ES3060948T3

ES3060948T3 - 2',3'-diacetyluridine substituted with acetoacetyl at the 5' position

Info

Publication number: ES3060948T3
Application number: ES21867793T
Authority: ES
Inventors: Borstel Reid Von; David Simpson; Garcia Rolando Garcia
Original assignee: Pharma Cinq LLC
Current assignee: Pharma Cinq LLC
Priority date: 2020-09-14
Filing date: 2021-09-14
Publication date: 2026-03-30
Anticipated expiration: 2041-09-14
Also published as: SI4210709T1; EP4667478A1; JP2023541919A; PL4210709T3; EP4210709B1; CN116157133A; EP4210709A1; US12577270B2; WO2022056428A1; KR20230067613A; CA3191547A1; PT4210709T; IL300902A; AU2021340882A1; MX2023002868A; FI4210709T3; DK4210709T3; HRP20260127T1; US20230357304A1; LT4210709T

Abstract

La 5'-O-(acetoacetil)-2',3'-di-O-acetiluridina es útil en el tratamiento o la prevención de trastornos caracterizados por insuficiencia energética metabólica cerebral o disminución de la capacidad de reserva energética mitocondrial. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] 2’,3’-diacetiluridina sustituida con acetoacetilo en la posición 5’

[0003] El suministro oral de uridina con fines terapéuticos está limitado por su escasa biodisponibilidad, aproximadamente 7 % tanto en seres humanos como en ratones. Se ha encontrado que los profármacos de éster de uridina mejoran su biodisponibilidad, aunque solo una, la 2’,3’,5,-tri-O-acetiluridina (o triacetato de uridina) se ha encontrado adecuada para suministrar uridina suficiente para propósitos clínicos. La biodisponibilidad de triacetato de uridina oral se ha medido en aproximadamente 50 % (Ashour 1996). Por lo tanto, hay margen de mejora en la eficiencia del suministro de uridina, lo cual es importante porque se requieren dosis relativamente grandes de uridina para sus aplicaciones terapéuticas.

[0004] Resumen de la invención

[0005] Esta invención proporciona el compuesto 5’-O-(acetoacetil)-2’,3’-di-O-acetiluridina. Proporciona un método para tratar o prevenir un trastorno caracterizado por el fallo de la energía metabólica cerebral o la disminución de la capacidad de reserva de energía mitocondrial en un sujeto mamífero, que comprende administrar al sujeto una cantidad de un compuesto de esta invención eficaz para tratar el trastorno. Esta invención también proporciona un compuesto de esta invención para su uso en el tratamiento o prevención, o para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención, de un trastorno caracterizado por el fallo de la energía metabólica cerebral o la disminución de la capacidad de reserva de energía mitocondrial en un sujeto mamífero. Y proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de esta invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Esta invención también proporciona un método para producir 5’-O-acetoacetil-2’,3’-di-O-acetiluridina, que comprende las etapas de: (a) mezclar 2’,3’-O-isopropilidenuridina y 2,2,6-trimetil-4H-1,3-dioxina-4-ona en dimetilformamida en condiciones para producir 5’-O-acetoacetil-2’,3’-O-isopropilidenuridina; (b) mezclar la 5’-O-acetoacetil-2’,3’-O-isopropilidenuridina de la etapa (a) con ácido acético acuoso en condiciones para producir 5’-O-acetoacetiluridina cruda; (c) disolver la 5’-O-acetoacetiluridina cruda de la etapa (b) en una mezcla de diclorometano y piridina, y después añadir anhídrido acético y agitar durante varios días; (d) a la mezcla resultante de la etapa (c), cambiar el solvente a acetato de etilo y neutralizar con NaHCO<3>saturado para producir 5’-O-acetoacetil-2’,3’-di-O-acetiluridina cruda. Esta invención también proporciona 5’-O-acetoa-cetiluridina como un intermediario crudo y como un compuesto aislado.

[0006] Los sustituyentes acetato mejoran la absorción del tracto gastrointestinal a la circulación y se eliminan rápidamente por la actividad de esterasa no específica. El acetato es un metabolito benigno, pero es farmacológicamente y terapéuticamente neutro. El descubrimiento de que la introducción de un sustituyente acetoacetilo en la posición 5’ mejora la biodisponibilidad de uridina lo suficiente para fines terapéuticos además de tener una actividad farmacológica beneficiosa en trastornos para los que también se indica el suministro de uridina, lo que produce una actividad terapéutica dual en una sola molécula, es un avance importante.

[0007] Las referencias relevantes pueden encontrarse en los documentos núms. WO 2016/028894 A1, WO 2019/152776 A1, WO 00/50043 A1 y US 2001/025032 A1.

[0008] Breve descripción de las figuras

[0009] Figura 1: [Uridina uracilo] en plasma en ratones después de la administración oral de profármacos de uridina UTA = triacetato de uridina (2’,3’,5’-tri-O-acetiluridina)

[0010] Tri-AcAcU = 2’,3’,5’-tri-O-(acetoacetil)uridina

[0011] AcAcDAU = 5’-O-(acetoacetil)-2’,3’-di-O-acetiluridina

[0012] DA-HU = 2’,3’-di-O-acetil-5’-O-heptanoiluridina

[0013] Figura 2. Uridina en plasma en ratones después de la administración oral de profármacos de uridina

[0014] Tri-AcAcU = 2’,3’,5’-tri-O-(acetoacetil)uridina

[0015] AcAcDAU = 5’-O-(acetoacetil)-2’,3’-di-O-acetiluridina

[0016] DA-HU = 2’,3’-di-O-acetil-5’-O-heptanoiluridina

[0017] Figura 3: Uridina en plasma en ratones después de la administración oral de profármacos de uridina

[0018] UTA = triacetato de uridina (2’,3’,5’-tri-O-acetiluridina)

[0019] DAU = 2’,3’-di-O-acetiluridina

[0020] AcAcU = 5’-O-(acetoacetil)uridina

[0021] Figura 4: Uridina en plasma en ratones después de la administración oral de AcAcDAU

