SE448577B - Ett direkt agglutinationstest for detektion av antigener i kroppsvetskor - Google Patents

Description

är antikroppen inte tillgänglig för reaktion med komplexet av antigen/bärare och någon agglutination förekommer inte och så- lunda är frånvaro av agglutination ett positivt test för anti- genet. Om antigen inte är närvarande i det kliniska nrovet reagerar omvänt antikroppen med komplexet av antigen och bärare och agglutination av indikatorprovet uppkommer. Den teori på vilken sådana agglutinationstester är baserad är väl- känd inom tekniken och belyses närmare i de amerikanska patent- skrifterna 3.171.783, 3.775.536, 3.873.683, 3.879.262, 4.003.988 och 4.045.384.

Man har länge haft den uppfattningen att den enda verkligt meningsfulla diagnostiska metoden med avseende på infektions- sjukdomar är tidig och hastig detektion av antigener som är associerade med det infekterande medlet, varigenom man åstad- kommer nñjlighet för omedelbar effektiv behandling. _Föreliggande uppfinning avser ett direkt agglutinationstest för detektion av antigener.- Enligt föreliggande uppfinning har man utvecklat ett ytterst känsligt agglutinationstest för detektion av antigener såsom proteiner och polysackarider från olikartade mikroorganismer innefattande bakterier, protozoer och svampar i låga koncentra- tioner i kroppsvätskor. Ett test enligt föreliggande uppfin- ning beskrives nedan, vilket rutinmässigt kan användas för att påvisa så litet som 0,2 nanogram per milliliter av de kapsy- lära polysackarider som är associerade med patogena bakterier.

Detta innebär en känslighet som är 25 - 250 gånger större än känsligheten för de allmänt använda motströms immunoelektro- foresmetoderna (CIE) och en känslighet som minst motsvarar det för radioimmunoanalys (RIA). Under det att CIE är snabb erfordrar denna metod dessutom tränad laboratoriepersonal och moderat dyrbara reagens och apparater och ger en begränsad känslighet motsvarande 10 - 50 nanoqram per milliliter för de flesta bakteriella polysackarider. Emedan lägre koncentra- tioner antigen ofta förekommer i kropnsvätskor förekommer ofta 448 577 falska negativa CIE-tester hos patienter med kulturdokumente- rade bakteriella infektioner. RIA å andra sidan är 10 - lOO gånger mer känslig än CIE men är mycket mer tidskrävande och 7 dyrbar.

Före föreliggande uppfinning var ett allmänt användande av partikelagglutinationstester begränsat även om de var ytterst enkla och prisbilliga, p.g.a. den låga känslighetsgraden hos dessa tester för små koncentrationer av antigen och dålig 'specificitet som visade sig i form av förekomst av icke specifik agglutination, särskilt med serumprover. Vid till- lämpning av metoden enligt föreliggande uppfinning, vilken beskrives nedan, uppnås en känslighet av storleksordningen Q,2 ng/ml och frekvensen av icke specifik agglutination med humansera minskas till 2 % eller mindre; Vidare har noggrant utval och beredning av antiserum gett ett test som utmärkes av enhetlig känslighet, god stabilitet och specificitet.

Ett ändamål med uppfinningen är sålunda att åstadkomma ett känsligt partikelagglutinationstest för detektion av mikro- biella antigener i kroppsvätskor vid koncentrationer så låga _ som 0,2 ng/ml kroppsvätska.

Ett annat ändamål med uppfinningen är att åstadkomma ett partikelagglutinationstest, som utmärkes av en grad av icke specifik agglutination med humansera av 2 % eller mindre.

Ett särskilt ändamål med uppfinningen är att åstadkomma en förbättrad partikelagglutinationsanalysmetod för hastig detektion av polyribofosfat (PRP), den kapsylära polysackari- den från Haemophilus Influenzae typ b.

