ES3063113T3 - Improved dosages of eteplirsen for treating duchenne muscular dystrophy - Google Patents

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Dosis mejoradas de eteplirsen para el tratamiento de la distrofia muscular de duchenne

[0003] SOLICITUDES RELACIONADAS

[0004] Esta solicitud de patente reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional de Estados Unidos n.º de serie 61/793.463, presentada el 15 de marzo de 2013.

[0005] CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0006] La presente invención se refiere al eteplirsen para su uso en el tratamiento de la distrofia muscular en un paciente.

[0007] ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0008] Se están desarrollando tecnologías antisentido que utilizan una serie de productos químicos para afectar la expresión génica en distintos niveles (transcripción, empalme, estabilidad, traducción). Gran parte de esa investigación se ha centrado en el uso de compuestos antisentido para corregir o compensar genes anormales o asociados a enfermedades en una amplio intervalo de indicaciones. Las moléculas antisentido son capaces de inhibir la expresión génica con especificidad y, por ello, muchas investigaciones sobre oligonucleótidos como moduladores de la expresión génica se han centrado en inhibir la expresión de genes diana o la función de elementos de acción cis. Los oligonucleótidos antisentido se dirigen normalmente contra el ARN, ya sea la cadena en sentido (por ejemplo, ARNm) o la cadena negativa en el caso de algunas dianas de ARN viral. Para lograr el efecto deseado de regulación génica específica a la baja, los oligonucleótidos generalmente promueven la desintegración del ARNm diana, bloquean la traducción del ARNm o bloquean la función de los elementos de ARN de acción cis, impidiendo así eficazmente la síntesisde novode la proteína diana o la replicación del ARN viral. Sin embargo, tales técnicas no son útiles cuando el objetivo es aumentar la producción de la proteína nativa o compensar las mutaciones que inducen la terminación prematura de la traducción, atl como las mutaciones sin sentido o de cambio de marco. En estos casos, el transcrito génico defectuoso no debería estar sometido a degradación dirigida o inhibición estérica, por lo que la química del oligonucleótido antisentido no debería promover la degradación del ARNm diana ni bloquear la traducción.

[0009] En diversas enfermedades genéticas, los efectos de las mutaciones sobre la expresión final de un gen pueden modularse mediante un proceso de omisión selectiva de exones durante el proceso de empalme. El proceso de empalme está dirigido por una compleja maquinaria multicomponente que acerca las uniones exón-intrón adyacentes en el pre-ARNm y realiza la escisión de los enlaces fosfodiéster en los extremos de los intrones con su posterior reformación entre los exones que se van a empalmar entre sí. Este proceso complejo y muy preciso está mediado por motivos de secuencia en el pre-ARNm que son segmentos de ARN relativamente cortos y semiconservados a los que se unen diversos factores nucleares de empalme que intervienen en las reacciones de empalme. Cambiando la forma en que la maquinaria de empalme lee o reconoce los motivos implicados en el procesamiento del pre-ARNm, es posible crear moléculas de ARNm empalmadas diferencialmente. En la actualidad se reconoce que la mayoría de los genes humanos se empalman alternativamente durante la expresión génica normal, aunque no se han identificado los mecanismos implicados. Bennett et al. (Patente de Estados Unidos n.º 6.210.892) describen la modulación antisentido del procesamiento de ARNm celular de tipo salvaje utilizando análogos de oligonucleótidos antisentido que no inducen la escisión mediada por ARNasa H del ARN diana. Esto resulta útil para generar ARNm empalmados alternativamente que carecen de exones específicos (por ejemplo, como describen (Sazani, Kole, et al.2007) para la generación de receptores solubles de la superfamilia TNF que carecen de exones que codifiquen dominios que abarcan la membrana.

[0010] En los casos en los que una proteína normalmente funcional se termina prematuramente debido a mutaciones en la misma, se ha demostrado que es posible un medio para restaurar cierta producción de proteína funcional mediante tecnología antisentido a través de la intervención durante los procesos de empalme, y que si los exones asociados con mutaciones causantes de enfermedades pueden eliminarse específicamente de algunos genes, a veces puede producirse un producto proteico acortado que tiene propiedades biológicas similares a las de la proteína nativa o tiene suficiente actividad biológica para mejorar la enfermedad causada por las mutaciones asociadas con el exón (véasepor ejemplo,Sierakowska, Sambade et al. 1996; Wilton, Lloyd et al. 1999; van Deutekom, Bremmer-Bout et al.2001; Lu, Mann et al.2003; Aartsma-Rus, Janson et al.2004). Kole et al. (Patentes de EStados Unidos Nos. 5.627.274; 5.916.808; 5.976.879; y 5.665.593) divulgan métodos para combatir el empalme aberrante utilizando análogos de oligonucleótidos en antisentido modificados que no promueven la desintegración del pre-ARN-m objetivo. Bennett et al. (Patente de Estados Unidos n.º 6.210.892) describen la modulación antisentido del procesamiento de ARNm celular de tipo salvaje también utilizando análogos de oligonucleótidos antisentido que no inducen la escisión mediada por ARNasa H del ARN diana.

[0011] Es probable que el proceso de omisión selectiva de exones sea especialmente útil en genes largos con muchos exones e intrones, en los que hay redundancia en la constitución genética de los exones o en los que una proteína puede funcionar sin uno o más exones concretos. Los esfuerzos por redirigir el procesamiento génico para el tratamiento de enfermedades genéticas asociadas a truncamientos causados por mutaciones en diversos genes se han centrado en el uso de oligonucleótidos antisentido que, o bien: (1) se superponen total o parcialmente con los elementos implicados en el proceso de empalme; o (2) se unen al pre-ARNm en una posición lo suficientemente cercana al elemento como para interrumpir la unión y la función de los factores de empalme que normalmente mediarían una reacción de empalme concreta que se produce en ese elemento.

[0012] La distrofia muscular de Duchenne (DMD) se provoca por un defecto en la expresión de la proteína de distrofina. El gen que codifica para la proteína contiene 79 exones propagados en más de 2 millones de nucleótidos de ADN. Cualquier mutación exónica que cambia el marco de lectura del exón, o introduce un codón de detención, o se caracteriza por la remoción de un exón o exones completos fuera de marco, o duplicaciones de uno o más exones, tiene el potencial de interrumpir la producción de distrofina funcional, dando por resultado la DMD.

[0013] El inicio de la enfermedad puede documentarse en el nacimiento con niveles elevados de creatina cinasa, y pueden presentarse déficits motores significativos en el primer año de vida. A los siete u ocho años, la mayoría de los pacientes con DMD tienen una marcha cada vez más dificultosa y pierden la capacidad de levantarse del suelo y subir escaleras; entre los 10 y los 14 años, la mayoría depende de una silla de ruedas. La DMD es uniformemente mortal; los individuos afectados suelen morir de insuficiencia respiratoria y/o cardíaca al final de la adolescencia o a comienzos de la tercera década de vida. La progresión continua de la DMD permite la intervención terapéutica en todas las fases de la enfermedad; sin embargo, el tratamiento se limita actualmente a los glucocorticoides, que se asocian a numerosos efectos secundarios incluyendo el aumento de peso, cambios de comportamiento, cambios puberales, osteoporosis, facies cushingoide, inhibición del crecimiento y cataratas. Por consiguiente, es imperativo desarrollar mejores terapias para tratar la causa subyacente de esta enfermedad.

[0014] Una forma menos severa de distrofia muscular, distrofia muscular de Becker (DMB) se ha encontrado que surge donde una mutación, típicamente una deleción de uno o más exones, resulta en un marco de lectura correcto a lo largo de la transcripción entera de la distrofina, tal que la traducción del ARNm en proteína no es prematuramente terminada. Si la unión de los exones aguas arriba y aguas abajo en el procesamiento de un per-ARNm de distrofina mutado mantiene el marco de lectura correcto del gen, el resultado es un ARNm que codifica para una proteína con una deleción interna corta que retiene alguna actividad, resultando en un fenotipo Becker.

[0015] Durante muchos años se ha sabido que las deleciones de un exón o exones que no alteran el marco de lectura de una proteína distrofina darían lugar a un fenotipo BMD, mientras que una deleción de exón que causa un cambio de marco dará lugar a DMD (Monaco, Bertelson et al.1988). En general, las mutaciones de la distrofina incluyendo mutaciones puntuales y deleciones de exón que cambian el marco de lectura y por lo tanto interrumpen la traducción apropiada de la proteína resultan en DMD. También debe tenerse en cuenta que algunos pacientes con BMD y DMD tienen deleciones de exón que abarcan múltiples exones.

[0016] La modulación del empalme del pre-ARNm de la distrofina mutante con oligorribonucleótidos en antisentido ha sido reportada tantoin vitrocomoin vivo(véasepor ejemplo,Matsuo, Masumura et al.1991; Takeshima, Nishio et al. 1995; Pramono, Takeshima et al. 1996; Dunckley, Eperon et al. 1997; Dunckley, Manoharan et al. 1998; Errington, Mann et al.2003).

[0017] El primer ejemplo de omisión de exón específica y reproducible en el modelo de ratónmdxfue comunicado por Wiltonet al.(Wilton, Lloyd et al. 1999). Dirigiendo una molécula en antisentido al sitio de empalme donante, la omisión del exón 23 consistente y eficiente fue inducida en el ARNm de la distrofina dentro de las 6 horas de tratamiento de las células cultivadas. Wiltonet al.también describen dirigir la región aceptora del pre-ARNm de la distrofina de ratón con oligonucleótidos en antisentido más largos. Mientras que el primer oligonucleótido en antisentido dirigido al sitio donador de empalme del intrón 23 indujo un salto de exón consistente en mioblastos primarios cultivados, se observó que este compuesto era mucho menos eficiente en cultivos de células inmortalizados que expresan niveles más altos de distrofina. Sin embargo, con un diseño refinado de oligonucleótidos antisentido, la eficiencia de la eliminación específica de exones se incrementó en casi un orden de magnitud (Mann, Honeyman et al.2002).

[0018] Estudios recientes han comenzado a abordar el reto de lograr la expresión sostenida de distrofina acompañada de efectos adversos mínimos en tejidos afectados por la ausencia de distrofina. La inyección intramuscular de un oligonucleótido antisentido dirigido al exón 51 (PRO051) en el músculo tibialis anterior en cuatro pacientes con DMD resultó en la omisión específica del exón 51 sin efectos adversos clínicamente aparentes (Mann, Honeyman et al. 2002; van Deutekom, Janson et al. 2007). Los estudios que miran la entrega sistémica de un oligómero morfolino fosforodiamidato en antisentido conjugado a un péptido penetrante celular (PPMO) dirigido al exón 23 en ratonesmdxprodujeron una producción alta y sostenida de proteína distrofina en los músculos esqueléticos y cardíacos sin toxicidad detectable (Jearawiriyapaisarn, Moulton et al.2008; Wu, Moulton et al.2008; Yin, Moulton et al.2008).

[0019] Los ensayos clínicos recientes que prueban la seguridad y eficacia de los oligonucleótidos de cambio de empalme (SSO) para el tratamiento de la DMD son con base en la tecnología de SSO para inducir el empalme alternativo de pre-ARNm por el bloqueo estérico del espliceosoma (Ciraket al.,2011; Goemanset al.,2011; Kinaliet al.,2009; van Deutekomet al.,2007). Sin embargo, a pesar de estos éxitos, las opciones farmacológicas disponibles para tratar la DMD son limitadas. En particular, un oligonucleótido antisentido (drisapersen), que utiliza un esqueleto de fosforotioato cargado negativamente, se ha asociado en ensayos clínicos con proteinuria, aumento de la α1-microglobulina urinaria, trombocitopenia y reacciones en el lugar de la inyección, tal como eritema e inflamación. Eteplirsen, que esta siendo desarrollado por el cesionario de esta solicitud, ha sido objeto de estudios clínicos para probar su seguridad y eficacia, y el desarrollo clínico está en curso. El eteplirsen es un oligonucleótido estructuralmente distinto del drisapersen. En concreto, el esqueleto químico del eteplirsen es el morfolino fosforodiamidato (PMO), mientras que el esqueleto químico del drisapersen es el fosforotioato de 2'O-metilo (2'-OMe). Recientemente se han descrito estas diferencias estructurales y su posible impacto en los resultados clínicos. VéaseMolecular Therapy Nucleic Acids(2014)3, e152; doi:10.1038/mtna.2014.6 (Publicado en línea el 11 de marzo de 2014).

[0020] La secuencia del eteplirsen se ha descrito previamente. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.º 7.807.816, cuya licencia es exclusiva de los Solicitantes. Sin embargo, la patente de Estados Unidos nº 7.807.816 no discute explícitamente los esquemas de dosificación óptimos ni las vías de administración del eteplirsen. Haddley (2013) Drugs of the Future, vol.38(1), pp.13-17 divulga que el eteplirsen ha sido desarrollado como un nuevo oligómero morfolino de fosforodiamidato en antisentido que induce la omisión del exón 51 de la transcripción del ARNm de la distrofina para restaurar el marco de lectura abierto y producir una proteína que conserva la función parcial. Este documento también describe que el eteplirsen ha mostrado una eficacia prometedora en modelos preclínicosin vivode DMD y ha avanzado hasta la evaluación clínica en pacientes con DMD.

[0021] Kaye (2012) Nucleic Acid Therapeutics, vol.2, pp. A13 describe el eteplirsen como una terapia de investigación diseñada para permitir la producción de distrofina funcional en niños que son susceptibles a la terapia de omisión del exón 51 ( ~13 %). Este resumen proporciona detalles de un estudio de Fase 2b que evalúa eteplirsen en pacientes, el cual mostró un beneficio clínico significativo de 69 metros en la 6MWT a lo largo de 36 semanas en la cohorte de eteplirsen 50mg/kg semanal.

[0022] Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de mejorar las composiciones y los tratamientos para la distrofia muscular, tales como la DMD y la BMD en pacientes.