[0022] AcAcDAU = 5’-O-(acetoacetil)-2’,3’-di-O-acetiluridina

[0023] Figura 5: Uracilo en plasma en ratones después de la administración oral de AcAcDAU

[0024] AcAcDAU = 5’-O-(acetoacetil)-2’,3’-di-O-acetiluridina

[0025] Figura 6: Uridina uracilo en plasma en ratones después de la administración oral de AcAcDAU

[0026] AcAcDAU = 5’-O-(acetoacetil)-2’,3’-di-O-acetiluridina

[0027] Figura 7: Beta-hidroxibutirato en plasma en ratones después de la administración oral de AcAcDAU BHB = Betahidroxibutirato

[0028] Figura 8: Supervivencia de ratones que reciben 60 mg/kg/día de ácido 3-nitropropiónico y se tratan con triacetato de uridina oral (UTA) 1000 mg/kg b.i.d. o 5’-O-acetoacetil-2’,3’-di-O-acetiluridina (AcAcDAU) 1113,5 mg/kg b.i.d. Descripción detallada de la invención

[0029] Como se usa en la presente, el término de transición "que comprende" es de extremo abierto. Una reivindicación que utiliza este término puede contener elementos además de los mencionados en dicha reivindicación. Por lo tanto, por ejemplo, las reivindicaciones pueden leerse en regímenes de tratamiento que también incluyen otros agentes terapéuticos o dosis de virus terapéuticas no mencionados específicamente en las mismas, siempre que estén presentes los elementos mencionados o su equivalente.

[0030] Abreviaturas

[0031] Determinados compuestos químicos se denominan en la presente descripción por su nombre químico o por la abreviatura o fórmula estructural que se muestra más abajo. El compuesto AcAcDAU está dentro del alcance de esta invención.

[0032] UTA = triacetato de uridina (2’,3’,5’-tri-O-acetiluridina)

[0033] Tri-AcAcU = 2’3’5’-tri-O-acetoacetil uridina PM 49642

[0035]

[0037] AcAcDAU = 5’-O-(acetoacetil)-2’,3’-di-O-acetiluridina PM 41235

[0040]

[0041] DA-HU = 2’,3’-di-O-acetil-5’-O-he tanoiluridina PM 44044

[0044]

[0045] DAU = 2’,3’-di-O-acetiluridina

[0046] AcAcU = 5’-O-(acetoacetil)uridina (también llamada 5’-O-acetoacetiluridina)

[0049]

[0050] BHB = beta-hidroxibutirato (también llamado 3-hidroxibutirato)

[0051] DCM = Diclorometano (también llamado cloruro de metileno, fórmula química CH2Cl2)

[0052] DMF = Dimetilformamida, fórmula química (CH3)2NC(O)H

[0053] De acuerdo con el método, el compuesto para su uso, el uso y la composición farmacéutica de esta invención pueden tratarse o prevenirse cualquier trastorno convencional caracterizado por el fallo de la energía metabólica cerebral o la disminución de la capacidad de reserva de energía mitocondrial en un sujeto mamífero. En una modalidad, el trastorno es un trastorno neurológico, por ejemplo, una enfermedad neurodegenerativa genética, un trastorno neurodegenerativo relacionado con la edad y una lesión cerebral traumática o isquémica. Los ejemplos de tales enfermedades neurodegenerativas genéticas incluyen, pero no se limitan a, demencia del síndrome de Down, enfermedad de Huntington y esclerosis lateral amiotrófica. Los ejemplos de tales trastornos neurodegenerativos relacionados con la edad incluyen, pero no se limitan a, la enfermedad de Parkinson y la demencia senil. La categoría de demencia senil incluye, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer y la demencia vascular. Los ejemplos de tales lesiones cerebrales traumáticas o isquémicas incluyen, pero no se limitan a, la lesión secundaria después de una lesión cerebral traumática, la lesión secundaria después de una encefalopatía hipóxico-isquémica, la lesión secundaria después de la asfixia al nacer, la lesión secundaria después de un accidente cerebrovascular isquémico, la lesión secundaria después de un accidente cerebrovascular hemorrágico, la lesión secundaria después de un paro cardíaco y la lesión secundaria después de ahogamiento.

[0055] En otra modalidad, el trastorno es un trastorno neuromuscular. Los ejemplos de tales trastornos neuromusculares incluyen, pero no se limitan a, la sarcopenia relacionada con la edad, la atrofia muscular por desuso, la distrofia muscular, la distrofia miotónica, el síndrome de fatiga crónica y la ataxia de Friedreich.

[0057] En otra modalidad, el trastorno es una insuficiencia cardiaca. Los ejemplos de tales insuficiencias cardíacas incluyen, pero no se limitan a, la cardiomiopatía dilatada, la insuficiencia del ventrículo derecho (que incluye la insuficiencia del ventrículo derecho secundaria a la hipertensión arterial pulmonar), la insuficiencia cardíaca aguda y la insuficiencia cardíaca crónica.

[0059] En otra modalidad, el trastorno es una enfermedad mitocondrial genética primaria. Los ejemplos de tales enfermedades mitocondriales genéticas primarias incluyen, pero no se limitan a, MELAS (encefalomiopatía mitocondrial con acidosis láctica y episodios similares a accidentes cerebrovasculares), MERRF (mioclono, epilepsia y miopatía con fibras rojas desgastadas), NARP (debilidad muscular neurogénica, ataxia, retinitis pigmentosa), NARP/MILS (debilidad muscular neurogénica, ataxia, retinitis pigmentosa/síndrome de Leigh hereditario materno), LHON (neuropatía óptica hereditaria de Leber) también conocido como "ceguera mitocondrial", KSS (síndrome de Kearns-Sayre), PMPS (síndrome de Pearson Marrow-Pancreas), PEO (oftalmoplejía externa progresiva), CPEO (oftalmoplejía externa progresiva crónica), síndrome de Leigh, MNGIE (síndrome de encefalopatía neurogastrointestinal mitocondrial), síndrome de Alpers, síndrome de eliminación múltiple del ADNmt, síndrome de depleción del ADNmt, deficiencia del complejo I mitocondrial, deficiencia del complejo II mitocondrial (SDH), deficiencia del complejo III mitocondrial, deficiencia del complejo IV mitocondrial (citocromo c oxidasa), deficiencia del complejo V mitocondrial, deficiencia del translocador de nucleótidos de adenina (ANT), deficiencia de piruvato deshidrogenasa (PDH), síndromes de eliminación múltiple del ADN mitocondrial, síndrome de Barth, miopatía mitocondrial, epilepsia mitocondrial y acidosis tubular renal mitocondrial.

