de control care indică nivelul sau starea de Tau la subiecţii normali de control. O diferenţă semnificativă între nivelul şi/sau starea polipeptidei Tau din proba biologică şi valoarea normală de control indică faptul că individul are o taupatie, cum ar fi boala Alzheimer şi/sau paralizia supranucleară progresivă.

[0208] Invenţia este descrisă acum cu privire la câteva exemple care, totuşi, nu trebuie interpretate ca limitative.

[0209] Experimente

[0210] Experimentul 1 - Generarea de anticorpi care leagă Tau

[0211] 1.1 Expresia Tau recombinantă

[0212] Proteina Tau umană a fost exprimată în două sisteme gazdă, celulele E. coli BL21 (DE3) şi HEK293 (linia celulară de rinichi embrionar uman). Patru izoforme diferite de Tau au fost produse în E. coli, izoformele 2, 3, 4 şi 5 şi o izoformă în celulele HEK293, izoforma 2. Secvenţa completă a tuturor vectorilor de expresie şi proteinelor produse este inclusă în figurile 5-14.

[0213] Producţia de tau în E. coli

[0214] Genele care codifică diferitele izoforme Tau au fost generate sintetic, iar codonii au fost optimizaţi pentru exprimare în E. coli. S-au utilizat tehnici standard de biologie moleculară pentru subclonare într-un vector pET32 modificat, conceput pentru a produce Tau cu o etichetă 6His-TEV la capătul N-terminal.

[0215] Celulele E. coli BL 21 (DE3) au fost transformate cu vectorul de mai sus, iar proteina a fost exprimată folosind tehnici standard.

[0216] Celulele E. coli au fost apoi recuperate prin centrifugare, lizate, iar proteina Tau a fost captată din fracţia solubilă prin cromatografie de afinitate folosind NiNTA (Qiagen). Marcajul 6His a fost îndepărtat folosind proteaza TEV, urmată de o a doua etapă de cromatografie NiNTA. Soluţia tampon Tau purificată a fost schimbată cu soluţii tampon adecvate, în funcţie de aplicaţie. Endotoxinele din probele generate pentru imunizări au fost îndepărtate folosind coloane Proteus NoEndo™ (Vivaproducts).

[0217] Generarea de Tau marcat izotopic pentru studii de rezonanţă magnetică nucleară (RMN):

[0218] Exprimarea proteinelor a fost efectuată aşa cum s-a descris mai sus, cu excepţia faptului că s-a utilizat un mediu minim pentru încorporarea 15N, 13C şi 2H în proteină. Peletele celulare de E. coli au fost lizate, iar proteina Tau a fost purificată folosind o etapă de cromatografie de afinitate cu NiNTA (Qiagen), eticheta 6His a fost îndepărtată cu protează TEV, iar proteina Tau a fost apoi purificată prin filtrare pe gel folosind o unitate Superdex 200 (GE-Healthcare).

[0219] Producţia de tau în HEK293

[0220] O genă care codifică izoforma 2 a genei Tau a fost generată sintetic folosind secvenţa de ADN de tip sălbatic. S-au utilizat tehnici standard de biologie moleculară pentru a-l subclona în vectorul de expresie pMV-lOHisTEV (care conţine un promotor CMV) modificat genetic pentru a produce Tau cu o etichetă lOHis-TEV N-terminală (SEQ ID NO: 51).

[0221] Vectorul rezultat a fost transfectat utilizând sistemul de expresie Expi293™ (Invitrogen), urmând protocoalele producătorului. Acest sistem utilizează celule umane Expi293F derivate din linia celulară HEK293

[0222] Proteina tau s-a acumulat în mediul de cultură de unde a fost recuperată folosind cromatografia de afinitate cu ioni metalici imobilizaţi Ni Sepharose Excel (GE Healthcare). Eticheta lOHis a fost apoi îndepărtată folosind protează TEV înainte de reaplicarea pe coloana de Ni Sepharose şi colectarea Tau scindată în fluxul prin care trece.Soluţia tampon Tau purificată a fost schimbată cu soluţii tampon adecvate, în funcţie de aplicaţie.

[0223] Formarea fibrilelor

[0224] Proteina Tau la 450 μΜ a fost filtrată steril şi agitată într-un tub Eppendorf de 1,5 ml folosind un termomixer (Eppendorf) la 750 rpm, 37°C timp de 310 ore. Formarea fibrilelor a fost monitorizată utilizând colorantul Thioflavin-T şi citind absorbanţa pe un spectrofotometru Fluostar Omega (BMG Labtech). Formarea filamentelor elicoidale pereche (PHF) a fost confirmată prin microscopie electronică cu colorare negativă.

[0225] 1.2 Imunizare

[0226] 10 Şobolani Sprague Dawley femele (260-280 g) au fost imunizaţi subcutanat cu 50 μg de proteină Tau recombinantă, emulsionată într-un volum egal de adjuvant Freund complet (CFA) prin amestecare viguroasă cu o seringă. Şobolanilor li s-au administrat 3 injecţii de rapel la intervale de 14 zile folosind adjuvant Freund incomplet (IF A), cu prelevare de sânge şi din coadă. Terminarea a avut loc la 14 zile după rapelul final cu suspensii de celule individuale de splină şi măduvă osoasă preparate şi congelate în dimetilsulfoxid (DMSO) 10% în ser fetal de viţel (FCS) la -80°C. Proteina Tau umană recombinantă a fost exprimată în E. coli purificată şi agregată in vitro înainte de imunizare. O probă finală dintr-un amestec echimolar de patru izoforme (2, 3, 4 şi 5) de Tau, conţinând un amestec de Tau solubilă şi Tau fibril insolubilă, a fost utilizată pentru imunizare.

[0227] 1.3 Cultură de celule B

[0228] Culturile de celule B au fost preparate folosind o metodă similară cu cea descrisă de Zubler şi colab. (1985). Pe scurt, celulele B derivate din PBMC de la şobolani imunizaţi au fost cultivate la o densitate de aproximativ 3000 de celule per godeu în plăci de cultură tisulară cu 96 de godeuri, cu coduri de bare, cu mediu RPMI 1640 de 200 μΐ/godeu (Gibco BRL) suplimentat cu 10% FCS (PAA laboratories ltd), 2% HEPES (Sigma Aldrich), 1% L-Glutamină (Gibco BRL), soluţie 1% penicilină/streptomicină (Gibco BRL), 0,1% β-mercaptoetanol (Gibco BRL), 3% supernatant de cultură de splenocite activate şi celule de timom murin mutant EL4 iradiate gamma (5x104/godeu) timp de şapte zile la 37°C într-o atmosferă de 5% CO2. În total, au fost prelevate aproximativ 1,2 x 108 celuleB.

[0229] 1.4 Screening primar

[0230] Prezenţa anticorpilor care leagă Tau în supernatantele culturilor de celule B a fost determinată utilizând un test de legare omogen bazat pe fluorescenţă, utilizând sfere Superavidin™ (Bangs Laboratories) acoperite cu Tau biotinilat solubil sau insolubil, obţinut conform descrierii din secţiunea 1.1. Tau generată a avut atât o fracţiune solubilă, cât şi una insolubilă. Tau insolubilă a fost îndepărtată din amestec prin centrifugare folosind o centrifugă Eppendorf mini-spin plus de banc la 14.500 RPM timp de 10 minute. Fiecare fracţie a fost biotinilată separat folosind kitul EZ-link sulfo-NHS-LC-Biotinilare, conform instrucţiunilor producătorului. Fracţia biotinilată solubilă a fost îndepărtată din biotina liberă folosind coloane de desalinizare prin spin Zeba, conform instrucţiunilor producătorului. Fracţia insolubilă a fost îndepărtată din biotina liberă prin centrifugarea amestecului într-o centrifugă Eppendorf mini-spin plus la 14.500 RPM timp de 10 minute, recuperând peleta care conţinea Tau şi resuspendarea acesteia în 1,5 ml de soluţie salină tamponată cu fosfat (PBS) şi repetând acest proces de 5 ori. Testul a permis screening-ul supernatantului care prezenta legare la forme de Tau solubile sau insolubile. 10 μl de supernatant au fost transferaţi de pe plăci de cultură tisulară cu 96 de godeuri şi coduri de bare în plăci de test cu pereţi negri şi coduri de bare cu 384 de godeuri, conţinând Tau solubil sau insolubil imobilizat pe sfere (ΙΟΙ/godeu) folosind un dispozitiv de manipulare a lichidelor Matrix Platemate. Legarea a fost evidenţiată cu un conjugat Cy-5 specific Fey-ului IgG de capră anti-şobolan (Jackson). Plăcile au fost citite pe un sistem de detecţie celulară Applied Biosystems 8200.