[0023] SUMARIO DE LA INVENCIÓN

[0024] La presente invención se basa, al menos en parte, en pruebas convincentes del efecto terapéutico de un oligonucleótido en antisentido de omisión de exón, el eteplirsen, que representa un gran avance en el tratamiento de la DMD al abordar la causa subyacente de la enfermedad. El nuevo hallazgo de que el tratamiento con un oligonucleótido en antisentido de omisión del exón 51, eteplirsen, produjo aumentos fiables en la nueva distrofina y estabilizó la capacidad de caminar (por ejemplo, la estabilización de la deambulación), medida por la Prueba de Marcha de 6 Minutos (6MWT), subraya el potencial de alterar el curso de la enfermedad. Cabe destacar que no se observaron efectos adversos relacionados con el fármaco en las 576 infusiones administradas a lo largo de un año. Cuando se aplica a otros exones, el uso de oligonucleótidos en antisentido de omisión de exón podría tratar un estimado de 70 % a 80 % de los pacientes que tienen DMD debido a una deleción en el gen de la distrofina. La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

[0025] Por consiguiente, en un aspecto la presente invención se refiere a eteplirsen para uso en el tratamiento de distrofia muscular de Duchenne en un paciente que lo necesita, el paciente que tiene una deleción o deleciones fuera de marco que pueden ser corregidas omitiendo el exón 51 del gen de la distrofina, en la que el tratamiento comprende administrar al paciente una dosis intravenosa única de eteplirsen de aproximadamente 30 mg/kg una vez a la semana o aproximadamente 50 mg/kg una vez a la semana, retrasando así la progresión de la enfermedad durante 120 semanas como se determina por uno o ambos de los siguientes:

[0026] (i) el paciente mantiene una capacidad estable para caminar durante 120 semanas, medida por un descenso inferior al 5 por ciento, o inferior a 13.9 metros, en la capacidad para caminar, en relación con la línea de base en la Prueba de Marcha de 6 Minutos (6MWT); y

[0027] (ii) que el paciente muestre un aumento de la función muscular respiratoria a lo largo de 120 semanas en relación con la línea de base, medido por un aumento del 14.6 por ciento de la presión inspiratoria máxima (MIP) y del 15 por ciento de la presión espiratoria máxima (MEP).

[0028] En algunas realizaciones, el paciente es un paciente pediátrico.

[0029] Aún en otras realizaciones, se administra al paciente un corticosteroide oral durante al menos 24 semanas antes de la primera dosis de eteplirsen.

[0030] BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0031] LaFIG. 1A(no forma parte de la presente invención) muestra una estructura de oligómero morfolino ejemplar con un enlace fosforodiamidato.

[0032] LaFIG.1B(no forma parte de la presente invención) muestra un conjugado de un péptido rico en arginina y un oligómero antisentido.

[0033] LaFIG.1C(no forma parte de la presente invención) muestra un conjugado como en la FIG.1B, en el que los enlaces del esqueleto contienen uno o más grupos cargados positivamente.

[0034] Las FIGs.1D-G(no forma parte de la presente invención) muestran el segmento de subunidad repetitiva de oligonucleótidos morfolinos ejemplares, designados de D a G.

[0035] LaFIG.2es una representación esquemática del diseño del estudio para el tratamiento de pacientes con DMD. Doce pacientes con DMD fueron asignados aleatoriamente a una de las tres cohortes del estudio doble ciego controlado con placebo 201: Cohorte 1, eteplirsen 30 mg/kg/semana; Cohorte 2, eteplirsen 50 mg/kg/semana; y Cohorte 3, placebo/eteplirsen retardado. En la semana 25, los pacientes de la Cohorte 3 tratados con placebo pasaron a un tratamiento abierto con 30 o 50 mg/kg/semana de eteplirsen. Los pacientes siguieron recibiendo la misma dosis de eteplirsen en el estudio de extensión abierto 202.

[0036] Biopsias musculares.Los pacientes fueron sometidos a biopsias de bíceps en la línea de base y biopsias de deltoides en la semana 48 para el análisis de distrofina. Se obtuvieron biopsias adicionales del bíceps en la semana 12 (de los pacientes de la Cohorte 2 y de dos pacientes de la Cohorte 3) o en la semana 24 (de los pacientes de la Cohorte 1 y de dos pacientes de la Cohorte 3).Evaluaciones de eficacia.La 6MWT se utilizó como medida de resultado funcional y se realizó antes del tratamiento y cada 12 semanas después del tratamiento hasta la semana 48.

[0037] LaFIG. 3muestra fibras musculares positivas para distrofina después de 12, 24, y 48 semanas de eteplirsen. Los panelesAyBmuestran el cambio absoluto medio desde la línea de base en el porcentaje de fibras positivas para distrofina en las semanas 12, 24, y 48 por grupo de tratamiento. En el panel A: *El valor P es para la comparación entre eteplirsen y placebo utilizando los resultados agrupados de las semanas 12 y 24, y con base en un modelo de análisis de covarianza para datos clasificados con el tratamiento como efecto fijo y la línea de base y el tiempo desde el diagnóstico de DMD como covariables. Los cambios medios mostrados se basan en estadísticas descriptivas.<†>El valor P procede de una prueba t pareada que compara el valor de la semana 48 con la línea de base. Se agrupan los resultados de los pacientes tratados con placebo a los que se realizaron biopsias en las semanas 12 y 24. § Los pacientes de placebo/eteplirsen retardado empezaron a recibir eteplirsen en la semana 25 y habían recibido un total de 24 dosis en la semana 48. Abreviaturas: BL=línea de base; NA=no aplicable; ND=no realizado; NS=no significativo; SE=error estándar.

[0038] LaFIG.4muestra los efectos del eteplirsen en el complejo de la glicoproteína asociada a la distrofina.

[0039] (A)Ejemplos representativos de aumentos dependientes del tiempo en fibras positivas para distrofina en relación al tratamiento para todos los pacientes participantes en el estudio.(B)La tinción de nNOS µ en el músculo de DMD (a) y pacientes de control normales (c) (no en el estudio), y del paciente 6 en la línea de base (b) y semana 48 (d), demuestra la restauración de la unión de nNOSµ con eteplirsen. Las tinciones de β- sarcoglicano (e) y γ- sarcoglicano (f) en el paciente 6 en la semana 48 demuestran la restauración del complejo sarcoglicano con eteplirsen.(C)El RT-PCR muestra producto omitido (289 pb) pos-tratamiento en el músculo del paciente 12.

[0040] LaFIG.5representa gráficamente la eficacia funcional de eteplirsen. La línea púrpura oscura muestra el cambio respecto a la línea de base en la distancia caminada en la 6MWT a lo largo del tiempo para los 6 pacientes evaluables que recibieron eteplirsen desde el inicio de 201 (se excluyeron de este análisis dos chicos que no pudieron en la semana 24 o más allá). La línea gris muestra el cambio respecto a la línea de base en la distancia caminada en la 6MWT para los 4 pacientes que recibieron placebo durante las primeras 24 semanas y eteplirsen durante las últimas 24 semanas.

[0041] DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0042] Las realizaciones de la presente invención se refieren a eteplirsen para su uso en el tratamiento de la distrofia muscular, tal como DMD y BMD. La distrofina juega un papel vital en la función muscular, y varias enfermedades relacionadas con el músculo se caracterizan por formas mutadas de este gen. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, el tratamiento mejorado en el presente documento puede ser usado para inducir omisión de exón en formas mutadas del gen de la distrofina humana, tales como los genes de distrofina mutados encontrados en DMD y BMD.

[0043] Debido a eventos aberrantes de empalme del ARNm causados por mutaciones, estos genes de distrofina humana mutados expresan proteína distrofina defectuosa o no expresan distrofina medible en absoluto, una condición que lleva a varias formas de distrofia muscular. Para remediar esta condición, el eteplirsen para uso en la presente invención se hibrida a regiones seleccionadas de un ARN preprocesado de un gen de la distrofina humana mutado, induce omisión de exón y empalme diferencial en ese ARNm de distrofina de otra manera empalmado aberrantemente, y por lo tanto permite a las células musculares producir un transcrito de ARNm que codifica una proteína distrofina funcional. En determinadas realizaciones, la proteína distrofina resultante no es necesariamente la forma "tipo salvaje" de la distrofina, sino más bien una forma truncada, pero funcional o semi-funcional, de la distrofina.

[0044] Aumentando los niveles de proteína distrofina funcional en células musculares, estas y las realizaciones relacionadas son útiles en la profilaxis y tratamiento de distrofia muscular, especialmente aquellas formas de distrofia muscular, tal como DMD y BMD, que son caracterizadas por la expresión de proteínas distrofina defectuosas debido al empalme aberrante de ARNm. Los usos descritos en el presente documento proporcionan además opciones de tratamiento mejoradas para pacientes con distrofia muscular y ofrecen ventajas significativas y prácticas sobre tratamientos alternativos de formas relevantes de distrofia muscular.

[0045] Por lo tanto, la invención se refiere a eteplirsen para su uso en el tratamiento de la distrofia muscular, tal como DMD y BMD, mediante la inducción de omisión de exón en un paciente, como se define en el presente documento. La presente invención se refiere al uso de eteplirsen como terapia modificadora de la enfermedad para tratar la DMD. Sin entrar en teorías, la eficacia clínica observada hasta la fecha con el eteplirsen puede derivarse de su perfil de seguridad debido a su composición química única, que se caracteriza por nucleótidos unidos a anillos de morfolina enlazados a través de fracciones de fosforodiamidato de carga neutra.

[0046] En pacientes con DMD tratados con eteplirsen durante un año, el porcentaje medio de fibras positivas para distrofina fue aumentado a 47 % de lo normal, en relación a la línea de base. La magnitud del aumento dependía de la duración del tratamiento. Aumentos significativos en los niveles de distrofina fueron observados en las biopsias de 24 semanas tomadas de pacientes en la Cohorte 1 (30 mg/kg) y en las biopsias de 48 semanas de pacientes en la Cohorte 3 (que empezaron eteplirsen en la semana 25).

[0047] El beneficio clínico del Eteplirsen reflejó su capacidad de inducir la omisión de exón y restaurar la producción funcional de distrofina. El efecto clínico se evaluó con la 6MWT, una medida de resistencia y capacidad muscular que va más allá de la evaluación de la fuerza en grupos musculares individuales. Los pacientes que recibieron 30 o 50 mg/kg de eteplirsen desde el principio mantuvieron una distancia de caminata estable durante 48 semanas, consistente con los aumentos inducidos por el eteplirsen en la nueva expresión de distrofina entre las semanas 12 y 24. Por el contrario, los pacientes de la cohorte placebo/eteplirsen retardado perdieron 70 metros en la semana 36, pero parecieron estabilizarse en la semana 48 (24 semanas después de iniciar el eteplirsen). Este es el mismo plazo en el que se observó un impacto clínico en los pacientes que recibieron 30 o 50 mg/kg de eteplirsen una vez a la semana desde el inicio del estudio. Ambas cohortes han mantenido estables los resultados de la 6MWT durante 120 semanas, como se describe a continuación.

[0048] A las 120 semanas, los pacientes de las cohortes de 30 mg/kg y 50 mg/kg de eteplirsen que fueron capaces de realizar la 6MWT (población modificada por intención de tratar o mITT; n=6) experimentaron una estabilidad general con un ligero descenso de 13.9 metros, o menos del 5 por ciento, con respecto a la línea de base en la capacidad de caminar. Se observó un beneficio del tratamiento estadísticamente significativo de 64.9 metros (p ≤0.006) para la población mITT en comparación con la cohorte placebo/tratamiento retrasado (n=4), que inició el tratamiento en la Semana 25 tras 24 semanas de placebo. Después de experimentar un declive sustancial temprano en el estudio (antes del tratamiento con eteplirsen), la cohorte placebo/tratamiento retardado también demostró estabilización en la capacidad de caminar por más de 1.5 años, desde la Semana 36 hasta la 120, el periodo desde el cual niveles significativos de distrofina fueron probablemente producidos, con un declive de 9.5 metros durante este marco de tiempo. Estos análisis se basaron en la puntuación máxima de la 6MWT cuando la prueba se realizó en dos días consecutivos.

[0049] La función muscular respiratoria desde la línea de base hasta la semana 120 en ambas cohortes de dosificación, medida por la presión inspiratoria y espiratoria máxima (MIP y MEP), mostró un aumento medio del 14.6 porciento en la MIP y del 15.0 porciento en la MEP. Los análisis del porcentaje previsto de MIP (MIP ajustado al peso) y del porcentaje previsto de MEP (MEP ajustado a la edad) demostraron un aumento medio del 90.2 porciento a en la línea de base al 95.2 % en la semana 120 en el porcentaje previsto de MIP, y un ligero aumento medio del 79.3 porciento en la línea de base al 79.6 porciento en la semana 120 en el porcentaje previsto de MEP. Además, se produjo un aumento medio de la capacidad vital forzada (), una medida del volumen pulmonar, del 8.7 porciento en la línea de base hasta la semana 120, y el porcentaje previsto de FVC (FVC ajustada por edad y estatura) se mantuvo por encima de una media del 90 porciento hasta la semana 120, con un 101 porciento en la línea de base y un 93 porciento en la Semana 120.

[0050] La presente invención se basa, al menos en parte, en la evidencia del efecto terapéutico del eteplirsen, que representa un gran avance en el tratamiento de la DMD al abordar la causa subyacente de la enfermedad. En consecuencia, la invención se refiere a eteplirsen para uso en el tratamiento de DMD o BMD en pacientes, que es complementario a una región diana en un exón del gen de la distrofina humana para hibridar específicamente a la región diana, inducir omisión de exón, y tratar la enfermedad. El tratamiento incluye la inducción de omisión de exón en un sujeto mediante la administración de una cantidad eficaz de eteplirsen, en el que el exón es el exón 51 del gen de la distrofina humana.

[0051] Salvo que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por las personas con conocimientos ordinarios en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque en la práctica o ensayo de la presente invención pueden utilizarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, se describen los métodos y materiales preferentes. A efectos de la presente invención, a continuación se definen los siguientes términos.

[0052] I. Definiciones

[0053] Por "aproximadamente" se entiende una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud que varía hasta un 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 % con respecto a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia.

[0054] Los términos "complementario" y "complementariedad" se refieren a polinucleótidos (es decir, una secuencia de nucleótidos) relacionados por reglas de emparejamiento de bases. Por ejemplo, la secuencia "T-G-A (5'-3')" es complementaria de la secuencia "T-C-A (5'-3')". La complementariedad puede ser "parcial", en la que sólo algunas de las bases de los ácidos nucleicos coinciden de acuerdo con las reglas de emparejamiento de bases. O puede haber una complementariedad "completa" o "total" entre los ácidos nucleicos. El grado de complementariedad entre las cadenas de ácidos nucleicos tiene efectos significativos sobre la eficiencia y la fuerza de la hibridación entre cadenas de ácidos nucleicos. Si bien a menudo se desea una complementariedad perfecta, algunas realizaciones pueden incluir uno o más, pero preferiblemente 6, 5, 4, 3, 2 o 1 desemparejamientos con respecto al ARN diana.

