HRP20040586A2 - Negatively charged polysaccharide derivable from aloe vera - Google Patents

Description

Predmetni izum se odnosi na pripravak tvari koja sadržava polisaharide dobivene iz Aloe vera i na postupak za izradu navedenog pripravka tvari, na biljni ili životinjski ekstrakt koji sadržava navedeni pripravak tvari i na postupak za izradu navedenog biljnog ili životinjskog ekstrakta te na njegovu primjenu kao dodatka hrani, u osobnoj njezi i u farmaceutskoj primjeni.

Aloe je član obitelji ljiljana koja obuhvaća preko dvjesto različitih rodova Aloe. Aloe barbadensis Miller ili Aloe Curacao se općenito prepoznaje kao "prava aloe" zbog njezine široke primjene i vrlo učinkovite snage liječenja. Aloe vera sadržava dva veća izvora tekućine, žuti lateks (eksudat) i bistri gel (sluz). Sluzava želatina iz parenhimalnih stanica biljke se naziva Aloe vera gel. Aloe vera gel je težinski oko 98.5% voda. Više od 60% ukupne krute tvari je načinjeno od polisaharida koji potječu od ugljikohidrata.

Još od najranijih dana pisane povijesti čovjek je upotrebljavao cijele listove, ekstrudate i svježe gelove dobivene od Aloe vera budući da je pouzdana za niz bioloških aktivnosti uključujući protu-bakterijske, protu-virusne i protuupalne aktivnosti. To je bila tradicionalna medicina u mnogim kulturama i koristila se među ostalim za gubu, opekotine i alergijska stanja. Drugi rodovi Aloe koji imaju moć liječenja su, na primjer, Aloe arborescens, Aloe vahombe, Aloe ferox i Aloe saponaria.

U literaturi je bilo opisano mnogo različitih saharida za koje je navedeno da su odgovorni za navedene biološke aktivnosti. Na primjer, u US patent 4,861,761 bio je otkriven jednostupanjski postupak za pripremanje čistog terapijski aktivnog polisaharida koji je nazvan Aloeferon s molekularnom težinom od oko 70 kD.

U US patent 5,118,673 opisuju se biološke aktivnosti po Acemannanu, polisaharid ekstrahiran iz gela Aloe vera koji sadržava molekule manoze koje su za oko 91% O-acetilirane. Osim manoze, prisutna je jedna druga komponenta glizozila, naime galaktoza u omjeru od oko 20:1. Molekularna težina je u prosjeku oko 1000 kD. Za ovaj netoksični polimer se također kaže da je učinkovit u suprimiranju tumora.

Međutim, u novije vrijeme su Nirmal Pugh i sur. opisali u Journal of Agricultural Food Chemistry, 4JL 1030-1034 (2001) novi polisaharid iz Aloe vera koji ima veliku molekularnu težinu sa snažnom imuno-stimulativnom aktivnošću. U izvještaju se navodi da je molekularna težina 4000-5000 kD. Važnije komponente glikozila su glukoza (37.2%), galaktoza (23.9%), manoza (19.5%) i arabinoza (10.3%). Navodi se da iako ovaj polisaharid izvornoj suhoj težini pridonosi samo s 0.015%, njegova biološka aktivnost u toj koncentraciji je u potpunosti zaslužna za aktivnost sirovog Aloe soka. Uzima se da je imunostimulatorna aktivnost acemannana mnogo niža zahvaljujući vrlo snažnoj tvari (najvjerojatnije polisaharid Aloerid) koja je prisutna u tragovima kao "zagađivač".

Stoga, sve do sada nije bilo ustanovljeno sa sigurnošću koja frakcija Aloe vera uzrokuje biološku aktivnost navedene biljke. Cilj je predmetnog izuma da izolira novi pripravak tvari koja se može dobiti iz Aloe vera ili iz biljnog ili životinjskog ekstrakta koji je prikladan kao dodatak hrani ili u dijetalnoj hrani, u osobnoj njezi ili u kozmetici, ili u farmaceutskoj upotrebi, naročito za sprečavanje adhezije mikroorganizama u tkivima. Drugi cilj ovog izuma je da osigura postupak pomoću kojega takav pripravak tvari ili ekstrakt može biti izoliran.

Nađeno je da nova frakcija polisaharida s negativnim nabojem koja je izolirana iz Aloe vera i koja uglavnom sadržava manozu pokazuje iznenađujuće veću biološku aktivnost nego odgovarajuća frakcija polisaharida koji nema naboja ili ima samo neznatan naboj, a koja frakcija se ne veže na pozitivno nabijen stupac. Ova veća biološka aktivnost nađena je kao podfrakcija sa svim očitim molekularnim težinama.

Predmetni izum osigurava takav pripravak tvari koji obuhvaća polisaharide dobivene iz Aloe vera sa sljedećim karakteristikama: a) polisaharid sadržava 70 - 90% D-manoze s opsegom između 60 - 100%, 30 - 10% D-glukoze s opsegom između 40 - 0% i 0 - 10% drugih monosaharida, b) polisaharidi imaju negativan naboj i c) poiisaharidi se vežu na stupac s pozitivnim nabojem. S drugim naznačenim širim opsegom misli se da polisaharidi s težinskim postotkom naznačenih polisaharida unutar širih granica pripadaju u djelokrug ovog izuma, da su povoljniji oni s takvim težinskim postotkom unutar malog opsega. Svi postoci koji imaju veze s pripravkom tvari odnose se na težinske postotke.

Poželjno je da u navedenom pripravku tvari polisaharidi imaju prosječnu molekularnu težinu od oko 100 - 300 kD. lako kao već i druge subfrakcije s prosječnom molekularnom težinom od ili 10 - 50 kD, ili više od 300 kD pokazuju značajnu biološku aktivnost, ove subfrakcije također čine jedan aspekt predmetnog izuma. Poželjno je daje omjer D-manoze i D-glukoze u navedenim polisaharidima unutar opsega od oko 5 do 20, poželjno 7-10.

Predmetni izum također predviđa postupak za izradu navedenog pripravka tvari sa sljedećim fazama postupka:

a) subfrakcija biljnog ili životinjskog ekstrakta, na primjer, ekstrakta Aloe ili Aloe vera u dvije frakcije, jedna s jasnom molekularnom težinom od > + 5 kD, koja se naziva subfrakcija l i jedna s jasnom molekularnom težinom od < ± 5 kD,

b) prelazeći od subfrakcije I preko stupca s pozitivnim nabojem kao što je, na primjer, stupac DEAE-sefaroze, stupac DEAE-sefadeksa ili stupac DEAE-celuloze,

c) dio subfrakcije I koji je izbjegao povezivanje na navedeni stupac s otopinom soli, na primjer, s otopinom natrijevog klorida koji rezultira u subfrakciji I-D1

d) destiliranje i ultrafiltracija I-D1, na primjer, kroz membranu PM10 pod pritiskom dušika, da bi se koncentrirao I-D1 do oko 0,1 originalnog volumena ekstrakta Aloe vera,

e) proizvoljna priprema subfrakcije I-D1, sa željenim jasnim molekularnim težinama od > 300 kD, 100 - 300 kD, 50-100 kD, naročito s ultrafiltracijom koja slijedi preko XM-300, XM-100, XM-50 i konačno membrane PM 10 ili pomoću pripravnog FPLC preko stupca Superoze.

Poželjna je da se faza prethodnog čišćenja izvede prije postupka faze "a" preko stupca Sephadex G-25.

U članku A. Femenia i drugih, Carbohγdrate Polvmers 39, 109-117 (1999), bili su opisani također i ekstrakti Aloe vera, iako navedeni ekstrakti nisu dalje bili frakcionirani i nisu dalje bili separirani uz pomoć stupca s pozitivnim nabojem.

Predmetni izum također kao supstancu osigurava biljni ili životinjski ekstrakt, naročito ekstrakt Aloe, pri čemu je to još posebnije ekstrakt Aloe vera, označen kao ekstrakt NAG-25 (nema sklonosti spajanja za Sephadex G-25), koji uključuje pripravak tvari kao što je gore definirano u koncentraciji od 5 - 10, naročito 8 puta većoj i sastojaka niske molekularne težine od oko 2 puta niže od ekstrakata koji su poznati u struci. Općenito takav biljni ili životinjski ekstrakt NAG-25 (treba se shvatiti kao biljni NAG-25 ili životinjski NAG-25 ekstrakt) će biti biljni sok.