[0231] 1.5 Screening secundar

[0232] După screening-ul primar, supernatantele pozitive au fost consolidate pe plăci master cu 96 de godeuri şi coduri de bare, utilizând un robot de selecţie a celulelor Aviso Onyx, iar celulele B au fost în plăci de cultură celulară congelate la -800°C. Plăcile master au fost apoi screening-ate printr-un test ELISA pe fracţia Tau solubilă. Acest lucru a fost realizat pentru a determina, printr-un screening mai strict, capacitatea anticorpilor de a se lega de Tau şi pentru a verifica dacă nu se leagă de perle în screening-urile primare. Testul ELISA a implicat acoperirea cu Tau solubil pe plăci Maxisorp cu 384 de godeuri (ThermoScientific/Nunc) la o concentraţie de 3 μg/ml într-un tampon de acoperire carbonat (dH2O+0,16% Na2CO3 + 0,3% NaHCO3). Plăcile au fost blocate cu 1% g/v cazeină + 1% g/v BSA în PBS şi apoi incubate cu 100 mg/godeu de supernatant de cultură de celule B. Anticorp secundar Fc IgG de capră anti-şobolan conjugat cu HRP (Stratech Scientific Ltd/ Jackson ImmunoResearch) a fost adăugat pe plăci, urmat de vizualizarea legării cu substratul TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidină, de la EMD Millipore; ΙΟμΙ/godeu). Densitatea optică a fost măsurată la 630nM utilizând un cititor de microplăci BioTek Synergy 2. Supernatantele celulelor B care demonstrează specificitate pentru Tau au fost selectate pentru recuperarea regiunii variabile.

[0233] 1.6 Recuperarea regiunii variabile

[0234] Pentru a permite recuperarea genelor regiunii variabile a anticorpilor dintr-o selecţie de godeuri de interes, a trebuit efectuată o etapă de deconvoluţie pentru a permite identificarea celulelor B specifice antigenului într-un anumit godeu care conţinea o populaţie eterogenă de celule B. Acest lucru a fost realizat folosind metoda focarelor fluorescente (Clargo şi colab., 2014). Pe scurt, celulele B secretoare de imunoglobulină dintr-un godeu pozitiv au fost amestecate cu sfere de streptavidină (New England Biolabs) acoperite cu Tau solubil biotinilat şi o diluţie finală 1:1200 a unui conjugat FITC specific fragmentului Fey de capră anti-şobolan (Jackson). După incubarea statică la 37°C timp de 1 oră, celulele B specifice antigenului au putut fi identificate datorită prezenţei unui halou fluorescent care înconjoară celulele B respective. Aceste celule B individuale, identificate folosind un microscop Olympus, au fost apoi prelevate cu un micromanipulator Eppendorf şi depuse într-un tub PCR.

[0235] Genele regiunii variabile a anticorpilor au fost recuperate din celule individuale prin transcripţie inversă (RT)-PCR utilizând primeri specifici regiunii variabile a lanţului greu şi uşor. Două runde de PCR au fost efectuate pe un robot de manipulare a lichidelor Aviso Onyx, a doua PCR imbricată încorporând situsuri de restricţie la capetele 3' şi 5', permiţând clonarea regiunii variabile într-un vector de expresie la mamifere γΐ IgG (VH) de şoarece sau kappa (VL) de şoarece. Construcţiile lanţurilor grele şi uşoare au fost co-transfectate în celule HEK-293 folosind Fectin 293 (Invitrogen), iar anticorpul recombinant a fost exprimat într-un balon Erlenmeyer de 125 ml într-un volum de 30 ml. După 5-7 zile de cultură, supernatantele au fost recoltate şi anticorpul a fost purificat folosind cromatografie de afinitate.

[0236] Experimentul 2 - Screening suplimentar al anticorpilor identificaţi

[0237] 2.1 Prepararea PHF

[0238] Proteina Tau cu filament elicoidal pereche (PHF) a fost purificată din probe de creier de la donatori cu boala Alzheimer sau paralizie supranucleară progresivă sau demenţă frontotemporală, conform protocolului publicat de Ksiezak-Reding şi Wall (Neurobiology of Aging 15, 11-19, 1994). Fracţiile 8 (echivalent cu PHF-Tau brut înainte de centrifugarea în gradient de zaharoză în această referinţă) şi 11 (echivalent cu fracţia A2, PHF solubil în SDS, aşa cum este descris în această referinţă), care au fost descrise anterior ca fiind îmbogăţite în PHF-Tau, au fost recuperate şi utilizate pentru testul BIAcore şi testul celular din Experimentul 3.

[0239] 2.2 Screening ELISA

[0240] Testul ELISA a implicat capturarea de Tau solubilă pe plăci Maxisorp cu 384 de godeuri (ThermoScientific/Nunc) la 3 μg/ml într-un tampon de acoperire carbonat (dH2O + 0,16% Na2CO3 + 0,3% NaHCO3). Plăcile au fost blocate cu 1% g/v cazeină + 1% g/v BSA în PBS şi apoi incubate cu anticorp purificat în godeu 10μI. Anticorpi Fc IgG de capră anti-şoarece conjugaţi cu HRP secundar (Stratech Scientific Ltd/ Jackson ImmunoResearch) au fost adăugaţi pe plăci, urmat de vizualizarea legării cu substratul TMB de tip HRP (3,3',5,5'-tetrametilbenzidină, de la EMD Millipore; ΙΟμΙ/godeu). Densitatea optică a fost măsurată la 630nM utilizând un cititor de microplăci BioTek Synergy 2.

[0241] 2.3 Screening-ul BIAcore

[0242] Fragmentele Fab monoclonale selectate (mFab) au fost preparate din anticorpi himerici mlgGl utilizând kitul de clivaj Pierce Ficin (Cat. Nr. 44980, Thermo Scientific) conform protocolului producătorului.

[0243] Absorbţia la 280 nm a fost utilizată pentru a determina concentraţia soluţiilor stoc Fab pentru analiza BIAcore. Un preparat de proteină Tau insolubilă de la pacienţi cu boala Alzheimer (AD-PHF, fracţia 11), monomerii izoformei-2 Tau derivaţi din HEK (aminoacizii 1-441) şi monomerii izoformei-2 exprimaţi în E. coli au fost imobilizaţi cu amină pe cipul CM5, iar legarea mFab-urilor anti-Tau a fost măsurată cu instrumentul Biacore T200. Tamponul HBS-EP de la GE Healthcare a fost utilizat pentru imobilizări, în afară de AD-PHF, pentru care s-a utilizat acid acetic 10mM (pH 3,0). Tamponul HBS-EP+ a fost suplimentat cu 300 mM NaCl şi 1,25% CM-Dextran (Sigma) şi utilizat ca tampon de testare. Deşi celula de flux (Fc) 1 a fost utilizată ca referinţă, următoarele valori RU au fost obţinute pentru Fc2-4: 44 RU cu 5 μg/ml E. coli Tau, 56 RU cu 5 μg/m HEK Tau şi 500 RU cu o soluţie diluată 1:20 de material AD-PHF. Pentru regenerare s-au utilizat două cicluri de 60 de secunde cu glicină 10mM (pH 1,7). Pentru imobilizare şi regenerare s-au utilizat debite de ΙO�μΙ/min, în timp ce pentru legarea analitului s-a utilizat un debit de 30 μ1/ηήη. Pentru AD-PHF, s-au aplicat multiple injecţii manuale pentru a ajunge la 500 RU, inclusiv plafonarea EDC/NHS şi EtoA. Au fost aplicate cinci cicluri de pornire şi 12 cicluri per probă mFab sau control tampon, utilizând injecţii cu 90 μ1 de analit timp de 180 de secunde sau 300 de secunde pentru disociere. Pentru fiecare mFab s-au utilizat diluţii de 1 x 1 x 3 dintr-o soluţie de 600 nM plus tampon. AB 1 a fost analizat folosind testul BIAcore.

