JPH06292594A - グルカゴンを生産する形質転換酵母 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 酵母によるグルカゴンの製造方法を提供す
る。 【構成】 グルカゴンの発現をコードする遺伝子を含ん
で成る複製可能な発現ビヒクルを含む形質転換酵母。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、酵母においてグルカゴンを産生
するための形質転換酵母株に関する。

【０００２】

【従来の技術】グルカゴンは、ランゲルハンス膵島のα
−細胞から分泌されるポリペプチドホルモンである。こ
れは、次の配列の２９個のアミノ酸からなる単鎖ポリペ
プチドである。 Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ −Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ −Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ −Ａｓｎ−Ｔｈｒ （Ｉ）

【０００３】グルカゴンはその代謝効果のために低血糖
の治療に用いられる。グルカゴンはまた平滑筋における
鎖痙作用と胃酸分泌抑制作用をも示す。グルカゴンは膵
臓抽出物から単離される。屠殺動物の膵臓からのグルカ
ゴン抽出は複雑な方法であり、多くの膵臓が必要であ
る。さらにグルカゴンはタンパク質加水分解による分解
を受けやすいので膵臓抽出物からの生成物は不均質であ
り、膵臓のグルカゴン含有物の約４分の１が得られるだ
けである。

【０００４】ヨーロッパ特許第８１３０２９７８号から
は，グルカゴンの断片または誘導体は次の一般式で知ら
れている。 Ｒ¹ −Ｒ² （II) （式中、Ｒ¹ はＨｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈ
ｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ
−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−
Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐを表わし、Ｒ² はＯ
Ｈ、ペプチド鎖−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌ
ｅｕもしくは−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒまたは最後に言
及した２つのペプチド鎖と同一であるがただしこれらの
２つのペプチド鎖のアミノ酸１個以上が省略された相当
するペプチド鎖を表わす。）

【０００５】式IIで表わされる化合物はグルカゴンと同
じ鎖痙作用と同じ胃酸分泌抑制作用を有するが、しかし
わずかの代謝作用を示すかまたは全く示さない。それゆ
え、式IIで表わされる化合物は鎖痙作用または胃酸分泌
抑制が所望される場合のみグルカゴンより優れていると
思われる。式IIで表わされる化合物は、天然グルカゴン
からまたはペプチド合成で一般に知られているより困難
な方法によって調製されうる。式IIで表わされる好まし
い化合物はグルカゴン（１−２１）である。

【０００６】本明細書においてグルカゴンの後の括弧内
の数はアミノ酸の数を示す。天然グルカゴンは２９個の
アミノ酸を有し、これはグルカゴン（１−２９）（また
は単にグルカゴン）とする。グルカゴン（１−２１）は
天然産生グルカゴンの最初の２１個のアミノ酸残基含む
等である。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、組換
えＤＮＡの技術を用いてグルカゴンまたはその断片もし
くは誘導体を調製するためのより有利な工業的方法のた
めの形質転換酵母を提供するものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、グルカゴンお
よびその誘導体（グルカゴン（１−２１））が、このよ
うな産生をコードするＤＮＡ配列で形質転換された酵母
株培養液の上清中に均質物質として高収率で表われると
いう驚くべき発見に基づく。本発明は、グルカゴンをコ
ードする遺伝子からなる複製可能な発現ビヒクル有する
酵母株を提供するものである。

【０００９】グルカゴン（１−２９）をコードする遺伝
子は合成遺伝子であるかまたはグルカゴンのＣＤＮＡク
ローンもしくはグルカゴンのゲノムクローンから誘導さ
れてもよい。適当な酵母宿主を上記の発現ビヒクルで形
質転換することにより所望産物が高収率で産生される。
驚くべきことに形成されたグルカゴンまたはグルカゴン
断片は非常に均質であり、培養の間に酵母により産生し
た酵素によるグルカゴンの１７番目と１８番目の二塩基
性アミノ酸列Ａｒｇ−Ａｒｇの開裂は全く見られない。
酵母がこのような対になった塩基性アミノ酸部位を特異
的に開裂するトリプシン様エンドペプチダーゼを産生す
ることは知られているので、このようなことは非常に驚
くべきことである。

【００１０】次に本発明を図面を用いて説明する。図１
はプラスミドｐＭＴ２９０の構築を示す図式、図２はプ
ラスミドｐＭＴ５４４，ｐＫＦＮ６およびｐＭＴ６１２
の構築を示す図式、図３はプラスミドｐＫＦＮ２３の構
築を示す図式、図４および図５はプラスミドｐＭＴ５４
４からの一定配列のインビトロ変異誘導を示す図式、図
６は純粋な本物のグルカゴン添加前または添加後の酵母
上清のＨＰＬＣ分折曲線を示し、図７は濃縮ＤＥＡＥ漏
出液（ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ）を調製用分別グラフ
を示す。

【００１１】

【好ましい実施態様の記載】上記アミノ酸配列（Ｉ）か
らグルカゴン（１−２９）をコードする合成遺伝子は、
アミノ酸コドン好ましくは酵母におけるタンパク質の高
発現に用いられるアミノ酸コドンの使用により幾つかの
オリゴヌクレオチドから構築された〔ベネッツェン ジ
エイ．エルら（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ Ｊ．Ｌ．ｅｔａ
ｌ），（１９８２）、ザ ジャーナル オブ バイオロ
ジカル ケミストリィ（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２５
７，３０２６−３０３１〕。

【００１２】さらに制限酵素識別部位を分子の適当な部
分に入れて遺伝子を特異的に切り出し特性決定と変異誘
発を助けることができる。連結反応および反応の埋め合
わせ（ｆｉｌｌｉｎｇ ｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）を
妨害する可能性のある二次構造を避ける試みがなされ
た。グルカゴンの断片または誘導体についてコードする
合成遺伝子をグルカゴン（１−２９）遺伝子から構築す
ることができる。グルカゴン（１−２１）をコードする
合成遺伝子は、グルカゴン（１−２９）遺伝子において
グルカゴン（１６−２９）に相当する制限断片をグルカ
ゴン（１６−２１）に相当する合成ＤＮＡ断片で置換す
ることにより構築される。

【００１３】合成グルカゴン（１−２９）遺伝子から他
のグルカゴン断片または誘導体をコードする合成遺伝子
を調製することまたはこのような産物に対する全遺伝子
のオリゴヌクレオチド合成によりどのようにしてこのよ
うな断片または誘導体に対する合成遺伝子を調製するか
は当業者にとって明らかであろう。グルカゴン（１−２
９）の遺伝子はｃＤＮＡグルカゴンクローンから誘導す
ることもできる。ウシ膵臓プレプログルカゴンｃＤＮＡ
を単離し配列する〔エル・シイ・ロペズら（Ｌ．Ｃ．Ｌ
ｏｐｅｚ ｅｔ．ａｌ），（１９８３）、プロシーディ
ング オブ ナチュラル アカデミィ オブ サイエン
ス オブ ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８０，５４８５−５４８９）。

【００１４】このプレプログルカゴンｃＤＮＡは、シグ
ナル・もしくはプレ−ペプチド、ＮＨ₂ 末端ペプチド、
グルカゴンおよび２つのカルボキシ末端グルカゴン様ペ
プチド（ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２）をコードする。
本発明の目的のためにグルカゴン配列は合成ｃＤＮＡか
ら切り出され、特異的変異誘導を位置させることにより
Ｔｈｒ（２９）のコドンの後に停止コドンを有するよう
にしてもよい。発現されたタンパク質をたとえば内在酵
素によるインビボ分解に対して保護する機能または発現
されたタンパク質を原形質膜空間へ輸送し最後には細胞
壁を通過して培養培地へ輸送するために必要な情報をも
たらす機能を有する別のタンパク質をコードするＤＮＡ
列に、所望産物の遺伝子を融合させてもよい。

