HUP0200367A2 - Streptococcus vaccine - Google Patents

Streptococcus vaccine Download PDF

Info

Publication number
HUP0200367A2
HUP0200367A2 HU0200367A HUP0200367A HUP0200367A2 HU P0200367 A2 HUP0200367 A2 HU P0200367A2 HU 0200367 A HU0200367 A HU 0200367A HU P0200367 A HUP0200367 A HU P0200367A HU P0200367 A2 HUP0200367 A2 HU P0200367A2
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
protein
polysaccharide
polysaccharides
conjugated
vaccine
Prior art date
Application number
HU0200367A
Other languages
English (en)
Inventor
Carine Capiau
Marguerite Deschamps
Pierre Michel Desmons
Craig Antony Joseph Laferriere
Jan Poolman
Jean-Paul Prieels
Original Assignee
Smithkline Beecham Biolog
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB9906437.0A external-priority patent/GB9906437D0/en
Priority claimed from GBGB9909077.1A external-priority patent/GB9909077D0/en
Priority claimed from GBGB9909466.6A external-priority patent/GB9909466D0/en
Priority claimed from GBGB9916677.9A external-priority patent/GB9916677D0/en
Application filed by Smithkline Beecham Biolog filed Critical Smithkline Beecham Biolog
Publication of HUP0200367A2 publication Critical patent/HUP0200367A2/hu
Publication of HU229968B1 publication Critical patent/HU229968B1/hu
Priority to HUS1500040C priority Critical patent/HUS1500040I1/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/095—Neisseria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6075—Viral proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/831—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving capsular polysaccharide of bacterium, e.g. polyribosyl ribitol phosphate

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

A találmány tárgyát bakteriális poliszacharid-antigén oltóanyagokképezik. Közelebbről a találmány tárgyát Haemophilus influenzaeprotein D-vel konjugált bakteriális poliszacharidok képezik. Ó