[0061] Los ejemplos adicionales de trastornos que pueden tratarse o prevenirse de acuerdo con esta invención incluyen: Aciduria etilmalónica con acidemia láctica; aciduria 3-metilglutacónica con acidemia; epilepsia refractaria con descensos durante la infección; síndrome de Asperger con descensos durante la infección; autismo con descensos durante la infección; parálisis cerebral con descensos durante la infección; dislexia con descensos durante la infección; trombocitopatía y síndrome de leucemia hereditaria materna; síndrome MARIAHS (ataxia mitocondrial, infecciones recurrentes, afasia, hipouricemia/hipomielinización, convulsiones y aciduria dicarboxílica); distonía ND6; síndrome de vómitos cíclicos con descensos durante la infección; aciduria 3-hidroxisobutírica con acidemia láctica; diabetes mellitus con acidemia láctica; síndrome neurológico sensible a uridina (URNS); necrosis estriatal bilateral familiar (FBSN); sordera asociada a aminoglucósidos; linfoma esplénico; síndrome de Wolfram; acidosis tubular renal/diabetes/ataxia; acidemia láctica; encefalopatía; proteinuria 1+; aminoaciduria; hidroxiprolinuria; deficiencia de cardiolipina; una enfermedad degenerativa neuromuscular; retraso en el desarrollo en habilidades cognitivas, motoras, del lenguaje, ejecutivas o sociales; epilepsia; neuropatía periférica; neuropatía óptica; neuropatía autonómica; disfunción intestinal neurogénica; sordera neurosensorial; disfunción vesical neurogénica; migraña; ataxia; acidosis tubular renal; cardiomiopatía dilatadora; esteatohepatitis; insuficiencia hepática y acidemia láctica. Los ejemplos de retraso en el desarrollo en habilidades cognitivas, motoras, del lenguaje, de la función ejecutiva o sociales incluyen, pero no se limitan a: retraso en el desarrollo generalizado, retraso en el desarrollo generalizado-no especificado de cualquier otra manera (PDD-NOS), trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH), síndrome de Rett y algunas formas de autismo.

[0063] De acuerdo con esta invención, el compuesto puede administrarse a cualquier sujeto mamífero. En una modalidad, el sujeto de mamífero es un sujeto humano. De acuerdo con esta invención, puede utilizarse cualquier vía de administración convencional. Preferentemente, el compuesto se administra por vía oral. El experto puede ajustar la dosis para optimizarla para un paciente en particular. Típicamente, el compuesto se administra por vía oral a un paciente humano en una dosis de uno a tres g/m<2>de área superficial corporal. Usualmente, la dosis se administra dos o tres veces al día.

[0065] Se ha descubierto que un sustituyente acetoacetato en la posición 5’ del resto ribosa, combinado con sustituyentes acetato en las posiciones 2’ y 3’ produce un compuesto novedoso que suministra uridina a la circulación así como también o mejor que el triacetato de uridina. El sustituyente del profármaco se selecciona además para proporcionar un beneficio terapéutico adicional o complementario, más allá de facilitar el suministro de uridina.

[0066] Por el contrario, compuestos tales como triacetoacetato de uridina (2’,3’,5’-tri-O-acetoacetiluridina; el acetoacetato es uno de los cuerpos cetónicos, una forma oxidada de beta-hidroxibutirato) o 5’-O-heptanoilo-2’,3’-di-O-acetiluridina proporcionó un suministro sistémico relativamente deficiente de uridina después de la administración oral. Igualmente, la 5’-O-acetoacetiluridina suministró poco uridina a la circulación, y la 2’,3’-di-O-acetiluridina suministró menos de 30 % de uridina a la circulación frente a una dosis equimolar de triacetato de uridina. Por el contrario, un híbrido que combina restos estructurales de estas cuatro moléculas relativamente inactivas, 5’-O-acetoacetil-2’,3’-di-O-acetiluridina, suministró más uridina y catabolitos de uridina a la circulación que una dosis equimolar de triacetato de uridina.

[0067] El acetoacetato, un cuerpo cetónico con propiedades neuroprotectoras, también se suministra simultáneamente con uridina cuando se incorpora en 5’-O-(acetoacetil)-2’,3’-di-O-acetiluridina. Acetoacetato y beta-hidroxibutirato, que se suministran ambos mediante la administración oral de 5’-O-(acetoacetil)-2’,3’-di-O-acetiluridina son problemáticos para suministrar por vía oral, en parte debido a un sabor poco agradable, de manera que se han propuesto profármacos éster de estos cuerpos cetónicos, notablemente 3-hidroxibutil 3-hidroxibutirato enriquecido enantioméricamente con respecto al enantiómero (3R, 3R’) (el enantiómero R [o D] es la forma natural en la bioquímica de los mamíferos, mientras que la síntesis química de BHB da como resultado inicialmente una mezcla racémica de enantiómeros). La 5’-O-(acetoacetil)-2’,3’-di-O-acetiluridina supera el problema de palatabilidad de los ácidos ceto libres y suministra inicialmente acetoacetato escindido de la armazón de uridina, que se convierte in vivo en R-BHB sin la necesidad de enriquecimiento enantiómero durante la síntesis y purificación química. Un agente único con actividades farmacológicas duales y complementarias también es ventajoso desde la perspectiva de los problemas regulatorios que involucran la complejidad de los ensayos clínicos para fármacos combinados y para reducir las cargas sobre los pacientes que pueden limitar el cumplimiento.

