HUP0200295A2 - Eljárás laktóz enzimatikus, különösen membrándiffúziós reaktor segítségével történő hasítására - Google Patents

Abstract

A találmány laktóz enzimatikus hasítására alkalmas, membrándiffúziósreaktorban végezhető eljárásra vonatkozik, amelynek során a permeációstérben laktózt hasító enzimként termofil enzimet vagy termofil enzimekkeverékét alkalmazzák, és az eljárást 50 °C és 85 °C közöttihőmérsékleten végzik, vagy amelynek során a permeációs térben laktózthasító enzimként mezofil enzimet vagy mezofil enzimek keverékétalkalmazzák, és az eljárást legfeljebb 50 °C hőmérsékleten végzik, ésaz eljárásban alkalmazott permeációs oldatot legalább részben sterilreszűrik és/vagy UV-fénnyel besugározzák. Ó

Description

PO^GO? 55 · '·-<.«·.

ielefon: ft,

73.128/PA

Eljárás laktóz enzímatíkus, különösen membrándiffúziós reaktor segítségével történő hasítására

A találmány tárgya eljárás laktóz enzimes hasítására, különösen laktóz membrándiffúziós-reaktor segítségével történő hasítására .

Egy ilyen eljárással egyrészt laktóz-oldatok, másrészt teja tejtermékek is kezelhetők, így például a sovány tej és a savó csökkentett mennyiségű laktózt tartalmazó termékké dolgozható fel.

A világ lakosságának mintegy 75 %-a laktózérzékeny, ezért nagy az igény a csökkentett mennyiségű laktózt tartalmazó tejtermékek iránt. Az is ismertté vált, hogy a tejben lévő laktózt gyakran az állatok sem viselik el, ami miatt a laktózban szegény tejtermékek nagyon előnyösek az állattenyésztésben is, az állatok táplálása és növekedése szempontjából. Végül arra is utalunk, hogy ha a tej szilárdanyag-tartalmát 30%-nál nagyobbra emelik, a fehérje fázis destabilizálódhat. Hasonló hátrányok lépnek fel például az élelmiszeriparban, mivel a fehérjét a laktóz alacsony hőmérsékleten való kikristályosodása miatt csak nehezen lehet újra szuszpendálni, ezért nem lehet nagy szilárdanyagtartalmú tejet alkalmazni. A laktóz kristályosodása úgynevezett jéghomokosodást okoz.

A laktóz olyan diszacharid, amely a béta-glikozidáz enzimek, például a béta—glükozidáz és a béta-galaktozidáz enzim hatására alkotórészeire, glükózra és galaktózra hasadhat. Az enzimek közvetlen hozzáadását sok fogyasztó elutasítja. Mivel az enzimek az érzékszervi tulajdonságokat is hátrányosan befolyásolhatják, a laktóz enzimes hasítására más lehetőségeket kerestek.

A DE 21515334 A1 számú német szabadalmi iratból ismert, hogy az enzimek hordozón vagy hordozóban megköthetők, és a tej vagy tejtermék ezekkel a szilárd anyagokkal a perkolációs berendezésben kezelhető. Kimutatták azonban, hogy a tej alkotórészei miatt ezek a berendezések eldugulásra hajlamosak, és ezen kívül a tej, illetve a tejsavó mikrobák által okozott romlása csak nehezen gátolható meg. Ehhez a berendezés sterilizálása szükséges, különösen arra való tekintettel, hogy a hőkezelés az alkalmazott enzimet is károsítja.

Ezen a területen előrelépésnek látszik a membrándiffúziós reaktorok és mezofil enzimek együttes alkalmazása. Az ilyen reaktorokban a tejet az enzim-oldattól egy olyan membrán választja el, amelynek a pórusmérete megengedi a laktóznak az enzimoldatba való diffúzióját, és a hasított termékeknek a laktózban szegény tejbe való visszadiffundálását. Itt utalunk P. Czermak cikkére (BioEngineering 8, 47-52). Az ilyen eljárásokat szobahőmérséklet és legfeljebb 45°C közötti hőfokon végezhetjük.