[0244] Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 1, care arată legarea mFab AB 1 având o VL de şobolan cu SEQ ID nr. 7 şi o VH de şobolan cu SEQ ID nr. 8 la izoforma 2 monomerică Tau exprimată în E. coli, la izoforma 2 monomerică Tau derivată din celule HEK293 de mamifere şi la fibrile PHF Tau izolate de la pacienţi cu boala Alzheimer (Tau agregat). Profilul de legare al AB1 şi al anticorpilor anteriori menţionaţi mai sus este prezentat în Tabelul 3.

[0245] Tabelul 1

Ab

Sursa Tau \tabRmax (RU)\tabka (1/Ms)\tabkd (1/s)\tabKD (M)*

101.4

Ecoli iso-2\tabnb\tab-\tab-\tab-

(isotype control)

HEK iso-2

AD-PHF

nb

nb

-

-

-

-

-

[0247] -

[0248] 17\tab6.9E+04\tab1.1E-02\tab1.6E-07

[0249] Ecoli iso-2\tab\tab\tab\tab

[0250] 17\tab7.3E+04\tab1.1E-02\tab1.6E-07

AB1

HEK iso-2\tab15\tab7.0E+04\tab1.1E-02\tab1.6E-07

15\tab6.6E+04\tab1.1E-02\tab1.7E-07

AD-PHF\tab7\tab5.2E+04\tab9.6E-03\tab1.9E-07

6\tab4.4E+04\tab8.0E-03\tab1.8E-07

[0252] nb = fără legătură

[0253] * valorile componentelor de legare majore afişate

[0254] Experimentul 3 - Caracterizarea suplimentară a anticorpilor identificaţi

[0255] 3.1 Test celular

[0256] Prepararea fracţiilor brute solubile şi insolubile de la şoareci transgenici Tau pentru a induce agregarea Tau

[0257] Pentru aceste experimente, s-au utilizat şoareci transgenici care exprimă gena Tau umană P301 S (Allen şi colab., 2002 J. Neurosci.22(21):9340-51 şi P301L (Lewis şi colab., 2000 Nat Genet. (4):402- 5.; G5tz J, şi colab., 2001 J Biol Chem. 276(1):529-34).

[0258] Fracţiile brute solubile şi insolubile au fost preparate din creierul şoarecilor transgenici P301 S şi P301L Tau prin centrifugare diferenţială. Pe scurt, ţesuturile cerebrale de la şoareci transgenici tau P301S (măduva spinării şi trunchiul cerebral) şi P301L (mezencefal şi trunchiul cerebral) au fost omogenizate în TBS răcit cu gheaţă (Fisher Scientific) folosind omogenizatorul portabil Pellet Pestle Motor (Kontes) în tuburi de microcentrifugă de 1,5 ml pe gheaţă. Apoi, omogenatele (H) au fost centrifugate la 4.000 g timp de 10 minute la 4°C pentru a îndepărta resturile tisulare. Supernatanţii (SO) rezultaţi au fost centrifugaţi la 20.000 g timp de 20 de minute la 4°C pentru a obţine supernatante corespunzătoare fracţiei brute solubile (SI). Peletele rămase (PI) au fost resuspendate în 1 ml de soluţie de sarkosil 1% preparată în TBS, incubate timp de 1 oră la temperatura camerei şi apoi centrifugate la 100.000 g timp de 1 oră la 4°C. Supernatantul (S2) a fost aruncat. Peletele (P2) au fost spălate cu 5 ml de TBS răcit cu gheaţă şi apoi resuspendate în TBS pentru a obţine fracţia insolubilă brută (Ρ2').

[0259] Prepararea celulelor HEK-293-F care exprimă tau uman cu mutaţia P301S

[0260] Celulele HEK-293-F (Life Technologies) au fost transfectate cu vectorul pcDNA3.1(+) care exprimă izoforma 2 a genei Tau umane cu o mutaţie P301 S, utilizând 293fectina (Life Technologies) conform instrucţiunilor producătorului. Alicote de celule transfectate au fost depozitate în azot lichid.

[0261] Inducerea agregării Tau

[0262] Figura 3 ilustrează diferitele etape ale testului de agregare celulară utilizat pentru a caracteriza activitatea anticorpilor terapeutici Tau. În ziua 1, celulele HEK-293-F care exprimă izoforma 2 a genei Tau umane cu mutaţia P301S (P301 S-tau) au fost decongelate la 37°C şi diluate în mediu de expresie 293 (Life Technologies) conţinând 10% ser fetal bovin şi 1% penicilină-streptomicină (FFBS). Celulele au fost numărate folosind un numărător automat de celule (Vi-CELL XR, Beckman Coulter) şi apoi placate în plăci cu 96 de godeuri pre-acoperite cu poli-D-lizină (Greiner Bio-One) la o densitate de 25.000 de celule vii per godeu. Celulele au fost menţinute la 37°C în 5% CO2. În aceeaşi zi, proteine Tau umane insolubile sonicate de la pacienţi cu boala Alzheimer (AD-PHF, fracţia 8) sau paralizie supranucleară progresivă (PSP-PHF, fracţia 8) sau demenţă frontotemporală (FTD-PHF, fracţia 8) sau fracţii cerebrale de la creierul de şoareci transgenici P301S sau P301L (utilizate ca seminţe pentru a induce agregarea proteinei Tau), au fost incubate cu sau fără anticorpi anti-Tau în mediu FFBS la 4°C cu agitare uşoară peste noapte. Fracţia 8 de AD-PHF a fost utilizată la 80 ng/μl şi, respectiv, 60 ng/μl pentru probele AD şi PSP; fracţia solubilă de creier de la şoarecii transgenici P301S şi P301L a fost utilizată la 0,1 μg/μl ± 1,2 μg/μl, respectiv. În ziua 2, seminţele sau amestecurile de seminţe/anticorpi au fost aplicate pe celule timp de 24 de ore. În ziua 3, mediul de cultură a fost înlocuit cu mediu FFBS proaspăt conţinând anticorpi, iar celulele au fost menţinute în cultură timp de încă 24 de ore. În ziua 4, agregarea Tau a fost măsurată utilizând un kit de testare a aggregaţiei tau (Cisbio) bazat pe transferul omogen de energie fluorescentă rezolvat în timp (HTRF), conform instrucţiunilor producătorului. Fluorescenţa a fost măsurată cu SpectraMax Paradigm (Molecular Devices). Agregarea a fost raportată ca procent de agregare faţă de control (-), care corespunde răspunsului maxim de agregare indus de fibrile sau fracţii exogene în absenţa anticorpului.

[0263] A fost testat efectul AB1 şi al altor anticorpi care leagă Tau din stadiul tehnicii asupra agregării Tau induse. Anticorpii din stadiul tehnicii au fost IPN002 din WO2014/028777A2, PT3 din WO2013/096380A2, mAb2.10.3 din WO2010/142423 A2 şi HJ8.5 din WO 2014/008404.

[0264] Rezultatele acestui test sunt rezumate în Tabelul 2 şi Figura 4.