Begränsad känslighet är det väsentliga problemet med tidigare kända metoder för mikrobiell antigendetektion. Såsom en följd härav kan bakteriella antigener inte påvisas hos samtliga patienter med dokumenterade infektioner. Tester har exempel- vis visat att 7 - 22 % av patienter med H.i.b. meningitis, 448 avi? 38 % med H.i.bf epiglottitis, 20 - 39 % med bakteremisk pneumokockisk lunginflammation och Sd - 90 % med icke bakteremisk pneumokockisk lunginflammation icke uppvisar på- visbart antigen i serum eller cerebrospinalvätska vid testning med tillgängliga analysmetoder baserade på motströms immuno- elektrofores eller partikelagglutination. En radioimmuno- analysmetod med vilken man kan påvisa 0,5 ng/ml eller därunder möjliggör emellertid diagnos av samtliga fall av H.i.b. meningitis när de uppvisas för läkaren. Testresultaten visar även att koncentrationen antigen hos 37 % av patienterna var mindre_än lG ng/ml och sålunda under känslighetsgränsen för de flesta tillgängliga förfaranden baserade på motströms immunoelektrofores.

Enligt föreliggande uppfinning har en analysmetod utvecklats baserad på partikelagglutinationsanalys som har en känslig- hetsgrad som är jämförbar med radioimmunoanalys. Den höga känslighetsgrad som uppnås vid analysmetoden enligt före- liggande uppfinning beror av modifikationer av tidigare kända metoder för partikelagglutination, nämligen utval av ett specifikt H.i.b. antiserum, användning av en globulinfraktion av antiserumet, tvättning av den sensibiliserade partikeln och förlängning av inkubationsperioden vid partikelagglutinations- 'testet från de vanliga 5 till ungefär 45 minuter eller däröver.

Valet av antiserum påverkar markant analysens sensitivitet.

Sex antisera framställda i tre djurarter ger partiklar med sensitlviteter varierande från 0,2 nanogram till mer än l000 nanogram PRP per milliliter. Den funktionella kvaliteten för den specifika antikroppen såväl som dess koncentration är av betydelse. Den antiserum som ger de mest sensitiva partik- larna har inte den högsta antikroppskoncentrationen vid bestämning med radioantigenbindande analys.

Sex antisera gentemot hel Haemophilus Influenzae typ b fram- ställdes i fyra kaniner, en åsna och en häst enligt den 448 577 immuniseringsplan som beskrives av H.E. Alexander et al i Journal of Immunology 54: 207 - 211, 1946.

Uttrvcket "partiklar" i föreliggande sammanhang avser nartik- lar som är inerta och neutrala gentemot de andra komponenterna och som kan adsorbera antisera på ett irreversibelt sätt.

Sådana partiklar kan vara pärlor av glas, polybutadien, poly- styren, polybutadien-styren etc. næd en medelpartikelstorlek från ungefär 0,15 till ungefär 0,9 um. Företrädesvis sensi- biliseras polystyrenlatexpartiklar med en enhetlig diameter av ungefär 0,81 um i form av en 10 %ig (vikt/volym) suspen- sion i destillerat vatten med ovannämnda antisera på följande Sätt: 'De hela antisera som erhållits från åsna och kanin utspäddes vardera l/500 och helt hästantiserum l/200 i standardiserad glycinhuffrad saltlösning (0,1 M glycin, 0,9 % natriumklorid, pH 8,2)._ Antikroppar adsorberades på latexpartiklar genom tillsats av en del 10-procentig latexsuspension på 80 delar utspätt antiserum och inkuberades vid rumstemperatur i en timme. Fritt.antiserum dekanterades efter centrifugering i l0 minuter i l2.000 G. Latexpellets suspenderades i glycin- buffrad saltlösning med en ringa mängd protein, nämligen 0,l % humant serumalbumin eller O,l % serum från åsna, kanin eller häst vid olika tillfällen för erhållande av en 0,125- procentig latexsuspension vilken på nytt centrifugerades och suspenderades i glycinbuffrad saltlösning. Fetalt kalvserum, som enligt radioimmunoanalys visade sig inte ha några anti- PRP-antikroppar, användes såsom utspädningsmedel för standar- -diserade lösningar av PRP-antigen.