Description

P02 00367 .’ZÉTÉTZLI ·:
Ρ*Χ1<4Ι_<Μ>Ζ^ΓΝ if
Sztreptokokkusz oltóanyag
A találmány tárgyát bakteriális poliszacharid-antigén oltóanyagok, azok gyártása és az. ilyen poliszacharidok gyógyhatású anyagokban történő alkalmazása képezik.
Közelebbről a találmány tárgyát három összefüggő megvalósítási mód képezi: 1. - konjugált pneumokokkusz-antigént, tipikusan pneumokokkusz konjugált poliszacharidantigén tartalmazó oltóanyagok, Streptococcus pneumoniae fehérjeantigénnel és opcionálisan Thl-indukáló adjuvánssal kiszerelve; 2. - specifikus, előnyös pneumokokkusz konjugátumok Thl-adjuvánssal kiszerelve; és 3. - bakteriális poliszacharid konjugátumok általában H. influenzae D proteinjéhez konjugálva.
A Streptococcus pneumoniae Gram-pozitív baktérium, amely jelentős morbiditásért és mortalitásért (különösen fiatalokban és idősekben) felelős, és olyan invazív betegségeket okoz, mint például a tüdőgyulladás, bakterémia és agyhártyagyulladás, és kolonizációval kapcsolatos betegségeket, mint például az akut középfülgyulladás. A pneumokokkusz-eredetű tüdőgyulladás aránya az Amerikai Egyesült Államokban a 60 évnél idősebb személyek között körülbelül 3 és 8 között van 100000 emberre számítva. Az esetek 20%-ában ez bakterémiához és más manifesztációkhoz, mint például agyhártyagyulladás vezet, közel 30%-os mortalitási aránnyal még antibiotikumos kezelés mellett is.
Aktaszámunk: 95227-3072A/LT
A pneumokkokkuszt kémiailag kapcsolt poliszacharid burkolja be, amely szerotipus-specifitást eredményez. 90 ismert pneumokokkusz szerotipus van, és a burok a pneumokokkuszok virulenciájának alapvető meghatározó faktora, mivel a burok nemcsak védi a baktérium belső felszíneit a komplement-rendszertől, hanem önmagában véve gyenge immunogén is. A poliszacharidok T-sejtektől független antigének, és nem processzálhatok és nem dolgozhatók fel MHC-molekulákon T-sejtekkel való kölcsönhatáshoz. Azonban alternatív mechanizmuson keresztül stimulálhatják az immunrendszert, ami a B-sejtek felszíni receptorainak keresztkötésével történik.
Számos kísérlet megmutatta, hogy az invazív pneumokokkuszos betegségek elleni védelem legjobban a burokra specifikus ellenanyagok mennyiségével korrelál, és a védelem szerotípus-specifikus.
Poliszacharid-antigénen alapuló oltóanyagok jól ismertek a szakirodalomban. A négy emberi alkalmazásra is engedélyezett közé tartozik a Salmonella typhi Vi-poliszacharidja, a Haemophilus influenzae PRP-poliszacharidja, az A, C, W135 és Y szerotípusokat tartalmazó tetravalens meningokokkusz oltóanyag, és a 23-valens pneumokokkusz oltóanyag, amely az 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, HA, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F és 33 szerotípusoknak megfelelő poliszacharidból áll (amelyek a vérből izolált pneumokokkuszoknak legalább 90%-át teszik ki).
Az utóbbi három oltóanyag légúti fertőzéseket okozó baktériumok ellen nyújt védettséget, amelyek komoly morbi ditást és mortalitást eredményeznek csecsemőkben, viszont ezen oltóanyagokat nem engedélyezték 2 évnél fiatalabb gyermekek esetén történő alkalmazásra, mivel nem kellően immunogének ebben a korosztályban [Peltola és mtsai., N. Engl. J. Med. 310, 1561-1566. old. (1984)]. A Streptococcus pneumoniae az invazív bakteriális betegségek és középfülgyulladás leggyakoribb oka csecsemők és kisgyermekek körében. Az idősek hasonlóképpen gyenge választ fejlesztenek ki pneumokokkusz-oltóanyagokra [Roghmann és mtsai., J. Gerontol. 42, 265-270. old. (1987)], innen van a bakteriális tüdőgyulladás megnövekedett előfordulása ebben a populációban [Verghese és Berk, Medicine (Baltimore) 62, 271285. old. (1983)].
A csecsemőkben való immunogenitás hiányának leküzdésére tervezett stratégiák közé tartozik a poliszacharidoknak nagy immunogén fehérjékhez való kapcsolása, amelyek mellékes T-sejtes segítséget nyújtanak, és amelyek immunológiai memóriát váltanak ki azokkal a poliszacharid-antigénekkel szemben, amelyekhez konjugálva vannak. Pneumokokkusz konjugált glikoprotein oltóanyagokat jelenleg is tesztelnek biztonság, immunogenitás és hatékonyság szempontjából különböző korosztályokban.
Az alábbiak az 1., pneumokokkusz poliszacharid-oltóanyagokat tartalmazó megvalósítási módra vonatkoznak.
A 23-valens konjugálatlan pneumokokkusz-oltóanyag széleskörű variációt mutat a klinikai hatékonyság területén, 0%-tól 81%-ig [Fedson és mtsai., Arch. Intern. Med. 154, 2531-2535. old. (1994)]. A hatékonyság az immunizált kocká zati csoporttal - mint például idősek, Hodgkin-féle betegség, lépeltávolitás, sarlósejtes betegség és agammaglobulinémiák [Fine és mtsai., Arch. Intern. Med. 154, 2666-2677. old. (1994)] - látszik összefüggni, és a betegség manifesztációjával is. A 23-valens oltóanyag nem mutat védettséget pneumokokkusz-eredetű tüdőgyulladás (bizonyos magas kockázatú csoportokban, mint például az idősek) és középfülgyulladás ellen.
Tehát szükség van javított pneumokokkusz-oltóanyag-készítményekre, előnyösen olyanokra, amelyek hatásosabbak a pneumokokkusz-betegségek (különösen tüdőgyulladás) megelőzésére és enyhítésére az idősek és kisgyermekek körében.
A találmány tárgyát ilyen javított oltóanyag képezi.
Az alábbiak a 2., kiválasztott pneumokokkusz poliszacharid-konjugátumokat és 3D-MPL készítményeket tartalmazó megvalósítási módra vonatkoznak.
Általánosan elfogadott, hogy a kereskedelmi forgalomban kapható pneumokokkusz-oltóanyag védőhatékonysága többékevésbé az immunizálással kiváltott ellenanyag-koncentrációval függ össze; valóban, a 23 poliszacharidot kizárólag az egyes komponens poliszacharidok immunogenitása alapján engedélyezték [Williams és mtsai., New York Academy of Sciences, 241-249. old. (1995)]. Tehát a pneumokokkuszpoliszacharidok elleni ellenanyagválasz további fokozása növelheti azon csecsemők és idősek százalékát, akik védő szintű ellenanyaggal reagálnak a poliszacharid vagy poliszacharid-konjugátum első oltására, és csökkentheti a dózist és a Streptococcus pneumoniae által okozott fertőzések elleni védő immunitás kiváltásához szükséges oltások számát .
A 20. század kezdete óta a kutatók nagyszámú vegyülettel kísérleteztek, amelyek antigénekhez adva javítják azok immunogenitását oltóanyag-készítményekben [összefoglalás: Powell és Newman, „Vaccine Design - the Subunit and Adjuvant Approach, 7. fejezet, „A compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients, kiad.: Plenum Press NY (1995)]. Sok nagyon hatásos, de szignifikáns helyi és szisztémás káros reakciót okoz, ami kizárja alkalmazásukat emberi oltóanyag-készítményekben. Az alumínium-alapú adjuvánsok (mint például alum, alumínium-hidroxid, alumínium-foszfát) , amelyeket először 1926-ban írtak le, maradnak az Amerikai Egyesült Államokban engedélyezett emberi oltóanyagban alkalmazott kizárólagos immunológiai adjuvánsok.
Az alumínium-alapú adjuvánsok az adjuvánsok hordozó osztályának példái, amelyek a kiváltott „depó-hatás révén működnek. Az antigén az adjuváns felszínére adszorbeálódik, és amikor a készítményt injektálják, az adjuváns és az antigén nem oszlik szét azonnal a véráramban, hanem a készítmény megmarad az injekció helyi környezetében, és jobban kifejezett immunválaszt eredményez. Az ilyen hordozó adjuvánsoknak további ismert előnye, hogy alkalmasak a lebomlásra érzékeny antigének, például poliszacharid-antigének stabilizálására.
A 3D-MPL a nem-hordozó adjuvánsok példája. Teljes neve 3-0-dezacil-monofoszforil lipid A (vagy 3-De-O-acil-monofoszforil lipid A, vagy 3-O-dezacil-4'-monofoszforil lipid
A) , és azért nevezik 3D-MPL-nek, mert ez kifejezi, hogy a 3. hely a redukáló végen lévő glükózaminban de-O-acetilált. Az előállítását a GB 2220211. számú szabadalmi irat tárja fel. Kémiailag 4-, 5- vagy 6-acilált lánccal rendelkező 3deacil-monofoszforil lipid A keveréke. Az 1990-es évek elején készítették el, amikor a lipid A 4'-monofoszforil származékának (MPL) 3-O-deacilálására szolgáló eljárás olyan molekulát eredményezett, amelynek toxicitása tovább gyengült a az immunstimuláló aktivitás változása nélkül.
A 3D-MPL-t magában, vagy előnyösen depó-típusú hordozó adjuvánsokkal, mint például alumínium-hidroxiddal, alumínium-foszfáttel vagy olaj-viz emulziókkal kombinálva alkalmazták adjuvánsként. Az ilyen készítményekben a 3D-MPL és az antigén ugyanazon részecskében található, ami lehetővé teszi az antigén és immunstimuláns szignálok hatásosabb célba juttatását. Vizsgálatok kimutatták, hogy a 3D-MPL képes tovvább fokozni az alum-adszorbeált antigén immunogenitását [Thoelen és mtsai., Vaccine 16, 708-714. old. (1998); EP 689 454 B1. számú európai szabadalmi irat]. Az ilyen kombinációk előnyösek a szakirodalomban adszorpcióra hajlamos (például bakteriális poliszacharid-konjugátumok) antigének számára is, ahol az alumra való adszorpció az antigén stabilizálásának kedvez. Legtöbbször kicsapott alumíniumalapú adjuvánsokat alkalmaznak, mivel jelenleg kizárólag ezek vannak engedélyezve emberi oltóanyagban. Ennek megfelelően a 3D-MPL-t alumínium-alapú adjuvánssal kombinálva tartalmazó oltóanyagok előnyben vannak részesítve a szak irodalomban a kifejlesztésük könnyűsége és a piacra való bevezetésük sebessége miatt.
A nem 3-deacilált MPL-t vizsgálták adjuvánsként számos monovalens poliszacharid-konjugátum oltóanyag-antigénnel. Az MPL sóoldatban való együttes injekciója fokozta a szérum ellenanyagválaszát négy monovalens poliszacharid-konjugátumra: pneumokokkusz PS 6B-tetanusz-toxoid, pneumokokkusz PS 12-diftéria-toxoid, és S. aureus 5. típus és S. aureus 8. típus, Pseudomonas aeruginosa A jelű exotoxinjához konjugálva [Schneerson és mtsai., J. Immunology 147, 21362140. old. (1991)]. A fokozott válaszról azt gondolták, hogy antigén-specifikus. MPL olaj-víz emulzióban (hordozó típusú adjuváns) következetesen fokozta az MPL sóoldatban lévő hatását, amiatt, hogy az MPL és az antigén ugyanazon részecskében volt jelen, és ezt más poliszacharid-konjugátum oltóanyagok esetén is optimális beadási rendszerének tartották.
Devi és mtsai. [Infect. Immun. 59 ,3700-3707. old. (1991)] vizsgálták a nem 3-deacetilált MPL adjuváns hatását sóoldatban, TT-konjugált Cryptococcus neoformans burokpoliszachariddal egér ellenanyagválaszra. Amikor az MPL-t egyidejűleg alkalmazták a konjugátummal, csupán csekély növekedés volt a poliszacharidra adott IgM- és IgG-specifikus válaszban; azonban az MPL-nek sokkal nagyobb hatása volt, amikor 2 nappal a konjugátum után adták be. Az olyan immunizálási séma alkalmazásának a gyakorlatiassága, amely az MPL beadásának késleltetését igényli az antigénhez képest, különösen csecsemők esetében, kérdéses. Az MPL adjuváns ha tása poliszacharidokkal és poliszacharid-fehérje konjugátumokkal készítmény-függőnek tűnik. Az MPL-nek megfelelő, lassú-felszabadulású bejuttató rendszerbe (például hordozó adjuváns alkalmazása) való beépítése tartós adjuváns hatást biztosít, és megkerüli az időzítés és késleltetett beadás problémáj át.
Összefoglalva, a technika állása úgy tanítja, hogy bizonyos poliszacharid vagy poliszacharid-konjugátum antigének, ahol MPL vagy 3D-MPL az adjuváns, előnyösen alkalmazhatók hordozó adjuvánssal (például alumínium-alapú adjuvánsokkal) együtt, annak érdekében, hogy maximalizáljuk az immunstimuláló hatást.
Meglepő módon azt találtuk, hogy bizonyos pneumokokkusz poliszacharid-konjugátumok esetén az oltóanyag-készítmény immunogenitása szignifikánsan nagyobb, amikor az antigént egyedül 3D-MPL-lel szereljük ki, mint 3D-MPL-lel és hordozó adjuvánssal (mint például alumínium-alapú adjuvánsokkal) együtt. Továbbá a megfigyelt javulás független az alkalmazott 3D-MPL koncentrációjától, és attól hogy az adott konjugátum monovalens készítményben van-e, vagy kombinálva polivalens készítményt alkotva.
Az alábbiak a 3., bakteriális poliszacharid-protein D konjugátumokat tartalmazó megvalósítási módra vonatkoznak.
Mint ahogyan fent említettük, poliszacharid-antigén alapú oltóanyagok jól ismertek a szakirodalomban. Az fent említett engedélyezett poliszacharid-oltóanyagok demonstrált klinikai hatékonysága különböző. A Vi-poliszacharidoltóanyag becsült hatékonysága 55% és 77% között van tényé szettel igazolt tífusz megelőzésére [Plotkin és Cam, Arc. Intern. Med 155, 2293-2299. old. (1995)]. A menimgokokkusz C-poliszacharid-oltóanyag hatékonysága 79%-nak bizonyult járványos körülmények között [De Wals és mtsai., Bull. World Health Organ. 74, 407-411. old. (1996)]. A 23-valens pneumokokkusz-oltóanyag széles variációt mutatott klinikai hatékonyság terén, 0%-tól 81%-ig [Fedson és mtsai., Arch. Intern. Med. 154, 2531-2535. old. (1994)]. Mint ahogy fent említettük, elfogadott tény, hogy a pneumokokkusz-oltóanyag hatékonysága többé-kevésbé az immunizálással kiváltott ellenanyag-koncentrációval függ össze.
Az immunizálás poliszacharidos megközelítésével kapcsolatos problémák között van az a tény, hogy a poliszacharidok önmagukban gyenge immunogének. Az immunogenitás ezen hiányának leküzdésére tervezett stratégiák közé tartozik a poliszacharidoknak nagy immunogén fehérjékhez való kapcsolása, amelyek mellékes T-sejtes segítséget nyújtanak.
Ezen jelentősen immunogén, jelenleg általánosan alkalmazott hordozók példái közé tartozik a diftéria-toxoid (DT vagy a CRM197 mutáns), tetanusz-toxoid (TT), kürtőscsiga („keyhole limpet) hemocianinja (KLH), és a tuberkulin tisztított fehérjeszármazéka (PPD).
Az általánosan alkalmazott hordozókkal kapcsolatos problémák
Az általánosan alkalmazott hordozók mindegyikével számos probléma kapcsolatos, köztük a konjugátumok GMP előállításában, és a konjugátumok immunológiai jellemzőiben.
Ezen hordozók általánosan elterjedt alkalmazásának és anti-poliszacharid ellenanyag-válaszok kiváltásában való sikerük ellenére számos hátrányuk van. Ismert például, hogy az antigén-specifikus immunválasz szupresszálható (epitópszupresszió) a hordozó, jelen esetben tetanusz-toxin ellen irányuló korábbi ellenanyagok jelenléte által [Di John és mtsai., Lancet 2, 1415-1418. old. (1989)]. Az emberek esetében a populáció nagyon magas százalékának van korábbról jelenlévő immunitása DT és TT ellen, mivel rutinszerűen immunizálják az embereket ezen antigénekkel. Az Egyesült Királyságban például a gyermekek 95%-a kap DTP-oltóanyagot, amely mind DT-t, mind TT-t tartalmaz. Más szerzők állati modellekben írták le peptid-oltóanyagokra az epitópszupresszió problémáját [Sad és mtsai., Immunology 74, 223227. old. (1991); Schutze és mtsai., J. Immunoi. 135, 23192322. old. (1985)].
Ezenfelül az olyan oltóanyagoknál, amelyek rendszeres megerősítést igényelnek, a jelentősen immunogén hordozók, mint például DT és TT alkalmazása valószínű módon szupresszálja a poliszacharid elleni ellenanyag-választ néhány injekció után. Ezen többszörös immunizációt nem kívánatos reakciók is kísérhetik, mint például késleltetett típusú hiperérzékenység („delayed type hyperresponsiveness, DTH).
A KLH-ról ismert, hogy hatásos immunogén, és már alkalmazták hordozóként IgE-peptidekhez emberi klinikai vizsgálatokban. Azonban néhány káros reakciót (DTH-szerű reakciók, vagy IgE-érzékenyítés), valamint ellenanyag elleni ellenanyag-reakciókat is megfigyeltek.
Tehát a hordozófehérjék kiválasztása poliszacharidalapú oltóanyaghoz megköveteli a minden betegben működő hordozó (széles MHC-felismerés) szükségessége, az anti-poliszacharid ellenanyag-válaszok magas szintje, és a hordozó elleni alacsony ellenanyag-válasz közti egyensúlyt.
A poliszacharid-alapú oltóanyagokban korábban alkalmazott hordozóknak tehát számos hátránya van. Ez különösen így van kombinált oltóanyagok esetében, ahol az epitópszupresszió különlegesen problémás, ha ugyanazt a hordozót alkalmazzák különböző poliszacharid-antigénekhez. A WO 98/51339. számú nemzetközi közzétételi irat szerint több hordozót alkalmaznak kombinált oltóanyagokban ezen hatás elkerülésnek megkísérlésére.
A találmány tárgyát poliszacharid/polipeptid-alapú immunogén készítmények előállítására alkalmazott hordozó képezi, amely nem szenved a fent említett hátrányoktól.
A találmány tárgya Haemophilus influenzae protein D fehérjéje (EP 0 594 610 B. számú európai szabadalmi irat), vagy annak fragmensei, poliszacharid-alapú immunogén készítmények, köztük oltóanyagok hordozójaként. Ezen hordozó alkalmazása különösen előnyös kombinációs oltóanyagokban.
Az alábbiak az 1., pneumokokkusz poliszacharid-oltóanyagokat tartalmazó megvalósítási módra vonatkoznak.
A találmány tárgyát képezi oltóanyag-készítmény, amely legalább egy (előnyösen konjugált) Streptococcus pneumoniae poliszacharid-antigént, és Streptococcus pneumoniae fehérjeantigént, vagy annak immunológiailag funkcionális ekvivalensét tartalmazza, opcionálisan Thl-adjuvánssal (olyan adjuvánssal, amely Thl immunválaszt vált ki). Előnyösen az oltóanyag-készítmény mind a pneumokokkusz fehérjét, mind a Thl-adjuvánst tartalmazza. A találmány szerinti készítmények különösen alkalmasak az időskori tüdőgyulladás kezelésére .
A pneumokokkusz poliszacharid-oltóanyagok (konjugáltak vagy sem) nem biztos, hogy képesek megvédeni a tüdőgyulladás ellen az idős populáció esetében, amelyben ezen betegség előfordulása nagyon magas. A pneumokokkusz elleni védekezés kulcsmechanizmusa az opszonofagocitózis (humorális Bsejtek és neutrofil sejtek által közvetített esemény, amelyet a pneumokokkusz poliszacharid elleni ellenanyagok termelése okoz, miáltal a baktérium végül fagocitózisra kerül) , azonban a részt vevő opszonikus mechanizmusok részei nem működnek az idősekben, azaz például a polimorf magvú sejtek („polymorphonuclear cell, PMN) szuperoxid előállítása, más reaktív oxigénfajták előállítása, PMN mobilizálása, PMN apoptózisa, PMN deformálhatósága. Az ellenanyagválaszok szintén hibásak lehetnek az idősekben.
A normálisan elfogadott dogmával ellentétben az antiburok-poliszacharid ellenanyagok normális szintje nem biztos, hogy hatásos a baktériumok teljes kiürítésére, mivel a pneumokokkuszok gazdasejteket is megtámadhatnak, elkerülve az immunrendszer ezen ágát.
Meglepő módon úgy találtuk, hogy az immunrendszer sejt-közvetített ágának (például T-sejtek által közvetített imunitás) egyidejű ingerlése az immunrendszer humorális ága (B-sejtek által közvetített) mellett szinergetikus hatást eredményez, amelyképes fokozni a pneumokokkusz kiürülését a gazdából. Ez egy felismerés, amely segítheti a pneumokokkusz-fertőzés megelőzését (vagy kezelését) általában, de különösen fontos lehet a tüdőgyulladás megelőzésében (vagy kezelésében) az idősekben, akikben a poliszacharid-alapú oltóanyagok nem hatásosak.
Azt találtuk, hogy az immunrendszer mindkét ága szinergizálhat ezen a módon, ha (előnyösen konjugált) pneumokokkusz poliszacharidot pneumokokkusz fehérjével (előnyösen a pneumokokkusz felszínén expresszált, vagy szekretált vagy kieresztett fehérjével, amely processzálható és prezentálható a fertőzött emlőssejtek felszínén I. és II. osztályba tartozó MHC kontextusában) adunk be. Bár a pneumokokkusz fehérje indukálhatja a sejtes immunitást magában is, azt találtuk, hogy egy Thl-indukáló adjuváns jelenléte az oltóanyag-kiszerelésben segíti az immunrendszer ezen ágát, és meglepő módon tovább fokozza az immunrendszer két ága közti szinergiát.
Az alábbiak a 2., kiválasztott pneumokokkusz poliszacharid-konjugátumokat és 3D-MPL készítményeket tartalmazó megvalósítási módra vonatkoznak.
A találmány tárgyát antigén készítmény is képezi, amely egy vagy több pneumokokkusz poliszacharid-konjugátumot tartalmaz 3D-MPL adjuvánssal kiszerelve, alapjában véve alumínium-alapú adjuvánstól mentesen, ahol legalább egy pneumokokkusz poliszacharid-konjugátum szignifikánsan immunogénebb 3D-MPL-t tartalmazó készítményekben, mint olyanok ban, amelyek 3D-MPL-t és alumínium-alapú adjuvánst is tartalmaznak .
Előnyös megvalósítási módok szerint a találmány tárgyát antigén készítmények képezik, amelyek az alábbi pneumokokkusz burok-poliszacharidok közül egyet vagy többet tartalmaznak: 4, 6B, 18C, 19F és 23F szerotípusok. Az ilyen készítményekben a poliszacharidok mindegyike meglepő módon immunogénebb egyedül 3D-MPL-t tartalmazó készítményekben, 3D-MPL-t és alumínium-alapú adjuvánst is tartalmazó készítményekhez hasonlítva.
Tehát a találmány egy megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát 4, 6B, 18C, 19F vagy 23F szerotípusú, immunogén fehérjéhez konjugált Streptococcus pneumoniae burok-poliszacharidot, és 3D-MPL adjuvánst tartalmazó antigén készítmény képezi, ahol a készítmény alapjában véve mentes alumínium-alapú adjuvánstól.
A találmány egy második megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát kombinált antigén készítmény képezi, amely alapjában véve mentes alumínium-alapú adjuvánstól, és amely 3D-MPL adjuvánst, és kettő vagy több pneumokokkusz burok-poliszacharid-konjugátumot tartalmaz, amelyek a 4, 6B, 18C, 19F vagy 23F szerotípusok bármelyike.
Az alábbiak a 3., bakteriális poliszacharid-protein D konjugátumokat tartalmazó megvalósítási módra vonatkoznak.
A találmány tárgyát poliszacharid-konjugátum antigén képezi, amely patogén baktériumból származó poliszacharidantigént tartalmaz Haemophilus influenzae protein D fehérjéjéhez, vagy annak fragmenséhez konjugálva. Ezenfelül a találmány tárgyát képezik polivalens készítmények, ahol egy vagy több poliszacharid-antigén protein D-hez van konjugálva.
Az alábbiak az 1., pneumokokkusz poliszacharid-oltóanyagokat tartalmazó megvalósítási módra vonatkoznak.
A találmány tárgya javított oltóanyag, előnyösen idősek (és/vagy csecsemők és kisgyermekek) pneumokokkuszfertőzésének megelőzésére és enyhítésére.
A találmánnyal összefüggésben egy beteget idősnek tekintünk, ha 55 éves vagy annál idősebb, tipikusan 60 éves vagy idősebb, és általánosabban 65 évesnél idősebb.
Tehát a találmány egy megvalósítási módja szerint a találmány tárgya idősekben (és/vagy csecsemőkben és kisgyermekekben) való alkalmazásra megfelelő oltóanyag-készítmény, amely legalább egy Streptococcus pneumoniae poliszacharid-antigént, és legalább egy Streptococcus pneumoniae fehérjeantigént tartalmaz.
A találmány egy második, előnyös megvalósítási módja szerint a találmány tárgya (idősek tüdőgyulladásnak megelőzésére alkalmas) oltóanyag-készítmény, amely legalább egy Streptococcus pneumoniae poliszacharid-antigént, és legalább egy Streptococcus pneumoniae fehérjeantigént, és Thladjuvánst tartalmaz.
Előreláthatóan az oltóanyag alkalmas lehet pneumokokkusz-fertőzések (például középfülgyulladás) kezelésére is a populáció más magas kockázatú csoportjaiban, mint például csecsemők és kisgyermekek.
« ’··· ♦ '·'·
A találmány egy harmadik megvalósítási módja szerint a találmány tárgya oltóanyag-készítmény, amely pneumokokkusz poliszacharid-antigént és Thl-adjuvánst tartalmaz.
A találmány szerinti Streptococcus pneumoniae poliszacharid-antigének
Tipikusan a találmány szerinti Streptococcus pneumoniae oltóanyag (előnyösen konjugált) poliszacharidantigéneket tartalmazhat, ahol a poliszacharidok legalább 4 pneumokokkusz szerotípusból származnak. Előnyösen a négy szerotípus a 6B, 14, 19F és 23F. Előnyösebben legalább 7 szerotípus van a készítményben, például a 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F és 23F szerotípusból származók. Még előnyösebben legalább 11 szerotípus van a készítményben, például egy megvalósítási mód szerint a készítmény tartalmaz 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F és 23F szerotípusból származó (előnyösen konjugált) burok-poliszacharidokat. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint legalább 13 (előnyösen konjugált) poliszacharid-antigént van a készítményben, bár további poliszacharid-antigének, például 23-valens (mint például 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F és 33) készítmény szintén a találmány tárgykörébe tartozik.
Idősek immunizálására (például tüdőgyulladás megelőzésére) előnyös a 8 és 12F szerotípusok felvétele (és legelőnyösebben a 15 és 22 szerotípusoké is) a fent feltárt 11valens oltóanyagba, 15-valens oltóanyagot kialakítva, míg csecsemők vagy kisgyermekek esetén (ahol a középfülgyulla dás a fő gond), előnyösen a 6A és 19A szerotípusokat vesszük fel 13-valens oltóanyag kialakítására.
Tüdőgyulladás idős (55 év feletti) populációban és középfülgyulladás csecsemők (18 hónapos korig) és kisgyermekek (tipikusan 18 hónaptól 5 évesig) körében történő megelőzésére és javítására a találmány előnyös megvalósítási módja a feltárt multivalens Streptococcus pneumoniae poliszacharidokat Streptococcus pneumoniae fehérjével, vagy annak immunológiailag funkcionális ekvivalensével kombinálni.
A találmány szerinti pneumokokkusz fehérjék
A találmány szerinti értelemben „immunológiailag funkcionális ekvivalens alatt fehérje olyan peptidjét értjük, amely a találmány szerinti fehérjék legalább egy epitópját tartalmazza. Ilyen epitópok jellemzően felszíni kitettségnek, magasan megőrzöttek, és képesek baktériumölő ellenanyag-választ kiváltani, vagy toxikus hatásokat megelőzni a gazdában. A funkcionális ekvivalens a találmány szerinti fehérje legalább 15, és előnyösen 30 vagy több összefüggő aminosavának felel meg. Legelőnyösebben a fehérje fragmensei, deléciói, mint például annak transzmembrán-deléciós variánsai (azaz a fehérje extracelluláris doménjének az alkalmazása) , fúziók, kémiailag vagy genetikailag detoxifikált származékok és hasonlók alkalmazhatók azzal a kikötéssel, hogy alapvetően ugyanolyan immunválaszt képesek kiváltani, mint a natív fehérje.
A találmány szerinti előnyös fehérjék azok a pneumokokkusz fehérjék, amelyek a pneumokokkusz külső felszínére kitettek (a gazda immunrendszere képesek azokat felismerni legalább az életciklusuk egy része során), vagy olyan fehérjék, amelyeket a pneumokokkusz szekretál vagy kiereszt. Legelőnyösebben a fehérje Streptococcus pneumoniae toxin, adhezin, kétkomponensű jeltovábbító vagy lipoprotein, vagy annak immunológiailag funkcionális ekvivalense.
Különösen előnyös fehérjék nem korlátozó példái közé tartoznak ilyen kombinált oltóanyagban a (előnyösen kémiailag vagy mutációval detoxifikált) pneumolizin [Mitchell és mtsai., Nucleic Acids Res. 18, 4010. old. (1990); Mitchell és mtsai., Biochem. Biophys. Acta 1007, 67-72. old. (1989); WO 96/05859., WO 90/06951. és WO 99/03884. számú nemzetközi közzétételi iratok]; PspA és transzmembrán-deletált variánsai (5 804 193. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat); PspC és transzmembrán-deletált variánsai (WO 97/09994. számú nemzetközi közzétételi irat); PsaA és transzmembrán-deletált variánsai [Berry és Paton, Infect. Immun. 64, 5255-5262. old. (1996)]; pneumokokkusz kolinkötő fehérjék és transzmembrán-deletált variánsai; CbpA transzmembrán-deletált variánsai (WO 97/41151. WO 99/51266. számú nemzetközi közzétételi iratok); gliceraldehid-3foszfát-dehidrogenáz [Infect. Immun. 64, 3544. old. (1996)]; HSP70 (WO 96/40928. számú nemzetközi közzétételi irat); PcpA [Sanchez-Beato és mtsai., FEMS Microbial Lett. 164, 207-214. old. (1998)]; M-szerű fehérje, SB szabadalmi bejelentés, EP 0 837 130; és adhezin-18627, SB szabadalmi bejelentés, EP 0 834 568.
A találmányban alkalmazott fehérjék előnyösen a pneumolizin, PsaA, PspA, PspC, CbpA bármelyike, vagy kettő vagy több kombinációja. A találmány tárgya az ilyen fehérjék immunológiailag funkcionális ekvivalensei a fenti definíció szerint.
A készítményben a fehérje segíthet a pneumokokkuszbetegség elleni T-sejtek által közvetített immunválasz kiváltásában - ami különösen szükséges tüdőgyulladás elleni védelemben amely együttműködik az immunrendszer humorális ágával a pneumokokkusz imváziójának gátlásában, és stimulálja az opszonofagocitózist.
A fehérjeantigén alkalmazásának további előnyei közé tartozik további antigének prezentálása az opszonofagocitózis folyamatában, és a bakteriális adhézió gátlása (ha adhezint alkalmazunk) vagy toxin semlegesítése (ha toxint alkalmazunk) .
Ennek megfelelően a találmány egy megvalósítási módja szerint a találmány tárgya Streptococcus pneumoniae oltóanyag, amely legalább négy, előnyösen legalább hét, előnyösebben legalább tizenegy szerotípusból származó konjugált pneumokokkusz poliszacharid antigént, és legalább egy, de előnyösen kettő Streptococcus pneumoniae fehérjét tartalmaz. A fehérjék egyike előnyösen pneumolizin vagy PsaA vagy PspA vagy CbpA (legelőnyösebben detoxifikált pneumolizin). Előnyös kombináció legalább pneumolizint vagy annak származékát és PspA-t tartalmaz.
Mint ahogyan fent említettük, az immunizálás poliszacharídos megközelítésével kapcsolatos problémák egyike az a tény, hogy a poliszacharidok önmagukban gyenge immunogének. Azért, hogy felülkerekedjünk ezen, a poliszacharidokat hor dozófehérjékhez konjugálhatjuk, amelyek mellékes T-sejtes segítséget nyújtanak. Ezért előnyös, hogy a találmány szerint alkalmazott poliszacharidokat ilyen hordozófehérjéhez kapcsoljuk. Ilyen poliszacharid-immunogének előállítására jelenleg általánosan alkalmazott hordozók példái közé tartozik a diftéria- és tetanusz-toxoid (DT, DT CRM197 és TT), kürtőscsiga („keyhole limpet) hemocianinja (KLH), N. meningitidis OMPC-je, és a tuberkulin tisztított fehérjeszármazéka (PPD).
Azonban számos probléma kapcsolatos ezen általánosan alkalmazott hordozók mindegyikével (lásd az „Az általánosan alkalmazott hordozókkal kapcsolatos problémák szakaszt).
A találmány tárgyát képezi egy előnyös megvalósítási mód szerint egy új hordozó poliszacharid-alapú immunogén konstrukciók előállításában való alkalmazásra, amely nem szenved ezen hátrányoktól. A pneumokokkusz poliszacharidalapú immunogén készítmények (vagy oltóanyagok) előnyös hordozója a Haemophilus influenzae protein D fehérjéje (EP 0 594 610 B. számú európai szabadalmi irat), vagy annak fragmensei. Az alkalmazásra megfelelő fragmensek közé tartoznak T-sejteket segítő epitópokat hordozó fragmensek. Előnyösen a protein D fragmens a fehérje N-terminális 1/3át tartalmazhatja.
A pneumokokkusz poliszacharid további előnyös hordozója maga a pneumokokkusz fehérje (mint ahogy az „A találmány szerinti pneumokokkusz fehérjék szakaszban definiáltuk).
A találmány szerinti oltóanyagokban előnyösen adjuváns található. Megfelelő adjuvánsok közé tartoznak alumínium sók, mint például aluminium-hidroxid gél (alum) vagy alumínium-foszfát, de kalcium, vas vagy cink sói is alkalmazhatók, vagy acetilált tirozin vagy acetilált cukrok, kationosan vagy anionosan származtatott poliszacharidok vagy polifoszfazének oldhatatlan szuszpenziója.
Az adjuváns előnyösen Thl típusú válasz kiváltója az immunválasz sejt-közvetített ágának segítésére.
A találmány szerinti Thl-adjuvánsok
A Thl-típusú citokinek magas koncentrációja hajlamos kedvezni a sejt-közvetített immunválasz kiváltásának adott antigénre, míg a Th2-típusú citokinek magas koncentrációja hajlamos kedvezni a humorális immunválasz kiváltásának az antigénre.
Fontos, hogy emlékezzünk arra, hogy a Thl- és Th2típusú immunválasz megkülönböztetése nem abszolút. A valóságban egy egyén olyan immunválaszt fejlesz ki, amelyet elsősorban Thl-nek, vagy Th2-nek írhatunk le. Azonban gyakran kényelmes a citokinek családjait oly módon figyelembe venni, ahogyan Mosmann és Coffman [Annual Review of Immunology 7, 145-173. old. (1989)] leírták egér CD4-pozitív T-sejt kiónokban. Hagyományosan a Thl-típusú válaszok a T-limfociták INF-γ és IL-2 citokintermelésével kapcsolatosak. Más, gyakran a Thl-típusú immunválasz kiváltásával közvetlenül kapcsolatos citokineket, mint például az IL-12-t nem Tsejtek termelnek. Ezzel ellentétben a Th2-típusú válaszok IL-4, IL-5, IL-6 és IL-10 szekréciójával kapcsolatosak. Az elsősorban Thl-típusú választ előidéző megfelelő adjuvánsrendszerek közé tartoznak a monofoszforil lipid A és szár22 mazékai, különösen 3-de-O-acil-monofoszforil lipid A, és monofoszforil lipid A, előnyösen 3-de-O-acil-monofoszforil lipid A kombinációja alumínium sóval.
Javított rendszer monofoszforil lipid A és szaponinszármazék kombinációját tartalmazza, előnyösen QS21 és 3DMPL kombinációja, a WO 94/00153. számú nemzetközi közzétételi irat feltárása szerint, vagy kevésbé reagáló készítményt, ahol a QS21-et koleszterinnel gyengítjük a WO 96/33739. számú nemzetközi közzétételi irat feltárása szerint.
Különösen hatásos adjuváns kiszerelést tár fel WO 95/17210. számú nemzetközi közzétételi irat, amely QS21t, 3D-MPL-t és tokoferolt tartalmaz olaj-víz emulzióban, amely egy előnyös kiszerelés.
Előnyösen az oltóanyag tartalmaz továbbá egy szaponint, előnyösebben QS21-t. A kiszerelés előnyösen tartalmazhat olaj-víz emulziót és tokoferolt (WO 95/17210. számú nemzetközi közzétételi irat).
A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás oltóanyagkiszerelés előállítására, amely szerint találmány szerinti fehérjét gyógyszerészeti elfogadható kötőanyaggal, mint például 3D-MPL-lel keverünk.
Metilálatlan CpG-t tartalmazó oligonukleotidok (WO 96/02555. számú nemzetközi közzétételi irat) szintén előnyös indukálószerei a Thl-típusú immunválasznak, és megfelelőek találmány szerinti alkalmazásra.
A találmány szerinti különösen előnyös készítmények tartalmaznak egy vagy több konjugált pneumokokkusz polisza charidot, egy vagy több pneumokokkusz fehérjét és Thladjuvánst. A sejt-közvetített válasz kiváltása pneumokokkusz fehérje által (mint ahogy fent leírtuk), és az immunrendszer két ága közti együttműködés elősegíthető ilyen Thl-adjuváns alkalmazásával, különösen hatásos oltóanyagot eredményezve pneumokokkusz-betegség ellen általában, és fontos módon az idősek pneumokokkusz tüdőgyulladása ellen.
A találmány további megvalósítási mód szerint a találmány tárgya a feltárt immunogén vagy oltóanyag, gyógyászatban történő alkalmazásra.
