ES2339737T3 - Vacuna contra polisacaridos capsulares de streptococcus pneumoniae. - Google Patents

Vacuna contra polisacaridos capsulares de streptococcus pneumoniae. Download PDF

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Abstract

Una composición antigénica liofilizada que comprende un polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae del serotipo 6B conjugado con 3D-MPL y sustancialmente desprovista de adyuvante basado en aluminio.

Description

Vacuna contra polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a vacunas antigénicas de polisacáridos bacterianos, a su fabricación y al uso de tales polisacáridos en medicamentos.
En particular la presente descripción se refiere a tres aspectos interrelacionados: A - vacunas que comprenden un antígeno de polisacárido de neumococos, típicamente un antígeno conjugado de polisacárido de neumococos, formulado con un antígeno proteico de Streptococcus pneumoniae y opcionalmente un adyuvante inductor de respuesta Th1; B - conjugados de polisacáridos de neumococos específicos y ventajosos a los que se les agrega un adyuvante Th1; y C - conjugados de polisacáridos de bacteria conjugados en general a la proteína D de H. influenzae.
Antecedentes de la invención
Streptococcus pneumoniae es una bacteria Gram-positiva responsable de una morbilidad y mortalidad considerables (particularmente en jóvenes y ancianos), que causa enfermedades invasivas tales como neumonía, bacteriemia y meningitis y enfermedades asociadas a colonización, tal como la otitis media aguda. Se estima que la tasa de neumonía neumocóccica en EE.UU. para personas con más de 60 años de edad es de 3 a 8 por cada 100.000. En el 20% de los casos da lugar a bacteriemia y otras manifestaciones tal como meningitis, con una tasa de mortalidad cercana al 30% incluso con tratamiento antibiótico.
El neumococo está encapsulado con un polisacárido unido químicamente que le confiere especificidad de serotipo. Existen 90 serotipos conocidos de neumococo y la cápsula es el principal determinante de virulencia para los neumococos, ya que la cápsula no sólo protege la superficie interna de la bacteria del complemento, sino que es por sí misma muy poco inmunógena. Los polisacáridos son antígenos T independientes y no pueden ser procesados o presentados en moléculas del CMH para interactuar con los linfocitos T. Pueden sin embargo, estimular el sistema inmunitario a través de un mecanismo alternativo que incluye el entrecruzamiento de receptores de superficie en células B.
Se ha demostrado en varios experimentos que la protección contra las enfermedades invasivas por neumococos está correlacionada más fuertemente con la especificidad de anticuerpo para la cápsula y la protección es específica de serotipo.
Las vacunas antigénicas basadas en polisacáridos son bien conocidas en la técnica. Cuatro de las que se autorizaron para uso en seres humanos incluyen el polisacárido Vi de Salmonella typhi, el polisacárido PRP de Haemophilus influenzae, la vacuna tetravalente para meningococo compuesta de serotipos A, C, W135 e Y, y la vacuna 23-valente neumocóccica compuesta de los polisacáridos correspondientes a los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33 (que suman al menos el 90% de los aislamientos de neumococos en sangre).
Las tres últimas vacunas confieren protección contra bacterias que causan infecciones respiratorias que dan como resultado morbilidad y mortalidad graves en lactantes, aunque estas vacunas aún no han sido autorizadas para el uso en niños de menos de dos años de edad porque son inadecuadamente inmunógenas en este grupo de edad. [Peltola y col. (1984), N. Engl. J. Med. 310:1561-1566]. Streptococcus pneumoniae es la causa más común de enfermedad bacteriana invasiva y otitis media en lactantes y niños de corta edad. Asimismo, los ancianos producen respuestas muy pobres a las vacunas neumocóccicas [Roghmann y col., (1987), J. Gerontol. 42:265-270], de ahí la incidencia aumentada de neumonía bacteriana en esta población [Verghese y Berk, (1983) Medicine (Baltimore) 62:271-285].
Las estrategias, que han sido diseñadas para solucionar esta falta de inmunogenicidad en lactantes, incluyen la unión del polisacárido a proteínas inmunógenas grandes, que proveen ayuda a la célula T presenciales y que inducen memoria inmunológica contra el antígeno polisacárido con el que está conjugado. Actualmente se están evaluando las vacunas para neumococos de conjugados de glicoproteínas con respecto a la seguridad, inmunogenicidad y eficacia en diversos grupos de edad.
A) Vacunas de Polisacáridos de Neumococos
La vacuna para neumococos no conjugada 23-valente demostró una amplia variación en la eficacia clínica, desde 0% hasta 81% (Fedson y col. (1994) Arch Intern Med. 154: 2531-2535). La eficacia parece estar relacionada con el grupo de riesgo que está siendo inmunizando, tal como ancianos, enfermedad de Hodgkin, esplenectomía, enfermedad de células falciformes y agammaglobulinémicos (Fine y col. (1994) Arch Intern Med. 154:2666-2677), y también con la manifestación de la enfermedad. La vacuna 23-valente no demuestra protección contra la neumonía neumocóccica (en ciertos grupos de alto riesgo tal como los ancianos) y otitis media.
Existe por lo tanto una necesidad de composiciones de vacunas para neumococos mejoradas, particularmente unas que puedan ser más eficaces en la prevención o alivio de la enfermedad neumocóccica (particularmente neumonía) en los ancianos y niños de corta edad.
B) Composiciones de Conjugado de Polisacárido Seleccionado de Neumococo + 3D-MPL
Se acepta generalmente que la eficacia protectora de la vacuna para neumococos no conjugada comercializada está más o menos relacionada con la concentración de anticuerpos inducidos tras la vacunación; de hecho, los 23 polisacáridos fueron aceptados para aprobación solamente en base a la inmunogenicidad de cada componente polisacárido (Ed. Williams y col. New York Academy of Sciences 1995 págs. 241-249). Por consiguiente otra potenciación de las respuestas de anticuerpos contra los polisacáridos del neumococo podrían aumentar el porcentaje de lactantes y ancianos que responden con niveles protectores de anticuerpo a la primera inyección de polisacárido o conjugado de polisacárido y podría reducir la dosificación y número de inyecciones necesarias para inducir una inmunidad protectora contra infecciones causadas por Streptococcus pneumoniae.
Desde principios del siglo XX, los investigadores han experimentado con una gran cantidad de compuestos que pueden agregarse a los antígenos para mejorar su inmunogenicidad en composiciones de vacunas [recapitulación por M. F. Powell & M. J. Newman, Plenum Press, NY, "Vaccine Design - the Subunit and Adjuvant Approach" (1995) Capítulo 7 "A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients"]. Muchos son muy eficaces, pero causan reacciones adversas locales y sistémicas significativas que impiden su uso en composiciones de vacunas para seres humanos. Los adyuvantes basados en aluminio (tales como alumbre hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio), descritos por primera vez en 1926, siguen siendo los únicos adyuvantes inmunológicos usados en vacunas autorizadas para uso en seres humanos en los Estados Unidos.
Los adyuvantes basados en aluminio son ejemplos de la clase de adyuvante portador que trabaja a través del "efecto depósito" que induce. El antígeno se adsorbe en su superficie y cuando se inyecta la composición, el adyuvante y el antígeno no se dispersan inmediatamente en el torrente sanguíneo - por el contrario la composición persiste en el medio local de la inyección y da como resultado una respuesta inmunitaria más pronunciada. Tales adyuvantes portador tienen la ventaja adicional conocida de ser adecuados para estabilizar antígenos que son propensos a romperse, por ejemplo algunos antígenos polisacáridos.
3D-MPL es un ejemplo de un adyuvante no portador. Su nombre completo es monofosforil lípido A 3-O-desacilado (o monofosforil lípido A 3 des-O-acilado o 3-O-desacil-4' monofosforil lípido A) y se lo nombra como 3D-MPL para indicar que la posición 3 del extremo reductor de glucosamina está des-O-acilado. Véase el documento GB 2220211 A y el documento US4912094 (Myers, Kent R y col.) que describen lipopolisacáridos modificados y procedimiento preparación. Químicamente es una mezcla de monofosforil lípido A 3-desacilado con 4, 5 ó 6 cadenas aciladas. Se preparó originalmente a principios de la década de 1990 cuando el procedimiento para 3-O-desacilar el derivado 4'-monofosforil del lípido A (MPL) dio una molécula con toxicidad más atenuada sin cambio en la actividad inmunoestimulante. Dermody y col., describen la evaluación de monofosforil lípido A como adyuvante de vacuna, para una vacuna glicoconjugada de neumococo multivalente en ratones (FASEB JOURNAL, vol 12 Nº 4, 17 de marzo de 1998).
Se ha usado el 3D-MPL como adyuvante ya sea solo o, de preferencia, combinado con un adyuvante portador de tipo depósito tal como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio o emulsiones de aceite en agua. En tales composiciones, antígeno y 3D-MPL están contenidos en las mismas estructuras particuladas, permitiendo una administración más eficaz de señales antigénicas e inmunoestimulantes. Los estudios demostraron que 3D-MPL es capaz de potenciar más la inmunogenicidad de un antígeno adsorbido en alum [Thoelen y col. Vaccine (1998) 16:708-14; EP 689454-B1]. Tales combinaciones resultan también de preferencia en la técnica para antígenos propensos a la adsorción (por ejemplo, conjugados de polisacáridos bacterianos), donde la adsorción sobre alumbre tiende a estabilizar al antígeno. Los adyuvantes basados en aluminio precipitado son muy usados ya que son los únicos adyuvantes actualmente usados en vacunas autorizadas para su uso en seres humanos. De acuerdo con esto, las vacunas que contienen 3D-MPL en combinación con adyuvantes basados en aluminio son preferidos en la técnica debido a su facilidad de desarrollo y velocidad de introducción en el mercado.
Se ha evaluado el MPL (no 3-desacilado) como adyuvante con diversos antígenos de vacuna monovalente de conjugado de polisacáridos. La coinyección de MPL en solución salina potenció la respuesta sérica de anticuerpos para cuatro conjugados de polisacáridos monovalentes: PS 6B de neumococo-toxoide tetánico, PS 12 de neumococo-toxoide diftérico y S. aureus tipo 5 y S. aureus tipo 8 conjugado con exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa [Schneerson y col. J. Immunology (1991) 147:2136-2140]. Las respuestas potenciadas resultaron ser específicas de antígeno. MPL en una emulsión de aceite en agua (un adyuvante de tipo portador) potenció consistentemente el efecto de MPL en solución salina debido a la presencia de MPL y antígeno en la misma estructura particulada y fue considerado como un sistema adyuvante de elección para administración óptima de otras vacunas de conjugados de polisacáridos.
Devi y col. [Infect. Immun. (11991) 59:3700-7] evaluaron el efecto adyuvante de MPL (no 3-desacilado) en solución salina en la respuesta de anticuerpos murinos para un conjugado TT de polisacárido capsular de Cryptococcus neoformans. Cuando se usó MPL conjuntamente con el conjugado sólo se produjo un aumento marginal en la respuesta específica de IgM e IgG para el PS; sin embargo MPL tuvo un efecto mucho mayor cuando se administró 2 días tras el conjugado. La practicidad de usar un esquema de inmunización que requiere una demora en la administración de MPL con respecto al antígeno, especialmente en lactantes, es cuestionable. El efecto adyuvante de MPL con conjugados de polisacáridos y polisacáridos-proteínas parece ser dependiente de la composición. Una vez más, la incorporación de MPL en sistemas de administración de liberación lenta adecuados (por ejemplo usando un adyuvante portador) provee un efecto adyuvante de mayor duración y salva el problema del tiempo y administración demorada.
En resumen, el estado actual de la técnica mostró que, para antígenos polisacáridos particulares o conjugados de polisacáridos, donde se usa MPL o 3D-MPL como adyuvante, se usa ventajosamente en conjunción con un adyuvante portador (por ejemplo los adyuvantes basados en aluminio) con el fin de maximizar su efecto inmunoestimulante.
Sorprendentemente, los autores de la presente invención hallaron que para ciertos conjugados de polisacáridos de neumococo, la inmunogenicidad de la composición de vacuna es significativamente mayor cuando el antígeno se formula con 3D-MPL solo en lugar de 3D-MPL en conjunción con un adyuvante portador (tal como un adyuvante basado en aluminio). Además, la mejora observada es independiente de la concentración de 3D-MPL usada y de si los conjugados particulares están en una composición monovalente o si están combinados para formar una composición polivalente.
C) Conjugados de Polisacárido Bacteriano-Proteína D
Como se ha mencionado anteriormente, las vacunas basadas en antígeno polisacárido son bien conocidas en la técnica. Las vacunas de polisacáridos autorizadas mencionadas anteriormente tienen diferente eficacia clínica demostrada. Se estima que la vacuna de polisacárido Vi tiene una eficacia de entre 55% y 77% en la prevención de fiebre tifoidea confirmada por cultivo (Plotkin y Cam, (1995) Arch Intern Med 155: 2293-99). La vacuna de polisacáridos de meningococo C demostró tener una eficacia de 79% bajo condiciones epidémicas (De Wals P, y col. (1996) Bull World Health Organ. 74: 407-411). La vacuna de neumococos 23-valente mostró una amplia variación en la eficacia clínica, desde 0% hasta 81% (Fedson y col. (1994) Arch Intern Med. 154: 2531-2535). Como se ha mencionado anteriormente, se acepta que la eficacia protectora de la vacuna de neumococos está más o menos relacionada con la concentración de anticuerpo inducida tras la vacunación.
Entre los problemas asociados con el enfoque de polisacáridos para vacunación, está el hecho de que los polisacáridos son per se inmunógenos pobres. Las estrategias diseñadas para solucionar esta falta de inmunogenicidad incluyen la unión del polisacárido a portadores proteicos grandes altamente inmunógenos que proveen ayuda a los linfocitos T presenciales.
Los ejemplos de estos portadores altamente inmunógenos que se usan comúnmente en la actualidad para la producción de inmunógenos polisacáridos incluyen el toxoide de Difteria (DT o el mutante CRM197), toxoide del Tetanos (TT), Hemocianina de lapa californiana (KLH) y la proteína purificada derivada de Tuberculina (PPD).