Agglutination utfördes genom tillsats av 0,05 ml andelar av vätska innehållande antigen till 0,01 ml sensibiliserad latex- lösning på en serologisk platta med keramiska ringar. Plattan roterades (180 varv per minut) i en fuktighetskammare vid rumstemperatur och undersöktes med avseende på aqglutinering efter 45 minuter. Ag lutinerinren graderades 4+ när aggluti- 9 3 g 440,57? nationsblandningen klarnade och grova klumpar av latexpartik- lar iakttogs, 3+ när blandningen förblev slöjig men grova klumpar iakttogs, 2+ när blandningen förblev slöjig men granu- laritet lätt kunde iakttagas, och l+ när blandningen förblev slöjíq men endast minimal granularitet íakttogs. Agglutine- . r . ,+ > Ü G . _ _" rlng som ar llka med 2 eller storre ansags positiv. De jam- förande sensitiviteterna anges nedan i tabell l. ggBELL I Sensitivitet vid LPA-analys med sex antisera med avseende på Haemophilus Influenzae typ b.

Serum Anti-PRP-antikroppl Anti-PRP-antikroppl Sensiti- i helserum (pg Ab adsorberad på vitetz protein/ml) latexpartiklar (pg för LPA Ab protein/ml LP) , (ng PRP/ ml) Åsna ll.200 ' 3,40 0,2 Kanin l 96.000 7,84 l,0 2 68.000 I 7,20 1,0 3 45.000 6,56 5,0 4 10.300 . l,95 10,0 näst ' 3.100 1,84 1 1000 l Bestämd enligt radioantigenbindande analys 2Lägsta koncentration.av PRP-5 i fetalt kalvserum som ger agglutination av 2+ eller större.

Tabell l visar klart att kvaliteten av det antiserum som an- vändes för att sensibilisera latexpartiklarna är kritisk för sensitiviteten för 1atexpartikelagglutinationstestet för detektion av PRP-antigen. Av resultaten i tabell l framgår klart att sensitiviteten inte enbart kan förutsägas på basis av koncentrationen av PRP i antíserum bestämd enligt radio- antigenbindande analys. Ett åsneantiserum, som endast inne- höll 12 % så mycket antikropp som det bästa kaninantiserum, 448 577 gav en femfaldigt större sensitiv latexpartikelbildning.

Penna skillnad med avseende på sensitivitet kunde inte för- klaras genom mer effektiv beläggning av latexpartiklarna med åsneantikroppar, emedan latexpartiklar belagda med kaninanti- 7 Serum hade 2,3 gånger mer absorbentantikropp. Agglutinerings- aktiviteten för åsne- och kaninantiserum för röda blodceller från får belagda med PRP var lika trots den mycket höga koncentrationen av PRP-bindande aktivitet i kaninantiserum.

Bestämning av associationshastigheter visar att åsneantikrop- par kombineras mycket hastigare med PRP-antigen än anti- kroppar från kanin. Associationshalvtiden är 20 minuter för åsneantikroppar och-mer än 60 minuter för kaninantikroppar.

Anledningen till denna skillnad med avseende på associations- hastighet är inte känd.

Dissociationshastigheten för komplex av antigen/antikropp i närvaro av'överskott av antigen är ett mått på bindningstät- heten eller affiniteten för antikroppen. Kaninantikroppar dissocierar mer långsamt från polyribos-fosfat än åsneanti- kroppar och har därför en större affinitet för antigenet.

Detta resultat ger stöd åt hypotesen att kombinationshastig- f heten för antigen och antikropp är mer signifikant vid agglu- tineringsförfaranden än styrkan hos reaktion mellan antigen och antikropp. b. iAnvändning av makroglobulinfraktion för att belägga LP Molekylsiktskromatografi av olika animala antisera till bakteriella polysackarider har visat att majoriteten av anti- polysackaridantikroppar hos hästdjur (åsna, häst) återfinnes i gmakroglobulinklassen, som frigöres i tomrummet i denna kolonn.