[0055] Los términos "oligómero antisentido", "compuesto antisentido" y "oligonucleótido antisentido" se usan indistintamente y se refieren a una secuencia de subunidades cíclicas, cada una de las cuales lleva una fracción de emparejamiento de bases, unidas por enlaces entre intersubunidades que permiten que las fracciones de emparejamiento de bases se hibriden con un secuencia diana en un ácido nucleico (típicamente un ARN) mediante emparejamiento de bases de Watson-Crick, para formar un heterodúplex de ácido nucleico:oligómero dentro de la secuencia diana. Las subunidades cíclicas se basan en ribosa u otro azúcar pentosa o, como en el eteplirsen, en un grupo morfolino (véase la descripción de los oligómeros morfolinos más adelante). El oligómero puede tener una complementariedad de secuencia exacta o casi con la secuencia diana; las variaciones en la secuencia cerca de los extremos de un oligómero son generalmente preferentes a las variaciones en el interior.

[0056] Tal oligómero antisentido puede diseñarse para bloquear o inhibir la traducción de ARNm o para inhibir/alterar el procesamiento natural de empalme de pre-ARNm, y puede decirse que está "dirigido a" o "dirigido contra" una secuencia diana con la que se hibrida. La secuencia diana suele ser una región que incluye un codón de inicio AUG de un ARNm, un oligómero supresor de la traducción, o un sitio de empalme de un ARNm preprocesado, un oligómero supresor de corte y empalme (SSO por sus siglas en inglés). La secuencia diana para un sitio de empalme puede incluir una secuencia de ARNm que tiene su extremo 5' de 1 a aproximadamente 25 pares de bases corritente abajo de una unión aceptora de corte y empalme normal en un ARNm preprocesado. Una secuencia diana preferente es cualquier región de un ARNm preprocesado que incluya un sitio de empalme o esté contenida completamente dentro de una secuencia codificante de exón o abarque un sitio aceptor o donante de empalme. Más generalmente se dice que un oligómero está "dirigido contra" una diana biológicamente relevante, tal como una proteína, virus o bacteria, cuando está dirigido contra el ácido nucleico de la diana de la manera descrita anteriormente.

[0057] Los términos "oligómero morfolino" o "PMO" (morfolino oligómero de fosforamidato o fosforodiamidato) se refieren a un análogo de oligonucleótido compuesto por estructuras de subunidades morfolinas, donde (i) las estructuras están unidas entre sí por enlaces que contienen fósforo, de uno a tres átomos de longitud, preferiblemente de dos átomos de longitud, y preferiblemente no cargados o catiónicos, que unen el nitrógeno morfolino de una subunidad a un carbono exocíclico 5' de una subunidad adyacente, y (ii) cada anillo morfolino lleva una fracción de emparejamiento de bases de purina o pirimidina eficaz para unirse, por enlace de hidrógeno específico de base, a una base de un polinucleótido. Véase, por ejemplo, la estructura de la Figura 1A, que muestra un tipo de enlace fosforodiamidato preferente. Se pueden introducir variaciones en este enlace siempre que no interfieran con la unión o la actividad. Por ejemplo, el oxígeno unido al fósforo puede sustituirse por azufre (tiofosforodiamidato). El oxígeno 5' puede estar sustituido con amino o amino sustituido con alquilo inferior. El nitrógeno colgante unido al fósforo puede estar sin sustituir, monosustituido o disustituido con alquilo inferior (opcionalmente sustituido). La fracción de emparejamiento de bases de purina o pirimidina suele ser adenina, citosina, guanina, uracilo, timina o inosina. La síntesis, las estructuras y las características de unión de los oligómeros morfolinos se detallan en las patentes de Estados Unidos nº 5,698,685, 5,217,866, 5,142,047, 5,034,506, 5,166,315, 5,521,063, 5,506,337, 8,076,476, 8,299,206 y 7,943,762 (enlaces catiónicos). Los enlaces intersubunidad modificados y los grupos terminales se detallan en la solicitud PCT US2011/038459 y en la publicación WO/2011/150408.

[0058] "Eteplirsen", también conocido como "AVN-4658" es un PMO que tiene la secuencia de bases 5'-CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3' (SEQ ID NO:1000). Eteplirsen está registrada bajo el Número de Registro de CAS 1173755-55-9. Los nombres químicos incluyen:

[0059] RNA, [P-deoxi-P-(dimetilamino)](2',3'-dideoxi-2',3'-imino-2',3'-seco)(2'a→5')(C-m5U-C-C-A-A-C-A-m5U-C-A-A-G-G-A-A-G-A-m5U-G-G-C-A-m5U-m5U-m5U-C-m5U-A-G), 5'-[P-[4-[[2-[2-(2-hidroxietoxi)etoxi]etoxi]carbonil]-1-piperazinil]-N,N-dimetilfosfonamidato]

[0060] y

[0061] P,2',3'-trideoxi-P-(dimetilamino)-5'-O-{P-[4-(10-hydroxy-2,5,8-trioxadecanoil)piperazin-1-il]-N,N-dimetilfosfonamidoil}-2',3'-imino-2',3'-secocitidilil-(2'a→5')-P,3'-dideoxi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-secotimidilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoxi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-secocitidilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoxi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-secocitidilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoxi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-secoadenilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoxi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-secoadenilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoxi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-secocitidilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoxi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-secoadenilil-(2'a→5')-P,3'-dideoxi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-secotimidilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoxi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-secocitidilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoxi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-secoadenilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoxi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-secoadenilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoxi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-secoguanilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoxi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-secoguanilil-(2'a→5')-P,2',3-trideoxi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-secoadenilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoxi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-secoadenilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoxi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-secoguanilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoxi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-secoadenilil-(2'a→5')-P,3'-dideoxi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-secotimidilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoxi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-secoguanilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoxi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-secoguanilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoxi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-secocitidilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoxi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-secoadenilil-(2'a→5')-P,3'-dideoxi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-secotimidilil-(2'a→5')-P,3'-dideoxi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-secotimidilil-(2'a→5')-P,3'-dideoxi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-secotimidilil-(2'a→5')-P,2',3'-trideoxi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-secocitidilil-(2'a→5')-P,3'-dideoxi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-secotimidil-(2'a→5')-P,2',3-trideoxi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-secoadenil-(2'a→5')-2',3'-dideoxi-2',3'-imino-2',3'-secoguanosina

[0062] Eteplirsen tiene la siguiente estructura:

[0063]

[0065] Una "subunidad de aminoácido" o "residuo de aminoácido" puede referirse a un residuo de α-aminoácido (-CO-CHR-NH-) o a un residuo de β- u otro aminoácido (por ejemplo, -CO-(CH<2>)<n>CHR-NH-), donde R es una cadena lateral (que puede incluir hidrógeno) y n es de 1 a 6, preferiblemente de 1 a 4.

[0066] El término "aminoácidode origen natural" se refiere a un aminoácido presente en las proteínas que se encuentran en la naturaleza. El término "aminoácidos no naturales" se refiere a aquellos aminoácidos que no están presentes en las proteínas que se encuentran en la naturaleza, como por ejemplo la beta-alanina (β-Ala), el ácido 6-aminohexanoico (Ahx) y el ácido 6-aminopentanoico.

[0067] Un "exón" se refiere a una sección definida de ácido nucleico que codifica para una proteína, o una secuencia de ácido nucleico que está representada en la forma madura de una molécula de ARN después de que se hayan eliminado por empalme porciones de un ARN preprocesado (o precursor). La molécula de ARN madura puede ser un ARN mensajero (ARNm) o una forma funcional de un ARN no codificante, tal como el ARNr o el ARNt. El gen de la distrofina humana tiene aproximadamente 79 exones.

[0068] Un "intrón" se refiere a una región de ácido nucleico (dentro de un gen) que no se traduce en una proteína. Un intrón es una sección no codificante que se transcribe en un ARNm precursor (pre-ARNm), y posteriormente se elimina por empalme durante la formación del ARN maduro.

[0069] Una "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de compuesto terapéutico, tal como un oligonucleótido antisentido, administrado a un sujeto humano, ya sea como una dosis única o como parte de una serie de dosis, lo cual es eficaz para producir un efecto terapéutico deseado. En el caso de un oligonucleótido antisentido, este efecto suele producirse inhibiendo la traducción o el procesamiento natural de empalme de una secuencia diana seleccionada. La "omisión de exón" se refiere en general al proceso por el cual se elimina un exón completo, o una porción del mismo, de un ARN preprocesado dado, y por lo tanto se excluye de estar presente en el ARN maduro, tal como el ARNm maduro que se traduce en una proteína. Por lo tanto, la parte de la proteína que de otro modo estaría codificada por el exón omitido no está presente en la forma expresada de la proteína, creando normalmente una forma alterada, aunque funcional, de la proteína. En ciertas realizaciones, el exón omitido es un exón aberrante del gen de la distrofina humana, que puede contener una mutación u otra alteración en su secuencia que de otra manera causa empalme aberrante. El exón omitido es el exón 51 del gen de la distrofina humana.

[0071] La "distrofina" es una proteína citoplasmática en forma de varilla, y una parte vital del complejo proteico que conecta el citoesqueleto de una fibra muscular a la matriz extracelular circundante a través de la membrana celular. La distrofina contiene múltiples dominios funcionales. Por ejemplo, la distrofina contiene un dominio de unión a actina en aproximadamente los aminoácidos 14-240 y un dominio de varilla central en aproximadamente los aminoácidos 253-3040. Este gran dominio central está formado por 24 elementos triple-helicoidales similares a la espectrina de aproximadamente 109 aminoácidos, que tienen homología con la alfa-actinina y la espectrina. Las repeticiones suelen estar interrumpidas por cuatro segmentos no repetitivos ricos en prolina, también denominados regiones bisagra. Las repeticiones 15 y 16 están separadas por un tramo de 18 aminoácidos que parece proporcionar un sitio importante para la escisión proteolítica de la distrofina. La identidad de secuencia entre la mayoría de las repeticiones se encuentra en el intervalo entre el 10 % y el 25 %. Una repetición contiene tres hélices alfa: 1, 2 y 3. Las hélices alfa 1 y 3 están formadas cada una por 7 vueltas de hélice, que probablemente interactúan como una espiral enrollada a través de una interfaz hidrófoba. La hélice alfa 2 tiene una estructura más compleja y está formada por segmentos de cuatro y tres vueltas de hélice, separados por un residuo de glicina o prolina. Cada repetición está codificada por dos exones, normalmente interrumpidos por un intrón entre los aminoácidos 47 y 48 de la primera parte de la hélice alfa 2. El otro intrón se encuentra en diferentes posiciones de la repetición, normalmente disperso sobre la hélice-3. La distrofina también contiene un dominio rico en cisteína de aproximadamente los aminoácidos 3080-3360), incluyendo un segmento rico en cisteína (es decir, 15 cisteínas en 280 aminoácidos) mostrando homología con el dominio C-terminal de la alfa-actinina del moho del limo (Dictyostelium discoideum). El dominio carboxi-terminal se encuentra de aproximadamente los aminoácidos 3361-3685.

[0073] El término amino de la distrofina se une a la F-actina y el término carboxi se une al complejo proteico asociado a la distrofina (DAPC) en el sarcolema. El DAPC incluye los distroglicanos, los sarcoglicanos, las integrinas y la caveolina, y las mutaciones en cualquiera de estos componentes causan distrofias musculares de herencia autosómica. El DAPC es desestabilizado cuando la distrofina está ausente, lo que resulta en niveles disminuidos de las proteínas miembro, y a su vez lleva al daño progresivo de la fibra y la fuga de membrana. En varias formas de distrofia muscular, tal como la distrofia muscular de Duchenne (DMD) y la distrofia muscular de Becker (BMD), las células musculares producen una forma alterada y funcionalmente defectuosa de distrofina, o ninguna distrofina en absoluto, principalmente debido a mutaciones en la secuencia génica que conducen a un empalme incorrecto. |La expresión predominante de la proteína distrofina defectuosa, o la falta completa de distrofina o una proteína similar a la distrofina, conduce a la rápida progresión de la degeneración muscular, como se señaló anteriormente. A este respecto, una proteína distrofina "defectuosa" puede ser caracterizada por las formas de distrofina que son producidas en ciertos sujetos con DMD o BMD, como es conocido en la técnica, o por la ausencia de distrofina detectable.

[0075] En el presente documento, los términos "función" y "funcional" y similares se refieren a una función biológica, enzimática o terapéutica.

[0077] Una proteína distrofina "funcional" se refiere generalmente a una proteína distrofina que tiene suficiente actividad biológica para reducir la degradación progresiva del tejido muscular que de otra manera es característica de la distrofia muscular, típicamente en comparación con la forma alterada o "defectuosa" de la proteína distrofina que está presente en ciertos sujetos con DMD o BMD. En determinadas realizaciones, una proteína distrofina funcional puede tener aproximadamente 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o 100 % (incluyendo todos los enteros en el medio) de la actividad biológica in vitro o in vivo de la distrofina de tipo salvaje, medida de acuerdo a técnicas de rutina en la técnica. Como un ejemplo, la actividad relacionada con la distrofina en cultivos de músculo in vitro puede ser medida de acuerdo con el tamaño del miotubo, la organización (o desorganización) de la miofibrilla, la actividad contráctil, y la agrupación espontánea de receptores de acetilcolina (véase, por ejemplo, Brown et al., Journal of Cell Science.112:209-216, 1999). Los modelos animales son también recursos valiosos para estudiar la patogénesis de la enfermedad, y proporcionan un medio para probar la actividad relacionada con la distrofina. Dos de los modelos animales más ampliamente usados para la investigación de DMD son el ratón mdx y el perro con distrofia muscular golden retriever (GRMD), ambos de los cuales son distrofina negativos (véase, por ejemplo, Collins & Morgan, Int J Exp Pathol 84: 165-172, 2003). Estos y otros modelos animales pueden ser usados para medir la actividad funcional de varias proteínas de distrofina. Incluidas son formas truncadas de distrofina, tales como aquellas formas que son producidas por el compuesto antisentido de omisión de exón eteplirsen como se usa en la presente invención.

[0078] El término "restauración" de la síntesis o producción de distrofina se refiere generalmente a la producción de una proteína distrofina incluyendo formas truncadas de distrofina en un paciente con distrofia muscular después del tratamiento con un oligonucleótido en antisentido como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el tratamiento resulta en un aumento de la nueva producción de distrofina en un paciente en un 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % (incluyendo todos los números enteros en el medio). En algunas realizaciones, el tratamiento aumenta el número de fibras positivas para distrofina a por lo menos 20 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 50%, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80%, aproximadamente 90 % o aproximadamente 95 % a 100 % de lo normal en el sujeto. En otras realizaciones, el tratamiento aumenta el número de fibras positivas para distrofina a aproximadamente 20 % a aproximadamente 60 %, o aproximadamente 30% a aproximadamente 50 % de lo normal en el sujeto. El porcentaje de fibras positivas para distrofina en un paciente después del tratamiento puede ser determinado por una biopsia muscular usando técnicas conocidas. Por ejemplo, se puede tomar una biopsia muscular de un músculo adecuado, tal como el músculo bíceps braquial en un paciente.