Proteínas Asociadas con Portadores Comúnmente Usados
Con cada uno de estos portadores comúnmente usados están asociados una serie de problemas, incluso en la producción de conjugados de GMP y también en las características inmunológicas de los conjugados.
A pesar del uso común de estos portadores y de su éxito en la inducción de respuestas de anticuerpos anti-polisacáridos, están asociados a diversos problemas. Por ejemplo, se sabe que las respuestas inmunitarias específicas de antígeno pueden suprimirse (supresión de epítopo) por la presencia de anticuerpos preexistentes dirigidos contra el portador, es el caso de la toxina del Tétanos (Di John y col.; (1989) Lancet, 2:1415-8). En la población en general, un porcentaje muy alto de personas tendrán inmunidad preexistente para DT y TT ya que las personas son vacunadas rutinariamente con estos antígenos. En el RU por ejemplo el 95% de los niños reciben la vacuna DPT que comprende DT y TT. Otros autores describieron el problema de la supresión de epítopo para vacunas de péptidos en modelos animales (Sad y col., Immunology, 1991; 74:223-227; Schutze y col., J. Immunol. 135: 4, 1985; 2319-2322).
Además, para vacunas que requieren estímulo regular, el uso de portadores altamente inmunógenos tales como TT o DT probablemente suprimen la respuesta de anticuerpos para polisacáridos tras varias inyecciones. Estas múltiples vacunaciones también pueden estar acompañadas por reacciones indeseables tal como hiperrespuesta de tipo retardada (HTR).
Se sabe que KLH es un inmunógeno potente y ya ha sido usado como portador para péptidos IgE en ensayos clínicos en seres humanos. Sin embargo, se han observado algunas reacciones adversas (reacciones de tipo HTR o sensibilización a IgE) así como respuestas de anticuerpos contra anticuerpos.
La selección de una proteína portadora, por consiguiente, para una vacuna basada en polisacáridos requerirá un equilibrio entre la necesidad de usar un portador que sirva en todos los pacientes (reconocimiento amplio del CMH), la inducción de altos niveles de respuesta de anticuerpos anti-polisacáridos y baja respuesta de anticuerpos contra el portador.
Los portadores previamente usados para vacunas basadas en polisacáridos, por lo tanto tienen muchas desventajas. Esto es particularmente así en vacunas de combinación, donde la supresión de epítopo es especialmente problemática si se usa el mismo portador para diversos antígenos polisacáridos. En el documento WO 98/51339, se usaron múltiples portadores en vacunas de combinación con el fin de intentar evitar este efecto.
La presente invención provee un portador nuevo para uso en la preparación de conjugados inmunógenos basados en polisacáridos/polipéptidos, que no sufre las desventajas mencionadas anteriormente.
La presente invención provee una proteína D (EP 0 594 610 B1) de Haemophilus influenzae, o fragmentos de la misma, como portador para composiciones inmunógenas basadas en polisacáridos, incluyendo vacunas. El uso de este portador es particularmente ventajoso en vacunas de combinación.
Resumen de la invención A) Vacunas de Polisacáridos de Neumococos
Las vacunas de polisacáridos de neumococo (conjugados o no) pueden no ser capaces de proteger contra la neumonía en la población de ancianos para la que la incidencia de esta enfermedad es muy alta. El mecanismo clave de defensa contra el neumococo es la opsonofagocitosis (un acontecimiento humoral mediado por células B/neutrófilos causado por la producción de anticuerpos contra el polisacárido del neumococo, que termina con la fagocitosis de la bacteria), sin embargo parte de los mecanismos opsónicos involucrados están deteriorados en los ancianos, es decir, la producción de superóxido por PMN (células polimorfonucleares), de otras especies reactivas de oxígeno, movilización de PMN, apoptosis de PMN, deformabilidad de PMN. Las respuestas de anticuerpos pueden también estar deterioradas en los ancianos.
Contrariamente al dogma aceptado normalmente, los niveles normales de anticuerpos anti-polisacárido capsular pueden no ser eficaces en la depuración completa de las bacterias, ya que los neumococos pueden invadir células hospedadoras para evadir esta rama del sistema inmunitario.
Sorprendentemente, los autores de la presente invención hallaron que estimulando simultáneamente la rama mediada por células del sistema inmunitario (por ejemplo la inmunidad mediada por linfocitos T) además de la rama humoral del sistema inmunitario (mediada por linfocitos B), se obtiene como resultado una sinergia (o cooperación) capaz de potenciar la depuración de neumococos del hospedador. Éste es un descubrimiento que ayudará a la prevención (o tratamiento) de la infección por neumococos en general, pero será particularmente importante para la prevención (o tratamiento) de neumonía en los ancianos donde las vacunas basadas en polisacáridos no muestran eficacia.
Los autores de la presente invención hallaron que ambos brazos del sistema inmunitario pueden funcionar sinérgicamente de esta manera si se administra un polisacárido de neumococo (de preferencia conjugado) con una proteína de neumococo (de preferencia una proteína expresada en la superficie del neumococo, o secretada o liberada, que puede procesarse y presentarse en el contexto del CMH de clase II y clase I en la superficie de las células del mamífero infectado). Aunque una proteína de neumococo puede por sí misma provocar la inmunidad mediada por células, los autores de la invención hallaron también que la presencia de un adyuvante inductor de Th1 en la formulación de vacuna ayuda a este brazo del sistema inmunitario y sorprendentemente potencia además la sinergia entre ambos brazos del sistema inmunitario.
B) Composiciones de Conjugado de Polisacáridos Seleccionados de Neumococo + 3D-MPL
Por lo tanto, la presente invención también provee una composición antigénica liofilizada que comprende un polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae conjugado del serotipo 6B junto con un adyuvante 3D-MPL y sustancialmente desprovista de adyuvantes basados en aluminio, comprendiendo la composición antigénica liofilizada comprende conjugados del polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, y 23F.
En esas composiciones, cada uno de los polisacáridos 4, 6B, 18C, 19F y 23F son sorprendentemente más inmunógenos en composiciones que comprenden 3DMPL solo en comparación con composiciones que comprenden 3D-MPL y un adyuvante basado en aluminio.
C) Conjugados de Polisacárido Bacteriano-Proteína D
Por lo tanto la presente invención provee un antígeno de conjugado de polisacáridos que comprende un antígeno polisacárido derivado de una bacteria patógena conjugado con proteína D de Haemophilus influenzae o un fragmento de proteína D. Además, la invención provee composiciones de vacuna polivalentes donde uno o más de los antígenos polisacáridos están conjugados con proteína D.
Descripción de la invención A) Vacunas de Polisacáridos de Neumococo
La presente invención provee una vacuna mejorada particularmente para la prevención o alivio de la infección por neumococos de los ancianos (y/o lactantes y niños pequeños).
En el contexto de la invención se considera a un paciente como anciano si tiene 55 años de edad o más, típicamente más de 60 años de edad y más generalmente más de 65 años de edad.
Antígenos Polisacáridos de Streptococcus pneumoniae de la Invención
La vacuna de Streptococcus pneumoniae de la presente invención comprenderá antígenos polisacáridos (conjugados), en la que los polisacáridos derivan de al menos once serotipos de neumococo incluyendo 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F. En una forma de realización preferida de la invención se incluyen al menos 13 antígenos polisacáridos, aunque también están coninactivacións por la invención otros antígenos polisacáridos, por ejemplo 23 valentes (tales como los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F).
Para la vacunación en ancianos (por ejemplo para la prevención de neumonía) resulta ventajoso incluir los serotipos 8 y 12F (y más preferentemente 15 y 22 también) a la composición antigénica 11 valente descrita anteriormente para formar una vacuna 15 valente, mientras que para lactantes y niños pequeños (donde la otitis media tiene más importancia) resulta ventajoso incluir los serotipos 6A y 19A para formar una vacuna 13 valente.
Para la prevención/alivio de neumonía en la población de ancianos (+ de 55 años de edad) y otitis media en lactantes (hasta 18 meses de edad) y niños pequeños (típicamente de 18 meses a 5 años de edad), resulta una forma de realización preferida de la invención combinar un polisacárido multivalente de Streptococcus pneumoniae como se describe en este documento con una proteína de Streptococcus pneumoniae o un equivalente inmunológicamente funcional de la misma.
Proteínas de Neumococo de la Invención
Para los objetivos de esta invención, "equivalente inmunológicamente funcional" se define como un péptido o proteína que comprende al menos un epítopo protector de las proteínas de la invención. Tales epítopos están característicamente expuestos en la superficie, altamente conservados y pueden provocar una respuesta bactericida de anticuerpos en un hospedador o prevenir efectos tóxicos. De preferencia, el equivalente funcional tiene al menos 15 y de preferencia 30 o más aminoácidos contiguos de la proteína de la invención. Más preferentemente, pueden usarse fragmentos, deleciones de la proteína, tales como variantes de deleción transmembrana de la misma (es decir, el uso de un dominio extracelular de las proteínas), fusiones, derivados sin toxicidad por tratamientos químicos o genéticos y similares, con la condición de que sean capaces de provocar sustancialmente la misma respuesta inmunitaria que la proteína nativa.
Las proteínas preferidas de la invención son aquellas proteínas neumocóccicas que están expuestas en la superficie exterior de los neumococos (capaces de ser reconocidas por el sistema inmunitario de un hospedador durante al menos parte del ciclo de vida del neumococo), o son las proteínas que son secretadas o liberadas por el neumococo. Lo más preferentemente, la proteína es una toxina, adhesina, transductor de señales de 2 componentes o lipoproteína de Streptococcus pneumoniae, o equivalentes inmunológicamente funcionales de las mismas.
Las proteínas de particular preferencia que deben incluirse en tal vacuna de combinación incluyen, pero no se limitan a: neumolisina (de preferencia sin toxicidad por tratamiento químico o mutación) [documento WO96/32963 (Henry M Jackson Foundation and SmithKline Beecham Bioloigicals), [Mitchell y col. Nucleic Acids Res. 1990 Jul. 11; 18(13): 4010 "Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2", Mitchell y col. Biochim Biophys Acta 1989 Jan. 23; 1007(1): 67-72 "Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties.", WO 96/05859 (A. Cyanamid), WO 90/06951 (Paton y col), WO 99/03884 (NAVA)]; PspA y variantes de deleción transmembrana de la misma (Patente de EE.UU. Nº 5.804.193 Briles y col.); PspC y variantes de deleción transmembrana de la misma (Documento WO 97/09994 Briles y col); PsaA y variantes de deleción transmembrana de la misma (Berry & Paton, Infect Immun Diciembre 1996; 64 (12):5255-62 "Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae"); proteínas neumocóccicas de unión a colina y variantes de deleción transmembrana de la misma, CbpA y variantes de deleción transmembrana de la misma (Documentos WO 97/41151; WO 99/51266); Gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (Infect. Immun. 1996 64:3544); HSP70 (Documento WO 96/40928); PcpA (Sanchez-Beato y col. FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14); proteína de tipo M, SB solicitud de Patente Nº EP 0837130; y adhesina 18627, SB Solicitud de Patente Nº EP 0834568.
Las proteínas usadas en la presente invención de preferencia se seleccionan del grupo constituido por neumolisina, PsaA, PspA, PspC, CbpA o una combinación de dos o más de tales proteínas. La presente invención también abarca equivalentes inmunológicamente funcionales de tales proteínas (como se ha definido anteriormente).
Dentro de la composición, la proteína puede ayudar a inducir una respuesta mediada por linfocitos T contra la enfermedad neumocóccica -particularmente necesaria para la protección contra neumonía- que coopera con la rama humoral del sistema inmunitario para inhibir la invasión por neumococos y estimular la opsonofagocitosis.
Otras ventajas de incluir el antígeno proteico es la presentación de otros antígenos para el proceso de opsonofagocitosis y la inhibición de la adhesión bacteriana (si se usa una adhesina) o la neutralización de toxina (si se usa una toxina).
Por lo tanto en una forma de realización de la invención se provee una vacuna de Streptococcus pneumoniae que comprende una vacuna de conjugados de polisacáridos de neumococo que comprende antígenos polisacáridos derivados de al menos cuatro serotipos, de preferencia al menos siete serotipos, más preferentemente al menos once serotipos, y al menos una, pero de preferencia dos, proteínas de Streptococcus pneumoniae. De preferencia una de las proteínas es Neumolisina o PsaA o PspA o CbpA (lo más preferentemente neumolisina detoxificada). Una combinación preferida contiene al menos neumolisina o un derivado de la misma y PspA.
Como se ha mencionado anteriormente, un problema asociado con el enfoque de vacunación con polisacáridos es el hecho de que los polisacáridos son per se inmunógenos pobres. Para solucionar esto, los polisacáridos pueden conjugarse a vehículos proteicos, que proveen ayuda de linfocitos T presenciales. Resulta preferible, por lo tanto, que los polisacáridos usados en la invención estén unidos a tal vehículo proteico. Los ejemplos de tales portadores que se usan comúnmente en la actualidad para la producción de inmunógenos polisacáridos incluyen los toxoides de Difteria y Tetanos (DT, DT CRM197 y TT respectivamente), Hemopcianina de lapa (KLH), OMPC de N. meningitidis, y el derivado proteico purificado de Tuberculina (PPD).
Sin embargo, están asociados una serie de problemas a cada uno de estos portadores usados (ver sección "Problemas Asociados con portadores Comúnmente Usados" a continuación).
La presente invención provee en una forma de realización preferida un nuevo portador para uso en la preparación de construcciones de inmunógenos basadas en polisacáridos que no sufre estas desventajas. El portador de preferencia para las composiciones inmunógenas basadas en polisacáridos de neumococo (o vacunas) es la proteína D de Haemophilus influenzae (Documento EP 594610-B), o fragmentos de la misma. Los fragmentos adecuados para su uso incluyen fragmentos que abarcan epítopos T-ayudantes. En particular un fragmento de proteína D de preferencia contendrá el 1/3 N-terminal de la proteína.
Otro portador de preferencia para el polisacárido de neumococo es la propia proteína de neumococo (como se ha definido anteriormente en la sección "Proteínas de Neumococo de la Invención").