I motsats därtill återfinnes majoriteten av kaninantikroppar i klassen IgG, som_frigöres senare. Såsom framgår av tabell 2, kan användning av makroglobulinfraktionen från åsne- eller hästantiserum vid en koncentration av 50 pg protein/ml för sensibilisering av latexpartiklarna markant förbättra sensi- tiviteten hos relativt svaga antisera från hästdjur. Sensiti- _ ..-...._._..__..,..._.._..__-..--..__- l44s 577 8 viteten för de bästa antisera förbättras inte ytterligare genom denna modifikation, även om agglutinationssreaktionens klarhet i allmänhet är bättre med den tomma volymfraktionen.

Användning av fraktionen IgG i kaninsera gor inte jämförbara förbättringar med avseende på sensitivitet eller agglutina- tionens klarhet.

TABELL 2 Jämförelse av sensitiviteter för latexpartiklar belagda med ' helt serum eller makroglobulinfraktioner i antisera från häst- djur gentemot bakteriella polysackarider.

Djur Antiserum mot Sensitivitetx för Sensitivitet _ " LP belagd med för LP belagd helt serum (1/500 med makroglo- utspädning) bulinfraktion (50 pg pro- tein/ml) Ãsna-F H. influenzae I l ng/ml 0,2 ng/ml - typ b Äsna-l32 'H. influenzae 0,2 ng/ml 0,2 ng/ml . typ b Åsna~W.J. H. influenzae 2 ng/ml 0,5 ng/ml typ b ' Åsna-Y Neisseria 4 l ng/ml 0,2 ng/ml meningitidis grupp Y Häst-49 N. meningitidis 0,5 ng/ml 0,2 ng/ml qrupp Å Häst-46 N. meningitidis >l0.000 ng/ml 2 ng/ml 1 grupp B _ .f Xnen lägsta koncentration av antigen som ger 2+-agglutinering eller däröver anges. c. Tvättning av belagd LP För att åstadkomma ytterligare förbättring av sensitiviteten för âsneantisera jämfördes de antikroppbelagda latexpartik- 448 577 larna, belagda med olika utspädningar av åsneantiserum i glycinbuffrad saltlösning, i otvättat tillstånd och efter l, 2 och 3 tvättningar med glycinbuffrad saltlösning innehållande l/1000 delar fetalt kalvserum och resultaten anges i tabell 3.

TABELL 3 Effekt av utspädning av antiserum och tvättning av latexpar- tiklar på sensitiviteten vid latexpartikelagglutineringstestet för polyribos-fosfat.

Utspädning av Minsta påvisade koncentration av PRPX åsneantiserum (ng/ml) som användes Otvättad Tvättad Tvättad Tvättad för sensibili- x l x 2 x 3 sering av latexpartiklar l/10 200 >l000 >l000 >l000 l/100 50 0,5 0,5 0,5 l/500 2 0,2 0,2 0,2 l/1000 0,5 0,2 0,2 0,2 l/2000 0,2 0,2 0,2 0,5 l/5000 >l000 >l000 >l000 >l000 X 2+-agglutinering eller däröver ansågs vara ett positivt resultat.

Såsom framgår av de i tabell 3 angivna resultaten är låga utspädningar av antiserum insensitiva. Med utspädningar av l/500 och däröver uppnås maximal sensitivitet förutsatt att latexpartiklarna är tvättade. Otvättade latexpartiklar uppnår maximal sensitivitet med endast ett snävt intervall av utspädningar. Två tvättningar gav maximal sensitivitet under det att tre tvättningar kan resultera i minskad sensitivitet.

Sensibiliserade latexpartiklar från tvättningsförsöket förva- rades vid 4OC och testades på nytt efter 12 och 24 månader. 448 577 10 Latexpartiklar sensibiliserade med åsneantiserum i utspäd- ningarna l/500 och l/1000 och tvättade två gånger bibehöll sin ursprungliga sensitivitet, under det att icke tvättade latex- partiklar var 2 - 4 gånger mindre sensitiva efter 24 månader. d. Inkubationsperiodens längd Fig. 1 i ritningarna visar relationen mellan analyssensitivi- tet och inkubationsperioden. Stora koncentrationer av antigen agglutinerade latexpartiklarna inom 5 minuter. Sensitiviteten ökade hastigt under de första 45 - 60 minuterna och därefter långsamt och nådde ett maximum av 0,05 nanogram/ml vid de mest sensitiva beredningarna vid 10 timmar. Hästdjursserumet enligt uppfinningen var mer sensitivt än kaninserum vid samtliga inkubationsperioder. Vid utförande av de jämförande försöken blandades 50 mikroliter provlösning och 10 mikroliter belagda latexpartiklar såsom beskrives nedan på en serologisk skiva och roterades vid 180 varv per minut vid rumstemperatur.

