ES3064150T3 - Anti-myostatin antibodies and methods of use - Google Patents

Anti-myostatin antibodies and methods of use

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ES3064150T3
ES3064150T3 ES17813419T ES17813419T ES3064150T3 ES 3064150 T3 ES3064150 T3 ES 3064150T3 ES 17813419 T ES17813419 T ES 17813419T ES 17813419 T ES17813419 T ES 17813419T ES 3064150 T3 ES3064150 T3 ES 3064150T3
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Yoshinao Ruike
Taichi Kuramochi
Hiroyasu Muramatsu
Atsunori Ueyama
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Abstract

La presente invención proporciona anticuerpos antimiostatina y métodos para su producción y uso. También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican dichos anticuerpos y células huésped que los contienen. Asimismo, la invención proporciona polipéptidos que contienen una región Fc variante y métodos para su producción y uso. También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican dichos polipéptidos y células huésped que los contienen. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Anticuerpos anti-miostatina y métodos de uso
[0003] Campo técnico
[0004] La presente descripción se refiere, en general, a anticuerpos anti-miostatina y a métodos de usar los mismos. La presente descripción también se refiere, en general, a polipéptidos que contienen regiones Fc variantes y a métodos de usar los mismos. La presente invención se refiere a un anticuerpo que se une a miostatina latente e inhibe la activación de miostatina, comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO: 86 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 96; o una secuencia de VH de SEQ ID NO: 87 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 96; o una secuencia de VH de SEQ ID NO: 88 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 96; o una secuencia de VH de SEQ ID NO: 89 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 96; o una secuencia de VH de SEQ ID NO: 90 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 96; o una secuencia de VH de SEQ ID NO: 91 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 96; o una secuencia de VH de SEQ ID NO: 92 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 97; o una secuencia de VH de SEQ ID NO: 93 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 97; o una secuencia de VH de SEQ ID NO: 94 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 97; o una secuencia de VH de SEQ ID NO: 95 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 97, y es para su uso en el tratamiento de una enfermedad de desgaste muscular. La divulgación se refiere además a un anticuerpo IgG de longitud completa de la invención. Cualquier referencia a un método de tratamiento del cuerpo humano o animal ha de interpretarse como sustancias y composiciones para su uso en tal método.
[0005] Antecedentes de la técnica
[0006] La miostatina, también denominada factor de crecimiento y diferenciación 8 (GDF8), es una proteína secretada y es un miembro de la superfamilia de proteínas del factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta). Los miembros de esta superfamilia presentan propiedades reguladoras del crecimiento y morfogenéticas (véanse, por ejemplo, el documento no de patente 1, el documento no de patente 2, y el documento de patente 1). La miostatina se expresa principalmente en músculo esquelético en desarrollo y adulto y funciona como regulador negativo del crecimiento muscular. La sobreexpresión sistémica de miostatina en ratones adultos conduce a desgaste muscular (véase, por ejemplo, el documento no de patente 3) mientras que, a la inversa, un ratón deficiente (knockout) en miostatina se caracteriza por hipertrofia e hiperplasia del músculo esquelético dando como resultado una masa muscular de dos a tres veces mayor que la de otros individuos de su misma camada silvestres (véase, por ejemplo, el documento no de patente 4).
[0007] Al igual que otros miembros de la familia de TGF-beta, la miostatina se sintetiza como una proteína precursora grande que contiene un dominio de propéptido N-terminal, y un dominio C-terminal considerado como la molécula activa (véanse, por ejemplo, el documento no de patente 5; documento de patente 2). Dos moléculas de precursor de miostatina están unidas de manera covalente a través de un único enlace disulfuro presente en el dominio de factor de crecimiento C-terminal. La miostatina madura activa (homodímero unido por enlaces disulfuro que consiste en el dominio de factor de crecimiento C-terminal) se libera del precursor de miostatina a través de múltiples etapas de procesamiento proteolítico. En la primera etapa de la ruta de activación de miostatina, se escinde un enlace peptídico entre el dominio de propéptido N-terminal y el dominio de factor de crecimiento C-terminal, Arg266-Asp267, por una proproteína convertasa de tipo furina en ambas cadenas del precursor homodimérico. Pero los tres péptidos resultantes (dos propéptidos y una miostatina madura (es decir, un homodímero unido por enlaces disulfuro que consiste en los dominios de factor de crecimiento)) permanecen asociados, formando un complejo inactivo no covalente que se denomina “miostatina latente”. La miostatina madura puede liberarse entonces a partir de miostatina latente a través de la degradación del propéptido. Los miembros de la familia de metaloproteinasas de la proteína morfogenética ósea 1 (BMP1) escinden un único enlace peptídico dentro del propéptido, Arg98-Asp99, con la liberación concomitante de miostatina madura activa, un homodímero (véase, por ejemplo, el documento no de patente 6). Además, la miostatina latente puede activarsein vitrodisociando el complejo con tratamiento o bien con ácido o bien térmico también (véase, por ejemplo, el documento no de patente 7).
[0008] La miostatina ejerce sus efectos a través de una familia de receptores de heterotetrámero de serina/treonina cinasa transmembrana, cuya activación mejora la transfosforilación del receptor, conduciendo a la estimulación de la actividad serina/treonina cinasa. Se ha demostrado que la ruta de miostatina implica una unión de dímero de miostatina activo al receptor de activina de tipo IIB (ActRIIB) con alta afinidad, que entonces recluta y activa la transfosforilación del receptor de baja afinidad, la cinasa de tipo activina 4 (ALK4) o cinasa de tipo activina 5 (ALK5). También se ha demostrado que las proteínas Smad2 y Smad3 se activan posteriormente y forman complejos con Smad4, que luego se translocan al núcleo para la activación de la transcripción de gen diana. Se ha demostrado que ActRIIB puede mediar en la influencia de la miostatinain vivo, ya que la expresión de una forma negativa dominante de ActRIIB en ratones imita la desactivación del gen de miostatina (véase, por ejemplo, el documento no de patente 8).
[0009] Varios trastornos o afecciones están asociados con desgaste muscular (es decir, pérdida o deterioro funcional del tejido muscular), tal como distrofia muscular (DM; incluyendo distrofia muscular de Duchenne), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), atrofia muscular, atrofia orgánica, fragilidad, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva (EPOC), sarcopenia, y caquexia resultante de cáncer u otros trastornos, así como enfermedad renal, insuficiencia o enfermedad cardiaca, y enfermedad hepática. Los pacientes se beneficiarán de un aumento de la masa muscular y/o la fuerza muscular; sin embargo, actualmente hay tratamientos limitados disponibles para estos trastornos. Por tanto, debido a su papel como regulador negativo del crecimiento de músculo esquelético, la miostatina se convierte en una diana deseable para la intervención terapéutica o profiláctica para tales trastornos o afecciones, o para monitorizar la evolución de tales trastornos o afecciones. En particular, los agentes que inhiben la actividad de miostatina pueden ser terapéuticamente beneficiosos.
[0011] La inhibición de la expresión de miostatina conduce tanto a hipertrofia como a hiperplasia muscular (documento no de patente 4). La miostatina regula negativamente la regeneración muscular después de una lesión y la falta de miostatina en ratones nulos para miostatina da como resultado una regeneración muscular acelerada (véase, por ejemplo, el documento no de patente 9). Se ha mostrado que los anticuerpos anti-miostatina (GDF8) descritos, por ejemplo, en el documento de patente 3, el documento de patente 4, el documento de patente 5, el documento de patente 6, y el documento de patente 7, y el documento de patente 8, el documento de patente 9, y el documento de patente 10 se unen a miostatina e inhiben la actividad de miostatinain vitroein vivo, incluyendo la actividad de miostatina asociada con la regulación negativa de la masa del músculo esquelético. Los anticuerpos neutralizantes de miostatina aumentan el peso corporal, la masa del músculo esquelético, y el tamaño y la fuerza muscular en el músculo esquelético de ratones silvestres (véase, por ejemplo, el documento no de patente 10) y los ratones mdx, un modelo para distrofia muscular (véanse, por ejemplo, el documento no de patente 11; el documento no de patente 12). Sin embargo, estos anticuerpos de la técnica anterior son todos específicos para miostatina madura pero no para miostatina latente, y las estrategias descritas para inhibir la actividad de miostatina han utilizado anticuerpos que pueden unirse a y neutralizar miostatina madura. El documento de patente 25 da a conocer anticuerpos IgG1 anti-pro/miostatina latente (parentales). El documento de patente 26 da a conocer un anticuerpo (SRK-015) que se une a miostatina latente e inhibe la segunda etapa de escisión mediada por Tolloid. El documento de patente 27 da a conocer anticuerpos que se unen a miostatina latente y la inhiben. El documento no de patente X da a conocer el barrido de anticuerpos como modalidad de anticuerpos terapéuticos que puede eliminar antígenos solubles de la circulación. El documento no de patente X da a conocer un mapeo del epítopo del anticuerpo SRK-015 al dominio beta-4.
[0013] Los anticuerpos están llamando la atención como productos farmacéuticos ya que son altamente estables en sangre y tienen pocos efectos secundarios (véanse, por ejemplo, el documento no de patente 13, y el documento no de patente 14). Casi todos los anticuerpos terapéuticos actualmente en el mercado son anticuerpos de la subclase IgG1 humana. Una de las funciones conocidas de los anticuerpos de clase IgG es la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (denominada más adelante en el presente documento actividad de ADCC) (véase, por ejemplo, el documento no de patente 15). Para que un anticuerpo presente actividad de ADCC, la región Fc del anticuerpo debe unirse a un receptor de Fc gamma (denominado más adelante en el presente documento Fc gamma R) que es un receptor de unión a anticuerpos presente en la superficie de células efectoras tales como linfocitos citolíticos, linfocitos citolíticos naturales, y macrófagos activados.
[0015] En seres humanos, las isoformas Fc gamma RIa (CD64A), Fc gamma RIIa (CD32A), Fc gamma RIIb (CD32B), Fc gamma RIIIa (CD16A), y Fc gamma RIIIb (CD16B) se han descrito como la familia de proteínas Fc gamma R, y también se han descrito los alotipos respectivos (véase, por ejemplo, el documento no de patente 16). Fc gamma RIa, Fc gamma RIIa, y Fc gamma RIIIa se denominan Fc gamma R activador puesto que tienen funciones inmunológicamente activas, y Fc gamma RIIb se denomina Fc gamma R inhibidor puesto que tiene funciones inmunosupresoras (véase, por ejemplo, el documento no de patente 17).
[0017] En la unión entre la región Fc y Fc gamma R, se ha demostrado que son importantes varios residuos de aminoácido en la región bisagra del anticuerpo y el dominio CH2, y una cadena de azúcar unida a Asn en la posición 297 (numeración de EU) unida al dominio CH2 (véanse, por ejemplo, el documento no de patente 18, el documento no de patente 19, y el documento no de patente 20). Hasta ahora se han estudiado diversas variantes que tienen propiedades de unión a Fc gamma R, principalmente anticuerpos con mutaciones introducidas en estos sitios; y se han obtenido variantes de región Fc que tienen mayores actividades de unión hacia Fc gamma R activador (véanse, por ejemplo, el documento de patente 11, el documento de patente 12, el documento de patente 13, y el documento de patente 14).
[0019] Cuando un Fc gamma R activador se reticula con un complejo inmunitario, fosforila motivos activadores basados en tirosina de inmunorreceptor (ITAM) contenidos en el dominio intracelular o cadena gamma común de FcR (una pareja de interacción), activa un transductor de señales SYK, y desencadena una respuesta inmunitaria inflamatoria iniciando una cascada de señales de activación (véase, por ejemplo, el documento no de patente 21).
[0021] Fc gamma RIIb es el único Fc gamma R expresado en células B (véase, por ejemplo, el documento no de patente 22). Se ha notificado que la interacción de la región Fc del anticuerpo con Fc gamma RIIb suprime la respuesta inmunitaria primaria de las células B (véase, por ejemplo, el documento no de patente 23). Además, se notifica que cuando Fc gamma RIIb en células B y el receptor de células B (BCR) se reticulan a través de un complejo inmunitario en sangre, se suprime la activación de células B y la producción de anticuerpos por células B (véase, por ejemplo, el documento no de patente 24). En esta transducción de señales de inmunosupresión mediada por BCR y Fc gamma RIIb, es necesario el motivo inhibidor basado en tirosina de inmunorreceptor (ITIM) contenido en el dominio intracelular de Fc gamma RIIb (véanse, por ejemplo, el documento no de patente 25, y el documento no de patente 26). Cuando se fosforila ITIM tras la señalización, se recluta inositol polifosfato-5-fosfatasa (SHIP) que contiene SH2, se inhibe la transducción de otras cascadas de señales de Fc gamma R activadora y se suprime la respuesta inmunitaria inflamatoria (véase, por ejemplo, el documento no de patente 27). Además, se ha notificado que la agregación de Fc gamma RIIb sólo suprime transitoriamente el flujo de entrada de calcio debido a la reticulación de BCR y la proliferación de células B de una manera independiente de BCR sin inducir apoptosis de células B productoras de IgM (véase, por ejemplo, el documento no de patente 28).
[0022] Fc gamma RIIb también se expresa en células dendríticas, macrófagos, neutrófilos activados, mastocitos, y basófilos. Fc gamma RIIb inhibe las funciones de Fc gamma R activador tales como fagocitosis y liberación de citocinas inflamatorias en estas células, y suprime respuestas inmunitarias inflamatorias (véase, por ejemplo, el documento no de patente 17).
[0023] La importancia de las funciones inmunosupresoras de Fc gamma RIIb se ha dilucidado hasta ahora a través de estudios que usan ratones deficientes en Fc gamma RIIb. Existen informes de que en ratones deficientes en Fc gamma RIIb, la inmunidad humoral no está regulada de manera apropiada (véase, por ejemplo, el documento no de patente 29), aumenta la sensibilidad hacia la artritis inducida por colágeno (AIC) (véase, por ejemplo, el documento no de patente 30), se presentan síntomas similares a lupus y se presentan síntomas similares al síndrome de Goodpasture (véase, por ejemplo, el documento no de patente 31).
[0024] Adicionalmente, se ha notificado que la deficiencia reguladora de Fc gamma RIIb está relacionada con enfermedades autoinmunitarias humanas. Por ejemplo, se ha notificado la relación entre polimorfismo genético en la región transmembrana y la región promotora de Fc gamma RIIb, y la frecuencia de desarrollo de lupus eritematoso sistémico (LES) (véanse, por ejemplo, el documento no de patente 32, el documento no de patente 33, el documento no de patente 34, el documento no de patente 35, y el documento no de patente 36) y la disminución de la expresión de Fc gamma RIIb en la superficie de células B en pacientes con LES (véanse, por ejemplo, el documento no de patente 37, y el documento no de patente 38).
[0025] A partir de modelos de ratón y hallazgos clínicos como tales, se considera que Fc gamma RIIb desempeña el papel de controlar enfermedades autoinmunitarias y enfermedades inflamatorias a través de la implicación en particular con las células B, y es una molécula diana prometedora para controlar enfermedades autoinmunitarias y enfermedades inflamatorias.
[0026] Se sabe que la IgG1, usada principalmente como anticuerpo terapéutico disponible comercialmente, se une no sólo a Fc gamma RIIb, sino también fuertemente a Fc gamma R activador (véase, por ejemplo, el documento no de patente 39). Puede ser posible desarrollar anticuerpos terapéuticos que tengan mayores propiedades inmunosupresoras en comparación con las de IgG1, utilizando una región Fc con unión mejorada a Fc gamma RIIb, o selectividad mejorada de unión a Fc gamma RIIb en comparación con Fc gamma R activador. Por ejemplo, se ha sugerido que el uso de un anticuerpo que tenga una región variable que se une a BCR y una Fc con unión mejorada a Fc gamma RIIb puede inhibir la activación de células B (véase, por ejemplo, el documento no de patente 40). Se ha notificado que la reticulación de Fc gamma RIIb en células B e IgE unida a un receptor de células B suprime la diferenciación de células B en células plasmáticas, lo que provoca como resultado la supresión de la producción de IgE; y en ratones a los que se trasplantan PBMC humanas, se mantienen las concentraciones de IgG e IgM humanas mientras que disminuye la concentración de IgE humana (véase, por ejemplo, el documento no de patente 41). Además de IgE, se ha notificado que cuando Fc gamma RIIB y CD79b, que es una molécula constituyente de un complejo receptor de células B, se reticulan mediante un anticuerpo, se suprime la proliferación de células Bin vitro, y se alivian los síntomas de artritis en el modelo de artritis por colágeno (véase, por ejemplo, el documento no de patente 42).
[0027] Además de las células B, se ha notificado que la reticulación de Fc épsilon RI y Fc gamma RIIb en mastocitos usando moléculas en las que la porción Fc de una IgG con unión mejorada a Fc gamma RIIb se fusiona a la porción Fc de IgE que se une a un receptor de IgE Fc épsilon RI, provoca la fosforilación de Fc gamma RIIb, suprimiendo de ese modo el flujo de entrada de calcio dependiente de Fc épsilon RI. Esto sugiere que es posible la inhibición de la desgranulación a través de la estimulación de Fc gamma RIIb, mejorando la unión a Fc gamma RIIb (véase, por ejemplo, el documento no de patente 43).
[0028] Por consiguiente, se sugiere que un anticuerpo que tiene una Fc con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada es prometedor como agente terapéutico para enfermedades inflamatorias tales como una enfermedad autoinmunitaria.
[0029] Además, se ha notificado que la activación de macrófagos y células dendríticas a través del receptor de tipo Toll 4 debido a la estimulación con LPS se suprime en presencia de un complejo inmunitario anticuerpo-antígeno, y también se sugiere que este efecto son acciones del complejo inmunitario a través de Fc gamma RIIb (véanse, por ejemplo, el documento no de patente 44, y el documento no de patente 45). Por tanto, se espera que el uso de anticuerpos con unión mejorada a Fc gamma RIIb permita la mejora de las acciones supresoras de señales de activación mediada por TLR; por tanto, se ha sugerido que tales anticuerpos son prometedores como agentes terapéuticos para enfermedades inflamatorias tales como enfermedades autoinmunitarias.
[0030] Adicionalmente, se ha sugerido que mutantes con unión mejorada a Fc gamma RIIb son agentes terapéuticos prometedores para el cáncer, así como agentes terapéuticos para enfermedades inflamatorias tales como enfermedades autoinmunitarias. Hasta ahora, se ha encontrado que Fc gamma RIIb desempeña un papel importante en la actividad agonista de anticuerpos agonistas contra la superfamilia de receptores anti-TNF. Específicamente, se ha sugerido que se requiere la interacción con Fc gamma RIIb para la actividad agonista de anticuerpos contra CD40, DR4, DR5, CD30 y CD137, que se incluyen en la familia de receptores de TNF (véanse, por ejemplo, el documento no de patente 46, el documento no de patente 47, el documento no de patente 48, el documento no de patente 49, el documento no de patente 50, el documento no de patente 51, y el documento no de patente 52). El documento no de patente 46 muestra que el uso de anticuerpos con unión mejorada a Fc gamma RIIb mejora el efecto antitumoral de anticuerpos anti-CD40. Por consiguiente, se espera que los anticuerpos con Fc gamma RIIb mejorado tengan un efecto de mejora de la actividad agonista de anticuerpos agonistas incluyendo anticuerpos contra la superfamilia de receptores anti-TNF.
[0032] Además, se ha demostrado que se suprime la proliferación celular cuando se usa un anticuerpo que reconoce Kit, un tipo de tirosina cinasa receptora (RTK), para reticular Fc gamma RIIb y Kit en células que expresan Kit. Se han notificado efectos similares incluso en casos en los que este Kit se activa de manera constitutiva y tiene mutaciones que provocan oncogénesis (véase, por ejemplo, el documento no de patente 53). Por tanto, se espera que el uso de anticuerpos con unión mejorada a Fc gamma RIIb pueda mejorar los efectos inhibidores en células que expresan RTK que tienen mutaciones activadas de manera constitutiva.
[0034] Se han notificado anticuerpos que tienen una Fc con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada (véase, por ejemplo, el documento no de patente 40). En este documento, la actividad de unión a Fc gamma RIIb se mejoró añadiendo alteraciones tales como S267E/L328F, G236D/S267E, y S239D/S267E a una región Fc de anticuerpo. Entre ellos, el anticuerpo al que se introdujo la mutación S267E/L328F se une más fuertemente a Fc gamma RIIb, y mantiene el mismo nivel de unión a Fc gamma RIa y Fc gamma RIIa tipo H en el que un residuo en la posición 131 de Fc gamma RIIa es His como el de una IgG1 que se produce de manera natural. Sin embargo, otro informe muestra que esta alteración mejora la unión a Fc gamma RIIa tipo R en la que un residuo en la posición 131 de Fc gamma RIIa es Arg varios cientos de veces al mismo nivel de unión a Fc gamma RIIb, lo que significa que la selectividad de unión a Fc gamma RIIb no mejora en comparación con Fc gamma RIIa tipo R (véase, por ejemplo, el documento de patente 15).
[0036] Sólo se considera que el efecto de mejorar la unión a Fc gamma RIIa y no la mejora de la unión a Fc gamma RIIb tiene influencia sobre células tales como plaquetas que expresan Fc gamma RIIa pero no expresan Fc gamma RIIb (véase, por ejemplo, el documento no de patente 17). Por ejemplo, se sabe que el grupo de pacientes a los que se administró bevacizumab, un anticuerpo contra VEGF, tiene un riesgo aumentado de tromboembolia (véase, por ejemplo, el documento no de patente 54). Además, se ha observado tromboembolia de manera similar en pruebas de desarrollo clínico de anticuerpos contra el ligando de CD40, y se interrumpió el estudio clínico (véase, por ejemplo, el documento no de patente 55). En ambos casos de estos anticuerpos, estudios posteriores usando modelos animales y similares han sugerido que los anticuerpos administrados agregan las plaquetas a través de la unión a Fc gamma RIIa en las plaquetas, y forman coágulos de sangre (véanse, por ejemplo, el documento no de patente 56, y el documento no de patente 57). En el lupus eritematoso sistémico que es una enfermedad autoinmunitaria, las plaquetas se activan a través de un mecanismo dependiente de Fc gamma RIIa, y se ha notificado que la activación de plaquetas se correlaciona con la intensidad de los síntomas (véase, por ejemplo, el documento no de patente 58). La administración de un anticuerpo con una unión a Fc gamma RIIa mejorada a tales pacientes que ya tienen un alto riesgo de desarrollar tromboembolia aumentará el riesgo de desarrollar tromboembolia, por lo que es extremadamente peligroso.
[0038] Además, se ha notificado que los anticuerpos con unión mejorada a Fc gamma RIIa mejoran la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos mediada por macrófagos (ADCP) (véase, por ejemplo, el documento no de patente 59). Cuando los antígenos que van a unirse por los anticuerpos se fagocitan por macrófagos, se considera que los propios anticuerpos también se fagocitan al mismo tiempo. Cuando los anticuerpos se administran como productos farmacéuticos, se supone que los fragmentos peptídicos derivados de los anticuerpos administrados también se presentan probablemente como antígeno, aumentando de ese modo el riesgo de producción de anticuerpos contra anticuerpos terapéuticos (anticuerpos anti-agentes terapéuticos). Más específicamente, la mejora de la unión a Fc gamma RIIa aumentará el riesgo de producción de anticuerpos contra los anticuerpos terapéuticos, y esto disminuirá notablemente su valor como productos farmacéuticos. Además, se ha sugerido que Fc gamma RIIb en células dendríticas contribuye a la tolerancia periférica inhibiendo la activación de células dendríticas provocada por complejos inmunitarios formados entre antígenos y anticuerpos, o suprimiendo la presentación de antígeno a células T por receptores Fc gamma activadores (véase, por ejemplo, el documento no de patente 60). Puesto que Fc gamma RIIa también se expresa en células dendríticas, cuando se usan anticuerpos que tienen una Fc con unión selectiva mejorada a Fc gamma RIIb como productos farmacéuticos, las células dendríticas no presentan fácilmente antígenos y esto debido a la unión selectiva mejorada a Fc gamma RIIb, y puede reducirse relativamente el riesgo de producción de anticuerpos anti-fármaco. Tales anticuerpos también pueden ser útiles a este respecto.
[0040] Más específicamente, se reducirá considerablemente el valor como productos farmacéuticos cuando se mejora la unión a Fc gamma RIIa, lo que conduce a un aumento del riesgo de formación de trombos a través de agregación plaquetaria y un aumento del riesgo de producción de anticuerpos anti-agentes terapéuticos debido a un aumento de la inmunogenicidad.
[0041] Desde tal punto de vista, la variante de Fc mencionada anteriormente con unión a Fc gamma RIIb mejorada muestra unión a Fc gamma RIIa de tipo-R mejorada significativamente en comparación con la de una IgG1 que se produce de manera natural. Por tanto, se reduce considerablemente su valor como producto farmacéutico para pacientes que portan Fc gamma RIIa de tipo R. Los tipos H y R de Fc gamma RIIa se observan en individuos de raza blanca y afroamericanos con aproximadamente la misma frecuencia (véanse, por ejemplo, el documento no de patente 61, y el documento no de patente 62). Por tanto, cuando se usó esta variante de Fc para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, será limitado el número de pacientes que pueden usarla de manera segura mientras disfrutan de sus efectos como producto farmacéutico.
[0042] Además, en células dendríticas deficientes en Fc gamma RIIb o células dendríticas en las que la interacción entre Fc gamma RIIb y la porción Fc del anticuerpo se inhibe por un anticuerpo anti-Fc gamma RIIb, se ha notificado que las células dendríticas maduran (véanse, por ejemplo, el documento no de patente 63, y el documento no de patente 64). Este informe sugiere que Fc gamma RIIb está suprimiendo activamente la maduración de células dendríticas en un estado estacionario donde la inflamación y tal no están teniendo lugar y la activación no tiene lugar. Fc gamma RIIa se expresa en la superficie de células dendríticas además de Fc gamma RIIb; por tanto, aunque se mejora la unión a Fc gamma RIIb inhibidor y si la unión a Fc gamma R activador tal como Fc gamma RIIa también se mejora, puede promoverse la maduración de las células dendríticas como resultado. Más específicamente, se considera que es importante mejorar no sólo la actividad de unión a Fc gamma RIIb sino también la razón de actividad de unión a Fc gamma RIIb con respecto a actividad de unión a Fc gamma RIIa para proporcionar anticuerpos con una acción inmunosupresora.
[0043] Por tanto, cuando se considera la generación de un producto farmacéutico que utiliza la acción inmunosupresora mediada por la unión a Fc gamma RIIb, existe la necesidad de una variante de Fc que no sólo tenga actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada, sino que también tenga unión a ambos alotipos, los tipos H y R de Fc gamma RIIa, que se mantenga a un nivel similar o se debilite a un nivel más bajo que el de una IgG1 que se produce de manera natural.
[0044] Mientras tanto, se han notificado hasta ahora casos en los que se introdujeron alteraciones de aminoácido en la región Fc para aumentar la selectividad de unión a Fc gamma RIIb (véase, por ejemplo, el documento no de patente 65). Sin embargo, todas las variantes que se dice que tienen selectividad para Fc gamma RIIb mejorada tal como se notifica en este documento mostraron una unión a Fc gamma RIIb disminuida en comparación con la de una IgG1 que se produce de manera natural. Por tanto, se considera que es difícil para estas variantes induzcan realmente una reacción inmunosupresora mediada por Fc gamma RIIb más fuertemente que IgG1.
[0045] Además, puesto que Fc gamma RIIb desempeña un papel importante en los anticuerpos agonistas mencionados anteriormente, se espera que mejorar su actividad de unión mejore la actividad agonista. Sin embargo, cuando la unión a Fc gamma RIIa se mejora de manera similar, se mostrarán actividades no intencionadas tales como actividad de ADCC y actividad de ADCP, y esto puede provocar efectos secundarios. También desde tal punto de vista, es preferible poder mejorar selectivamente la actividad de unión a Fc gamma RIIb.
[0046] A partir de estos resultados, en la producción de anticuerpos terapéuticos que van a usarse para tratar enfermedades autoinmunitarias y cáncer utilizando Fc gamma RIIb, es importante que en comparación con las de una IgG que se produce de manera natural, se mantengan o disminuyan las actividades de unión a ambos alotipos de Fc gamma RIIa, y se mejore la unión a Fc gamma RIIb. Sin embargo, Fc gamma RIIb comparte el 93 % de identidad de secuencia en la región extracelular con la de Fc gamma RIIa que es uno de los Fc gamma R activadores, y son muy similares estructuralmente. Existen alotipos de Fc gamma RIIa, tipo H y tipo R, en los que el aminoácido en la posición 131 es His (tipo H) o Arg (tipo R), y aún cada uno de ellos reacciona de manera diferente con los anticuerpos (véase, por ejemplo, el documento no de patente 66). Por tanto, el problema difícil puede ser producir una variante de la región Fc con una unión selectiva mejorada a Fc gamma RIIb en comparación con cada alotipo de Fc gamma RIIa, que implica distinguir secuencias altamente homólogas entre Fc gamma RIIa y Fc gamma RIIb. A pesar de esas dificultades, hasta ahora se han identificado varias variantes de la región Fc, que tienen actividad de unión selectiva para Fc gamma RIIb en comparación con Fc gamma RIIa, llevando a cabo un análisis exhaustivo de modificación de aminoácidos en la región Fc (véanse, por ejemplo, el documento de patente 16, el documento de patente 17, el documento de patente 18, el documento de patente 19, y el documento de patente 20). Ha habido un informe sobre una variante de la región Fc con selectividad de unión para Fc gamma RIIb en relación con Fc gamma R humano hasta ahora, mientras que no ha habido ningún informe sobre una variante de la región Fc con selectividad de unión para Fc gamma RIIb en relación con Fc gamma R de mono. Debido a la ausencia de tal variante de Fc, los efectos de la variante de Fc que se une selectivamente a Fc gamma RIIb no se han sometido aún a prueba exhaustivamente en mono.
[0047] Aparte de lo anterior, se notifica que modificando la carga de residuos de aminoácido que pueden quedar expuestos en la superficie de un anticuerpo para aumentar o disminuir el punto isoeléctrico (pI) del anticuerpo, es posible regular la semivida del anticuerpo en sangre (véanse, por ejemplo, el documento de patente 21, y el documento de patente 22). Muestran que es posible prolongar la semivida en plasma de un anticuerpo reduciendo el pI del anticuerpo y viceversa.
[0048] Además, se notifica que puede promoverse la incorporación de un antígeno en las células modificando la carga de residuos de aminoácido especificados, particularmente en su dominio CH3, para aumentar el pl del anticuerpo (véase, por ejemplo, el documento de patente 23). Además, se ha notificado que la modificación de la carga de residuos de aminoácido en la región constante (principalmente dominio CH1) de un anticuerpo para reducir el pl puede prolongar la semivida del anticuerpo en plasma (véase, por ejemplo, el documento de patente 24).
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[0239] Compendio de la invención
[0240] Problema técnico
[0241] Un objetivo de la invención es proporcionar anticuerpos anti-miostatina, anticuerpos que contienen regiones Fc variantes, y métodos de usar los mismos.
[0242] Solución al problema
[0243] La descripción proporciona anticuerpos anti-miostatina y métodos de usar los mismos. La descripción también proporciona proteínas que contienen una región Fc variante y métodos de usar las mismas. La invención se expone en el juego adjunto de reivindicaciones
[0244] Un anticuerpo anti-miostatina aislado de la presente invención se une a miostatina latente. En realizaciones adicionales, el anticuerpo se une a un epítopo dentro de un fragmento que consiste en los aminoácidos 21-100 del propéptido de miostatina (SEQ ID NO: 78). Un anticuerpo anti-miostatina aislado de la presente invención inhibe la activación de miostatina. En realizaciones adicionales, el anticuerpo bloquea la liberación de miostatina madura a partir de miostatina latente. En realizaciones adicionales, el anticuerpo bloquea la liberación proteolítica de miostatina madura. En realizaciones adicionales, el anticuerpo bloquea la liberación espontánea de miostatina madura. En realizaciones adicionales, el anticuerpo no se une a miostatina madura. En realizaciones adicionales, el anticuerpo se une al mismo epítopo que un anticuerpo descrito en la tabla 13. En realizaciones adicionales, el anticuerpo se une al mismo epítopo que un anticuerpo que comprende un par de VH y VL descrito en la tabla 13. En realizaciones adicionales, el anticuerpo se une al mismo epítopo que un anticuerpo descrito en la tabla 2a. En realizaciones adicionales, el anticuerpo se une al mismo epítopo que un anticuerpo que comprende un par de VH y VL descrito en la tabla 2a. En realizaciones adicionales, el anticuerpo se une al mismo epítopo que un anticuerpo descrito en la tabla 11a. En realizaciones adicionales, el anticuerpo se une al mismo epítopo que un anticuerpo que comprende un par de VH y VL descrito en la tabla 11a. En realizaciones adicionales, el anticuerpo se une al mismo epítopo que un anticuerpo descrito en la tabla 2a, 11a, o 13. En realizaciones adicionales, el anticuerpo se une al mismo epítopo que un anticuerpo que comprende un par de VH y VL descrito en la tabla 2a, 11a, o 13.
[0245] En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-miostatina aislado de la presente invención se une a miostatina latente con mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-miostatina se une a miostatina latente con mayor afinidad a pH 7,4 que a pH 5,8. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-miostatina aislado de la presente invención se une a un fragmento de polipéptido que consiste en los aminoácidos 21-100 del propéptido de miostatina (SEQ ID NO: 78) con mayor afinidad a pH 7,4 que a pH 5,8. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une al mismo epítopo de miostatina que un anticuerpo descrito en la tabla 13 con una mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido. En realizaciones adicionales, un anticuerpo anti-miostatina se une al mismo epítopo que un anticuerpo descrito en la tabla 13 con una mayor afinidad a pH 7,4 que a pH 5,8. En realizaciones adicionales, el anticuerpo se une al mismo epítopo que un anticuerpo que comprende un par de VH y VL descrito en la tabla 13 con una mayor afinidad a pH 7,4 que a pH 5,8. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une al mismo epítopo de miostatina que un anticuerpo descrito en la tabla 2a con una mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une al mismo epítopo de miostatina que un anticuerpo descrito en la tabla 2a con una mayor afinidad a pH 7,4 que a pH 5,8. En realizaciones adicionales, el anticuerpo se une al mismo epítopo que un anticuerpo que comprende un par de VH y VL descrito en la tabla 2a con una mayor afinidad a pH 7,4 que a pH 5,8. En realizaciones adicionales, un anticuerpo anti-miostatina se une al mismo epítopo que un anticuerpo descrito en la tabla 11a con una mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido. En realizaciones adicionales, el anticuerpo se une al mismo epítopo de miostatina que un anticuerpo descrito en la tabla 11a con una mayor afinidad a pH 7,4 que a pH 5,8. En realizaciones adicionales, el anticuerpo se une al mismo epítopo que un anticuerpo que comprende un par de VH y VL descrito en la tabla 11a con una mayor afinidad a pH 7,4 que a pH 5,8. En realizaciones adicionales, un anticuerpo anti-miostatina se une al mismo epítopo que un anticuerpo descrito en la tabla 2a, 11a, o 13 con una mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido. En realizaciones adicionales, el anticuerpo se une al mismo epítopo de miostatina que un anticuerpo descrito en la tabla 2a, 11a, o 13 con una mayor afinidad a pH 7,4 que a pH 5,8. En realizaciones adicionales, el anticuerpo se une al mismo epítopo que un anticuerpo que comprende un par de VH y VL descrito en la tabla 2a, 11a, o 13 con una mayor afinidad a pH 7,4 que a pH 5,8.
[0247] En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-miostatina aislado de la presente invención compite por la unión a miostatina latente con un anticuerpo proporcionado en el presente documento. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-miostatina aislado de la presente invención compite por la unión a miostatina latente con un anticuerpo descrito en la tabla 13. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-miostatina aislado de la presente invención compite por la unión a miostatina latente con un anticuerpo que comprende un par de VH y VL descrito en la tabla 13. En algunas realizaciones, el anticuerpo compite por la unión a miostatina latente con un anticuerpo descrito en la tabla 2a. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-miostatina aislado de la presente invención compite por la unión a miostatina latente con un anticuerpo que comprende un par de VH y VL descrito en la tabla 2a. En algunas realizaciones, el anticuerpo compite por la unión a miostatina latente con un anticuerpo descrito en la tabla 11a. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-miostatina aislado de la presente invención compite por la unión a miostatina latente con un anticuerpo que comprende un par de VH y VL descrito en la tabla 11a. En realizaciones adicionales, un anticuerpo anti-miostatina compite por la unión a miostatina latente con un anticuerpo descrito en la tabla 2a, 11a, o 13. En realizaciones adicionales, un anticuerpo anti-miostatina compite por la unión a miostatina latente con un anticuerpo que comprende un par de VH y VL descrito en la tabla 2a, 11a, o 13. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-miostatina se une a miostatina latente con una mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-miostatina se une a miostatina latente con una mayor afinidad a pH 7,4 que a pH 5,8. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-miostatina se une a un fragmento de polipéptido que consiste en los aminoácidos 21-100 del propéptido de miostatina (SEQ ID NO: 78) con mayor afinidad a pH 7,4 que a pH 5,8. Se describen métodos para evaluar la capacidad de un anticuerpo para competir con un anticuerpo de referencia por la unión a miostatina latente en el presente documento y se conocen en la técnica.
[0249] En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-miostatina aislado de la presente invención es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-miostatina aislado de la presente invención es un anticuerpo humano, humanizado, o quimérico. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-miostatina aislado de la presente invención es un fragmento de anticuerpo que se une a miostatina latente. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-miostatina aislado de la presente invención es un fragmento de anticuerpo que se une a un fragmento de polipéptido que consiste en los aminoácidos 21-100 del propéptido de miostatina (SEQ ID NO: 78). En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-miostatina aislado de la presente invención es un anticuerpo IgG de longitud completa.
[0251] En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-miostatina de la divulgación comprende:
[0253] (a) (i) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos GVPAX<1>SX<2>GGDX<3>, en la que X<1>es Y o H, X<2>es T o H, X<3>es L o K (SEQ ID NO: 128), (ii) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos AGGYGGGX<1>YA, en la que X<1>es L o R (SEQ ID NO: 131), y (iii) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos IISX<1>AGX<2>X<3>YX<4>X<3>X<6>WAKX<7>, en la que X<1>es Y o H, X<2>es S o K, X<3>es T, M o K, X<4>es Y o K, X<3>es A, M o E, X<6>es S o E, X<7>es G o K (SEQ ID NO: 127);
[0255] (b) (i) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos X<1>X<2>DIS, en la que X<1>es S o H, X<2>es Y, T, D o E (SEQ ID NO: 126), (ii) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos IISX<1>AGX<2>X<3>YX<4>X<3>X<6>WAKX<7>, en la que X<1>es Y o H, X<2>es S o K, X<3>es T, M o K, X<4>es Y o K, X<3>es A, M o E, X<6>es S o E, X<7>es G o K (SEQ ID NO: 127), y (iii) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos GVPAX<1>SX<2>GGDX<3>, en la que X<1>es Y o H, X<2>es T o H, X<3>es L o K (SEQ ID NO: 128);
[0257] (c) (i) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos X<1>X<2>DIS, en la que X<1>es S o H, X<2>es Y, T, D o E (SEQ ID NO: 126), (ii) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos IISX<1>AGX<2>X<3>YX<4>X<3>X<6>WAKX<7>, en la que X<1>es Y o H, X<2>es S o K, X<3>es T, M o K, X<4>es Y o K, X<3>es A, M o E, X<6>es S o E, X<7>es G o K (SEQ ID NO: 127), (iii) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos GVPAX<1>SX<2>GGDX<3>, en la que X<1>es Y o H, X<2>es T o H, X<3>es L o K (SEQ ID NO: 128), (iv) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos X<1>X<2>SQX<3>VX<4>X<5>X<6>NWLS, en la que X<1>es Q o T, X<2>es S o T, X<3>es S o E, X<4>es Y o F, X<3>es D o H, X<6>es N, D, A o E (SEQ ID NO: 129); (v) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos WAX<1>TLAX<2>, en la que X<1>es S o E, X<2>es S, Y, F o W (SEQ ID NO: 130); y (vi) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos AGGYGGGX<1>YA, en la que X<1>es L o R (SEQ ID NO: 131);
[0258] (d) (i) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos X<1>X<2>SQX<3>VX<4>X<3>X<6>NWLS, en la que X<1>es Q o T, X<2>es S o T, X<3>es S o E, X<4>es Y o F, X<3>es D o H, X<6>es N, D, A o E (SEQ ID NO: 129); (ii) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos WAX<1>TLAX<2>, en la que X<1>es S o E, X<2>es S, Y, F o W (SEQ ID NO: 130); y (iii) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos AGGYGGGX<1>YA, en la que X<1>es L o R (SEQ ID NO: 131). En algunas realizaciones el anticuerpo de (b) comprende además una región de marco de dominio variable de cadena pesada FR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 132-134; FR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 135-136; FR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 137; y FR4 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 138. En algunas realizaciones, el anticuerpo de (d), comprende además una región de marco de dominio variable de cadena ligera FR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 139; FR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 140-141; FR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 142-143; y FR4 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 144.
[0260] En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-miostatina aislado de la presente divulgación comprende (a) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos GVPAX<1>SX<2>GGDX<3>, en la que X<1>es Y o H, X<2>es T o H, X<3>es L o K (SEQ ID NO: 128), (b) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos AGGYGGGX<1>YA, en la que X<1>es L o R (SEQ ID NO: 131), y (c) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos IISX<1>AGX<2>X<3>YX<4>X<5>X<6>WAKX<7>, en la que X<1>es Y o H, X<2>es S o K, X<3>es T, M o K, X<4>es Y o K, X<5>es A, M o E, X<6>es S o E, X<7>es G o K (SEQ ID NO: 127).
[0262] En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-miostatina aislado de la presente divulgación comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos X<1>X<2>DIS, en la que X<1>es S o H, X<2>es Y, T, D o E (SEQ ID NO: 126), (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos IISX<1>AGX<2>X<3>YX<4>X<5>X<6>WAKX<7>, en la que X<1>es Y o H, X<2>es S o K, X<3>es T, M o K, X<4>es Y o K, X<5>es A, M o E, X<6>es S o E, X<7>es G o K (SEQ ID NO: 127), y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos GVPAX<1>SX<2>GGDX<3>, en la que X<1>es Y o H, X<2>es T o H, X<3>es L o K (SEQ ID NO: 128). En realizaciones adicionales, el anticuerpo comprende una región de marco de dominio variable de cadena pesada FR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 132-134; FR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 135-136; FR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 137; y FR4 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 138. En realizaciones adicionales, el anticuerpo comprende adicionalmente (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos X<1>X<2>SQX<3>VX<4>X<5>X<6>NWLS, en la que X<1>es Q o T, X<2>es S o T, X<3>es S o E, X<4>es Y o F, X<5>es D o H, X<6>es N, D, A o E (SEQ ID NO: 129); (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos WAX<1>TLAX<2>, en la que X<1>es S o E, X<2>es S, Y, F o W (SEQ ID NO: 130); y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos AGGYGGGX<1>YA, en la que X<1>es L o R (SEQ ID NO: 131).
[0264] En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-miostatina aislado de la presente divulgación comprende (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos X<1>X<2>SQX<3>VX<4>X<5>X<6>NWLS, en la que X<1>es Q o T, X<2>es S o T, X<3>es S o E, X<4>es Y o F, X<5>es D o H, X<6>es N, D, A o E (SEQ ID NO: 129); (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos WAX<1>TLAX<2>, en la que X<1>es S o E, X<2>es S, Y, F o W (SEQ ID NO: 130); y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos AGGYGGGX<1>YA, en la que X<1>es L o R (SEQ ID NO: 131). En una realización adicional, el anticuerpo comprende además una región de marco de dominio variable de cadena ligera FR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 139; FR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 140-141; FR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 142-143; y FR4 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 144.
[0266] En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-miostatina aislado de la presente divulgación comprende una región de marco de dominio variable de cadena pesada FR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 132-134; FR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 135-136; FR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 137; y FR4 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 138. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-miostatina aislado de la presente divulgación comprende una región de marco de dominio variable de cadena ligera FR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 139; FR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 140-141; FR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 142-143; y FR4 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 144.
[0268] Un anticuerpo anti-miostatina aislado de la presente divulgación comprende (a) una secuencia de VH que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 16-30, 32-34, y 86-95; (b) una secuencia de VL que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 15, 31, 35-38, y 96-99; o (c) una secuencia de VH como en (a) y una secuencia de VL como en (b). En realizaciones adicionales, el anticuerpo comprende una secuencia de VH de una cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 16-30, 32-34, y 86-95. En realizaciones adicionales, el anticuerpo comprende una secuencia de VL de una cualquiera de las SEQ ID NO: 15, 31, 35-38, y 96-99. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia de VH de una cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 16-30, 32-34, y 86-95. En realizaciones adicionales, el anticuerpo comprende una secuencia de VH de una cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 16-30, 32-34, y 86-95; y una secuencia de VL de una cualquiera de las SEQ ID NO: 15, 31, 35-38, y 96-99.
[0269] En la presente invención, el anticuerpo que se une a miostatina latente e inhibe la activación de miostatina comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO: 86 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 96; o una secuencia de VH de SEQ ID NO: 87 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 96; o una secuencia de VH de SEQ ID NO: 88 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 96; o una secuencia de VH de SEQ ID NO: 89 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 96; o una secuencia de VH de SEQ ID NO: 90 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 96; o una secuencia de VH de SEQ ID NO: 91 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 96; o una secuencia de VH de SEQ ID NO: 92 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 97; o una secuencia de VH de SEQ ID NO: 93 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 97; o una secuencia de VH de SEQ ID NO: 94 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 97; o una secuencia de VH de SEQ ID NO: 95 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 97, y es para su uso en el tratamiento de una enfermedad de desgaste muscular.
[0270] La divulgación también proporciona ácidos nucleicos aislados que codifican para un anticuerpo anti-miostatina de la presente invención. La divulgación también proporciona células huésped que comprenden un ácido nucleico de la presente invención. La divulgación también proporciona un método de producir un anticuerpo que comprende cultivar una célula huésped de la presente divulgación de modo que se produzca el anticuerpo.
[0271] En algunos aspectos, la divulgación proporciona un método de producir un anticuerpo anti-miostatina de la invención que comprende: (a) cultivar una célula huésped de la presente divulgación de modo que se produzca el anticuerpo; o (b) inmunizar a un animal frente a un polipéptido, en el que el polipéptido comprende la región correspondiente a los aminoácidos en las posiciones 21 a 100 del propéptido de miostatina (SEQ ID NO: 78).
[0272] La divulgación proporciona además un método de producir un anticuerpo anti-miostatina. En algunas realizaciones, el método comprende inmunizar a un animal frente a un polipéptido, en el que el polipéptido comprende la región correspondiente a los aminoácidos en las posiciones 21-100 del propéptido de miostatina (SEQ ID NO: 78).
[0273] La divulgación también proporciona una formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-miostatina de la presente invención y un grupo transportador farmacéuticamente aceptable.
[0274] Anticuerpos anti-miostatina de la presente invención pueden ser para su uso como medicamento. En algunas realizaciones, el anticuerpo se usa en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad de desgaste muscular. En algunas realizaciones que están presentes únicamente con fines de ilustración el anticuerpo se usa en la fabricación de un medicamento para (a) aumentar la masa de tejido muscular; (b) aumentar la fuerza de tejido muscular; o (c) reducir la acumulación de grasa corporal. En algunas realizaciones que están presentes únicamente con fines de ilustración, anticuerpos anti-miostatina de la presente divulgación pueden ser para su uso en el tratamiento de una enfermedad de desgaste muscular. En algunas realizaciones que están presentes únicamente con fines de ilustración anticuerpos anti-miostatina de la presente divulgación pueden ser para su uso en aumentar la masa de tejido muscular. En algunas realizaciones que están presentes únicamente con fines de ilustración anticuerpos anti-miostatina de la presente divulgación pueden ser para su uso en aumentar la fuerza de tejido muscular. En algunas realizaciones que están presentes únicamente con fines de ilustración anticuerpos antimiostatina de la presente divulgación pueden ser para su uso en reducir la acumulación de grasa corporal.
[0275] Un anticuerpo anti-miostatina proporcionado en el presente documento tiene uso en el tratamiento de una enfermedad de desgaste muscular. En algunas realizaciones que están presentes únicamente con fines de ilustración un anticuerpo anti-miostatina de la divulgación tiene uso en: (a) aumentar la masa de tejido muscular; (b) aumentar la fuerza de tejido muscular; o (c) reducir la acumulación de grasa corporal.
[0276] Anticuerpos anti-miostatina de la presente invención pueden usarse en la fabricación de un medicamento. El anticuerpo de la presente invención se usa en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad de desgaste muscular. En algunas realizaciones que están presentes únicamente con fines de ilustración un anticuerpo de la divulgación se usa en la fabricación de un medicamento para (a) aumentar la masa de tejido muscular; (b) aumentar la fuerza de tejido muscular; o (c) reducir la acumulación de grasa corporal. En algunas realizaciones, el medicamento es para el tratamiento de una enfermedad de desgaste muscular. En algunas realizaciones que están presentes únicamente con fines de ilustración, el medicamento es para aumentar la masa de tejido muscular. En algunas realizaciones que están presentes únicamente con fines de ilustración, el medicamento es para aumentar la fuerza de tejido muscular. En algunas realizaciones que están presentes únicamente con fines de ilustración, el medicamento es para reducir la acumulación de grasa corporal.
[0277] La divulgación también proporciona un método de tratar a un individuo que tiene una enfermedad de desgaste muscular. En algunas realizaciones, el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-miostatina de la presente invención. En algunas realizaciones que están presentes únicamente con fines de ilustración la divulgación también proporciona un método de aumentar la masa de tejido muscular en un individuo. En algunas realizaciones, el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-miostatina de la presente divulgación para aumentar la masa de tejido muscular. En algunas realizaciones que están presentes únicamente con fines de ilustración la divulgación también proporciona un método de aumentar la fuerza de tejido muscular en un individuo. En algunas realizaciones, el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-miostatina de la presente divulgación para aumentar la fuerza de tejido muscular. En algunas realizaciones que están presentes únicamente con fines de ilustración la divulgación también proporciona un método de reducir la acumulación de grasa corporal en un individuo. En algunas realizaciones, el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-miostatina de la presente divulgación para reducir la acumulación de grasa corporal.
[0278] Se proporcionan específicamente:
[0279] [1] Un anticuerpo que se une a miostatina latente e inhibe la activación de miostatina, en el que el anticuerpo comprende:
[0280] (a) una secuencia de VH de SEQ ID NO: 86 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 96; o
[0281] (b) una secuencia de VH de SEQ ID NO: 87 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 96; o
[0282] (c) una secuencia de VH de SEQ ID NO: 88 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 96; o
[0283] (d) una secuencia de VH de SEQ ID NO: 89 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 96; o
[0284] (e) una secuencia de VH de SEQ ID NO: 90 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 96; o
[0285] (f) una secuencia de VH de SEQ ID NO: 91 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 96; o
[0286] (g) una secuencia de VH de SEQ ID NO: 92 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 97; o
[0287] (h) una secuencia de VH de SEQ ID NO: 93 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 97; o
[0288] (i) una secuencia de VH de SEQ ID NO: 94 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 97; o
[0289] (j) una secuencia de VH de SEQ ID NO: 95 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 97, y en el que el anticuerpo es para su uso en el tratamiento de una enfermedad de desgaste muscular.
[0290] [2] El anticuerpo para su uso del punto [1], en el que el anticuerpo es un anticuerpo IgG de longitud completa.
[0291] La invención proporciona anticuerpos que comprenden regiones Fc variantes y métodos de producir y usar los mismos.
[0292] En una realización, la invención proporciona anticuerpos de unión a Fc gamma RIIB que comprenden regiones Fc variantes y métodos de usar los mismos. En algunas realizaciones, una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada de la presente invención comprende al menos una alteración de aminoácido en una región Fc parental. En realizaciones adicionales, la razón de [valor de KD de la región Fc parental para Fc gamma RIIb de mono]/[valor de KD de la región Fc variante para Fc gamma RIIb de mono] es de 2,0 o mayor. En realizaciones adicionales, la razón de [valor de KD de la región Fc parental para Fc gamma RIIIa de mono]/[valor de KD de la región Fc variante para Fc gamma RIIIa de mono] es de 0,5 o menor. En realizaciones adicionales, la razón de [valor de KD de la región Fc parental para Fc gamma RIIb humano]/[valor de KD de la región Fc variante para Fc gamma RIIb humano] es de 2,0 o mayor. En realizaciones adicionales, la razón de [valor de KD de la región Fc parental para Fc gamma RIIIa humano]/[valor de KD de la región Fc variante para Fc gamma RIIIa humano] es de 0,5 o menor. En realizaciones adicionales, la razón de [valor de KD de la región Fc parental para Fc gamma RIIa humano (tipo H)]/[valor de KD de la región Fc variante para Fc gamma RIIa humano (tipo H)] es de 5,0 o menor. En realizaciones adicionales, la razón de [valor de KD de la región Fc parental para Fc gamma RIIa humano (tipo R)]/[valor de KD de la región Fc variante para Fc gamma RIIa humano (tipo R)] es de 5,0 o menor. En otra realización, el valor de KD de la región Fc variante para Fc gamma RIIb de mono es 1,0 x 10<-6>M o menor. En otra realización, el valor de KD de la región Fc variante para Fc gamma RIIIa de mono es de 5,0 x 10<-7>M o mayor. En otra realización, el valor de KD de la región Fc variante para Fc gamma RIIb humano es 2,0 x 10<-6>M o menor. En otra realización, el valor de KD de la región Fc variante para Fc gamma RIIIa humano es 1,0 x 10<-6>M o mayor. En otra realización, el valor de KD de la región Fc variante para Fc gamma RIIa humano (tipo H) es 1,0 x 10<-7>M o mayor. En otra realización, el valor de KD de la región Fc variante para Fc gamma RIIa humano (tipo R) es 2,0 x 10<-7>M o mayor.
[0293] En algunas realizaciones, una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada en un anticuerpo de la presente invención comprende al menos una alteración de aminoácido de al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en: 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 264, 266, 267, 268, 271, 295, 298, 325, 326, 327, 328, 330, 331, 332, 334, y 396, según la numeración de EU.
[0294] En realizaciones adicionales, la región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada comprende al menos dos alteraciones de aminoácido que comprenden: (a) una alteración de aminoácido en la posición 236, y (b) al menos una alteración de aminoácido de al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en: (i) las posiciones 231, 232, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 264, 266, 267, 268, 271, 295, 298, 325, 326, 327, 328, 330, 331, 332, 334, y 396; (ii) las posiciones: 231, 232, 235, 239, 268, 295, 298, 326, 330, y 396; o (iii) las posiciones 268, 295, 326, y 330; según la numeración de EU.
[0295] En realizaciones adicionales, la región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada comprende al menos dos alteraciones de aminoácido que comprenden: (a) una alteración de aminoácido en la posición 236, y (b) al menos una alteración de aminoácido de al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en: 231, 232, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 264, 266, 267, 268, 271, 295, 298, 325, 326, 327, 328, 330, 331, 332, 334, y 396, según la numeración de EU.
[0296] En realizaciones adicionales, la región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada comprende al menos dos alteraciones de aminoácido que comprenden: (a) una alteración de aminoácido en la posición 236, y (b) al menos una alteración de aminoácido de al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en: 231, 232, 235, 239, 268, 295, 298, 326, 330, y 396, según la numeración de EU.
[0297] En realizaciones adicionales, la región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada comprende al menos dos alteraciones de aminoácido que comprenden: (a) una alteración de aminoácido en la posición 236, y (b) al menos una alteración de aminoácido de al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en: 268, 295, 326, y 330 según la numeración de EU.
[0298] En algunas realizaciones, una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada en un anticuerpo de la presente invención comprende al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: (a) Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr en la posición 231; (b) Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr en la posición 232; (c) Asp en la posición 233; (d) Trp, Tyr en la posición 234; (e) Trp en la posición 235; (f) Ala, Asp, Glu, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Ser, Thr, Val en la posición 236; (g) Asp, Tyr en la posición 237; (h) Glu, Ile, Met, Gln, Tyr en la posición 238; (i) Ile, Leu, Asn, Pro, Val en la posición 239; (j) Ile en la posición 264; (k) Phe en la posición 266; (1) Ala, His, Leu en la posición 267; (m) Asp, Glu en la posición 268; (n) Asp, Glu, Gly en la posición 271; (o) Leu en la posición 295; (p) Leu en la posición 298; (q) Glu, Phe, Ile, Leu en la posición 325; (r) Thr en la posición 326; (s) Ile, Asn en la posición 327; (t) Thr en la posición 328; (u) Lys, Arg en la posición 330; (v) Glu en la posición 331; (w) Asp en la posición 332; (x) Asp, Ile, Met, Val, Tyr en la posición 334; y (y) Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr en la posición 396; según la numeración de EU.
[0299] En realizaciones adicionales, la región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada comprende al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: (a) Gly, Thr en la posición 231; (b) Asp en la posición 232; (c) Trp en la posición 235; (d) Asn, Thr en la posición 236; (e) Val en la posición 239; (f) Asp, Glu en la posición 268; (g) Leu en la posición 295; (h) Leu en la posición 298; (i) Thr en la posición 326; (j) Lys, Arg en la posición 330, y (k) Lys, Met en la posición 396; según la numeración de EU.
[0300] En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región Fc variante con punto isoeléctrico (pI) aumentado y un método de usar el mismo. En algunas realizaciones, un anticuerpo que comprende una región Fc variante con pI aumentado comprende al menos dos alteraciones de aminoácido en una región Fc parental. En realizaciones adicionales, cada una de las alteraciones de aminoácido aumenta el punto isoeléctrico (pI) de la región Fc variante en comparación con el de la región Fc parental. En realizaciones adicionales, el aminoácido puede estar expuesto en la superficie de la región Fc variante. En realizaciones adicionales, un anticuerpo comprende la región Fc variante y un dominio de unión a antígeno. En realizaciones adicionales, la actividad de unión a antígeno del dominio de unión a antígeno cambia según las condiciones de concentración iónica. En realizaciones adicionales, la región Fc variante con pI aumentado en un anticuerpo de la presente invención comprende al menos dos alteraciones de aminoácido de al menos dos posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: 285, 311, 312, 315, 318, 333, 335, 337, 341, 342, 343, 384, 385, 388, 390, 399, 400, 401, 402, 413, 420, 422, y 431 según la numeración de EU. En realizaciones adicionales, la región Fc variante con pI aumentado comprende Arg o Lys en cada una de las posiciones seleccionadas.
[0301] En algunas realizaciones, una región Fc variante en un anticuerpo de la presente invención comprende alteraciones de aminoácido descritas en las tablas 14-30.
[0302] En algunas realizaciones, un anticuerpo comprende una región Fc variante de la presente divulgación. En realizaciones adicionales, la región Fc parental se deriva de IgG1 humana. En realizaciones adicionales, el polipéptido es un anticuerpo. En realizaciones adicionales que están presentes únicamente con fines de ilustración, el polipéptido es una proteína de fusión de Fc.
[0303] La invención proporciona un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 229-381.
[0304] La divulgación también proporciona ácido nucleico aislado que codifica para el anticuerpo que comprende una región Fc variante de la presente invención. La divulgación también proporciona una célula huésped que comprende el ácido nucleico de la presente divulgación. La divulgación también proporciona un método de producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante que comprende cultivar el huésped de la presente divulgación de modo que se produzca el anticuerpo.
[0305] La invención proporciona además una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo que comprende una región Fc variante de la presente invención y un grupo transportador farmacéuticamente aceptable.
[0306] Breve descripción de los dibujos
[0307] [Fig.1]
[0308] La figura 1 ilustra la inhibición de la activación proteolítica de miostatina latente por el anticuerpo anti-miostatina latente, tal como se describe en el ejemplo 3. Se midió la actividad de miostatina activa liberada a partir de miostatina latente por la proteasa BMP1 en presencia de anticuerpo anti-miostatina latente, usando un ensayo con HEK Blue.
[0309] [Fig.2]
[0310] La figura 2 ilustra la inhibición de la activación espontánea de miostatina latente por el anticuerpo anti-miostatina latente, tal como se describe en el ejemplo 4. Se midió la actividad de miostatina activa liberada a partir de miostatina latente mediante incubación a 37 grados C en presencia de anticuerpo anti-miostatina latente, usando un ensayo con HEK Blue.
[0311] [Fig.3]
[0312] La figura 3 ilustra la unión de anticuerpo anti-miostatina latente a dominio de propéptido, tal como se describe en el ejemplo 5.
[0313] [Fig.4]
[0314] La figura 4 ilustra el análisis de inmunotransferencia de tipo Western frente a propéptido de miostatina, tal como se describe en el ejemplo 6. Se evaluó la escisión proteolítica del propéptido de miostatina por BMP1 en presencia y ausencia de anticuerpo anti-miostatina latente.
[0315] [Fig.5]
[0316] Las figuras 5A-5C ilustran sensogramas de BIACORE (marca registrada) de anticuerpo anti-miostatina latente MST1032-G1m contra miostatina latente humana (A), miostatina latente de macaco cangrejero (B), y miostatina latente de ratón (C), tal como se describe en el ejemplo 7,
[0317] [Fig.6A]
[0318] La figura 6A ilustra la eficaciain vivode anticuerpo anti-miostatina latente y anticuerpo anti-miostatina madura en la masa muscular y la masa adiposa, tal como se describe en el ejemplo 8. Se administró anticuerpo anti-miostatina latente (MST1032-G1m; descrito como MST1032 en las figuras) o anticuerpo anti-miostatina madura (41C1E4) a ratones SCID, y se midió la masa magra corporal total (o masa magra corporal: LMB).
[0319] [Fig.6B]
[0320] La figura 6B ilustra la eficaciain vivode anticuerpo anti-miostatina latente y anticuerpo anti-miostatina madura en la masa muscular y la masa adiposa, tal como se describe en el ejemplo 8. Se administró anticuerpo anti-miostatina latente (MST1032-G1m; descrito como MST1032 en las figuras) o anticuerpo anti-miostatina madura (41C1E4) a ratones SCID, y se midió el cambio de masa adiposa corporal total desde el día 0 hasta el día 14.
[0321] [Fig.6C]
[0322] La figura 6C ilustra la eficaciain vivode anticuerpo anti-miostatina latente y anticuerpo anti-miostatina madura en la masa muscular y la masa adiposa, tal como se describe en el ejemplo 8. Se administró anticuerpo anti-miostatina latente (MST1032-G1m; descrito como MST1032 en las figuras) o anticuerpo anti-miostatina madura (41C1E4) a ratones SCID, y se midió la masa de los músculos gemelos y cuádriceps.
[0323] [Fig.7A]
[0324] La figura 7A ilustra la comparación de la eficaciain vivoentre varios anticuerpos anti-miostatina, tal como se describe en el ejemplo 9. Se administró anticuerpo anti-miostatina latente (MST1032-G1m; descrito como MST1032 en las figuras) o anticuerpo anti-miostatina madura (41C1E4, REGN, OGD, o MYO-029) a ratones SCID, y se midió la masa magra corporal total.
[0325] [Fig.7B]
[0326] La figura 7B ilustra la comparación de la eficaciain vivoentre varios anticuerpos anti-miostatina, tal como se describe en el ejemplo 9. Se administró anticuerpo anti-miostatina latente (MST1032-G1m; descrito como MST1032 en las figuras) o anticuerpo anti-miostatina madura (41C1E4, REGN, OGD, o MYO-029) a ratones SCID, y se midió la fuerza de prensión.
[0327] [Fig.7C]
[0328] La figura 7C ilustra la comparación de la eficaciain vivoentre varios anticuerpos anti-miostatina, tal como se describe en el ejemplo 9. Se administró anticuerpo anti-miostatina latente (MST1032-G1m; descrito como MST1032 en las figuras) o anticuerpo anti-miostatina madura (41C1E4, REGN, OGD, o MYO-029) a ratones SCID, y se midió el cambio de masa adiposa corporal total desde el día 0 hasta el día 14.
[0329] [Fig.8]
[0330] La figura 8 ilustra la inhibición de la activación proteolítica y espontánea de miostatina latente por el anticuerpo humanizado anti-miostatina latente, tal como se describe en el ejemplo 10. Se midió la actividad de miostatina activa liberada a partir de miostatina latente por la proteasa BMP1 (proteolítica) o mediante incubación a 37 grados C sin BMP1 (espontánea) en presencia de anticuerpo anti-miostatina latente, usando un ensayo con HEK Blue.
[0331] [Fig.9]
[0332] La figura 9 ilustra sensogramas de BIACORE (marca registrada) de variantes con sustitución de histidina de anticuerpo anti-miostatina latente, tal como se describe en el ejemplo 11. Se permitió que se disociasen los complejos anticuerpo/antígeno a pH 7,4, seguido por disociación adicional a pH 5,8 (apuntado por una flecha) para evaluar las interacciones dependientes del pH. Los anticuerpos sometidos a prueba en este experimento son: Ab001 (curva continua de color negro), Ab002 (curva de trazos cortos de color negro), Ab003 (curva de puntos de color negro), Ab004 (curva de trazos cortos de color gris), Ab005 (curva continua de color gris), Ab006 (curva de trazos largos de color gris), y Ab007 (curva de trazos largos de color negro).
[0333] [Fig.10]
[0334] La figura 10 ilustra la inhibición de la activación proteolítica y espontánea de miostatina latente por anticuerpos antimiostatina latente dependientes del pH, tal como se describe en el ejemplo 13. Se midió la actividad de miostatina activa liberada a partir de miostatina latente por la proteasa BMP1 (proteolítica) o mediante incubación a 37 grados C sin BMP1 (espontánea) en presencia de anticuerpos anti-miostatina latente, usando un ensayo con HEK Blue. Los anticuerpos MS1032LO01-SG1, MS1032LO02-SG1, MS1032LO03-SG1, y MS1032LO04-SG1 se describen respectivamente como MSLO-01, MSLO-02, MSLO-03, y MSLO-04 en la figura. Se logró una inhibición comparable de la activación proteolítica y espontánea de miostatina latente contra MS1032LO00-SG1 por MS1032LO01-SG1, MS1032LO02-SG1, MS1032LO03-SG1, y MS1032LO04-SG1.