Még egy további megvalósítási mód szerint a találmány tárgya készítmény, amely pneumokokkusz poliszacharid-konjugátumot és Thl-adjuvánst (előnyösen 3D-MPL-t) tartalmaz, amely képes szerokonverzióra, vagy humorális ellenanyagválasz kiváltására a poliszacharid-antigén ellen a nem reagálók populációjában.
A populáció 10-30%-a ismert módon nem reagál poliszacharid immunizálásra (nem reagál az oltóanyagban lévő szerotípusok több mint 50%-ára) [Konradsen és mtsai., Scand. J. Immunoi. 40, 251. old. (1994); Rodriguez és mtsai., JID 173, 1347. old. (1996)]. Ez előfordulhat konjugált oltóanyagokkal is [Musher és mtsai., Clin. Inf. Dis. 27, 1487. old. (1998)]. Ez különösen komoly lehet a populáció magas kockázatú részeiben (csecsemők, kisgyermekek és idősek).
Azt találtuk, hogy konjugált pneumokokkusz poliszacharid (amely hajlamos alacsony válaszra egy bizonyos populációban) és Thl-adjuváns (lásd az „A találmány szerinti Thladjuvánsok szakaszt) kombinációja meglepő módon felülkere kedhet ezen a nem reagáló állapoton. Előnyösen 3D-MPL-t kell alkalmaznunk, legelőnyösebben 3D-MPL-t alumínium-alapú adjuváns nélkül (ami még jobb választ biztosít). A találmány tárgyát képezik tehát ilyen készítmények, és továbbá eljárás pneumokokkusz poliszacharidokra nem reagálók kezelésére ilyen készítmények beadásával, és még továbbá Thladjuváns alkalmazása a poliszacharid-antigénre nem reagáló egyénekben pneumokokkusz-betegség elleni kezelésére vagy attól való védelmére alkalmas konjugált pneumokokkusz poliszacharid- antigéneket tartalmazó gyógyszer gyártásában.
Egy megvalósítási mód szerint adott egy eljárás tüdőgyulladás megelőzésére vagy javítására idős emberben, amely szerint az oltóanyag biztonságos és hatásos mennyiségét adjuk be a leírás szerint idős betegnek, amely oltóanyag Streptococcus pneumoniae poliszacharid-antigént és akár Thl-adjuvánst, akár pneumokokkusz fehérjét (előnyösen mindkettőt) tartalmaz.
Egy további megvalósítási mód szerint adott egy eljárás középfülgyulladás megelőzésére vagy javítására csecsemőkben vagy kisgyermekekben, amely szerint az oltóanyag biztonságos és hatásos mennyiségét adjuk be a leírás szerint csecsemőnek vagy kisgyermeknek, amely oltóanyag Streptococcus pneumoniae poliszacharid-antigént és akár Thl-adjuvánst, akár pneumokokkusz fehérjét (előnyösen mindkettőt) tartalmaz.
A fent feltárt találmány szerinti eljárásokban a poliszacharid-antigén előnyösen poliszacharid-fehérje-konjugátumként van jelen.
A találmány szerinti oltóanyag-preparátumok
A találmány szerinti oltóanyag-preparátumok fertőzésre fogékony emlős védelmére vagy kezelésére alkalmazhatók, az oltóanyag szisztémás vagy nyálkahártyái beadásával. Ezen beadási módok közé tartoznak intramuszkuláris, intraperitoneális, intradermális vagy szubkután injekciók; vagy nyálkahártyái beadás a szájüreg/bélrendszeri, légúti, húgyivari szervekbe. Az intranazális beadás tüdőgyulladás vagy középfülgyulladás kezelésére előnyös (mivel a pneumokokkusz orrgaratüregi bevitele hatásosabban megelőzhető, így a fertőzés a legkorábbi fázisban gyengíthető).
A konjugált antigén mennyiségét minden oltóanyag-dózisban úgy választjuk meg, hogy védő immunválaszt váltson ki tipikus oltóanyagokban szignifikáns káros hatások nélkül. Ez a mennyiség változhat az alkalmazott specifikus immunogéntől és a prezentációtól függően. Általában várhatóan minden dózis 0,1-100 pg poliszacharidot tartalmaz, előnyösen 0,1-50 pg-ot, előnyösebben 0,1-10 pg-ot, legelőnyösebben 1-5 pg-ot.
Az oltóanyag fehérjetartalma tipikusan az 1-100 pg tartományban lehet, előnyösen 5-50 pg, legtipikusabban 5-25 pg.
Egy adott oltóanyag komponenseinek optimális mennyiségét az alanyokban megfigyelt megfelelő immunválaszokat magában foglaló szokásos vizsgálatokkal állapíthatjuk meg. Az elsődleges immunizálást követően az alanyok egy vagy több megerősítő immunizálást kaphatnak megfelelő időközönként.
Az oltóanyag-előállítást általánosan a „Vaccine Design - the Subunit and Adjuvant Approach [szerk.: Powell és Newman, kiad.: Plenum Press NY (1995)] című könyv tárja fel. A liposzómákba való bezárást Fullerton (4 235 877. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat) tárja fel.
Az alábbiak a 2., kiválasztott pneumokokkusz poliszacharid-konjugátumokat és 3D-MPL készítményeket tartalmazó megvalósítási módra vonatkoznak.
A találmány szerinti értelemben „a találmány szerinti pneumokokkusz poliszacharid-konjugátumok kifejezés alatt a Streptococcus pneumoniae burok-poliszacharidok olyan konjugátumait értjük, amelyek immunogénebbek 3D-MPL-t tartalmazó készítményekben, mint 3D-MPL-t alumínium-alapú adjuvánsokkal együtt tartalmazó készítményekben (például 4, 6B, 18C, 19F vagy 23F szerotípus konjugátumai).
A találmány szerinti értelemben „alapjában véve alumínium-alapú adjuvánstól mentes kifejezés alatt olyan készítményt értünk, amely nem tartalmaz elegendő alumíniumalapú adjuvánst (például alumínium-hidroxidot, és előnyösen alumínium-foszfátot) ahhoz, hogy a találmány szerinti pneumokokkusz poliszacharid-konjugátum immunogenitásának bármilyen csökkenését eredményezze ekvivalens készítményhez képest, amely 3D-MPL-t tartalmaz hozzáadott alumínium-alapú adjuváns nélkül. Előnyösen az antigénhatású készítmény lényegében 3D-MPL-t tartalmazó adjuvánst kell, hogy tartalmazzon. A dózisonként hozzáadott alumínium-alapú adjuváns mennyisége előnyösen kevesebb, mint 50 pg, előnyösebben ke vesebb, mint 30 pg, még előnyösebben kevesebb, mint 10 pg kell, hogy legyen, és legelőnyösebben nem adunk alumíniumalapú adjuvánst a találmány szerinti antigénhatású készítményhez .
A találmány céljaira annak meghatározását, hogy egy pneumokokkusz poliszacharid-konjugátum szignifikánsan immunogénebb-e 3D-MPL-t tartalmazó készítményekben, mint 3DMPL-t alumínium-alapú adjuvánsokkal együtt tartalmazó készítményekben, a 2. példa feltárása szerint kell megvalósítani. Annak a jele, hogy egy készítmény szignifikánsan immunogénebb, amikor egyedül 3D-MPL-t tartalmaz, egyedül 3D-MPL-t tartalmazó és 3D-MPL-t alumínium-foszfát adjuvánssal együtt tartalmazó ekvivalens készítmény közötti GMC IgG-koncentráció aránynak nagyobbnak kell lennie, mint 2, előnyösen mint 5, előnyösebben mint 7, még előnyösebben mint 9, és legelőnyösebben mint 14.
Az immunizálás poliszacharidos megközelítésével kapcsolatos problémák között van az a tény, hogy a poliszacharidok önmagukban gyenge immunogének. Az immunogenitás ezen hiányának leküzdésére tervezett stratégiák közé tartozik a poliszacharidoknak nagy immunogén hordozófehérjékhez való kapcsolása, amelyek mellékes T-sejtes segítséget nyújtanak. Előnyös, hogy a találmány szerint alkalmazott poliszacharidokat hordozófehérjéhez kapcsoljuk, amely mellékes T-sejtes segítséget nyújt. Ilyen alkalmazható hordozók példái közé tartozik a diftéria-, mutáns diftéria- és tetanusz-toxoid (DT, DT CRM197 és TT), kürtőscsiga („keyhole limpet) hemo cianinja (KLH), a tuberkulin tisztított fehérjeszármazéka (PPD) , és Neisseria meningitidis OMPC-je.
Legelőnyösebben a Haemophilus influenzae protein D fehérjéjét (EP 0 594 610 B. számú európai szabadalmi irat), vagy annak fragmenseit alkalmazzuk (lásd a következő szakaszt a találmány 3., bakteriális poliszacharid-protein D konjugátumokat tartalmazó megvalósítási módjáról) immunogén hordozófehérjének a találmány szerinti pneumokokkusz poliszacharidokhoz.
Egy megvalósítási mód szerint a találmány szerinti antigénhatású készítmény pneumokokkusz 4-es poliszacharid szerotípust (PS) tartalmaz immunogén fehérjéhez konjugálva és 3D-MPL adjuvánssal kiszerelve, ahol a készítmény alapjában véve alumínium-alapú adjuvánstól mentes. További megvalósítási módok szerint az antigénhatású készítmény PS 6B-t, PS 18C-t, PS 19F-et vagy PS 23F-et tartalmaz immunogén fehérjéhez konjugálva és 3D-MPL adjuvánssal kiszerelve, ahol a készítmény alapjában véve alumínium-alapú adjuvánstól mentes.
A találmány még további megvalósítási módja szerint a találmány tárgya kombinált antigénhatású készítmény, amely két vagy több pneumokokkusz poliszacharid-konjugátumot tartalmaz a PS 4, PS 6B, PS 18C, PS 19F és PS 23F közül 3D-MPL adjuvánssal kiszerelve, ahol a készítmény alapjában véve alumínium-alapú adjuvánstól mentes.
A találmány szerinti pneumokokkusz poliszacharid-konjugátumok immunogenitását nem befolyásolja szignifikánsan más pneumokokkusz poliszacharid-konjugátumokkal való kombi nálás (lásd a 3. példát). Ennek megfelelően a találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a találmány tárgya kombinált antigénhatású készítmény, amely egy vagy több, találmány szerinti pneumokokkusz poliszacharid-konjugátumot tartalmaz egy vagy több, további találmány szerinti pneumokokkusz poliszacharid-konjugátummal kombinálva, ahol a készítmény 3D-MPL adjuvánssal kiszerelve, de alapjában véve alumínium-alapú adjuvánstól mentes.
A találmány további előnyös megvalósítási módjai szerint a találmány tárgya kombinált antigénhatású készítmény, amely legalább egy, de előnyösen 2, 3, 4, vagy mind az 5 pneumokokkusz poliszacharid-konjugátumot tartalmazza a PS 4, PS 6B, PS 18C, PS 19F és PS 23F közül, és ezenfelül más pneumokokkusz poliszacharid-konjugátumot bármilyen kombinációját tartalmazza, ahol a készítmény 3D-MPL adjuvánssal kiszerelve, de alapjában véve alumínium-alapú adjuvánstól mentes.
A találmány szerinti Streptococcus pneumoniae kombinációs antigénhatású készítmény tipikusan konjugált poliszacharid-antigéneket tartalmazhat, amelyek legalább négy, hét, tizenegy, tizenhárom, tizenöt vagy huszonhárom szerotípusból származnak (lásd az „A találmány szerinti Streptococcus pneumoniae poliszacharid-antigének szakaszt fent a szerotípusok előnyös kombinációhoz, a kezelendő betegségtől függően).
A találmány szerinti antigénhatású készítményeket előnyösen oltóanyag-készítményekben alkalmazzuk pneumokokkusz fertőzések megelőzésére (vagy kezelésére), különösen idősekben, csecsemőkben és kisgyermekekben.
A találmány további megvalósítási módjai közé tartoznak: a fenti antigénhatású készítmények biztosítása gyógyászatban történő alkalmazásra; eljárás immunválasz kiváltására Streptococcus pneumoniae burok-poliszacharid-konjugátum ellen, amely a fenti antigénhatású készítmények biztonságos és hatásos mennyiségének betegnek történő beadásának lépését tartalmazza; és a fenti antigénhatású készítmények egyikének alkalmazása pneumokokkusz-betegség megelőzésére (vagy kezelésére) alkalmas gyógyszer gyártásában.
Tüdőgyulladás idős (55 év feletti) populációban és középfülgyulladás csecsemők (18 hónapos korig) és kisgyermekek (tipikusan 18 hónaptól 5 évesig) körében történő megelőzésére/javitására a találmány további előnyös megvalósítási módja a feltárt multivalens Streptococcus pneumoniae poliszacharidok Streptococcus pneumoniae fehérjével, vagy annak immunológiailag funkcionális ekvivalensével történő kombinálása (lásd az „A találmány szerinti pneumokokkusz fehérjék szakaszt fent az előnyös fehérjékhez és fehérje kombinációkhoz).
Az eddig feltárt antigénhatású készítmények (és oltóanyagok) előnyösen liofilizáltak a felhasználásig, amikor azokat oldószerrel rögtönözve rekonstituáljuk. Legelőnyösebben azokat 3D-MPL jelenlétében liofilizáljuk, és sóoldattal rekonstituáljuk.
A készítmények liofilizálása stabilabb készítményt eredményez (például megakadályozza a poliszacharid-antigé nek lebomlását). A folyamat meglepő módon még magasabb ellenanyag-titert okoz a pneumokokkusz poliszacharidok ellen. Ez különösen szignifikánsnak bizonyult a PS 6B konjugátumokra. Tehát a találmány egy másik megvalósítási módja PS 6B konjugátumot tartalmazó liofilizált antigénhatású készítmény 3D-MPL adjuvánnsal és alapjában véve alumíniumalapú adjuvánstól mentesen.
Az oltóanyagok előállításáról bővebben lásd a fenti „A találmány szerinti oltóanyag-preparátumok szakaszt.
Az alábbiak a 3., bakteriális poliszacharid-protein D konjugátumokat tartalmazó megvalósítási módra vonatkoznak.
A kombinált oltóanyagokra való törekvés előnye a beteg kényelmetlenségének csökkentése, a tervezés megkönnyítése, és a terápia befejezésének biztosítása; azonban ezzel együtt jár az oltóanyag hatékonysága csökkentésének a kockázata (lásd fent az epitóp-szupresszió tárgyalását a hordozófehérjék túlzott alkalmazásával kapcsolatban). Ezáltal előnyös lenne olyan oltóanyag-kombinációk előállítása, amelyek eleget tesznek a populáció igényeinek, és emellett nem mutatnak immunológiai zavaró hatást a komponenseik között. Ezen előnyöket elérhetjük a találmány szerinti immunogén készítményekkel (vagy oltóanyagokkal), amelyek különösen előnyösek kombinált oltóanyagok beadására magas kockázatú csoportokban, mint például csecsemők, kisgyermekek vagy idősek.
A találmány tárgyát képezi Haemophilus influenzae protein D fehérjéje, vagy annak fragmensei, poliszacharid-alapú immunogén készítmények, köztük oltóanyagok hordozója ként. Az alkalmazásra megfelelő fragmensek közé tartoznak a T-sejteket segítő epitópokat hordozó fragmensek. Előnyösen a protein D fragmens a fehérje N-terminális 1/3-át tartalmazhat j a.
A protein D Haemophilus influenzae IgD-kötő fehérjéje (EP 0 594 610 B. számú európai szabadalmi irat) és potenciális immunogén.
A találmány tárgykörébe tartalmazó protein D-hez konjugálandó poliszacharidok nem korlátozó példái közé tartozik a Salmonella typhi Vi-poliszacharidja, meningokokkusz poliszacharidok (köztük az A, C, W135 és Y típusú, és a Bcsoportos meningokokkusz poliszacharidok és módosított poliszacharidok), Staphylococcus aureus poliszacharidok, Streptococcus agalactae poliszacharidok, Streptococcus pneumoniae poliszacharidok, mikobaktérium poliszacharidok, például Mycobacterium tuberculosis poliszacharidok (mint például mannofoszfoinizitidek, trehalózok, mikolsav, mannóz-sapkázott arabinoglikánok, azok burka, és arabinogalaktánok), Cryptococcus neoformans poliszacharidok, nem tipizálható Haemophilus influenzae lipopoliszacharidok, Haemophilus influenzae b burok-poliszacharidja, Moraxella catharralis lipopoliszacharidok, Shigella sonnei lipopoliszacharidjok, Trypanosoma cruzi lipopeptidofoszfoglikán (LPPG), rákkal kapcsolatos GD3, GD2 gangliozidok, tumorral kapcsolatos mucinok, különösen a T-F-antigén, és a szialilT-F-antigén, és a HIV-vel kapcsolatos poliszacharid, amely szerkezetileg a T-F-antigénnel rokon.
A poliszacharidot bármilyen ismert eljárással kapcsolhatjuk a hordozófehérjéhez, például Likhite (4 372 945. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat) és Armor és mtsai. (4 474 757. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat) eljárása szerint. Előnyösen CDAPkonjugálást végzünk (WO 95/08348. számú nemzetközi közzétételi irat).
Az 1-ciano-dimetilaminopiridinium-tetrafluoroborát (CDAP) cianiláló reagenst előnyösen alkalmazzuk poliszacharid-fehérje-konjugátumok szintézisére. A cianiláló reakciót viszonylag enyhe körülmények között hajthatjuk végre, elkerülve az alkalikus pH-ra érzékeny poliszacharidok hidrolízisét. Ezen szintézis lehetővé teszi a hordozófehérjéhez történő közvetlen kapcsolást.
A poliszacharidot vízben vagy sóoldatban oldjuk fel. A CDAP-t acetonitrilben oldjuk fel, és azonnal a poliszacharid-oldathoz adjuk. A CDAP a poliszacharid hidorxil-csoportjaival reagál cianát-észtert alkotva. Az aktiválási lépés után hozzáadjuk a hordozófehérjét a reakcióelegyhez. A lizinek amino-csoportjai reagálnak az aktivált poliszacharidddal kovalens izourea-kötést alkotva.
A kapcsolási reakciót követően glicin nagy feleslegét adjuk a reakcióelegyhez a maradék aktivált csoportok lekötéséhez. Ezután a terméket gélszűrjük a reagálatlan hordozófehérje és maradék reagensek eltávolítására. Ennek megfelelően a találmány tárgya eljárás poliszacharid-protein D konjugátumok előállítására, amely során a poliszacharid aktiváljuk és a poliszacharidot protein D-hez kapcsoljuk.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát immunogén készítmény (vagy oltóanyag) kiszerelés képezi Streptococcus pneumoniae fertőzések megakadályozására .
Az a mechanizmust, amellyel a pneumokokkuszok a tüdőbe, gerincvelői folyadékba és a vérbe jutnak, alig értjük. A normális tüdőléghólyagokat elérő baktériumok növekedését gátolja azok viszonylagos szárazsága és az léghólyagok makrofágjainak aktivitása. Bármilyen anatómiai vagy élettani változás ezen koordinált védekező-mechanizmusok megváltoztatására a tüdő fertőzésre való fogékonyságát fokozza. A Streptococcus pneumoniae sejtfalának fontos szerepe a tüdő léghólyagainak gyulladásának előidézése [Gillespie és mtsai., I&I 65, 3936. old. (1997)].
Tipikusan a találmány szerinti Streptococcus pneumoniae oltóanyag protein D-konjugátumokat tartalmaz, amelyek legalább négy, hét, tizenegy, tizenhárom, tizenöt vagy huszonhárom szerotípusból származnak. Lásd az „A találmány szerinti Streptococcus pneumoniae poliszacharidantigének szakaszt fent a szerotípusok előnyös kombinációhoz, a kezelendő betegségtől függően.
A találmány egy további megvalósítási módja szerint a találmány tárgya Neisseria meningitidis oltóanyag; előnyösen az A, C, W135 és Y szerotípusokból. Neisseria meningitidis a bakteriális agyhártyagyulladás egyik legfontosabb oka. Ezen organizmusok szénhidrát burka virulenciát meghatározó tényezőként működhet, és védő ellenanyagok célpontja. A szénhidrátok mindazonáltal jól ismert módon gyen ge immunogének fiatal gyermekekben. A találmány tárgya különösen megfelelő hordozófehérje ezen poliszacharidok számára, protein D, amely olyan T-sejt-epitópokat biztosít, amelyek aktiválhatják a T-sejtes választ az antigén-specifikus B-sejtes proliferáció és érés segítéséhez, valamint az immunológiai memória indukálásához.
A találmány egy más megvalósítási módja szerint a találmány tárgya Haemophilus influenzae b burok-poliszacharid (PRP)-protein D konjugátum.
A találmány tárgykörébe tartoznak kombinált oltóanyagok is, amelyek különböző kórokozók köre ellen nyújtanak védettséget. A protein D hordozó meglepően alkalmas hordozóként kombinált oltóanyagokban, ahol több poliszacharidantigént konjugálunk. Mint ahogyan fent említettük, epitópszupresszió előfordulása valószínű, ha ugyanazt a hordozót alkalmazzák különböző poliszacharid-antigénekhez. A WO 98/51339. számú nemzetközi közzétételi iratban olyan készítményeket tárnak fel, amelyek megkísérlik minimalizálni ezt a zavaró hatást a készítményben lévő poliszacharidok egy részének DT-hez, a maradéknak TT-hez való konjugálásával .
Meglepő módon úgy találtuk, hogy a protein D különösen alkalmas az ilyen epitóp-szupressziós hatások minimalizálására kombinált oltóanyagokban. Egy kombinációban egy vagy több poliszacharidot kedvezően protein D-hez konjugálhatunk, és előnyösen az összes antigént protein D-hez konjugálhatjuk az ilyen kombinált oltóanyagokban.
Előnyös kombináció olyan oltóanyagot tartalmaz, amely Neisseria meningitidis C és Y (és előnyösen A) szerotipusa általi fertőzés ellen nyújt védelmet, ahol Y és C (és legelőnyösebben A) szerotipus egy vagy több poliszacharidantigénjét protein D-hez kapcsolunk.
Haemophilus influenzae poliszacharid-alapú oltóanyagot (PRP konjugálva előnyösen TT-hez, DT-hez vagy CRM197-hez, vagy legelőnyösebben protein D-hez) is kiszerelhetünk a fenti kombinált oltóanyagokkal.
Számos gyermekgyógyászati oltóanyagot kombinált oltóanyagként adnak be manapság, hogy csökkentsék a gyereknek adandó oltások számát. Ezért gyermekgyógyászati oltóanyagokhoz egyéb antigének is kiszerelhetők a találmány szerinti oltóanyagokkal. Például a találmány szerinti oltóanyagok kiszerelhetők, vagy külön, de egyidőben beadhatók jól ismert trivalens kombinált oltóanyagokkal, amelyek diftériatoxidot (DT), tetanusz-toxoidot (TT) és pertusszisz komponenst [tipikusan detoxifikált pertusszisz-toxoidot (PT)] és fonalas hemagglutinint (FHA) tartalmaznak opcionális pertacinnal (PRN) és/vagy agglutininnel, például a kereskedelmi forgalomban kapható INFANTRIX-DTPa™ (SmithKlineBeecham Biologicals), amely DT, TT, PT, FHA és PRN antigéneket tartalmaz, vagy egész sejtes pertusszisz komponenssel, például a SmithKlineBeecham Biologicals által forgalmazott Tritanrix™. A kombinált oltóanyag tartalmazhat más antigént is, mint például hepatitisz B felszíni antigént (HbsAg), poliovírus-antigéneket (például inaktivált trivalens polio vírus - IPV), Moraxella catharrhalis külső membrán fehérjé két, nem tipizálható Haemophilus influenzae fehérjéket, N. meningitidis B külső membrán fehérjéket.
Előnyös Moraxella catharrhalis fehérjeantigének példái, amelyek kombinált oltóanyagban lehetnek (különösen középfülgyulladás megelőzésére): OMP106 [WO 97/41731. (Antex) és WO 96/34960. számú nemzetközi közzétételi irat (PMC)]; LbpA és LbpB [WO 98/55606. számú nemzetközi közzétételi irat (PMC)]; TpbA és TpbB [WO 97/13785. és WO 97/32980. számú nemzetközi közzétételi irat (PMC)]; CopB [Helminen és mtsai., Infect. Immun. 61, 2003-2010. old. (1993)]; UspAl/2 [WO 93/03761. számú nemzetközi közzétételi irat (University of Texas)]; és OmpCD. Nem tipizálható Haemophilus influenzae antigének példái, amelyek kombinált oltóanyagban lehetnek (különösen középfülgyulladás megelőzésére): fimbrin fehérje [5 766 608. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat (Ohio State Research Foundation)] és abból származó peptidek fúziói [például LBl(f) peptidfúziók, 5 843 464. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat (OSU) vagy WO 99/64067. számú nemzetközi közzétételi irat]; OMP26 [WO 97/01638. számú nemzetközi közzétételi irat (Cortecs)]; P6 [EP 281 673. számú európai szabadalmi irat (State University of New York) ] ; TbpA és TbpB; Hia; Hmwl,2; Hap; és D15.
A találmány tárgykörébe tartozó előnyös gyermekgyógyászati oltóanyagok:
a) N. meningitidis C poliszacharid-konjugátum és Haemophilus influenzae b poliszacharid-konjugátum, opcionálisan N. meningitidis A és/vagy Y poliszacharid-konjugá tummal, feltéve, hogy legalább egy poliszacharid-antigén, és előnyösen az összes protein D-hez van konjugálva.
b) Az a) pont szerinti oltóanyag, plusz DT, TT, pertusszisz komponens (előnyösen PT, FHA és PRN), hepatitisz B felszíni antigén és IPV (inaktivált trivalens poliovirus oltóanyag).
c) Streptococcus pneumoniae poliszacharid-antigének protein D-hez konjugálva.
d) A c) pont szerinti oltóanyag, plusz egy vagy több Moraxella catharrhalis és/vagy nem tipizálható Haemophilus influenzae antigén.
Az összes fenti kombinált oltóanyagnak hasznára válhat protein D hordozóként való alkalmazása. Nyilvánvalóan minél több hordozót alkalmazunk egy kombinált oltóanyagban (például epitóp-szupresszió elkerülésére), annál drágább és bonyolultabb a végső oltóanyag. A kombinált oltóanyag összes poliszacharid-antigénjének, vagy többségüknek protein D-hez konjugálása tehát jelentős előnnyel jár.
Tüdőgyulladás idős (55 év feletti) populációban és középfülgyulladás csecsemők és kisgyermekek körében történő megelőzésére a találmány előnyös megvalósítási módja a feltárt multivalens Streptococcus pneumoniae poliszacharidokprotein D konjugátumokat Streptococcus pneumoniae fehérjével, vagy annak immunológiailag funkcionális ekvivalensével kombinálni. Lásd az „A találmány szerinti pneumokokkusz fehérjék szakaszt fent az előnyös fehérjékhez és fehérje kombinációkhoz, amelyeket ilyen kombinációkban alkalmazhatunk) .
Ennek megfelelően a találmány tárgya immunogén készítmény, amely Streptococcus pneumoniae poliszacharid-protein D konjugátumot és Streptococcus pneumoniae fehérjeantigént tartalmaz.
A találmány szerinti poliszacharid-protein D konjugátumok előnyösen adjuvánnsal együtt szerepelnek a találmány szerinti oltóanyag-kiszerelésekben. Megfelelő adjuvánsok közé tartoznak alumínium-sók, mint például alumínium-hídroxid gél (alum) vagy alumínium-foszfát, de kalcium, vas vagy cink sóit is alkalmazhatjuk, vagy acetilált tirozin vagy acetilált cukrok, kationosan vagy anionosan származtatott poliszacharidok vagy polifoszfazének oldhatatlan szuszpenzióját.
Időskori oltóanyagok esetében előnyös, ha a kiválasztott adjuváns Thl-típusú válasz preferenciális indukálószere .
Thl-adjuvánsokról bővebben lásd az „A találmány szerinti Thl-adjuvánsok„ szakaszt.
A találmány egy további megvalósítási módja szerint a találmány tárgya a feltárt immunogén vagy oltóanyag, gyógyászatban történő alkalmazásra.
A konjugátumot tartalmazó oltóanyag előállításáról és beadásáról bővebben lásd a fenti „A találmány szerinti oltóanyag-preparátumok szakaszt.
Protein D-t előnyösen alkalmazzuk középfülgyulladás elleni oltóanyagban is, mivel önmagában egy olyan immunogén, amely képes B-sejtek által közvetített védelmet kiváltani nem tipizálható Haemophilus influenzae (ntHi) ellen.
Az ntHi eláraszthatja a gazdasejteket, és elkerülheti a fehérjeantigén által kiváltott, B-sejtek által közvetített hatásokat. Meglepő módon találtunk egy utat a protein D hatásosságának növelésére (akár önmagában, akár hordozóként poliszacharid számára) középfülgyulladás elleni oltóanyag antigénjeként. Ezt úgy értük el, hogy a protein D-t adjuvánssal együtt adtuk be oly módon, hogy erős Thl-választ indukáltunk az alanyban oly módon, hogy az immunrendszer sejt-közvetített ágának optimalizáltuk protein D ellen. Ezt meglepő módon protein D-t és Thl-adjuvánst (előnyösen 3DMPL-t) tartalmazó liofilizált készítmény alkalmazásával értük el, amelyet röviddel beadás előtt rekonstituáltunk. A találmány tárgyát képezik tehát ilyen készítmények is, eljárás ilyen készítmények előállítására (protein D-t és Thladjuvánst tartalmazó elegy liofilizálásával) , és ilyen készítmények alkalmazása középfülgyulladás kezelésére.
Tágabb értelemben elképzelhető, hogy immunogén liofilizálása Thl-adjuváns (lásd az „A találmány szerinti Thladjuvánsok szakaszt), előnyösen 3D-MPL jelenlétében általában fokozza az immunogén elleni immunválaszt. A találmány tehát alkalmazható bármilyen immunogénhez, amelyre erősebb Thl immunválasz szükséges. Ilyen immunogének bakteriális, virális és tumoros fehérjeantigéneket, valamint sajátanyagelleni fehérjéket és peptideket tartalmaznak.
Szabadalmi példák
Az alábbi példákkal a találmányt részletesebben is bemutatjuk, azonban az oltalmi kört nem kívánjuk a bemutatott megvalósítási módokra korlátozni.
1. példa
S. pneumoniae burok-poliszacharid
A 11-valens oltóanyag-jelölt tartalmazza az 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F és 23F szerotípusú burok-poliszacharidokat, amelyeket lényegében az EP 72513. számú európai szabadalmi irat feltárása alapján készítettünk el. Minden poliszacharidot a CDAP kémia alkalmazásával (WO 95/08348. számú nemzetközi közzétételi irat) aktiváltunk és módosítottunk, és a hordozófehérjéhez konjugáltunk. Az összes poliszacharidot natív formájában konjugáltuk, kivéve a 3-as szerotípust (amelynek méretét csökkentettük a viszkozitás csökkentésére).
Hordozófehérje:
A választott hordozófehérje rekombináns protein D nem tipizálható Haemophilus influenzae-ből, E. coli-ban. expresszálva.
PROTEIN D EXPRESSZIÓJA
Haemophilus influenzae protein D
Protein D expressziójának genetikai konstrukciója
Kiindulási anyagok
A protein D-t kódoló DNS
A protein D nagyon konzervált a H. influenzae összes szerotípusában és nem tipizálható törzseiben. A teljes protein D-gént kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó pHIC34842 vektort Dr A. Forsgreen-től (Department of Medical Microbiology, University of Lund, Malmö General Hospital, Malmö, Sweden) szereztük be. A protein D DNS-szekvenciáját Janson és mtsai. [Infect. Immun. 59, 119-125. old. (1991)] publikálták.
A pMGl expressziós vektor
A pMGl expressziós vektor a pBR322 (Gross és mtsai., 1985) származéka, amelybe λ-bakteriofág eredetű transzkripciós és transzlációs szabályozóelemeket építettünk be (Schatzman és mtsai., 1983). Ezenfelül az ampicillin rezisztenciagént kanamicin rezisztenciagénre cseréltük ki.
Az AR58 E. coli törzs
Az AR58 E. coli törzset N99 Pl-fággal való transzdukciójával állítottuk elő, amelyet előzőleg SA500-származékon tenyésztettünk (galE::TN10, lambdaKil” cI857 ΔΗ1). Az N99 és SA500 Dr. Martin Rosenberg laboratóriumából (National Institute of Health) származó E. coli törzsek.
A pMGl expressziós vektor
A protein D termeléséhez a fehérjét kódoló DNS-t pMGl expressziós vektorba klónoztuk. Ezen plazmid lambdafág DNSből származó szignálokat használ a beillesztett idegen gének transzkripciójának és transzlációjának irányítására. A vektor PL promótert, OL operátort és két hasznosítási helyet (NutL és NutR) tartalmaz a transzkripciós polaritás! hatások enyhítésére N-fehérje alkalmazása esetén (Gross és mtsai., 1985). A PL-promótert tartalmazó vektorokat lizogén E. coli gazdába juttatják a plazmid DNS stabilizálására. Lizogén gazdatörzsek replikáció-hiányos lambdafág DNS-t tartalmaznak a genomba integrálódva (Schatzman és mtsai., 1983) . A kromoszómális lambdafág DNS irányítja a cl represszorfehérje szintézisét, amely a vektor OL-represszorához kötődik és megakadályozza az RNS-polimeráz kötődését a PL-promóterhez, és ezáltal a beillesztett gén transzkripcióját. Az AR58 expressziós törzs cl-génje hőmérsékletre érzékeny mutánst tartalmaz, ily módon a PL-irányított transzkripciót hőmérséklet váltással szabályozhatjuk, azaz a tenyészet hőmérsékletének emelése inaktiválja a represzszort és az idegen fehérje szintézise megindul. Ezen expressziós rendszer lehetővé teszi idegen fehérjék szabályozott szintézisét, különösen azokét, amelyek toxikusak lehetnek a sejt számára (Shimataka és Rosenberg, 1981) .
Az AR58 E. coli törzs
A protein D hordozó termelésére alkalmazott AR58 lizogén E. coli törzs a szokványos NIH E. coli N99-es K12 törzs származéka (F“ su galK2 lacZ~ thr) . Hibás lizogén lambdafágot (galE::TN10, lambdaKil- cI857 ΔΗ1) tartalmaz. A Kil fenotípus megakadályozza a gazda makromolekula-szintézisének kikapcsolását. A c857 mutáció a cl-represszor hőmérséklet-érzékeny zavarát okozza. A ΔΗ1 deléció eltávolítja a lambdafág jobboldali operonját és a gazda bio, uvr3 és chlA lókuszait. Az AR58 E. coli törzset N99 Pl-fággal való transzdukciójával állítottuk elő, amelyet előzőleg SA500származékon tenyésztettünk (galE::TN10, lambdaKil” cI857 ΔΗ1). A hibás lizogén N99-be való beépítését tetraciklinen szelektáltuk a TNlO-transzpozon jelenléte révén, amely tetraciklin-rezisztenciát kódol a szomszédos galE-génben.
A pMGMDPPrD-vektor konstrukciója
Az influenzavírus nem szerkezeti Sl-fehérjéjét (pMGNSl) kódoló gént tartalmazó pMGl-vektort alkalmaztuk a pMGMDPPrD megkonstruálásához. A protein D-gént PCR-rel amplifikáltuk a pHIC348-vektorból (Janson és mtsai., 1991), az 5' és 3' végeken sorrendben Neo I és Xba I restrikciós helyeket tartalmazó PCR-láncindítókkal. Az Neo I/Xba I fragmenst ezután pMGNSl-be illesztettük be Neo I és Xba I helyek között, így olyan fúziós fehérjét hoztunk létre, amely tartalmazza az Sl-fehérje N-terminális 81 aminosava mögött a protein D-t. Ezt a vektort pMGNSIPrD-nek jelöltük.
A fent feltárt konstrukció alapján állítottuk elő a végső konstrukciót a protein D expressziójához. A pMGNSIPrD-ből eltávolítottunk egy Bam HI/Bam Hl fragmenst. Ez eltávolítja az NS1 kódoló régióját az N-terminális első három aminosava kivételével. A vektor religációját követően az alábbi N-terminális aminosav-szekvenciájú fúziós fehérjét kódoló gént állítottunk elő:
----MDP SSHSSNMANT-------NS1 protein D
A protein D nem tartalmaz vezető peptidet vagy Nterminális ciszteint, amelyhez normálisan lipidek kapcsolódnak. Tehát a fehérje se nem expresszálódik a periplazmába, se nem módosul lipid-származékká, hanem oldható alakban a citoplazmában marad.
A végső mPG-MDPPrD konstrukciót az AR58 gazdatörzsbe juttattuk be hősokk révén 37°C-on. A plazmidot tartalmazó baktériumokat kanamicin jelnelétében szelektáltuk. A protein D-t tartalmazó DNS-inzert jelenlétét az izolált plazmid DNS kiválasztott endonukleázokkal való emésztésével igazoltuk. A rekombináns E. coli törzset ECD4-nek nevezzük.
A protein D expressziója a lambda PL-promóter és 0Loperátor szabályozása alatt áll. Az AR58 gazdatörzs hőmérséklet-érzékeny cl-gént tartalmaz, amely gátolja a lambda PL-ről való expressziót alacsonyt hőmérsékleten az OL-hez való kötődés révén. Ha egyszer a hőmérsékletet megemeljük, cl felszabadul az OL-ről, és a protein D expresszálódik. A fermentálás végén a sejteket töményitjük és fagyasztjuk.
Az összegyűjtött sejtek extrakcióját és a protein D tisztítását az alábbiak szerint végeztük. A fagyasztott sejttenyészet-csapadékot felolvasztottuk és újra felszuszpendáltuk sejtfeltáró oldatban (citrát-puffér, pH=6,0) OD65o=60 értékre. A szuszpenziót kétszer átnyomtuk magasnyomású homogenizátoron 1000 bar nyomással. A sejttenyészet homogenizátumát centrifugálással derítettük, és a sejttörmeléket szűréssel távolítottuk el. Az első tisztítási lépésben a szűrt lizátumot kationcserélő kromatográfiás oszlopra (SP Sepharose Fast Flow) vittük fel. A Protein D ionos kölcsönhatással kötődik az oszloptöltethez, és az elúciós puffer ionerejének lépcsős emelésével eluálódik.
Egy második tisztítási lépésben a szennyezéseket anioncserélő kromatográfiás (Q Sepharose Fast Flow) tölte46 ten tartottuk vissza. A Protein D nem kötődik a töltethez, és az átfolyóban összegyűjthető.
Mindkét kromatográfiás lépésben a frakciószedést OD alapján követtük. Az anioncserélő oszlopkromatográfia átfolyóját, amely a tisztított protein D-t tartalmazza, ultrafiltrációval töményítettük.
A protein D-t tartalmazó ultrafiltrátumot végül 0,2 pm-es membránon szűrtük.
Kémiai reakciók
Aktiválási és kapcsolási reakciók:
Az aktiválási és kapcsolási körülmények specifikusak minden egyes poliszacharidra. Ezeket az 1. táblázatban adjuk meg. A natív poliszacharidokat (kivéve a PS3-at) 2 M NaCl-ban vagy vízben oldottuk fel az injekciózáshoz. Az optimális poliszacharid-koncentrációt az összes szerotípusra értékeltük.