【００１５】遺伝子が融合生成物として発現される場合
には、このような融合産物からグルカゴン部分を分割す
る手段が提供されるべきである。このような目的のため
に、選択的分割部位を有するアミノ酸配列をコードする
コドンを、別のタンパク質をコードするＤＮＡ列と所望
産物の遺伝子との間に挿入する。別のタンパク質は、形
質転換微生物自体により所望産物の分泌の間に分離され
る。たとえば２個の塩基性アミノ酸（たとえばＬｙｓ−
Ｌｙｓ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｌｙｓ−ＡｒｇまたはＡｒｇ
−Ｌｙｓ）をコードするコドンをグルカゴンのＮ−末端
に隣接して挿入する場合には、これら塩基性アミノ酸と
グルカゴン間のペプチド結合は分泌の間に酵母により分
割されうる。

【００１６】別のタンパク質が後に酵素的または化学的
手段により余分なアミノ酸配列を分離するために所望タ
ンパク質のＮ−末端に隣接して選択的分割部位を有する
ならば、所望タンパク質をこの所望タンパク質のＮ−末
端と連結した別のタンパク質配列とともに分泌すること
もできる。分泌のために別のＤＮＡ配列はシグナルペプ
チドをコードしうる。別のＤＮＡ配列はさらにリーダー
ペプチド配列をコードしうる。シグナルおよびリーダー
ペプチドは細胞から形質発現タンパク質産物が分泌され
る間に形質転換微生物により分割除去され、より簡単な
所望産物の単離方法が確保される。

【００１７】酵母に対する非常に好適なリーダーペプチ
ド系は酵母ＭＦα１リーダー列またはその一部である
〔クリジャン，ジェイ．（Ｋｕｒｊａｎ，Ｊ．）および
ヘルスコウィツ，アイ．（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，
Ｉ．），セル（Ｃｅｌｌ）３０（１９８２）９３３−９
４３〕。しかしながら酵母において分泌をもたらすいか
なるシグナル−またはリーダー配列も使用することがで
き、本発明は特定の分泌系に限定されるものではない。

【００１８】発現の目的で、プロモーター配列が所望タ
ンパク質産物に対するＤＮＡ配列の上流に位置する。酵
母宿主微生物固有の遺伝子からのプロモーター、すなわ
ちＴＲＩ−（トリオースホスフェート異性化酵素）遺伝
子プロモーターが用いられる。所望産物のＤＮＡ配列の
後には、転写ターミネータ配列、好ましくは宿主酵母微
生物固有の遺伝子からのターミネーター配列すなわちＴ
ＰＩ−遺伝子またはＭＦα１−遺伝子のターミネーター
が続くであろう。

【００１９】適当なプロモーター、リーダーおよびター
ミネーター配列と融合する所望タンパク質産物をコード
するＤＮＡ配列は、酵母において所望タンパク質産物の
形質発現のための発現ビヒクルに挿入される。発現ビヒ
クルは酵母において複製しうるプラスミドまたは酵母の
染色体へ組込まれうるプラスミドである。このプラスミ
ドは、宿主細胞の生存率または正常増殖に必須の遺伝
子、すなわち細胞分割、細胞壁生合成、タンパク質合成
等をコードする遺伝子を入れることにより宿主微生物の
プラスミド損失に対し安定化されるのが好ましい。

【００２０】

【詳細な記載】グルカゴン（１−２９）合成遺伝子は、
連結反応とこれに続く部分的二重鎖構造の酵素による閉
鎖により、幾つかのオリゴヌクレオチドから構築され
る。オリゴヌクレオチドはシリカ支持体においてホスホ
アミダイト化学（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ）を用いて自動ＤＮＡ合成機において
合成される〔エス．エル・ビュウケージ（Ｓ．Ｌ．Ｂｅ
ａｕｃａｇｅ）とエム．エイチ．カルサーズ（Ｍ．Ｈ．
Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）（１９８１）テトラヒドロン レ
ターズ（Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｎｌｅｔｔｅｒｓ）２
２，１８５９−１８６９）かまたはジーおよびトリヌク
レオチド ブロックに接近するホスホトリエステルおよ
びポリスチレン支持体を用いる半自動的カラム合成によ
り合成される〔エイチ．イトウ（Ｈ．Ｉｔｏ），ワイ．
イケ（Ｙ．Ｉｋｅ），エス．イカタ（Ｓ．Ｉｋａｔａ）
およびケイ．イタクラ（Ｋ．Ｉｔａｋｕｒａ）（１９８
２），ヌクレイック アシド レス（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）１０，１７５５−１７６９〕。

【００２１】連続的カップリング反応により小さい単位
からオリゴヌクレオチドを合成することは当業者では公
知である。グルカゴン（１−２９）をコードする合成遺
伝子は次のように合成される： ３３ｍｅｒ（Ｉ）： GAGCACTCTCAGGGTACCTTCACTTCTGACTAC （Ｉ） を、１３ｍｅｒ（III)： ATTTAGAGTAGTC （III) の存在下に３３ｍｅｒ（II) ： TCTAAATACTTGGACTCTAGAAGAGCCCAAGAC （II) と連結すると６６−ｍｅｒ（Ｉ−II) ：

【００２２】

【表１】

【００２３】が得られる。 さらに、７３−ｍｅｒが、３３−ｍｅｒ（II) の存在下
に１３−ｍｅｒ（III)、１６−ｍｅｒ（Ｖ）： CTTCTAGAGTCCAAGT （Ｖ） と４４−ｍｅｒ（IV) ： CCGAAGCTTAGGTGTTCATCAACCATTGGACGAAGTCTTGGGCT （I
V) とを連結することにより合成され、７３−ｍｅｒ（III
−Ｖ−IV) ：

【００２４】

【表２】 が得られる。

【００２５】３′末端が３９塩基にわたって相補性であ
る６６−ｍｅｒ（Ｉ−II) と７３−ｍｅｒ（III −Ｖ−
IV) をアニールし、３′−末端を酵素により延長し、そ
の結果得られる１００ｂｐの二重鎖ＤＮＡ分子を編入し
た制限部位とともに次に示す（大文字：化学合成、小文
字：酵素による延長）：

【００２６】

【表３】

【００２７】合成遺伝子のＫｐｎｌ−Ｈｉｎｄ３断片を
Ｔ₄ リガーゼを用いてプラスミド（Ｋｐｎ１とＨｉｎｄ
３で切断されたｐＬａ Ｃ４８）に挿入する。連結反応
を用いてコンピテント大腸菌細胞を形質転換する。再度
形質転換後、グルカゴン（４−２９）に対する正しい配
列を有する形質転換細胞（ｐＫＦＮ４）が同定される。

【００２８】合成グルカゴン（１−３）配列を有する酵
母プラスミド中にグルカゴン（４−２９）遺伝子を挿入
することによりグルカゴン（１−２９）をコードする合
成遺伝子を構築する。連結はＫｐｎ１−部位で生じる。
グルカゴン（１−２１）をコードする合成遺伝子（１−
２１）は、グルカゴン（１６−２９）に相当するＸｂａ
ｌ−Ｈｉｎｄ３断片をグルカゴン（１６−２１）に相当
する合成Ｘｂａｌ−Ｈｉｎｄ３断片に置換することによ
りグルカゴン（１−２９）遺伝子から構築される：

【００２９】

【表４】

【００３０】プラスミド構築 グルカゴンの最初の４つのアミノ酸をコードしＫｐｎ１
位置で終わる合成オリゴヌクレオチドを、ＭＦα１リー
ダー配列の後で酵母ベクターに入れる〔ジェイ．クリジ
ャン（Ｊ．Ｋｕｒｉｊａｎ）とアイ．ヘルスコウィッツ
（Ｉ．Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ）、ストラクチュア オブ
ア イースト フェロモン ジーンＭＦα（Ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ Ｙｅａｓｔ Ｐｈｅｒｏｍｏｎ
ｅ Ｇｅｎｅ ＭＦα）：ア ピュータティブ アルフ
ァーファクター プレカーソルコンテインズ フォアタ
ンデム コピーズ オブ マチュア アルファーファー
クター（Ａ Ｐｕｔａｔｉｖｅ α−Ｆａｃｔｏｒ Ｐ
ｒｅｃｕｓｏｒ Ｄｏｎｔａｉｎｓ ｆｏｕｒ Ｔａｎ
ｄｅｍ Ｃｏｐｉｅｓ ｏｆ Ｍａｔｕｒｅ α−Ｆａ
ｃｔｏｒ），セル（Ｃｅｌｌ）３０（１９８２）９３３
−９４３〕。α−ファクターリーダーの最後のもとから
のＨｉｎｄ３位置をカップリングにより破壊する。カッ
プリングは次のように示される：

