FR2459480A1 - Tests et reactifs de diagnostic par agglutination et procedes pour preparer ces reactifs - Google Patents
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- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
Abstract
ON UTILISE UN ANTISERUM D'UNE ESPECE ANIMALE DIRIGE CONTRE L'ANTIGENE A METTRE EN EVIDENCE. ON DILUE L'ANTISERUM DANS UN TAMPON PHYSIOLOGIQUE; ON MELANGE LA SUSPENSION D'ANTISERUM A UNE SUSPENSION DE PARTICULES; APRES INCUBATION, ON CENTRIFUGE ET ON DECANTE L'ANTISERUM A ABSORBER. LE CULOT OBTENU EST MIS EN SUSPENSION DANS UN TAMPON PHYSIOLOGIQUE; APRES CENTRIFUGATION, LE CULOT RECUEILLI EST MIS EN SUSPENSION DANS LE TAMPON CONTENANT UN SERUM ANIMAL NON IMMUN DE LA MEME ESPECE QUE CELLE AYANT SERVI A LA PREPARATION DE L'ANTISERUM.
Description
i Tests et réactifs de diagnostic par agglutination et procédés nour prép-
rer ces ré ctifs, La présente invention concerne des tests et des
réactifs de diagnostic par agglutination; plus particulière-
ment l'invention concerne des tests directs d'agglutination de particules visant à déterminer la présence ou l'absence d'antigènes dans des liquides de l'organisme tels que le sérum, l'urine, le liquide céphalorachidien et similaires
pour contribuer au diagnostic de certains états physiologi-
ques ou pathologiques chez l'homme et l'animal.
La détection d'antigènes microbiens dans les liquides de l'organisme peut être utile pour le diagnostic rapide d'un nombre croissant d'infections. Cependant un problème important est que les techniques actuelles ne sont
pas suffisamment sensibles (immunodiffusion, immuno-
électrophorèse à contre-courant), si bien que l'on ne peut pas mettre en évidence la présence d'antigènes chez une proportion importante de patients infectés, ou sont trop lentes pour permettre le diagnostic rapide (détermination radio-immunologique, essai avec immunoabsorbant) lié à une enzyme. Dans certains cas, le complexe antigène-anticorps se forme lentement et/ou les particules formées sont trop petites pour être observées de façon certaine. Pour améliorer
les possibilités de détection, on a utilisé des tests d'agglu-
tination employant des particules servant de supports sur la surface desquelles la molécule d'antigène ou d'anticorps est
adsorbée ou fixée.
On peut effectuer ces tests d'agglutination selon une technique indirecte dans laquelle on mélange l'échantillon clinique à l'anticorps avec une dilution déterminée et, après une période d'incubation appropriée, on ajoute au mélange un système indicateur constitué d'un complexe fait de l'antigène fixé à un support particulaire. Si l'antigène est présent dans l'échantillon clinique, l'anticorps n'est pas disponible pour réagir avec le complexe antigène-support et il ne se produit pas d'agglutination, cette absence d'agglutination constituant un test positif de l'antigène. Inversement, si l'antigène est absent de l'échantillon clinique, l'anticorps réagit avec le complexe antigène-support ce qui provoque une agglutination de l'échantillon indicateur. La théorie sur laquelle repose ces tests d'agglutination est bien connue dans l'art comme illustré par les brevets US no 3 171 783, no 3 775 536, no 3 873 683, no 3 879 262, no 4 003 988 et
no 4 045 384.
On considère depuis longtemps que la seule voie vraiment significative pour le diagnostic des maladies infectieuses est la détection précoce et rapide des antigènes associés à l'agent infectieux pour permettre l'application
immédiate d'un traitement efficace.
L'invention concerne un test direct d'agglutination
pour la détection des antigènes.
Plus particulièrement l'invention concerne un test d'agglutination très sensible pour la détection des antigènes,
tels que les protéines et les polysaccharides de divers micro-
organismes y compris les bactéries, les protozoaires et les champignons à de faibles concentrations dans les liquides de l'organisme. Un test selon l'invention permet la détection selon une technique simple d'une concentration aussi faible que 0,2 ng/ml des polysaccharides capsulaires associés aux bactéries pathogènes. Ceci correspond à une sensibilité 25 à
250 fois supérieure à celle des méthodes d'immuno-électropho-
rèse à contre-courant très utilisées et à une sensibilité au
moins égale à celle des déterminations radio-immunologiques.
Deplus bien que l'immuno-électrophorèse à contre-courant soit
rapide, elle nécessite un personnel de laboratoire expérimen-
té ainsi que des réactifs et un appareillage assez coûteux et sa sensibilité vis-à-vis de la plupart des polysaccharides bactériens est limitée entre 10 et 50 ng/ml. Comme des concentrations plus faibles en antigènes sont fréquentes dans les liquides de l'organisme, l'immunoélectrophorèse à contre-courant donne souvent des résultats faussement
négatifs chez des patients atteints d'une infection bacté-
rienne confirmée par culture. D'autre part, la détermination radioimmunologique est 10 à 100 fois plus sensible que l'immuno-électrophorèse à contre-courant mais elle est bien
plus lente et coateuse.