[0265] Tabelul 2 rezumă potenţa (IC50) şi eficacitatea maximă (Imaxla 300 nM) a AB1 având un VL de şobolan cu SEQ ID NR.: 7 şi un VH de şobolan cu SEQ ID NR.: 8, a unui anticorp care leagă Tau având lanţul uşor cu SEQ ID NR.: 14 şi lanţul greu cu SEQ ID NR.: 17 (L14H17), a unui anticorp care leagă Tau având lanţul uşor cu SEQ ID NR.: 14 şi lanţul greu cu SEQ ID NR.: 18 (L14H18) şi a anticorpilor competitori împotriva unei game de seminţe de Tau din diverse extracte de creier. Întrucât Figura 4 prezintă eficacitatea unui anticorp care leagă Tau având lanţul uşor al SEQ ID nr.: 14 şi lanţul greu al SEQ ID nr.: 17 (L14H17) şi a unui anticorp care leagă Tau având lanţul uşor al SEQ ID nr.: 14 şi lanţul greu al SEQ ID nr.: 18 (L14H18) într-un test de agregare celulară utilizând fibrile patologice Tau umane de la pacienţi cu AD umană.

[0266] 3.2 Analiza histologică

[0267] AB1 având o VL de şobolan cu SEQ ID NO.: 7 şi o VH de şobolan cu SEQ ID NO.: 8 şi anticorpii IPN002, PT3 şi Mab2.10.3 din stadiul tehnicii au fost testaţi, iar concentraţia optimă a fost determinată folosind criosecţii de hipocampus uman de la un donator cu boala Alzheimer, despre care s-a demonstrat anterior că conţine structuri Tau patologice folosind imunomarcarea AT8 (cum ar fi cea descrisă în Braak & Braak, 1995, Neurobiol Aging; 16(3):271-8). AB1 şi toţi anticorpii anteriori au prezentat imunoreactivitate specifică şi dependentă de concentraţie, cu excepţia lui 101.4 (anticorp de control negativ). Din aceste date a fost selectată o singură concentraţie optimă de anticorpi şi utilizată pentru a examina un grup de şase probe de creier uman. Trei probe au provenit de la donatori cu boala Alzheimer sau de la donatori foarte vârstnici care au prezentat niveluri ridicate de patologie Tau (patologie Tau pozitivă detectată prin imunomarcare AT8) şi trei de la donatori fără patologie Tau (patologie Tau negativă detectată prin imunomarcare AT8).

[0268] AB 1 şi IPN002 au arătat imunomarcare specifică a înghesuielilor neurofibrilare (NFT intraneuronal), colorare citoplasmatică a înghesuielilor neurofibrilare (NFT extraneuronal), structurilor asemănătoare plăcilor neuritice şi filamentelor neurofile în probele de patologie Tau pozitive. De asemenea, au arătat imunomarcare în probele clasificate cu patologie Tau negativă.

[0269] Rezultatele experimentelor 2 şi 3 sunt rezumate în tabelele 2 şi 3 de mai jos:

[0270] Tabelul 2

[0271] Experiment 3.1

mAB

Tg mice

[0273] (P301S)

IC50/lmax

Tg mice

[0275] (P301L)

IC50/lmax

Human AD samples

IC50/lmax

Human

[0277] PSP

samples

Human

[0279] FTD

[0280] samples

AB1

IC50: 2 nM

lmax: 93%

IC50 :30 nM

lmax: 89%

IC50: 4 nM

lmax: 98%

Netestat\tabIC50: 3 nM

[0282] lmax: 97%

L14H17

Netestat\tabNetestat\tabIC50 :11 nM

lmax: 98%

Netestat\tabNetestat

L14H18

Netestat\tabNetestat\tabIC50 :12 nM

lmax: 98%

IC50: 42 nM

lmax : 100%

IC50: 1 nM

[0284] lmax: 99%

IPN002

IC50: ND lmax: 22%\tabIC50:122 nM

lmax: 73%

IC50 : ND lmax: 19%\tabIC50 :207 nM

lmax : 64%

IC50: ND

[0286] lmax : 50%

PT3

IC50 :350nM lmax : 56%\tabIC50 :26 nM

lmax: 69%

IC50 :32 nM

lmax: 69%

IC50 :47 nM

lmax : 55%

IC50 : 1nM

[0288] lmax: 80%

Mab2.10.3

IC50 :ND lmax: 35%\tabIC50 :ND lmax: 29%\tabIC50 :ND lmax: 16%\tabIC50 :ND lmax: 28%(*)\tabIC50: ND

[0290] lmax: 30%

HJ8.5

IC50: ND

lmax: 43%

Netestat\tabIC50: ND

lmax: 46%

IC50: 73 nM

lmax: 79%

IC50: ND

[0292] lmax: 67%

[0293] Tabelul 3

mAB

Experiment 3.2\tabExperiment 2.3\tabExperiment 3.3

AB1

AD1 & ctrl.2\tabMonom.3 & Agg.4\tab+AD, PSP, ctr

IPN002

AD1 & ctrl.2\tabMonom. & Agg.\tab+ AD, PSP, ctr

PT3

AD>ctr\tabAgg\tabWeak

Mab2.10.3

AD>ctr\tabAgg\tabWeak

[0295] 1 reprezintă detectarea Tau în probe cu patologie Tau confirmată.

[0296] 2 reprezintă detectarea Tau în probe cu patologie Tau negativă.

[0297] 3 reprezintă forma monomerică Tau a izoformei Tau monomerice-2 exprimată în E. coli şi izoforma Tau monomerică-2 derivată din celule HEK293 de la mamifere.

[0298] 4 reprezintă forma Tau agregată a fibrilelor Tau PHF izolate de la pacienţi cu boala Alzheimer

[0299] ND: Nedeterminat.

[0300] (*) eficacitate maximă la 100 nM

[0301] 3.3 Western blot

[0302] Western blot-uri efectuate folosind o citire chemiluminiscentă: omogenatele preparate din AD, PSP sau oameni de control au fost încărcate pe geluri de poliacrilamidă 10% (2C^g proteină per bandă). Proteinele au fost separate prin SDS-PAGE (electroforeză în gel de poliacrilamidă cu dodecilsulfat de sodiu) şi electrotransferate pe o membrană PVDF (fluorură de poliviniliden). Membranele au fost blocate în 4% BSA (albumină serică bovină (în TBST: 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH-ul ajustat cu HCl la 7,6). Membranele au fost incubate peste noapte la 4°C cu anticorp primar sau anticorp de control IgG neimun, clătite în TBST, incubate cu anticorp secundar timp de 1 oră (anti-biotină de şoarece), clătite în TBST, incubate cu anticorp terţiar timp de 1 oră (anti-IgG-peroxidază de şoarece), clătite în TBST şi developate folosind expuneri pe film ECL (chemiluminescenţă îmbunătăţită) timp de 2 până la 5 minute.

[0303] Alternativ, s-au efectuat Western blots utilizând o citire fluorescentă: homogenatele (H), fracţiile solubile (S I) şi insolubile (Ρ2') de la şoareci transgenici tau sau fracţia 8 AD-PHF au fost încărcate în geluri NuPAGE® Novex 4-12% Bis-Tris (Life Technologies) şi apoi separate prin SDS-PAGE. Proteinele separate au fost electrotransferate pe membrane de difluorură de poliviniliden utilizând sistemul de transfer Trans-Blot® Turbo™ (Bio-Rad). Membranele au fost blocate cu tampon de blocare Odyssey® (LI-COR) şi incubate peste noapte la 4°C cu diferiţi anticorpi primari diluaţi în acelaşi tampon conţinând 0,1% Tween-20. Anticorpii secundari IRDye au fost diluaţi în tampon de blocare Odyssey® conţinând 0,1% Tween-20 şi 0,01% SDS (1:5.000; LI-COR) şi incubaţi timp de 1 oră la temperatura camerei, iar vizualizarea a fost efectuată utilizând sistemul de imagistică Odyssey CLx (LI-COR). Anticorpii VR4295 (UCB Biopharma S.P.R.L), IPN002, PTR3 şi Mab2.10.3 au fost utilizaţi la concentraţii de 0,1-1 μg/ml. Anticorpii anti-tau pS202/T205 (AT 8; Thermo Scientific), anti-Tau pThr231 (AT 180; Thermo Scientific) şi anti-Tau total (HT7; Thermo Scientific) au fost utilizaţi la o diluţie de 1:200. Pentru a controla încărcarea, s-au analizat bloturile pentru β-actină (1:2.000; Sigma). Intensităţile semnalului au fost cuantificate folosind Image Studio 3.1 (Li-COR).