【００３１】

【表５】

【００３２】得られるプラスミドｐＭＴ２９０は、ＭＦ
α１リーダーのＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌ
ｕ−Ａｌａの後に直ちに置かれたグルカゴン遺伝子のプ
ロモーター近接部を有し、ＴＰＩプロモーター（ＴＰＩ
ｐ）で制御される。このプラスミドはプラスミドｐＫＦ
Ｎ４からのグルカゴン（４−２９）に対する配列の挿入
に適する。しかしながらこのプラスミドは転写終結のい
かなる酵母シグナルをも含まない。

【００３３】このような終結部位はクローンタンパク質
の収率を１０倍ほど増加すると報告されている〔ジェ
イ．メローら（Ｊ．Ｍｅｌｌｏｒ ｅｔ．ａｌ）、ジー
ン（Ｇｅｎｅ）２４（１９８３）１−１４〕。それゆえ
酵母発現ベクターｐＭＴ５４４においては、ｐＭＴ４０
９からのα−ファクター転写ターミネーター（ＭＦα１
_T ）配列をグルカゴン挿入部の後に入れる。

【００３４】ＴＰＩｐ−ＭＦα１リーダー・グルカゴン
（１−２９）−ＭＦα１_T に対する挿入コードを有する
プラスミドｐＭＴ５４４はいまだにＮ−末端Ｇｌｕ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ延長をコードする配列を含み、こ
れは我々の構築においては酵母により分子の約１／３が
除去されるだけである。ＭＦα１リーダーのＣ−末端Ｇ
ｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−ＡｌａをコードするＤＮＡ配列
は、インビトロの欠失突然変異誘発によりｐＭＴ５４４
から除かれる。得られる酵母発現プラスミドｐＫＦＮ６
はＴＰＩｐ−ＭＦα１リーダー（Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌ
ｕ−Ａｌａを引く）−グルカゴン（１−２９）−ＭＦα
１_T に対する挿入コードを含む。

【００３５】好ましい構築において、この発現単位は安
定で高いコピー数の酵母プラスミドＣＰＯＴ（ＡＴＣＣ
Ｎｏ．３９６８５）へ移され、これは増殖培地におい
てグルコースの存在により単に選択されるだけである。
得られるグルカゴン（１−２９）に対する酵母発現プラ
スミドはｐＭＴ６１２の番号が付けられる。ＴＰＩｐ−
ＭＦα１リーダー（Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａを
引く）−グルカゴン（１−２１）−ＭＦα１_T に対する
挿入コードを含むプラスミドは、ｐＫＦＮ６から、グル
カゴン（１６−２１）をコードするＸｂａｌ−Ｈｉｎｄ
３断片をグルカゴン（１６−２３）をコードする合成Ｘ
ｂａｌ−Ｈｉｎｄ３断片に置き換えることにより構築さ
れる。

【００３６】好ましい構築において、上記発現単位は酵
母プラスミドＣＰＯＴ（ＡＴＣＣＮｏ．３９６８５）へ
移される。得られるグルカゴン（１−２１）に対する酵
母発現プラスミドはｐＫＦＮ２３の番号が付けられる。

【００３７】形質転換 プラスミドｐＭＴ６１２を、グルコースにおける増殖に
対し選択することによりトリオースホスフェートイソメ
ラーゼ（ＴＰＩ）遺伝子に欠失を有する酵母（Ｓ．ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）株へ形質転換する。このような株
は、一般に、単独炭素源としてのグルコースでの増殖が
不安定であり、ガラクト−スラクテート培地で非常にゆ
っくり増殖する。

【００３８】この欠陥は、ＴＰＩ遺伝子における突然変
異のためであり、これは欠失によりまたはこの遺伝子の
大部分を酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＬＥＵ２遺
伝子で置き換えることにより得られる。増殖欠失のため
に，ＴＰＩをコードする遺伝子を含むプラスミドに対し
強い選択性がある。ｐＭＴ６１２はスキゾサッカロマイ
セスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏ．ｐｏｍｂｅ）ＴＰＩ遺伝子
を有する。

【００３９】プラスミドｐＭＴ５４４を、ロイシンプロ
トロフィに対する選択性により酵母（Ｓ．ｃｅｖｅｖｉ
ｓｉａｅ）ＬＥＵ２突然変異株へ形質転換〔エー・ヒン
ネン（Ａ．Ｈｉｎｎｅｎ）、ジェイ．ビィ．ヒックス
（Ｊ．Ｂ．Ｈｉｃｈｓ）およびジィ．アール．フィンク
（Ｇ．Ｒ．Ｆｉｎｋ）、“トランスフォーメーションオ
ブ イースト（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｙｅａｓｔ）”、プロシーディング オブ ナチュラル
アカデミィ オブ サイエンス，７５，（１９７
８），１９２９〕。

【００４０】プラスミドｐＫＦＮ２３を、グルコース増
殖に対する選択性によりＴＰＩ遺伝子に欠失を有するエ
ス．セレヴィシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株へ
形質転換する。移された株ＫＦＮ３１は別な用途のため
に選択される。プラスミドｐＭＴ６１２を有する形質転
換株ＭＴ６１５は、出願人により、Ｄ−３４００ゲッチ
ンゲン、グリースバッハストラーセ８のドイチェ サム
ラングフォン ミクロオルガニスメニン（Ｄｅｕｔｓｃ
ｈｅ Ｓａｍｍｌｕｖｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａ
ｎｉｓｍｅｎ）（ＤＳＭ）に１９８５年１月１０日に寄
託され、寄託番号ＤＳＭ３１８４が付された。

【００４１】株ＫＦＮ３１は、出願人により１９８５年
１２月１３日にＤＳＭに寄託され、寄託番号ＤＳＭ３６
０８が付された。ＤＳＭは１９７７年のブタペスト条約
により権限を与えられた国際寄託機関であり、上記条約
のそれぞれ９条と１１条にしたがって上記寄託物の永続
性と公衆によるこれの取得を保証するものである。

【００４２】実験例１．オリゴデオキシリボヌクレオチド合成 保護されたデオキシリボヌクレオシド３′−ｐ−クロロ
フェニルホスフェートならびに保護されたジーおよびト
リヌクレオチド３′−ｐ−クロロフェニルホスフェート
を記載されているように調製する〔ジィ．アール．ゴッ
フ（Ｇ．Ｒ．Ｇｏｕｇｈ）、ケイ．ジェイ．コリー
（Ｋ．Ｊ．Ｃｏｌｌｉｅｒ）、エイチ．エル．ワイス
（Ｈ．Ｌ．Ｗｅｉｔｈ）およびピー．ティ．ギルハム
（Ｐ．Ｔ．Ｇｉｌｈａｍ）（１９７９）ヌクレイック
アシド リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ）７，１９５５−１９６４〕。

【００４３】ピリジンを還流し次いで水素カルシウムか
ら留出することにより無水物にする。ホスホトルエステ
ルの接近によりオリゴヌクレオチド合成に対する支持体
は、３′−Ｏ−スクシニル基を介してアミノメチル化１
％架橋ポリスチレンビーズ（バッケム Ｂａｃｈｅｍ）
と結合する完全に保護されたジオキシリポヌクレオシド
である。