Avant l'invention, la généralisation de l'emploi des tests d'agglutination des particules, bien qu'ils soient extrêmement simples et peu coateux, était limitée par le faible degré de sensibilité à de faibles concentrations de l'antigène et à la mauvaise spécificité se traduisant par des agglutinations non spécifiques en particulier avec les échantillons de sérum. Lorsqu'on opère selon la technologie de l'invention décrite ci-après, on atteint une sensibilité de l'ordre de 0, 2 ng/ml et la fréquence des agglutinations non spécifiques avec les sérums humains est réduite à 2% ou moins. De plus, le choix judicieux et la préparation de 1' l'antisérum permettent d'effectuer un test caractérisé par une sensibilité uniforme, une bonne stabilité et une bonne spécificité.
L'invention a pour but de fournir un test d'agglu-
tination sensible des particules pour la détection d'antigè-
nes microbiens dans les liquides de l'organisme à des concentrations aussi faibles que 0,2 ng/ml de liquide de l'organisme. Elle a également pour but de fournir un test d'agglutination des particules caractérisé par une fréquence d'agglutination non spécifique avec les sérums humains de 2% ou moins; elle vise en particulier une détermination améliorée par agglutination de particules pour la détection rapide du polyribophosphate (PRP) du polysaccharide
capsulaire d'Haemophilus influenzae type b, (H.i.b).
La sensibilité limitée est le problème principal des procédés précédemment décrits de détection des antigènes microbiens. Par conséquent, on ne peut pas détecter un
antigène microbien chez tous les patients atteints d'infec-
tions confirmées. Par exemple des tests ont montré que chez 7 à 22% de patients atteints de méningite à H.i.b., 38% de patients atteints d'épiglottite à H.i:b., 20 à 39%o de patients atteints de pneumonie pneumococcique avec bactériémie et 50 à 90% de patients atteints de pneumonie pneumococcique sans bactériémie, on ne pouvait pas détecter d'antigène dans le sérum ou le liquide céphalorachidien selon les tests connus par immuno-électrophorèse à contre-courant ou par agglutination de particules. Cependant une détermination radio-immunologique qui est capable de détecter 0,5 ng/ml ou moins permet de diagnostiquer pratiquement tous les cas de
méningites à H.i.b. dès le premier examen par un médecin.
Les résultats des tests indiquent également que la concentra-
tion de l'antigène chez 37% des patients est inférieure à ng/ml et que par conséquent elle est inférieure à la
sensibilité de la plupart des techniques d'immuno-électro-
phorèse à contre-courant dont on dispose.
L'invention concerne un test d'agglutination des particules ayant un degré de sensibilité comparable à celui des déterminations radioimmunologiques. Le degré élevé de sensibilité du test de l'invention résulte de modifications des tests connus d'agglutination des particules à savoir le choix d'un antisérum anti-H.i.b. spécifique, l'emploi d'une fraction de globulines de cet antisérum, le lavage des particules sensibilisées et la prolongation de la période d'incubation des tests d'agglutination des particules de la
valeur habituelle de 5 minutes à environ 45 minutes ou plus.
a. Sensibilité.
Le choix de l'antisérum a un effet important sur la sensibilité du test. Six antisérums préparés chez trois espèces animales permettent d'obtenir des particules ayant des sensibilités comprises entre 0,2 ng et plus de 1 000 ng de PRP/ml. La qualité fonctionnelle de l'anticorps spécifique ainsi que sa concentration sont importantes. L'antisérum produisant les particules les plus sensibles n'a pas la
concentration maximale en anticorps mesurée par radio-
détermination de la fixation d'antigène.
On prépare six antisérums dirigés contre Haemophilus influenzae type b total chez quatre lapins, un âne et un cheval selon les programmes d'immunisation décrits par H.E. Alexander et coll. dans Journal of Immunology 54:
207-211, 1946.
Dans l'invention, on entend par "particules" des particules inertes et neutres vis-à-vis des autres composants
et capables d'adsorber les antisérums de façon irréversible.
Ces particules peuvent être des perles de verre ou des
particules de polybutadiène, de polystyrène, de polybutadiène-
styrène, etc. ayant une taille moyenne d'environ 0,15 à environ 0,9 gm. De préférence on sensibilise des particules de latex de polystyrène ayant un diamètre uniforme d'environ 0,81 gm sous forme d'une suspension à 10%o p/v dans de l'eau distillée avec les antisérums précités de la façon suivante: On dilue les antisérums entiers d'âne et de lapins à 1/500 et on dilue l'antisérum entier de cheval au 1/200 dans du tampon salé standard à la glycine (0,1 M en glycine, 0,9 % de chlorure de sodium, pH 8,2). Pour adsorber les anticorps sur les particules de latex, on ajoute 1 partie de suspension de latex à 10% à 80 parties d'antisérum dilué et
on incube à la température ordinaire pendant une heure.
On décante les antisérums libres après centrifugation pendant 10 minutes à 12 000 x g. On met le culot de latex en suspension dans du tampon salé à la glycine avec une
petite quantité de protéine, telle que 0,1 % de sérum-
albumine humaine ou 0,1%o de sérum d'âne, de lapin ou de cheval selon le cas, pour obtenir une suspension à 0,125% de latex, on centrifuge à nouveau et on remet en suspension dans du tampon salé à la glycine. On utilise du sérum foetal
de veau, ne contenant pas d'anticorps anti-PRP, par détermi-
nation radio-immunologique, comme diluant pour les solutions
standards d'antigène PRP.