[0080] El análisis del porcentaje de fibras de distrofina positivas puede ser realizado pretratamiento y/o postratamiento o en puntos de tiempo a lo largo del curso del tratamiento. En algunas realizaciones, se toma una biopsia postratamiento del músculo contralateral a la biopsia pretratamiento. Estudios de expresión de distrofina pre- y postratamiento pueden ser realizados usando cualquier ensayo adecuado para distrofina. En una realización, la detección inmunohistoquímica es realizada en secciones de tejido de la biopsia muscular usando un anticuerpo que es un marcador para distrofina, tal como un anticuerpo monoclonal o policlonal. Por ejemplo, el anticuerpo MANDYS106 puede ser usado que es un marcador altamente sensible para la distrofina. Puede utilizarse cualquier anticuerpo secundario adecuado.

[0082] En algunas realizaciones, el porcentaje de fibras positivas para distrofina es calculado dividiendo el número de fibras positivas por el total de fibras contadas. Muestras de músculo normal tienen 100 % de fibras positivas para distrofina. Por lo tanto, el porcentaje de fibras positivas para distrofina puede ser expresado como un porcentaje de lo normal. Para controlar la presencia de niveles traza de distrofina en el músculo pretratamiento así como fibras revertientes, una línea de base puede ser establecida usando secciones de músculos pretratamiento de cada paciente cuando se cuentan fibras positivas para distrofina en músculos postratamiento. Esto puede ser usado como un umbral para contar fibras positivas para distrofina en secciones de músculo postratamiento en ese paciente. En otras realizaciones, secciones de tejido teñidas con anticuerpos también pueden ser usadas para la cuantificación de distrofina usando el software de análisis de imagen Bioquant (Bioquant Image Analysis Corporation, Nashville, TN). La intensidad total de la señal de fluorescencia de la distrofina puede ser reportada como un porcentaje de lo normal. Además, el análisis Western blot con anticuerpos anti-distrofina monoclonales o policlonales puede ser usado para determinar el porcentaje de fibras positivas de distrofina. Por ejemplo, el anticuerpo anti-distrofina NCL-Dys1 de Novacastra puede ser usado. El porcentaje de fibras positivas para distrofina también puede ser analizado determinando la expresión de los componentes del complejo sarcoglicano (β,γ) y/o NOS neuronal.

[0084] En algunas realizaciones, el tratamiento con eteplirsen ralentiza o reduce la disfunción y/o insuficiencia muscular respiratoria progresiva en pacientes con DMD que cabría esperar sin tratamiento. En una realización, el tratamiento con eteplirsen puede reducir o eliminar la necesidad de asistencia respiratoria que cabría esperar sin tratamiento. En una realización, las mediciones de la función respiratoria para el seguimiento del curso de la enfermedad, así como la evaluación de posibles intervenciones terapéuticas incluyen la presión inspiratoria máxima (MIP), la presión espiratoria máxima (MEP) y la capacidad vital forzada (FVC). La MIP y la MEP miden el nivel de presión que una persona puede generar durante la inhalación y la exhalación, respectivamente, y son medidas sensibles de la fuerza muscular respiratoria. La MIP es una medida de la debilidad del músculo del diafragma.

[0086] En una realización, la MEP puede disminuir antes que los cambios en otras pruebas de función pulmonar, incluidas la MIP y la FVC. En otra realización, la MEP puede ser un indicador precoz de disfunción respiratoria. En otra realización, la FVC puede utilizarse para medir el volumen total de aire expulsado durante la espiración forzada después de una inspiración máxima. En los pacientes con DMD, la FVC aumenta concomitantemente con el crecimiento físico hasta los primeros años de la adolescencia. Sin embargo, a medida que el crecimiento se ralentiza o se atrofia por la progresión de la enfermedad, y la debilidad muscular avanza, la capacidad vital entra en una fase descendente y disminuye a una tasa media de entre el 8 y el 8.5 porciento anual después de los 10 o 12 años de edad. En otra realización, el porcentaje previsto de MIP (MIP ajustado al peso), el porcentaje previsto de MEP (MEP ajustado a la edad) y el porcentaje previsto de FVC (FVC ajustada a la edad y a la altura) son análisis de apoyo.

[0088] Por "aislado" se entiende el material que está sustancial o esencialmente libre de los componentes que normalmente lo acompañan en su estado nativo. Por ejemplo, un "polinucleótido aislado", como se utiliza en el presente documento, puede referirse a un polinucleótido que ha sido purificado o separado de las secuencias que lo flanquean en estado natural, por ejemplo, un fragmento de ADN que ha sido separado de las secuencias que normalmente son adyacentes al fragmento.

[0089] Eteplirsen tiene un número mínimo de nucleótidos para ser capaz de hibridarse específicamente al exón 51 del gen de la distrofina humana. Por "potenciar" o "potenciando", o "aumentar" o "aumentando", o "estimular" o "estimulando", se refiere generalmente a la capacidad de uno o varios compuestos o composiciones antisentido para producir o causar una mayor respuesta fisiológica (es decir, efectos descendentes) en una célula o un sujeto, en comparación con la respuesta causada por ningún compuesto antisentido o un compuesto de control. Una respuesta fisiológica medible puede incluir la expresión aumentada de una forma funcional de una proteína distrofina, o la actividad biológica aumentada relacionada con la distrofina en el tejido muscular, entre otras respuestas aparentes del entendimiento en la técnica y la descripción en el presente documento. También puede medirse el aumento de la función muscular, incluyendo los aumentos o mejoras de la función muscular en aproximadamente un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20%, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 %. El porcentaje de fibras musculares que expresan una distrofina funcional también puede ser medido, incluyendo el aumento de la expresión de distrofina en aproximadamente 1 %, 2 %, %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o 100 % de las fibras musculares. Por ejemplo, se ha demostrado que aproximadamente 40 % de mejora de la función muscular puede ocurrir si 25-30 % de las fibras expresan distrofina (véase, por ejemplo, DelloRusso et al, Proc Natl Acad Sci USA 99: 12979-12984, 2002). Una cantidad "aumentada" o "mejorada" suele ser una cantidad "estadísticamente significativa", y puede incluir un aumento que sea 1.1, 1.2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o más veces (por ejemplo, 500, 1000 veces) (incluyendo todos los números enteros y decimales intermedios y superiores a 1), por ejemplo, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, etc.) la cantidad producida por ningún compuesto antisentido (la ausencia de un agente) o un compuesto de control.

[0091] Los términos "reducir" o "inhibir" pueden referirse en general a la capacidad de uno o más compuestos antisentido para "disminuir" una respuesta fisiológica o celular relevante, tal como un síntoma de una enfermedad o afección descrita en el presente documento, medida de acuerdo con técnicas rutinarias en la técnica del diagnóstico. Las respuestas fisiológicas o celulares relevantes (in vivooin vitro) serán evidentes para los expertos en la técnica, y pueden incluir reducciones en los síntomas o patología de la distrofia muscular, o reducciones en la expresión de formas defectuosas de distrofina, tales como las formas alteradas de distrofina que se expresan en individuos con DMD o BMD. Una "disminución" en una respuesta puede ser estadísticamente significativa en comparación con la respuesta producida por ningún compuesto antisentido o una composición de control, y puede incluir una disminución del 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 %, incluidos todos los números enteros intermedios.

[0093] También se incluyen sistemas de entrega de vectores que son capaces de expresar las secuencias oligoméricas, dirigidas a la distrofina, tales como vectores que expresan una secuencia polinucleotídica que comprende una o más de las secuencias mostradas en las Tablas 3 y 4, y variantes de las mismas, como se describe en el presente documento. Por "vector" o "construcción de ácido nucleico" se entiende una molécula polinucleotídica, preferiblemente una molécula de ADN derivada, por ejemplo, de un plásmido, bacteriófago, levadura o virus, en la que puede insertarse o clonarse un polinucleótido. Un vector contiene preferiblemente uno o más sitios de restricción únicos y puede ser capaz de replicarse de forma autónoma en una célula huésped definida, incluyendo una célula o tejido diana o una célula o tejido progenitor de la misma, o integrarse en el genoma del huésped definido de forma que la secuencia clonada sea reproducible. Por consiguiente, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido lineal o circular cerrado, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula huésped, se integra en el genoma y se replica junto con el cromosoma o cromosomas en los que se ha integrado.

[0094] El "Tratamiento" de un individuo (por ejemplo, un mamífero, tal como un ser humano) o una célula es cualquier tipo de intervención utilizada en un intento de alterar el curso natural del individuo o célula. El tratamiento incluye, pero no se limita a, la administración de una composición farmacéutica y puede realizarse de forma profiláctica o posterior al inicio de un evento patológico o al contacto con un agente etiológico. El tratamiento incluye cualquier efecto deseable sobre los síntomas o patología de una enfermedad o afección asociada con la proteína distrofina, como en determinadas formas de distrofia muscular y puede incluir, por ejemplo, cambios mínimos o mejoras en uno o más marcadores medibles de la enfermedad o afección que se está tratando. También se incluyen tratamientos "profilácticos", que pueden estar dirigidos a reducir la tasa de progresión de la enfermedad o afección que se está tratando, retrasar la aparición de esa enfermedad o afección o reducir la gravedad de su aparición. El "Tratamiento" o "profilaxis" no indican necesariamente la erradicación completa, la curación o la prevención de la enfermedad o afección, o de sus síntomas asociados.

[0096] En una realización, el tratamiento con eteplirsen aumenta la nueva producción de distrofina y retarda o reduce la pérdida de ambulación que se esperaría sin tratamiento. Por ejemplo, el tratamiento puede estabilizar, mantener, mejorar o aumentar la capacidad de caminar (por ejemplo, estabilización de la deambulación) en el sujeto. En algunas realizaciones, el tratamiento mantiene o aumenta una distancia de marcha estable en un paciente, medida mediante, por ejemplo, la Prueba de Marcha de 6 Minutos (6MWT), descrita por McDonald, et al. (Muscle Nerve, 2010; 42:966-74). Un cambio en la la Prueba de Marcha de 6 Minutos (6MWD) puede expresarse como un valor absoluto, un cambio porcentual o un cambio en el valor porcentual predicho. En algunas realizaciones, el tratamiento mantiene o mejora una distancia de marcha estable en una 6MWT a partir de un déficit del 20 % en el sujeto en relación con un par sano. El rendimiento de un paciente con DMD en el 6MWT relativo al rendimiento típico de un compañero sano puede ser determinado calculando un valor % predicho. Por ejemplo, el el % predicho de 6MWD puede calcularse utilizando la siguiente ecuación para varones: 196.72 (39.81 x edad) - (1.36 x edad<2>) (132.28 x altura en metros). Para las mujeres, el el % predicho de 6MWD puede calcularse utilizando la siguiente ecuación: 188.61 (51.50 x edad) - (1.86 x edad<2>) (86.10 x altura en metros) (Henricson et al. PLoS Curr., 2012, version 2). En algunas realizaciones, el tratamiento con un oligonucleótido en antisentido aumenta la distancia de marcha estable en el paciente desde la línea de base a más de 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 o 50 metros (incluidos todos los números enteros intermedios).

[0097] La pérdida de función muscular en pacientes con DMD puede ocurrir en el contexto de un crecimiento y desarrollo infantil normal. De hecho, los niños más jóvenes con DMD pueden mostrar un aumento en la distancia caminada durante 6MWT en el transcurso de aproximadamente 1 año a pesar del deterioro muscular progresivo. En algunas realizaciones, la 6MWD de pacientes con DMD se compara con sujetos control de desarrollo típico y con datos normativos existentes de sujetos emparejados por edad y sexo. En algunas realizaciones, el crecimiento y el desarrollo normales pueden contabilizarse utilizando una ecuación con base en la edad y la estatura ajustada a datos normativos. Tal ecuación puede ser usada para convertir 6MWD a un valor porcentual predicho (% predicho) en sujetos con DMD. En determinadas realizaciones, el análisis de los datos de % predicho 6MWD representa un método para tener en cuenta el crecimiento y desarrollo normal, y puede mostrar que las ganancias en la función a edades tempranas (por ejemplo, menor o igual a la edad de 7 años) representan habilidades estables en lugar de mejorar en pacientes con DMD (Henricson et al. PLoS Curr., 2012, version 2).

[0098] Un "sujeto", como se utiliza en el presente documento, incluye cualquier animal que presente un síntoma, o esté en riesgo de presentar un síntoma, que pueda tratarse con un compuesto antisentido, tal como un sujeto que tenga o esté en riesgo de tener DMD o BMD, o cualquiera de los síntomas asociados con estas afecciones (por ejemplo, pérdida de fibras musculares). Los sujetos (pacientes) adecuados incluyen animales de laboratorio (tales como ratones, ratas, conejos o cobayas), animales de granja y animales domésticos o mascotas (tales como un gato o un perro). Se incluyen primates no humanos y, preferiblemente, pacientes humanos.

[0099] Un "paciente pediátrico", como se utiliza en el presente documento, es un paciente de 1 a 21 años, ambos inclusive. Se propuso y publicó un sistema de nomenclatura de moléculas antisentido para distinguir entre las diferentes moléculas antisentido (véase Mann et al., (2002) J Gen Med 4, 644-654). Esta nomenclatura se hizo especialmente relevante al probar varias moléculas antisentido ligeramente diferentes, todas dirigidas a la misma región diana, como se muestra a continuación:

[0100] H#A/D(x:y).

[0101] La primera letra designa la especie (por ejemplo, H: humana, M: murina, C: canina). "#" designa el número de exón de la distrofina objetivo. "A/D" indica sitio de empalme aceptor o donante al principio y al final del exón, respectivamente. (x y) representa las coordenadas de recocido donde "-" o "+" indican secuencias intrónicas o exónicas respectivamente. Por ejemplo, A(-6+18) indicaría las 6 últimas bases del intrón que preceden al exón diana y las 18 primeras bases del exón diana. El sitio de empalme más cercano sería el aceptor, por lo que estas coordenadas irían precedidas de una "A". La descripción de las coordenadas de recocido en el sitio de empalme donante podría ser D(+2-18) donde las 2 últimas bases exónicas y las 18 primeras bases intrónicas corresponden al sitio de recocido de la molécula antisentido. Coordenadas de recocido totalmente exónicas que estarían representadas por A(+65+85), es decir, el sitio entre el nucleótido 65 y el 85 desde el inicio de ese exón.

[0102] IV. Formulaciones y tratamiento

[0103] En el presente documento se describen formulaciones o composiciones adecuadas para la administración terapéutica de eteplirsen. Por lo tanto, en el presente documento se describen composiciones farmacéuticamente aceptables que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de eteplirsen, formulada junto con uno o más portadores (aditivos) y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Aunque es posible administrar eteplirsen solo, es preferible administrar el compuesto como una formulación farmacéutica (composición).

