FI104363B

FI104363B - Immunosuppressanttien ja interferonien farmakologisten keskinäisten vaikutusten parantaminen lisäaineilla

Info

Publication number: FI104363B
Application number: FI972121A
Authority: FI
Inventors: Timo Kalevi Korpela; Vladimir Petrovich Zavialov; Raisa Nikolaevna Vasilenko; Dmitry Aleksandrovich Dolgikh; Mikhail Petrovich Kirpichnikov; Elena Vitalievna Navolotskaya
Original assignee: Timo Kalevi Korpela; Vladimir Petrovich Zavialov; Raisa Nikolaevna Vasilenko; Dmitry Aleksandrovich Dolgikh; Mikhail Petrovich Kirpichnikov; Elena Vitalievna Navolotskaya
Priority date: 1997-05-19
Filing date: 1997-05-19
Publication date: 2000-01-14
Also published as: FI972121L; ATE234624T1; FI972121A0; EP0981359A1; DE69812347T2; WO1998052594A1; EP0981359B1; DE69812347D1; AU7435298A; DE69812347T9; JP2001526675A

Description

” 5 104363

IMMUNOSUPPRESSANTTIEN JA INTERFERONIEN FARMAKOLOGISTEN KESKINÄISTEN VAIKUTUSTEN PARANTAMINEN LISÄAINEILLA

KEKSINNÖN ALUE

Keksintö käsittelee ihmisten ja eläinten lääkkeitä ja erityisesti tavallisten immunosupressanttien, anti-inflammatoristen ja/tai antiparasiittisten aineiden 10 terapeuttisten vaikutusten lisäämistä, joissa lääkkeissä vaikuttavana aineena on syklosporiineja, FK506 tai rapamysiini. Samoin tavallisten antiproliferatiivisten lääkkeiden farmaseuttista aktiivisuutta voidaan lisätä keksinnön mukaisesti lääkkeissä, jotka sisältävät tyypin I interferoneita (interferonit οί,β,ω jax). Keksintö kuvailee uusia molekyylejä, joiden avulla voidaan tehokkaasti vahvistaa edellämainittujen komponenttien 15 aktiivisuutta niin, että niiden terapeuttista annosta voidaan laskea ja toisaalta voidaan välttää niiden sivuvaikutuksia.

KEKSINNÖN TAUSTA

20 Syklosporiinit ovat rengasmaisia peptidejä, jotka koostuvat 11 aminohappotähteestä sisältäen ennestään tuntemattomia N-metyloituja aminohappotähteitä. Syklosporiinit ovat kaupallisesti tärkeitä tuotteita, joita eristetään Tolypocladium - homeen kasvatusliuoksista.

Syklosporiineja käytetään allogeenisten siirrännäisten, kuten iho, munuainen, haima, ; ·. luuydin, ohutsuoli j a kehko, eliniän pidentämiseen.

!·:·. 25 • * ·

Syklosporiinien tehokkuuden tiedetään nykyisin johtuvan spesifisestä ja palautuvasta immunokompetenttien solujen, etupäässä T-auttajasolujen, inhibitiosta. Valitettavasti syklosporiinien laajamittaisen käytön esteenä on usein esiintyvät munuaismyrkytykset :·, (munuaisen vajaatoiminta), maksamyrkytykset, lisääntynyt lymfoidisten solujen • · · 30 syöpäriski, sekä lisääntyneet satunnaiset infektiot. Syklosporiinien sivuvaikutukset ovat * ♦ niin ankarat ja niin yleiset, että ne rajoittavat syklosporiinien käyttöä vakavien elämää ja • · · .. näköä uhkaavien sairauksien hoidossa.

• * • · • « *

Syklosporiinit, kuten FK506 ja muut vastaavat molekyylit, sitoutuvat spesifisesti tiettyihin 104363 2 fysiologisesti tärkeisiin kudosten ja verenkierron molekyylilajeihin (Denesyuk A. et ai., 1993, Biochem. Biophys. Res. Commun. 197, pp. 1438-1442; Denesyuk A. et ai., 1993, Biochem. Biophys. Res. Commun. 194, pp. 280-286; Denesyuk A. et ai., 1993, Biochem. Biophys. Res. Commun. 192, pp. 912-917). Syklosporiini A:n identifioinnin jälkeen on 5 kuvattu muita syklosporiineja B,C,D ja G, joissa on pieniä eroja molekyylirakenteessa. Monilla näistä syklosporiineista on syklosporiini A:n kaltaista farmaseuttista käyttöä ja kirjallisuudessa on runsaasti esimerkkejä ja ehdotuksia niiden käyttämisestä terapeuttisina aineina.

10 Syklosporiineja ehdotettiin ensin käytettäväksi antifixngaalisina aineina, mutta niiden immunosupressiivinen vaikutus huomattiin olevan tärkeämpi. Syklosporiinit inhiboivat spesifisesti ja palautuvasti immunokompetentteja soluja, etupäässä T-auttajasoluja, käyttäen spesifistä vuorovaikutusta peptidyyli-prolyyli cis-trans isomeraasin kanssa (PPIase; kts. Schreiber S. ja Crabtree G., 1992, Immunol. Today 13, pp. 136-142; 15 Zav'yalov V. et ai., 1995, Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. 103, pp. 401-415).

Nämä monitoimiset PPIase-proteiinit saattavat myös toimia ATP-riippumattomina molekulaarisina saperoniineina (chaperones) auttaen kohdeproteiinien fouldautumisessa (folding) ja moniyksikköisten proteiinikompleksien muodostumisessa (Schmid F. et ai., 1993, Adv. Protein Chem. 46, pp. 25-65), mutta niiden pääfunktio on 2 0 immunosuppressiivisten lääkkeiden, syklosporiini A, FK506 ja rapamysiini, sitomisessa.