100 mg/ml-es acetonitriles törzsoldatból CDAP-t (a CDAP/PS arány 0,75 mg/mg) adtunk a poliszacharid-oldathoz. 105 perc elteltével 0,2 M trietilamint adtunk hozzá a specifikus aktiválási pH elérésére. A poliszacharid aktiválását ezen a pH-η végeztük, 2 percig 25’C-on. Protein D-t (a mennyiség a kezdeti PS/PD aránytól függ) adtunk az aktivált poliszacharidhoz, és a kapcsolási reakciót a specifikus pHn végeztük 1 óráig. Ezután a reakciót glicinnel állítottuk le, 30 percig 25°C-on és éjszakán keresztül 4°C-on.
A konjugátumokat gélszűréssel tisztítottuk 0,2 M NaCllel ekvilibrált Sephacryl 500HR gélszűrő oszlop alkalmazá sával .
Az eluált frakciók szénhidrát- és fehérje-tartalmát meghatároztuk. A konjugátumot tartalmazó frakciókat összeöntöttük, és sterilre szűrtük 0,22 pm-es sterilizáló membránon. A konjugátum preparátumok PS/fehérje arányát meghatároztuk.
Jellemzés:
Minden konjugátumot jellemeztünk, és azok teljesítették a 2. táblázatban leírt előírásokat. A poliszacharidtartalmat (pg/ml) rezorcinol-teszttel, a fehérjetartalmat (pg/ml) Lowry-féle teszttel mértük. A kapott PS/fehérje arányt (w/w) a koncentrációk arányával határoztuk meg.
Reziduális DMAP-tartalom (ng/pg PS) :
A poliszacharid aktiválása CDAP-vel cianát-csoportokat épít ki a poliszacharidon, és DMAP (4-dimetilamino-piridin) szabadul fel. A reziduális DMAP-tartalmat specifikus, SBnél kifejlesztett vizsgálati eljárással határoztuk meg.
Szabad poliszacharid tartalom (%):
A 4°C-on tárolt és 37°C-on 7 napig tartott konjugátumok szabad poliszacharid-tartalmát a felülúszóból határoztuk meg, amelyet α-PD ellenanyagokkal és telített ammóniumszulfáttal való inkubálással, majd centrifugálással kaptunk .
A szabad poliszacharid meghatározásához a-PD/a-PS enzimes immunológiai vizsgálati eljárást (ELISA) alkalmaztunk. A konjugátum hiányát szintén a-PD/a-PS ELISA-val mértük. A szabad poliszacharid mennyiségének csökkenése javított konjugált oltóanyagot eredményez.
Antigénhatás :
Ugyanezen konjugátumok antigénhatását szendvics-ELISA eljárással elemeztük, amelyben a befogó és detektáló ellenanyagok sorrendben oí-PS és oí-PD voltak.
Szabad fehérje tartalom (%):
A „szabad reziduális protein D-t a minta SDS-kezelésével járó eljárás alkalmazásával határoztuk meg. A konjugátumot 10 percig melegítettük 100°C-on 0,1% SDS jelenlétében, és SEC-HPLC gélszűrő oszlopra (TSK 3000-PWXL) vittük fel. Mivel a protein D dimer, fennáll annak a kockázata, hogy túlbecsüljük a „szabad protein D szintjét a szerkezet disszociációja miatt SDS hatására.
Molekulaméret (Kav) :
A molekulaméret meghatározását SEC-HPLC gélszűrő oszlopon (TSK 5000-PWXL) végeztük el.
Stabilitás:
A stabilitást SEC-HPLC gélszűrő oszlopon (TSK 6000PWXL) mértük 4’C-on tárolt és 37°C-on 7 napig tartott konjugátumokkal.
A 11-valens oltóanyag jellemzését a 2. táblázatban adjuk meg.
A fehérje-konjugátumokat alumínium-foszfátra adszorbeálhatjuk és összeönthetjük a kész oltóanyag kialakításához.
Következtetések:
Immunogén konjugátumokat állítottunk elő, amelyekről azóta bebizonyosodott, hogy egy ígéretes oltóanyag komponensei. Feltártuk a legjobb minőségű konjugált pneumokokkusz késztermékhez az optimalizált CDAP-körülményeket mind a 11 komponens esetében. A fenti javított (optimalizált) CDAP-eljárással kapható pneumokokkusz poliszacharid-konjugátumok (függetlenül a hordozófehérjétől, de előnyösen protein D-vel) tehát a találmány további megvalósítási módját képezik.
2. példa - Javított adjuvánsok hatásának tanulmányozása a 11-valens pneumokokkusz PS-PD konjugált oltóanyag immunogenitására patkánycsecsemőkben
Patkánycsecsemőket immunizáltunk a 11-valens pneumokokkusz PS-PD oltóanyaggal, minden egyes (az 1. példa eljárása szerint előállított) poliszacharid 0,1 pg-os dózisával, és az alábbi adjuváns-kiszereléssel: semmi, A1PO4, 3DMPL, 3D-MPL AlP04-on.
Az egyedül 3D-MPL-t tartalmazó kiszerelés statisztikusan (és meglepő módon) immunogénebb volt (legnagyobb GMC IgG) , mint a többi kiszerelések 11-ből 5 antigénre. Ez igaz vöt mind magas, mind alacsony 3D-MPL-koncentrációkra.
Az opszonofagocitózis megerősítette a GMC-eredményeket .
Anyagok és eljárások
Immunizálási eljárás
Különböző anyától származó, véletlenszerűen választott csecsemő OFA patkányokat 7 napos korban immunizáltunk elsődleges oltással. Két további megerősítő oltást adtunk 14 és 28 nappal később. Az 56. napon vért vettünk (28 nappal a 3. oltást követően). Minden oltóanyagot szubkután adtunk be, és oltóanyag-csoportonként 10 patkányt alkalmaztunk.
A patkányokat 11-valens pneumokokkusz konjugált oltóanyaggal immunizáltuk, amely az alábbi poliszacharid szerotipusokat tartalmazta protein D-re konjugálva: 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F és 23F.
Kiszerelés
A különböző javított adjuyánsok hatásnak tanulmányozására a konjugátum dózisát állandó szinten tartottuk, 0,1 ug minden poliszacharidból, és az A1PO4 és 3D-MPL adjuvánsokat különböző dózisokban és kombinációkban szereltük ki, beleértve az adjuváns nélküli esetet is. Ezeket a 3. táblázatban soroljuk fel referenciaként sorszámozva.
Adszorpció AlPO4-ra
A koncentrált, abszorbeált monovalenseket az alábbi eljárás szerint állítottuk elő: 50 ug AlP04-ot (pH=5,l) kevertünk 5 pg konjugált poliszachariddal 2 órán keresztül. A pH-t 5,1-re állítottuk be, és az elegyet további 16 órán át hagytuk. 1500 mM NaCl-t adtunk az elegyhez a sókoncentráció 150 mM-ra való beállításához. 5 perc múlva 5 mg/ml 2fenoxietanolt adtunk az elegyhez. További 30 perc elteltével a pH-t 6,1-re állítottuk be, és több mint három napig hagytuk 4°C-on.
Oldószerek előállítása
Három oldószert állítottunk elő 150 mM NaCl/5 mg/ml fenoxietanolban.
A: 1 mg/ml A1PO4
B: 3D-MPL AlP04-on, sorrendben 250 és 1000 pg/ml, tömegarány 5:20
C: 3D-MPL AlPO4-on, sorrendben 561 és 1000 pg/ml, tömegarány 50:89
Adszorbeált 11-valens előállítása
A 11 koncentrált, adszorbeált PS-PD monovalenst a helyes arányokban összekevertük. Az AlPO4-kiegészítést az A jelű oldószerként adtuk. Ahol szükséges, 3D-MPL-t vagy vizes oldatként (nem adszorbeált, alábbi 1. út), vagy B vagy C jelű oldószerként (3D-MPL AlP04-on arszorbeálva 2 dózisban, alábbi 2. út) adtuk az elegyhez.
1. út
A kombinált adszorbeált konjugátuntokhoz vizes oldatként adtuk a 3D-MPL-t. 10 percig kevertük a 11-valens eleggyel és 4C-on tároltuk beadásig.
2. út
3D-MPL-t előadszorbeáltuk AlP04-ra a kombinált adszorbeált konjugátumokhoz történő hozzáadás előtt (B és C jelű oldószer). 1 ml oldószer előállításához 3D-MPL vizes szuszpenzióját (250 vagy 561 pg) 1 mg AlPO4-tal (150 mM NaClban, pH=6,3) kevertük 5 percig szobahőmérsékleten. Ezt az oldatot hígítottuk NaCl pH=6,1/fenoxietanollal, és inkubáltuk éjszakán át 4°C-on.
Nem adszorbeált 11-valens oltóanyag előállítása
A tizenegy PS-PD konjugátumot a megfelelő arányokban kevertük és 150 mM NaCl, pH=6,1/fenoxietanol pufferrel hígítottuk. /Vhol szükséges, 3D-MPL-t adtunk az oldathoz (nem adszorbeált).
Az összes oltáshoz szükséges kiszerelései 18 nappal az első beadás előtt készítettük el.
ELISA
ELISA eljárást végeztünk a patkány IgG mérésére (az ELISA eljárás végzésére vonatkozó WHO Munkaértekezlet szerinti eljárás alkalmazásával) Streptococcus pneumoniae burok-poliszacharidjai elleni IgG-ellenanyagok mennyiségének meghatározására szérumban. Lényegében a mikrotiterlemezt közvetlenül vontuk be tisztított burok-poliszachariddal. A szérummintákat előinkubáltuk az összes pneumokokkuszban közös sejtfal poliszacharidddal (C-anyag), ami az EP 72513 Bl. számú európai szabadalmi irat feltárása szerint tisztított pneumokokkusz poliszacharidban körülbelül 0,5%-ban jelen van. Jackson Immunolaboratories Inc.-tői származó reagenseket alkalmaztunk a kötött egér IgG detektálására. A titrálási görbéket belső standardokhoz viszonyítottuk (monoklonális ellenanyagok) log-log egyenlettel modellezve. A számításokat SoftMax Pro szoftverrel végeztük. Ezen eredmények maximális abszolút hibája várhatóan egy 2-es faktoron belül van. A relatív hiba kisebb, mint 30%.
Opszonofagocitézis
Az opszonikus Litereket a 3, 6B, 7F, 14, 19F és 23F szerotípusokra határoztunk meg a CDC-eljárás („Streptococcus pneumoniae Opsonophagocytosis using Differentiated HL60 cells, version 1.1) alkalmazásával, tisztított emberi PMN-nel és nyúlcsecsemő komplementtel. Módosításként házilag előállított pneumokokkusz-törzseket alkalmaztunk, és a fagocitáló HL60-sejteket tisztított emberi neutrofil PMN-nel (nagymértékű korreláció van e két ’* %·*♦ * . · -* · fagocitáló sejt között) helyettesítettük. Ezenfelül 3 mm-es üveggyöngyöket adtunk a mikrotiterlemezekhez a keverés növelésére, és ez lehetővé tette a fagocita .-baktérium arány csökkentését, aminek az ajánlott értéke 400 volt.
Eredmények
IgG-koncentrácl ók
A minden szerotípusra és PD-re meghatározott IgGkoncentrációk geometrikus átlagát 4-10. táblázatokban mutatjuk be. A 6B, 14, 19F és 23F szerotípusra a korábbi tetravalens kiszereléssel kapott eredményeket is bemutatjuk összehasonlításképpen.
A legmagasabb IgG-koncentrációkat kiemeltük a 4-10. táblázatokban. A statisztikai p-értékeket a 3D-MPL és 3DMPL/AIPO4 készítmények között a 11. táblázatban mutatjuk be. A 4. adjuváns-kiszerelés (nem abszorbeált konjugátumok magas dózisú 3D-MPL-vel) adja a legmagasabb GMC-értéket 11ből 9 esetben. 11-ből 5 esetben az alacsony dózisú MPL a második legimmunogénebb kiszerelés. Ezenfelül az adjuváns alkalmazása magasabb GMC-értéket ad, mint a szerotípusok dózisának módosítása (adatokat nem közlünk), és ez statisztikusan szignifikáns a 4, 6B, 7F, 18C és 23F szerotípusokra (p<0,05 95%-os konfidencia-intervallummal).
Opszonofagoci tóz is
Az összeöntött szérumok opszonofagocitózis eredményeit a 3, 6B, 7F, 14, 19F és 23F szerotípusokra a 4-8. táblázatokban mutatjuk be. A legtöbb esetben ezen opszonikus titerek alátámasztják a GMC IgG-értéket. Valóban, az IgGkoncentrációval való korreláció nagyobb, mint 85% a 6B, 19F és 23F szerotípusra (adatokat nem közlünk) . A 3-as szerotipus esetén fontos megjegyeznünk, hogy csak a 3D-MPLcsoport váltott ki küszöbérték feletti opszonikus aktivitást .
Következtetések
Ebben a kísérletben váratlan volt, hogy a 3D-MPL egyedüli alkalmazása váltja ki a legmagasabb IgG-koncentrációt.
Az adjuváns változtatásával kapott maximális GMC IgGértéket összehasonlítottuk a PS-dózis módosításával kapott maximális GMC IgG-értékkel, és azt találtuk, hogy a 3D-MPL szignifikánsan magasabb választ vált ki 11-ből 5 szerotípussal.
A 11. táblázatban a 3D-MPL és 3D-MPL/A1PO4 készítmények összehasonlítását mutatjuk be (a kiszerelési eljárást és a 3D-MPL dózisát hasonlítjuk össze), a poliszacharidkonjugátumok közül 5 szignifikánsan javult az immunogenitás tekintetében, amikor csak 3D-MPL-lel volt kiszerelve, 3DMPL és A1PO4 helyett: PS 4, PS 6B, PS 18C, PS 19F és PS 23F.
3. példa - A kombináció hatásának tanulmányozása PS 4, PS 6B, PS 18C, PS 19F és PS 23F konjugátumok immunogenitására felnőtt patkányokban
Felnőtt patkányokat immunizáltunk pneumokokkusz poliszacharid-protein D konjuált oltóanyagokkal vagy különkülön, vagy kombinálva multivalens készítményben (tetra-, penta-, hepta- és dekavalens). Patkányok tízes csoportjait immunizáltuk kétszer 28 nap különbséggel, és vért vettünk a 28. és 42. napon (14 nappal a második dózis után).
A szérumokat ELISA-val teszteltük pneumokokkusz poliszacharidok elleni IgG-ellenanyagokra. Minden konjugátum specifikus IgG-ellenanyag termelését váltotta ki az ELISAval való mérés alapján. A 12. táblázatban a monovalens PS 6B, PS 18C, PS 19F és PS 23F protein D-konjugátumok kombinálásának a hatását mutatjuk be azok immunogenitására felnőtt patkányokban, az IgG-koncentráció mérése alapján 14 nappal a 2. dózis után.
Minden mintán statisztikai elemzést végeztünk annak meghatározásár, hogy a kombináció nyomán kialakult ellenanyag-koncentráció különbségek szignifikánsak-e. A PS 6B, PS 18C, PS 19F és PS 23F protein D-konjugátumok bármelyikének kombinálása nem változtatta meg szignifikánsan azok immunogenitását.
1. Táblázat: S: pneumoniae PS-protein D konjugátumok specifikus aktiválási, konjugálás! és reakció-leállitási körülményei
Szerotípus 1 3 4 5 6B 7F
PS konc. (mg/ml) 2, 0 3, 0 2, 0 7,5 5, 4 3, 0
PS oldat 2M NaCl 2M NaCl H2O H2O 2M NaCl 2M NaCl
PD konc. (mg/ml) 5, 0 5, 0 5, 0 5, 0 5, 0 5, 0
Kezdeti PS/PD arány (w/w) 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1
CDAP konc, (mg/mg PS) 0, 75 0, 75 0, 75 0, 75 0, 75 0, 75
pHa/pHk/pHi 9/9/9 9/9/9 9/9/9 9/9/9 9/9/9 9/9/9
Szerotípus 9V 14 18C 19F 23F
PS konc. (mg/ml) 2, 5 2,5 2, 0 4, 0 3, 3
PS oldat 2M NaCl 2M NaCl h2o 2M NaCl 2M NaCl
PD konc. (mg/ml) 5, 0 5, 0 5, 0 5, 0 5, 0
Kezdeti PS/PD arány (w/w) 1/0,75 1/0,75 1/1 1/0, 5 1/1
CDAP konc, (mg/mg PS) 0, 75 0, 75 0, 75 0, 75 0, 75
pHa/pHk/pHi 8,5/8,5 /9 9/9/9 9/9/9 10/9,5/ 9 9/9/9
Táblázat: A 11-valens pneumokokkusz PS-PD oltóanyag előírásai (a tételszám első száma
CXI
D6PDJ209 1/0,69 o cn CO o 0,13 maradt
D5PDJ235 , 1/0,86 σ> 21 1,2 o maradt
D4PDJ228 co o r~ 19 O 0,12 maradt
D03PDJ236 1/1,09 rH V kD O 0, 13 maradt
D01PDJ227 99 '0/1 i-t CO 0,2 CO o maradt
Kritérium PS/fehérje arány Szabad PS tartalom (%) <10% Szabad fehérje tartalom (%) <15% DMAP tartalom (ng/pg PS) <0,5 ng/pg PS Molekulaméret (KaV) Stabilitás
I co
LQ
I
CXI
CXI hi Q CL cn CXI Q 1/0,74 ο 12 cn o 0, 12 maradt
co o CXI tj Q CL σ> 1/0,45 10 o 0, 12 maradt
Q
04 04 •o Q CL oo 1/0,62 21 CN o o o maradt
Q
CXI o CXI h> Q CL sr 89'0/1 V co 0, 3 o maradt
Q
D09PDJ222 o 00 o V 0, 3 0, 6 0,14 maradt
D07PDJ225 00 LT) o ι—1 00 o O maradt
Kritérium PS/fehérje arány Szabad PS tartalom (%) <#> O V Szabad fehérje tartalom (%) <15% DMAP tartalom (ng/pg PS) <0,5 ng/pg PS Molekulaméret (Kav) Stabilitás
3. Táblázat: A 11-valens pneumokokkusz PS-PD-vel patkánycsecsemőkben tesztelt adjuvans kiszerelések összefoglalása
Csoport AIPO4 MPL Élj árás Leírás
1 Semmi
2 100 AIPO4
3 5 MPL alacsony
4 50 MPL magas
5 100 5 1. út 1. út alacsony
6 100 50 1. út 1. út magas
7 100 5 2 út 2 út alacsony
8 100 50 2 út 2 út magas
• Táblázat: A 6B s szerotípus geometrikus IgG átlagkoncentrációja, szerokonverziója és átlagos opszonikus titere 28 nappal patkánycsecsemők 3. immunizálását követően különböző adjuvánsokat tartalmazó 11-valens PS-PD oltóanyaggal (és összehasonlítás a tetravalens immunizálással)
Opszonikus titer 11-valens <6,25 <6,25 43 192 <6,25 <6,25 <6,25 m CM CD V
Szerokonverzió o o 10/10 10/10 o 10/10 o 00 o 00
GMC IgG (pg/ml) o o o cn o LO CO 4,927 CM O O 0,255 00 o o ín o o
Opszonikus titer Tetravalens m CM LO CD m CM cd V
Szerokonverzió o CM o o cn
GMC IgG (pg/ml) o o co o o 0, 033
Eljárás rH t—1 CM CM
á § m o m m o LT) m o LO
O o o o o o o o o O O
Csoport t—1 CM en o· m CD 00
. Táblázat. A 14-es szerotípus geometrikus IgG átlagkoncentrációja, szerokonverziója és átlagos opszonikus titere 28 nappal patkánycsecsemők 3. immunizálását követően különböző adjuvánsokat tartalmazó 11-valens PS-PD oltóanyaggal (és összehasonlítás a tetravalens immunizálással)
Opszonikus titer 11-valens <6,25 27 41 81 67 00 cn 81 133
Szerokonverzió 3/10 8/10 10/10 10/10 9/10 1------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 10/10 8/10 10/10
GMC IgG (pg/ml) 0,022 0, 237 0,233 0, 676 0 0 0 0,165 ío ·».
Opszonikus titer __________Tetravalens ______64 CO 00 _____49
Szerokonverzió 3/10 10/10 10/10
GMC IgG (pg/ml) 0, 046 66 '0 0, 81
Élj árás i-l T—1 CM CM
MPL pg 0 LD 1 ! 50 LT) 50
A1PO4 pg 100 100 100 100 100
Csoport r—1 CM CO V) kO co
Táblázat: A 19F-es szerotípus geometrikus IgG átlagkoncentrációja, szerokonverziója és átlagos opszonikus titere 28 nappal patkánycsecsemők 3. immunizálását követően különböző adjuvánsokat tartalmazó 11-valens PS-PD oltóanyaggal (és összehasonlítás a tetravalens immunizálással)
Opszonikus titer 11-valens <6,25 6L 296 1276 172 00 0 CM 323 1--- 241
Szerokonverzió 2/10 7/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10
GMC IgG (pg/ml) CM 0 0 0, 222 co CM 0 21,411 1, 649 00 00 CM kO 0 3,539
Opszonikus titer Tetravalens 64 _____367 193
Szerokonverzió 2/10 9/10 10/10
GMC IgG (pg/ml) 0, 04 0 1,09
Élj árás 1—1 T-l CM CM
MPL pg iD 50 50 LO 50
A1PO4 pg 100 100 100 100 100
Csoport <-i CM CO sr <0 r* co
Táblázat: A 23F-es szerotipus geometrikus IgG átlagkoncentrációja, szerokonverziója és átlagos opszonikus titere 28 nappal patkánycsecsemők 3. immunizálását követően különböző adjuvánsokat tartalmazó 11-valens PS-PD oltóanyaggal (és összehasonlítás a tetravalens immunizálással)
Opszonikus titer 11-valens <6,25 <6,25 389 >1600 17 Γ 54 18 43
Szerokonverzió 3/10 8/10 9/10 10/10 5/10 8/10 3/10 0
GMC IgG (pg/ml) 0,152 l£> m 0 2,296 4,969 0, 462 0, 635 0,203 0 m 0
Opszonikus titer Tetravalens m CM 70 <6,25
Szerokonverzió 2/10 10/10 10/10
GMC IgG (pg/ml) O O 0, 29 0, 38
Eljárás <—1 T-l CM CM
á 5 50 50 m 50
A1PO4 pg 100 100 100 100 100
Csoport CM (Π q· m co
to to C <D rt nJ (β to c
to Φ rtJ to rtj I co
Opszonikus titer _____ 7F <6,25 43 477 332 54 59 30 o
Szerokonverzió 7/10 o σ> 10/10 10/10 10/10 9/10 8/10 9/10
GMC IgG (pg/ml) 0, 040 0,25 2,435 2,569 0, 579 0, 611 0, 154 0, 638
Opszonikus titer CO <6,25 <6, 25 tn CM co V 18 LO CM CD V LO CM CD V <6,25 LO CM LO V
Szerokonverzió 1/10 6/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10
GMC IgG (pg/ml) £00 '0 00 o o o o o o CD O O tn o o CM O O 900 '0 co o o
Elj árás <-d r-i CM CM
MPL pg m 50 LO 50 LO 50
o w. 100 100 100 100 100
Csoport r—1 CM tn m· LO CD r- 00
I ιΠ
VO
I
-P
to (<J 44 O tn
'Φ c
nJ
'0
•ri Ό
0 nJ
'OJ '0
N
c 0
Φ X)
Ü c
c :0
0 1-4
44 =3
0» 44
«J a
-P Φ
'(0 *o
0 44 Φ '/rt
tn > IQ φ
M =0 44 Ö> aj
<0 3 44 &
44 OJ fit
•H +J ε tn 'rt N IV Ό 44 r4 0
o φ tn •H C g Q Ch 1
n t> 1 •H UJ Ch
Ch tn
-P 0 tn C Φ
M 44 (ti
Φ N >O E > I
to <0 Φ tn 0 1
=0 1 m Φ tn 0 Ό N fit
tn & 1
'Φ in '«J 44 -P nJ 44
Φ 1 nJ Ch H at 44
q· r—I m
tn Ch
Φ Ch
1 nJ
r—1 a
CO CM at
-P
OJ Ό
N •rl
'rt N
M
Λ Φ
'rt >
H C
• 0 44
<Λ 0
P Φ N tn
Szerokonverzió m 3/10 9/10 10/10 10/10 10/10 10/10 01/01 10/10
GMC IgG (pg/ml) o ’tr o o o LZ6 ‘ L 13,974 3,015 5,755 2, 062 σ> o o LO
Szero[konverzió 0/10 5/10 10/10 10/10 10/10 9/10 9/10 10/10
GMC IgG (pg/ml) 0, 005 0, 052 3,452 7,102 0, 676 0, 419 LO CXI o 0,423
Szerokonverzió r-l 4/10 8/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10
GMC IgG (pg/ml) 0, 026 0,282 1, 614 (o CM CM 0, 568 1,430 co o CO LT) ’ET
Eljárás Ι-H 1—I CXI CX]
MPL pg m o in m 50 ID 50
bri ’OdIV 100 100 100 100 100
Csoport r-| CM CO LD r- CO
10. Táblázat: Az 9V-s, 18C-s szerotípus és protein D geometrikus IgG átlagkoncentrációja és szerokonverziója 28 nappal patkánycsecsemők 3. immunizálását követően különböző adjuvánsokat tartalmazó 11-valens PS—PD oltóanyaggal
Szerokonverzió protein D 0/10 10/10 10/10 10/10 10/10 1-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 10/10 8/10 10/10
GMC IgG (pg/ml) n o o o 0,993 3, 349 LO LT) o vl· 1,258 1, 665 5, 665
Szerokonverzió 18C 1/10 5/10 10/10 10/10 |—........ 10/10 10/10 0T/0I o o
GMC IgG ___(pg/ml) 0, 013 ____0,092 6,560 14,023 o cn uo o ____1,771 0, 528 0, 980
Szerokonverzió Λ6 0/10 6/10 7/10 10/10 1 9/10 10/10 10/10 9/10
GMC IgG (pg/ml) CO o o CH 00 o 0, 482 CM 'q· %» 2,133 2,558 1,536 2, 448
Eljárás r-4 CM CM
MPL pg 50 m 50 50
AlPOí pg 100 100 100 100 100
Csoport CM co LO r- 00
11. Táblázat: Statisztikai szignifikancia (p-érték), miszerint bizonyos pneumokokkusz poliszacharid-konjugátumok immunogenitása javult-e egyedül 3D-MPL-ben kiszerelve a 3DMPL/AlPCU-hez képest. 0,01 alatti p-érték erősen szignifikáns. 1. út és 2. út a kiszerelés módját jelöli.
Szerotipus 50 pg 3D-MPL - 3D-MPL/A1PO4 5 pg 3D-MPL - 3D-MPL/A1PO4
1. út 2 . út 1. út 2 . út
1 0, 3 0, 05 0, 079 0, 11
3 0, 075 0, 01 0,27 0, 008
4 0, 002 0,0003 0, 02 0, 003
5 0, 04 0, 002 0, 1 0, 12
6B 0, 001 0,0001 0, 001 0,0006
7F 0, 13 0, 15 0, 01 0, 005
9V 0, 02 0, 02 0, 1 0, 04
14 0, 65 0,21 0, 3 0, 66
18C 0,0008 0,0002 0, 006 0, 004
19F 0,0009 0, 006 0, 21 0, 04
23F 0, 002 0,0004 0, 01 0,0004
12. Táblázat: Geometrikus IgG átlagkoncentrációk (pg/ml) 14 nappal felnőtt patkányok 2. immunizálását követően, 1,0 pg poliszacharid-protein D konjugátum alkalmazásával egyedül vagy kombinálva, tetravalens, pentavalens, heptavalens vagy dekavalens oltóanyagban. Az adatok 5 különálló kísérlet kombinált eredményei.
Szerotípus 4 6B 18C 19F 23F
Oltóanyag H T H T T
Egyedül 9, 3 0, 11 15 5,2 2,5
Kombinálva 4 0,23 3,7 3, 7 2, 8
T: Kombinálva tetravalens pentavalens (T plusz PS 3) 9V és 18C) , és dekavalens kombninált oltóanyagban. H plusz PS 4, 9V és 18C), és 7F) kombinált oltóanyagban (T) (PS 6B, 14, 19F, 23F), , heptavalens (Η) (T plusz PS 4, (H plusz PS 1, 5 és 7F) : Kombinálva heptavalens (Η) (T dekavalens (H plusz PS 1, 5 és
4. példa — Pneumolizinnek és 3D-MPL-nek a PD-konjugált 11-valens poliszacharid-oltóanyaghoz történő hozzáadásának a jótékony hatása pneumokokkuszos tüdő-kolonizáció ellen egérben
Immunológiai mérések
Pneumolizin-specifikus szérum IgG ELISA adagolása
Maxisorp Nunc mikrotiterlemezeket vontunk be 2 órán keresztül 37°C-on, 100 pg/mérőhely 2 pg/ml koncentrációjú, PBS-ben hígított rekombináns natív pneumolizinnel (PLY). A lemezeket háromszor mostuk 0,9% NaCl, 0,05% Tween-20 pufferrel. Azután anti-PLY referenciaszérum kétszeres hígítási sorozatát (PBS/0,05% Tween-20 pufferben, 100 μΐ/mérőhely) adtuk a lemezekhez standard görbeként (670 ng/ml IgG-vel kezdve), és szérummintákat (1/10-szeres hígítástól kezdve) inkubáltunk 30 percig 20’C-on rázás mellett. A fenti módon való mosás után PBS/0,05% Tween-20 pufferben 5000-szeresre hígított (100 ul/mérőhely) peroxidázzal konjugált kecske anti-egér-IgG-t (Jackson) inkubáltunk 30 percig 20°C-on rázás mellett. Mosás után a lemezeket 15 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten 100 μΐ/mérőhely kimutató pufferrel (0,4 mg/ml OPDA és 0,05% H2O2 100 mM citrátpufferben, pH=4,5). A kimutatást 50 μΐ/mérőhely 1 N HC1 hozzáadásával állítottuk le. Az optikai denzitásokat Emax Immunoreader (Molecular Devices) alkalmazásával olvastuk le 490 és 620 nm-en. Az ellenanyag-titert 4-paraméteres matematikai eljárásssl számítottuk SoftMax Pro szoftver alkalmazásával.
Hemolízis-gátlás
Ezt a vizsgálati eljárást a szérum ellenanyagok azon képességének mérésére végeztük, hogy gátolják a pneumolizin (PLY) hemolitikus aktivitását. A koleszterin (ami fogékony a PLY-vel való kölcsönhatásra) eltávolítására a szérummintákat kétszer kezeltük az alábbi módon: azonos térfogatú kloroformmal kevertük azokat, majd 45 percig inkubáltuk rázás mellett. A felülúszókat 10 perc, 1000 rpm centrifugálás után összegyűjtöttük. A koleszterinmentes szérumokat hígítottuk (kétszeres sorozathígítás 1 mM ditiotreitol, 0,01% BSA, 15 mM Tris, 150 mM NaCl, pH=7,5 pufferben) 96ΊΟ mérőhelyes mikrotiterlemezen (Nunc). 50 μΐ, 4 HU (hemolízis egység) PLY-t tartalmazó oldatot adtuk minden mérőhelyhez, és 15 percig inkubáltuk 37°C-on. Azután 100 μΐ juh vörösvértestet (1%-os oldat) adtunk a lemezekhez 30 percig 37°Οση. 10 perc, 1000 rpm centrifugálást követően a felülúszókat (150 μΐ) összegyűjtöttük és egy másik 96-mérőhelyes mikrotiterlemezre tettük az optikai denzitás leolvasásához 405 nm-en. Az eredményeket felezőponti hígitási titerben fejeztük ki.
Pneumolizin kémiai detoxifikálása
Rekombináns natív pneumolizint (PLY) dializáltunk 50 mM foszfát, 500 mM NaCl, pH=7,6 pufferrel szemben. Az összes következő lépést 39,5°C-on hajtottuk végre epizódszerű keverés mellett. Az első napon 10% Tween-80 (1/250 v/v) , 57,4 mM N-acetyl-triptofán (1/300 v/v) pH=7,6, 2,2 M glicin foszfát pufferben (1/100 v/v), és 10% formaldehid foszfát pufferben (3/100 v/v) elegyet adtunk a PLYoldathoz. A 2. és 3. napon megint 10% formaldehid-oldatot adtunk, sorrendben 3/100 v/v és 2/100 v/v arányban. A 37Οση történő inkubálást a 7. napig folytattuk, epizódszerű keverés mellett. Végezetül a PLY-t 50 mM foszfát, 500 mM NaCl, pH=7,6 pufferrel szemben dializáltuk. A PLY teljes inaktiválását a hemolizises vizsgálati eljárással demonstráltuk .
OF1-egerek intranazális pneumokokkusz fertőzése
Hét hetes nőstény OFl-egereket intranazálisan oltottunk érzéstelenítés alatt 5xl05 CFU egérhez-adaptált 6B-s szerotípusú S. pneumoniae-val. A tüdőket 6 órával a fertő71 zés után eltávolitottuk és homogenizáltuk (Ultramax, 24000 rpm, 4'C-on) Todd-Hewitf Broth (THB, Gibco) tápoldatban. A tüdőhomogenizátumok tízszeres sorozathígítását tenyésztettük 37°C-on éjszakán keresztül, élesztőkivonattal kiegészített THB-agart tartalmazó Petricsészéken. A pneumokokkuszos tüdőfertőzést CFU/egér egységben határoztuk meg, logaritmikus súlyozott átlagként. A kimutatási határ 2,14 log CFU/egér volt.
4/A példa 3D-MPL adjuváns hatása anti-pneumolizin immunválaszra
Ebben a példában a 3D-MPL adjuváns alkalmazásának hatását értékeltük a natív rekombináns pneumolizinre (PLY, J. Paton, Children's Hospital, North Adelaide, Australia), és kémiai úton detoxifikált változatára (DPLY) adott immunválaszra. A kémiai detoxifikálsát a fenti módon hajtottuk végre.
Hat hetes nőstény Balb/C-egerek tízes csoportjait intramuszkulárisan immunizáltunk a 0., 14. és 21. napon 1 pg PLY-vel vagy DPLY-vel, amely vagy A: 100 pg AlPO4-et, vagy B: 100 pg A1PO4 plusz 5 pg 3D-MPL-t (3-de-O-acetiláltmonofoszforil lipid A, Ribi Immunochem) tartalmazott. Az 1A és 1B ábrán a 3. oltást követő ELISA IgG- és hemolízisgátlási Litereket mutatjuk be.
Akármelyik antigénnel is, a legjobb immunválaszt a 3DMPL-lel kiegészített kiszerelésekkel immunizált állatokban kaptuk. Érdekes módon a DPLY ugyanannyira volt immunogén mint a PLY, ha AlPO4/3D-MPL-lel együtt adtuk be, és gyengébb immunogén volt az AlPO4-kiszerelésben. Ez mutatta a
3D-MPL előnyös képességét a detoxifikált pneumolizin elleni ellenanyag-válasz javítására.
Pneumolizint tartalmazó készítményekben előnyösebb lehet a kémiai úton detoxifikált pneumolizin alkalmazása, mint mutációval detoxifikált pneumoliziné. Ennek az az oka, hogy az eddig kapott detoxifikált mutánsoknak még van reziduális toxinaktivitása, de a kémiai úton detoxifikált pneumolizinnék nincs. Tehát általában a találmány egy másik megvalósítási módjának számít kémiai úton detoxifikált pneumolizint (vagy pneumolizin-mutánst) tartalmazó készítmény, oltóanyagban történő alkalmazásra, amennyiben Thladjuvánssal, előnyösen 3D-MPL-lel együtt adjuk be. Ilyen készítmények a találmány tárgyát képezik. A kémiai úton detoxifikált pneumolizin elleni immunválasz növelésére szolgáló eljárás, amely Thl-adjuváns (előnyösen 3D-MPL) készítményhez való adását tartalmazza, szintén elképzelhető.
4/B példa Pneumolizin legyengített mutáns és 3D-MPL adjuváns hozzáadásának jótékony hatása a PD-konjugált 11valens poliszacharid-oltóanyag védő hatásosságára 6B szerotípussal intranazálisan fertőzött OFl-egerek pneumokokkuszos tüdőkolonizálásában
Ebben a példában a 11-valens poliszacharid-protein D konjugátumot, legyengített mutáns pneumolizin-antigént (PdB, WO 90/06951. számú nemzetközi közzétételi irat), és A1PO4 és 3D-MPL adjuvánsokat tartalmazó oltóanyag profilaktikus hatékonyságát értékeltük, összehasonlítva a klasszikus AlP04-adszorbeált 11-valens poliszacharid-protein Dkonjugátum kiszereléssel.
Négy hetes nőstény OFl-egerek 12-es csoportjait szubkután immunizáltunk a 0. és 14. napon az alábbi kiszerelésekkel: A: 50 pg A1PO4; B: szerotipusonként 0,1 pg PS-t tartalmazó 11-valens protein D-konjugált poliszacharidoltóanyag + 50 pg A1PO4; vagy C: szerotipusonként 0,1 pg PS-t tartalmazó 11-valens protein D-konjugált poliszacharid-oltóanyag + 10 pg PdB (J. Paton, Children's Hospital, North Adelaide, Australia) + 50 pg A1PO4 + 5 pg 3D-MPL (Ribi Immunochem). A fertőzést a 21. napon végeztük a fenti leírás szerint.
Mint ahogy az IC ábrán bemutatjuk, a PdB-vel és A1PO4 + MPL-lel kiegészített 11-valens poliszacharid-konjugátum oltóanyag nagyon szignifikáns (p<0,007) védelmet nyújtott (a fekete téglalapok mutatják az aritmetikai átlagot). Ezzel ellentétben a 11-valens poliszacharid-konjugátum oltóanyag / A1PO4 kiszereléssel immunizált állatokban nem figyeltünk meg szignifikáns védelmet. Ez az eredmény bebizonyította, hogy a pneumolizin-antigén (még a legyengítetté is) és a 3D-MPL adjuváns hozzáadása javította a 11-valens poliszacharid-konjugátum oltóanyag hatásosságát tüdőgyulladás ellen.
4/C példa A 4B példában bemutatott védelem immunológiai megfelelői
A 4B példában nyújtott, legyengített mutáns pneumolizinnel (PdB) és 3D-MPL-lel kiegészített 11-valens poliszacharid-konjugátum oltóanyag általi védelem immunológiai megfelelőinek megállapítása érdekében megmértük a fertőzés előtti, 6B poliszacharidra és PdB-re adott szerológiai ellenanyag-válaszokat a fenti leírás szerint.
Azután az ellenanyag-titereket a megfelelő állatok fertőzés után 6 órával begyűjtött tüdejében mért baktériumkolóniaszámokhoz hasonlítottuk. Az R2-értékeket log/log lineáris regresszióval számítottuk.
A számított R2-értékek sorrendben 0,18 és 0,02 voltak anti-PdB és anti-6B ellenanyag-válaszokra. Ez a korreláció hiányát mutatta a humorális immunválasz és a védelem között mindkét antigénre. Az anti-6B ellenanyag-titerek nem voltak szignifikánsan különbözőek a 11-valens konjugált oltóanyaggal immunizált csoportokban (GMT = 0,318 ng/ml), vagy a PdB-vel és 3D-MPL-lel kiegészített ugyanilyen oltóanyagokban (GMT = 0,458 ng/ml). Tehát a védelem C-kiszereléssel látott javulása nem kizárólag a 6B-poliszacharid elleni magasabb ellenanyag-válasznak a következménye.
Együttesen az eredmények azt sugallják, hogy a védelmet nem egyedül a humorális immunválasz közvetítette, hanem a PdB-antigén 3D-MPL jelenlétében indukált sejt-közvetített immunitása is. Ez további támogatást adott a fehérjeantigén(ek)nek és hatásos adjuváns(ok)nak a pneumokokkusz poliszacharid-konjugátum oltóanyaghoz való hozzáadásához, ily módon összehangolva az immunrendszer mindkét ágát az optimális védelem elérésére.
5. példa - Az immunrendszer mindkét ágának együttműködése pneumolizinnel aktívan immunizált, és pneumokokkusz PS elleni ellenanyagokkal passzívan immunizált egerekben
5/A példa - Passzívan beadott anti-6B-poliszacharidellenanyag (anti-PS) tüdőgyulladás ellen védő koncentrációjának megtalálása.
Élj árás
Oltóanyag-csoportok: Egerek négy 16-os csoportját passzívan immunizáltunk (intraperitoneálisan) a -1. napon 100 μΐ hígítatlan patkány anti-poliszacharid antiszérummal az alábbi csoportokban, (összesen 64 egér)
Csoport Specifitás IgG-koncentráció az antiszérumban
G1 «-PS-6B 5 pg/ml
G2 a-PS-6B 2 pg/ml
G3 0Í-PS-6B 0,75 pg/ml
G4 Kontroll 0 pg/ml
Állatok: 64 hím CD-l-egér (Charles River, Canada), tömegük körülbelül 35 g (körülbelül 10 hetesek).
Érzéstelenítés: Az egereket izofluránnal (3%) plusz 02-vel (1 L/perc) érzéstelenítettük.
Organizmusok: Az S. pneumoniae N1387 törzset (6-os szerotípus) 5% lóvérrel kiegészített, triptikázos szójaagar (TSA) csészékről gyűjtöttük össze, és 6 ml PBS-ben felszuszpendáltuk. A fertőzést közvetlenül megelőzően 1 ml baktérium-szuszpenziót 9 ml lehűtött, olvasztott tápagarba (BBL) hígítottunk, és 41°C-on tartottunk. Az egerek körülbelül 106 CFU/egér dózist kaptak 50 μΐ térfogatban.
Fertőzés: A 0. napon az egereket érzéstelenítettük a fent leírt módszerrel, és S. pneumoniae N1387 törzzsel fertőztük (50 μΐ lehűtött baktérium-szuszpenzióval) intrabronhiális becsepegtetéssel, nem sebészi intratracheális csőbevezetéssel. ezt az eljárást Woodnut és Berry [Antimicrob. Ag. Chemotherap. 43, 29. old. (1999)] tárták fel.
Minták: A fertőzés után a 3. napon csoportonként 8 egeret feláldoztunk C02-túladagolással, és a tüdőket kivágtuk és homogenizáltuk 1 ml PBS-ben. Tízszeres sorozathígítást készítettünk PBS-ben az életképes baktériumok számának meghatározására. A mintákat három párhuzamosban (20 μΐ) 5% lóvérrel kiegészített TSA-csészékre oltottuk, és 37°C-on inkubáltuk éjszakán keresztül a kiértékelés előtt. Az egerek további csoportját áldoztuk fel a 7. napon és a mintákat a fenti módon értékeltük.
Eredmények
IgG-koncentráció (pg/ml) a patkányszérumban Baktériumszám (log CFU/tüdő) fertőzés után
3 8
5 6,7 ± 0,7 (1/7) 7,2 ± 0,7 (5/8)
2 6,5 ± 0,7 (1/7) 6, 9 ± 1,8 (4/7)
0, 75 7,7 ± 0,5 (5/8) 4,8 ± 1,4 (2/8)
0 6,7 ± 1,5 (3/6) 6,3 ± 1,5 (3/9)
A zárójelben lévő számok a mintavétel ideje előtt elpusztult állatok számát jelzik.
Következtetés:
Általában nem volt szignifikáns különbség egyik kezelési csoportból izolált baktériumszám között sem. Ez azt mutatja, hogy az anti-poliszacharid nem nyújtott mérhető védelmet 5 pg/ml koncentrációig, azt is beleértve.
Ez hasonló ahhoz, amit néhány emberi klinikai vizsgálatban megfigyeltek, azaz az anti-poliszacharid elégtelen pneumokokkuszos tüdőgyulladás elleni védelemre bizonyos populációkban .
5/B példa - PLY (pneumolizin) aktív beadásával (adjuvánssal és anélkül) nyújtott védelem meghatározása, és szinergia szuboptimális anti-PS-ellenanyaggal.
Eljárás
Állatok: 128 hím CD-l-egér (Charles River, St.
Constant, Quebec, Canada), 6 hetes immunizáláskor, 10 hetes fertőzéskor. Az állatok tömege körülbelül 20 g volt 6 hetesen, és körülbelül 38 g 10 hetes korban.
Immunizálás: Egerek hat 16-os csoportját szubkután injekcióval immunizáltunk a -22. és -14. napon 100 μΐ oltóanyaggal az alábbiak szerint, (összesen 128 egér) . PdB-t (WO 90/06951. számú nemzetközi közzétételi irat) Dr. J. Paton, Australia szívességéből, 3D-MPL-t Ribi/Corixa cégtől szereztük be.
A -1. napon specifikus csoportokat (lásd az alábbi táblázatot) passzívan immunizáltunk (intraperitoneálisan 100 μΐ) 4,26 μg/ml koncentrációjú egér anti-poliszacharidellenanyaggal (4 ml 5 μg/ml oldat + 1,3 ml 2 μg/ml oldat).
Cso- port Aktív inj. térfogata Oltóanyag dózis (pg, -22., -14. nap) Passzív inj. térfogata Passzív IgG, -1. nap
-1 100 pl, se. PdB/AlPO4 (10/50)
-2 100 pl, se. PdB/MPL/AlPO4 (10/5/50)