[0335] [Fig.11]
[0336] Las figuras 11A-11F ilustran sensogramas de BIACORE (marca registrada) de anticuerpo anti-miostatina latente dependiente del pH, tal como se describe en el ejemplo 14. Se midieron parámetros cinéticos de MST1032-SG1 (A), MS1032LO00-SG1 (B), MS1032LO01-SG1 (C), MS1032LO02-SG1 (D), MS1032LO03-SG1 (E), y MS1032LO04-SG1 (F), a pH neutro y pH ácido.
[0337] [Fig.12]
[0338] La figura 12 ilustra el transcurso temporal de la concentración de miostatina en plasma después de administración intravenosa de un anticuerpo anti-miostatina en ratones, tal como se describe en el ejemplo 15. Se evaluaron los efectos de la captación celular mediada por Fc gamma R de complejos anticuerpo/antígeno sobre el aclaramiento de miostatinain vivocomparando anticuerpos anti-miostatina con unión a Fc gamma R (MS1032LO00-SG1) y anticuerpos anti-miostatina con unión a Fc gamma R suprimida (MS1032LO00-F760).
[0339] [Fig.13]
[0340] La figura 13 ilustra el transcurso temporal de la concentración de miostatina en plasma después de administración intravenosa de un anticuerpo anti-miostatina en ratones, tal como se describe en el ejemplo 16. Se midieron los efectos de la unión dependiente del pH de anticuerpo anti-miostatina sobre el aclaramiento de miostatinain vivocomparando anticuerpo anti-miostatina dependiente del pH (MS1032LO01-SG1 o MS1032LO01-F760) y anticuerpo anti-miostatina no dependiente del pH (MS1032LO00-SG1 o MS1032LO00-F760).
[0341] [Fig.14]
[0342] La figuras 14A-14E ilustran la eficaciain vivode anticuerpos anti-miostatina latente dependientes del pH y no dependientes del pH, tal como se describe en el ejemplo 17. Se administró anticuerpo anti-miostatina latente dependiente del pH (MS1032LO01-SG1; descrito como MSLO1 en la figura) o anticuerpo anti-miostatina latente no dependiente del pH (MS1032LO00-SG1; descrito como MSLO0 en la figura) a ratones SCID, y se midieron la masa magra corporal total (A), masa adiposa corporal total (B), masa muscular de cuádriceps (C), masa muscular de gemelos (D), y fuerza de prensión (E).
[0343] [Fig.15]
[0344] La figura 15 ilustra la actividad de unión de anticuerpo anti-miostatina latente MST1032 contra miostatina latente y GDF11, tal como se describe en el ejemplo 19.
[0345] [Fig.16]
[0346] La figura 16 ilustra la actividad inhibidora del anticuerpo anti-miostatina latente MST1032 frente a la activación proteolítica y espontánea de GDF11, tal como se describe en el ejemplo 20. Se midió la actividad de GDF11 activo liberado por la proteasa BMP1 (proteolítica) o mediante incubación a 37 grados C sin BMP1 (espontánea) en presencia de anticuerpo anti-miostatina latente, usando un ensayo con HEK Blue.
[0347] [Fig.17]
[0348] La figura 17 ilustra la inhibición de la activación proteolítica de miostatina latente por el anticuerpo anti-miostatina latente, tal como se describe en el ejemplo 22. Se midió la actividad de miostatina activa liberada a partir de miostatina latente por la proteasa BMP1 en presencia de anticuerpo anti-miostatina latente, usando un ensayo con HEK Blue.
[0349] [Fig.18]
[0350] La figura 18 ilustra el transcurso temporal de la concentración de miostatina en plasma después de administración intravenosa de anticuerpos anti-miostatina latente en ratones, tal como se describe en el ejemplo 23. Se evaluaron los efectos de la dependencia del pH sobre el aclaramiento de miostatinain vivocomparando anticuerpo antimiostatina latente no dependiente del pH (MS1032LO00-SG1) y diferentes anticuerpos anti-miostatina latente dependientes del pH (MS1032LO01-SG1, MS1032LO06-SG1, MS1032LO11-SG1, MS1032LO18-SG1, MS1032LO19-SG1, MS1032LO21-SG1 y MS1032LO25-SG1).
[0351] [Fig.19]
[0352] La figuras 19A y 19B ilustran el transcurso temporal de la concentración de miostatina en plasma después de administración intravenosa de anticuerpos anti-miostatina latente en macaco cangrejero, tal como se describe en el ejemplo 24. (A) Se evaluó el efecto de la dependencia del pH y la modificación por ingeniería de Fc sobre el aclaramiento de miostatinain vivocomparando anticuerpo anti-miostatina latente no dependiente del pH (MS1032LO00-SG1) y anticuerpos anti-miostatina latente dependientes del pH con modificación por ingeniería de Fc (MS1032LO06-SG1012, MS1032LO06-SG1016, MS1032LO06-SG1029, MS1032LO06-SG1031, MS1032LO06-SG1033, MS1032LO06-SG1034). (B) Se evaluó el efecto de la modificación por ingeniería de Fc sobre el aclaramiento de miostatinain vivocomparando anticuerpos anti-miostatina latente (MS1032LO19-SG1079, MS1032LO19-SG1071, MS1032LO19-SG1080, MS1032LO19-SG1074, MS1032LO19-SG1081, y MS1032LO19-SG1077).
[0353] [Fig.20A]
[0354] La figura 20A, junto con las figuras 20B-20I, ilustra la eficaciain vivode anticuerpos anti-miostatina latente (variantes de MS1032) sobre la masa magra corporal (LBM), fuerza de prensión, y masa adiposa corporal, tal como se describe en el ejemplo 25. Se administraron MS1032LO06-SG1, MS1032LO11-SG1, y MS1032LO18-SG1 a ratones Scid, y se midió la masa magra corporal (A).
[0355] [Fig.20B]
[0356] La figura 20B, junto con las figuras 20A, 20C-20I, ilustra la eficaciain vivode anticuerpos anti-miostatina latente (variantes de MS1032) sobre la masa magra corporal (LBM), fuerza de prensión, y masa adiposa corporal, tal como se describe en el ejemplo 25. Se administraron MS1032LO06-SG1, MS1032LO19-SG1, y MS1032LO25-SG1 a ratones Scid, y se midió la masa magra corporal (B).
[0357] [Fig.20C]
[0358] La figura 20C, junto con las figuras 20A-B, 20D-I, ilustra la eficaciain vivode anticuerpos anti-miostatina latente (variantes de MS1032) sobre la masa magra corporal (LBM), fuerza de prensión, y masa adiposa corporal, tal como se describe en el ejemplo 25. MS1032LO01-SG, MS1032LO06-SG1, y MS1032LO11-SG1 Se administraron a ratones Scid, y se midió la masa magra corporal (C).
[0359] [Fig.20D]
[0360] La figura 20D, junto con las figuras 20A-C, 20E-I, ilustra la eficaciain vivode anticuerpos anti-miostatina latente (variantes de MS1032) sobre la masa magra corporal (LBM), fuerza de prensión, y masa adiposa corporal, tal como se describe en el ejemplo 25. Se administraron MS1032LO06-SG1, MS1032LO11-SG1, y MS1032LO18-SG1 a ratones Scid, y se midió la fuerza de prensión (D).
[0361] [Fig.20E]
[0362] La figura 20E, junto con las figuras 20A-D, 20F-20I, ilustra la eficaciain vivode anticuerpos anti-miostatina latente (variantes de MS1032) sobre la masa magra corporal (LBM), fuerza de prensión, y masa adiposa corporal, tal como se describe en el ejemplo 25. Se administraron MS1032LO06-SG1, MS1032LO19-SG1, y MS1032LO25-SG1 a ratones Scid, y se midió la fuerza de prensión (E).
[0363] [Fig.20F]
[0364] La figura 20F, junto con las figuras 20A-E, 20G-I, ilustra la eficaciain vivode anticuerpos anti-miostatina latente (variantes de MS1032) sobre la masa magra corporal (LBM), fuerza de prensión, y masa adiposa corporal, tal como se describe en el ejemplo 25. Se administraron MS1032LO01-SG, MS1032LO06-SG1, y MS1032LO11-SG1 a ratones Scid, y se midió la fuerza de prensión (F).
[0365] [Fig.20G]
[0366] La figura 20G, junto con las figuras 20A-F, 20H-I, ilustra la eficaciain vivode anticuerpos anti-miostatina latente (variantes de MS1032) sobre la masa magra corporal (LBM), fuerza de prensión, y masa adiposa corporal, tal como se describe en el ejemplo 25. Se administraron MS1032LO06-SG1, MS1032LO11-SG1, y MS1032LO18-SG1 a ratones Scid, y se midió la masa adiposa corporal (G).
[0367] [Fig.20H]
[0368] La figura 20H, junto con las figuras 20A-G, 20I, ilustra la eficaciain vivode anticuerpos anti-miostatina latente (variantes de MS1032) sobre la masa magra corporal (LBM), fuerza de prensión, y masa adiposa corporal, tal como se describe en el ejemplo 25. Se administraron MS1032LO06-SG1, MS1032LO19-SG1, y MS1032LO25-SG1 a ratones Scid, y se midió la masa adiposa corporal (H).
[0369] [Fig.20I]
[0370] La figura 20I, junto con las figuras 20A-H, ilustra la eficaciain vivode anticuerpos anti-miostatina latente (variantes de MS1032) sobre la masa magra corporal (LBM), fuerza de prensión, y masa adiposa corporal, tal como se describe en el ejemplo 25. Se administraron MS1032LO01-SG, MS1032LO06-SG1, y MS1032LO11-SG1 a ratones Scid, y se midió la masa adiposa corporal (I).
[0371] [Fig.21]
[0372] La figura 21 ilustra la actividad inhibidora sobre la activación de miostatina latente por los anticuerpos anti-miostatina latente, tal como se describe en el ejemplo 26. Se midieron las cantidades de miostatina madura liberada a partir de miostatina latente por la proteasa BMP1 en presencia de anticuerpos anti-miostatina latente (MST1032, MST1504, MST1538, MST1551, MST1558, MST1572, y MST1573).
[0373] [Fig.22A]
[0374] La figura 22A ilustra un diagrama esquemático de fragmentos de miostatina latente de 100 aminoácidos cada uno, diseñados para el mapeo de epítopos de anticuerpos anti-miostatina latente, tal como se describe en el ejemplo 26.
[0375] [Fig.22B]
[0376] La figura 22B ilustra el análisis de inmunotransferencias de tipo Western frente a fragmentos de miostatina latente humana con etiqueta GST (GST-hMSTN) por un anticuerpo anti-GST, tal como se describe en el ejemplo 26. Cada carril indica: 1, GST-hMSTN 1-100 aa; 2, GST-hMSTN 21-120 aa; 3, GST-hMSTN 41-140 aa; 4, GST-hMSTN 61-160 aa; 5, GST-hMSTN 81-180 aa; 6, GST-hMSTN 101-200 aa; 7, GST-hMSTN 121-220 aa; 8, GST-hMSTN 141-241 aa; 9, GST control.
[0377] [Fig.22C]
[0378] La figura 22C ilustra el análisis de inmunotransferencias de tipo Western frente a fragmentos de miostatina latente humana con etiqueta GST (GST-hMSTN) por los anticuerpos anti-miostatina latente (MST1032, MST1538, MST1572, y MST1573), tal como se describe en el ejemplo 26. Cada carril indica: 1, GST-hMSTN 1-100 aa; 2, GST-hMSTN 21-120 aa; 3, GST-hMSTN 41-140 aa; 4, GST-hMSTN 61-160 aa; 5, GST-hMSTN 81-180 aa; 6, GST-hMSTN 101-200 aa; 7, GST-hMSTN 121-220 aa; 8, GST-hMSTN 141-241 aa; 9, GST control; 10, miostatina latente humana (100ng).
[0379] [Fig.22D]
[0380] La figura 22D ilustra resultados resumidos del análisis de inmunotransferencias de tipo Western y posiciones de epítopos deducidas para anticuerpos anti-miostatina latente (MST1032, MST1538, MST1572, y MST1573), tal como se describe en el ejemplo 26.
[0381] [Fig.23]
[0382] La figura 23 ilustra una alineación de secuencias de aminoácidos de Fc gamma RIIa1, Fc gamma RIIa2, Fc gamma RIIa3, Fc gamma RIIb, Fc gamma RIIaH humano, Fc gamma RIIaR, y Fc gamma RIIb de macaco cangrejero (cynomolgus,cyno). Las regiones recuadradas indican supuestos residuos que interaccionan con el dominio de Fc.
[0383] [Fig.24]
[0384] La figura 24 ilustra el transcurso temporal de la concentración de miostatina total en plasma después de administración intravenosa de un anticuerpo anti-miostatina con una variante de Fc mejorada para Fc gamma RIIb en todos los ratones transgénicos para Fc gamma R humano, tal como se describe en el ejemplo 28. Se evaluaron los efectos de las variantes de Fc mejoradas para Fc gamma RIIb sobre la eliminación de antígeno a través de Fc gamma RIIb humano.
[0385] [Fig.25]
[0386] La figura 25 ilustra el transcurso temporal de anticuerpo concentración en plasma después de administración intravenosa de un anticuerpo anti-miostatina con una variante de Fc mejorada para Fc gamma RIIb en todos los ratones transgénicos para Fc gamma R humano, tal como se describe en el ejemplo 28. Se evaluaron los efectos de las variantes de Fc mejoradas para Fc gamma RIIb sobre la farmacocinética del anticuerpo.
[0387] [Fig.26]
[0388] La figuras 26A y 26B ilustran el transcurso temporal de la concentración de miostatina en plasma después de administración intravenosa de anticuerpos anti-miostatina latente en macaco cangrejero, tal como se describe en el ejemplo 29. (A) Se evaluó el efecto de la dependencia del pH y la modificación por ingeniería de Fc sobre el aclaramiento de miostatinain vivocomparando anticuerpo anti-miostatina latente no dependiente del pH (MS1032LO00-SG1) y anticuerpos anti-miostatina latente dependientes del pH con modificación por ingeniería de Fc (MS1032LO06-SG1012, MS1032LO06-SG1016, MS1032LO06-SG1029, MS1032LO06-SG1031, MS1032LO06-SG1033, MS1032LO06-SG1034). (B) Se evaluó el efecto de la modificación por ingeniería de Fc sobre el aclaramiento de miostatinain vivocomparando anticuerpos anti-miostatina latente (MS1032LO19-SG1079, MS1032LO19-SG1071, MS1032LO19-SG1080, MS1032LO19-SG1074, MS1032LO19-SG1081, y MS1032LO19-SG1077).
[0389] [Fig.27A]
[0390] La figura 27A ilustra el transcurso temporal de la concentración de miostatina total en plasma después de administración intravenosa de un anticuerpo anti-miostatina con una variante de Fc con pI aumentado en ratones transgénicos para FcRn humano, tal como se describe en el ejemplo 30. Se evaluaron los efectos de variantes de Fc con pI aumentado sobre la eliminación de antígeno.
[0391] [Fig.27B]
[0392] La figura 27B ilustra el transcurso temporal de anticuerpo concentración en plasma después de administración intravenosa de un anticuerpo anti-miostatina con una variante de Fc con pI aumentado en ratones transgénicos para FcRn humano, tal como se describe en el ejemplo 30. Se evaluaron los efectos de variantes de Fc con pI aumentado sobre la farmacocinética del anticuerpo.
[0393] [Fig.28A]
[0394] La figura 28A ilustra el transcurso temporal de la concentración de miostatina total en plasma después de administración intravenosa de un anticuerpo anti-miostatina con una variante de Fc con pI aumentado en ratones transgénicos para FcRn humano, tal como se describe en el ejemplo 30. Se evaluaron los efectos de variantes de Fc con pI aumentado sobre la eliminación de antígeno. En este ensayo, se coadministraron un exceso de inmunogloblina normal humana con el anticuerpo anti-miostatina con el fin de imitar la situación del plasma humano.
[0395] [Fig.28B]
[0396] La figura 28B ilustra el transcurso temporal de anticuerpo concentración en plasma después de administración intravenosa de un anticuerpo anti-miostatina con una variante de Fc con pI aumentado en ratones transgénicos para FcRn humano, tal como se describe en el ejemplo 30. Se evaluaron los efectos de variantes de Fc con pI aumentado sobre la farmacocinética del anticuerpo. En este ensayo, se coadministraron un exceso de inmunogloblina normal humana con el anticuerpo anti-miostatina con el fin de imitar la situación del plasma humano.
[0397] [Fig.29]
[0398] La figura 29 ilustra el transcurso temporal de la concentración de miostatina total en plasma después de administración intravenosa de un anticuerpo anti-miostatina con una variante de Fc mejorada para Fc gamma RIIb en ratones transgénicos para Fc gamma RIIb humano, tal como se describe en el ejemplo 31. Se evaluaron los efectos de variantes de Fc mejoradas para Fc gamma RIIb sobre la eliminación de antígeno a través de Fc gamma RIIb humano.
[0399] [Fig.30]
[0400] La figura 30 ilustra el transcurso temporal de anticuerpo concentración en plasma después de administración intravenosa de un anticuerpo anti-miostatina con una variante de Fc mejorada para Fc gamma RIIb en ratones transgénicos para Fc gamma RIIb humano, tal como se describe en el ejemplo 31. Se evaluaron los efectos de variantes de Fc mejoradas para Fc gamma RIIb sobre la farmacocinética del anticuerpo.
[0401] [Fig.31]
[0402] La figura 31 ilustra resultados del análisis de obtención de imágenes de células de anticuerpos anti-miostatina con una variante de Fc mejorada para Fc gamma RIIb, tal como se describe en el ejemplo 33. Se complejó cada anticuerpo con miostatina marcada con fluorescencia y se midió la captación intracelular del complejo antígenoanticuerpo en células que expresan Fc gamma RIIb humano.
[0403] Descripción de realizaciones
[0404] Las técnicas y procedimientos descritos o a los que se hace referencia en el presente documento generalmente se entienden bien y se emplean habitualmente usando metodología convencional por los expertos en la técnica, tal como, por ejemplo, las metodologías utilizadas ampliamente descritas en Sambrooket al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3ª edición (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel,et al., eds., (2003)); la serie Method in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames y G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow y Lane, eds. (1988) Anticuerpos, A Laboratory Manual, y Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather y P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, y D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller y M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mulliset al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coliganet al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway y P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow y D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti y J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); y Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVitaet al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).
[0405] I. DEFINICIONES
[0406] A menos que se definan de otro modo, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. Singletonet al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2ª ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, N.Y.1994), y March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4ª ed., John Wiley & Sons (Nueva York, N.Y. 1992) proporcionan a un experto en la técnica una guía general para muchos de los términos usados en la presente solicitud.
[0407] Con fines de interpretar esta memoria descriptiva, se aplicarán las siguientes definiciones y, siempre que sea apropiado, los términos usados en singular también incluirán el plural y viceversa. Debe entenderse que la terminología usada en el presente documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares solamente, y no pretende ser limitativa. En el caso de que cualquier definición expuesta a continuación entre en conflicto con cualquier documento citado en el presente documento como referencia, prevalecerá la definición expuesta a continuación.
[0408] Una “región de marco humana aceptora” para los fines del presente documento es una región de marco que comprende la secuencia de aminoácidos de una región de marco de dominio variable de cadena ligera (VL) o una región de marco de dominio variable de cadena pesada (VH) derivada de una región de marco de inmunoglobulina humana o una región de marco consenso humana, tal como se definen a continuación. Una región de marco humana aceptora “derivada de” una región de marco de inmunoglobulina humana o una región de marco consenso humana puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de la misma, o puede contener cambios en la secuencia de aminoácidos. En algunas realizaciones, el número de cambios de aminoácidos es de 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos. En algunas realizaciones, la región de marco humana aceptora de VL es idéntico en secuencia a la secuencia de región de marco de inmunoglobulina humana de VL o la secuencia de región de marco consenso humana.
[0409] “Afinidad” se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su pareja de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique lo contrario, tal como se usa en el presente documento, “afinidad de unión” se refiere a afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su pareja Y puede representarse generalmente por la constante de disociación (Kd). La afinidad puede medirse mediante métodos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. A continuación se describen realizaciones ilustrativas y a modo de ejemplo específicas para medir la afinidad de unión.
[0410] Un anticuerpo “madurado por afinidad” se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables (HVR), en comparación con un anticuerpo parental que no presenta tales alteraciones, dando tales alteraciones como resultado una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno.
[0411] Los términos “anticuerpo anti-miostatina” y “un anticuerpo que se une a miostatina” se refieren a un anticuerpo que puede unirse a miostatina con suficiente afinidad de tal manera que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico en el direccionamiento a miostatina. En una realización, el grado de unión de un anticuerpo antimiostatina a una proteína distinta de miostatina, no relacionada es menor de aproximadamente el 10 % de la unión del anticuerpo a miostatina tal como se mide, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA). En ciertas realizaciones, un anticuerpo que se une a miostatina tiene una constante de disociación (Kd) de 1 microM o menor, 100 nM o menor, 10 nM o menor, 1 nM o menor, 0,1 nM o menor, 0,01 nM o menor, o 0,001 nM o menor (por ejemplo, 10<-8>M o menor, por ejemplo, desde 10<-8>M hasta 10<-13>M, por ejemplo, desde 10<-9>M hasta 10<-13>M). En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti miostatina se une a un epítopo de miostatina que se conserva entre miostatina de diferentes especies.
[0412] El término “anticuerpo” en el presente documento se usa en el sentido más amplio y abarca diversas estructuras de anticuerpos incluyendo, pero sin limitación, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), y fragmentos de anticuerpo siempre que muestren la actividad de unión a antígeno deseada.
[0413] Un “fragmento de anticuerpo” se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)<2>; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de una sola cadena (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.
[0414] Un “anticuerpo que se une al mismo epítopo” que un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo competitivo, y/o a la inversa, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo competitivo. En el presente documento, se proporciona un ensayo competitivo a modo de ejemplo.
[0415] El término anticuerpo “quimérico” se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie diferente.
[0416] La “clase” de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que presenta su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varias de estas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG<1>, IgG<2>, IgG<3>, IgG<4>, IgA<1>, e IgA<2>. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma, y mu, respectivamente.
[0417] El término “agente citotóxico” tal como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o previene una función celular y/o provoca muerte o destrucción celular. Los agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, isótopos radiactivos (por ejemplo, At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>e isótopos radiactivos de Lu); agentes o fármacos quimioterápicos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorubicina u otros agentes intercalantes); agentes inhibidores del crecimiento; enzimas y fragmentos de las mismas tales como enzimas nucleolíticas; antibióticos; toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas; y los diversos agentes antitumorales o antineoplásicos descritos a continuación.
[0418] “Funciones efectoras” se refiere a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión al receptor de Fc; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de células B); y activación de células B.
[0419] Una “cantidad eficaz” de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado. El término “epítopo” incluye cualquier determinante capaz de unirse a un anticuerpo. Un epítopo es una región de un antígeno que se une por un anticuerpo que se dirige a ese antígeno, e incluye aminoácidos específicos que entran en contacto directamente con el anticuerpo. Los determinantes epitópicos pueden incluir agrupamientos superficiales químicamente activos de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, grupos fosforilo o sulfonilo, y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, y/o características de carga específicas. Generalmente, los anticuerpos específicos para un antígeno diana particular reconocerán preferentemente un epítopo en el antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas.
[0420] “Receptor de Fc” o “FcR” describe un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. En algunas realizaciones, un FcR es un FcR humano nativo. En algunas realizaciones, un FcR es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases Fc gamma RI, Fc gamma RII, y Fc gamma RIII, incluyendo variantes alélicas y formas de corte y empalme alternativas de esos receptores. Los receptores Fc gamma RII incluyen Fc gamma RIIA (un “receptor activador”) y Fc gamma RIIB (un “receptor inhibidor”), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplasmáticos de los mismos. El receptor activador Fc gamma RIIA contiene un motivo activador basado en tirosina de inmunoreceptor (ITAM) en su dominio citoplasmático. El receptor inhibidor Fc gamma RIIB contiene un motivo inhibidor basado en tirosina de inmunorreceptor (ITIM) en su dominio citoplasmático. (Véase, por ejemplo, Daeron, Annu. Immunol. 15:203-234 (1997).) Los FcR se revisan, por ejemplo, en Ravetch y Kinet, Annu. Immunol. 9:457-92 (1991); Capelet al., Immunomethods 4:25-34 (1994y de Haaset al., J. Lab. Clin. Med.126:330-41 (1995). Otros FcR, incluyendo los que vayan a identificarse en el futuro, están abarcados por el término “FcR” en el presente documento.
[0421] El término “receptor de Fc” o “FcR” también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyeret al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kimet al., J. Immunol. 24:249 (1994) y la regulación de la homeostasis de inmunoglobulinas. Se conocen métodos para medir la unión a FcRn (véase, por ejemplo, Ghetie y Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetieet al., Nature Biotechnology 15 (7) :637-640 (1997); Hintonet al., J. Biol. Chem.279(8):6213-6216 (2004); el documento WO 2004/92219 (Hintonet al.). La unión a FcRn humanoin vivoy la semivida en suero de polipéptidos de unión de alta afinidad a FcRn humano puede someterse a ensayo, por ejemplo, en ratones transgénicos o líneas celulares humanas transfectadas que expresan FcRn humano, o en primates a los que se administran los anticuerpos con una región Fc variante. El documento WO 2000/42072 (Presta) describe variantes de anticuerpo con unión mejorada o disminuida a FcR. Véase también, por ejemplo, Shieldset al., J. Biol. Chem.9(2):6591-6604 (2001).
[0422] El término “región Fc” en el presente documento se usa para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia nativa y regiones Fc variantes. En una realización, una región Fc de cadena pesada de IgG humana se extiende desde Cys226, o desde Pro230, hasta el extremo carboxilo-terminal de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C-terminal (Lys447) o glicina-lisina (residuos 446-447) de la región Fc puede estar presente o no. A menos que se especifique lo contrario en el presente documento, la numeración de los residuos de aminoácido en la región Fc o región constante es según el sistema de numeración de EU, también llamado índice de EU, tal como se describe en Kabatet al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, 1991.
[0423] El término “anticuerpo que comprende la región Fc” se refiere a un anticuerpo que comprende una región Fc. La lisina C-terminal (residuo 447 según el sistema de numeración de EU) o glicina-lisina C-terminal (residuos 446-447) de la región Fc puede eliminarse, por ejemplo, durante la purificación del anticuerpo o mediante modificación por ingeniería recombinante del ácido nucleico que codifica para el anticuerpo. Por consiguiente, una composición que comprende un anticuerpo que tiene una región Fc según esta invención puede comprender un anticuerpo con G446-K447, con G446 y sin K447, con todos los G446-K447 eliminados, o una mezcla de los tres tipos de anticuerpos descritos anteriormente.
[0424] “Región de marco” o “FR” se refiere a residuos de dominio variable distintos de los residuos de región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable consiste generalmente en cuatro dominios de FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. Por consiguiente, las secuencias de HVR y FR aparecen generalmente en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
[0425] Los términos “anticuerpo de longitud completa”, “anticuerpo intacto”, y “anticuerpo completo” se usan en el presente documento indistintamente para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo nativo o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fc tal como se define en el presente documento.
[0426] Una “región Fc funcional” presenta una “función efectora” de una región Fc de secuencia nativa. Las “funciones efectoras” a modo de ejemplo incluyen la unión a C1q; CDC; unión al receptor de Fc; ADCC; fagocitosis; regulación por disminución de receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B; BCR), etc. Tales funciones efectoras requieren generalmente que la región Fc se combine con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo) y pueden evaluarse usando diversos ensayos tal como se da a conocer, por ejemplo, en las definiciones en el presente documento.
[0427] Los términos “célula huésped”, “línea celular huésped”, y “cultivo de células huésped” se usan indistintamente y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la progenie de tales células. Las células huésped incluyen “transformantes” y “células transformadas”, que incluyen la célula transformada primaria y la progenie derivada de la misma sin tener en cuenta el número de pases. La progenie puede no ser completamente idéntica en el contenido de ácido nucleico a una célula parental, sino que puede contener mutaciones. La progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada o seleccionada en la célula transformada originalmente se incluye en el presente documento.
[0428] Un “anticuerpo humano” es uno que presenta una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano o célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican para anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígenos no humanos.
[0429] Un “región de marco consenso humana” es una región de marco que representa los residuos de aminoácido que se producen más comúnmente en una selección de secuencias de región de marco de VL o VH de inmunoglobulina humana. Generalmente, la selección de secuencias de VL o VH de inmunoglobulina humana es de un subgrupo de secuencias de dominio variable. Generalmente, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabatet al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, publicación NIH 91-3242, Bethesda MD (1991), vol.
[0430] 1-3. En una realización, para VL, el subgrupo es el subgrupo kappa I como en Kabatet al., citado anteriormente. En una realización, para VH, el subgrupo es el subgrupo III como en Kabatet al., citado anteriormente.
[0431] Un anticuerpo “humanizado” se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos de aminoácido de HVR no humanas y residuos de aminoácido de FR humanas. En ciertas realizaciones, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables en los que todas o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano, y todas o sustancialmente todas las FR corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado puede comprender opcionalmente al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una “forma humanizada” de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización.
[0432] El término “región hipervariable” o “HVR”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son de secuencia hipervariable (“regiones determinantes de la complementariedad” o “CDR”) y/o forman bucles definidos estructuralmente (“bucles hipervariables”) y/o contienen los residuos de contacto con antígeno (“contactos con antígeno”). Generalmente, los anticuerpos comprenden seis HVR: tres en VH (H1, H2, H3), y tres en VL (L1, L2, L3). Las HVR a modo de ejemplo en el presente documento incluyen: (a) bucles hipervariables que se producen en los residuos de aminoácido 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), y 96-101 (H3) (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); (b) CDR que se producen en los residuos de aminoácido 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), y 95-102 (H3) (Kabatet al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Servicio de Salud Pública, NIH, Bethesda, MD (1991) (c) contactos de antígeno que se producen en los residuos de aminoácido 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), y 93-101 (H3) (MacCallumet al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996); y (d) combinaciones de (a), (b) y/o (c), incluyendo los residuos de aminoácido de HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3), y 94-102 (H3).
[0433] A menos que se indique lo contrario, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, residuos de FR) se numeran en el presente documento según Kabatet al., citado anteriormente.
[0434] Un “inmunoconjugado” es un anticuerpo conjugado con una o más molécula(s) heteróloga(s), incluyendo pero sin limitación un agente citotóxico.
[0435] Un “individuo” o “sujeto” es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros, y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos tales como monos), conejos, y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En ciertas realizaciones, el individuo o sujeto es un ser humano.
[0436] Un anticuerpo “aislado” es uno que se ha separado de un componente de su entorno natural. En algunas realizaciones, un anticuerpo se purifica hasta una pureza superior al 95 % o al 99 % tal como se determina, por ejemplo, mediante electroforesis (por ejemplo, SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), electroforesis capilar) o cromatografía (por ejemplo, HPLC de intercambio iónico o de fase inversa). Para una revisión de los métodos para la evaluación de la pureza de anticuerpos, véase, por ejemplo, Flatmanet al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007). Un ácido nucleico “aislado” se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que contienen habitualmente la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente de manera extracromosómica o en una ubicación cromosómica que es diferente de su ubicación cromosómica natural.
[0437] “Ácido nucleico aislado que codifica para un anticuerpo anti-miostatina” se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo (o fragmentos de las mismas), incluyendo tal(es) molécula(s) de ácido nucleico en un único vector o vectores independientes, y tal(es) molécula(s) de ácido nucleico presente(s) en una o más ubicaciones en una célula huésped.
[0438] El término “anticuerpo monoclonal” tal como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones que se producen de manera natural o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando presentes generalmente tales variantes en cantidades minoritarias. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que incluyen normalmente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales está dirigido contra un único determinante en un antígeno. Por tanto, el modificador “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo como obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo mediante ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que van a usarse según la presente invención pueden prepararse mediante una variedad de técnicas, incluyendo pero sin limitarse a, el método de hibridoma, métodos de ADN recombinante, métodos de presentación en fagos, y métodos que utilizan animales transgénicos que contienen la totalidad o parte de los loci de inmunoglobulina humana, describiéndose en el presente documento tales métodos y otros métodos a modo de ejemplo para producir anticuerpos monoclonales.
[0440] Un “anticuerpo desnudo” se refiere a un anticuerpo que no está conjugado con un resto heterólogo (por ejemplo, un resto citotóxico) o radiomarcador. El anticuerpo desnudo puede estar presente en una formulación farmacéutica.
[0441] “Anticuerpos nativos” se refiere a moléculas de inmunoglobulina que se producen de manera natural con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos IgG nativos son glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que están unidas por enlaces disulfuro. Desde el extremo N al C-terminal, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también denominada dominio pesado variable o dominio variable de cadena pesada, seguido por tres dominios constantes (CH1, CH2, y CH3). De manera similar, desde el extremo N al C-terminal, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también denominada dominio ligero variable o dominio variable de cadena ligera, seguido por un dominio ligero constante (CL). La cadena ligera de un anticuerpo puede asignarse a uno de dos tipos, denominados kappa (kappa) y lambda (lambda), basándose en la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.
[0443] Una “región Fc de secuencia nativa” comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc que se encuentra en la naturaleza. Las regiones Fc humanas de secuencia nativa incluyen una región Fc de IgG1 humana de secuencia nativa (alotipos distinto de A y A); región Fc de IgG2 humana de secuencia nativa; región Fc de IgG3 humana de secuencia nativa; y región Fc de IgG4 humana de secuencia nativa, así como variantes que se producen de manera natural de las mismas.
[0445] El término “prospecto” se usa para referirse a instrucciones incluidas habitualmente en envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, terapia de combinación, contraindicaciones y/o advertencias referentes al uso de tales productos terapéuticos.
[0447] El “porcentaje ( %) de identidad de secuencia de aminoácidos” con respecto a una secuencia de polipéptido de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácido en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácido en la secuencia de polipéptido de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y no considerando ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. La alineación con fines de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede lograrse de diversas maneras que están dentro de la experiencia en la técnica, por ejemplo, usando software informático disponible para el público tal como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN, Megalign (DNASTAR), o GENETYX (marca registrada) (Genetyx Co., Ltd.). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la máxima alineación a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se comparan. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 era propiedad de Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con documentación de usuario ante la Oficina de Derechos de Autor de los Estados Unidos, Washington D.C., 20559, donde se registra con el Número de Registro de Derechos de Autor de los Estados Unidos, TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible para el público en Genentech, Inc., South San Francisco, California, o puede compilarse a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 debe compilarse para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo Digital UNIX V4.0D. Todos los parámetros de comparación de secuencias se establecen mediante el programa ALIGN-2 y no varían.
[0449] En situaciones en las que se emplea ALIGN-2 para comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada con respecto a, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada (que como alternativa puede expresarse como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada) se calcula tal como sigue: 100 x la fracción X/Y; donde X es el número de residuos de aminoácido puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en la alineación de ese programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos de aminoácido en B. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se indique específicamente lo contrario, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen tal como se describe en el párrafo inmediatamente anterior usando el programa informático ALIGN-2.
[0451] El término “formulación farmacéutica” se refiere a una preparación que está en una forma tal que permite que la actividad biológica de un principio activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administrará la formulación.
[0453] Un “grupo transportador farmacéuticamente aceptable” se refiere a un componente en una formulación farmacéutica, distinto de un principio activo, que no es tóxico para un sujeto. Un grupo transportador farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizante, o conservante.
[0455] El término miostatina, tal como se usa en el presente documento, puede referirse a cualquier miostatina nativa de cualquier fuente de vertebrados, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, seres humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). A menos que se indique de otro modo, el término miostatina se refiere a una proteína miostatina humana que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 y que contiene el dominio de propéptido terminal de miostatina humana tal como se muestra en SEQ ID NO: 75 ó 78. El término abarca miostatina no procesada de “longitud completa”, así como cualquier forma de miostatina que resulta del procesamiento en la célula. El término también abarca variantes de miostatina que se producen de manera natural, por ejemplo, variantes de corte y empalme o variantes alélicas. La secuencia de aminoácidos de una miostatina humana a modo de ejemplo (promiostatina) se muestra en SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos de un dominio de factor de crecimiento C-terminal a modo de ejemplo de miostatina humana se muestra en SEQ ID NO: 2. La secuencia de aminoácidos de un dominio de propéptido N-terminal a modo de ejemplo de miostatina humana se muestra en SEQ ID NO: 75 ó 78. La miostatina madura activa es un homodímero unido por enlaces disulfuro que consiste en dos dominios de factor de crecimiento C-terminales. La miostatina latente inactiva es un complejo asociado de manera no covalente de dos propéptidos y la miostatina madura. Tal como se describe en la presente memoria, los anticuerpos de la invención se unen a miostatina latente inactiva, pero no se unen al homodímero de miostatina activa madura. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención se unen a un epítopo dentro de un fragmento que consiste en los aminoácidos 21-100 del propéptido de miostatina (SEQ ID NO: 78), pero no se unen al homodímero de miostatina activa madura. La secuencia de aminoácidos de una miostatina de macaco cangrejero y murina (promiostatina) a modo de ejemplo se muestra en SEQ ID NO: 3 y 5, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de un dominio de factor de crecimiento C-terminal a modo de ejemplo de miostatina de macaco cangrejero y murina se muestra en SEQ ID NO: 4 y 6, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de un dominio de propéptido N-terminal a modo de ejemplo de miostatina de macaco cangrejero y murina se muestra en SEQ ID NO: 76 ó 79, y 77 u 80, respectivamente. GDF-11 (BMP-11) es una molécula estrechamente relacionada con miostatina, siendo ambos miembros de la superfamilia de TGF-beta. De manera similar a la miostatina, GDF11 se sintetiza como un polipéptido precursor en primer lugar, y después se escinde para dar un prodominio N-terminal y GDF11 maduro C-terminal. La secuencia de aminoácidos de GDF11 humano (precursor) se muestra en la SEQ ID NO: 81. La secuencia de aminoácidos de GDF11 humano maduro C-terminal se muestra en la SEQ ID NO: 82. La secuencia de aminoácidos de un prodominio N-terminal de GDF11 humano se muestra en la SEQ ID NO: 83 u 84. Las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 78, 79, 80, 81, y 84 incluyen una secuencia señal. Los aminoácidos 1-24 de las mismas corresponden a ella y se eliminan durante el procesamiento en la célula.
[0457] Tal como se usa en el presente documento, “tratamiento” (y variaciones gramaticales del mismo tales como “tratar” o “que trata”) se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar el curso natural del individuo que está tratándose, y puede realizarse o bien para profilaxis o bien durante el transcurso de patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, prevención de la aparición o recurrencia de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la tasa de evolución de la enfermedad, mejora o paliación del estado patológico, y remisión o pronóstico mejorado. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la evolución de una enfermedad.
[0459] El término “región variable” o “dominio variable” se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo nativo tienen generalmente estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones de marco (FR) conservadas y tres regiones hipervariables (HVR). (Véase, por ejemplo, Kindtet al., Kuby Immunology, 6ª ed., W.H. Freeman y Co., página 91 (2007).) Un único dominio VH o VL puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular pueden aislarse usando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para cribar una biblioteca de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Véanse, por ejemplo, Portolanoet al., J. Immunol.150:880-887 (1993); Clarksonet al., Nature 352:624-628 (1991).
[0461] Una “región Fc variante” comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de una región Fc de secuencia nativa en virtud de al menos una modificación (alteración) de aminoácidos, preferiblemente una o más sustitución/sustituciones de aminoácidos. Preferiblemente, la región Fc variante tiene al menos una sustitución de aminoácidos en comparación con una región Fc de secuencia nativa o con la región Fc de un anticuerpo parental, por ejemplo, desde aproximadamente una hasta aproximadamente diez sustituciones de aminoácidos, y preferiblemente desde aproximadamente una hasta aproximadamente cinco sustituciones de aminoácidos en una región Fc de secuencia nativa o en la región Fc del anticuerpo parental. La región Fc variante en el presente documento presentará preferiblemente al menos aproximadamente el 80 % de homología con una región Fc de secuencia nativa y/o con una región Fc de un anticuerpo parental, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente el 90 % de homología con la misma, más preferiblemente al menos aproximadamente el 95 % de homología con la misma.
[0462] El término “vector”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede propagar otro ácido nucleico al que está unida. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico de autorreplicación, así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Ciertos vectores pueden dirigir la expresión de ácidos nucleicos a los que están operativamente unidos. Tales vectores se denominan en el presente documento “vectores de expresión”.
[0463] II. COMPOSICIONES Y MÉTODOS
[0464] En un aspecto, la invención se basa, en parte, en anticuerpos anti-miostatina y usos de los mismos. Particularmente, se proporcionan anticuerpos que se unen a miostatina latente e inhiben la activación de miostatina. Los anticuerpos de la invención son útiles, por ejemplo, para el diagnóstico o tratamiento de una enfermedad de desgaste muscular. En otro aspecto, la invención se basa, en parte, en anticuerpos que comprenden regiones Fc variantes y usos de los mismos. En una realización, se proporcionan anticuerpos que comprenden regiones Fc variantes con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada. En otra realización, se proporcionan anticuerpos que comprenden regiones Fc variantes con pI aumentado. Los polipéptidos de la invención son anticuerpos. Los anticuerpos que comprenden una región Fc variante de la invención son útiles, por ejemplo, para el diagnóstico o tratamiento de una enfermedad de desgaste muscular.
[0465] A. Anticuerpos anti-miostatina a modo de ejemplo y polipéptidos que comprenden regiones Fc variantes
[0466] En un aspecto, la divulgación proporciona anticuerpos aislados que se unen a miostatina. Un anticuerpo antimiostatina de la presente invención se une a miostatina latente. En realizaciones adicionales, un anticuerpo antimiostatina de la presente invención se une al propéptido de miostatina (humano: SEQ ID NO: 75 o 78; de macaco cangrejero: SEQ ID NO: 76 o 79; de ratón: SEQ ID NO: 77 o 80). En realizaciones adicionales, el anticuerpo se une a un epítopo dentro de un fragmento que consiste en los aminoácidos 21-100 del propéptido de miostatina (SEQ ID NO: 78). El propéptido está contenido en miostatina latente como uno de los componentes, tal como se ha descrito anteriormente. Un anticuerpo anti-miostatina de la presente invención inhibe la activación de miostatina. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-miostatina bloquea la liberación de miostatina madura a partir de miostatina latente. Se ha notificado que se libera miostatina madura a través de procesos proteolíticos y no proteolíticos a partir de miostatina latente. El anticuerpo anti-miostatina de la presente invención puede bloquear la liberación proteolítica y/o no proteolítica de miostatina madura a partir de miostatina latente. En ciertas realizaciones, el anticuerpo antimiostatina bloquea la escisión proteolítica de miostatina latente. En ciertas realizaciones, el anticuerpo antimiostatina bloquea el acceso de una proteasa a miostatina latente (especialmente, al sitio de escisión proteolítica (Arg98-Asp99) de miostatina latente). En realizaciones adicionales, la proteasa puede ser una metaloproteasa de la familia de BMP1/TLD tal como BMP1, TED, proteína similar a Tolloid 1 (TLL-1), o proteína similar a Tolloid 2 (TLL-2). En otra realización, el anticuerpo anti-miostatina bloquea la liberación no proteolítica de miostatina madura a partir de miostatina latente. La liberación no proteolítica tal como se usa en el presente documento significa una liberación espontánea de miostatina madura a partir de miostatina latente, que no está acompañada por la escisión proteolítica de miostatina latente. La liberación no proteolítica incluye, por ejemplo, una liberación de miostatina madura incubando miostatina latente por ejemplo, a 37 grados C en ausencia de una proteasa que escinde la miostatina latente. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-miostatina de la presente invención no se une a miostatina madura. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-miostatina se une al mismo epítopo que un anticuerpo descrito en la tabla 2a. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-miostatina compite por la unión a miostatina latente con un anticuerpo descrito en la tabla 2a. En realizaciones adicionales, un anticuerpo anti-miostatina compite por la unión a miostatina latente con un anticuerpo que comprende un par de VH y VL descrito en la tabla 2a. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-miostatina compite por la unión a un fragmento que consiste en los aminoácidos 21-100 del propéptido de miostatina (SEQ ID NO: 78) con un anticuerpo descrito en la tabla 2a. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-miostatina se une al mismo epítopo que un anticuerpo descrito en la tabla 11a o 13. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-miostatina compite por la unión a miostatina latente con un anticuerpo descrito en la tabla 11a o 13. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-miostatina compite por la unión a un fragmento que consiste en los aminoácidos 21-100 del propéptido de miostatina (SEQ ID NO: 78) con un anticuerpo descrito en la tabla 11a o 13.
[0467] Un anticuerpo anti-miostatina de la presente invención se une a miostatina latente e inhibe la activación de miostatina. En realizaciones adicionales, el anticuerpo: (a) bloquea la liberación de miostatina madura a partir de miostatina latente; (b) bloquea la liberación proteolítica de miostatina madura; (c) bloquea la liberación espontánea de miostatina madura; o (d) no se une a miostatina madura; o se une a un epítopo dentro de un fragmento que consiste en los aminoácidos 21-100 del propéptido de miostatina (SEQ ID NO: 78). En realizaciones adicionales, el anticuerpo compite por la unión a miostatina latente con, o se une al mismo epítopo que, un anticuerpo que comprende un par de VH y VL descrito en las tablas 2a, 11a, o 13. En realizaciones adicionales, el anticuerpo se une a miostatina latente con mayor afinidad a pH neutro (por ejemplo, pH 7,4) que a pH ácido (por ejemplo, pH 5,8).
[0468] En realizaciones adicionales, el anticuerpo es (a) un anticuerpo monoclonal, (b) un anticuerpo humano, humanizado, o quimérico; (c) un anticuerpo IgG de longitud completa o (d) un fragmento de anticuerpo que se une a miostatina latente o propéptido de miostatina.
[0470] En otra realización, un anticuerpo anti-miostatina de la presente invención no se une a GDF11. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-miostatina de la presente invención no inhibe la activación de GDF11. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-miostatina no bloquea la liberación de GDF11 maduro a partir de GDF11 latente. El anticuerpo anti-miostatina de la presente invención no bloquea ni la liberación proteolítica ni la no proteolítica de GDF11 maduro a partir de GDF11 latente. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-miostatina no bloquea la escisión proteolítica de GDF11 latente. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-miostatina no bloquea el acceso de una proteasa a GDF11 latente (especialmente, al sitio de escisión proteolítica de GDF11 latente). En realizaciones adicionales, la proteasa puede ser una metaloproteasa de la familia de BMP1/TLD tal como BMP1, TED, proteína similar a Tolloid 1 (TLL-1), o proteína similar a Tolloid 2 (TLL-2). La liberación no proteolítica tal como se usa en el presente documento significa una liberación espontánea de GDF11 maduro a partir de GDF11 latente, que no está acompañada por la escisión proteolítica de GDF11 latente. La liberación no proteolítica incluye, por ejemplo, una liberación de GDF11 maduro incubando GDF11 latente por ejemplo, a 37 grados C en ausencia de una proteasa que escinde GDF11 latente. La mayor parte de los anticuerpos anti-miostatina conocidos hasta la fecha no eran específicos para miostatina. Estos anticuerpos tienen alta afinidad por otros miembros de la superfamilia de TGF-beta, tales como GDF11 y neutralizan las actividades biológicas de los mismos. GDF11 desempeña un papel importante durante la embriogénesis, y es responsable de la transformación homeótica del esqueleto axial. Ratones deficientes en GDF11 homocigotos son perinatal letales, ratones con una copia silvestre del gen GDF11 son viables pero tienen defectos esqueléticos. Puesto que GDF11 desempeña un papel importante durante la embriogénesis, un antagonista que inhibe GDF11 plantea riesgos de seguridad teóricos que podrían presentarse o bien como toxicidad en pacientes tratados o bien como toxicidad en la reproducción, por ejemplo, en mujeres en edad de procrear. Por tanto, existe la necesidad de una inhibición específica de la actividad de miostatina en tratamientos de trastornos asociados con miostatina para los que es deseable aumentar la masa, tamaño, fuerza muscular, etc., particularmente en mujeres en edad de procrear.
[0472] En otro aspecto, la invención proporciona anticuerpos anti-miostatina que muestran características de unión dependiente del pH. Tal como se usa en el presente documento, la expresión “unión dependiente del pH” significa que el anticuerpo muestra “unión reducida a miostatina a pH ácido en comparación con su unión a pH neutro” (para los fines de la presente divulgación, ambas expresiones pueden usarse indistintamente). Por ejemplo, anticuerpos “con características de unión dependiente del pH” incluyen anticuerpos que se unen a miostatina con mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido. En ciertas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención se unen a miostatina con al menos 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000, o más veces mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido. En algunas realizaciones, los anticuerpos se unen a miostatina (por ejemplo, miostatina latente o miostatina como propéptido) con mayor afinidad a pH 7,4 que a pH 5,8. En realizaciones adicionales, los anticuerpos se unen a miostatina con al menos 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000, o más veces mayor afinidad a pH 7,4 que a pH 5,8.
[0474] Cuando un antígeno es una proteína soluble, la unión de un anticuerpo al antígeno puede dar como resultado una semivida ampliada del antígeno en plasma (es decir, aclaramiento reducido del antígeno desde el plasma), puesto que el anticuerpo puede tener una semivida en plasma más larga que el propio antígeno y puede servir como grupo transportador para el antígeno. Esto se debe al reciclado del complejo antígeno-anticuerpo por FcRn a través de la ruta endosómica en la célula (Roopenian, Nat. Rev. Immunol.7(9): 715-725 (2007)). Sin embargo, se espera que un anticuerpo con características de unión dependiente del pH, que se une a su antígeno en el entorno extracelular neutro mientras se libera el antígeno en compartimentos endosómicos ácidos tras su entrada en células, tenga propiedades superiores en cuanto a neutralización de antígeno y aclaramiento con relación a su homólogo que se une de manera independiente del pH (Igawaet al., Nature Biotechnol. 28(11):1203-1207 (2010); Devanaboyinaet al., mAbs 5(6):851-859 (2013); documento WO 2009/125825).
[0476] La “afinidad” de un anticuerpo por miostatina, para los fines de la presente divulgación, se expresa en cuanto a la KD del anticuerpo. La KD de un anticuerpo se refiere a la constante de disociación de equilibrio de una interacción anticuerpo-antígeno. Cuando mayor es el valor de KD para un anticuerpo que se une a su antígeno, más débil será su afinidad de unión para ese antígeno particular. Por consiguiente, tal como se usa en el presente documento, la expresión “mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido” (o la expresión equivalente “unión dependiente del pH”) significa que la KD del anticuerpo que se une a miostatina a pH ácido es mayor que la KD del anticuerpo que se une a miostatina a pH neutro. Por ejemplo, en el contexto de la presente invención, se considera que un anticuerpo se une a miostatina con mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido si la KD del anticuerpo que se une a miostatina a pH ácido es al menos 2 veces mayor que la KD del anticuerpo que se une a miostatina a pH neutro. Por tanto, la presente invención incluye anticuerpos que se unen a miostatina a pH ácido con una KD que es al menos 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000, o más veces mayor que la KD del anticuerpo que se une a miostatina a pH neutro. En otra realización, el valor de KD del anticuerpo a pH neutro puede ser de 10<-7>M, 10<-8>M, 10<-9>M, 10<-10>M, 10<-11>M, 10<-12>M, o menor. En otra realización, el valor de KD del anticuerpo a pH ácido puede ser de 10<-9>M, 10<-8>M, 10<-7>M, 10<-6>M, o mayor.
[0477] En realizaciones adicionales se considera que un anticuerpo se une a miostatina (por ejemplo, miostatina latente o miostatina como propéptido) con una mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido si la KD del anticuerpo que se une a miostatina a pH 5,8 es al menos 2 veces mayor que la KD del anticuerpo que se une a miostatina a pH 7,4. En algunas realizaciones, los anticuerpos proporcionados se unen a miostatina a pH 5,8 con una KD que es al menos 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000, o más veces mayor que la KD del anticuerpo que se une a miostatina a pH 7,4. En otra realización, el valor de KD del anticuerpo a pH 7,4 puede ser de 10<-7>M, 10<-8>M, 10<-9>M, 10<-10>M, 10<-11>M, 10<-12>M, o menor. En otra realización, el valor de KD del anticuerpo a pH 5,8 puede ser de 10<-9>M, 10<-8>M, 10<-7>M, 10<-6>M, o mayor.
[0479] Las propiedades de unión de un anticuerpo para un antígeno particular también pueden expresarse en cuanto a la kd del anticuerpo. La kd de un anticuerpo se refiere a la constante de velocidad de disociación del anticuerpo con respecto a un antígeno particular y se expresa en cuanto a la inversa de los segundos (es decir, s<-1>). Un aumento del valor de kd significa una unión más débil de un anticuerpo a su antígeno. Por tanto, la presente invención incluye anticuerpos que se unen a miostatina con un mayor valor de kd a pH ácido que a pH neutro. La presente invención incluye anticuerpos que se unen a miostatina a pH ácido con una kd que es al menos 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000, o más veces mayor que la kd del anticuerpo que se une a miostatina a pH neutro. En otra realización, el valor de kd del anticuerpo a pH neutro puede ser de 10<-2>1/s, 10<-3>1/s, 10<-4>1/s, 10<-5>1/s, 10<-6>1/s, o menor. En otra realización, el valor de kd del anticuerpo a pH ácido puede ser de 10<-3>1/s, 10<-2>1/s, 10<-1>1/s, o mayor. La invención también incluye anticuerpos que se unen a miostatina (por ejemplo, miostatina latente o miostatina como propéptido) con un mayor valor de kd a pH 5,8 que a pH 7,4. La invención incluye anticuerpos que se unen a miostatina a pH 5,8 con una kd que es al menos 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000, o más veces mayor que la kd del anticuerpo que se une a miostatina a pH 7,4. En otra realización, el valor de kd del anticuerpo a pH 7,4 puede ser de 10<-2>1/s, 10<-3>1/s, 10<-4>1/s, 10<-5>1/s, 10<-6>1/s, o menor. En otra realización, el valor de kd del anticuerpo a pH 5,8 puede ser de 10<-3>1/s, 10<-2>1/s, 10<-1>1/s, o mayor.
[0481] En ciertos casos, una “unión reducida a miostatina a pH ácido en comparación con su unión a pH neutro” se expresa en cuanto a la razón del valor de KD del anticuerpo que se une a miostatina a pH ácido con respecto al valor de KD del anticuerpo que se une a miostatina a pH neutro (o viceversa). Por ejemplo, puede considerarse que un anticuerpo muestra “unión reducida a miostatina a pH ácido en comparación con su unión a pH neutro”, para los fines de la presente invención, si el anticuerpo muestra una razón de KD ácida/neutra de 2 o mayor. En ciertas realizaciones, la razón de KD a pH 5,8/pH 7,4 para un anticuerpo anti-miostatina de la presente invención es de 2 o mayor. En ciertas realizaciones a modo de ejemplo, la razón de KD ácida/neutra para un anticuerpo de la presente invención puede ser de 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000, o mayor. En otra realización, el valor de KD del anticuerpo a pH neutro puede ser de 10<-7>M, 10<-8>M, 10<-9>M, 10<-10>M, 10<-11>M, 10<-12>M, o menor. En otra realización, el valor de KD del anticuerpo a pH ácido puede ser de 10<-9>M, 10<-8>M, 10<-7>M, 10<-6>M, o mayor. En casos adicionales, puede considerarse que un anticuerpo muestra “unión reducida a miostatina (por ejemplo, miostatina latente) a pH ácido en comparación con su unión a pH neutro”, si el anticuerpo muestra una razón de KD a pH 5,8/pH 7,4 de 2 o mayor. En ciertas realizaciones a modo de ejemplo, la razón de KD a pH 5,8/pH 7,4 para el anticuerpo puede ser de 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000, o mayor. En otra realización, el valor de KD del anticuerpo a pH 7,4 puede ser de 10<-7>M, 10<-8>M, 10<-9>M, 10<-10>M, 10<-11>M, 10<-12>M, o menor. En otra realización, el valor de KD del anticuerpo a pH 5,8 puede ser de 10<-9>M, 10<-8>M, 10<-7>M, 10<-6>M, o mayor.
[0483] En ciertos casos, una “unión reducida a miostatina a pH ácido en comparación con su unión a pH neutro” se expresa en cuanto a la razón del valor de kd del anticuerpo que se une a miostatina a pH ácido con respecto al valor de kd del anticuerpo que se une a miostatina a pH neutro (o viceversa). Por ejemplo, puede considerarse que un anticuerpo muestra “unión reducida a miostatina a pH ácido en comparación con su unión a pH neutro”, para los fines de la presente invención, si el anticuerpo muestra una razón de KD ácida/neutra de 2 o mayor. En ciertas realizaciones a modo de ejemplo, la razón de KD a pH 5,8/pH 7,4 para un anticuerpo de la presente invención es 2 o mayor. En ciertas realizaciones a modo de ejemplo, la razón de KD ácida/neutra para un anticuerpo de la presente invención puede ser de 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000, o mayor. En otra realización, el valor de kd del anticuerpo a pH neutro puede ser de 10<-2>1/s, 10<-3>1/s, 10<-4>1/s, 10<-5>1/s, 10<-6>1/s, o menor. En otra realización, el valor de kd del anticuerpo a pH ácido puede ser de 10<-3>1/s, 10<-2>1/s, 10<-1>1/s, o mayor. En ciertas realizaciones a modo de ejemplo, la razón de KD a pH 5,8/pH 7,4 para un anticuerpo de la presente invención puede ser de 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000, o mayor. En otra realización, el valor de kd del anticuerpo a pH 7,4 puede ser de 10<-2>1/s, 10<-3>1/s, 10<-4>1/s, 10<-5>1/s, 10<-6>1/s, o menor. En otra realización, el valor de kd del anticuerpo a pH 5,8 puede ser de 10<-3>1/s, 10<-2>1/s, 10<-1>1/s, o mayor.
[0485] Tal como se usa en el presente documento, la expresión “pH ácido” significa un pH de 4,0 a 6,5. La expresión “pH ácido” incluye valores de pH de uno cualquiera de 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, y 6,5. En aspectos particulares, el “pH ácido” es de 5,8.
[0487] Tal como se usa en el presente documento, la expresión “pH neutro” significa un pH de 6,7 a aproximadamente 10,0, La expresión “pH neutro” incluye valores de pH de uno cualquiera de 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, y 10,0. En aspectos particulares, el “pH neutro” es de 7,4.
[0488] Pueden determinarse valores de KD, y valores de kd, tal como se expresan en el presente documento, usando un biosensor basado en resonancia de plasmón superficial para caracterizar interacciones anticuerpo-antígeno. (Véase, por ejemplo, el ejemplo 7, en el presente documento.) Pueden determinarse valores de KD, y valores de kd a 25 grados C o 37 grados C.
[0489] En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-miostatina de la presente divulgación se une a miostatina de más de una especie. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-miostatina se une a miostatina de un ser humano y un animal no humano. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-miostatina se une a miostatina de ser humano, ratón, y mono (por ejemplo, macaco cangrejero, macaco Rhesus, tití, chimpancé, o babuino).
[0490] Un anticuerpo anti-miostatina de la presente invención se une a miostatina latente de más de una especie. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-miostatina se une a miostatina latente de un ser humano y un animal no humano. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-miostatina se une a miostatina latente de ser humano, ratón, y mono.
[0491] En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-miostatina de la presente divulgación se une a miostatina como propéptido de más de una especie. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-miostatina se une a miostatina como propéptido de un ser humano y un animal no humano. En realizaciones adicionales, el anticuerpo antimiostatina se une a miostatina como propéptido de ser humano, ratón, y mono.
[0492] En un aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo anti-miostatina que forma un complejo inmunitario (es decir, complejo antígeno-anticuerpo) con miostatina. En ciertas realizaciones, dos o más anticuerpos antimiostatina se unen a dos o más moléculas de miostatina para formar un complejo inmunitario. Esto es posible porque la miostatina existe como homodímero que contiene dos moléculas de miostatina mientras que un anticuerpo tiene dos sitios de unión a antígeno. El anticuerpo anti-miostatina puede unirse al mismo epítopo en una molécula de miostatina o puede unirse a epítopos diferentes en una molécula de miostatina, de manera muy similar a un anticuerpo biespecífico. En términos generales, cuando dos o más anticuerpos forman un complejo inmunitario con dos o más antígenos, el complejo inmunitario resultante puede unirse fuertemente a receptores de Fc que existen en las superficies celulares debido a efectos de avidez a través de las regiones Fc de los anticuerpos en el complejo y pueden absorberse entonces en la célula con alta eficiencia. Por tanto, el anticuerpo anti-miostatina mencionado anteriormente que puede formar un complejo inmunitario que contiene dos o más anticuerpos anti-miostatina y dos o más moléculas de miostatina puede conducir a un rápido aclaramiento de miostatina desde el plasma en un cuerpo vivo, a través de la fuerte unión a receptores de Fc debido a efectos de avidez.
[0493] Además, se cree que un anticuerpo con características de unión dependiente del pH tiene propiedades superiores en cuanto a neutralización de antígeno y aclaramiento con relación a su homólogo que se une de manera independiente del pH (Igawaet al., Nature Biotech. 28(11):1203-1207 (2010); Devanaboyinaet al. mAbs 5(6):851-859 (2013); documento WO 2009/125825). Por tanto, se espera que un anticuerpo que tiene ambas propiedades anteriores, es decir, un anticuerpo que tiene características de unión dependiente del pH y que forma un complejo inmunitario que contiene dos o más anticuerpos con dos o más antígenos, tenga propiedades incluso más superiores para la eliminación altamente acelerada de antígenos desde el plasma (documento WO 2013/081143). En la presente invención, el anticuerpo que se une a miostatina latente e inhibe la activación de miostatina comprende una secuencia de VH de SEQ ID NO: 86 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 96; o una secuencia de VH de SEQ ID NO: 87 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 96; o una secuencia de VH de SEQ ID NO: 88 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 96; o una secuencia de VH de SEQ ID NO: 89 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 96; o una secuencia de VH de SEQ ID NO: 90 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 96; o una secuencia de VH de SEQ ID NO: 91 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 96; o una secuencia de VH de SEQ ID NO: 92 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 97; o una secuencia de VH de SEQ ID NO: 93 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 97; o una secuencia de VH de SEQ ID NO: 94 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 97; o una secuencia de VH de SEQ ID NO: 95 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 97, y es para su uso en el tratamiento de una enfermedad de desgaste muscular.
[0494] En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-miostatina que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, o seis HVR seleccionadas de (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 55-57, 114-115, 126; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 58-60, 116-120, 127; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 61-64, 121, 128; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 65-69, 122-124, 129; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 70-72, 125, 130; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 73-74, 131.
[0495] En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-miostatina que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, o seis HVR seleccionadas de (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 55-57; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 58-60; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 61-64; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 65-69; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 70-72; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 73-74.
[0497] En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-miostatina que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, o seis regiones hipervariables (HVR) seleccionadas de (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO:114-115; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 116-120; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 122-124; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 125; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 73-74.
[0499] En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-miostatina que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, o seis HVR seleccionadas de (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74. En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-miostatina que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, o seis HVR seleccionadas de (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74.
[0501] En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-miostatina que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, o seis HVR seleccionadas de (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 126; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 127; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 128; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 130; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 131.
[0503] En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias de HVR de VH seleccionadas de (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 55-57, 114-115, 126; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 58-60, 116-120, 127; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 61-64, 121, 128. En una realización, el anticuerpo comprende una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 61-64, 121, 128. En otra realización, el anticuerpo comprende una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 61-64, 121, 128 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 73-74, 131. En una realización adicional, el anticuerpo comprende una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 61-64, 121, 128, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 73-74, 131, y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 58-60, 116-120, 127. En una realización adicional, el anticuerpo comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 55-57, 114-115, 126; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 58-60, 116-120, 127; y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 61-64, 121, 128.
[0505] En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias de HVR de VH seleccionadas de (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 55-57; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 58-60; y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 61-64. En una realización, el anticuerpo comprende una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 61-64. En otra realización, el anticuerpo comprende una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 61-64 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 73-74. En una realización adicional, el anticuerpo comprende una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 61-64, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 73-74, y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 58-60. En una realización adicional, el anticuerpo comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 55-57; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 58-60; y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 61-64.
[0506] En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias de HVR de VH seleccionadas de (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 114-115; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 116-120; y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121. En una realización, el anticuerpo comprende una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121. En otra realización, el anticuerpo comprende una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 73-74. En una realización adicional, el anticuerpo comprende una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 73-74, y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 116-120. En una realización adicional, el anticuerpo comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 114-115; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 116-120; y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121.
[0508] En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias de HVR de VH seleccionadas de (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63. En una realización, el anticuerpo comprende una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63. En otra realización, el anticuerpo comprende una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74. En una realización adicional, el anticuerpo comprende una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74, y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58. En una realización adicional, el anticuerpo comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63.
[0510] En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias de HVR de VH seleccionadas de (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 126; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 127; y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 128. En una realización, el anticuerpo comprende una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 128. En otra realización, el anticuerpo comprende una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 128 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 131. En una realización adicional, el anticuerpo comprende una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 128, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 131, y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 127. En una realización adicional, el anticuerpo comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 126; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 127; y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 128.
[0512] En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias de HVR de VL seleccionadas de (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 65-69,122-124, 129; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 70-72, 125, 130; y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 73-74, 131. En una realización, el anticuerpo comprende (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 65-69,122-124, 129; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 70-72, 125, 130; y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 73-74, 131.
[0514] En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias de HVR de VL seleccionadas de (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 65-69; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 70-72; y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 73-74. En una realización, el anticuerpo comprende (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 65-69; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 70-72; y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 73-74.
[0516] En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias de HVR de VL seleccionadas de (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 122-124; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 125; y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 73-74. En una realización, el anticuerpo comprende (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 122-124; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 125; y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 73-74.
[0517] En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias de HVR de VL seleccionadas de (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74. En una realización, el anticuerpo comprende (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74. En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias de HVR de VL seleccionadas de (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74. En una realización, el anticuerpo comprende (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74.
[0519] En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias de HVR de VL seleccionadas de (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 130; y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 131. En una realización, el anticuerpo comprende (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 130; y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 131.