[0104] Las composiciones pueden administrarse solas o en combinación con otra terapéutica. El tratamiento adicional puede administrarse antes, simultáneamente o después de la administración de la composición. Por ejemplo, las composiciones pueden administrarse en combinación con un esteroide y/o un antibiótico. El esteroide puede ser un glucocorticoide o prednisona. Los glucocorticoides, tales como el cortisol, controlan el metabolismo de los hidratos de carbono, las grasas y las proteínas, y son antiinflamatorios al impedir la liberación de fosfolípidos, disminuir la acción de los eosinófilos y otros mecanismos. Los mineralocorticoides, tales como la aldosterona, controlan los niveles de electrolitos y agua, principalmente favoreciendo la retención de sodio en el riñón. Los corticosteroides son una clase de sustancias químicas que incluyen hormonas esteroideas producidas de forma natural en la corteza suprarrenal de los vertebrados y análogos de estas hormonas que se sintetizan en laboratorios. Los corticosteroides intervienen en una amplia gama de procesos fisiológicos, incluyendo la respuesta al estrés, la respuesta inmunitaria y la regulación de la inflamación, el metabolismo de los hidratos de carbono, el catabolismo de las proteínas, los niveles de electrolitos en sangre y el comportamiento. Los corticosteroides incluyen Betametasona, Budesonida, Cortisona, Dexametasona, Hidrocortisona, Metilprednisolona, Prednisolona y Prednisona.

[0105] Otros agentes que pueden administrarse incluyen un antagonista del receptor de rianodina, tal como el dantroleno, que ha demostrado potenciar la omisión de exón mediada por antisentido en células de pacientes y en un modelo de ratón de DMD (G. Kendall et al. Sci Tranl Med 4164ra160 (2012)).

[0106] Los métodos de administración de moléculas de ácido nucleico se describen, por ejemplo, en Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio., 2:139; y Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar; Sullivan et al. Akhtar; Sullivan et al., PCT WO 94/02595. Estos y otros protocolos pueden utilizarse para la administración de prácticamente cualquier molécula de ácido nucleico, incluyendo el eteplirsen para su uso en la presente invención. Como se detalla a continuación, las composiciones farmacéuticas pueden estar especialmente formuladas para su administración mediante inyección intravenosa.

[0107] La frase "farmacéuticamente aceptable" se emplea en el presente documento para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que son, dentro del ámbito del buen juicio médico, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, proporcional a una relación beneficio/riesgo razonable.

[0108] La frase "portador farmacéuticamente aceptable", tal como se utiliza en el presente documento, significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un relleno líquido o sólido, diluyente, excipiente, auxiliar de fabricación (por ejemplo, lubricante, magnesio talco, calcio o estearato de zinc, o ácido estérico), o material de encapsulación de disolvente, que interviene en el transporte del compuesto en cuestión de un órgano, o porción del cuerpo, a otro órgano, o porción del cuerpo. Cada portador debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes de la formulación y no perjudicial para el paciente.

[0109] Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, sin limitación: (1) azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de maíz y fécula de papa; (3) celulosa, y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; (9) aceites, tales como aceite de maní, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; (10) glicoles, tales como propilenglicol; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; (12) ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes tamponadores, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua libre de pirógenos; (17) solución salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) soluciones de pH tamponado; (21) poliésteres, policarbonatos y/o polianhídridos; y (22) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas.

[0110] Otros ejemplos no limitantes de agentes adecuados para la formulación con eteplirsen para su uso en la presente invención incluyen: Ácidos nucleicos conjugados con PEG, ácidos nucleicos conjugados con fosfolípidos, ácidos nucleicos con fracciones lipofílicos, fosforotioatos, inhibidores de la glicoproteína P (tales como Pluronic P85), que pueden mejorar la entrada de fármacos en diversos tejidos; polímeros biodegradables, tales como microesferas de poli (DL-lactida-coglicolida) para liberación sostenida después de la implantación (Emerich, D F et al., 1999, Cell Transplant, 8, 47-58) Alkermes, Inc. Cambridge, Massachusetts; y nanopartículas cargadas, talese como las de polibutilcianoacrilato, que pueden liberar fármacos a través de la barrera hematoencefálica y alterar los mecanismos de captación neuronal (Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 23, 941-949, 1999).

[0111] También se describe en el presente documento el uso de la composición que comprende liposomas modificados en superficie que contienen lípidos de poli (etilenglicol) (modificados con PEG, ramificados y no ramificados o combinaciones de los mismos, o liposomas de larga circulación o liposomas sigilosos). Eteplirsen también puede comprender moléculas de PEG unidas covalentemente de diversos pesos moleculares. Estas formulaciones ofrecen un método para aumentar la acumulación de fármacos en los tejidos diana. Esta clase de portadores de fármacos resiste la opsonización y la eliminación por el sistema fagocítico mononuclear (MPS o RES), lo que permite tiempos de circulación sanguínea más prolongados y una mayor exposición tisular del fármaco encapsulado (Lasic et al. Chem. Rev. 1995, 95, 2601-2627; Ishiwata et al., Chem. Pharm. Bull. 1995, 43, 1005-1011). Se ha demostrado que tales liposomas se acumulan selectivamente en los tumores, presumiblemente por extravasación y captura en los tejidos diana neovascularizados (Lasic et al., Science 1995, 267, 1275-1276; Oku et al., 1995, Biochim. Biophys. Acta, 1238, 86-90). Los liposomas de larga circulación mejoran la farmacocinética y la farmacodinámica del ADN y el ARN, especialmente en comparación con los liposomas catiónicos convencionales, que se sabe que se acumulan en los tejidos del MPS (Liu et al., J. Biol. Chem.1995, 42, 2486424870; Choi et al., Publicación PCT internacional nº WO 96/10391; Ansell et al., Publicación PCT internacional nº WO 96/10390; Holland et al., Publicación PCT internacional nº WO 96/10392). También es probable que los liposomas de circulación prolongada protejan a los fármacos de la degradación por nucleasas en mayor medida que los liposomas catiónicos, con base en su capacidad para evitar la acumulación en tejidos metabólicamente agresivos para las MPS, tales como el hígado y el bazo.

[0112] También se describen en el presente documento composiciones de eteplirsen preparadas para su administración tal como se describe en la Patente de Estados Unidos Nos. 6,692,911, 7,163,695 y 7,070,807. A este respecto, en el presente documento se describe el eteplirsen para su uso en la presente invención en una composición que comprende copolímeros de lisina e histidina (HK) (como se describe en la Patente de Estados Unidos Nos.

[0113] 7,163,695, 7,070,807, y 6,692,911) ya sea solo o en combinación con PEG (por ejemplo, PEG ramificado o no ramificado o una mezcla de ambos), en combinación con PEG y una fracción diana o cualquiera de los anteriores en combinación con un agente reticulante. También se describe en el presente documento el eteplirsen para su uso en la presente invención en composiciones que comprenden polihistidina modificada con ácido glucónico o polihistidina gluconilada/transferrina-polisina. Un experto en la técnica también reconocerá que los aminoácidos con propiedades similares a His y Lys pueden sustituirse dentro de la composición.

[0114] Eteplirsen contiene un grupo funcional básico, tales como amino o alquilamino, y es, por tanto, capaz de formar sales farmacéuticamente aceptables con ácidos farmacéuticamente aceptables. El término "sales farmacéuticamente aceptables" a este respecto, se refiere a las sales de adición ácida relativamente no tóxicas, inorgánicas y orgánicas, de compuestos de la presente invención. Estas sales pueden prepararse in situ en el vehículo de administración o en el proceso de fabricación de la forma de dosificación, o haciendo reaccionar por separado un compuesto purificado de la invención en su forma de base libre con un ácido orgánico o inorgánico adecuado, y aislando la sal así formada durante la purificación posterior. Las sales representativas incluyen el hidrobromuro, hidrocloruro, sulfato, bisulfato, fosfato, nitrato, acetato, valerato, oleato, palmitato, estearato, laurato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato, naftilato, mesilato, glucoheptonato, lactobionato y sales de laurilsulfonato y similares. (Véase, por ejemplo, Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci.66:1-19).

[0115] Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales convencionales no tóxicas o las sales de amonio cuaternario de los compuestos, por ejemplo, de ácidos orgánicos o inorgánicos no tóxicos. Por ejemplo, tales sales convencionales no tóxicas incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos tales como el clorhídrico, el bromhídrico, el sulfúrico, el sulfámico, el fosfórico, el nítrico y similares; y las sales preparadas a partir de ácidos orgánicos,tales como el acético, propiónico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, palmítico, maleico, hidroximaleico, fenilacético, glutámico, benzoico, salicílico, sulfanílico, 2-acetoxibenzoico, fumárico, toluenosulfónico, metanosulfónico, etano disulfónico, oxálico, isotiónico y similares.

[0116] En determinadas realizaciones, el eteplirsen puede contener uno o más grupos funcionales ácidos y, por lo tanto, es capaz de formar sales farmacéuticamente aceptables con bases farmacéuticamente aceptables. El término "sales farmacéuticamente aceptables" en estos casos se refiere a las sales de adición de bases orgánicas e inorgánicas relativamente no tóxicas de los compuestos de la presente invención. Estas sales también pueden prepararse in situ en el vehículo de administración o en el proceso de fabricación de la forma de dosificación, o haciendo reaccionar por separado el compuesto purificado en su forma ácida libre con una base adecuada, tal como el hidróxido, carbonato o bicarbonato de un catión metálico farmacéuticamente aceptable, con amoníaco, o con una amina orgánica primaria, secundaria o terciaria farmacéuticamente aceptable. Las sales alcalinas o alcalinotérreas representativas incluyen las sales de litio, sodio, potasio, calcio, magnesio, aluminio y similares. Las aminas orgánicas representativas útiles para la formación de sales de adición de bases incluyen etilamina, dietilamina, etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina y similares. (Véase, por ejemplo, Berge et al.,supra).

[0117] También pueden estar presentes en las composiciones agentes humectantes, emulsionantes y lubricantes, tales como lauril sulfato sódico y estearato de magnesio, así como colorantes, agentes desmoldeantes, agentes de recubrimiento, edulcorantes, aromatizantes y perfumantes, conservantes y antioxidantes.

[0118] Los ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato sódico, metabisulfito sódico, sulfito sódico y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, butilhidroxianisol (BHA), butilhidroxitolueno (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y (3) agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares.

[0119] Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse por cualquier método bien conocido en la técnica de la farmacia. La cantidad de principio activo que puede combinarse con un material de soporte para producir una única forma de dosificación variará en función del huésped que se esté tratando y del modo de administración concreto. La cantidad de principio activo que puede combinarse con un material de soporte para producir una única forma de dosificación será generalmente aquella cantidad del compuesto que produzca un efecto terapéutico. Generalmente, del cien por cien, esta cantidad se encuentra en el intervalo entre aproximadamente el 0.1 por ciento y aproximadamente el noventa y nueve por ciento de principio activo, preferiblemente entre aproximadamente el 5 por ciento y aproximadamente el 70 por ciento, más preferiblemente entre aproximadamente el 10 por ciento y aproximadamente el 30 por ciento.

[0120] En determinadas realizaciones, una formulación comprende un excipiente seleccionado de ciclodextrinas, celulosas, liposomas, agentes formadores de micelas, por ejemplo, ácidos biliares, y portadores poliméricos, por ejemplo, poliésteres y polianhídridos; y eteplirsen para su uso en la presente invención. En determinadas realizaciones, una formulación antes mencionada proporciona eteplirsen biodisponible por vía oral para su uso en la presente invención.

[0121] Los métodos de preparación de estas formulaciones o composiciones incluyen el paso de poner en asociación el eteplirsen con el portador y, opcionalmente, uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan asociando uniforme e íntimamente un compuesto de la presente invención con portadores líquidos, o portadores sólidos finamente divididos, o ambos, y luego, si es necesario, dando forma al producto.

[0122] Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspensión como, por ejemplo, alcoholes isostearílicos etoxilados, sorbitol polioxietilenado y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, y mezclas de los mismos.

[0123] Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración parenteral pueden comprender eteplirsen para uso en la invención en combinación con una o más soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas isotónicas estériles farmacéuticamente aceptables, o polvos estériles que pueden reconstituirse en soluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes de su uso, que pueden contener azúcares, alcoholes, antioxidantes, tampones, bacteriostáticos, solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto o agentes de suspensión o espesantes. Ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de las dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos.

[0124] Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la acción de los microorganismos sobre el eteplirsen puede garantizarse mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol sórbico y similares. También puede ser conveniente incluir en las composiciones agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro sódico y similares. Además, La absorción prolongada de una forma farmacéutica inyectable puede conseguirse mediante el uso de agentes que retrasen la absorción, tales como el monoestearato de aluminio y gelatina.

[0125] En algunos casos, para prolongar el efecto de un fármaco, es conveniente ralentizar su absorción a partir de una inyección subcutánea o intramuscular. Esto puede lograrse mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo que tiene poca solubilidad en agua, entre otros métodos conocidos en la técnica. La tasa de absorción del fármaco depende entonces de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y de la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de una forma farmacéutica administrada parenteralmente se consigue disolviendo o suspendiendo el fármaco en un vehículo oleoso.

[0126] Las formas de depósito inyectables pueden fabricarse formando matrices de microencápsulas de eteplirsen en polímeros biodegradables, tales como polilactida-poliglicolida. Dependiendo de la relación entre eteplirsen y polímero, y de la naturaleza del polímero concreto empleado, puede controlarse la tasa de liberación del oligómero. Algunos ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen los poli(ortoésteres) y los poli(anhídridos). Las formulaciones inyectables de depósito también pueden prepararse atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones que sean compatibles con los tejidos corporales.

[0127] Cuando el eteplirsen para uso en la presente invención se administra como fármaco, a seres humanos y animales, puede administrarse per se o como una composición farmacéutica que contenga, por ejemplo, del 0.1 al 99 % (más preferiblemente, del 10 al 30 %) de principio activo en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. Las frases "administración parenteral" y "administrado por vía parenteral", como se utilizan en el presente documento, significan modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, normalmente por inyección. El eteplirsen utilizado en la presente invención se administra en una única dosis intravenosa.

[0128] Las frases "administración sistémica", "administrada sistémicamente", "administración periférica" y "administrada periféricamente", como se utilizan en el presente documento, se refieren a la administración de un compuesto, fármaco u otro material que no sea directamente en el sistema nervioso central, de forma que entre en el sistema del paciente y, por lo tanto, esté sujeto al metabolismo y otros procesos similares, por ejemplo, la administración subcutánea.