-3 100 pl, se. PdB/AlPO4 (10/50) 100 pl, ip. ot-PS
-4 100 pl, se. PdB/MPL/AlPO4 (10/5/50) 100 pl, ip oí-PS
-5 100 pl, se. MPL/A1PO4 (5/50) 100 pl, ip a-PS
-6 100 pl, se. MPL/A1PO4 (5/50)
- 79 • « · · ··· ·* · · ·
Fertőzés: A 0. napon az egereket érzéstelenítettük (3% izofluránnal plusz 1 L/perc 02-vel). Baktérium-inokulumokat S. pneumoniae N1387 törzs (6-os szerotípus) 5% lóvérrel kiegészített, triptikázos szója-agar (TSA) csészékről való összegyűjtésével állítottunk elő, 6 ml PBS-ben felszuszpendálva. Tízszeres hígítást készítettünk (1 ml plusz 9 ml) lehűtött, olvasztott tápagarral (41°C-on tartva) közvetlenül a fertőzést megelőzően. Az egereket intra-bronhiális becsepegtetéssel, nem sebészi intratracheális csőbevezetéssel fertőztük, és azok körülbelül 106 CFU/egér dózist kaptak 50 μΐ térfogatban. Ezt az eljárást Woodnut és Berry [Antimicrob. Ag. Chemotherap. 43, 29. old. (1999)] tárták fel.
Minták: A fertőzés után a 72 órával csoportonként 8 egeret feláldoztunk CO2-túladagolással, és a tüdőket kivágtuk és homogenizáltuk 1 ml PBS-ben. Tízszeres sorozathígítást készítettünk PBS-ben az életképes baktériumok számának meghatározására. A mintákat három párhuzamosban (20 μΐ) 5% lóvérrel kiegészített TSA-csészékre oltottuk, és 37°C-on inkubáltuk éjszakán keresztül a kiértékelés előtt. Az egerek további csoportját áldoztuk fel a 8. napon és a mintákat a fenti módon értékeltük. Az adatok elemzése Az összehasonlító kezelés kimenetelének mérőszáma a baktériumok száma volt a tüdőben 3 és 7 nappal a fertőzés után. Az eredményeket csoportok átlagaként fejeztük ki szórással. A statisztikai elemzést Student-féle teszttel vé80 geztük, ahol a 0,05-nél kisebb P-értéket tartottuk szignifikánsnak.
Eredmények órával a fertőzés után
A baktériumszámok az 1-4 csoportban szignifikánsan (p<0,05) alacsonyabbak voltak, mint az 1-3 csoportban.
A baktériumszámok az 1-4 csoportban szignifikánsan (p<0,05) alacsonyabbak voltak, mint az 1-5 csoportban.
168 órával a fertőzés után
A baktériumszámok minden csoportban körülbelül két nagyságrenddel alacsonyabbak voltak a 8. napon, mint a 3. napon, a fertőzés felbomlását mutatva.
A baktériumszámok az 1-2 csoportban szignifikánsan (p<0,05) alacsonyabbak voltak, mint az 1-5 csoportban.
Csoport 3. nap 8. nap
log CFU/tüdő Szórás log CFU/tüdő Szórás
1-1 6, 93 0, 61 5, 23 1,28
1-2 6, 59 1,25 4, 08 1,34
1-3 7, 09 0, 8 5, 32 1,26
1-4 6, 09 1,43 4,46 2,32
1-5 7, 19 0, 89 5, 42 1,05
1-6 6, 68 1,14 5, 01 1,48
Mint ahogy fent demonstráltuk, egyedül az anti-poliszacharid-ellenanyag (1-5 csoport) nem nyújt védelmet a pneumokokkuszok növekedése ellen a tüdőben. A PdB és A1PO4 adjuváns szintén nem biztosít védelmet, de a 8. napon van egy trend a védelemre, ha a PdB-t 3D-MPL-lel kombináljuk (1-2 csoport).
A 3. napon a legszignifikánsabban védett csoport, az 1-4 csoport, mind a három komponenst tartalmazta, PdB-t, 3D-MPL-t és passzívan beadott anti-poliszacharid-ellenanyagot. Ezt a következtetést a mortalitási adatok is alátámasztják. Az 1-4 csoportban 2/8 állat pusztult el az 1-5 és 1-3 csoportok 5/10 halálozásával összehasonlítva.
Következtetés:
Mivel a kísérletet passzívan immunizált állatokkal végeztük, a pneumolizinnel és MPL-lel való aktív immunizálás szinergetikus hatása nem lehet a poliszacharid-antigén elleni ellenanyagok szintjében bekövetkező növekedés következménye .
Mivel az állatokat csak passzívan immunizáltuk pneumokokkusz poliszacharid ellen, a 8. napra az ilyen ellenanyagok nagyrészt eltűntek volna a gazdából.
Még így is szignifikáns védelem látható pneumokokkuszos tüdőgyulladás ellen a pneumolizin + 3D-MPL-lel immunizált csoportokban, és különösen a pneumolizin + 3D-MPL-lel + passzívan beadott anti-poliszacharid-ellenanyaggal immunizált csoportokban, mutatva ezen kombináció szinergetikus hatását.
Ha az anti-poliszacharid immunizálást aktívan hajtottuk volna végre (előnyösen konjugált poliszachariddal) , a hatás még kifejezettebb lett volna, mivel a B-sejtes memória hatása és az anti-PS ellenanyagok állandó szintje hoz záadódott volna az immunválasz együttműködéséhez (lásd például az IC ábrát, ahol számos, poliszachariddal és fehérjével aktívan immunizált állatban nem volt kimutatható baktérium a tüdőkben a fertőzés után).
6. példa — 11-valens pneumokokkusz poliszacharidprotein D-konjugátum oltóanyag és 3D-MPL adjuváns immunogenitása egyéves Balb/C-egerekben
Bevezetés és célok:
A pneumokokkusz-fertőzés elleni védelmet szerotípusspecifikus ellenanyagok közvetítik opszonofagocitózis révén. Feltételezhető, hogy az ellenanyag-koncentráció növekedése nagyobb fokú védelmet eredményez, és ezáltal sok energiát fordítottak a humorális immunválasz fokozásának útjainak megtalálására. Az egyik sikeresen alkalmazott stratégia klinikai elővizsgálatokban konjugált oltóanyagok esetén immunstimuláló adjuvánsok alkalmazása [összefoglalás: Poolman és mtsai., „Carbohydrate-Based Bacterial Vaccines, „Handbook of Experimental Pharmacology, szerk.: Perlmann és Wigsell, kiad.: Springer-Verlag, Heidelberg, D (1998) ] .
Az ebben a szakaszban feltárt adatok a legutóbbi, klinikai mintákat alkalmazó kísérlet eredményeit mutatják be, klinikai vizsgálatokat utánzására tervezett eljárásban.
Élj árás:
Egyéves Balb/C-egereket immunizáltunk a pneumokokkusz poliszacharid-protein D-konjugátum oltóanyag emberi dózisának 1/10-ével, vagy a 23-valens egyszerű poliszacharidoltóanyaggal. Az alkalmazott oltóanyagok a DSP009, DSP013 vagy DSP014 sorszámú klinikai minták voltak, amelyek sorrendben a 11-valens konjugált oltóanyag 6B és 23F szerotípus 1 meg dózisának, és a többi szerotípus 5 meg dózisának, a 11-valens konjugált oltóanyag 0,1 meg dózisának, vagy a 11-valens konjugált oltóanyag 0,1 meg dózisának 5 meg 3DMPL-lel feleltek meg. Az összes 11-valens konjugált oltóanyagot 50 pg AlPO4-adjuvánssal is kiszereltük.
Egerek 20-as csoportjait immunizáltuk intramuszkulárisan. Az alábbi táblázatban felsorolt csoportok oltását a 0. és 21. napon végeztük. A 35. napon (14 nappal az második dózis után) teszt véreztetést hajtottunk végre.
Táblázat: Egyéves Balb/C-egerek immunizálási terve pneumokokkusz poliszacharid-protein D-konjugátum oltóanyag klinikai mintáival
Csoport 0. nap Oltóanyag 1. dózis 21. nap Oltóanyag 2. dózis Egerek száma
1 Pneumovax-2 3 2,5 meg Puffer 20
2a 11-valens Pn-PD 0,1 meg Puffer 20
2b 11-valens Pn-PD 0,1 meg 11-valens Pn-PD 0,1 meg 20
3a 11-valens Pn-PD + MPL 0,1 meg + 5 meg Puffer 20
3b 11-valens Pn-PD + MPL 0,1 meg + 5 meg 11-valens Pn-PD + MPL 0,1 meg + 5 meg 20
4a 11-valens Pn-PD 1/0,5 meg Puffer 20
4b 11-valens Pn-PD 1/0,5 meg 11-valens Pn-PD 1/0,5 meg 20
Kontroll Puffer Puffer 20
A szérumokat ELISA eljárással vizsgáltuk pneumokokkusz poliszacharidok elleni IgG-ellenanyagok jelenlétére a CDC/WHO konszenzusos eljárást követve, azaz a szérum sejtfal-poliszachariddal történő semlegesítését követően. Az
ELISA-t szerotípus-specifikus IgGl monoklonális ellenanyagokkal kalibráltuk úgy, hogy mcg/ml egységű ellenanyag-koncentrációkat kapjunk.
Az összehasonlítások statisztikai elemzését UNISTAT version 5.0 beta alkalmazásával számítottuk. Az ANOVA-elemzést a Tukey-HSD eljárással végeztük log-transzformált IgGkoncentrációkon. A szerokonverziós arányok páronkénti összehasonlítását Fisher-féle egzakt teszttel végeztük.
Eredmények:
A 11 szerotípus és protein D ellen 14 nappal a második immunizálás után kiváltott GMC IgG-értéket és 95%-os konfidencia-intervallumot az alábbi táblázatban mutatjuk be. Ahol 95%-os konfidencia-intervallumot nem lehetett számítani, a szerokonverziós arányt mutatjuk be.
Az 1. csoport mutatja az egyszerű poliszacharidokkal való immunizálás hatását, amelyek normálisan csak IgM termelését váltják ki állatokban. A legtöbb IgG-koncentráció a kimutatási küszöb alatt van; mindazonáltal a Balb/C-egerek képesek voltak IgG-t termelni néhány pneumokokkusz poliszacharid ellen, nevezetesen a 3, 19F és 14 szerotípusok ellen .
A konjugált oltóanyagokkal való immunizálás magas szerokonverziós arányú IgG-ellenanyag-termelést váltott ki az összes szerotípus ellen, a 23F kivételével.
Dózis-függő választ (2. a 4. csoporttal szemben) csak a 7F és 19F szerotípusoknál figyeltünk meg, de ezek nem voltak statisztikusan szignifikánsak. Fokozottabb választ figyeltünk meg két dózis után (b csoportok az a csoportok86 kai szemben) a 3, 6B, 7F és 19F szerotípusok és protein D esetében, és ezek statisztikusan szignifikánsak voltak sok esetben mindhárom kiszerelésre.
A legérdekesebb a 3D-MPL hatása. A 3D-MPL-vel kiszerelt oltóanyag két dózisa (3b csoport) váltja ki a specifikus IgG legmagasabb GMC-értékét, és ez statisztikusan szignifikáns az össze szerotipusra a 23F kivételével, amely esetén szignifikánsan magasabb volt a szerokonverziós arány (p = 0,02, 3b csoport a 2b csoporttal szemben, Fisher-féle egzakt teszt).
Táblázat: Kiválasztott pneumokokkusz szerotípusok és protein D IgG-koncentráció geometrikus átlaga és 95% konfidencia-intervalluma egyéves Balb/C-egérben 14 nappal a 11valens PS-PD konjugált oltóanyaggal történő immunizálás után
Csoport 1 2a 2b 3a 3b 4a 4b
Szerotíp GM[IgG] GM[IgG] GM[IgG] GM[IgG] GM [IgG] GM[IgG] GM [IgG]
US pg /ml pg /ml pg /ml pg /ml pg /ml pg /ml pg /ml
(95% (95% (95% (95% (95% (95% (95%
KI) KI) KI) KI) KI) KI) KI)
3 0, 24 0, 18 0, 84 0, 72 4, 84 0, 22 0, 95
(0,16- (0,11- (0,47- (0,51- (3, 0- (0,14- (0,19-
0, 6) 0,27) 1,5) 1,0) 7,9) 0, 35) 1,8)
6B 0, 02 0, 04 0, 19 0, 14 0, 74 0, 09 0, 11
0/20# 8/19# (0,09- (0,07- (0,29- (0,05- (0,05-
0,41) 0,27) 1,9) 0, 16) 0, 23)
7F 0, 04 0, 07 0, 19 0, 15 0, 97 0, 09 0, 45
0/20# (0,04- (0,10- (0,10- (0,49- (0,06- (0,20-
0,12) 0,39) 0,22) 2,0) 0,14) 1, 02)
14 0, 15 4,5 6,2 12, 9 13, 6 4,0 6,9
3/20# (2,5- (3, 6- (7, 8- (9, 4- (2, 0- (4, 6-
8,1) 10, 5) 21,2) 19,7) 8,0) 10, 6)
19F 1,2 6,7 12,1 10, 1 58, 5 5, 9 22, 0
(0,56- (3, 6- (7,6- (5, 5- (42-81) (3, 5- (16, 0-
2, 6) 12,5) 19, 3) 18,5) 9, 9) 30, 2)
23F 0, 07 0, 08 0, 08 0, 07 0, 17 0, 06 0, 10
1/20# 3/20# 2/19# 2/10# 9/20# 1/18# 4/20#
PD* 0, 25 5,2 11,9 13,5 98, 0 10, 9 38,7
1/20# (3, 3- (6, 9- (9, 5- (49,1- (6,4- (21,3-
8,3) 20,7) 19, 0) 195) 1’8,4) 70,3)
*EU/ml egységben; #szerokonverziós arány, kétszeres szórással a negatív kontroll átlaga felett
Lásd az előző táblázatot a csoportok definícióját illetően.
Következtetés:
Az itt feltárt adatok demonstrálják, hogy a 3D-MPL hozzáadása a 11-valens pneumokokkusz poliszacharid-protein D-konjugátum oltóanyaghoz fokozta az immunválaszt idős Balb/C-egerekben az összes vizsgált szerotípus esetében.
A legtöbb esetben az oltóanyag két dózisa magasabb geometrikus IgG-átlagkoncentrációt váltott ki, mint egy dózis. Mivel ez nem volt megfigyelhető az egyszerű polisza88 charid-oltóanyag alkalmazásával, még emberekben sem, így ez a T-sejt-függő immunválasz és az immunológiai memória kiváltása jelének tekinthető.
Az adatok alátámasztanak egy Thl-adjuvánssal (előnyösen 3D-MPL-lel) együtt beadott konjugált pneumokokkusz poliszacharid oltóanyagot alkalmazó beadási sémát, ahol az az adjuvánsos oltóanyagnak legalább két dózisát adjuk be, előnyösen 1-12 hét, legelőnyösebben 3 hét időközzel. Az ilyen beadási séma a találmány egy további megvalósítási módját képezi.
A kísérletben alkalmazott egerek érzéketlenek a PS 23ra (egyszerű vagy konjugált). Érdekes módon, bár a poliszacharid elleni ellenanyag-koncentráció alacsony maradt az alkalmazott oltóanyag-készítménytől függetlenül, sokkal több egér válaszolt a PS23-ra, amikor 3D-MPL-t alkalmaztunk adjuvánsként (a szerokonverzió szignifikánsan magasabb). Thl-adjuváns, előnyösen 3D-MPL alkalmazása konjugált pneumokokkusz-poliszacharidokat tartalmazó oltóanyag-készítményekben az oltott egyén pneumokokkusz-poliszacharidre való érzéketlenségének enyhítésére a találmány még egy további megvalósítási módját képezi.
7. példa - Neisseria meningitidis C-poliszacharidprotein D-konjugátum (PSC-PD)
A: PROTEIN D EXPRESSZIÓJA
Mint az 1. példában feltártuk.
B: C-POLISZACHARID GYÁRTÁSA
A poliszacharid C-csoportjának forrása az N. meningitidis Cll törzse. Ezt klasszikus fermentálás! mód szerekkel fermentáljuk (EP 72513. számú európai szabadalmi irat). A konjugálás! eljárásban alkalmazott száraz por alakú poliszacharidok azonosak a Mencevax-szal (SB Biologicals s . a.) .
A Cll-törzs egy alikvotját felolvasztottuk, és a szuszpenzió 0,1 ml-ét élesztőkivonat dializátummal (10%, v/v) kiegészített Mueller Hinton táptalajt tartalmazó petricsészére kentük, és 23-25 órát inkubáltuk 36°C-on vízgőzzel telített inkubátorban.
A felszíni tenyészetet ezután újra felszuszpendáltuk sterilizált fermentációs tápközegben, és ezzel a szuszpenzióval beoltottunk egy élesztőkivonat dializátummal (10%, v/v) kiegészített Mueller Hinton tápközeget és steril üveggyöngyöket tartalmazó Roux-edényt. A Roux-edény 23-25 órán keresztül 36°C-on vízgőzzel telített inkubátorban történő inkubálását követően a felszíni tenyészetet újra felszuszpendáltuk 10 ml steril fermentációs tápközegben, és ezen szuszpenzió 0,2-0,3 ml-ét átoltottuk 12 másik Mueller Hinton tápközeget tartalmazó Roux-edénybe.
A 23-25 órán keresztül 36°C-on vízgőzzel telített inkubátorban történő inkubálást követően a felszíni tenyészetet újra felszuszpendáltuk 10 ml steril fermentációs tápközegben. A baktérium-szuszpenziót kúpalakú lombikba összeöntöttük.
Ezen szuszpenziót azután aszeptikusán átvittük a fermentorba steril fecskendők alkalmazásával.
A meningokokkusz fermentációját negatív nyomású tisztaszobában lévő fermentorokban végeztük. A fermentáció ál tálában 10-12 óra elteltével teljes, és körülbelül 1O10 baktérium/ml-nek (azaz a korai stacionárius szakasznak) felel meg, és a pH emelkedésével detektáljuk.
Ebben az állapotban a teljes táptalajt hővel inaktiváljuk (12 perc 56'C-on) a centrifugálás előtt. Az inaktiválás előtt és után a táptalajból mintát veszünk, és Mueller Hinton petricsészére kenjük.
C: PS-TISZTÍTÁS
A tisztítás többlépéses folyamat az egész fermentációs táptalajon végrehajtva. A tisztítás első fázisában az inaktivált tenyészetet centrifugálással derítjük, és a felülúszót begyújtjuk.
A poliszacharid-tisztítás kvaterner-ammóniumsóval (cetil-trimetil-ammónium-bromid, CTAB, Cetvalon R) történő kicsapáson alapul. A CTAB oldhatatlan komplexet képez polianionokkal, mint például poliszacharidokkal, nukleinsavakkal és fehérjékkel, a pl-jüktől függően. Az ionosán szabályozott reakciót követően ezen eljárás alkalmazható szennyezések (alacsony vezetőképesség) vagy poliszacharidok (magas vezetőképesség) kicsapására.
A derített felülúszóban található poliszacharidokat kovaföld (Celite® 545) hordozóként való alkalmazásával csapjuk ki, oldhatatlan inert anyag keletkezésének elkerülése végett a kicsapások/tisztítások során.
N. meningitidis C-poliszacharidjának tisztítási sémája:
1. lépés: A PSC-CTAB komplexet rögzítjük Celite® 545 hordozón, és eltávolítjuk a sejttörmelékeket, nukleinsavakat és fehérjéket 0,05% CTAB mosással.
2. lépés: A PS-t eluáljuk 50% etanollal. Az első zavaros és szennyezéseket és LSP-t tartalmazó frakciókat eldobjuk. A következő frakciókban a PS jelenlétét flokkulációs teszttel ellenőrizzük.
3. lépés: A PSC-CTAB komplexet újra rögzítjük Celite® 545 hordozón, és eltávolítjuk a kisebb nukleinsavakat és fehérjéket 0,05% CTAB mosással.
4. lépés: A PS-t eluáljuk 50% etanollal. Az első zavaros frakciókat eldobjuk. A következő frakciókban a PS jelenlétét flokkulációs teszttel ellenőrizzük.
Az eluátumot szűrjük és a nyers poliszacharidot tartalmazó szűrletet összegyűjtjük. A poliszacharidot kicsapjuk a szűrletből etanol 80% végkoncentrációban való hozzáadásával. Azután a poliszacharidot fehér porként visszanyerjük, vákuumban szárítjuk, és -20°C-on tároljuk.
D: CDAP-KONJUGÁLÁS
PSC és PD konjugálása
A PSC és PD konjugálásához a CDAP konjugációs módszert részesítettük előnyben a klasszikus CNBr-aktiváláshoz és kapcsoló-molekulán keresztül fehérjéhez történő kapcsoláshoz képest. A poliszacharidot először cianilálással aktiváljuk l-ciano-4-dimetilaminopiridínium-tetrafluoroboráttal (CDAP). A CDAP vízoldható cianiláló reagens, amelyben a ciano-csoport elektrofilsága megnövelt a CNBr-hez képest, lehetővé téve a cianiláló reakció viszonylag enyhe körülmények közti végrehajtását. Az aktiválás után a poliszacharidot közvetlenül kapcsolhatjuk a hordozófehérjéhez annak amino-csoportjain keresztül bármiféle kapcsoló-molekula alkalmazása nélkül. A reagálatlan cianátészter-csoportokat glicinnel való alapos reakcióval reagáltathajuk el. A konjugátum előállításában szereplő lépések száma csökkent, és az a legfontosabb, hogy potenciálisan immunogén kapcsoló-molekulák nincsenek jelen a végtermékben.
A poliszacharid CDAP-val történő aktiválása cianátcsoportot épít be a poliszacharidba, és dimetilaminopiridin (DMAP) szabadul fel. A cianát-csoport reagál a fehérje amino-csoportjaival az aktiválást követő kapcsolási reakcióban, és karbamát-csoporttá alakul át.
PSC aktiválás és PSC-PD kapcsolás
Az aktiválást és kapcsolást 25°C-on végezzük.
120 mg PS-t oldunk legalább 4 órán keresztül WFI-ben (injektálható víz, „Water for Injection).
CDAP-oldatot (100 mg/ml, frissen készítve acetonitrilben) adunk a poliszacharid-oldathoz 0,75 CDAP/PS (w/w) arány elérésig.
perc 30 másodpercnél a pH-t az aktiválási pH-ra (pH=10) emeljük trietilamin hozzáadásával, és stabilizáljuk a PD hozzáaádásáig.
perc 30 másodpercnél NaCl-ot adunk az elegyhez 2M végkoncentrációban.
percnél tisztított PD-t adunk az elegyhez 1,5/1 PD/PS arányban; a pH-t azonnal a kapcsolási pH-ra (pH=10 állítjuk be. Az oldatot 1 órát állni hagyjuk a pH szabályozása mellett.
A reakció leállítása ml 2 M glicin-oldatot adunk a PS/PD/CDAP elegyhez. A pH-t a leállítási pH-ra (pH=8,8) állítjuk be. A reakcióelegyet 30 percig kevertetjük a munkahőmérsékleten, majd éjszakán keresztül 2-8”C-on folyamatos lassú keveréssel.
PS-PD tisztítása
Szűrés után (5 pm) a PD-PS-konjugátumot hidegszobában tisztítjuk gélszűrő kromatográfiával Sephacryl S400HR-tölteten a kismolekulák (beleértve az DMAP-t) és a konjugálatlan PD eltávolítása végett. Elúció: 150 mM NaCl, pH=6,5; követés: UV 280 nm, pH és vezetőképesség.
A reakciókomponensek különböző molekulamérete szerint először a PS-PD-konjugátum eluálódik, majd a szabad PD és végül a DMAP. A DMAB-bal (PS) és pBCA-val (fehérje) detektált konjugátumot tartalmazó frakciókat összeöntjük. Az összeöntött frakciókat sterilen szűrjük (0,2 pm) .
E: ABSZORBEÁLT PSC-PD-KONJUGÁTUM OLTÓANYAG KISZERELÉSE
A1PO4 mosása
A PSC-PD-konjugátum AlP04-en való adszorbeálásának optimalizáláshoz az AlPO4-t mossuk a PO4 3—koncentráció csökkentésére :
- az AlPO4-t 150 mM NaCL-lel mossuk és centrifugáljuk (négyszer);
• .*· ···· »♦ ·· * · · * * ί ·*} >· ··· *' 4 ·»
- a csapadékot újra felszuszpendáljuk 150 mM NaCl-ban és szűrjük (10 μια); és
- a szűrletet hővel sterilizáljuk.
ezt a mosott AlPO4-t WAP-nek („washed autoclaved phosphate, mosott autoklávozott foszfát) nevezzük.
Kiszerelési eljárás
A PSC-PD-konjugátum nagy mennyiségét A1PO4 WAP-ra adszorbeáltuk a végtermék kiszerelését megelőzően. Az A1PO4 WAP-ot PSC-PD-vel kevertük 5 percig szobahőmérsékleten. A pH-t 5,1-re állítottuk, és az elegyet további 18 órát kevertük szobahőmérsékleten. NaCl-oldatot adtunk az elegyhez 150 mM koncentrációban, és az elegyet 5 percig kevertük szobahőmérsékleten. 2-fenoxietanolt adtunk 5 mg/ml koncentrációban és az elegyet 15 percig kevertük szobahőmérsékleten, majd a pH-t 6,1-re állítottuk.
Végső kiszerelés/dózis
- PSC-PD: 10 pg PS
- A1PO4 WAP: 0,25 mg Al3+
- NaCl: 150 mM
- 2-fenoxietanol: 2,5 mg
- injektálható víz: 0,5 ml-re
- pH:
6,1
F: PREKLINIKAI INFORMÁCIÓK
Poliszacharid-konjugátum immunogenitása egérben
A PSC-PD-konjugátum immunogenitását 6-8 hetes Balb/Cegerekben állapítottuk meg. A sima (nem adszorbeált) konjugátumot vagy az AlPO4-ra adszorbeált konjugátumot monovalens oltóanyagként injektáltuk. Az indukált anti-PSCellenanyagokat ELISA-val mértük, míg a funkcionális ellenanyagokat baktericid-teszttel elemeztük, mindkét eljárást a CDC (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, USA) eljárása szerint. A dózis-hatás és adjuváns (Α1Ρ04) hatásának megállapítására elvégzett két különböző kísérlet eredményeit mutatjuk be.
Dózis-hatás kísérlet
Ebben a kísérletben a PSC-PD-konjugátumot kétszer injektáltuk Balb/C-egerekbe, két hét időközzel. Négy különböző AlP04-on kiszerelt konjugátum-dózist alkalmaztunk: 0,1; 0,5; 2,5 és 9,6 pg/állat. Az egereket (csoportonként 10-et) a 14. (14 nappal az első oltás után), a 28. (14 nappal a második oltás után), és a 42. (28 nappal a második oltás után) véreztettük. Az ELISA-val mért C-poliszacharid-specifikus ellenanyagok geometrikus átlagait (GMC) pg IgG/ml-ben fejeztük ki, tisztított IgG referenciaként való alkalmazásával. A baktericid ellenanyagokat összeöntött szérumokon mértük, és a titereket a baktériumok 50%-át elpusztítani képes hígítás reciprokaként fejeztük ki, N. meningitidis Cll törzsét alkalmazva nyúlcsecsemő-komplement jelenlétében .
A kapott dózis-hatás telítést mutat a 2,5 pg-os dózistól kezdve. Az eredmények azt jelzik, hogy jó megerősítő hatás van az első oltást követő 14. nap és a második oltást követő 14. nap között. 28 nappal a második oltás után az ellenanyag-szintek legalább ekvivalensek a 14 nappal a második oltás utánihoz képest. A baktericid ellenanyagtiterek összhangban vannak az ELISA-val kapott koncentrációkkal, és megerősítik a PSC-PD-konjugátum immunogenitását.
Az adjuváns hatása
Ebben a kísérletben AlP04-on kiszerelt PSC-PD-konjugátum egy mintáját vizsgáltuk, a sima (adjuváns nélküli) konjugátumot injektáltuk összehasonlításképpen. Csoportonként 10 egeret kétszer injektáltunk, két hét időközzel szubkután úton, 2 pg konjugátummal. Az egereket a 14. (14 nappal az első oltás után), a 28. (14 nappal a második oltás után), és a 42. (28 nappal a második oltás után) véreztettük, és ELISA- és funkcionális ellenanyag-titereket mértünk (csak 14 nappal a második oltás után és 28 nappal a második oltás a baktericid-teszthez). Az AlPO4-kiszerelés 10-szer magasabbig terjedő ellenanyag-titereket vált ki a nem-adjuvánsos kiszerelésekkel összehasonlítva.
Következtetések
Az alábbi általános következtetéseket vonhatjuk le a fent feltárt kísérletek eredményeiből:
- A PSC-PD-konjugátum emlékező választ vált ki, demonstrálva, hogy a konjugált PSC T-sejt-függő antigénné válik.
- Az ELISA-val mért anti-PSC-ellenanyag koncentrációi jól korrelálnak a baktericid-ellenanyag-titerekkel, mutatva, hogy a PSC-PD-konjugátummal kiváltott ellenanyagok mű-
- 97 • · · · · · · ··· · · · · · ködőképesek a Neisseria meningitidis C-szerocsoportjávál szemben.
- Körülbelül 2,5 pg AlPO4-on adszorbeált konjugátum látszólag optimális immunválaszt vált ki egerekben.
- A CDAP-reakció megfelelő eljárásnak látszik immunogén PSC-PD-konjugátumok előállítására.
8. példa - N. meningitidis A-szerocsoportjából származó poliszacharid-protein D-konjugátum előállítása
Poliszacharid-A (PSA) száraz porát oldottuk egy órán keresztül 0,2 M NaCl oldatban 8 mg/ml végkoncentrációra. Azután a pH-t 6-os értékre állítottuk vagy HCl-lel, vagy NaOH-val, és az oldat hőmérsékletét 25°C-on szabályoztuk. 0,75 mg CDAP-t /mg PSA (100 mg/ml oldatként acetonitrilben) adtunk a PSA-oldathoz. 1,5 perc elteltével (a pH szabályozása nélkül) 0,2 M NaOH-t adtunk az elegyhez, és 10-es pH-t kaptunk. 2,5 perccel később protein D-t (5 mg/ml-re koncentrálva) adtunk az elegyhez, körülbelül 1 PD/PSA aránynak megfelelően. A 10-es pH-t tartottuk a kapcsolási idő alatt, ami 1 óra volt. Azután 10 mg glicint (2 M, pH=9,0) /mg PSA adtunk az elegyhez, és a pH-t szabályoztuk 9,0-ra, 30 percig 25’C-on. Az elegyet azután 4°C-on tartottuk éjszakán át, mielőtt gélszűrő kromatográfiával tisztítottuk (Sephacryl S400HR a Pharmacia-tól) . Először a konjugátum eluálódik, majd a reagálatlan PD és a melléktermékek (DMAP, glicin, sók) . A konjugátumot összegyűjtöttük, és sterilizáltuk 0,2 pm-es szűréssel Sartopore-membránon (Sartorius).
9. példa - A 7. és 8. példában előállított termékek in vivo jellemzése
A fő tulajdonságokat az alábbi táblázatban foglaljuk össze:
No . Konjugátum leírása Fehérje és PS tartalom (pg/ml) PS/fehérj e arány (w/w) Szabad fe- hérje (%) Szabad PS (%)
1 PSC-PD NaOH-val szab. pH PD: 210 PS: 308 1/0,68 < 2 8-9
2 PSC-PD TEA-val szab. pH PD: 230 PS: 351 1/0,65 < 2 5-6
3 PSA-PD NaOH-val szab. pH PD: 159 PS: 149 1/1,07 5 5-9
In vivo eredmények
Balb/C-egereket alkalmaztunk állati modellként a konjugátumok immunogenitásának vizsgálatára. A konjugátumokat vagy AlPO4-ra vagy Al(OH)3-ra adszorbeáltuk (10 pg PS-t 500 pg Al3+-ra) , vagy nem adszorbeáltuk. Az egereket az alábbiak szerint oltottuk: két oltás két hetes időközzel (2 pg PS/oltás).
Ezen eredményekből az a következtetést vonhatjuk le először, hogy a szabad PS nagyban befolyásolja az immunválaszt. Jobb eredményeket kaptunk 10%-nál kevesebb PS-t tar talmazó konjugátumokkal. A fenti javítások a CDAP-eljárásra tehát a találmány további megvalósítási módját képezik.
A kiszerelés is fontos. A1PO4 látszik a legmegfelelőbb adjuvánsnak ebben a modellben. A konjugátumok megerősítő hatást váltanak ki, ami nem figyelhető meg az egyedül injektált poliszacharidokkal.
Következtetések
A N. meningitidis A és C poliszacharidjainak konjugátumait állítottuk elő sorrendben 1 és 0,6-0,7 (w/w) PS/fehérje aránnyal. A szabad PS és szabad hordozófehérje sorrendben 10% és 15% alatt volt. A poliszacharid kitermelés magasabb, mint 70%. A fenti javított CDAP-eljárással kapható PSA és PC konjugátumok (függetlenül a hordozófehérjétől, de előnyösen protein D-vel) tehát a találmány további megvalósítási módját képezik.
10. példa — H. influenzae b-ből származó poliszacharid-protein D-konjugátum előállítása
H. influenzae az agyhártyagyulladás egyik fő oka a két évesnél fiatalabb gyermekekben. A H. influenzae burok-poliszacharidja (PRP) tetanusz-toxoid-konjugátumként jól ismert (J. Robbins által kifejlesztett reakcióval konjugálva). A CDAP alkalmazása javított reakció. Az alábbi a PRP (előnyösen PD-hez való) konjugálásakor talált optimális körülmények leírása.
100
A konjugálás! reakciót befolyásoló paraméterek az alábbiak:
• A poliszacharid kiindulási koncentrációja (aminek kettős hatása lehet a szabad poliszacharid végső szintjére és a steril szűrési lépésre).
• A hordozófehérje kiindulási koncentrációja.
• A poliszacharid/fehérje kiindulási aránya (aminek szintén kettős hatása lehet szabad poliszacharid végső szintjére és a steril szűrési lépésre).
• Az alkalmazott CDAP mennyisége (általában nagy feleslegben alkalmazzuk).
• A reakcióhőmérséklet (ami befolyásolhatja a poliszacharid lebomlását, a reakció kinetikáját, és a reaktív csoportok lebomlását).
• Az aktiválás és kapcsolás pH-ja.
• A reakció leállításának pH-ja (a reziduális DMAP szintjét befolyásolja).
• Az aktiválás, kapcsolás és leállítás ideje.
Úgy találtuk, hogy a három legkritikusabb paraméter a végtermék minőségének optimalizálására: a poliszacharid/fehérje kiindulási aránya,; a poliszacharid kiindulási koncentrációja; és a kapcsolás pH-ja.
Ezért egy 3-paraméteres reakció-rendszert terveztünk a három fenti körülménnyel a három tengelyen. A középpontok (és a kísérleti tartományok) az alábbiak voltak: PS/fehérje arány: 1/1 (±0,3/1); [PS]: 5 mg/ml (±2 mg/ml); és kapcsolási pH: 8,0 (±1, 0) .
101
A kevésbé lényeges paramétereket az alábbiakban rögzítettük: 30 mg poliszacharidot alkalmaztunk; hőmérséklet 25°C; [CDAP] = 0,75 mg/mg PS; a pH-t 0,2 M NaOH-val állítottuk; aktiválási pH 9,5; aktiválás ideje 1,5 perc; kapcsolás ideje 1 óra; [fehérje] = 10 mg/ml; leállítás! pH 9,0; leállítás ideje 1 óra; PS oldásának ideje az oldószerben: 1 óra 2 M NaCl-ben; tisztítás Sephacryl S400HRoszlopon 150 mM NaCl-lel 12 cm/óra folyási sebességgel; és steril szűrés SARTOLAB P20 szűrőn 5 ml/perc sebességgel.
A vizsgált adatok a fenti reakció-rendszerrel előállított termékek optimalizált körülményeinek meghatározásánál az alábbiak voltak: folyamat adatok - maximális kitermelés szűrés után, maximális beépített fehérje-szint; és termékminőségi adatok - PS/fehérje végső aránya, szabad PS szintje, szabad fehérje szintje, minimum reziduális DMAP (CDAP lebomlási terméke) szint.
A szűrés hozama
A szűrés utáni hozamot befolyásoló tényező a kiindulási [PS], és a kapcsolási pH és a kiindulási PS/fehérje arány kölcsönhatása. Alacsony [PS]-nál kicsi a kölcsönhatás a két utóbbi tényezővel, és mindig jó szűrhetőség az eredmény (körülbelül 95% az összes termékre). Azonban magas koncentrációknál a szűrhetőség csökken, ha a pH és a kiindulási arány nő (magas [PS], legkisebb arány, legalacsonyabb pH = 99% szűrhetőség; de magas [PS], legmagasabb arány és pH = 19% szűrhetőség).
102
Fehérjebeépülés szintje
A PS/fehérje végső aránya a kiindulási arányhoz képest a kapcsolás hatékonyságának a mérőszáma. Magas [PS]-nál a pH nem befolyásolja az arányok arányát. Azonban a kiindulási arány igen (1,75 alacsony kiindulási aránynál, 1,26 magas kiindulási aránynál). Alacsony [PS]-nál az arányok aránya legnagyobb részben alacsonyabb, azonban a pH-nak ott nagyobb hatása van (alacsony pH, alacsony arány = 0,96; alacsony pH, magas arány = 0,8; magas pH, alacsony arány = 1,4; és magas pH, magas arány = 0,92).
Végső PS/fehérje arány
A végső arány a kiindulási aránytól és [PS]-tól függ. A legnagyobb végső arányokat a magas kiindulási arány és magas [PS] kombinációjával kaptuk. A pH hatása a végső arányra nem annyira szignifikáns, mint az alacsony [PS].
Szabad protein D szintje
A legkisebb mennyiségű szabad protein D-t magas pH-nál és magas [PS]-nál figyeltük meg (a szint 0,0-hoz közelít). A magas [PS] hatása különösen kifejezetté válik, amikor a pH alacsony. A kiindulási arány növelése egy kcsit járul csak hozzá a szabad protein D szintjének növekedéséhez.
Reziduális DMAP
A kiindulási aránynak nincs szignifikáns hatása. Ezzel ellentétben a DMAP szintje növekszik a [PS]-val, és csökken, amikor a pH-t emeljük.
Következtetések
A legelőnyösebb konjugálás! körülmények tehát az alábbiak: kapcsolási pH = 9,0; [PS] = 3 mg/ml; és kiindulási
103 arány = 1/1. Ilyen körülmények mellett a végtermék tulajdonságai az alábbiak:
Végső arány PS/fehérje PS hozam szűrés után (%) Arányok aránya Szabad protein D (%) DMAP szint (ng/10 pg PS)
érték tarto- mány érték tartomány ér- ték tarto- mány ér- ték tartomány ér- ték tartomány
1,10 0, 91- 1,30 92, 6 50-138 1,16 1, 03- 1, 29 0, 71 0-10,40 4,95 2, 60- 7, 80
A fenti javított (optimalizált) CDAP-eljárással kapható PRP-konjugátumok (függetlenül a hordozófehérjétől, de előnyösen protein D-vel) tehát a találmány további megvalósítási módját képezik.
11. példa: Protein D mint antigén - hogyan javíthatjuk a nem tipizálható H. influenzae elleni védő hatékonyságát 3D-MPL-lel való kiszerelés révén
Nőstény Balb/C-egereket (csoportonként 10-et) immunizáltunk (intramuszkulárisan) a 11-valens pneumokokkusz poliszacharid-protein D-konjugátum oltóanyaggal először 20 hetes korban (D0), majd másodszor két héttel később (D14). A második immunizálás után 7 nappal vért vettünk. A protein D ellni ellenanyag-titereket IgGl, IgG2a és IgG2b típusú ellenanyagok mennyiségének vonatkozásában mértük.
Fagyasztva-szárított 11-valens oltóanyagot (A1PO4 nélkül) állítottunk elő a konjugátumok 15,75% laktózzal való kombinálása révén, 15 perc keveréssel szobahőmérsékleten, a
104 pH-t 6,l±0,1-re állítva, és liofilizáltuk (a ciklus általában -69°C-on kezdtük, fokozatosan -24°C-ra állítottuk 3 óra alatt, majd tartottuk ezt a hőmérsékletet 18 órán keresztül, utána fokozatosan -16°C-ra állítottuk 1 óra alatt, majd tartottuk ezt a hőmérsékletet 6 órán keresztül, utána fokozatosan 34°C-ra állítottuk 3 óra alatt, majd tartottuk ezt a hőmérsékletet 9 órán keresztül).
A kiszerelések és a liofilizátumokat rekonstituáló oldatok összetételét a 13. táblázatban mutatjuk be.
A legjellegzetesebb mérés Thl-típusú sejt-közvetített immunválasz bekövetkeztére ismert módon a korreláció az IgG2a-ellenanyagok szintjével. Mint ahogyan az adatokból láthatjuk, meglepően nagy IgG2a-koncentráció emelkedés az eredménye annak, hogy a protein D-t Thl-adjuvánssal (ebben az esetben 3D-MPL-lel) együtt liofilizáltuk.
β
•rl Φ 4J 0 Λί φ Μ φ 4J Ή +J 1 tn φ >1 β Φ β Φ Φ ω 'Φ
4-> β 'Φ Λ! β 0 m φ (0 ω •Η Ν Ό Ό
Ν Ό ο
Ό •Η
Μ Φ β φ Λ Μ
'Φ Ö1
Φ Φ
Φ 4J β Φ
'Φ 4J Φ Ν ω tn :0 Λ4 Φ ΙΟ 'φ φ Μ Φ Ν m Ή Φ
φ N
Λ 'rt
IgG2b dP 0,313 0,265 0,526 0, 795 0,853 1,477 0,160 0,620 6, 849 3,089 8,062 — 1, 990 0,298
IgG2a 0,554 0,427 3,02 3,12 2,73 0,967 3,96 0 0 5,09 15,1 31,1 1,55 0,465
IgGl 99,1 99,3 96,4 96,1 96,4 97,6 95,9 99,0 88,1 81,8 I-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 60, 8 96,5 99,2
IgG2b μg/ml 0,24 0,176 0,036 0,043 0,046 0,168 0,075 0,119 3,5 5,1 LT) CT) 0,899
IgG2a 0425 0,284 0,207 0,169 0,147 0 1, 86 0 0 2.6 25 22 7,1 1,4
IgGl 76 66 6,6 CM m 5,2 11,1 45 19 45 135 43 441 299
Rekonstituens nincs nincs nincs nincs 150 mM NaCl1 150 mM NaCl1 tM O cu 3 tn 3- O O m tsi O cu 2 5 0 0 m τΊ<ΞΗ Bri οζ 50 μg MPL1 puffer1 1 nincs nincs
Tartósító ω CU 1 CM 2-PE 2-PE 2-PE nincs nincs nincs nincs nincs nincs nincs 2-PE 2-PE
Szilárdító ágens nincs nincs nincs nincs 3,15% laktóz 3,15% laktóz 3,15% laktóz 3,15% laktóz 3,15% laktóz 3,15% laktóz 1 3,15% laktóz nincs nincs
Inununstimuláns nincs nincs nincs nincs nincs nincs nincs nincs nincs nincs MPL (50 ug) MPL (50 ug) MPL (50 ug)
AIPO4 (/500 pl) 500 μg 500 μg 0 pg 0 pg 0 pg O' 3. 0 órt 0 bri 0 0 pg 0 pg 0 pg 500 pg 500 pg
PS (/500 pl) 1 ug 5 pg 1 pg 5 pg őri x 5 pg o> 3. 5 pg 1 pg 5 pg O' 3. O' 3- 5 pg
Fizikai állapot folyadék folyadék folyadék folyadék lio lio lio lio lio lio lio folyadék folyadék
oltás előtt; ±2 órával oltás előtt; 3 2-fenoxietanol