Tällaisia PPIaseja nimitetään immunofiliineiksi (ImP). Nämä proteiinireseptorit jakaantuvat niiden rakenteen perusteella kahteen pääluokkaan: syklosporiineja sitovat proteiinin, joita myös kutsutaan syklofiliineiksi (CyP) ja FK506:tta sitoviin proteiineihin, • · : *·· joita kusutaan FKBP.iksi, joista jälkimmäiset mieluiten sitovat rapamysiiniä (Trandini C. ··« V : 2 5 et ai., 1992, FASEB J. 6, pp. 3410-3420; Liu J., 1993, Immunol. Today 14, pp. 290-295).

•s.

On havaittu, että Ca - ja kalmoduliiniriippuvaiset proteiinifosfataasit, kalsineuriinit • · « (CäN), sitoutuvat voimakkaasti ImP-lääke kompleksiin. Kokeelliset tulokset viittaavat « « » *\ * siihen, että sytoplasminen NF-AT proteiini (NF-ATc) on joko suora tai epäsuora ·· : *·· substraatti fosfaattikaskadin kautta CaN:lle. NF-AT on monimutkainen proteiini, joka • · · • * _ 30 muodostuu ainakin kahdesta alayksiköstä. Yksi NF-AT:n alayksikkö (NF-ATp; DNA:ta : : : sitova fosfoproteiini) on CaN:n substraatti in vitro ja on vuorovaikutuksessa Fos ja Jun • · · proteiinien kanssa aktivoitujen T-solujen tumassa (Jain J. et ai., 1993, Nature 365, pp. 352-355). Defosforylaatio CaN:n avulla saattaa suoraan indusoida NF-ATc :n 104363 3 kulkeutumisen solukalvon läpi (translokaatio). Tämän proteiinin aktiivinen muoto on vuorovaikutuksessa IL-2 voimistajamolekyylin toiminnallisten sekvenssien kanssa. Erään hypoteesin mukaan syklosporiini-A - CyP tai FK506-FKBP-12 katkaisevat NF-ATc:n tumallisen translokaation ja IL-2:n aktivoiman geenien ilmentämisen johtuen CaN:n 5 aktiivisuuden estosta.

Syklosporiinien immunosuppressiiviset ominaisuudet ovat johtaneet niiden laajaan rutiininomaiseen käyttöön immuunijärjestelmään liittyvien tautien hoidossa kuten on kuvattu esimerkiksi suomalaisessa patenttijulkaisussa 900604. Tästä syystä myös 10 patenttien lukumäärä näihin tarkoituksiin on suuri. Lisäksi silmälääketiede on hyötynyt syklosporiineista. Mm. U.S. Patent No. 4, 649, 047 kuvaa menetelmän eräiden silmäsairauksien (phacoanaphylactic endophthalmitis ja uveitis) silmän anterior- tai posteriorsegmentissä, joihin kohdennettiin syklosporiinia tarpeen mukaan.

15 Toisissa silmälääketieteen sovellutuksissa syklosporiinia on käytetty vain silmäsairauksien ulkoiseen käsittelyyn (komea). BenEzra et ai., 1986, Amer. J. Ophthlmol. 101, pp. 278-282 kuvasivat 2% syklosporiinia sisältävien silmätippojen vaikutuksen vaikeaan keväiseen kerakonjuktivitiseen. Se on vuodenaikaan sidottu allerginen häiriö, joka ei johdu kyynelnesteen puutteesta. Hunter et ai., 1981, Clin. Exp. Immunol. 45, pp. 173-177 ':": 20 kuvailivat kanimallilla syklosporiinin positiivisia tuloksia komeaalisiirrännäisillä. Boisjoly ', ‘ ' et ai., 1984, Arch. Ophthalmol. 102, pp. 1804-1807 esittivät syklosporiinin kohdennetusta käytöstä hyviä tuloksia estettäessä vaikeaa herpes-viruksen aiheuttamaa silmänesteen ; samentumaa. Mosteller et ai., käsittelivät 1994 julkaisussa Investigative Ophthalmol.

I t • · : *· Supp. 25, pp. 3-38, komeaalisten siirrännäisten hylkimisreaktioita kaneilla käyttäen ·«» • · * ·* * 25 yksittäistä annosta 10% syklosporiini A voidetta alaluomen alla. Syklosporiineja on myös käytetty systeemisesti muissa silmälääketieteen sovellutuksissa, joissa hoidettava tauti ei • · · ole rajoittunut silmän pintaan. Esimerkiksi Nussenblatt et ai., 1983, Amer. J. Ophthalmol.

• » ·

I I I

t *, 96, pp. 275-282 raportoi kliinisen parannuksen joillakin potilailla, joilla oli ei- • · • · ί * * infektiivmen posteriaalinen uveitis, kun käytetettiin systeemistä käsittelyä syklosporiinilla.

• « · :·.·! 30 9 · · v · Syklosporiineita käytetään oraalisesti tai injektioina. Valitettavasti systeemisesti » 11 käytettävät syklosporiinit johtavat suureen todennäköisyyteen saada munuasimyrkytys (munuaisten toimintahäiriö), joissakin tapauksissa maksamyrkytys, tai muihin vakaviin 104363 4 häiriöihin. Syklosporiinit ovat vain hieman vähemmän toksisia kuin eräät toiset immunosuppressiiviset aineet kuten sytoksaani tai atsiotiotropiini. Syklosporiinien systeemiset sivuvaikutukset ovat niin ankaria ja niin tavallisia että ne rajoittavat syklosporiinien käyttöä.