【００４４】３３−ｍｅｒ（Ｉ）の合成を、カラム（オ
ムニフィットＯｍｎｉｆｉｔ，６．５mm内径）に充てん
したＤＭＴｒ−ｄＡ^BZ−ポリマー３μモルで開始する。
ＨＰＬＣポンプ（コントロンＫｏｎｔｒｏｎ ＬＣポン
プ４１０）および６個の出口を有する空気作動性回転弁
（レオダインＲｈｅｏｄｙｎｅ ５０１１型）を介した
制御装置（コントロン プログラマー Ｋｏｎｔｒｏｎ
Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｒ ２００型）を用いてカラムへ
溶媒と反応物を流す。

【００４５】最初のサイクルは、トリクロロ酢酸の１０
％クロロホルム溶液でジメトキシトリチル基を除去し続
いてクロロホルムとピリジンで洗浄することからなる。
カップリング反応は、無水ピリジン中に０．１Ｍジメト
キシトリチル チミジン ３′−Ｏ−ｐ−クロロフェニ
ルホスフェート、０．３Ｍ １−メシチレンスルホニル
−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾールおよび１Ｍ
Ｎ−メチルイミダゾールを手動により注入することで行
なわれる〔ビー．エス．スプロート（Ｂ．Ｓ．Ｓｐｒｏ
ａｔ）およびダブリュ．バンワース（Ｗ．Ｂａｂｗａｒ
ｔｈ）（１９８３）テトラヘドロン レターズ（Ｔｅｔ
ｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ）２４，５７７１−
５７７４〕。

【００４６】室温で３０分間カップリング後、ポリマー
をピリジンとクロロホルムで洗う。サイクル時間は８５
分であった。同様な方法で、保護されたジーおよびトリ
ヌクレオチド３′−Ｏ−ｐ−クロロフェニルホスフェー
トを、支持体上で成長するオリゴヌクレオチドに連結す
る。完全に保護された３３−ｍｅｒを部分的に脱保護化
し、３７℃で２４時間ピリジン−水（４：１）中の０．
５Ｍテトラメチルグアニジニウム ピリジン−２−アル
ドキシメートで処理することにより支持体から分割する
〔シィ．ビィ．リーセ（Ｃ．Ｂ．Ｒｅｅｓｅ）、アー
ル．シィ．チトマス（Ｒ．Ｃ．Ｔｉｔｍａｓ）およびエ
ル．ヤウ（Ｌ．Ｔａｕ）（１９７８）テトラヘドロン
レターズ，２７２７−２７３０〕。

【００４７】２４時間５５℃にて濃アンモニアで処理す
ることにより塩基性保護基を除去する。最後に、室温で
３０分間８０％酢酸水溶液で処理することによりジメト
キシトリチル基を除く。記載されているようにＣ１８カ
ラム中でＨＰＬＣにより３３−ｍｅｒ（Ｉ）を精製する
〔エイチ．ジェイ．フリッツ（Ｈ．Ｊ．Ｆｒｉｔｚ）、
アール ベラガジェ（Ｒ．Ｂｅｌａｇａｊｅ）、イー．
ブラウン（Ｅ．Ｂｒｏｗｎ）、アール．エイチ．フリッ
ツ（Ｒ．Ｈ．Ｆｒｉｔｚ）、アール．エー．ジョンズ
（Ｒ．Ａ．Ｊｏｎｅｓ）、アール．ジィ．リーズ（Ｒ．
Ｊ．Ｌｅｅｓ）およびエイチ．ジィ．コーラナ（Ｈ．
Ｊ．Ｋｈｏｒａｎａ）（１９７８）バイオケミストリィ
（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１７，１２５７−１２
６７〕。

【００４８】同様な方法で１３−ｍｅｒ（III)、１６−
ｍｅｒ（Ｖ）、４４−ｍｅｒ（IV) が合成され、α−フ
ァクターリーダー配列とグルカゴン（１−２９）遺伝子
の融合に対する合成グルカゴン（１−４）リンカーとし
て２つのオリゴヌクレオチド（１０−ｍｅｒと１８−ｍ
ｅｒ）が使用される。３３−ｍｅｒII、グルカゴン（１
−２１）の遺伝子構築に用いられる２個の１９−ｍｅｒ
および２６−ｍｅｒ突然変異誘発性欠失プライマーは、
自動ＤＮＡ合成機（アプライド バイオシステムズ Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３８０Ａ型）中で
ホスホラミジト ケミストリィおよび市販されている反
応物を用いて合成される。

【００４９】例２．グルカゴン（４−２９）をコードす
る遺伝子の合成 オリゴヌクレオチドを記載されているように５′−末端
でラベルする〔ケイ．ノリズ（Ｋ．Ｎｏｒｒｉｓ）、エ
フ．ノリス（Ｆ．Ｎｏｒｒｉｓ）、エル．クリスチャン
セン（Ｆ．Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ）およびエヌ．フ
ィール（Ｎ．Ｆｉｌｌ）（１９８３）ヌクレイック ア
シド リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ）１１，５１０３−５１１２〕。

【００５０】水１０μｌ中の１および５′−³²Ｐ−標識
化IIのそれぞれ１０ピコモルとIII２０ピコモルの混合
物を５分間６０℃で加熱し氷中で急冷する。１３２mMト
リス−ＨＣｌ（pH７．４）１０μｌ、２０mM ＭｇＣｌ
₂ 、２mM ＡＴＰ、２０mMＤＴＴ、１００μｇ／mlゼラ
チンおよび０．５μｌ Ｔ₄ リガーゼ（２００単位）を
加える。１６℃で２．５時間連結反応を行ない、ここで
約２／３が連結する。得られる６６−ｍｅｒ（Ｉ−II)
をＰＡＧＥ変性および緩衝液溶出により精製する。

【００５１】同様に５′−³²Ｐ−標識化Ｖ２０ピコモル
を、１６℃にて２．５時間II２５ピコモルの存在下に
５′−³²Ｐ−標識化（III)２０ピコモルとIV２０ピコモ
ルと連結する。得られる７３−ｍｅｒ（III −Ｖ−IV)
をＰＡＧＥ変性および緩衝液溶出により精製する。９μ
ｌの５０mMトリス−ＨＣｌ（pH７．８）、５mM ＭｇＣ
ｌ₂ 、１０mM ＤＴＴおよび５０μｇ／mlゼラチン中の
（Ｉ−II) および（III −Ｖ−IV) それぞれ２ピコモル
を８０℃にて３分間加熱し、次いで３０分間かけて４５
℃まで冷却する。

【００５２】４５℃で１５分間アニーリングした後、反
応混合物を１６℃まで冷却し１μｌｄＮＴＰ−ｍｉｘ
（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰそれぞれ５
mM）と１μｌ ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウフラグ
メント（３．５単位）を加える。反応における充てんが
１６℃で６０分間進められ、次いでフエノール抽出によ
り単離され、エタノールで析出される。ＤＮＡはＫｐｎ
１とＨｉｎｄ３を消化し、プラスミドｐＬａ Ｃ４８
（独自のＫｐｎ１とＨｉｎｄ３部位を有するｐＢＲ３２
２の誘導体）からの大きなＫｐｎ１−Ｈｉｎｄ３断片と
連結する。

【００５３】連結混合物をアンピリシン耐性を選択する
コンピテント大腸菌細胞へ形質転換させる。制限酵素分
析（Ｘｂａｌ、Ｋｐｎ１およびＨｉｎｄ３）およびＤＮ
Ａ配列〔エー・マキサム（Ａ．Ｍａｘａｍ）およびダブ
リュ・ギルバート（Ｗ．Ｇｉｌｂｅｒｔ）（１９８０）
メソード エンザイモール（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ−）６５，４９９−５６０〕により、合成グルカ
ゴン（４−２９）遺伝子を含むプラスミドｐＫＦＮ４を
有するコロニーが同定された。