[0304] AB 1 având un VL de şobolan cu SEQ ID nr. 7 şi un VH de şobolan cu SEQ ID nr. 8 şi versiuni umanizate având un lanţ uşor cu SEQ ID nr. 14 şi un lanţ greu cu SEQ ID nr. 17 sau un lanţ uşor cu SEQ ID nr. 14 şi un lanţ greu cu SEQ ID nr. 18 se leagă de Tau patologic de la şoareci transgenici P301 S şi P301L şi de la probe de pacienţi umani cu AD, PSP şi control. Toţi cei trei anticorpi prezintă un model similar de legare prin Western blot şi relevă în AD şi PSP un model tipic de benzi între 50 şi 75 kDa, corespunzător Tau patologic din AD şi PSP (vezi figura 5). IPN002 a prezentat un comportament similar, în timp ce anticorpii PTR3 şi Mab2.10.3 se leagă de Tau patologic de la şoarecii transgenici P301 S şi P301L şi se leagă slab de AD uman, dar prezintă un model diferit prin western blot. Anticorpii de control negativ 101.4 şi A33 nu au relevat niciun semnal semnificativ. Actina a fost utilizată ca un control al încărcăturii.

[0305] 3.4 Definirea epitopului AB 1

[0306] Legarea epitopului anticorpului AB1 având un VL cu SEQ ID nr.: 7 şi un VH cu SEQ ID nr.: 8 a fost determinată utilizând rezonanţă magnetică nucleară cu coerenţă cuantică unică heteronucleară (RMN HSQC) folosind un fragment Fab al anticorpului.

[0307] Atribuirea coloanei vertebrale a izoformei Tau 4

[0308] Probele RMN au avut în mod tipic un volum de 350 μl cu o concentraţie de proteine de 270 μΜ de izoforma 4 a genei Tau umane marcată cu 2H/13C/15N în tuburi Shigemi de 5 mm. Condiţiile tampon au fost 100 mM NaCl, 25 mM fosfat de sodiu pH 6,4, 10 μM AEBSF, 0,02% NaN3. Toate experimentele au fost înregistrate la 20 °C pe spectrometre Bruker DRX de 600 MHz sau Bruker Avance de 800 MHz, echipate cu sonde răcite criogenic. Conexiunile secvenţiale între semnalele RMN ale reziduurilor din proteina HN(i)-N(i)-N(i±1) au fost realizate utilizând un experiment 3D (H)N(CA)NNH (Weisemann et al, 1993 Tehnici RMN 3D cu triplă rezonanţă pentru atribuirea secvenţială a rezonanţelor NH şi 15N în proteinele marcate cu 15N şi 13C. J. Biomol. RMN 3. doi: 10.1007/BF00242479) înregistrate cu lăţimi spectrale de 1640, 1640 şi 7000 Hz şi timpi de achiziţie de 120 (F1, 120 (F2) şi 150 (F3) ms în dimensiunile 15N,15N şi respectiv 1H, cu 8 scanări per increment şi o întârziere de relaxare de 1,5 s. S-a utilizat eşantionarea neuniformă cu o densitate de eşantionare de 13% (5200 din 40000 de puncte hipercomplexe), rezultând un timp total de achiziţie de 3,5 zile. Conexiunile secvenţiale au fost confirmate şi tipurile de reziduuri identificate folosind HNCA (Grzesiek şi Bax, 1992 Tehnici RMN cu triplă rezonanţă 3D îmbunătăţite aplicate unei proteine de 31 kDa. J. Magn. Rezonanţă. 96, 432-440. doi: 10.1016/0022-2364(92)90099-S) şi HNCACB (Wittekind şi Mueller, 1993 HNCACB, un experiment RMN 3D de înaltă sensibilitate pentru corelarea rezonanţelor amidă-proton şi azot cu rezonanţele alfa- şi beta-carbon din proteine. J. Magn. Rezonanţă. Ser. B 101, 201-205. doi: 10.1006/jmrb.1993.1033). Experimentul HNCA a fost înregistrat cu lăţimi spectrale de 1640, 4830 şi 6600 Hz şi timpi de achiziţie de 24 (Fl), 6,6 (F2) şi 80 (F3) ms în dimensiunile 15N,13C şi 1H, respectiv (8 scanări per increment, întârziere de relaxare de 1,5 s, timp total de achiziţie de 19 ore), în timp ce HNCACB a fost înregistrat cu lăţimi spectrale de 9800, 1640 şi 6600 Hz şi timpi de achiziţie de 6 (Fl), 24 (F2) şi 80 (F3) ms în dimensiunile 13C, 15N şi 1H, respectiv (8 scanări per increment, întârziere de relaxare de 1,5 s, timp total de achiziţie de 1,5 zile). Spectrele RMN au fost procesate folosind NMRPipe (Delaglio et al., 1995 NMRPipe: un sistem de procesare spectrală multidimensională bazat pe conducte UNIX). J. Biomol. RMN 6, 277-93) cu reconstrucţia datelor NUS efectuată folosind metoda iterativă Harvard de stabilire a pragului uşor (Hyberts şi colab., 2012). Analiza datelor a fost efectuată utilizând Sparky (Goddard şi Kneller, D. G. SPARKY 3. In., Universitatea din California, San Francisco), rezultând atribuirea rezonanţelor de proton şi azot amidic a 304 reziduuri, corespunzătoare la 96% din reziduuri (excluzând reziduurile de prolină şi glicina N-terminală).

[0309] Cartografierea situsului de legare al AB1:

[0310] Cartografierea situsului de legare al AB 1 a fost efectuată utilizând probe de izoforma 4 a proteinei Tau umane marcate cu 2H/13C/15N, cu concentraţii cuprinse între 80 şi 150 μΜ şi conţinând un exces molar de 10% din Fab-ul AB 1 corespunzător. Probele au fost preparate în acelaşi tampon descris mai sus pentru atribuirea structurii principale a Tau. Modificările de deplasare chimică 1H, 15N şi 13C au fost determinate din HNCO (Grzesiek şi Bax, 1992 Tehnici RMN cu triplă rezonanţă 3D îmbunătăţite aplicate unei proteine de 31 kDa. J. Magn. Rezonanţă. 96, 432^140. doi: 10.1016/0022-2364(92)90099-S) spectre înregistrate pe probele complexe Tau/Fab, precum şi pe o probă de Tau liber (aşa cum s-a descris mai sus). Experimentele HNCO au fost înregistrate cu lăţimi spectrale de 2190, 2210 şi 8800 Hz şi timpi de achiziţie de 25 (F1), 29 (F2) şi 80 (F3) ms în dimensiunile 15N, 13C şi 1H (8 scanări per increment, întârziere de relaxare de 1,8 s), cu NUS utilizat cu densităţi de eşantionare de 25-35%, reducând timpii totali de achiziţie de la 60 de ore la 15-21 de ore. Modificările deplasării chimice au fost analizate utilizând abordarea deplasării minime (Williamson şi colab., 1997 Maparea situsului de legare pentru metaloproteinaza matriceală pe domeniul N-terminal al inhibitorului tisular al metaloproteinazelor-2 prin perturbarea deplasării chimice RMN). Biochemistry 36, 13882-9. doi: 10.1021/bi9712091), în esenţă aşa cum s-a descris anterior (Veverka şi colab., 2008 Caracterizarea structurală a interacţiunii mTOR cu acidul fosfatidic şi o nouă clasă de inhibitori: dovezi convingătoare pentru un rol central al domeniului FRB în reglarea mTOR mediată de molecule mici. Oncogene 27, 585-95. doi: 10.1038/sj. one.1210693), cu excepţia unei modificări a ecuaţiei utilizate pentru calcularea schimbării combinate de deplasare chimică (Δδ) pentru a include deplasarea chimică carbonil, rezultând următoarea ecuaţie:

[0312] unde ΔδΗΝ, ΔδΝ şi ΔδC sunt diferenţele dintre deplasările chimice ale 1H, 15N şi 13C. αN şi αC corespund unor factori de scalare de 0,2 şi, respectiv, 0,35, utilizaţi pentru a explica diferenţele dintre intervalele de deplasare chimică ale deplasărilor chimice ale protonului amidic, azotului şi carbonilului.