[0068] La conversión de acetoacetato a BHB a través de la enzima beta-hidroxibutirato deshidrogenasa usa NADH como donante de electrones, lo que da como resultado la regeneración de NAD+. En algunos estados de la enfermedad asociados con la disfunción de la cadena respiratoria mitocondrial, una relación NADH/NAD+ alta, debido a la capacidad limitada de la cadena respiratoria para aceptar electrones de NADH, da como resultado una patología secundaria importante, ya que las relaciones NADH/NAD+ afectan la actividad de un gran número de enzimas citosólicas. El mantenimiento de una relación NADH/NAD+ excesiva se denomina "estrés reductivo" y es un contribuyente reconocido a la disfunción tisular y los efectos adversos sobre la esperanza de vida en trastornos con déficits en la cadena de transporte de electrones mitocondrial. La administración de AcAcDAU exógena da como resultado la oxidación neta de NADH para producir NAD+, lo que genera BHB, que a su vez tiene importantes beneficios farmacológicos y fisiológicos, tanto como combustible alternativo para el cerebro y otros tejidos, como molécula de señalización, con efectos antiinflamatorios, antiepilépticos y otros conocidos. Por lo tanto, AcAcDAU es útil para aliviar el estrés reductor en trastornos caracterizados por la acumulación de NADH secundaria a la disfunción de la cadena de transporte de electrones, con la oxidación de NADH por acetoacetato que complementa la mejora de la eficiencia bioenergética mitocondrial mediada por el resto de uridina. Además, se conoce que el BHB tiene beneficios pleiotrópicos potenciales, no necesariamente mediados por el alivio del estrés reductor, a concentraciones alcanzadas después de la administración oral de AcAcDAU, que incluyen, pero no se limitan a, la actividad antiinflamatoria y antiepiléptica.

[0069] En una modalidad del método para producir 5’-O-acetoacetil-2’,3’-di-O-acetiluridina descrita anteriormente, la etapa (a) se realiza a una temperatura de 90 °C a 110 °C, por ejemplo a una temperatura de aproximadamente 110 °C. En otra modalidad, la etapa (b) se realiza a una temperatura de a partir de la temperatura ambiente a 75 °C, por ejemplo a una temperatura de aproximadamente 65 °C. En otra modalidad etapa (c) se realiza a aproximadamente temperatura ambiente. La temperatura ambiente es típicamente aproximadamente 25 °C. Preferentemente, el método para producir 5’-O-acetoacetil-2’,3’-di-O-acetiluridina descrito anteriormente comprende además como etapa (e), purificar la 5’-O-acetoacetil-2’,3’-di-O-acetiluridina cruda de la etapa (d) para producir 5’-O-acetoacetil-2’,3’-di-O-acetiluridina.

[0070] La invención se entenderá mejor mediante referencia a los siguientes ejemplos, que ilustran pero no limitan la invención descrita en la presente descripción.

[0071] Ejemplos

[0072] Ejemplo 1: Síntesis de 5’-O-(acetoacetil)-2’,3’-di-O-acetiluridina, 5’-O-(acetoacetil)-2’-O-acetil-3’-O-formiluridina y 5’-O-(acetoacetil)-3’-O-acetil-2’-O-formiluridina

[0073]

[0076] Una mezcla de 2’,3’-O-isopropilidenuridina (5,21 g, 18,3 mmol) y 25 ml de N-metilpirrolidinona se calentó a 110 °C, y después 2,2,6-trimetil-4H-1,3-dioxin-4-ona (3,00 ml, 22,6 mmol). Después de 2 h, la mezcla se enfrió y se dividió entre acetato de etilo (3x100 ml) y agua (2x100 ml). Las fases orgánicas se lavaron con salmuera (100 ml), se secaron sobre MgSO<4>anhidro y se concentraron al vacío para dar un aceite marrón oscuro. Rf 0,50 (10 % de MeOH/DCM). La mezcla cruda se calentó a 65 °C en una mezcla de 20 ml de ácido fórmico y 20 ml de agua durante 4 horas. Después, los componentes volátiles se evaporaron al vacío. Rf 0,29 (10 % de MeOH/DCM).

[0078] Una mezcla del producto de reacción crudo y 6 ml de piridina y 36 ml de DCM se enfrió mediante un baño de hielo. Después, se añadió lentamente cloruro de acetilo (3,00 ml, 42,0 mmol). Después de 2 h, se añadieron 5 ml de agua y la mezcla se concentró. El residuo se recogió en acetato de etilo (100 ml) y se lavó sucesivamente con 100 ml de agua, bicarbonato de sodio saturado, agua, HCl 1 M y agua. Las fases acuosas se extrajeron con acetato de etilo (2x100 ml). Las fases orgánicas se lavaron con salmuera (100 ml), se secaron en MgSO<4>anhidro y se concentraron al vacío. La purificación del producto principal por cromatografía ultrarrápida mediante el uso de un gradiente de etapa de 1 %, 2 % y 3 % de MeOH/DCM dio 1,6 g de material de color amarillo pálido. Rf 0,24 (5 % de MeOH/DCM) El análisis por LC/MS mostró que el material era una mezcla 9,4:1 de 5’-O-(acetoa-cetil)-2’,3’-di-O-acetiluridina y una combinación de 5’-O-(acetoacetil)-2’-O-acetil-3’-O-formiluridina y 5’-O-(acetoa- cetil)-3’-O-acetil-2’-O-formiluridina.

[0079] Esquema 1

[0080]

[0083] Ejemplo 2: Síntesis mejorada de 5’-O-acetoacetil-2’,3’-di-O-acetiluridina

[0086]

[0088] 5’-O-acetoacetil-2’,3’-O-isopropilidenuridina

[0090] Una mezcla de 2’,3’-O-isopropilidenuridina (40 g, 141 mmol) y 2,2,6-trimetil-4H-1,3-dioxin-4-ona (18,7 ml, 141 mmol) en 60 ml de DMF se calentó a 110 °C durante 2 h. Después, la mezcla se enfrió y los componentes volátiles se evaporaron. El residuo se dividió entre acetato de etilo y agua, y las fases orgánicas se lavaron con salmuera, se secaron en MgSO<4>anhidro y se concentró por evaporación. La purificación por cromatografía ultrarrápida (3 % de MeOH/DCM) dio el producto contaminado por material coloreado. La decoloración parcial con 2 g de carbón activado en acetato de etilo dio 35 g de producto como un jarabe de color marrón claro. Rf 0,71 (10 % de MeOH/DCM).