5

Kuten U.S. Patent No. 4, 117, 118 1978 (Harri et ai.) kuvailee, sykslosporiini on helposti liukeneva useimpiin tavallisiin orgaanisiin liuottimiin mutta käytännössä liukenematon petrolieetteriin ja veteen. Heikko syklosporiinien liukoisuus tekee niiden imeytymisen suolistossa oraalisesti nautittavilla lääkkeillä samoin kuin suonensisäisten lääkkeiden 10 kohdalla vaihtelevaksi eri potilailla. Jos melko korkeat ja vakioiset tasot syklosporiineja vaaditaan verenkierrossa, syklosporiinien annostelu on vaikeaa. Sandoz Ltd. valmistaa syklosporiinia kauppanimellä Sandimmune. Oraalinen lääke on liuotettuna oliiviöljyyn mikä laimenee edelleen ruoan kanssa. Suonensisäinen syklosporiini on liuotettu paksuun polyoksietyloituun öljyyn ja etanoliin. Syklosporiinien vapautuminen kantaja-aineista on 15 potilaasta riippuvaista ja usein joko annos ei ole terapeuttisesti vaikuttava tai se on toksinen. Kuten on aiemmin mainittu, pitkitetty systeeminen syklosporiinien käyttö esimerkiksi elintensiirtojen yhteydessä luo riskejä muille sairauksille, kuten syöville. Mahdollisuus käyttää huomattavasti alempia kuin toksisia syklosporiinin annoksia on siksi erittäin tärkeää.

-:-:20

Pitkään laiminlyötyjen tyypin I interferonien (IFN-α,β,ω ja?) mahdollisuuksiin '' immuunisysteemin säätelyssä on hiljattain kiinnitetty huomiota (Belardelli F. and Gresser I., 1996, Immunol. Today 17, pp. 369-372). Interferonien IFN-α,β,ω ja τ « · • · ’ ** immunomodulatiivinen aktiivisuus on hyvin mutkikas ja käsittää: • I) « · · ··’ · 25 - lymfosyyttien lisääntymisen inhibitio lektiinien tai allogeenisten solujen stimulaation • f * jälkeen; • · · • · · - ihosiirrännäisten eliniän pidentymisen; • * • · ί ** - pitkittyneen tyypin hypersensitiivisyys;

« I I « V

30 -erilaistuminenkohtiTh 1-tyypinimmuuniresponsia; V * - pitkäikäisen antigeenispesifisen muistin stimulaatio CD8+ solujen sytotoksisuudelle t » in vivo·, . - supressori T-soluj en inhibitio; i 104363 5 - luonnollisten tappajasolujen (NK) sytotoksisuuden lisääntyminen; - päähistokompatibiliteettikompleksin (MHC) luokan I antigeenien ilmentymisen lisääntyminen.

5 Ensimmäiset kolme tyypin I interferonien immunomodulaatio-ominaisuuksista (lymfosyyttien lisääntymisen inhibitio lektiinien tai allogeenisten solujen stimulaation jälkeen, ihosiirrännäisten eliniän pidentymisen ja pitkittyneen tyypin hypersensitiivisyys) voivat olla hyödyllisiä immunosuppressanttien (syklosporiinit, FK506 ja rapamysiini) vaikutusten lisäämisessä. Kuitenkin on huomattavaa, että muut immunomodulaatio-10 ominaisuudet (erilaistuminen kohti Thl-tyypin immuuniresponsia, pitkäikäisen antigeenispesifisen muistin stimulaatio CD8+ solujen sytotoksisuudelle in vivo, supressori T-solujen inhibitio, luonnollisten tappajasolujen (NK) sytotoksisuuden lisääntyminen, ja päähistokompatibiliteettikompleksin (MHC) luokan I antigeenien ilmentymisen lisääntyminen) voivat indusoida vastakkaisen ilmiön. Havaittiin, että monoklonaalinen 15 vasta-aine, joka oli tehty ihmisen (h)DFN-a reseptorin solun ulkoista osaa vastaan, mikä inhiboi sekä kaikkien tyypin I IFNiien sitoutumista että biologista aktiivisuutta, aiheutti annoksesta riippumattoman yleisen lymfosyyttireaktion ja indusoi ihosiirrännäisten pysyvyyden erilaisissa MHC Cynomologus apinoissa, jotka oli käsitelty alimitoitetuilla syklosporiini A:n annoksilla (Tovey, M.G. et ai, 1996, J. Leukocyte Biol. 59, pp. 512-____; 20 517).

• t

I I I I ( I

.,.,; Tämän keksinnön mukaisesti havaittiin yllättäen, että immunosuppressanttien ;. t! (syklosporiinit, FK506 ja rapamysiini) ja tyypin I interferonien fysiologiset vaikutukset • » voivat dramaattisesti lisääntyä toinen toisiaan vahvistaen, jos samanaikaisesti annetaan 25 potilaalle mitä tahansa näistä immunosupressanteista yhdessä tyypin I interferonien (interferonit α,β,ω jät) kanssa, tai peptidien kanssa, joiden rakenne muistuttaa • « « : voimakkaasti sitovaa/antilymfoproliferatiivista/immunomudulatiivista interferonien α, β,ω * * * V * jät kohtaa, tai muistuttaa rekombinanttiproteiineja, joilla on sanotun peptidin kohdalle • ’·.. vastaava aminohappojärjestys.