[0313] Pentru a identifica situsurile de legare Fab (epitopii) de pe Tau, a fost utilizată o histogramă a deplasării minime combinate în funcţie de secvenţa proteică pentru a dezvălui regiuni de Tau care conţin semnale semnificativ perturbate. Dacă mărimea modificării combinate a deplasării chimice pentru aminoacizii individuali a depăşit o valoare prag a mediei modificării combinate a deplasării chimice pentru toţi aminoacizii plus o deviaţie standard de la acea medie, aceste reziduuri au fost selectate pentru o evaluare ulterioară ca posibile reziduuri de contact în situsul de legare Fab.

[0314] Reziduurile semnificativ perturbate au fost identificate ca fiind cele a căror deplasare minimă a fost cel puţin mai mare decât media plus o deviaţie standard a tuturor deplasărilor calculate. Au fost aplicate patru praguri diferite pentru a identifica reziduurile legate de Fab. Reziduurile implicate în situsul de legare sunt evaluate cu o stringenţă crescătoare, astfel: cele a căror deplasare minimă depăşeşte media plus o deviaţie standard a tuturor deplasărilor calculate (fiind >0,009817); cele a căror deplasare minimă depăşeşte media plus două deviaţii standard ale tuturor deplasărilor calculate (fiind >0,016913); cele a căror deplasare minimă depăşeşte media plus trei deviaţii standard ale tuturor deplasărilor calculate (fiind >0,024009); cele a căror deplasare minimă depăşeşte media plus patru deviaţii standard ale tuturor deplasărilor calculate (fiind >0,031105). În această analiză, reziduurile de prolină nu pot fi identificate deoarece nu conţin protoni amidici.

[0315] Epitopul pentru AB1 Fab este definit cu stringenţă crescătoare ca media plus o deviaţie standard a tuturor deplasărilor calculate: A246, A239, S241, T245, S238, S235, K240, Q244, S237, V248, L243, M250, R242; media plus două deviaţii standard ale tuturor deplasărilor calculate: A246, A239, S241, T245, S238, S235, K240, Q244, S237; media plus trei deviaţii standard ale tuturor deplasărilor calculate: A246, A239, S241, T245, S238, S235, K240, Q244; media plus patru deviaţii standard ale tuturor deplasărilor calculate: A246, A239, S241, T245, S238.

[0316] Folosind numerotarea aminoacizilor utilizată în secvenţa de referinţă NCBI NP 005901.2 (SEQ ID No.: 35), s-a constatat că AB1 se leagă de cel puţin următoarele reziduuri (medie + 3 SD) A246, A239, S241, T245, S238, S235, K240, Q244. Anticorpul se poate lega de toate următoarele reziduuri (medie + 1 deviaţie standard) A246, A239, S241, T245, S238, S235, K240, Q244, S237, V248, L243, M250, R242.

[0317] Experimentul 4 - Umanizarea anticorpilor identificaţi.

[0318] Anticorpul AB1 având o VL cu SEQ ID nr.: 7 şi o VH cu SEQ ID nr.: 8 a fost umanizat prin grefarea CDR-urilor din regiunile V ale anticorpilor de şobolan pe structuri ale regiunii V ale anticorpilor de linie germinală umană.

[0319] Pentru a recupera activitatea anticorpului, o serie de reziduuri ale cadrului din regiunile V de şobolan sau iepure au fost, de asemenea, reţinute în secvenţa umanizată. Aceste reziduuri au fost selectate folosind protocolul descris de Adair şi colab. (1991) (Anticorpi umanizaţi. W091/09967). Alinierile secvenţelor regiunii V a anticorpilor (donor) de şobolan cu secvenţele regiunii V a liniei germinale (acceptor) umane sunt prezentate în Figurile 1 şi 2 împreună cu secvenţele umanizate proiectate. CDR-urile grefate de la secvenţa donor la secvenţa acceptorului sunt aşa cum sunt definite de Kabat (Kabat şi colab., 1987), cu excepţia CDR-H1, unde se utilizează definiţia combinată Chothia/Kabat (vezi Adair şi colab., 1991 Humanised anticorps, W091/09967).

[0320] Regiunea V umană IGKV2-29 plus regiunea J JK2 (IMGT, http://www.imgt.org/) (SEQ ID No.: 31) a fost aleasă ca acceptor pentru CDR-urile lanţului uşor al anticorpului AB1. Reziduurile cadrului lanţului uşor din grefa gVL3_ABl (SEQ ID No.: 14) provin toate din gena germinală umană.

[0321] Regiunea V umană IGHV4-59 plus regiunea J JH3 (IMGT, http://www.imgt.org/) (SEQ ID No.: 32) a fost aleasă ca acceptor pentru CDR-urile lanţului greu al anticorpului AB1. Reziduurile cadrului lanţului greu din grefele gVH17_AB1 (SEQ ID No.: 17) şi gVH18_ABl (SEQ ID No.: 18) provin toate din gena liniei germinale umane, cu excepţia reziduului 48 (numerotare Kabat), unde reziduul donor Metionină (M48) a fost reţinut. Păstrarea reziduului M48 a permis obţinerea potenţei complete a anticorpului umanizat. Reziduul de glutamină din poziţia 1 a structurii umane a fost înlocuit cu acid glutamic (El) pentru a permite exprimarea şi purificarea unui produs omogen: conversia glutaminei în piroglutamat la capătul N-terminal al anticorpilor şi fragmentelor de anticorpi este raportată pe scară largă. CDRH2 cu SEQ ID nr.: 37 şi 38 a fost mutat în grefele gVH17_ABl şi, respectiv, gVH18_ABl pentru a modifica un potenţial situs de deamidare.

[0322] Genele care codifică o serie de secvenţe variante ale regiunii V a lanţului greu şi uşor pentru anticorp au fost proiectate şi construite printr-o abordare de sinteză automată de către DNA2.0 Inc. Alte variante ale regiunilor V ale lanţurilor grele şi uşoare au fost create prin modificarea genelor VH şi VK prin mutageneză dirijată de oligonucleotide, incluzând, în unele cazuri, mutaţii în cadrul CDR-urilor pentru a modifica potenţialele situsuri de deamidare. Pentru exprimarea tranzitorie în celulele mamiferelor, genele regiunii V a lanţului uşor umanizat au fost clonate în vectorul de expresie a lanţului uşor uman UCB pMhCK, care conţine ADN care codifică regiunea constantă a lanţului Kappa uman (alotipul Km3). Genele regiunii V a lanţului greu umanizat au fost clonate în vectorul de expresie a lanţului greu gamma-4 uman UCB pMhy4P FL, care conţine ADN care codifică regiunea constantă a lanţului greu gamma-4 uman cu mutaţia de stabilizare a balamalei S241P (Angal şi colab., Mol Immunol. 1993, 30(1): 105-8). Alternativ, genele VH umanizate au fost clonate în vectorul de expresie a lanţului greu gamma-1 uman UCB pMhylFL, care conţine ADN care codifică regiunea constantă a lanţului greu gamma-1 uman (alotipul Glml7, 1). Pentru a evalua cinetica de legare monovalentă a anticorpilor umanizaţi, genele VH umanizate au fost, de asemenea, clonate în vectorul de expresie Fab-HIS uman UCB pMhFablOHIS, care conţine ADN care codifică domeniul balama gamma-1 CHI uman cu o etichetă C-terminală formată din zece reziduuri de histidină: eticheta de histidină facilitează purificarea Fab-urilor exprimate prin cromatografie de afinitate. Co-transfecţia vectorilor cu lanţ greu şi uşor rezultanţi în celule în suspensie HEK293 a fost realizată utilizând 293 Fectin (12347-019 Invitrogen) şi a dat exprimare anticorpilor umanizaţi, recombinanţi, fie în format IgG4P uman, IgGl, fie în format Fab-HIS.