[0521] En otro aspecto, un anticuerpo de la divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias de HVR de VH seleccionadas de (i) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 55-57, 114, 115, 126 (ii) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 58-60, 116-120, 127, y (iii) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 61-64, 121, 128; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias de HVR de VL seleccionadas de (i) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 65-69, 122-124, 129, (ii) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 70-72, 125, 130 y (iii) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 73-74, 131.
[0523] En otro aspecto, un anticuerpo de la divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias de HVR de VH seleccionadas de (i) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 55-57, (ii) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 58-60, y (iii) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 61-64; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias de HVR de VL seleccionadas de (i) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 65-69, (ii) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 70-72, y (iii) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 73-74.
[0525] En otro aspecto, un anticuerpo de la divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias de HVR de VH seleccionadas de (i) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 114-115, (ii) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 116-120, y (iii) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias de HVR de VL seleccionadas de (i) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 122-124, (ii) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 125, y (iii) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 73-74. En otro aspecto, un anticuerpo de la divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias de HVR de VH seleccionadas de (i) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114, (ii) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58, y (iii) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias de HVR de VL seleccionadas de (i) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122, (ii) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71, y (iii) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74. En otro aspecto, un anticuerpo de la divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias de HVR de VH seleccionadas de (i) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114, (ii) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58, y (iii) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias de HVR de VL seleccionadas de (i) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123, (ii) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71, y (iii) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74.
[0526] En otro aspecto, un anticuerpo de la divulgación comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias de HVR de VH seleccionadas de (i) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 126, (ii) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 127, y (iii) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 128; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias de HVR de VL seleccionadas de (i) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129, (ii) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 130, y (iii) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 131.
[0527] En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo que comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 55-57, 114-115, 126; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 58-60, 116-120, 127; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 61-64, 121, 128; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 65-69, 122-124, 129; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 70-72, 125, 130; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 73-74, 131. En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo que comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 55-57, 114-115; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 58-60, 116-120; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 61-64, 121; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 65-69, 122-124; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 70-72, 125; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 73-74.
[0528] En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo que comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 114-115; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 116-120; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 121; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 122-124; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 125; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 73-74.
[0529] En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo que comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74. En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo que comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74. En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo que comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 126; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 127; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 128; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 129; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 130; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 131.
[0530] En ciertas realizaciones, se sustituyen uno cualquiera o más aminoácidos de un anticuerpo anti-miostatina proporcionado anteriormente en las siguientes posiciones de HVR: (a) en HVR-H1 (SEQ ID NO: 55), en las posiciones 1, y 2; (b) en HVR-H2 (SEQ ID NO: 58), en las posiciones 4, 7, 8, 10, 11, 12, y 16; (c) en HVR-H3 (SEQ ID NO: 61), en las posiciones 5, 7, y 11; (d) en HVR-L1 (SEQ ID NO: 65), en las posiciones 1, 2, 5, 7, 8, y 9; (e) en HVR-L2 (SEQ ID NO:70), en las posiciones 3, y 7; y (f) en HVR-L3 (SEQ ID NO:73), en la posición 8.
[0531] En ciertas realizaciones, la una o más sustituciones de aminoácidos de un anticuerpo anti-miostatina son sustituciones conservativas, tal como se proporciona en el presente documento. En ciertas realizaciones, pueden realizarse una cualquiera o más de las siguientes sustituciones en cualquier combinación: (a) en HVR-H1 (SEQ ID NO: 55), S1H; Y2T, D, o E; (b) en HVR-H2 (SEQ ID NO: 58), Y4H; S7K; T8M o K; Y10K; A11M o E; S12E; G16K; (c) en HVR-H3 (SEQ ID NO: 61), Y5H; T7H; L11K; (d) en HVR-L1 (SEQ ID NO: 65), Q1T; S2T; S5E; Y7F; D8H; N9D o A o E; (e) en HVR-L2 (SEQ ID NO: 70), S3E; S7Y, F o W; y (f) en HVR-L3 (SEQ ID NO: 73), L8R.
[0532] Todas las posibles combinaciones de las sustituciones anteriores están abarcadas por las secuencias consenso de las SEQ ID NO: 126, 127, 128, 129, 130, y 131 para HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2, y HVR-L3, respectivamente.
[0533] En cualquiera de las realizaciones anteriores, un anticuerpo anti-miostatina puede humanizarse. En una realización, un anticuerpo anti-miostatina comprende HVR como en cualquiera de las realizaciones anteriores, y comprende además una región de marco humana aceptora, por ejemplo, una región de marco de inmunoglobulina humana o una región de marco consenso humana. En otra realización, un anticuerpo anti-miostatina comprende HVR como en cualquiera de las realizaciones anteriores, y comprende además un VH o VL que comprende una secuencia de FR. En una realización adicional, el anticuerpo anti-miostatina comprende las siguientes secuencias de FR de dominio variable de cadena pesada y/o de cadena ligera FR: para el dominio variable de cadena pesada, la FR1 comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 132-134, FR2 comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 135-136, FR3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 137, FR4 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 138. Para el dominio variable de cadena ligera, FR1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 139, FR2 comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 140-141, FR3 comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 142-143, FR4 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 144.
[0535] En un aspecto, que está presente únicamente con fines de ilustración, se proporciona un anticuerpo anti-miostatina que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, o seis HVR seleccionadas de (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 157-162; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 163-168; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 169-174; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 175-180; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 181-186; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 187-192.
[0537] En un aspecto, que está presente únicamente con fines de ilustración, se proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias de HVR de VH seleccionadas de (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 157-162; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 163-168; y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 169-174. En una realización que está presente únicamente con fines de ilustración, el anticuerpo comprende una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 169-174. En otra realización que está presente únicamente con fines de ilustración, el anticuerpo comprende una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 169-174 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 187-192. En una realización adicional que está presente únicamente con fines de ilustración, el anticuerpo comprende una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 169-174, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 187-192, y una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 163-168. En una realización adicional que está presente únicamente con fines de ilustración, el anticuerpo comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 157-162; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 163-168; y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 169-174.
[0539] En otro aspecto que está presente únicamente con fines de ilustración, se proporciona un anticuerpo que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias de HVR de VL seleccionadas de (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 175-180; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 181-186; y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 187-192. En una realización que está presente únicamente con fines de ilustración, el anticuerpo comprende (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 175-180; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 181-186; y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 187-192.
[0541] En otro aspecto que está presente únicamente con fines de ilustración, un anticuerpo comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias de HVR de VH seleccionadas de (i) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 157-162, (ii) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 163-168, y (iii) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 169-174; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos, o las tres secuencias de HVR de VL seleccionadas de (i) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 175-180, (ii) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 181-186, y (iii) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 187-192.
[0543] En otro aspecto que está presente únicamente con fines de ilustración, se proporciona un anticuerpo que comprende (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 157-162; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 163-168; (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 169-174; (d) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 175-180; (e) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 181-186; y (f) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 187-192.
[0544] En otro aspecto, un anticuerpo anti-miostatina comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada (VH) que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 16-30, 32-34, y 86-95. En ciertas realizaciones, una secuencia de VH que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o el 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones, o deleciones con relación a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-miostatina que comprende esa secuencia mantiene la capacidad para unirse a miostatina. En ciertas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o delecionado en una cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 16-30, 32-34, y 86-95. En ciertas realizaciones, se producen sustituciones, inserciones, o deleciones en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-miostatina comprende la secuencia de VH en una cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 16-30, 32-34, y 86-95, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una realización particular, el VH comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 55-57, 114-115, 126, (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 58-60, 116-120, 127, y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 61-64, 121, 128. Las modificaciones postraduccionales incluyen, pero no se limitan a, una modificación de glutamina o glutamato en el extremo N-terminal de cadena pesada o cadena ligera a ácido piroglutámico mediante piroglutamilación.
[0546] En otro aspecto que está presente únicamente con fines de ilustración, un anticuerpo anti-miostatina comprende una secuencia de VH que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 16-30, 32, 33, y 34. En ciertas realizaciones, una secuencia de VH que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o el 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones, o deleciones con relación a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-miostatina que comprende esa secuencia mantiene la capacidad para unirse a miostatina. En ciertas realizaciones que están presentes únicamente con fines de ilustración, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o delecionado en una cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 16-30, 32, 33, y 34. En ciertas realizaciones, se producen sustituciones, inserciones, o deleciones en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-miostatina que se da a conocer únicamente con fines de ilustración comprende la secuencia de VH en una cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 16-30, 32, 33, y 34, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una realización particular, el VH comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 55-57, (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 58-60, y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 61-64. Las modificaciones postraduccionales incluyen, pero no se limitan a, una modificación de glutamina o glutamato en el extremo N-terminal de cadena pesada o cadena ligera a ácido piroglutámico mediante piroglutamilación.
[0548] En otro aspecto, un anticuerpo anti-miostatina comprende una secuencia de VH que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 86-95. En ciertas realizaciones, una secuencia de VH que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o el 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones, o deleciones con relación a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-miostatina que comprende esa secuencia mantiene la capacidad para unirse a miostatina. En ciertas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o delecionado en una cualquiera de las SEQ ID NO: 86-95. En ciertas realizaciones, se producen sustituciones, inserciones, o deleciones en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-miostatina comprende la secuencia de VH en una cualquiera de las SEQ ID NO: 86-95, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una realización particular, el VH comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 57, 114-115, 126, (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 58, 116-120, 127, y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 63, 121, 128. Las modificaciones postraduccionales incluyen, pero no se limitan a, una modificación de glutamina o glutamato en el extremo N-terminal de cadena pesada o cadena ligera a ácido piroglutámico mediante piroglutamilación.
[0550] En otro aspecto, un anticuerpo anti-miostatina comprende una secuencia de VH que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 86. En ciertas realizaciones, una secuencia de VH que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o el 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones, o deleciones con relación a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-miostatina que comprende esa secuencia mantiene la capacidad para unirse a miostatina. En ciertas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o delecionado en SEQ ID NO: 86. En ciertas realizaciones, se producen sustituciones, inserciones, o deleciones en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-miostatina comprende la secuencia de VH en SEQ ID NO: 86, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una realización particular, el VH comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114, (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58, y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63. Las modificaciones postraduccionales incluyen, pero no se limitan a, una modificación de glutamina o glutamato en el extremo N-terminal de cadena pesada o cadena ligera a ácido piroglutámico mediante piroglutamilación. En otro aspecto, un anticuerpo anti-miostatina comprende una secuencia de VH que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 92. En ciertas realizaciones, una secuencia de VH que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o el 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones, o deleciones con relación a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-miostatina que comprende esa secuencia mantiene la capacidad para unirse a miostatina. En ciertas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o delecionado en SEQ ID NO: 92. En ciertas realizaciones, se producen sustituciones, inserciones, o deleciones en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-miostatina comprende la secuencia de VH en SEQ ID NO: 92, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una realización particular, el VH comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114, (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58, y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63. Las modificaciones postraduccionales incluyen, pero no se limitan a, una modificación de glutamina o glutamato en el extremo N-terminal de cadena pesada o cadena ligera a ácido piroglutámico mediante piroglutamilación.
[0552] En otro aspecto, se da a conocer un anticuerpo anti-miostatina, en el que el anticuerpo comprende un VL que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 15, 31, 35-38, y 96-99. En ciertas realizaciones, una secuencia de VL que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o el 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones, o deleciones con relación a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-miostatina que comprende esa secuencia mantiene la capacidad para unirse a miostatina. En ciertas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o delecionado en una cualquiera de las SEQ ID NO: 15, 31, 35-38, y 96-99. En ciertas realizaciones, se producen las sustituciones, inserciones, o deleciones en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-miostatina comprende la secuencia de VL en una cualquiera de las SEQ ID NO: 15, 31, 35-38, y 96-99, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una realización particular, el VL comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 65-69, 122-124, 129; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 70-72, 125, 130; y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 73-74, 131. Las modificaciones postraduccionales incluyen, pero no se limitan a, una modificación de glutamina o glutamato en el extremo N-terminal de cadena pesada o cadena ligera a ácido piroglutámico mediante piroglutamilación.
[0554] En otro aspecto que está presente únicamente con fines de ilustración, se proporciona un anticuerpo anti-miostatina, en el que el anticuerpo comprende un VL que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 15, 31, 35, 36, 37, y 38. En ciertas realizaciones, una secuencia de VL que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o el 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones, o deleciones con relación a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-miostatina que comprende esa secuencia mantiene la capacidad para unirse a miostatina. En ciertas realizaciones que están presentes únicamente con fines de ilustración, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o delecionado en una cualquiera de las SEQ ID NO: 15, 31, 35, 36, 37, y 38. En ciertas realizaciones, se producen las sustituciones, inserciones, o deleciones en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-miostatina que se da a conocer únicamente con fines de ilustración comprende la secuencia de VL en una cualquiera de las SEQ ID NO: 15, 31, 35, 36, 37, y 38, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una realización particular, el VL comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 65-69; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 70-72; y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 73-74. Las modificaciones postraduccionales incluyen, pero no se limitan a, una modificación de glutamina o glutamato en el extremo N-terminal de cadena pesada o cadena ligera a ácido piroglutámico mediante piroglutamilación.
[0556] En otro aspecto, se da a conocer un anticuerpo anti-miostatina, en el que el anticuerpo comprende un VL que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 96-99. En ciertas realizaciones, una secuencia de VL que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o el 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones, o deleciones con relación a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-miostatina que comprende esa secuencia mantiene la capacidad para unirse a miostatina. En ciertas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o delecionado en una cualquiera de las SEQ ID NO: 96-99. En ciertas realizaciones, se producen las sustituciones, inserciones, o deleciones en regiones fuera de las HVR. Opcionalmente, el anticuerpo anti-miostatina comprende la secuencia de VL en una cualquiera de las SEQ ID NO: 96-99, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una realización particular, el VL comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 122-124, 129; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 71, 125, 130; y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74, 131. Las modificaciones postraduccionales incluyen, pero no se limitan a, una modificación de glutamina o glutamato en el extremo N-terminal de cadena pesada o cadena ligera a ácido piroglutámico mediante piroglutamilación.
[0558] En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-miostatina, en el que el anticuerpo comprende un VL que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 96. En ciertas realizaciones, una secuencia de VL que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o el 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones, o deleciones con relación a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-miostatina que comprende esa secuencia mantiene la capacidad para unirse a miostatina. En ciertas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o delecionado en SEQ ID NO: 96. En ciertas realizaciones, se producen las sustituciones, inserciones, o deleciones en regiones fuera de las HVR. Opcionalmente, el anticuerpo anti-miostatina comprende la secuencia de VL en SEQ ID NO: 96, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una realización particular, el VL comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 122; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74. Las modificaciones postraduccionales incluyen, pero no se limitan a, una modificación de glutamina o glutamato en el extremo N-terminal de cadena pesada o cadena ligera a ácido piroglutámico mediante piroglutamilación. En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-miostatina, en el que el anticuerpo comprende un VL que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 97. En ciertas realizaciones, una secuencia de VL que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o el 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones, o deleciones con relación a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-miostatina que comprende esa secuencia mantiene la capacidad para unirse a miostatina. En ciertas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o delecionado en SEQ ID NO: 97. En ciertas realizaciones, se producen las sustituciones, inserciones, o deleciones en regiones fuera de las HVR. Opcionalmente, el anticuerpo anti-miostatina comprende la secuencia de VL en SEQ ID NO: 97, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una realización particular, el VL comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 123; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74. Las modificaciones postraduccionales incluyen, pero no se limitan a, una modificación de glutamina o glutamato en el extremo N-terminal de cadena pesada o cadena ligera a ácido piroglutámico mediante piroglutamilación.
[0560] En otro aspecto, se da a conocer un anticuerpo anti-miostatina, en el que el anticuerpo comprende un VH como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente, y un VL como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente. En una realización, el anticuerpo comprende las secuencias de VH y VL en una cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 16-30, 32-34, y 86-95 y una cualquiera de las SEQ ID NO: 15, 31, 35-38, y 96-99, respectivamente, incluyendo modificaciones postraduccionales de esas secuencias. En una realización que está presente únicamente con fines de ilustración, el anticuerpo comprende las secuencias de VH y VL en una cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 16-30, y 32-34 y una cualquiera de las SEQ ID NO: 15, 31, y 35-38, respectivamente, incluyendo modificaciones postraduccionales de esas secuencias. En una realización, el anticuerpo comprende las secuencias de VH y VL en una cualquiera de las SEQ ID NO: 86-95 y una cualquiera de las SEQ ID NO: 96-99, respectivamente, incluyendo modificaciones postraduccionales de esas secuencias. Las modificaciones postraduccionales incluyen, pero no se limitan a, una modificación de glutamina o glutamato en el extremo N-terminal de cadena pesada o cadena ligera a ácido piroglutámico mediante piroglutamilación.
[0562] En otro aspecto, se da a conocer un anticuerpo anti-miostatina, en el que el anticuerpo comprende un VH como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente, y un VL como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente. En una realización, el anticuerpo de la invención comprende las secuencias de VH y VL en SEQ ID NO: 86 y SEQ ID NO: 96, respectivamente, incluyendo modificaciones postraduccionales de esas secuencias. En una realización, el anticuerpo de la invención comprende las secuencias de VH y VL en SEQ ID NO: 92 y SEQ ID NO: 97, respectivamente, incluyendo modificaciones postraduccionales de esas secuencias. Las modificaciones postraduccionales incluyen, pero no se limitan a, una modificación de glutamina o glutamato en el extremo N-terminal de cadena pesada o cadena ligera a ácido piroglutámico mediante piroglutamilación.
[0564] En otro aspecto que está presente únicamente con fines de ilustración, un anticuerpo anti-miostatina comprende una secuencia de VH que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 12, 145-150. En ciertas realizaciones, una secuencia de VH que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o el 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones, o deleciones con relación a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-miostatina que comprende esa secuencia mantiene la capacidad para unirse a miostatina. En ciertas realizaciones que están presentes únicamente con fines de ilustración, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o delecionado en una cualquiera de las SEQ ID NO: 12, 145-150. En ciertas realizaciones, se producen sustituciones, inserciones, o deleciones en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-miostatina que se da a conocer únicamente con fines de ilustración comprende la secuencia de VH en una cualquiera de las SEQ ID NO: 12, 145-150, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una realización particular que está presente únicamente con fines de ilustración, el VH comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 55, 157-162, (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 58, 163-168, y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 61, 169-174. Las modificaciones postraduccionales incluyen, pero no se limitan a, una modificación de glutamina o glutamato en el extremo N-terminal de cadena pesada o cadena ligera a ácido piroglutámico mediante piroglutamilación.
[0565] En otro aspecto que está presente únicamente con fines de ilustración, se da a conocer un anticuerpo antimiostatina, en el que el anticuerpo comprende a dominio variable de cadena ligera (VL) que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 14, 151-156. En ciertas realizaciones, una secuencia de VL que tiene al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o el 99 % de identidad contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas), inserciones, o deleciones con relación a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-miostatina que comprende esa secuencia mantiene la capacidad para unirse a miostatina. En ciertas realizaciones que están presentes únicamente con fines de ilustración, un total de 1 a 10 aminoácidos se han sustituido, insertado y/o delecionado en una cualquiera de las SEQ ID NO: 14, 151-156. En ciertas realizaciones, se producen las sustituciones, inserciones, o deleciones en regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-miostatina que se da a conocer únicamente con fines de ilustración comprende la secuencia de VL en una cualquiera de las SEQ ID NO: 14, 151-156, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una realización particular que está presente únicamente con fines de ilustración, el VL comprende una, dos o tres HVR seleccionadas de (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 65, 175-180; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 70, 181-186; y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 73, 187-192. Las modificaciones postraduccionales incluyen, pero no se limitan a, una modificación de glutamina o glutamato en el extremo N-terminal de cadena pesada o cadena ligera a ácido piroglutámico mediante piroglutamilación.
[0566] En otro aspecto, se da a conocer un anticuerpo anti-miostatina, en el que el anticuerpo comprende un VH como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente, y un VL como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente. En una realización que está presente únicamente con fines de ilustración, el anticuerpo comprende las secuencias de VH y VL en una cualquiera de las SEQ ID NO: 12, 145-150 y una cualquiera de las SEQ ID NO: 14, 151-156, respectivamente, incluyendo modificaciones postraduccionales de esas secuencias. Las modificaciones postraduccionales incluyen, pero no se limitan a, una modificación de glutamina o glutamato en el extremo N-terminal de cadena pesada o cadena ligera a ácido piroglutámico mediante piroglutamilación.
[0567] En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-miostatina de la presente invención descrito en el presente documento comprende un VH como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente y una región constante de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 7, 9, 11, 193, 195-198, 227, 228, 229-381. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-miostatina de la presente invención comprende un VL como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente, y una región constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 8 y 10.
[0568] En un aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-miostatina proporcionado en el presente documento. En un aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo descrito en la tabla 2a. En un aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo descrito en las tablas 11a o 13. En ciertas realizaciones, un anticuerpo se proporciona que se une a un epítopo dentro de un fragmento del propéptido de miostatina que consiste en los aminoácidos 21-100 de SEQ ID NO: 78. Como alternativa, el anticuerpo se une al fragmento de propéptido de miostatina que consiste en los aminoácidos 21-80, 41-100, 21-60, 41-80, 61-100, 21-40, 41-60, 61-80, o 81-100, de SEQ ID NO: 78.
[0569] En un aspecto adicional de la divulgación, un anticuerpo anti-miostatina según cualquiera de las realizaciones anteriores es un anticuerpo monoclonal, incluyendo un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En una realización, un anticuerpo anti-miostatina es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fv, Fab, Fab’, scFv, diacuerpo, o F(ab’)<2>. En otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG de longitud completa, por ejemplo, un anticuerpo IgG1 o IgG4 intacto u otra clase o isotipo de anticuerpo tal como se define en el presente documento. En un aspecto adicional, un anticuerpo anti-miostatina según cualquiera de las realizaciones anteriores puede incorporar cualquiera de las características, individualmente o en combinación, tal como se describe en las Secciones 1-7 a continuación.
[0570] 1. Afinidad de anticuerpos
[0571] En ciertas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento tiene una constante de disociación (Kd) de 1 microM o menor, 100 nM o menor, 10 nM o menor, 1 nM o menor, 0,1 nM o menor, 0,01 nM o menor, o 0,001 nM o menor (por ejemplo, 10<-8>M o menor, por ejemplo, desde 10<-8>M hasta 10<-13>M, por ejemplo, desde 10<-9>M hasta 10<-13>M).
[0573] En una realización, se mide Kd mediante un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA). En una realización, se realiza un RIA con la versión de Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno. Por ejemplo, se mide la afinidad de unión en disolución de Fab por antígeno equilibrando Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (<125>I) en presencia de una serie de titulación de antígeno no marcado, luego capturando el antígeno unido con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (véase, por ejemplo, Chenet al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)). Para establecer las condiciones para el ensayo, se recubren placas de múltiples pocillos MICROTITER (marca registrada) (Thermo Scientific) durante la noche con 5 microg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6), y posteriormente se bloquean con albúmina sérica bovina al 2 % (p/v) en PBS durante de dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 grados C). En una placa no adsorbente (Nunc #269620), se mezclan [<125>I]-antígeno 100 pM o 26 pM con diluciones en serie de un Fab de interés (por ejemplo, compatible con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Prestaet al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). El Fab de interés se incuba entonces durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un periodo más largo (por ejemplo, aproximadamente 65 horas) para garantizar que se alcanza el equilibrio. Después de eso, las mezclas se transfieren a la placa de captura para incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). Luego se retira la disolución y se lava la placa ocho veces con polisorbato 20 al 0,1 % (TWEEN-20 (marca registrada)) en PBS. Cuando se han secado las placas, se añaden 150 microl (microlitros)/pocillo de agente de centelleo (MICROSCINT-20<™>; Packard), y las placas se cuentan en un contador gamma TOPCOUNT<™>(Packard) durante diez minutos. Se eligen concentraciones de cada Fab que dan menos del o igual al 20 % de la unión máxima para su uso en ensayos de unión competitivos.
[0575] Según otra realización, se mide Kd usando un ensayo de resonancia de plasmón superficial de BIACORE (marca registrada). Por ejemplo, un ensayo usando un sistema BIACORE (marca registrada)-2000 o un sistema BIACORE (marca registrada)-3000 (BIACORE (marca registrada), Inc., Piscataway, NJ) se realiza a 25 grados C con chips de antígeno CM5 inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (RU). En una realización, se activan chips de biosensor de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE (marca registrada), Inc.) con clorhidrato de N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) según las instrucciones del proveedor. Se diluye el antígeno con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, hasta 5 microg/ml (~0,2 microM) antes de la inyección a una velocidad de flujo de 5 microl/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Tras la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear grupos que no han reaccionado. Para mediciones cinéticas, se inyectan diluciones en serie de dos veces de Fab (de 0,78 nM a 500 nM) en PBS con polisorbato 20 al 0,05 % (TWEEN-20<™>) tensioactivo (PBST) a 25 grados C a una velocidad de flujo de aproximadamente 25 microl/min. Se calculan las velocidades de asociación (k<on>) y velocidades de disociación (k<off>) usando un modelo de unión de Langmuir uno a uno simple (software de evaluación de BIACORE (marca registrada) versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calcula como la razón k<off>/k<on>Véase, por ejemplo, Chenet al., J. Mol. Biol.293:865-881 (1999). Si la tasa de asociación supera 10<6>M<-1>s<-1>mediante el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces la tasa de asociación puede determinarse usando una técnica de extinción de fluorescencia que mide el aumento o la disminución de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25 grados C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma de Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno tal como se mide en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con parada de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO<™>de la serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.
[0577] 2. Fragmentos de anticuerpo
[0579] En ciertas realizaciones, un anticuerpo dado a conocer en el presente documento es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)<2>, Fv, y scFv, y otros fragmentos descritos a continuación. Para una revisión de ciertos fragmentos de anticuerpo, véase Hudsonet al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Para una revisión de fragmentos scFv, véase, por ejemplo, Pluckthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., (Springer-Verlag, Nueva York), págs.
[0580] 269-315 (1994); véanse también, el documento WO 1993/16185; y las patentes estadounidenses n.<os>5.571.894 y 5.587.458. Para una discusión de fragmentos Fab y F(ab’)<2>que comprenden residuos de epítopo de unión a receptores salvajes y que tienen una semividain vivoaumentada, véase la patente estadounidense n.º 5.869.046.
[0582] Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véanse, por ejemplo, los documentos EP 404,097; WO 1993/01161; Hudsonet al., Nat. Med.9:129-134 (2003); y Hollingeret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993). También se describen triacuerpos y tetracuerpos en Hudsonet al., Nat. Med.9:129-134 (2003).
[0584] Los anticuerpos de un solo dominio son fragmentos de anticuerpo que comprende la totalidad o una porción del dominio variable de cadena pesada o la totalidad o una porción del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo. En ciertas realizaciones, un anticuerpo de un solo dominio es un anticuerpo de un solo dominio humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 6.248.516 B1).
[0585] Pueden producirse fragmentos de anticuerpo mediante diversas técnicas, incluyendo pero sin limitarse a, digestión proteolítica de un anticuerpo intacto así como la producción por células huésped recombinantes (por ejemplo,E. colio fago), tal como se describe en el presente documento.
[0586] 3. Anticuerpos quiméricos y humanizados
[0587] En ciertas realizaciones, un anticuerpo dado a conocer en el presente documento es un anticuerpo quimérico. Ciertos anticuerpos quiméricos se describen, por ejemplo, en la patente estadounidense n.º 4.816.567; y Morrisonet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo, o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En un ejemplo adicional, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo “con cambio de clase” en el que la clase o subclase se ha cambiado con respecto a la del anticuerpo parental. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos.
[0588] En ciertas realizaciones, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Normalmente, se humaniza un anticuerpo no humano para reducir la inmunogenicidad para seres humanos, mientras que se mantienen la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano parental. Generalmente, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que HVR, por ejemplo, CDR, (o porciones de las mismas) se derivan de un anticuerpo no humano, y FR (o porciones de las mismas) se derivan de secuencias de anticuerpos humanos. Un anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante humana. En algunas realizaciones, algunos residuos de FR en un anticuerpo humanizado se sustituyen por residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que se derivan los residuos de HVR), por ejemplo, para restaurar o mejorar la especificidad o afinidad de anticuerpo.
[0589] Se revisan los anticuerpos humanizados y métodos de producirlos, por ejemplo, en Almagro, Front. Biosci.13:1619-1633 (2008), y se describen adicionalmente, por ejemplo, en Riechmannet al., Nature 332:323-329 (1988); Queenet al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); las patentes estadounidenses n.<os>5.821.337.7.527.791, 6.982.321, y 7.087.409; Kashmiriet al., Methods 36:25-34 (2005) (que describen el injerto de región determinante de la especificidad (SDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (que describe remodelación superficial (“resurfacing”)); Dall’Acquaet al., Methods 36:43-60 (2005) (que describen “intercambio de FR”); y Osbournet al., Methods 36:61-68 (2005) y Klimkaet al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (que describen el enfoque de “selección guiada” para el intercambio de FR).
[0590] Las regiones de marco humanas que pueden usarse para la humanización incluyen, pero no se limitan a: regiones de marco seleccionadas usando el método “del mejor ajuste” (véase, por ejemplo, Simset al. J. Immunol.151:2296 (1993)); regiones de marco derivadas de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena ligera o pesada (véanse, por ejemplo, Carteret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); y Prestaet al. J. Immunol. 151:2623 (1993)); regiones de marco maduras humanas (mutadas de manera somática) o regiones de marco de línea germinal humana (véase, por ejemplo, Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); y regiones de marco derivadas de bibliotecas de FR de cribado (véanse, por ejemplo, Bacaet al., J. Biol. Chem.272:10678-10684 (1997) y Rosoket al., J. Biol. Chem.271:22611-22618 (1996)).
[0591] 4. Anticuerpos humanos
[0592] En ciertas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo humano. Pueden producirse anticuerpos humanos usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Se describen generalmente anticuerpos humanos en van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol.5:368-374 (2001) y Lonberg, Curr. Opin. Immunol.20:450-459 (2008).
[0593] Pueden prepararse anticuerpos humanos mediante la administración de un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a exposición antigénica. Tales animales contienen normalmente la totalidad o una porción de los loci de inmunoglobulina humana, que reemplazan los loci de inmunoglobulina endógena, o que están presentes de manera extracromosómica o integrados aleatoriamente en los cromosomas del animal. En tales ratones transgénicos, los loci de inmunoglobulina endógena se han inactivado generalmente. Para una revisión de métodos para obtener anticuerpos humanos a partir de animales transgénicos, véase Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Véanse también, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.<os>6.075.181 y 6.150.584 que describen la tecnología XENOMOUSE<™>; la patente estadounidense n.º 5.770.429 que describe la tecnología HUMAB (marca registrada); la patente estadounidense n.º 7.041.870 que describe la tecnología K-M MOUSE (marca registrada), y la publicación de solicitud de patente estadounidense n.º US 2007/0061900, que describe la tecnología VELOCIMOUSE (marca registrada)). Las regiones variables humanas de anticuerpos intactos generadas por tales animales pueden modificarse adicionalmente, por ejemplo, mediante combinación con una región constante humana diferente.
[0594] También pueden producirse anticuerpos humanos mediante métodos basados en hibridomas. Se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma humano-de ratón para la producción de anticuerpos humanos monoclonales se han descrito. (Véase, por ejemplo, Kozbor J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeuret al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs.51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987); y Boerneret al., J. Immunol. 147:86 (1991).) también se describen anticuerpos humanos generados a través de la tecnología del hibridoma de células B humanas en Liet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:3557-3562 (2006). Los métodos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en la patente estadounidense n.º 7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos IgM humanos monoclonales a partir de líneas celulares de hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue 26(4):265-268 (2006) (que describen hibridomas humano-humano). La tecnología del hibridoma humanos (tecnología del trioma) también se describe en Vollmers y Brandlein, Histology and Histopathology 20(3):927-937 (2005) y Vollmers y Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(3):185-191 (2005).
[0595] También pueden generarse anticuerpos humanos mediante el aislamiento de secuencias de dominio variable de clon de Fv seleccionadas de bibliotecas de presentación en fago derivadas de ser humano. Tales secuencias de dominio variable pueden combinarse entonces con un dominio constante humano deseado. Se describen a continuación técnicas para seleccionar anticuerpos humanos de bibliotecas de anticuerpos.
[0596] 5. Anticuerpos derivados de bibliotecas
[0597] Los anticuerpos de la invención pueden aislarse mediante cribado de bibliotecas combinatorias para anticuerpos con la actividad o actividades deseadas. Por ejemplo, se conocen en la técnica una variedad de métodos para generar bibliotecas de presentación en fagos y cribar tales bibliotecas para detectar anticuerpos que presentan las características de unión deseadas. Tales métodos se revisan, por ejemplo, en Hoogenboomet al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (2000); O’Brienet al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) y se describen adicionalmente, por ejemplo, en McCaffertyet al., Nature 348:552-554; Clacksonet al., Nature 352:624-628 (1991); Markset al., J. Mol. Biol.222:581-597 (1992); Marks y Bradbury, en Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhuet al., J. Mol. Biol.338(2):299-310 (2004); Leeet al., J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004); y Leeet al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004).
[0598] En ciertos métodos de presentación en fagos, se clonan por separado repertorios de genes de VH y VL mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en bibliotecas de fagos, que pueden cribarse entonces para detectar fago de unión a antígeno tal como se describe en Winteret al., Ann. Rev. Immunol.
[0599] 12:433-455 (1994). Un fago normalmente presenta fragmentos de anticuerpo, o bien como fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv) o bien como fragmentos Fab. las bibliotecas de fuente inmunizadas proporcionan de anticuerpos alta afinidad al inmunógeno sin el requisito de construir hibridomas. Como alternativa, puede clonarse el repertorio no sometido a experimentación (por ejemplo, de ser humano) para proporcionar una única fuente de anticuerpos a una amplia gama de antígenos no propios y también propios sin ninguna inmunización tal como se describe por Griffithset al., EMBO J, 12:725-734 (1993). Finalmente, también pueden producirse por síntesis bibliotecas no sometidas a experimentación clonando segmentos de gen V no reordenados de células madre, y usando cebadores para PCR que contienen una secuencia aleatoria para codificar para las regiones CDR3 altamente variables y para el reordenamientoin vitro, tal como se describe por Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol. 227:381-388 (1992). Las publicaciones de patente que describen bibliotecas de fagos para anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: la patente estadounidense n.º 5.750.373, las publicaciones estadounidenses n.<os>2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, y 2009/0002360.
[0600] Anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados de bibliotecas de anticuerpos humanos se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpo humanos en el presente documento.
[0601] 6. Anticuerpos multiespecíficos
[0602] En ciertas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión para al menos dos sitios diferentes. En ciertas realizaciones, una de las especificidades de unión es para miostatina y la otra es para cualquier otro antígeno. En ciertas realizaciones, pueden unirse anticuerpos biespecíficos a dos epítopos diferentes de miostatina. También pueden usarse anticuerpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos en células que expresan miostatina. Pueden prepararse anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo.
[0603] Las técnicas para producir anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que tienen diferentes especificidades (véase, Milstein y Cuello, Nature 305:537 (1983)), el documento WO 1993/08829, y Trauneckeret al., EMBO J.10: 3655 (1991)), y la modificación por ingeniería “botón en ojal” (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 5.731.168). Los anticuerpos multiespecíficos también pueden producirse mediante efectos de conducción electrostática por ingeniería para producir moléculas heterodiméricas de Fc de anticuerpos (documento WO 2009/089004A1); reticulación de dos o más anticuerpos o fragmentos (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 4.676.980, y Brennanet al., Science, 229:81 (1985)); usando cremalleras de leucina para producir los anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Kostelnyet al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)); usando la tecnología de “diacuerpos” para producir fragmentos de anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Hollingeret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)); y usando dímeros de Fv de cadena sencilla (sFv) (véase, por ejemplo, Gruberet al., J. Immunol. 152:5368 (1994)); y preparando anticuerpos triespecíficos tal como se describe, por ejemplo, en Tuttet al., J. Immunol.147:60 (1991).
[0604] También se incluyen anticuerpos modificados por ingeniería con tres o más sitios de unión a antígeno funcionales, incluyendo “anticuerpos pulpo”, en el presente documento (véase, por ejemplo, el documento US 2006/0025576A1). El anticuerpo o fragmento en el presente documento también incluye un “Fab de acción dual” o “DAF” que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a miostatina así como a otro antígeno diferente (véase, el documento US 2008/0069820, por ejemplo).
[0605] 7. Variantes de anticuerpo
[0606] En ciertas realizaciones, se contemplan variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/o otras propiedades biológicas del anticuerpo. pueden prepararse variantes de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo mediante la introducción de modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica para el anticuerpo, o mediante síntesis peptídica. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Cualquier combinación de deleción, inserción, y sustitución puede realizarse para llegar al constructo final, siempre que el constructo final presente las características deseadas, por ejemplo, unión a antígeno.
[0607] a. Variantes de sustitución, inserción, y deleción
[0608] En ciertas realizaciones, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una o más sustituciones de aminoácidos. Los sitios de interés para mutagénesis por sustitución incluyen las HVR y FR. Se muestran sustituciones conservativas en la tabla 1 bajo el encabezado de “sustituciones preferidas”. Se proporcionan cambios más sustanciales en la tabla 1 bajo el encabezado de “sustituciones a modo de ejemplo”, y tal como se describen adicionalmente a continuación con referencia a clases de cadenas laterales de aminoácidos. Pueden introducirse sustituciones de aminoácidos en un anticuerpo de interés y cribarse los productos para detectar una actividad deseada, por ejemplo, unión a antígeno mantenida/mejorada, inmunogenicidad disminuida, o ADCC o CDC mejorada.
[0609] (Tabla 1)
[0612]
[0614] Los aminoácidos pueden agruparse según propiedades comunes de la cadena lateral: (1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) restos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe. Las sustituciones no conservativas implicarán intercambiar un miembro de uno de estos grupos por un miembro de otro grupo.
[0615] Un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más restos de la región hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para un estudio adicional tendrá(n) modificaciones (por ejemplo, mejoras) en ciertas propiedades biológicas (por ejemplo, afinidad aumentada, inmunogenicidad reducida) en relación con el anticuerpo parental y/o habrá(n) mantenido sustancialmente ciertas propiedades biológicas del anticuerpo parental. Una variante de sustitución a modo de ejemplo es un anticuerpo madurado por afinidad, que puede generarse convenientemente, por ejemplo, usando técnicas de maduración por afinidad basadas en presentación en fagos tales como las descritas en el presente documento. En resumen, uno o más residuos de HVR se mutan y los anticuerpos variantes se presentan en fagos y se criban para detectar una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión). Pueden realizarse alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad de anticuerpos. Tales alteraciones pueden realizarse en “puntos calientes” de HVR, es decir, residuos codificados por codones que experimentan mutación a alta frecuencia durante el proceso de maduración somática (véase, por ejemplo, Chowdury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008) y/o residuos que entran en contacto con el antígeno, sometiéndose a prueba el VH o VL variante resultante para determinar la afinidad de unión. La maduración por afinidad mediante construcción y reselección de bibliotecas secundarias se ha descrito, por ejemplo, en Hoogenboomet al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brienet al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).) En algunas realizaciones de maduración por afinidad, se introduce diversidad en los genes variables elegidos para maduración mediante cualquiera de una variedad de métodos (por ejemplo, PCR con propensión a errores, transposición de cadenas o mutagénesis dirigida a oligonucleótidos). Entonces se crea una biblioteca secundaria. La biblioteca se criba luego para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro método para introducir diversidad implica enfoques dirigidos a HVR, en los que se aleatorizan varios residuos de HVR (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez). Los residuos de HVR implicados en la unión a antígeno pueden identificarse específicamente, por ejemplo, usando modelado o mutagénesis por barrido de alanina. A menudo se seleccionan como diana CDR-H3 y CDR-L3, en particular.
[0616] En ciertas realizaciones, pueden producirse sustituciones, inserciones, o deleciones dentro de una o más HVR siempre que tales alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo para unirse al antígeno. Por ejemplo, pueden realizarse alteraciones conservativas (por ejemplo, sustituciones conservativas tal como se proporciona en el presente documento) que no reduzcan sustancialmente la afinidad de unión en las HVR. Tales alteraciones pueden, por ejemplo, estar fuera de los residuos en contacto con el antígeno en las HVR. En ciertas realizaciones de las secuencias de VH y VL variantes proporcionadas anteriormente, cada HVR no está alterada, o no contiene más de una, dos o tres sustituciones de aminoácidos.
[0617] Un método útil para la identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que pueden seleccionarse como diana para la mutagénesis se denomina “mutagénesis por barrido de alanina” tal como se describe por Cunningham y Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En este método, un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados tales como Arg, Asp, His, Lys y Glu) se identifican y reemplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con el antígeno se ve afectada. Pueden introducirse sustituciones adicionales en las localizaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. Como alternativa, o adicionalmente, puede analizarse una estructura cristalina de un complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Tales residuos de contacto y residuos vecinos pueden seleccionarse como diana o eliminarse como candidatos para la sustitución. Las variantes pueden cribarse para determinar si contienen las propiedades deseadas.
[0618] Las inserciones de secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxilo-terminales que varían en longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de un solo o múltiples residuos de aminoácidos. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N-terminal. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al extremo N- o C-terminal del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que aumenta la semivida en suero del anticuerpo.
[0619] b. Variantes de glicosilación
[0620] En ciertas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento se altera para aumentar o disminuir el grado en que el anticuerpo está glicosilado. La adición o deleción de sitios de glicosilación a un anticuerpo puede llevarse a cabo convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de tal manera que se creen o eliminen uno o más sitios de glicosilación.
[0621] Cuando el anticuerpo comprende una región Fc, el hidrato de carbono unido a la misma puede alterarse. Los anticuerpos nativos producidos por células de mamífero comprenden normalmente un oligosacárido biantenario ramificado que generalmente está conectado por una unión a N a Asn297 del dominio CH2 de la región Fc. Véase, por ejemplo, Wrightet al., TIBTECH 15:26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir diversos hidratos de carbono, por ejemplo, manosa, N-acetilglucosamina (GlcNAc), galactosa, y ácido siálico, así como una fucosa unida a una GlcNAc en el “tallo” de la estructura de oligosacárido biantenario. En algunas realizaciones, pueden realizarse modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la invención con el fin de crear variantes de anticuerpo con ciertas propiedades mejoradas.
[0623] En una realización, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una estructura de hidrato de carbono que carece de fucosa conectada (directa o indirectamente) a una región Fc. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en tal anticuerpo puede ser de desde el 1 % hasta el 80 %, desde el 1 % hasta el 65 %, desde el 5 % hasta el 65 % o desde el 20 % hasta el 40 %. La cantidad de fucosa se determina calculando la cantidad promedio de fucosa dentro de la cadena de azúcar en Asn297, en relación con la suma de todas las glicoestructuras conectadas a Asn 297 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y de alto contenido en manosa) tal como se mide mediante espectrometría de masas MALDI-TOF, tal como se describe en el documento WO 2008/077546, por ejemplo. Asn297 se refiere al residuo de asparagina ubicado aproximadamente en la posición 297 en la región Fc (numeración de Eu de los residuos de la región Fc); sin embargo, Asn297 también puede ubicarse aproximadamente /- 3 aminoácidos en el sentido de 5’ o en el sentido de 3’ de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones de secuencia menores en los anticuerpos. Tales variantes de fucosilación pueden tener función de ADCC mejorada. Véanse, por ejemplo, las publicaciones estadounidenses n.<os>US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd).). Los ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpo “desfucosiladas” o “deficientes en fucosa” incluyen: los documentos US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazakiet al., J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnukiet al., Biotech. Bioeng. 87: 87614 (2004). Los ejemplos de líneas celulares que pueden producir anticuerpos desfucosilados incluyen células CHO Lec13 deficientes en la fucosilación de proteínas (Ripkaet al., Arch. Biochem. Biophys.
[0624] 249:533-545 (1986); la solicitud de patente estadounidense n.º US 2003/0157108 A1, Presta, L; y el documento WO 2004/056312, Adamset al., en particular en el ejemplo 11), y líneas celulares de desactivación, tales como el gen de alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO de desactivación (véase, por ejemplo, Yamane-Ohnukiet al., Biotech. Bioeng.87:614 (2004); Kadaet al., Biotechnol. Bioeng.94(4):680-688 (2006); y el documento 2003/085107).
[0626] Las variantes de anticuerpo se proporcionan además con oligosacáridos bisectados, por ejemplo, en los que un oligosacárido biantenario conectado a la región Fc del anticuerpo se bisecta por GlcNAc. Tales variantes de anticuerpo pueden tener una fucosilación reducida y/o función de ADCC mejorada. Se describen ejemplos de tales variantes de anticuerpo, por ejemplo, en el documento WO 2003/011878 (Jean-Mairetet al.); la patente estadounidense n.º 6.602.684 (Umanaet al.); y el documento US 2005/0123546 (Umanaet al.). También se proporcionan variantes de anticuerpo con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido conectado a la región Fc. Tales variantes de anticuerpo pueden tener una función de CDC mejorada. Tales variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo, en los documentos WO 1997/30087 (Patelet al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); y WO 1999/22764 (Raju, S.).
[0628] c. Variantes de región Fc
[0630] En ciertas realizaciones, pueden introducirse una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fc de un anticuerpo proporcionado en el presente documento, generando de ese modo una variante de región Fc. La variante de región Fc puede comprender una secuencia de región Fc humana (por ejemplo, una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación de aminoácidos (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácido.
[0632] En ciertas realizaciones, la invención contempla una variante de anticuerpo que presenta algunas pero no todas las funciones efectoras, lo que hace que sea un candidato deseable para aplicaciones en las que la semivida del anticuerpoin vivoes importante, pero ciertas funciones efectoras (tales como del complemento y ADCC) son innecesarias o perjudiciales. Pueden llevarse a cabo ensayos de citotoxicidadin vitroy/oin vivopara confirmar la reducción/agotamiento de las actividades de CDC y/o ADCC. Por ejemplo, pueden realizarse ensayos de unión al receptor de Fc (FcR) para garantizar que el anticuerpo carece de unión a Fc gamma R (por tanto, probablemente carece de actividad de ADCC), pero mantiene la capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para mediar en ADCC, células NK, expresan Fc gamma RIII únicamente, mientras que los monocitos expresan Fc gamma RI, Fc gamma RII y Fc gamma RIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Immunol.9:457-492 (1991). Se describen ejemplos no limitativos de ensayosin vitropara evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés en las patentes estadounidenses n.<os>5.500.362 (véase, por ejemplo, Hellstrom,et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) y Hellstrom, Iet al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5.821.337 (véase Bruggemann,et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Como alternativa, pueden emplearse métodos de ensayos no radiactivos (véase, por ejemplo, ensayo de citotoxicidad no radiactivo ACTI<™>para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); y ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96 (marca registrada) (Promega, Madison, WI)). Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK cells). Como alternativa, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede evaluarsein vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el dado a conocer en Clyneset al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). También pueden llevarse a cabo ensayos de unión a C1q para confirmar que el anticuerpo no puede unirse a C1q y, por tanto, carece de actividad de CDC. Véase, por ejemplo, ELISA de unión a C1q y C3c en los documentos WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento, puede realizarse un ensayo de CDC (véanse, por ejemplo, Gazzano-Santoroet al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragget al., Blood 101:1045-1052 (2003), y Cragg, Blood 103:2738-2743 (2004)). También pueden realizarse determinaciones de unión a FcRn las de aclaramiento/semividain vivousando métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Petkovaet al., Int'l. Immunol.18(12):1759-1769 (2006)).
[0633] Los anticuerpos con función efectora reducida incluyen aquellos con sustitución de uno o más de los residuos de región Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente estadounidense n.º 6.737.056). Tales mutantes de Fc incluyen mutantes de Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones de aminoácido 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el denominado mutante de Fc “DANA” con sustitución de los residuos 265 y 297 por alanina (patente estadounidense n.º 7.332.581).
[0634] Se describen ciertas variantes de anticuerpo con unión mejorada o disminuida a FcR. (Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 6.737.056; el documento WO 2004/056312, y Shieldset al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).)
[0635] En ciertas realizaciones, una variante de anticuerpo comprende una región Fc con una o más sustituciones de aminoácidos que mejoran la ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333, y/o 334 de la región Fc (numeración de EU de residuos).
[0636] En algunas realizaciones, se realizan alteraciones en la región Fc que dan como resultado una unión a C1q y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) alteradas (es decir, o bien mejoradas o bien disminuidas), por ejemplo, tal como se describe en la patente estadounidense n.º 6.194.551, el documento WO 1999/51642, y Idusogieet al., J. Immunol.164:4178-4184 (2000).
[0637] Los anticuerpos con semividas aumentadas y unión mejorada al receptor de Fc neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyeret al., J. Immunol.117:587 (1976) y Kimet al., J. Immunol.24:249 (1994)), se describen en el documento US2005/0014934A1 (Hintonet al.). Esos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fc a FcRn. Tales variantes de Fc incluyen aquellas con sustituciones en uno o más de los residuos de región Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, la sustitución del residuo de región Fc 434 (patente estadounidense n.º 7.371.826). Véanse también, Duncan, Nature 322:738-40 (1988); patentes estadounidenses n.<os>5.648.260 y 5.624.821; y documento WO 1994/29351 referentes a otros ejemplos de variantes de región Fc.
[0638] d. Variantes de anticuerpo modificadas por ingeniería con cisteína
[0639] En ciertas realizaciones, puede ser deseable crear anticuerpos modificados por ingeniería con cisteína, por ejemplo, “tioMAb”, en los que uno o más residuos de un anticuerpo están sustituidos por residuos de cisteína. En realizaciones particulares, los residuos sustituidos se producen en sitios accesibles del anticuerpo. Sustituyendo esos residuos por cisteína, se colocan de ese modo grupos tiol reactivos en sitios accesibles del anticuerpo y pueden usarse para conjugar el anticuerpo con otros restos, tales como restos de fármaco o restos de conectorfármaco, para crear un inmunoconjugado, tal como se describe adicionalmente en el presente documento. En ciertas realizaciones, uno cualquiera o más de los siguientes residuos pueden sustituirse por cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración de EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración de EU) de la región Fc de cadena pesada. Los anticuerpos modificados por ingeniería con cisteína pueden generarse tal como se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense n.º 7.521.541.
[0640] e. Derivados de anticuerpo
[0641] En ciertas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en el presente documento puede modificarse adicionalmente para contener restos no proteicos adicionales que se conocen en la técnica y están fácilmente disponibles. Los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, polímeros solubles en agua. Los ejemplos no limitativos de polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinil-pirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (o bien homopolímeros o bien copolímeros al azar), y dextrano o poli(n-vinil-pirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de polipropilenglicol, copolímeros de poli(óxido de propileno/óxido de etileno), polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), poli(alcohol vinílico), y mezclas de los mismos. El propionaldehído de polietilenglicol puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o no ramificado. El número de polímeros conectados al anticuerpo puede variar, y si se conecta más de un polímero, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización pueden determinarse basándose en consideraciones que incluyen, pero no se limitan a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que va a mejorarse, si el derivado de anticuerpo se usará en una terapia en condiciones definidas, etc.
[0642] En otra realización, se proporcionan conjugados de un anticuerpo y resto no proteico que pueden calentarse selectivamente mediante exposición a radiación. En una realización, el resto no proteico es un nanotubo de carbono (Kamet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:1160-11605 (2005)). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda e incluye, pero no se limita a, longitudes de onda que no dañan las células ordinarias, pero que calientan el resto no proteico hasta una temperatura a la que se destruyen las células proximales al resto no proteico-anticuerpo.
[0643] 8. Regiones Fc variantes
[0644] En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada. En algunos aspectos, el polipéptido es un anticuerpo. En algunos aspectos, el anticuerpo es una proteína de fusión de Fc. En ciertas realizaciones, la región Fc variante comprende al menos una alteración de residuos de aminoácido (por ejemplo, sustitución) en comparación con la secuencia correspondiente en la región Fc de una secuencia nativa o variante de referencia (a veces denominadas colectivamente en el presente documento región Fc “parental”). En ciertas realizaciones, la región Fc variante de la invención tiene actividad de unión mejorada para Fc gamma RIIb de mono en comparación con la región Fc parental. En realizaciones particulares, el Fc gamma RIIb de mono es Fc gamma RIIb de macaco cangrejero (SEQ ID NO: 223). En ciertas realizaciones, la razón de [valor de KD de una región Fc parental para Fc gamma RIIb de mono]/[valor de KD de una región Fc variante para Fc gamma RIIb de mono] puede ser de 2,0 o mayor, 3,0 o mayor, 4,0 o mayor, 5,0 o mayor, 6,0 o mayor, 7,0 o mayor, 8,0 o mayor, 9,0 o mayor, 10 o mayor, 15 o mayor, 20 o mayor, 25 o mayor, 30 o mayor, 40 o mayor, o 50 o mayor. En realizaciones adicionales, la región Fc variante tiene actividad de unión disminuida para Fc gamma RIIIa de mono. En ciertas realizaciones, la razón de [valor de KD de una región Fc parental para Fc gamma RIIIa de mono]/[valor de KD de una región Fc variante para Fc gamma RIIIa de mono] puede ser de 0,50 o menor, 0,40 o menor, 0,30 o menor, 0,20 o menor, 0,10 o menor, 0,09 o menor, 0,08 o menor, 0,07 o menor, 0,06 o menor, 0,05 o menor, 0,04 o menor, 0,03 o menor, 0,02 o menor, o 0,01 o menor. En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb de mono tiene la secuencia de SEQ ID NO:223 (macaco cangrejero). En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIIa de mono tiene la secuencia de SEQ ID NO:224 (macaco cangrejero).
[0645] En realizaciones adicionales, la región Fc variante tiene actividad de unión mejorada para Fc gamma RIIb humano. En ciertas realizaciones, la razón de [valor de KD de una región Fc parental para Fc gamma RIIb humano]/[valor de KD de una región Fc variante para Fc gamma RIIb humano] puede ser de 2,0 o mayor, 3,0 o mayor, 4,0 o mayor, 5,0 o mayor, 6,0 o mayor, 7,0 o mayor, 8,0 o mayor, 9,0 o mayor, 10 o mayor, 15 o mayor, 20 o mayor, 25 o mayor, 30 o mayor, 40 o mayor, o 50 o mayor. En realizaciones adicionales, la región Fc variante tiene actividad de unión disminuida para Fc gamma RIIIa humano. En ciertas realizaciones, la razón de [valor de KD de una región Fc parental para Fc gamma RIIIa humano]/[valor de KD de una región Fc variante para Fc gamma RIIIa humano] puede ser de 0,50 o menor, 0,40 o menor, 0,30 o menor, 0,20 o menor, 0,10 o menor, 0,09 o menor, 0,08 o menor, 0,07 o menor, 0,06 o menor, 0,05 o menor, 0,04 o menor, 0,03 o menor, 0,02 o menor, o 0,01 o menor. En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb humano tiene la secuencia de las SEQ ID NO: 212, 213, o 214. En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIIa humano tiene la secuencia de SEQ ID NO:215, 216, 217, o 218.
[0646] En realizaciones adicionales, la región Fc variante tiene actividad de unión disminuida para Fc gamma RIIa humano (tipo H) que para Fc gamma RIIb humano. En ciertas realizaciones, la razón de [valor de KD de una región Fc parental para Fc gamma RIIa humano (tipo H)]/[valor de KD de una región Fc variante para Fc gamma RIIa humano (tipo H)] puede ser de 5,0 o menor, 4,0 o menor, 3,0 o menor, 2,0 o menor, 1,0 o menor, 0,9 o menor, 0,8 o menor, 0,7 o menor, 0,6 o menor, 0,5 o menor, 0,4 o menor, 0,3 o menor, 0,2 o menor, o 0,1 o menor. En realizaciones adicionales, la región Fc variante tiene actividad de unión disminuida para Fc gamma RIIa humano (tipo R) que para Fc gamma RIIb humano. En ciertas realizaciones, la razón de [valor de KD de una región Fc parental para Fc gamma RIIa humano (tipo R)]/[valor de KD de una región Fc variante para Fc gamma RIIa humano (tipo R)] puede ser de 5,0 o menor, 4,0 o menor, 3,0 o menor, 2,0 o menor, 1,0 o menor, 0,9 o menor, 0,8 o menor, 0,7 o menor, 0,6 o menor, 0,5 o menor, 0,4 o menor, 0,3 o menor, 0,2 o menor, o 0,1 o menor. En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIa humano (tipo H) tiene la secuencia de SEQ ID NO:211. En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIa humano (tipo R) tiene la secuencia de SEQ ID NO:210.
[0647] En ciertas realizaciones, la razón de [valor de KD de una región Fc parental para Fc gamma RIIa de mono]/[valor de KD de una región Fc variante para Fc gamma RIIa de mono] puede ser de 2,0 o mayor, 3,0 o mayor, 4,0 o mayor, 5,0 o mayor, 6,0 o mayor, 7,0 o mayor, 8,0 o mayor, 9,0 o mayor, 10 o mayor, 15 o mayor, 20 o mayor, 25 o mayor, 30 o mayor, 40 o mayor, o 50 o mayor. En ciertas realizaciones, Fc gamma RIIa de mono se selecciona de Fc gamma RIIa1 de mono (por ejemplo, Fc gamma RIIa1 de macaco cangrejero (SEQ ID NO:220)), Fc gamma RIIa2 de mono (por ejemplo, Fc gamma RIIa2 de macaco cangrejero (SEQ ID NO:221)), y Fc gamma RIIa3 de mono (por ejemplo, Fc gamma RIIa3 de macaco cangrejero (SEQ ID NO:222).
[0648] En otra realización, el valor de KD de la región Fc variante para Fc gamma RIIb de mono puede ser de 1,0 x 10<-6>M o menor, 9,0 x 10<-7>M o menor, 8,0 x 10<-7>M o menor, 7,0 x 10<-7>M o menor, 6,0 x 10<-7>M o menor, 5,0 x 10<-7>M o menor, 4,0 x 10<-7>M o menor, 3,0 x 10<-7>M o menor, 2,0 x 10<-7>M o menor, o 1,0 x 10<-7>M o menor. En otra realización, el valor de KD de la región Fc variante para Fc gamma RIIIa de mono puede ser de 5,0 x 10<-7>M o mayor, 6,0 x 10<-7>M o mayor, 7,0 x 10<-7>M o mayor, 8,0 x 10<-7>M o mayor, 9,0 x 10<-7>M o mayor, 1,0 x 10<-6>M o mayor, 2,0 x 10<-6>M o mayor, 3,0 x 10<-6>M o mayor, 4,0 x 10<-6>M o mayor, 5,0 x 10<-6>M o mayor, 6,0 x 10<-6>M o mayor, 7,0 x 10<-6>M o mayor, 8,0 x 10<-6>M o mayor, 9,0 x 10<-6>M o mayor, o 1,0 x 10<-5>M o mayor. En otra realización, el valor de KD de la región Fc variante para Fc gamma RIIb humano puede ser de 2,0 x 10<-6>M o menor, 1,0 x 10<-6>M o menor, 9,0 x 10<-7>M o menor, 8,0 x 10<-7>M o menor, 7,0 x 10<-7>M o menor, 6,0 x 10<-7>M o menor, 5,0 x 10<-7>M o menor, 4,0 x 10<-7>M o menor, 3,0 x 10<-7>M o menor, 2,0 x 10<-7>M o menor, o 1,0 x 10<-7>M o menor. En otra realización, el valor de KD de la región Fc variante para Fc gamma RIIIa humano puede ser de 1,0 x 10<-6>M o mayor, 2,0 x 10<-6>M o mayor, 3,0 x 10<-6>M o mayor, 4,0 x 10<-6>M o mayor, 5,0 x 10<-6>M o mayor, 6,0 x 10<-6>M o mayor, 7,0 x 10<-6>M o mayor, 8,0 x 10<-6>M o mayor, 9,0 x 10<-6>M o mayor, 1,0 x 10<-5>M o mayor, 2,0 x 10<-5>M o mayor, 3,0 x 10<-5>M o mayor, 4,0 x 10<-5>M o mayor, o 5,0 x 10<-5>M o mayor. En otra realización, el valor de KD de la región Fc variante para Fc gamma RIIa humano (tipo H) puede ser de 1,0 x 10<-7>M o mayor, 2,0 x 10<-7>M o mayor, 3,0 x 10<-7>M o mayor, 4,0 x 10<-7>M o mayor, 5,0 x 10<-7>M o mayor, 6,0 x 10<-7>M o mayor, 7,0 x 10<-7>M o mayor, 8,0 x 10<-7>M o mayor, 9,0 x 10<-7>M o mayor, 1,0 x 10<-6>M o mayor, 2,0 x 10<-6>M o mayor, 3,0 x 10<-6>M o mayor, 4,0 x 10<-6>M o mayor, o 5,0 x 10<-6>M o mayor. En otra realización, el valor de KD de la región Fc variante para Fc gamma RIIa humano (tipo R) puede ser de 2,0 x 10<-7>M o mayor, 3,0 x 10<-7>M o mayor, 4,0 x 10<-7>M o mayor, 5,0 x 10<-7>M o mayor, 6,0 x 10<-7>M o mayor, 7,0 x 10<-7>M o mayor, 8,0 x 10<-7>M o mayor, 9,0 x 10<-7>M o mayor, 1,0 x 10<-6>M o mayor, 2,0 x 10<-6>M o mayor, 3,0 x 10<-6>M o mayor, 4,0 x 10<-6>M o mayor, o 5,0 x 10<-6>M o mayor.
[0649] En otra realización, el valor de KD de la región Fc variante para Fc gamma RIIa de mono puede ser de 1,0 x 10<-6>M o menor, 9,0 x 10<-7>M o menor, 8,0 x 10<-7>M o menor, 7,0 x 10<-7>M o menor, 6,0 x 10<-7>M o menor, 5,0 x 10<-7>M o menor, 4,0 x 10<-7>M o menor, 3,0 x 10<-7>M o menor, 2,0 x 10<-7>M o menor, o 1,0 x 10<-7>M o menor. En ciertas realizaciones, Fc gamma RIIa de mono puede seleccionarse de uno cualquiera de Fc gamma RIIa1 de mono, Fc gamma RIIa2 de mono, y Fc gamma RIIa3 de mono.
[0650] Cuando se desarrolla un producto farmacéutico para el tratamiento de enfermedades de seres humanos, la evaluación de su eficacia y seguridad en mono son importantes debido a su proximidad biológica al ser humano. Desde tales puntos de vista, es preferible que un producto farmacéutico que va a desarrollarse tenga reactividad cruzada tanto con ser humano como con mono en la actividad de unión objetivo.
[0651] “Los receptores de Fc gamma” (en el presente documento, denominados receptores de Fc gamma, Fc gamma R o FcgR) se refiere a receptores que pueden unirse a la región Fc de anticuerpos monoclonales IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4 y, en la práctica, significa cualquier miembro de la familia de proteínas codificadas por los genes de receptor de Fc gamma. En seres humanos, esta familia incluye Fc gamma RI (CD64) que incluye las isoformas Fc gamma RIa, Fc gamma RIb, y Fc gamma RIc; Fc gamma RII (CD32) que incluye las isoformas Fc gamma RIIa (que incluye los alotipos H131 (tipo H) y R131 (tipo R)), Fc gamma RIIb (que incluye Fc gamma RIIb-1 y Fc gamma RIIb-2), y Fc gamma RIIc; y Fc gamma RIII (CD16) que incluye las isoformas Fc gamma RIIIa (que incluye los alotipos V158 y F158), y Fc gamma RIIIb (que incluye los alotipos Fc gamma RIIIb-NA1 y Fc gamma RIIIb-NA2), y cualquier Fc gamma R humano, isoforma o alotipo de Fc gamma R que aún no se haya descubierto, pero no se limita a los mismos. Se han notificado Fc gamma RIIb1 y Fc gamma RIIb2 como variantes de corte y empalme de Fc gamma RIIb humano. Además, se ha notificado una variante de corte y empalme nombrada como Fc gamma RIIb3 (J Exp Med, 1989, 170: 1369-1385). Además de estas variantes de corte y empalme, Fc gamma RIIb humano incluye todas las variantes de corte y empalme registradas en NCBI, que son NP_001002273.1, NP_001002274.1, NP_001002275.1, NP_001177757.1, y NP_003992.3. Además, Fc gamma RIIb humano incluye cada polimorfismo genético notificado previamente, así como Fc gamma RIIb (Arthritis Rheum.48:3242-3252 (2003); Konoet al., Hum. Mol. Genet. 14:2881-2892 (2005); y Kyogojuet al., Arthritis Rheum. 46:1242-1254 (2002)), y cada polimorfismo genético que se notifique en el futuro.
[0652] En Fc gamma RIIa, existen dos alotipos, uno en el que el aminoácido en la posición 131 de Fc gamma RIIa es histidina (tipo H) y otro en el que el aminoácido en la posición 131 se sustituye por arginina (tipo R) (Warrmerdam, J. Exp. Med.172:19-25 (1990)).
[0653] El Fc gamma R incluye Fc gamma R derivados de ser humano, ratón, rata, conejo, y mono pero no se limita a los mismos, y pueden derivar de cualquier organismo. Los Fc gamma R de ratón incluyen Fc gamma RI (CD64), Fc gamma RII (CD32), Fc gamma RIII (CD16), y Fc gamma RIII-2 (CD16-2), y cualquier Fc gamma R de ratón, o isoformas de Fc gamma R, pero no se limitan a los mismos. A menos que se especifique de otro modo, el término “Fc gamma R de mono” o una variación del mismo, se refiere a Fc gamma RIIa1 (SEQ ID NO:220), Fc gamma RIIa2 (SEQ ID NO:221), Fc gamma RIIa3 (SEQ ID NO:222), Fc gamma RIIb (SEQ ID NO:223), o Fc gamma RIIIaS (SEQ ID NO:224) . de macaco cangrejero
[0654] La secuencia de polinucleótido de Fc gamma RI humano se expone en SEQ ID NO: 199 (NM_000566.3); la secuencia de polinucleótido de Fc gamma RIIa humano se expone en SEQ ID NO: 200 (BC020823.1) o SEQ ID NO:201 (NM_001136219.1); la secuencia de polinucleótido de Fc gamma RIIb humano se expone en SEQ ID NO: 202 (BC146678.1) o SEQ ID NO:203 (NM_004001.3); la secuencia de polinucleótido de Fc gamma RIIIa humano se expone en SEQ ID NO: 204 (BC033678.1) o SEQ ID NO:205 (NM_001127593.1); y la secuencia de polinucleótido de Fc gamma RIIIb humano se expone en SEQ ID NO: 206 (BC128562.1).