Preparaciones de Vacunas de la Invención
Las preparaciones de vacunas de la presente invención pueden usarse para proteger o tratar a un mamífero susceptible de infección, por medio de la administración de dicha vacuna por vía sistémica o por vía mucosa. Estas administraciones pueden incluir la inyección por vía intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; o por administración por vía mucosa a los tractos oral/alimentario, respiratorio, genitourinario. Resulta de preferencia la administración de vacunas por vía intranasal para el tratamiento de neumonía u otitis media (ya que puede prevenirse más eficazmente el transporte de neumococos a través de la nasofaringe, y así atenuar la infección en su etapa
temprana).
La cantidad de antígeno conjugado en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin los efectos colaterales adversos significativos de las vacunas típicas. Tal cantidad variará dependiendo de qué inmunógeno específico se usa y cómo se presenta. Generalmente, se espera que cada dosis comprenderá 0,1-100 \mug de polisacárido, de preferencia 0,1-50 \mug, de preferencia 0,1-10 \mug, de los cuales 1 a 5 \mug es el intervalo lo más preferentemente.
El contenido de antígenos proteicos en la vacuna típicamente estará en el intervalo de 1-100 \mug, de preferencia 5-50 \mug, más típicamente en el intervalo de 5-25 \mug.
Pueden averiguarse las cantidades óptimas de componentes para una vacuna en particular por medio de estudios estándar que incluyen la observación de respuestas inmunitarias adecuadas en sujetos. Tras una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de estímulo adecuadamente espaciadas.
La preparación de vacunas está descrita en general en Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (ed. Powell M. F. & Newman M. J.) (1995) Plenum Press New York). El encapsulado dentro de liposomas está descrito por Fullerton, Patente de EE.UU. Nº 4.235.877.
B) Composiciones de Conjugado de Polisacárido Seleccionado de Neumococo + 3D-MPL
Para los fines de esta invención, la frase "conjugados de polisacáridos de neumococo de la invención" describe aquellos conjugados de polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae que son más inmunógenos en composiciones que comprenden 3D-MPL en comparación con las composiciones que comprenden 3D-MPL en conjunción con un adyuvante basado en aluminio (por ejemplo, conjugados de serotipo 4; serotipo 6B; serotipo 18C; serotipo 19F; o serotipo 23F).
Para los fines de esta invención, la expresión "sustancialmente desprovisto de adyuvantes basados en aluminio" describe una composición que no contiene suficiente adyuvante basado en aluminio (por ejemplo hidróxido de aluminio y, particularmente, fosfato de aluminio) para causar cualquier disminución en la inmunogenicidad de un conjugado de polisacáridos de neumococo de la invención en comparación con una composición equivalente que comprende 3DMPL sin agregado de adyuvante basado en aluminio. De preferencia la composición antigénica debería contener un adyuvante constituido esencialmente por 3D-MPL. Las cantidades agregadas de adyuvante basado en aluminio por dosis deberían de preferencia ser inferiores a 50 \mug, más preferentemente inferior a 30 \mug, más preferentemente aún inferior a 10 \mug, y lo más preferentemente no hay adyuvante basado en aluminio agregado en las composiciones de la invención.
Para los fines de esta invención, la determinación de si un conjugado de polisacáridos de neumococo es significativamente más inmunógeno en composiciones que comprenden 3D-MPL en comparación con composiciones que comprenden 3D-MPL en conjunción con un adyuvante basado en aluminio, debería establecerse como se describe en el Ejemplo 2. Como una indicación de si una composición es significativamente más inmunógena cuando comprende 3D-MPL solo, la relación de concentración de MGC (media geométrica de la concentración) de IgG (determinada como en el Ejemplo 2) entre composiciones que comprenden 3D-MPL solo frente a una composición equivalente que comprende 3D-MPL en conjunción con un adyuvante de fosfato de aluminio debería ser superior a 2, de preferencia superior a 5, más preferentemente superior a 7, más preferentemente aún superior a 9 y lo más preferentemente superior a 14.
Entre los problemas asociados con el enfoque de polisacáridos para vacunación, uno es el hecho de que los polisacáridos per se son inmunógenos pobres. Las estrategias, que se diseñaron para solucionar esta falta de inmunogenicidad, incluyen la unión (conjugación) del polisacárido a un vehículo proteico grande, que provee ayuda a linfocitos T presenciales. Resulta de preferencia que los polisacáridos de neumococo de la invención estén unidos a un vehículo proteico que provee ayuda a linfocitos T presenciales. Los ejemplos de tales portadores que pueden usarse incluyen los toxoides de Difteria, mutante de Difteria y Tetanos (DT, CRM197 y TT respectivamente), Hemocianina de lapa (KLH), la proteína purificada derivada de Tuberculina (PPD), y OMPC de Neisseria meningitidis.
Con más preferencia se usa proteína D de Haemophilus influenzae (documento EP 0 594 610-B), o fragmentos de la misma (ver sección C), como vehículo proteico inmunógeno para los polisacáridos de neumococo de la invención. En una forma de realización la composición antigénica liofilizada de la invención comprende un polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae del serotipo 6B al que se le agrega el adyuvante 3D-MPL y sustancialmente desprovista de adyuvantes basados en aluminio, y en la que la composición antigénica liofilizada comprende conjugados del polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, y 23F.
La combinación con otros conjugados de polisacáridos de neumococo no provoca significativamente la inmunogenicidad de los conjugados de polisacáridos de neumococo de la invención (Ejemplo 3).
Típicamente la composición de combinación antigénica de Streptococcus pneumoniae de la presente invención comprenderá antígenos de conjugados de polisacáridos, en la que los polisacáridos derivan de al menos once, trece, quince o veintitrés serotipos (véase "Antígenos Polisacáridos de Streptococcus pneumoniae de la Invención" anteriormente para combinaciones de serotipos de preferencia dependiendo de la enfermedad a tratar).
Las composiciones antigénicas de la invención se usan de preferencia como composiciones de vacuna para prevenir (o tratar) infecciones por neumococos, particularmente en ancianos y en lactantes y niños pequeños.
Otras formas de realización de la presente invención incluyen: la provisión de las composiciones antigénicas anteriores para uso en medicina; un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria para un conjugado de polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae, que comprende las etapas de administrar una cantidad segura y eficaz de una de las composiciones antigénicas anteriores a un paciente; y el uso de una de las composiciones antigénicas anteriores en la fabricación de un medicamento para la prevención (o tratamiento) de la enfermedad por neumococos.
Para la prevención/alivio de neumonía en la población de ancianos (+ 55 años de edad) y otitis media en lactantes (hasta 18 meses de edad) y niños pequeños (típicamente 18 meses a 5 años de edad), combinar un conjugado multivalente de polisacáridos de Streptococcus pneumoniae formulado como se describe en este documento con proteína de Streptococcus pneumoniae o un equivalente inmunológicamente funcional de la misma es otra forma de realización preferida de la invención. Ver la sección anterior "Proteínas de Neumococo de la Invención" para combinaciones proteínas/proteína de preferencia.
Las composiciones antigénicas liofilizadas de preferencia (y vacunas) descritas anteriormente en este documento se liofilizan hasta el momento de su uso, momento en el que se reconstituyen extemporáneamente con diluyente. Más preferentemente se liofilizan en presencia de 3D-MPL y se reconstituyen extemporáneamente con solución salina.
Liofilizar las composiciones da como resultado una composición más estable (por ejemplo previene la ruptura de los antígenos polisacáridos). El procedimiento es también sorprendentemente responsable de un título de anticuerpos más alto aún contra los polisacáridos de neumococo. Esto demostró ser particularmente significativo para los conjugados PS 6B. Para la preparación de las vacunas, ver la sección anterior "Preparaciones de Vacunas de la Invención".
C) Conjugados de Polisacáridos Bacterianos/Proteína D
La tendencia hacia las vacunas de combinación tiene la ventaja de disminuir la incomodidad para el receptor, facilitando la confección de un calendario y asegurando que el régimen se realice completamente; pero existe también el riesgo concomitante de disminuir la eficacia de la vacuna (ver anteriormente la discusión acerca de la supresión de epítopo por el uso excesivo de proteínas vehículo). Sería, por lo tanto, ventajoso realizar combinaciones de vacunas que cumplen con las necesidades de una población y que, además, no presentan interferencia inmunógena entre sus componentes. Estas ventajas pueden obtenerse mediante las composiciones inmunógenas (o vacunas) de la invención, que son beneficiosas particularmente para administrar vacunas de combinación a grupos de alto riesgo tales como lactantes, niños pequeños o ancianos.
La presente invención provee una proteína D de Haemophilus influenzae, o fragmentos de la misma, como portador para composiciones inmunógenas basadas en polisacáridos, incluyendo vacunas. Los fragmentos adecuados para su uso incluyen fragmentos que abarcan epítopos de linfocitos T-ayudantes. En particular el fragmento de proteína D de preferencia contendrá el 1/3 N terminal de la proteína.
La proteína D es una proteína de unión a IgD de Haemophilus influenzae (documento EP 0 594 610 B1) y es un potencial inmunógeno.
El polisacárido puede unirse a la proteína portadora por medio de cualquier procedimiento conocido (por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 4.372.945 de Likhite y la Patente de EE.UU. Nº 4.474.757 de Armor y col.). De preferencia, se realiza la conjugación CDAP (documento WO 95/08348).
En CDAP, se usa de preferencia el reactivo de cianilación tetrafluoroborato de 1-ciano-dimetilaminopiridinio (CDAP) para la síntesis de conjugados de polisacárido-proteína. La reacción de cianilación puede realizarse bajo condiciones relativamente suaves, que evitan la hidrólisis de los polisacáridos sensibles a la alcalinidad. Esta síntesis permite el acoplamiento directo de una proteína portadora.
Se disuelve el polisacárido en agua o solución salina. Se disuelve CDAP en acetonitrilo y se agrega inmediatamente a la solución de polisacárido. El CDAP reacciona con los grupos hidroxilo del polisacárido para formar un éster de cianato. Tras la etapa de activación, se agrega la proteína portadora. Los grupo amino de la lisina reaccionan con el polisacárido activado para formar un enlace covalente isourea.
Tras la reacción de acoplamiento, se agrega una gran cantidad de glicina en exceso para inactivar las funciones activadas residuales. Posteriormente se pasa el producto a través de un gel de exclusión molecular para eliminar la proteína portadora sin reaccionar y los reactivos residuales. En consecuencia, la invención provee un procedimiento para producir conjugados de polisacárido proteína D que comprende las etapas de activación del polisacárido y unión del polisacárido a la proteína D.
En una forma de realización preferida de la invención se provee una formulación de composición inmunógena (o vacuna) para la prevención de infecciones por Streptococcus pneumoniae.
El mecanismo por el que se esparcen los neumococos hacia los pulmones, líquido cefalorraquídeo y sangre se comprende vagamente. El crecimiento de las bacterias que llegan a los alvéolos pulmonares normales se inhibe por su sequedad relativa y por la actividad fagocítica de los macrófagos alveolares. Cualquier cambio anatómico o fisiológico de estas defensas coordinadas tiende a aumentar la susceptibilidad de los pulmones a la infección. La pared celular de Streptococcus pneumoniae tiene un papel importante en la generación de una respuesta inflamatoria en los alvéolos del pulmón (Gillespie y col. (1997), I&I 65: 3936).
Típicamente la vacuna de Streptococcus pneumoniae de la presente invención comprenderá conjugados de proteína D y polisacáridos, en la que el polisacárido deriva de al menos once, trece, quince o 23 serotipos. Véase la sección anterior "Antígenos Polisacáridos de Streptococcus pneumoniae de la Invención" para combinaciones de preferencia de serotipos dependiendo de la enfermedad a tratar.
Sorprendentemente, los autores de la presente invención hallaron que la proteína D es particularmente adecuada para minimizar tales efectos de supresión de epítopos en las vacunas de combinación. En una combinación, uno o más polisacáridos pueden estar conjugados ventajosamente a proteína D y de preferencia todos los antígenos están conjugados dentro de tales vacunas de combinación.
Muchas vacunas pediátricas están siendo actualmente administradas como vacunas de combinación para reducir el número de inyecciones que tiene que recibir un niño. Por ello, para vacunas pediátricas pueden formularse otros antígenos con las vacunas de la invención. Por ejemplo las vacunas de la invención pueden formularse, o administrarse separadamente, pero al mismo tiempo, con la bien conocida vacuna de combinación "trivalente" que comprende toxoide de Difteria (DT), toxoide de tétanos (CT) y componentes de pertussis [típicamente toxoide detoxificado de Pertussis (PT) y hemaglutinina filamentosa (FHA) con pertactina (PRN) y/o aglutinina 1+2 opcionales], por ejemplo, la vacuna comercializada INFANRIX-DTPa^{TM} (SmithKlineBeecham Biologicals) que contiene antígenos DT, TT, PT, FHA y PRN, o con un componente de células de pertussis completa, por ejemplo, como comercializa SmithKline-Beecham Biologicals s.a., como Tritanrix^{TM}. La vacuna de combinación también puede comprender otro antígeno, tal como antígeno de superficie de Hepatitis B (HBsAg), antígenos de virus de Polio (por ejemplo virus de polio trivalente inactivado-IPV), proteínas de membrana externa de Moraxella catarrhalis, proteínas de Haemophilus influenzae no tipificable, proteínas de membrana externa de N. meningitidis B.
Los ejemplos de antígenos proteicos de preferencia de Moraxella catarrhalis que pueden incluirse en una vacuna de combinación (especialmente para la prevención de otitis media) son: 0MP106 [documento WO 97/41731 (Antex) & WO 96/34960 (PMC)]; OMP21; LbpA & LbpB [documento WO 98/55606 (PMC)]; ThpA & TbpB [documentos WO 97/13785 &WO 97/32980 (PMC)]; CopB [Helminen ME, y col. (1993) Infect. Immun. 61:2003-2010]; UspA1/2 [documento WO 93/03761 (Universidad de Texas)]; y OmpCD. Los ejemplos de antígenos de Haemophilus influenzae no tipificable que pueden incluirse en una vacuna de combinación (especialmente para la prevención de otitis media) incluyen: proteína Fimbrina [(Patente de EE.UU. Nº 5.766.608-Ohio State Research Foundation)] y fusiones que comprenden péptidos de la misma [por ej. fusiones de péptidos LB 1(f); Patente de EE.UU. Nº 5.843.464 (OSU) o documento WO 99/64067]; OMP26 [WO 97/01638 (Cortecs)]; P6 [Documento EP 281673 (Universidad Estatal de New York)]; TbpA y TbpB; Hia; Hmw1,2; Hap; y D15.