30 • * ♦

Kauan sitten havaittiin että hIFNs-a/P:lla ja kateenkorvan hormonilla, tymosiini- otella (TMoii) on primaarirakenteen homologiaa (Zav'yalov V. ja Denesyuk A., 1984, Doklady

• I

Akademii Nauk SSSR 275, pp. 242-246). Primaarirakenteen vertailu proTMof ja hIFNs- 104363 6 α/β välillä paljastaa homologian prohormonien ja niiden IFN:ien kohtien välillä, jotka muodostavat C-terminaaliset kierteet D ja E. Kuitenkin suurin homologia havaitaan C-terminaalisen osan kierteen D ja rakenneosan silmukan DE välillä (Zav'yalov V. et ai., 1989, Immun. Lett. 22, pp. 173-182; Zav'yalov V. et ai., 1990, Biochim. Biophys. Acta 5 1041, pp. 178-185). On oletettavaa, että tämä kohta mnolekyyliä vastaa IFN-«/P:n immunomodulatiivista kohtaa. Eräs syntetisoiduista peptideistä (α-peptoferoni), joka on päällekkäinen hIFN-«2:n TM«i-kaltaisen sekvenssin kanssa, kilpaili tehokkaasti hIFN-oi2, TM«i ja proTM«:n kanssa yhteisestä reseptorista hiiren tymosyyttien pinnalla m (rekombinantti (r)hIFN-a2:n sitoutumisen Ki a-peptoferonilla on noin 101 M; Zav'yalov 10 V. et ai., 1991, FEBS Lett. 278, pp. 187-189; Zav'yalov V. et ai., 1995, Molec. Immun. 32, pp. 425-431). Hiljattain raportoitiin ensimmäiset onnistuneet tulokset MFN-a2:n TM«i- kaltaisen immunomodulatiivisen kohdan konstruoimiseksi, jolloin saatiin de novo - proteiini, albeferoni (Dolgikh D. et ai., 1996, Protein Engin. 9, pp. 195-201). IFN-a2 - fragmentti, joka vastasi TM«i- kaltaista sekvenssiä 130-137, insertoitiin heti aloittavan 15 Met tähteen jälkeen. Kimeerinen proteiini (albeferoni) ilmennettiin vehnän idun soluttamalla translaatiosysteemillä ja tutkittiin rakenteen ja stabiilisuuden suhteen.

Osoitettiin, että albeferoni on käytännöllisesti katsoen yhtä kompakti kuin luonnon proteiinit, joilla on vastaava molekyylimassa. Albeferoni oli myös hyvin stabiili urean indusoimaa denaturoitumista vastaan. Testattaessa albeferonin affiniteettia jyrsijöiden 2 0 tymosyyttireseptoria kohtaan, merkatun [ I] a-peptoferoniproteiinin sitoutuminsen : inhibitorinen vaikutus määritettiin. Albeferonin kompetitiivinen sitoutumisvakio (IC50) ja , laskettu inhibitiovakio (Ki) ovat hyvin lähellä rhEFN-o(2:n vastaavia arvoja. Osoitettiin että solun pinnan sitoutumisen luonteenpiirteet olivat vastaavia konsensustyypin I IFN:n I 1.· aiheuttamalle antilymfoproliferatiiviselle aktiivisuudelle, kun käytettiin ihmisen • · 1 v · 2 5 polymorfonukleaarisia soluja (Klein S. et ai., 1996, J. Interferon and Cytokine Res. 16, pp.

1-6; Dhib-Jalbut S. et ai., 1996, J. Interferon and Cytokine Res. 16, pp. 195-200).

Ml • · · • · · · · • · · V · Tämä keksintö sisältää uusia yhdistelmiä molekyyleistä niin, että voidaan vahvistaa : syklosporiinien, FK506:n ja rapamysiinin immunosuppressiivista aktiivisuutta ja toisaalta 30 vahvistaa interferonien antiproliferatiivista aktiivisuutta immunosupressanteilla. Tällöin : ’ · ’: voidaan välttää kummankin bioaktiivisten aineiden ryhmän ei-toivottuja sivuvaikutuksia.

• · • · -7 : 104363

PIIRROSTEN LYHYT KUVAUS

Kuva 1. rhIFN-«2:n ja peptidin, joka on komplementaarinen hIFN-a2:n (a-peptoferonin) korkea-affiinista/antiproliferatiivista/immunomodulatiivista kohtaa vastaan, vaikutus 5 mitogeeniseen (PHA)-indusoituun ihmisen periferisten polymorfonukleaaristen solujen proliferaatioon.

Kuva 2. rhIFN-«2:n ja peptidin, joka on komplementaarinen hIFN-Oi2:n (a-peptoferonin) korkeaffiinista/antiproliferatiivista/immunomodulatiivista kohtaa vastaan, vaikutus IFN-10 sensitiivisten ihmisen lymfoblatomasolulinj an 4 soluj en proliferaatioon.

Kuva 3. rhIFN-a2:n, albeferonin and albebetinin vaikutus mitogeeniseen (PHA)-indusoituun ihmisen polymorfonukleaaristen solujen proliferaatioon.

15 Kuva 4. rhIFN-«2:n, albeferonin ja albebetinin vaikutus IFN-sensitiivisten ihmisen T-lymfoblastomasolulinjan MT-4:n solujen proliferaatioon.