U skladu s daljnjim aspektom izuma, postupak je bio predviđen za pripremu takvog biljnog ili životinjskog ekstrakta NAG-25 čišćenjem odgovarajućeg neobrađenog biljnog ili životinjskog ekstrakta preko stupca Sephadex G-25 da bi se uklonili materijali s afinitetom za navedeni stupac. Pod "odgovarajući" misli se na istu vrstu biljke ili životinje. Takav NAG-25 ekstrakt sadržava sve visoko molekularne spojeve bez bilo kakvog afiniteta za matricu polisaharida stupca s pozitivnim nabojem koji se koristi, ali također sastojaka s manje niskom molekularnom težinom nego što se očekivalo. Ako je potrebno, rezultirajući ekstrakt se dalje koncentrira s faktorom od 5 do 50 uklanjanjem vode što rezultira biljnim ili životinjskim NAG-25 ekstraktom koji je u skladu s predmetnim izumom, također označen s 2QRide. Općenito, ako je početni spoj raspršeni osušeni prašak, može se dobiti koncentrirana otopina polazeći u malom volumenu vode u kojem slučaju nisu potrebne dalje faze koncentriranja.

Poželjno je da, ako se koristi biljka za pripremanje pripravka tvari ili NAG-25 ekstrakta koji je u skladu s izumom, to je biljka Aloe, posebno Aloe vera. Međutim ekstrakt koji sadržava polisaharide s negativnim nabojem može biti također dobiven iz drugih biljaka. Biološki aktivni polisaharidi bili su nađeni u Vaccinnium macrocarpon (Cranberrv), Panax ginseng, Plantago, Echinacea, Garcinia, Arnica, Angelica, Hibiscus, Glycyrrhiza, Morinda i tako dalje. Ako se koristi životinja, naročito su prikladne ribe i puževi. Međutim, osim biljnih i životinjskih ekstrakata također se mogu za ovu patentnu prijavu razmotriti ekstrakti iz nižih organizama kao što su morske alge, spužve i školjke kao da pripadaju u opseg ovog izuma. Stoga za ovu patentnu prijavu izrazi u tekstu biljka i životinja obuhvaćaju također niže organizme.

U skladu s još daljnjim aspektom ovog izuma predviđen je ekstrakt Aloe, naročito Aloe vera koji je bio ultrafiltriran, poželjno s postupkom unakrsnog toka preko membrane radi pripreme subfrakcija s željenom jasnom molekularnom težinom kao što je gore naznačeno, ali i s polisaharidima koji imaju naboj i polisaharidima koji su bez naboja, koji se vežu i koji se ne vežu na stupac s pozitivnim nabojem. Također ovaj ultrafiltrirani ekstrakt Aloe sadržava novi polisaharid s negativnim nabojem koji je u skladu s ovim izumom. Poželjno je da se navedeni polisaharidi s nabojem i bez naboja dalje razdvajaju u polisaharide s nabojem i polisaharide bez naboja pomoću prolaza preko filtara s nabojem, od kojih su polisaharidi s nabojem označeni kao 2QRide.

Novi saharidi s negativnim nabojem, biljni ili životinjski ekstrakti NAG-25 i ultrafiltrirani ekstrakt Aloe koji sadržavaju visok postotak polisaharida s negativnim nabojem koji su u skladu s ovim izumom i ovdje su opisani, imaju visoku biološku aktivnost i mogu se primijeniti kao dodatak hrani ili kao dijetalna hrana, na primjer, radi sprečavanja adhezije bakterija, naročito u sloju mukoze ljudskog želučanog epitela. Nadalje, navedeni polisaharidi s negativnim nabojem, biljni ili životinjski ekstrakti NAG-25 i ultrafiltrirani ekstrakti Aloe koji sadržavaju iste mogu se primijeniti za osobnu njegu i kozmetičku upotrebu radi sprečavanja infekcija od štetnih i škodljivih mikroorganizama, na primjer, kod njege zuba kao pasta za zube radi sprečavanja gingivitisa i karijesa. Nadalje, polisaharidi s nabojem i navedeni ekstrakti koji sadržavaju iste mogu se vjerojatno prikladno primjeniti u tekućinama, na primjer, radi zaštite očnih leća, u sprejevima i u toniku te u kapljicama, kremama i gelovima koji se koriste za njegu kože, kose, očiju i ušiju. Konačno, navedeni polisaharidi i navedeni ekstrakti koji sadržavaju iste, mogu se koristiti u farmaceutskoj primjeni, naročito kao medikamenti ili kao pomoćna sredstva u farmaceutskim pripravcima radi sprečavanja ili liječenja infekcija od infektivnih mikroorganizama kao što su virusi, gljivice i bakterije i liječenja upala, i vjerojatno kod imunoterapije i kod liječenja rana. Infekcija s četiri od navedenih bakterija, bakterije Helicobacter pylori, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus mutans i Streptococcus sanguis, mogu naročito biti suzbijene pomoću ovih polisaharida.

U ovoj patentnoj prijavi svi postoci koji imaju veze s pripravkom tvari odnose se na težinske postotke. Nadalje, izrazom "odgovarajući" misli se da je kao početni materijal ista vrsta biljke ili životinje kao što je i konačni ekstrakt. Nadalje, ako nije drukčije istaknuto, izrazom "ekstrakt" misli se vodeni ekstrakt.

Infekcija želuca s Helicobacter pylori je jedna od najuobičajenijih bakterijskih infekcija. Kod manjine inficiranih pojedinaca razvijaju se gastro-duodenalne bolesti koje su povezane s tom bakterijom. Primjeri za to su razvoj čira želuca, kroničnog i atrofičnog gastritisa, limfoma limfoidnog tkiva povezanog sa sluznicom i karcinoma želuca. Adhezija Helicobacter pylori za mukozu je ograničena na apikalnu površinu mukoznih epitelnih stanica i stanica koje okružuju želučane kripte, naročito u donjem dijelu želuca. Otkriveni su različiti adhezini koji posreduju u ovom vezanju, prepoznavanjem proteina ili specifičnihglikokonjugata, npr. mucina prisutnih na eukariotskoj staničnoj površini (D. Ilver et al., Science 279, 373-377 (1998)). Prema tome, čini se da je adhezija Helicobacter pylori barem dijelom ovisna o glikokonjugatima. Do danas, međutim, učinkovitost biljnog ili životinjskog ekstrakta NAG-25, kao što je primjerice ekstrakt Aloe ili ekstrakt Atoe dobiven ultrafiltracijom koji sadržava negativno nabijene polisaharide u skladu s izumom, nije nigdje bila opisana za borbu protiv infekcije s Helicobacter pylori.

U utvrđenom ELISA testu činilo se da ekstrakti Aloe vera uistinu mogu inhibirati adheziju pripravaka adhezina Helicobacter pylori na mucine slinovnica. Zbog toga je odlučeno da se istraži koje su komponente u ekstraktu odgovorne za inhibiciju. Aktivne subfrakcije gela Aloe vera dobivene su kombinacijom precipitacije, molekularnog prosijavanja i kromatografije s anionskom izmjenom te su karakterizirane s obzirom na molekularnu težinu i sastav šećera i činilo se da su nove.

Predmetni izum je ilustriran sljedećim slikama s objašnjenjima:

Slika 1: Eluiranje vezane frakcije od 200 ml AV-15 frakcije I (>5 kD frakcija AV-15 NAG) iz stupca DEAE-Sepharose s gradijentom NaCl od 0-2 M NaCl. Y-os predstavlja koncentraciju NaCl (M) kao i apsorbanciju na 250 nm; X-os predstavlja elucijski volumen. Nula ml predstavlja polaznu točku 0-3.0 M gradijenta NaCl koji je primjenjen nakon sakupljanja DEAE-nevezane AV-D0 frakcije, nakon čega je slijedilo ispiranje stupca s Milli-Q vodom volumena 2 stupca.