A membrándiffúziós reaktorok gyakran üreges szálas reaktorokként vannak kialakítva, amelyekben a kezelendő anyag a permeációs oldattal körülvett belső szálakban áramlik. Az enzimnek a permeációs oldatban van. A membrándiffúziós eljárás számos egyéb előnye mellett azért is kedvező, mert az enzim-oldatnak a laktóztartalmú szubsztrát-oldattól való elválasztása meggátolja az enzimnek a tej alkotórészei, nevezetesen a fehérjék és a maradék zsírok által okozott, egyébként lehetséges inaktiválódását. Jelentős előny továbbá, hogy az enzim hosszú távú stabilitása nőhet, és az eljárás egyszerűsödik az enzim-oldat elválasztott kezelésének következtében, hiszen nem szükséges az enzimet a termékáramból leválasztani.

Az ilyen berendezéseknél is fennáll természetesen a mikrobiális fertőzés veszélye. Ennek elkerülésére javasolták a gőzzel sterilizálható membrándiffúziós reaktorok alkalmazását. Ezzel kapcsolatban utalunk a következő irodalmi helyre: P. Czermak, DECHEMA-Biotechnol. Conf. 2, 133-145 (Elsevier Applied Science, London, 1991). Megmutatkozott azonban, hogy ezek a reaktorok drágák és nagy ráfordítást igényelnek, ezért ipari alkalmazásuk nem jöhet szóba.

A jelen találmány előtt álló feladat olyan eljárás kidolgozása, amellyel az ismert eljárások hátrányai kiküszöbölhetők. A találmány szerint ezt úgy érjük el, hogy a laktóz hasításához hőstabil enzimet vagy hőstabil enzimek keverékét alkalmazzuk, és az eljárást 50 °C és 85 °C közötti hőmérsékleten végezzük.

Ebben a hőmérsékleti tartományban, amely hasonló a pasztörizálás! hőmérséklethez, a legtöbb mikroorganizmus növekedése lelassul. A membrándiffúziós reaktorral való munkánál a magasabb hőmérsékletek miatt megnövekszik a laktózdiffúzió, ami a membrán jobb kihasználásához vezet.

Enzimként előnyösen rekombináns mikroorganizmusból származó hőstabil béta-glikozidázt, például béta-galaktozidáxt, illetve béta-glükozidázt alkalmazunk. Ilyen béta-glikozidáz például a

Sulfolobus solfataricusból vagy a Pyrococcus furiosusból kinyerhető enzim. Ezzel kapcsolatban a következő irodalmi helyekre utalunk: M. Moracci, R. Nucci, F. Febbraio, C. Vaccaro, N. Vespa, F. La Cara és M. Rossi, Enzyme and Microbial Technology, 17, 992-997 (1995) és W. G. B. Voorhorst, R. I. L. Eggen, E. J. Luesink és W. M. de Vos, Journal of Bacteriology, 7105-1711, (1995 december) . Erre a célra azonban más hőstabil, laktózt hasító enzimek is használhatók.

Az 50 C és 85 C közötti hőmérsékleten a permeációs oldatban előfordulhatnak a hőre különösen nem érzékeny mikroorganizmusok. Ezért előnyösnek bizonyult, hogy a permeációs oldatot legalább részben sterilre szűrjük és/vagy UV-fénnyel besugározzuk.

A jelen találmány tárgya továbbá eljárás a laktóz enzimatikus hasítására mezofil enzim segítségével, legfeljebb 45°C hőmérsékleten, membrándiffúziós reaktorban, amely eljárásban a találmány szerint a permeációs oldatot legalább részben sterilre szűrjük és/vagy UV-fénnyel besugározzuk. Előnyös az is, ha az eljárás folyamatos.

Önmagában véve ismert, hogy mindkét sterilizezési eljárás, azaz a sterilre szűrés és az UV-besugárzás is alkalmazható mikroorganizmus-mentesítésre, azonban ezeket az eljárásokat mindeddig nem alkalmazták laktózok hasításával összefüggésben membrándiffúziós reaktorokban. Ennek nyilvánvalóan az az oka, hogy csak az eljárás nagyon gondos kivitelezésével érhető el, hogy az enzimek ne inaktiválódjanak a mikroorganizmusok elpusztításával egyidejűleg.