[0655] La secuencia de aminoácidos de Fc gamma RI humano se expone en SEQ ID NO: 207 (NP_000557.1); la secuencia de aminoácidos de Fc gamma RIIa humano se expone en SEQ ID NO: 208 (AAH20823.1), SEQ ID NO:209, SEQ ID NO:210 o SEQ ID NO:211; la secuencia de aminoácidos de Fc gamma RIIb humano se expone en SEQ ID NO: 212 (AAI46679.1), SEQ ID NO: 213 o SEQ ID NO:214; la secuencia de aminoácidos de Fc gamma RIIIa humano se expone en SEQ ID NO: 215 (AAH33678.1), SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:217 o SEQ ID NO:218; y la secuencia de aminoácidos de Fc gamma RIIIb humano se expone en SEQ ID NO: 219 (AAI28563.1).
[0656] La secuencia de aminoácidos de Fc gamma RIIa de macaco cangrejero se expone en SEQ ID NO: 220 (Fc gamma RIIa1), SEQ ID NO:221 (Fc gamma RIIa2) o SEQ ID NO:222 (Fc gamma RIIa3); la secuencia de aminoácidos de Fc gamma RIIb de macaco cangrejero se expone en SEQ ID NO: 223; y la secuencia de aminoácidos de Fc gamma RIIIa de macaco cangrejero se expone en SEQ ID NO: 224.
[0658] En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos que contienen regiones Fc variantes con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada en comparación con un anticuerpo de unión a Fc gamma RIIb de referencia correspondiente. En aspectos adicionales, el anticuerpo de la invención comprende al menos una alteración de aminoácido de al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en: 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 264, 266, 267, 268, 271, 295, 298, 325, 326, 327, 328, 330, 331, 332, 334, y 396, según la numeración de EU. En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb de macaco cangrejero (SEQ ID NO:223). En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb humano (por ejemplo, las SEQ ID NO:212, 213, o 214).
[0660] En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos que comprenden regiones Fc variantes con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada que comprenden al menos dos alteraciones de aminoácido que comprenden: (a) una alteración de aminoácido en la posición 236, y (b) al menos una alteración de aminoácido de al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en: 231, 232, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 264, 266, 267, 268, 271, 295, 298, 325, 326, 327, 328, 330, 331, 332, 334, y 396, según la numeración de EU. En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb de macaco cangrejero (SEQ ID NO:223). En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb humano (por ejemplo, las SEQ ID NO:212, 213, o 214).
[0662] En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos que comprenden una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada que comprende una alteración de aminoácido en la posición 236 según la numeración de EU.
[0664] En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos que comprenden una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada que comprende al menos dos alteraciones de aminoácido que comprenden: (a) una alteración de aminoácido en la posición 236, y (b) al menos una alteración de aminoácido de al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en: 231, 232, 235, 239, 268, 295, 298, 326, 330, y 396, según la numeración de EU. En una realización adicional, la región Fc variante comprende una alteración de aminoácido de al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en: 231, 232, 235, 239, 268, 295, 298, 326, 330, y 396, según la numeración de EU. En una realización adicional, la región Fc variante comprende una alteración de aminoácido de al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en: 268, 295, 326, y 330, según la numeración de EU. En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb de macaco cangrejero (SEQ ID NO:223). En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb humano (por ejemplo, las SEQ ID NO:212, 213, o 214).
[0666] En otro aspecto, la invención proporciona anticuerpos que comprenden regiones Fc variantes con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada que comprenden alteraciones de aminoácido de uno cualquiera de los siguientes puntos (1)-(37): (1) posiciones 231, 236, 239, 268 y 330; (2) posiciones 231, 236, 239, 268, 295 y 330; (3) posiciones 231, 236, 268 y 330; (4) posiciones 231, 236, 268, 295 y 330; (5) posiciones 232, 236, 239, 268, 295 y 330; (6) posiciones 232, 236, 268, 295 y 330; (7) posiciones 232, 236, 268 y 330; (8) posiciones 235, 236, 268, 295, 326 y 330; (9) posiciones 235, 236, 268, 295 y 330; (10) posiciones 235, 236, 268 y 330; (11) posiciones 235, 236, 268, 330 y 396; (12) posiciones 235, 236, 268 y 396; (13) posiciones 236, 239, 268, 295, 298 y 330; (14) posiciones 236, 239, 268, 295, 326 y 330; (15) posiciones 236, 239, 268, 295 y 330; (16) posiciones 236, 239, 268, 298 y 330; (17) posiciones 236, 239, 268, 326 y 330; (18) posiciones 236, 239, 268 y 330; (19) posiciones 236, 239, 268, 330 y 396; (20) posiciones 236, 239, 268 y 396; (21) posiciones 236 y 268; (22) posiciones 236, 268 y 295; (23) posiciones 236, 268, 295, 298 y 330; (24) posiciones 236, 268, 295, 326 y 330; (25) posiciones 236, 268, 295, 326, 330 y 396; (26) posiciones 236, 268, 295 y 330; (27) posiciones 236, 268, 295, 330 y 396; (28) posiciones 236, 268, 298 y 330; (29) posiciones 236, 268, 298 y 396; (30) posiciones 236, 268, 326 y 330; (31) posiciones 236, 268, 326, 330 y 396; (32) posiciones 236, 268 y 330; (33) posiciones 236, 268, 330 y 396; (34) posiciones 236, 268 y 396; (35) posiciones 236 y 295; (36) posiciones 236, 330 y 396; y (37) posiciones 236 y 396, según la numeración de EU. En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb de macaco cangrejero (SEQ ID NO:223). En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb humano (por ejemplo, las SEQ ID NO:212, 213, o 214).
[0668] En una realización adicional, la región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada comprende al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: (a) Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr en la posición 231; (b) Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr en la posición 232; (c) Asp en la posición 233; (d) Trp, Tyr en la posición 234; (e) Trp en la posición 235; (f) Ala, Asp, Glu, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Ser, Thr, Val en la posición 236; (g) Asp, Tyr en la posición 237; (h) Glu, Ile, Met, Gln, Tyr en la posición 238; (i) Ile, Leu, Asn, Pro, Val en la posición 239; (j) Ile en la posición 264; (k) Phe en la posición 266; (1) Ala, His, Leu en la posición 267; (m) Asp, Glu en la posición 268; (n) Asp, Glu, Gly en la posición 271; (o) Leu en la posición 295; (p) Leu en la posición 298; (q) Glu, Phe, Ile, Leu en la posición 325; (r) Thr en la posición 326; (s) Ile, Asn en la posición 327; (t) Thr en la posición 328; (u) Lys, Arg en la posición 330; (v) Glu en la posición 331; (w) Asp en la posición 332; (x) Asp, Ile, Met, Val, Tyr en la posición 334; y (y) Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr en la posición 396; según la numeración de EU. En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb de macaco cangrejero (SEQ ID NO:223). En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb humano (por ejemplo, las SEQ ID NO:212, 213, o 214).
[0670] En una realización adicional, la región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada comprende al menos una alteración de aminoácido (por ejemplo, sustitución) seleccionada del grupo que consiste en: (a) Gly, Thr en la posición 231; (b) Asp en la posición 232; (c) Trp en la posición 235; (d) Asn, Thr en la posición 236; (e) Val en la posición 239; (f) Asp, Glu en la posición 268; (g) Leu en la posición 295; (h) Leu en la posición 298; (i) Thr en la posición 326; (j) Lys, Arg en la posición 330; y (k) Lys, Met en la posición 396; según la numeración de EU. En una realización adicional, la región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada comprende alteraciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones) de: Asn en la posición 236, Glu en la posición 268, Lys en la posición 330, y Met en la posición 396; según la numeración de EU. En una realización adicional, la región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada comprende alteraciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones) de: Asn en la posición 236, Asp en la posición 268, y Lys en la posición 330; según la numeración de EU. En una realización adicional, la región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada comprende alteraciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones) de: Asn en la posición 236, Asp en la posición 268, Leu en la posición 295, y Lys en la posición 330; según la numeración de EU. En una realización adicional, la región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada comprende alteraciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones) de: Thr en la posición 236, Asp en la posición 268, y Lys en la posición 330; según la numeración de EU. En una realización adicional, la región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada comprende alteraciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones) de: Asn en la posición 236, Asp en la posición 268, Leu en la posición 295, Thr en la posición 326, y Lys en la posición 330; según la numeración de EU. En una realización adicional, la región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada comprende alteraciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones) de: Trp en la posición 235, Asn en la posición 236, Asp en la posición 268, Leu en la posición 295, Thr en la posición 326, y Lys en la posición 330; según la numeración de EU.
[0672] En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos que comprenden regiones Fc variantes con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada que comprenden una alteración de aminoácido en la posición 238 según la numeración de EU.
[0674] En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos que comprenden regiones Fc variantes con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada que comprenden al menos una alteración de aminoácido de al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en: 234, 238, 250, 264, 267, 307, y 330 según la numeración de EU. En realizaciones adicionales, el anticuerpo comprende al menos una alteración de aminoácido de al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en: 234, 250, 264, 267, 307, y 330 según la numeración de EU. En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb de macaco cangrejero (SEQ ID NO:223). En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb humano (por ejemplo, las SEQ ID NO:212, 213, o 214).
[0676] En otro aspecto, la invención proporciona anticuerpos que comprenden regiones Fc variantes con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada que comprenden alteraciones de aminoácido de uno cualquiera de los siguientes puntos (1)-(9): (1) posiciones 234, 238, 250, 307 y 330; (2) posiciones 234, 238, 250, 264, 307 y 330; (3) posiciones 234, 238, 250, 264, 267, 307 y 330; (4) posiciones 234, 238, 250, 267, 307 y 330; (5) posiciones 238, 250, 264, 307 y 330; (6) posiciones 238, 250, 264, 267, 307 y 330; (7) posiciones 238, 250, 267, 307 y 330; (8) posiciones 238, 250 y 307; y (9) posiciones 238, 250, 307 y 330, según la numeración de EU. En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb de macaco cangrejero (SEQ ID NO:223). En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb humano (por ejemplo, las SEQ ID NO:212, 213, o 214).
[0678] En una realización adicional, la región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada comprende al menos una alteración de aminoácido (por ejemplo, sustitución) seleccionada del grupo que consiste en: (a) Tyr en la posición 234; (b) Asp en la posición 238; (c) Val en la posición 250, (d) Ile en la posición 264; (e) Ala en la posición 267; (f) Pro en la posición 307; y (g) Lys en la posición 330; según la numeración de EU. En una realización adicional, la región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada comprende alteraciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones) de: Asp en la posición 238; según la numeración de EU. En una realización adicional, la región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada comprende alteraciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones) de: Asp en la posición 238, Val en la posición 250, y Pro en la posición 307; según la numeración de EU. En una realización adicional, la región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada comprende alteraciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones) de: Asp en la posición 238, Val en la posición 250, Pro en la posición 307, y Lys en la posición 330; según la numeración de EU. En una realización adicional, la región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada comprende alteraciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones) de: Asp en la posición 238, Val en la posición 250, Ile en la posición 264, Pro en la posición 307, y Lys en la posición 330; según la numeración de EU. En una realización adicional, la región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada comprende alteraciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones) de: Asp en la posición 238, Val en la posición 250, Ala en la posición 267, Pro en la posición 307, y Lys en la posición 330; según la numeración de EU. En una realización adicional, la región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada comprende alteraciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones) de: Tyr en la posición 234, Asp en la posición 238, Val en la posición 250, Pro en la posición 307, y Lys en la posición 330; según la numeración de EU. En una realización adicional, la región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada comprende alteraciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones) de: Tyr en la posición 234, Asp en la posición 238, Val en la posición 250, Ala en la posición 267, Pro en la posición 307, y Lys en la posición 330; según la numeración de EU. En una realización adicional, la región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada comprende alteraciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones) de: Asp en la posición 238, Val en la posición 250, Ile en la posición 264, Ala en la posición 267, Pro en la posición 307, y Lys en la posición 330; según la numeración de EU. En una realización adicional, la región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada comprende alteraciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones) de: Tyr en la posición 234, Asp en la posición 238, Val en la posición 250, Ile en la posición 264, Pro en la posición 307, y Lys en la posición 330; según la numeración de EU. En una realización adicional, la región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada comprende alteraciones de aminoácido (por ejemplo, sustituciones) de: Tyr en la posición 234, Asp en la posición 238, Val en la posición 250, Ile en la posición 264, Ala en la posición 267, Pro en la posición 307, y Lys en la posición 330; según la numeración de EU. En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb de macaco cangrejero (SEQ ID NO:223). En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb humano (por ejemplo, las SEQ ID NO:212, 213, o 214).
[0680] En otro aspecto, la invención proporciona anticuerpos aislados que comprenden regiones Fc variantes con punto isoeléctrico (pI) aumentado. En ciertas realizaciones, una región Fc variante descrita en el presente documento comprende al menos dos alteraciones de aminoácido en una región Fc parental. En ciertas realizaciones, cada una de las alteraciones de aminoácido aumenta el punto isoeléctrico (pI) de la región Fc variante en comparación con el de la región Fc parental. Se basan en los hallazgos de que la eliminación de antígeno desde el plasma puede promoverse con un anticuerpo cuyo pI se ha aumentado mediante la modificación de al menos dos residuos de aminoácido, por ejemplo cuando el anticuerpo se administrain vivo.
[0682] En la presente invención, el pI puede ser o bien un pI teórico o bien determinado experimentalmente. Puede determinarse el valor de pI, por ejemplo, mediante isoelectroenfoque conocido por los expertos en la técnica. Puede calcularse el valor de un pI teórico, por ejemplo, usando software de análisis de genes y secuencia de aminoácidos (Genetyx, etc.).
[0684] En una realización, el valor de pI puede estar aumentado, por ejemplo, al menos en 0,01, 0,03, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, o más, al menos en 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, o más, al menos en 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, o más, o al menos en 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 3,0 o más, en comparación con antes de la modificación.
[0686] En ciertas realizaciones, el aminoácido para pI aumentado puede estar expuesto en la superficie de la región Fc variante. En la presente invención, un aminoácido que puede estar expuesto en la superficie se refiere, en general, a un residuo de aminoácido ubicado en la superficie de un anticuerpo que constituye una región Fc variante. Un residuo de aminoácido ubicado en la superficie de un anticuerpo se refiere a un residuo de aminoácido cuya cadena lateral puede estar en contacto con moléculas de disolvente (que, en general, son en su mayoría moléculas de agua). Sin embargo, la cadena lateral no tiene que estar necesariamente en contacto completamente con moléculas de disolvente, e incluso cuando una porción de la cadena lateral está en contacto con las moléculas de disolvente, el aminoácido se define como un “residuo de aminoácido ubicado en la superficie”. Los residuos de aminoácido ubicados en la superficie de un anticuerpo también incluyen residuos de aminoácido ubicados cerca de la superficie y de ese modo pueden tener una influencia de carga eléctrica de otro residuo de aminoácido cuya cadena lateral, incluso parcialmente, está en contacto con las moléculas de disolvente. Los expertos en la técnica pueden preparar un modelo de homología de un polipéptido por ejemplo, usando softwares disponibles comercialmente. Como alternativa, es posible usar métodos conocidos por los expertos en la técnica, tales como cristalografía de rayos X. Los residuos de aminoácido que pueden estar expuestos en la superficie se determinan, por ejemplo, usando coordenadas de un modelo tridimensional usando un programa informático tal como el programa InsightII (Accelrys). pueden determinarse sitios que pueden quedar expuestos en la superficie usando algoritmos conocidos en el campo técnico (por ejemplo, Lee y Richards (J. Mol. Biol.55:379-400 (1971)); Connolly (J. Appl. Cryst.16:548-558 (1983)). pueden determinarse sitios que pueden quedar expuestos en la superficie usando software adecuado para información de estructura tridimensional y modelado de proteínas. El software disponible para tales fines incluye, por ejemplo, el software de módulo de biopolímeros SYBILO (Tripos Associates). Cuando un algoritmo requiere un parámetro de tamaño introducido por un usuario, el “tamaño” de una sonda que se usa en el cálculo puede establecerse en aproximadamente 1,4 Angstrom (A) o menos de radio. Además, se han descrito métodos para determinar regiones que pueden quedar expuestas en la superficie usando software para ordenadores personales por Pacios (Comput. Chem. 18(4):377-386 (1994); J. Mol. Model. 1:46-53 (1995)). Basándose en tal información tal como se ha descrito anteriormente, pueden seleccionarse residuos de aminoácido apropiados ubicados en la superficie de un anticuerpo que constituye una región Fc variante.
[0688] En ciertas realizaciones, un anticuerpo comprende tanto la región Fc variante como un dominio de unión a antígeno. En realizaciones adicionales, el antígeno es un antígeno soluble. En una realización, el antígeno está presente en líquidos biológicos (por ejemplo, plasma, líquido intersticial, líquido linfático, líquido ascítico, y líquido pleural) de sujetos. El antígeno también puede ser un antígeno de membrana.
[0690] En realizaciones adicionales, la actividad de unión a antígeno del dominio de unión a antígeno cambia según las condiciones de concentración iónica. En una realización, la concentración iónica no está particularmente limitada y se refiere a la concentración de iones de hidrógeno (pH) o la concentración de iones de metal. En el presente documento, iones de metal se refieren a iones de elementos del grupo I excepto hidrógeno, tales como metales alcalinos y los elementos del grupo del cobre, elementos del grupo II tales como metales alcalinotérreos y elementos del grupo del zinc, elementos del grupo III excepto boro, elementos del grupo IV excepto carbono y silicio, elementos del grupo VIII tales como elementos del grupo del hierro y platino, elementos perteneciente al subgrupo A de los grupos V, VI, y VII, y elementos metálicos tales como antimonio, bismuto, y polonio. En la presente invención, iones de metal incluyen, por ejemplo, calcio ion, tal como se describe en el documento WO 2012/073992 y WO 2013/125667. En una realización, “la condición de concentración iónica” puede ser una condición que se centra en diferencias en el comportamiento biológico de un dominio de unión a antígeno entre una baja concentración iónica y una alta concentración iónica. Además, “la actividad de unión a antígeno de un dominio de unión a antígeno cambia según las condiciones de concentración iónica” significa que la actividad de unión a antígeno de un dominio de unión a antígeno cambia entre una baja concentración iónica y una alta concentración iónica (tal dominio de unión a antígeno se denomina en el presente documento “dominio de unión a antígeno dependiente de la concentración iónica”). La actividad de unión a antígeno de un dominio de unión a antígeno en una condición de alta concentración iónica puede ser mayor (más fuerte) o menor (más débil) que en una condición de baja concentración iónica. En una realización, pueden obtenerse dominios de unión a antígeno dependientes de la concentración iónica (tales como dominios de unión a antígeno dependientes del pH o dominios de unión a antígeno dependientes de la concentración iónica de calcio) mediante métodos conocidos, por ejemplo, descritos en los documentos WO 2009/125825, WO 2012/073992, y WO 2013/046722.
[0692] En la presente invención, la actividad de unión a antígeno de un dominio de unión a antígeno en una condición de alta concentración iónica de calcio puede ser mayor que en una condición de baja concentración iónica de calcio. La alta concentración iónica de calcio no está particularmente limitada a, pero puede ser una concentración seleccionada entre 100 microM y 10 mM, entre 200 microM y 5 mM, entre 400 microM y 3 mM, entre 200 microM y 2 mM, entre 400 microM y 1 mM, o entre 500 microM y 2,5 mM, que es preferible que sea próxima a la concentración en plasma (sangre) de iones de calcioin vivo. Mientras tanto, la baja concentración iónica de calcio no está particularmente limitada a, pero puede ser una concentración seleccionada entre 0,1 microM y 30 microM, entre 0,2 microM y 20 microM, entre 0,5 microM y 10 microM, entre 1 microM y 5 microM, o entre 2 microM y 4 microM, que es preferible que sea próxima a la concentración de iones de calcio en endosomas tempranosin vivo.
[0694] En una realización, la razón entre las actividades de unión a antígeno en una condición de baja concentración iónica de calcio y una condición de alta concentración iónica de calcio no está limitada pero la razón de la constante de disociación (KD) en una condición de baja concentración iónica de calcio con respecto a la KD en una condición de alta concentración iónica de calcio, es decir, KD (condición de baja concentración iónica de calcio)/KD (condición de alta concentración iónica de calcio), es de 2 o más, 10 o más, o 40 o más. El límite superior de la razón puede ser de 400, 1000, o 10000, siempre que tal dominio de unión a antígeno pueda producirse mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Como alternativa, por ejemplo, la constante de velocidad de disociación (kd) puede usarse en lugar de la KD. En este caso, la razón de la kd en una condición de baja concentración iónica con respecto a la kd en una condición de alta concentración iónica, es decir, kd (condición de baja concentración iónica de calcio)/kd (condición de alta concentración iónica de calcio), es de 2 o más, 5 o más, 10 o más, o 30 o más. El límite superior de la razón puede ser de 50, 100, o 200, siempre que el dominio de unión a antígeno pueda producirse basándose en el conocimiento técnico común de los expertos en la técnica.
[0696] En la presente invención, la actividad de unión a antígeno de un dominio de unión a antígeno con una baja concentración iónica de hidrógeno (pH neutro) puede ser mayor que con una alta concentración iónica de hidrógeno (pH ácido). El pH ácido puede ser, por ejemplo, un pH seleccionado desde pH 4,0 hasta pH 6,5, seleccionado desde pH 4,5 hasta pH 6,5, seleccionado desde pH 5,0 hasta pH 6,5, o seleccionado desde pH 5,5 hasta pH 6,5, que es preferible que sea próximo al pHin vivopH en endosomas tempranos. El pH ácido también puede ser, por ejemplo, pH 5,8 o pH 6,0, En realizaciones particulares, el pH ácido es pH 5,8, Mientras tanto, el pH neutro puede ser, por ejemplo, un pH seleccionado desde pH 6,7 hasta pH 10,0, seleccionado desde pH 6,7 hasta pH 9,5, seleccionado desde pH 7,0 hasta pH 9,0, o seleccionado desde pH 7,0 hasta pH 8,0, que es preferible que sea próximo al pHin vivoen plasma (sangre). El pH neutro también puede ser, por ejemplo, pH 7,4 o pH 7,0, En realizaciones particulares, el pH neutro es pH 7,4.
[0698] En una realización, la razón entre las actividades de unión a antígeno en una condición de pH ácido y una condición de pH neutro no está limitada pero la razón de la constante de disociación (KD) en una condición de pH ácido con respecto a la KD en una condición de pH neutro, es decir, KD (condición de pH ácido)/KD (condición de pH neutro), es de 2 o más, 10 o más, o 40 o más. El límite superior de la razón puede ser de 400, 1000, o 10000, siempre que tal dominio de unión a antígeno puede producirse mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Como alternativa, por ejemplo, la constante de velocidad de disociación (kd) puede usarse en lugar de la KD. En este caso, la razón de la kd en una condición de pH ácido con respecto a la kd en una condición de pH neutro, es decir, kd (condición de pH ácido)/kd (condición de pH neutro) es de 2 o más, 5 o más, 10 o más, o 30 o más. El límite superior de la razón puede ser de 50, 100, o 200, siempre que el dominio de unión a antígeno pueda producirse basándose en el conocimiento técnico común de los expertos en la técnica.
[0700] En una realización, por ejemplo, se sustituye al menos un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido con un pKa de cadena lateral de 4,0-8,0, y/o se inserta al menos un aminoácido con un pKa de cadena lateral de 4,0-8,0 en el dominio de unión a antígeno, tal como se describe en el documento WO 2009/125825. El aminoácido puede sustituirse y/o insertarse en cualquier sitio siempre que la actividad de unión a antígeno del dominio de unión a antígeno se vuelva más débil en una condición de pH ácido que en una condición de pH neutro en comparación con antes de la sustitución o inserción. Cuando el dominio de unión a antígeno tiene una región variable o CDR, el sitio puede estar dentro de la región variable o CDR. El número de aminoácidos que se sustituyen o insertan puede determinarse apropiadamente por los expertos en la técnica; y el número puede ser de uno o más. Pueden usarse aminoácidos con un pKa de cadena lateral de 4,0-8,0 para cambiar la actividad de unión a antígeno del dominio de unión a antígeno según la condición de concentración iónica de hidrógeno. Tales aminoácidos incluyen, por ejemplo, aminoácidos naturales tales como His (H) y Glu (E), y aminoácidos no naturales tales como análogos de histidina (documento US2009/0035836), m-NO2-Tyr (pKa 7,45), 3,5-Br2-Tyr (pKa 7,21), y 3,5-I2-Tyr (pKa 7,38) (Heylet al., Bioorg. Med. Chem.11(17):3761-3768 (2003)). También pueden usarse aminoácidos con un pKa de cadena lateral de 6,0-7,0, incluyendo, por ejemplo, His (H).
[0702] En otra realización, se describen dominios de unión a antígeno preferibles para la región Fc variante con pI aumentado y pueden obtenerse mediante métodos descritos en las solicitudes de patente japonesa JP2015-021371 y JP2015-185254.
[0704] En ciertas realizaciones, la región Fc variante con pI aumentado comprende al menos dos alteraciones de aminoácido de al menos dos posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: 285, 311, 312, 315, 318, 333, 335, 337, 341, 342, 343, 384, 385, 388, 390, 399, 400, 401, 402, 413, 420, 422, y 431, según la numeración de EU.
[0705] En realizaciones adicionales, la región Fc variante con pI aumentado comprende al menos dos alteraciones de aminoácido de al menos dos posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: 311, 341, 343, 384, 399, 400, 401, 402, y 413, según la numeración de EU.
[0707] En otro aspecto, la invención proporciona anticuerpos que comprenden regiones Fc variantes con pI aumentado que comprenden alteraciones de aminoácido de uno cualquiera de los siguientes puntos (1)-(10): (1) posiciones 311 y 341; (2) posiciones 311 y 343; (3) posiciones 311, 343 y 413; (4) posiciones 311, 384 y 413; (5) posiciones 311 y 399; (6) posiciones 311 y 401; (7) posiciones 311 y 413; (8) posiciones 400 y 413; (9) posiciones 401 y 413; y (10) posiciones 402 y 413; según la numeración de EU.
[0709] Un método para aumentar el pI de una proteína es, por ejemplo, para reducir el número de aminoácidos con una cadena lateral cargada negativamente (por ejemplo, ácido aspártico y ácido glutámico) y/o para aumentar el número de aminoácidos con una cadena lateral cargada positivamente (por ejemplo, arginina, lisina e histidina) en una condición de pH neutro. Los aminoácidos con una cadena lateral cargada negativamente tienen una carga negativa representada como -1 en una condición de pH que es suficientemente mayor que su pKa de cadena lateral, que es una teoría bien conocida por los expertos en la técnica. Por ejemplo, el pKa teórico para la cadena lateral de ácido aspártico es de 3,9, y la cadena lateral tiene una carga negativa representada como -1 en una condición de pH neutro (por ejemplo, en una disolución de pH 7,0). A la inversa, aminoácidos con una cadena lateral cargada positivamente tienen una carga positiva representada como 1 en una condición de pH que es suficientemente menor que su pKa de cadena lateral. Por ejemplo, el pKa teórico para la cadena lateral de arginina es de 12,5, y la cadena lateral tiene una carga positiva representada como 1 en una condición de pH neutro (por ejemplo, en una disolución de pH 7,0). Mientras tanto, los aminoácidos cuya cadena lateral no tiene carga en una condición de pH neutro (por ejemplo, en una disolución de pH 7,0) se sabe que incluyen 15 tipos de aminoácidos naturales, es decir, alanina, cisteína, fenilalanina, glicina, isoleucina, leucina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, serina, treonina, valina, triptófano, y tirosina. Por norma, se entiende que los aminoácidos para aumentar el pI pueden ser aminoácidos no naturales.
[0711] A partir de lo anterior, un método para aumentar el pI de una proteína en una condición de pH neutro (por ejemplo, en una disolución de pH 7,0) puede conferir una alteración de carga de 1 a una proteína de interés, por ejemplo, sustituyendo aminoácidos con cadenas laterales no cargadas para ácido aspártico o ácido glutámico (cuya cadena lateral tiene una carga negativa de -1) en la secuencia de aminoácidos de la proteína. Además, puede conferirse una alteración de carga de 1 a la proteína, por ejemplo, sustituyendo arginina o lisina (cuya cadena lateral tiene una carga positiva de 1) por aminoácidos cuya cadena lateral no tiene carga. Además, puede conferirse una alteración de carga de 2 de una vez a la proteína sustituyendo arginina o lisina (cuya cadena lateral tiene una carga positiva de 1) por ácido aspártico o ácido glutámico (cuya cadena lateral tiene una carga negativa de -1). Como alternativa, para aumentar el pI de una proteína, aminoácidos con una cadena lateral que no tiene carga y/o preferiblemente aminoácidos que tienen una cadena lateral cargada positivamente pueden añadirse o insertarse en la secuencia de aminoácidos de la proteína, o aminoácidos con una cadena lateral que no tiene carga y/o preferiblemente pueden delecionarse aminoácidos con una cadena lateral cargada negativamente presentes en la secuencia de aminoácidos de la proteína. Se entiende que, por ejemplo, los residuos de aminoácido N-terminal y C-terminal de una proteína tienen una carga derivada de la cadena lateral (NH<3>+
del grupo amino en el extremo N-terminal y COO<->del grupo carbonilo en el extremo C-terminal) además de sus cargas derivadas de la cadena lateral. Por tanto, el pI de una proteína también puede aumentarse realizando a los grupos funcionales derivados de cadena lateral alguna adición, deleción, sustitución, o inserción.
[0712] La sustitución de un aminoácido para aumentar el pI incluye, por ejemplo, la sustitución de un aminoácido cuya cadena lateral no tiene carga por un aminoácido que tiene una cadena lateral cargada negativamente, la sustitución de un aminoácido que tiene una cadena lateral cargada positivamente por un aminoácido cuya cadena lateral no tiene carga, y la sustitución de un aminoácido que tiene una cadena lateral cargada positivamente por un aminoácido que tiene una cadena lateral cargada negativamente en la secuencia de aminoácidos de una región Fc parental, que se realizan solas o en combinaciones apropiadas.
[0713] La inserción o adición de un aminoácido para aumentar el pI incluye, por ejemplo, la inserción o adición de un aminoácido cuya cadena lateral no tiene carga, y/o la inserción o adición de un aminoácido que tiene una cadena lateral cargada positivamente en la secuencia de aminoácidos de una región Fc parental, que se realizan solas o en combinaciones apropiadas.
[0714] La deleción de un aminoácido para aumentar el pI incluye, por ejemplo, la deleción de un aminoácido cuya cadena lateral no tiene carga, y/o la deleción de un aminoácido que tiene una cadena lateral cargada negativamente en la secuencia de aminoácidos de una región Fc parental, que se realizan solas o en combinaciones apropiadas.
[0715] En una realización, los aminoácidos naturales usados para aumentar el pI pueden clasificarse tal como sigue: (a) un aminoácido con una cadena lateral cargada negativamente puede ser Glu (E) o Asp (D); (b) un aminoácido cuya cadena lateral no tiene carga puede ser Ala (A), Asn (N), Cys (C), Gln (Q), Gly (G), His (H), Ile (I), Leu (L), Met (M), Phe (F), Pro (P), Ser (S), Thr (T), Trp (W), Tyr (Y), o Val (V); y (c) un aminoácido con una cadena lateral cargada positivamente puede ser His (H), Lys (K), o Arg (R). En una realización, la inserción o sustitución de aminoácido después de modificación es Lys (K) o Arg (R).
[0716] En otro aspecto, la invención proporciona anticuerpos aislados que comprenden regiones Fc variantes con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada y pI aumentado. En ciertas realizaciones, una región Fc variante descrita en el presente documento comprende al menos dos alteraciones de aminoácido en una región Fc parental.
[0717] En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos que comprenden regiones Fc variantes con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada y pI aumentado que comprenden al menos tres alteraciones de aminoácido que comprenden: (a) al menos una alteración de aminoácido de al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en: 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 264, 266, 267, 268, 271, 295, 298, 325, 326, 327, 328, 330, 331, 332, 334, y 396, según la numeración de EU, y (b) al menos dos alteraciones de aminoácido de al menos dos posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: 285, 311, 312, 315, 318, 333, 335, 337, 341, 342, 343, 384, 385, 388, 390, 399, 400, 401, 402, 413, 420, 422, y 431, según la numeración de EU.
[0718] En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos que comprenden regiones Fc variantes con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada y pI aumentado, y que comprenden al menos tres alteraciones de aminoácido que comprenden: (a) al menos una alteración de aminoácido de al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en: 231, 232, 235, 236, 239, 268, 295, 298, 326, 330, y 396, según la numeración de EU, y (b) al menos dos alteraciones de aminoácido de al menos dos posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: 311, 341, 343, 384, 399, 400, 401, 402, y 413, según la numeración de EU.
[0719] En otro aspecto, la invención proporciona anticuerpos que comprenden regiones Fc variantes con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada y pI aumentado que comprenden alteraciones de aminoácido de uno cualquiera de los siguientes puntos (1)-(9): (1) posiciones 235, 236, 268, 295, 311, 326, 330 y 343; (2) posiciones 236, 268, 295, 311, 326, 330 y 343; (3) posiciones 236, 268, 295, 311, 330 y 413; (4) posiciones 236, 268, 311, 330, 396 y 399; (5) posiciones 236, 268, 311, 330 y 343; (6) posiciones 236, 268, 311, 330, 343 y 413; (7) posiciones 236, 268, 311, 330, 384 y 413; (8) posiciones 236, 268, 311, 330 y 413; y (9) posiciones 236, 268, 330, 396, 400 y 413; según la numeración de EU. En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb de macaco cangrejero (SEQ ID NO:223). En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb humano (por ejemplo, las SEQ ID NO:212, 213, o 214).
[0720] En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos que comprenden regiones Fc variantes con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada y pI aumentado que comprenden al menos tres alteraciones de aminoácido que comprenden: (a) al menos una alteración de aminoácido de al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en: 234, 238, 250, 264, 267, 307, y 330, y (b) al menos dos alteraciones de aminoácido de al menos dos posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: 285, 311, 312, 315, 318, 333, 335, 337, 341, 342, 343, 384, 385, 388, 390, 399, 400, 401, 402, 413, 420, 422, y 431, según la numeración de EU. En realizaciones adicionales, los anticuerpos comprenden al menos dos alteraciones de aminoácido de al menos dos posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: 311, 341, 343, 384, 399, 400, 401, 402, y 413, según la numeración de EU. En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb de macaco cangrejero (SEQ ID NO:223). En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb humano (por ejemplo, las SEQ ID NO:212, 213, o 214).
[0721] En otro aspecto, la invención proporciona anticuerpos que comprenden regiones Fc variantes con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada y pI aumentado que comprenden alteraciones de aminoácido de uno cualquiera de los siguientes puntos (1)-(16): (1) posiciones 234, 238, 250, 264, 307, 311, 330 y 343; (2) posiciones 234, 238, 250, 264, 307, 311, 330 y 413; (3) posiciones 234, 238, 250, 264, 267, 307, 311, 330 y 343; (4) posiciones 234, 238, 250, 264, 267, 307, 311, 330 y 413; (5) posiciones 234, 238, 250, 267, 307, 311, 330 y 343; (6) posiciones 234, 238, 250, 267, 307, 311, 330 y 413; (7) posiciones 234, 238, 250, 307, 311, 330 y 343; (8) posiciones 234, 238, 250, 307, 311, 330 y 413; (9) posiciones 238, 250, 264, 267, 307, 311, 330 y 343; (10) posiciones 238, 250, 264, 267, 307, 311, 330 y 413; (11) posiciones 238, 250, 264, 307, 311, 330 y 343; (12) posiciones 238, 250, 264, 307, 311, 330 y 413; (13) posiciones 238, 250, 267, 307, 311, 330 y 343; (14) posiciones 238, 250, 267, 307, 311, 330 y 413; (15) posiciones 238, 250, 307, 311, 330 y 343; y (16) posiciones 238, 250, 307, 311, 330 y 413; según la numeración de EU.
[0723] En una realización adicional, la región Fc variante comprende alteraciones de aminoácido seleccionadas de cualquier alteración única, combinación de alteraciones únicas, o alteraciones en combinación descritas en las tablas 14-30.
[0725] En algunas realizaciones, un anticuerpo comprende una región Fc variante de la presente divulgación. El polipéptido es un anticuerpo. En una realización adicional, el anticuerpo es una proteína de fusión de Fc.
[0727] En una realización adicional, la invención proporciona un anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 229-381.
[0729] A “región Fc parental” tal como se usa en el presente documento se refiere a una región Fc antes de la introducción de alteración/alteraciones de aminoácido descrita(s) en el presente documento. Los ejemplos preferidos de la región Fc parental incluyen regiones Fc derivadas de anticuerpos nativos. Los anticuerpos incluyen, por ejemplo, IgA (IgA1, IgA2), IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), e IgM, o similares. Pueden derivarse anticuerpos de ser humano o mono (por ejemplo, macaco cangrejero, macaco Rhesus, tití, chimpancé, o babuino). Los anticuerpos nativos también pueden incluir mutaciones que se producen de manera natural. Una pluralidad de secuencias de alotipo de IgG debidas a polimorfismo genético se describen en “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, Publicación de NIH n.º 91-3242, y puede usarse cualquiera de ellas en la presente invención. En particular, para IgG1 humana, la secuencia de aminoácidos en las posiciones 356 a 358 (numeración de EU) puede ser o bien DEL o bien EEM. Los ejemplos preferidos de la región Fc parental incluyen regiones Fc derivadas de una región constante de cadena pesada de IgG1 humana (SEQ ID NO: 195), IgG2 humana (SEQ ID NO: 196), IgG3 humana (SEQ ID NO: 197), e IgG4 humana (SEQ ID NO: 198). Otro ejemplo preferido de la región Fc parental es una región Fc derivada de una región constante de cadena pesada SG1 (SEQ ID NO: 9). Además, la región Fc parental puede ser una región Fc producida añadiendo una(s) alteración/alteraciones de aminoácido distinta(s) de una(s) alteración/alteraciones de aminoácido descrita(s) en el presente documento a una región Fc derivada de un anticuerpo nativo.
[0731] Además, pueden combinarse alteraciones de aminoácido realizadas con otro(s) propósito(s) en una región Fc variante descrita en el presente documento. Por ejemplo, pueden añadirse sustituciones de aminoácidos que mejoran la actividad de unión a FcRn (Hintonet al., J. Immunol. 176(1):346-356 (2006); Dall’Acquaet al., J. Biol. Chem. 281(33):23514-23524 (2006); Petkovaet al., Intl. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006); Zalevskyet al., Nat. Biotechnol. 28(2):157-159 (2010); los documentos WO 2006/019447; WO 2006/053301; y WO 2009/086320), y sustituciones de aminoácidos para mejorar la heterogeneidad o estabilidad de anticuerpos (documento WO 2009/041613). Como alternativa, pueden combinarse polipéptidos con la propiedad de promover el aclaramiento de antígeno, que se describen en los documentos WO 2011/122011, WO 2012/132067, WO 2013/046704 o WO 2013/180201, polipéptidos con la propiedad de unión específica a un tejido diana, que se describen en el documento WO 2013/180200, polipéptidos con la propiedad para la unión repetida a una pluralidad de moléculas de antígeno, que se describen en los documentos WO 2009/125825, WO 2012/073992 o WO 2013/047752, con una región Fc variante descrita en el presente documento. Como alternativa, con el objetivo de conferir capacidad de unión a otros antígenos, pueden combinarse las alteraciones de aminoácido dadas a conocer en los documentos EP1752471 y EP1772465 en CH3 de una región Fc variante descrita en el presente documento. Como alternativa, con el objetivo de aumentar la retención en plasma, pueden combinarse alteraciones de aminoácido que disminuyen el pI de la región constante (documento WO 2012/016227) en una región Fc variante descrita en el presente documento. Como alternativa, con el objetivo de promover la captación en células, pueden combinarse alteraciones de aminoácido de aumento de pI de la región constante (documento WO 2014/145159) en una región Fc variante descrita en el presente documento. Como alternativa, con el objetivo de promover la eliminación de una molécula diana desde el plasma, pueden combinarse alteraciones de aminoácido de aumento de pI de la región constante (solicitudes de patente japonesa números JP2015-021371 y JP2015-185254) en una región Fc variante descrita en el presente documento. En una realización, tal alteración puede incluir, por ejemplo, la sustitución en al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en 311, 343, 384, 399, 400, y 413 según la numeración de EU. En una realización adicional, tal sustitución puede ser un reemplazo de un aminoácido por Lys o Arg en cada posición.
[0732] También pueden combinarse alteraciones de aminoácido de mejora de la actividad de unión a FcRn humano en pH ácido, en una región Fc variante descrita en el presente documento. Específicamente, tales alteraciones pueden incluir, por ejemplo, la sustitución de Leu por Met en la posición 428 y la sustitución de Ser por Asn en la posición 434, según la numeración de EU (Zalevskyet al., Nat. Biotechnol.28:157-159 (2010)); la sustitución de Ala por Asn en la posición 434 (Denget al., Metab. Dispos. 38(4):600-605 (2010)); la sustitución de Tyr por Met en la posición 252, la sustitución de Thr por Ser en la posición 254 y la sustitución de Glu por Thr en la posición 256 (Dall’Acquaet al., J. Biol. Chem.281:23514-23524 (2006)); la sustitución de Gln por Thr en la posición 250 y la sustitución de Leu por Met en la posición 428 (Hintonet al., J. Immunol.176(1):346-356 (2006)); la sustitución de His por Asn en la posición 434 (Zhenget al., Clin. Pharmacol. Ther.89(2):283-290 (2011), y alteraciones descritas en los documentos WO 2010/106180, WO 2010/045193, WO 2009/058492, WO 2008/022152, WO 2006/050166, WO 2006/053301, WO 2006/031370, WO 2005/123780, WO 2005/047327, WO 2005/037867, WO 2004/035752, o WO 2002/060919. Tales alteraciones pueden incluir, por ejemplo, al menos una alteración seleccionada del grupo que consiste en la sustitución de Leu por Met en la posición 428, la sustitución de Ala por Asn en la posición 434 y la sustitución de Thr por Tyr en la posición 436. Esas alteraciones pueden incluir además la sustitución de Arg por Gln en la posición 438 y/o sustitución de Glu por Ser en la posición 440 (solicitudes de patente japonesa números JP2015-021371 y JP2015-185254).
[0733] Dos o más anticuerpos que comprenden una región Fc variante descrita en el presente documento pueden estar incluidos en una molécula, en la que se asocian dos anticuerpos que comprenden regiones Fc variantes, de manera muy similar a en un anticuerpo. El tipo de anticuerpo no está limitado, y pueden usarse IgA (IgA1, IgA2), IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), e IgM, o similar.
[0734] The dos anticuerpos asociados que comprenden regiones Fc variantes pueden ser anticuerpos que comprenden regiones Fc variantes en las que se ha(n) introducido la(s) misma(s) alteración/alteraciones de aminoácido (a continuación en el presente documento, denominadas regiones Fc variantes homólogas), o anticuerpos que comprenden regiones Fc variantes en las que se ha(n) introducido diferente(s) alteración/alteraciones de aminoácido, o como alternativa anticuerpos que comprenden regiones Fc variantes en las que en las que se ha(n) introducido alteración/alteraciones de aminoácido sólo en una de las regiones Fc (a continuación en el presente documento, denominados anticuerpos heterólogos que comprenden regiones Fc variantes). Una de las alteraciones de aminoácido preferibles es una alteración en la estructura de bucle desde las posiciones 233 hasta 239 (numeración de EU) en el dominio CH2 de la región Fc, que está implicado en la unión con Fc gamma RIIb y Fc gamma RIIa. Preferiblemente, se introduce una alteración en la estructura de bucle del dominio CH2 de una de las regiones Fc que mejoran la actividad de unión a Fc gamma RIIb y/o selectividad, y se introduce otra alteración en la estructura de bucle del dominio CH2 de la otra región Fc que la desestabiliza. Ejemplos de alteraciones de aminoácido que pueden desestabilizar la estructura de bucle del dominio CH2 pueden ser la sustitución de al menos un aminoácido seleccionado de los aminoácidos en las posiciones 235, 236, 237, 238, y 239 por otro aminoácido. Específicamente, puede desestabilizarse, por ejemplo, alterando el aminoácido en la posición 235 a Asp, Gln, Glu, o Thr, alterando el aminoácido en la posición 236 a Asn, alterando el aminoácido en la posición 237 a Phe o Trp, alterando el aminoácido en la posición 238 a Glu, Gly, o Asn, y alterando el aminoácido en la posición 239 a Asp o Glu, según la numeración de EU.
[0735] Para la asociación de anticuerpos heterólogos que comprenden regiones Fc variantes, puede aplicarse una técnica de suprimir la asociación no pretendida de anticuerpos homólogos que comprenden regiones Fc variantes introduciendo repulsión electrostática en la superficie de contacto del dominio CH2 o CH3 de la región Fc, tal como se describe en el documento WO 2006/106905.
[0736] Los ejemplos de residuos de aminoácido en contacto en la superficie de contacto del dominio CH2 o CH3 de la región Fc incluyen el residuo en la posición 356 (numeración de EU), el residuo en la posición 439 (numeración de EU), el residuo en la posición 357 (numeración de EU), el residuo en la posición 370 (numeración de EU), el residuo en la posición 399 (numeración de EU), y el residuo en la posición 409 (numeración de EU) en el dominio CH3. Más específicamente, por ejemplo, puede producirse la región Fc en la que de uno a tres pares de residuos de aminoácido seleccionados de los puntos (1) a (3) mostrados a continuación tienen la misma carga: (1) residuos de aminoácido en las posiciones 356 y 439 (numeración de EU) en el dominio CH3; (2) residuos de aminoácido en las posiciones 357 y 370 (numeración de EU) en el dominio CH3; y (3) residuos de aminoácido en las posiciones 399 y 409 (numeración de EU) en el dominio CH3.
[0737] Además, pueden producirse anticuerpos heterólogos que comprenden regiones Fc variantes, en los que de uno a tres pares de residuos de aminoácido seleccionados de los puntos (1) a (3) indicados anteriormente tienen la misma carga en el dominio CH3 de la primera región Fc, y los pares de residuos de aminoácido seleccionados en la primera región Fc mencionada anteriormente también tienen la misma carga en el dominio CH3 de la segunda región Fc, siempre que las cargas en la primera y segunda regiones Fc sean opuestas.
[0738] En las regiones Fc mencionadas anteriormente, por ejemplo, los residuos de aminoácido cargados negativamente se seleccionan preferiblemente de ácido glutámico (E) y ácido aspártico (D), y los residuos de aminoácido cargados positivamente se seleccionan preferiblemente de lisina (K), arginina (R), e histidina (H).
[0739] Otras técnicas conocidas pueden usarse adicionalmente para la asociación de anticuerpos heterólogos que comprenden regiones Fc variantes. Específicamente, se lleva a cabo una técnica de este tipo sustituyendo una cadena lateral de aminoácido presente en una de las regiones Fc por una cadena lateral más grande (botón; que significa “protuberancia”), y sustituyendo una cadena lateral de aminoácido presente en la región Fc por una cadena lateral más pequeña (ojal; que significa “hueco”), para colocar el botón dentro del ojal. Esto puede promover una asociación eficiente entre anticuerpos que contiene región Fc que tienen diferentes secuencias de aminoácidos entre sí (documento WO 1996/027011; Ridgwayet al., Prot. Eng.9:617-621 (1996); Merchantet al., Nat. Biotech.16, 677-681 (1998)).
[0740] Además, otras técnicas conocidas también pueden usarse para la asociación heteróloga de anticuerpos que comprenden regiones Fc variantes. Puede inducirse la asociación de anticuerpos que comprenden una región Fc de manera eficiente usando heterodímeros de dominio CH3 modificados por ingeniería con intercambio de hebras (Daviset al., Prot. Eng. Des. & Sel., 23:195-202 (2010)). Esta técnica también puede usarse para inducir de manera eficiente la asociación entre anticuerpos que contienen región Fc que tienen diferentes secuencias de aminoácidos. Además, también pueden usarse técnicas de producción de anticuerpos heterodimerizados que usan la asociación de CH1 y CL de anticuerpo, y la asociación de VH y VL, que se describen en el documento WO 2011/028952.
[0741] Como con el método descrito en los documentos WO 2008/119353 y WO 2011/131746, también es posible usar la técnica de producir anticuerpos heterodimerizados produciendo dos tipos de anticuerpos homodimerizados de antemano, incubar los anticuerpos en condiciones reductoras para disociarlos, y permitir que se asocien de nuevo. Como con el método descrito en Strop (J. Mol. Biol. 420:204-219 (2012)), también es posible usar la técnica de producir anticuerpos heterodimerizados introduciendo residuos cargados tales como Lys, Arg, Glu, y Asp de modo que se introduce repulsión electrostática en dominios CH3.
[0742] Además, como con el método descrito en el documento WO 2012/058768, también es posible usar la técnica de producir anticuerpos heterodimerizados añadiendo alteraciones a los dominios CH2 y CH3.
[0743] Cuando se expresan simultáneamente dos anticuerpos que comprenden una región Fc variante que tienen secuencias de aminoácidos diferentes, con el fin de producir anticuerpos que comprenden regiones Fc variantes heterólogas, también se producen habitualmente anticuerpos que comprenden regiones Fc variantes homólogas como impurezas. En tales casos, anticuerpos que comprenden regiones Fc variantes heterólogas pueden obtenerse de manera eficiente separándolos y purificándolos de anticuerpos que comprenden regiones Fc variantes homólogas usando tecnologías conocidas. Se ha notificado un método para separar y purificar de manera eficiente anticuerpos heterodimerizados de anticuerpos homodimerizados usando cromatografía de intercambio iónico, introduciendo alteraciones de aminoácido en las regiones variables de los dos tipos de cadenas pesadas de anticuerpo para crear una diferencia en los puntos isoeléctricos entre los anticuerpos homodimerizados y los anticuerpos heterodimerizados (documento WO 2007/114325). Se ha notificado otro método para purificar anticuerpos heterodimerizados usando cromatografía con proteína A, construyendo un anticuerpo heterodimerizado que comprende dos tipos de cadenas pesadas derivadas de IgG2a de ratón que se une a proteína A e IgG2a de rata que no se une a proteína A (documentos WO 1998/050431 y WO 1995/033844).
[0744] Además, un anticuerpo heterodimerizado puede purificarse de manera eficiente usando cromatografía con proteína A, sustituyendo residuos de aminoácido en las posiciones 435 y 436 (numeración de EU), que están ubicados en el sitio de unión a proteína A de un anticuerpo cadena pesada, por aminoácidos tales como Tyr o His, para producir diferentes afinidades de unión a proteína A.
[0745] En la presente invención, alteración de aminoácido significa cualquiera de sustitución, deleción, adición, inserción, y modificación, o una combinación de las mismas. En la presente invención, alteración de aminoácido puede reformularse como mutación de aminoácido.
[0746] Cuando se sustituyen residuos de aminoácido, la sustitución a un residuo de aminoácido diferente puede llevarse a cabo con el objetivo de alterar aspectos tales como los puntos (a)-(c) descritos a continuación: (a) estructura principal de anticuerpo en la región de estructura de lámina o estructura de hélice; (b) carga eléctrica o hidrofobicidad en el sitio diana; o (c) tamaño de la cadena lateral.
[0747] Los residuos de aminoácido se clasifican en los siguientes grupos basándose en propiedades generales de su cadena lateral: (a) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, e Ile; (b) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, y Gln; (c) ácidos: Asp y Glu; (d) básica: His, Lys, y Arg; (e) residuos que afectan a la orientación de la cadena: Gly y Pro; y (f) aromáticos: Trp, Tyr, y Phe.
[0748] Se producen alteraciones de aminoácido mediante diversos métodos conocidos por los expertos en la técnica. Tales métodos incluyen el método de mutagénesis dirigida al sitio (Hashimoto-Gotohet al., Gene 152:271-275 (1995); Zoller, Meth. Enzymol.100:468-500 (1983); Krameret al., Nucleic Acids Res.12: 9441-9456 (1984)); Kramer y Fritz, Methods Enzymol.154: 350-367 (1987); y Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985)), el método de mutación por PCR, y el método de mutación por casete, pero no se limitan a los mismos.
[0749] El número de alteraciones de aminoácido introducidas en una región Fc no está limitado. En ciertas realizaciones, puede ser de 1, 2 o menos, 3 o menos, 4 o menos, 5 o menos, 6 o menos, 8 o menos, 10 o menos, 12 o menos, 14 o menos, 16 o menos, 18 o menos, o 20 o menos.
[0750] La modificación de aminoácido incluye modificación postraduccional. Una modificación postraduccional específica puede ser la adición o deleción de una cadena de azúcar. Por ejemplo, el residuo de aminoácido en la posición 297 (numeración de EU) en la región constante de IgG1 pueden modificarse con cadena de azúcar. La estructura de cadena de azúcar para la modificación no está limitada. Por ejemplo, puede añadirse ácido siálico a la cadena de azúcar de una región Fc (MAbs sep.-oct. de 2010, 2(5): 519-527). Generalmente, los anticuerpos expresados en células eucariotas comprenden glicosilación en la región constante. Por ejemplo, se sabe que se añade normalmente algún tipo de cadena de azúcar a los anticuerpos expresados en células tales como células productoras de anticuerpos que se producen de manera natural de mamíferos o células eucariotas transformadas con un vector de expresión que comprende un ADN que codifica para un anticuerpo.
[0751] Las células eucariotas mostradas en el presente documento incluyen células de levaduras y animales. Por ejemplo, células CHO y células HEK293 son células animales representativas usadas en la transformación con un vector de expresión que comprende un ADN que codifica para anticuerpos. Por otra parte, regiones constantes sin glicosilación también están incluidas en la presente invención. Pueden obtenerse anticuerpos cuya región constante no se glicosila expresando un gen que codifica para anticuerpos en células procariotas tales comoEscherichia coli. Además, un anticuerpo que comprende una región Fc variante de la presente invención puede modificarse químicamente con diversas moléculas tales como polietilenglicol (PEG) y sustancias citotóxicas. Están establecidos en la técnica métodos para tal modificación química de un anticuerpo.
[0752] En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada. El polipéptido es un anticuerpo. En algunos aspectos, el anticuerpo es una proteína de fusión de Fc. En ciertas realizaciones, un anticuerpo es un anticuerpo quimérico, o un anticuerpo humanizado. El origen de un anticuerpo no está particularmente limitado, sino que los ejemplos incluyen un anticuerpo humano, un anticuerpo de ratón, un anticuerpo de rata, y un anticuerpo de conejo. En algunos aspectos, el anticuerpo es una proteína de fusión de Fc.
[0753] Las regiones variables de anticuerpos que comprenden una región Fc variante proporcionados en el presente documento y los motivos de unión a proteína de proteínas de fusión de Fc que comprenden una región Fc variante pueden reconocer cualquier antígeno. Ejemplos de antígenos que pueden unirse mediante tales anticuerpos y proteínas de fusión incluyen, pero no se limitan a ligandos (citocinas, quimiocinas, y similares), receptores, antígenos de cáncer, antígenos de CMH, antígenos de diferenciación, inmunoglobulinas, y complejos inmunitarios que contienen parcialmente inmunoglobulinas.
[0754] Los ejemplos de citocinas que pueden unirse mediante un anticuerpo o una proteína de fusión que contiene una región Fc variante de la invención, y/o fusionarse de manera recombinante con un anticuerpo que comprende una región Fc variante dada a conocer incluyen pero no se limitan a, interleucinas 1 to 18, factores estimulantes de colonias (G-CSF, M-CSF, GM-CSF, etc.), interferones (IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, etc.), factores de crecimiento (EGF, FGF, IGF, NGF, PDGF, TGF, HGF, etc.), factores de necrosis tumoral (TNF-alfa y TNF-beta), linfotoxina, eritropoyetina, leptina, SCF, TPO, MCAF, y BMP.
[0755] Los ejemplos de quimiocinas que pueden unirse mediante un anticuerpo o una proteína de fusión que contiene una región Fc variante de la invención, y/o fusionarse de manera recombinante con un anticuerpo que comprende una región Fc variante dada a conocer incluyen pero no se limitan a, quimiocinas CC tales como CCL1 a CCL28, quimiocinas CXC tales como CXCL1 a CXCL17, quimiocinas C tales como XCL1 a XCL2, y quimiocinas CX3C tales como CX3CL1.
[0756] Los ejemplos de receptores que pueden unirse mediante un anticuerpo o una proteína de fusión que contiene una región Fc variante de la divulgación, y/o fusionarse de manera recombinante con un anticuerpo que comprende una región Fc variante dada a conocer incluyen pero no se limitan a, receptores que pertenecen a familias de receptores tales como la familia de receptores de factores de crecimiento hematopoyéticos, la familia de receptores de citocinas, la familia de receptores de tipo tirosina cinasa, la familia de receptores de tipo serina/treonina cinasa, la familia de receptores de TNF, la familia de receptores acoplados a proteínas G, la familia de receptores de tipo anclaje de GPI, la familia de receptores de tipo tirosina fosfatasa, la familia de factores de adhesión, y la familia de receptores hormonales. Los receptores que pertenecen a estas familias de receptores y sus características se han descrito en muchos documentos tales como Cooke , ed. New Comprehesive Biochemistry vol. 18B “Hormones and their Actions Part II” págs.1-46 (1988) Elsevier Science Publishers BV; Patthy (Cell 61(1):13-14 (1990)); Ullrich (Cell 61(2):203-212 (1990)); Massague (Cell 69(6):1067-1070 (1992)); Miyajimaet al. (Annu. Rev. Immunol. 10:295-331 (1992)); Tagaet al. (FASEB J.6:3387-3396 (1992)); Fantlet al. (Annu. Rev. Biochem.62:453-481 (1993)); Smithet al. (Cell 76(6):959-962 (1994)); y Flower (Biochim. Biophys. Acta 1422(3): 207-234 (1999)).
[0757] Los ejemplos de receptores específicos que pertenecen a las familias de receptores mencionadas anteriormente incluyen receptores de eritropoyetina (EPO) humana o de ratón (Joneset al., Blood 76(1):31-35 (1990); D’Andreaet al., Cell 57(2):277-285 (1989)), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) humano o de ratón (Fukunagaet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(22):8702-8706 (1990), mG-CSFR; Fukunagaet al., Cell 61(2): 341-350 (1990)), receptores de trombopoyetina (TPO) humanos o de ratón (Vigonet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
[0758] 89(12):5640-5644 (1992); Skodaet al., EMBO J. 12(7):2645-2653 (1993)), receptores de insulina humanos o de ratón (Ullrichet al., Nature 313(6005):756-761 (1985)), receptores de ligando Flt-3 humanos o de ratón (Smallet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91(2):459-463 (1994)), receptores factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF) humanos o de ratón (Gronwaldet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.85(10):3435-3439 (1988)), receptores de interferón (IFN)-alfa y beta humanos o de ratón (Uzeet al., Cell 60(2): 225-234 (1990); Novicket al., Cell 77(3):391-400 (1994)), receptores de leptina humanos o de ratón, receptores de hormona del crecimiento (GH) humanos o de ratón, receptores de interleucina (IL)-10 humanos o de ratón, receptores de factor de crecimiento insulínico (IGF)-I humanos o de ratón, receptores de factor inhibidor de leucemia (LIF) humanos o de ratón, y receptores de factor neurotrófico ciliar (CNTF) humanos o de ratón.
[0760] Los antígenos de cáncer son antígenos que se expresan a medida que se vuelven malignas células, y también se denominan antígenos específicos de tumor. Las cadenas de azúcar anómalas que aparecen en las superficies celulares o moléculas de proteína cuando las células se vuelven cancerosas son también antígenos de cáncer, y también se denominan antígenos de cáncer con cadena de azúcar. Los ejemplos de antígenos de cáncer que pueden unirse mediante un anticuerpo o una proteína de fusión que contiene una región Fc variante de la invención incluyen pero no se limitan a, GPC3 que es un receptor que pertenece a la familia de receptores de tipo anclaje de GPI mencionada anteriormente, y también se expresa en varios cánceres incluyendo cáncer de hígado (Midorikawaet al., Int. J. Cancer 103(4):455-465 (2003)), así como EpCAM que se expresa en varios cánceres incluyendo cáncer de pulmón (Linnenbachet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(1):27-31 (1989)), CA19-9, CA15-3, y sialil-SSEA-1 (SLX).
[0762] Los antígenos de CMH se clasifican de manera aproximada antígenos de CMH de clase I y antígenos de CMH de clase II. Los antígenos de CMH de clase I incluyen HLA-A, -B, -C, -E, -F, -G, y -H, y los antígenos de CMH de clase II incluyen HLA-DR, -DQ, y -DP.
[0764] Los ejemplos de antígenos de diferenciación que pueden unirse mediante un anticuerpo o una proteína de fusión que contiene una región Fc variante de la invención, y/o fusionarse de manera recombinante con un anticuerpo que comprende una región Fc variante dada a conocer incluyen pero no se limitan a, CD1, CD2, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15s, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD32, CD33, CD34, CD35, CD38, CD40, CD41a, CD41b, CD42a, CD42b, CD43, CD44, CD45, CD45RO, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD51, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD64, CD69, CD71, CD73, CD95, CD102, CD106, CD122, CD126, y CDw130.
[0766] Las inmunoglobulinas incluyen IgA, IgM, IgD, IgG, e IgE. Los complejos inmunitarios incluyen un componente de al menos cualquiera de las inmunoglobulinas.
[0768] Otros ejemplos de antígenos que pueden unirse mediante un anticuerpo o una proteína de fusión que contiene una región Fc variante de la divulgación, y/o fusionarse de manera recombinante con un anticuerpo que comprende una región Fc variante dada a conocer incluyen pero no se limitan a, 17-IA, 4-1BB, 4Dc, 6-ceto-PGF1a, 8-iso-PGF2a, 8-oxo-dG, A1 receptor de adenosina, A33, ACE, ACE-2, activina, activina A, activina AB, activina B, activina C, activina RIA, activina RIA ALK-2, activina RIB ALK-4, activina RIIA, activina RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, adresina, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, alfa-1-antitripsina, antagonista alfa-V/beta-1, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, artemina, anti-Id, ASPÁRTICO, péptido natriurético auricular, integrina av/b3, Axl, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, factor estimulante de linfocitos B (BlyS), BACE, BACE-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, BMP-3 osteogenina, BMP-4, BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, bombesina, factor neurotrófico derivado de hueso, BPDE, BPDE-ADN, BTC, factor del complemento 3 (C3), C3a, C4, C5, C5a, C10, CA125, CAD-8, calcitonina, AMPc, antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno asociado a cáncer, catepsina A, catepsina B, catepsina C/DPPI, catepsina D, catepsina E, catepsina H, catepsina L, catepsina O, catepsina S, catepsina V, catepsina X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR11, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (proteína p67), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, GMPc, CINC, toxina botulínica, toxina deClostridium perfringens, CKb8-1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, antígeno asociado a tumor de citoqueratina, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, factor regulador del complemento (factor acelerador de la descomposición), des(1-3)-IGF-I (IGF-1 cerebral), Dhh, digoxina, DNAM-1, ADNasa, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, receptor de endotelina, encefalinasa, eNOS, Eot, eotaxina 1, EpCAM, efrina B2/EphB4, EPO, ERCC, E-selectina, ET-1, factor IIa, factor VII, factor VIIIc, factor IX, proteína de activación de fibroblastos (FAP), Fas, FcR1, FEN-1, ferritina, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, fibrina, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, hormona estimulante del folículo, fractalquina, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF8 (miostatina), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-alfa1, GFR-alfa2, GFR-alfa3, GITR, glucagón, Glut4, glicoproteína IIb/IIIa (GPIIb/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, hormona liberadora de hormona del crecimiento, hapteno (NP-cap o NIP-cap), HB-EGF, HCC, glicoproteína de la envuelta gB de CMVH, glicoproteína de la envuelta gH de CMVH, UL de CMVH, factor de crecimiento hematopoyético (HGF), gp120 de hep. B, heparanasa, Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), glicoproteína gB del virus del herpes simple (VHS), glicoproteína gD de VHS, HGFA, antígeno asociado a melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA), gp120 de VIH, bucle V3 de gp 120 de VIH IIIB, HLA, HLA-DR, HM1.24, PEM de HMFG, HRG, Hrk, miosina cardiaca humana, citomegalovirus humano (CMVH), hormona del crecimiento humana (HGH), HVEM, I-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, receptor de IgA, IgE, IGF, proteína de unión a IGF, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, interferón (IFN)-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, inhibina, iNOS, cadena A de insulina, cadena B de insulina, factor de crecimiento insulínico 1, integrina alfa2, integrina alfa3, integrina alfa4, integrina alfa4/beta1, integrina alfa4/beta7, integrina alfa5 (alfa V), integrina alfa5/beta1, integrina alfa5/beta3, integrina alfa6, integrina beta1, integrina beta2, interferón gamma, IP-10, I-TAC, JE, calicreína 2, calicreína 5, calicreína 6, calicreína 11, calicreína 12, calicreína 14, calicreína 15, calicreína L1, calicreína L2, calicreína L3, calicreína L4, KC, KDR, factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), laminina 5, LAMP, LAP, LAP (TGF-1), TGF-1 latente, bp1 de TGF-1 latente, LBP, LDGF, LECT2, lefty, antígeno Y de Lewis, antígeno asociado a Y de Lweis, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, lipoproteína, LIX, LKN, Lptn, L-selectina, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, superficie pulmonar, hormona luteinizante, receptor de linfotoxina beta, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, METALOPROTEASAS, receptor de MGDF, MGMT, CMH (HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-alfa, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, mucina (Muc1), MUC18, sustancia inhibidora mülleriana, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, N-cadherina, NCA 90, NCAM, neprilisina, neurotrofina-3, -4, o -6, neurturina, factor de crecimiento nervioso (NGF), NGFR, NGF-beta, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, hormona paratiroidea, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-cadherina, PCNA, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, fosfatasa alcalina placentaria (PLAP), PIGF, PLP, PP14, proinsulina, prorrelaxina, proteína C, PS, PSA, PSCA, antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, cadena A de relaxina, cadena B de relaxina, renina, F de virus respiratorio sincitial (VRS), Fgp de VRS, Ret, factor reumatoide, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINA, albúmina sérica, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72 (glicoproteína-72 asociada a tumor), TARC, TCA-3, receptor de células T (por ejemplo, receptor de células T alfa/beta), TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, TERT, fosfatasa alcalina de tipo PLAP de testículo, TfR, TGF, TGF-alfa, TGF-beta, TGF-beta pan-específico, TGF-betaRI (ALK-5), TGF-betaRII, TGF-betaRIIb, TGF-betaRIII, TGF-beta1, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta4, TGF-beta5, trombina, Ck-1 de timo, hormona estimulante del tiroides, Tie, TIMP, TIQ, factor tisular, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-alfa, TNF-alfa beta, TNF-beta2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B (OPG OCIF, TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF1A (TNF RI CD120a, p55-60), TNFRSF1B (TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68, TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFRSF25 (DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (ligando TRAIL Apo-2, TL2), TNFSF11 (ligando de TRANCE/RANK ODF, ligando de OPG), TNFSF12 (TWEAK ligando de Apo-3, ligando de DR3), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (LIGHT HVEM ligando, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (ligando de GITR ligando de AITR, TL6), TNFSF1A (conectina TNF-a, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (LTa de TNF-b, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (ligando de OX40 gp34, TXGP1), TNFSF5 (ligando de CD40 CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (ligando de Fas ligando de Apo-1, ligando APT1), TNFSF7 (ligando de CD27 CD70), TNFSF8 (ligando de CD30 CD153), TNFSF9 (ligando de 4-1BB ligando de CD137), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, receptor de transferrina, TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, antígeno asociado a tumor CA125, antígeno asociado a tumor que expresa hidratos de carbono asociados a Y de Lewis, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, urocinasa, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-cadherina, VE-cadherina-2, VEFGR-1 (flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, antígeno viral, VLA, VLA-1, VLA-4, integrina VNR, factor de von Willebrand, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNTSA, WNTSB, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, HMGB1, IgA, A beta, CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG, Hsp90, IL-17/IL-17R, IL-20/IL-20R, LDL oxidado, PCSK9, precalicreína, RON, TMEM16F, SOD1, cromogranina A, cromogranina B, tau, VAP1, cininógeno de alto peso molecular, IL-31, IL-31R, Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2a, C2b, C3, C3a, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, factor B, factor D, factor H, properdina, esclerostina, fibrinógeno, fibrina, protrombina, trombina, factor tisular, factor V, factor Va, factor VII, factor VIIa, factor VIII, factor VIIIa, factor IX, factor IXa, factor X, factor Xa, factor XI, factor XIa, factor XII, factor XIIa, factor XIII, factor XIIIa, TFPI, antitrombina III, EPCR, trombomodulina, TAPI, tPA, plasminógeno, plasmina, PAI-1, PAI-2, GPC3, sindecano-1, sindecano-2, sindecano-3, sindecano-4, LPA, y S1P; y receptores para factores hormonales y de crecimiento.