Claramente, cuanto mayor número de portadores estén involucrados en una vacuna de combinación (por ejemplo, para solucionar la supresión de epítopo), más cara y compleja es la vacuna final. Tener todos, o la mayoría, de los antígenos polisacáridos de una vacuna de combinación conjugada a la proteína D proporciona así una ventaja considerable.
Para la prevención de neumonía en la población de ancianos (+ de 55 años de edad) y otitis media en lactantes y niños pequeños, resulta una forma de realización preferida de la invención combinar antígenos de polisacáridos de Streptococcus pneumoniae multivalentes y proteína D como se describe en este documento con una proteína de Streptococcus pneumoniae o un equivalente inmunológicamente funcional de la misma. Ver la sección anterior "Proteínas de Neumococo de la Invención" para combinaciones proteínas/proteína de preferencia que pueden incluirse en tal combinación.
En consecuencia la presente invención provee una composición antigénica liofilizada que comprende un conjugado de polisacárido de Streptococcus pneumoniae-proteína D y un antígeno proteico de Streptococcus pneumoniae.
En otro aspecto de la presente invención se provee un inmunógeno o una vacuna como se describe en este documento para uso en medicina.
Para la preparación de la vacuna/administración del conjugado, ver la sección anterior "Preparación de Vacunas de la Invención".
La proteína D también se usa ventajosamente en una vacuna contra la otitis media, ya que es por sí misma un inmunógeno capaz de producir protección mediada por células B contra H. influenzae no tipificable (ntHi). ntHi puede invadir células del hospedador y evadir los efectos mediados por células B inducidos por el antígeno proteico. Los autores de la presente invención hallaron sorprendentemente una manera de aumentar la eficacia de la proteína D (por sí misma o como portador para un polisacárido) como antígeno para una vacuna contra la otitis media. Esto se realiza agregando adyuvantes a la proteína D de manera tal que se induce una potente respuesta Th1 en el sujeto de manera que se optimiza el brazo del sistema inmunitario contra la proteína D mediado por células. Esto se logra sorprendentemente usando una composición liofilizada que comprende proteína D y 3D-MPL que se reconstituye poco antes de la administración. La invención también provee tales composiciones, un procedimiento para fabricar tales composiciones (liofilizando una mezcla que comprende proteína D y un adyuvante Th1) y un uso de tal composición en el tratamiento de la otitis media.
En un sentido más amplio, los autores de la invención prevén que liofilizando un inmunógeno en presencia de 3D-MPL, aumentará generalmente la respuesta inmunitaria Th1 contra el inmunógeno. La presente invención es por lo tanto aplicable a cualquier inmunógeno para el que se necesita una respuesta inmunitaria Th1 más potente. Tales inmunógenos comprenden antígenos proteicos bacterianos, virales y tumorales, así como proteínas y péptidos mismos.
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Ejemplos
Los ejemplos ilustran, pero no limitan la invención.
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Ejemplo 1
Polisacárido Capsular de S. pneumoniae
La vacuna candidata 11 valente incluye los serotipos de polisacáridos capsulares 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F que se realizaron esencialmente como se describe en el documento EP 72513. Se activa y deriva cada polisacárido usando química de CDAP (documento WO 95/08348) y se conjuga al vehículo proteico. Todos los polisacáridos se conjugan en su forma nativa, excepto para el serotipo 3 (al que se le redujo el tamaño para disminuir su viscosidad).
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Vehículo Proteico
El vehículo proteico seleccionado es la proteína D recombinante (PD) de Haemophilus influenzae no tipificable, expresada en E. coli.
Expresión de proteína D Proteína D de Haemophilus influenzae Construcción Genética para Expresión de Proteína D Materiales de Partida ADN que Codifica la Proteína D
La proteína D está altamente conservada entre todos los serotipos de H. influenzae y cepas no tipificables. El Dr. A. Forsgren, Departamento de Microbiología Médica, Universidad de Lund, Malmo General Hospital, Malmo, Suecia obtuvo el vector pHIC348 que contiene el gen con la secuencia de ADN que codifica la proteína D completa. La secuencia de ADN de proteína D fue publicada por Janson y col. (1991) Infect. Immun. 59: 119-125.
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El Vector de Expresión pMG1
El vector de expresión pMG1 es un derivado de pBR322 (Gross y col., 1985) en el que se introdujeron elementos de control para la transcripción y traducción de genes extraños insertados derivados de bacteriofago \lambda (Shatzman y col., 1983). Además, se cambió el gen de resistencia a la Ampicilina con el gen de resistencia a Kanamicina.
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La Cepa AR58 de E. coli
Se generó la cepa AR58 de E. coli por transducción de N99 con una disolución madre de fago P1 cultivado previamente en un derivado SA500 (galE::TN10, lambdaKil-cI857 \DeltaH1). N99 y SA500 son cepas K12 de E. coli derivadas del laboratorio del Dr. Martin Rosenberg en el National Institute of Health.
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El Vector de Expresión pMG1
Para la producción de proteína D, se clonó el ADN que codifica la proteína en el vector de expresión pMG1. Este plásmido usa señales de ADN de fago lambda para dirigir la transcripción y traducción de genes extraños insertados. El vector contiene el promotor PL, el operador OL y dos sitios de utilización (NutL y NutR) para aliviar los efectos de polaridad transcripcional, cuando se provee proteína N (Gross y col., 1985). Los vectores que contienen el promotor PL se introducen en un hospedador lisogénico de E. coli para estabilizar el ADN del plásmido. Las cepas lisogénicas del hospedador contienen ADN de fago lambda defectivo para la replicación integrado en el genoma (Shatzman y col., 1983). El ADN cromosómico del fago lambda dirige la síntesis de la proteína represora cI que se une al represor OL del vector y previene la unión de ARN polimerasa al promotor PL y por lo tanto la transcripción del gen insertado. El gen cI de la cepa AR58 de expresión contiene un mutante sensible a la temperatura de manera que la transcripción dirigida por PL puede regularse por medio de cambios de temperatura, es decir, un aumento en la temperatura de cultivo inactiva el represor y se inicia la síntesis de la proteína extraña. Este sistema de expresión permite la síntesis controlada de proteínas extrañas especialmente de aquellas que pueden ser tóxicas para la célula (Shimataka & Rosenberg, 1981).
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La Cepa AR58 de E. coli
La cepa lisogénica de E. coli AR58 usada para la producción del vehículo de proteína D es un derivado de la cepa de E. coli K12 N99 estándar según NIH (F-su-galK2, lacZ-thr-). Contiene un fago lambda lisogénico defectuoso (galE::TN10, lambdaKil-cI857 \DeltaH1). El fenotipo Kil- previene la desconexión de la síntesis macromolecular del hospedador. La mutación cI857 confiere una lesión sensible a la temperatura al represor cI. La deleción \DeltaH1 elimina el operón derecho del fago lambda y los loci bio, uvr3, y chlA del hospedador. La cepa AR58 se generó por transducción de N99 con una disolución madre de fago P1 cultivado previamente en un derivado SA500 (galE::TN10, lambdaKil-cI857 \DeltaH1). La introducción del lisógeno defectuoso en N99 se seleccionó con tetraciclina gracias a la presencia de un transposón TN10 que codifica resistencia a la tetraciclina en el gen galE adyacente.
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Construcción del Vector pMGMDPPrD
Se usó el vector pMG 1 que contiene el gen que codifica la proteína no estructural S1 del virus de Influenza (pMGNSI) para construir pMGMDPPrD. Se amplificó el gen de proteína D por PCR a partir del vector pHIC348 (Janson y col. 1991) con cebadores de PCR que contienen sitios de restricción NcoI y XbaI en los extremos 5' y 3', respectivamente. Posteriormente se introdujo el fragmento NcoI/XbaI en pMGNS1 entre NcoI y XbaI creando así una proteína de fusión que contiene los 81 aminoácidos N-terminal de la proteína NS1 seguidos por la proteína D. Se marcó este vector pMGNS1 PrD.
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En base a la construcción descrita anteriormente se generó la construcción final para la expresión de proteína D. Se eliminó una región del fragmento BamHI/BamHI de pMGNS1PrD. Esta hidrólisis de ADN elimina la región que codifica NS1, excepto por los primeros tres residuos N-terminales. Tras la nueva unión del vector se generó un gen que codifica una proteína de fusión con la siguiente secuencia de aminoácidos N-terminal:
1
La proteína D no contiene un péptido líder o la cisteína N-terminal a los que normalmente están unidas cadenas de lípidos. Por lo tanto la proteína ni es excretada dentro del periplasma ni se le agregan lípidos y permanece en el citoplasma en una forma soluble.
Se introdujo la construcción final pMG-MDPPrD en la cepa hospedadora AR58 por medio de choque de calor a 37ºC. Se seleccionaron las bacterias que contienen plásmido en presencia de Kanamicina. La presencia de ADN que codifica proteína D se demostró por digestión de ADN aislado de plásmidos con endonucleasas seleccionadas. Se nombra a la cepa recombinante de E. coli como ECD4.
La expresión de proteína D está bajo el control del promotor lambda PL/operador Ol. La cepa hospedadora AR58 contiene un gen cI sensible a la temperatura en el genoma que bloquea la expresión a partir de lambda PL a bajas temperaturas uniéndose a OL. Una vez que se eleva la temperatura cI se libera de OL y se expresa la proteína D. Al final de la fermentación las células se concentran y se congelan.
La extracción a partir de las células cultivadas y la purificación de proteína D se realizó de la siguiente manera. Se descongela el sedimento del cultivo celular congelado y se resuspende en una solución de disrupción celular (tampón citrato pH 6,0) hasta una DO_{650} = 60. Se pasa la suspensión dos veces a través de un homogeneizador de alta presión a P = 100 MPa. Se clarifica el homogeneizado del cultivo celular por centrifugación y se eliminan los restos celulares por filtración. En la primera etapa de purificación el lisado filtrado se aplica a una columna de cromatografía de intercambio catiónico (SP Sepharose de Flujo Rápido). PD se une a la matriz de gel por interacción iónica y se eluye mediante una etapa en la que se aumenta la fuerza iónica del tampón de elución.
En una segunda etapa de purificación se retienen impurezas en una matriz de intercambio aniónico (Q Sepharose de Flujo Rápido). PD no se une al gel y puede recogerse en el fluido obtenido.
En ambas etapas de cromatografía en columna se controla la recolección de fracciones mediante la DO. Se concentra por ultrafiltración el fluido obtenido de la columna de intercambio aniónico que contiene la proteína D purificada.
El retenido de la ultrafiltración que contiene proteína D se pasa finalmente a través de una membrana de 0,2 \mum.
Química Química de Activación y Acoplamiento
Las condiciones de activación y acoplamiento son específicas para cada polisacárido. Éstas se presentan en la Tabla 1. Se disolvió el polisacárido nativo (excepto para PS3) en NaCl 2M o en agua para inyección. La concentración óptima de polisacáridos se evaluó para todos los serotipos.
De una solución madre de 100 mg/ml en acetonitrilo, se agregó CDAP (relación CDAP/PS 0,75 mg/mg PS) a la solución de polisacárido. Tras 1,5 minutos se agregó trietilamina 0,2M para obtener el pH específico de activación. La activación del polisacárido se realizó a este pH durante 2 minutos a 25ºC. Se agregó proteína D (la cantidad depende de la relación inicial PS/PD) al polisacárido activado y se realizó la reacción de acoplamiento al pH específico durante 1 hora. Posteriormente se inactivó la reacción con glicina durante 30 minutos a 25ºC y durante toda la noche a 4ºC.
Se purificaron los conjugados por medio de filtración en gel usando una columna de filtración con gel Sephacryl 500HR equilibrada con NaCl 0,2M.
Se determinó el contenido de carbohidrato y proteína de las fracciones eluidas. Se combinaron los conjugados y se filtraron de manera estéril en una membrana de esterilización de 0,22 \mum. Se determinaron las relaciones PS/Proteína en las preparaciones de conjugados.
Caracterización
Se caracterizó cada conjugado y cumplió con las especificaciones descritas en la Tabla 2. Se midió el contenido de polisacárido (\mug/ml) por la prueba del Resorcinol y el contenido de proteína (\mug/ml) mediante la prueba de Lowry. Se determina la relación final PS/PD mediante la relación de las concentraciones.
Contenido Residual de DMAP (ng/\mug PS)
La activación del polisacárido con CDAP introduce un grupo cianato en el polisacárido y se libera DMAP (4-dimetilaminopiridina). Se determinó el contenido residual de DMAP por medio de un ensayo específico desarrollado en SB.
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Contenido de Polisacárido Libre (%)
Se determinó el contenido de polisacárido libre en conjugados mantenidos a 4ºC o almacenados durante 7 días a 37ºC en el sobrenadante obtenido tras la incubación con anticuerpos \alpha-PD y sulfato de amonio saturado, seguida por una centrifugación.
Se usó un ELISA de \alpha-PS/\alpha-PS para la cuantificación de polisacárido libre en el sobrenadante. También se controló la ausencia de conjugado por medio de un ELISA \alpha-PD/\alpha-PS. La reducción de la cantidad de polisacárido libre da como resultado una vacuna de conjugado mejorada.
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Antigenicidad
Se analizó la antigenicidad en los mismos conjugados en el ELISA tipo sándwich en el que la captura y detección de anticuerpos fue \alpha-PS y \alpha-PD respectivamente.
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Contenido de Proteína Libre (%)
Se determinó el nivel de proteína D residual "libre" usando un procedimiento con tratamiento de SDS de la muestra. Se calentó el conjugado 10 min a 100ºC en presencia de SDS 0,1% y se inyectó en una columna de filtración con gel SEC-HPLC (TSK 3000-PWXL). Como la proteína D es un dímero, existe el riesgo de sobreestimar el nivel de proteína D "libre" por disociación de la estructura con SDS.
