FR2575162A1 - Procede de synthese d'un dna a longue chaine - Google Patents

Abstract

PROCEDE DE SYNTHESE D'UN DNA A LONGUE CHAINE, CARACTERISE EN CE QUE DES BLOCS AYANT 4 A 8 SEQUENCES DE BASES SONT LIES PAR VOIE PUREMENT CHIMIQUE PAR UN PROCEDE "EN PHASE SOLIDE" (PROCEDE AU TRIESTER) EN UTILISANT UN CPG AMINE COMME SUPPORT.

Description

1. La présente invention concerne un nouveau procédé de synthèse d'un DNA

à longue chaîne portant de l'information

pour la synthèse de protéines déterminées, et plus particu-

lièrement un procédé de synthèse d'un DNA à longue chaîne par voie purement chimique, c'est-à-dire sans utiliser d'en- zymes, par un procédé dit "en phase solide", en utilisant un bloc de 4 à 8 séquences de base et un CPG aminé comme support. Il est connu que la synthèse de polypeptides par la technologie des gènes en utilisant un gène synthétique

est possible par les stades de (1) synthèse d'un gène struc-

tural; (2) recombinaison du gène dans un plasmide approprié;

(3) transformation d'un h6te approprié par le plasmide chi-

mère formé; et (4) préparation du polypeptide désiré par

culture de la substance transformée.

Depuis une époque récente, la mise au point d'une sonde à DNA attire l'attention du public en tant que moyen nouveau de la technologie des gènes. Il s'agit d'un procédé d'identification d'un DNA et d'un RNA inconnus qui est un produit transcrit par une hybridation d'un DNA et 2.

d'un RNA à toron unique, lesquels sont connus dans la techni-

que, en utilisant les propriétés du DNA et du RNA de former

un duplex en choisissant une substance complémentaire, rela-

tion qui est exactement celle du gabarit de moulage et de l'objet moulé.. Comme une identification très sensible et

très rapide est possible en utilisant le procédé d'hybrida-

tion, ce procédé peut être appliqué au diagnostic précis d'une maladie en trouvant un DNA et un RNA particuliers au niveau des gènes dans le sang et les cellules des malades et dans les bactéries pathogènes. En conséquence, le DNA est

important comme agent de diagnostic étant donné son utili-

sation comme sonde à DNA.

En ce qui concerne le DNA indiqué ci-dessus com-

me gène structural et son utilisation comme sonde à DNA, il est connu, pour ce qui est de sa nature, que plus la séquence de bases est longue, plus la source d'information est importante et plus le domaine d'utilisation comme sonde à DNA est vaste. Cependant, il est également connu que plus la séquence des bases est longue, et plus sa synthèse est

difficile.

En conséquence, il était souhaitable de disposer d'une technique pour préparer par synthèse d'une manière

aisée un DNA à longue chaîne.

Le procédé classique de synthèse du DNA est le

suivant. On prépare d'abord par synthèse chimique des frag-

ments de DNA relativement courts comprenant 10 à 20 radi-

caux basiques, puis on les combine pour préparer des frag-

ments ayant une structure totale de DNA à double toron pré-c.

sentant l'information sur la synthèse peptidique désirée,et enfin on les combine en utilisant une enzyme appelée DNA ligase. Par ce procédé, cependant, on ne fabrique que

des fragments relativement courts comportant 1 base (monomé-

re), 2 bases (dimère) ou 3 bases (trimère) avant la conden-

sation en blocs, et il n'est pas possible de préparer par

synthèse un DNA long avec par exemple 80 radicaux.

3.

En outre, dans ce procédé, il est essentiel d'uti-

liser une enzyme appelée DNA ligase. Par conséquent, lors-

qu'on prépare par synthèse un DNA a double toron comme gène,

il est nécessaire que toutes les séquences de bases cons-

tituant le DNA & double toron soient préparées par synthèse en même temps. En conséquence, le procédé ci-dessus n'est pas

aussi efficace dans un procédé de synthèse d'un DNA à dou-

ble toron.

La demanderesse a poursuivi des études pour surmon-

ter la difficulté technique ci-dessus, et elle a réussi à préparer par synthèse-un DNA comportant par exemple 46 bases, en utilisant un procédé dit "procédé au triester" (parmi les

procédés dits "solides"), dans lequel on utilise comme sup-

port du polystyrène à 1 %, et les composés de 4 bases (té-

tramère) ou 5 bases (pentamère) sont soumis à une condensa-

tion répétée.