【００５４】実施例３．グルカゴン（１−２９）の発現
に対する酵母プラスミドの構築 プラスミドｐ２８５を制限酵素Ｘｂａｌで切断し、次い
でクレノウポリメラーゼとデオキシリボヌクレオチドト
リホスフェートで処理することによりブラントエンドす
る。フエノールで抽出しエタノールで析出させ再懸濁
後、ＤＮＡをＨｉｎｄ３で切断し１０．５kb断片を単離
する。この断片は、ＴＰＩプロモーター〔ティ．アルバ
ー（Ｔ．Ａｌｂｅｒ）とジィ．カワサキ（Ｇ．Ｋａｗａ
ｓａｋｉ）、ジャーナルオブ モレキュラー アプライ
ド ジェネト （Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌｉｅｄ．Ｇｅｎ
ｅｔ．）１（１９８２），４１９−４３４〕とＭＦα１
リーダー配列を有する。ｐ２８５の構築は米国特許出願
Ｓ．Ｎ．５４７，７４８（１９８３年１１月１日）に記
載されている。

【００５５】ｐ２８５は挿入ＴＰＩｐ−ＭＦα１リーダ
ーＢ−Ｃ−Ａ−ＴＰＩ_T を有し、酵母株Ｚ３３（ＡＴＣ
Ｃ Ｎｏ．２０６８１）で寄託される。プラスミドｐＢ
ｏｅ１５（Ｋｐｎ１部位を含む合成Ｈｉｎｃ２，Ｈｉｎ
ｄ３挿入部を備えたｐＵＣ８の誘導体）を制限酵素Ｎｄ
ｅ１で切断し、上述のようにクレノウポリメラーゼを用
いてブラント−エンドし、Ｋｐｎ１で切断し、最後に
０．３kbの断片を単離する。

【００５６】上述したように調製された合成グルカゴン
（１−４）リンカーを用いて、ｐＵＣ８挿入部のＫｐｎ
１部位をＭＦα１リーダー配列の２６３位のＨｉｎｄ３
部位と接続することにより、これら２つの断片を連結す
る。多重コピーの挿入を避けるために、リンカーを連結
前にホスホリル化しない。ＭＦα１リーダーの最後の固
有Ｈｉｎｄ３部位はリンカーによって改質されない。連
結混合物をアミピシリン耐性要求性大腸菌へ形質転換す
る。

【００５７】所望の制限パターンを含むプラスミド、ｐ
ＭＴ２９０（図１）が得られる。グルカゴン（１−２
９）をコードする完全な遺伝子および遺伝子に続く転写
終結配列をも含む発現プラスミドを得るために、ｐＭＴ
２９０からの６．５kb Ｘｈｏ１−Ｋｐｎ１断片をｐＭ
Ｔ４０９（０．７kb Ｘｂａ１−ＢａｍＨ１欠失を有す
るｐＭＴ１８３）からの５．１kb Ｈｉｎｄ３−Ｘｈｏ
１断片およびｐＫＦＮ４からのグルカゴン（４−２９）
をコードする合成Ｋｐｎ１−Ｈｉｎｄ３断片と連結す
る。

【００５８】プラスミドｐＭＴ１８３は２．１kb Ｓｐ
ｈ１−ＢａｍＨ３挿入部を含むＹＥＰ１３の誘導体であ
る。挿入部はスキゾサッカロマイセス ポンベ（Ｓｃｈ
ｉｚｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）から
のアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターの制御下に
エス・セレヴィシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の
ＭＦα１遺伝子の発現をコードする。そのＢａｍＨ３隣
接部における挿入部はまた転写終結を特定するＭＦα１
遺伝子からの配列をも含む。連結混合物をアンピシリン
耐性を選択する大腸菌へ形質転換する。

【００５９】得られるプラスミドの１つ、ｐＭＴ５４４
（図２）はグルカゴン（１−２９）の発現をコードする
予想された制限パターンを示すが、まだＮ−末端Ｇｌｕ
−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ伸展部をコードする配列をも
有する。Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａをコードする
配列をインビトロ変異誘発によりｐＭＴ５４４から除く
とｐＫＦＮ６が得られる。ｐＭＴ５４４をグルカゴン遺
伝子における固有のＸｂａ１部位で切断することにより
直線化する。

【００６０】ＥｘｏIII ヌクレアーゼ処理により得られ
た二重鎖ＤＮＡの３′−末端から５′−モノヌクレオチ
ドを除去する。ＥｘｏIII ヌクレアーゼ処理を２３℃で
行ないこの条件下で線状プラスミドの各３′−末端から
約２５０個のヌクレオチドが除かれる〔エル・グオ
（Ｌ．Ｇｕｏ）およびアール・ダブリュユー・（Ｒ．Ｗ
Ｕ）（１９８３），メソード イン エンザイモロジィ
（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）１０
０，６０−９６〕。

【００６１】キナーゼ化２６−ｍｅｒ変異誘発性欠失プ
ライマーｄ(CTTTGGATAAAAGACACTCTCAAGGT)を突然変異位
置までアニールする（図４）。クレノウポリメラーゼを
用いた充てんとＴ₄ リガーゼを用いた連結により二重鎖
環状ＤＮＡが作られる。グルカゴン遺伝子における最初
のＸｂａ１部位はクレノウ充てんとそれに続く連結によ
り破壊される。

【００６２】大腸菌（ＭＴ１７２）の形質転換後、５′
−³²Ｐ−標識化２６ｍｅｒ欠失変異誘発性プライマーを
用いてコロニーハイブリッド法により突然変異体が同定
される。８個の突然変異体からのプラスミドをＫｐｎ１
＋Ｐｓｔ１消化により分析し、これにより１２個の塩基
の予想された欠失が確認される。８個の突然変異体のう
ち３個は“純粋な”突然変異体であるがこれらからのプ
ラスミドはそれにもかかわらず再度大腸菌（ＭＴ１７
２）へ形質転換される。

【００６３】ｐＭＴ５４４からの４．４kb ＢａｍＨ１
−Ｘｈｏ１および０．９kb ＢａｍＨ１−Ｋｐｎ１断片
（グルカゴン（４−２９）遺伝子を含む）を１２bp欠失
を有する２つのプラスミドからの６．６kb Ｘｈｏ１−
Ｋｐｎ１断片と連結することにより、グルカゴン遺伝子
における破壊されたＸｂａ１部位を再構築する（図５参
照）。

【００６４】２つの連結混合物を形質転換に使用する
〔大腸菌（ＭＴ１７２）と形質転換細胞から単離された
プラスミドをＸｂａ１部位（Ｘｂａ１＋ＥｃｏＲ１消
化）の存在についてスクリーニングする〕。４個のプラ
スミドからのＸｂａ１−Ｓａｌ１断片のＤＮＡ配列決定
により欠失を確認する〔エイ・マクサム（Ａ．Ｍａｘａ
ｍ）とダブリュ・ギルバート（Ｗ．Ｇｉｌｂｅｒｔ）
（１９８０）メソード インエンザイモロジィ（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）６５，４９９
−５６０〕。別の用途のために１つのプラスミド、ｐＫ
ＦＮ６が選択される。

【００６５】ＴＰＩｐ−ＭＦα１リーダー（Ｇｌｕ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａを引く）−グルカゴン（１−２
９）−ＭＦα１_T を含むｐＫＦＮ６からの２．１kb Ｂ
ａｍＨ１−Ｓｐｈ１（部分）断片を、エス・ポンベ
（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）を含むプラスミドＣＰＯＴの約１１
kb ＢａｍＨ１−Ｓｐｈ１断片に連結する。連結混合物
をアンピシリン耐性選択性大腸菌へ形質転換する。得ら
れたプラスミドはｐＭＴ６１２であった（図２参照）。

【００６６】例４．グルカゴン（１−２１）の発現に対
する酵母プラスミドの構築両方ともｐＫＦＮ６からの
０．９kb ＢａｍＨ１−Ｈｉｎｄ３断片と１１kb Ｘｂ
ａ１−ＢａｍＨ１断片をグルカゴン（１６−２１）をコ
ードする合成の１９bp Ｈｉｎｄ３−Ｘｂａ１断片に連
結する（上記参照）。連結混合物をアンピシリン耐性選
択性大腸菌（ＭＴ１７２）へ形質転換する。