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Tamaño Molecular (K_{av})
Se determinó el tamaño molecular en una columna de filtración de gel SEC-HPLC (TSK 5000-PWXL).
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Estabilidad
Se midió la estabilidad en un gel de filtración HPLC-SEC (TSK 6000-PWXL) para conjugados mantenido a 4ºC y almacenado durante 7 días a 37ºC. En la Tabla 2 se presenta la caracterización 11-valente.
Los conjugados proteicos pueden adsorberse en fosfato de aluminio y combinarse para formar la vacuna final.
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Conclusión
Se produjeron conjugados inmunógenos que demostraron ser componentes de una vacuna prometedora. Las condiciones de CDAP optimizadas para la mejor calidad final del producto de polisacáridos conjugados de neumococo se descubrieron para cada una de las 11 valencias. Por ello los conjugados de estos polisacáridos de neumococo obtenibles por el procedimiento anterior de CDAP mejorado (optimizado) (independientemente de la proteína portadora, pero preferentemente proteína D) es otro aspecto de la invención.
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Ejemplo 2
Estudio del Efecto de Adyuvantes Avanzados en la Inmunogenicidad de la Vacuna de Conjugado PS-PD 11 Valente de Neumococo en Ratas Infantes
Se inmunizaron ratas infantes con vacuna de conjugado PS-PD 11 valente de neumococo a una dosificación de 0,1 \mug de cada polisacárido (realizada de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 1), y usando las formulaciones de adyuvantes siguientes: ninguno, AlPO_{4}, 3D-MPL, 3D-MPL en AlPO_{4}.
La formulación con 3D-MPL solo fue estadísticamente (y sorprendentemente) más inmunógena (MGC de IgG más elevada) que las otras formulaciones para 5 de 11 antígenos. Esto fue así tanto para concentraciones altas como bajas de 3D-MPL.
La opsonofagocitosis confirmó los resultados de MGC.
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Materiales y Procedimientos Protocolo de Inmunización
Se repartieron aleatoriamente ratas lactantes OFA a diferentes madres y tenían 7 días de vida cuando recibieron la primera inmunización. Recibieron 2 inmunizaciones adicionales tras 14 y 28 días. Se obtuvieron muestras de sangre en el día 56 (28 días post III). Todas las vacunas se inyectaron por vía s.c., y se realizó en grupos de 10 ratas por vacuna.
Se inmunizó a las ratas con una vacuna de conjugado de neumococo 11 valente que comprende los siguientes serotipos de polisacáridos conjugados con proteína D: 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, 23F.
Formulación
Para examinar el efecto de diferentes adyuvantes avanzados, se mantuvo constante la dosificación de conjugado en 0,1 \mug de cada polisacárido y se formularon los adyuvantes AlPO_{4} y 3D-MPL en diferentes dosificaciones y combinaciones, incluyendo sin ningún adyuvante. En la Tabla 3 se presenta una lista de éstos para referencia.
Adsorción sobre AlPO_{4}
Los monovalentes concentrados, adsorbidos se prepararon de acuerdo con el siguiente procedimiento. Se mezclaron 50 \mug de AlPO_{4} (pH 5,1) con 5 \mug de polisacáridos conjugados durante 2 horas. Se ajustó el pH hasta 5,1 y se dejó la mezcla durante otras 16 horas. Se agregó NaCl 1500 mM para alcanzar la concentración salina de 150 mM. Tras 5 minutos se agregaron 5 mg/ml de 2-fenoxietanol. Tras otros 30 minutos se ajustó el pH hasta 6,1 y se dejó durante más de 3 días a 4ºC.
Preparación de Diluyentes
Se prepararon tres diluyentes en NaCl 150 mM/5 mg/ml de fenoxietanol.
A: AlPO_{4}, 1 mg/ml.
B: 3D-MPL en AlPO_{4}, 250 y 1000 \mug/ml respectivamente. Relación de pesos 3D-MPL/AlPO_{4} = 5/20
C: 3D-MPL en AlPO_{4}, 561 y 1000 \mug/ml respectivamente. Relación de pesos 3D-MPL/AlPO_{4} = 50/89
Preparación de Undecavalente Adsorbido
Se mezclaron los once monovalentes PS-PD concentrados, adsorbidos en las relaciones correctas. Se agregó el complemento de AlPO_{4} como diluyente A. Cuando fue necesario, se agregó 3D-MPL como solución acuosa (no adsorbida, Forma 1, ver a continuación) o como diluyente B o C (3D-MPL adsorbido en AlPO_{4} en 2 dosis, Forma 2, ver a continuación).
Forma 1
Se agregó 3D-MPL a los conjugados combinados adsorbidos como una suspensión acuosa. Se mezcló con el undecavalente durante 10 minutos a temperatura ambiente y se almacenó a 4ºC hasta la administración.
Forma 2
Se preadsorbió 3D-MPL en APO_{4} previo al agregado a los conjugados combinados adsorbidos (diluyentes B y C). Para preparar 1 ml de diluyente, se mezcló una suspensión acuosa de 3D-MPL (250 ó 561 \mug) con 1 mg de AlPO_{4} en NaCl 150 mM a pH 6,3 durante 5 min a temperatura ambiente. Se diluyó esta solución en NaCl a pH 6,1/fenoxi y se incubó durante toda la noche a 4ºC.
Preparación de Undecavalente No Adsorbido
Se mezclaron los once conjugados PS-PD y se diluyeron en las relaciones correctas en NaCl 150 mM a pH 6,1, fenoxi. Cuando fue necesario, se agregó 3D-MPL como solución (no adsorbido).
Se prepararon las formulaciones de todas las inyecciones 18 días antes de la primera administración.
ELISA
Se realizó el ELISA para medir IgG de rata usando el protocolo derivado del Workshop de WOH en el procedimiento de ELISA para la cuantificación de anticuerpos IgG contra polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae en suero humano. En esencia, se recubre la placa de microtitulación directamente con polisacárido capsular purificado. Se incuban muestras de suero previamente con el polisacárido de pared celular común a todos los neumococos (sustancia C) y que está presente aproximadamente en un 0,5% en polisacáridos de neumococos purificados de acuerdo con la descripción (documento EP 72513 B1). Se usaron reactivos de Jackson ImmunoLaboratories Inc. para detectar IgG murina unida. Se referenciaron las curvas de titulación a patrones internos (anticuerpos monoclonales) modeladas mediante ecuación Logistic log. Se realizaron los cálculos usando el programa informático SoftMax Pro. Se esperaba que el error máximo absoluto en estos resultados estuviera dentro de un factor de 2. El error relativo es menor que 30%.
Opsonofagocitosis
Se determinaron los títulos opsónicos para los serotipos 3, 6B, 7F, 14, 19F y 23F usando el protocolo del CDC (Opsonofagocitosis de Streptococcus pneumoniae usando células Diferenciadas HL60, versión 1.1) con PMN humanos purificados y complemento de crías de conejo. La modificación incluyó el uso de cepas de elaboración propia de neumococo y se reemplazaron las células fagocíticas HL60 por PMN neutrófilos humanos purificados (existe un alto grado de correlación entre estas células fagocíticas). Además, se agregaron perlas de vidrio de 3 mm a los pocillos de microtitulación para incrementar la mezcla, lo que permitió la reducción de la relación fagocito:bacteria, siendo la relación recomendada de 400.
Resultados Concentraciones de IgG
Se determinó la media geométrica de las concentraciones de IgG para cada serotipo y PD, y se muestran en las Tablas 4 a 10. Para los serotipos 6B, 14, 19F y 23F, se incluyen para comparación resultados previos obtenidos usando una formulación tetravalente.
En las Tablas 4 a 10 se han resaltado las concentraciones de IgG más elevadas. El valor estadístico de p para composiciones con 3D-MPL frente a composiciones con 3D-MPL/AlPO_{4} está en la Tabla 11. La formulación de adyuvante número 4 (conjugados no adsorbidos con dosis alta de 3D-MPL) da la MGC más alta para 9 de 11 casos. En 5/11 casos, MPL en baja dosis es el segundo más inmunógeno. Además, el agregado de adyuvantes da MGC más alta que la modificación de la dosis para todos los serotipos (no mostrado), y esto es estadísticamente significativo para los serotipos 4, 6B, 7F, 18C y 23F (p<0,05 para IC 95%).
Opsonofagocitosis
Los resultados de opsonofagocitosis en sueros combinados se muestra para los serotipos 3, 6B, 7F, 14, 19F y 23F en las Tablas 4 a 8. Para la mayor parte, estos títulos opsónicos confirman la MGC de IgG. De hecho, la correlación con la concentración de IgG es mayor que 85% para los serotipos 6B, 19F, 23F (datos no mostrados). Para el serotipo 3, es importante notar que sólo el grupo con 3D-MPL indujo la actividad opsónica por encima del umbral.
Conclusiones
En este experimento, no se esperaba que el uso de 3D-MPL solo induciría las concentraciones más elevadas de IgG.
La MGC de IgG máxima obtenida modificando el adyuvante se comparó con la MGC máxima obtenida modificando la dosificación de PS y se halló que 3D-MPL podía inducir respuestas significativamente más altas en 5/11 serotipos.
La Tabla 11 muestra que cuando se comparan las composiciones con 3D-MPL y 3D-MPL/AlPO_{4} (comparando el procedimiento de formulación, y la dosis de 3D-MPL), 5 de los conjugados de polisacáridos mejoran significativamente, en términos de inmunogenicidad, cuando se formulan sólo con 3D-MPL en lugar de 3D-MPL más AlPO_{4}: PS 4, PS 6B, PS 18C, PS 19F, y PS 23F.
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Ejemplo 3
Estudio del Efecto de Combinación en la Inmunogenicidad de Conjugados PS 4, PS 6B, PS 18C, PS 19F, y PS 23F en Ratas Adultas
Se inmunizaron ratas adultas con vacunas de conjugado de polisacárido de neumococo-proteína D individualmente, o combinada en una composición multivalente (tetra-, penta-, hepta-, o decavalente). Se inmunizaron grupos de 10 ratas dos veces con una diferencia de 28 días y se obtuvieron muestras de sangre el día 28 y 42 (14 días tras la 2ª dosis).
Se probaron los sueros por medio de ELISA para anticuerpos IgG para los polisacáridos de neumococos. Todos los conjugados indujeron anticuerpos IgG específicos como se midió por ELISA. La Tabla 12 muestra el efecto de la combinación de conjugados monovalentes de PS 6B, PS 18C, PS 19F, y PS 23F proteína D en la inmunogenicidad en ratas adultas, como se mide por medio de la concentración de IgG en el día 14 posterior a la 2ª dosis.
Se realizó el análisis estadístico en todas las muestras para determinar si las diferencias en la concentración de anticuerpos tras la combinación eran significativas. La combinación de cualquiera de los conjugados de serotipos PS 6B, PS 18C, PS 19F, y PS 23F proteína D en una vacuna multivalente no cambió significativamente su inmunoge-
nicidad.
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TABLA 1 Condiciones específicas de activación/acoplamiento/inactivación de conjugados de PS. S. pneumoniae-Proteína D 
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TABLA 11 Significancia estadística (valor de p) de si ciertos conjugados de polisacáridos de neumococos mejoraron la inmunogenicidad cuando se formularon con 3D-MPL solo frente a los formulados con 3D-MPL/AlPO_{4}. Se considera altamente significativo un valor de p por debajo de 0,01. Forma 1 y Forma 2 indica el procedimiento de formulación
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TABLA 12 Media Geométrica de la concentración de IgG (\mug/ml) en el día 14 post 2ª dosis tras la inmunización de ratas adultas con 1,0 \mug de conjugado de polisacárido-proteína D solo o combinado en vacuna tetravalente, pentavalente, heptavalente o decavalente. Estos datos están combinados a partir de 5 experimentos separados
14
Ejemplo 4
Impacto Beneficioso de la Adición de Neumolisima y 3D-MPL en la Eficacia Protectora de la Vacuna de Polisacárido 11 Valente Conjugada con PD Contra la Colonización Pulmonar de Neumococos en Ratones Lecturas Inmunológicas Dosificación de Neumolisina-IgG Sérica Específica por ELISA
Se recubrieron inmunoplacas Maxisorp Nunc durante 2 horas a 37ºC con 100 \mul/pocillo de neumolisina nativa recombinante (PLY) diluida en PBS. Se lavaron las placas 3 veces con tampón NaCl 0,9% Tween-20 0,05%. Posteriormente se agregaron diluciones seriadas 2 veces (en PBS/Tween-20 0,05%, 100 \mul por pocillo) de un suero anti-PLY de referencia como curva patrón (comenzando con 670 ng/ml de IgG) y se incubaron muestras de suero (comenzando con una dilución 1/10) durante 30 minutos a 20ºC bajo agitación. Tras el lavado descrito anteriormente, se incubaron IgG de cabra anti-ratón conjugada con peroxidasa (Jackson) diluida 5000 veces en PBS/Tween-20 0,05% (100 \mul/pocillo) durante 30 minutos a 20ºC bajo agitación. Tras lavar, se incubaron las placas durante 15 min a temperatura ambiente con 100 \mul/pocillo de tampón de revelado (OPDA 0,4 mg/ml y H_{2}O_{2} 0,05% en tampón citrato 100 mM a pH 4,5). Se detuvo el revelado agregando 50 \mul/pocillo de HCl 1N. Se realizaron las lecturas de densidad óptica a 490 y 620 nm usando un inmunolector Emax (Molecular Devices). Se calcularon los títulos de anticuerpo por el procedimiento matemático de 4 parámetros usando el programa informático SoftMaxPro.