Claims (18)

  1. - 106 SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Immunogén készítmény, amely poliszacharid-konjugátum antigének sokaságát tartalmazza, amelyek a Haemophilus influenzae protein D fehérjéjéhez vagy annak fragmenséhez konjugált patogén baktériumból származó poliszacharid-antigénből állnak.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti immunogén készítmény, amely poliszacharid-antigénként Salmonella typhi Vi-poliszacharidok, meningokokkusz poliszacharidok, B-csoportos meningokokkusz poliszacharidok és módosított poliszacharidok, Staphylococcus aureus poliszacharidok, Streptococcus agalactiae poliszacharidok, Streptococcus pneumoniae poliszacharidok, mikobaktériumok poliszacharidok, Cryptococcus neoformans poliszacharidok, nem tipizálható Haemophilus influenzae lipopoliszacharidok, Haemophilus influenzae b burok-poliszacharidok, Moraxella catharralis lipopoliszacharidok, Shigella sonnei lipopoliszacharidok, vagy Trypanosoma cruzi lipopeptidofoszfoglikán (LPPG) bármelyikét tartalmazza.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti immunogén készítmény, amely legalább négy Streptococcus pneumoniae szerotípus poliszacharid- antigénjeit tartalmazza.
  4. 4. A 2. vagy 3. igénypont szerinti immunogén készítmény, amely legalább egy Streptococcus pneumoniae fehérjeantigént is tartalmaz.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti immunogén készítmény, amely fehérjeantigénként a Streptococcus pneumoniae külső felszí
    - 107 ni fehérjéjét vagy szekretált fehérjéjét, vagy annak immunológiailag funkcionális ekvivalensét tartalmazza.
  6. 6. A 4. vagy 5. igénypont szerinti immunogén készítmény, amely fehérjeantigénként a Streptococcus pneumoniae toxinját, adhezinjét vagy lipoproteinjét, vagy annak immunológiailag funkcionális ekvivalensét tartalmazza.
  7. 7. A 4-6. igénypontok bármelyike szerinti immunogén készítmény, amely fehérjeantigénként, vagy annak immunológiailag funkcionális ekvivalenseként pneumolizin, PspA vagy annak transzmembrán-deletált variánsa, PspC vagy annak transzmembrán-deletált variánsa, PsaA vagy annak transzmembrán-deletált variánsa, gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz, vagy CbpA vagy annak transzmembrán-deletált variánsa bármelyikét tartalmazza.
  8. 8. A 2. igénypont szerinti immunogén készítmény, amelyben a protein D-hez konjugált fehérjeantigének az N. meningitidis A., C vagy Y szerotípusainak kombinációjából származnak.
  9. 9. Immunogén készítmény, amely a Haemophilus influenzae b, a meningokokkusz C és a meningokokkusz Y konjugált burok-poliszacharidjait tartalmazza, ahol a konjugált burokpoliszacharid-antigének H. influenzae protein D fehérjéjéhez vannak konjugálva, azzal a kikötéssel, hogy a Haemophilus influenzae b burok-poliszacharidja tetanusztoxoidhoz van konjugálva.
  10. 10. Immunogén készítmény, amely a Streptococcus pneumoniae, a Haemophilus influenzae b, a meningokokkusz C és a meningokokkusz Y konjugált burok-poliszacharidjait
    - 108 tartalmazza, ahol a konjugált burok-poliszacharid-antigének a H. influenzae protein D fehérjéjéhez vannak konjugálva, azzal a kikötéssel, hogy a Haemophilus influenzae b burokpoliszacharidja tetanusz-toxoidhoz van konjugálva.
  11. 11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti immunogén készítmény, amely adjuvánst is tartalmaz.
  12. 12. A 11. igénypont szerinti immunogén készítmény, amelyben a poliszacharid-protein D-konjugátum antigének alumínium-foszfátra vannak abszorbeálva.
  13. 13. A 11. igénypont szerinti immunogén készítmény, amely adjuvánsként egy Thl-válasz preferenciális indukálószerét tartalmazza.
  14. 14. A 13. igénypont szerinti immunogén készítmény, amely adjuvánsként az alábbiak legalább egyikét tartalmazza: 3D-MPL, szaponin immunstimuláns vagy immunstimuláns hatású CgP-oligonukleotid.
  15. 15. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti immunogén készítmény, gyógyszerként történő alkalmazásra.
  16. 16. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti immunogén készítményt tartalmazó oltóanyag.
  17. 17. Eljárás patogén baktériumok sokasága elleni immunogén készítmény előállítására azzal jellemezve, hogy a patogén baktériumokból poliszacharid-antigének sokaságát izoláljuk;
    a poliszacharidokat aktiváljuk;
    a poliszacharidokat a H. influenzae protein D fehérjéjéhez konjugáljuk; és a konjugált poliszacharidokat összekeverjük.
    - 109 -
  18. 18. Eljárás patogén baktériummal való fertőzéstől szenvedő, vagy arra fogékony beteg kezelésére azzal jellemezve, hogy 1-17. igénypontok bármelyike szerinti immunogén készítmény hatásos mennyiségét beadjuk.
    A meghatalmazott:
    DANUBIA c
    Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.
    Molnár Imre szabadalmi ügyvivő
HU0200367A 1999-03-19 2000-03-17 Sztreptokokkusz oltóanyag HU229968B1 (hu)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HUS1500040C HUS1500040I1 (hu) 1999-03-19 2015-07-14 Sztreptokokkusz oltóanyag