[0129] Independientemente de la vía de administración seleccionada, el eteplirsen para su uso en la presente invención, y/o las composiciones farmacéuticas, pueden formularse en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica. Los niveles reales de dosificación de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particulares, sin ser inaceptablemente tóxica para el paciente.

[0130] El nivel de dosificación seleccionado de eteplirsen para su uso en la invención es de aproximadamente 30 mg/kg una vez a la semana o de aproximadamente 50 mg/kg una vez a la semana.

[0131] Las moléculas de ácido nucleico pueden administrarse a las células por una variedad de métodos conocidos por quienes están familiarizados con la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, la encapsulación en liposomas, por iontoforesis, o por incorporación en otros vehículos, tales como hidrogeles, ciclodextrinas, nanocápsulas biodegradables y microesferas bioadhesivas, como se describe en el presente documento y se conoce en la técnica. En determinadas realizaciones, la tecnología de microemulsificación puede utilizarse para mejorar la biodisponibilidad de agentes farmacéuticos lipofílicos (insolubles en agua). Algunos ejemplos incluyen Trimetrine (Dordunoo, S. K., et al., Drug Development and Industrial Pharmacy, 17(12), 1685-1713, 1991 y REV 5901 (Sheen, P. C., et al., J Pharm Sci 80(7), 712-714, 1991). Entre otras ventajas, la microemulsificación proporciona una mayor biodisponibilidad al dirigir preferiblemente la absorción al sistema linfático en lugar del circulatorio, lo que evita el hígado, y previene la destrucción de los compuestos en la circulación hepatobiliar.

[0132] En un aspecto, las formulaciones contienen micelas formadas a partir de eteplirsen y al menos un portador anfifílico, en el que las micelas tienen un diámetro medio inferior a aproximadamente 100 nm. También se proporcionan micelas que tienen un diámetro medio inferior a aproximadamente 50 nm, o inferior a aproximadamente 30 nm, o incluso inferior a aproximadamente 20 nm.

[0133] Aunque se contemplan todos los portadores anfifílicos adecuados, los preferentes en la actualidad son generalmente los que tienen el estatus de Generalmente Reconocidos como Seguros (GRAS), y que pueden tanto solubilizar el compuesto como microemulsionarlo en una etapa posterior cuando la solución entra en contacto con una fase acuosa compleja (tal como la que se encuentra en el tracto gastrointestinal humano). Por lo general, los ingredientes anfifílicos que satisfacen estos requisitos tienen valores de HLB (equilibrio hidrófilo a lipofílico) de 2-20, y sus estructuras contienen radicales alifáticos de cadena recta en el intervalo de C-6 a C-20. Algunos ejemplos son los glicéridos grasos glicolizados con polietileno y los polietilenglicoles.

[0134] Entre los ejemplos de portadores anfifílicos se incluyen los glicéridos de ácidos grasos polietilenglicolizados saturados y monoinsaturados, tales como los obtenidos a partir de diversos aceites vegetales total o parcialmente hidrogenados. Tales aceites pueden consistir de forma ventajosa en glicéridos de ácidos grasos tri-, di- y mono y ésteres de di- y mono-polietilenglicol de los ácidos grasos correspondientes, con una composición de ácidos grasos particularmente preferente que incluye ácido cáprico 4-10, ácido cáprico 3-9, ácido láurico 40-50, ácido mirístico 14-24, ácido palmítico 4-14 y ácido esteárico 5-15 %. Otra clase útil de portadores anfifílicos incluye sorbitán y/o sorbitol parcialmente esterificados, con ácidos grasos saturados o monoinsaturados (serie SPAN) o sus correspondientes análogos etoxilados (serie TWEEN).

[0135] Los portadores anfifílicos disponibles comercialmente pueden ser particularmente útiles, incluyendo la serie Gelucire, Labrafil, Labrasol, o Lauroglycol (todos fabricados y distribuidos por Gattefosse Corporation, Saint Priest, Francia), PEG-monooleato, PEG dioleato, PEG monolaurato y dilaurato, Lecitina, Polisorbato 80, etc. (producidos y distribuidos por una serie de empresas en Estados Unidos y en todo el mundo).

[0136] La administración puede producirse mediante el uso de liposomas, nanocápsulas, micropartículas, microesferas, partículas lipídicas, vesículas y similares, para la introducción de las composiciones utilizadas en la presente invención en células huésped adecuadas. En particular, las composiciones utilizadas en la presente invención pueden formularse para su administración encapsuladas en una partícula lipídica, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera, una nanopartícula o similares. La formulación y el uso de tales vehículos de suministro pueden llevarse a cabo utilizando técnicas conocidas y convencionales.

[0137] Los polímeros hidrófilos adecuados para su uso en la presente invención son aquellos que son fácilmente solubles en agua, pueden unirse covalentemente a un lípido formador de vesículas y que se toleran in vivo sin efectos tóxicos (es decir, son biocompatibles). Entre los polímeros adecuados se incluyen el polietilenglicol (PEG), el poliláctico (también denominado polilactida), el ácido poliglicólico (también denominado poliglicólido), un copolímero de ácido poliláctico-poliglicólico y el alcohol polivinílico. En determinadas realizaciones, los polímeros tienen un peso molecular de aproximadamente 100 o 120 daltons hasta aproximadamente 5,000 o 10,000 daltons, o de aproximadamente 300 daltons hasta aproximadamente 5,000 daltons. En otras realizaciones, el polímero es polietilenglicol que tiene un peso molecular de aproximadamente 100 a aproximadamente 5,000 daltons, o que tiene un peso molecular de aproximadamente 300 a aproximadamente 5,000 daltons. En determinadas realizaciones, el polímero es polietilenglicol de 750 daltons (PEG(750)). Los polímeros también pueden definirse por el número de monómeros que contienen; una realización preferente utilizada en la presente invención utiliza polímeros de al menos aproximadamente tres monómeros, tales polímeros de PEG consistentes en tres monómeros (aproximadamente 150 daltons).

[0138] Otros polímeros hidrófilos que pueden ser adecuados para su uso en la presente invención incluyen polivinilpirrolidona, polimetoxazolina, polietiloxazolina, polihidroxipropilmetacrilamida, polimetacrilamida, polidimetilacrilamida y celulosas derivatizadas, tales como hidroximetilcelulosa o hidroxietilcelulosa.

[0139] En determinadas realizaciones, una formulación utilizada en la presente invención comprende un polímero biocompatible seleccionado del grupo que consiste en poliamidas, policarbonatos, polialquilenos, polímeros de ésteres acrílicos y metacrílicos, polímeros de polivinilo, poliglicólidos, polisiloxanos, poliuretanos y copolímeros de los mismos, celulosas, polipropileno, polietilenos, poliestireno, polímeros de ácido láctico y ácido glicólico, polianhídridos, poli(orto)ésteres, poli(ácido bútico), poli(ácido valérico), poli(lactida-co-caprolactona), polisacáridos, proteínas, ácidos polihialurónicos, policianoacrilatos y mezclas o copolímeros de los mismos.

[0140] Las ciclodextrinas son oligosacáridos cíclicos, que consisten en 6, 7 u 8 unidades de glucosa, designadas por la letra griega α, β o γ, respectivamente. Las unidades de glucosa están unidas por enlaces α-1,4-glucosídicos. Como consecuencia de la conformación en silla de las unidades de azúcar, todos los grupos hidroxilo secundarios (en C-2, C-3) están situados en un lado del anillo, mientras que todos los grupos hidroxilo primarios en C-6 están situados en el otro lado. Como resultado, las caras externas son hidrófilas, lo que hace que las ciclodextrinas sean solubles en agua. En cambio, las cavidades de las ciclodextrinas son hidrófobas, ya que están recubiertas por el hidrógeno de los átomos C-3 y C-5, y por oxígenos similares al éter. Estas matrices permiten la complejación con una variedad de compuestos relativamente hidrófobos, incluyendo, por ejemplo, compuestos esteroideos, tales como el 17αestradiol (véase, por ejemplo, van Uden et al. Plant Cell Tiss. Org. Culto.38:1-3-113 (1994)). La complejación se produce por interacciones de Van der Waals y por formación de enlaces de hidrógeno. Para una revisión general de la química de las ciclodextrinas, véase, Wenz, Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 33:803-822 (1994).

[0141] Las propiedades fisicoquímicas de los derivados de ciclodextrina dependen en gran medida del tipo y el grado de sustitución. Por ejemplo, su solubilidad en agua se encuentra en el intervalo insoluble (por ejemplo, triacetil-betaciclodextrina) y 147 % soluble (p/v) (G-2-beta-ciclodextrina). Además, son solubles en muchos disolventes orgánicos. Las propiedades de las ciclodextrinas permiten controlar la solubilidad de varios componentes de la formulación aumentando o disminuyendo su solubilidad.

[0142] Se han descrito numerosas ciclodextrinas y métodos para su preparación. Por ejemplo, Parmeter (I), et al. (Patente de Estados Unidos No. 3,453,259) y Gramera, et al. (Patente de Estados Unidos Nº 3,459,731) describió las ciclodextrinas electroneutrales. Otros derivados son las ciclodextrinas con propiedades catiónicas [Parmeter (II), Patente de Estados Unidos No. 3,453,257], ciclodextrinas reticuladas insolubles (Solms, Patente de Estados Unidos No.3,420,788), y ciclodextrinas con propiedades aniónicas [Parmeter (III), Patente de Estados Unidos No.

[0143] 3,426,011]. Entre los derivados de ciclodextrina con propiedades aniónicas, se han añadido a la ciclodextrina madre ácidos carboxílicos, ácidos fosfóricos, ácidos fosfínicos, ácidos fosfónicos, ácidos tiofosfónicos, ácidos tiosulfínicos y ácidos sulfónicos [véase, Parmeter (III), supra]. Además, los derivados de sulfoalquil éter ciclodextrina han sido descritos por Stella, et al. (Patente de Estados Unidos No.5,134,127).

[0144] Los liposomas consisten en al menos una membrana de bicapa lipídica que encierra un compartimento interno acuoso. Los liposomas pueden caracterizarse por el tipo de membrana y por el tamaño. Las vesículas unilamelares pequeñas (SUV) tienen una sola membrana y suelen estar en el intervalo entre 0.02 y 0.05 µm de diámetro; las vesículas unilamelares grandes (LUVS) suelen ser mayores de 0.05 µm. Las vesículas grandes oligolamelares y las vesículas multilamelares tienen múltiples capas de membrana, normalmente concéntricas, y suelen medir más de 0.1 µm. Los liposomas con varias membranas no concéntricas, es decir, varias vesículas más pequeñas contenidas dentro de una vesícula mayor, se denominan vesículas multivesiculares.

[0145] En el presente documento se describen formulaciones que comprenden liposomas que contienen eteplirsen para su uso en la presente invención, donde la membrana del liposoma se formula para proporcionar un liposoma con mayor capacidad de transporte. Alternativa o adicionalmente, el eteplirsen para su uso en la presente invención puede estar contenido dentro de, o adsorbido sobre, la bicapa liposomal del liposoma. El eteplirsen para uso en la presente invención puede agregarse con un tensioactivo lipídico y transportarse dentro del espacio interno del liposoma; en estos casos, la membrana del liposoma se formula para resistir los efectos disruptivos del agregado agente activo-surfactante.

[0146] Como se describe en el presente documento, la bicapa lipídica de un liposoma contiene lípidos derivados con polietilenglicol (PEG), de manera que las cadenas de PEG se extienden desde la superficie interna de la bicapa lipídica hacia el espacio interior encapsulado por el liposoma, y se extienden desde el exterior de la bicapa lipídica hacia el entorno circundante.

[0147] Los agentes activos contenidos en los liposomas utilizados en la presente invención están en forma solubilizada. Los agregados de tensioactivo y agente activo (tal como emulsiones o micelas que contienen el agente activo de interés) pueden quedar atrapados en el espacio interior de los liposomas utilizados en la presente invención. Un tensioactivo actúa para dispersar y solubilizar el agente activo, y puede seleccionarse de cualquier tensioactivo alifático, cicloalifático o aromático adecuado, incluyendo, pero no se limita a, lisofosfatidilcolinas biocompatibles (LPG) de longitudes de cadena variables (por ejemplo, de aproximadamente C14 a aproximadamente C20). Los lípidos derivados de polímeros, tales como los lípidos PEG, también pueden utilizarse para la formación de micelas, ya que actúan inhibiendo la fusión micela/membrana, y la adición de un polímero a las moléculas de tensioactivo disminuye la CMC del tensioactivo y contribuye a la formación de micelas. Se prefieren tensioactivos con CMO en el intervalo micromolar; pueden utilizarse tensioactivos con CMC superior para preparar micelas atrapadas en liposomas utilizados en la presente invención.

[0149] Los liposomas utilizados en la presente invención pueden prepararse mediante una variedad de técnicas conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No.4,235,871; Solicitudes PCT publicadas WO 96/14057; New RRC, Liposomes: A practical approach, IRL Press, Oxford (1990), páginas 33-104; Lasic DD, Liposomes from physics to applications, Elsevier Science Publishers BV, Amsterdam, 1993. Por ejemplo, los liposomas utilizados en la presente invención pueden prepararse difundiendo un lípido derivatizado con un polímero hidrófilo en liposomas preformados, tal como exponiendo liposomas preformados a micelas compuestas de polímeros injertados con lípidos, a concentraciones de lípidos correspondientes al porcentaje molar final de lípido derivatizado que se desea en el liposoma. Los liposomas que contienen un polímero hidrófilo también pueden formarse por homogeneización, hidratación en campo lipídico o técnicas de extrusión, como son conocidas en la técnica.

[0151] En otro procedimiento de formulación ejemplar, el agente activo se dispersa primero por sonicación en una lisofosfatidilcolina u otro tensioactivo de bajo CMC (incluyendo los lípidos injertados con polímeros) que solubiliza fácilmente las moléculas hidrófobas. A continuación, la suspensión micelar de agente activo resultante se utiliza para rehidratar una muestra de lípidos secos que contenga un porcentaje molar adecuado de lípidos poliméricos o colesterol. A continuación, la suspensión de lípidos y agentes activos se forma en liposomas utilizando técnicas de extrusión conocidas en la técnica, y los liposomas resultantes se separan de la solución no encapsulada mediante separación en columna estándar.

[0153] Los liposomas se preparan para que tengan tamaños sustancialmente homogéneos en un intervalo de tamaños seleccionado. Un método eficaz de dimensionamiento consiste en extruir una suspensión acuosa de los liposomas a través de una serie de membranas de policarbonato que tienen un tamaño de poro uniforme seleccionado; el tamaño de poro de la membrana se corresponderá aproximadamente con los tamaños más grandes de liposomas producidos por extrusión a través de esa membrana. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No.