[0770] Tal como se comenta en el presente documento, se permiten una o más alteraciones de residuo de aminoácido en las secuencias de aminoácidos que constituyen las regiones variables siempre que se mantengan sus actividades de unión a antígeno. Cuando se altera una secuencia de aminoácidos de región variable, no hay particularmente ninguna limitación sobre el sitio de alteración y el número de aminoácidos alterados. Por ejemplo, los aminoácidos presentes en CDR y/o FR pueden alterarse de manera apropiada. Cuando se alteran aminoácidos en una región variable, la actividad de unión se mantiene preferiblemente sin limitación particular; y por ejemplo, en comparación con antes de la alteración, la actividad de unión puede ser del 50 % o más, el 80 % o más, y el 100 % o más. Además, la actividad de unión puede aumentarse mediante alteraciones de aminoácido. Por ejemplo, la actividad de unión puede ser 2-, 5-, 10 veces mayor o similar que antes de la alteración. Alteración de secuencia de aminoácidos puede ser al menos una de sustitución, adición, deleción, y modificación de residuos de aminoácido.
[0771] Por ejemplo, la modificación de la glutamina N-terminal de una región variable a ácido piroglutámico mediante piroglutamilación es una modificación bien conocida por los expertos en la técnica. Por tanto, cuando el extremo N-terminal de cadena pesada es glutamina, los anticuerpos descritos en el presente documento pueden comprender las regiones variables en las que se modifica la glutamina a ácido piroglutámico.
[0772] Las regiones variables de anticuerpo descritas en el presente documento pueden tener cualquier secuencia, y pueden ser regiones variables de anticuerpo de cualquier origen, tales como anticuerpos de ratón, anticuerpos de rata, anticuerpos de conejo, anticuerpos de cabra, anticuerpos de camello, anticuerpos humanizados producidos mediante humanización de estos anticuerpo no humanos, y anticuerpos humanos. Además, estos anticuerpos pueden tener diversas sustituciones de aminoácidos introducidas en sus regiones variables para mejorar su unión a antígeno, farmacocinética, estabilidad, e inmunogenicidad. Las regiones variables pueden tener la capacidad de unirse a antígenos repetidamente debido a su dependencia del pH en la unión a antígenos (documento WO 2009/125825).
[0773] La cadena kappa y la cadena lambda están presentes en regiones constantes de cadena ligera de anticuerpo, y cualquiera es aceptable. Además, pueden tener algunas alteraciones de aminoácido tales como sustituciones, deleciones, adiciones, y/o inserciones.
[0774] Además, pueden producirse anticuerpos que comprenden regiones Fc variantes descritas en el presente documento en proteínas de fusión de Fc mediante conexión a otras proteínas tales como péptidos fisiológicamente activos. Tales proteínas de fusión pueden ser un multímero de al menos dos anticuerpos que comprenden las regiones Fc variantes. Los ejemplos de las otras proteínas incluyen receptores, moléculas de adhesión, ligandos, y enzimas, pero no se limitan a los mismos.
[0775] Los ejemplos de proteínas de fusión de Fc incluyen proteínas fusionadas con una región Fc a un receptor que se une a una molécula diana, incluyendo proteína de fusión TNFR-Fc, proteína de fusión IL1R-Fc, proteína de fusión VEGFR-Fc, y proteína de fusión CTLA4-Fc (Economideset al,. Nat. Med. 9(1):47-52 (2003); Dumontet al., BioDrugs.20(3):151-60 (2006)). Además, las proteínas que van a fusionarse pueden ser otras moléculas que tienen una actividad de unión a diana, por ejemplo, scFv (documento WO 2005/037989), anticuerpos de un solo dominio (documentos WO 2004/058821; WO2003/002609), moléculas similares a anticuerpos (Davinder, Curr. Op. Biotech.
[0776] 17:653-658 (2006); Current Opinion en Biotechnology 18:1-10 (2007); Nygrenet al., Curr. Op. Struct. Biol.7:463-469 (1997); y Hoss. Protein Science 15:14-27 (2006)) tales como DARPins (documento WO 2002/020565), Affibody (documento WO 1995/001937), Avimer (documentos WO 2004/044011; WO 2005/040229), y Adnectin (documento WO 2002/032925). Además, los anticuerpos y proteínas de fusión de Fc pueden ser multiespecíficos y pueden unirse a múltiples tipos de moléculas o epítopos diana.
[0777] B. Métodos y composiciones recombinantes
[0778] Pueden producirse anticuerpos usando métodos y composiciones recombinantes, por ejemplo, tal como se describe en la patente estadounidense n.º 4.816.567. En una realización, se proporciona el ácido nucleico aislado que codifica para un anticuerpo anti-miostatina descrito en el presente documento. En otra realización, se proporciona el ácido nucleico aislado que codifica para un anticuerpo que comprende una región Fc variante o una región Fc parental descrita en el presente documento. Tal ácido nucleico puede codificar para una secuencia de aminoácidos que comprende el VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo (por ejemplo, las cadenas ligeras y/o pesadas del anticuerpo). En una realización adicional, se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden tal ácido nucleico. En una realización adicional, se proporciona una célula huésped que comprende tal ácido nucleico. En una realización, una célula huésped comprende (por ejemplo, se ha transformado con): (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo. En una realización, la célula huésped es eucariota, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o célula linfoide (por ejemplo, una célula Y0, NS0, y Sp20). En una realización, se proporciona un método de producir un anticuerpo anti-miostatina, en el que el método comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo, tal como se ha proporcionado anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo, y opcionalmente recuperar el anticuerpo a partir de la célula huésped (o medio de cultivo de células huésped). En otra realización, se proporciona un método de producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante o una región Fc parental, en el que el método comprende cultivar una célula huésped que comprende el/los ácido(s) nucleico(s) que codifica(n) para el anticuerpo, la región Fc, o región Fc variante, tal como se ha proporcionado anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo, y opcionalmente recuperar el anticuerpo a partir de la célula huésped (o medio de cultivo de células huésped).
[0779] Para la producción recombinante de un anticuerpo anti-miostatina, se aíslan ácidos nucleicos que codifican para un anticuerpo, por ejemplo, tal como se ha descrito anteriormente, y se insertan en uno o más vectores para la clonación y/o expresión adicionales en una célula huésped. Para la producción recombinante de una región Fc, se aísla el ácido nucleico que codifica para una región Fc y se inserta en uno o más vectores para la clonación y/o expresión adicionales en una célula huésped. Tal ácido nucleico puede aislarse y secuenciarse fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótido que pueden unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo).
[0780] Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión de vectores que codifican para anticuerpos incluyen células procariotas o eucariotas descritas en el presente documento. Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos en bacterias, en particular cuando no son necesarias glicosilación y función efectora de Fc. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y anticuerpos en bacterias, véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.<os>5.648.237, 5.789.199, y 5.840.523. (véase también, Charlton, Methods in Molecular Biology, vol.248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), págs. 245-254, que describen la expresión de fragmentos de anticuerpo enE. coli.) Después de la expresión, el anticuerpo puede aislarse de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y puede purificarse adicionalmente.
[0781] Además de los procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican para anticuerpos, incluyendo cepas de levaduras y hongos cuyas rutas de glicosilación se han “humanizado”, dando como resultado la producción de un anticuerpo con un patrón de glicosilación parcial o totalmente humano. Véanse Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), y Liet al., Nat. Biotech.24:210-215 (2006).
[0782] Las células huésped adecuadas para la expresión de anticuerpo glicosilado también se derivan de organismos pluricelulares (invertebrados y vertebrados). Ejemplos de células de invertebrados incluyen células de plantas e insectos. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus que pueden usarse junto con células de insectos, particularmente para la transfección de células deSpodoptera frugiperda.
[0783] También pueden utilizarse cultivos de células vegetales como huéspedes. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.<os>5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978, y 6.417.429 (que describen la tecnología de PLANTIBODIES<™>para producir anticuerpos en plantas transgénicas).
[0784] También pueden usarse células de vertebrados como huéspedes. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas celulares de mamíferos que están adaptadas para crecer en suspensión. Otros ejemplos de líneas de células huésped de mamíferos útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7); línea de riñón embrionario humano (293 o células 293 tal como se describen, por ejemplo, en Grahamet al., J. Gen Virol.36:59 (1977)); línea de riñón de hámster recién nacido (BHK); células de Sertoli de ratón (células TM4 tal como se describen, por ejemplo, en Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma cervicouterino humano (HELA); células de riñón canino (MDCK; células de hígado de rata Buffalo (BRL 3A); células de pulmón humano (W138); células de hígado humano (Hep G2); tumor de mama de ratón (MMT 060562); células TRI, tal como se describen, por ejemplo, en Matheret al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); células MRC 5; y células FS4. Otras líneas de células huésped de mamíferos útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO DHFR<->(Urlaubet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma tales como Y0, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de ciertas líneas de células huésped de mamíferos adecuadas para la producción de anticuerpos, véase, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), págs.255-268 (2003).
[0785] Pueden obtenerse anticuerpos con características dependientes del pH usando métodos de cribado y/o métodos de mutagénesis por ejemplo, tal como se describen en el documento WO 2009/125825. Los métodos de cribado pueden comprender cualquier proceso mediante el que se identifica un anticuerpo que tiene características de unión dependiente del pH dentro de una población de anticuerpos específicos para un antígeno particular. En ciertas realizaciones, los métodos de cribado pueden comprender medir uno o más parámetros de unión (por ejemplo, KD o kd) de anticuerpos individuales dentro de una población inicial de anticuerpos tanto a pH ácido como neutro. Los parámetros de unión de los anticuerpos pueden medirse usando, por ejemplo, resonancia de plasmón superficial, o cualquier otro método analítico que permita la evaluación cuantitativa o cualitativa de las características de unión de un anticuerpo a un antígeno particular. En ciertas realizaciones, los métodos de cribado pueden comprender identificar un anticuerpo que se une a un antígeno con una razón de KD ácida/neutra de 2 o mayor. En realizaciones adicionales, los métodos de cribado pueden comprender identificar un anticuerpo que se une a un antígeno con una razón de KD a pH 5,8/pH 7,4 de 2 o mayor. Como alternativa, los métodos de cribado pueden comprender identificar un anticuerpo que se une a un antígeno con una razón de KD ácida/neutra de 2 o mayor. En realizaciones adicionales, los métodos de cribado pueden comprender identificar un anticuerpo que se une a un antígeno con una razón de KD a pH 5,8/pH 7,4 de 2 o mayor.
[0786] En otra realización, los métodos de mutagénesis pueden comprender incorporar una deleción, sustitución, o adición de un aminoácido dentro de la cadena pesada y/o ligera del anticuerpo para mejorar la unión dependiente del pH del anticuerpo a un antígeno. En ciertas realizaciones, la mutagénesis puede llevarse a cabo dentro de uno o más dominios variables del anticuerpo, por ejemplo, dentro de una o más HVR (por ejemplo, CDR). Por ejemplo, la mutagénesis puede comprender sustituir un aminoácido dentro de una o más HVR (por ejemplo, CDR) del anticuerpo por otro aminoácido. En ciertas realizaciones, la mutagénesis puede comprender sustituir uno o más aminoácidos en al menos una HVR (por ejemplo, CDR) del anticuerpo por una histidina. En ciertas realizaciones, “unión dependiente del pH mejorada” significa que la versión mutada del anticuerpo muestra una mayor razón de KD ácida/neutra, o una mayor razón de kd ácida/neutra, que la versión “parental” original (es decir, menos dependiente del pH) del anticuerpo antes de la mutagénesis. En ciertas realizaciones, la versión mutada del anticuerpo tiene una razón de KD ácida/neutra de 2 o mayor. En ciertas realizaciones, la versión mutada del anticuerpo tiene una razón de KD a pH 5,8/pH 7,4 de 2 o mayor. Como alternativa, la versión mutada del anticuerpo tiene una razón de kd ácida/neutra de 2 o mayor. En realizaciones adicionales, la versión mutada del anticuerpo tiene una razón de kd a pH 5,8/pH 7,4 de 2 o mayor.
[0787] Se producen preferiblemente anticuerpos policlonales en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (s.c.) o intraperitoneales (i.p.) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede resultar útil conjugar el antígeno relevante a una proteína que es inmunogénica en la especie que va a inmunizarse, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, albúmina sérica, tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripsina de soja usando un agente bifuncional o de derivatización, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil-sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl<2>, o R<1>N=C=NR, donde R y R<1>son grupos alquilo diferentes.
[0788] Se inmunizan los animales (habitualmente mamíferos no humanos) frente al antígeno, conjugados inmunogénicos, o derivados combinando, por ejemplo, 100 microg o 5 microg de la proteína o el conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la disolución por vía intradérmica en múltiples sitios. Un mes después se inyecta a los animales una dosis de refuerzo con de 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. De siete a 14 días después se extrae sangre de los animales y se somete a ensayo el suero para determinar el título de anticuerpos. Se inyecta a los animales una dosis de refuerzo hasta que el título alcanza una meseta. Preferiblemente, se inyecta al animal una dosis de refuerzo con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado a una proteína diferente y/o a través de un reactivo de reticulación diferente. También pueden producirse conjugados en cultivo celular recombinante as fusiones de proteína. Además, se usan de manera adecuada agentes de agregación tales como alumbre para mejorar la respuesta inmunitaria.
[0789] Se obtienen anticuerpos monoclonales a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por posibles mutaciones y/o modificaciones postraduccionales que se producen de manera natural (por ejemplo, isomerizaciones, amidaciones) que pueden estar presentes en cantidades minoritarias. Por tanto, el modificador “monoclonal” indica que la naturaleza del anticuerpo no es una mezcla de anticuerpos discretos.
[0790] Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse usando el método del hibridoma descrito por primera vez por Kohleret al., Nature 256(5517):495-497 (1975). En el método del hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster, se inmuniza tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento para producir linfocitos que producen o pueden producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína usada para la inmunización. Como alternativa, pueden inmunizarse linfocitosin vitro.
[0791] El agente de inmunización incluirá normalmente la proteína antigénica o una variante de fusión de la misma. Generalmente se usan o bien linfocitos de sangre periférica (PBL) si se desean células de origen humano, o bien células de bazo o se usan células de ganglio linfático si se desean fuentes de mamíferos no humanos. Entonces se fusionan los linfocitos con una línea celular inmortalizada usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), págs.59-103).
[0792] Las líneas celulares inmortalizadas son habitualmente células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de origen de roedor, bovino y humano. Habitualmente, se emplean líneas celulares de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma así preparadas se siembran y se hacen crecer en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parentales, no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá normalmente hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT), que son sustancias que impiden el crecimiento de células deficientes en HGPRT.
[0793] Células de mieloma inmortalizadas preferidas son aquellas que se fusionan de manera eficiente, soportan una producción estable de alto nivel de anticuerpo por las células productoras de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Entre estas, se prefieren líneas de mieloma murino, tales como las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, EE.UU., y células SP-2 (y derivados de las mismas, por ejemplo, X63-Ag8-653) disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, Virginia, EE.UU. También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma humano-de ratón para la producción de anticuerpos humanos monoclonales (Kozboret al. J. Immunol.133(6):3001-3005 (1984); Brodeuret al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, págs.51-63 (1987)).
[0794] Se somete a ensayo el medio de cultivo en que se hacen crecer células de hibridoma para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferiblemente, se determina la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de uniónin vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Tales técnicas y ensayos se conocen en la técnica. Por ejemplo, puede determinarse la afinidad de unión mediante el análisis de Scatchard de Munson, Anal. Biochem.107(1):220-239 (1980).
[0795] Después de identificarse células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad, y/o actividad deseadas, pueden subclonarse los clones mediante procedimientos de dilución limitante y hacerse crecer mediante métodos convencionales (Goding, citado anteriormente). Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden hacerse crecerin vivocomo tumores en un mamífero.
[0796] Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, líquido ascítico, o suero mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.
[0797] Pueden producirse anticuerpos mediante inmunización de un animal huésped apropiado frente a un antígeno. En una realización, el antígeno es un polipéptido que comprende una miostatina de longitud completa. En una realización, el antígeno es un polipéptido que comprende miostatina latente. En una realización, el antígeno es un polipéptido que comprende un propéptido de miostatina. En una realización, el antígeno es un polipéptido que comprende la región correspondiente a los aminoácidos en las posiciones 21 a 100 del propéptido de miostatina (SEQ ID NO: 78). En una realización, el antígeno es un polipéptido que comprende los aminoácidos en las posiciones 21-80, 41-100, 21-60, 41-80, 61-100, 21-40, 41-60, 61-80, o 81-100 del propéptido de miostatina (SEQ ID NO: 78). También se incluyen en la presente invención anticuerpos producidos mediante inmunización de a un animal frente al antígeno. Los anticuerpos pueden incorporar cualquiera de las características, individualmente o en combinación, tal como se ha descrito en “Anticuerpos anti-miostatina a modo de ejemplo” anteriormente.
[0798] Una región Fc puede obtenerse mediante una nueva elución de la fracción adsorbida sobre una columna de proteína A después de digerir parcialmente anticuerpos monoclonales IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 o similares usando una proteasa tal como pepsina. La proteasa no está particularmente limitada siempre que pueda digerir un anticuerpo de longitud completa de modo que se producirán Fab y F(ab’)2 de manera restrictiva estableciendo de manera apropiada las de condiciones reacción enzimática tales como pH, y los ejemplos incluyen pepsina y papaína.
[0799] Además, la presente invención proporciona un método para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada en comparación con un anticuerpo que comprende una región Fc parental, que comprende introducir al menos una alteración de aminoácido en la región Fc parental. El polipéptido producido es un anticuerpo. En ciertas realizaciones, un anticuerpo es un anticuerpo quimérico, o un anticuerpo humanizado. En algunos aspectos, el anticuerpo producido es una proteína de fusión de Fc.
[0800] En ciertas realizaciones, el método de producción comprende las siguientes etapas: (a) preparar un anticuerpo que comprende una región Fc parental; (b) introducir al menos una alteración de aminoácido en la región Fc parental dentro del anticuerpo; (c) medir las actividades de unión a Fc gamma RIIb de mono del anticuerpo que comprende la región Fc parental y el anticuerpo que comprende la región Fc en la etapa (b); y (d) seleccionar un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb de mono mejorada en comparación con el anticuerpo que comprende la región Fc parental.
[0801] En ciertas realizaciones, el método de producción comprende las siguientes etapas: (a) preparar un anticuerpo que comprende una región Fc parental; (b) introducir al menos una alteración de aminoácido en la región Fc parental dentro del anticuerpo; (c) medir las actividades de unión a Fc gamma RIIIa de mono del anticuerpo que comprende la región Fc parental y el anticuerpo que comprende la región Fc en la etapa (b); y (d) seleccionar un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIIa de mono disminuida en comparación con el anticuerpo que comprende la región Fc parental.
[0802] En ciertas realizaciones, el método de producción comprende las siguientes etapas: (a) preparar un anticuerpo que comprende una región Fc parental; (b) introducir al menos una alteración de aminoácido en la región Fc parental dentro del anticuerpo; (c) medir las actividades de unión a Fc gamma RIIb humano del anticuerpo que comprende la región Fc parental y el anticuerpo que comprende la región Fc en la etapa (b); y (d) seleccionar un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb humano mejorada en comparación con el anticuerpo que comprende la región Fc parental.
[0803] En ciertas realizaciones, el método de producción comprende las siguientes etapas: (a) preparar un anticuerpo que comprende una región Fc parental; (b) introducir al menos una alteración de aminoácido en la región Fc parental dentro del anticuerpo; (c) medir las actividades de unión a Fc gamma RIIIa humano del anticuerpo que comprende la región Fc parental y el anticuerpo que comprende la región Fc en la etapa (b); y (d) seleccionar un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIIa humano disminuida en comparación con el anticuerpo que comprende la región Fc parental.
[0804] En ciertas realizaciones, el método de producción comprende las siguientes etapas: (a) preparar un anticuerpo que comprende una región Fc parental; (b) introducir al menos una alteración de aminoácido en la región Fc parental dentro del anticuerpo; (c) medir las actividades de unión a Fc gamma RIIa (tipo H) humano del anticuerpo que comprende la región Fc parental y el anticuerpo que comprende la región Fc en la etapa (b); y (d) seleccionar un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIa (tipo H) humano disminuida en comparación con el anticuerpo que comprende la región Fc parental.
[0805] En ciertas realizaciones, el método de producción comprende las siguientes etapas: (a) preparar un anticuerpo que comprende una región Fc parental; (b) introducir al menos una alteración de aminoácido en la región Fc parental dentro del anticuerpo; (c) medir las actividades de unión a Fc gamma RIIa (tipo R) humano del anticuerpo que comprende la región Fc parental y el anticuerpo que comprende la región Fc en la etapa (b); y (d) seleccionar un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIa (tipo R) humano disminuida en comparación con el anticuerpo que comprende la región Fc parental.
[0806] En un aspecto, se altera al menos un aminoácido en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada, de al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en: 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 264, 266, 267, 268, 271, 295, 298, 325, 326, 327, 328, 330, 331, 332, 334, y 396, según la numeración de EU. En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb de macaco cangrejero (SEQ ID NO:223). En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb humano (por ejemplo, las SEQ ID NO:212, 213, o 214).
[0807] En otro aspecto, se altera un aminoácido en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada, en la posición 236.
[0808] En otro aspecto, se alteran al menos dos aminoácidos en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada, comprendiendo las alteraciones: (a) una alteración de aminoácido en la posición 236, y (b) al menos una alteración de aminoácido de al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en: 231, 232, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 264, 266, 267, 268, 271, 295, 298, 325, 326, 327, 328, 330, 331, 332, 334, y 396, según la numeración de EU. En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb de macaco cangrejero (SEQ ID NO:223). En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb humano (por ejemplo, las SEQ ID NO:212, 213, o 214).
[0809] En otro aspecto, se alteran al menos dos aminoácidos en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada, comprendiendo las alteraciones: (a) una alteración de aminoácido en la posición 236, y (b) al menos una alteración de aminoácido de al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en: 231, 232, 235, 239, 268, 295, 298, 326, 330, y 396, según la numeración de EU. En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb de macaco cangrejero (SEQ ID NO:223). En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb humano (por ejemplo, las SEQ ID NO:212, 213, o 214).
[0810] En otro aspecto, se alteran al menos dos aminoácidos en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada, comprendiendo las alteraciones: (a) una alteración de aminoácido en la posición 236, y (b) al menos una alteración de aminoácido de al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en: 268, 295, 326, y 330, según la numeración de EU. En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb de macaco cangrejero (SEQ ID NO:223). En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb humano (por ejemplo, las SEQ ID NO:212, 213, o 214).
[0811] En otro aspecto, se alteran aminoácidos en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada, en las posiciones de uno cualquiera de los siguientes puntos (1)-(37): (1) en las posiciones 231, 236, 239, 268 y 330; (2) en las posiciones 231, 236, 239, 268, 295 y 330; (3) en las posiciones 231, 236, 268 y 330; (4) en las posiciones 231, 236, 268, 295 y 330; (5) en las posiciones 232, 236, 239, 268, 295 y 330; (6) en las posiciones 232, 236, 268, 295 y 330; (7) en las posiciones 232, 236, 268 y 330; (8) en las posiciones 235, 236, 268, 295, 326 y 330; (9) en las posiciones 235, 236, 268, 295 y 330; (10) en las posiciones 235, 236, 268 y 330; (11) en las posiciones 235, 236, 268, 330 y 396; (12) en las posiciones 235, 236, 268 y 396; (13) en las posiciones 236, 239, 268, 295, 298 y 330; (14) en las posiciones 236, 239, 268, 295, 326 y 330; (15) en las posiciones 236, 239, 268, 295 y 330; (16) en las posiciones 236, 239, 268, 298 y 330; (17) en las posiciones 236, 239, 268, 326 y 330; (18) en las posiciones 236, 239, 268 y 330; (19) en las posiciones 236, 239, 268, 330 y 396; (20) en las posiciones 236, 239, 268 y 396; (21) en las posiciones 236 y 268; (22) en las posiciones 236, 268 y 295; (23) en las posiciones 236, 268, 295, 298 y 330; (24) en las posiciones 236, 268, 295, 326 y 330; (25) en las posiciones 236, 268, 295, 326, 330 y 396; (26) en las posiciones 236, 268, 295 y 330; (27) en las posiciones 236, 268, 295, 330 y 396; (28) en las posiciones 236, 268, 298 y 330; (29) en las posiciones 236, 268, 298 y 396; (30) en las posiciones 236, 268, 326 y 330; (31) en las posiciones 236, 268, 326, 330 y 396; (32) en las posiciones 236, 268 y 330; (33) en las posiciones 236, 268, 330 y 396; (34) en las posiciones 236, 268 y 396; (35) en las posiciones 236 y 295; (36) en las posiciones 236, 330 y 396; y (37) en las posiciones 236 y 396; según la numeración de EU. En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb de macaco cangrejero (SEQ ID NO:223). En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb humano (por ejemplo, las SEQ ID NO:212, 213, o 214).
[0813] En un aspecto adicional, se selecciona una alteración de aminoácido en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada, en cada posición del grupo que consiste en: (a) Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr en la posición 231; (b) Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr en la posición 232; (c) Asp en la posición 233; (d) Trp, Tyr en la posición 234; (e) Trp en la posición 235; (f) Ala, Asp, Glu, His, Ile, Leu, Met, Asn, Gln, Ser, Thr, Val en la posición 236; (g) Asp, Tyr en la posición 237; (h) Glu, Ile, Met, Gln, Tyr en la posición 238; (i) Ile, Leu, Asn, Pro, Val en la posición 239; (j) Ile en la posición 264; (k) Phe en la posición 266; (1) Ala, His, Leu en la posición 267; (m) Asp, Glu en la posición 268; (n) Asp, Glu, Gly en la posición 271; (o) Leu en la posición 295; (p) Leu en la posición 298; (q) Glu, Phe, Ile, Leu en la posición 325; (r) Thr en la posición 326; (s) Ile, Asn en la posición 327; (t) Thr en la posición 328; (u) Lys, Arg en la posición 330; (v) Glu en la posición 331; (w) Asp en la posición 332; (x) Asp, Ile, Met, Val, Tyr en la posición 334; y (y) Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr en la posición 396; según la numeración de EU. En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb de macaco cangrejero (SEQ ID NO:223). En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb humano (por ejemplo, las SEQ ID NO:212, 213, o 214).
[0815] En un aspecto adicional, se selecciona una alteración de aminoácido en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada, en cada posición del grupo que consiste en: (a) Gly, Thr en la posición 231; (b) Asp en la posición 232; (c) Trp en la posición 235; (d) Asn, Thr en la posición 236; (e) Val en la posición 239; (f) Asp, Glu en la posición 268; (g) Leu en la posición 295; (h) Leu en la posición 298; (i) Thr en la posición 326; (j) Lys, Arg en la posición 330, y (k) Lys, Met en la posición 396; según la numeración de EU. En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb de macaco cangrejero (SEQ ID NO:223). En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb humano (por ejemplo, las SEQ ID NO:212, 213, o 214).
[0817] En un aspecto adicional, alteraciones de aminoácido en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada, son: Asn en la posición 236, Glu en la posición 268, Lys en la posición 330, y Met en la posición 396; según la numeración de EU. En un aspecto adicional, alteraciones de aminoácido en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada, son: Asn en la posición 236, Asp en la posición 268, y Lys en la posición 330; según la numeración de EU. En un aspecto adicional, alteraciones de aminoácido en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada, son: Asn en la posición 236, Asp en la posición 268, Leu en la posición 295, y Lys en la posición 330; según la numeración de EU. En un aspecto adicional, alteraciones de aminoácido en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada, son: Thr en la posición 236, Asp en la posición 268, y Lys en la posición 330; según la numeración de EU. En un aspecto adicional, alteraciones de aminoácido en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada, son: Asn en la posición 236, Asp en la posición 268, Leu en la posición 295, Thr en la posición 326, y Lys en la posición 330; según la numeración de EU. En un aspecto adicional, alteraciones de aminoácido en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada, son: Trp en la posición 235, Asn en la posición 236, Asp en la posición 268, Leu en la posición 295, Thr en la posición 326, y Lys en la posición 330; según la numeración de EU.
[0819] En un aspecto, se altera al menos un aminoácido en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada, de al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en: 234, 238, 250, 264, 267, 307, y 330 según la numeración de EU. En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb de macaco cangrejero (SEQ ID NO:223). En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb humano (por ejemplo, las SEQ ID NO:212, 213, o 214).
[0821] En otro aspecto, se altera un aminoácido en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada, en la posición 238.
[0823] En otro aspecto, se alteran al menos dos aminoácidos en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada, comprendiendo las alteraciones: (i) una alteración de aminoácido en la posición 238, y (ii) al menos una alteración de aminoácido de al menos una posición seleccionada del grupo que consiste en: 234, 250, 264, 267, 307, y 330 según la numeración de EU. En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb de macaco cangrejero (SEQ ID NO:223). En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb humano (por ejemplo, las SEQ ID NO:212, 213, o 214).
[0825] En otro aspecto, se alteran aminoácidos en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada, en las posiciones de uno cualquiera de los siguientes puntos (1)-(9): (1) en las posiciones 234, 238, 250, 307 y 330; (2) en las posiciones 234, 238, 250, 264, 307 y 330; (3) en las posiciones 234, 238, 250, 264, 267, 307 y 330; (4) en las posiciones 234, 238, 250, 267, 307 y 330; (5) en las posiciones 238, 250, 264, 307 y 330; (6) en las posiciones 238, 250, 264, 267, 307 y 330; (7) en las posiciones 238, 250, 267, 307 y 330; (8) en las posiciones 238, 250 y 307; y (9) en las posiciones 238, 250, 307 y 330; según la numeración de EU.
[0827] En un aspecto adicional, se selecciona una alteración de aminoácido en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada, en cada posición del grupo que consiste en: (a) Tyr en la posición 234; (b) Asp en la posición 238; (c) Val en la posición 250; (d) Ile en la posición 264; (e) Ala en la posición 267; (f) Pro en la posición 307; y (g) Lys en la posición 330; según la numeración de EU. En un aspecto adicional, alteraciones de aminoácido en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada, son: Asp en la posición 238; según la numeración de EU. En un aspecto adicional, alteraciones de aminoácido en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada, son: Asp en la posición 238, Val en la posición 250, y Pro en la posición 307; según la numeración de EU. En un aspecto adicional, alteraciones de aminoácido en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada, son: Asp en la posición 238, Val en la posición 250, Pro en la posición 307, y Lys en la posición 330; según la numeración de EU. En un aspecto adicional, alteraciones de aminoácido en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada, son: Asp en la posición 238, Val en la posición 250, Ile en la posición 264, Pro en la posición 307, y Lys en la posición 330; según la numeración de EU. En un aspecto adicional, alteraciones de aminoácido en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada, son: Asp en la posición 238, Val en la posición 250, Ala en la posición 267, Pro en la posición 307, y Lys en la posición 330; según la numeración de EU. En un aspecto adicional, alteraciones de aminoácido en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada, son: Tyr en la posición 234, Asp en la posición 238, Val en la posición 250, Pro en la posición 307, y Lys en la posición 330; según la numeración de EU. En un aspecto adicional, alteraciones de aminoácido en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada, son: Tyr en la posición 234, Asp en la posición 238, Val en la posición 250, Ala en la posición 267, Pro en la posición 307, y Lys en la posición 330; según la numeración de EU. En un aspecto adicional, alteraciones de aminoácido en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada, son: Asp en la posición 238, Val en la posición 250, Ile en la posición 264, Ala en la posición 267, Pro en la posición 307, y Lys en la posición 330; según la numeración de EU. En un aspecto adicional, alteraciones de aminoácido en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada, son: Tyr en la posición 234, Asp en la posición 238, Val en la posición 250, Ile en la posición 264, Pro en la posición 307, y Lys en la posición 330; según la numeración de EU. En un aspecto adicional, alteraciones de aminoácido en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada, son: Tyr en la posición 234, Asp en la posición 238, Val en la posición 250, Ile en la posición 264, Ala en la posición 267, Pro en la posición 307, y Lys en la posición 330; según la numeración de EU. En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb de macaco cangrejero (SEQ ID NO:223). En ciertas realizaciones, el Fc gamma RIIb tiene la secuencia de Fc gamma RIIb humano (por ejemplo, las SEQ ID NO:212, 213, o 214).
[0829] Además, la presente invención proporciona un método para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con pI aumentado en comparación con un anticuerpo que comprende una región Fc parental, que comprende introducir al menos dos alteraciones de aminoácido en la región Fc parental.
[0831] En ciertas realizaciones, el método de producción para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante proporcionada en el presente documento comprende las siguientes etapas: (a) preparar un anticuerpo que comprende una región Fc parental; (b) introducir al menos dos alteraciones de aminoácido en la región Fc parental dentro del anticuerpo; (c) medir los pI del anticuerpo que comprende la región Fc parental y el polipéptido que comprende la región Fc en la etapa (b); y (d) seleccionar un anticuerpo que comprende una región Fc variante con pI aumentado en comparación con el anticuerpo correspondiente que comprende la región Fc parental.
[0832] En un aspecto, se alteran al menos dos aminoácidos en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con pI aumentado, de al menos dos posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: 285, 311, 312, 315, 318, 333, 335, 337, 341, 342, 343, 384, 385, 388, 390, 399, 400, 401, 402, 413, 420, 422, y 431, según la numeración de EU. En un aspecto adicional, el anticuerpo producido comprende una región Fc variante con pI aumentado, que comprende al menos dos alteraciones de aminoácido de al menos dos posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: 311, 341, 343, 384, 399, 400, 401, 402, y 413, según la numeración de EU.
[0833] En otro aspecto, se alteran aminoácidos en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con pI aumentado, en las posiciones de uno cualquiera de los siguientes puntos (1)-(10): (1) en las posiciones 311 y 341; (2) en las posiciones 311 y 343; (3) en las posiciones 311, 343 y 413; (4) en las posiciones 311, 384 y 413; (5) en las posiciones 311 y 399; (6) en las posiciones 311 y 401; (7) en las posiciones 311 y 413; (8) en las posiciones 400 y 413; (9) en las posiciones 401 y 413; y (10) en las posiciones 402 y 413; según la numeración de EU.
[0834] En un aspecto adicional, alteraciones de aminoácido en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con pI aumentado, son: Arg en la posición 400 y Lys en la posición 413; según la numeración de EU. En un aspecto adicional, alteraciones de aminoácido en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con pI aumentado, son: Arg en la posición 311 y Lys en la posición 413; según la numeración de EU. En un aspecto adicional, alteraciones de aminoácido en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con pI aumentado, son: Arg en la posición 311 y Arg en la posición 399; según la numeración de EU. En un aspecto adicional, alteraciones de aminoácido en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con pI aumentado, son: Arg en la posición 311 y Arg en la posición 343; según la numeración de EU. En un aspecto adicional, alteraciones de aminoácido en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con pI aumentado, son: Arg en la posición 311 y Arg en la posición 413; según la numeración de EU. En un aspecto adicional, alteraciones de aminoácido en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con pI aumentado, son: Arg en la posición 311, Arg en la posición 343, y Arg en la posición 413; según la numeración de EU. En un aspecto adicional, alteraciones de aminoácido en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con pI aumentado, son: Arg en la posición 311, Arg en la posición 384, y Arg en la posición 413; según la numeración de EU.
[0835] En un aspecto adicional, se seleccionan las alteraciones de aminoácido en el método mencionado anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante con pI aumentado, de Lys o Arg en cada posición.
[0836] En un aspecto adicional, se seleccionan las alteraciones de aminoácido en los métodos de producción mencionados anteriormente de cualquier alteración única, combinación de alteraciones únicas, o alteraciones en combinación descritas en las tablas 14-30.
[0837] Opcionalmente, pueden incluirse las siguientes etapas adicionales en los métodos mencionados anteriormente para producir un anticuerpo que comprende una región Fc variante, cuando el anticuerpo comprende además un dominio de unión a antígeno: (e) evaluar la farmacocinética del antígeno en plasma, después de la administración del anticuerpo que comprende la región Fc parental y el anticuerpo que comprende la región Fc variante en animales tales como ratones, ratas, conejos, perros, monos, y seres humanos; y (f) seleccionar un anticuerpo que comprende una región Fc variante con capacidad mejorada de eliminación de antígeno desde el plasma en comparación con el polipéptido que comprende la región Fc parental.
[0838] Están incluidos en la presente invención anticuerpos que comprenden una región Fc variante producidos mediante cualquiera de los métodos mencionados anteriormente u otros métodos que se conocen en la técnica.
[0839] C. Ensayos
[0840] Anticuerpos anti-miostatina proporcionados en el presente documento pueden identificarse, cribarse para detectar, o caracterizarse por sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas mediante diversos ensayos que se conocen en la técnica.
[0841] Regiones Fc variantes proporcionadas en el presente documento pueden identificarse, cribarse para detectar, o caracterizarse por sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas mediante diversos ensayos descritos en el presente documento o que se conocen por lo demás en la técnica.
[0842] 1. Ensayos de unión y otros ensayos
[0843] En un aspecto, se somete a prueba un anticuerpo de la invención para determinar su actividad de unión a antígeno, mediante métodos conocidos tales como ELISA, inmunotransferencia de tipo Western, BIACORE (marca registrada), etc. En un aspecto, un anticuerpo que comprende se somete a prueba una región Fc variante de la invención para determinar su actividad de unión al receptor de Fc, mediante métodos conocidos tales como BIACORE (marca registrada), etc.
[0845] En otro aspecto, pueden usarse ensayos competitivos para identificar un anticuerpo que compite por la unión a miostatina con cualquier anticuerpo anti-miostatina descrito en el presente documento. En ciertas realizaciones, cuando un anticuerpo competitivo de este tipo está presente en exceso, bloquea (por ejemplo, reduce) la unión de un anticuerpo de referencia a miostatina en al menos el 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, el 75 % o más. En algunos casos, se inhibe la unión en al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o más. En ciertas realizaciones, un anticuerpo competitivo de este tipo se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o conformacional) que se une mediante un anticuerpo anti-miostatina descrito en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo anti-miostatina descrito en las tablas 2a, 11a, o 13). En aspectos adicionales, el anticuerpo de referencia tiene un par de VH y VL descrito en las tablas 2a, 11a, o 13. Se proporcionan métodos detallados a modo de ejemplo para el mapeo de un epítopo al que se une un anticuerpo en Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols”, en Methods in Molecular Biology vol.66 (Humana Press, Totowa, NJ).
[0847] En un ensayo competitivo a modo de ejemplo, se incuba miostatina latente o propéptido de miostatina inmovilizado en una disolución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une a la miostatina y un segundo anticuerpo no marcado que está sometiéndose a prueba para determinar su capacidad para competir con el primer anticuerpo por la unión a la miostatina. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como control, se incuba miostatina inmovilizada en una disolución que comprende el primer anticuerpo marcado pero no el segundo anticuerpo no marcado. Después de la incubación en condiciones permisivas para la unión del primer anticuerpo a la miostatina, se retira el anticuerpo no unido en exceso, y se mide la cantidad de marcador asociado con miostatina inmovilizada. Si la cantidad de marcador asociado con miostatina inmovilizada está sustancialmente reducida en la muestra de prueba con relación a la muestra de control, entonces que indica que el segundo anticuerpo compite con el primer anticuerpo por la unión a la miostatina. Véase, Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual cap.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
[0849] Se describen en el presente documento ensayos para determinar la actividad de unión de un anticuerpo que contiene una región Fc variante contra uno o más miembros de la familia de Fc gamma R o se conocen por lo demás en la técnica. Tales ensayos de unión incluyen pero no se limitan a análisis mediante BIACORE (marca registrada), que utiliza los fenómeno de resonancia de plasmón superficial (SPR), cribado mediante el ensayo homogéneo de proximidad de luminiscencia amplificada (ALPHA), ELISA, y separación de células activada por fluorescencia (FACS) (Lazaret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11): 4005-4010).
[0851] En una realización, puede usarse análisis mediante BIACORE (marca registrada) para evaluar si la actividad de unión de un anticuerpo que comprende una región Fc variante se mejora, o mantiene o disminuye con respecto a un miembro de la familia de Fc gamma R particular, por ejemplo, observando si hay una disminución o un aumento del valor de la constante de disociación (KD) obtenido a partir de análisis de sensogramas, donde diversos Fc gamma R se someten a interacción como analito con anticuerpos que comprenden una región Fc variante inmovilizada o capturada sobre el chip de sensor usando métodos y reactivos conocidos (tales como proteína A, proteína L, proteína A/G, proteína G, anticuerpos anti-cadena lamda, anticuerpos anti-cadena kappa, péptidos antigénicos, proteínas antigénicas). También pueden determinarse alteraciones en la actividad de unión comparando cambios en el valor de unidades de resonancia (RU) en el sensograma antes y después de que el uno o más tipos de Fc gamma R se sometan a interacción como analitos con los anticuerpos capturados que comprenden la región Fc variante. Como alternativa, puede inmovilizarse o capturarse Fc gamma R sobre los chips de sensor, y los anticuerpos que comprenden la región Fc variante se usan como analito.
[0853] En el análisis mediante BIACORE (marca registrada), una de las sustancias (el ligando) en observación de una interacción se inmoviliza sobre una película delgada de oro sobre un chip de sensor, e iluminando con luz desde el lado inverso del chip de sensor de modo que tenga lugar reflexión total en la superficie de contacto entre la película delgada de oro y vidrio, se forma una porción de intensidad de reflexión reducida en parte de la luz reflejada (señal de SPR). Cuando la otra de las sustancias (el analito) en observación de una interacción se hace fluir sobre la superficie del chip de sensor y el ligando se une al analito, aumenta la masa de la molécula de ligando inmovilizada y cambia el índice de refracción del disolvente en la superficie del chip de sensor. Se desplaza la posición de la señal de SPR como resultado de este cambio en el índice de refracción (por otra parte, retorna la posición de la señal cuando se disocia esta unión). El sistema de BIACORE (marca registrada) indica la cantidad de desplazamiento mencionada anteriormente, o más específicamente la variable de tiempo de la masa representando gráficamente el cambio en la masa en la superficie del chip de sensor en las ordenadas como los datos de medición (sensograma). La cantidad de analito unido al ligando atrapado en la superficie del chip de sensor se determina a partir del sensograma. Se determinan parámetros cinéticos tales como constantes de velocidad de asociación (ka) y constantes de velocidad de disociación (kd) a partir de las curvas del sensograma, y se determinan las constantes de disociación (KD) a partir de la razón de estas constantes. En el método de BIACORE (marca registrada), se usa preferiblemente un método para medir la inhibición. Un ejemplo del método para medir la inhibición se describe en Lazaret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103(11):4005-4010 (2006).
[0855] Se realiza cribado por ALPHA mediante la tecnología ALPHA de que usa dos perlas, una donadora y una aceptora, basándose en los siguientes principios. Se detectan señales luminiscentes únicamente cuando moléculas unidas a perlas donadoras interaccionan físicamente con moléculas unidas a las perlas aceptoras, y las dos perlas están en estrecha proximidad entre sí. Un fotosensibilizador excitado por láser en las perlas donadoras convierte oxígeno ambiental en oxígeno singlete en estado excitado. El oxígeno singlete se dispersa alrededor de las perlas donadoras, y cuando alcanza las perlas aceptoras adyacentes, se induce una reacción quimioluminiscente en las perlas y, en última instancia, se emite luz. Cuando las moléculas unidas a las perlas donadoras no interaccionan con las moléculas unidas a las perlas aceptoras, no tiene lugar la reacción quimioluminiscente porque el oxígeno singlete producido por las perlas donadoras no alcanza las perlas aceptoras.
[0857] Por ejemplo, un complejo de anticuerpo biotinilado se une a las perlas donadoras, y Fc gamma receptor con etiqueta de glutatión S transferasa (GST) se conecta a las perlas aceptoras. En ausencia de un complejo de anticuerpo competitivo que comprende una región Fc variante, el complejo de anticuerpo que comprende una región Fc parental interacciona con el receptor de Fc gamma y produce señales a 520-620 nm. El complejo de anticuerpo que comprende una región Fc variante sin etiqueta compite con el complejo de anticuerpo que comprende una región Fc parental para la interacción con el receptor de Fc gamma. Pueden determinarse actividades de unión relativas cuantificando la disminución de la fluorescencia observada como resultado de la competencia. La biotinilación de complejos de anticuerpo tales como anticuerpos que usan sulfo-NHS-biotina y similares se conoce bien. El método de expresar el receptor de Fc gamma y GST en un célula porta un fen de fusión producido fusionando un polinucleótido que codifica para el receptor de Fc gamma en marco con un polinucleótido que codifica para GST en un vector expresable, y realizando purificación usando una columna de glutatión se adopta de manera apropiada como método para etiquetar un receptor de Fc gamma con GST. Las señales obtenidas se analizan preferiblemente, por ejemplo, ajustándolas a un modelo de competencia de un sitio que usa un análisis de regresión no lineal usando software tal como GRAPHPAD PRISM (GraphPad, San Diego).
[0859] Una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma R disminuida se refiere a una región Fc que se une a Fc gamma R con actividad de unión esencialmente más débil que una región Fc parental cuando se realizan ensayos usando sustancialmente la misma cantidad de una región Fc parental correspondiente y una región Fc variante. Además, una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma R mejorada se refiere a una región Fc que se une a Fc gamma R con actividad de unión esencialmente más fuerte que una región Fc parental correspondiente cuando se realizan ensayos usando sustancialmente la misma cantidad de una región Fc parental y una región Fc variante. Una región Fc variante con actividad de unión a Fc gamma R mantenida se refiere a una región Fc que se une a Fc gamma R con actividad de unión equivalente a o esencialmente no diferente de la de una región Fc parental cuando se realizan ensayos usando sustancialmente la misma cantidad de la región Fc parental correspondiente y el anticuerpo que contiene la región Fc variante.
[0861] Puede determinarse si estaban mejoradas o disminuidas o no las actividades de unión de una región Fc contra diversos Fc gamma R a partir del aumento o la disminución de la cantidad de unión de los diversos Fc gamma R a la región Fc, que se determinaron según el método de medición mencionado anteriormente. En este caso, la cantidad de unión de los diversos Fc gamma R a la región Fc puede evaluarse como valor obtenido dividiendo la diferencia en los valores de RU de sensogramas que cambiaron antes y después de la interacción de diversos Fc gamma R como el analito con la región Fc, entre la diferencia en los valores de RU de sensogramas que cambiaron antes y después de capturar las regiones Fc en los chips de sensor.
[0863] En la presente invención, actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada significa preferiblemente, por ejemplo, que la razón de [valor de KD de una región Fc parental para Fc gamma RIIb]/[valor de KD de una región Fc variante para Fc gamma RIIb] en los valores de KD medidos mediante el método de medición mencionado anteriormente preferiblemente pasa a ser de 2,0 o mayor, 3,0 o mayor, 4,0 o mayor, 5,0 o mayor, 6,0 o mayor, 7,0 o mayor, 8,0 o mayor, 9,0 o mayor, 10 o mayor, 15 o mayor, 20 o mayor, 25 o mayor, 30 o mayor, 35 o mayor, 40 o mayor, 45 o mayor, o incluso 50 o mayor, 55 o mayor, 60 o mayor, 65 o mayor, 70 o mayor, 75 o mayor, 80 o mayor, 85 o mayor, 90 o mayor, 95 o mayor, o 100 o mayor.
[0865] El valor de KD (mol/l) de una región Fc variante descrita en el presente documento para Fc gamma RIIb es preferiblemente menor que el de una región Fc parental para Fc gamma RIIb, y puede ser, por ejemplo, de 2,0 x 10<-6>M o menor, 1,0 x 10<-6>M o menor, 9,0 x 10<-7>M o menor, 8,0 x 10<-7>M o menor, 7,0 x 10<-7>M o menor, 6,0 x 10<-7>M o menor, 5,0 x 10<-7>M o menor, 4,0 x 10<-7>M o menor, 3,0 x 10<-7>M o menor, 2,0 x 10<-7>M o menor, 1,0 x 10<-7>M o menor, 9,0 x 10<-8>M o menor, 8,0 x 10<-8>M o menor, 7,0 x 10<-8>M o menor, 6,0 x 10<-8>M o menor, 5,0 x 10<-8>M o menor.
[0866] Además, una región Fc variante con selectividad de unión mejorada para Fc gamma RIIb en comparación con Fc gamma RIIa se refiere a una región Fc donde: (a) se mejora la actividad de unión a Fc gamma RIIb, y se mantiene o disminuye la actividad de unión a Fc gamma RIIa; (b) se mejora la actividad de unión a Fc gamma RIIb y también se mejora la actividad de unión a Fc gamma RIIa es también, pero el grado de mejora de la actividad de unión a Fc gamma RIIa es menor que el grado de mejora de la actividad de unión a Fc gamma RIIb; o (c) la actividad de unión a Fc gamma RIIb está disminuida y la actividad de unión a Fc gamma RIIa también está disminuida, pero el grado de disminución de actividad de unión a Fc gamma RIIb es menor que el grado de disminución de actividad de unión a Fc gamma RIIa. Puede determinarse si una región Fc variante tiene o no selectividad de unión mejorada para Fc gamma RIIb en vez de para Fc gamma RIIa, por ejemplo, comparando la razón del valor de KD para Fc gamma RIIa con respecto al valor de KD para Fc gamma RIIb de la región Fc variante (la razón de [valor de KD de la región Fc variante para Fc gamma RIIa]/[valor de KD de la región Fc variante para Fc gamma RIIb]), con la razón del valor de KD para Fc gamma RIIa con respecto al valor de KD para Fc gamma RIIb de la región Fc parental (la razón de [valor de KD de la región Fc parental para Fc gamma RIIa]/[valor de KD de la región Fc parental para Fc gamma RIIb]), que se determinaron según los ejemplos mencionados con anterioridad. Específicamente, cuando la razón de KD para la región Fc variante es mayor que la de la región Fc parental, puede determinarse que la región Fc variante tiene una selectividad de unión mejorada para Fc gamma RIIb en vez de para Fc gamma RIIa en comparación con la región Fc parental. Especialmente en ser humano, es probable que la actividad de unión a Fc gamma RIIb se correlacione con la actividad de unión a Fc gamma RIIa (tipo R) que con Fc gamma RIIa (tipo H) puesto que la secuencia de aminoácidos de Fc gamma RIIb comparte mayor identidad con Fc gamma RIIa (tipo R) que con Fc gamma RIIa (tipo H). Por tanto, hallar alteración/alteraciones de aminoácido que pueden mejorar la selectividad de unión <a Fc gamma RIIb humano en comparación con Fc gamma RIIa humano (tipo R) es importante para mejorar la selectividad de unión a Fc gamma RIIb en comparación con Fc gamma RIIa en seres humanos.
[0867] Cuando una región Fc variante de la presente invención tiene mayor actividad de unión frente a Fc gamma RIIb y menor actividad de unión frente a Fc gamma RIII (tal como Fc gamma RIIIa o Fc gamma RIIIb) en comparación con las de una región Fc parental, puede decirse que la región Fc variante puede es específica de Fc gamma RIIb. 2. Ensayos de actividad
[0868] En un aspecto, se proporcionan ensayos para identificar anticuerpos anti-miostatina que tienen actividad biológica. La actividad biológica puede incluir, por ejemplo, inhibir la activación de miostatina, bloquear la liberación de miostatina madura a partir de miostatina latente, inhibir la escisión proteolítica de miostatina latente, bloquear el acceso de una proteasa a miostatina latente, etc. También se proporcionan anticuerpos que tienen tal actividad biológicain vivoy/oin vitro. En ciertas realizaciones, se somete a prueba un anticuerpo de la invención para determinar tal actividad biológica.
[0869] En ciertas realizaciones, se determina si un anticuerpo de prueba inhibe la escisión de miostatina latente detectando el producto de escisión de miostatina latente (miostatina) usando un método que se conoce en la técnica tal como electroforesis, cromatografía, análisis de inmunotransferencia, un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA), o espectrometría de masas, después de ponerse en contacto una proteasa que puede escindir miostatina latente con la miostatina latente en presencia o ausencia del anticuerpo de prueba (véase, por ejemplo, Thieset al., Growth Factors 18(4):251-259 (2001). Cuando se detecta una cantidad disminuida del producto de escisión de miostatina latente (por ejemplo, propéptido de miostatina humana) en presencia de (o tras el contacto con) el anticuerpo de prueba, se identifica el anticuerpo de prueba como un anticuerpo que puede inhibir la escisión de miostatina latente. En ciertas realizaciones, se determina si un anticuerpo de prueba bloquea el acceso de una proteasa a miostatina latente mediante métodos para la detección de interacciones proteicas entre la proteasa y miostatina latente, por ejemplo, ELISA o BIACORE (marca registrada). Cuando se detecta una interacción disminuida entre la proteasa y miostatina latente en presencia de (o tras el contacto con) el anticuerpo de prueba, se identifica el anticuerpo de prueba como un anticuerpo que puede bloquear el acceso de la proteasa a miostatina latente.
[0870] En ciertas realizaciones, se determina si un anticuerpo de prueba bloquea la liberación de miostatina madura a partir de miostatina latente detectando actividad de miostatina madura, por ejemplo, la actividad de unión a un receptor de miostatina, o la actividad de mediar en la transducción de señales en una célula que expresa un receptor de miostatina (por ejemplo, ActRIIb). Las células útiles para un ensayo de este tipo pueden ser aquellas que expresan un receptor de miostatina endógeno, por ejemplo, miocitos L6, o pueden ser aquellas que están modificadas genéticamente, de manera transitoria o estable, para expresar un transgén que codifica para un receptor de miostatina, por ejemplo, un receptor de activina tal como un receptor de activina tipo II (Thieset al, citado anteriormente). Puede detectarse la unión de miostatina a un receptor de miostatina usando un ensayo de unión a receptor. Puede detectarse la transducción de señales mediada por miostatina en cualquier nivel en la ruta de transducción de señales, por ejemplo, examinando la fosforilación de un polipéptido Smad, examinando la expresión de un gen regulado por miostatina incluyendo un gen indicador, o midiendo la proliferación de una célula dependiente de miostatina. Cuando se detecta una actividad de miostatina madura disminuida en presencia de (o tras el contacto con) el anticuerpo de prueba, se identifica el anticuerpo de prueba como un anticuerpo que puede bloquear la liberación de miostatina madura a partir de miostatina latente.
[0871] También puede detectarse y/o medirse la inhibición de la activación de miostatina usando los métodos expuestos y ejemplificados en los ejemplos de trabajo. Usando ensayos de estos u otros tipos adecuados, pueden cribarse anticuerpos de prueba para determinar los que pueden inhibir la activación de miostatina. En ciertas realizaciones, la inhibición de la activación de miostatina incluye al menos una disminución del 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, o el 40 % o mayor de la activación de miostatina en el ensayo en comparación con un control negativo en condiciones similares. En algunas realizaciones, se refiere a la inhibición de la activación de miostatina de al menos el 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, o el 95 % o mayor.
[0872] En otro aspecto, se proporcionan ensayos para identificar anticuerpos anti-miostatina que forman un complejo inmunitario (es decir, un complejo antígeno-anticuerpo) con miostatina. También se proporcionan anticuerpos que tiene tal actividad biológicain vivoy/oin vitro.
[0873] En ciertas realizaciones, se somete a prueba un anticuerpo de la invención para determinar tal actividad biológica. En ciertas realizaciones, se evalúa la formación de un complejo inmunitario mediante un método tal como cromatografía de exclusión molecular (filtración en gel), ultracentrifugación, dispersión de luz, microscopio electrónico, o espectrometría de masas (Mol. Immunol. 39:77-84 (2002), Mol. Immunol. 47:357-364 (2009)). Estos métodos hacen uso de la propiedad que un complejo inmunitario es una molécula más grande que un anticuerpo solo, o un antígeno solo. Cuando se detecta un complejo grande que contiene dos o más anticuerpos y dos o más antígenos (por ejemplo, moléculas de miostatina) en presencia de un anticuerpo de prueba y un antígeno, se identifica el anticuerpo de prueba como un anticuerpo que puede formar un complejo inmunitario que contiene dos o más anticuerpos y dos o más moléculas de miostatina. En otra realización, se evalúa la formación de un complejo inmunitario mediante un método tal como, ELISA, FACS, o SPR (ensayo de resonancia de plasmón superficial; por ejemplo, usando BIACORE (marca registrada)) (Shieldset al., J. Biol. Chem.276(9):6591-6604 (2001); Singhet al., J. Immunol. Methods 50:109-114 (1982); Suzukiet al., J. Immunol. 184(4):1968-1976 (2010); Luoet al., mAbs 1(5):491-504 (2009)). Estos métodos hacen uso de la propiedad de que un complejo inmunitario que contiene dos o más anticuerpos y dos o más antígenos puede unirse más fuertemente a un receptor de Fc o un componente del complemento que puede un anticuerpo o antígeno solo. Cuando se detecta una unión aumentada a un receptor de Fc o un componente del complemento en presencia tanto de un anticuerpo de prueba y un antígeno en comparación con en presencia de un anticuerpo solo, se identifica el anticuerpo de prueba como un anticuerpo que puede formar un complejo inmunitario que contiene dos o más anticuerpos y dos o más moléculas de miostatina. En otra realización, se evalúa la formación de un complejo inmunitario administrando un anticuerpo de prueba a un animal (por ejemplo, un ratón) y medir el aclaramiento de antígeno desde el plasma. Tal como se ha descrito anteriormente, se espera que un anticuerpo que forma un complejo inmunitario que contiene dos o más anticuerpos con dos o más antígenos acelere la eliminación de antígenos desde el plasma. Por tanto, cuando se observa una eliminación de miostatina acelerada desde el plasma en un ratón al que se administró anticuerpo de prueba en comparación con en un ratón al que se administró anticuerpo de referencia, se identifica el anticuerpo de prueba como un anticuerpo que puede formar un complejo inmunitario que contiene dos o más anticuerpos y dos o más moléculas de miostatina de manera más eficiente que el anticuerpo de referencia.
[0874] D. Inmunoconjugados
[0875] En algunas realizaciones, la invención proporciona inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo antimiostatina en el presente documento conjugado a uno o más agentes citotóxicos, tales como agentes o fármacos quimioterápicos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, toxinas proteicas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal, o animal, o fragmentos de las mismas), o isótopos radiactivos.
[0876] En algunas realizaciones, la invención proporciona inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo que comprende una región Fc variante en el presente documento conjugado a uno o más agentes citotóxicos, tales como agentes o fármacos quimioterápicos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, toxinas proteicas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal, o animal, o fragmentos de las mismas), o isótopos radiactivos.
[0877] En una realización, un inmunoconjugado es un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) en el que un anticuerpo se conjuga a uno o más fármacos, incluyendo pero sin limitarse a, un maitansinoide (véanse las patentes estadounidense n.<os>5.208.020, 5.416.064 y la patente europea EP 0 425 235 B1); una auristatina tal como retos farmacológicos de monometilauristatina DE y DF (MMAE y MMAF) (véanse las patentes estadounidense n.<os>5.635.483 y 5.780.588, y 7.498.298); una dolastatina; una calicheamicina o derivado de la misma (véanse las patentes estadounidense n.<os>5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, y 5.877.296; Hinmanet al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); y Lodeet al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); una antraciclina tal como daunomicina o doxorubicina (véanse Kratzet al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffreyet al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgovet al., Bioconj. Chem.16:717-721 (2005); Nagyet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchiket al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); Kinget al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); y la patente estadounidense n.º 6.630.579); metotrexato; vindesina; un taxano tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel, y ortataxel; un tricoteceno; y CC1065.
[0878] En otra realización, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo tal como se describe en el presente documento conjugado a una toxina enzimáticamente activa o fragmento de la misma, incluyendo pero sin limitarse a cadena de A de difteria, fragmentos activos sin unión de toxina diftérica, cadena A de exotoxina (dePseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, proteínas deAleurites fordii, proteínas diantinas, proteínas dePhytolaca americana(PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor deMomordica charantia, curcina, crotina, inhibidor deSapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y un tricoteceno.
[0879] En otra realización, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo tal como se describe en el presente documento conjugado a un átomo radiactivo para formar un radioconjugado. Una variedad de isótopos radiactivos están disponibles para la producción de radioconjugados. Los ejemplos incluyen At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>e isótopos radiactivos de Lu. Cuando se usa el radioconjugado para detección, puede comprender un átomo radiactivo para estudios gammagráficos, por ejemplo tc99m o I123, o un marcador de espín para obtención de imágenes mediante resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como imágenes de resonancia magnética, IRM), tal como yodo-123 de nuevo, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso y hierro.
[0880] Pueden producirse conjugados de un anticuerpo y agente citotóxico usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncionales tales como 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), bis-azido-compuestos (tales como bis (p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno-2,6-diisocianato), y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina de ricina tal como se describe en Vitettaet al., Science 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen-triaminopentaacético marcado con carbono-14 (MX-DTPA) es un agente quelante a modo de ejemplo para la conjugación de radionucleótido al anticuerpo. Véase el documento WO 1994/11026. El conector puede ser un “conector escindible” que facilita la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, pueden usarse un conector lábil en ácido, conector sensible a peptidasa, conector fotolábil, conector de dimetilo o conector de contiene disulfuro (Chariet al., Cancer Res.52:127-131 (1992); la patente estadounidense n.º 5.208.020).
[0881] Los inmunoconjugados o ADC en el presente documento contemplan expresamente, pero no se limitan a tales conjugados preparados con reactivos que son agentes de reticulación incluyendo, pero sin limitarse a, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, y sulfo-SMPB, y SVSB ((4-vinilsulfona)benzoato de succinimidilo) que están disponibles comercialmente (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EE.UU.).
[0882] E. Métodos y composiciones para diagnóstico y detección
[0883] En ciertas realizaciones, cualquiera de los anticuerpos anti-miostatina proporcionados en el presente documento es útil para detectar la presencia de miostatina en una muestra biológica. El término “detectar” tal como se usa en el presente documento abarca detección cuantitativa o cualitativa. En ciertas realizaciones, una muestra biológica comprende una célula o un tejido, tal como suero, sangre completa, plasma, muestra de biopsia, muestra de tejido, suspensión celular, saliva, esputo, líquido bucal, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, líquido ascítico, leche, calostro, secreción de glándula mamaria, linfa, orina, sudor, líquido lagrimal, líquido gástrico, líquido sinovial, líquido peritoneal, líquido del cristalino ocular o mucosidad.
[0884] En una realización, se proporciona un anticuerpo anti-miostatina para su uso en un método de diagnóstico o detección. En un aspecto adicional, se proporciona un método de detectar la presencia de miostatina latente o propéptido de miostatina en una muestra biológica. En ciertas realizaciones, el método comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-miostatina tal como se describe en el presente documento en condiciones permisivas para la unión del anticuerpo anti-miostatina a miostatina, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-miostatina y miostatina. Tal método puede ser un métodoin vitrooin vivo. En una realización, un anticuerpo anti-miostatina se usa para seleccionar sujetos elegibles para terapia con un anticuerpo anti-miostatina, por ejemplo, donde la miostatina es un biomarcador para la selección de pacientes.
[0885] Los trastornos a modo de ejemplo incluyen pero no se limitan a, distrofia muscular (DM; incluyendo distrofia muscular de Duchenne), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), atrofia muscular, atrofia orgánica, síndrome del túnel carpiano, debilidad, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva (EPOC), sarcopenia, caquexia, síndromes de desgaste muscular, desgaste muscular inducido por VIH, diabetes tipo 2, tolerancia alterada a la glucosa, síndrome metabólico (incluyendo síndrome X), resistencia a la insulina (incluyendo resistencia inducida por traumatismo, por ejemplo, quemaduras o desequilibrio de nitrógeno), trastornos del tejido adiposo (por ejemplo, obesidad, dislipidemia, esteatosis hepática no alcohólica, etc.), osteoporosis, osteopenia, osteoartritis, y trastornos óseos metabólicos (incluyendo baja masa ósea, insuficiencia gonadal prematura, supresión de andrógenos, deficiencia de vitamina D, hiperparatiroidismo secundario, carencias nutritivas, y anorexia nerviosa).