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB9906437.0 1999-03-19
GBGB9906437.0A GB9906437D0 (en) 1999-03-19 1999-03-19 Vaccine
GBGB9909077.1A GB9909077D0 (en) 1999-04-20 1999-04-20 Novel compositions
GB9909077.1 1999-04-20
GBGB9909466.6A GB9909466D0 (en) 1999-04-23 1999-04-23 Vaccines
GB9909466.6 1999-04-23
GB9916677.9 1999-07-15
GBGB9916677.9A GB9916677D0 (en) 1999-07-15 1999-07-15 Vaccine
PCT/EP2000/002468 WO2000056360A2 (en) 1999-03-19 2000-03-17 Vaccine against antigens from bacteriae

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUP0200367A2 true HUP0200367A2 (en) 2002-05-29
HU229968B1 HU229968B1 (hu) 2015-03-30

Family

ID=27451884

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0200664A HUP0200664A2 (en) 1999-03-19 2000-03-17 Streptococcus vaccine
HU0200373A HU228499B1 (en) 1999-03-19 2000-03-17 Streptococcus vaccine
HU0200367A HU229968B1 (hu) 1999-03-19 2000-03-17 Sztreptokokkusz oltóanyag
HUS1500040C HUS1500040I1 (hu) 1999-03-19 2015-07-14 Sztreptokokkusz oltóanyag

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0200664A HUP0200664A2 (en) 1999-03-19 2000-03-17 Streptococcus vaccine
HU0200373A HU228499B1 (en) 1999-03-19 2000-03-17 Streptococcus vaccine

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HUS1500040C HUS1500040I1 (hu) 1999-03-19 2015-07-14 Sztreptokokkusz oltóanyag

Country Status (32)

Country Link
US (8) US20030147922A1 (hu)
EP (6) EP1776962A1 (hu)
JP (4) JP4846906B2 (hu)
KR (3) KR20020000785A (hu)
CN (3) CN1192798C (hu)
AR (3) AR022963A1 (hu)
AT (3) ATE459373T1 (hu)
AU (3) AU750788B2 (hu)
BE (1) BE1025464I2 (hu)
BR (4) BR0009163A (hu)
CA (3) CA2366152A1 (hu)
CY (3) CY1107561T1 (hu)
CZ (3) CZ20013378A3 (hu)
DE (4) DE122009000054I1 (hu)
DK (2) DK1163000T3 (hu)
ES (3) ES2300255T3 (hu)
FR (1) FR10C0008I2 (hu)
HK (3) HK1043728B (hu)
HU (4) HUP0200664A2 (hu)
IL (5) IL145043A0 (hu)
LU (1) LU91652I2 (hu)
MX (1) MXPA01009452A (hu)
MY (2) MY125202A (hu)
NL (1) NL300415I1 (hu)
NO (4) NO330736B1 (hu)
NZ (3) NZ513841A (hu)
PL (3) PL355178A1 (hu)
PT (2) PT1163000E (hu)
SI (2) SI1162999T1 (hu)
TR (3) TR200102739T2 (hu)
TW (3) TWI286938B (hu)
WO (3) WO2000056358A2 (hu)

Families Citing this family (291)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US20030157129A1 (en) * 1995-06-23 2003-08-21 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccine comprising a polysaccharide antigen - carrier protein conjugate and free carrier protein
US7078042B2 (en) * 1995-09-15 2006-07-18 Uab Research Foundation Pneumococcal surface protein C (PspC), epitopic regions and strain selection thereof, and uses therefor
EP0909323B1 (en) 1996-01-04 2007-02-28 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Helicobacter pylori bacterioferritin
FR2763244B1 (fr) 1997-05-14 2003-08-01 Pasteur Merieux Serums Vacc Composition vaccinale multivalente a porteur mixte
US20010016200A1 (en) 1998-04-23 2001-08-23 Briles David E. Pneumococcal surface protein C (PspC), epitopic regions and strain selection thereof, and uses therefor
DK1077722T3 (da) 1998-05-22 2006-11-27 Ottawa Health Research Inst Fremgangsmåder og produkter til induktion af mukosaimmunitet
US6797275B1 (en) * 1998-12-04 2004-09-28 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of immunizing humans against Salmonella typhi using a Vi-rEPA conjugate vaccine
CA2366152A1 (en) * 1999-03-19 2000-09-28 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Streptococcus pneumoniae vaccine
GB9925559D0 (en) * 1999-10-28 1999-12-29 Smithkline Beecham Biolog Novel method
GB0108364D0 (en) * 2001-04-03 2001-05-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine composition
GB0022742D0 (en) * 2000-09-15 2000-11-01 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US7939087B2 (en) 2000-10-27 2011-05-10 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Nucleic acids and proteins from Streptococcus groups A & B
GB2370770B (en) * 2001-01-03 2005-06-01 Simon Connolly Uses of Streptococcus Vaccines
US7082569B2 (en) 2001-01-17 2006-07-25 Outlooksoft Corporation Systems and methods providing dynamic spreadsheet functionality
CA2435681C (en) 2001-01-23 2011-06-21 Aventis Pasteur Multivalent meningococcal polysaccharide-protein conjugate vaccine
EP1361890B1 (en) 2001-02-23 2011-03-30 GlaxoSmithKline Biologicals s.a. Influenza vaccine formulations for intradermal delivery
GB0107661D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Staphylococcus aureus
GB0107658D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Streptococcus pneumoniae
GB0109297D0 (en) 2001-04-12 2001-05-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
GB0115176D0 (en) * 2001-06-20 2001-08-15 Chiron Spa Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines
US8481043B2 (en) 2001-06-22 2013-07-09 Cpex Pharmaceuticals, Inc. Nasal immunization
GB0118249D0 (en) 2001-07-26 2001-09-19 Chiron Spa Histidine vaccines
GB0121591D0 (en) 2001-09-06 2001-10-24 Chiron Spa Hybrid and tandem expression of neisserial proteins
AR045702A1 (es) 2001-10-03 2005-11-09 Chiron Corp Composiciones de adyuvantes.
ES2386386T3 (es) 2001-12-12 2012-08-20 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Inmunización contra Chlamydia trachomatis
GB0130215D0 (en) * 2001-12-18 2002-02-06 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
JP4646516B2 (ja) 2002-02-20 2011-03-09 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド 吸着したポリペプチド含有分子を有する微粒子
NZ536859A (en) * 2002-05-14 2007-11-30 Chiron Srl Mucosal combination vaccines for bacterial meningitis
DE60328481D1 (de) * 2002-05-14 2009-09-03 Novartis Vaccines & Diagnostic Schleimhautapplizierter impfstoff, der das adjuvanz chitosan und menigokokkenantigene enthält
GB0302218D0 (en) 2003-01-30 2003-03-05 Chiron Sri Vaccine formulation & Mucosal delivery
GB0220194D0 (en) 2002-08-30 2002-10-09 Chiron Spa Improved vesicles
EP2351579B1 (en) 2002-10-11 2016-09-21 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Polypeptide vaccines for broad protection against hypervirulent meningococcal lineages
JP5116971B2 (ja) * 2002-10-15 2013-01-09 インターセル アーゲー Ｂ群連鎖球菌の接着因子をコードする核酸、ｂ群連鎖球菌の接着因子、およびその使用
CA2503871C (en) 2002-11-01 2012-12-11 Glaxosmithkline Biologicals S.A. An immunogenic composition for generating an immune response against polio virus
WO2004043405A2 (en) 2002-11-12 2004-05-27 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Polysaccharide vaccine for staphylococcal infections
CA2506318C (en) 2002-11-15 2011-07-12 Chiron Srl Unexpected surface proteins in neisseria meningitidis
GB0227346D0 (en) 2002-11-22 2002-12-31 Chiron Spa 741
US7956043B2 (en) 2002-12-11 2011-06-07 Coley Pharmaceutical Group, Inc. 5′ CpG nucleic acids and methods of use
EP2263687B1 (en) 2002-12-27 2015-03-25 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Immunogenic compositions containing phospholipid
FR2850106B1 (fr) 2003-01-17 2005-02-25 Aventis Pasteur Conjugues obtenus par amination reductrice du polysaccharide capsulaire du pneumocoque de serotype 5
DK1587537T3 (da) * 2003-01-30 2012-07-16 Novartis Ag Injicerbare vacciner mod multiple meningococ-serogrupper
NZ561879A (en) * 2003-03-07 2009-05-31 Wyeth Corp Polysaccharide - staphylococcal surface adhesin carrier protein conjugates for immunization against nosocomial infections
MXPA05009579A (es) * 2003-03-13 2005-11-17 Glaxosmithkline Biolog Sa Proceso de purificacion para citolisina bacteriana.
WO2004087153A2 (en) 2003-03-28 2004-10-14 Chiron Corporation Use of organic compounds for immunopotentiation
ES2596553T3 (es) 2003-06-02 2017-01-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Composiciones inmunogénicas a base de micropartículas que comprenden toxoide adsorbido y un antígeno que contiene un polisacárido
GB0323103D0 (en) 2003-10-02 2003-11-05 Chiron Srl De-acetylated saccharides
ES2397923T3 (es) * 2003-10-02 2013-03-12 Novartis Ag Vacunas líquidas para múltiples serogrupos meningocócicos
GB0406013D0 (en) 2004-03-17 2004-04-21 Chiron Srl Analysis of saccharide vaccines without interference
RU2379052C2 (ru) 2004-04-30 2010-01-20 Чирон С.Р.Л. Вакцинация менингококковыми конъюгатами
GB0409745D0 (en) 2004-04-30 2004-06-09 Chiron Srl Compositions including unconjugated carrier proteins
GB0500787D0 (en) 2005-01-14 2005-02-23 Chiron Srl Integration of meningococcal conjugate vaccination
US7444197B2 (en) * 2004-05-06 2008-10-28 Smp Logic Systems Llc Methods, systems, and software program for validation and monitoring of pharmaceutical manufacturing processes
GB0410866D0 (en) 2004-05-14 2004-06-16 Chiron Srl Haemophilius influenzae
GB0411387D0 (en) 2004-05-21 2004-06-23 Chiron Srl Analysis of saccharide length
GB0413868D0 (en) 2004-06-21 2004-07-21 Chiron Srl Dimensional anlaysis of saccharide conjugates
CA2571421A1 (en) 2004-06-24 2006-01-05 Nicholas Valiante Compounds for immunopotentiation
EP1768662A2 (en) 2004-06-24 2007-04-04 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Small molecule immunopotentiators and assays for their detection
WO2006078318A2 (en) 2004-07-29 2006-07-27 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Immunogenic compositions for gram positive bacteria such as streptococcus agalactiae
GB0424092D0 (en) 2004-10-29 2004-12-01 Chiron Srl Immunogenic bacterial vesicles with outer membrane proteins
CN101107007B (zh) 2005-01-27 2011-08-17 奥克兰儿童医院及研究中心 对脑膜炎奈瑟球菌所致疾病具有广谱保护作用的gna1870囊泡疫苗
GB0502095D0 (en) 2005-02-01 2005-03-09 Chiron Srl Conjugation of streptococcal capsular saccharides
JP2008530245A (ja) 2005-02-18 2008-08-07 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド 尿路病原性菌株由来の抗原
AU2006214064B2 (en) 2005-02-18 2012-04-26 J. Craig Venter Institute, Inc. Proteins and nucleic acids from meningitis/sepsis-associated escherichia coli
GB0505518D0 (en) * 2005-03-17 2005-04-27 Chiron Srl Combination vaccines with whole cell pertussis antigen
US20070184072A1 (en) 2005-04-08 2007-08-09 Wyeth Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
IL308456A (en) * 2005-04-08 2024-01-01 Wyeth Llc A multivalent pneumomuroral protein-polysaccharide conjugate preparation
US7955605B2 (en) 2005-04-08 2011-06-07 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
US7709001B2 (en) * 2005-04-08 2010-05-04 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
EP1871411A4 (en) 2005-04-18 2010-07-21 Novartis Vaccines & Diagnostic EXPRESSION OF HEPATITIS B VIRUS SURFACE ANTIGEN FOR VACCINE MANUFACTURE
HUE045482T2 (hu) * 2005-06-27 2019-12-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogén készítmény
CN102973929B (zh) 2005-09-01 2017-04-26 诺华疫苗和诊断有限两合公司 含血清群c脑膜炎球菌的多价疫苗
GB0522765D0 (en) 2005-11-08 2005-12-14 Chiron Srl Combination vaccine manufacture
WO2007081447A2 (en) 2005-11-22 2007-07-19 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Norovirus and sapovirus antigens
GB0524066D0 (en) 2005-11-25 2006-01-04 Chiron Srl 741 ii
TWI457133B (zh) 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
JP5792920B2 (ja) * 2005-12-22 2015-10-14 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム ワクチン
GB0607088D0 (en) 2006-04-07 2006-05-17 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
MX2008009280A (es) * 2006-01-17 2008-12-12 Arne Forsgren Una nueva proteina de haemophilus influenzae expuesta en la superficie (proteina e; pe).
CN101024079B (zh) * 2006-02-17 2012-02-01 福州昌晖生物工程有限公司 肺炎链球菌多糖-外膜蛋白结合疫苗及制备方法
KR101838938B1 (ko) * 2006-03-17 2018-03-15 더 거버먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카 에즈 레프리젠티드 바이 더 세크러테리 오브 더 디파트먼트 오브 헬스 앤드 휴먼 서비시즈 복합 다가 면역원성 콘쥬게이트의 제조 방법
US10828361B2 (en) 2006-03-22 2020-11-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Regimens for immunisation with meningococcal conjugates
NZ572054A (en) 2006-03-22 2011-12-22 Novartis Ag Regimens for immunisation with meningococcal conjugates
GB0605757D0 (en) 2006-03-22 2006-05-03 Chiron Srl Separation of conjugated and unconjugated components
ATE539079T1 (de) 2006-03-23 2012-01-15 Novartis Ag Imidazochinoxalinverbindungen als immunmodulatoren
JO3418B1 (ar) * 2006-03-30 2019-10-20 Glaxosmithkline Biologicals Sa عملية اقتران خاصة ب pnag وبروتين حامل
NZ570805A (en) * 2006-03-30 2011-10-28 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine comprising Type 5 and Type 8 capsular polysaccharides from Staphyloccocus aureus
TW200806315A (en) 2006-04-26 2008-02-01 Wyeth Corp Novel formulations which stabilize and inhibit precipitation of immunogenic compositions
US8808707B1 (en) 2006-05-08 2014-08-19 Wyeth Llc Pneumococcal dosing regimen
DK2054431T3 (da) * 2006-06-09 2012-01-02 Novartis Ag Konformere af bakterielle adhæsiner
GB0612854D0 (en) 2006-06-28 2006-08-09 Novartis Ag Saccharide analysis
EP2586790A3 (en) 2006-08-16 2013-08-14 Novartis AG Immunogens from uropathogenic Escherichia coli
CA2665169C (en) * 2006-10-10 2017-02-21 Wyeth Purification of streptococcus pneumoniae type 3 polysaccharides
GB0700136D0 (en) 2007-01-04 2007-02-14 Glaxosmithkline Biolog Sa Process for manufacturing vaccines
GB0700562D0 (en) 2007-01-11 2007-02-21 Novartis Vaccines & Diagnostic Modified Saccharides
EA200901578A1 (ru) * 2007-06-26 2010-08-30 Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. Вакцина, содержащая конъюгаты капсульных полисахаридов streptococcus pneumoniae
GB0713880D0 (en) 2007-07-17 2007-08-29 Novartis Ag Conjugate purification
GB0714963D0 (en) 2007-08-01 2007-09-12 Novartis Ag Compositions comprising antigens
US8287885B2 (en) 2007-09-12 2012-10-16 Novartis Ag GAS57 mutant antigens and GAS57 antibodies
HRP20120433T1 (en) 2007-10-19 2012-07-31 Novartis@Ag Meningococcal vaccine formulations
US20090124573A1 (en) 2007-11-09 2009-05-14 Sarkis Mazmanian Immunomodulating compounds and related compositions and methods
AU2008335457B2 (en) 2007-12-07 2015-04-16 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Compositions for inducing immune responses
GB0818453D0 (en) 2008-10-08 2008-11-12 Novartis Ag Fermentation processes for cultivating streptococci and purification processes for obtaining cps therefrom
NZ586430A (en) 2007-12-21 2012-09-28 Novartis Ag Mutant forms of streptolysin o (slo)
US8226959B2 (en) * 2008-02-01 2012-07-24 Newcastle Innovation Pty Ltd Vaccine compositions
AU2009215364B2 (en) 2008-02-21 2014-09-18 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Meningococcal fHBP polypeptides
AU2009223613B2 (en) 2008-03-10 2014-09-25 Children's Hospital & Research Center At Oakland Chimeric factor H binding proteins (fHBP) containing a heterologous B domain and methods of use
CN102159540B (zh) 2008-07-21 2015-08-12 布赖汉姆妇女医院 与合成的β-1,6葡糖胺寡糖相关的方法和组合物
PT2349520T (pt) 2008-10-27 2016-08-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Método de purificação para hidrato de carbono de estreptococos grupo a
BRPI0922561A2 (pt) 2008-12-09 2020-08-11 Pfizer Vaccines Llc vacina de peptídeo de ch3 da ige.
GB0822634D0 (en) 2008-12-11 2009-01-21 Novartis Ag Meningitis vaccines
GB0822633D0 (en) 2008-12-11 2009-01-21 Novartis Ag Formulation
AU2009329193A1 (en) 2008-12-17 2011-07-14 Novartis Ag Meningococcal vaccines including hemoglobin receptor
CA2748788C (en) 2009-01-05 2021-02-09 Epitogenesis Inc. The use of a composition comprising mustard oil, catechin, and vitamin a for modulating an immune response
WO2010079464A1 (en) 2009-01-12 2010-07-15 Novartis Ag Cna_b domain antigens in vaccines against gram positive bacteria
CN104548082A (zh) 2009-03-24 2015-04-29 诺华股份有限公司 为脑膜炎球菌因子h结合蛋白添加佐剂
EP3017826A1 (en) 2009-03-24 2016-05-11 Novartis AG Combinations of meningococcal factor h binding protein and pneumococcal saccharide conjugates
EP2419129A2 (en) 2009-04-14 2012-02-22 Novartis AG Compositions for immunising against staphylococcus aerus
WO2010132833A1 (en) 2009-05-14 2010-11-18 The Regents Of The University Of Michigan Streptococcus vaccine compositions and methods of using the same
AU2010264538B2 (en) 2009-06-22 2013-10-03 Wyeth Llc Immunogenic compositions of Staphylococcus aureus antigens
WO2011041003A2 (en) 2009-06-22 2011-04-07 Wyeth Llc Compositions and methods for preparing staphylococcus aureus serotype 5 and 8 capsular polysaccharide conjugate immunogenic compositions
WO2011017101A2 (en) * 2009-07-27 2011-02-10 Fina Biosolutions, Llc Method for producing protein-carbohydrate vaccines reduced in free carbohydrate
CN102596236B (zh) 2009-07-30 2015-06-24 辉瑞疫苗有限责任公司 抗原性Tau肽及其用途
WO2011024072A2 (en) 2009-08-27 2011-03-03 Novartis Ag Hybrid polypeptides including meningococcal fhbp sequences
KR101660578B1 (ko) * 2009-09-03 2016-09-27 화이자 백신스 엘엘씨 Ｐｃｓｋ９ 백신
CN102695523A (zh) 2009-09-10 2012-09-26 诺华有限公司 针对呼吸道疾病的组合疫苗
CA2779816A1 (en) 2009-10-27 2011-05-05 Novartis Ag Modified meningococcal fhbp polypeptides
PT2493498T (pt) 2009-10-30 2017-05-24 Glaxosmithkline Biologicals Sa Purificação de sacáridos capsulares de staphylococcus aureus tipo 5 e tipo 8
GB0919690D0 (en) 2009-11-10 2009-12-23 Guy S And St Thomas S Nhs Foun compositions for immunising against staphylococcus aureus
BR122022002139B1 (pt) 2009-12-17 2022-08-23 Fina Biosolutions, Llc Processo de conjugação de carboidratos na preparação de vacinas conjugadas e suas respectivas vacinas
SG181628A1 (en) 2009-12-22 2012-07-30 Celldex Therapeutics Inc Vaccine compositions
GB201003333D0 (en) 2010-02-26 2010-04-14 Novartis Ag Immunogenic proteins and compositions
GB201003922D0 (en) 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
TR201802933T4 (tr) 2010-03-30 2018-03-21 Childrens Hospital & Res Center At Oakland Özellikleri değiştirilmiş faktör h bağlama proteinleri (fhbp) ve bunların kullanım yöntemi.
GB201005625D0 (en) 2010-04-01 2010-05-19 Novartis Ag Immunogenic proteins and compositions
HUE040658T2 (hu) 2010-04-07 2019-03-28 California Inst Of Techn Vivõanyag vegyület mukózus membránhoz juttatásához és kapcsolódó készítmények, eljárások és rendszerek
WO2011146910A1 (en) * 2010-05-20 2011-11-24 Round June L Antigen specific tregs and related compositions, methods and systems
CN102933267B (zh) 2010-05-28 2015-05-27 泰特里斯在线公司 交互式混合异步计算机游戏基础结构
EP3626263A1 (en) * 2010-06-04 2020-03-25 Wyeth LLC Vaccine formulations
EP2575868A1 (en) 2010-06-07 2013-04-10 Pfizer Vaccines LLC Ige ch3 peptide vaccine
CA2798837A1 (en) 2010-06-07 2011-12-15 Pfizer Inc. Her-2 peptides and vaccines
WO2011161653A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Novartis Ag Combinations of meningococcal factor h binding proteins
GB201101665D0 (en) 2011-01-31 2011-03-16 Novartis Ag Immunogenic compositions
US20130315959A1 (en) 2010-12-24 2013-11-28 Novartis Ag Compounds
US10286056B2 (en) 2011-01-27 2019-05-14 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Adjuvant nanoemulsions with crystallisation inhibitors
CN103533954B (zh) 2011-03-02 2015-09-09 诺华股份有限公司 含较低剂量的抗原和/或佐剂的联合疫苗
GB201103836D0 (en) 2011-03-07 2011-04-20 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
US10357568B2 (en) 2011-03-24 2019-07-23 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Adjuvant nanoemulsions with phospholipids
EP2511295A1 (en) 2011-04-15 2012-10-17 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Compositions for preventing and/or treating an infection by an HIV-1 virus
WO2012154072A1 (ru) 2011-05-06 2012-11-15 Aparin Petr Gennadievich Экзополисахарид бактерии shigella sonnei, способ его получения и включающие его вакцина и фармацевтическая композиция
EP2723378A4 (en) 2011-06-24 2015-01-28 Epitogenesis Inc PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS COMPRISING A COMBINATION OF VECTORS, VITAMINS, TANNINS AND FLAVONOIDS SELECTED AS ANTIGEN-SPECIFIC IMMUNOMODULATORS
CN103764171B (zh) 2011-07-08 2016-08-17 诺华股份有限公司 酪氨酸连接方法
GB201114923D0 (en) 2011-08-30 2011-10-12 Novartis Ag Immunogenic proteins and compositions
EP2755683B1 (en) 2011-09-14 2019-04-03 GlaxoSmithKline Biologicals SA Methods for making saccharide-protein glycoconjugates
WO2013043518A1 (en) 2011-09-22 2013-03-28 Merck Sharp & Dohme Corp. Imidazopyridyl compounds as aldosterone synthase inhibitors
RU2636350C2 (ru) 2011-11-07 2017-11-22 Новартис Аг МОЛЕКУЛА, СОДЕРЖАЩАЯ SPR0096 и SPR2021
GB2495341B (en) 2011-11-11 2013-09-18 Novartis Ag Fermentation methods and their products
DE102011122891B4 (de) 2011-11-11 2014-12-24 Novartis Ag Fermentationsmedium, das frei von tierischen Bestandteilen ist, zur Herstellung von Diphtherie-Toxoiden zur Verwendung bei der Impfung von Menschen
EP2592137A1 (en) 2011-11-11 2013-05-15 Novartis AG Fermentation media free of animal-derived components for production of diphtheria toxoids suitable for human vaccine use
DE102011118371B4 (de) 2011-11-11 2014-02-13 Novartis Ag Zur Impfung von Menschen geeignete Zusammensetzung, die ein Diphtherie-Toxoid umfasst, sowie Verfahren zu deren Herstellung
AU2012349753A1 (en) 2011-12-08 2014-06-19 Novartis Ag Clostridium difficile toxin-based vaccine
GB201121301D0 (en) 2011-12-12 2012-01-25 Novartis Ag Method
EP2797624A1 (en) 2011-12-29 2014-11-05 Novartis AG Adjuvanted combinations of meningococcal factor h binding proteins
CN104321335A (zh) 2012-02-24 2015-01-28 诺华股份有限公司 菌毛蛋白质和组合物
WO2013131983A1 (en) 2012-03-07 2013-09-12 Novartis Ag Adjuvanted formulations of streptococcus pneumoniae antigens
EP2822584A1 (en) 2012-03-08 2015-01-14 Novartis AG Combination vaccines with tlr4 agonists
SA115360586B1 (ar) 2012-03-09 2017-04-12 فايزر انك تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها
SG10201608980YA (en) 2012-04-26 2016-12-29 Novartis Ag Antigens and antigen combinations
US10279026B2 (en) 2012-04-26 2019-05-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Antigens and antigen combinations
PL2844282T3 (pl) 2012-05-04 2019-11-29 Pfizer Antygeny związane z gruczołem krokowym i schematy immunoterapii oparte na szczepionce
EP2852414B9 (en) 2012-05-22 2020-12-09 GlaxoSmithKline Biologicals SA Meningococcus serogroup x conjugate
KR102057217B1 (ko) 2012-06-20 2020-01-22 에스케이바이오사이언스 주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
BR112015005056A2 (pt) 2012-09-06 2017-11-21 Novartis Ag vacinas de combinação com sorogrupo b meningococcus e d/t/p
CN104582718B (zh) 2012-10-03 2017-10-24 诺华股份有限公司 免疫原性组合物
EP2906239A1 (en) 2012-10-12 2015-08-19 GlaxoSmithKline Biologicals SA Non-cross-linked acellular pertussis antigens for use in combination vaccines
WO2014060385A1 (en) * 2012-10-17 2014-04-24 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogenic composition
US20140193451A1 (en) * 2012-10-17 2014-07-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition
KR20140075196A (ko) 2012-12-11 2014-06-19 에스케이케미칼주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
KR20140075201A (ko) * 2012-12-11 2014-06-19 에스케이케미칼주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
US9827190B2 (en) 2013-02-01 2017-11-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Intradermal delivery of immunological compositions comprising toll-like receptor 7 agonists
WO2014182966A1 (en) 2013-05-10 2014-11-13 California Institute Of Technology Probiotic prevention and treatment of colon cancer
CN112999344A (zh) 2013-05-15 2021-06-22 阿尔伯达大学董事会 E1e2 hcv疫苗及使用方法
CN103386126B (zh) * 2013-06-25 2015-06-17 北京科兴生物制品有限公司 一种含肠道病毒抗原的多价免疫原性组合物
RU2662968C2 (ru) 2013-09-08 2018-07-31 Пфайзер Инк. Иммуногенная композиция против neisseria meningitidis (варианты)
WO2015095868A1 (en) * 2013-12-20 2015-06-25 Wake Forest University Health Sciences Methods and compositions for increasing protective antibody levels induced by pneumococcal polysaccharide vaccines
BR112016015835B1 (pt) 2014-01-21 2023-12-26 Pfizer Inc Processo de preparação de conjugados compreendendo polissacarídeos capsulares de streptococcus pneumoniae
US11160855B2 (en) 2014-01-21 2021-11-02 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
IL312327B2 (en) 2014-01-21 2026-02-01 Pfizer Immunogenic preparations comprising conjugated capsular saccharide antigens and their uses
EP3104877B1 (en) 2014-02-11 2020-01-22 The USA, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Pcsk9 vaccine and methods of using the same
CN106661092B (zh) 2014-02-28 2021-07-06 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 修饰的脑膜炎球菌fHbp多肽
EP2921856B1 (en) * 2014-03-18 2016-09-14 Serum Institute Of India Private Limited A quantitative assay for 4-pyrrolidinopyridine (4-ppy) in polysaccharide-protein conjugate vaccines
CN104829711B (zh) * 2014-04-08 2018-04-03 北京天成新脉生物技术有限公司 脑膜炎球菌荚膜多糖单克隆抗体及其应用
BR112017001417B1 (pt) 2014-07-23 2023-11-07 Children's Hospital & Research Center At Oakland Variantes da proteína de ligação ao fator h (fhbp), composição imunogênica e uso de uma fhbp variante referência cruzada
US9107906B1 (en) 2014-10-28 2015-08-18 Adma Biologics, Inc. Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency
EP3034516A1 (en) 2014-12-19 2016-06-22 Novartis AG Purification of streptococcal capsular polysaccharide
PL3244917T3 (pl) 2015-01-15 2023-07-17 Pfizer Inc. Kompozycje immunogenne do zastosowania w szczepionkach przeciwko pneumokokom
CN104548090B (zh) * 2015-01-27 2016-11-30 中国科学院过程工程研究所 一种β-葡聚糖修饰的脑膜炎多糖结合疫苗及其制备方法
WO2016184963A1 (en) 2015-05-19 2016-11-24 Innavirvax Treatment of hiv-infected individuals
WO2016201342A1 (en) 2015-06-10 2016-12-15 California Institute Of Technology Sepsis treatment and related compositions methods and systems
EP3109255A1 (en) 2015-06-26 2016-12-28 Institut National De La Recherche Agronomique Immunogenic composition
EP3319988A1 (en) 2015-07-07 2018-05-16 Affiris AG Vaccines for the treatment and prevention of ige mediated diseases
KR20250058066A (ko) 2015-07-21 2025-04-29 화이자 인코포레이티드 접합된 캡슐형 사카라이드 항원을 포함하는 면역원성 조성물, 그를 포함하는 키트 및 그의 용도
CN107921113B (zh) 2015-08-25 2026-08-11 巴比塔·阿格拉沃尔 免疫调节组合物及其使用方法
CN117229414A (zh) 2015-10-08 2023-12-15 艾伯塔大学理事会 丙型肝炎病毒e1/e2异二聚体及其生产方法
GB201518684D0 (en) 2015-10-21 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
US10786561B2 (en) 2015-11-20 2020-09-29 Pfizer Inc. Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines
MX2018006785A (es) 2015-12-04 2018-11-09 Dana Farber Cancer Inst Inc Vacunacion con el dominio alfa 3 de mica/b para el tratamiento del cancer.
WO2017117539A1 (en) 2015-12-30 2017-07-06 Northwestern University Cell-free glycoprotein synthesis (cfgps) in prokaryotic cell lysates enriched with components for glycosylation
CA2954892A1 (en) 2016-01-19 2017-07-19 Pfizer Inc. Immunogens derived from tumor-associated antigens or nucleic acid molecules encoding the immunogens
WO2017175082A1 (en) 2016-04-05 2017-10-12 Gsk Vaccines S.R.L. Immunogenic compositions
EP3474890B1 (en) * 2016-06-22 2026-05-06 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
US10829795B2 (en) 2016-07-14 2020-11-10 Northwestern University Method for rapid in vitro synthesis of glycoproteins via recombinant production of N-glycosylated proteins in prokaryotic cell lysates
US11224652B2 (en) 2016-08-05 2022-01-18 Sanofi Pasteur Inc. Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
EP3493837B1 (en) 2016-08-05 2022-08-31 Sanofi Pasteur, Inc. Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
JP7104027B2 (ja) 2016-09-02 2022-07-20 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 淋菌に対するワクチン
CN117801069A (zh) 2016-10-07 2024-04-02 恩特罗姆公司 用于癌症疗法的免疫原性化合物
IL296165B2 (en) 2016-10-07 2023-10-01 Enterome S A Immunogenic compounds for cancer treatment
BE1025162B9 (fr) 2016-12-06 2019-01-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Procede de purification pour les polysaccharides capsulaires
BR112019014833A2 (pt) 2017-01-20 2020-04-14 Pfizer composições imunogênicas para uso em vacinas pneumococais
SG11201906519RA (en) 2017-01-31 2019-08-27 Pfizer Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
WO2018169303A1 (ko) * 2017-03-15 2018-09-20 주식회사 엘지화학 다가 폐렴구균 백신 조성물
US11167022B2 (en) 2017-03-31 2021-11-09 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Immunogenic composition, use and method of treatment
WO2018178265A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Immunogenic composition, use and method of treatment
MX2019014829A (es) 2017-06-10 2020-08-17 Inventprise Llc Vacunas de conjugado multivalente con polisacáridos de conjugado bivalente o multivalente que proporcionan inmunogenicidad y avidez mejoradas.
US10729763B2 (en) 2017-06-10 2020-08-04 Inventprise, Llc Mixtures of polysaccharide-protein pegylated compounds
GB201711635D0 (en) 2017-07-19 2017-08-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition
JP2020530478A (ja) 2017-08-14 2020-10-22 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 免疫応答を強化する方法
EP3691677A4 (en) 2017-10-04 2021-07-07 Pogona, Llc COMPOSITIONS OF SACCHARIDE-POLYPEPTIDE CONJUGATES AND THEIR METHODS OF USE
EP3720483B1 (en) 2017-12-06 2025-11-19 Merck Sharp & Dohme LLC Compositions comprising streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof
WO2019152921A1 (en) 2018-02-05 2019-08-08 Sanofi Pasteur Inc. Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
BR112020015696A2 (pt) 2018-02-05 2020-12-08 Sanofi Pasteur, Inc. Composição de conjugado polissacarídeo-proteína pneumocócico multivalente
US11633471B2 (en) 2018-03-06 2023-04-25 Unm Rainforest Innovations Compositions and methods for reducing serum triglycerides
US20210106652A1 (en) 2018-04-11 2021-04-15 Enterome S.A. Immunogenic Compounds For Treatment Of Fibrosis, Autoimmune Diseases And Inflammation
ES2935702T3 (es) 2018-04-11 2023-03-09 Enterome S A Péptidos antigénicos para la prevención y el tratamiento del cáncer
TW202011985A (zh) 2018-04-18 2020-04-01 韓商Ｓｋ生物科學股份有限公司 肺炎鏈球菌的莢膜多醣類以及其免疫原性接合體
WO2020016322A1 (en) 2018-07-19 2020-01-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Processes for preparing dried polysaccharides
BR112021000965A2 (pt) 2018-08-07 2021-04-27 Glaxosmithkline Biologicals S.A. processos e vacinas
US11260119B2 (en) 2018-08-24 2022-03-01 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
JP7551618B2 (ja) 2018-12-12 2024-09-17 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム Ｏ－結合型グリコシル化のための修飾キャリアタンパク質
US20220016229A1 (en) 2018-12-12 2022-01-20 Pfizer Inc. Immunogenic Multiple Hetero-Antigen Polysaccharide-Protein Conjugates and uses thereof
EP3897705A2 (en) 2018-12-19 2021-10-27 Merck Sharp & Dohme Corp. Compositions comprising streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof
EP3908669A4 (en) 2019-01-11 2023-05-03 Northwestern University SYNTHESIS OF BIOCONJUGATED VACCINES IN PROKARYOT CELL LYSATE
US12397014B2 (en) 2019-02-05 2025-08-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Polysaccharide compositions for use in treating filariasis
EP3923982A1 (en) 2019-02-11 2021-12-22 Pfizer Inc. Neisseria meningitidiscompositions and methods thereof
JP7239509B6 (ja) 2019-02-22 2023-03-28 ファイザー・インク 細菌多糖類を精製するための方法
US20220184199A1 (en) 2019-04-10 2022-06-16 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof
US20220221455A1 (en) 2019-04-18 2022-07-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Antigen binding proteins and assays
CA3139257A1 (en) 2019-05-10 2020-11-19 Glaxosmithkline Biologicals Sa Conjugate production
WO2021023691A1 (en) 2019-08-05 2021-02-11 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition
JP2022543264A (ja) 2019-08-05 2022-10-11 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム プロテインｄポリペプチドを含む組成物を調製するプロセス
CA3155669A1 (en) 2019-09-27 2021-04-01 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
MX2022004598A (es) 2019-10-16 2022-09-23 Enterome S A Compuestos inmunogenicos para el tratamiento del cancer suprarrenal.
AU2020375214B2 (en) 2019-11-01 2024-02-08 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
PL4021487T3 (pl) 2019-11-15 2024-04-15 Enterome S.A. Peptydy antygenowe do zapobiegania i leczenia nowotworów złośliwych wywodzących się z limfocytów b
BR112022008761A2 (pt) 2019-11-22 2022-07-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Dosagem e administração de uma vacina de glicoconjugado de sacarídeo
US20220409539A1 (en) * 2019-12-30 2022-12-29 Fraunhofer Usa Inc. Particles for multi-dose delivery
CN115362177A (zh) 2020-02-21 2022-11-18 辉瑞公司 糖类的纯化
KR20220143910A (ko) 2020-02-23 2022-10-25 화이자 인코포레이티드 에스케리키아 콜라이 조성물 및 그의 방법
CN111588847B (zh) * 2020-05-18 2023-05-26 广州中医药大学(广州中医药研究院) 一种含有单磷酸化的脂质a与糖抗原的缀合物及其制备方法和应用
US20230250142A1 (en) 2020-06-12 2023-08-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Dock tag system
US12053515B2 (en) 2020-08-10 2024-08-06 Inventprise, Inc. Multivalent pneumococcal glycoconjugate vaccines containing emerging serotype 24F
MX2023004912A (es) 2020-10-27 2023-05-16 Pfizer Composiciones de escherichia coli y metodos de las mismas.
US12138302B2 (en) 2020-10-27 2024-11-12 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
CA3200602A1 (en) 2020-11-04 2022-05-12 Pfizer Inc. Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines
US20230405137A1 (en) 2020-11-10 2023-12-21 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
US12357681B2 (en) 2020-12-23 2025-07-15 Pfizer Inc. E. coli FimH mutants and uses thereof
TW202245836A (zh) 2021-02-19 2022-12-01 美商賽諾菲巴斯德公司 重組ｂ型腦膜炎球菌疫苗
EP4294433A1 (en) 2021-02-22 2023-12-27 GlaxoSmithKline Biologicals SA Immunogenic composition, use and methods
EP4070814A1 (en) 2021-04-07 2022-10-12 Lama France Sars-cov-2 polypeptides and uses thereof
CA3221075A1 (en) 2021-05-28 2022-12-01 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
JP7714690B2 (ja) 2021-05-28 2025-07-29 ファイザー・インク コンジュゲートさせた莢膜糖抗原を含む免疫原性組成物およびその使用
CA3224156A1 (en) 2021-06-28 2023-01-05 VST LLC dba Medgene Labs Sapovirus vaccines
EP4433080A1 (en) 2021-11-18 2024-09-25 Matrivax, Inc. Immunogenic fusion protein compositions and methods of use thereof
JP2025508749A (ja) 2022-01-13 2025-04-10 ファイザー・インク コンジュゲートさせた莢膜糖抗原を含む免疫原性組成物およびその使用
WO2023161817A1 (en) 2022-02-25 2023-08-31 Pfizer Inc. Methods for incorporating azido groups in bacterial capsular polysaccharides
AU2023246941A1 (en) 2022-03-31 2024-10-24 Enterome S.A. Antigenic peptides for prevention and treatment of cancer.
US20250312433A1 (en) 2022-05-11 2025-10-09 Pfizer Inc. Process for Producing of Vaccine Formulations With Preservatives
WO2024110827A1 (en) 2022-11-21 2024-05-30 Pfizer Inc. Methods for preparing conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
EP4622665A2 (en) 2022-11-22 2025-10-01 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
CN120513083A (zh) 2022-12-01 2025-08-19 辉瑞大药厂 肺炎链球菌缀合物疫苗制剂
WO2024166008A1 (en) 2023-02-10 2024-08-15 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
AU2024246082A1 (en) 2023-03-30 2025-10-16 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
PE20252779A1 (es) 2023-04-14 2025-12-22 Pfizer Composiciones inmunogenas que comprenden antigenos de sacarido capsular conjugados y usos de estos
WO2024224266A1 (en) 2023-04-24 2024-10-31 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
CN122249227A (zh) 2023-11-21 2026-06-19 万能药生物有限公司 与d蛋白偶联的流感嗜血杆菌的免疫原性组合物
WO2025133971A1 (en) 2023-12-23 2025-06-26 Pfizer Inc. Improved methods for producing bacterial capsular saccharide glycoconjugates
WO2025186705A2 (en) 2024-03-06 2025-09-12 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
TW202602467A (zh) 2024-03-11 2026-01-16 美商輝瑞股份有限公司 包含經共軛之大腸桿菌糖的免疫原性組成物及其用途
WO2025219904A1 (en) 2024-04-19 2025-10-23 Pfizer Inc. Improved methods for producing glycoconjugates by reductive amination in aprotic solvent
CN120404993B (zh) * 2025-07-03 2025-10-03 成都迈科康生物科技有限公司 一种检测样本中mpl的方法及其相关应用