【００６７】１２個の形質転換体からのプラスミドをＢ
ａｍＨ１＋Ｘｂａｌ１消化により分析する。プラスミド
の１つからの２．１kb ＢａｍＨ１−Ｓｐｈ１（部分）
断片をエス・ポンベＴＰＩ遺伝子を含むプラスミドＣＰ
ＯＴからのほぼ１１kb ＢａｍＨ１−Ｓｐｈ１断片と連
結する。連結混合物をアンピシリン耐性選択性大腸菌
（ＭＴ１７２）へ形質転換する。

【００６８】制限酵素分析（ＢａｍＨ１＋Ｘｂａ１およ
びＨｉｎｄ３＋Ｐｓｔ１）および０．７kb³²Ｐ−標識化
Ｓａｌ１−Ｓｐｈ１断片のＤＮＡ配列決定により、合成
グルカゴン（１−２１）含有プラスミドｐＫＦＮ２３を
有するコロニーが同定される。

【００６９】例５．酵母株ＭＴ５５６におけるグルカゴ
ン（１−２９）の発現 エス・セルヴィシアエ株３６２（ｌｅｕ２）をＯ．Ｄ．
６００が２．１になるまでＹＰＤ培地〔シャーマンら
（Ｓｈｅｒｍａｎ ｅｔ．ａｌ．）、メソードイン イ
ースト ジェネティックス（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙ
ｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、コールド スプリング
ハーバー ラボラトリイ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌｓｂｏｒａｔｏｒｙ），１９８１〕で増
殖する。

【００７０】培養液１００mlを遠心分離により採取し、
水１０mlで洗い、再度遠心分離し、（１．２Ｍソルビト
ール、２５mM Ｎａ₂ ＥＤＴＡ pH＝８．０、６．７
mg／mlジチオトレイトール）１０mlに再懸濁する。懸濁
液を３０℃で１５分間インキュベートし、遠心分離し、
細胞を（１．２Ｍソルビトール、１０mM Ｎａ₂ ＥＤＴ
Ａ、０．１Ｍクエン酸ナトリウムpH＝５．８、２mgノボ
ザイムＮｏｖｏｚｙｍ（商標）２３４）の１０mlに再懸
濁する。

【００７１】懸濁液を３０℃で３０分間インキュベート
し、細胞を遠心分離により集め、１２Ｍソルビトール１
０mlとＣＡＳ（１．２Ｍソルビトール、１０mM ＣａＣ
ｌ₂、１０mMトリス（トリス＝トリス（ヒドロキシメチ
ル）−アミノメタン）pH＝７．５）１０ml中で洗い、Ｃ
ＡＳ２mlに再懸濁する。形質転換のためにＣＡＳ−再懸
濁細胞０．１mlをほぼ１μｇのプラスミドｐＭＴ５４４
と混合し、室温で１５分間放置する。（２０％ポリエチ
レングリコール４０００、１０mM ＣａＣｌ₂、１０mM
トリスpH＝７．５）の１mlを加え、混合物をさらに３０
分間室温で放置する。

【００７２】混合物を遠心分離し、ペレットをＳＯＳ
（１．２Ｍソルビトール、３３％ｖ／ｖ ＹＰＤ、６．
７mM ＣａＣｌ₂ 、１４μｇ／mlロイシン）の０．１ml
中に再懸濁させ、３０℃で２時間インキュベートする。
次いで懸濁液を遠心分離し、ペレットを１．２Ｍソルビ
トール０．５ml中に再懸濁させる。寒天上層〔シャーマ
ンらのＳＣ培地（メソード イン イースト ジェネテ
ィックス，コールド スプリング ハーバー ラボラト
リィ，１９８１）、ロイシンを排除し、１．２Ｍソルビ
トール＋２．５％寒天を含むもの〕６mlを５２℃で加
え、この懸濁液を同種の寒天固化ソルビトール含有培地
を含むプレートの上面に注入する。

【００７３】３０℃にて３日後形質転換コロニーを選
び、再単離し、液状培養を開始するのに使用する。この
ような形質転換体の１つＭＴ５５６（＝ＭＴ３６２／ｐ
ＭＴ５４４）をさらに特性決定のために選択する。株Ｍ
Ｔ５６６を、ロイシンを含まない合成の完全培地ＳＣ
（シャーマンら、メソード インイーストジェネティッ
クス コールド スプリング ハーバー ラボラトリ
ィ、１９８１）で増殖する。２ｌの流れ防止フラスコ中
の１ｌ培養液を３０℃で攪拌してＯ．Ｄ．６００nm７〜
１０までとなるようにする。次いで培養物を遠心分離
し、さらに別の分析のために上清を除く。

【００７４】抗グルカゴン血清Ｋ−６２４８を用いたラ
ジオイムノアッセイによりＭＴ５５６からの上清中でグ
ルカゴン様免疫活性（ＧＬＩ）を測定する６〔ヘデイン
グエル．ジィ．（Ｈｅｄｉｎｇ Ｌ．Ｇ．）、（１９８
３）ハンドブック オブエクスペリメンタル ファルマ
コロジィ（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅ
ｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）、グルカゴン
Ｉ；ピィ．ジェイ．レフェブレ（Ｐ．Ｊ．Ｌｅｆｅｂｖ
ｒｅ）編、スプリンガーフェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅ
ｒ Ｖｅｒｌａｇ）ｐｐ１８９−２０２〕。この抗体は
グルカゴン分子の中心にある配列を識別する。

【００７５】形質転換酵母細胞における免疫活性グルカ
ゴン（１−２９）の発現レベルは１７７ナノモル／ｌ上
清である。ＧＬＩ−ペプチドをＭＴ５５６上清から回収
する。上清８００mlへ¹²⁵ Ｉ−グルカゴンレーサーと９
６％エタノールをアルコール濃度５％（ｖ／ｖ）が得ら
れるまで添加する。上清をセプ−パック（Ｓｅｐ−Ｐａ
ｋ）（商標）カラム（ウォーターズＷａｔｅｒｓ）で濃
縮し、上清５３３mlに相当する濃縮液の２／３を抗グル
カゴンイムノソルベントカラムで精製する。

【００７６】抗グルカゴンカラムからの溶出液を、１０
μウォーターズ ミクロボンドパック（μ Ｂｏｎｄｏ
ｐａｋ）Ｃ−１８カラム（３．９×３００mm）中ＨＰＬ
Ｃで分別する。Ａ緩衝液およびＢ緩衝液は、それぞれ
０．１％ＴＦＡ（Ｈ₂ Ｏ）と０．０７％ＴＦＡ（ＭｅＣ
Ｎ）である。カラムを２５％Ｂ（流速：１．５ml／分）
で平衡化し、ペプチドをＭｅＣＮの直線状勾配（１％／
分）で溶出し、２７６nmで検出する。

【００７７】ＧＬＩに相当するピークが膵臓グルカゴン
１−２９標準物と同じ領域で溶出する。この分画を濃縮
し、再度溶解し、アミノ酸配列分析を施す。単離された
ペプチドの配列分析をガスフェーズセクエンサー（Ｇａ
ｓ Ｐｈａｓｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）で行なう〔モー
ディ，エイ．ジェイ．（Ｍｏｏｄｙ，Ａ．Ｊ．）、チ
ム，エル．（Ｔｈｉｍ．Ｌ）、ヴァルベルデ．アイ．
（Ｖａｌｖｅｒｄｅ，Ｉ．）フェデレーション オブ
ヨーロピアン バイオケミカル ソサイアティーズレタ
ー（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．），１７２（１９８４），１
４２−１４８〕。次の結果が得られた：

【００７８】

【表６】

【００７９】配列決定から発現産物は３つのペプチドか
らなることがわかった。 Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−グルカゴン（１−２９） ３３％ Ｇｌｕ−Ａｌａ−グルカゴン（１−２９）および ３３％ グルカゴン（１−２９） ３３％ ３つのペプチドは示唆した相対量で存在する。さらにＡ
ｒｇ−Ａｒｇ配列はすべての３つのペプチドで損なわれ
ていないこともわかる。