Même par ce procédé, cependant, le nombre de ba-

ses dans le DNA obtenu est de 50 au maximum, et il reste difficile de préparer par synthèse un DNA ayant des chaînes

comportant jusqu'à 80 à 150 radicaux.

Compte-tenu de ce qui précède, la demanderesse a

poursuivi des études supplémentaires en portant son atten-

tion (1) sur la synthèse d'un DNA à longue chaîne portant

autant d'information de gène que possible, et (2) sur la syn-

thèse dans des conditions encore plus avantageuses, et elle

a finalement réalisé la présente invention.

Les caractéristiques de la présente invention sont les suivantes: (1) les nombres d'unité avant la condensation en blocs sont de 4 à 8 bases (octamère); (2) parmi les procédés dits "en phase solide", on utilise le "procédé au triester"; et

(3) on utilise du CPG aminé comme support.

La présente invention sera encore illustrée par ce qui suit: Avant la condensation, chaque bloc peut être

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4. obtenu de la manière classique, dans laquelle chaque base

est soumise à une synthèse en phase liquide.

Le CPG aminé (verre à pores de taille réglée)

(voir Tetrahedron, 24, 747-750, 1983) utilisé dans la pré-

sente invention est utilisé comme support dans le procédé

en phase solide. Au groupe amino de cette substance, on com-

bine de la désoxythymidine qui est transformée en 3'-succi-

nate par le procédé habituel. Celui-ci est utilisé comme

support pour le nucléoside. Chacun des blocs désirés est pro-

longé successivement, sur cette résine, en direction de l'élément 5'terminal. Comme agent de condensation, on peut

utiliser par exemple du mésitylène sulfonyl-3-nitrotriazoli-

de (MSNT). Le DNA ainsi obtenu est à un seul toron, et le DNA à toron complémentaire qui est nécessaire pour la préparation

du DNA duplet peut -être aisément obtenu d'une manière similai-

re. On peut aussi obtenir très aisément ce DNA duplet au moyen de DNA polymérase, en utilisant un fragment court (10 paires de bases, par exemple), qui est complémentaire de la région 3'-terminale du DNA à toron unique obtenu. Le fait

que la DNA polymérase puisse être utilisée est un des méri-

tes les plus importants de la présente invention, puisque la réaction de condensation peut être accomplie sans l'aide

de DNA ligase qui a été largement utilisée dans les procé-

dés classiques.

Le DNA duplet obtenu est combiné pour donner un plasmide vecteur par le procédé connu, puis transformé dans des bactéries telles qu'Escherichia coli, et la souche est cultivée pour donner le polypeptide désiré. Dans les stades

ci-dessus, on peut appliquer divers moyens de la-technolo-

gie des gènes qui ont déjà fait leurs preuves.

Il est possible, conformément à la présente inven-

tion, de préparer par synthèse un DNA ayant jusqu'à 80 a 150 radicaux, et on peut par conséquent préparer par synthèse des polypeptides ayant 15 à 30 aminoacides par les moyens connus de la technologie des gènes. Par exemple, on peut 5. préparer par synthèse les polypeptides suivants: le facteur

d'inhibition de la libération des hormones (la somatostati-

ne contenant 14 aminoacides), le stimulant de la sécrétion gastrique (gastrine, contenant 17 aminoacides), le remède a l'ulcère duodénal (secrétine, contenant 27 aminoacides), le stimulant de la sécrétion de l'hormone de croissance, l'agent pour augmenter le taux d'insuline et de sucre dans le sang (glucagon, contenant 29 aminoacides), un agent

analogue à la morphine (béta-endorphine, contenant 31 amino-

acides) et le remède contre l'hypercalcémie (calcitonine, contenant 32 aminoacides), etc. En outre, le DNA à longue chaîne de la présente invention s'applique non seulement à des séquences de bases de DNA de parties structurales de gènes, mais aussi à la préparation d'un DNA général comprenant des sites régulateurs et des séquences déterminées, ainsi qu'à une sonde de DNA à

longue chaîne reconnaissant leurs structures. En conséquen-

ce, la présente invention peut être utilisée avec succès pour

la mise au point d'agents de diagnostic.

Conformément à la présente invention, un DINA à longue chaîne peut être préparé par synthèse d'une manière simple et en grandes quantités. Le DNA à longue chaîne de la présente invention peut être utilisé efficacement (1) comme source d'information de gène concernant la synthèse de polypeptides et (2) comme source pour l'application

d'une sonde à DNA dans la technologie des gènes.