Family Cites Families (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
US4372945A (en) 1979-11-13 1983-02-08 Likhite Vilas V Antigen compounds
IL61904A (en) 1981-01-13 1985-07-31 Yeda Res & Dev Synthetic vaccine against influenza virus infections comprising a synthetic peptide and process for producing same
BE889979A (fr) 1981-08-14 1982-02-15 Smith Kline Rit Procede de preparation de polysaccharides bacteriens capsulaires antigeniques purifies, produits obtenus et leur utilisation
US5360897A (en) * 1981-08-31 1994-11-01 The University Of Rochester Immunogenic conjugates of streptococcus pneumonial capsular polymer and toxin or in toxiad
US4761283A (en) * 1983-07-05 1988-08-02 The University Of Rochester Immunogenic conjugates
US4882317A (en) * 1984-05-10 1989-11-21 Merck & Co., Inc. Covalently-modified bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers and methods of preparing such polysaccharides and conjugataes and of confirming covalency
US5173294A (en) 1986-11-18 1992-12-22 Research Foundation Of State University Of New York Dna probe for the identification of haemophilus influenzae
US4912094B1 (en) * 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
JP3237842B2 (ja) 1988-12-16 2001-12-10 オランダ国 ニューモリシンミュータント及びそれから製造されたニューモコッカルワクチン
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
NZ239643A (en) * 1990-09-17 1996-05-28 North American Vaccine Inc Vaccine containing bacterial polysaccharide protein conjugate and adjuvant (c-nd-che-a-co-b-r) with a long chain alkyl group.
CA2059692C (en) * 1991-01-28 2004-11-16 Peter J. Kniskern Pneumoccoccal polysaccharide conjugate vaccine
US5476929A (en) 1991-02-15 1995-12-19 Uab Research Foundation Structural gene of pneumococcal protein
US6592876B1 (en) 1993-04-20 2003-07-15 Uab Research Foundation Pneumococcal genes, portions thereof, expression products therefrom, and uses of such genes, portions and products
US5552146A (en) 1991-08-15 1996-09-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions relating to useful antigens of Moraxella catarrhalis
DE69313134T2 (de) 1992-06-25 1998-02-26 Smithkline Beecham Biolog Adjuvantien enthaltende impfstoffzusammensetzung
EP0618813B1 (en) * 1992-09-16 2002-01-09 The University Of Tennessee Research Corporation Antigen of hybrid m protein and carrier for group a streptococcal vaccine
KR100310510B1 (ko) 1993-03-23 2002-07-04 장 스테판느 3-0-탈아세틸화모노포스포릴지질a를함유하는백신조성물
JP3429313B2 (ja) 1993-05-18 2003-07-22 オハイオ・ステイト・リサーチ・ファウンデーション 中耳炎ワクチン
EP0720485B1 (en) 1993-09-22 2003-11-19 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Method of activating soluble carbohydrate using novel cyanylating reagents for the production of immunogenic constructs
GB9326253D0 (en) * 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US5866135A (en) * 1994-04-21 1999-02-02 North American Vaccine, Inc. Group A streptococcal polysaccharide immunogenic compositions and methods
AU713040B2 (en) 1994-07-15 1999-11-18 University Of Iowa Research Foundation, The Immunomodulatory oligonucleotides
US5565204A (en) 1994-08-24 1996-10-15 American Cyanamid Company Pneumococcal polysaccharide-recombinant pneumolysin conjugate vaccines for immunization against pneumococcal infections
US5681570A (en) * 1995-01-12 1997-10-28 Connaught Laboratories Limited Immunogenic conjugate molecules
AU716806B2 (en) * 1995-04-17 2000-03-09 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Induction and enhancement of the immune response to polysaccharides with bacterial lipoproteins
UA56132C2 (uk) * 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
US6440425B1 (en) 1995-05-01 2002-08-27 Aventis Pasteur Limited High molecular weight major outer membrane protein of moraxella
US5843464A (en) 1995-06-02 1998-12-01 The Ohio State University Synthetic chimeric fimbrin peptides
NZ311000A (en) 1995-06-07 1999-04-29 Smithkline Beecham Biolog Vaccine comprising a polysaccharide antigen-carrier protein conjugate and a free carrier protein
US5736533A (en) * 1995-06-07 1998-04-07 Neose Technologies, Inc. Bacterial inhibition with an oligosaccharide compound
CZ394297A3 (cs) 1995-06-07 1998-04-15 Biochem Vaccines Inc. Streptokokové proteiny teplotního šoku ze skupiny HSP70
GB9513074D0 (en) 1995-06-27 1995-08-30 Cortecs Ltd Novel anigen
US6290970B1 (en) 1995-10-11 2001-09-18 Aventis Pasteur Limited Transferrin receptor protein of Moraxella
US6090576A (en) 1996-03-08 2000-07-18 Connaught Laboratories Limited DNA encoding a transferrin receptor of Moraxella
SE9601158D0 (sv) 1996-03-26 1996-03-26 Stefan Svenson Method of producing immunogenic products and vaccines
WO1997041151A2 (en) 1996-05-01 1997-11-06 The Rockefeller University Choline binding proteins for anti-pneumococcal vaccines
US6245335B1 (en) * 1996-05-01 2001-06-12 The Rockefeller University Choline binding proteins for anti-pneumococcal vaccines
US7341727B1 (en) 1996-05-03 2008-03-11 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. M. catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, methods of eliciting an immune response comprising same
JPH102001A (ja) * 1996-06-15 1998-01-06 Okajima Kogyo Kk グレーチング
US5882896A (en) 1996-09-24 1999-03-16 Smithkline Beecham Corporation M protein
US5882871A (en) 1996-09-24 1999-03-16 Smithkline Beecham Corporation Saliva binding protein
FR2763244B1 (fr) * 1997-05-14 2003-08-01 Pasteur Merieux Serums Vacc Composition vaccinale multivalente a porteur mixte
BR9809914A (pt) 1997-06-03 2001-09-18 Connaught Lab Genes de moracella receptores de lactoferrina
AU740956B2 (en) 1997-07-21 2001-11-15 Baxter Healthcare Sa Modified immunogenic pneumolysin compositions as vaccines
US6224880B1 (en) * 1997-09-24 2001-05-01 Merck & Co., Inc. Immunization against Streptococcus pneumoniae using conjugated and unconjugated pneumoccocal polysaccharide vaccines
US20050031638A1 (en) * 1997-12-24 2005-02-10 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccine
GB9727262D0 (en) * 1997-12-24 1998-02-25 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US6709658B1 (en) * 1998-02-12 2004-03-23 Wyeth Holdings Corporation Pneumococcal vaccines formulated with interleukin-12
NZ530277A (en) 1998-04-07 2005-08-26 Medimmune Inc Derivatives of pneumococcal choline binding proteins for vaccines
GB9812613D0 (en) 1998-06-11 1998-08-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
CN1263510C (zh) 1998-08-19 2006-07-12 巴克斯特健康护理股份有限公司 多糖－蛋白质缀合物或寡糖－蛋白质缀合物、其制备方法及其应用
CA2355364C (en) * 1998-12-21 2014-03-18 Medimmune, Inc. Streptococcus pneumoniae proteins and immunogenic fragments for vaccines
CA2366152A1 (en) 1999-03-19 2000-09-28 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Streptococcus pneumoniae vaccine
GB9909077D0 (en) * 1999-04-20 1999-06-16 Smithkline Beecham Biolog Novel compositions
GB0022742D0 (en) * 2000-09-15 2000-11-01 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
CN201252175Y (zh) * 2008-08-04 2009-06-03 富士康(昆山)电脑接插件有限公司 线缆连接器组件

Also Published As

Publication number Publication date
EP1880735A2 (en) 2008-01-23
NO20014323D0 (no) 2001-09-05
WO2000056359A2 (en) 2000-09-28
NL300415I1 (nl) 2009-12-01
CY1107390T1 (el) 2010-07-28
ATE387214T1 (de) 2008-03-15
FR10C0008I1 (fr) 2010-03-26
IL145043A0 (en) 2002-06-30
US20110217329A1 (en) 2011-09-08
AU3291900A (en) 2000-10-09
SI1163000T1 (sl) 2008-06-30
ES2339737T3 (es) 2010-05-25
CY2009014I1 (el) 2010-07-28
HK1043730A1 (zh) 2002-09-27
JP5551579B2 (ja) 2014-07-16
CZ303653B6 (cs) 2013-01-30
NZ513840A (en) 2004-02-27
AR022963A1 (es) 2002-09-04
TR200102736T2 (tr) 2002-04-22
BR0009166A (pt) 2001-12-26
EP1776962A1 (en) 2007-04-25
EP1162998A2 (en) 2001-12-19
US9168313B2 (en) 2015-10-27
KR20020000785A (ko) 2002-01-05
MY125202A (en) 2006-07-31
HU228499B1 (en) 2013-03-28
DE60032120T2 (de) 2007-09-20
ES2300255T3 (es) 2008-06-16
TWI281403B (en) 2007-05-21
EP1162999A2 (en) 2001-12-19
KR20020001785A (ko) 2002-01-09
TR200102739T2 (tr) 2001-12-21
PT1162999E (pt) 2007-02-28
PL355264A1 (en) 2004-04-05
CY1107561T1 (el) 2013-03-13
CN1351503A (zh) 2002-05-29
CN1192798C (zh) 2005-03-16
NZ513842A (en) 2004-05-28
JP2011057713A (ja) 2011-03-24
ATE346608T1 (de) 2006-12-15
CA2366152A1 (en) 2000-09-28
CN100339130C (zh) 2007-09-26
IL145044A (en) 2007-03-08
DE60043930D1 (de) 2010-04-15
EP1162999B1 (en) 2006-11-29
NO330736B1 (no) 2011-06-27
HUS1500040I1 (hu) 2018-05-28
CZ20013380A3 (cs) 2002-03-13
JP4846906B2 (ja) 2011-12-28
KR20020000549A (ko) 2002-01-05
ATE459373T1 (de) 2010-03-15
US8926985B2 (en) 2015-01-06
KR100642044B1 (ko) 2006-11-10
DE60038166D1 (de) 2008-04-10
CN1391481A (zh) 2003-01-15
PL355180A1 (en) 2004-04-05
TWI286938B (en) 2007-09-21
NO2011014I1 (no) 2011-09-19
CN1191852C (zh) 2005-03-09
WO2000056360A3 (en) 2001-01-25
CZ20013379A3 (cs) 2002-03-13
KR100798212B1 (ko) 2008-01-24
WO2000056358A2 (en) 2000-09-28
NO330532B1 (no) 2011-05-09
WO2000056359A3 (en) 2001-02-01
DE60038166T2 (de) 2009-03-12
DE60032120D1 (de) 2007-01-11
US20060093626A1 (en) 2006-05-04
NO20014322D0 (no) 2001-09-05
BR0009163A (pt) 2001-12-26
LU91652I9 (hu) 2019-01-03
WO2000056360A2 (en) 2000-09-28
NO20014325L (no) 2001-11-14
JP2002539273A (ja) 2002-11-19
IL145044A0 (en) 2002-06-30
WO2000056358A3 (en) 2001-01-04
FR10C0008I2 (fr) 2012-10-26
PL203917B1 (pl) 2009-11-30
HK1043728A1 (en) 2002-09-27
DK1162999T3 (da) 2007-03-26
TWI235064B (en) 2005-07-01
BR0009154A (pt) 2001-12-26
NL300415I2 (hu) 2016-12-13
CZ301445B6 (cs) 2010-03-03
SI1162999T1 (sl) 2007-04-30
HK1043728B (en) 2007-06-22
EP1162998B1 (en) 2010-03-03
AR022964A1 (es) 2002-09-04
NO20014323L (no) 2001-11-14
US20150079125A1 (en) 2015-03-19
MY125387A (en) 2006-07-31
CA2365296A1 (en) 2000-09-28
IL145045A0 (en) 2002-06-30
ES2275499T3 (es) 2007-06-16
NO2011014I2 (no) 2011-08-30
JP2002540075A (ja) 2002-11-26
AU750913B2 (en) 2002-08-01
BE1025464I2 (hu) 2019-03-06
NO20014322L (no) 2001-11-14
US20050031646A1 (en) 2005-02-10
LU91652I2 (fr) 2010-10-13
CA2366314C (en) 2012-01-10
HUP0200373A2 (en) 2002-06-29
BRPI0009163B1 (pt) 2019-04-09
CA2366314A1 (en) 2000-09-28
DE122009000054I1 (de) 2009-12-31
CY2009014I2 (el) 2010-07-28
US20060002961A1 (en) 2006-01-05
AR022965A1 (es) 2002-09-04
HK1043731B (en) 2009-01-23
PL204890B1 (pl) 2010-02-26
AU750762B2 (en) 2002-07-25
US20100119544A1 (en) 2010-05-13
EP1163000B1 (en) 2008-02-27
EP2277535A2 (en) 2011-01-26
PT1163000E (pt) 2008-03-20
US20100291138A1 (en) 2010-11-18
CN1351501A (zh) 2002-05-29
IL145043A (en) 2007-06-17
JP2002540074A (ja) 2002-11-26
DK1163000T3 (da) 2008-04-28
CZ20013378A3 (cs) 2002-03-13
NO20014325D0 (no) 2001-09-05
AU3813600A (en) 2000-10-09
AU3430700A (en) 2000-10-09
NZ513841A (en) 2001-09-28
MXPA01009452A (es) 2002-08-06
HU229968B1 (hu) 2015-03-30
EP2277535A3 (en) 2011-03-09
BRPI0009163B8 (pt) 2021-05-25
HUP0200664A2 (en) 2002-06-29
HK1043731A1 (en) 2002-09-27
PL355178A1 (en) 2004-04-05
TR200102735T2 (tr) 2002-04-22
US20030147922A1 (en) 2003-08-07
EP1163000A2 (en) 2001-12-19
EP1880735A3 (en) 2008-03-12
AU750788B2 (en) 2002-07-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1162999B1 (en) Vaccine against Streptococcus pneumoniae
US20150079129A1 (en) Vaccine
HK1114012A (en) Vaccine
HK1106137A (en) Vaccine against streptococcus pneumoniae
MXPA01009459A (es) Vacuna
MXPA01009455A (en) Vaccine

Legal Events

Date Code Title Description
HC9A Change of name, address

Owner name: GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS S.A., BE

Free format text: FORMER OWNER(S): SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS S.A., BE

AA1S Information on application for a supplementary protection certificate

Free format text: PRODUCT NAME: VACCINE COMPRISING A PLURALITY OF PNEUMOCOCCAL POLYSACCHARIDE CONJUGATE ANTIGENS WHICH CONSIST OF PNEUMOCOCCAL POLYSACCHARIDE ANTIGENS CONJUGATED TO PROTEIN D FROM HAEMOPHILUS INFLUENZAE; REGISTRATION NO/DATE: EU/1/09/508 20090330

Spc suppl protection certif: S1500040

Filing date: 20150714

Expiry date: 20200317

FG4S Grant of supplementary protection certificate

Spc suppl protection certif: S1500040

Filing date: 20150714

Expiry date: 20200317

Extension date: 20240331