Pour effectuer l'agglutination, on ajoute des portions de 0,05 ml de liquide contenant l'antigène à des fractions de 0,01 ml de solution de latex sensibilisé sur une lame pour examen sérologique comportant des anneaux en céramique. On fait tourner la lame (180 tr/min) dans une chambre humidifiée à la température ordinaire et on examine l'agglutination après 45 minutes. On note l'agglutination 4+ lorsque le mélange d'agglutination est limpide et qu'on observe des amas grossiers de particules de latex, 3+ lorsque le mélange demeure trouble mais qu'on observe des amas grossiers, 2+ lorsque le mélange demeure trouble et granuleux et 1+ lorsque le mélange demeure trouble mais n'est que très peu granuleux. On considère qu'une agglutination égale ou supérieure à 2+ est positive. Les sensibilités comparées
figurent dans le tableau 1.
Tableau 1
Sensibilité de la détermination par agglutination de particu-
les de latex avec six antisérums anti-Haemopfilus influenza
type b.
Anticorps anti- Anticorps anti- Sensibilité des PRP du sérum PRP fixés aux particules de
Sérum total 1 particles de latex anti-
(lg de protéines latex 1(glg de PRP2 d'anticorps/ml) protéines (ng de PRP/ml) d'anticorps/ml de particules de latex) Ane 11 200 3,40 0,2 Lapin 1 96 000 7,84 1,0
2 68 000 7,20 1,0
3 45 000 6,56 5,0
4 10 300 1,95 10,0
Cheval 3 100 1,84 1000 1 mesurés par détermination radio-immunologique par
fixation d'antigène.
2 concentration minimale en PRP-5 dans le sérum foetal de
veau provoquant une agglutination égale ou supérieure à 2+.
Le tableau 1 montre nettement l'importance de la qualité de l'antisérum utilisé pour sensibiliser les
particules de latex sur la sensibilité du test d'agglutina-
tion des particules de latex pour la détection de l'antigène PRP. Les résultats du tableau 1 montrent nettement que l'on ne peut pas prévoir la sensibilité uniquement à partir de la
concentration en PRP de l'antisérum mesurée par radio-
détermination par fixation d'antigène. Un antisérum d'âne, ne contenant que 12% des anticorps du meilleur antisérum de lapin, permet d'obtenir des particules de latex cinq fois plus sensibles. Cette différence de sensibilité ne peut s'expliquer par un revêtement plus efficace des particules de latex par les anticorps d'âne car il y a 2,3 fois plus d'anticorps absorbés sur les particules de latex revCtues d'antisérum de lapin. Les activités d'agglutination des antisérums d'âne et de lapin visà-vis des hématies de mouton revêtues de PRP sont égales bien que l'antisérum de lapin ait
une activité bien supérieure de fixation du PRP.
La mesure des vitesses d'association montre que les
anticorps d'âne se combinent bien plus rapidement avec l'anti-
gène PRP que ne le font les anticorps de lapin. La période de demiassociation est de 20 minutes pour les anticorps d'âne et de plus de 60 minutes pour les anticorps de lapin. La raison
de cette différence des vitesses d'association est inconnue.
La vitesse de dissociation des complexes antigène-
anticorps en présence d'un excès d'antigène, mesure la
robustesse de la fixation ou l'affinité de l'anticorps.
L'anticorps de lapin se dissocie plus lentement du polyribo-
sephosphate que ne le fait l'anticorps d'âne et par conséquent a une plus grande affinité pour l'antigène. Ce résultat vient
à l'appui de l'hypothèse selon laquelle la vitesse de combi-
naison de l'antigène et de l'anticorps est plus importante dans les processus d'agglutination que la robustesse de
l'interaction antigène-anticorps.
b. Emploi d'une fraction de macroglobulines pour rev9tir des
particules de latex.
La chromatographie sur tamis moléculaire de diffé-
rents antisérums dirigés contre des polysaccharides bactériens montre que la majorité des anticorps anti-polysaccharide des
équidés (Ane, cheval) est présente dans la classe des macro-
globulines qui est éluée dans le volume vide de cette colonne.
Au contraire, la majorité des anticorps de lapin est présente dans la classe des IgG qui est éluée ultérieurement. Comme
indiqué dans le tableau 2, l'emploi de la fraction de macro-
globulines de l'antisérum d'âne ou de cheval, à une concen-
tration de 50 kig de protéine/ml pour sensibiliser les particules de latex, améliore considérablement la sensibilité
des antisérums d'équidés relativement faibles. Cette modifica-
tion n'apporte pas d'amélioration complémentaire des meilleurs antisérums bien que la netteté de la réaction d'agglutination soit généralement meilleure avec la fraction correspondant au volume vide. L'emploi de la fraction d'IgG des sérums de lapin ne provoque pas d'améliorations comparables de la sensibilité
ou de la netteté de l'agglutination.