[0091] 5’-O-acetoacetiluridina

[0092] Una mezcla de 5’-O-acetoacetil-2’,3’-O-isopropilidenuridina (35 g, 95 mmol), 100 ml de ácido acético y 100 ml de agua se calentó a 65 °C durante 24 horas, momento en el que la TLC de una alícuota de la mezcla mostró que el material de partida se consumió casi por completo. Los componentes volátiles se evaporaron al vacío. El producto crudo se continuó. Rf 0,32 (10 % de MeOH/DCM).

[0093] 5’-O-acetoacetil-2’,3’-di-O-acetiluridina

[0094] El producto crudo obtenido anteriormente se recogió en 100 ml de DCM y 30 ml de piridina, y después los solventes se evaporaron al vacío. El residuo se recogió en 250 ml de DCM y 19 ml de piridina. Una vez que la mezcla fue homogénea, se añadieron 22 ml de anhídrido acético. La mezcla se agitó durante 3 días. Después, el solvente se cambió a 500 ml de acetato de etilo y se neutralizó con NaHCO<3>saturado. Los componentes volátiles se evaporaron para eliminar el exceso de piridina. El residuo se dividió entre acetato de etilo y agua, HCl 1 M, agua y salmuera, y las fases orgánicas se secaron en MgSO<4>anhidro y se concentraron al vacío. La purificación por cromatografía ultrarrápida (3 % de MeOH/DCM) dio 25,7 g de producto como un sólido espumoso blanco.<1>H RMN (400 MHz, CDCl<3>) δ 9,04 (br s, 1H), 7,47 (d, 1H, J=8 Hz), 6,07 (d, 1H, J=6 Hz), 5,84 (d, 1H, J=8 Hz), 5,38-5,35 (m, 1H), 5,31-5,28 (m, 1H), 4,90 (ABX, 1H, J=2,5, 12,5 Hz), 4,39 (ABX, 1 H, J=3,7, 12,4 Hz), 4,35-4,32 (m, 1H), 3,61 (AB, 1H, J=16 Hz), 3,56 (AB, 1H, J=16 Hz), 2,97 (s, 3H), 2,14 (s, 3H), 2,10 (s, 3H); LC/MS 99,4 % de pureza (260 nm); PM: Calc.412, Encontrada 412; Rf 0,24 (5 % de MeOH/DCM).

[0095] Esquema 2

[0096]

[0098] Ejemplo 3: Síntesis mejorada de 5’-O-acetoacetiluridina

[0100]

[0102] 5’-O-acetoacetiluridina

[0103] Una mezcla de 5’-O-acetoacetil-2’,3’-O-isopropilidenuridina (11,4 g, 31,0 mmol), 75 ml de ácido acético y 75 ml de agua se calentó a 65 °C durante 24 h, momento en el que la TLC de una alícuota de la mezcla mostró que el material de partida se consumió casi por completo. Los componentes volátiles se evaporaron al vacío. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (gradiente en etapa de 5 % y 7 % de MeOH/DCM) para dar 6,10 g del producto como un sólido espumoso blanco.<1>H RMN (400 MHz, DMSO- d<6>) δ 11,36 (s, 1H), 7,59 (d, 1H, J=8 Hz), 5,76 (d, 1H, J=5 Hz), 5,64 (d, 1H, J=8 Hz), 5,46 (d, 1H, J=6 Hz), 5,29 (d, 1H, J=6 Hz), 4,31 (1H, ABX, J=3, 12 Hz), 4,22 (1H, ABX, J=5, 12 Hz), 4,07 (q, 1H, J=5 Hz), 4,02-3,98 (m, 1H), 3,95 (q, 1H, J=5 Hz), 3,68 (2H, AB), 2,19 (s, 3H);<13>C RMN (100 MHz, DMSO-d<6>) δ 201,63, 167,07, 163,01, 150,62, 140,75, 101,99, 88,48, 81,04, 72,63, 69,68, 64,26, 49,46, 30,10; Rf 0,32 (10 % de MeOH/DCM).

[0104] Ejemplo 4: Uridina y [uridina uracilo] en plasma en ratones después de la administración oral de profármacos de uridina

[0105] Producto químico(s): HPMC (hidroxipropil)metilcelulosa (SIGMA-Aldrich: núm. cat. H3785, CAS 9004-65-3); triacetato de uridina (2’,3’,5’-tri-O-acetiluridina): UTA, código de artículo D000156, lote núm. Q000001095, fabricado por Almac Sciences; 2’,3’,5’-tri- O-(acetoacetil)uridina: Tri-AcAcU; 5’-O-(acetoacetil)-2’,3’-di-O-acetiluridina: AcAcDAU; 2’,3’-di-O-acetil-5’-O-hepta- noiluridina: DA-HU. (Nota: la AcAcDAU usada en este experimento fue la mezcla de 9,4 partes de 5’-O-(acetoacetil)-2’,3’-di-O-acetiluridina y 1 parte de una combinación de 5’-O-(acetoacetil)-2’-O-acetil-3’-O-formiluridina y 5’-O-(acetoacetil)-3’-O-acetil-2’-O-formiluridina del Ejemplo 1 anterior.) Vehículo: Se usó HPMC acuosa como vehículo para la administración oral de los derivados de uridina.

[0106] Formulación de dosificación: La UTA y otros derivados de uridina se prepararon en HPMC al 0,75 %. Se añadieron UTA y otros derivados de uridina a HPMC al 0,75 % y se homogeneizaron para eliminar grumos. La suspensión se preparó hasta el volumen y la concentración deseados y se sonicó para desagregar cualquier grupo pequeño sobrante en partículas finas. Las suspensiones se almacenaron a 4 °C hasta su uso. Las suspensiones se usaron dentro de las 24 horas posteriores a la preparación.