【００８０】例６．酵母株ＭＴ６１５におけるグルカゴ
ン（１−２９）の発現 エス．セレ．ヴィシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
株ＭＴ５０１（Ｅ２−７Ｂ×Ｅ１１−３Ｃ（ａ／α，Δ
ｔｉ／Δｔｐｉ，ｐｅｐ４−３／ｐｅｐ４−３）を、次
の修正を伴って例４で記載したようにｐＴＭ６１２で形
質転換する： １）形質転換前に株ＭＴ５０１をＹＰ ＧａＬ（１％バ
クト酵母抽出物、２％バクトペプトン、２％ガラクトー
ス、１％ラクテート）でＯ．Ｄ．６００が０．６になる
まで増殖する。

【００８１】２）ＳＯＳ溶液はＹＰＤの代わりにＹＰ
ＧａＬを含む。１つの形質転換体ＭＴ６１５（＝ＭＴ５
０１／ｐＭＴ６１２）をさらに特性決定のために選択す
る。株ＭＴ６１５をＭＴ５５６について記載したように
ただしＹＰＤ培地（シャーマンら、メソード インイー
スト ジェネティックス，コールド スプリング ハー
バー ラボラトリィ，１９８１）で、Ｏ．Ｄ．６００が
１５になるまで増殖する。

【００８２】グルカゴンをＭＴ６１５上清から単離す
る。２回単離を行なう。最初に、上清からのペプチドを
メルク（Ｍｅｒｃｋ）Ｃ１８のカラムに結合し、６０％
エタノールで溶出し、次いでウォーターズ（Ｗａｔｅｒ
ｓ）ＨＰＬＣ ＳＰイオン交換体中で分別する。この方
法では、ＳＰ上での分離のためのＣ１８溶出液の調製の
間トレーサーとして用いる¹²⁵ Ｉ−グルカゴンが定量的
に析出するために、部分的に成功するだけである。第二
の方法は、ＭＴ６１５上清液中のペプチドをＳＰセファ
デックスに結合し、逆相ＨＰＬＣにより溶出し分別する
ことである。

【００８３】抗グルカゴン血清Ｋ６２４８およびＫ５５
６３（これはグルカゴンのＣ末端部分を識別する）を用
いて〔ヘディング エル．ジィ．（Ｈｅｄｉｎｇ Ｌ．
Ｇ．）、（１９８３）ハンドブック オブ エクスペリ
メンタル ファルマコロジィ（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇ
ｙ）、グルカゴンＩ：ピィ．ジェイ．レフェブレ編、ス
プリンガー フェアラーク，ｐｐ１８９−２０２〕、Ｒ
ＩＡ〔ヘディング，エル．ジィ．（１９７１）、ラジオ
ロジカル ディターミネーション オブ パンクレアテ
ィック アンドガット グルカゴン イン プラズマ
（Ｒａｄｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉ
ｏｎ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ａｎｄ ｇｕｔ
ｇｕｌｃａｇｏｎ ｉｎ ｐｌａｓｍａ）、ダイアベト
ロギア（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ）７，１０−１９〕
により測定される。

【００８４】単離１¹²⁵ Ｉ−豚グルカゴンを９００mlのＭＴ６１５（バッチ
１）へ加え、８００mlを次のようにして分別する。試料
を５％エタノール溶液に調整し、メチル リクロプレッ
プ（Ｍｅｒｃｋ Ｌｉｃｈｒｏｐｒｅｐ）Ｃ１８（２５
−４０μ）の４．８×１．５cmカラムへの約２００ml／
hrで加える。２５ミリモル／ｌ・ギ酸アンモニウム、pH
３．５中の５％エタノールおよび同じ緩衝液中の１５％
エタノール５０mlでカラムを洗浄した後、保持されたペ
プチドをエタノールの６０％ギ酸アンモニウム溶液で溶
出する。

【００８５】粗ペプチドを水で希釈する（イオン強度お
よび有機溶媒％の両方ともを減びるため）と、 ¹²⁵Ｉ−
グルカゴンの塊を含む多量の析出物が形成される。これ
はpH３−５でのＳＰイオン交換剤の計画的使用を予め排
除する。析出物をpH９．０で溶解し、pH４．０で再度沈
でんさせる。ウォーターズＤＥＡＥイオン交換体中で分
別するために、試料を２０％アセトニトリル中の２．５
ミリモル／ｌ・ギ酸アンモニウムpH７．５に溶かす。試
料を施こすと ¹²⁵Ｉ−グルカゴンが結合しない。それゆ
え、ＤＥＡＥカラムからの漏出液を減圧下に濃縮し、ヌ
クレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）５μＣ１８の２５０
×４．６mmカラム上で逆相ＨＰＬＣによりペプチドを分
別する。

【００８６】単離２．ＳＰセファデックスＣ２５（適当
な特性を有する他のイオン交換体を使用してもよい）２
ｇを２００mlのＭＴ６１５（バッチ２）（pHを４．３に
調整）へ加え、懸濁液を室温で２０分間攪拌する。ＳＰ
セファデックスを直径２．５cmのガラス製クロマトグラ
フィカラム中で濾去し、２５ミリモル／ｌ・ギ酸アンモ
ニウム、pH３．５の５０mlで洗い、結合したペプチドを
５００ミリモル／ｌ・ギ酸アンモニウムpH８．４で溶出
する。ヌクレオシルＣ１８の２５０×４．６mmカラム中
で逆相ＨＰＬＣによりこの溶出液からグルカゴンを単離
する。

【００８７】分別の間のグルカゴン様免疫活性（ＧＬ
Ｉ）の分布を、グルカゴン１１−１５およびグルカゴン
のＣ−末端部を識別する抗体（それぞれＫ６２４８およ
びＫ５５６３）を用いてＲＩＡにより測定する。分別に
おけるＨＰＬＣ“グルカゴン”の量はＨＰＬＣにより評
価される。

【００８８】使用される方法は、グルカゴンを加えるこ
となく試料を分析し、次いで内部標準グルカゴンを加え
て、“グルカゴン”を同定することである。次いで、
“グルカゴン”のＵＶピークを、試料中のＨＰＬＣ“グ
ルカゴン”の量を算定するのに用いる。ピーク高さの算
定に対する基線は、“グルカゴン”ピークと隣接する
Ｕ．Ｖ．トレースである。グルカゴン１mg（２９０ナノ
モル）／mlが２７０nmで２．０cm^-1の吸収率を有すると
仮定された。

【００８９】結果 ＭＴ６１５，バッち１およびバッチ２におけるＨＰＬＣ
“グルカゴン”とＧＬＩの含有量を第１表に示す。未処
理ＭＴ６１５上清（バッチ１）単独のＨＰＬＣ分析曲線
（上側図）および３μｇグルカゴン添加後のＨＰＬＣ分
析曲線（下側図）を図６に示す。カラムは、２５％アセ
トニトリル中の１００ミリモル／ｌ・ギ酸アンモニウ
ム、pH３．５で１．０ml／分にて平衡化されたマーチェ
レイ−ナゲル ヌクレオシル（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａ
ｇｅｌ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）５ミクロンＣ１８、２５
０×４．６mmである。

【００９０】２分後、試料をギ酸アンモニウム中のアセ
トニリル勾配液で溶出する（３分間２５％から３０％、
次いで３５分間３０％から４０％）。流出液のＵＶ吸収
率をフルスケール０．０８Ａ単位で２８０nmにて測定す
る。ＨＰＬＣ“グルカゴン”は上側図にハッチされる。
ペプチドピーク（Ｒｔ２０．３８）がグルカゴンの添加
により増加することがわかり、この物質がＨＰＬＣ“グ
ルカゴン”ではないかと思われる。