Tableau 2
Comparaison des sensibilités des particules de latex revêtues de sérum entier ou de la fraction de macroglobulines
d'antisérums d'équidés vis-à-vis de polysaccharides bactériens.
Antisérum Sensibilité * des Sensibilité des dirigé particules de particules de contre: latex revêtues de latex revêtues sérum entier de la fraction de Animal (dilution au macroglobulines 1/500) (50 lg de ______. __ _ _ _ _ _ _ _ _ protéines/ml) Ane-F H. influenzae 1 ng/ml 0,2 ng/ml type b Ane-132 H. influenzae 0,2 ng/ml 0,2 ng/ml type b Ane- H. influenzae 2 ng/ml 0,5 ng/ml W.J. type b
Ane-Y Neisseria menin-
gitidis-groupe Y I ng/ml 0,2 ng/ml Cheval- N. meningitidis 0,5 ng/ml 0,2 ng/ml 49 groupe A Cheval- N. meningitidis > 10 000 ng/ml 2 ng/ml 46 groupe B * la concentration la plus faible d'antigène provoquant une
agglutination égale ou supérieure à 2+ est indiquée.
c. Lavage des particules de latex revêtues Pour améliorer encore là sensibilité des antisérums d'Ane, on compare des particules de latex revêtues d'anticorps avec diverses dilutions d'antisérum d'âne dans du tampon salé à la glycine, non lavées ou après un, deux et trois lavages avec du tampon salé à la glycine contenant 1/1 000 parties de
sérum foetal de veau; les résultats figurent dans le tableau 3.
Tableau 3
Effet de la dilution de l'antisérum et du lavage des particules de latex sur la sensibilité du test d'agglutination des
particules de latex par le polyribosephosphate.
Dilution de l'antisérum Concentration minimale de PRP détectée * d'Ane utili- (ng/ml) sé pour sen- non lavées lavées lavées sibiliser lavées 1 fois 2 fois 3 fois
les particu-
les de latex
1/10 200 > 1000 > 1000 > 1000
1/100 50 0,5 0,5 0,5
1/500 2 0,2 0,2 0,2
1/1000 0,5 0,2 0,2 0,2
1/2000 0,2 0,2 0,2 0,5
1/5000 > 0 > >1000 > 1000 > 10001000
un résultat positif correspond à une agglutination égale
ou supérieure à 2+.
Comme le montrent les résultats du tableau 3, les
faibles dilutions d'antisérum sont insensibles. Avec des dilu-
tions de 1/500 et plus, on obtient la sensibilité maximale lorsque les particules de latex sont lavées. On obtient la sensibilité maximale avec les particules de latex non lavées iuniquement dans une gamme étroite de dilutions. Deux lavages permettent d'obtenir la sensibilité maximale tandis que trois
lavages peuvent réduire la sensibilité.
On conserve à 400 les particules de latex sensibili-
sées de l'expérience de lavage et on les soumet h de nouveaux
essais après 12 et 24 mois. Les particules de latex sensibi-
lisées avec une dilution au 1/500 et au 1/1 000 d'antisérum d'Ane et lavées deux fois conservent leur sensibilité d'origine tandis que les particules de latex non lavées sont deux à
quatre fois moins sensibles après 24 mois.
d. Durée de la période d'incubation La figure unique annexée illustre la relation entre la sensibilité de la détermination (mg de PRP/ml) en ordonnées et la durée d'incubation (minutes) en abscisses. Les courbes indiquent la concentration minimale de PRP-5 détectée par agglutination des particules de latex après diverses périodes d'incubation. On considère qu'un résultat positif correspond à une agglutination égale ou supérieure à 2+. La courbe A - t correspond aux particules de latex revêtues de l'antisérum de lapin nO 144 et la courbe o-o correspond aux particules de latex revêtues d'antisérum d'Ane nO 132. Des concentrations importantes en antigène agglutinent les particules de latex en 5 minutes. La sensibilité s'accroit rapidement pendant les 45 à 60 premières minutes puis lentement pour atteindre un maximum de 0,05 ng/ml avec les préparations les plus sensibles après 10 heures. Le sérum d'équidé de l'invention est plus sensible que le sérum de lapin pour toutes les périodes d'incubation. Pour effectuer l'étude comparative, on mélange sur une lame pour sérologie, 50 pi de solution d'échantillon
et 10 pi de particules de latex revêtues, comme décrit ci-
après et on fait tourner à 180 tr/min à la température ordinaire. On recouvre les lames -et on maintient l'humidité avec des éponges saturées d'eau chaude. On observe les lames
aux temps indiqués.
Lorsqu'on accroit la période d'incubation de minutes à 45 minutes ou plus, la sensibilité s'accroit de à 20 fois. Pour l'emploi clinique, on choisit une période d'incubation de 45 minutes avec normalement des lectures à des intervalles de 5 à 15 minutes lorsqu'on utilise des
particules de latex revêtues d'un antisérum d'équidé.
Ces particules de latex ont une sensibilité de 0,2 ng
d'antigène/ml de liquide.
On prévoyait que l'accroissement de la sensibilité
des déterminations par agglutination de particules augmente-
rait la fréquence des agglutinations non spécifiques, et en fait dans le cas des échantillons de sérum, 69% des sérums
d'enfants hospitalisés agglutinaient les particules de latex.