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Inhibición de Hemólisis
Se realizó este ensayo para medir la capacidad de los anticuerpos séricos de inhibir la actividad hemolítica de la neumolisina (PLY). Con el fin de eliminar el colesterol (susceptible de interactuar con PLY), se trataron las muestras de suero 2 veces de la siguiente manera: se mezclaron con 1 volumen igual de cloroformo y posteriormente se incubaron durante 45 minutos bajo agitación. Se recogieron los sobrenadantes tras centrifugar durante 10 minutos a 1000 rpm. Se diluyeron los sueros libres de colesterol (diluciones seriadas 2 veces en ditiotreitol 1 mM, 0,01% BSA, TRIS 15 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5) en microplacas de 96 pocillos (Nunc). Se agregaron cincuenta \mul de una solución que contiene 4 UH (Unidades Hemolíticas) de PLY en cada pocillo y se incubaron durante 15 minutos a 37ºC. Posteriormente, se agregaron 100 \mul de glóbulos rojos de oveja (solución al 1%) durante 30 minutos a 37ºC. Tras centrifugar durante 10 minutos a 1000 rpm, se recogieron los sobrenadantes (150 \mul) y se colocaron en otra microplaca de 96 pocillos para leer la densidad óptica a 405 nm. Los resultados se expresaron como el punto medio de los títulos de
dilución.
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Detoxificación Química de Neumolisina
Se dializó neumolisina nativa recombinante (PLY) contra tampón Fosfato 50 mM NaCl 500 mM a pH 7,6. Todas las demás etapas se realizaron a 39,5ºC bajo agitación esporádica. En el día 1, se agregaron Tween-80 10% (1/250 v/v), N-acetiltriptófano 57,4 mM a pH 7,6 (3/100 v/v), glicina 2,2 M en tampón Fosfato (1/100 v/v) y formaldehído 10% en tampón Fosfato (3/100 v/v) en la solución de PLY. En los días 2 y 3, se agregó formaldehído 10%, en proporciones 3/100 y 2/100 v/v, respectivamente. Se mantuvo la incubación a 39,5ºC hasta el día 7 bajo agitación esporádica. Finalmente, se dializó PLY contra tampón Fosfato 50 mM NaCl 500 mM a pH 7,6. Se demostró la inactivación completa de PLY en el ensayo de hemólisis.
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Exposición Intranasal con Neumococo en Ratones OF1
Se inocularon ratones hembra OF1 de siete semanas de vida por vía intranasal bajo anestesia con 5 x 10^{5} UFC de S. pneumoniae serotipo 6B adaptadas para ratón. Se extrajeron los pulmones a las 6 horas de la exposición y se homogeneizaron (Ultramax, 24000 rpm, 4ºC) en medio Todd Hewith Broth (THB, Gibco). Se pusieron en placa diluciones seriadas a 1/10 de homogeneizados de pulmón durante toda la noche a 37ºC en placas de Petri que contienen agar THB suplementado con extracto de levadura. Se determinó la infección pulmonar por neumococo como el número de UFC/ratón, expresado como el promedio logarítmico. El límite de detección fue de 2,14 log UFC/ratón.
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Ejemplo 4A
Efecto del Adyuvante 3D-MPL en la Respuesta inmunitaria Anti-Neumolisina
En el presente ejemplo, evaluamos el impacto de la adición de adyuvante 3D-MPL en la respuesta inmunitaria a la neumolisina nativa recombinante (PLY, provista por J. Paton, Children's Hospital, North Adelaide, Australia) y su contrapartida químicamente detoxificada (DPLY). La detoxificación química se realizó como se ha descrito anteriormente.
Se inmunizaron grupos de 10 ratones hembra Balb/c de 6 semanas de edad por vía intramuscular en los días 0, 14 y 21 con 1 \mug de PLY o DPLY contenido en A: AlPO_{4} 100 \mug; o B: AlPO_{4} 100 \mug + 5 \mug de 3D-MPL (monofosforil lípido A 3 des-O-acilado, suministrado por Ribi Immunochem). Las Figuras 1A y 1B muestran los títulos de IgG por ELISA y de Inhibición de Hemólisis (HLI) medidos en suero post III.
Con cualquier antígeno, las mejores respuestas inmunitarias se indujeron en animales vacunados con formulaciones suplementadas con 3D-MPL. Es interesante destacar que DPLY fue tan inmunógeno como PLY cuando se administró con AlPO_{4} + 3D-MPL, mientras que resultó un inmunógeno más débil en la formulación con AlPO4. Esto mostró la ventajosa capacidad de 3D-MPL para mejorar la respuesta de anticuerpos para neumolisina detoxificada.
En composiciones que contienen neumolisina, resultaría de preferencia usar neumolisina químicamente detoxificada en vez de neumolisina detoxificada por mutación. Esto es porque los mutantes detoxificados obtenidos hasta el momento todavía tienen actividad de toxina residual - la neumolisina detoxificada químicamente no la tiene. Por lo tanto se considera otro aspecto de la invención que, en general, las composiciones que comprenden neumolisina (o mutantes de neumolisina) que se detoxificó químicamente para uso en una vacuna, deberían contar con el agregado de un adyuvante Th1, de preferencia 3D-MPL. La invención provee tales composiciones. También se prevé un procedimiento para aumentar la respuesta inmunitaria de neumolisina químicamente detoxificada dentro de una composición inmunógena que comprende las etapas de agregar un adyuvante Th1 (de preferencia 3D-MPL) a la
composición.
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Ejemplo 4B
Impacto Beneficioso de la Adición de un Mutante Atenuado de Neumolisina y Adyuvante 3D-MPL en la Eficacia Protectora de la Vacuna de Polisacáridos 11 Valente Conjugada con PD Contra la Colonización Pulmonar en Ratones OF1 Expuestos Intranasalmente con Serotipo 6B
En el presente ejemplo, evaluamos la eficacia terapéutica de una vacuna que contiene un conjugado de polisacárido 11 valente y proteína D, antígeno neumolisina mutante atenuado (PdB, documento WO 90/06951) y adyuvantes AlPO_{4} + 3D-MPL, en comparación con la formulación clásica de conjugado adsorbido en AlPO4 de polisacárido 11 valente y proteína D.
Se inmunizaron grupos de 12 ratones hembra OF1 de 4 semanas de vida por vía subcutánea en los días 0 y 14 con formulaciones que contienen A: 50 \mug de APO_{4}; B: 0,1 \mug de PS/serotipo de vacuna de polisacárido 11 valente conjugada con PD + 50 \mug de AlPO4; o C: 0,1 de \mug PS/serotipo de vacuna de polisacárido 11 valente conjugada con PD + 10 de \mug PdB (provisto por J. Paton, Children's Hospital, North Adelaide, Australia) + 50 \mug de APO_{4} + 5 \mug de 3D-MPL (suministrado por Ribi Immunochem). La exposición se realizó en el día 21 como se ha descrito anteriormente.
Como se muestra en la Figura 1C, la vacuna de conjugado de polisacárido 11 valente suplementada con PdB y con adyuvante AlPO_{4} + MPL confirió una protección muy significativa (p<0,007) (las barras negras representan la media aritmética). Por el contrario, no se observó protección significativa en animales inmunizados con la formulación de conjugado de polisacárido 11 valente/AlPO4. Este resultado probó que el agregado de antígeno neumolisina (incluso atenuado) y adyuvante 3D-MPL mejora la eficacia de la vacuna de conjugado de polisacárido 11 valente contra la neumonía.
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Ejemplo 4C
Correlatos Inmunitarios de la Protección Mostrada en el Ejemplo 4B
Con el fin de establecer los correlatos inmunitarios de protección conferida en el ejemplo 4B, por la vacuna de conjugado de polisacárido 11 valente suplementada con neumolisina mutante atenuada (PdB) y 3D-MPL, se midieron las respuestas de anticuerpo sérico a polisacárido 6B y PdB previo a la exposición como se ha descrito anterior-
mente.
Posteriormente se compararon los títulos de anticuerpos con los números de colonias de bacterias medidos en pulmones de los correspondientes animales recogidos 6 horas después de la exposición. Se calculó R^{2} en regresiones lineales Log/Log.
Las R^{2} calculadas fueron iguales a 0,18 y 0,02 para las respuestas de anticuerpo anti-PdB y anti-6B, respectivamente. Esto mostró la ausencia de correlación entre las respuestas inmunitarias humorales y la protección para ambos antígenos. Los títulos de anticuerpo anti-6B no fueron significativamente diferentes en los grupos inmunizados con la vacuna de conjugado 11 valente (GMT = 0,318 ng/ml) o con la misma vacuna suplementada con PdD y 3D-MPL (GMT = 0,458 ng/ml). Por lo tanto, la mejor protección observada con la formulación C no se debió solamente a la respuesta de anticuerpos para polisacárido 6B más elevada.
Tomados conjuntamente, los resultados sugieren que la protección no está mediada sólo por las respuestas inmunitarias humorales, sino también por una inmunidad mediada por células inducida por el antígeno PdB en presencia de 3DMPL. Esto respaldó aún más el agregado de antígeno(s) proteico(s) y adyuvante(s) potente(s) en la vacuna de conjugado de polisacáridos de neumococo, para así coordinar ambos brazos del sistema inmunitario para una protección óptima.
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Ejemplo 5
Cooperación de Ambos Brazos del Sistema inmunitario en Ratones Activamente Inmunizados con Neumolisina y Pasivamente Inmunizados con Anticuerpos Contra PS de Neumococo
Ejemplo 5A
Hallazgo de la Concentración Protectora Contra Neumonía del Anticuerpo Anti-polisacárido-6B (Anti-PS) Administrado Pasivamente Procedimiento
Grupos de Vacunas: Se inmunizaron pasivamente (i.p.) cuatro grupos de 16 ratones en el día -1 con 100 \mul de antisuero anti-polisacárido de rata sin diluir de acuerdo con los grupos detallados a continuación. (total 64 ratones)
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Animales: 64 ratones macho CD-1 de Charles River, Canadá, con un peso aproximado de 35 g (aproximadamente 10 semanas de vida).
Anestesia: Los ratones se anestesiaron con isoflurano (3%) más O_{2} (1 l/min).
Organismo: Se cultivó S. pneumoniae N1387 (serotipo 6) a partir de placas de agar tripticasa soja (TSA) suplementado con 5% de sangre de caballo y suspendido en 6 ml de PBS. Inmediatamente antes de la infección, se diluyó 1 ml de suspensión bacteriana en 9 ml de agar nutritivo fundido frío (BBL) y se mantuvo a 41ºC. Los ratones recibieron aproximadamente 6,0 log 10 ufc/ratón en un volumen de 50 \mul.
Infección: se anestesiaron los ratones en el día 0 como se ha descrito anteriormente y se infectaron con S. pneumoniae N1387 (50 \mul de suspensión bacteriana enfriada) por instilación intrabronquial vía intubación intratraqueal no quirúrgica. Este procedimiento fue descrito por Woodnut y Berry (Antimicrob. Ag. Chemotherap. 43: 29 (1999)).
Muestras: En el día 3 post infección, se sacrificaron 8 ratones/grupo por sobredosis de CO2 y se escindieron los pulmones y se homogeneizaron en 1 ml de PBS. Se prepararon diluciones seriadas a 1/10 en PBS para enumerar las bacterias viables. Se inocularon muestras (20 \mul) por triplicado en placas de TSA suplementadas con 5% de sangre de caballo y se incubaron durante toda la noche a 37ºC antes de la evaluación. Las otras series de ratones se sacrificaron en el día 7 y se tomaron muestras como se ha explicado anteriormente.
Resultados
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Los números entre paréntesis son el número de animales que murieron previamente al tiempo de toma de muestras.
Conclusión: En general, no hubo diferencias significativas en el número de bacterias aisladas de cualquier grupo de tratamiento. Esto indica que no se alcanzó protección medible por los anti-polisacáridos a concentraciones de hasta e incluyendo 5 \mug/ml.
Esto es similar a lo observado en algunos ensayos clínicos con seres humanos, esto es, el anticuerpo anti-polisacárido es insuficiente para proteger a algunas poblaciones contra la neumonía por neumococo.
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Ejemplo 5B
Determinar la protección para neumonía alcanzada por administración activa de PLY (neumolisina) con o sin adyuvante, y sinergia con anticuerpo anti-PS subóptimo Procedimiento
Animales: 128 ratones CD-1 macho (6 semanas de vida en el momento de la inmunización, 10 semanas de vida en el momento de la infección) de Charles River, St. Constant, Quebec, Canadá. Los animales pesaron aproximadamente 20 g a las 6 semanas y 38 g a las 10 semanas.
Inmunizaciones: Se inmunizaron seis grupos de 16 ratones por inyección subcutánea en los días -22 y -14 con 100 \mul de vacuna como se detalla a continuación. (Total 128 ratones). Se obtuvo PdB (documento WO 90/06951) por cortesía de Dr. James Paton, Australia. Se obtuvo 3D-MPL de Ribi/Corixa.
En el día -1 se inmunizaron (i.p. 100 \mul) grupos específicos (ver Tabla a continuación) pasivamente con una concentración de 4,26 \mug/ml (4 ml de 5 \mug/ml + 1,3 ml de 2 \mug/ml) de anticuerpo anti-polisacárido de ratón.
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Infección: Se anestesiaron los ratones en el día 0 (3% isoflurano más 1 l/min de O_{2}). Se prepararon inóculos bacterianos a partir de un cultivo de S. pneumoniae N1387 (serotipo 6) a partir de placas de agar tripticasa soja (TSA) suplementado con 5% de sangre de caballo y suspendido en 6 ml de PBS. Se preparó una dilución a 1/10 (1 ml más 9 ml) en agar nutritivo fundido enfriado (mantenido a 41ºC) inmediatamente previo a la infección. Se infectaron los ratones por instilación intrabronquial vía intubación intratraqueal y recibieron aproximadamente 6,0 log 10 ufc/ratón en un volumen de 50 \mul. Este procedimiento fue descrito por Woodnut y Berry (Antimicrob. Ag. Chemotherap. 43: 29 (1999)).
Muestras: A las 72 horas post infección, se sacrificaron 8 ratones/grupo por sobredosis de CO2 y se escindieron los pulmones y se homogeneizaron en 1 ml de PBS. Se prepararon diluciones seriadas a 1/10 en PBS para enumerar las bacterias viables. Se inocularon muestras (20 \mul) por triplicado en placas de TSA suplementadas con 5% de sangre de caballo y se incubaron durante toda la noche a 37ºC antes de la evaluación. Las otras series de ratones se sacrificaron en el día 8 y se tomaron muestras como se ha explicado anteriormente.