[0107] Dosificación: Los ratones recibieron una dosis de 600 mg/kg de UTA administrada por sonda gástrica a 0,02 ml/g de peso corporal. Otros derivados de uridina se administraron de la misma manera a concentraciones que contenían cantidades de uridina equimolares a UTA.

[0108] Animales: Ratones CD-1 hembras.

[0111]

[0113] El diseño inicial general para el experimento implicó la administración por sonda gástrica de grupos de 6 ratones con derivados de uridina y la obtención de muestras de sangre en varios puntos de tiempo después (3 ratones se sangraron durante 2 puntos de tiempo (15 y 60 minutos), y otros 3 ratones se sangraron durante los otros 2 puntos de tiempo (30 y 120 minutos). Cada experimento incluyó un punto de tiempo de HPMC (vehículo solo) con 3 ratones para establecer una línea de base para la uridina en sangre.

[0116]

[0118] Las muestras de sangre se recolectaron en tubos de separación de plasma, que se centrifugaron inmediatamente después de la recolección de sangre, y las alícuotas de plasma se congelaron para su posterior procesamiento. Más tarde, el plasma se desproteinizó y la uridina y el uracilo se cuantificaron mediante cromatografía líquida mediante el uso de detección de absorbancia UV y espectrometría de masas.

[0119] El suministro de uridina al torrente sanguíneo se evaluó mediante el monitoreo de uridina y la suma de uridina y uracilo [uridina uracilo] en plasma, ya que el uracilo es el primer producto en la degradación enzimática de la uridina. Los ratones convierten la uridina administrada en uracilo más rápida y extensamente que los humanos. De los compuestos probados, la administración oral de 5’-O-(acetoacetil)-2’,3’-di-O-acetiluridina (AcAcDAU) dio como resultado el suministro de uridina y [uridina uracilo sistémica a un grado similar o mayor que el suministro oral de triacetato de uridina.

[0120] Las concentraciones de [uridina uracilo] en plasma y uridina en plasma después de la administración de un conjunto de profármacos de uridina se muestran en las Figuras 1 y 2. La Figura 3 muestra la uridina en plasma en ratones después de la administración oral de un conjunto diferente de profármacos de uridina.

[0121] Ejemplo 5: Uridina y beta-hidroxibutirato en plasma en ratones después de la administración oral de 5’-O-(acetoacetil)-2’,3’-di-O-acetiluridina

[0122] Una característica importante de la 5’-O-(acetoacetil)-2’,3’-di-O-acetiluridina (AcAcDAU) es que produce un suministro simultáneo o concurrente de uridina y acetoacetato a través de una sola molécula de fármaco. El acetoacetato en plasma está en equilibrio con beta-hidroxibutirato (BHB) que refleja las relaciones NADH/NAD+ libres en los mitocondrias hepáticas, y favorece en gran medida el BHB como el más prevalente de los dos cuerpos cetónicos en condiciones fisiológicas normales. Además, el BHB es estable después de la obtención y el procesamiento de muestras de sangre, mientras que el acetoacetato es lábil. Por lo tanto, el BHB en plasma se midió junto con la uridina en plasma en ratones que recibieron AcAcDAU oral.

[0123] Producto químico(s): HPMC (hidroxipropil) metilcelulosa (SIGMA-Aldrich: núm. cat. H3785, CAS 9004-65-3), 5’-O-(acetoacetil)-2’,3’-di-O-acetiluridina (AcAcDAU; lote # 432168B). Este experimento usó la AcAcDAU del Ejemplo 2. Vehículo: Se usó HPMC acuosa como vehículo para la administración oral de los derivados de uridina.

[0124] Formulación de dosificación: La UTA y otros derivados de uridina se prepararon en HPMC al 0,75 %. Se añadió AcAcDAU a HPMC al 0,75 % y se homogeneizó para eliminar los grumos. Las suspensiones se prepararon hasta el volumen y la concentración deseados y se sometieron a sonicación para desagregar cualquier grumo pequeño sobrante en partículas finas. Las suspensiones se almacenaron a 4 °C hasta su uso. Las suspensiones se usaron dentro de las 24 horas posteriores a la preparación.

[0125] Dosificación: Los ratones recibieron una dosis de 2350 mg/kg de AcAcDAU administrados por sonda gástrica a 0,02 ml/g de peso corporal. Los ratones de control recibieron solo el vehículo de HPMC al 0,75 %

[0128]

[0130] Diseño experimental general: El diseño general del experimento implicó la administración por sonda gástrica de AcAcDAU a ratones y la obtención de muestras de sangre en varios puntos de tiempo después (ver tabla más abajo para más detalles). El experimento incluyó un grupo con 2 ratones que recibieron por sonda gástrica HPMC sola y se les extrajo sangre a los 60 y 120 min para determinar la uridina en plasma inicial.

[0133]

[0135] Los ratones recibieron 0,02 ml/g de peso corporal de una suspensión (hidroxipropilmetilcelulosa al 0,75 % en agua) con una concentración de AcAcDAU de 117 mg/ml para una dosis de 2350 mg/kg de peso corporal. En cada punto de tiempo (15, 30, 60 y 120 minutos después de la administración), se recolectaron muestras de sangre (~100 microlitros) de 4 ratones en tubos separadores de plasma. Las muestras se centrifugaron rápidamente y el plasma resultante se congeló en hielo seco. Subsecuentemente, las muestras de plasma se desproteinizaron y se sometieron a análisis de HPLC de fase inversa para la medición de uridina en plasma y su metabolito inicial uracilo. También se usaron alícuotas de las mismas muestras de plasma para la medición de las concentraciones de BHB con un kit de ensayo enzimático comercial.

[0136] La uridina en plasma y su metabolito inicial uracilo se elevaron después de la administración oral de AcAcDAU, como se muestra en las Figuras 4, 5 y 6. El beta-hidroxibutirato en plasma también se elevó mediante la administración de AcAcDAU, como se muestra en la Figura 7, con un área bajo la curva (AUC) de 24212 nmol/ml x min.