Cet inconvénient majeur limitait la généralisation de ces déterminations. Les facteurs que l'on a impliqués dans l'agglutination des particules de latex revêtues de Y-globulines sont des composants thermolabiles du sérum (vraisemblablement le complément) et des antiglobulines thermostables, dont de faibles teneurs sont souvent présentes dans les sérums humains en particulier chez les patients
atteints d'affections inflammatoires chroniques.
L'agglutination non spécifique était établie par l'agglutination de particules de latex témoins sensibilisées
par un sérum animal non immun. Lorsqu'on utilisait des parti-
cules de latex revêtues de macroglobulines, on revgtait les particules de latex témoins de la fraction de macroglobulines
du sérum non immun.
Selon l'invention pour réduire la fréquence l'agglutination non spécifique avec les sérums humains à 2o
ou plus, (1) on ajoute le sérum animal non immun aux parti-
cules de latex sensibilisées, (2) on ajoute un tampon sérum contenant un polyanion et/ou un agent réducteur directement au mélange d'incubation et/ou (3) on inactive les sérums par
la chaleur.
On détermine la fréquence de l'agglutination non spécifique avec des sérums d'enfants et d'adultes hospitalisés qui, ne sont pas atteints de maladie à H.i.b.. On teste tous ces sérums avec des particules de latex sensibilisées avec de l'anti-sérum d'âne (particules de latex anti-PRP) et avec des particules de latex sensibilisées avec du sérum d'âne non
immun (particules de latex témoins).
Dans des expériences préliminaires, on teste des sérums contenant des agglutinines thermostables par addition de 10 pl d'un agent réducteur, tel que le dithio-1,4 thréitOl (DTT) ou le mercapto-2 éthanol (ME), ajouté au mélange d'incubation au début de l'incubation. Les concentrations optimales sont de 0,018 M pour le DTT et de 0,35 M pour le ME (les concentrations finales dans le mélange d'incubation
sont de 0,0026 M pour le DTT et de 0,05 M pour le DE).
Le tableau 4 suivant regroupe les résultats obtenus avec 104 sérums d'enfants conservés au moins 24 heures à 40Q
avant l'essai.
Tableau 4
Fréquence de l'agglutination non spécifique avec des sérums conserves d'enfants hospitalisés n'étant pas atteints de
maladie à Haemophilus influenzae type b.
Agglutination avec les particules de latex anti-PRP Agglutination avec les particules de latex témoin Sérum non traité
(N=104)
Sérum inactivé par chauffage (n-104) Addition de sérum normal d'Ane (2,5%) aux particules de latex (n=104) Inactivation du sérum par chauffage et addition de sérum normal d'âne
(2,5%) aux parti-
cules de latex(n=104) Addition de sérum normal d'âne (2,5%) aux particules de latex et addition de DTT2 au sérum (n=53)3 négative positive négative positive négative positive positive négative
32 (31%) 65 (63%) 3 (3%) 4 (4%)
49 (47%) 47 (45%) 1 (1%) 7 (7%)
72 (69%) 23 (22%) 7 (7%) 2 (2%)
(72%) 23 (22%) 5 (5%)
52 (98%) 1 (2%e) 0
1 (1%)
conservés au moins 24 heures à 40C avant l'essai.
2dithiothréitol, concentration finale de 0,0026 M dans le mélange d'incubation 3seuls 53 échantillons sur 104 contiennent suffisamment de
sérum pour effectuer cet essai.
Avec les particules de latex anti-PRP, 69% des sérums provoquent des agglutinations non spécifique mais toutes (sauf 4%) sont identifiées avec les particules de
latex témoin.
L'inactivation par la chaleur (600C pendant 15 minu-
tes ne réduit que faiblement à 53%o l'agglutination non spécifi-
que et l'addition de sérum d'âne non immun aux particules de latex antiPRP et aux particules de latex témoins réduit l'agglutination non spécifique à 31%; l'addition de 10 pl d'un agent réducteur, par exemple le dithiothréitol réduit la fréquence des réactions non spécifiques à 2%e. Les résultats
obtenus avec les 52 sérums conservés d'adultes sont semblables.
Seul un sérum produit une agglutination non spécifique (positive avec les particules de latex anti-PRP et les particules de latex témoins) lorsqu'on ajoute 2,5% de sérum normal d'âne aux particules de latex et du DTT au mélange d'incubation. Pour déterminer si les sérums frais produisent des agglutinations non spécifiques fréquentes, on recueille sérums d'adultes que l'on place immédiatement sur de la glace et qu'on teste le jour même. On teste chaque sérum avec et sans agent réducteur (ME) et avec et sans inactivation par la chaleur (600C pendant 5 minutes). On teste l'agglutination avec des particules de latex anti-PRP et des particules de latex témoins contenant chacune 2,5% de sérum normal d'Ane
et dans les deux cas on observe des résultats correspondants.
Les schémas d'agglutinations figurent dans le
tableau 5.