[0154] 4,737,323 (12 de abril de 1988). A menudo, pueden utilizarse reactivos, tales como DharmaFECT<®>y Lipofectamine<®>para introducir polinucleótidos o proteínas en las células.

[0156] Las características de liberación de una formulación dependen del material de encapsulación, la concentración del fármaco encapsulado y la presencia de modificadores de la liberación. Por ejemplo, la liberación puede manipularse para que dependa del pH, por ejemplo, utilizando un recubrimiento sensible al pH que libere sólo a un pH bajo, como en el estómago, o a un pH más alto, como en el intestino. Puede utilizarse un recubrimiento entérico para evitar que se produzca la liberación hasta después del paso por el estómago. Pueden utilizarse múltiples recubrimientos o mezclas de cianamida encapsulada en diferentes materiales para obtener una liberación inicial en el estómago, seguida de una liberación posterior en el intestino. La liberación también puede manipularse mediante la inclusión de sales o agentes formadores de poros, que pueden aumentar la absorción de agua o la liberación del fármaco por difusión desde la cápsula. Los excipientes que modifican la solubilidad del fármaco también pueden utilizarse para controlar la tasa de liberación. También pueden incorporarse agentes que potencien la degradación de la matriz o su liberación. Pueden añadirse al fármaco, añadirse como fase separada (es decir, como partículas), o pueden codisolverse en la fase polimérica dependiendo del compuesto. En la mayoría de los casos, la cantidad debe estar comprendida entre el 0.1 y el treinta por ciento (p/p de polímero). Los tipos de potenciadores de la degradación incluyen sales inorgánicas tales como sulfato de amonio y cloruro de amonio, ácidos orgánicos, tales como ácido cítrico, ácido benzoico y ácido ascórbico, bases inorgánicas, tales como carbonato de sodio, carbonato de potasio, carbonato cálcico, carbonato de zinc e hidróxido de zinc, y bases orgánicas, tales como sulfato de protamina, espermina, colina, etanolamina, dietanolamina y trietanolamina, y tensioactivos, tales como Tween<®>y Pluronic<®>. Los agentes formadores de poros que añaden microestructura a las matrices (es decir, compuestos solubles en agua, tales como sales inorgánicas y azúcares) se añaden en forma de partículas. El intervalosuele estar entre el uno y el treinta por ciento (p/p de polímero).

[0158] La absorción también puede manipularse alterando el tiempo de permanencia de las partículas en el intestino. Esto puede conseguirse, por ejemplo, recubriendo la partícula con, o seleccionando como material encapsulante, un polímero adhesivo para la mucosa. Entre los ejemplos se incluyen la mayoría de los polímeros con grupos carboxilo libres, tales como el quitosano, las celulosas y, especialmente, los poliacrilatos (en el presente documento, poliacrilatos se refiere a polímeros que incluyen grupos acrilato y grupos acrilato modificados, como cianoacrilatos y metacrilatos).

[0159] Además de los métodos previstos en el presente documento, el eteplirsen para uso de acuerdo con la invención puede formularse para su administración de cualquier forma conveniente para su uso en medicina humana o veterinaria, por analogía con otros productos farmacéuticos. Eteplirsen y sus formulaciones correspondientes pueden ser administradas solas o en combinación con otras estrategias terapéuticas en el tratamiento de distrofia muscular, tales como trasplante de mioblastos, terapias de células madre, administración de antibióticos aminoglucósidos, inhibidores del proteasoma, y terapias de regulación ascendente (por ejemplo, regulación ascendente de utrofina, un paralogo autosómico de distrofina).

[0160] V. Kits

[0161] También se proporcionan kits para el tratamiento de un paciente con distrofia muscular de Duchenne, cuyo kit comprende eteplirsen, empaquetado en un recipiente adecuado, junto con instrucciones para su uso. Los kits también pueden contener reactivos periféricos, tales como tampones, estabilizadores, etc.

[0162] VII. EJEMPLOS

[0163] Materiales y métodos

[0164] Pacientes

[0165] Los pacientes elegibles tenían entre 7 y 13 años de edad (inclusive), con deleciones fuera del marco del gen DMD que podían corregirse omitiendo el exón 51. Se confirmó que los pacientes tenían una función cardiaca y pulmonar estable y una dosis estable de glucocorticoides durante al menos 24 semanas antes de la inscripción. Sólo se incluyeron pacientes que podían caminar entre 200 y 400 metros (±10 %) en la Prueba de Marcha de 6 Minutos (6MWT) en la línea de base.

[0166] Diseño del estudio

[0167] Este ensayo de un año de duración se llevó a cabo en dos fases: (1) el tratamiento fue doble ciego hasta la semana 24 y (2) abierto a partir de entonces. Los criterios de valoración primarios fueron el cambio en el porcentaje de fibras de distrofina y la ambulación medida por la Prueba de Marcha de 6 Minutos (6MWT).

[0168] El estudio 201 fue un ensayo de eficacia, seguridad y tolerabilidad de dosis múltiples de eteplirsen, realizado en un único centro, aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo. Doce pacientes con DMD fueron aleatorizados a uno de tres grupos: eteplirsen 30 mg/kg/semana (Cohorte 1); eteplirsen 50 mg/kg/semana (Cohorte 2); o placebo/eteplirsen retardado (Cohorte 3). Todos los pacientes recibieron dosificaciones semanales de eteplirsen intravenoso o placebo/eteplirsen retardado. Los pacientes tratados con placebo pasaron a recibir semanalmente eteplirsen 30 (n=2) o 50 mg/kg (n=2) en la semana 25. La eficacia y la seguridad se evaluaron en las visitas programadas, y un comité independiente de supervisión de la seguridad de los datos veló por el bienestar de todos los pacientes. Todos los pacientes se sometieron a biopsias de bíceps en la línea base. Se realizaron biopsias de seguimiento en el brazo opuesto (bíceps) en la semana 12 para el grupo de 50 mg/kg y dos pacientes tratados con placebo y en la semana 24 para el grupo de 30 mg/kg y dos pacientes tratados con placebo.

[0169] Los pacientes siguieron recibiendo dosificaciones semanales de 30 o 50 mg/kg de eteplirsen en el estudio 202, un estudio de extensión abierto a largo plazo. Todas las evaluaciones de eficacia siguieron realizándose durante el Estudio 202, incluyendo una tercera biopsia (en el músculo deltoides izquierdo) en todos los pacientes en la semana 48. El seguimiento de los acontecimientos adversos continuó durante todo el estudio. En la Figura 2 se muestra un esquema del diseño del estudio.

[0170] Fármaco del estudio

[0171] Eteplirsen [secuencia 5'-CTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG-3'] (SEC ID NO: 1000) fue suministrado por Sarepta Therapeutics, Inc. en viales de un solo uso de solución salina tamponada con fosfato (100 mg/ml). Eteplirsen se reconstituyó con 150 ml de solución salina normal y se infundió durante 60 minutos. El placebo, administrado durante las primeras 24 semanas del Estudio 201, se suministró en viales idénticos de solución salina tamponada con fosfato y se administró del mismo modo que el eteplirsen.

[0172] Control de seguridad y tolerabilidad

[0173] La seguridad se evaluó mediante la valoración de acontecimientos adversos, constantes vitales, exámenes físicos, electrocardiogramas, ecocardiogramas y pruebas de laboratorio clínico. Además, se controló la función renal mediante evaluaciones periódicas de la cistatina C en suero y de la cistatina C y KIM-1 en orina.

[0174] Evaluaciones farmacocinéticas e inmunológicas

[0175] Los parámetros farmacocinéticos de eteplirsen se establecieron a partir de plasma y orina tomados tras la duodécima dosis utilizando un método bioanalítico validado y sensible de cromatografía líquida de alta resolución de intercambio aniónico con detección de fluorescencia. Se tomaron muestras individuales para el análisis de las concentraciones plasmáticas en las semanas 24, 25 y 36. La respuesta inmune a la nueva proteína distrofina fue medida cada seis semanas hasta la semana 24 con ELISPOT siguiendo métodos previamente publicados.Evaluaciones bioquímicas de la eficacia

[0176] Los estudios de expresión de distrofina antes y después del tratamiento se basaron en el MANDYS106 [un regalo de Glen Morris, Biblioteca de Anticuerpos Monoclonales de la MDA], un marcador altamente sensible para la distrofina usado en estudios previos de eteplirsen y otros candidatos de omisión de exón. Tres secciones congeladas de 10 µm, separadas al menos 200 µm, se tiñeron con MANDYS106, seguidas de un anticuerpo secundario (anticuerpo antimouse de cabra Alexa Fluor 594). Porcentaje de fibras positivas para distrofina fueron calculadas dividiendo el número de fibras positivas por el total de fibras contadas. Como las muestras de músculo normal tienen 100 % de fibras positivas para distrofina, el porcentaje de fibras positivas para distrofina es expresado como un porcentaje de lo normal. Las mismas secciones teñidas con anticuerpos fueron usadas para la cuantificación de distrofina usando el software de análisis de imagen Bioquant. La intensidad total de la señal de fluorescencia de la distrofina fue reportada como un porcentaje de lo normal.

[0177] Las medidas de apoyo incluyeron la expresión de los componentes del complejo sarcoglicano (β,γ), NOS neuronal, y Western blot (con el anticuerpo anti-distrofina NCL-Dys1 de Novacastra). El análisis RT-PCR, para la confirmación de la omisión de exón, fue realizado en 400 ng de ARN total usando cebadores inversos específicos de distrofina como se describió previamente.

[0178] Evaluaciones de eficacia clínica

[0179] La 6MWT se administró utilizando el protocolo establecido para pacientes con DMD por McDonald, et al. (Muscle Nerve, 2010; 42:966-74). Los resultados funcionales exploratorios incluyeron la evaluación ambulatoria North Star, pruebas musculares cuantitativas, la Prueba de las 9 Clavijas, pruebas de función pulmonar (PFT), pruebas de función cronometradas y evaluación de la calidad de vida.

[0180] Análisis estadístico

[0181] Para todos los análisis estadísticos se utilizó la versión 9.3 de SAS (Cary, NC). Se utilizó un modelo mixto con el tratamiento como efecto fijo, el sujeto anidado dentro del tratamiento como efecto aleatorio, con el valor de la línea de base y el tiempo desde el diagnóstico de DMD como covariables para el análisis de los datos de la biopsia muscular. Se utilizó un modelo mixto de medidas repetidas (MMRM) con tratamiento, tiempo, y términos de interacción tratamiento-tiempo como efecto fijo, sujeto anidado dentro del tratamiento como efecto aleatorio, y con el valor de la línea de base y el tiempo desde el diagnóstico de DMD como covariables para el análisis de los datos de 6MWT. Los análisis de seguridad y de biopsia muscular se realizaron en la población de intención de tratamiento; el análisis de los resultados relacionados con la deambulación, incluida la 6MWT, utilizó una población de intención de tratamiento modificada (mITT) que excluyó a dos pacientes de la Cohorte 1 que mostraron signos de progresión de la enfermedad y un deterioro significativo en la 6MWT a las pocas semanas de la inscripción y no pudieron realizar mediciones de la deambulación en la semana 24 o después.

[0182] Ejemplo 1: Características del sujeto

[0183] Las características de la línea de base de los 12 pacientes de este estudio se resumen en la Tabla 2. Cinco genotipos diferentes susceptibles de omisión del exón 51 estaban representados en la población de estudio. Las distancias medias en la Prueba de Marcha de 6 Minutos (6MWT) en la línea de base fueron similares a las de otros estudios de niños con DMD, y como se esperaba, estaban muy por debajo de los 600 metros o más típicamente observados en niños sanos de la misma edad. Debido a la naturaleza estocástica del muestreo, la cohorte de 30 mg/kg era ligeramente mayor, más pesada y más alta que las otras cohortes, y tenía una distancia media 6MWT inferior a la línea de base. Todos los pacientes recibieron todas las infusiones de la medicación del estudio según lo previsto y completaron todas las evaluaciones.

[0184]

[0188]

[0190] Ejemplo 2: Seguridad y ausencia de efectos adversos

[0191] El eteplirsen fue bien tolerado, sin acontecimientos adversos relacionados con el tratamiento, acontecimientos adversos graves, interrupciones u omisiones de dosis durante 48 semanas de tratamiento. Además, no se observaron cambios clínicamente significativos en la exploración física ni en las constantes vitales. Los electrocardiogramas, ecocardiogramas y pruebas de función pulmonar se mantuvieron estables, y la bioquímica no mostró cambios clínicamente significativos en las funciones hematológica, renal, de coagulación o hepática. Se observó proteinuria leve y transitoria en un único sujeto tratado con placebo.

[0192] Ejemplo 3: Perfil farmacocinético

[0193] El análisis de los parámetros PK en la semana 12 reveló una rápida absorción. El aclaramiento plasmático promedio fue de 339 75.8 ml/hr/kg para 30 mg/kg y 319 ± 125 ml/hr/kg para 50 mg/kg. La vida media fue de una media de 3.30 ± 0.341 h para 30 mg/kg y de 3.17 ± 0.249 h para 50 mg/kg, con un aclaramiento renal de aproximadamente el 65-70 % del aclaramiento sistémico total.

[0194] Ejemplo 4: Eficacia

[0195] En la semana 48, el eteplirsen produjo aumentos robustos en el número y la intensidad de fibras positivas para distrofina. Como se muestra en la Fig.3, los pacientes que recibieron 30 o 50 mg/kg de eteplirsen sin interrupción durante 48 semanas mostraron un aumento medio en el porcentaje de fibras positivas para distrofina a 47 % de lo normal (p ≤0.001), en relación con la línea de base. Los aumentos fueron similares cuando las cohortes de 30 (52 %; p ≤0.001) y 50 (43 %; p ≤0.008) mg/kg fueron analizadas por separado, sugiriendo que el efecto del eteplirsen en la producción de nueva distrofina es independiente de la dosis dentro de este intervalo de dosis.

[0196] Las biopsias fueron tomadas en puntos de tiempo escalonados (véase la Fig. 2) para evaluar el impacto de la duración del tratamiento en la nueva producción de distrofina. En la semana 12, la cohorte de 50 mg/kg tenía niveles indetectables de nueva distrofina. En la semana 24, la cohorte de 30 mg/kg demostró un aumento en el porcentaje de fibras positivas para distrofina a 23 % de lo normal (p ≤0.002), y en la semana 48, después de 24 semanas de tratamiento con 30 o 50 mg/kg de eteplirsen, los 4 pacientes en la cohorte de placebo/eteplirsen retardado mostraron un aumento a 38 % de lo normal, en relación a la línea de base (p ≤0.009). Juntos estos datos sugieren que la duración del tratamiento juega un papel importante en la capacidad del eteplirsen de restaurar uniformemente la nueva producción de distrofina. En consonancia con estos hallazgos, el eteplirsen también aumentó significativamente la intensidad media de la señal de fluorescencia en la semana 48 en los tres grupos de tratamiento (todos los valores p ≤0.023).