Kuva 5. rhIFN-oi2:n ja peptidin, joka on komplementaarinen hIFN-cx2:n («-peptoferonin) korkea-affiinista/antiproliferatiivista/immunomodulatiivista kohtaa vastaan, vaikutus 20 mitogeeniseen (PHA)-indusoituun ihmisen periferisten polymorfonukleaaristen solujen proliferaatioon 20 μΜ syklosporiini A:n läsnäollessa kasvatusmediumissa.

Kuva 6. Albeferonin vaikutus mitogeeniseen (PHA)-indusoituun ihmisen periferisten polymorfonukleaaristen solujen proliferaatioon 10 μΜ syklosporiini A:n läsnäollessa :T: 25 kasvatusmediumissa.

KEKSINNÖN YKSITYISKOHTAINEN KUVAUS

• · · • · «

• I I

»

Syklosporiineita, FK506:a ja rapamysiiniä käytetään laajasti kaupallisesti tärkeissä ’ : ] : 30 lääkkeissä, joilla hoidetaan erilaisia ihmisen ja korkeampien eläinten tauteja. Näillä lääkkeillä on kuitenkin vakavia haittoja johtuen niiden toksisuudesta ja kapeasta vaikuttavasta annostelualueesta. Tämä aiheuttaa sen, että on tarve kehittää muita tehokkaampia ja vähemmän toksisia vastaavia lääkkeitä tai parantaa sanottujen lääkkeiden 104363 8 aktiivisuutta muilla lisäaineilla. Tehokkuutta on yritetty parantaa tekemällä sanotuista vaikuttavista aineista formulaatioita, jotka absorboituvat täydellisemmin suolistosta tai formulaatteja, joilla on pitempi absorptioaika suolistosta, tai pitempi vaikutusaika suonensisäisesti annosteltuna.

5 Tämän keksinnön mukaisesti havaittiin yllättäen, että tietyt suotuisat syklosporiinien, FK506:n ja rapamysiinin fysiologiset vaikutukset voidaan vahvistaa tyypin I interferoneilla (IFNs-α,β,ω,τ), tai biologisesti aktiivisilla peptideillä tai vastaavilla rekombinanttiproteiineilla, jotka kiinnittyvät korkea-affiiniseen/antiproliferatiiviseen/ 10 immunomodulatiiviseen IFNs-α,β,ω,τ -kohtaan. Vastaavasti, tyypin I interferonien antiproliferatiivinen aktiivisuus tai sanottujen peptidien tai rekombinanttiproteiinien voidaan vahvistaa sanotuilla immunomodulaattorien avulla. Luonnollisia tai rekombinatteja tyypin I interferoneita tuotetaan lisäksi kaupallisena ja tämän keksinnön mukaiset peptidit tai rekombinanttiproteiinit voidaan tuottaa kaupallisesti synteettisesti tai 15 rekombinanttitekniikoilla. Tämä keksintö antaa selvän parannuksen ihmisille ja korkeammille eläimille tarkoitettuihin lääkeaineisiin, jotka perustuvat syklosporiineihin, FK506:een tai rapamysiiniin ja interferoneihin tai biologisesti aktiivisiin peptideihin. Keksinnön mukaiset kompositiot sisältävät sanottuja immunomodulaattoreita ja biologisesti aktiivisia peptidejä tai vastaavia rekombinanttiproteiineja, jotka ovat 20 komplementaarisia korkea-affiiniselle/antiproliferatiiviselle/immunomodulatiiviselle IFNs-α,β,ω,τ -kohdalle. Vaikkei ollut mahdollista kokeellisesti testata kaikkia tälle kohdalle vastaavia potentiaalisia rekombinatti-interferoneita tai bioaktiivisia peptidejä, joita voidaan käyttää immunomodulatiivisten lääkkeiden (syklosporiinit, FK506 ja

• I

rapamysiini) kanssa, peptidien rakenteet selvitettiin laajalla uudenaikaiseen ϊ.Γ: 25 molekyylimallitukseen perustuvalla tekniikalla, missä verrattiin eri eliölajeista peräisin olevien interferonien saatavissa olleet aminohappojäqestykset. Ottaen huomioon nämä • · · V · tulokset, ja eräät kokeelliset tulokset, voitiin paikantaa ΙΡΝ-α,β,ω,τ^βη korkea- ··· ’.* * afFiininen/antilymfoproliferatiivinen/immunomodulatiivinen sitoutumiskohta. Lisäksi m käytettiin hyväksi kokeellisia tietoja tyypin I IFN:ien kilpailusta sitoutua tavallisiin : ": 30 reseptoreihin.

• · · • · * • « ·

Aikaisemmin tehdyissä tutkimuksissa (Zav'yalov V. et ai., 1991, FEBS Lett. 278, pp. 187- • * · 189; Zav'yalov V. et ai., 1995, Molec. humun. 32, pp. 425-431) osoitettiin, että 104363 9 oktapeptidi vastaten aminohappotähteitä 130-137 hIFN-öi2:n aminohappojäqestyksessä omasi saman tai korkeamman affiniteetin spesifiseen reseptoriin verrattuna rekombinatti hIFN-«2:een. On ennestään tunnettua, että kaikki tyypin I IFN:t kilpailevat yhteisestä reseptorista ja voivat indusoida yhteisen tyypin I IFN-aktiivisuuksista. Siksi on perusteltua 5 väittää, että luonnon valinnan prosessissa muutokset IFN-a,P,co5T;ien korkea- affiinisen/antilymfoproliferatiisen/immunomodulatiivisen kohdan aminohappojäijestyksessä tapahtuivat niin, ettei kohdan biologinen aktiivisuus vähentynyt. Näin ollen kaikki tyypin I luonnolliset ja mahdolliset rekombinantti-IFN:t yhtä hyvin kuin peptidit sanottua kohtaa vastaan voivat saada aikaan antiproliferatiivisen aktiivisuuden ja siten 10 vahvistaa immunosuppressiivisen vaikutuksen. Vastaavasti, syklosporiinit, FK506 ja rapamysiini vahvistavat tyypin I interferonien (ja yllämainittujen analogien) anti-proliferatiivista aktiivisuutta.