Slika 2: Inhibicija adherencije mucina za S-sloj Helicobacter pylori pomoću Aloe vera ekstrakata dobivenih iz raznih izvora:

muc, pozitivna kontrola koja sadržava samo mucin

AV, ko-inkubacija mucina s 2 - 16 puta razrjeđenom otopinom Aloe vera ekstrakta

AV-3 i AV-4 1:1 Aloe Gel produkti; AV-B, AV-D, AV-E i AV-F su komercijalno dostupni izvori Aloe vera, koncentrirani 40, 10, 5 i 2,5 puta, svaki pojedino

A490 nm vrijednosti apsorbancije po bazenčiću u dvostruko, za mucin četverostruko.

Slika 3: Inhibicija 100 - 300 kD supfrakcije nabijene frakcije I-D., ekstrakta Aloe vera s:

muc, pozitivnom kontrolom koja sadržava samo mucin

AV-2; 1:1 Aloe-Gel produkt u raznim koncentracijama

A490 nm vrijednosti apsorbancije po bazenčiću u dvostruko, za mucin četverostruko.

Slika 4: Inhibicija atherencije FITC-obilježenog Helicobacter pylori za slojeve ljudskog antruma supfrakcijama ekstrakta Aloe vera AV-5 pomoću:

a. regularne projekcije

b. uzastopnim rezom inkubiranim s FITC-obilježenim Helicobacter pylori i ukupnom frakcijom I

c. uzastopnim rezom inkubiranim s FITC-obilježenim Helicobacter pylori i frakcijom I-D0, identičnom s kontrolama bez Aloe vera supfrakcija.

Sljedeće skraćenice korištene u ovoj patentnoj prijavi označavaju:

DEAE = dietilaminoetil

FITC = fluorescein 5-izotiocijanat

HPAEC-PAD = kromatografija s anionskom izmjenom visokog pH s pulsnom amperometrijskom detekcijom (high pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection)

BCA = bicinhoninička kiselina

ELISA = enzimski imunotest (enzyme-linked immunoassay)

A490nm = apsorbancija na 490 nm

NMR = nuklearna magnetska rezonancija

DEAE frakcija vezanja može biti izolirana iz frakcije I iz AV-15 NAG-25 veće od 5 kD pomoću DEAE-Sepharoze, DEAE-celuloza i DEAE-Sephacel kromografije pod elucijom s 0,5 ili 1 M NaCl. To je pokazano primjerom NaCl gradijenta na slici 1 za eluciju DEAE-vežuće frakcije od 200 ml AV-15 frakcije I. Nespecifična adhezija na celuloznu matricu nije vjerojatna budući da je kao početni materijal za subfrakcioniranje korištena NAG-25 frakcija, a ne Aloe gel. Prema tome, elucija ovisna o NaCl potvrđuje da je DEAE-vezivanje izazvano negativnim nabojem na molekulama. Proteini ili peptidi bili su ispod detektabilne razine. Analiza šećera otkrila je da je galakturonska kiselina prisutna u malim količinama, ali se čini da je taj šećer prisutan i u ne-vežućoj D0 frakciji (rezultati nisu pokazani). Stoga molekularna priroda negativnog naboja još nije utvrđena.

Svi dostupni Aloe vera ekstrakti inhibirali su interakciju s mucinima ovisno o dozi kad su bili ko-inkubirani s fiksnom koncentracijom mucina, vidi sliku 2. Varijacije u inhibitornoj aktivnosti odražavaju razlike u sastavima ekstrakata ovisno o izvorima ili stanju kulture biljaka Aloe vera, ali slabo mijenjaju proporcionalnu biološku aktivnost raznih subfrakcija. Očito komponenta Aloe vera ili komponente Aloe vera kompetiraju s mucinom za vezanje za pripravak adhezina iz Helicobacter pylori.

Većina inhibitorne aktivnosti ekstrakata Aloe vera čini se da proizlčazi iz subfrakcije l, s molekularnom težinom od najmanje 5 kD, sudeći prema njenom ponašanju na Sephadex G-25 kromatografiji. Daljnje studije fokusirale su se na tu električki nabijenu frakciju zbog njene visoke aktivnosti. Ugljikohidratna analiza i analitička permeativna kromatografija na Superdex HR-200 stupcu otkrila je da su glavni sastojci olisaharidi. Sastav šećera ovisi o Aloe vera ekstraktu, ali svaki ekstrakt se sastoji od homo- i heteropolimera manoze i glukoze.

Opseg inhibitorne aktivnosti može se dobiti i eluirati specifično s NaCl sa stupaca za anionsku izmjenu. Kromatografija s DEAE-Sepharose upotrijebljena je za izolaciju ovu očito negativno nabijenu polisaharidnu frakciju, obilježenu sa frakcijom I-D,. Sekvencijska ultrafiltracija korištena je za dobivanje subfrakcija s očitom molekularnom težinom od >300 kD, 100-300 kD, 50-100 kD i 10-50 kD. Ove subfrakcije također su pripremljene za sastojke koji se nisu vezali za DEAE-Sepharose obilježenu sa frakcijom I-D0. Čini se da su sve subfrakcije sadržavale 90%, točnije 95% i više homo- i heteropolimera manoze i glukoze, od čega polimanoze oblikuju glavne komponente kako je sažeto u tablici 1 niže u tekstu. Ostatak uključuje galaktozu i različite neidentificirane šećere (nisu prikazani u tablici).

Kako je prikazano u tablici 1, inhibitorne aktivnosti DEAE-vežućih frakcija su značajno više nego one od nevežućih subfrakcija iz Aloe vera ekstrakata. Subfrakcija od 100-300 kD od I-D, pokazuje najvišu inhibitornu aktivnost (82%), iako je testom po bazenčiću, 12,5 μl, prisutna samo mala količina Aloe vera polisaharida, točnije 0,325 μg manoze i 0,045 μg glukoze. To predstavlja oko 9,3 nM polisaharida u 200 μl konačnog volumena pretpostavljajući srednju molekularnu težinu od 200 kD. Inhibicija je ovisna o dozi i 50% inhibicije doseže se pri deseterostruko nižoj koncentraciji od oko 0,03 μg manoze po bazenčiću ili oko 0,9 nM polisaharida, vidi sliku 3. Vrlo mala količina pripravka tvari nađena u DEAE-vežućoj frakciji od >300 kD je također vrlo aktivna po pmol polimanoze kad se uzmu u obzir velike molekularne težine. Ostale dvije DEAE-vežuće frakcije pokazuju znatno nižu specifičnu aktivnost, mada još uvijek višu nego u odgovarajućim subfrakcijama DEAE-nevežuće I-D0. Začudo, inhibitorna aktivnost nije bila otkrivena za polisaharide prisutne u frakciji I-D0 s molekularnim težinama većima od 300 kD.

Tablica 1

Inhibitorna aktivnost subfrakcija I-D0 i I-D, na adherenciju H. pylori

[image]

Subfrakcije Aloe vera ekstrakta AV-2 (vidi pod Materijali) pripravljaju se sekvencijskom ultrafiltracijom počevši od 25 ml navedenog ekstrakta AV-2. Volumen svake subfrakcije prilagođen je na 12,5 ml. Podaci se zasnivaju na vrijednostima dobivenima dvostruko za jednake količine (12,5 μl) svake frakcije i izraženi su relativno u ovisnosti o apsorbanciji mjerenoj u kontrolnim bazenčićima koji su sadržavali samo mucin. Inhibitorna aktivnost 12,5 μg originalnog AV-2 ekstrakta s 813 μg glukoze/ml i 325 μg manoze/ml, viz. 268 nM polisaharida, iznosila je 76%.