Análisis de los Datos
La medida de resultados para comparación del tratamiento fue el número de bacterias en los pulmones en los días 3 y 7 post infección. Los resultados se presentan como medias de grupos con desviaciones estándar. El análisis estadístico se realizó usando la prueba-t de Student donde un valor de P <0,05 se considera significativo.
Resultados 72 horas Post Infección
Los recuentos bacterianos de los grupos 1-4 fueron significativamente inferiores (p<0,05) que aquellos de los grupos 1-3.
Los recuentos bacterianos de los grupos 1-4 fueron significativamente inferiores (p<0,05) que aquellos de los grupos 1-5.
168 horas Post Infección
El número de bacterias en todos los grupos fue aproximadamente 2 log inferior a los 8 días que a los 3 días, indicando que la infección se estaba resolviendo.
Los recuentos bacterianos de los grupos 1-2 fueron significativamente inferiores (p<0,05) a aquellos de los grupos 1-5.
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Como se demostró anteriormente, el anticuerpo anti-polisacárido solo (grupo 1-5) no brinda protección contra el crecimiento de neumococos en el pulmón. PdB con adyuvante AlPO4 tampoco confiere protección, pero en el día 8 existe una tendencia hacia una protección cuando PdB se combina con 3D-MPL (grupo 1-2).
En el día 3, el grupo más significativamente protegido, grupo 1-4, tenía los tres elementos, PdB, 3D-MPL y anticuerpos anti-polisacáridos administrados pasivamente. Esta conclusión está respaldada por la tasa de mortalidad. El grupo 1-4 tuvo sólo 2/8 muertes comparado con 5/10 para los grupos 1-5 y 1-3.
Conclusión
Como el experimento se realizó con animales inmunizados pasivamente, el efecto sinérgico de la inmunización activa con neumolisina y MPL tampoco puede deberse a un aumento en el nivel de anticuerpos contra el antígeno polisacárido.
Como los animales se inmunizaron sólo pasivamente contra polisacárido de neumococo, para el día 8 los niveles de dicho anticuerpo deberían haber desaparecido del hospedador.
Aún así, pudo observarse protección significativa contra la neumonía por neumococo en grupos inmunizados con neumolisina más 3D-MPL y especialmente en grupos inmunizados con neumolisina más 3D-MPL más anticuerpo anti-polisacárido administrado pasivamente, que indica la sinergia de esta combinación.
Si la inmunización anti-polisacárido se hubiera realizado activamente (de preferencia con polisacárido conjugado), el efecto podría haber sido aún más marcado, ya que el efecto de memoria de células B, y los niveles constantes de anticuerpos anti-PS deberían contribuir con la cooperación de la respuesta inmunitaria (ver por ejemplo la Figura 1C donde muchos animales inmunizados activamente con polisacárido y proteína demostraron no tener bacterias en los pulmones tras la exposición).
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Ejemplo 6
Inmunogenicidad en ratones Balb/C de 1 año de edad de la vacuna de conjugado de polisacárido de neumococo 11 valente y Proteína D con adyuvante 3D-MPL Introducción y Objetivo(s)
La protección contra la infección por neumococos está mediada por anticuerpos específicos de serotipo a través de opsonofagocitosis. Se puede suponer que aumentos en la concentración de anticuerpos darían como resultado una protección mayor, y por lo tanto se ha invertido mucho esfuerzo en hallar formas para aumentar la respuesta humoral. Una estrategia que se aplicó con éxito para vacunas conjugadas en estudios preclínicos es el uso de adyuvantes inmunoestimulantes (revisión por Poolman y col. 1998, Carbohydrate-Based Bacterial Vaccines. En: Handbook of Experimental Pharmacology eds. P. Perlmann y H. Wigsell. Springer-Verlag, Heidelberg, D).
Los datos presentados en esta sección muestran los resultados del último experimento usando lotes clínicos en un protocolo diseñado para imitar un ensayo clínico.
Protocolo
Se inmunizaron ratones Balb/C de un año de edad con un décimo de la dosis para seres humanos de vacuna de conjugado de polisacárido de neumococo y proteína D, o vacuna de polisacárido pleno 23 valente. Las vacunas usadas fueron lotes clínicos DSP009, DSP013 o DSP014 correspondientes a la dosificación de 1 \mug de serotipos 6B y 23F y 5 \mug de los restantes serotipos de la vacuna conjugada 11 valente, la dosificación de 0,1 \mug de la vacuna conjugada 11 valente, o la dosificación de 0,1 \mug de la vacuna conjugada 11 valente con 5 \mug de adyuvante 3D-MPL, respectivamente. A todas las vacunas conjugadas 11 valentes se les agregó como adyuvante 50 \mug de AlPO_{4}.
Se inmunizaron grupos de 20 ratones por vía intramuscular. Las inyecciones de los grupos que se presentan en la siguiente tabla se realizaron en los días 0 y 21. Se obtuvieron muestras de sangre en el día 35, (14 días tras la segunda dosis).
TABLA Calendario de Inmunización para ratones Balb/C de 1 año de edad inmunizados con lotes clínicos de vacuna conjugada de polisacárido de neumococo y Proteína D
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Se probaron los sueros mediante ELISA para anticuerpos IgG para polisacáridos de neumococo siguiendo el protocolo de consenso de CDC/WHO, esto es, tras la neutralización del suero con polisacárido de pared celular. Se calibró el ELISA para dar concentraciones de anticuerpos en \mug/ml usando anticuerpos monoclonales IgG1 específicos de serotipo.
Los análisis estadísticos de comparaciones se calcularon usando UNISTAT versión 5.0 beta. Se realizó el método ANOVA por el Tukey-HSD en concentraciones de IgG transformadas a log. Se realizó la comparación de a pares de las tasas de seroconversión usando la prueba exacta de Fisher.
Resultados
En la siguiente tabla se muestran la MGC de IgG y un intervalo de confianza de 95% contra los 11 serotipos y proteína D inducida 14 días tras la segunda inmunización (dosis 2). Las tasas de seroconversión se muestran donde no se pudo calcular un intervalo de confianza de 95%.
El grupo 1 muestra el efecto de la inmunización con polisacáridos plenos, que normalmente inducen sólo la producción de IgM en animales. La mayoría de los niveles de IgG están por debajo del umbral de detección; sin embargo los ratones Balb/C fueron capaces de generar IgG contra unos pocos polisacáridos, principalmente los serotipos 3, 19F y 14.
La inmunización con vacunas de conjugado indujo la producción de anticuerpos IgG con altas tasas de seroconversión contra todos los serotipos excepto 23F.
Se observó una respuesta dependiente de la dosis (grupo 4 frente a grupo 2) sólo para los serotipos 7F y 19F, pero estas observaciones no fueron estadísticamente significativas. Se observó una mayor respuesta tras dos dosis (grupos b frente a grupos a) para los serotipos 3, 6B, 7F y 19F, y PD, y estas observaciones fueron estadísticamente significativas en muchos casos con las 3 formulaciones.
Más interesante es el efecto de 3D-MPL. Dos dosis de la vacuna formulada con 3D-MPL (grupo 3b) indujeron la MGC más alta de IgG específica, y esto fue estadísticamente significativo para todos los serotipos excepto 23F, en cuyo caso tuvo una tasa de seroconversión significativamente más alta (p = 0,02 grupo 3b frente a 2b, prueba exacta de Fisher).
TABLA Media Geométrica [IgG] e Intervalos de Confianza de 95% para Serotipos Seleccionados de Neumococo y Proteína D en Ratones Balb/C de 1 año de edad 14 Días Post II Inmunización con Vacuna de Conjugado PS 11 valente-PD
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Conclusión
Los datos presentados aquí demuestran que la adición de 3D-MPL a la vacuna de conjugado de polisacárido 11 valente de neumococo y Proteína D aumentó la respuesta inmunitaria en ratones Babl/C ancianos para todos los serotipos probados.
En la mayoría de los casos, dos dosis de vacuna indujeron una media geométrica de concentración de IgG más alta que una sola dosis. Ya que esto no se observa usando vacuna de polisacáridos plenos, incluso en seres humanos, se considera una indicación de una respuesta inmunitaria dependiente de linfocitos T y la inducción de memoria inmunitaria.
Estos datos respaldan un esquema de administración de vacuna usando polisacáridos de neumococo conjugados con adyuvantes Th1 (de preferencia 3D-MPL), con los que se administran al menos dos dosis de vacuna con adyuvante, de preferencia separadas por 1-12 semanas y más preferentemente separadas por 3 semanas. Se considera a tal esquema de administración otro aspecto de la invención.
Los ratones usados en el experimento no respondían a PS 23 (pleno o conjugado). Resulta interesante que aunque los niveles de anticuerpos contra el polisacárido se mantuvieron bajos sin importar la composición de vacuna usada, muchos más ratones respondieron a PS 23 cuando se usó como adyuvante 3D-MPL (la seroconversión fue significativamente más elevada). El uso de adyuvantes Th1, particularmente 3D-MPL, en composiciones de vacunas que comprenden polisacáridos de neumococos conjugados con el fin de solucionar la falta de respuesta frente al polisacárido de neumococo en una vacuna es aún otro aspecto de la invención. Un procedimiento para solucionar la falta de respuesta con la composición anteriormente mencionada usando el esquema de administración de dos dosis es aún otro aspecto.
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Ejemplo 7
Conjugado de Polisacárido C de Neisseria Meningitidis-Proteína D (PSC-PD) A: Expresión de la Proteína D
Como para el Ejemplo 1.
B: Fabricación del Polisacárido C
La fuente de polisacáridos del grupo C es la cepa C11 de N. meningitidis. Ésta fermenta usando técnicas clásicas de fermentación (documento EP 72513). Los polisacáridos en polvo seco usados en el procedimiento de conjugación son idénticos a Mencevax (SB Biologicals s.a.).
Se descongela una alícuota de la cepa C11 y se siembra en una placa de petri con medio Mueller Hinton suplementado con dializado de extracto de levadura (10%, v/v) y se incuba durante 23 a 25 horas a 36ºC en un incubador con aire saturado de agua.
Posteriormente se resuspende el crecimiento en superficie en medio de fermentación esterilizado y se inocula con esta suspensión en una botella Roux que contiene medio Mueller Hinton suplementado con dializado de extracto de levaduras (10%, v/v) en perlas de vidrio estériles. Tras la incubación de la botella Roux durante 25 horas a 36ºC en un incubador con aire saturado de agua, se resuspende el crecimiento de superficie en 10 ml de medio de fermentación estéril y 0,2 a 0,3 ml de esta suspensión se inoculan en otras 12 botellas de Roux de medio Mueller Hinton.
Tras incubar durante 23 a 25 horas a 36ºC en un incubador con aire saturado de agua, se resuspendió el crecimiento de superficie en 10 ml de medio de fermentación estéril. Se combinó la suspensión bacteriana en un matraz cónico.
Posteriormente se transfirió asépticamente esta solución al fermentador usando jeringas estériles.
La fermentación del meningococo se realiza en fermentadores dentro de una habitación limpia bajo presión negativa.
Generalmente la fermentación se completa tras 10-12 horas que corresponde a aproximadamente 10^{10} bacterias/ml (es decir la fase estacionaria temprana) y se detecta por el aumento de pH.
En esta etapa, se inactiva el cultivo completo por medio de calor (12 min a 56ºC) previo a la centrifugación. Previamente y tras la inactivación, se toma una muestra y se siembra en placas de petri con medio Mueller Hinton.
C: Purificación de PS
El procedimiento de purificación es un procedimiento de múltiples etapas que se realiza en todo el cultivo de fermentación. En una primera etapa de purificación el cultivo inactivado se clarifica por centrifugación y se recupera el sobrenadante.
La purificación de polisacáridos se basa en la precipitación con una sal de amonio cuaternario (Bromuro de Cetiltrimetilamonio/CTAB, CETAVLON R). CTAB forma complejos insolubles con polianiones tales como polisacáridos, ácidos nucleicos y proteínas dependiendo de su pI. Siguiendo condiciones iónicas controladas, este procedimiento puede usarse para precipitar impurezas (conductividad baja) o polisacáridos (conductividad alta).
Los polisacáridos incluidos en el sobrenadante clarificado precipitan usando tierra de diatomeas (CELITE® 545) como matriz para evitar la formación de masa inerte insoluble durante las diferentes precipitaciones/purificaciones.
Esquema de purificación para polisacárido C de N. meningitidis
Etapa 1:
Fijación de complejo PSC-CTAB en CELITE® 545 y eliminación de restos celulares, ácidos nucleicos y proteínas lavando con CTAB 0,05%.
Etapa 2:
Elución de PS con EtOH 50%. Se descartan las primeras fracciones que son turbias y contienen impurezas y LPS. Se verifica la presencia de PS en las siguientes fracciones mediante prueba de floculación.
Etapa 3:
Refijación de complejo PS-CTAB en CELITE® 545 y eliminación de ácidos nucleicos más pequeños y proteínas mediante lavado con CTAB 0,05%.
Etapa 4:
Elución de PS con EtOH 50%. Se descartan las primeras fracciones turbias. Se verifica la presencia de PS en las siguientes fracciones mediante la prueba de floculación.
Se filtra el eluido y se recoge el filtrado que contiene polisacárido bruto. Se precipita el polisacárido del filtrado agregando etanol hasta una concentración final de 80%. Posteriormente se recupera el polisacárido como un polvo blanco, se seca sobre vacío y se almacena a -20ºC.
D: Conjugación de CDAP Conjugación de PSC y PD
Para la conjugación de PSC y PD se prefirió la tecnología de conjugación con CDAP a la activación clásica con CNBr y acoplamiento por medio de un espaciador a la proteína portadora. Primero se activa el polisacárido por cianilación con tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamino-piridinio (CDAP). CDAP es un reactivo de cianilación soluble en agua en el que la electrofilia del grupo ciano está aumentada sobre la de CNBr, permitiendo la reacción de cianilación bajo condiciones relativamente suaves. Tras la activación, el polisacárido puede acoplarse directamente a la proteína portadora a través de sus grupos amino sin introducir ninguna molécula espaciadora. Los grupos estercianato sin reaccionar se inactivan por medio de una reacción extensiva con glicina. Se reduce el número total de etapas involucradas en la preparación de vacunas de conjugado y lo más importante es que en el producto final no están presentes moléculas espaciadoras potencialmente inmunógenas.