Testattaessa syklosporiinien, FK506 ja rapamysiinin synergiaa tyypin I interferonien tai 15 sanottujen biologisesti aktiivisten peptidien, tai tiettyjä sekvenssejä omaavien rekombinanttiproteiinien kanssa, käytettiin klassista antilymfoproliferatiivisuuden testisysteemiä käyttäen ihmisen periferisiä polymorfonukleaarisia soluja tai ihmisen T-lymfoblastomasolulinjaa MT-4. Soluviljelyolosuhteet muistuttavat läheisesti humoraalisten solujen olosuhteita verenkierrossa, ja itse asiassa soluviljelyssä, jota , 20 käytetään yleisesti testattessa potentiaalisia lääkeaineita, olosuhteet pidetään tarkkaan samanlaisina kuin on verenkierrossa lämpötilan, pH:n, puskurin, mineraalien, CCh:n ja 02:n osapaineiden ym. suhteen. Toisaalta tässä erikoistapauksessa tutkitut biologisesti ; vaikuttavat aineet esiintyvät spesifisesti verenkierrossa hyvin samantapaisesti kuin on käytetyssä testisysteemissä. Näin ollen on erittäin todennäköistä, että keksinnön mukaiset :T: 25 lääkeyhdistelmät toimivat tarkoituksissa, joissa on ennen käytetty sanottuja immunosupresantteja tai tyypin I interferoneita yksinään aktiivisina komponentteina.

• · · • · » • · · • · · . v * Vaikka keksintö kuvaa pääasiassa tyypin I interferonin vaikutuksia syklosporiinien, FK506:n ja rapamysiinin kanssa, on ilmeistä teoreettisista syistä jotka on esitetty 30 keksinnön edellä, että sama vaikutus saadaan minkä tahansa muun immunosupressantin

kanssa. Samoin voidaan päätellä, että mikä tahansa immunosuppressantti lisää tyypin I

. ·1 ’. interferonein aktiivisuutta.

• « • * · ίο 104363

Esimerkki 1.

Yhdeksänkymmentäviisi mL:aa verta otettiin 10:stä vapaaehtoisesta luovuttajasta ja 5 mL

3-5% EDTA lisättiin vereen heti ja sekoitettiin huolellisesti koagulaation estämiseksi. Veri 5 sekoitettiin yhtäläisen tilavuuden kanssa mediumia 199 tai puskuroidun fysiologisen suolaliuksen kanssa. Ficoll-Paquera (Pharmacia) kaadettiin muovisiin sentrifogiputkiin (Costar), joissa oli korkit (3 mL Ficoll-Pague / putki, koeputken tilavuus 15 mL, läpimitta 13 mm, huoneen lämpötila; sitten 6-7 mL laimennettua verta kerrostettiin päälle).

Koeputket sentrifiigoitiin 20 °C:ssa 40 minuuuttia 400 g:llä niin että sentrifugin jarru oli 10 kytketty pois päältä. Mononukleaariset solut muodostivat kerroksen kerrosten rajapinnalle, josta solut kerättiin Pasteur-pipetillä sentrifugiputkiin, joissa oli 5 mL RPMI 1640 sisältäen 2 % inaktivoitua fetaaliseerumia, penisilliiniä (100 yksikköä/mL) ja streptomysiiniä (100 yksikköä/ mL). Sitten solut pestiin fysiologisella puskuriliuoksella (PBS) kolme kertaa välillä sentrifugoiden (400 g, 5 minuuttia +8 °C:ssa). Kun solujen 15 väkevyys oli 2,5x106 solua/mL, ne pantiin RPMI 1640 mediumiin sisältäen 5 % fetaaliseerumia (kuumennettu 30 minuuttia +56 °C:ssa), 100 yksikköä/mL penisilliiniä, 100 yksikköä/mL streptomysiiniä, 1 mL 200 mM L-glutamiinia 100 mL:aa kohti seerumia. Kaikki reagenssit olivat Gibcolta. Solut pipetoitiin 96 kaivon kuoppalevyille (100 μΐ/ kaivo) joihin oli etukäteen pipetoitu mitogen-hemaglutiniinia (PHA; lopullinen 20 konsentraatio 2 pg/ml), tutkittavaa preparaattia ja immunosupressantteja (syklosporiini A, FK506 tai rapamysiini konsentraationa 5-20 μΜ). Levyt asetettiin 72 tunniksi CO2- .; inkubaattoriin, jossa oli 5 % CC>2:a kostutetussa ilmassa. 12-18 tuntia ennen inkuboinnin ;' ,; loppua 1 pCi [3H]-tymidiiniä lisättiin kuhunkin kaivoon. Sitten solut pestiin • % puoliautomaattisella pesurilla (Titertec Flow Lab.) käyttäen Whatman-suodatinpaperia. :T: 25 Kukin suodatin siirrettiin varovasti pulloihin sisältäen 5 mL nestetuikeliuosta (Sigma).

Radioaktiivisten hajoamisten määrä/ minuutti laskettiin Minibeta-laskurilla (LKB).