Inhibicija vezanja Helicobacter pylori za želučanu sluznicu dokazana je inkubacijom sekvencijskih slojeva mukoze iz ljudskog antruma s FITC-obilježenima Helicobacter pylori u odsustvu i prisustvu subfrakcija Aloe vera. Kao u studiji koju su načinili Boren et al., Science, 262. 1892-1895 (1993.), selektivno vezivanje stanica Helicobacter pylori obilježenih s FITC zamijećeno je jedino u sluzničnim slojevima antruma, vidi slike 4a i 4c. Ko-inkubacija Helicobacter pylori obilježenih s FITC s ukupnom težinom frakcije I, viz. I-D0 i I-D, frakcije Aloe vera ekstrakta, snažno je inhibirala atherenciju bakterija za mukozu (vidi sliku 4b) što je u oštrom kontrastu prema odsutnosti inhibicije kad je ko-inkubirana samo subfrakcija I-D0. To je još jedna jaka indikacija da inhibitorna aktivnost ostaje u negativno nabijenoj frakciji.

Obrazac inhibicije koji se može usporediti nađen je za Helicobacter pylori obilježen s Syto-13, pri čemu je Syto-13 zelena fluorescentna oznaka koja se upotrebljava u dvije različite koncentracije Aloe vera subfrakcija u skladu s izumom o pločicama s bazenčićima obilježenima s MUC5. U članku Van den Brink et al., Gut 46, 601-607 (2000.), «H. pylori se nalazi na istim mjestima u ljudskom želucu kao i MUC5-AC», opisano je da se H. pylori u želucu veže za specifičan mucin koji se nalazi u antralnom dijelu želuca. Prema tome, učinak subfrakcija Aloe vera na sličan mucin iz sline u in vitro pokusnom sustavu može poslužiti kao model za mucin-specifično vezanje H. pylori za epitel želuca.

Rezultati su prikazani u tablicama 2 i 3.

Tablica 2

Inhibitorna aktivnost subfrakcije I-D, AV ekstrakta na atherenciju H. pylori

[image]

Tablica 3

Inhibitorna aktivnost subfrakcije I-D, AV ekstrakta na atherenciju H. pylori

[image]

Na isti način učinak atherencije Aloe vera subfrakcije na kolonije P. aeruginosa obilježene sa Syto-13 u skladu s izumom testiran je na pločicama s bazenčićima obilježenima s MUC5. Količina bakterija koja se vezala za pločice ovisila je o količini obloženog MUC-5. Rezultati su prikazani u tablici 4 i tablici 5, svakoj pojedino.

Tablica 4

Inhibitorna aktivnost subfrakcije I-D, AV ekstrakta na atherenciju P: aeruginosa

[image]

Tablica 5

Inhibitorna aktivnost subfrakcije I-D, AV ekstrakta na atherenciju Pseudomonas aeruginosa

[image]

Na isti je način testiran učinak atherencije subfrakcije Aloe vera u skladu s izumom na Syto-13 obilježen soj bakterije Streptococcus mutans i na Syto-13 obilježen soj bakterije Streptococcus sanguis na slini obogaćenoj aglutininom prilijepljenoj za pločice. Količina bakterija koja se vezala za pločice ovisila je o količini obloženog MUC-5. Rezultati su prikazani u tablici 6 i tablici 7, svakoj pojedino.

Tablica 6

Inhibitorna aktivnost subfrakcije I-D, AV ekstrakta na atherenciju Streptococcus mutans

[image]

Tablica 7

Inhibitorna aktivnost subfrakcije I-D, AV ekstrakta na atherenciju Streptococcus sanguis

[image]

Osobama iz struke valja obratiti pažnju da anti-adhezivni polisaharidi u skladu s izumom su i anti-infektivni agensi protiv svih mikroorganizama koji invadiraju površinu tkiva domaćina, što je dokazano primjerima Helicobacter pylori, Pseudomonas aeruginosa, Streptomyces mutans i sanguis bakterija kao što je prije napomenuto. Izuzetak od bakterijske invazije je fenotip uobičajen kod tumorskih stanica, leukocita, parazita, bakterija i virusa koji uključuje adheziju stanica-stanica, adheziju staničnog matriksa proteolizu i pokretljivost. Ove aktivnosti regulirane su međudjelovanjem napadača i domaćina. Adhezija mikroorganizama za površinu tkiva domaćina je često prvi korak u patogenezi. Populacija pacijenata postaje sve više podložna morbiditetu i mortalitetu povezanom s patogenima otpornima na lijekove. Inhibicija adhezije je, prema tome, važna odlika novih antiinfektivnih tvari.

Polisaharidi u skladu s izumom smanjuju opterećenje biofilmom. To nastaje zahvaljujuću redukciji adhezije Gram negativnih, a vjerojatno i Gram pozitivnih bakterija za stanice. Nadalje, navedeni polisaharidi također ometaju proces adhezije virusa, gljiva, flagelata i drugih parazita i mogu biti dio terapije za liječenje ili prevenciju kliconoštava ili obolijevanja čitavog organizma čovjeka, životinje ili moguće biljaka. Vjeruje se da navedeni polisaharidi koji se sastoje od jednostavnih monosaharida nisu toksični bilo u topičkoj, oralnoj, injekcijskoj ili sistemskoj primjeni.

U vezi s primjenom negativno nabijenih polisaharida ili biljnih ili životinjskih NAG-25 ekstrakata koji sadrže navedene polisaharide u skladu s predmetnim izumom u oralnom obliku, u svim prikladnim doznim oblicima koji se mogu primijeniti, kao što su injektabilne tekućine ili tablete koje proizvoljno sadrže prikladne ekscipijente kao što su produkti celuloze, primjerice mikrokristalinična ili mikrofina celuloza ili silika-gel, dezintegratore, primjerice modificirani škrob, natrij-karboksi-metil celuloza ili unakrsno-vezani polivinil-pirolidon, proizvoljno lubrikante i proizvoljno zaslađivače, primjerice okuse i arome, jesu u dosegu predmetnog izuma. Također i drugi oralni dozažni oblici kao kapsule i sirupi proizvoljno zajedno s prikladnim ekscipijentima koji uključuju polisaharide iz predmetnog izuma čine dio predmetnog izuma. Navedeni oralni dozažni oblici mogu se, međutim, također primijeniti kao lijek u prevenciji ili liječenju infekcije uzrokovane zaraznim mikroorganizmima ili u prevenciji i liječenju upala. Nadalje, u dosegu izuma su također i topički dozni oblici kao što su kreme ili gelovi, naročito u polju osobne upotrebe za kozmetičku primjenu.

Primjeri izloženosti, infekcije i bolesti koje se mogu prevenirati i liječiti anti-adhezivnim polisaharidima iz predmetnog izuma, osim onih koje uzrokuju mikroorganizmi koji invadiraju gastrointestinalni trakt, primjerice želudac, na primjer Helicobacter pylori, također jesu i:

kožne, koje uzrokuju

- Staphylococcus aureus i Staphylococcus epidermidis, koji su uobičajeni patogeni, npr. u bolnicama

- virusi poput herpes virusa povezanog s Kaposijevim sarkomom, herpes simplex virus

- gljive, primjerice Candida sp., Blastomyces dermatidis; adhezija na kožu također uključuje i adheziju na kožne mikrovaskularne endotelne stanice

očne, koje uzrokuju

- Staphγlococcus epidermidis, koji igra važnu ulogu u patogenezi nekih oblika endoftalmitisa koji nastaju nakon operacije katarakte

- Moraxella bovis kao izvor infekcije goveđim keratokonjunktivitisom

uha, nosa i grla, koje uzrokuju

- Staphylococcus aureus koji adherira na kožu i sluznična tkiva

- bakterije koje sudjeluju u razvoju upale srednjeg uha i nazofaringealnih infekcija, kao što su Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae i Moraxella catarrhalis

usne šupljine, gdje biofilm zubnog plaka igra ključnu ulogu u progresiji bolesti zuba, a polisaharidi su vrlo važni u ekologiji zubnog biofilma, koje uzrokuju

- bakterije koje uzrokuju karijes, kao što su Streptococcus sobrinus kao akariogena mrlja, Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius, Streptococcus gordonii i Actinomγces viscosus, Actinobacillus actinomγcetemcomitans

- parodontopatogene bakterije, kao što su Porphγromonas gingivalis i Streptococcus salivarius, Streptococcus oralis, Fusobacterium nucleatum, i Prevotella intermedia

- sve oralne spirohete koje se klasificiraju u rod Treponema, kao što su denticola, pectinovorum, socranskii i vincentii

- Mycoplasma salivarium

- mikroorganizmi koji sudjeluju u stvaranju nosnih polipa

- mikroorganizmi koji sudjeluju u nastanku sinuitisa

urogenitalnog trakta, koje uzrokuju

- gram negativna uropatogena Escherichia coli, koja adherira na tkiva urogenitalnog trakta

- Mγcoplasma genitalium

- Trichomonas vaginalis

- Candida sp.