Skivorna belades och fuktigheten upprätthölls med svampar mättade med hett vatten. Skivorna iakttogs därefter vid angivna tidpunkter.

Förlängning av inkubationsperioden från 5 minuter till 45 minuter eller däröver resulterar i en l0 - 20 -faldig sensiti- vitetsökning. För praktiska kliniska ändamål valdes en inku- bationsperiod av 45 minuter som normalt avlästes vid inter- valler om 5 - l5 minuter vid användning av latexpartiklar belagda med ett hästdjursantiserum. Sådana latexpartiklar hade en sensitivitet av 0,2 nanogram antigen per milliliter vätska. Det kunde förväntas att ökning av sensibiliteten för partikelagglutinationsanalysen även skulle öka förekomsten av icke specifik agglutination och när det gäller serumprov agglutinerade dessa latexpartiklar 69 % av sera från sjukhus- behandlade barn. Denna väsentliga olägenhet har tidigare begränsat en vidsträckt användning av denna analysmetod.

Faktorer som påverkat agglutinationen av latexpartiklarna belagda med gammaglobuliner är värmelabila serumkomponenter (förmodligen komplement) och värmestabila antiglobuliner, av Q A ll vilka låga halter vanligen återfinnas i humansera, särskilt från patienter med kroniska inflammationssjukdomar.

Icke specifik.agglutination konstaterades genom agglutina- tionen av kontrollatexpartiklar som sensitiverats med helt icke immunt animalt serum. När latexpartiklar belagda med makroglobulin användes är kontrollatexpartiklarna belagda med makroglobulinfraktionen från icke-immunserum.

Enligt föreliggande uppfinning reducerades frekvensen av icke specifik aqglutination med humansera till 2 % eller lägre genom (i) tillsats av icke-immunt antimalt serum till de sensibiliserade latexpartiklarna; (ii) genom tillsats av en serumbuffert innehållande en polyanjon och/eller ett reduce- rande medel direkt till inkubationsblandningen och/eller (iii) genom värmeínaktiverinq av sera.

Förekomst-av icke snecifik agglutination bestämdes med sera från barn och vuxna, som var patienter på sjukhus och inte hade H.i.b.-sjukdom- Samtliga sera testades med latexpartik- lar sensibiíiserade med åsneantiserum (anti-PRP LP) och med latexpartiklar sensibiliserade med icke-immunt åsneserum (kontroll-LP).

Vid preliminära försök testades sera innehållande värmestabila agglutiner genom tillsats av lO mikroliter av ett reduktions- medel såsom.l,4-ditiotreitol (DTT) eller 2-merkaptoetanol (ME) till inkubationsblandningen vid inkubationens början. Opti~ mala koncentrationer var 0,018 M för DTT och 0,35 M för ME (de slutliga koncentrationerna i inkubationsblandningen var o,oo2e M för nfrm och mos M för ME).

Tabell 4 nedan sammanfattar de resultat som erhölls med 104 pediatriska sera, som lagrats i minst 24 timmar vid 4°C före testning. 4> is Go) G1 ~J 1 ||=-, gjziBELL Förekomst av icke specifik agglutination i lagrade seral 12 från sjukhusbehatdlade barn utan Haemophilus influenzae typ b.