La production de DNA a été de 0,1 OD (1OD équi-

vaut à environ 50 microgranmes) pour un lot, au maximum.

Cependant, conformément à la présente invention, il est à présent possible de fabriquer dans des quantités allant

jusqu'à 30 à 50 OD par lot. En conséquence, on peut s'atten-

dre à une expansion du domaine d'utilisation du DNA à longue

chaîne comme gène et comme sonde à DNA.

EXEMPLES

La présente invention sera encore illustrée par des exemples concernant la synthèse de l'endorphine dont les 6. activités, physiologiques telles que l'action analgésique

sur le système nerveux central et l'action d'hormone endocri-

ne, sont connues.

(1) Synthèse de chacun des blocs constituant des séquences de base contenant le gène endorphine.

La séquence d'aminoacides des endorphines est con-

nue, et la séquence de bases du DNA lui correspondant peut

être librement choisie en se référant à un tableau de l'uti-

lisation des codons. On les trouvera ci-dessous en mme temps

que leur relation avec chacun des blocs constituant les sé-

quences de bases de DNA utilisées dans la présente invention.

Les colonnes supérieure, moyenne et inférieure correspondent respectivement à chaque bloc (les chiffres qui s'y trouvent sont les numéros des blocs), & la séquence des bases et à la séquence d'aminoacides correspondante. Incidemment, les sites d'enzymes de restriction sont donnés aux deux extrémités des séquences de bases du DNA. Ces sites sont utilisés pour

insérer le plasmide.

*1 1d dOlS dOIS JqI SZ lek nal old Jq1 uT9 5 aS;ú1 ni9:aS lqL @- - g -t I[Z lea noq o2d JqI u[9 Jo$S&s1 hi9 JO$ JqY O s515 Sil V3 lo iV3 L3L OVi sVs 5 3e loV -_*-9-* - 1 8 6 o'z tel aqdgs<15 gis10 o g sd

3l11 311 159 15 3V1 91v 9O335V25L23.

-01 o.- S S.-9 - t -

au-Ftrctopua _ t 1nal _' si Iîsd dOIS dO7S J'I 6 55V291355 o11 ?Ti 131 u o, - - ( IVAtoOd qIe lae s ZSZl 1jO t Z ehA na o.zd 'lu ulSJ sAnl JaS 'W 0 5195 I V)33 13V 11v 131 oui 515 13I 13V

"- 9 L - 8 - 6

IaI< aqd ú15 úI5 'l lY l'y l cSd D1V 311 155 sls 3M1 353 153 3391351233 aupcdLopu2 _ OL

I9 SLSZ

8. T - t Leu 3 - Endorphine

* 13-= 16----15 ' -10--

s' ACCTGCAGCC ATG TAC CGT GGT TTC TTC Pst I met Tyr Cly GIy Pbe Leu

9 " 8 - 7, -: 6

ACT TCT GAG AAG TCT. CAA ACT CCA TTC GTG

Thr Ser Glu Lys Ser Gin Tbr Pro Leu Val

5-217----- 1

=17 3 = -,

ACT TTG TAG GGCTGCAGGT '

Thr Leu STOP Pst I Q T - Endorphine

* 13 - 1 2 1-. 10-

?' ACCTGCAGCC CGT CGC TAC GGT 'GGT TTC ATG

I_ Pst I Ara Art Tyr Gly Gly Phe Met

a, S 7 -6-

ACT TCT GAG AAG TCI CAA ACT CCA TTG GTG

Thr Ser Glu Lys Ser Gln Tbr Pro Leu Val 2 1

-17---- 3

ACT TTG TAG GGCTGCLAGGT.'

t Thr Leu STOP Pst I Parmi les blocs constituant les gènes endorphine cidessus, le bloc 7 a été préparé par synthèse en passant

par les stades indiqués ci-dessous.