- Neisseria gonorrhoeae, koja adherira na epitel jajovoda

- Treponema pallidum, koja uzrokuje perivaskulitis, abnormalnosti endotelnih stanica koje su istaknuti histopatološki znaci sifilisa i različite kožne lezije koje su glavni klinički znaci sifilisa

- Escherichia coli

- Citrobacter species

crijeva, koje uzrokuju

- Salmonella species, npr. Salmonella typherium

- Peroteus mirabilis

- Clostridium species, npr. difficile, perfringens, bifermentans

- Shigella species, npr. flexneri

- Mγcoplasma species, npr. gallisepticum

- Enterococcus species

- Bacteroides fragilis

- Bacillus species

- Listeria monocγtogenes

- Hepatitis A virus

- Campγlobacterjejuni

- Salmonella tγphimurium

- Versinia enterocolitica i Versinia pseudotuberculosis

- Aeromonas veronii biovar sobna

- Envinia chiγsanthemi, koja je model biljnog patogena koji može parazitirati u domaćinu sisavcu kao i u biljkama

respiratornog trakta, koje uzrokuju

- Pseudomonas aeruginosa, Gram-negativni fakultativni patogen bronha i pluća, kao i u bolesnika koji boluju od cistične fibroze

- Klebsiella pneumoniae

- Bordetella species, npr. pertussis, parapertussis i bronchiseptica

- bakterije roda Legionella, koje su intracelularni paraziti i važan patogen za ljude

- respiratorni sincicijski virus (RSV), koji potencijalno uzrokuje infekcije donjeg respiratornog trakta u djece

- Mγcoplasma pneumoniae

- Rhinovirus koji inducira proastmatske promjene

- Ciγptococcus neoformans, koji se najčešće nalazi u plućima i uključen je u interakciju između gljiva i alveolarnih epitelnihstanica

- Spreptococcus species, kao na primjer pyogenes ili gordonii

- Escherichia pneumoniae, važan respiratorni patogen

- kompleks Burkholderia cepacia, koji se sastoji od najmanje pet dobro dokumentiranih bakterijskih genovara, od kojih je svaki izoliran iz sputuma različitih pacijenata s cističnom fibrozom

- Mannheimia (Pasteurella) haemolγtica, koja je jedan od najvažnijih respiratornih patogena stoke i uzrokuje ozbiljne provale akutne pneumonije u novorođene, sišuće ili veće janjadi, teladi ili kozlića. Također je i važan uzrok pneumonije u odraslih životinja

- Rhinotracheitis virus, parainfluenza-3 virus ili goveđi respiratorni sincicijski virus, koji predisponiraju životinju za infekciju s M. haemolγtica

organa, krvi, limfe, krvnih žila i limfatičkog sustava, koje uzrokuju

- Staphylococcus aureus u bakterijskom endokarditisu

- Streptococcus sanguis u bakterijskom endokarditisu

- Staphylococcus epidermidis u bakterijskom endokarditisu

- Gram-pozitivne i Gram-negativne bakterije, kao na primjer S. aureus i E. coli u intravaskularnim infekcijama

- Coxsackie virus

- Rotavirus

- Cytomegalovirus glodavaca

- Adenovirus

- Neisseria meningitidis

- Chlamydia pneumoniae

- Wolbachia, bakterija povezana s Gram-negativnim rikecijalama, u osoba inficiranih s Onchocerca volvulus

- Borrelia burgdorferi, uzročnik Lymske bolesti

- Coxiella burnetti, uzročnik Q-groznice

- Acholeplasma laidlawii

- intracelularna invazija je važan dio Carrionove bolesti, koju uzrokuje Bartonella baciliformis. l krvna i tkivna faza bolesti uključuju inicijalnu adherenciju mikroorganizama za eritrocite i endotelne stanice

- Paracoccidioides brasiliensis, dimorfna gljiva poznata po tome da uzrokuje invazivnu sistemsku bolest u ljudi.

Prema tome, u skladu s izumom, pripravak tvari koji sadržava negativno nabijene polisaharide, proizvoljno prisutne u biljnom ili životinjskom ekstraktu NAG-25 ili u Aloe vera ultrafiltracijskom ekstraktu u skladu s izumom, koji se može učinkovito primijeniti za prevenciju i liječenje infekcija mikroorganizmima, po svoj prilici sprečavanjem adhezije navedenih mikroorganizama. Navedeni pripravak ili NAG-25 ekstrakt ili Aloe vera ultrafiltracijski ekstrakt može se primijeniti kao dodatak hrani ili u vidu posebne prehrane, u osobnoj njezi i kozmetičkoj primjeni, kao i u farmaceutskoj primjeni.

Predmetni izum bit će dalje opisan i primjerima koji slijede, a koje se ni u kom pogledu ne smije smatrati ograničavajućima po pitanju doseg izuma.

Materijali i postupci

Materijali:

Jednokratni polistirenski stupci s najvećim volumenom posudice od 2 ml, nabavljeni su od tvrtke Pierce, Rockford, Irska. Sephadex G-25 Fine, DEAE-Sepharose, stupci brzog protoka koji oduzimaju sol, volumena 5 ml i Superose 200 HJR10/30 i 1 ml MonoQ HR 5/5 stupci nabavljeni su od tvrtke Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Švedska. Filtracijske jedinice od 10 ml i 50 ml, kao i dijapazon ultrafiltracijskih membrana nabavljeni su od Amicon corp., Lexington, SAD i Millipore, Bedford, SAD. Carbopack TM MA1 i PA1 analitički stupci (4×250 mm) u kombinaciji s Carbopac TM Aminotrap Guard stupcem (10×32 mm) i HPAEC-PAD sustavom nabavljeni su od Dionex, Sunnvdale, ČA, SAD. Fluorotrac 600 pločice za mikrotitraciju s 96 bazenčića ravnog dna, visoko vežućih, dobivene su od Greiner, Frickenhausen, Njemačka. Mucin velike molekularne težine dobiven iz ljudske sline kao i mišja anti-humana monoklonalna protutijela (MabF2) protiv mucina iz sline donirao je dr. E. Veerman, Odjel za oralnu biokemiju, ACTA, Amsterdam. Aglutininom obogaćena ljudska slina dar je dr. A. J.M. Ligtenberg, Odjel za oralnu biokemiju, ACTA, Amsterdam. Peroksidaza hrena obilježena anti-mišjim IgG i IgM iz koze nabavljena je od American Qualex, San Clemente, CA, SAD. Fluorescein-5-izotiocijanat (FITC) nabavljen je od Sigma, St. Louis, MO, SAD.

Syto-13, fluorescentno zelena boja za nukleinsku kiselinu nabavljena je od Molecular probes (Leiden, Nizozemska) kao 5 mM otopina u dimetilsulfoksidu. Standardni šećeri korišteni za analizu ugljikohidrata su iz komercijalnih izvora i analitičkog sastava.

Aloe vera ekstrakti:

Aloe vera ekstrakti (AV-1 do AV-7, AV-15, AV-16 i AV-A do AV-F) nabavljeni su od Bioclin B.V. (Delft, Nizozemska), a porijeklo vuku iz komercijalnih izvora. AV-A, AV-3 i AV-4 uključuju Aloe vera ekstrakt i gel u omjeru 1:1, AV-B i AV-D su koncentrati iz komercijalnih izvora s faktorima 40 i 10, svaki pojedino. AV-2 ekstrakt sadržava 813 i 325 μg glukoze i manoze, svake pojedino, AV-16 pripremljen je ultrafiltracijom filtriranog biljnog soka Aloe vera unutrašnjeg gela iz prašnika kao što je dalje opisano, pomoću cross-flow postupka preko šuplje vlaknate membrane s odmakom od 30 kD, nakon čega je slijedila 10× koncentracija. AV-5, AV-6, AV-7 i AV-E su dobiveni kao liofilizirani prašci, a AV-F i AV-17 kao osušeni prašci u obliku spreja.