A membrándiffúziós eljárással kapcsolatban megemlítjük, hogy a szükséges membránfelület és az enzim-oldat költsége olyan tényezők, amelyek ennek az eljárásnak a gazdaságosságát jelentősen befolyásolják. Minden olyan intézkedés, amelynek hatására az enzim-oldat stabilitása növekszik, jelentős megtakarításhoz vezet. Mivel a mikroorganizmusok anyagcseretermékei inaktiválhatják az enzimeket, a permeációs oldat folyamatos sterilizálása jelentősen hozzájárul az enzim-oldat stabilizálásához.

Egy adott mennyiségű laktózban szegény tej előállításához időegységenként szükséges membránfelület nagysága elsősorban a laktóz diffúzió-sebességétől függ. Ebben fontos szerepet játszanak a különböző fizikai és kémiai tényezők, így például a hőmérséklet, a laktóz koncentrációja és hasonlók, valamint a modul specifikus, illetve a membránspecifikus tulajdonságok is. Ezek közé tartozik például az üreges szál átmérője, a membrán pórusmérete és anyaga. A találmány szerinti technológia kifejlesztése során fontos szempont az alkalmas membránanyag kiválasztása. Emellett arra is utalunk, hogy az említett befolyásoló tényezők részben egymástól is függnek. így például az enzimkoncentráció növelésével részben csökkenthető a membrán felülete. Az eljárás kivitelezésének megválasztását a kíván minőségű (hidrolizáltsági fokú) végtermék előállítására lényegében csak a gazdaságossági szempontok befolyásolják.

A találmány szerinti eljárást az alábbiakban diagramokkal és ábrákkal közelebbről is bemutatjuk.

1. ábra: E. coli BL21 (DE3) fermentációjának lefutása rekombináns béta-glikozidáz Pyrococcus furiosusból történő előállítására;

2. ábra: membrándiffúziós eljárás kivitelezésére alkalmas berendezés vázlatos rajza;

3. ábra: membrándiffúziós eljárással kivitelezésére alkalmas olyan berendezés vázlatos rajza, amelynél a permeációs oldatot sterilre szűrik és/vagy UV-fénnyel besugározzák; és

4. ábra: az UV-besugárzásnak a csiraszámra és az enzimaktivitásra kifejtett hatása grafikusan ábrázolva.

Az előnyösen alkalmazható enzimet a rekombináns E. coliból nyertük. A béta—glikozidáznak például a Pyrococcus furiosusból való termelése a rekombináns E. coli BL 21 (DE3) fermentációjával történt. Az 1. ábrán bemutatott diagramon egy jellemző fermentáció lefutása látható. Optimális körülmények között az S. solfataricusból nyert enzim felezési ideje körülbelül 10 nap, ezzel szemben a Pyrococcus furiosusból nyert enzim azonos körülmények között több, mint 2 hónapig volt stabil. A pH optimális értéke mindkét esetben 5,0 és 6,0 között volt, ami a tejben lévő laktóznak a hasítása (pH 6,6) szempontjából az optimum közelében van. A nagy ionkoncentráció befolyása sok enzimmel dolgozó eljárásnál az enzimaktivitás csökkenéséhez vezet. A tejben átlagosan összesen körülbelül 200 mM kálium, kalcium, magnézium és nátrium van. A jelen esetben az S. solfataricusból nyert béta-glikozidáz aktivitása körülbelül 85 %—ra, míg a P. furiosusból nyert béta-glikozidáz aktivitása több, mint egyharmadával csökken. Ezek az értékek a találmány szerinti eljárás megvalósításához éppen megfelelőek. Az enzimek termelésére az jellemző, hogy a rázólombikban 3000 U/liter, illetve 24500 U/liter koncentrációjú tenyészoldatot kapunk. A P. furiosusból nyert béta-glikozidáz enzim ki termelése 15 literes fermentorban több, mint négyszeresére emelkedik.