[0197] La Fig.4 ilustra el efecto tiempo-dependiente del eteplirsen en el porcentaje de fibras positivas para distrofina (Panel A), que fue acompañado por la restauración de β- y γ-sarcoglicano y nNOSµ en el sarcolema (Panel B). La expresión de la distrofina y la omisión de exón fueron confirmadas por Western blot y RT-PCR en todos los pacientes. Resultados de RT-PCR de un paciente representativo son mostrados en el Panel C. Estos datos confirmaron el aumento de distrofina funcional en los pacientes.

[0198] Ejemplo 5: Resultados funcionales

[0199] La pérdida progresiva de la capacidad de caminar es un sello universal de la DMD, con la mayoría de los pacientes mostrando compromiso funcional a los 7 u 8 años de edad y volviéndose dependientes de la silla de ruedas entre los 10 y 14 años de edad. En consonancia con esto, los niños asignados a la cohorte placebo/eteplirsen retardado en este estudio mostraron un declive en la capacidad de caminar después de la semana 12 a un ritmo predicho por estudios previos, culminando en una pérdida de aproximadamente 60 metros en la semana 48 (Fig. 5). En marcado contraste, los pacientes tratados con eteplirsen mantuvieron una distancia caminada estable durante la duración del estudio, con un aumento medio respecto a la línea de base de aproximadamente 7 metros en la semana 48. La diferencia entre los pacientes tratados con eteplirsen y los de la cohorte placebo/eteplirsen retardado se hizo estadísticamente significativa por primera vez en la semana 32 (diferencia de 39 metros; p ≤0.05). Curiosamente, los pacientes de la cohorte placebo/eteplirsen retardado parecieron estabilizarse después de la semana36, es decir,entre 12 y 24 semanas después de iniciar el tratamiento con eteplirsen en la semana 25. Como se señaló anteriormente, se excluyó de este análisis a dos niños que mostraron signos de progresión rápida de la enfermedad y un deterioro significativo en la 6MWT a las pocas semanas de la inscripción y que no pudieron realizar mediciones de la deambulación a las 24 semanas o después. Sin embargo, ambos permanecieron en tratamiento con eteplirsen hasta la semana 48 sin efectos adversos relacionados con el tratamiento y mantuvieron estables la función pulmonar y de las extremidades superiores, medidas por PFT y la Prueba de las 9 Clavijas, respectivamente.

[0200] En particular, los pacientes que recibieron eteplirsen durante 48 semanas, evaluables en la 6MWT (n=6), mejoraron significativamente (p ≤0.001) en la 6MWT (67.3 m) en comparación con la cohorte placebo/retraso.

[0201] Ambas cohortes han mantenido estables los resultados de la 6MWT durante 120 semanas, como se describe a continuación. A las 120 semanas, los pacientes de las cohortes de 30 mg/kg y 50 mg/kg de eteplirsen que fueron capaces de realizar la 6MWT (población modificada por intención de tratar o mITT; n=6) experimentaron una estabilidad general con un ligero descenso de 13.9 metros, o menos del 5 por ciento, con respecto a la línea de base en la capacidad de caminar. Se observó un beneficio del tratamiento estadísticamente significativo de 64.9 metros (p ≤0.006) para la población mITT en comparación con la cohorte placebo/tratamiento retrasado (n=4), que inició el tratamiento en la Semana 25 tras 24 semanas de placebo. Después de experimentar un declive sustancial temprano en el estudio (antes del tratamiento con eteplirsen), la cohorte placebo/tratamiento retardado también demostró estabilización en la capacidad de caminar por más de 1.5 años, desde la Semana 36 hasta la 120, el periodo desde el cual niveles significativos de distrofina fueron probablemente producidos, con un declive de 9.5 metros durante este marco de tiempo. Estos análisis se basaron en la puntuación máxima de la 6MWT cuando la prueba se realizó en dos días consecutivos.

[0202] Ejemplo 6: Respuesta inmunitaria

[0203] No hubo diferencias entre los pacientes tratados con eteplirsen y placebo en el número de colonias de formación de manchas inducidas por interferón-γ a grupos de péptidos de distrofina (extendidos sobre la proteína entera) en cualquier punto de tiempo evaluado, incluyendo la semana 24, indicando que la distrofina recién expresada en los pacientes tratados con eteplirsen no provocó una respuesta de células T.

[0204] Ejemplo 7: Función pulmonar

[0205] La función muscular respiratoria desde la línea de base hasta la semana 120 en ambas cohortes de dosificación, medida por la presión inspiratoria y espiratoria máxima (MIP y MEP), mostró un aumento medio del 14.6 porciento en la MIP y del 15.0 porciento en la MEP. Los análisis del porcentaje previsto de MIP (MIP ajustado al peso) y del porcentaje previsto de MEP (MEP ajustado a la edad) demostraron un aumento medio del 90.2 porciento a en la línea de base al 95.2 % en la semana 120 en el porcentaje previsto de MIP, y un ligero aumento medio del 79.3 porciento en la línea de base al 79.6 porciento en la semana 120 en el porcentaje previsto de MEP. Además, se produjo un aumento medio de la capacidad vital forzada (), una medida del volumen pulmonar, del 8.7 porciento en la línea de base hasta la semana 120, y el porcentaje previsto de FVC (FVC ajustada por edad y estatura) se mantuvo por encima de una media del 90 porciento hasta la semana 120, con un 101 porciento en la línea de base y un 93 porciento en la Semana 120.

[0206] REFERENCIAS

[0207] 1. Emery AEH. Population frequencies of inherited neuromuscular diseases - a world survey. Neuromuscul Disord 1991;1:19-29.

[0208] 2. Mendell JR, Shilling C, Leslie ND, Flanigan KM, al-Dahhak R, Gastier-Foster, J, et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Ann Neurol 2012;71:304-13.

[0209] 3. McDonald CM, Abresch RT, Carter GT, Fowler WM Jr, Johnson ER, Kilmer DD, et al. Profiles of neuromuscular diseases. Duchenne muscular dystrophy. Am J Phys Med Rehabil 1995;74:S70-S92. 4. Bushby K, Finkel R, Birnkrant DJ, Case LE, Clemens PR, Cripe L, et al. Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 1: diagnosis, and pharmacological and psychosocial management. Lancet Neurol 2010;9:77-93.

[0210] 5. Kohler M, Clarenbach CF, Böni L, Brack T, Russi EW, Bloch KE. Quality of life, physical disability and respiratory impairment in Duchenne muscular dystrophy. Am J Respir Crit Care Med 2005;172:1032-6.

[0211] 6. Mendell JR, Moxley RT, Griggs RC, Brooke MH, Fenichel GM, Miller JP, et al. Randomized, doubleblind six-month trial of prednisone in Duchenne's muscular dystrophy. N Engl J Med 1989;320:1592-97.

[0212] 7. Manzur AY, Kuntzer T, Pike M, Swan A. Glucocorticoid corticosteroids for Duchenne muscular dystrophy. Cochrane Database Syst Rev.2004;(2):CD003725.

[0213] 8. van Deutekom JC, Janson AA, Ginjaar IB, Frankhuizen WS, Aartsma-Rus A, Bremmer-Bout M, et al. Local dystrophin restoration with antisense oligonucleotide PRO051. N Engl J Med 2007;357:2677-86.

[0214] 9. Kinali M, Arechavala-Gomeza V, Feng L, Cirak S, Hunt D, Adkin C, et al. Local restoration of dystrophin expression with the morpholino oligomer AVI-4658 in Duchenne muscular dystrophy: a single-blind, placebo-controlled, dose-escalation, proof-of-concept study. Lancet Neurol 2009;8:918-28.

[0215] 10. Goemans NM, Tulinius M, van den Akker JT, Burm BE, Ekhart PF, Heuvelmans N, et al. Systemic administration of PRO051 in Duchenne's muscular dystrophy. N Engl J Med 2011;364:1513-22.

[0216] 11. Cirak S, Arechavala-Gomeza V, Guglieri M, Feng L, Torelli S, Anthony K, et al. Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study. Lancet 2011;378:595-605.

[0217] 12. Aartsma-Rus A, Fokkema I, Verschuuren J, Ginjaar I, van Deutekom J, van Ommen GJ, et al. Theoretic applicability of antisense-mediated exon skipping for Duchenne muscular dystrophy mutations. Hum Mutat 2009;30:293-99.

[0218] 13. Muntoni F, Torelli S, Ferlini A. Dystrophin and mutations: one gene, several proteins, multiple phenotypes. Lancet Neurol.2003;2:731-40.

[0219] 14. Bushby KM, Gardner-Medwin D. The clinical, genetic and dystrophin characteristics of Becker muscular dystrophy. I. Natural history. J Neurol 1993;240:98-104.

[0220] 15. Arechavala-Gomeza V, Graham IR, Popplewell LJ, Adams AM, Aartsma-Rus A, Kinali M, et al. Comparative analysis of antisense oligonucleotide sequences for targeted skipping of exon 51 during dystrophin pre-mRNA splicing in human muscle. Hum Gene Ther 2007;18:798-810.

[0221] 16. Mendell JR, Campbell K, Rodino-Klapac L, Sahenk Z, Shilling C, Lewis S, et al. Dystrophin immunity revealed by gene therapy in Duchenne muscular dystrophy. N Engl J Med 2010;363:1429-37.

[0222] 17. Nguyen TM, Morris GE. Use of epitope libraries to identify exon-specific monoclonal antibodies for characterization of altered dystrophins in muscular dystrophy. Am J Hum Genet 1993;52:1057-66.

[0223] 18. Arechavala-Gomeza V, Kinali M, Feng L, Brown SC, Sewry C, Morgan JE, et al. Immunohistological intensity measurements as a tool to assess sarcolemma-associated protein expression. Neuropathol Appl Neurobiol 2010;36: 265-74.

[0224] 19. McDonald CM, Henricson EK, Han JJ, Abresch RT, Nicorici A, Elfring GL, et al. The 6-minute walk test as a new outcome measure in Duchenne muscular dystrophy. Muscle Nerve 2010;41:500-10.

[0225] 20. Mazzone E, Vasco G, Sormani MP, Torrente Y, Berardinelli A, Messina S, et al. Functional changes in Duchenne muscular dystrophy: a 12-month longitudinal cohort study. Neurology 2011;77(3):250-6. 21. McDonald CM, Henricson EK, Han JJ, Abresch RT, Nicorici A, Atkinson L, et al. The 6-minute walk test in Duchenne/Becker muscular dystrophy: longitudinal observations. Muscle Nerve 2010;42: 966-74. 22. Strober JB. Therapeutics in Duchenne muscular dystrophy. NeuroRX 2006;3:225-34.

[0226] 23. Hoffman EP, Fischbeck KH, Brown RH, Johnson M, Medori R, Loike JD, et al. Characterization of dystrophin in muscle-biopsy specimens from patients with Duchenne's or Becker's muscular dystrophy. N Engl J Med 1988;318:1363-68.

[0227] 24. Azofeifa J, Voit T, Hubner C, Cremer M. X-chromosome methylation in manifesting and healthy carriers of dystrophinopathies: concordance of activation ratios among first degree female relatives and skewed inactivation as cause of the affected phenotypes. Hum Genet 1995;96:167-76.

[0228] 25. van Putten M, Hulsker M, Nadarajah VD, van Heiningen SH, van Huizen E, van Iterson M, et al. The Effects of Low Levels of Dystrophin on Mouse Muscle Function and Pathology. PLoS ONE 2012;7:e31937.

[0229] 26. Brooke MH, Fenichel GM, Griggs RC, Mendell JR, Moxley R, Miller JP, et al. Clinical investigation in Duchenne dystrophy: 2. Determination of the "power" of therapeutic trials based on the natural history. Muscle Nerve.1983;6:91-103.

[0230] 27. Ahmad A, Brinson M, Hodges BL, Chamberlain JS, Amalfitano A. Mdx mice inducibly expressing dystrophin provide insights into the potential of gene therapy for Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet 2000;9:2507-15.

[0231] 28. Hoffman EP, Bronson A, Levin AA, Takeda S, Yokota T, Baudy AR, Connor EM.. Restoring dystrophin expression in Duchenne muscular dystrophy muscle: Progress in exon skipping and stop codon read through. Am J Path 2011;179:12-22.

[0232] 29. Merlini L, Gennari M, Malaspina E, Cecconi I, Armaroli A, Gnudi S, et al. Early corticosteroid treatment in 4 Duchenne muscular dystrophy patients: 14-year follow-up. Muscle Nerve 2012;45:796-802.

[0233] 30. Fletcher S, Honeyman K, Fall AM, Harding PL, Johnsen RD, Steinhaus JP, et al. Morpholino oligomermediated exon skipping averts the onset of dystrophic pathology in the mdx mouse. Mol Ther 2007;15:1587-92.

[0234] 31. Yokota T, Lu QL, Partridge T, Kobayashi M, Nakamura A, Takeda S,, et al. Efficacy of systemic morpholino exon-skipping in Duchenne dystrophy dogs. Ann Neurol 2009;65:667-76.

[0235] 32. Aartsma-Rus A, Janson AA, Kaman WE, Bremmer-Bout M, van Ommen GJ, den Dunnen JT, et al. Antisense-induced multiexon skipping for Duchenne muscular dystrophy makes more sense. Am J Hum Genet 2004;74:83-92.

Claims (3)

1. REIVINDICACIONES

1. Eteplirsen para uso en el tratamiento de distrofia muscular de Duchenne en un paciente que lo necesita, el paciente que tiene una deleción o deleciones fuera de marco que pueden ser corregidas omitiendo el exón 51 del gen de la distrofina, en el que el tratamiento comprende administrar al paciente una dosis intravenosa única de eteplirsen de aproximadamente 30 mg/kg una vez a la semana o aproximadamente 50 mg/kg una vez a la semana, retrasando así la progresión de la enfermedad durante 120 semanas según lo determinado por uno o ambos de los siguientes:

(i) que el paciente mantenga estable su capacidad para caminar durante 120 semanas, medida por un descenso inferior al 5 por ciento, o inferior al 13 por ciento.9 metros, en la capacidad de caminar, en relación con la línea de base en la Prueba de Marcha de 6 Minutos (6MWT); y

(ii) que el paciente muestre un aumento de la función muscular respiratoria a lo largo de 120 semanas en relación con la línea de base, medido por un aumento del 14.6 por ciento de la presión inspiratoria máxima (MIP) y del 15 por ciento de la presión espiratoria máxima (MEP).

2. Eteplirsen para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el paciente es un paciente pediátrico.

3. Eteplirsen para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el paciente pediátrico tiene entre 7 y 13 años de edad.