Agglutination med anti-PRP LP negativ Agglutination med kontroll-LP Ingen behandling av serum (n = 104) 32 Värmeinaktivering av serum (n = 104) 49 negativ (31%) (47%) Tillsats av normalt åsneserum (¿,5%) till LP in = 104) 72 Värmeinaktivering av serum och till- sats av normalt åsneserum (:,5¿) till LP (n t IU4) 75 Tillsats av normalt åsneserum (2,5%) till LP och till- sats av DTT2 till serum (n = 53)3 (69%) 52 (98%) l ' positiv positiv 65 (63%) 47 (45%) 23 (22%) 23 (22%) l (2%) negativ positiv' positiv negativ 3 (3%) 4 (4%) l (l%) 7 (7%) 7 (7%) 2 (2%) 5 (5%) 1 (lt) 0 0 Lagrade i minst 24 timmar vid 4°C före testning. 2Ditiotreito1, slutlig koncentration 0,0026 M i inkubations- blandningen. 3 detta test. 69 % PRP och alla utom 4 % Endast 53 av 104 prov innehöll tillräckligt med serum för av dessa sera gav icke specifik agglutination med anti- identifierades genom kontroll~LP.

Värmeinaktivering (60oC i l5 minuter) reducerade endast i ringa mån icke specifik_agglutination till 53 % och tillsats av icke-immunt åsneserum till både anti-PRP och kontroll-LP minskade icke specifik agqlutination till 31 %; tillsats av 10 mikroliter av ett reduktionsmedel, d v s ditiotreitol, W 448 577 13 minskade förekomsten av icke specifika reduktioner till 2 %.

Resultat erhållna med 52 lagrade sera från vuxna personer var liknande. Endast ett serum som gav icke specifik agglutina- tion (positiv med anti-PRP-LP och kontroll-LP) vid tillsats av 2,5 % normalt âsneserum sattes till latexpartiklarna och DTT sattes till inkubationsblandningen.

För att bestämma huruvida färska sera gav en större förekomst av icke specifik agglutination framtogs 100 sera från vuxna och placerades omedelbart på is och analyserades samma dag.

Varje serum testades med och utan reduktionsmedel (ME) och med- och utan värmeinaktivering (6000 i 5 minuter). Agglutina- tionen testades med anti-PRP-LP och kontroll-LP som vardera innehöll 2,5% normalt åsneserum och korresponderade i samtliga fall. Agglutinationsmönstret sammanfattas i tabell 5. ¶gBELL 5 Icke specifik agglutination med färska sera från 100 vuxna utan Haemophilus influenzae typ bl.

Mönster Ingen värme- Värme- inaktivering inaktivering -Antal Utan ME ME2 Utan ME ME2 sera Tolkning l. (~) (t) (“) (-l 43 7 Inga antiglo- ' buliner - Inga komple- ment 2. (+) (~) (+) (-) 28 Enbart anti- globuliner 3. (+) (+) (~) (-) 4 _ Enbart komple- - ~ ment 4, (-) 0 (+) _ (~) (-) 14. Enbart komple- ment ("reakti- verat" med ME) K5, (+) (+) (+) (-) l0 Antiglobuliner och komplement 448 577 14 Ingen värme- Värme- » inaktivering inaktivering ¿¿¿5 gg ME2 utan ME ME2 w Antal sera som gav icke specifik aggiutinatiøn 42 38 38 f 1 lAlla analyser utfördes med anti-PRP- och kontroll-LP innehål- lande 2,5 ? normalt åsneserumß Fullständig överensstämmelse rådde mellan resultat erhållna med anti-PRP- och kontroll-LP. 32-merkaptoetanol, slutlig koncentration 0,05 M i inkubations- blandningen. 42 % av de obehandlade sera (ingen värme, inget reduktions- medel) gav icke specifik agglutination. När ett reduktions- medel (ME) tillsattes blev 28 av dessa sera negativa (mönster 2) som visar närvaro av antiglobuliner. 14 sera som initiellt varit negativa blev positiva (mönster 4) vilket visar att ett värmestabilt agglutinin reaktiverades av merkaptoetanol.

Nettoeffekten av ME enbart var att reducera icke specifik agglutination till 38 %. En liknande förekomst av icke specifik agglutination uppnås med värmeinaktivering enbart.

Kombination av värmeinaktivering av dessa sera och tillsats av ett reduktiorsmedcl till inkubcringsblandningen reducerade emellertid förekomsten av icke specifik agglutination till storleksordningen 2 % eller lägre.