[0323] Variantele de lanţuri de anticorpi umanizaţi şi combinaţiile acestora au fost exprimate şi evaluate pentru potenţa lor în raport cu anticorpul părinte, proprietăţile lor biofizice şi adecvarea pentru procesarea ulterioară.

[0324] Pentru exprimarea stabilă a anticorpilor recombinanţi umanizaţi în celulele mamiferelor, gena regiunii V a lanţului uşor umanizat a fost unită cu o secvenţă de ADN care codifică regiunea constantă C-Kappa umană (alotipul Km3), pentru a crea o genă a lanţului uşor contiguu. Genele lanţului greu umanizate au fost unite la ADN-ul care codifică fie regiunea constantă a lanţului greu gamma-4P uman, fie regiunea constantă a lanţului greu gamma-1 uman (alotip Glml7, 1), pentru a crea gene contigue ale lanţului greu. Genele lanţurilor grele şi uşoare au fost clonate într-un vector de expresie la mamifere.

[0325] Experimentul 5 - Măsurarea stabilităţii termice

[0326] Temperatura de topire (Tm) sau temperatura la mijlocul desfăşurării a fost determinată utilizând testul Thermofluor. În această metodă, colorantul fluorescent SYPRO portocaliu a fost utilizat pentru a monitoriza procesul de desfăşurare a proteinelor prin legarea la regiunile hidrofobe care devin expuse pe măsură ce temperatura creşte.

[0327] Amestecul de reacţie a conţinut 5 μl de colorant 30 x SYPRO® Orange (Invitrogen), diluat cu PBS din soluţia stoc 5000X şi 45 μl de probă la 0,12 mg/ml (în PBS pH 7,4). 10 μl din amestec au fost distribuiţi în cvadruplicat într-o placă PCR cu 384 godeuri optice şi au fost rulaţi pe un sistem PCR rapid în timp real 7900HT (Applied Biosystems). Dispozitivul de încălzire al sistemului PCR a fost setat la 20 °C până la 99 °C, cu o rată de creştere de 1.1 °C/min. Un dispozitiv cuplat cu sarcină a monitorizat modificările fluorescenţei în godeuri. Creşterile de intensitate au fost reprezentate grafic, iar punctul de inflexiune al pantei (pantelor) a fost utilizat pentru a calcula Tm, aşa cum este descris mai jos.

[0328] Analiza anticorpilor care conţin lanţul uşor al SEQ ID nr.: 14 şi un lanţ greu variabil al SEQ ID nr.: 12 sau SEQ ID nr.: 13 pentru izotipurile IgGl (lanţul uşor al SEQ ID nr.: 14 şi lanţul greu al SEQ ID nr.: 54 (L14/H54) sau lanţul uşor al SEQ ID nr.: 14 şi lanţul greu al SEQ ID nr.: 55 (L14/H55)) şi IgG4 (lanţul uşor al SEQ ID nr.: 14 şi lanţul greu al SEQ ID nr.: 17 (L14/H17) sau lanţul uşor al SEQ ID nr.: 14 şi lanţul greu al SEQ ID nr. 18 (L14/H18)) este prezentată în Figura 6 şi Tabelul 3 de mai jos. Au fost observate două domenii de desfăşurare pentru ambele izotipuri. Prima poate fi atribuită Tm domeniului CH2; pentru izotipul IgGl aceasta s-a dovedit a fi mai mare (mai stabilă) decât formatul IgG4, în conformitate cu literatura de specialitate (Garber E, Demarest SJ. Biochem Biophys Res Commun. 2007 13 aprilie;355(3):751-7). Al doilea domeniu de desfăşurare poate fi atribuit unei medii a Tm a domeniului de desfăşurare Fab şi a domeniului CH3.

Anticorpul

Fab/CH3 (media)\tabFab/CH3 (SD)\tabCH2 (media)\tabCH2 (SD)

Ll4/Hl7

80.9 °C\tab0.3 °C\tab64.5 °C\tab0.3 °C

Ll4/Hl8

81.4 °C\tab0.7 °C\tab64.5 °C\tab0.5 °C

Ll4/H54

82.8 °C\tab0.2 °C\tab68.8 °C\tab0.2 °C

Ll4/H55

83 °C\tab0.1 °C\tab68.8 °C\tab0.2 °C

[0330] Experimentul 6 - Cristalografie cu raze X

[0331] Interacţiunea dintre un anticorp care leagă Tau având lanţul uşor al SEQ ID NO: 14 şi lanţul greu al SEQ ID NO: 18 (L14H18) şi o peptidă constând din reziduurile 234 până la 250 de Tau, aşa cum este definită în SEQ ID NO: 35 (peptidă, N-acetil-KSPSSAKSRLQTAPVPM-amidă definită în SEQ ID NO: a fost studiată prin cristalografie cu raze X.

[0332] Cristalizarea, determinarea structurii şi rafinarea structurii cristaline a peptidei tau complexate cu Fab L14H18.

[0333] Cristalizare

[0334] Complexul L14H18 Fab/peptidă tau 234-250 a cristalizat dintr-o picătură stagnantă prin faza de vapori într-un rezervor conţinând 30% g/v polietilen glicol 4000, 0,1M HEPES, pH 7,5, 0,2 M clorură de calciu deshidratată timp de 1-2 săptămâni în plăci MRC.

[0335] Picăturile au conţinut 400 nl de proteină Fab L14H18 la 1 lmg/ml cu un exces molar de 2 peptide tau 234-250 şi 400 nl de soluţie rezervor.

[0336] Cristalele aparţin grupului spaţial P3121, cu două copii ale peptidei L14H18 Fab/tau 234-250 în unitatea asimetrică.

[0337] Colecţie de difracţie cu raze X

[0338] Am colectat datele de difracţie cu raze X printr-un singur cristal de peptidă L14H18 Fab/tau 234-250. Cristalul a fost suspendat într-o buclă litografică şi congelat rapid sub azot lichid, după trecerea scurtă printr-o soluţie crioprotectoare conţinând 30% polietilen glicol 4000, 0,2M clorură de calciu, 0,1M tampon HEPES pH 7,5 şi 10% etilen glicol. Datele de difracţie au fost colectate pe un aparat Pilatis 6M la staţia de fascicul 104-1 din cadrul sincrotronului Diamond, Didcot, Oxfordshire, Marea Britanie. Lungimea de undă a fasciculului de raze X monocromatice a fost de 0,92819A. Spaţiul reciproc a fost eşantionat la trepte de oscilaţie de 0,2° în jurul axei goniostatului φ. Fişierul XIA cu date procesate, furnizat de instalaţia de sincrotron, a fost utilizat pentru determinarea structurii.

[0339] Determinarea structurii

[0340] Poziţia Fab a fost localizată de programul de înlocuire moleculară Phaser (Read,RJ, Acta Cryst. D57, 1373-1382 (2001)), utilizând Fab cu codul PDB 4HIX. Coeficientul Matthews a indicat o greutate moleculară probabilă de 100 kDa în celula unitară, soluţia găsind 2 copii ale Fab în unitatea asimetrică.