Tableau 5
Agglutination non spécifique avec des sérums frais de adultes sans affection par Haemophilus influenzae
Pas d'inactiva-
tion par Schéma chauffage sans ME ME2
1. (-) (-)
2. (+)
3. (+)
4. (-)
5. (+)
(-) (+) (+) (+) Inactivation par chauffage sans ME (-) (+) (-) (-) (+) Nombre de sérums
Interpré-
tation
(-) 43 pas d'antiglobu-
line - pas de complément (-) 28 antiglobulines seulement (-) 4 complément seulement (-) 14 complément seulement ("réactivé" par le ME) (-) 10 antiglobulines et complément
6. (-)
(-) NM de sérum 42 38
produi-
sant
l'agglu-
tination non-spécifique (-) (+) On effectue toutes les déterminations avec des particules de latex anti-PRP et des particules de latex témoins contenant 2,5% de sérum normal d'Ane. Il existe une correspondance
complète des résultats pour les particules de latex anti-
PRP et les particules de latex témoins.
2 mercapto-2 éthanol, à la concentration finale de 0,05 M dans
le mélange d'incubation.
On observe une agglutination non spécifique avec 42%
des sérums non traités (ni chauffage ni agent réducteur).
Lorsqu'on ajoute un agent réducteur (ME) 28 sérums deviennent négatifs (schéma 2) ce qui indique la présence d'antiglobuline Quatorze sérums qui étaient au départ négatifs deviennent positifs (schéma 4) ce qui indique qu'une agglutinine
type b1.
type b ME2 thermolabile a été réactivée par le mercaptoéthanol. L'effet
global du ME seul est de réduire l'agglutination non spécifi-
que h 38%. On obtient une fréquence semblable d'agglutinations
non spécifiques avec l'inactivitation par la chaleur seule.
Cependant la combinaison de l'inactivation des sérums par la chaleur et de l'addition d'un agent réducteur au mélange d'incubation, réduit la fréquence de l'agglutination non
spécifique à une valeur de 2% ou moins.
Comme l'inactivation par la chaleur est longue, on a mis au point un autre procédé pour éliminer l'agglutination non
spécifique provoquée par les facteurs thermolabiles du sérum.
Divers polyanions y compris le polyéthanolsulfonate de sodium (SPS), le sulfate de dextrane, la carraghénine et l'héparine empochent l'agglutination non spécifique par les facteurs thermolabiles du sérum des particules de latex revêtues de globuline. On teste 100 sérums fAsd'adultes avec un tampon sérum contenant à la fois du ME (comme cidessus) et du SPS à la concentration de 0,05%. Seul un des 100 sérums produit une agglutination non spécifique avec les particules de latex anti-PRP et les particules de latex témoins. Le chauffage supprime l'agglutination non spécifique par ce sérum.
Il est souhaitable d'ajouter un tampon sérum contenant un agent réducteur et un polyanion au mélange d'incubation constitué de particules de latex sensibilisées stabilisées et
d'un échantillon de sérum.
On prépare ce tampon sérum de la façon suivante: On dilue du mercapto-2 éthanol 14 M (solution standard concentrée) au 1/40 dans du tampon salé à la glycine (GBS)
(0,1 M en glycine, 0,9% de chlorure de sodium, pH 8,2).
Dans le même GBS, on dilue au 1/00 une solution aqueuse à 5%
de polyéthanolsulfonate de sodium.
Le tampon sérum peut contenir d'autres agents réduc-
teurs tels que le dithiothréitol, le glutathion, la cystéine et similaires au lieu du mercapto-2 éthanol. De plus on peut utiliser d'autres polyanions tels que le sulfate de dextrane, l'héparine, la carragéénine et similaires sous réserve qu'ils
ne gênent pas la réaction antigène-anticorps.
Le tableau 6 suivant montre les concentrations optima-
* les des composants du tampon sérum. Des concentrations plus élevées en agents réducteurs ou en polyanions réduisent la sensibilité de la détermination et des concentrations plus faibles ne suppriment pas l'agglutination non spécifique de
tous les sérums.
Tableau 6
Concentrations optimales des composants du tampon sérum.
DTT 2-ME SPS
Concentration finale dans le mélange de détermination Diminution de la sensibilité 12,8 mM 400 MM 0,07% Bonne sensibilité et élimination de l'agglutination non spécifique 2,6 mM 50 mM 0,007% L'agglutination non spécifique n'est pas éliminée 0,65 mM 10 mM 0,0007% On examine à nouveau la concentration efficace du sérum animal non immun dans la suspension de latex, dans le
système de détermination utilisant le tampon sérum précédem-
ment décrit.
Des concentrations en sérum animal non immun infé-
rieures à 0,25%o dans la suspension de particules (moins de 0,035% dans le mélange final de détermination) provoquent une agglutination non spécifique occasionnelle malgré l'emploi du
tampon sérum.
Des concentrations en sérum animal non immun atteignant environ 25% dans la suspension de latex (3,5% dans le mélange
final de détermination) sont efficaces pour réduire la fréquen-
ce de l'agglutination non spécifique, cependant la concentra-
tion maximale, c'est-à-dire 25%, réduit de 2 fois la sensibi-
lité de la détermination du polyribophosphate.