• * · V · Stimulaatiokerroin määritettiin aritmeettisena keskiarvona vähintään kolmelle « · · V : rinnakkaiselle mittaukselle (±SD) verraten vastaavaan kontrolliin. Kuva 1 esittää rhlFN- «2:n ja peptidin, joka vastaa korkea-affiinista/antilymfoproliferatiivista hIFN-«2 kohtaa : : 30 (ot-peptoferoni), vaikutuksia mitogeeni (PHA) -indusoidulla ihmisen periferisillä . * I *; polymorfonukleaarisilla soluilla. PHA indusoi voimakkaan lymfoproliferatiivisen vasteen, joka inhiboitui rhIFN-a2 ja α-peptoferonin annokseen verrannollisesti. rhIFN-a2 ja • I · peptoferon osoittivat samantapaiset vaikutukset. rhIFN-Y:lla joko ei ollut mitään 11 104363 vaikutusta tai tai esiintyi pientä lisäävää vaikutusta lymfbproliferatiiviseen vasteeseen. Kuvassa on: (1) = rhIFN-«2; (2) = a-peptoferoni; (3) = kontrolli, PHA; (4) = kontrolli, kasvumediumi.

5 Esimerkki 2.

Kuva 2 esittää rhIFN-a2:n ja α-peptoferonin vaikutusta IFN-sensitiivisen ihmisen T-lymfoblastomasolulinjan MT-4 proliferaatioon. Proliferaatio inhiboitui rhIFN-a2:lla ja «-peptoferonilla annoksesta riippuen. rhIFN-«2 ja α-peptoferoni osoittivat samantapaiset 10 vaikutukset. Käytettiin vastaavia menetelmiä kuin esimerkissä 1. Kuvasasa 2 on: (1)= rhIFN-«2 ja (2) = a-peptoferoni.

Esimerkki 3.

15 Kuva 3 esittää rhIFN-c<2:n ja kehitetyn de novo kimeerisen proteiinin, albeferonin, sisältäen hIFN-a2:n TMc*i-kaltaisen sekvenssin 130-137, joka on asetettu proteiinin leipäähän heti aloittavan Met-tähteen jälkeen (2), kehitetyn de novo proteiinin, albebetinin, jossa ei ole hIFN-a2 -fragmenttia (3), vaikutukset PHA-indusoituun ihmisen periferisten polymorfonukleaaristen solujen proliferaatioon. PHA indusoi voimakkaan , .20 lymfoproliferatiivisen vasteen, jota inhiboi rhIFN-°f2:n ja albeferonin annoksesta

• I

: riippuvalla tavoin. rhIFN-a2 ja albeferoni osoittivat samantapaiset vaikutukset.

• «i • «

Albebetinillä ei ollut mitään vaikutusta lymfoproliferatiiviseen vasteeseen. Tulokset /. j osoittavat, että hIFN-a2 fragmentti, joka vastaa TM«i-kaltaista sekvenssiä 130-137 on • · ·*·,. vastuussa antilymfoproliferatiivisesta rhIFN-oi2:n vaikutuksesta. Samanlaisia menetemiä :T;25 kuin esimerkissä 1 käytettiin. Kuvassa 3 on: (1) =rhIFN-a2; (2) = albeferon; (3) = albebetini; (4)= kontrolli, kasvatusmediumi; (5)= kontrolli, PHA.

t · ·

I I I

• · · • »» V * Esimerkki 4.

« • · • 4 9 *9 • 30 Kuva 4 esittää rhIFN-a2:n, albeferonin ja albebetinin vaikutukset IFN-sensitiiviseen « « « ihmisen T-lymfoblastomasolulinjaan MT-4. Solulinjan solujen proliferaatio inhiboitui « · · rhIFN-a2:lla ja albeferonilla annoksesta riippuvalla tavalla. Tässä kokeessa albeferonilla oli korkeampi aktiivisuus kuin rhIFN-a2:lla, mutta saman tapainen kuin muissa • 1 « 104363 12 tutkimuksissa rhIFN-a2:lla (kts. kuvat 1-2 ja tulokset julkaisussa Dhib-Jalbut S. et ai., 1996, J. Interferon and Cytokine Res. 16, pp. 195-200). Albebetinillä ei ollut mitään lymfoproliferatiivista vastetta. Tulokset osoittavat, että hIFN-a2 fragmentti, joka vastaa TM«i-kaltaista sekvenssiä 130-137 on vastuussa antilymfoproliferatiivisesta rhIFN-a2:n 5 vaikutuksesta. Kuvassa 4 on: (1)= rhIFN-Qi2; (2)= albeferoni; (3)= albebetini.

Esimerki 5.

Kuva 5 esittää rhIFN-c<2:n PHA-indusoidun lymfoproliferattiivisen vaikutuksen ihmisen 10 periferisillä polymorfonukleaarisilla soluilla 20 μΜ syklosporiin A:n (CsA) läsnäollessa kasvatusmediumuissa. PHA indusoi voimakkaan lymfoproliferatiivisen vasteen. Valituilla syklosporiiniväkevyyksillä oli lisäävä vaikutus lymfoproliferatiiviseen vasteeseen.