[0137] Ejemplo 6: Protección contra la mortalidad provocada por ácido 3-nitropropiónico mediante 5’-acetoacetil-2’,3’-di-O-acetiluridina y 2’3’5’-tri-O-acetiluridina

[0138] La 5’-O-acetoacetil-2’,3’-di-O-acetiluridina (AcAcDAU) suministra tanto uridina como acetoacetato (y betahidroxibutirato [BHB] derivado de acetoacetato) a la circulación después de la administración oral. Se diseñó un estudio para comparar la eficacia relativa de UTA frente a AcAcDAU en un modelo de fallo de energía mitocondrial letal progresiva. La disfunción mitocondrial se produjo mediante la administración diaria de ácido 3-nitropropiónico (3-NP; 60 mg/kg/día) mediante inyección intraperitoneal. El 3-NP es un inhibidor irreversible de la succinato deshidrogenasa (complejo II de la cadena de transporte de electrones mitocondrial). La dosificación diaria con 3-NP da como resultado una disminución progresiva de la capacidad mitocondrial para mantener la producción de ATP, lo que finalmente da como resultado la mortalidad tanto por neurodegeneración como por cardiomiopatía. Ratones CD-1 hembras de aproximadamente 16 semanas de edad se dividieron en grupos de 10 ratones cada uno con peso coincidente. Todos los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales diarias de 3-NP (60 mg/kg) en un volumen de 0,01 ml por gramo de peso corporal.

[0139] Además de las inyecciones diarias de 3-NP, los tres grupos de ratones recibieron 1) vehículo; 2) UTA; o 3) AcAcDAU. Este experimento usó la AcAcDAU del Ejemplo 2. Estos tratamientos se administraron por vía oral, por sonda gástrica, en un volumen de 0,02 ml por gramo de peso corporal.

[0140] Grupos:

[0141] 1. Control de vehículo (HPMC al 0,75 %; hidroxipropilmetilcelulosa)

[0142] 2. Triacetato de uridina 1000 mg/kg BID (suspendido en HPMC al 0,75 %)

[0143] 3. AcAcDAU 1113,5 mg/kg (equivalente molar a 1000 mg/kg de UTA) BID (disuelta en HPMC al 0,75 %) El esquema de tratamiento fue el si uiente:

[0146]

[0148] Los pesos corporales se registraron cada día para ajustar las dosis del fármaco a medida que los ratones perdían peso durante el tratamiento repetido con 3-NP.

[0149] Los tiempos de supervivencia (supervivencia mediana; el punto de tiempo en el que el 50 % de los animales en un grupo habían muerto) y el por ciento de supervivencia al final del estudio de 11 días se usaron para cuantificar y comparar los efectos protectores de los agentes de prueba.

[0150] Resultados:

[0151] Los porcentajes de supervivencia finales y los tiempos de supervivencia media al final del estudio se muestran en la siguiente Tabla 1 y en la Figura 8.

[0152] Tabla 1: Supervivencia de ratones que recibieron 60 mg/kg/día de ácido 3-nitropropiónico y se trataron con triacetato de uridina oral UTA 1000 m /k b.i.d. o 5’-acetoacetil-2’3’-di-O-acetiluridina AcAcDAU 11135 m /k b.i.d.

[0155]

[0157] Las dosis equimolares de UTA y AcAcDAU mejoraron ambas el tiempo de supervivencia durante el fallo mitocondrial progresivo frente al vehículo solo. El tratamiento con AcAcDAU mostró un tiempo medio de supervivencia más largo que la administración de UTA en ratones sometidos a un fallo progresivo de la energía mitocondrial.

[0158] Ejemplo 7: Protección contra la mortalidad debida al ácido 3-nitropropiónico por 5’-acetoacetil-2’,3’-di-O-acetiluridina y 2’3’5’-tri-O-acetiluridina

[0159] El Ejemplo 6 mostró que el tratamiento con AcAcDAU dio como resultado una mejor supervivencia en un modelo de efectos de fallo mitocondrial progresivo letal cuando se administró por vía oral a 1113,5 mg/kg por dosis frente al equivalente molar de UTA (1000 mg/kg/dosis). En este ejemplo, el efecto de dosis más altas de UTA (2000 mg/kg/dosis) frente a AcAcDAU equimolar (2227 mg/kg/dosis) se comparó en el mismo sistema modelo.

[0160] Grupos:

[0161] 1. Control de vehículo (HPMC al 0,75 %; hidroxipropilmetilcelulosa)

[0162] 2. Triacetato de uridina 2000 mg/kg BID (suspendido en HPMC al 0,75 %)

[0163] AcAcDAU 2227 mg/kg (equivalente molar a 2000 mg/kg de UTA) BID (disuelto en HPMC al 0,75 %). Este experimento usó la AcAcDAU del Ejemplo 2. El esquema de tratamiento fue el siguiente:

[0166]

[0168] Los pesos corporales se registraron cada día para ajustar las dosis del fármaco a medida que los ratones perdían peso durante el tratamiento repetido con 3-NP.

[0169] El por ciento de supervivencia de los ratones en cada grupo de 10 ratones al final del estudio de 10 días se usó para cuantificar y comparar los efectos protectores de los agentes de prueba.

[0170] Resultados:

[0171] Los porcentajes de supervivencia finales al final del estudio se muestran en la siguiente Tabla 2.

[0172] Tabla 2: Supervivencia de ratones que reciben 60 mg/kg/día de ácido 3-nitropropiónico y se trataron con triacetato de uridina (UTA) oral 2000 m /k b.i.d. o 5’-acetoacetil-2’3’-di-O-acetiluridina AcAcDAU 2227 mg/kg b.i.d.

[0175]

[0177] Tanto UTA como AcAcDAU mejoraron el tiempo de supervivencia durante el fallo mitocondrial progresivo frente al vehículo solo. El tratamiento con AcAcDAU dio como resultado una mejor supervivencia en el punto de tiempo de 10 días que la administración de dosis equimolares de UTA oral en ratones sometidos a fallo progresivo de la energía mitocondrial.