Agglutination non spécifique dans d'autres liquides de l'organisme. La plupart des échantillons d'urine produisent une agglutination non spécifique avec les particules de latex anti-PRP et les particules de latex témoins. On peut éliminer
cette agglutination soit par chauffage (100 C pendant 5 minu-
tes) soit par filtration de l'urine. Dans le mode de
réalisation préféré on utilise un filtre de 0,45 pm.
Il est très rare que les échantillons de liquide céphalorachidien produisent une agglutination non spécifique,
et on l'élimine par chauffage (1000C pendant 5 minutes).
L'antigène PRP demeure stable dans ces opérations de chauffa-
ge et de filtration.
L'exemple non limitatif suivant illustre le mode de
réalisation préféré de l'invention.
EXEMPLE
a. Revêtement des particules de latex.
Pour préparer les particules de latex anti-PRP, on dilue au 1/500 dans du GBS de l'antisérum entier d'âne dirigé contre H. influenzae type b et on chauffe à 560C pendant minutes. On ajoute 1 partie de suspension de latex (suspension à 10%e de particules de 0,81 pm de diamètre dans l'eau distillée) à 80 parties d'antisérum dilué pour obtenir
une concentration finale des particules de latex de 0,125%.
On incube ce mélange pendant une heure à la température ordinaire, on centrifuge à 12 000 x g pendant 10 minutes puis on rejette le surnageant. On remet le culot en suspension dans ui volume égal de GBS contenant 0,1% de sérum non immun d'Ane, on centrifuge comme ci-dessus puis on remet en suspension dans
un volume égal do GBS contenant 2,5% de sérum non immun d'âne.
On prépare les particules de latex témoins comme ci-dessus si ce n'est qu'on utilise du sérum non immun d'Ane dilué au 1/500 dans le GBS pour le revêtement initial des particules de latex. De sérum non immun d'&ne que l'on utilise doit être le sérum prélevé avant l'immunisation à l'animal que
l'on immunise.
Lorsqu'on utilise la fraction de macroglobulines, on chromatographie les sérums entiers d'Ane prélevés avant l'immunisation et après l'immunisation sur une colonne filtrante garnie de gel Sephacryl G-200 et on regroupe les fractions éluées dans le volume vide de la colonne. On dilue l'ensemble à une concentration en protéines de 50 pg/ml dans du GBS et on utilise la dilution au lieu du sérum entier dilué dans le procédé précédemment décrit.
b. Préparation du tampon sérum.
On dilue au 1/40 dans du GBS, du mercapto-2 éthanol
14 M (solution concentrée standard). On ajoute du polyéthanol-
sulfonate de sodium à la concentration finale de 0,05%.
c. Mode de détermination.
On effectue la détermination selon l'invention de la
façon suivante.
On introduit 50 pli de sérum témoin positif, de sérum
témoin négatif et d'échantillon de sérum de liquide céphalo-
rachidien et d'urine dans les deux rangées de cupules d'une
lame propre et sèche pour sérologie selon le diagramme ci-
après. Le sérum témoin positif contient 2 ng d'antigène PRP/ml.
Le sérum témoin négatif contient des antiglobulines qui agglutinent à la fois les particules de latex anti-PEP et les particules de latex témoins en l'absence d'addition de tampon
sérum, ce qui permet de contrôler l'activité du tampon sérum.
On filtre au préalable les échantillons d'urine avec un
filtre de 0,45 gm.
Sérum Sérum Sérum Liquide Urine
témoin témoin étu- céphalo- étu-
positif négatif dié rachidien diée ____ __ _ ___ _ __ ___ étudié _ _ _
Rangée A: particules -
de latex anti-PRP I F Rangée B: particules de latex témoins 0 0 TS: addition de tampon sérum On ajoute 10 pil de tampon sérum aux godets contenant du sérum témoin positif, du sérum témoin négatif ou un
échantillon de sérum.
On mélange doucement les suspensions de latex sans former de mousse et on ajoute 10 pl de particules de latex anti-PRP à une des rangées (rangée A) et on mélange intimement
les réactifs.
On ajoute 10 il de particules de latex témoin aux godets de la seconde rangée et on agite intimement les réactifs. On place la lame sur un agitateur pour sérologie et on la fait tourner pendant environ 45 minutes. On doit humidifier la chambre avec des éponges trempées dans l'eau chaude pour
qu'une condensation soit visible pendant toute la détermina-
tion. On retire les lames de la chambre, on essuie la conden-
sation et on lit l'agglutination en basculant lentement les lames en lumière oblique sur un fond sombre. On note les résultats de la façon suivante: 4+ gros amas-fond limpide 3 gros amas-fond laiteux 2+ petits amas 1+ grains fins O laiteux On doit facilement différencier les réactions 3+ et 4+ des témoins lorsqu'on observe la lame à bout de bras. Les
réactions 2+ nécessitent un examen plus rapproché.
Interprétation des résultats.
Particules de Particules de latex anti- latex témoins Interprétation hoemoUhilus _ (+) (-) Positif pour l'antigène
H. influenzae type b.
(-) (-) lNégatifpour l'antigène
H. influenzae type b.
(+) (+) Agglutination non spécifique l'antigène H. influenzae type
b, peut être présent ou absent.