Lisättäessä äärimmäisen pieni määrä rhIFN-a2:a (10'16 M) PHA-indusoitu lymfoproliferatiivinen vaste hävisi kokonaan. Vastaavanlainen vaikutus saatiin mitogeeni- 15 indusoiduilla ihmisen veren periferisillä T-lymfosyyteillä 20 μΜ CsA:n läsnäollessa oktapeptidin (α-peptoferoni) vaikutuksesta, oktapeptidin ollessa tehty hIFN-a2:n korkeaktiivista/antiproliferatiivista kohtaa vastaan. Vastaavat tulokset saatiin 1-50 μΜ FK506:lla tai rapamysiinillä CsA:n asemesta. Esimerkin 1 menetelmiä käytettiin. Kuvassa 5 on: (1)= rhIFN-Oi2 ja 20 μΜ CsA; (2)= οί-peptoferoni ja 20 μΜ CsA; (3)= kontrolli, ..,.; 20 kasvatusmediumi; (4)= kontrolli, 20 μΜ CsA; (5)= kontrolli, PHA; (6)= kontrolli, 20 μΜ : CsA ja PHA.

« « < :' , · Esimerkki 6.

< « ·· • · • · ·

:T: 25 Kuva 6 esittää albeferonin vaikutusta PHA-indusoituun ihmisen periferisiin polymorfonukleaarisiin soluihin 10 μΜ syklosporiini A:n (CsA) läsnäollessa. PHA

• · · V · indusoi voimakkaan lymfoproliferatiivisen vasteen. Valituilla CsA väkevyyksillä oli • · · · lisäävä vaikutus lymfoproliferatiiviseen vasteeseen. Äärimmäisten pienten määrien lisäys albeferonia (10*12 M) poisti PHA-indusoidun lymfoproliferatiivisen vasteen.

• 30 Samantapaiset tulokset saatiin 1-50 μΜ väkevyyksillä FK506:a tai rapamysiiniä CsA:n asemesta. Kuva 6 osoittaa myös, että oktapeptidi, joka on spesifinen hIFN-«2:n («- .···. peptoferoni) korkea-affiinista/antilymfoproliferatiivista kohtaa vastaan, joka oli • * « immobilisoitu makromolekyylikantajaan (se on, de ttovo proteiiniin albebetiniin) on 104363 13 biologisesti aktiivinen. Vastaavia menetelmiä kuin esimerkissä 1 käytettiin. Kuvassa 6 on: (1)= albeferoni; (2) albeferoni ja 10 μΜ CsA; (3)= kontrolli, kasvatusmediumi; (4)= kontrolli, PHA; (5)= kontrolli, PHA ja 10 μΜ CsA.

f I I « · • · f m · • « • · 1 • · · • 1 · * 1 1 « · · • « · • · · II» • · » • · · • · • · • · · 11«

• I I

I I

• · I

Claims

14 104363

1. Mikä tahansa seos, joka käsittää immunosupressantit syklosporiinit, FK506, tai 5 rapamysiini ja luonnollisia tai rekominanttisia tyypin I interferoneita, interferoneita °ί,β,ω,τ, tai niiden rakennetta vastaavia bioaktiivisia peptidejä, tai rekombinattiproteiineja jotka sisältävät yhden tai useamman sanotun peptidin rakenteen, mikä seos on tarkoitettu lisäämään keskinäisesti sanottujen immunosupressanttien ja interferonien aktiivisuutta ja/tai alentamaan niiden terapeuttista annosta, jolloin vältetään ei-toivottuja lääkkeiden 10 sivuvaikutuksia elinten tai kudosten siirron yhteydessä tai syöpien, kuten lymfomat, leukemiat, myelomat, adenokarsinomat; autoimmuuni- ja krooniset tulehdussairaudet, kuten rheumatoid arthritis, myasthenia gravis, lupus erythematosis, uveitis, hypeproliferatiiviset sairaudet, kuten psoriasis vulgaris, yhteydessä, missä käytetään syklosporiineja, FK506:a tai rapamysiiniä ja interferoneita.

2. Seokset vaatimuksen 1 mukaisesti sisältäen immunosupressantteja syklosporiinit, FK506 tai rapamysiini yhden tai useamman peptidin kanssa, joissa on vähintään 5 identtistä aminohappotähdettä seuraavasta taulukosta:

20 LTEKKYSP R R R R H R R Q D N D D D M L M N NL : I S S S

25. K G H : E A E A G I · • · • · · missä, kukin aminohappo ylimpänä olevassa sekvenssissä voidaan korvata millä tahansa • 1 · 3. sen alla olevalla aminohappotähteellä. » · · • · · • · · :1·;

3. Vaatimuksen 1 mukaiset lääkeaineseokset sisältäen immunosupressantteja .·’ syklosporiinit, FK506 tai rapamysiini ja rekombinattisia polypeptidejä, jotka sisältävät • «· . · 1, yhden tai useamman vaatimuksen 2 mukaisen peptidisekvenssin. 35 « ·

4. Seokset vaatimusten 1 ja 2 mukaisesti mukaisesti sisältäen immunosupressantteja syklosporiinit, FK506 tai rapamysiini ja bioaktiivisia peptidejä tai interferoneita, missä sanotut aktiiviset peptidit tai interferonit ovat geneettisesti tai kemiallisesti modifioitu, tai 104363 15 geneettisesti, kemiallisesti tai fysikaalisesti sidottu pienimolekulaarisiin tai makromolekulaarisiin aineisiin tarkoituksella lisätä peptidien tai interferonien stabiilisuutta fysiologisissa olosuhteissa ja/tai tarkoituksella säädellä peptidien biosaatavuutta.

5 • I r ·· • « • · · I·» • · · • 4 « « · · • · · • · · • · · « I I 9 · · • • · • · • «· • « « f I · » • · • · I • · · f · · « « · • · ♦ 16 104363