9. bzbz ( 1) d (DnTr) AeAe c ITEA bzbz () d (DnTr) Ae Ce c bzbz BSA bz (i) d (DOTr) Ae eo' d (DITr) TeCecc bzbz TA bbzbz IdA Ce d (DMTr) CeAece (VI> NoN bz j BSA bbbbd (DnTr) TeCe o bzbzb2bz (bl) d (DMlTr) AeAeAeCect bzbz () d4Ce Ae CE

TEA ' 1)

bzbzbzbz Mi d (DflTr) AeA'e ACpo- bzbzbz (X I) d (D.1Tr) TeCeiCAecú I BSA bzbzbz d.E C2e CE A? cE ' (X i) ixi

S T ( X)

bzbzbzbz bzbzbz d (DllTr) AeAeAeCeTeCe CeCEec

1 T- A ( X IV)

bzbzbzbz bzbzbz 4d (DfTr) AeAe -CeTeCeCeAeo - --Block 7 DMIr: 4,4' diméthoxytolityle bz. bAz: N-benzoyladénosyle AÀ bz N-benzovlcytidvlyvle c. T: Tymidylyle E: Phosphate d'o-chlorophényle BSA: Acide benzènesulfonique TEA: Triéthylamnine 10. D'autres blocs (1-6, et 8-17) constituant des gènes du type endorphine peuvent être préparés par synthèse d'une

manière similaire. Les rendements sont donnés ci-dessous.

Blocs Séquences de bases Rendement I CAGo 77

2 GCTG 94

3 TAGG 70

4 TTAA 104

TGAC 93

6 TTGG 67

7 AAACICCA 70

8 GAAGTCTC 62

9 AC.iCTIGA 65

GT-TCATG 65

11 CTACGTG 70

12 GCCCCICA 65

13 ACCTGCA 65

14 GTTCrTG 70

GTACGGIG 67

16 GCCAT 75

17 TTG 95

(2) Synthèse des gènes endorphines: Le gène alpha-endorphine (désoxy 80 mère) contenant des sites d'enzyme de restriction a été préparé par synthèse par un procédé en phase solide de la manière suivante: 1. Une résine désoxytymidine CPG est lavée avec CH2C12/MeOH. 2. La détritylation est effectuée avec de la BSA à 2 %/CH2Cl2 (ceci est effectué à plusieurs reprises et 11.

rapidement jusqu' ce que la coloration disparaisse).

3. On effectue un séchage azéotropigue après

substitution par de la pyridine.

On ajoute une solution de chacun des blocs, on la soumet à un séchage azêotropique et on ajoute du MSNT et de la pyridine pour la réaction. On laisse reposer à la

température ambiante et on lave avec de la pyridine.

4. On ajoute une solution de diméthylaminopyri-

dine O,lM/pyridine et de l'anhydride acétique, on laisse

reposer à la température ambiante et on lave à la pyridine.

On effectue plusieurs fois l'opération ci-dessus, 13 fois au total. Le rendement moyen de la réaction est de

-84 %. Puis, on déprotège la résine, à la température ambian-

te, avec une solution de tétraméthylguanidine O,lM-pyridine aldoxime (voir C. B. Reese, et coll.: Tetrahedron Lett., 2727, 1978) dans du dioxane-eau, puis on la lave avec de la pyridine-eau, on concentre le liquide de lavage sous vide, on y ajoute de l'ammoniaque concentrée et on chauffe le

mélange. On en fait évaporer l'ammoniac et une partie du ré-

sidu est prise en utilisant le groupe diméthoxytrityle comme

cible pour calculer le rendement du stade final.

On soumet la solution réactionnelle résiduelle à

des chromatographies ouvertes en phase inversée (gel de sili-

ce C18 pour Prep 500 fabriqué par Waters), par échange d'ions (DEAEtoyopal) et en.phase inversée (gel de silice C18, Gel TSK 10-20 microns), ce qui donne le gène alpha-endorphine pur (contenant des sites d'enzyme de restriction) (= désoxy

mère).

La pureté est confirmée par HPLC (Nucléosil 300-7 C18) et par électrophorèse, et ses séquences de base sont confirmées par la méthode de Maxam-Gilbert. Le résultat

est donné dans les figures 1 à 3.

On prépare de la même manière le gène alpha-

(Leu5)-endorphine contenant un site d'enzyme de restriction) (désoxy 77 mère), le gène gamma-(Leu5)-endorphine (contenant 12. un site d'enzyme de restriction) (désoxy 77 mère) et le gène ganmma-endorphine (contenant un site d'enzyme de restriction)

(désoxy 80 mère).

(3) Synthèse du DNA duplet et sa combinaison avec le plasmide vecteur. On mélange chaque molécule de désoxy 80 mère et d'amorce de nucléotide synthétique qui est complémentaire de l'élément 3'-terminal du premier, on les chauffe à 650C et on les refroidit à la température ambiante pour cuire le désoxy 80 mère et l'amorce. Puis on ajoute de la E. coli polymérase I (fragment de Klenow) par un moyen classique et

on la fait réagir à 370C pendant 30 minutes, de façon à trans-

former le DNA en sa forme à double toron.