Hmudan värmcinaktivering är tidskrävande har en alternativ metod för att eliminera icke specifik agglutination genom inverkan av värmelabila serumfaktorer utvecklats. Olikartade polyanjoner innefattande natriumpolyanetolsulfonat (SPS), dextransulfat, karragenin och heparin förhindrar den icke specifika agglutinationen av globulin-belagda latexpartiklar genom inverkan av värmelabila serumfaktorer. 100 färska sera från vuxna personer testades med en serum- 448 577 15 buffert innehållande både ME (såsom ovan) och SPS vid en koncentration av 0,05 %. Endast ett av de 100 sera gav icke specifik agglutination med anti-PRP- och kontroll-LP. Icke specifik agglutination med detta serum eliminerades genom upp- hettning. Såsom önskvärt tillsattes en serumbuffert innehål- lande både reduktionsmedel och en polyanjon till inkubations- blandningen av.en stabiliserad sensibiliserad latexpartikel och ett serumprov.

Icke~specifik agglutination i andra kroppsvätskor De flesta urinprov ger icke specifik agglutination med anti- PRP- och kontroll-LP. Detta kan elimineras antingen genom upphettning (l00oC i 5 minuter) eller genom att filtrera urinen. Vid den föredragna utföringsformen användes ett filter med porstorleken 0,45 pm.

Prov av cerebrospinalvätska ger mycket sällan icke specifik agglutination, vilken elimineras genom upphettning (l00oC i 5 minuter). PRP-antigenet är stabilt vid den ovannämnda upp- hettningen och filtreringen.

Claims (3)

448 577 l6 PATENTKRAV

1. l. Ett direkt agglutinationstest för detektion av anti- gener i kroppsvätskor som kan antas innehålla sådana anti- gener, k ä n n e t e c k n a t därav, att man kombinerar ett prov av en kroppsvätska utvald bland gruppen bestående av serum eller plasma med ett flytande reagens, som agglutineras vid kontakt med vätskor som innehåller antigener, vilket reagens innefattar en bärare belagd med animalt antiserum gentemot nämnda antigener suspenderade i ett kompatibelt fysiologiskt buffertsystem och icke immunt animalt serum från samma djurart som bildat antiserumet, varvid antiserumet är helt hästdjursantiserum, särskilt makroglobulinfraktionen därav, med ett buffertsystem innehållande en polyanjon, som kan minska effekten av värmelabila beståndsdelar i provet, och ett reduktionsmedel, som kan minska antiglobulinantikropparna i provet, inkuberar blandningen och därefter visuellt bestäm- mer agglutinationsgraden, varvid polyanjonen utväljes från gruppen bestående av natriumpolyanetolsulfonat, dextransulfat, karragenin och heparin, och varvid reduktionsmedlet utväljes från gruppen bestående av 2-merkaptoetanol, ditiotreitol, glutation och cystein.

2. Ett direkt agglutinationstest enligt patentkravet 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att man upphettar kropps- vätskan och kombinerar den värmebehandlade kroppsvätskan med ett reduktionsmedel, som kan reducera antiglobulinantikroppar i kroppsvätskan och det flytande reagenset enligt patent- kravet l, inkuberar blandningen och visuellt bestämmer agglu- tinationsgraden, varvid reduktionsmedlet utväljes från gruppen bestående av 2-merkaptoetanol, ditiotreitol, glutation, cystein och liknande.

3. Ett direkt agglutinationstest enligt patentkravet 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att inkubationen utföres under en tidsperiod av 45 minuter eller längre. .g x 1% 448 577 Figur l Minsta koncentration av PRP-5 detekterad av LPA efter olika inkubationsperioder. Agglutination med storleken 2+ eller större har ansetts vara ett positivt resultat. Linjen A A avser LP belagt med kaninantiserum nr 144; linjen o______o avser LP belagt med âsneantiserum nr 132. 5ß~¶ 2D C50 Sensitivitet (ng PRP/ml) QW F I I ' I L Lä! xo 20 :o 45 so 120 G00 Tid (min.)