Az eljárási körülmények felülvizsgálatát és optimalizálását labor méretű membrándiffúziós reaktorban végeztük, amit a következőkben a 2. ábrán mutatunk be. A tejet egy, a 2 hűtőfürdőben levő 1 tárolótartályból folyamatosan adagoljuk, és a 3 pumpán és a 4 hőcserélőn át az M membrándiffúziós reaktorba vezetjük. Ezalatt az enzim—oldatot az 5 enzimtartályból egyenáramban szintén átvezetjük az M membránreaktoron. Lényeges a berendezés nyomása és hőmérséklete, ezek értékét többek között a 6 hőmérsékletérzékelőkkel és a 7 manométerekkel ellenőrizzük. Az enzim-oldatot a külső tárolóvezetéken át az áramlási körbe pumpáljuk.

A jelen munkák alapjaként először a következő eljárási műszaki paramétereket választottuk:

Pórusméret kb. 5000 daltonnak megfelelő

A szál belső átmérője kb. 200 mikrométer

Specifikus hidrolízis tel- kb. 2 liter tej óránként a membjesítmény ránfelület 1 m²-ére vonatkoztatva (kb. 80%-os hidrolízisfoknál)

Azt találtuk azonban, hogy a találmány szerinti eljárás nagyobb (kb. 10 000 daltonnak megfelelő) pórusméretű membránokkal is kivitelezhető. A kb. 30 000 daltonnak megfelelő pórusméretnél azonban már észrevehető volt az enzimveszteség. A szálak belső átmérője 500 mikrométer is lehet. A kísérletek azt mutatták to vábbá, hogy a 200 mikrométeres belső átmérőjű szálakkal körülbelül azonos hidrolízis-teljesítményt lehetett elérni.

A 3. ábra a 2. ábra szerinti berendezést mutatja be, amelynél a permeációs oldatnak a 8 berendezésben sterilre szűrése, illetve a 9 berendezésben az UV-besugárzása történik.

A 4. ábra szerinti diagramon látható, hogy UV-fény hatására a csíraszám nagyon rövid idő alatt gyorsan csökken. Az enzimaktivitás mégis majdnem állandó marad, ami ennek a kezelési eljárásnak az alkalmazhatósága szempontjából döntő jelentőségű.

A következőkben példákat mutatunk be a hőstabil enzimmel történő laktoz-hidrolízisre és a mezofil enzimekkel végezhető analóg eljárásokra is.

1. példa

Laktóz-hidrolizis hőstabil enzimmel

A 2. ábra szerinti berendezésben a sovány tejet hőcserélő segítségével kb. 65 C-ra (338 K) melegítettük, és az üreges szál modulon át szivattyúztuk. Az üreges szálak belső átmérője kb. 0,0005 m volt. A tej átáramlását a membránfelület egy m^{1 2}-ére vonatkoztatva óránként kb. 0,002 m³-re állítottuk be, így 80%-os hidolízisfokot értünk el. Amint az a 2. ábrán látható, az enzimoldatot az áramlási körbe szivattyúztuk, miközben a hőmérsékletet kb. 338 °K-on tartottuk. A folyamat kivitelezésénél ez a viszonylag magas hőmérséklet a mikroorganizmusok növekedését nagymértékben gátolja. A laktóz hidrolízisét így viszonylag hosszú ideig folyamatosan végezhetjük. Az alkalmazott, a Pyrococcus furiosusból nyert termofil rekombináns enzim felezési ideje kb.

hét. Ilyen időközönként végeztük a teljes berendezés tisztítását és öblítését.