Svi ti produkti bili su produkti unutrašnjeg gela prašnika Aloe vera. Ti gel-prašnici su pripremljeni kako je opisano u CA patentnoj prijavi br. 1305475. Postupci liofilizacije i sprej-sušenja poznati su stručnjacima; detalji se razlikuju od izvora do izvora.

Ekstrakti i prašci bili su pohranjeni smrznuti izravno nakon pripremanja; između eksperimenata su resolubilizirani prašci i ekstrakti čuvani na 4 °C ne duže od jednog mjeseca. Ekstrakti su dobiveni iz lišća uzetog iz Aloe barbendiensis Miller. 2% smjesa stabilizacijskih komponenata, koja se sastojala od askorbinske kiseline, natrij benzoata, kalij sorbata, tokoferola, etilnog alkohola, limunske kiseline i sorbitola, dodana je izravno nakon berbe na plantaži. Neki pripravci dostavljeni su u obliku liofiliziranih prašaka koji su se rekonstituirali dodavanjem milliQ-vode u željenom volumenu. Grubi pripravak Acemanna svojom ljubaznošću omogućio je dr. R. Zarzycki, Carrington Laboratories Inc. (Irving, TX).

Subfrakcioniranje ekstrakata Aloe vera:

50-150 ml ekstrakata Aloe vera i rekonstitucionirani prašci centrifugirani su ukroz 45 minuta na 15 000 Xg na 15 °C. Talog je bačen, a supernatant filtriran preko 0,2 μm membrane. Rutinski se još proizvoljno dobivena bistra otopina može filtrirati preko malog volumena Sephadex-a G-25 da se uklone komponente Aloe vera koje imaju afinitet za taj materijal (Frakcija III, također obilježena kao Aloe vera NAG-25 ekstrakt, vidi niže u tekstu). Frakcija I (vjerojatna mol. težina > +5 kD) i II (vjerojatna mol. težina < +5 kD) pripremljene su pomoću FPLC (Acta Explorer 10S, Amersham/Pharmacia, Uppsala, Švedska) preko dva spojena stupca za uklanjanje soli od 5 ml (Pharmacia) koji su bili eluirani s milliQ-vodom brzinom protoka od 5 ml/min; apsorbancija je snimana na različitim valnim duljinama između 190 i 280 nm. To je izvedeno pomoću automatske ponavljajuće injekcije volumena 0,5 ml dobivenog ekstrakta i odvajanja i sakupljanja dviju frakcija na bazi promjena u provodljivosti, upotrebljavajući AKTA Explorer 10S. Frakcija II je liofilizirana i posljedično otopljena u milliQ vodi do 0,1 originalnog volumena ekstrakta i pohranjena na -20 °C do upotrebe. Frakcija l puštena je preko DEAE-Sepharose stupca (pripremljenog u milliQ vodi; 10 ml volumena na 50 ml originalnog ekstrakta) i isprana s dva stupca volumena milliQ vode te su se skupile neoslabljena (I-D0) i blago oslabljena (I-DJ frakcija. Vezani materijali (I-D,) eluirani su s volumenom jednog stupca 0,5 M NaCl u milliQ vodi. Frakcija I-D0 koncentrirana je do 0,1 originalnog volumena Aloe vera ekstrakta ultrafiltracijom pod tlakom dušika, kroz PM10 membranu koristeći 10 ili 50 ml filtracijsku jedinicu. Frakcija I-D, je odsoljena automatiziranim postupkom opisanim gore i posljedično koncentrirana do 0,1 originalnog volumena Aloe vera ekstrakta ultrafiltracijom preko PM-10 filtera. U nekim eksperimentima su subfrakcije s jasnim molekularnim težinama od >300, 100-300, 50-100 i 10-50 kD pripremljene iz frakcija I-D0 i I-D, sekvencijskom ultrafiltracijom, svaka pojedino, preko XM-300, XIVMOO, XM-50 i konačno PM-10 membrane. Alternativno su se usporedive subfrakcije pripremale pomoću pripremne FPLC preko Superose 200 HR 10/30. Svaka subfrakcija je isprana 3 puta dodavanjem milliQ vode dok se nije dobio volumen deset puta veći od početnog; prvi ispirak dodan je slijedećoj frakciji, a prije filtracije preko sljedećeg filtera. Sve frakcije su pohranjene u alikvotama pri -20 °C do sljedeće upotrebe.

Ekstrakt Aloe vera NAG-25:

10 grama osušenog ekstrakta Aloe vera u obliku spreja dobivenog od 2 litre Aloe vera ekstrakta je otopljeno u 200 m! milliQ vode i pušteno preko stupca Sephadex G-25 (5 cm širok i 10 cm visok; pripremljen u milliQ vodi, brzina protoka 7,5 ml/min) da se uklone materijali koji imaju afinitet za matricu Sephadex G-25 i smanjuju sadržaj molekula male molekularne težine. Stupac se na kraju ispire s Milli-Q vodom, a ekstrakt Aloe vera NAG-25 se sakuplja kao eluat volumena 60-310 ml.

Bakterije i bakterijski ekstrakti:

Divlji tip H. pylori (ATCC 43504) uzgojen je u mikroaerofilnim uvjetima na krvnom agaru DENT pločica koje je opisao F. Namavar i sur., Infection Immunity, 66, 444-447 (1998)]. Ekstrakti Helicobacterpylori koji sadrže adhezin za vanjsku membranu, takozvani S-sloj, pripremljeni su iz konfluirajućih bakterijskih kultura s dviju ili više agarskih pločica. Bakterije su suspendirane u 0,15 M NaCl, miješane lagano 1 minutu i centrifugirane kroz 30 minuta na 5000 Xg. Supernatant koji je sadržavao bakterijski ekstrakt pohranjen je na -80 °C nakon završetka koncentracije proteina pomoću BCA proteinskog testa (Pierce, Rockford, SAD). FITC-obilježena H. pylori pripremljena je inkubiranjem bakterije u 1 ml 0,2 M karbonatnog pufera (pH 8,0) koji je sadržavao 0,1 mg/ml FITC u mraku kroz 15 minuta s albumonim (PBST-BSA), stanice su zatim suspendirane u istom puferu gustoćom 0,13-0,20 A^^ i pohranjene u 0,1 ml alikvotama do upotrebe.

Bakterijske kulture sojeva Pseudomonas aeruginosa PA025 i PA14 dobiveni su iz Odjela za medicinsku mikrobiologiju, VU medicinskog centra, a Streptococcus mutans i Streptococcus sanguis su dobiveni iz Odjela za oralnu biokemiju, ACTA, Amsterdam. U slučaju da se bakterije koriste u fluorescentnim inhibicijskim testovima, one se moraju suspendirati i razrijediti u 100 mM natrij acetatu (pH 5), koji sadržava 0,5 % Tween-20 do konačne apsorbancije od 0,1 na 700 nm. Bakterije su obilježene fluorescentno dodavanjem Syto-13 (1:500 v/v).

Fluorescentni test inhibicije

Fluotrac 600 pločice su obložene s različitim razrjeđenjima mucina iz sline (za Helicobacter pylori i Pseudomonas aeruginosa) ili ljudskom slinom obogaćenom aglutininom (za Streptococcus mutans i Streptococcus sanguis) u oblagajućem puferu (0,1 M natrij karbonat (pH 9,6)). Pločice su inkubirane preko noći na 4 °C i nakon toga isprane četiri puta s PBS-0,1% Tween-20 (puferza ispiranje). Syto-13 obilježene bakterije (50 μl) dodane su u bazenčiće, a nakon njih i 50 μl otopine uzorka >Aloe vera I-D1 ili vode (pozitivna kontrola). Bazenčići bez obloženog mucona služili su kao negativna kontrola. Nakon inkubacije kroz 1 h na 37 °C pločice su isprane puferom za ispiranje. Fluorescencija je mjerena pomoću Fuostar Galaxy, a ekscitacijska i emisijska valna duljina bile su 485 i 520 nm, svaka pojedino.