[0886] En ciertas realizaciones, se proporcionan anticuerpos marcados anti-miostatina. Los marcadores incluyen, pero no se limitan a, marcadores o restos que se detectan directamente (tales como marcadores fluorescentes, cromofóricos, electrodensos, quimioluminiscentes, y radiactivos), así como restos, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, a través de una reacción enzimática o interacción molecular. Los marcadores a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, los radioisótopos<32>P,<14>C,<125>I,<3>H, y<131>I, fluoróforos tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luceriferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (la patente estadounidense n.º 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazindionas, peroxidasa del rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, betagalactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa, y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas tales como uricasa y xantina oxidasa, acoplados con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de colorante tal como HRP, lactoperoxidasa, o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de espín, marcadores de bacteriófago, radicales libres estables, y similares.
[0887] F. Formulaciones farmacéuticas
[0888] Se preparan formulaciones farmacéuticas de un anticuerpo anti-miostatina tal como se describe en el presente documento mezclando tal anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con uno o más grupos transportadores farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16ª edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o disoluciones acuosas.
[0889] Se preparan formulaciones farmacéuticas de un anticuerpo que comprende una región Fc variante tal como se describe en el presente documento mezclando tal anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con uno o más grupos transportadores farmacéuticamente aceptables opcionales en forma de formulaciones liofilizadas o disoluciones acuosas.
[0890] Grupos transportadores farmacéuticamente aceptables son generalmente no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen, pero no se limitan a: tampones tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil-amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilo parabenos tales como metil o propil-parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones de formación de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Los grupos transportadores farmacéuticamente aceptables a modo de ejemplo en el presente documento incluyen además agentes de dispersión de fármacos intersticiales tales como glicoproteínas hialuronidasas activas en forma neutra solubles (sHASEGP), por ejemplo, glicoproteínas hialuronidasas PH-20 solubles humanas, tales como rHuPH20 (HILENEX (marca registrada), Baxter International, Inc.). Ciertas sHASEGP a modo de ejemplo y métodos de uso, incluyendo rHuPH20, se describen en las publicaciones estadounidenses n.<os>2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, se combina una sHASEGP con una o más glicosaminoglicanasas adicionales tales como condroitinasas.
[0891] Se describen formulaciones de anticuerpos liofilizadas a modo de ejemplo en la patente estadounidense n.º 6.267.958. Las formulaciones de anticuerpos acuosas incluyen las descritas en la patente estadounidense n.º 6.171.586 y el documento WO 2006/044908, incluyendo estas últimas formulaciones un tampón de histidina-acetato. La formulación en el presente documento también puede contener más de un principio activo, según sea necesario, para la indicación particular que esté tratándose, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afecten de manera adversa entre sí. Tales principios activos están presentes de manera adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el fin pretendido.
[0892] Pueden atraparse principios activos en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas poli-(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se dan a conocer en Remington’s Pharmaceutical Sciences 16ª edición, Osol, A. Ed. (1980).
[0893] Pueden producirse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas, o microcápsulas.
[0894] Las formulaciones son generalmente estériles. La esterilidad puede lograrse fácilmente, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.
[0895] G. Composiciones y métodos terapéuticos
[0896] Cualquiera de los anticuerpos anti-miostatina de la invención pueden usarse en métodos terapéuticos. Asimismo, cualquiera de los anticuerpos que comprenden una región Fc variante proporcionados en el presente documento pueden usarse en métodos terapéuticos.
[0897] En un aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-miostatina para su uso como medicamento. Se proporciona el anticuerpo anti-miostatina de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad de desgaste muscular. En ciertas realizaciones, se proporciona un anticuerpo anti-miostatina para su uso en un método de tratamiento. En ciertas realizaciones, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-miostatina para su uso en un método de tratar a un individuo que tiene una enfermedad de desgaste muscular que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo anti-miostatina. En una realización, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional. En realizaciones adicionales que están presentes únicamente con fines de ilustración pero que no forman parte de la invención, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-miostatina para su uso en aumentar la masa de tejido muscular. En ciertas realizaciones que están presentes únicamente con fines de ilustración pero que no forman parte de la invención, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-miostatina para su uso en un método de aumentar la masa de tejido muscular en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo anti-miostatina para aumentar la masa de tejido muscular. En realizaciones adicionales que están presentes únicamente con fines de ilustración pero que no forman parte de la invención, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-miostatina para su uso en aumentar la fuerza de tejido muscular. En ciertas realizaciones que están presentes únicamente con fines de ilustración pero que no forman parte de la invención, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-miostatina para su uso en un método de aumentar la fuerza de tejido muscular en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo anti-miostatina para aumentar la fuerza de tejido muscular. En realizaciones adicionales que están presentes únicamente con fines de ilustración pero que no forman parte de la invención, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-miostatina para su uso en reducir la acumulación de grasa corporal. En ciertas realizaciones que están presentes únicamente con fines de ilustración pero que no forman parte de la invención, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-miostatina para su uso en un método de reducir la acumulación de grasa corporal en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo anti-miostatina para reducir la acumulación de grasa corporal. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriores es preferiblemente un ser humano.
[0899] Un anticuerpo anti-miostatina de la presente invención puede mostrar características de unión dependiente del pH. En realizaciones adicionales, la divulgación proporciona un anticuerpo anti-miostatina para su uso en la mejora del aclaramiento de miostatina desde el plasma. En ciertas realizaciones, la divulgación proporciona un anticuerpo antimiostatina para su uso en un método de mejora del aclaramiento de miostatina desde el plasma en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo anti-miostatina para mejorar el aclaramiento de miostatina desde el plasma. En una realización, un anticuerpo anti-miostatina con características de unión dependiente del pH mejora el aclaramiento de miostatina desde el plasma, en comparación con un anticuerpo antimiostatina convencional que no tiene características de unión dependiente del pH. En una realización adicional, un anticuerpo anti-miostatina con una característica de unión dependiente del pH entre la unión a pH 5,8 y pH 7,4 mejora el aclaramiento de miostatina desde el plasma, en comparación con un anticuerpo anti-miostatina convencional que no tiene características de unión dependiente del pH. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriores es preferiblemente un ser humano.
[0901] En un aspecto adicional, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo anti-miostatina en la fabricación o preparación de un medicamento. En una realización, el medicamento es para el tratamiento de una enfermedad de desgaste muscular. En una realización adicional, el medicamento es para su uso en un método de tratar una enfermedad de desgaste muscular que comprende administrar a un individuo que tiene una enfermedad de desgaste muscular una cantidad eficaz del medicamento. En una realización, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional. En una realización adicional que está presente únicamente con fines de ilustración pero que no forma parte de la invención, el medicamento es para aumentar la masa de tejido muscular. En una realización adicional que está presente únicamente con fines de ilustración pero que no forma parte de la invención, el medicamento es para su uso en un método de aumentar la masa de tejido muscular en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del medicamento para aumentar la masa de tejido muscular. En una realización adicional que está presente únicamente con fines de ilustración pero que no forma parte de la invención, el medicamento es para aumentar la fuerza de tejido muscular. En una realización adicional que está presente únicamente con fines de ilustración pero que no forma parte de la invención, el medicamento es para su uso en un método de aumentar la fuerza de tejido muscular en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del medicamento para aumentar la fuerza de tejido muscular. En una realización adicional que está presente únicamente con fines de ilustración pero que no forma parte de la invención, el medicamento es para reducir la acumulación de grasa corporal. En una realización adicional que está presente únicamente con fines de ilustración pero que no forma parte de la invención, el medicamento es para su uso en un método de reducir la acumulación de grasa corporal en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del medicamento para reducir la acumulación de grasa corporal. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriores puede ser un ser humano.
[0903] Un anticuerpo anti-miostatina de la presente invención puede mostrar características de unión dependiente del pH. En una realización adicional, el medicamento es para mejorar el aclaramiento de miostatina desde el plasma. En una realización adicional, el medicamento es para su uso en un método de mejora del aclaramiento de miostatina desde el plasma en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del medicamento para mejorar el aclaramiento de miostatina desde el plasma. En una realización, un anticuerpo anti-miostatina con características de unión dependiente del pH mejora el aclaramiento de miostatina desde el plasma, en comparación con un anticuerpo anti-miostatina convencional que no tiene características de unión dependiente del pH. En una realización adicional, el anticuerpo anti-miostatina muestra características de unión dependiente del pH diferentes entre pH 5,8 y pH 7,4. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriores es preferiblemente un ser humano.
[0905] En otro aspecto, la divulgación proporciona un método para tratar una enfermedad de desgaste muscular. En una realización, el método comprende administrar a un individuo que tiene tal enfermedad de desgaste muscular una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-miostatina proporcionado en el presente documento. En una realización, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional. El “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriores puede ser un ser humano.
[0906] En otro aspecto que está presente únicamente con fines de ilustración pero que no forma parte de la invención, la divulgación proporciona un método para aumentar la masa de tejido muscular en un individuo. En una realización que está presente únicamente con fines de ilustración pero que no forma parte de la invención, el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-miostatina proporcionado en el presente documento para aumentar la masa de tejido muscular. En una realización, el “individuo” es un ser humano. En otro aspecto que está presente únicamente con fines de ilustración pero que no forma parte de la invención, la divulgación proporciona un método para aumentar la fuerza de tejido muscular en un individuo. En una realización que está presente únicamente con fines de ilustración pero que no forma parte de la invención, el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-miostatina proporcionado en el presente documento para aumentar la fuerza de tejido muscular. En una realización, el “individuo” es un ser humano.
[0907] En otro aspecto que está presente únicamente con fines de ilustración pero que no forma parte de la invención, la divulgación proporciona un método para reducir la acumulación de grasa corporal en un individuo. En una realización que está presente únicamente con fines de ilustración pero que no forma parte de la invención, el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-miostatina proporcionado en el presente documento para reducir la acumulación de grasa corporal. En una realización, el “individuo” es un ser humano.
[0908] Un anticuerpo anti-miostatina de la presente invención puede mostrar características de unión dependiente del pH. En una realización adicional, la divulgación proporciona un método para mejorar el aclaramiento de miostatina desde el plasma en un individuo. En una realización, el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-miostatina proporcionado en el presente documento para mejorar el aclaramiento de miostatina desde el plasma. En una realización, un anticuerpo anti-miostatina con características de unión dependiente del pH mejora el aclaramiento de miostatina desde el plasma, en comparación con un anticuerpo anti-miostatina convencional que no tiene características de unión dependiente del pH. En una realización adicional, el anticuerpo anti-miostatina muestra características de unión dependiente del pH diferentes entre pH 5,8 y pH 7,4. En una realización, un “individuo” es un ser humano.
[0909] En un aspecto adicional, la divulgación proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos anti-miostatina proporcionados en el presente documento, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los métodos terapéuticos anteriores. En una realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-miostatina proporcionados en el presente documento y un grupo transportador farmacéuticamente aceptable. En otra realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos antimiostatina proporcionados en el presente documento y al menos un agente terapéutico adicional.
[0910] En un aspecto adicional, la formulación farmacéutica es para el tratamiento de una enfermedad de desgaste muscular. En una realización adicional, la formulación farmacéutica es para aumentar la masa de tejido muscular. En una realización adicional, la formulación farmacéutica es para aumentar la fuerza de tejido muscular. En una realización adicional, la formulación farmacéutica es para reducir la acumulación de grasa corporal. Un anticuerpo anti-miostatina de la presente invención puede mostrar características de unión dependiente del pH. En una realización adicional, la formulación farmacéutica es para mejorar el aclaramiento de miostatina desde el plasma. En una realización, la formulación farmacéutica se administra to un individuo que tiene una enfermedad de desgaste muscular. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriores es preferiblemente un ser humano.
[0911] En un aspecto adicional, la divulgación proporciona métodos para preparar un medicamento o una formulación farmacéutica, que comprende mezclar cualquiera de los anticuerpos anti-miostatina proporcionados en el presente documento con un grupo transportador farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los métodos terapéuticos anteriores. En una realización, los métodos para preparar un medicamento o una formulación farmacéutica comprenden además añadir al menos un agente terapéutico adicional al medicamento o la formulación farmacéutica.
[0912] En ciertas realizaciones, una enfermedad de desgaste muscular se selecciona del grupo que consiste en distrofia muscular (DM; incluyendo distrofia muscular de Duchenne), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), atrofia muscular, atrofia orgánica, síndrome del túnel carpiano, debilidad, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva (EPOC), sarcopenia, caquexia, síndromes de desgaste muscular, desgaste muscular inducido por VIH, diabetes tipo 2, tolerancia alterada a la glucosa, síndrome metabólico (incluyendo síndrome X), resistencia a la insulina (incluyendo resistencia inducida por traumatismo, por ejemplo, quemaduras o desequilibrio de nitrógeno), trastornos del tejido adiposo (por ejemplo, obesidad, dislipidemia, esteatosis hepática no alcohólica, etc.), osteoporosis, osteopenia, osteoartritis, y trastornos óseos metabólicos (incluyendo baja masa ósea, insuficiencia gonadal prematura, supresión de andrógenos, deficiencia de vitamina D, hiperparatiroidismo secundario, carencias nutritivas, y anorexia nerviosa).
[0913] Cualquiera de los anticuerpos que comprenden una región Fc variante proporcionados en el presente documento pueden usarse en métodos terapéuticos. En un aspecto adicional, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo que comprende cualquiera de los anticuerpos que comprenden regiones Fc variantes proporcionado en el presente documento, por ejemplo, para su uso en métodos terapéuticos. En una realización, una formulación farmacéutica comprende un anticuerpo que comprende cualquiera de los anticuerpos que comprenden regiones Fc variantes proporcionado en el presente documento y un grupo transportador farmacéuticamente aceptable. En otra realización, una formulación farmacéutica comprende un anticuerpo que comprende cualquiera de las regiones Fc variantes proporcionado en el presente documento y al menos un agente terapéutico adicional.
[0914] En un aspecto, se proporciona un anticuerpo que comprende una región Fc variante para su uso como medicamento. En aspectos adicionales, se proporciona un anticuerpo que comprende una región Fc variante para su uso en el tratamiento de un trastorno. En ciertas realizaciones, se proporciona un anticuerpo que comprende una región Fc variante para su uso en un método de tratamiento. En ciertas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región Fc variante para su uso en un método de tratar a un individuo que tiene un trastorno que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo que comprende una región Fc variante proporcionada en el presente documento. En una realización, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional. En una realización, el “individuo” es un ser humano.
[0915] En un aspecto adicional, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo que comprende una región Fc variante en la fabricación o preparación de un medicamento. En una realización, el medicamento es para el tratamiento de un trastorno. El polipéptido es un anticuerpo. En algunos aspectos, el anticuerpo es una proteína de fusión de Fc. En una realización adicional, el medicamento es para su uso en un método de tratar un trastorno que comprende administrar a un individuo que tiene el trastorno que va a tratarse una cantidad eficaz del medicamento. En una realización, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional. En una realización, el “individuo” es un ser humano.
[0916] En un aspecto adicional, la divulgación proporciona un método para tratar un trastorno. En una realización, el método comprende administrar a un individuo que tiene tal trastorno una cantidad eficaz de un anticuerpo que comprende una región Fc variante. En una realización, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional. En una realización, el “individuo” es un ser humano. En un aspecto adicional, la divulgación proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo que comprende una región Fc variante proporcionada en el presente documento, para su uso en un método terapéutico tal como cualquiera de los métodos terapéuticos descritos en el presente documento. En una realización, una formulación farmacéutica comprende un anticuerpo que comprende una región Fc variante proporcionada en el presente documento y un grupo transportador farmacéuticamente aceptable. En otra realización, una formulación farmacéutica comprende un anticuerpo que comprende una región Fc variante proporcionada en el presente documento y al menos un agente terapéutico adicional.
[0917] En un aspecto adicional, la formulación farmacéutica es para el tratamiento de un trastorno. En una realización, la formulación farmacéutica se administra to un individuo que tiene un trastorno. En una realización, el “individuo” es un ser humano.
[0918] En realizaciones adicionales, la divulgación proporciona un anticuerpo que comprende una región Fc variante para su uso en la supresión de la activación de células B, mastocitos, células dendríticas, y/o basófilos. En ciertas realizaciones, la divulgación proporciona un anticuerpo que comprende una región Fc variante para su uso en un método de suprimir la activación de células B, mastocitos, células dendríticas, y/o basófilos en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo que comprende una región Fc variante para suprimir la activación de células B, mastocitos, células dendríticas, y/o basófilos. En una realización, el “individuo” es un ser humano.
[0919] En un aspecto adicional, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo que comprende una región Fc variante en la fabricación o preparación de un medicamento. El polipéptido es un anticuerpo. En algunos aspectos, el anticuerpo es una proteína de fusión de Fc. En una realización adicional, el medicamento es para suprimir la activación de células B, mastocitos, células dendríticas, y/o basófilos. En una realización adicional, el medicamento es para su uso en un método de suprimir la activación de células B, mastocitos, células dendríticas, y/o basófilos en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del medicamento para suprimir la activación de células B, mastocitos, células dendríticas, y/o basófilos. En una realización, el “individuo” es un ser humano. En un aspecto adicional, la divulgación proporciona un método para suprimir la activación de células B, mastocitos, células dendríticas, y/o basófilos en un individuo. En una realización, el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un polipéptido que comprende una región Fc variante para suprimir la activación de células B, mastocitos, células dendríticas, y/o basófilos. En una realización, el “individuo” es un ser humano.
[0920] En un aspecto adicional, la divulgación proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo que comprende una región Fc variante. En una realización adicional, la formulación farmacéutica es para suprimir la activación de células B, mastocitos, células dendríticas, y/o basófilos.
[0921] Anticuerpos que comprenden una región Fc variante de la presente divulgación pueden suprimir la activación de células B, mastocitos, células dendríticas, y/o basófilos. Sin desear estar restringido por la teoría, se cree que esta activación suprimida es el resultado de la unión selectiva de las regiones Fc variantes proporcionadas a Fc gamma RIIb sin activar Fc gamma R. Tal como se usa en el presente documento, “activación de células B” incluye proliferación, producción de IgE, producción de IgM, y producción de IgA. Sin desear estar restringido por la teoría, se cree que la activación suprimida de células B es el resultado de la capacidad de las regiones Fc variantes proporcionadas en anticuerpos que comprenden una región Fc variante de la presente divulgación para reticular Fc gamma RIIb con IgE para suprimir la producción de IgE de células B, con IgM para suprimir la producción de IgM de células B, y con IgA para suprimir la producción de IgA. De manera distinta a lo anterior, se presentan efectos supresores similares a los mencionados anteriormente reticulando directamente o indirectamente Fc gamma RIIb con moléculas que se expresan en células B y comprenden el dominio de ITAM en el interior de la célula o interaccionan con el dominio de ITAM tal como BCR, CD19, y CD79b. Tal como se usa en el presente documento, “activación de mastocitos” incluye proliferación, activación por IgE, y desgranulación. Sin desear estar restringido por la teoría, se cree que la activación suprimida de mastocitos es el resultado de la capacidad de las regiones Fc variantes proporcionadas en anticuerpos que comprenden una región Fc variante de la presente divulgación para reticular directamente o indirectamente Fc gamma RIIb con moléculas de receptor de IgE que se expresan en mastocitos y comprenden el dominio de ITAM o interaccionan con el dominio de ITAM tal como Fc épsilon RI, DAP12, y CD200R3. Tal como se usa en el presente documento, “activación de basófilos” incluye proliferación y desgranulación de basófilos. Sin desear estar restringido por la teoría, se cree que la activación suprimida de basófilos es el resultado de la capacidad de las regiones Fc variantes proporcionadas en anticuerpos que comprenden una región Fc variante de la presente divulgación para reticular directamente o indirectamente Fc gamma RIIb con moléculas en la membrana celular, que comprenden el dominio de ITAM en el interior de la célula o interaccionan con el dominio de ITAM. Tal como se usa en el presente documento, “activación de células dendríticas” incluye proliferación y desgranulación de células dendríticas. Sin desear estar restringido por la teoría, se cree que la activación suprimida de células dendríticas es el resultado de la capacidad de las regiones Fc variantes proporcionadas en anticuerpos que comprenden una región Fc variante de la presente divulgación para reticular directamente o indirectamente Fc gamma RIIb con moléculas en la membrana celular, que comprenden el dominio de ITAM en el interior de la célula o interaccionan con el dominio de ITAM.
[0922] En realizaciones adicionales, la divulgación proporciona un anticuerpo que comprende una región Fc variante proporcionada en el presente documento para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria inmunológica. En ciertas realizaciones, la divulgación proporciona un anticuerpo que comprende una región Fc variante para su uso en un método de tratar una enfermedad inflamatoria inmunológica en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo que comprende una región Fc variante para tratar una enfermedad inflamatoria inmunológica. En una realización, el “individuo” es un ser humano.
[0923] En un aspecto adicional, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo que comprende una región Fc variante proporcionada en el presente documento en la fabricación o preparación de un medicamento. El polipéptido es un anticuerpo. En algunos aspectos, el anticuerpo es una proteína de fusión de Fc. En una realización adicional, el medicamento es para tratar una enfermedad inflamatoria inmunológica. En una realización adicional, el medicamento es para su uso en un método de tratar una enfermedad inflamatoria inmunológica en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del medicamento para tratar enfermedades inflamatorias inmunológicas. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriores puede ser un ser humano.
[0924] En un aspecto adicional, la divulgación proporciona un método para tratar una enfermedad inflamatoria inmunológica en un individuo. En una realización, el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo que comprende una región Fc variante para tratar enfermedades inflamatorias inmunológicas. En una realización, un “individuo” es un ser humano.
[0925] En un aspecto adicional, la divulgación proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos que comprenden una región Fc variante proporcionados en el presente documento. En una realización adicional, la formulación farmacéutica es para tratar una enfermedad inflamatoria inmunológica.
[0926] Tal como se ha descrito anteriormente, puesto que anticuerpos que comprenden una región Fc variante de la presente divulgación pueden suprimir la activación de células B, mastocitos, células dendríticas y/o basófilos, la administración de los anticuerpos que comprenden una región Fc variante de la presente divulgación como resultado puede tratar o prevenir enfermedades inflamatorias inmunológicas.
[0927] En ciertas realizaciones, la enfermedad inflamatoria inmunológica tratada se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, hepatitis autoinmunitaria, tiroiditis autoinmunitaria, enfermedades ampollosas autoinmunitarias, enfermedad corticosuprarrenal autoinmunitaria, anemia hemolítica autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica autoinmunitaria, anemia megalocítica, gastritis atrófica autoinmunitaria, neutropenia autoinmunitaria, orquitis autoinmunitaria, encefalomielitis autoinmunitaria, enfermedad de receptor autoinmunitaria, infecundidad autoinmunitaria, hepatitis activa crónica, glomerulonefritis, fibrosis pulmonar intersticial, esclerosis múltiple, enfermedad de Paget, osteoporosis, mieloma múltiple, uveítis, espondilitis aguda y crónica, artritis gotosa, enfermedad inflamatoria del intestino, síndrome de dificultad respiratoria del adulto (SDRA), psoriasis, enfermedad de Crohn, enfermedad de Basedow, diabetes juvenil, enfermedad de Addison, miastenia grave, uveítis inducida por lentes, lupus eritematoso sistémico, rinitis alérgica, dermatitis alérgica, colitis ulcerosa, hipersensibilidad, degeneración muscular, caquexia, esclerodermia sistémica, esclerodermia localizada, síndrome de Sjogren, enfermedad de Behchet, síndrome de Reiter, tipo I y tipo II diabetes, trastorno por resorción ósea, reacción de injerto contra huésped, lesión por isquemia-reperfusión, aterosclerosis, traumatismo cerebral, paludismo cerebral, septicemia, choque séptico, síndrome de choque tóxico, fiebre, malgias debidas a manchas, anemia aplásica, anemia hemolítica, trombocitopenia idiopática, síndrome de Goodpasture, síndrome de Guillain-Barre, tiroiditis de Hashimoto, pénfigo, nefropatía por IgA, polinosis, síndrome de anticuerpos antifosfolípidos, polimiositis, granulomatosis de Wegener, arteritis nudosa, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, fibromialgia, asma, dermatitis atópica, gastritis atrófica crónica, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, pancreatitis autoinmunitaria, síndrome de aortitis, glomerulonefritis de progresión rápida, anemia megaloblástica, púrpura trombocitopénica idiopática, hipotiroidismo primario, enfermedad de Addison idiopática, diabetes mellitus insulinodependiente, lupus eritematoso discoide crónico, penfigoide, herpes gestacional, dermatosis ampollosa con depósitos lineales de IgA, epidermólisis ampollosa adquirida, alopecia areata, vitíligo vulgar, leucodermia adquirida centrífuga de Sutton, enfermedad de Harada, neuropatía óptica autoinmunitaria, azoospermia idiopática, aborto habitual, hipoglucemia, urticaria crónica, espondilitis anquilosante, artritis psoriásica, artritis enteropática, artritis reactiva, espondiloartropatía, entesopatía, síndrome del intestino irritable, síndrome de fatiga crónica, dermatomiositis, miositis por cuerpos de inclusión, síndrome de Schmidt, enfermedad de Graves, anemia perniciosa, hepatitis lupoide, demencia presenil, enfermedad de Alzheimer, trastorno desmielinizante, esclerosis lateral amiotrófica, hipoparatiroidismo, síndrome de Dressler, síndrome de Eaton-Lambert, dermatitis herpetiforme, alopecia, esclerosis sistémica progresiva, síndrome CREST (calcinosis, fenómeno de Raynaud, disfunción de la motilidad esofágica, esclerodactilia, y telangiectasia), sarcoidosis, fiebre reumática, eritema multiforme, síndrome de Cushing, reacción transfusional, enfermedad de Hansen, arteritis de Takayasu, polimialgia reumática, arteritis temporal, artritis de células gigantes, eccema, granulomatosis linfomatoide, enfermedad de Kawasaki, endocarditis, fibrosis endomiocárdica, endoftalmitis, eritroblastosis fetal, fascitis eosinofílica, síndrome de Felty, púrpura de Henoch-Schonlein, rechazo de trasplante, paperas, cardiomiopatía, artritis purulenta, fiebre mediterránea familiar, síndrome de Muckle-Wells, y síndrome de hiper-IgD.
[0929] En realizaciones adicionales, la divulgación proporciona un anticuerpo que comprende una región Fc variante para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad autoinmunitaria que puede estar provocada por o asociada con la producción de anticuerpos frente a autoantígenos (autoanticuerpos). En ciertas realizaciones, la divulgación proporciona un anticuerpo que comprende una región Fc variante para su uso en un método de tratar o prevenir una enfermedad autoinmunitaria que puede estar provocada por, o asociada con, la producción de anticuerpos frente a un autoantígeno (autoanticuerpo) en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo que comprende una región Fc variante para tratar o prevenir la enfermedad autoinmunitaria. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriores es preferiblemente un ser humano.
[0930] En un aspecto adicional, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo que comprende una región Fc variante en la fabricación o preparación de un medicamento. El polipéptido es un anticuerpo. En algunos aspectos, el anticuerpo es una proteína de fusión de Fc. En una realización adicional, el medicamento es para tratar o prevenir una enfermedad autoinmunitaria que puede estar provocada por o asociada con la producción de anticuerpos frente a autoantígenos (autoanticuerpos). En una realización adicional, el medicamento es para su uso en un método de tratar o prevenir una enfermedad autoinmunitaria que puede estar provocada por o asociada con la producción de anticuerpos frente a autoantígenos (autoanticuerpos) en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del medicamento para tratar o prevenir la enfermedad autoinmunitaria. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriores puede ser un ser humano.
[0932] En un aspecto adicional, la divulgación proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad autoinmunitaria que puede estar provocada por o asociada con la producción de anticuerpos frente a autoantígenos (autoanticuerpos) en un individuo. En una realización, el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo que comprende una región Fc variante para tratar o prevenir la enfermedad autoinmunitaria. En una realización, un “individuo” es un ser humano.
[0934] En un aspecto adicional, la divulgación proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos que comprenden una región Fc variante proporcionados en el presente documento. En una realización adicional, la formulación farmacéutica es para tratar o prevenir una enfermedad autoinmunitaria que puede estar provocada por o asociada con la producción de anticuerpos frente a un autoantígeno (autoanticuerpos).
[0936] Los anticuerpos que comprenden una región Fc variante de la presente divulgación pueden tratar o prevenir una enfermedad autoinmunitaria que puede estar provocada por o asociada con la producción de anticuerpos frente a un autoantígeno (autoanticuerpos) mediante la supresión de la producción de esos autoanticuerpos. Se ha notificado que el uso de una molécula de fusión de una porción de Fc de anticuerpo con AchR (un autoantígeno de miastenia grave) suprime la proliferación de células B que expresan BCR que reconoce AchR, e induce apoptosis (J. Neuroimmunol 227: 35-43 (2010)). El uso de una proteína de fusión formada entre una región Fc variante de la presente divulgación y un antígeno reconocido por un autoanticuerpo permite la reticulación de Fc gamma RIIb con BCR para ese autoantígeno en una célula B, lo que provoca la supresión de la proliferación de las células B y/o provoca la inducción de apoptosis de las células B.
[0937] En ciertas realizaciones, una enfermedad autoinmunitaria que puede tratarse o prevenirse se selecciona del grupo que consiste en síndrome de Guillain-Barre, miastenia grave, gastritis atrófica crónica, hepatitis autoinmunitaria, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, pancreatitis autoinmunitaria, síndrome de aortitis, síndrome de Goodpasture, glomerulonefritis de progresión rápida, anemia megaloblástica, anemia hemolítica autoinmunitaria, neutropenia autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica idiopática, enfermedad de Basedow, tiroiditis de Hashimoto, hipotiroidismo primario, enfermedad de Addison idiopática, diabetes mellitus insulinodependiente, lupus eritematoso discoide crónico, esclerodermia localizada, pénfigo, penfigoide, herpes gestacional, dermatosis ampollosa con depósitos lineales de IgA, epidermólisis ampollosa adquirida, alopecia areata, vitíligo vulgar, leucodermia adquirida centrífuga de Sutton, enfermedad de Harada, neuropatía óptica autoinmunitaria, azoospermia idiopática, aborto habitual, tipo II diabetes, hipoglucemia, y urticaria crónica.
[0938] En realizaciones adicionales, la divulgación proporciona un anticuerpo que comprende una región Fc variante para su uso en el tratamiento de una enfermedad asociada con una deficiencia de una proteína biológicamente esencial. En ciertas realizaciones, la divulgación proporciona un anticuerpo que comprende una región Fc variante para su uso en un método de tratar una enfermedad asociada con una deficiencia de una proteína biológicamente esencial en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo que comprende una región Fc variante para tratar la enfermedad. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriores es preferiblemente un ser humano.
[0939] En un aspecto adicional, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo que comprende una región Fc variante en la fabricación o preparación de un medicamento. El polipéptido es un anticuerpo. En algunos aspectos, el anticuerpo es una proteína de fusión de Fc. En una realización adicional, el medicamento es para tratar una enfermedad asociada con una deficiencia de una proteína biológicamente esencial. En una realización adicional, el medicamento es para su uso en un método de tratar una enfermedad asociada con una deficiencia de una proteína biológicamente esencial en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del medicamento para tratar la enfermedad. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriores puede ser un ser humano.
[0940] En un aspecto adicional, la divulgación proporciona un método de tratar una enfermedad asociada con una deficiencia de una proteína biológicamente esencial en un individuo. En una realización, el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo que comprende una región Fc variante para tratar la enfermedad. En una realización, un “individuo” es un ser humano.
[0941] En un aspecto adicional, la divulgación proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos que comprenden una región Fc variante proporcionados en el presente documento. En una realización adicional, la formulación farmacéutica es para tratar una enfermedad asociada con una deficiencia de una proteína biológicamente esencial.
[0942] Para enfermedades con deficiencia de una proteína biológicamente esencial, se usan métodos terapéuticos que administran y complementan la proteína como agente farmacéutico. Sin embargo, puesto que el paciente carece de la proteína desde el principio, la proteína complementada de manera externa se reconoce como sustancia extraña y se producen anticuerpos frente a esa proteína. Como resultado, la proteína se elimina fácilmente, y se reduce el efecto como producto farmacéutico. El uso de una proteína de fusión que comprende tal proteína y una región Fc variante de la presente invención permite la reticulación entre Fc gamma RIIb y BCR que reconoce la proteína en células B, lo que provoca la supresión de la producción de anticuerpos frente a la proteína.
[0943] En ciertas realizaciones, la proteína que va a complementarse se selecciona del grupo que consiste en factor VIII, factor IX, TPO, EPO, alfa-iduronidasa, iduronato sulfatasa, heparano N-sulfatasa tipo A, alfa-N-acetilglucosaminidasa tipo B, acetil CoA tipo C: alfa-glucosaminidasa acetiltransferasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa tipo D, galactosa 6-sulfatasa, N-acetilgalactosamina 4-sulfatasa, beta-glucuronidasa, alfa-galactosidasa, alfa-galactosidasa ácida, y glucocerebrosidasa. Estas proteínas pueden complementarse para enfermedades tales como hemofilia, púrpura trombocitopénica idiopática, anemia renal, y enfermedad lisosómica (mucopolisacaridosis, enfermedad de Fabry, enfermedad de Pompe, y enfermedad de Gaucher), sin limitarse a las mismas.
[0944] En realizaciones adicionales, la divulgación proporciona un anticuerpo que comprende una región Fc variante para su uso en el tratamiento de una infección viral. En ciertas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región Fc variante para su uso en un método de tratar una infección viral en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo que comprende una región Fc variante para tratar una infección viral. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriores es preferiblemente un ser humano.
[0945] En un aspecto adicional, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo que comprende una región Fc variante proporcionada en el presente documento en la fabricación o preparación de un medicamento. El polipéptido es un anticuerpo. En algunos aspectos, el anticuerpo es una proteína de fusión de Fc. En una realización adicional, el medicamento es para tratar una infección viral. En una realización adicional, el medicamento es para su uso en un método de tratar una infección viral en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del medicamento para tratar una infección viral. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriores puede ser un ser humano.
[0946] En un aspecto adicional, la divulgación proporciona un método para tratar una infección viral en un individuo. En una realización, el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo que comprende una región Fc variante para tratar una infección viral. En una realización, un “individuo” es un ser humano.
[0947] En un aspecto adicional, la divulgación proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos que comprenden una región Fc variante proporcionados en el presente documento. En una realización adicional, la formulación farmacéutica es para tratar una infección viral.
[0948] Los anticuerpos anti-virus que comprenden una región Fc variante de la presente divulgación pueden suprimir la mejora dependiente de anticuerpos observada con anticuerpos anti-virus convencionales. La mejora dependiente de anticuerpos es un fenómeno en el que se fagocita un virus unido a un anticuerpo a través de la activación de Fc gamma R de modo que se mejora la infección del virus en una célula. Se ha notificado que la unión de anticuerpos anti-virus del dengue a Fc gamma RIIb desempeña un papel importante en la supresión de la mejora dependiente de anticuerpos (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108:12479-12484, (2011)). La reticulación de moléculas de Fc gamma RIIb mediante un complejo inmunitario de los anticuerpos anti-virus del dengue y virus del dengue, inhibe la fagocitosis mediada por Fc gamma R, dando como resultado la supresión de la mejora dependiente de anticuerpos. Los ejemplos de tales virus incluyen virus del dengue (DENV1, DENV2, DENV3, y DENV4) y VIH, pero no se limitan a los mismos.
[0949] En realizaciones adicionales, la divulgación proporciona un anticuerpo que comprende una región Fc variante para su uso en la prevención o el tratamiento de arteriosclerosis. En ciertas realizaciones, la divulgación proporciona un anticuerpo que comprende una región Fc variante para su uso en un método de prevenir o tratar arteriosclerosis en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo que comprende una región Fc variante para prevenir o tratar arteriosclerosis. El polipéptido es un anticuerpo. En algunos aspectos, el anticuerpo es una proteína de fusión de Fc. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriores es preferiblemente un ser humano.
[0950] En un aspecto adicional, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo que comprende una región Fc variante en la fabricación o preparación de un medicamento. El polipéptido es un anticuerpo. En algunos aspectos, el anticuerpo es una proteína de fusión de Fc. En una realización adicional, el medicamento es para prevenir o tratar arteriosclerosis. En una realización adicional, el medicamento es para su uso en un método de prevenir o tratar arteriosclerosis en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del medicamento para prevenir o tratar arteriosclerosis. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriores puede ser un ser humano.
[0951] En un aspecto adicional, la divulgación proporciona un método para prevenir o tratar arteriosclerosis en un individuo. En una realización, el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo que comprende una región Fc variante para prevenir o tratar arteriosclerosis. En una realización, un “individuo” es un ser humano.
[0952] En un aspecto adicional, la divulgación proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos que comprenden una región Fc variante proporcionados en el presente documento. El polipéptido es un anticuerpo. En algunos aspectos, el anticuerpo es una proteína de fusión de Fc. En una realización adicional, la formulación farmacéutica es para prevenir o tratar arteriosclerosis.
[0953] Anticuerpos frente a LDL oxidado, es decir, una causa de arteriosclerosis, que comprenden una región Fc variante de la presente invención pueden prevenir la adhesión dependiente de Fc gamma RIIa de células inflamatorias. Se ha notificado que mientras que anticuerpos anti-LDL oxidado inhiben la interacción entre LDL oxidado y CD36, anticuerpos anti-LDL oxidado se unen a células endoteliales, y los monocitos reconocen su porción de Fc de manera dependiente de Fc gamma RIIa o dependiente de Fc gamma RI (Immunol. Lett. 108:52-61, (2007)). Usando anticuerpos que comprenden una región Fc variante de la presente invención puede inhibirse la unión dependiente de Fc gamma RIIa y suprimirse la adhesión de monocitos mediante señales inhibidoras mediadas por Fc gamma RIIb.
[0954] En realizaciones adicionales, la divulgación proporciona un anticuerpo que comprende una región Fc variante para su uso en la prevención o el tratamiento de cáncer. En ciertas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región Fc variante para su uso en un método de prevenir o tratar cáncer en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo que comprende una región Fc variante para prevenir o tratar cáncer. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriores es preferiblemente un ser humano.
[0955] En un aspecto adicional, la divulgación proporciona el uso de un anticuerpo que comprende una región Fc variante proporcionada en el presente documento en la fabricación o preparación de un medicamento. El polipéptido es un anticuerpo. En algunos aspectos, el anticuerpo es una proteína de fusión de Fc. En una realización adicional, el medicamento es para prevenir o tratar cáncer. En una realización adicional, el medicamento es para su uso en un método de prevenir o tratar cáncer en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del medicamento para prevenir o tratar cáncer. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriores puede ser un ser humano.
[0956] En un aspecto adicional, la divulgación proporciona un método para prevenir o tratar cáncer en un individuo. En una realización, el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo que comprende una región Fc variante para prevenir o tratar cáncer. El polipéptido es un anticuerpo. En algunos aspectos, el anticuerpo es una proteína de fusión de Fc. En una realización, un “individuo” es un ser humano.
[0957] En un aspecto adicional, la divulgación proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos que comprenden una región Fc variante proporcionados en el presente documento. El polipéptido es un anticuerpo. En algunos aspectos, el anticuerpo es una proteína de fusión de Fc. En una realización adicional, la formulación farmacéutica es para prevenir o tratar cáncer.
[0958] Tal como se ha descrito anteriormente, se sabe que mejorar la unión a Fc gamma RIIb aumenta la actividad agonista de un anticuerpo agonista, y mejora el efecto antitumoral del anticuerpo. Por tanto, anticuerpos agonistas que comprenden una región Fc variante de la presente divulgación son útiles para el tratamiento o la prevención de cáncer. Específicamente, una región Fc variante de la presente divulgación mejora la actividad agonista de anticuerpos frente a, por ejemplo, receptores de la familia de receptores de TNF tales como, CD120a, CD120b, receptor de linfotoxina beta, CD134, CD40, FAS, TNFRSF6B, CD27, CD30, CD137, TNFRSF10A, TNFRSF10B, TNFRSF10C, TNFRSF10D, RANK, osteoprotegerina, TNFRSF12A, TNFRSF13B, TNFRSF13C, TNFRSF14, Factor de crecimiento nervioso receptor, TNFRSF17, TNFRSF18, TNFRSF19, TNFRSF21, TNFRSF25, y receptor de ectodisplasina A2, y puede usarse para tratar o prevenir cáncer. Además, también se mejora la actividad agonista para anticuerpos frente a otras moléculas, que muestran actividad agonista a través de interacción con Fc gamma RIIb. Además, mediante la incorporación de una región Fc variante de la presente divulgación en un anticuerpo frente a una tirosina cinasa receptora (RTK) tal como Kit, que suprime la proliferación celular tras reticulación con Fc gamma RIIb, puede mejorarse el efecto inhibidor del anticuerpo frente a la proliferación celular.
[0959] En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para prevenir o tratar un cáncer, incluyendo pero sin limitarse a, un elemento seleccionado de: cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, adenocarcinoma pulmonar, y carcinoma de células escamosas de pulmón), cáncer de intestino grueso, cáncer rectal, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de tiroides, colangiocarcinoma, cáncer de peritoneo, mesotelioma, carcinoma de células escamosas, cáncer cervicouterino, cáncer de endometrio, cáncer de vejiga, cáncer de esófago, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de nasofaringe, tumor de glándula salival, timoma, cáncer de piel, tumor de células basales, melanoma maligno, cáncer de ano, cáncer de pene, cáncer de testículo, tumor de Wilms, leucemia mieloide aguda (incluyendo mieloleucemia aguda, leucemia mieloblástica aguda, leucemia promielocítica aguda, leucemia mielomonocítica aguda, y leucemia monocítica aguda), leucemia mielógena crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfática crónica, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (linfoma de Burkitt, leucemia linfocítica crónica, micosis fungoides, linfoma de células del manto, linfoma folicular, linfoma de células grandes difuso, linfoma de zona marginal, leucemia pilocítica plasmacitoma, linfoma de células T periféricas, y leucemia/linfoma de células T del adulto), histiocitosis de células de Langerhans, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, tumor cerebral (incluyendo glioma, astroglioma, glioblastoma, meningioma, y ependimoma), neuroblastoma, retinoblastoma, osteosarcoma, sarcoma de Kaposi, sarcoma de Ewing, angiosarcoma, y hemangiopericitoma.
[0960] Anticuerpos que se han modificado para tener actividad de unión mejorada a Fc gamma R incluyendo Fc gamma RIIb mediante modificación de al menos un residuo de aminoácido pueden promover la eliminación de antígeno desde el plasma, tal como se describe o sugiere, por ejemplo, en los documentos WO 2013/047752, WO 2013/125667, WO 2014/030728, o WO 2014/163101.
[0961] Sin querer estar restringido por una teoría particular, un anticuerpo que tiene una actividad de unión a Fc gamma R aumentada en una condición de pH neutro se capta rápidamente en células junto con su antígeno complejado con el anticuerpo, y como resultado, puede promoverse la eliminación de antígeno desde el plasma cuando el anticuerpo se administrain vivo.
[0962] Anticuerpos que se han modificado para tener un pI aumentado mediante la modificación de al menos un residuo de aminoácido que puede estar expuesto en la superficie del anticuerpo pueden incorporarse más rápidamente en células o pueden promover la eliminación de antígeno desde el plasma, tal como se describe o sugiere, por ejemplo, en los documentos WO 2007/114319, WO 2009/041643, WO 2014/145159, o WO 2012/016227.
[0963] Sin querer estar restringido por una teoría particular, se cree que el pH de líquidos biológicos (por ejemplo, plasma) está en un intervalo de pH neutro. En líquidos biológicos, aumenta la carga positiva neta de un anticuerpo con pI aumentado debido al pI aumentado, y como resultado el anticuerpo se ve atraído más fuertemente mediante interacción de Coulomb fisicoquímica a la superficie de células endoteliales que tienen una carga negativa neta en comparación con un anticuerpo que no tiene un pI aumentado. Eso significa, a través de tal unión inespecífica, se mejora la captación en células del anticuerpo complejado con su antígeno, lo que da como resultado la mejora de la eliminación de antígeno desde el plasma. Se espera que se produzcan estos fenómenos habitualmentein vivo, independientemente del tipo de célula, del tipo de tejido, tipo de órgano, etc.
[0964] En el presente documento, la mejora de la eliminación de antígeno desde el plasma significa, por ejemplo, que aumenta la tasa de eliminación de antígeno desde el plasma en comparación con la que hay cuando se ha administrado un polipéptido que comprende una región Fc correspondiente que no se ha modificado así. El aumento de la eliminación de antígeno desde el plasma puede evaluarse, por ejemplo, midiendo la concentración del antígeno en plasma. Diversos métodos para medir la concentración de antígeno en plasma se conocen en la técnica.
[0965] En realizaciones adicionales, la divulgación proporciona un anticuerpo que comprende una región Fc variante para su uso en promover la eliminación de un antígeno desde el plasma. En ciertas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo que comprende una región Fc variante para su uso en un método de promover la eliminación de un antígeno desde el plasma en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo que comprende una región Fc variante para promover la eliminación de un antígeno desde el plasma. En esas realizaciones, es preferible que el anticuerpo comprenda además un dominio de unión a antígeno. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriores es preferiblemente un ser humano.
[0966] En un aspecto adicional, la invención proporciona el uso de un polipéptido que comprende una región Fc variante en la fabricación o preparación de un medicamento. El polipéptido es un anticuerpo. En algunos aspectos, el anticuerpo es una proteína de fusión de Fc. En una realización adicional, el medicamento es para promover la eliminación de un antígeno desde el plasma. En una realización adicional, el medicamento es para su uso en un método de promover la eliminación de un antígeno desde el plasma en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del medicamento para promover la eliminación de un antígeno desde el plasma. En esas realizaciones, es preferible que el polipéptido comprenda además un dominio de unión a antígeno. Un “individuo” según cualquiera de las realizaciones anteriores puede ser un ser humano.
[0967] En una realización adicional, la divulgación proporciona un método para promover la eliminación de un antígeno desde el plasma en un individuo. En una realización, el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo que comprende una región Fc variante para promover la eliminación de un antígeno desde el plasma. En esas realizaciones, es preferible que el anticuerpo comprenda además un dominio de unión a antígeno. En una realización, un “individuo” es un ser humano.
[0968] En un aspecto adicional, la divulgación proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos que comprenden una región Fc variante proporcionados en el presente documento. En una realización adicional, la formulación farmacéutica es para promover la eliminación de un antígeno desde el plasma. En esa realización, es preferible que el anticuerpo comprenda además un dominio de unión a antígeno.
[0969] En una realización, en comparación con antes de la modificación de aminoácido, un anticuerpo que tiene una región Fc variante de la presente divulgación mejora la eliminación de antígeno desde el plasma, por ejemplo, en al menos 1,1 veces, 1,25 veces, 1,5 veces, 1,75 veces, 2,0 veces, 2,25 veces, 2,5 veces, 2,75 veces, 3,0 veces, 3,25 veces, 3,5 veces, 3,75 veces, 4,0 veces, 4,25 veces, 4,5 veces, 4,75 veces, 5,0 veces, 5,5 veces, 6,0 veces, 6,5 veces, 7,0 veces, 7,5 veces, 8,0 veces, 8,5 veces, 9,0 veces, 9,5 veces, o 10,0 veces o más, cuando el anticuerpo se administrain vivo.
[0970] En un aspecto adicional, la invención proporciona métodos para preparar un medicamento o una formulación farmacéutica, que comprende mezclar cualquiera de los anticuerpos que comprenden una región Fc variante proporcionados en el presente documento con un grupo transportador farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los métodos terapéuticos anteriores. En una realización, los métodos para preparar un medicamento o una formulación farmacéutica comprenden además añadir al menos un agente terapéutico adicional al medicamento o la formulación farmacéutica.
[0971] Pueden usarse anticuerpos de la invención o bien solos o bien en combinación con otros agentes en una terapia. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede coadministrarse con al menos un agente terapéutico adicional. Asimismo, anticuerpos que comprenden una región Fc variante de la divulgación puede usarse o bien solos o bien en combinación con otros agentes en una terapia. Por ejemplo, un anticuerpo que comprende una región Fc variante de la divulgación pueden coadministrarse con al menos un agente terapéutico adicional.
[0972] Tales terapias de combinación indicadas anteriormente engloban administración combinada (donde se incluyen dos o más agentes terapéuticos en la misma formulación o formulaciones independientes), y administración independiente, en cuyo caso, la administración del anticuerpo o polipéptido que comprende una región Fc variante de la invención puede producirse antes de, simultáneamente, y/o tras, la administración del agente o agentes terapéuticos adicionales. En una realización, la administración del anticuerpo anti-miostatina y la administración de un agente terapéutico adicional se producen en un plazo de aproximadamente un mes, o en un plazo de aproximadamente una, dos o tres semanas, o en un plazo de aproximadamente uno, dos, tres, cuatro, cinco, o seis días, entre sí.
[0973] En otra realización, la administración del anticuerpo que comprende la región Fc variante y la administración de un agente terapéutico adicional se producen en un plazo de aproximadamente un mes, o en un plazo de aproximadamente una, dos o tres semanas, o en un plazo de aproximadamente uno, dos, tres, cuatro, cinco, o seis días, entre sí.
[0974] Un anticuerpo que comprende una región Fc variante de la divulgación (y opcionalmente cualquier agente terapéutico adicional) puede administrarse mediante cualquier medio adecuado, incluyendo administración parenteral, intrapulmonar, e intranasal, y, si se desea para tratamiento local, intralesional. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, o subcutánea. La dosificación puede ser por cualquier vía adecuada, por ejemplo, mediante inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o prolongada. Diversas pautas posológicas, incluyendo pero sin limitarse a administraciones únicas o múltiples a lo largo de diversos puntos de tiempo, administración en bolo, e infusión pulsada se contemplan en el presente documento.
[0975] Anticuerpos que comprenden una región Fc variante de la divulgación pueden formularse, dosificarse, y administrarse de modo compatible con la buena práctica médica. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno particular que esté tratándose, el mamífero particular que esté tratándose, la afección clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, la pauta de administración, y otros factores conocidos por profesionales sanitarios. El anticuerpo no es necesario que esté, pero se formula opcionalmente con uno o más agentes usados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de tales otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento, y otros factores analizados anteriormente. Estos se usan generalmente en las mismas dosificaciones y con vías de administración tal como se describen en el presente documento, o aproximadamente a desde el 1 hasta el 99 % de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosificación y por cualquier vía que se determine empírica/clínicamente que es apropiado.
[0976] Para la prevención o el tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada de un anticuerpo de la invención (cuando se usa solo o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que va a tratarse, el tipo de anticuerpo, el tipo de anticuerpo que comprende una región Fc variante, la gravedad y evolución de la enfermedad, si el anticuerpo que comprende la región Fc variante, se administra para fines preventivos o terapéuticos, terapia previa, antecedentes clínicos del paciente y respuesta al anticuerpo que comprende la región Fc variante, y el criterio del médico responsable. El anticuerpo que comprende una región Fc variante de la divulgación se administra de manera adecuada al paciente de una vez o a lo largo de una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad, de aproximadamente 1 microg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1mg/kg-10mg/kg) de anticuerpo puede ser una dosificación candidata inicial para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones independientes, o mediante infusión continua. Una dosificación diaria típica podría oscilar desde aproximadamente 1 microg/kg hasta 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas a lo largo de varios días o más tiempo, dependiendo de la afección, el tratamiento se mantendría generalmente hasta que se produjese una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Una dosificación a modo de ejemplo del anticuerpo que comprende la región Fc variante estaría en el intervalo de desde aproximadamente 0,05 mg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg. Por tanto, pueden administrarse una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas) al paciente. Tales dosis pueden administrarse de manera intermitente, por ejemplo, cada semana o v tres semanas (por ejemplo, de tal manera que el paciente reciba desde aproximadamente dos hasta aproximadamente veinte, o por ejemplo, aproximadamente seis dosis del anticuerpo que comprende la región Fc variante). Pueden administrarse una mayor dosis de carga inicial, seguida por una o más dosis menores. Se monitoriza fácilmente la evolución de esta terapia mediante técnicas y ensayos convencionales.
[0977] Se entiende que cualquiera de las formulaciones o métodos terapéuticos anteriores pueden llevarse a cabo usando un inmunoconjugado de la divulgación en lugar de o además de un anticuerpo anti-miostatina.
[0978] Se entiende asimismo que cualquiera de las formulaciones o métodos terapéuticos anteriores pueden llevarse a cabo usando un inmunoconjugado de la divulgación en lugar de o además de un anticuerpo que comprende una región Fc variante proporcionada en el presente documento.
[0979] H. Artículos de fabricación
[0980] En otro aspecto de la divulgación, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, la prevención y/o el diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un envase y una etiqueta o un prospecto en o asociado con el envase. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas, bolsas de disolución i.v., etc. Los envases pueden formarse a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El envase contiene una composición que va por sí misma o se combina con otra composición eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa de disolución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo de la invención. La etiqueta o el prospecto indica que la composición se usa para tratar la afección de elección. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer envase con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un anticuerpo de la invención; y (b) un segundo envase con una composición contenida en el mismo, en el que la composición comprende un agente citotóxico adicional o terapéutico por lo demás. El artículo de fabricación en esta realización de la divulgación puede comprender además un prospecto que indica que las composiciones pueden usarse para tratar una afección particular. Como alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) envase que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y disolución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y para el usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, y jeringas.
[0981] Se entiende que cualquiera de los artículos de fabricación anteriores puede incluir un inmunoconjugado de la divulgación en lugar de o además de un anticuerpo anti-miostatina.
[0982] Ejemplos
[0983] Los siguientes son ejemplos de métodos y composiciones de la invención. Se entiende que pueden ponerse en práctica otras realizaciones diversas, dada la descripción general proporcionada anteriormente.
[0984] [EJEMPLO 1]
[0985] Expresión y purificación de forma latente y madura de miostatina de ser humano, macaco cangrejero, y ratón Se expresó de manera transitoria miostatina latente humana (también descrita en el presente documento como forma latente de miostatina humana) (SEQ ID NO: 1) usando células FreeStyle293-F (células FS293-F) (Thermo Fisher, Carlsbad, CA, EE.UU.). Se acidificaron medios condicionados que contenían forma latente de miostatina humana expresada hasta pH 6,8 y se diluyeron con 1/2 vol. de agua milliQ, seguido por la aplicación a una columna de intercambio aniónico Q-sepharose FF (GE healthcare, Uppsala, Sweden). Se ajustó la fracción no retenida a pH 5,0 y se aplicó a una columna de intercambio catiónico SP-sepharose HP (GE healthcare, Uppsala, Sweden), y luego se eluyó con un gradiente de NaCl. Se recogieron las fracciones que contenían la forma latente de miostatina humana y posteriormente se sometieron a una columna de filtración en gel Superdex 200 (GE healthcare, Uppsala, Sweden) equilibrada con 1x PBS. Entonces se combinaron las fracciones que contenían la forma latente de miostatina humana y se almacenaron a -80 grados C.
[0986] Se purificó miostatina madura humana (también descrita en el presente documento como forma madura de miostatina humana) (SEQ ID NO: 2) a partir de la forma latente de miostatina humana purificada. Se acidificó la forma latente de miostatina humana mediante la adición de ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1 % y se aplicó a una columna de fase inversa Vydac 214TP C4 (Grace, Deerfield, IL, EE.UU.) y se eluyó con un gradiente de TFA/CH<3>CN. Se combinaron las fracciones que contenían miostatina madura humana, se secaron y se almacenaron a -80 grados C. Para reconstituirla, se disolvió miostatina madura humana en HCl 4 mM.
[0987] Se realizaron la totalidad de la expresión y purificación de las formas latente y madura de miostatina de macaco cangrejero (cynomolgusocyno) (SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente) y ratón (SEQ ID NO: 5 y 6, respectivamente) exactamente de la misma manera que para el homólogo humano. La homología de secuencia de la forma madura entre ser humano,cyno, y ratón son idénticas al 100 %, por tanto, se usó cualquiera de las miostatinas maduras independientemente de la especie como miostatina madura en todos los experimentos necesarios.
[0988] [EJEMPLO 2]
[0989] Identificación de anticuerpo anti-miostatina latente
[0990] Se prepararon, se seleccionaron, y se sometieron a ensayo anticuerpos anti-miostatina latente tal como sigue. Se inmunizaron conejos NZW de doce a dieciséis semanas de edad por vía intradérmica con miostatina latente de miostatina latente de ratón y/o humana (50-100 microg/dosis/conejo). Se repitió esta dosis 3-4 veces a lo largo de un periodo de un mes. Una semana después de la inmunización final, se extrajeron el bazo y sangre del conejo inmunizado. Se tiñeron células B específicas de antígeno con antígeno marcado, se separaron con el separador de células FCM (FACS aria III, BD), y se pusieron en placas de 96 pocillos a una densidad de una célula/pocillo junto con 25.000 células/pocillo de células EL4 (Colección Europea de Cultivos Celulares) y con medio condicionado de células T de conejo diluido 20 veces, y se cultivaron durante 7-12 días. Se trataron las células EL4 con mitomicina C (Sigma) durante 2 horas y se lavaron 3 veces de antemano. Se preparó el medio condicionado de células T de conejo cultivando timocitos de conejo en RPMI-1640 que contiene fitohemaglutinina-M (Roche), 12-miristato-13-acetato de forbol (Sigma) y FBS al 2 %. Después del cultivo, se recogieron sobrenadantes de cultivo de células B para análisis adicional y se crioconservaron los sedimentos.
[0991] Se usó un ELISA ensayo ELISA para someter a prueba la especificidad de anticuerpos en un sobrenadante de cultivo de células B. Se recubrió con estreptavidina (GeneScript) sobre una placa de 384 pocillos MAXISorp (Nunc) a 50 nM en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Entonces se bloquearon las placas con Blocking One (Nacalai Tesque) diluido 5 veces. Se marcó miostatina latente humana o de ratón con NHS-PEG4-biotina (PIERCE) y se añadió a las placas de ELISA bloqueadas, se incubaron durante 1 hora, y se lavaron con solución salina tamponada con Tris con Tween-20 al 0,05 % (TBS-T). Se añadieron los sobrenadantes de cultivo de células B a las placas de ELISA, se incubaron durante 1 hora, y se lavaron con TBS-T. Se detectó la unión mediante IgG de cabra anti-conejo-peroxidasa del rábano picante (BETHYL) seguido por la adición de ABTS (KPL).
[0992] Se cribaron un total de 17.818 líneas de células B para determinar la especificidad de unión a miostatina latente de ratón y/o humana y se seleccionaron 299 líneas y se designaron como MST0255-287, 630-632, 677-759, 910, 932-1048, 1050-1055, 1057-1066, 1068, 1070-1073, 1075-1110, 1113-1119. Se purificó ARN de sedimentos celulares correspondientes usando kits ZR-96 Quick-RNA (ZYMO RESEARCH).
[0993] Se amplificó ADN que codificaba para las regiones variables de la cadena pesada y ligera de cada línea celular seleccionada mediante PCR con transcripción inversa y se clonaron en vectores de expresión con la secuencia de región constante de cadena pesada Glm (SEQ ID NO: 50 (se muestra la secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO: 7)) y con la secuencia de región constante de cadena ligera k0MTC o k0MC (SEQ ID NO: 53 o 194 (se muestra la secuencia de aminoácidos (ambas son la misma) en SEQ ID NO: 8)), respectivamente. Se expresaron anticuerpos recombinantes de manera transitoria usando las células FreeStyle FS293-F y 293fectin (Life technologies), según las instrucciones del fabricante. Se usaron sobrenadante de cultivo o anticuerpos recombinantes para el cribado. Se purificaron anticuerpos recombinantes con proteína A (GE Healthcare) y se eluyeron en tampón D-PBS o His (histidina 20 mM, NaCl 150 mM, pH 6,0). Se llevó a cabo además cromatografía de exclusión molecular para retirar un componente de alto peso molecular y/o de bajo peso molecular, si era necesario.
[0994] [EJEMPLO 3]
[0995] Caracterización de anticuerpo anti-miostatina latente (ensayo con HEK Blue (activación de BMP1))
[0996] Se usó un ensayo de gen indicador para evaluar la actividad biológica de miostatina activain vitro. Las células HEK-Blue<™>TGF-beta (Invivogen) que expresan genes indicadores de SEAP inducibles por elementos de unión a Smad3/4 (SBE), permiten la detección de miostatina bioactiva monitorizando la activación de los receptores de activina tipo 1 y tipo 2. La miostatina activa estimula la producción de SEAP que se secreta en el sobrenadante celular. Luego se evalúa la cantidad de SEAP secretada usando QUANTIBlue<™>(Invivogen).
[0997] Se mantuvieron las células HEK-Blue<™>TGF-beta en medio DMEM (Gibco) complementado con suero bovino fetal al 10 %, 50 microg/ml de estreptomicina, 50 U/ml de penicilina, 100 microg/ml de Normocin<™>, 30 microg/ml de blasticidina, 200 microg/ml de HygroGold<™>y 100 microg/ml de Zeocin<™>. Durante el ensayo funcional, se cambiaron las células a medio de ensayo (DMEM con albúmina sérica bovina al 0,1 %, estreptomicina, penicilina y Normocin<™>) y se sembraron en una placa de 96 pocillos. Se incubó miostatina latente de ser humano, macaco cangrejero o ratón con BMP1 humana recombinante (R&D Systems) y anticuerpo anti-forma latente a 37 grados C durante la noche. Se transfirieron las mezclas de muestras a células. Después de incubación durante 24 horas, se mezclaron los sobrenadantes celulares con QUANTIBIlue<™>y se midió la densidad óptica a 620 nm en un lector de placas colorimétrico. Tal como se muestra como figura 1, el AcM MST1032-G1m (véase la tabla 2a para las secuencias de aminoácidos y nucleótidos) impidió la activación mediada por proteasa activación de miostatina latente de ser humano, macaco cangrejero y ratón, tal como se refleja mediante concentraciones disminuidas de SEAP secretada. MST1032-G1m mostró una actividad de inhibición casi comparable frente a miostatina latente de ser humano, macaco cangrejero, y ratón.
[0998] (Tabla 2a)
[0999] Anticuerpos anti-miostatina latente y sus secuencias de ADN y de aminoácidos (mostradas como SEQ ID NO)
[1000]
[1001] (Tabla 2b)
[1002] Secuencias de aminoácidos de HVR de anticuer os anti-miostatina latente (mostradas como SEQ ID NO)
[1003] [EJEMPLO 4]
[1004] Caracterización de anticuerpo anti-miostatina latente (ensayo con HEK Blue (activación espontánea))
[1005] Se incubó miostatina latente de ser humano, macaco cangrejero o ratón con el anticuerpo anti-miostatina latente a 37 grados C durante la noche y se transfirieron las mezclas de muestras a células HEK-Blue<™>TGF-beta. Después de incubación durante 24 horas, se mezcló el sobrenadante celular con QUANTIBIlue<™>y se midió la densidad óptica a 620 nm en un lector de placas colorimétrico. Tal como se muestra como figura 2, se detectó la liberación de miostatina activa a partir de su forma latente después de incubación a 37 grados C. En presencia del AcM MST1032-G1m, se inhibió la activación de miostatina y, por tanto, se detectó un menor nivel de SEAP en el sobrenadante celular. MST1032-G1m inhibió la activación espontánea de miostatina latente, y mostró una actividad de inhibición casi comparable frente a miostatina latente de ser humano, macaco cangrejero, y ratón.
[1006] [EJEMPLO 5]
[1007] Caracterización de anticuerpo anti-miostatina latente (ELISA)
[1008] Se recubrieron placas de ELISA sin recubrir (superficie MAXISORP de placa NUNC-IMMUNO, Nalge Nunc International) con 20 microl de estreptavidina 50 nM (GenScript) durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego se lavaron las placas con PBST tres veces y se bloquearon con 50 microl de Blocking One al 20 % (Nacalai Tesque) durante la noche. Al día siguiente, se incubó cada pocillo de cada placa con miostatina madura biotinilada, miostatina latente biotinilada humana o de ratón, o proteína quimérica de propéptido de miostatina de ratón recombinante biotinilada-Fc (R&D Systems) a 4 nM/pocillo/20 microl durante 2 horas. Después del lavado, se añadieron 20 microl de muestra de anticuerpo a los pocillos y se dejaron las placas durante 1 hora. Se lavaron las placas y se añadieron 20 microl de anticuerpo anti-IgG humana-peroxidasa de rábano picante (HRP) (Abcam) diluido en solución salina tamponada con HEPES, y se dejaron las placas durante otra hora. Entonces se lavaron las placas de nuevo, y luego se añadieron 50 microl de ABTS (KPL) a cada pocillo, y se incubaron las placas durante 1 hora. Se detectó la señal a 405 nm en un lector de placas colorimétrico. Los resultados del experimento de unión se muestran en la figura 3. MST1032-G1m se unió a miostatina latente (es decir, el complejo no covalente de miostatina madura y propéptidos) y propéptido, pero no se unió a miostatina madura. Estos resultados muestran que MST1032-G1m se une específicamente al propéptido de miostatina (por ejemplo, la parte de propéptido), pero no a miostatina activa (por ejemplo, región madura).
[1009] [EJEMPLO 6]
[1010] Caracterización de anticuerpo anti-miostatina latente (inmunotransferencia de tipo Western)
[1011] Se incubó miostatina latente de ratón con BMP1 humana recombinante (R&D Systems), con o sin MST1032-G1m a 37 grados C durante la noche. Entonces se mezclaron las muestras con tampón de muestra para SDS-PAGE reductora 4x (Wako) y se calentaron a 95 grados C durante 5 minutos y después se cargaron para electroforesis en gel con SDS. Se transfirieron las proteínas a membrana mediante el sistema de transferencia Trans-Blot (marca registrada) Turbo<™>(Bio-rad). El propéptido de miostatina se detectó usando un anticuerpo de oveja de antipropéptido de GDF8 de ratón (R&D Systems), que luego se detectó mediante anticuerpo anti-IgG de oveja-HRP (Santa Cruz). Se incubó la membrana con sustrato de ECL y se obtuvieron imágenes usando un sistema ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare). Tal como se muestra en la figura 4, la escisión del propéptido por BMP1 se vio inhibida por MST1032-G1m.