Une agglutination positive à 2+ doit être considérée comme
"faiblement positive".
Bien que dans la présente description les durées et
les températures utilisées pour le traitement par la chaleur et l'incubation soient optimales, on peut obtenir des résultats identiques avec des températures plus élevées pour des durées plus brèves ou inversement des températures plus basses pour
des durées plus importantes. De plus dans la description
précédente, on utilise des réactifs, des milieux et des techniques pour établir l'utilité de l'invention. Il est cependant évident pour l'homme de l'art que l'on peut effectuer des modifications des techniques, des durées, des volumes et des natures des matières, des milieux et des
appareils sans sortir du cadre de l'invention.
Claims (10)
1. Procédé pour préparer un réactif qui s'agglutine lorsqu'on le met en contact avec des liquides de l'organisme contenant des antigènes, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes selon lesquelles on injecte une certaine quantité d'antigènes à une espèce animale, en particulier une espèce d'équidés telle que 1'ane, et on laisse l'espèce animale produire un antisérum dirigé contre l'antigène; on recueille l'antisérum ainsi produit
on dilue cet antisérum dans un système tampon physiolo-
gique compatible; on mélange la solution d'antisérum ainsi obtenue à une suspension de particules; on incube la suspension on centrifuge cette suspension et on décante l'antisérum non adsorbé; on remet le culot ainsi obtenu en suspension dans un système tampon physiologique compatible; et on centrifuge à nouveau et on remet le culot en suspension dans ledit système tampon contenant un sérum animal non immun de la même espèce que celle ayant servi à la préparation de l'antisérum.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on choisit l'antigène parmi le groupe constitué par les polysaccharides.
3.Pcédé-pourpréparer un réactif qui s'agglutine lorsqu'on le met en contact avec des liquides de l'organisme contenant des polysaccharides, caractérisé en ce qu'il comprend: l'injection d'une certaine quantité d'un polysaccharide à une espèce d'équidé, en particulier l'âne, pour produire un antisérum dirigé contre cet antigène; la récupération de l'antisérum ainsi produit
la sélection des fractions à titre élevé en macroglobuli-
nes de l'antisérum recueilli; la dilution de ces fractions dans un système tampon physiologique compatible; la combinaison de l'antisérum dilué à une suspension aqueuse de particules l'incubation de la suspension la centrifugation de la suspension et la décantation de l'antisérum non adsorbé la remise en suspension du culot ainsi obtenu dans un système tampon physiologique compatible; et la centrifugation à nouveau et la remise en suspension du culot dans ledit système tampon contenant du sérum d'équidé
non immun.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le polysaccharide est le polyribophosphate constituant le
polysaccharide capsulaire d'Haemophilus influenzae type b.
5. Réactif liquide s'agglutinant lorsqu'on le met en contact avec des liquides contenant des antigènes, caractérisé en ce qu'il comprend un support revêtu d'un antisérum animal, en particulier un antisérum entier d'équidé, en particulier la fraction de macroglobulines d'un antisérum d'équidé, dirigé contre lesdits antigènes en suspension dans un système tampon physiologique compatible et d'un sérum animal non immun de la
même espèce animale que celle utilisée pour produire l'anti-
sérum.
6. Réactif liquide selon la revendication 5, caracté-
risé en ce que l'antigène est un polysaccharide.
7. Test direct d'agglutination pour la détection d'antigènes dans des liquides de l'organisme susceptibles de contenir de tels antigènes, caractérisé en ce qu'il comprend la combinaison d'un échantillon de liquide de l'organisme choisi parmi le sérum ou le plasma, avec un réactif liquide selon la revendication 5 et un système tampon contenant un polyanion capable de réduire l'effet des constituants
thermolabiles de l'échantillon en particulier le polyéthanol-
sulfonate de sodium, le sulfate de dextrane, la carlagénine, l'héparine et similaires et un agent réducteur capable de réduire les anticorps de type antiglobulines de l'échantillon, en particulier le mercapto-2 éthanol, le dithiothréitol, le glutathion, la cystéine et similaires, l'incubation de ce mélange puis la détermination
visuellement du degré d'agglutination.
8. Test direct d'agglutination pour la détection d'antigènes dans les liquides de l'organisme choisis parmi le groupe constitué par le sérum et le plasma susceptible de contenir de tels antigènes, caractérisé en ce qu'il comprend le chauffage de ce liquide de l'organisme et la combinaison de ce liquide de l'organisme traité par la chaleur avec un agent réducteur capable de réduire les anticorps de type antiglobuli nes de ce liquide, en particulier le mercapto-2 éthanol, le dithiothréitol, le glutdthion, la cystéine et un réactif liquide selon la revendication 5, l'incubation de ce milieu puis la détermination visuellement du degré d'agglutination.
9. Test direct d'agglutination selon la revendication 7, caractérisé en ce que la période d'incubation est de
minutes ou plus.
10. Test direct d'agglutination pour la détection d'antigenes dans un liquide céphalorachidien susceptible de contenir ces antigènes, caractérisé en ce qu'il comprend la combinaison de ce liquide céphalorachidien avec un réactif liquide de la revendication 5, l'incubation du mélange puis
la détermination visuellement du degré d'agglutination.
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