Analiza monosaharida:

Analiza monosaharida izvedena je kromatografijom s anionskom izmjenom s visokim pH i s pulsnom amperometričkom detekcijom (HPAEC-PAD) na Carbopack TM MAI stupcu nakon hidrolize frakcija kroz 4 h u 2 M tri-fluoroctenoj kiselini na 100 °C. Stupac je eluiran s 0,2 M NaOH s brzinom protoka od 0,4 ml/min i kalibriran je sa smjesom standardnih šećera.

Primjer 1

Inhibicija adherencije Helicobacter pylori na mucine iz sline

Inhibicija vezanja adhezina iz Helicobacter pylori na ljudski mucin iz sline pomoću Aloe vera ekstrakata ili subfrakcija proučavana je utvrđenim ELISA testom (vidi F. Navamar et al., označeno ranije), u kojem su mikrotitarske pločice obložene preparatom S-sloja iz Helicobacter pylori (100 μl po bazenčiću, 10-20 μg proteina/ml; 16 sati na 4 °C; PBS pufer za ispiranje (pH 7,5)-0,1 Tween-20 (v/v) (PBST)) inkubirane u duplikatu s humanim mucinom iz sline u prisustvu i odsustvu dilucijskih raspona Aloe vera ekstrakata ili frakcija kroz 2 sata na 37 °C. Ukupni volumen inkubacijskih smjesa bio je 100 μl, što se sastojalo od 50 μl mucina iz sline (0,2-0,5 μg/ml) i 50 μl otopine uzorka Aloe vera, oba u natrij-acetatu - 150 mM NaCl -Tween-20 (pH 5,0). Monoklonsko protutijelo F2, koje prepoznaje sulfo-lewisa skupine istaknute na mucinu iz sline, i peroksidazom obilježena anti-mišja protutijela koze korištena su za detekciju količine vezanog mucina nakon ispiranja s PBTS kao što je prije opisano, na primjer E. Veerman et al., Glycobiology 7, 737 (1997).

Uzorci su testirani u duplikatu u dvostrukom rasponu otopina. Inhibitorna aktivnost prikazana je kao postotak smanjenja A490 nm relativno u odnosu na kontrolne bazenčiće koji su sadržavali samo mucin, nakon korekcije za prazan reagens. Rezultati su prikazani na slikama 2 i 3, kao i u tablici 1. Kao što je prije opisano, inhibitorne aktivnosti DEAE-vežućih frakcija su mnogo više nego one od nevežućih frakcija. Od ove DEAE-vežuće frakcije, subfrakcija od 100-300 kD pokazuje najjaču inhibitornu aktivnost (82%).

Primjer 2

Inhibicija adherencije Helicobacter pylori na želučanu sluznicu

Adherencija bakterija označenih s FITC za dijelove antruma želuca detektirana je prema Boren et al., vidi gore. Šest-μm sekvencijskih rezova antruma ljudskog želuca, dobivenog od normalnog tkiva i od pacijenata s blago i umjereno upaljenim i metaplastičnim tkivom nabavljeni su od Odjela za patologiju. U Sekvencijskim rezovima uklonjen je parafin u ksilenu (10 min, ispiranje tri puta), nakon čega je slijedilo ispiranje tri puta po pet minuta u etanolu, rehidracija u sporotekućoj milliQ vodi i ispiranje triput kroz pet minuta u PBS. Nacrtan je krug oko rezova s PAP olovkom PA03 (Diagnostics BV, Uithoorn, Nizozemska), nakon čega je slijedila inkubacija s 0,1 ml PBTS-BSA pod vlažnim uvjetima, kroz najmanje 1 sat na 4 °C. Konačno, pufer je zamijenjen s 0,1 ml FITC-obilježenih bakterija plus ili minus (pozitivna kontrola), dilucijskog raspona AV-5 ekstrakta ili subfrakcije u PBST-BSA. Rezovi su inkubirani kroz jedan sat u mraku. Nevezane bakterije su uklonjene ispiranjem šest puta s PBST-BSA na rotirajućem stolu. Konačno je primijenjen PBS u glicerolu (1:1 v/v) na rezove prije nego što se zapečate pokrovnim staklom za fluorescentnu mikroskopiju koja je izvedena pomoću Nikon Eclipse mikroskopa (Uvikon, Bunnik, Nizozemska), s Nikon digitalnom kamerom D×M 1200 i Nikon ACT-1 kontrolnim programom za kameru.

Rezultati su prikazani na slici 4. Kontrole bez Aloe vera subfrakcija bile su identične ploči c (nije prikazana). Kao što je prije opisano, ukupna težina frakcije I Aloe vera ekstrakta je snažni inhibirala adherenciju bakterija na sluznicu (vidi sliku 4b) dok je ta inhibicija bila smanjena gotovo na nulu kad je nenabijena frakcija sama bila ko-inkubirana s bakterijama obilježenima s FITC.

Primjer 3

Inhibicija adherencije Helicobacter pylori na pločice s više bazenčića obilježene s MUC-5

U fluorescencijskom inhibicijskom testu su žive bakterije, čija je DNA obilježena s fluorescentnim Syto-13, inkubirane u prisustvu ili odsustvu Aloe vera I-D, pripravka na pločici s 96 bazenčića obloženoj s označenim otopinama mucina iz sline MUC-5 ili aglutininom obogaćenom slinom. U svakom bazenčiću bila je prisutna ista količina bakterija obilježenih sa Syto-13. Po eksperimentu, svi su bazenčići sadržavali istu količinu Aloe vera pripravka u slučaju ko-inkubacije s bakterijama. Svi su testovi provedeni u duplikatu.

Tipični eksperimenti prikazani su u tablicama 2 i 3. Opseg vezanja Helicobacter pylori za bazenčiće bio je vidno ovisan o količini obloženog MUC-5 koji se nalazio u bazenčićima. Ko-inkubacija s I-D, pripravkom inhibirala je vezanje Helicobacter pylori za MUC-5 na način ovisan o koncentraciji. Inhibicija se pojačala kad se količina MUC-5 smanjila (eksperiment 1), kao i kad je dodano više I-D, (eksperiment 2). Količina materijala u 0,01 ml I-D, prisutna u bazenčićima dobivena je od 0,02 g praška AV-17 (što odgovara 10-20 ml originalnog Aloe vera gela).

Primjer 4

Inhibicija adherencije Pseudomonas aeruginosa obilježenog sa Syto-13 na pločice s više bazenčića obilježene s MUC-5

Učinci AV-16 I-D, pripravka testirani su na dva soja Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas aeruginosa PA025 i Pseudomonas aeruginosa PA14. Količina materijala u 0,01 ml AV-16 I-D, frakcije dobivena je od 2,5 ml AV-16. Količina bakterija vezanih za pločice ovisila je o količini obloženog MUC-5. Rezultati su prikazani u tablici 4 i tablici 5, svakoj pojedino. Ko-inkubacija s 0,01 ml AV-16 I-D| rezultirala je jakom inhibicijom vezanja bakterija. Pilot-studija naznačila je da inhibicija ovisi o koncentraciji, budući da se inhibicija pojačala kad se smanjila količina obloženog MUC-5.

Primjer 5

Inhibicija adherencije Streptococcus mutans i Streptococcus sanguis obilježenih sa Syto-13 na pločice obložene slinom obogaćenom aglutininom

Učinci AV-16 I-D, pripravka testirani su na dva soja Streptococcus mutans i Streptococcus sanguis. Količina bakterija vezana za pločice ovisila je o količini sline obogaćene aglutininom koja je oblagala te pločice. Ko-inkubacija sa 0,01 ml AV-16-DI rezultirala je snažnom inhibicijom vezanja bakterija. Količina materijala u 0,01 ml AV-16-DI dobivena je iz 2,5 ml Aloe vera 16.