[1012] [EJEMPLO 7]
[1013] Caracterización de anticuerpo anti-miostatina latente (BIACORE (marca registrada))
[1014] Los parámetros cinéticos de anticuerpos anti-miostatina latente contra miostatina latente humana, de macaco cangrejero (cyno) y de ratón se evaluaron a 37 grados C a pH 7,4 usando un instrumento BIACORE (marca registrada) T200 (GE Healthcare). Se inmovilizó ProA/G (Pierce) sobre todas las celdas de flujo de un chip CM4 usando el kit de acoplamiento de amina (GE Healthcare). Se prepararon anticuerpos anti-miostatina latente y analitos en ACES pH 7,4 (ACES 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl<2>1,2 mM, Tween 20 al 0,05 %, NaN<3>al 0,005 %). Se capturó el anticuerpo sobre la superficie del sensor por ProA/G. Los niveles de captura del anticuerpo fueron normalmente de 150 a 220 unidades de resonancia (RU). Después se inyectó miostatina latente humana, decynoo de ratón a de 3,125 a 50 nM preparada mediante dilución en serie doble, seguido de disociación. La superficie del sensor se regeneró con NaOH 25 mM. Se determinaron los parámetros cinéticos procesando y ajustando los datos a un modelo de unión 1:1 usando el software de evaluación de BIACORE (marca registrada) T200, versión 2.0 (GE Healthcare). Se muestran los sensogramas en la figura 5. La velocidad de asociación (ka), la velocidad de disociación (kd) y la afinidad de unión (KD) se enumeran en la tabla 3. Los parámetros cinéticos de MST1032-G1m frente a miostatina latente humana, decynoy de ratón fueron comparables.
[1015] (Tabla 3)
[1016] ka, kd y KD del anticuerpo anti-miostatina latente MST1032-G1m
[1017] ka(M<-1>s<-1>)kd(s<-1>)KD(M) Miostatina latente humana 1,13E+06 8,65E-05 7,66E-11 Miostatina latente de ratón 1,41E+06 8,16E-05 5,79E-11 Miostatina latente decyno1,09E+06 7,79E-05 7,17E-11 [EJEMPLO 8]
[1018] Eficaciain vivodel anticuerpo anti-miostatina latente sobre la masa muscular y la masa adiposa
[1019] Se evaluó en ratones la eficaciain vivodel AcM MST1032-G1m. Se usó el anticuerpo anti-miostatina madura 41C1E4 (tal como se describe en la patente estadounidense n.º 7.632.499) como control positivo en este estudio. Para evitar la inmunomodulación potencial debida a una respuesta de anticuerpo antihumano de ratón, se realizaron estudiosin vivoen ratones inmunodeficientes con inmunodeficiencia combinada grave (SCID). Se trataron ratones SCID (C.B-17 SCID) de cinco semanas de edad (Charles River Laboratories Japan, Inc. (Kanagawa, JAPÓN)) con anticuerpos monoclonales a diversas dosis o vehículo (PBS) administrado por vía intravenosa una vez a la semana durante dos semanas. Los días 0, 7 y 14, se evaluaron la masa magra y la masa adiposa corporal total de los ratones mediante resonancia magnética nuclear (RMN) (el analizador minispec LF-50, Bruker Bio Spin, (Kanagawa, JAPÓN)). Se sacrificaron los animales el día 14, y se diseccionaron y pesaron los músculos gemelos y cuádriceps. Se determinó la significación estadística mediante ANOVA, una prueba de la t de Student y una prueba de Dunnett con el software JMP 9 (SAS, Inc.). Un valor de p menor de 0,05 se consideró significativo.
[1020] Los resultados de este experimento se muestran en las figuras 6A-C. Ambos anticuerpos (MST1032-G1m y 41C1E4) aumentaron la masa corporal magra de manera dependiente de la dosis, y MST1032-G1m, cuando se administró a 40 mg/kg, disminuyó significativamente la masa adiposa en comparación con el grupo de vehículo (PBS) el día 14.
[1021] Después de dos semanas de tratamiento, los anticuerpos administrados a 10 mg/kg y 40 mg/kg dieron como resultado un incremento significativo del peso en húmedo de cuádriceps y gemelos en relación con el grupo de vehículo.
[1022] [EJEMPLO 9]
[1023] Comparación de la eficaciain vivode diversos anticuerpos relacionados con miostatina
[1024] Todos los ajustes experimentales para la comparación fueron los mismos que en el ejemplo 8. Se sometieron a prueba diversos anticuerpos relacionados con miostatina, 41C1E4, REGN, OGD, y MYO-029 en ratones SCID de cinco semanas de edad durante dos semanas. REGN, OGD, y MYO-029 son anticuerpos anti-miostatina madura descritos en el documento WO 2011/150008 como H4H1657N2, el documento WO 2013/186719 como OGD1.0.0, y el documento WO 2004/037861 como MYO-029, respectivamente. Estos anticuerpos se administraron por vía intravenosa una vez a la semana. Se examinaron la masa corporal magra y la masa adiposa mediante exploración por RMN de cuerpo completo los días 0 y 14. Se midió la fuerza de prensión con un medidor de prueba de fuerza de prensión (por ejemplo, GPM-100B, MELQUEST Ltd., (Toyama, JAPÓN)) el día 14. Tal como se muestra en los resultados presentados en las figuras 7A-C, se aumentó la masa corporal magra por estos anticuerpos excepto por MYO-029 (P > 0,05). La fuerza de prensión del grupo al que se le administró MST1032-G1m aumentó significativamente con respecto al grupo de vehículo (PBS), a 10 mg/kg (P<0,05). 41C1E4 y REGN también aumentaron significativamente la fuerza de prensión en comparación con el vehículo (PBS). La masa adiposa corporal total tendía a reducirse por 10 mg/kg de MST1032-G1m. La eficacia de reducción de masa adiposa de MST1032-G1m fue más fuerte que la de otros anticuerpos anti-miostatina madura.
[1025] [EJEMPLO 10]
[1026] Humanización de anticuerpo anti-miostatina latente
[1027] Los residuos de aminoácidos de una región variable de anticuerpo se numeran según Kabat (Kabatet al., Sequence of proteins of immunological interest, 5ª ed., Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD (1991)).
[1028] Se diseñaron regiones variables de las cadenas pesada y ligera para los anticuerpos MST1032 humanizados. Algunos de los anticuerpos MST1032 humanizados contienen retromutación en la región de marco. Los polinucleótidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera diseñados se sintetizaron por GenScript Inc., y se clonaron en vectores de expresión que contenían la secuencia de región constante de cadena pesada SG1 (SEQ ID NO: 52 (la secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 9)) y la secuencia de región constante de cadena ligera SK1 (SEQ ID NO: 54 (la secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 10)), respectivamente. Los anticuerpos humanizados se expresaron de manera transitoria en células FS293-F, y se llevaron a cabo el ensayo con HEK Blue y el análisis mediante BIACORE (marca registrada) tal como se ha descrito anteriormente. Tal como se muestra en la figura 8 y la tabla 4, y en comparación con las figuras 1 y 2, el anticuerpo humanizado (MS1032LO00-SG1) mostró una actividad de inhibición y afinidad comparables al anticuerpo quimérico (MST1032-G1m).
[1030] (Tabla 4)
[1031] Parámetros cinéticos del anticuerpo humanizado anti-miostatina latente
[1032] ka(M<-1>s<-1>)kd(s<-1>)KD(M) MST1032-G1m 1,13E+06 8,65E-05 7,66E-11
[1033] MS1032LO00-SG1 1,27E+06 9,52E-05 7,50E-11
[1035] [EJEMPLO 11]
[1037] Generación de anticuerpo anti-miostatina latente dependiente del pH
[1039] Para generar anticuerpos anti-miostatina latente dependientes del pH, se realizó mutagénesis de barrido con histidina para todas las CDR del AcM MS1032LO00-SG1. Cada aminoácido en las CDR se mutó individualmente a histidina usando el kit de clonación In-Fusion HD (Clontech Inc. o Takara Bio company) según las instrucciones del fabricante. Después de confirmar a través de secuenciación que cada variante estaba mutada correctamente, se expresaron las variantes de manera transitoria y se purificaron mediante el método descrito anteriormente. Todas las variantes con sustitución de histidina se evaluaron mediante un ensayo de BIACORE modificado (marca registrada) en comparación con el descrito anteriormente. En resumen, se integró una fase de disociación adicional a pH 5,8 en el ensayo de BIACORE (marca registrada) inmediatamente después de la fase de disociación a pH 7,4. Esto es para evaluar la disociación dependiente del pH entre el anticuerpo (Ab) y el antígeno (Ag) de los complejos formados a pH 7,4 en oposición a la disociación correspondiente a pH 5,8. La velocidad de disociación a pH 5,8 del tampón se determinó procesando y ajustando los datos usando el software de ajuste de curvas Scrubber 2.0 (BioLogic Software).
[1041] Tal como se muestra en la figura 9, el anticuerpo parental (Ab001) no mostró reducción de la respuesta de unión a pH 5,8 en comparación con la fase de disociación a pH 7,4. Varias de las sustituciones de una sola histidina dieron como resultado una reducción de moderada a fuerte en la respuesta de unión a pH 5,8 en comparación con la fase de disociación a pH 7,4. La velocidad de disociación a pH 5,8 para cada una de las variantes de sustitución de una sola histidina se muestra en la tabla 5. Tal como se muestra en la tabla 5, Ab002 mostró la velocidad de disociación del complejo Ac/Ag más rápida a pH 5,8, más de 200 veces más rápida que el anticuerpo parental (Ab001). Se generaron entonces anticuerpos con una combinación de estas mutaciones en las CDR. Las secuencias de CDR de los anticuerpos que contienen estas diversas mutaciones se muestran en la tabla 6.
[1043] (Tabla 5)
[1044] Velocidad de disociación a pH 5,8 para anticuerpos anti-miostatina latente con sustitución de una sola histidina Nombre de la región variable
[1045] Cadena pesada Cadena ligera Abreviatura kd (1/s) M103205H000 M103202L000 Ab001 2,92E-05 M103205H001 M103202L000 Ab002 6,09E-03 M103205H009 M103202L000 Ab003 8,80E-04 M103205H026 M103202L000 Ab004 1,86E-04 M103205H028 M103202L000 Ab005 7,63E-05 M103205H000 M103202L008 Ab006 8,58E-05 M103205H028 M103202L008 Ab007 4,15E-04 (Tabla 6)
[1046] Secuencias de CDR y sus SEQ ID NO de anticuerpo anti-miostatina latente con sustitución de histidina
[1047]
[1048] [EJEMPLO 12]
[1049] Mejora de la afinidad del anticuerpo anti-miostatina latente dependiente del pH
[1050] Para identificar mutaciones que mejoran la afinidad a pH 7,4 y/o la actividad de inhibiciónin vitro, se generaron más de 500 variantes para la cadena pesada y ligera respectivamente, usando al menos una variante generada en el ejemplo 11 como molde. Estas variantes tenían cada aminoácido en las CDR sustituido por otros 18 aminoácidos, excluyendo el aminoácido original y la cisteína. Se evaluó la capacidad de unión de variantes contra miostatina latente humana a 37 grados C a pH 7,4 usando un instrumento BIACORE (marca registrada) 4000 (GE Healthcare). El sobrenadante de cultivo que contenía variantes expresadas en células FS293-F se preparó con tampón de ACES pH 7,4 que contenía 10 mg/ml de BSA y 0,1 mg/ml de carboximetil-dextrano (CMD). Cada anticuerpo se capturó sobre las células de flujo hasta que el nivel de captura alcanzó alrededor de 200 RU. Luego, se inyectó miostatina latente humana 25 nM sobre las células de flujo. Se integró una fase de disociación adicional a pH 5,8 en el ensayo de BIACORE (marca registrada) inmediatamente después de la fase de disociación a pH 7,4. Esta fase de disociación adicional evalúa la disociación dependiente del pH entre el anticuerpo (Ac) y el antígeno (Ag) de los complejos formados a pH 7,4. La superficie de la celda de flujo se regeneró con NaOH 25 mM. Se determinaron los parámetros cinéticos usando el software de evaluación de BIACORE (marca registrada) 4000, versión 2.0 (GE Healthcare). Se realizó un análisis de disociación adicional a pH 5,8 usando Scrubber2 (BioLogic Software).
[1051] Se seleccionaron variantes con afinidad mejorada a pH 7,4 y/o actividad de inhibiciónin vitro, y se combinaron con mutaciones que mejoran la dependencia del pH identificadas en el ejemplo 11. Después de la combinación de estas mutaciones, se seleccionaron cuatro variantes (MS1032LO0102, 03, y 04) y se expresaron de manera transitoria con SG1 o F760 (SEQ ID NO: 11 y 51) para el análisis cinético de unión de BIACORE (marca registrada), ensayosin vitroy/oin vivo. Tanto SG1 como F760 son regiones constantes de cadena pesada humana. Las afinidades de unión de SG1 frente a Fc gamma R humanos son comparables a las de la región constante de IgG1 natural, pero la de F760 se suprime por la modificación de Fc (también descrita en el presente documento como Fc silenciosa). Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de las cuatro variantes de anticuerpo anti-miostatina se muestran en la tabla 2a.
[1052] [EJEMPLO 13]
[1053] Caracterización de variantes de MS1032 dependientes del pH (ensayo con HEK Blue (BMP1 y activación espontánea))
[1054] Todos los ajustes experimentales fueron los mismos en los ejemplos 3 y 4. Tal como se muestra en la figura 10, todas las variantes mostraron una actividad de inhibición comparable contra miostatina latente humana a MS1032LO00-SG1.
[1055] [EJEMPLO 14]
[1056] Caracterización de variantes de MS1032 dependientes del pH (BIACORE (marca registrada))
[1057] Todos los ajustes experimentales fueron los mismos que en el ejemplo 7, excepto que también se realizaron mediciones en tampón de ACES pH 5,8 además de la condición de ACES a pH 7,4. Algunos anticuerpos se midieron sólo contra miostatina latente humana. Se tenía como objetivo un nivel de captura de anticuerpos de 185 RU y 18,5 RU, para el ensayo de avidez y afinidad, respectivamente. Se determinaron los parámetros cinéticos usando un ajuste de unión 1:1 usando el software de evaluación T200 BIACORE (marca registrada), versión 2.0 (GE Healthcare). Los sensogramas de todos los anticuerpos contra miostatina latente humana con condición de avidez se muestran en la figura 11, y ka, kd, y KD calculados a partir de diferentes condiciones se enumeran en las tablas 7-10. En la condición de avidez, todos los anticuerpos excepto MS1032LO00-SG1 mostraron una velocidad de disociación más rápida a pH ácido que a pH neutro. En la condición de afinidad, todos los anticuerpos excepto MS1032LO00-SG1 mostraron una débil interacción con miostatina latente a pH ácido y, por tanto, no se determinaron los parámetros cinéticos.
[1058] (Tabla 7)
[1059] ka, kd, y KD de ensayo en condición de avidez en pH neutro
[1060] Miostatina latente humana Miostatina latente de ratón Miostatina latente decyno ka(M-1s-1)kd(s-1)KD(M)ka(M-1s-1)kd(s-1)KD(M)a(M-1s-1)kd(s-1)KD(M) MS1032LO00-SG1 1,27E+06 9,52E-05 7,50E-11 1,52E+06 7,18E-05 4,71E-1 ,21E+06 8,08E-05 6,66E-11 MS1032LO01-SG1 1,27E+06 2,16E-04 1,70E-10 1,45E+06 2,17E-04 1,49E-1 ,19E+06 1,97E-04 1,65E-10 MS1032LO02-SG1 8,36E+05 2,49E-04 2,98E-10 N/T N/T N/T N/T N/T N/T MS1032LO03-SG1 9,81E+05 1,92E-04 1,96E-10 N/T N/T N/T N/T N/T N/T
[1061] MS1032LO04-SG1 1,33E+06 2,17E-04 1,63E-10
N/T N/T N/T
N/T N/T N/T
[1062] N/T: no sometido a prueba
[1063] (Tabla 8)
[1064] ka, kd, y KD de ensayo en condición de avidez en pH ácido
[1065] Miostatina latente humana Miostatina latente de ratón Miostatina latente decyno ka(M-1s-1)kd(s-1)KD(M)ka(M-1s-1)kd(s-1)KD(M)a(M-1s-1)kd(s-1)KD(M) MS1032LO00-SG1 1,60E+06 1,28E-04 7,97E-11 2,32E+06 2,02E-05 8,70E-1 ,79E+06 1,58E-05 8,83E-12 MS1032LO01-SG1 1,22E+06 2,42E-02 1,99E-08 1,02E+06 6,25E-03 6,15E-0 ,64E+05 6,80E-03 8,90E-09 MS1032LO02-SG1 1,70E+06 4,14E-02 2,43E-08 N/T N/T N/T N/T N/T N/T MS1032LO03-SG1 5,43E+05 5,24E-02 9,66E-09 N/T N/T N/T N/T N/T N/T
[1066] MS1032LO04-SG1 7,81E+05 7,13E-02 9,13E-09
N/T N/T N/T
N/T N/T N/T
[1067] N/T: no sometido a prueba
[1068] (Tabla 9)
[1069] ka, kd, y KD de ensayo en condición de afinidad en pH neutro
[1070] Miostatina latente humana Miostatina latente de ratón Miostatina latente decyno ka(M-1s-1)kd(s-1)KD(M)ka(M-1s-1)kd(s-1)KD(M)a(M-1s-1)kd(s-1)KD(M) MS1032LO00-SG1 1,07E+06 2,45E-04 2,30E-10 1,31E+06 1,60E-04 1,22E-1 ,02E+06 1,23E-04 2,09E-10 MS1032LO01-SG1 1,64E+06 1,29E-03 7,88E-10 1,50E+06 1,07E-03 7,13E-1 ,15E+06 1,10E-03 9,54E-10 MS1032LO02-SG1 1,09E+06 1,79E-03 1,64E-09 N/T N/T N/T N/T N/T N/T MS1032LO03-SG1 1,08E+06 1,17E-03 1,08E-09 N/T N/T N/T N/T N/T N/T MS1032LO04-SG1 1,54E+06 1,25E-03 8,12E-10
N/T N/T N/T
N/T N/T N/T
[1071] N/T: no sometido a prueba
[1072] (Tabla 10)
[1073] ka kd KD de ensa o en condición de afinidad en H neutro
[1076]
[1078] n.d.: no determinado, N/T: no sometido a prueba
[1079] [EJEMPLO 15]
[1080] Comparación de la concentración de miostatina total en plasma entre anticuerpos con unión a Fc gamma R y una unión a Fc gamma R suprimida en ratones
[1081] Pruebain vivousando ratones C.B-17 SCID
[1082] La acumulación de miostatina endógena se evaluóin vivotras la administración de anticuerpo anti-miostatina latente en ratones SCID C.B-17 (In Vivos, Singapur). Se administró un anticuerpo anti-miostatina latente (3 mg/ml) a una dosis única de 10 ml/kg en la vena caudal. Se extrajo sangre 5 minutos, 7 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 7 días, 14 días, 21 días, y 28 días después de la administración. Se centrifugó la sangre extraída inmediatamente a 14.000 rpm en 4 grados C durante 10 minutos para separar el plasma. Se almacenó el plasma separado a o por debajo de -80 grados C hasta la medición. Los anticuerpos anti-miostatina latente usados fueron MS1032LO00-SG1 y MS1032LO00-F760.
[1083] Medición de la concentración de miostatina total en plasma mediante electroquimioluminiscencia (ECL)
[1084] Se midió mediante ECL la concentración de miostatina total en plasma de ratón. Se prepararon placas con inmovilización de anticuerpo anti-miostatina madura dispensando anticuerpo anti-miostatina madura RK35 (tal como se describe en el documento WO 2009/058346) en una placa de 96 pocillos MULTI-ARRAY (Meso Scale Discovery) y se incubó durante la noche a 4 grados C. Se prepararon muestras para curva de calibración de miostatina madura y muestras de plasma de ratón diluidas 40 veces o más. Se mezclaron las muestras en una disolución ácida (glicina-HCl 0,2 M, pH 2,5) para disociar miostatina madura de su proteína de unión (tal como propéptido). Posteriormente, se añadieron las muestras sobre una placa con inmovilización de anticuerpo anti-miostatina madura, y se permitió que se uniesen durante 1 hora a temperatura ambiente antes del lavado. A continuación, se añadió anticuerpo antimiostatina madura marcado con ETIQUETA SULFO, RK22 (tal como se describe en el documento WO 2009/058346) y se incubó la placa durante 1 hora a temperatura ambiente antes del lavado. Se añadió inmediatamente tampón de lectura T (x4) (Meso Scale Discovery) a la placa y se detectó la señal mediante SECTOR Imager 2400 (Meso Scale Discovery). Se calculó La concentración de miostatina madura basándose en la respuesta de la curva de calibración usando el software analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices). El transcurso temporal de la concentración de miostatina total en plasma después de la administración intravenosa de anticuerpo antimiostatina latente medido mediante este método se muestra en la figura 12.
[1085] Efecto de la unión a Fc gamma R sobre la acumulación de miostatinain vivo
[1086] Después de la administración del anticuerpo MS1032LO00-F760, la concentración de miostatina total en plasma el día 28 se acumuló 248 veces en comparación con la concentración de miostatina total en plasma a los 5 minutos. Por el contrario, después de la administración de MS1032LO00-SG1, la concentración de miostatina total en plasma el día 28 se acumuló 37 veces en comparación con la concentración de miostatina total en plasma a los 5 minutos. Se observó una diferencia de aproximadamente 7 veces de la concentración de miostatina total en plasma el día 28 entre MS1032LO00-F760 (Fc silenciosa) y MS1032LO00-SG1 debido a la unión a Fc gamma R. En IL-6R soluble humana (hsIL-6R), no se observó una diferencia significativa en la concentración de hsIL-6R en plasma entre los anticuerpos anti-hsIL-6R F760 (Fc silenciosa) y SG1 tal como se describe en el documento WO 2013/125667. Puesto que hsIL-6R es un antígeno monomérico, el complejo anticuerpo-hsIL-6R contiene sólo 1 Fc. Por tanto, el resultado en el documento WO 2013/125667 sugería que un complejo anticuerpo-antígeno con 1 Fc no tiene unión significativa a Fc gamma Rin vivopara acelerar la captación del complejo inmunitario por las células. Por otro lado, con un antígeno multimérico (tal como miostatina), el anticuerpo puede producir un complejo inmunitario grande y el complejo anticuerpo-antígeno contiene más de 2 Fc. Por tanto, puede observarse una diferencia significativa en la concentración de antígeno en plasma entre F760 y SG1 debido a la fuerte unión de avidez contra Fc gamma R. El resultado sugiere que MST1032 puede formar un complejo inmunitario grande que contiene más de 2 anticuerpos con miostatina.
[1087] [EJEMPLO 16]
[1088] Comparación de la concentración de miostatina total en plasma entre anticuerpo anti-miostatina latente no dependiente del pH y anticuerpo anti-miostatina latente dependiente del pH en ratones
[1089] Pruebain vivousando ratones C.B-17 SCID
[1090] Se evaluó la acumulaciónin vivode miostatina de ratón endógena después de administrar anticuerpo anti-miostatina latente en ratones SCID C.B-17 (In Vivos, Singapur) tal como se describe en el ejemplo 15. Los anticuerpos antimiostatina latente usados fueron MS1032LO01-SG1 y MS1032LO01-F7660.
[1091] Medición de la concentración de miostatina total en plasma mediante ECL
[1092] Se midió mediante ECL la concentración de miostatina total en plasma de ratón tal como se describe en el ejemplo 15. El transcurso temporal de la concentración de miostatina total en plasma después de la administración intravenosa de anticuerpo anti-miostatina latente tal como se mide mediante este método se muestra en la figura 13. Efecto de la unión de miostatina dependiente del pH sobre la acumulación de miostatinain vivo
[1093] Los anticuerpos anti-miostatina latente dependientes del pH (MS1032LO01-SG1 y MS1032LO01-F760) se sometieron a pruebain vivoy se realizó una comparación de la concentración de miostatina total en plasma. Los resultados de medición de la concentración de miostatina total después de la administración de MS1032LO00-SG1 y MS1032LO00-F760 descritos en el ejemplo 15 también se muestran en la figura 13. MS1032LO00 es un anticuerpo no dependiente del pH y MS1032LO01 es un anticuerpo dependiente del pH. Tal como se muestra en la figura 13, la concentración de miostatina total después de la administración de MS1032LO01-F760 se redujo en comparación con MS1032LO00-F760 debido a la unión dependiente del pH. Además, la concentración de miostatina total después de la administración de MS1032LO01-SG1 se redujo drásticamente en comparación con la de MS1032LO00-SG1 debido a la unión dependiente del pH y aumento de la captación celular por la unión de Fc gamma R. Se espera que MS1032LO01-SG1 tenga una propiedad superior de mejora de aclaramiento de miostatina desde el plasma como “anticuerpo de barrido”.
[1094] [EJEMPLO 17]
[1095] Eficaciain vivodel anticuerpo anti-miostatina latente dependiente del pH
[1096] Todos los ajustes experimentales fueron los mismos que en el ejemplo 8. Tal como se muestra en la figura 14, cuando se administró por vía intravenosa a ratones SCID a dosis de 0,2, 1, y 5 mg/kg, MS1032LO00-SG1 (anticuerpo no de barrido) y MS1032LO01-SG1 (anticuerpo de barrido) aumentaron la masa del músculo esquelético de manera dependiente de la dosis después de 2 semanas. MS1032LO01-SG1 aumentó significativamente el peso en húmedo de cuádriceps y la fuerza de prensión a 1 y 5 mg/kg, y aumentó significativamente la masa corporal magra y el peso en húmedo de gemelos a 5 mg/kg con respecto al grupo de vehículo (PBS). MS1032LO01-SG1 también disminuyó significativamente la masa adiposa a 1 y 5 mg/kg con respecto al grupo de vehículo (PBS). MS1032LO00-SG1 no mostró aumento de la masa corporal magra a 0,2 mg/kg. Por otro lado, MS1032LO01-SG1 aumentó drásticamente la masa corporal magra, el peso en húmedo de cuádriceps, el peso en húmedo de gemelos y la fuerza de prensión a 0,2 mg/kg. Por tanto, un anticuerpo de unión dependiente del pH muestra un mayor crecimiento de la masa muscular y una mejora de la potencia muscular en relación con un anticuerpo de unión no dependiente del pH.
[1097] [EJEMPLO 18]
[1098] Expresión y purificación de GDF11 latente humano y de ratón
[1099] Se expresaron de manera transitoria GDF11 humano con etiqueta Flag en el extremo N-terminal (también descrito en el presente documento como Flag-hGDF11, GDF11 latente humano, hGDF11, o GDF11 humano, SEQ ID NO: 85) usando células FreeStyle293-F (Thermo Fisher). Se aplicó medio condicionado que expresaba Flag-hGDF11 a una columna rellena con resina de afinidad anti-Flag M2 (Sigma) y se eluyó con péptido Flag (Sigma). Se recogieron las fracciones que contenían Flag-hGDF11 y posteriormente se sometieron a una columna de filtración en gel Superdex 200 (GE healthcare) equilibrada con PBS 1x. Luego se combinaron las fracciones que contenían FlaghGDF11 y se almacenaron a -80 grados C.
[1100] [EJEMPLO 19]
[1101] Caracterización de anticuerpo anti-miostatina latente (ELISA)
[1102] Se recubrieron placas de ELISA sin recubrir (superficie MAXISORP de placa NUNC-IMMUNO, Nalge Nunc International) con 20 microl de estreptavidina 50 nM (GenScript) durante 2 horas a temperatura ambiente. Luego se lavaron las placas con PBST tres veces y se bloquearon con 50 microl de Blocking One al 20 % (Nacalai Tesque) durante la noche. Al día siguiente, se incubó cada pocillo de las placas con miostatina latente humana biotinilada a 2 nM/pocillo/20 microl o GDF11 latente humano biotinilado a 20 nM/pocillo/20 microl durante 2 horas. Después del lavado, se añadieron 20 microl de muestra de anticuerpo a los pocillos y se dejaron las placas durante 1 hora. Se lavaron las placas y se añadieron 20 microl de anticuerpo anti-IgG humana-peroxidasa de rábano picante (HRP) (Abcam) diluido en solución salina tamponada con HEPES, y se dejaron las placas durante otra hora. Se lavaron los pocillos de nuevo, y luego se añadieron 50 microl de ABTS (KPL) a cada pocillo, y se incubaron las placas durante 1 hora. Se detectó la señal a 405 nm en un lector de placas colorimétrico. Los resultados del experimento de unión se muestran en la figura 15. MST1032-G1m se unió a miostatina latente (es decir, complejo no covalente de miostatina madura y propéptidos), pero no se unió a HGDF11. Estos resultados muestran que MST1032-G1m se une específicamente a miostatina, no a hGDF11.
[1103] [EJEMPLO 20]
[1104] Caracterización del anticuerpo anti-miostatina latente (ensayo con HEK Blue (BMP1 y activación espontánea)) Se usó un ensayo de gen indicador para evaluar la actividad biológica de GDF11 activoin vitro. Las células HEK-Blue<™>TGF-beta (Invivogen) que expresan un gen indicador SEAP inducible por el elemento de unión a Smad3/4 (SBE), permiten la detección de GDF11 bioactivo monitorizando la activación de los receptores de activina de tipo 1 y de tipo 2. El GDF11 activo estimula la producción y secreción de SEAP en el sobrenadante celular. La cantidad de SEAP secretada se evalúa entonces usando QUANTIBlue<™>(Invivogen).
[1105] Las células HEK-Blue<™>TGF-beta se mantuvieron en medio DMEM (Gibco) complementado con suero bovino fetal al 10 %, 50 microg/ml de estreptomicina, 50 U/ml de penicilina, 100 microg/ml de Normocin<™>, 30 microg/ml de blasticidina, 200 microg/ml de HygroGold<™>y 100 microg/ml de Zeocin<™>. Durante el ensayo funcional, se cambiaron las células a medio de ensayo (DMEM con albúmina de suero bovino al 0,1 %, estreptomicina, penicilina y Normocin<™>) y se sembraron en una placa de 96 pocillos. Se incubó GDF11 humano con o sin BMP1 humana recombinante (Calbiochem) y anticuerpo anti-forma latente (MST1032-G1m) a 37 grados C durante la noche. Las mezclas de muestras se transfirieron a células. Después de 24 horas de incubación, se mezcló el sobrenadante celular con QUANTIBlue<™>y se midió la densidad óptica a 620 nm en un lector de placas colorimétrico. Tal como se muestra en la figura 16, MST1032-G1m no previno la activación espontánea o mediada por proteasa de GDF11 humano y, por tanto, no pudo inhibir la secreción de SEAP.
[1106] [EJEMPLO 21]
[1107] Optimización adicional de variantes de MS1032 para mejorar el efecto de barrido
[1108] Como el anticuerpo dependiente del pH, MS1032LO01-SG1, mostró una eficacia superior en ratón, se realizó una optimización adicional para aumentar la dependencia del pH, para mejoar la captación en células, para aumentar la estabilidad, y así sucesivamente, introduciendo mutaciones en las CDR de anticuerpo o cambiando las regiones de marco. Se evaluaron más de mil variantes en un ensayo de BIACORE (marca registrada) y/o con HEK Blue tal como se ha descrito anteriormente, y se generaron MS1032LO06-SG1, MS1032LO07-SG1, MS1032LO10-SG1, MS1032LO11-SG1, MS1032LO12-SG1, MS1032LO18-SG1, MS1032LO19-SG1, MS1032LO21-SG1, MS1032LO23-SG1, MS1032LO24-SGI, MS1032LO25-SG1, y MS1032LO26-SG1. Sus secuencias de aminoácidos y nucleótidos de estos anticuerpos generados se muestran en la tabla 11.
[1109] (Tabla 11a)
[1110] Variantes de MS1032 sus secuencias de ADN y de aminoácidos (mostradas como SEQ ID NO)
[1111] (Tabla 11b)
[1112] Secuencias de aminoácidos de HVR de variantes de MS1032 (mostradas como SEQ ID NO)
[1113] La afinidad de la unión de la variante de MS1032 a miostatina latente humana, de macaco cangrejero (cyno) o de ratón a pH 7,4 y pH 5,8 se determinó a 37 grados C usando el instrumento T200 BIACORE (marca registrada) (GE Healthcare) para evaluar el efecto del pH sobre la unión a antígeno. Se inmovilizó ProA/G (Pierce) sobre todas las celdas de flujo de un chip CM4 usando un kit de acoplamiento de amina (GE Healthcare). Todos los anticuerpos y analitos se prepararon en tampón de ACES pH 7,4 o pH 5,8 que contenía ACES 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl<2>1,2 mM, Tween 20 al 0,05 %, NaN al 0,005 %<3>. Cada anticuerpo se capturó sobre la superficie del sensor por proA/G. Los niveles de captura de anticuerpos fueron normalmente de 130 a 240 unidades de resonancia (RU). Se inyectó miostatina latente humana, decynoy de ratón a de 3,125 a 50 nM preparada mediante dilución en serie doble, seguido de disociación. La superficie del sensor se regeneró cada ciclo con glicina HCl 10 mM pH 1,5. Se determinó la afinidad de unión procesando y ajustando los datos a un modelo de unión 1:1 usando el software de evaluación de BIACORE (marca registrada) T200, versión 2.0 (GE Healthcare).
[1115] La afinidad (KD) de las variantes de MS1032 que se unen a miostatina latente humana, de macaco cangrejero (cyno) y de ratón a pH 7,4 y pH 5,8 se muestran en la tabla 12. Todas las variantes mostraron una razón de KD ((KD a pH 5,8)/(KD a pH 7,4)) de más de 5, lo que indica una unión dependiente del pH a miostatina latente.
[1116] (Tabla 12)
[1117] Parámetros cinéticos de variantes de MS1032 n.d.: no determinado
[1118]
[1119] [EJEMPLO 22]
[1120] Evaluación de la actividad de neutralización de variantes optimizadas adicionales en el ensayo con HEK Blue Se evaluó la actividad de neutralización de MS1032LO06-SG1, MS1032LO07-SG1, MS1032LO10-SG1, MS1032LO11-SG1, MS1032LO12-SG1, MS1032LO18-SG1, MS1032LO19-SG1, MS1032LO21-SG1, MS1032LO23-SG1 y MS1032LO25-SG1 contra miostatina latente humana tal como se describe en el ejemplo 3. Tal como se muestra en la figura 17, todas las variantes mostraron una actividad comparable a MS1032LO01-SG1.
[1121] [EJEMPLO 23]
[1122] Comparación de la concentración de miostatina total en plasma entre anticuerpo anti-miostatina latente no dependiente del pH y diferentes anticuerpos anti-miostatina latentes dependientes del pH en ratones
[1123] Pruebain vivousando ratones C.B-17 SCID
[1124] La acumulación de miostatina endógena se evaluóin vivotras la administración de anticuerpo anti-miostatina latente en ratones SCID C.B-17 (In vivos, Singapur). Se administró un anticuerpo anti-miostatina latente (3 mg/ml) a una dosis única de 10 ml/kg en la vena caudal. Se extrajo sangre 5 minutos, 7 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 7 días, 14 días, 21 días, y 28 días después de la administración. Se centrifugó la sangre extraída inmediatamente a 14.000 rpm en 4 grados C durante 10 minutos para separar el plasma. Se almacenó el plasma separado a o por debajo de -80 grados C hasta la medición. Los anticuerpos anti-miostatina latente sometidos a prueba fueron MS1032LO00-SG1, MS1032LO01-SG1, MS1032LO06-SG1, MS1032LO11-SG1, MS1032LO18-SG1, MS1032LO19-SG1, MS1032LO21-SG1 y MS1032LO25-SG1.
[1125] Medición de la concentración de miostatina total en plasma mediante electroquimioluminiscencia (ECL)
[1126] Se midió mediante ECL la concentración de miostatina total en plasma de ratón. Se prepararon placas con inmovilización de anticuerpo anti-miostatina madura dispensando anticuerpo anti-miostatina madura biotinilado RK35 (tal como se describe en el documento WO 2009/058346) en una placa de estreptavidina de 96 pocillos MULTI-ARRAY (Meso Scale Discovery) y se incubó en tampón de bloqueo durante 2 horas a temperatura ambiente. Se prepararon muestras para curva de calibración de miostatina madura y muestras de plasma de ratón diluidas 40 veces o más. Se mezclaron las muestras en una disolución ácida (glicina-HCl 0,2 M, pH 2,5) para disociar miostatina madura de su proteína de unión (tal como propéptido). Posteriormente, se añadieron las muestras sobre una placa con inmovilización de anticuerpo anti-miostatina madura, y se permitió que se uniesen durante 1 hora a temperatura ambiente antes del lavado. A continuación, se añadió anticuerpo anti-miostatina madura marcado con ETIQUETA SULFO RK22 (tal como se describe en el documento WO 2009/058346) y se incubó la placa durante 1 hora a temperatura ambiente antes del lavado. Se añadió inmediatamente tampón de lectura T (x4) (Meso Scale Discovery) a la placa y se detectó la señal mediante SECTOR Imager 2400 (Meso Scale Discovery). Se calculó La concentración de miostatina madura basándose en la respuesta de la curva de calibración usando el software analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices). El transcurso temporal de la concentración de miostatina total en plasma después de la administración intravenosa de anticuerpo anti-miostatina latente medido mediante este método se muestra en la figura 18.
[1127] Efecto de la unión de miostatina dependiente del pH sobre la acumulación de miostatina en ratones en estudioin vivo
[1128] El efecto de la dependencia del pH sobre la acumulación de miostatina en ratones se comparó usando anticuerpo anti-miostatina latente no dependiente del pH (MS1032LO00-SG1) y diferentes anticuerpos anti-miostatina latente dependientes del pH (MS1032LO01-SG1, MS1032LO06-SG1, MS1032LO11-SG1, MS1032LO18-SG1, MS1032LO19-SG1, MS1032LO21-SG1 y MS1032LO25-SG1). La introducción de dependencia del pH acelera significativamente el aclaramiento de miostatina desde el plasma de ratón SCID. Tal como se muestra en la figura 18, los anticuerpos anti-miostatina latente dependientes del pH (MS1032LO01-SG1, MS1032LO06-SG1, MS1032LO11-SG1, MS1032LO18-SG1, MS1032LO19-SG1, MS1032LO21-SG1 y MS1032LO25-SG1) pudieron reducir la acumulación de miostatina en comparación con el anticuerpo anti-miostatina latente no dependiente del pH (MS1032LO00-SG1) el día 28.
[1129] [EJEMPLO 24]
[1130] Comparación de la concentración de miostatina total en plasma entre anticuerpo anti-miostatina latente no dependiente del pH y anticuerpos anti-miostatina latente con modificación por ingeniería tanto de pH como de Fc en macaco cangrejero
[1131] Pruebain vivousando macacos cangrejeros
[1132] La acumulación de miostatina endógena se evaluóin vivotras la administración de anticuerpo anti-miostatina latente enMacaca fascicularis(macaco cangrejero) de 2-4 años de edad de Camboya (Shin Nippon Biomedical Laboratories Ltd., Japón). Se inyectó un nivel de dosis de 30 mg/kg en la vena cefálica del antebrazo usando una jeringa desechable, tubo de extensión, aguja permanente, y bomba de infusión. La velocidad de dosificación fue de 30 minutos por cuerpo. Se extrajo sangre antes del inicio de la dosificación y o bien 5 minutos, 7 horas y 1, 2, 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 y 56 días después del fin de la dosificación, o bien 5 minutos y 2, 4 y 7 horas y 1, 2, 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 y 56 días después del fin de la dosificación. Se extrajo sangre de la vena femoral con una jeringa que contenía heparina sódica. Se enfrió la sangre inmediatamente en hielo, y se obtuvo plasma mediante centrifugación a 4 grados C, 1700 x g durante 10 minutos. Las muestras de plasma se almacenaron en un ultracongelador (intervalo aceptable: -70 grados C o por debajo) hasta la medición. Los anticuerpos anti-miostatina latente usados fueron MS1032LO00-SG1, MS1032LO06-SG1012, MS1032LO06-SG1016, MS1032LO06-SG1029, MS1032LO06-SG1031, MS1032LO06-SG1033 y MS1032LO06-SG1034 (en el presente documento, SG1012, SG1016, SG1029, SG1031, SG1033 y SG1034 son las regiones constantes de cadena pesada construidas basándose en SG1 tal como se describe a continuación).
[1133] Se administró un nivel de dosis de 2 mg/kg en la vena cefálica del antebrazo o vena safena usando una jeringa desechable, y una aguja permanente para los anticuerpos anti-miostatina latente MS1032LO19-SG1079, MS1032LO19-SG1071, MS1032LO19-SG1080, MS1032LO19-5G1074, MS1032LO19-SG1081, y MS1032LO19-SG1077 (en el presente documento, SG1079, SG1071, SG1080, SG1074, SG1081, y SG1077 son las regiones constantes de cadena pesada construidas basándose en SG1 tal como se describe a continuación). Se extrajo sangre antes del inicio de la dosificación y 5 minutos y 2, 4 y 7 horas y 1, 2, 3, 7, 14 días después del fin de la dosificación. Se procesó la sangre tal como se ha descrito anteriormente. Se almacenaron muestras de plasma en un ultracongelador (intervalo aceptable: -70 grados C o por debajo) hasta la medición.
[1134] Medición de la concentración de miostatina total en plasma mediante electroquimioluminiscencia (ECL)
[1135] Se midió la concentración de miostatina total en plasma de mono mediante ECL tal como se describe en el ejemplo 23. El transcurso temporal de la concentración de miostatina total en plasma después de la administración intravenosa de anticuerpo anti-miostatina latente tal como se mide mediante este método se muestra en la figura 19. Medición de ADA en plasma de mono usando electroquimioluminiscencia (ECL)
[1136] Se recubrió con fármaco biotinilado sobre una placa de estreptavidina de 96 pocillos MULTI-ARRAY (Meso Scale Discovery) y se incubó en tampón de bajo cruzamiento (Candor) durante 2 horas a temperatura ambiente. Se diluyeron muestras de plasma de mono 20 veces en tampón de bajo cruzamiento antes de la adición a la placa. Se incubaron muestras durante la noche a 4C. Al día siguiente, se lavó la placa tres veces con tampón de lavado antes de la adición de anticuerpo secundario anti-IgG de mono marcado con ETIQUETA SULFO (Thermo Fisher Scientific). Después de incubar durante una hora a temperatura ambiente, se lavó la placa tres veces con tampón de lavado. Se añadió inmediatamente tampón de lectura T (x4) (Meso Scale Discovery) a la placa y se detectó la señal usando un sistema SECTOR Imager 2400 (Meso Scale Discovery).
[1137] Efecto de la ingeniería genética de Fc y dependiente del pH sobre la acumulación de miostatina en monosin vivoEn macaco cangrejero, la administración de anticuerpo no dependiente del pH (MS1032LO00-SG1) dio como resultado un aumento de al menos 60 veces de la concentración de miostatina desde el nivel inicial el día 28. El día 28, los anticuerpos anti-miostatina latente dependientes del pH MS1032LO06-SG1012 y MS1032LO06-SG1033 dieron como resultado un aumento de 3 veces y 8 veces desde el nivel inicial, respectivamente. Al fuerte barrido contribuyó principalmente el aumento de la afinidad por Fc gamma RIIb de macaco cangrejero. El día 28, los anticuerpos anti-miostatina latente dependientes del pH MS1032LO06-SG1029, MS1032LO06-SG1031 y MS1032LO06-SG1034 pudieron barrer el antígeno por debajo del nivel inicial. El motivo para el fuerte barrido de MS1032LO06-SG1029, MS1032LO06-SG1031 y MS1032LO06-SG1034 es un aumento de la captación inespecífica en la célula debido al aumento del agrupamiento de carga positiva del anticuerpo y un aumento de la captación celular mediada por Fc gamma R debido a la unión mejorada a Fc gamma R.
[1138] La administración de anticuerpos anti-miostatina latente dependientes del pH MS1032LO19-SG1079, MS1032LO19-SG1071, MS1032LO19-SG1080, MS1032LO19-SG1074, MS1032LO19-SG1081 y MS1032LO19-SG1077 redujo la concentración de miostatina por debajo del límite de detección (<0,25 ng/ml) desde el día 1 en macaco cangrejero. El día 14, la concentración de miostatina aumentó por encima del límite de detección para MS1032LO19-SG1079 y MS1032LO19-SG1071 mientras que la concentración de miostatina permaneció por debajo del límite de detección para MS1032LO19-SG1080, MS1032LO19-SG1074, MS1032LO19-SG1081 y MS1032LO19-SG1077. La supresión más débil de MS1032LO19-SG1079 y MS1032LO19-SG1071 podría deberse a la diferencia en las mutaciones de pl. Los datos sugieren que podría conseguirse un fuerte barrido de miostatina desde el plasma mediante mutaciones que aumentan la unión a Fc gamma RIIb o combinando mutaciones que aumentan la carga positiva del anticuerpo y aumentan la unión a Fc gamma RIIb. Se espera que pueda conseguirse un fuerte barrido de miostatina en seres humanos combinando mutaciones que aumentan la carga positiva del anticuerpo y aumentan la unión a Fc gamma R.
[1139] [EJEMPLO 25]
[1140] Eficaciain vivode variantes optimizadas adicionales en ratón
[1141] Tal como se describe en el ejemplo 8, se evaluó la eficaciain vivoen ratones Scid usando MS1032LO06-SG1, MS1032LO11-SG1, MS1032LO18-SG1, MS1032LO19-SG1 y MS1032LO25-SG1. Se realizaron tres estudios independientes y se usó MS1032LO01 como control.
[1142] Los resultados de estos experimentos se muestran en las figuras 20A-20I. Todos los anticuerpos (MS1032LO06-SG1, MS1032LO11-SG1, MS1032LO18-SG1, MS1032LO19-SG1, y MS1032LO25-SG1) mostraron un aumento dependiente de la dosis de la masa corporal magra (LBM) así como la fuerza de prensión de las extremidades. Los anticuerpos también mostraron una disminución de la masa adiposa corporal de manera dependiente de la dosis. [EJEMPLO 26]
[1143] Mapeo de epítopos de anticuerpos anti-miostatina latente
[1144] Se generaron anticuerpos anti-miostatina latente humana adicionales para el mapeo de sus epítopos de unión correspondientes. Se inmunizaron dos conejos NZW y se extrajeron tal como se describe en el ejemplo 2. Las líneas de células B productoras de anticuerpos 1760 identificadas se cribaron adicionalmente para determinar su capacidad para bloquear la activación mediada por BMP1 de miostatina latente humana. En resumen, se incubó sobrenadante de células B que contiene anticuerpos secretados con miostatina latente humana en presencia de BMP1 humana recombinante (R&D Systems) a 37 grados C durante la noche. Después, se transfirieron 50 microl de la mezcla de reacción a una placa de 96 pocillos MULTI-ARRAY de Meso Scale Discovery recubierta con anticuerpo antimiostatina madura RK35 (tal como se describe en el documento WO 2009/058346). Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente con agitación, se incubaron las placas con anticuerpo anti-miostatina madura biotinilado RK22 (tal como se describe en el documento WO 2009/058346) seguido de estreptavidina con etiqueta SULFO. Luego se añadió tampón de lectura T (x4) (Meso Scale Discovery) a la placa y se detectó la señal de ECL mediante SECTOR Imager 2400 (Meso Scale Discovery). Se seleccionaron 94 líneas que mostraban diferentes niveles de actividades neutralizantes para el análisis posterior (MST1495-MST1588). Las regiones variables de estas líneas seleccionadas se clonaron tal como se describe en el ejemplo 2, excepto que se usó un vector de expresión con la secuencia de región constante de cadena pesada F1332m (SEQ ID NO: 193).
[1145] La actividad inhibidora sobre la activación de miostatina latente humana se evaluó adicionalmente para un panel de 7 anticuerpos anti-miostatina latente (MST1032, MST1504, MST1538, MST1551, MST1558, MST1572 y MST1573; los identificadores de secuencia para las secuencias de aminoácidos de estos anticuerpos se muestran en la tabla 13). Tal como se muestra en la figura 21, todos los anticuerpos pudieron inhibir la activación mediada por BMP1 de miostatina latente humana de una manera dependiente de la dosis.
[1146] (Tabla 13)
[1147] Secuencias de aminoácidos de anticuer os anti-miostatina latente
[1150]
[1152] Se seleccionaron 4 anticuerpos que funcionaban bien en inmunotransferencias de tipo Western para el mapeo de epítopos. Se clonaron fragmentos de la región codificante de propéptido N-terminal de miostatina latente humana en un vector pGEX4.1 para producir fragmentos de propéptido marcados con etiqueta GST de 100 aminoácidos cada uno, con solapamiento de 80 aminoácidos (figura 22A). Se indujo la expresión de proteínas en células competentes BL21 transformadas con el sistema de autoinducción Overnight Express (Merck Millipore) y se extrajo la proteína usando el reactivo de extracción de proteínas BugBuster (Novagen). La expresión de los fragmentos de proteína deseados a aproximadamente 37 kDa se verificó mediante análisis de inmunotransferencias de tipo Western tal como se describe en el ejemplo 6 (anticuerpo anti-GST (Abcam)) (figura 22B). Cuando se someten a prueba con anticuerpos anti-miostatina latente humana, tal como se muestra en la figura 22C, aunque los 4 anticuerpos pudieron inhibir la activación de miostatina latente, reconocieron diferentes epítopos en miostatina latente humana. El anticuerpo MST1032 pudo detectar los primeros cinco fragmentos, no se detectaron bandas después de la eliminación de los aminoácidos 81-100 (SEQ ID NO: 78). Tanto el anticuerpo MST1538 como MST1572 se unen a los tres primeros fragmentos únicamente, no se detectaron bandas en ausencia de los aminoácidos 41-60 de SEQ ID NO: 78. El anticuerpo MST1573 sólo se unió fuertemente a los dos primeros fragmentos, lo que sugiere que su epítopo se encuentra dentro de los aminoácidos 21-40 de SEQ ID NO: 78 (Figura 22D).
[1153] [EJEMPLO 27]
[1154] Desarrollo de nuevas variantes de Fc mejoradas para Fc gamma RIIb
[1155] En este ejemplo, se ilustra la modificación por ingeniería de Fc para mejorar el aclaramiento de miostatina.
[1156] Se ha demostrado en el documento WO 2013/125667 que puede mejorarse el aclaramiento de un antígeno soluble mediante su administración de moléculas de unión a antígeno que comprenden un dominio de Fc que presenta una afinidad aumentada por Fc gamma RIIb. Además, se han ilustrado variantes de Fc que pueden mostrar unión mejorada a Fc gamma RIIb humano en los documentos WO 2012/115241 y WO 2014/030728. También se ha ilustrado que estas variantes de Fc pueden mostrar una unión mejorada selectivamente a Fc gamma RIIb humano y una unión disminuida a otros Fc gamma R activos. Esta mejora selectiva de la unión a Fc gamma RIIb puede ser favorable no sólo para el aclaramiento de antígeno soluble sino también para disminuir el riesgo de funciones efectoras y respuesta inmunitaria no deseadas.
[1157] Para el desarrollo de un fármaco de anticuerpo, deben evaluarse la eficacia, la farmacocinética, y la seguridad en animales no humanos en los que el fármaco es farmacológicamente activo. Si es activo sólo en seres humanos, deben considerarse enfoques alternativos tales como el uso de un anticuerpo sustituto (Int. J. Tox. 28: 230-253 (2009)). Sin embargo, no sería fácil predecir con precisión los efectos de la interacción entre la región Fc y Fc gamma R en seres humanos usando un anticuerpo sustituto, porque los patrones de expresión y/o las funciones de Fc gamma R en animales no humanos no siempre son iguales que en seres humanos. Sería preferible que las regiones Fc de los fármacos de anticuerpo tuvieran reactividad cruzada con animales no humanos, especialmente con macaco cangrejero que tiene patrones de expresión y funciones de Fc gamma R cercanos a los de seres humanos, de modo que los resultados obtenidos en animales no humanos pudieran extrapolarse a los seres humanos.
[1158] Por tanto, en este estudio se desarrollaron variantes de Fc que muestran reactividad cruzada con Fc gamma R humanos y decyno.
[1159] Medición de afinidad de una variante de Fc mejorada para Fc gamma RIIb existente contra Fc gamma R humanos y de mono
[1160] El gen de cadena pesada de la variante mejorada para Fc gamma RIIb humano (en el presente documento, “mejorado para Fc gamma RIIb” significa “con actividad de unión a Fc gamma RIIb mejorada”) dado a conocer en el documento WO 2012/115241 se generó sustituyendo Pro en la posición 238 en la numeración de EU por Asp en la cadena pesada de MS1032LO06-SG1 que se denomina M103205H795-SG1 (VH, SEQ ID NO: 86; CH, SEQ ID NO: 9). La cadena pesada resultante se denomina M103205H795-MY009 (VH, SEQ ID NO: 86; CH, SEQ ID NO: 252). Como cadena ligera del anticuerpo, se usó M103202L889-SK1 (VL, SEQ ID NO: 96; CL, SEQ ID NO: 10). El anticuerpo recombinante se expresó según el método mostrado en el ejemplo 34.
[1161] Se prepararon los dominios extracelulares de Fc gamma R de la siguiente manera. La síntesis de los genes para el dominio extracelular de Fc gamma R humanos se llevó a cabo en métodos conocidos por el experto en la técnica a partir de la información registrada en el NCBI. Específicamente, Fc gamma RIIa se basó en la secuencia del # de registro del NCBI NM_001136219.1, Fc gamma RIIb se basaba en NM_004001.3, Fc gamma RIIIa se basaba en NM_001127593.1, respectivamente. Se prepararon alotipos de Fc gamma RIIa y Fc gamma RIIIa según los informes sobre polimorfismo para Fc gamma RIIa (J. Exp. Med. 172:19-25 (1990) y para Fc gamma RIIIa (J. Clin. Invest.
[1162] 100(5):1059-1070 (1997)), respectivamente. La síntesis del gen para el dominio extracelular de Fc gamma R de macaco cangrejero se construyó clonando ADNc de cada Fc gamma R de macaco cangrejero usando los métodos conocidos por los expertos en la técnica. Las secuencias de aminoácidos de los dominios extracelulares construidos de Fc gamma R se muestran en la lista de secuencias: (SEQ ID NO 210 para Fc gamma RIIaR humano, SEQ ID NO 211 para Fc gamma RIIaH humano, SEQ ID NO 214 para Fc gamma RIIb humano, SEQ ID NO 217 para Fc gamma RIIIaF humano, SEQ ID NO 218 para Fc gamma RIIIaV humano, SEQ ID NO 220 para Fc gamma RIIa1 decyno, SEQ ID NO 221 para Fc gamma RIIa2 decyno, SEQ ID NO 222 para Fc gamma RIIa3 decyno, SEQ ID NO 223 para Fc gamma RIIb decyno, SEQ ID NO 224 para Fc gamma RIIIaS decyno). Después se añadió la cola His a su extremo C-terminal y se insertó cada gen obtenido en el vector de expresión diseñado para la expresión en células de mamífero. El vector de expresión se introdujo en las células FreeStyle293 derivadas de células embrionarias de riñón humano (Invitrogen) para expresar la proteína diana. Después del cultivo, se filtró el sobrenadante de cultivo resultante y se purificó mediante las siguientes cuatro etapas en principio. La cromatografía de intercambio catiónico usando SP Sepharose FF se realizó como la primera etapa, una cromatografía de afinidad contra la cola His (HisTrap HP) como la segunda etapa, una cromatografía en columna de filtración en gel (Superdex200) como la tercera etapa, y filtración estéril como la cuarta etapa. Se midió la absorbancia a 280 nm de las proteínas purificadas usando un espectrofotómetro y se determinó la concentración de la proteína purificada usando un coeficiente de extinción calculado mediante el método de PACE (Protein Science 4:2411-2423 (1995)).
[1163] El análisis cinético de las interacciones entre estos anticuerpos y Fc gamma R se llevó a cabo usando BIACORE (marca registrada) T200 o BIACORE (marca registrada) 4000 (GE Healthcare). Se usó HBS-EP+ (GE Healthcare) como tampón de ejecución, y se ajustó la temperatura de medición a 25 grados C. Se usó un chip producido inmovilizando proteína A, proteína A/G o IgG de ratón anti-cadena ligera kappa humana de (BD Biosciences) en un chip sensor de la serie S CM4 o CM5 (GE Healthcare) mediante el método de acoplamiento de amina. Se capturó un anticuerpo de interés sobre este chip para que interaccionase con cada Fc gamma R que se había diluido con el tampón de ejecución, y se midió la unión al anticuerpo. Después de la medición, el anticuerpo capturado sobre el chip se retiró por lavado permitiendo la reacción con glicina-HCl 10 mM, pH 1,5 y NaOH 25 mM de modo que se regeneró el chip y se usó repetidamente. Los sensogramas obtenidos como resultados de medición se analizaron mediante el modelo de unión de Langmuir 1:1 usando el software de evaluación de BIACORE (marca registrada) para calcular la constante de velocidad de unión ka (l/mol/s) y la constante de velocidad de disociación kd (1/s), y se calculó la constante de disociación KD (mol/l) a partir de estos valores. Puesto que la unión de MS1032LO06-MY009 a Fc gamma RIIaH humano, Fc gamma RIIIaV humano, y Fc gamma RIIIaS decynofue débil, no pudieron calcularse parámetros cinéticos tales como KD a partir del método analítico mencionado anteriormente. Con respecto a tales interacciones, se calcularon valores de KD usando el siguiente modelo de unión 1:1 descrito en el manual de software de BIACORE (marca registrada) T100, BR1006-48 edición AE.
[1164] El comportamiento de las moléculas que interaccionan según el modelo de unión 1:1 en BIACORE (marca registrada) puede describirse mediante la ecuación 1: Req = C x R max/(KD+C)+RI, en la que, Req es una representación gráfica de los niveles de unión en estado estacionario con la concentración de analito, C es la concentración, RI es la contribución del índice de refracción volumétrico en la muestra, y Rmax es la capacidad de unión a analito de la superficie. Cuando se reorganiza esta ecuación, puede expresarse KD como la ecuación 2: KD=C x Rmax/ (Req-RI)-C. puede calcularse KD sustituyendo los valores de Rmax, RI, y C en la ecuación 1 o la ecuación 2. A partir de las condiciones de medición actuales, puede usarse RI = 0, C = 2 micromol/l. Además, el valor de Rmax obtenido al ajustar globalmente el sensograma obtenido como resultado del análisis de la interacción de cada Fc gamma R con IgG1 usando el modelo de unión de Langmuir 1:1 se dividió entre la cantidad de SG1 capturado, ésta se multiplicó por la cantidad de MY009 capturado, y se usó el valor resultante como Rmax. Este cálculo se basa en la hipótesis de que la cantidad límite de cada Fc gamma R que puede unirse por SG1 permanece sin cambios para todas las variantes producidas mediante la introducción de mutaciones en SG1, y la Rmax en el momento de la medición es proporcional a la cantidad de anticuerpo unido en el chip en el momento de la medición. Req se definió como la cantidad de unión de cada Fc gamma R a cada variante en el chip sensor observada en el momento de la medición.
[1165] La tabla 14 muestra el resultado del análisis cinético de SG1 y MY009 frente a Fc gamma R humanos y decyno. Se calcularon los valores de KD en celdas rellenas de color gris usando la [ecuación 2], ya que su afinidad era demasiado débil para determinarse correctamente mediante análisis cinético. Se calcularon los valores de veces de KD dividiendo el valor de KD de SG1 entre el valor de KD de la variante para cada Fc gamma R.
[1166] Tal como se muestra en la tabla 14, la variante mejorada para Fc gamma RIIb humano MY009 no muestra unión mejorada a Fc gamma RIIb decynopero muestra unión mejorada a Fc gamma RIIb humano. Su afinidad por Fc gamma RIIb decynoestaba más bien disminuida en 0,4 veces en comparación con SG1, lo que indica que la variante mejorada para Fc gamma RIIb humano MY009 no tiene reactividad cruzada con Fc gamma R decyno. Desarrollo de una nueva variante de Fc que muestra una unión mejorada tanto a Fc gamma RIIb humano como decyno
[1167] Idealmente, la nueva variante de Fc debe tener una unión mejorada tanto a Fc gamma RIIb humano como a decynoselectivamente y una unión disminuida a otros Fc gamma R activos. Sin embargo, debido a que los supuestos residuos de unión a Fc en Fc gamma RIIb decynoson completamente los mismos que cualquiera de los alotipos de Fc gamma RIIa decyno(figura 23), es imposible teóricamente conseguir una mejora selectiva de la unión a Fc gamma RIIb decynosobre Fc gamma RIIa decyno. Por tanto, una nueva variante de Fc debe tener una unión mejorada selectivamente a Fc gamma RIIb humano, Fc gamma RIIb decynoy Fc gamma RIIa decyno.
[1168] Con el fin de obtener una nueva variante de Fc que muestre una unión mejorada selectivamente tanto a Fc gamma RIIb humano como decyno, se usaron los resultados de un estudio de mutagénesis exhaustivo realizado en el documento WO 2012/115241. En el estudio de mutagénesis exhaustivo, se introdujeron mutaciones exhaustivas en todas las posiciones en las regiones de unión a Fc gamma R en anticuerpos IgG1 y se analizó exhaustivamente la unión a cada Fc gamma R tal como se muestra en los siguientes procedimientos.
[1169] (Tabla 14)
[1170] Reactividad cruzada de una variante mejorada para Fc gamma RIIb humano con FC gamma R decyno
[1171] La región variable de un anticuerpo de glipicano 3 que comprende la CDR de GpH7 que es un anticuerpo antiglipicano 3 con cinética en plasma mejorada dado a conocer en el documento WO 2009/041062 se usó como región variable de cadena pesada de anticuerpo (GpH7: SEQ ID NO: 225). De manera similar, para la cadena ligera de anticuerpo, se usó GpL16-k0 (SEQ ID NO: 226) del anticuerpo glipicano 3 con cinética en plasma mejorada dado a conocer en el documento WO 2009/041062. Además, se usó B3 (SEQ ID NO: 228) en el que se ha introducido una mutación K439E en G1d (SEQ ID NO: 227) producido eliminando la Gly y Lys C-terminal de IgG1 como región constante de cadena H de anticuerpo. Esta cadena pesada, que se ha preparado fusionando GpH7 y B3, se denomina GpH7-B3 (VH, SEQ ID NO: 225; CH, SEQ ID NO: 228).
[1173] Con respecto a GpH7-B3, los residuos de aminoácido que se considera que están implicados en la unión a Fc gamma R y los residuos de aminoácido circundantes (posiciones 234 a 239, 265 a 271, 295, 296, 298, 300, y 324 a 337, según la numeración de EU) se sustituyeron, respectivamente, por 18 residuos de aminoácido excluyendo el residuo de aminoácido original y Cys. Estas variantes de Fc se denominan variantes de B3. Se expresaron variantes de B3 y se evaluó exhaustivamente la unión de anticuerpos purificados con proteína A a cada Fc gamma R (Fc gamma RIIa tipo H, Fc gamma RIIa tipo R, Fc gamma RIIb, y Fc gamma RIIIaF) de la siguiente manera. El análisis de interacción entre cada anticuerpo alterado y el receptor gamma de Fc preparado tal como se mencionó anteriormente se llevó a cabo usando BIACORE (marca registrada) T100 (GE Healthcare), BIACORE (marca registrada) T200 (GE Healthcare), BIACORE (marca registrada) A100 o BIACORE (marca registrada) 4000. Se usó HBS-EP+ (GE Healthcare) como tampón de ejecución, y se ajustó la temperatura de medición a 25 grados C. Se usaron chips producidos inmovilizando proteína A (Thermo Scientific), proteína A/G (Thermo Scientific) o proteína L (ACTIGEN o BioTechniques) mediante el método de acoplamiento de amina a un chip sensor de la serie S CM5 o CM4 (GE Healthcare). Después de la captura de anticuerpos de interés sobre estos chips sensores, se permitió que interaccionase un receptor gamma de Fc diluido con el tampón de ejecución, se midió la cantidad unida a un anticuerpo. Sin embargo, puesto que la cantidad de receptor gamma de Fc unido depende de la cantidad de anticuerpos capturados, la cantidad de receptor gamma de Fc unido se dividió entre la cantidad de cada anticuerpo capturado para obtener valores corregidos, y se compararon estos valores. Además, se lavaron los anticuerpos capturados sobre los chips con glicina-HCl 10 mM, pH 1,5, y se regeneraron los chips y se usaron repetidamente. El valor de la cantidad de unión a Fc gamma R de cada variante de B3 se dividió entre el valor de la cantidad de unión a Fc gamma R del anticuerpo B3 parental (un anticuerpo que tiene la secuencia de una IgG1 humana que se produce de manera natural en las posiciones 234 a 239, 265 a 271, 295, 296, 298, 300, y 324 a 337, según la numeración de EU). El valor obtenido multiplicando este valor por 100 se usó como un indicador de la actividad relativa de unión a R de gamma Fc de cada variante.
[1175] La tabla 15 muestra el perfil de unión de sustituciones prometedoras seleccionadas basándose en los siguientes criterios (más del 40 % para Fc gamma RIIb humano, menos del 100 % para Fc gamma RIIaR humano y Fc gamma RIIaH humano, menos del 10 % para Fc gamma RIIIaF humano, en comparación con los del anticuerpo B3 parental).
[1177] (Tabla 15)
[1178] Perfil de unión de sustituciones seleccionadas contra Fc amma R humanos
[1180]
[1183] En la siguiente etapa, se evaluó la reactividad cruzada de estas sustituciones con Fc gamma R decyno. Estas 16 mutaciones se introdujeron en M103205H795-SG1. Se expresaron las variantes usando M103202L889-SK1 como cadena ligera y se analizó su afinidad por Fc gamma RIIa1, IIa2, IIa3, IIb, IIIaS decyno.
[1185] La tabla 16 muestra el perfil de unión de estas 16 variantes a Fc gamma R decyno. El valor de la cantidad de unión a Fc gamma R se obtuvo dividiendo la cantidad de Fc gamma R unido entre la cantidad de cada anticuerpo capturado. Este valor se normalizó adicionalmente usando el valor para SG1 como 100.