2. példa

Laktóz hidrolízise mezofil enzimekkel

A) Az enzim-oldat sterilre szűrése

A folyamat eljárás—technikai kivitelezése a 3. ábra szerinti berendezésben történt. A berendezés a steril szűrésre és az UV— -besugárzásra való kiegészítő berendezések kivételével lényegében az 1. példa szerinti berendezésnek felelt meg. A tejet egy hőcserélő segítségével kb. 30°C-ra (303 K) melegítettük, és egy üreges szál modulon át szivattyúztuk. Az üreges szálak belső átmérője azonos volt az 1. példa szerinti berendezésnél alkalmazottal, és a tej átáramoltatását is ugyanúgy állítottuk be. Mivel a 30°C-os hőmérséklet a mikroorganizmusok számára majdnem ideális növekedési körülményeket biztosít a cukortartalmú enzimoldatban, sterilizálás nélkül a folyamatos eljárás majdhogynem kivitelezhetetlen. Ezért az enzim-oldatot folyamatosan sterilre szűrtük. A jelen esetben kb. 0,2 pm pórusméretű Cross-flow mikroszűrő modult alkalmaztunk. Emellett alapvető fontosságú volt, hogy a mikroorganizmusok az alkalmazott szűrőn visszamaradjanak, és hogy az enzimek a sterilszűrőn akadály nélkül áthaladhassanak.

B) Az enzim-oldat UV-besugárzása

Ebben a példában az enzim-oldatot UV-sugárzás (254 nm) segítségével egy a kereskedelemben kapható hengeres besugárzó kamrában a szokásos besugárzási teljesítménnyel besugároztuk. A be sugárzó lámpa teljesítménye 25 watt volt. A besugárzási dózis beállítását nagyon gondosan kellett végezni azért, hogy eközben az enzim-oldat ne inaktiválódjon.

C) Az enzim-oldat sterilszűrése és UV-besugárzása

A rendszer hatékonyságát úgy tudtuk növelni, hogy az eljárás során elvégeztük a sterilszűrést és/vagy az enzim-oldat UV-besugárzását is. Az összcsíraszámot több órán át nagyon alacsony szinten tudtuk tartani. Az enzimek élettartama néhány nap volt.

Claims (14)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás laktóz enzimatikus hasítására membrándiffúziós reaktorban, amelynek során a permeációs térben laktózt hasító enzimként termofil enzimet vagy termofil enzimek keverékét alkalmazzuk, és az eljárást 50 °C és 85°C közötti hőmérsékleten végezzük, vagy amelynek során a permeációs térben laktózt hasító enzimként mezofil enzimet vagy mezofil enzimek keverékét alkalmazzuk, és az eljárást legfeljebb 50°C hőmérsékleten hajtjuk vére, azzal jellemezve, hogy a permeációs oldatot legalább részben sterilre szűrjük és/vagy UV-fénnyel besugározzuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy enzimként egy rekombináns mikroorganizmusból nyert hőstabil béta~glikozidázt, így béta-galaktozidázt, illetve béta-glükozidázt alkalmazunk.
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy enzimként hőstabil béta-glikozidázt, előnyösen Sulfolobus solfataricusból vagy Pyrococcus furiosusból származó hőstabil béta-glikozidázt alkalmazunk.
4. 4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy enzimként rekombináns hőstabil béta-glikozidázt, előnyösen E. coli BL21-ből (DE3), Saccharomyces cerevisiaeből, Pichia stipitisből vagy Lactococcus lactisból származó rekombináns hőstabil béta-glikozidázt alkalmazunk.
5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sterilszűrést kb. 0,2 pm pórusnagyságot alkalmazva végezzük.
6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy, az enzim-oldatot egy Cross-flow mikroszűrő modulon át vezetjük.
7. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a permeációs oldatot sterilszűrés és/vagy UV-besugárzás után vezetjük az áramlási körbe.
8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárást folyamatosan végezzük.
9. 9. Eljárás csökkentett laktóztartalmú tejtermék előállítására az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárással.
10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási szubsztrátként a mindenkori zsírfokozatú tejet alkalmazzuk.
11. 11. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási szubsztrátként savót vagy savófrakciókat alkalmazunk.
12. 12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási szubsztrátként laktóz-oldatot alkalmazunk.
13. 13. A 9-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kiindulási szubsztrátot előzetesen besűrítj ük.
14. 14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a membránokat a tejfehérjék vagy más fehérjék okozta enzimveszteség elkerülése végett előzetesen bevonjuk.

    /2 /'' -2 / ' ^A meghatalmazott: f