【００９１】濃縮されたＤＥＡＥ露出液の調製用分別を
図７に示す。ＨＰＬＣ分離を図６のように行なうが、た
だしＵ．Ｖ．吸収率は２８０nm、フルスケール１．２８
Ａ単位で測定する。上側図は濃縮ＤＥＡＥ漏出液の調製
用ＨＰＬＣ分離を示し、下側図は画分におけるＧＬＩの
分布を示す。カラムからの流出液を減圧下に減少させ、
凍結乾燥し、ＧＬＩ分析のために６０％エタノール中の
０．１％酢酸に溶かす。“グルカゴン”Ｒｔ２０．５１
が完全に配列し、グルカゴンであることがわかる。

【００９２】分別の間にＭＴ６１５、バッチ１からの
¹²⁵Ｉ−グルカゴン、ＨＰＬＣ“グルカゴン”およびＧ
ＬＩの回収を第２表に示し、バッチ２からのＨＰＬＣ
“グルカゴン”の回収を第３表に示す。酵母構築物ＭＴ
６１５が２５０−１０００ナノモル／ｌ（ＨＰＬＣで判
定されるように）の範囲でグルカゴンを産生することが
わかる。

【００９３】

【表７】

【００９４】

【表８】

【００９５】

【表９】

【００９６】例７．酵母株ＫＦＮ３１におけるグルカゴ
ン（１−２１）の発現 エス．セレヴィシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株
ＭＴ６６３（２／α，Δｔ_pi／Δｔ_pi，ｐｅｐ４−３／
ｐｅｐ４−３）を、例６で記載のようにｐＫＦＮ２３で
形質転換する。１つの形質転換体ＫＦＮ３１（＝ＭＴ６
６３／ｐＫＦＮ２３）をさらに特性決定のために選択す
る。株ＫＦＮ３１をＭＴ６１３について記載したように
（例６参照）増殖しＯ．Ｄ．６００＝１５とする。発現
レベル

【００９７】酵母上清中のグルカゴン（１−２１）の量
を次の方法によりＨＰＬＣ分析で測定する： 溶媒Ａ：Ｈ₂ Ｏ中のトリフロロ酢酸（ＴＦＡ）０．１％
ｖ／ｖ 溶媒Ｂ：アセトニトリル（ＭｅＣＮ）中のＴＦＡ０．０
７％ｖ／ｖ カラム：ＲＰ−Ｃ１８ノボ−パック（Ｎｏｖｏ−ｐａ
ｋ）登録商標，５μ，４．６×１５０mm（ウォーター
ズ）

【００９８】流 速：１．５ml／分 検 出：２８０nmにおけるＵＶ−吸収率 溶出方法：０−２分 ：１０％Ｂ／９０％Ａで平均的溶
出 ２−２２分：１０％Ｂ／９０％Ａから３０％Ｂ／７０％
Ａへ１％ＭｅＣＮ／分に相当しながら勾配溶出 標準品：合成グルカゴン（１−２１） （ノボ インダストリィＡ／Ｓ）

【００９９】上記ＨＰＬＣ法において、グルカゴン（１
−２１）は保持時間１７．３６分で溶出する。異なった
量の酵母株ＫＦＮ３１上清を注入することにより、グル
カゴン（１−２１）の発現レベルを測定する：０．８８
μmol ／ｌ（“ＨＰＬＣ”−グルカゴン（１−２
１））。

【０１００】グルカゴン（１−２１）の精製 リクロプレプＬｉｃｈｒｏｐｒｅｐ（商標）ＲＰ−１８
（メルク，商品．９３０３）のカラム（１×９cm）を、
６０％（ｖ／ｖ）エタノール含有５０ｍＭ ＮＨ₄ ＨＣ
Ｏ₃ ３０mlで洗う。次いでカラムを５％（ｖ／ｖ）エ
タノール含有５０mM ＮＨ₄ ＨＣＯ₃ で平衡化する。９
６％エタノール２３．５mlを上清４５０mlへ加え、混合
物を一晩カラムへポンプ注入する（流速２５ml／ｈ）。

【０１０１】カラムを０．１Ｍ ＮａＣｌ １５mlで次
いでＨ₂ Ｏ １５mlで洗い、ペプチド物質を６０％（ｖ
／ｖ）エタノール含有ＮＨ₄ ＨＣＯ₃ ５０mMで溶出す
る。３mlの分画を集める。ペプチド物質が分画Ｎｏ．６
と７に溶出し、これら分画をプールし、減圧遠心分離
〔サバント バキューム セントリフュージ（Ｓａｖａ
ｎｔｖａｃｕｕｍ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）〕により１
mlまで濃縮してエタノールを除去する。

【０１０２】２５mM ＨＥＰＥＳ緩衝液（pH＝７．４）
１mlをこの濃縮液へ加え、これを予め２５mM ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液（pH＝７．４）１０mlで平衡化した抗−グルカ
ゴンセファロースカラム（１．５×２．５cm）へ施こ
す。施用後、カラムを室温で３０分間放置し、その後２
５mM ＨＥＰＥＳ緩衝液（pH＝７．４）１０mlで洗う。
ペプチド物質を２０％（ｖ／ｖ）酢酸で溶出し、溶出液
のpHをＮＨ₄ ＯＨで７．０に調節する。

【０１０３】先きの工程からの溶出液を減圧回転により
５００μｌまで濃縮し、グルカゴン（１−２１）を上述
の方法を用いて逆相ＨＰＬＣによりさらに精製する。試
料をそれぞれ１００μｌ容量の５つのアリコートに分け
る。保持時間１７．３６分に相当するピークとして溶出
するペプチド物質を集める。ペプチド物質を減圧遠心分
離により乾燥し、０．１％（ｖ／ｖ）酢酸１００μｌに
再溶解する。グルカゴン（１−２１）の全収率は８５％
である。

【０１０４】特性決定 精製されたグルカゴン（１−２１）は、アミノ酸分析
〔チム，エル．（Ｔｈｉｍ，Ｌ．）およびモーディ，エ
イ，ジェイ．（Ｍｏｏｄｙ，Ａ．Ｊ．），バイオキミカ
エ バイオフィジカ アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）７０３（１９８２）１３４−１４
１〕およびアミノ酸配列分析〔モーディ，エイ．ジェ
イ．，チム．エル、およびヴァルベルデ，アイ．，フェ
デレーションオブ ヨーロピアン バイオケミカル ソ
サイアティーズ レターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．），
１７２（１９８４）、１４２−１４８〕により特性決定
を行なう。結果をそれぞれ第４表および第５表に示す。

【０１０５】

【表１０】

【０１０６】

【表１１】 Ｇｌｎ₃ およびＧｌｎ₂₀から計算される平均反応収率は
９０％である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はプラスミドｐＭＴ２９０の構築を示す図
である。

【図２】図２はプラスミドｐＭＴ５４４，ｐＫＦＮ６お
よびｐＭＴ６１２の構築を示す図である。

【図３】図３はプラスミドｐＫＦＮ２３の構築を示す図
である。

【図４】図４はプラスミドｐＭＴ５４４からの一定の配
列のインビトロ突然変異誘発を示す図である。

【図５】図５はプラスミドｐＭＴ５４４からの一定の配
列インビトロに突然変異誘発を示す図である。

【図６】図６は純粋な真生グルカゴン添加前および後の
酵母上清のＨＰＬＣ分析曲線を示し、

【図７】図７は濃縮ＤＥＡＥ漏出液の調製用分別グラフ
を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 37/28 ＡＤＰ Ｃ０７Ｋ 7/34 8318−4Ｈ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） 7804−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） 7804−4Ｂ Ｃ０７Ｋ 99:34 (72)発明者 ラルス ティム デンマーク国，デーコー−2820 ゲントフ テ，スキフテバイ 22 (72)発明者 ファニー ノリス デンマーク国，デーコー−2900 ヘレル プ，アールマンス アレ 34 (72)発明者 モーゲンス トリア ハンセン デンマーク国，デーコー−3650 エルステ ィケ，ビンケルバイ 21 (72)発明者 アリステア ジェイムズ モーディ デンマーク国，デーコー−2840 ホルテ, セラレド，スロツバイ ６−８

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 グルカゴンの発現をコードする遺伝子を
   含んで成る複製可能な発現ビヒクルを含む形質転換酵
   母。