[1186] (Tabla 16)
[1187] P rfil ni n i i n l i n nr F mm Rn
[1189]
[1191] Entre las 16 variantes de Fc seleccionadas, sólo MY001 mantuvo la unión a Fc gamma RIIb decynoen un 85 % en comparación con SG1. Adicionalmente, MY001 mostró una unión reducida a Fc gamma RIIIaS decynoy se mantiene su unión a Fc gamma RIIa1, IIa2, y IIa3 decyno. Como resultado, la mutación G236N es la sustitución única que muestra un perfil de unión similar tanto a Fc gamma R humanos como decyno.
[1192] Aunque la sustitución G236N muestra reactividad cruzada tanto con Fc gamma R humanos como decyno, su afinidad por Fc gamma RIIb es menor que SG1 (el 75 % para Fc gamma RIIb humano y el 85 % para Fc gamma RIIb decyno, respectivamente). Con el fin de aumentar su afinidad por Fc gamma RIIb, se evaluaron sustituciones adicionales. Específicamente, se seleccionaron sustituciones que mostraron una unión aumentada a Fc gamma RIIb humano, una unión reducida a Fc gamma RIIIa humano y una selectividad aumentada por Fc gamma RIIb humano sobre Fc gamma RIIa humano basándose en el resultado del estudio de mutagénesis exhaustivo (tabla 17).
[1193] (Tabla 17)
[1194] Perfil de unión de sustituciones seleccionadas adicionalmente contra Fc amma R humanos
[1196]
[1197]
[1199] Entre estas sustituciones, se seleccionaron L234W y L234Y para aumentar la selectividad por Fc gamma RIIb humano sobre Fc gamma RIIa humano. Y se seleccionaron G236A, G236S, A330R, A330K y P331E para disminuir la unión a Fc gamma RIIIa humano. Todas las demás sustituciones se seleccionaron para aumentar la unión a Fc gamma RIIb humano. Se evaluó la reactividad cruzada de las sustituciones seleccionadas con Fc gamma R decyno. Además, también se evaluaron tres sustituciones, P396M, V264I, y E233D. Las sustituciones se introdujeron en M103205H795-SG1 y se expresaron las variantes usando M103202L889-SK1 como cadena ligera.
[1200] La tabla 18 muestra el análisis cinético de sustituciones seleccionadas que incluyen G236N contra Tanto FC gamma R humanos como decyno. Específicamente, se introdujeron sustituciones en M103205H795-SG1. Se expresaron las variantes usando M103202L889-SK1 como cadena ligera y se analizó su afinidad por Fc gamma RIIa1, IIa2, IIa3, IIb, IIIaS decyno. Se calcularon los valores de KD en celdas rellenas de color gris usando la [ecuación 2], ya que su afinidad era demasiado débil para determinarse correctamente mediante análisis cinético. Se calcularon los valores de veces de KD dividiendo el valor de KD de SG1 entre el valor de KD de la variante para cada Fc gamma R.
[1201] G236N mostró afinidad de unión comparable a Fc gamma RIIa1 decyno, Fc gamma RIIa2 decyno, Fc gamma RIIa3 decyno, y Fc gamma RIIb decynoa SG1. Aunque la afinidad por Fc gamma RIIb humano se reduce a 0,6 veces, las afinidades por Fc gamma RIIaH humano y Fc gamma RIIaR humano se reducen a 0,2 veces y 0,1 veces, respectivamente, lo que indica que esta sustitución tiene alta selectividad por Fc gamma RIIb humano sobre Fc gamma RIIa humano. Además, sus afinidades por Fc gamma RIIIaS decynoy Fc gamma RIIIaV humano son de 0,03 veces y 0,04 veces, respectivamente, lo que es favorable para eliminar la actividad de ADCC. Basándose en este resultado, G236N mostró reactividad cruzada casi ideal con Fc gamma humanos y decynoaunque debe mejorarse su afinidad tanto para Fc gamma RIIb humano como decyno.
[1202] Entre las sustituciones adicionales evaluadas, S298L, G236A, P331E, E233D, K334Y, K334M, L235W, S239V, K334I, L234W, K328T, Q295L, K334V, K326T, P396M, I332D, H268E, P271G, S267A y H268D mostraron una unión aumentada tanto a Fc gamma RIIb humano como decyno. Específicamente, H268D mostró el mayor efecto (7 veces para Fc gamma RIIb humano y 5,3 veces para Fc gamma RIIb decyno). Con respecto al efecto de la reducción de la unión a Fc gamma RIIIa, G236S, A330K, y G236D mostraron menos de 0,5 veces de afinidad en comparación con SG1.
[1203] Con el fin de mejorar la afinidad tanto por Fc gamma RIIb humano como por el decynode MY001, se evaluaron las combinaciones de sustituciones enumeradas en la tabla 18. Específicamente, se introdujeron sustituciones en M103205H795-SG1. Se expresaron las variantes usando M103202L889-SK1 como cadena ligera y se analizó su afinidad. La tabla 19 muestra el resultado del análisis cinético frente a Fc gamma R humanos y decyno. Se calcularon los valores de KD en celdas rellenas de color gris usando la [ecuación 2], ya que su afinidad era demasiado débil para determinarse correctamente mediante análisis cinético. Se calcularon los valores de veces de KD dividiendo el valor de KD de SG1 entre el valor de KD de la variante para cada Fc gamma R.
[1204] (Tabla 18)
[1205] Análisis cinético de variantes contra Fc gamma R humanos y decyno
[1206]
[1207] (Tabla 19)
[1208] Análisis cinético de variantes que se componen de G236N y sustituciones adicionales
[1209]
[1210] Todas las variantes suprimieron las afinidades por Fc gamma RIIIaV humano en menos de 0,26 veces y por Fc gamma RIIIaS decynoen menos de 0,42 veces en comparación con SG1. Además, todas las variantes excepto MY047, MY051, y MY141 mostraron satisfactoriamente una unión mejorada tanto a Fc gamma RIIb humano como a decynoen comparación con MY001 y se mantuvieron su unión a Fc gamma RIIa humano en menos de 2 veces en comparación con SG1. Entre ellos, MY201, MY210, MY206, MY144, MY103, MY212, MY105, MY205, MY109, MY107, MY209, MY101, MY518, MY198 y MY197 mostraron una unión mejorada tanto a Fc RIIb gamma humano como decynoen más de 4 veces en comparación con SG1. Sobre todo, MY205, MY209, MY198, y MY197 mostraron una unión mejorada a la unión tanto a Fc RIIb gamma humano como decynoen más de 7 veces.
[1211] Se ilustra en el documento WO2014030728 que las sustituciones en la posición 396 en el dominio CH3 mejoraron la afinidad por Fc gamma RIIb humano. Se introdujo mutagénesis exhaustiva en la posición 396 de M103205H795-MY052, que contiene sustituciones G236N/H268E/P396M. Se expresaron las variantes resultantes usando M103202L889-SK1 como cadena ligera y se evaluó su afinidad por Fc gamma R humanos y decyno(tabla 20). Se calcularon los valores de veces de KD dividiendo el valor de KD de SG1 entre el valor de KD de la variante para cada Fc gamma R.
[1212] Entre las sustituciones sometidas a prueba, P396I, P396K y P396L mantuvieron la unión a Fc gamma RIIb humano en más de 5 veces en comparación con SG1 y sólo la sustitución de P396L mejoró la afinidad por Fc gamma RIIb humano en comparación con MY052. Con respecto a la unión a Fc gamma RIIb decyno, MY052 parental mostró la mayor afinidad que es un aumento de 3,9 veces con respecto a SG1.
[1213] Puesto que G236N mostró reactividad cruzada ideal para Fc gamma R humanos y decyno, se sometieron a prueba otras sustituciones en la posición 236 que no se evaluaron en los ejemplos anteriores. Específicamente, Asn en M103205H795-MY201 se sustituyó por Met, His, Val, Gln, Leu, Thr, e Ile. Se expresaron las variantes resultantes usando M103202L889-SK1 como cadena ligera y se evaluó su afinidad por Fc gamma R humanos y decyno(tabla 21). Se calcularon los valores de KD en celdas rellenas de color gris usando la [ecuación 2], ya que su afinidad era demasiado débil para determinarse correctamente mediante análisis cinético. Se calcularon los valores de veces de KD dividiendo el valor de KD de SG1 entre el valor de KD de la variante para cada Fc gamma R.
[1214] (Tabla 20)
[1215] Análisis cinético de variantes de P396 derivadas de MY052
[1216]
[1217] (Tabla 21)
[1218] Análisis cinético de variantes de G236 derivadas de MY201
[1219]
[1220] (Tabla 22)
[1221] Análisis cinético de variantes derivadas de MY265
[1222]
[1223] Aunque todas las variantes mostraron afinidad disminuida tanto por Fc gamma RIIb humano como decynoen comparación con el MY201 parental, MY265, que se produce sustituyendo Asn por Thr en la posición 236 de MY201, mantuvo una unión mejorada en 2,1 veces para Fc gamma RIIb humano y 3,1 veces para Fc gamma RIIb decyno, respectivamente en comparación con SG1. MY265 también mantuvo la unión reducida tanto a Fc gamma RIIIa humano como decyno. Aunque se mejoró la afinidad por Fc gamma RIIaH y Fc gamma RIIaR humanos en más de 2,5 veces en comparación con SG1, G236T es la segunda sustitución favorable en la posición 236.
[1224] Con el fin de mejorar la selectividad y afinidad de MY265 por Fc gamma RIIb humano, se realizó un estudio de mutagénesis exhaustivo en las posiciones 231 y 232. Específicamente, las posiciones 231 y 232 de M103205H795-MY265 se sustituyeron por 18 residuos de aminoácido excluyendo el aminoácido original y Cys. Se expresaron las variantes resultantes usando M103202L889-SK1 como cadena ligera y se evaluó su afinidad por Fc gamma R humanos y decyno(tabla 22). Se calcularon los valores de veces de KD dividiendo el valor de KD de SG1 entre el valor de KD de la variante para cada Fc gamma R.
[1225] Con respecto a la afinidad por Fc gamma RIIb, la adición de A231T, A231M, A231V, A231G, A231F, A231I, A231L, A231, A231W, P232V, P232Y, P232F, P232M, P232I, P232W, P232L aumentó la unión tanto a Fc gamma RIIb humano como decynoen comparación con MY265 parental. Sobre todo, la adición de A231T y A231G redujo la unión a Fc gamma RIIaR humano en comparación con MY265.
[1226] Se evaluó la combinación de las sustituciones que no se evaluaron en los ejemplos anteriores. Las sustituciones sometidas a prueba y que revelaron ser prometedoras se introdujeron en M103205H795-SG1 en combinación. Se expresaron las variantes resultantes usando M103202L889-SK1 como cadena ligera y se evaluó su afinidad por Fc gamma R humanos y decyno. La tabla 23 muestra el resultado y se calcularon los valores de KD en celdas rellenas de color gris usando la [ecuación 2] ya que su afinidad era demasiado débil para determinarse correctamente mediante análisis cinético. Se calcularon los valores de veces de KD dividiendo el valor de KD de SG1 entre el valor de KD de la variante para cada Fc gamma R. Los valores para MY209 que se seleccionaron como variantes prometedoras en la tabla 19 se mostraron de nuevo para comparación.
[1227] Entre las variantes sometidas a prueba, sólo MY213 mostró una mayor afinidad de unión tanto para Fc gamma RIIb humano como decynoen comparación con MY209. Sin embargo, las afinidades de MY213 por Fc gamma RIIaH humano y Fc gamma RIIaR humano son mayores que las de MY209.
[1228] (Tabla 23A)
[1229] Análisis cinético de otras combinaciones
[1230]
[1231] (Tabla 23B)
[1232] Análisis cinético de otras combinaciones
[1233]
[1234] (Tabla 24)
[1235] Perfil de unión de las variantes sometidas a prueba en todos los ratones transgénicos para Fc gamma R humano
[1236]
[1237] [EJEMPLO 28]
[1238] Evaluación del aclaramiento de miostatina usando variantes de Fc mejoradas para Fc gamma RIIb en todos los ratones transgénicos para Fc gamma R humanos
[1239] Se evaluó el efecto del aclaramiento de miostatina por la variante de Fc mejorada para Fc gamma RIIb construida en el ejemplo 27 en un ratón en el que se han delecionado todos los Fc gamma R murinos y se han insertado Fc gamma R humanos, codificados como transgenes, en el genoma del ratón (Proc. Natl. Acad. Sci., 2012, 109, 6181).). En estos ratones, todos los Fc gamma R de ratón se sustituyen con humanos de modo que pueda evaluarse el efecto de mejora de la afinidad por Fc gamma RIIb humano sobre el aclaramiento de antígeno soluble en ratón. Además, se evaluaron sustituciones de aumento de pI en combinación con variantes de Fc mejoradas para Fc gamma RIIb construidas en el ejemplo 27.
[1240] Preparación y perfil de variantes sometidas a prueba
[1241] Los 8 anticuerpos sometidos a prueba y sus perfiles de unión se resumen en la tabla 24. Se preparó la cadena pesada, MS103205H795-PK2, introduciendo sustituciones de aumento de pI (S400R/D413K) en MS103205H795-MY101. Se prepararon MS103205H795-MY351, MS103205H795-MY344, MS103205H795-MY335 introduciendo otras sustituciones de aumento de pI (Q311R/D413K) en MS103205H795-MY201, MS103205H795-MY205, MS103205H795-MY265, respectivamente. Se expresaron todas las variantes de MS1032LO06 con M103202L889-SK1 como cadena ligera según el método mostrado en el ejemplo 27 y se evaluaron sus afinidades por Fc gamma R humanos y decynousando el método en el ejemplo 27.
[1242] Basándose en el análisis mediante SPR resumido en la tabla 24, se confirmó que las sustituciones de aumento de pI no afectan a la unión a Fc gamma R de variantes de Fc mejoradas para Fc gamma RIIb. MY101 y PK2, que se prepararon introduciendo S400R/D413K en MY101, mostraron unión a Fc gamma RIIb humano mejorada 9 veces y 8 veces, respectivamente. Las afinidades de MY101 y PK2 por Fc gamma RIIa humano permanecieron comparables a SG1. Con respecto a otros Fc gamma R humanos y decyno, mostraron casi el mismo perfil de unión. De manera similar, MY351 mostró un perfil de unión similar al de MY201 parental, MY344 con el de MY205 parental, y MY335 con el de MY265 parental (tabla 21), respectivamente. Estos resultados indican que cualquier par de sustituciones de aumento de pI, S400R/D413K o Q311R/D413K, no afecta a las afinidades por Fc gamma R humanos y decyno. Estudio PK en todos los ratones transgénicos para Fc gamma R humanos
[1243] Pruebain vivousando todos los ratones transgénicos para Fc gamma R humanos
[1244] Se evaluaronin vivola eliminación de miostatina y anticuerpo anti-miostatina latente tras la coadministración de anticuerpo anti-miostatina latente y miostatina latente humana en todos los ratones transgénicos para Fc gamma R humanos (figuras 24 y 25). Se administraron un anticuerpo anti-miostatina latente (0,3 mg/ml) y miostatina latente (0,05 mg/ml) a una dosis única de 10 ml/kg en la vena caudal. El anticuerpo anti-CD4 (1 mg/ml) se administró tres veces (cada 10 días) a una dosis de 10 ml/kg en la vena caudal para suprimir el anticuerpo anti-fármaco. Se extrajo sangre a los 5 minutos, 15 minutos, 1 hora, 4 horas, 7 horas, 1 día, 2 días, 7 días, 14 días, 21 días, y 28 días después de la administración. Se centrifugó la sangre extraída inmediatamente a 15.000 rpm en 4 grados C durante 5 minutos para separar el plasma. Se almacenó el plasma separado a o por debajo de -20 grados C hasta la medición. Los anticuerpos anti-miostatina latente usados fueron MS1032LO06-SG1, MS1032LO06-MY101, MS1032L006-PK2, MS1032L006-MY201, MS1032LO06-MY351, MS1032LO06-MY205, MS1032LO06-MY344 y MS1032LO06-MY335.
[1245] Medición de la concentración de miostatina total en plasma mediante electroquimioluminiscencia (ECL)
[1246] Se midió mediante ECL la concentración de miostatina total en plasma de ratón. Se prepararon placas con inmovilización de anticuerpo anti-miostatina madura dispensando anticuerpo anti-miostatina madura RK35 (documento WO 2009058346) en una placa de 96 pocillos MULTI-ARRAY (Meso Scale Discovery) y se incubó durante la noche a 4 grados C. Se prepararon muestras para curva de calibración de miostatina madura y muestras de plasma de ratón diluidas 4 veces o más. Se mezclaron las muestras en una disolución ácida (glicina-HCl 0,2 M, pH 2,5) para disociar miostatina madura de su proteína de unión (tal como propéptido). Posteriormente, se añadieron las muestras sobre una placa con inmovilización de anticuerpo anti-miostatina madura, y se permitió que se uniesen durante 1 hora a temperatura ambiente antes del lavado. A continuación, se añadió anticuerpo antimiostatina madura marcado con ETIQUETA DE BIOTINA, RK22 (documento WO 2009/058346) y se incubó la placa durante 1 hora a temperatura ambiente antes del lavado. A continuación, se añadió estreptavidina marcada con ETIQUETA SULFO (Meso Scale Discovery) y se incubó la placa durante 1 hora a temperatura ambiente antes del lavado. Se añadió inmediatamente tampón de lectura T (x4) (Meso Scale Discovery) a la placa y se detectó la señal mediante SECTOR Imager 2400 (Meso Scale Discovery). Se calculó La concentración de miostatina madura basándose en la respuesta de la curva de calibración usando el software analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices). El transcurso temporal de la concentración de miostatina total en plasma después de la administración intravenosa de anticuerpo anti-miostatina latente y miostatina latente medido mediante este método se muestra en la figura 24.
[1247] Medición de la concentración de anticuerpo anti-miostatina latente en plasma mediante cromatografía de líquidos de alta resolución-espectrometría de masas en tándem por electropulverización (CL/ESI-EM/EM)
[1248] Se midió la concentración de anticuerpo anti-miostatina latente en plasma de ratón mediante CL/ESI-EM/EM. Las concentraciones de patrones de calibración fueron de 1,5625, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100. y 200 microg/ml en plasma de ratón. Se añadieron tres microl de los patrones de calibración y las muestras de plasma a 50 microl de Ab-Capture Mag (ProteNova) y se permitió que incubasen durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de eso, se recuperaron las perlas magnéticas de las muestras y se lavaron dos veces con 0,2 ml de PBS 10 mmol/l con Tween 20 al 0,05 %. Posteriormente, se lavaron las perlas magnéticas con PBS 10 mmol/l para garantizar la eliminación de Tween 20. Después del lavado, se suspendieron las perlas magnéticas en 25 microl de urea 7,5 mol/l, ditiotreitol 8 mmol/l y lisozima (clara de huevo de gallina) 1 microg/ml en bicarbonato de amonio 50 mmol/l y se incubaron las muestras suspendidas durante 45 minutos a 56 grados C. Luego, se añadieron 2 microl de yodoacetoamida 500 mmol/l y se incubaron las muestras durante 30 minutos a 37 grados C en la oscuridad. A continuación, se llevó a cabo la digestión con lisil-endopeptidasa añadiendo 150 microl de 0,67 microg/ml de lisil endopeptidasa para bioquímica (Wako) en bicarbonato de amonio 50 mmol/l y se incubaron las muestras durante 3 h a 37 grados C. Posteriormente, se llevó a cabo digestión tríptica añadiendo 10 microl de tripsina modificada de calidad para secuenciación 10 microg/ml (Promega) en bicarbonato de amonio 50 mmol/l. Se permitió que se digiriesen las muestras mezclando durante una noche a 37 grados C, y se extinguieron añadiendo 5 microl de ácido trifluoroacético al 10 %. Se sometieron cincuenta microl de muestras de digestión a análisis mediante CL/ESI-EM/EM. Se realizó CL/ESI-EM/EM usando un instrumento de triple cuadrupolo Xevo TQ-S (Waters) equipado con UPLC 2D de clase I (Waters). El péptido específico de anticuerpo anti-miostatina latente YAFGQGTK y el péptido específico de lisozima GTDVQAWIR como patrón interno se monitorizaron mediante la monitorización de reacción seleccionada (SRM). La transición de SRM fue de [M+2H]2+ (m/z 436,2) a ion y8 (m/z 637,3) para el anticuerpo antimiostatina latente, y de [M+2H]2+ (m/z 523,3) a ion y8 (m/z 545,3) para lisozima. Se construyó una curva de calibración interna mediante regresión lineal ponderada (1/x o 1/x2) usando el área del pico representada gráficamente frente a las concentraciones. Se calculó la concentración en plasma de ratón a partir de la curva de calibración usando el software analítico Masslynx ver. 4.1 (Waters). El transcurso temporal de la concentración de anticuerpo en plasma después de la administración intravenosa de anticuerpo anti-miostatina latente y miostatina latente medido mediante este método se muestra en la figura 25.
[1249] Efecto de pl y de la unión a Fc gamma R sobre la concentración de miostatinain vivo
[1250] Después de la administración de MS1032LO06-SG1, la concentración de miostatina total en plasma a las 7 horas disminuyó 5 veces en comparación con la concentración de miostatina total en plasma a los 5 minutos. Por el contrario, después de la administración de MS1032LO06-MY101, MS1032LO06-MY201 y MS1032LO06-MY205, la concentración de miostatina total en plasma a las 7 horas disminuyó 28-200 veces en comparación con la concentración de miostatina total en plasma a los 5 minutos. Además, después de la administración de MS1032LO06-PK2, MS1032L006-MY351, MS1032LO06-MY344 y MS1032LO06-MY335, la concentración de miostatina total en plasma a las 7 horas disminuyó 361-419 veces en comparación con la concentración de miostatina total en plasma a los 5 minutos. Por otro lado, la diferencia en la concentración de cada anticuerpo en cada punto de muestreo en comparación con la de MS1032LO06-SG1 fue aproximadamente de 2 veces, y las variantes de pl no aumentaron la eliminación de anticuerpos desde el plasma. Tanto los anticuerpos mejorados para la unión a Fc gamma RIIb humano como las sustituciones de aumento de pI aumentaron la eliminación de miostatina, pero no de anticuerpos.
[1251] Las variantes de alto pI tienen más carga positiva en plasma. Puesto que esta carga positiva interacciona con la superficie celular de carga negativa, el complejo inmunitario antígeno-anticuerpo de variantes de alto pI se acerca a la superficie celular, dando como resultado una captación celular aumentada del complejo inmunitario antígenoanticuerpo de variantes de alto pI.
[1252] [EJEMPLO 29]
[1253] Evaluación del aclaramiento de miostatina usando variantes de Fc mejoradas para Fc gamma RIIb en mono Se evaluó en macaco cangrejero el efecto de la unión mejorada de variantes de Fc desarrolladas en el ejemplo 27 a Fc gamma RIIb decynosobre el barrido de miostatina. Y también se evaluó el efecto de la combinación con sustituciones de aumento de pI.
[1254] Preparación y perfil de variantes sometidas a prueba
[1255] Los 14 anticuerpos sometidos a prueba y sus perfiles de unión se resumen en la tabla 25. Se ha informado que la variante de Fc con unión mejorada a FcRn a pH ácido mejora la semivida del anticuerpoin vivo(J. Biol. Chem.2006 281:23514-23524 (2006); Nat. Biotechnol. 28:157-159 (2010), Clin Pharm. & Thera. 89(2):283-290 (2011)). Para mejorar la semivida del anticuerpo sin unión al factor reumatoide, se combinaron estas sustituciones con variantes de Fc gamma RIIb mejoradas y pI aumentado.
[1256] La cadena pesada, MS103205H795-SG1012, MS103205H795-SG1029, MS103205H795-SG1031, MS103205H795-SG1033, MS103205H795-SG1034 se prepararon introduciendo una sustitución N434A en MS103205H795-MY101, MS103205H795-MY344, MS103205H795-MY351, MS103205H795-MY201, MS103205H795-MY335, respectivamente. Se preparó MS103205H795-SG1016 introduciendo sustituciones de aumento de pI (Q311R/D399K) en MS103205H795-SG1012. Se prepararon MS103240H795-SG1071 y MS103240H795-SG1079 introduciendo sustituciones M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E y sustituciones N434A/Q438R/S440E en MS103240H795-MY344 respectivamente (MS103240H795: VH, SEQ ID NO; 92).
[1258] Se prepararon MS103240H795-SG1074 y MS103240H795-SG1077 introduciendo sustituciones Q311R/P343R y M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E de aumento de pI en MS103240H795-MY209 y MS103240H795-MY518, respectivamente. Se prepararon MS103240H795-SG1080 y MS103240H795-SG1081 introduciendo sustituciones de aumento de pI Q311R/P343R y N434A/Q438R/S440E en MS103240H795-MY209 y MS103240H795-MY518, respectivamente. Se preparó MS103240H795-SG1071 introduciendo sustituciones de aumento de pI Q311R/D413K y sustituciones M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E en MS103240H795-MY205. Se preparó MS103240H795-SG1079 introduciendo sustituciones de aumento de pI Q311R/D413K y N434A/Q438R/S440E en MS103240H795-MY205. Estas variantes de MS1032LO06 y variantes de MS1032LO19 se expresaron con M103202L889-SK1 y M103202L1045-SK1, respectivamente (M103202L1045: VL, SEQ ID NO: 97) como cadena ligera según el método mostrado en el ejemplo 34 y se evaluaron sus afinidades por Fc gamma R humanos y decynousando el método en el ejemplo 27. En este ejemplo, se calculó el valor de veces de KD para cada variante de Fc dividiendo el valor de KD de SG1 parental entre el valor de KD de la variante para cada Fc gamma R. Por ejemplo, se calcularon los valores de veces de KD para MS1032LO06-SG1012 y MS1032LO19-SG1071 dividiendo los valores de KD de MS1032LO06-SG1 y MS1032L019-SG1 entre los valores de KD de MS1032L006-SG1012 y MS1032LO19-SG1071, respectivamente.
[1259] Tabla 25
[1260]
[1261] Los resultados del análisis mediante SPR se resumen en la tabla 25. Entre estas variantes, SG1012, SG1016, SG1074 y SG1080 muestran la afinidad más fuerte por Fc gamma RIIb humano, que tiene una afinidad aumentada 10 veces por Fc gamma RIIb humano en comparación con SG1.
[1262] 29.2. Estudio PK en monos
[1263] Pruebain vivousando macacos cangrejeros
[1264] Se evaluóin vivola acumulación de miostatina endógena tras la administración de anticuerpo anti-miostatina latente enMacaca fascicularis(macaco cangrejero) de 2-4 años de edad de Camboya (Shin Nippon Biomedical Laboratories Ltd., Japón). Se inyectó un nivel de dosis de 30 mg/kg en la vena cefálica del antebrazo usando una jeringa desechable, tubo de extensión, aguja permanente y bomba de infusión. La velocidad de dosificación fue de 30 minutos por cuerpo. Se extrajo sangre antes del inicio de la dosificación y, o bien 5 minutos, 7 horas y 1, 2, 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 y 56 días después del fin de la dosificación, o bien 5 minutos y 2, 4 y 7 horas y 1, 2, 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 y 56 días después del fin de la dosificación. Se extrajo sangre de la vena femoral con una jeringa que contenía heparina sódica. Se enfrió la sangre inmediatamente en hielo, y se obtuvo plasma mediante centrifugación a 4 grados C, 1700 x g durante 10 minutos. Se almacenaron las muestras de plasma en un ultracongelador (intervalo aceptable: -70 grados C o por debajo) hasta la medición. Los anticuerpos anti-miostatina latente usados fueron MS1032LO00-SG1, MS1032L006-SG1012, MS1032LO06-SG1016, MS1032LO06-SG1029, MS1032LO06-SG1031, MS1032LO06-SG1033, y MS1032LO06-SG1034 (en el presente documento, SG1012, SG1016, SG1029, SG1031, SG1033, y SG1034 son las regiones constantes de cadena pesada construidas basándose en SG1 tal como se describe a continuación).
[1265] Se administró un nivel de dosis de 2 mg/kg en la vena cefálica del antebrazo o vena safena usando una jeringa desechable, y una aguja permanente para los anticuerpos anti-miostatina latente MS1032LO19-SG1079, MS1032LO19-SG1071, MS1032LO19-SG1080, MS1032LO19-SG1074, MS1032LO19-SG1081, y MS1032LO19-SG1077 (en el presente documento, SG1079, SG1071, SG1080, SG1074, SG1081, y SG1077 son las regiones constantes de cadena pesada construidas basándose en SG1 tal como se describe a continuación). Se extrajo sangre antes del inicio de la dosificación y 5 minutos y 2, 4 y 7 horas y 1, 2, 3, 7, 14 días después del fin de la dosificación. Se procesó la sangre tal como se ha descrito anteriormente. Se almacenaron muestras de plasma en un ultracongelador (intervalo aceptable: -70 grados C o por debajo) hasta la medición.
[1266] Medición de la concentración de miostatina total en plasma mediante electroquimioluminiscencia (ECL)
[1267] Se midió la concentración de miostatina total en plasma de mono mediante ECL tal como se describe en el ejemplo 23. El transcurso temporal de la concentración de miostatina total en plasma después de la administración intravenosa de anticuerpo anti-miostatina latente tal como se mide mediante este método se muestra en la figura 26. Medición de ADA en plasma de mono usando electroquimioluminiscencia (ECL)
[1268] Se recubrió con fármaco biotinilado sobre una placa de estreptavidina de 96 pocillos MULTI-ARRAY (Meso Scale Discovery) y se incubó en tampón de bajo cruzamiento (Candor) durante 2 horas a temperatura ambiente. Se diluyeron muestras de plasma de mono 20 veces en tampón de bajo cruzamiento antes de la adición a la placa. Se incubaron muestras durante la noche a 4C. Al día siguiente, se lavó la placa tres veces con tampón de lavado antes de la adición de anticuerpo secundario anti-IgG de mono marcado con ETIQUETA SULFO (Thermo Fisher Scientific). Después de incubar durante una hora a temperatura ambiente, se lavó la placa tres veces con tampón de lavado. Se añadió inmediatamente tampón de lectura T (x4) (Meso Scale Discovery) a la placa y se detectó la señal usando un sistema SECTOR Imager 2400 (Meso Scale Discovery).
[1269] Efecto de la modificación por ingeniería de Fc y dependiente del pH sobre la acumulación de miostatina en monosin vivo
[1270] En macaco cangrejero, la administración de anticuerpo no dependiente del pH (MS1032LO00-SG1) dio como resultado un aumento de al menos 60 veces de la concentración de miostatina desde el nivel inicial el día 28. El día 28, los anticuerpos anti-miostatina latente dependientes del pH MS1032LO06-SG1012 y MS1032LO06-SG1033 dieron como resultado un aumento de 3 veces y 8 veces desde el nivel inicial respectivamente. Al fuerte barrido contribuyó principalmente el aumento de la afinidad por Fc gamma RIIb de macaco cangrejero. El día 28, los anticuerpos anti-miostatina latente dependientes del pH MS1032LO06-SG1029, MS1032LO06-SG1031 y MS1032LO06-SG1034 pudieron barrer el antígeno por debajo del nivel inicial. El motivo para el fuerte barrido de MS1032LO06-SG1029, MS1032LO06-SG1031 y MS1032LO06-SG1034 es un aumento de la captación inespecífica en la célula debido al aumento del agrupamiento de carga positiva del anticuerpo y un aumento de la captación celular mediada por Fc gamma R debido a la unión mejorada a Fc gamma R.
[1271] La administración de los anticuerpos anti-miostatina latente dependientes del pH MS1032LO19-SG1079, MS1032LO19-SG1071, MS1032LO19-SG1080, MS1032LO19-SG1074, MS1032LO19-SG1081 y MS1032LO19-SG1077 redujo la concentración de miostatina por debajo del límite de detección (<0,25 ng/ml) desde el día 1 en macaco cangrejero. El día 14, la concentración de miostatina aumentó por encima del límite de detección para MS1032LO19-SG1079 y MS1032LO19-SG1071 mientras que la concentración de miostatina permaneció por debajo del límite de detección para MS1032LO19-SG1080, MS1032LO19-SG1074, MS1032LO19-SG1081 y MS1032LO19-SG1077. La supresión más débil de MS1032LO19-SG1079 y MS1032LO19-SG1071 podría deberse a la diferencia en las mutaciones de pl.
[1272] Los datos sugieren que podría conseguirse un fuerte barrido de miostatina desde el plasma mediante mutaciones que aumentan la unión a Fc gamma RIIb o combinando mutaciones que aumentan la carga positiva del anticuerpo y aumentan la unión a Fc gamma RIIb. Se espera que pueda conseguirse un fuerte barrido de miostatina en seres humanos combinando mutaciones que aumentan la carga positiva del anticuerpo y aumentan la unión a Fc gamma R.
[1273] [EJEMPLO 30]
[1274] Cribado de sustituciones con aumento de pI para mejorar el aclaramiento de miostatina.
[1275] Para mejorar el aclaramiento de miostatina, se evaluaron sustituciones con aumento de pI en la porción Fc del anticuerpo en este ejemplo. El método de añadir sustituciones de aminoácidos a la región constante de anticuerpo para aumentar el pl no está particularmente limitado pero, por ejemplo, puede realizarse mediante el método descrito en el documento WO 2014/145159. Como en el caso de la región variable, las sustituciones de aminoácidos introducidas en la región constante son preferiblemente aquellas que disminuyen el número de aminoácidos cargados negativamente (tales como ácido aspártico y ácido glutámico) mientras aumentan los aminoácidos cargados positivamente (tales como arginina y lisina). Además, pueden introducirse sustituciones de aminoácidos en cualquier posición en la región constante del anticuerpo, y pueden ser una sola sustitución de aminoácidos o una combinación de múltiples sustituciones de aminoácidos. Sin limitación particular, los sitios para introducir sustituciones de aminoácidos son preferiblemente posiciones en las que pueden quedar expuestas cadenas laterales de aminoácidos en la superficie de la molécula de anticuerpo. Los ejemplos particularmente preferibles incluyen el método de introducir una combinación de múltiples sustituciones de aminoácidos en posiciones tales que pueden quedar expuestas en la superficie de la molécula de anticuerpo. Alternativamente, las múltiples sustituciones de aminoácidos introducidas en este caso se colocan preferiblemente de modo que estén estructuralmente próximas entre sí. Además, sin limitación particular, las múltiples sustituciones de aminoácidos introducidas en el presente documento son preferiblemente sustituciones de aminoácidos cargados positivamente, de modo que preferiblemente dan como resultado un estado en el que múltiples cargas positivas están presentes en posiciones estructuralmente proximales.
[1276] Preparación y perfil de variantes sometidas a prueba
[1277] Los anticuerpos sometidos a prueba se resumen en la tabla 26. La cadena pesada, MS103205H795-SG141, se preparó introduciendo sustituciones de aumento de pI Q311R/D399R en MS103205H795-SG1. También se prepararon otras variantes de cadena pesada introduciendo las sustituciones respectivas representadas en la tabla 26 en MS103205H795-SG1. Se expresaron todas las variantes de MS1032LO06 con M103202L889-SK1 como cadena ligera según el método mostrado en el ejemplo 34.
[1278] Ensayo de unión a Fc gamma RII de ratón de variantes de Fc con aumento de pI usando BIACORE (marca registrada)
[1279] Con respecto a los anticuerpos que contienen variantes de región Fc producidos, se realizaron ensayos de unión entre Fc gamma RII de ratón soluble y complejos antígeno-anticuerpo usando BIACORE (marca registrada) T200 (GE Healthcare). Se produjo Fc gamma RII de ratón soluble en forma de una molécula marcada con cola de His mediante un método conocido por los expertos en la técnica. Se fijó una cantidad apropiada de un anticuerpo anti-His sobre un chip sensor CM5 (GE Healthcare) mediante el método de acoplamiento de amina usando un kit de captura de His (GE Healthcare) para capturar Fc gamma RII de ratón. A continuación, se inyectaron un complejo anticuerpo-antígeno y un tampón de ejecución (como disolución de referencia), y se permitió que tuviera lugar la interacción con el Fc gamma RII de ratón capturado sobre el chip sensor. Se usó ácido N-(2-acetamido)-2-aminoetanosulfónico 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl<2>1,2 mM, y Tween 20 al 0,05 % (p/v) a pH 7,4 como tampón de ejecución, y también se usó el tampón respectivo para diluir el Fc gamma RII de ratón soluble. Para regenerar el chip sensor, se usó glicina-HCl 10 mM a pH 1,5. Todas las mediciones se llevaron a cabo a 25 grados C. Se realizaron análisis basándose en la unión (RU) calculada a partir de sensogramas obtenidos mediante las mediciones, y se muestran los valores relativos cuando la cantidad de unión de SG1 se definió como 1,00. Para calcular los parámetros, se usó el software de evaluación de BIACORE (marca registrada) T100 (GE Healthcare) Los resultados del análisis mediante SPR se resumen en la tabla 26. Se demostró que unas pocas variantes de Fc tenían afinidad mejorada hacia Fc gamma RII de ratón fijado sobre el chip sensor de BIACORE (marca registrada). Aunque no se limita a una teoría particular, este resultado puede explicarse tal como sigue. Se sabe que el chip sensor de BIACORE (marca registrada) está cargado negativamente, y puede considerarse que este estado cargado se asemeja a la superficie de la membrana celular. Más específicamente, se supone que la afinidad de un complejo antígeno-anticuerpo por Fc gamma RII de ratón fijado sobre el chip sensor de BIACORE cargado negativamente (marca registrada) se asemeja a la manera en la que el complejo antígeno-anticuerpo se une a Fc gamma RII de ratón presente en una superficie de membrana celular cargada negativamente de manera similar.
[1280] (Tabla 26)
[1281] Resumen de variantes de Fc con I aumentado
[1283]
[1284] En este caso, los anticuerpos producidos introduciendo modificaciones de aumento de pI en la región Fc son anticuerpos en los que la carga de la región Fc es más hacia el lado positivo en comparación con antes de la introducción de las modificaciones. Por tanto, puede considerarse que se ha reforzado la interacción coulómbica entre la región Fc (carga positiva) y la superficie del chip sensor (carga negativa) mediante las modificaciones de aminoácidos de aumento de pI. Además, se espera que tales efectos tengan lugar de manera similar en la misma superficie de la membrana celular cargada negativamente; por tanto, también se espera que muestren un efecto de aceleración de la velocidad de captación en las célulasin vivo.
[1285] Entre las variantes de Fc con aumento de pI con dos sustituciones de aminoácidos de SG1, el complejo antígenoanticuerpo producido por SG141, P1499m, P1501m y P1540m muestra la mayor unión a Fc gamma RIIb humano. Se supone que las sustituciones de aminoácidos en Q311R/D399R, Q311R/P343R, Q311R/D413R y D401R/D413K tienen un fuerte efecto de carga sobre la unión a Fc gamma RIIb humano en el chip sensor.
[1286] Captación celular de variantes de Fc con aumento de pI
[1287] Para evaluar la velocidad de captación intracelular en una línea celular que expresa Fc gamma Rllb humano, se realizó el siguiente ensayo. Se produjo una línea celular MDCK (riñón canino de Madin-Darby) que expresa de manera constitutiva Fc gamma RIIb humano mediante métodos conocidos. Usando estas células, se evaluó la captación intracelular de complejos antígeno-anticuerpo.
[1288] Específicamente, se usó pHrodoRed (Life Technologies) para marcar miostatina latente humana (antígeno) según un protocolo establecido, y se formaron complejos antígeno-anticuerpo en una disolución de cultivo, siendo la concentración de anticuerpo de 10 mg/ml y siendo la concentración de antígeno de 2,5 mg/ml. La disolución de cultivo que contenía los complejos antígeno-anticuerpo se añadió a placas de cultivo de las células MDCK mencionadas anteriormente que expresan de manera constitutiva Fc gamma RIIb humano y se incubaron durante una hora, y lego se cuantificó la intensidad de fluorescencia del antígeno captado en las células usando el analizador InCell 6000 (GE healthcare). La cantidad de antígeno captada se presentó como valores relativos con respecto al valor de SG1, que se tomó como 1,00.
[1289] Los resultados de cuantificación de captación celular se resumen en la tabla 26. Se observó una fuerte fluorescencia derivada del antígeno en las células en varias variantes de Fc.
[1290] Aunque no se limita a una teoría particular, este resultado puede explicarse tal como sigue.
[1291] El antígeno y los anticuerpos añadidos a la disolución de cultivo celular forman complejos antígeno-anticuerpo en la disolución de cultivo. Los complejos antígeno-anticuerpo se unen a Fc gamma RIIb humano expresado en la membrana celular a través de la región Fc del anticuerpo, y se captan en las células de una manera dependiente del receptor. Los anticuerpos usados en este experimento se unen al antígeno de una manera dependiente del pH; por tanto, el anticuerpo puede disociarse del antígeno en los endosomas (condiciones de pH ácido) en el interior de las células. Puesto que el antígeno disociado está marcado con pHrodoRed tal como se ha descrito anteriormente, emite fluorescencia en los endosomas. Por tanto, se cree que una fuerte intensidad de fluorescencia en el interior de la célula indica que la captación de los complejos antígeno-anticuerpo en las células está teniendo lugar más rápidamente o en mayores cantidades.
[1292] Entre las variantes de Fc con aumento de pI con dos sustituciones de aminoácidos de SG1, el complejo antígenoanticuerpo producido por SG141, P1375m, P1378m, P1499m, P1524m, P1525m, P1532m, P1533m, P1540m, P1541m y P1543m muestra una captación de antígeno más fuerte en las células. Se supone que las sustituciones de aminoácidos en Q311R/D399R, Q311R/D413K, S400R/D413K, Q311R/P343R, Q311R/G341R, Q311R/G341K, Q311R/D401R, Q311R/D401K, D401R/D413K, D401K/D413K y G402K/D413K tienen un fuerte efecto de carga sobre la captación del complejo antígeno-anticuerpo en las células.
[1293] Estudio PK en ratones transgénicos para FcRn humano
[1294] Pruebain vivousando ratones transgénicos para FcRn humano
[1295] Se evaluaronin vivola eliminación de miostatina y anticuerpo anti-miostatina latente tras la coadministración de anticuerpo anti-miostatina latente y miostatina latente en ratones transgénicos para FcRn humano en los que FcRn de ratón se sustituyó por FcRn humano. Se administraron un anticuerpo anti-miostatina latente (0,1 mg/ml) y miostatina latente de ratón (0,05 mg/ml) a una dosis única de 10 ml/kg en la vena caudal en el experimento PK-2 (descrito en la figura 27). Se administraron un anticuerpo anti-miostatina latente (0,3 mg/ml), miostatina latente humana (0,05 mg/ml) e inmunoglobulina normal humana (CSL Behring AG) (100 mg/ml) a una dosis única de 10 ml/kg en la vena caudal en el experimento PK-4 (descrito en la figura 28). Se extrajo sangre a los 5 minutos, 15 min, 1 hora, 4 horas, 7 horas, 1 día, 2 días, 7 días, 14 días, 21 días, y 28 días después de la administración en el experimento PK-2. Se extrajo sangre a los 5 minutos, 1 hora, 4 horas, 7 horas, 1 día, 7 días, 14 días, 21 días, y 30 días después de la administración en el experimento PK-4. Se centrifugó la sangre extraída inmediatamente a 15.000 rpm en 4 grados C durante 5 minutos para separar el plasma. Se almacenó el plasma separado a o por debajo de -20 grados C hasta la medición. Los anticuerpos anti-miostatina latente usados fueron MS1032LO06-SG1, MS1032LO06-P1375m, MS1032LO06-P1378m, MS1032LO06-P1383m en el experimento PK-2, y MS1032LO06 P1375m, MS1032LO06-P1499m en el experimento PK-4.
[1296] Medición de la concentración de miostatina total en plasma mediante electroquimioluminiscencia (ECL)
[1297] Se midió mediante ECL la concentración de miostatina total en plasma de ratón tal como se describe en el ejemplo 28 (Ravetch PK). El transcurso temporal de la concentración de miostatina total en plasma después de la administración intravenosa de anticuerpo anti-miostatina latente y miostatina latente medido mediante este método se muestra en las figuras 27A y 28A.
[1298] Medición de la concentración de anticuerpo anti-miostatina latente en plasma mediante ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA)
[1299] Se midió la concentración de anticuerpo anti-miostatina latente en plasma de ratón mediante ELISA en el experimento PK-2. Se dispensó un fragmento de anticuerpo F(ab’)2 anti-IgG humana (específico de cadena gamma) (Sigma) en una placa Nunc-ImmunoPlate MaxiSorp (Nalge Nunc International) y se dejó en reposo durante la noche a 4 grados C para preparar placas con inmovilización de anticuerpo anti-IgG humana. Se prepararon muestras para curva de calibración que tenían concentraciones en plasma de 2,5, 1,25, 0,625, 0,313, 0,156, 0,078, y 0,039 microg/ml, y muestras de plasma de ratón diluidas 100 veces o más. Después, se dispensaron las muestras sobre las placas con inmovilización de anticuerpo anti-IgG humana, y se dejaron en reposo durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego, se añadió conjugado de anticuerpo de cabra anti-IgG humana (específico de cadena gamma)-biotina (Southern Biotech) para que reaccionasen durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego, se añadió estreptavidina-poliHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) para que reaccionasen durante una hora a temperatura ambiente, y se llevó a cabo una reacción cromogénica usando sustrato de micropocillos de HRP de un componente TMB (BioFX Laboratories) como sustrato. Después de detener la reacción con ácido sulfúrico 1 N (Showa Chemical), se midió la absorbancia a 450 nm por un lector de microplacas. Se calculó la concentración en plasma de ratón a partir de la absorbancia de la curva de calibración usando el software analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices). El transcurso temporal de la concentración de anticuerpo en plasma después de la administración intravenosa de anticuerpo anti-miostatina latente y miostatina latente medido mediante este método se muestra en la figura 27B.
[1300] Se midió la concentración de anticuerpo anti-miostatina latente en plasma de ratón mediante un sistema Gyrolab Bioaffy<™>CD (Gyros) en el experimento PK-4. Se hizo fluir anticuerpo Fc anti-IgG humana biotinilado por la columna de perlas de estreptavidina dentro de la microestructura de las CD. Se prepararon muestras para curva de calibración que tenían concentraciones en plasma de 0,5, 1, 2, 4, 8, 16, y 32 microg/ml de concentraciones en plasma de adición conocida de 5 mg/ml de inmunoglobulina normal humana (CSL Behring AG) y 200 microg/ml de miostatina latente de ratón, y muestras de plasma de ratón diluidas 25 veces o más de concentraciones en plasma de adición conocida de 200 microg/ml de miostatina latente de ratón. Luego, se añadieron las muestras en CD y se hicieron fluir por la columna de perlas. Posteriormente, se añadió anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG humana marcado con Alexa (BETHYL) a las CD y se hizo fluir por la columna de perlas. Se calculó la concentración en plasma de ratón a partir de la respuesta de la curva de calibración usando el programa Gyrolab Evaluator. El transcurso temporal de la concentración de anticuerpo en plasma después de la administración intravenosa de anticuerpo anti-miostatina latente y miostatina latente medido mediante este método se muestra en la figura 28B. Efecto del pl sobre la concentración de miostatinain vivo
[1301] Después de la administración de MS1032LO06-SG1, la concentración de miostatina total en plasma a las 7 horas disminuyó 12 veces en comparación con la concentración de miostatina total en plasma a los 5 minutos en el experimento PK-2. Por el contrario, después de la administración de MS1032LO06-P1375m, MS1032LO06-P1378m y MS1032LO06-P1383m, la concentración de miostatina total en plasma a las 7 horas disminuyó 26-67 veces en comparación con la concentración de miostatina total en plasma a los 5 minutos en el experimento PK-2. La concentración de anticuerpos de MS1032LO06-P1378m y MS1032LO06-P1383m disminuyó más de 3 veces en comparación con la de MS1032LO06-SG1, aunque la diferencia en la concentración de MS1032LO06-P1375m en cada punto de muestreo en comparación con MS1032LO06-SG1 estaba dentro de 2 veces en el experimento PK-2. Las variantes de pI que incluyen las sustituciones de aminoácidos en Q311R/D413K mostraron una mejora de la eliminación de miostatina desde el plasma sin mejora de la eliminación de anticuerpos desde el plasma.
[1302] Además, se evaluaron la concentración de miostatina total y la concentración de anticuerpos después de la administración de MS1032LO06-P1499m con la coadministración de inmunoglobulina normal humana para imitar el plasma humano. Después de la administración de MS1032LO06-P1375m y MS1032LO06-P1499m, la concentración de miostatina total en plasma a las 7 horas disminuyó 3,4 y 5,3 veces en comparación con la concentración de miostatina total en plasma a los 5 minutos, y la concentración de miostatina total y la concentración de anticuerpos en cada punto de muestreo en MS1032LO06-P1499m estaba dentro de 1,5 veces en comparación con la de MS1032LO06-P1375m en el experimento PK-4. Las variantes de pI que incluyen las sustituciones de aminoácidos en Q311R/P343R también mostraron mejora de la eliminación de miostatina desde el plasma sin mejora de la eliminación de anticuerpos desde el plasma.
[1303] Las variantes de alto pI tienen más carga positiva en plasma. Puesto que esta carga positiva interacciona con la superficie celular de carga negativa, el complejo inmunitario antígeno-anticuerpo de variantes de alto pI se acerca a la superficie celular, dando como resultado una mayor captación celular del complejo inmunitario antígenoanticuerpo de variantes de alto pI.
[1304] [EJEMPLO 31]
[1305] Sustituciones con pI aumentado en combinación con variante de Fc mejorada para Fc gamma RIIb
[1306] Se evaluó el efecto del aclaramiento de miostatina por la variante de Fc mejorada para Fc gamma RIIb en combinación con otras sustituciones de aumento de pI, en ratones transgénicos para Fc gamma RIIb humano. Se generaron ratones transgénicos para Fc gamma RIIb humano mediante microinyección de vector BAC (cromosoma artificial bacteriano) que contenía todos los exones del gen de FCGR2B humano en el pronúcleo de óvulos fertilizados de C57BL/6N mediante técnicas convencionales (véase, por ejemplo, J. Immunol., 1 de octubre de 2015; 195(7): 3198-205). Se generaron ratones deficientes en Fc gamma RIIb de ratón usando nucleasas con dedos de zinc (ZFN) que se diseñaron para dirigirse al exón 1. Los ratones con Fc gamma RIIb humanizado se establecieron mediante el cruzamiento de ratones transgénicos para Fc gamma RIIb humano con ratones Fc gamma RIIb KO de ratón. Usando este ratón, puede evaluarse el efecto de combinación de la mejora de la afinidad por Fc gamma RIIb humano y el aumento de pI en el aclaramiento del antígeno soluble.
[1307] Preparación y perfil de variantes sometidas a prueba
[1308] Los 7 anticuerpos sometidos a prueba y sus perfiles de unión se resumen en la tabla 27. La cadena pesada, MS103205H795-MY352, MS103205H795-PK55, MS103205H795-PK56, MS103205H795-PK57, se prepararon introduciendo sustituciones de aumento de pI Q311R/D413R, Q311R/P343R, Q311R/P343R/D413R, Q311R/N384R/D413R, respectivamente en MS103205H795-MY201. Todas las variantes de MS1032LO06 se expresaron con M103202L889-SK1 como cadena ligera según el método mostrado en el ejemplo 30 y se evaluaron sus afinidades por Fc gamma R humanos y decynousando el método en el ejemplo 27.
[1309] Tabla 27
[1310]
[1311] Basándose en el análisis mediante SPR resumido en la tabla 27, se confirmó que las sustituciones de aumento de pI no afectan a la unión a Fc gamma R de variantes de Fc mejoradas para Fc gamma RIIb. MY201 y MY351, que se prepararon introduciendo Q311R/D413K en MY201, muestran una unión a Fc gamma RIIb humano mejorada 6 veces y 5 veces, respectivamente. Con respecto a otros Fc gamma R humanos y decyno, muestran casi el mismo perfil de unión. De manera similar, MY352, PK55, PK56 y PK57 mostraron un perfil de unión similar con MY201 parental (tabla 27). Estos resultados indican que cualquier par de sustituciones de aumento de pI no afecta a las afinidades contra Fc gamma R humanos y decyno.
[1312] Estudio PK en ratones transgénicos para Fc gamma RIIb humano
[1313] Pruebain vivousando ratones transgénicos para Fc gamma RIIb humano
[1314] Se evaluaron la eliminación de miostatina y anticuerpo anti-miostatina latentein vivotras la coadministración de anticuerpo anti-miostatina latente y miostatina latente humana en ratones transgénicos para Fc gamma RIIb humano en los que Fc gamma RII de ratón se sustituyó por Fc gamma RIIb humano. Se administraron un anticuerpo antimiostatina latente (0,3 mg/ml) y miostatina latente (0,05 mg/ml) a una dosis única de 10 ml/kg en la vena caudal. Se extrajo sangre a los 5 minutos, 1 hora, 4 horas, 7 horas, 1 día, 7 días, 14 días, 21 días, y 28 días después de la administración. Se centrifugó la sangre extraída inmediatamente a 15.000 rpm en 4 grados C durante 5 minutos para separar el plasma. Se almacenó el plasma separado a o por debajo de -20 grados C hasta la medición. Los anticuerpos anti-miostatina latente usados fueron MS1032LO06-SG1, MS1032LO06-MY201, MS1032LO06-MY351, MS1032LO06-MY352, MS1032LO06-PK55, MS1032LO06-PK56 y MS1032LO06-PK57.
[1315] Medición de la concentración de miostatina total en plasma mediante electroquimioluminiscencia
[1316] Se midió la concentración de miostatina total en plasma de ratón mediante electroquimioluminiscencia (ECL) tal como se describe en el ejemplo 28. El transcurso temporal de la concentración de miostatina total en plasma después de la administración intravenosa de anticuerpo anti-miostatina latente y miostatina latente medido mediante este método se muestra en la figura 29.
[1317] Medición de la concentración de anticuerpo anti-miostatina latente en plasma mediante ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA)
[1318] Se midió la concentración de anticuerpo anti-miostatina latente en plasma de ratón mediante ELISA. Se dispensó el fragmento de anticuerpo F(ab’)2 anti-IgG humana (específico de cadena gamma) (Sigma) en una placa Nunc-ImmunoPlate MaxiSorp (Nalge Nunc International) y se dejó en reposo durante la noche a 4 grados C para preparar placas con inmovilización de anticuerpo anti-IgG humana. Se prepararon muestras para curva de calibración que tenían concentraciones en plasma de 2,5, 1,25, 0,625, 0,313, 0,156, 0,078, y 0,039 microg/ml, y muestras de plasma de ratón diluidas 100 veces o más. Luego, se dispensaron las muestras sobre las placas con inmovilización de anticuerpo anti-IgG humana, y se dejaron en reposo durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, se añadió conjugado de anticuerpo de cabra anti-IgG humana (específico de cadena gamma)-biotina (Southern Biotech) para que reaccionasen durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego, se añadió estreptavidina-poliHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) para que reaccionasen durante una hora a temperatura ambiente, y se llevó a cabo una reacción cromogénica usando sustrato de micropocillos de HRP de un componente TMB (BioFX Laboratories) como sustrato. Después de detener la reacción con ácido sulfúrico 1 N (Showa Chemical), se midió la absorbancia a 450 nm por un lector de microplacas. Se calculó la concentración en plasma de ratón a partir de la absorbancia de la curva de calibración usando el software analítico SOFTmax PRO (Molecular Devices). El transcurso temporal de la concentración de anticuerpo en plasma después de la administración intravenosa de anticuerpo anti-miostatina latente y miostatina latente medido mediante este método se muestra en la figura 30. Efecto del pI y la unión a Fc gamma R sobre la concentración de miostatinain vivo
[1319] Después de la administración de MS1032LO06-MY201, la concentración de miostatina total en plasma a las 7 horas disminuyó 8 veces en comparación con la concentración de miostatina total en plasma a los 5 minutos. Por el contrario, después de la administración de MS1032LO06-PK57, la concentración de miostatina total en plasma a las 7 horas disminuyó 376 veces en comparación con la concentración de miostatina total en plasma a los 5 minutos. Otras variantes de alto pI mostraron una mejora similar de la eliminación de miostatina desde el plasma. La concentración de anticuerpos de variantes de alto pI a los 28 días disminuyó 2-3 veces en comparación con la concentración de anticuerpos de MS1032LO06-SG1, y las variantes de pI mostraron una ligera mejora de la eliminación de anticuerpos desde el plasma.
[1320] Las variantes de alto pI tienen más carga positiva en plasma. Puesto que esta carga positiva interacciona con la superficie celular de carga negativa, el complejo inmunitario antígeno-anticuerpo de variantes de alto pI se acerca a la superficie celular, dando como resultado una mayor captación celular del complejo inmunitario antígenoanticuerpo de variantes de alto pI.
[1321] [EJEMPLO 32]
[1322] Desarrollo de variantes de Fc mejoradas para Fc gamma RIIb humano
[1323] Se construyeron variantes de Fc mejoradas para Fc gamma RIIb humano con región variable anti-miostatina y se evaluó su afinidad por Fc gamma R humanos. Específicamente, se construyeron variantes de Fc mejoradas para Fc gamma RIIb humano introduciendo sustituciones en MS103240H795-SG1 (VH, SEQ ID NO: 92; CH, SEQ ID NO: 9) en combinación con sustituciones T250V/T307P. Además, también se introdujeron sustituciones (Q311R/D413K o Q311R/P343R). Se expresaron las variantes usando M103202L1045-SK1 como cadena ligera y se analizó su afinidad por Fc gamma R humanos según el método mostrado en el ejemplo 34. La tabla 28 muestra el resultado del análisis cinético frente a Fc gamma R humanos y decyno. Se calcularon los valores de KD en celdas rellenas de color gris usando la [ecuación 2], ya que su afinidad era demasiado débil para determinarse correctamente mediante análisis cinético.
[1325] Todas las variantes evaluadas mostraron afinidad mejorada por Fc gamma RIIb humano y unión reducida a Fc gamma RIIaR humano, Fc gamma RIIaH, Fc gamma RIIIaV en comparación con SG1. La afinidad por el Fc gamma RIIb humano varía entre un aumento de 4,1 veces y 30,5 veces en comparación con SG1. La afinidad por el Fc gamma RIIaR humano estaba entre 0,02 veces y 0,22 veces. Las afinidades por Fc gamma RIIaH humano y Fc gamma RIIIaV humano fueron menores de 0,04 veces y 0,012 veces, respectivamente. Se reveló que las sustituciones (T250V/T307P) no afectan al perfil de unión a Fc gamma R humanos comparando las afinidades de MY009 (P238D) y MY214 (P238D/T250V/T307P). Por otro lado, ambos pares de sustituciones de aumento de pI (Q311R/D413K y Q311R/P343R) disminuyeron la afinidad de unión aproximadamente 0,5 veces en comparación con las variantes que no contienen las sustituciones de aumento de pI. Por ejemplo, aunque TT14 mostró una afinidad 30,5 veces mayor por Fc gamma RIIb humano, mostró solamente un aumento de 16,1 veces y 14,5 veces en combinación con Q311R/D413K (TT33) y Q311R/P343R (TT32), respectivamente.
[1327] Además, se introdujeron las sustituciones usadas en el ejemplo 29 para mejorar la semivida del anticuerpo y reducir la unión al factor reumatoide, en variantes de Fc mejoradas para Fc gamma RIIb humano y se analizó su afinidad frente a Fc gamma R humanos (tabla 29). En este análisis mediante SPR, se obtuvieron todos los datos usando cadena ligera kappa de anticuerpo de ratón anti-IgG humana para capturar los anticuerpos de interés. La tabla 30 muestra el resultado y se calcularon los valores de KD en celdas rellenas de color gris usando la [ecuación 2] ya que su afinidad era demasiado débil para determinarse correctamente mediante análisis cinético.
[1328] (Tabla 28)
[1329] Perfil de unión de la variante de Fc meorada ara Fc amma RIIb humano
[1330]
[1331] (Tabla 29)
[1332] Secuencias de aminoácidos de regiones constantes de cadena pesada que comprenden variantes de Fc mejoradas para Fc amma RIIb humano mostradas como SED ID NO
[1334]
[1335] (Tabla 30)
[1336] Perfil de unión de las variantes de Fc meoradas para Fc gamma RIIb humano
[1337]
[1338] Se evaluaron de nuevo SG1 y TT33 en esta medición en la que el método de captura era diferente del de la tabla 28. Como resultado, los valores de “veces de KD” de TT33 fueron compatibles con los obtenidos con la tabla 28 (16,1 veces en la tabla 28 y 15,7 veces en la tabla 30 frente a Fc gamma RIIb humano). TT92 y TT93, que se construyeron introduciendo N434A/Q438R/S440E y M428L/N434A/Y436T/Q438R/S440E en TT33, mostraron un perfil de unión comparable a TT33. De manera similar, TT90 y TT91 derivados de TT32, TT72 y TT73 derivados de TT31, TT70 y TT71 derivados de TT30, TT68 y TT69 derivados de TT21, y TT66 y TT67 derivados de TT20 muestran un perfil de unión comparable al de los anticuerpos parentales mostrados en la tabla 28. Estos resultados indican que las sustituciones para mejorar la semivida del anticuerpo y reducir la unión al factor reumatoide no afectan al perfil de unión a variantes mejoradas para Fc gamma RIIb humano frente a Fc gamma R humanos.
[1339] [EJEMPLO 33]
[1340] Análisis mediante obtención de imágenes celulares de variantes de Fc mejoradas para Fc gamma RIIb
[1341] Para evaluar la captación intracelular del complejo antígeno-anticuerpo formado por el anticuerpo descrito en el ejemplo 32, se realizó el ensayo de obtención de imágenes celulares descrito en el ejemplo 30. Para evitar la saturación de señal, se formaron los complejos antígeno-anticuerpo en una disolución de cultivo siendo la concentración de anticuerpo de 1,25 mg/ml y siendo la concentración de antígeno de 0,34 mg/ml en este ejemplo. Se muestran los resultados de ensayo en la figura 31. Aumentando la afinidad de unión a Fc gamma RIIb humano, se aumentó la captación celular del complejo antígeno-anticuerpo. En el caso de TT14, que tiene una afinidad de unión mejorada 30 veces por Fc gamma RIIb humano en comparación con SG1, la intensidad fluorescente del antígeno en el interior de las células aumentó 7,5 veces la de SG1.
[1342] Aunque las sustituciones de aumento de pI (Q311R/D413K y Q311R/P343R) disminuyeron la afinidad de unión a Fc gamma RIIb humano aproximadamente 0,5 veces en comparación con las variantes que no contienen las sustituciones de aumento de pI, aumentó la captación celular del complejo antígeno-anticuerpo de variantes de Fc con sustituciones con aumento de pI en comparación con variantes de Fc sin sustituciones con aumento de pI. TT33 muestra un aumento de 36 veces de la captación de anticuerpo antigénico en las células en comparación con SG1, mientras que su TT14 parental muestra un aumento de 7,5 veces en la captación celular. Además, TT33 muestra una captación celular comparable del complejo antígeno-anticuerpo en las células en comparación con SG1071, SG1074, SG1077, SG1079, SG1080 y SG1081, que muestra un fuerte barrido en macaco cangrejero. Estos resultados sugieren que la combinación de sustituciones con aumento de pI con variantes de Fc mejoradas para Fc gamma RIIb es la herramienta poderosa para el barrido de antígenos.
[1343] [EJEMPLO 34]
[1344] Construcción de vectores de expresión de anticuerpos; y expresión y purificación de anticuerpos
[1345] Se llevó a cabo la síntesis de genes de longitud completa que codifican para las secuencias de nucleótidos de la cadena H y la cadena L de las regiones variables de anticuerpo mediante métodos de producción conocidos por los expertos en la técnica usando PCR de ensamblaje y similares. La introducción de sustituciones de aminoácidos se llevó a cabo mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica usando PCR o similares. El fragmento de plásmido obtenido se insertó en un vector de expresión de células animales, y se produjeron el vector de expresión de la cadena H y el vector de expresión de la cadena L. Se determinó la secuencia de nucleótidos del vector de expresión obtenido mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Se introdujeron los plásmidos producidos de manera transitoria en la línea celular HEK293H derivada de células de cáncer de riñón embrionario humano (Invitrogen) o en células FreeStyle293 (Invitrogen) para la expresión de anticuerpos. Se recogió el sobrenadante de cultivo obtenido y después se hizo pasar a través de un filtro MILLEX(R)-GV de 0,22 microm (Millipore), o a través de un filtro MILLEX(R)-GV de 0,45 microm (Millipore) para obtener el sobrenadante de cultivo. Se purificaron los anticuerpos del sobrenadante de cultivo obtenido mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica usando rProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) o Protein G Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare). Para la concentración de los anticuerpos purificados, se midió su absorbancia a 280 nm usando un espectrofotómetro. A partir del valor obtenido, se usó el coeficiente de extinción calculado mediante los métodos tales como PACE para calcular la concentración de anticuerpo (Protein Sci.4:2411-2423 (1995)).
[1346] Aunque la invención anterior se ha descrito con algún detalle a modo de ilustración y ejemplo con fines de claridad de comprensión, las descripciones y ejemplos no deben interpretarse como limitativos del alcance de la invención que se expone en el juego adjunto de reivindicaciones.

Claims (2)

1. REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo que se une a miostatina latente e inhibe la activación de miostatina, en el que el anticuerpo comprende:
(a) una secuencia de VH de SEQ ID NO: 86 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 96; o
(b) una secuencia de VH de SEQ ID NO: 87 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 96; o
(c) una secuencia de VH de SEQ ID NO: 88 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 96; o
(d) una secuencia de VH de SEQ ID NO: 89 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 96; o
(e) una secuencia de VH de SEQ ID NO: 90 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 96; o
(f) una secuencia de VH de SEQ ID NO: 91 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 96; o
(g) una secuencia de VH de SEQ ID NO: 92 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 97; o
(h) una secuencia de VH de SEQ ID NO: 93 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 97; o
(i) una secuencia de VH de SEQ ID NO: 94 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 97; o
(j) una secuencia de VH de SEQ ID NO: 95 y una secuencia de VL de SEQ ID NO: 97,
y en el que el anticuerpo es para su uso en el tratamiento de una enfermedad de desgaste muscular.
2. El anticuerpo para su uso según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo IgG de longitud completa.
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