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Un compuesto, 5’-O-(acetoacetil)-2’,3’-di-O-acetiluridina.

2. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable.

3. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 2 para su uso en el tratamiento o la prevención de un trastorno caracterizado por fallo de la energía metabólica cerebral o disminución de la capacidad de reserva de energía mitocondrial en un sujeto mamífero, en donde una cantidad del compuesto eficaz para tratar el trastorno se administra al sujeto.

4. El compuesto o composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el trastorno es un trastorno neurológico, un trastorno neuromuscular, insuficiencia cardiaca o una enfermedad mitocondrial genética primaria.

5. El compuesto o composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el trastorno es un trastorno neurológico, opcionalmente en donde el trastorno neurológico se selecciona del grupo que consiste en:

una enfermedad neurodegenerativa genética, además opcionalmente en donde la enfermedad neurodegenerativa genética se selecciona del grupo que consiste en demencia del síndrome de Down, enfermedad de Huntington y esclerosis lateral amiotrófica;

un trastorno neurodegenerativo relacionado con la edad, además opcionalmente en donde el trastorno neurodegenerativo relacionado con la edad se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Parkinson y la demencia senil, y opcionalmente en donde la demencia senil se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Alzheimer y la demencia vascular; y

una lesión cerebral traumática o isquémica, además opcionalmente en donde la lesión cerebral traumática o isquémica se selecciona del grupo que consiste en la lesión secundaria después de una lesión cerebral traumática, la lesión secundaria después de una encefalopatía hipóxico-isquémica, la lesión secundaria después de la asfixia al nacer, la lesión secundaria después de un accidente cerebrovascular isquémico, la lesión secundaria después de un accidente cerebrovascular hemorrágico, la lesión secundaria después de un paro cardíaco y la lesión secundaria después de ahogamiento.

6. El compuesto o composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el trastorno es un trastorno neuromuscular, opcionalmente en donde el trastorno neuromuscular se selecciona del grupo que consiste en sarcopenia relacionada con la edad, atrofia muscular por desuso, distrofia muscular, distrofia miotónica, síndrome de fatiga crónica y ataxia de Friedreich.

7. El compuesto o composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el trastorno es insuficiencia cardiaca, opcionalmente en donde la insuficiencia cardiaca se selecciona de un grupo que consiste en miocardiopatía dilatada, insuficiencia ventricular derecha, insuficiencia cardiaca aguda e insuficiencia cardiaca crónica.

8. El compuesto o composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el trastorno es una enfermedad mitocondrial primaria genética, opcionalmente en donde la enfermedad mitocondrial primaria genética se selecciona del grupo que consiste en encefalopatía mitocondrial con acidosis láctica y episodios de accidente cerebrovascular (MELAS), mioclono, epilepsia y miopatía con fibras rojas desgastadas (MERRF), debilidad muscular de origen neurogénico, ataxia, retinitis pigmentosa (NARP), debilidad muscular de origen neurogénico, ataxia, retinitis pigmentosa/síndrome de Leigh de herencia materna (NARP/MILS), neuropatía óptica hereditaria de Lebers (LHON), ceguera mitocondrial, síndrome de Kearns-Sayre (KSS), síndrome de Pearson Marrow-Pancreas (PMPS), oftalmoplejía externa progresiva (PEO), oftalmoplejía externa progresiva crónica (CPEO), síndrome de Leigh, síndrome neurogastrointestinal encefalopático mitocondrial (MNGIE), síndrome de Alpers, síndrome de eliminación múltiple de ADN mitocondrial (mtDNA), síndrome de depleción de mtDNA, deficiencia del complejo I mitocondrial, deficiencia del complejo II mitocondrial (SDH), deficiencia del complejo III mitocondrial, deficiencia del complejo IV mitocondrial (citocromo c oxidasa), deficiencia del complejo V mitocondrial, deficiencia del translocador de nucleótidos de adenina (ANT), deficiencia de piruvato deshidrogenasa (PDH), síndrome de Barth, miopatía mitocondrial, epilepsia mitocondrial y acidosis tubular renal mitocondrial.

9. El compuesto o composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el sujeto mamífero es un sujeto humano.

10. El compuesto o composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el compuesto se administra por vía oral.

11. El compuesto o composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el

compuesto se administra en una dosis de uno a tres g/m<2>, opcionalmente en donde la dosis se administra dos o tres veces al día.

12. Un método para producir 5’-O-acetoacetil-2’,3’-di-O-acetiluridina, que comprende las etapas de:

(a) mezclar 2’,3’-O-isopropilidenuridina y 2,2,6-trimetil-4H-1,3-dioxina-4-ona en dimetilformamida en condiciones para producir 5’-O-acetoacetil-2’,3’-O-isopropilidenuridina;

(b) mezclar la 5’-O-acetoacetil-2’,3’-O-isopropilidenuridina de la etapa (a) con ácido acético acuoso en condiciones para producir 5’-O-acetoacetiluridina cruda;

(c) disolver la 5’-O-acetoacetiluridina cruda de la etapa (b) en una mezcla de diclorometano y piridina, y después añadir anhídrido acético y agitar durante varios días para producir una mezcla resultante;

(d) cambiar el solvente en la mezcla resultante de la etapa (c) a acetato de etilo, y neutralizar con NaHCO<3>saturado para producir 5’-O-acetoacetil-2’,3’-di-O-acetiluridina cruda.

13. El método de la reivindicación 12, en donde: la etapa (a) se realiza a una temperatura de 90 °C a 110 °C; la etapa (b) se realiza a una temperatura de temperatura ambiente a 75 °C, opcionalmente en donde la etapa (b) se realiza a una temperatura de aproximadamente 65 °C; y/o la etapa (c) se realiza a aproximadamente temperatura ambiente.

14. El método de la reivindicación 12, que comprende además purificar la 5’-O-acetoacetil-2’,3’-di-O-acetiluridina cruda de la etapa (d) para producir 5’-O-acetoacetil-2’,3’-di-O-acetiluridina.

15. Un compuesto, 5’-O-acetoacetiluridina.