Claims (26)

1. Pripravak tvari u izoliranom obliku koja sadržava polisaharide koji se mogu dobiti iz Aloe vera, naznačen time, što: a) polisaharidi sadrže 60-100 % D-manoze, 40-0 % D-glukoze i 0 - 10 % drugih monosaharida b) polisaharidi su negativno nabijeni c) polisaharidi se vežu za pozitivno nabijeni stupac d) prosječna molekularna težina je veća od 50 kD.

2. Pripravak tvari u izoliranom obliku u skladu s patentnim zahtjevom 1 koji sadržava polisaharide koji se mogu dobiti iz Aloe vera, naznačen time, što: a) polisaharidi sadrže 70 - 90 % D-manoze, 30- 10 % D-glukoze i 0 - 10 % drugih monosaharida b) polisaharidi su negativno nabijeni c) polisaharidi se vežu za pozitivno nabijeni stupac.

3. Pripravak tvari u skladu s patentnim zahtjevima 1 ili 2, naznačen time, što navedeni polisaharidi imaju prosječnu molekularnu težinu od oko 100- 300 kD.

4. Pripravak tvari u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 1 - 3, naznačen time, što navedeni polisaharidi sadrže D-manozu i D-glukozu u omjeru koji je u rasponu od oko 5 do 20.

5. Postupak za izradu pripravka tvari u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 1-4, naznačen time, što se sastoji od sljedećih koraka u postupku: a) subfrakcioniranje Aloe vera ekstrakta u dvije frakcije, jednu s očitom molekularnom težinom > +5 kD, nazvanu subfrakcija I i jednu s očitom molekularnom težinom < +5 kD b) prolaz subfrakcije I preko pozitivno nabijenog stupca c) eluiranje dijela subfrakcije I vezanog za naveden stupac otopinom soli, čime se dobije subfrakcija I-D1 d) uklanjanje soli i ultrafiltracija I-D1 e) proizvoljno priprema subfrakcija I-D1 sa željenim molekularnim težinama od >300 kD, 100-300 kD, 50-100kDi 10-50kD.

6. Postupak u skladu s patentnim zahtjevom 5, naznačen time, što se primjenjuje i pre-purifikacijski korak prije koraka a postupka preko Sephadex G-25 stupca da se uklone materijali s afinitetom za taj stupac.

7. Postupak u skladu s patentnim zahtjevom 5 ili 6, naznačen time, što se tijekom koraka b postupka koristi stupac DEAE-Sephadex ili DEAE-Sepharose.

8. Postupak u skladu s bilo koji od patentnih zahtjeva 5-7, naznačen time, što se primjenjuje sekvencijska ultrafiltracija ili preparativna FPLC preko stupca Superose.

9. Biljni ili životinjski ekstrakt, naznačen time, što sadržava pripravak tvari definirane bilo kojim od patentnih zahtjeva 1 -4.

10. Biljni NAG-25 ekstrakt u skladu s patentnim zahtjevom 9, naznačen time, što je navedena biljka Aloe.

11. Biljni NAG-25 ekstrakt u skladu s patentnim zahtjevom 9, naznačen time, što navedena biljka Aloe jest Aloe vera.

12. Postupak za pripravljanje biljnog ili životinjskog NAG-25 ekstrakta kao što je definirano bilo kojim od patentnih zahtjeva 9-11, naznačen time, što se primjenjuje purifikacijski korak s odgovarajućim neobrađenim ekstraktom preko stupca Sephadex G-25 da se uklone materijali s afinitetom za taj stupac.

13. Ultrafiltracijski ekstrakt Aloe, naznačen time, što sadržava pripravak tvari koji je definiran bilo kojim od patentnih zahtjeva 1-4.

14. Postupak za pripravljanje ultrafiltracijskog ekstrakta Aloe kao što je definirano u patentnom zahtjevu 13, naznačen time, što se primjenjuje ultrafiltracija odgovarajućeg Aloe ekstrakta.

15. Pripravak tvari izabran između jednog ili više od sljedećeg: pripravak tvari koji je definiran bilo kojim od patentnih zahtjeva 1 -4 ili biljni ili životinjski NAG-25 ekstrakt koji je definiran bilo kojim od patentnih zahtjeva 9-11 ili Ultrafiltracijski ekstrakt Aloe koji je definiran patentnim zahtjevom 13, naznačen time, što se koristi kao dodatak hrani ili u posebnoj prehrani.

16. Pripravak tvari izabran između jednog ili više od sljedećeg: pripravak tvari koji je definiran bilo kojim od patentnih zahtjeva 1 - 3 ili biljni ili životinjski NAG-25 ekstrakt koji je definiran bilo kojim od patentnih zahtjeva 8 - 10 ili Ultrafiltracijski ekstrakt Aloe koji je definiran patentnim zahtjevom 13, naznačen time, što se koristi u osobnoj njezi ili kozmetici.

17. Pripravak tvari izabran između jednog ili više od sljedećeg: pripravak tvari koji je definiran bilo kojim od patentnih zahtjeva 1 - 3 ili biljni ili životinjski NAG-25 ekstrakt koji je definiran bilo kojim od patentnih zahtjeva 8 - 10 ili Ultrafiltracijski ekstrakt Aloe koji je definiran patentnim zahtjevom 13, naznačen time, što se koristi u farmaciji.

18. Pripravak tvari u skladu s bilo koji od patentnih zahtjeva 15-17, naznačen time, što se koristi za bilo koju od sljedećih primjena: anti-bakterijski, anti-virusno ili protuupalno.

19. Pripravak tvari u skladu s patentnim zahtjevom 18, naznačen time, što se koristi za prevenciju ili liječenje infekcije uzrokovane bilo kojim mikroorganizmom: bakterijama, virusima i gljivama.

20. Pripravak tvari u skladu s patentnim zahtjevom 19, naznačen time, što se koristi za prevenciju infekcije s jednom ili više bakterija izabranih iz grupe koja se sastoji od Helicobacter pylori, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus mutans i Streptococcus sanguis.

21. Upotreba pripravka tvari u skladu s patentnim zahtjevom 17, naznačena time, što se koristi kao lijek u prevenciji ili liječenju infekcije infektivnim mikroorganizmima ili u prevenciji i liječenju upala.

22. Oralni dozni oblik, kao što je tableta, kapsula ili sirup, naznačen time, što sadrži pripravak tvari izabran između jednog ili više od sljedećeg: pripravak tvari koji je definiran bilo kojim od patentnih zahtjeva 1 - 4 ili biljni ili životinjski NAG-25 ekstrakt koji je definiran bilo kojim od patentnih zahtjeva 9-11 ili ultrafiltracijski ekstrakt Aloe koji je definiran patentnim zahtjevom 13 i proizvoljno ekscipijenti.

23. Topički dozni oblik, kao što je krema ili gel, naznačen time što sadrži pripravak tvari izabran između jednog ili više od sljedećeg: pripravak tvari koji je definiran bilo kojim od patentnih zahtjeva 1 -4 ili biljni ili životinjski NAG-25 ekstrakt koji je definiran bilo kojim od patentnih zahtjeva 9-11 ili ultrafiltracijski ekstrakt Aloe koji je definiran patentnim zahtjevom 13 i proizvoljno ekscipijenti.

24. Injekcijski dozni oblik kao što je injekcijska tekućina, naznačen time, što sadrži pripravak tvari izabran između jednog ili više od sljedećeg: pripravak tvari koji je definiran bilo kojim od patentnih zahtjeva 1 - 4 ili biljni ili životinjski NAG-25 ekstrakt koji je definiran bilo kojim od patentnih zahtjeva 9-11 ili ultrafiltracijski ekstrakt Aloe koji je definiran patentnim zahtjevom 13 i proizvoljno ekscipijenti.

25. Postupak inhibiranja, preveniranja ili uklanjanja adherencije mikroorganizma na staničnu membranu u živom organizmu, naznačen time, što uključuje primjenu doznog oblika kao je definirano bilo kojim od patentnih zahtjeva 22 - 24 u navedenog organizma.

26. Upotreba doznog oblika u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 22 - 24, naznačena time, što se koristi za proizvodnju lijeka koji inhibira, prevenira ili uklanja adherenciju mikroorganizma za staničnu membranu živog organizma.