[0341] Construirea şi rafinarea modelului

[0342] Folosind hărţile densităţii electronice 2Fo-Fc şi Fo-Fc, reziduurile din molecula Fab au fost înlocuite conform secvenţei Fab L14H18, cu poziţiile ghidate de hărţile densităţii electronice.

[0343] Lanţurile Fab C şi D pentru a doua copie a Fab au avut o densitate mai clară decât prima copie (lanţurile H şi L).

[0344] Densitatea suplimentară de electroni a fost vizibilă adiacent CDR-urilor unei copii a Fab (lanţurile C şi D). Aceasta a relevat un lanţ peptidic cu o structură elicoidală în care a putut fi construită o parte din secvenţa peptidelor 234-250. Peptida a fost aliniată folosind densitatea clară pentru reziduurile de arginină şi lizină, apoi construită conform secvenţei cunoscute. Runde ulterioare de construire şi rafinare a modelului au îmbunătăţit densitatea regiunii peptidice şi au arătat o oarecare densitate pentru o peptidă legată de cealaltă copie a Fab (lanţurile H şi L).

[0345] Pentru construirea modelului a fost utilizat programul de calculator Coot (Emsley P., Lohkamp B., Scott W.G., Cowton K. Acta Crystallography D Biol Crystallography, 2010 Apr; 66 (Pt 4): 486 - 501). Rafinarea a fost efectuată folosind programul REFMAC (Murshudov G.N., Skubak P., Lebedev A.A., Pannu N.S., Steiner R.A., Nicholls R.A., Winn M.D., Long F., Vagin A.A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 2011 Apr; 67 (Pt 4): 355-67).

[0346] Modelul complexului peptidic L14H18 Fab/tau 234-250 constă din reziduurile 234-244 ale peptidei Tau, aşa cum este definită în SEQ ID NO: 35, reziduurile 2-219 ale lanţului greu şi 1-219 ale lanţului uşor.

[0347] Factorul R al modelului este 0,234, iar R fără reflexii este 0,291 pentru 36483 de reflexii. Abaterea rms de la geometria standard este de 0,0145 pentru lungimile legăturilor şi de 1,93° pentru unghiurile de legătură.

[0348] Epitopul

[0349] Interacţiunea dintre anticorpul L14H18 şi peptida tau, N-acetil-KSPSSAKSRLQTAPVPM-amida (bazată pe secvenţele 234 până la 250 ale izoformei 2 tau umane), a fost studiată prin cristalografie cu raze X utilizând un co-complex preparat din fragmentul Fab L14H18 incubat cu peptida. Structura rezultată a relevat principalele situsuri de contact dintre Fab L14H18 şi peptida tau şi au fost identificate ca fiind grupate în principal la nivelul buclelor CDR ale anticorpului şi reziduurilor peptidice SPSSAKSRLQ corespunzătoare reziduurilor 235-244 ale proteinei tau. Conform secvenţei de numerotare, aşa cum se arată în SEQ ID NO. 35, reziduurile care interacţionează cel mai strâns cu regiunea CDR a Fab-ului L14H18 din 5.0A sunt S235, P236, S237, S238, A239, K240, R242, L243, Q244 şi T245.

Claims (17)

1. Un anticorp izolat care se leagă de Tau sau un fragment de legare al acestuia, în care anticorpul sau fragmentul de legare al acestuia cuprinde o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde o CDR1 selectată din SEQ ID No.: 1, o CDR2 selectată din SEQ ID No.: 2 şi o CDR3 selectată din SEQ ID No.: 3; şi o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde o CDR1 selectată din SEQ ID No.: 4, o CDR2 selectată din SEQ ID No.: 5 şi/sau o CDR3 selectată din SEQ ID No.: 6.

2. Un anticorp izolat care se leagă de Tau sau un fragment de legare al acestuia, în care anticorpul sau fragmentul de legare al acestuia cuprinde o regiune variabilă a lanţului uşor care cuprinde SEQ ID Nr.: 9 şi o regiune variabilă a lanţului greu care cuprinde SEQ ID No.: 10.

3. Un anticorp care leagă Tau sau un fragment de legare al acestuia conform revendicării 2, în care anticorpul care leagă Tau sau fragmentul de legare al acestuia cuprinde un lanţ uşor care cuprinde SEQ ID No.: 14 şi/sau un lanţ greu care cuprinde SEQ ID No.: 17 sau 18.

4. Un anticorp care leagă Tau sau un fragment de legare al acestuia conform revendicării 2 sau 3, în care anticorpul care leagă Tau sau fragmentul de legare al acestuia cuprinde un lanţ uşor care cuprinde SEQ ID No.: 14 şi/sau un lanţ greu care cuprinde SEQ ID No.: 17 sau 18.

5. Un anticorp care leagă Tau sau un fragment de legare al acestuia conform revendicării 1, în care anticorpul sau fragmentul de legare al acestuia este un anticorp monoclonal umanizat.

6. Un anticorp de legare ATau sau fragment de legare al acestuia conform oricăreia dintre revendicările 1, 2, 3, 4 sau 5, în care anticorpul de legare Tau sau fragmentul de legare al acestuia se leagă atât de filamentele umane solubile, cât şi de filamentele elicoidale pereche (PHF) ale tau uman..

7. O moleculă sau molecule de acid nucleic izolate care codifică lanţul uşor şi greu al unui anticorp care se leagă de Tau sau un fragment de legare al acestuia conform oricăreia dintre revendicările 1, 2, 3, 4, 5 sau 6, în care lanţul uşor şi greu menţionat sunt codificate de aceeaşi moleculă de acid nucleic izolată sau de molecule de acid nucleic separate.

8. Un vector sau mai mulţi vectori de clonare sau expresie care cuprind una sau mai multe secvenţe de acid nucleic conform revendicării 7.

9. O celulă gazdă care cuprinde una sau mai multe secvenţe de acid nucleic conform revendicării 7 sau unul sau mai mulţi vectori de clonare sau expresie conform revendicării 8.

10. O metodă de producere a unui anticorp care leagă Tau sau a unui fragment de legare al acestuia, conform oricăreia dintre revendicările 1, 2, 3, 4 sau -5, cuprinzând cel puţin etapele de a) cultivare a unei celule gazdă conform revendicării 9 şi b) izolare a anticorpului care leagă Tau sau a fragmentului de legare al acestuia.

11. Un anticorp izolat care leagă Tau sau un fragment de legare al acestuia, conform oricăreia dintre revendicările 1, 2, 3, 4, 5 sau 6, pentru utilizare ca agent terapeutic activ.

12. Un anticorp izolat care leagă Tau sau un fragment de legare al acestuia, conform oricăreia dintre revendicările 1, 2, 3, 4, 5 sau 6, pentru utilizare în tratarea unei tauopatii.

13. Un anticorp izolat care leagă Tau sau un fragment de legare al acestuia, pentru utilizare conform revendicării 12, în care tauopatia menţionată este boala Alzheimer sau paralizie supranucleară progresivă.

14. Anticorpul biHdiHg Tau izolat sau fragment biHdiHg al acestuia, conform revendicărilor 1, 2, 3, 4, 5 sau 6, pentru utilizare ca agent diagnostic.

15. Un anticorp izolat care leagă Tau sau un fragment de legare al acestuia, conform oricăreia dintre revendicările 1, 2, 3, 4, 5 sau 6, pentru utilizare într-o metodă in vivo de diagnosticare a unei tauopatii.

16. Un anticorp izolat care se leagă de Tau sau un fragment de legare al acestuia pentru utilizare conform revendicării 15, în care tauopatia menţionată este boala Alzheimer sau paralizie supranucleară progresivă..

17. Utilizarea anticorpului izolat care leagă Tau sau a fragmentului de legare al acestuia, conform oricăreia dintre revendicările 1, 2, 3, 4, 5 sau 6, în diagnosticul in vitro.