On récupère le DNA sous forme de précipité dans

l'éthanol, on fait réagir à 370C pendant 30 minutes en utili-

sant de la polynucléotidekinase T4 et on phosphoryle les

deux éléments 5'-terminaux du DNA à double toron.

On coupe ensuite le plasmide vecteur pUC 8 DNA

avec une enzyme de restriction Pst 1, on l'ajoute à la solu-

tion de DNA à double toron ci-dessus, on le fait réagir à 160C pendant une nuit avec de la T4 DNA ligase, et on combine le

DNA désoxy-80 mère à double toron avec le plasmide vecteur.

(4) Clonage du gène endorphine contenant le plasmi-

de. On transforme le plasmide préparé comme ci-dessus dans une souche de E. coli JM 103 par des moyens classiques, puis on le choisit en utilisant une déficience d'activité de bêta-galactosidase présente dans le pUC 8 comme cible,

et on recueille les molécules de plasmide par clonage à par-

tir de la souche.

I1 est confirmé que le plasmide dans lequel le gè-

ne endorphine a été inséré dans l'orientation et la position correctes est tel que désiré conformément a la méthode de Maxam-Gilbert. (5) Préparation d'endorphines Une souche d'E. coli JM 103 transformée est 13.

pré-cultivSe une nuit dans un milieu LB, elle est transplan-

t6e dans un milieu 2YT et soumise & une culture agitée à 37 C.

De i'IPTG est ajouté aux stades de la phase produc-

tive logarithmique (stades initial, moyen et final) pour le

rendre 0,5 mM, et on amorce la synthèse de l'endorphine.

Après avoir été induite par i'IPTG, la protéine condensée est extraite et analysée par HPLC, et l'on trouve qu'il s'est

formé une quantité adéquate de protéine (1-5,0 x 105 molécu-

les par cellule) lorsque l'induction est appliquée au stade

initial de la phase productive logarithmique.

En ce qui concerne l'endorphine alpha du type natu-

rel et l'endorphine gamma ayant un radical méthionine dans une molécule, on les traite par la trypsine de la manière classique. En ce qui concerne l'alpha-(Leu 5)-endorphine et la gamma-(Leu5)-endorphine ayant un radical leucine à la place de la méthionine, on la traite par BrCN. En tout cas, chacune

des protéines endorphines désirée est soumise à une chromato-

graphie sur colonne conformément au procédé général de puri-

fication des protéines, après quoi chacune d'elles est sépa-

rée et purifiée.

Le fait que chacune des molécules d'endorphine

obtenues présente la séquence d'aminoacides désirée est confir-

mé par le fait qu'elles sont identiques à des échantillons déjà obtenus par synthèse peptidique dans l'essai par HPLC

en utilisant un support de phase inversée.

La figure 1 est un autoradiogramme aux rayons X

montrant le résultat d'une électrophorèse sur polyacrylami-

de à 20 % de désoxy 80 mère contenant le gène alpha-endor-

phine préparé par synthèse après détermination par la métho-

de Maxam-Gilbert.

La figure 2 est un autoradiogramme aux rayons X

montrant le résultat d'une électrophorèse sur polyacrylami-

de à 8 % du désoxy 80 mère contenant le gène alpha-endor-

phine préparé par synthèse après détermination par la mé-

thode Maxam-Gilbert.

14.

La figure 3 montre le résultat d'une chromatogra-

phie liquide à hautes performances (Nucléosil 300-7 C18) du désoxy 80 mère contenant le gène alpha-endorphine préparé

par synthèse après détermination par la méthode Maxam-Gil-

bert. En ordonnées et en abscisses, on a respectivement l'absorbance et le temps. Le système de solvants utilisé est l'acétate de triéthylamineacétonitrile et le débit est

de 1,0 ml/minute.

La présente invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au contraire susceptible de modifications et de variantes

qui apparaîtront à l'homme de l'art.

15.

Claims (1)

REVENDICATIONS

1 - Procédé de synthèse d'un DNA à longue chaîne, caractérisé en ce que des blocs ayant 4 à 8 séquences de base sont liés par voie purement chimique par un procédé "en phase solide" (procédé au triester) en utilisant un CPG

aminé comme support.