La activación de polisacáridos con CDAP introduce un grupo cianato en los polisacáridos y se libera dimetilaminopiridina (DMAP). El grupo cianato reacciona con grupos NH_{2} en la proteína durante el subsiguiente proceso de acoplamiento y se convierte en un carbamato.
Activación de PSC y acoplamiento de PSC-PD
La activación y el acoplamiento se realizan a 25ºC.
Se disuelven 120 mg de PS durante al menos 4 horas en WFI.
Se agrega solución de CDAP (100 mg/ml de acetonitrilo recién preparado) para alcanzar una relación CDAP/PS (p/p) de 0,75.
Tras 1 minuto 30, se eleva el pH hasta el pH de activación (pH 10) por el agregado de trietilamina y se estabiliza hasta el agregado de PD.
A los 3 minutos 30, se agrega NaCl hasta una concentración final de 2M. A los 4 minutos, se agrega PD purificada hasta alcanzar una relación PD/PS de 1,5/1; se ajusta inmediatamente el pH hasta el pH de acoplamiento (pH 10). Se deja la solución durante 1 hora bajo regulación del pH.
Inactivación
Se agregan 6 ml de una solución de glicina 2M a la mezcla de PS/PD/CDAP. Se ajusta el pH hasta el pH de inactivación (pH 8,8). Se agita la solución durante 30 min a la temperatura de trabajo, posteriormente se deja durante toda la noche a +2-8ºC con agitación lenta y continua.
Purificación de PS-PD
Tras la filtración (5 \mum), se purifica el conjugado PS-PD en un ambiente frío por cromatografía de exclusión molecular con gel en un gel S400HR Sephacryl para eliminar moléculas pequeñas (incluyendo DMAP) y PD no conjugada: Elución-NaCl 150 mM-pH 6,5; Control-UV 280 nm, pH y conductividad.
En base a los diferentes tamaños moleculares de los componentes de la reacción, los conjugados PS-PD se eluyen primero seguidos por PD libre y finalmente DMAP. Se combinan las fracciones que contienen conjugado detectado por DMAB (PS) y \muBCA (proteína). Las fracciones combinadas se esterilizan por filtración (0,2 \mum).
E: Formulación de vacuna de conjugado PSC-PD adsorbida Lavado de AlPO_{4}
Con el fin de optimizar la adsorción del conjugado PSC-PD sobre AlPO_{4}, se lava el AlPO_{4 }para disminuir la concentración de PO_{4}^{3-}:
-
Se lava el AlPO_{4} con NaCl 150 mM y se centrifuga (4 veces);
-
Posteriormente se resuspenden los sedimentos en NaCl 150 mM y se filtra (100 \mum); y
-
Se esteriliza el filtrado por calor.
A este AlPO_{4} lavado se lo denomina WAP (fosfato lavado autoclavado).
Procedimiento de formulación
El grueso del conjugado PSC-PD se adsorbió sobre AlPO_{4} WAP previo a la formulación final del producto terminado. Se agitó el AlPO_{4} WAP con PSC-PD durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se ajustó el pH hasta 5,1 y se agitó la mezcla durante otras 18 horas a temperatura ambiente. Se agregó solución de NaCl hasta 150 nM y se agitó la mezcla durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se agregó 2-fenoxietanol hasta 5 mg/ml y se agitó la mezcla durante 15 minutos a temperatura ambiente, posteriormente se ajustó el pH hasta 6,1.
Composición final/dosis
-
PSC-PD: 10 \mug PS
-
AlPO_{4} WAP: 0,25 mg Al^{3+}
-
NaCl: 150 mM
-
2-fenoxietanol: 2,5 mg
-
Agua para inyección: hasta 0,5 ml
-
pH: 6,1
F: Información preclínica Inmunogenicidad del conjugado de polisacáridos en ratones
La inmunogenicidad del conjugado PSC-PD se evaluó en ratones Balb/C de 6 a 8 semanas de vida. Se inyectó el conjugado (no adsorbido) o el conjugado adsorbido sobre AlPO4 como vacuna monovalente. Se midieron los anticuerpos anti-PSC por ELISA mientras que se analizaron los anticuerpos funcionales usando la prueba bactericida, ambos procedimientos basados en los protocolos del CDC (Centros para el Control y Prevención de Enfermedades, Atlanta, EE.UU.). Se presentan los resultados de dos experimentos diferentes realizados para evaluar la respuesta frente a la dosis y el efecto del adyuvante (APO_{4}).
Experimento dosis-intervalo
En este experimento, se inyectaron ratones Balb/C dos veces (separadas por dos semanas) con PSC-PD. Se usaron cuatro dosis diferentes de conjugado formulado con AlPO_{4}: 0,1; 0,5; 2,5; y 9,6 \mug/animal. Se obtuvieron muestras de sangre de los ratones (10/grupo) en los días 14 (14 Post I), 28 (14 Post II) y 42 (28 Post II). Las medias geométricas de las concentraciones (MGCs) de anticuerpos específicos para polisacárido C medidos por ELISA se expresaron en \mug de IgG/ml usando IgG purificada como referencia. Se midieron los anticuerpos bactericidas en sueros combinados y los títulos se expresaron como la inversa de la dilución capaz de matar el 50% de las bacterias, usando la cepa C11 de N. meningitidis en presencia de complemento de cría de conejo.
La dosis-respuesta obtenida muestra una meseta a partir de la dosis de 2,5 \mug. Los resultados indican que hay una buena respuesta al estímulo entre los días 14 Post I y 14 Post II. Los niveles de anticuerpos en el día 28 Post II son al menos equivalentes a aquellos en el día 14 Post II. Los títulos bactericidas de anticuerpos concuerdan con las concentraciones por ELISA y confirman la inmunogenicidad del conjugado PSC-PD.
Efecto del adyuvante
En este experimento, se evaluó un lote de conjugado PSC-PD formulado con APO_{4}, se inyectó el conjugado pleno (sin adyuvante) para comparación. Se inyectaron 10 ratones/grupo dos veces, separadas por dos semanas, por vía subcutánea, con 2 \mug de conjugado. Se obtuvieron muestras de sangre en los días 14 (14 Post I), 28 (14 Post II) y 42 (28 Post II), y se midieron los títulos de anticuerpos funcionales por ELISA (sólo en los días 14 Post II y 28 Post II para la prueba bactericida). La formulación con AlPO4 induce títulos hasta 10 veces más elevados en comparación con las formulaciones sin adyuvantes.
Conclusiones
A partir de los resultados de los experimentos descritos anteriormente se pueden sacar las siguientes conclusiones:
-
El conjugado PSC-PD induce una respuesta anamnésica que demuestra que PSC, cuando está conjugado, se convierte en un antígeno dependiente de linfocitos T.
-
Las concentraciones de anticuerpos anti-PSC medidas por ELISA correlacionan bien con los títulos de anticuerpos bactericidas mostrando que los anticuerpos inducidos por el conjugado PSC-PD son funcionales contra el serogrupo C de N. meningitidis
-
Aproximadamente 2,5 \mug de conjugado adsorbido sobre AlPO_{4} parecen provocar una respuesta óptima de anticuerpos en ratones.
-
La química de CDAP parece ser un procedimiento adecuado para fabricar conjugados PSC-PD inmunógenos.
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Ejemplo 8
Preparación de un Conjugado de Polisacárido de N. meningitidis Serogrupo A-PD
Se disuelve un polvo seco de polisacárido A (PSA) durante una hora en solución NaCl 0,2 M hasta una concentración final de 8 mg/ml. Posteriormente se fija el pH hasta un valor de 6 con HCl o NaOH y se termorregula la solución a 25ºC. Se agrega 0,75 mg de CDAP/mg de PSA (una preparación hasta 100 mg/ml de acetonitrilo) a una solución de PSA. Tras 1,5 minutos sin regulación de pH, se agrega NaOH 0,2 M para obtener un pH de 10. 2,5 minutos más tarde, se agrega proteína D (concentrada hasta 5 mg/ml) de acuerdo con una relación PD/PSA de aproximadamente 1. Se mantiene un pH de 10 durante el periodo de reacción de acoplamiento de 1 hora. Posteriormente, se agregan 10 mg de glicina (2 M pH 9,0)/mg de PSA y se regula el pH a un valor de 9,0 durante 30 minutos a 25ºC. Posteriormente se conserva la mezcla durante toda la noche a 4ºC previo a la purificación por cromatografía de exclusión en columna (Sephacryl S400HR de Pharmacia). Primero eluye el conjugado, seguido por PD sin reaccionar y subproductos (DMAP, glicina, sales). Se recoge el conjugado y se esteriliza por filtración en una membrana de 0,2 \mum Sartopore de Sartorius.
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Ejemplo 9
Caracterizaciones in vitro de los productos de los Ejemplos 7 y 8
Las características principales se resumen en la tabla a continuación:
23
Resultados in vivo
Como modelo animal se usaron ratones Balb/C para probar la inmunogenicidad de los conjugados. Los conjugados se adsorbieron sobre AlPO_{4} o Al(OH)_{3} (10 \mug de PS sobre 500 \mug de Al) o no se adsorbieron. Se inyectó a los ratones de la siguiente manera: 2 inyecciones con intervalos de dos semanas (2 \mug de PS/inyección).
De estos resultados podemos concluir en primer lugar que PS libre tiene gran influencia en la respuesta inmunitaria. Se obtuvieron mejores resultados con conjugados con menos de 10% de PS libre. Las mejoras anteriores al procedimiento CDAP es otro aspecto de la invención.
La formulación es también importante. AlPO_{4} parece ser el adyuvante más adecuado en este modelo. Los conjugados inducen un efecto estimulante que no se observa cuando se inyectan sólo polisacáridos.
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Conclusiones
Se obtuvieron conjugados de N. meningitidis A y C con una relación final PS/proteína de 1 y 0,6-0,7 (p/p) respectivamente. PS libre y portador libre estaban por debajo del 10% y 15% respectivamente. La recuperación de polisacáridos es superior al 70%. Los conjugados de PSA y PSC obtenibles por medio del procedimiento anterior mejorado (optimizado) de CDAP (sin tener en cuenta la proteína portadora, pero de preferencia es proteína D) es otro aspecto de la invención.
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Ejemplo 10
Preparación de un Conjugado de Polisacárido de H. influenzae b-PD
H. influenzae b es una de las causas principales de meningitis en niños con menos de 2 años de edad. Es bien conocido el polisacárido de H. influenzae (PRP) como conjugado con el toxoide del tétanos (conjugado por reacción química desarrollada por J. Robbins). CDAP es un procedimiento químico mejorado. La siguiente es una descripción de las condiciones óptimas halladas de CDAP para conjugar PRP, de preferencia con PD.
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Los parámetros que tienen influencia sobre la conjugación son los siguientes:
-
La concentración inicial de polisacárido (que puede tener un doble impacto en los niveles finales de polisacárido libre y en la etapa de esterilización por filtración).
-
La concentración inicial de la proteína portadora.
-
La relación inicial de polisacárido a proteína (que también puede tener el doble impacto en los niveles finales de polisacárido libre y en la etapa de esterilización por filtración).
-
La cantidad de CDAP usada (por lo general en gran exceso).
-
La temperatura de la reacción (que puede influir en la descomposición del polisacárido, la cinética de la reacción y descomposición de los grupos reactivos).
-
El pH de activación y acoplamiento.
-
El pH de inactivación (que influye en el nivel de DMAP residual).
-
El tiempo de activación, acoplamiento e inactivación.
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Los autores de la presente invención hallaron que los 3 parámetros más críticos para optimizar la calidad del producto final son: la relación inicial de polisacárido/proteína; la concentración de polisacárido; y el pH de acoplamiento.
De esta manera se diseñó un cubo de reacción con las 3 condiciones anteriores como los tres ejes. Los puntos centrales (e intervalo de valores experimentados) para estos ejes fueron: relación PS/proteína - 1/1 (\pm0,3/1); [PS] = 5 mg/ml (\pm2 mg/ml); y pH de acoplamiento = 8,0 (\pm 1,0 unidad de pH).
Los parámetros menos esenciales se fijaron como los siguientes: se usaron 30 mg de polisacárido; temperatura 25ºC; [CDAP] = 0,75 mg/mg de PS; pH titulado con NaOH 0,2M; pH de activación = 9,5; temperatura para activación = 1,5 minutos; temperatura de acoplamiento -1 hora; [proteína] = 10 mg/ml; pH de inactivación = 9,0; temperatura de inactivación = 1 hora; temperatura de disolución de PS en solvente = 1 hora en NaCl 2M; purificación en Sephacryl S-400HR eluido con NaCl 150 mM a 12 cm/hora; y esterilización por filtración con un SARTOLAB P20 a
5 ml/min.
Los datos considerados para establecer condiciones óptimas al fabricar productos dentro del cubo de reacción mencionado anteriormente fueron: datos de proceso - rendimiento máximo tras filtración, máximo nivel de proteína incorporada; y calidad de datos del producto - relación final PS/proteína, nivel de PS libre, nivel de proteína libre, niveles mínimos de DMAP residual (un producto de descomposición de CDAP).
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Producto final de la filtración
El factor que afecta al producto tras la filtración es la interacción entre [PS] inicial y el pH de acoplamiento y la relación PS/proteína inicial. A bajas [PS] existe poca interacción con los últimos 2 factores y el resultado siempre es una buena filtrabilidad (aproximadamente 95% para todos los productos). Sin embargo, a concentraciones altas la filtrabilidad disminuye si el pH y la relación inicial aumenta ([PS] alta, relación más baja, pH más bajo = 99% de filtración; pero [PS] alta, relación y pH más altos = 19% filtración).
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Nivel de incorporación de la proteína
La proporción de la relación PS/proteína final con respecto a la relación inicial es una medida de la eficacia del acoplamiento. A [PS] alta, el pH no afecta a la proporción de las relaciones. Sin embargo, la relación inicial sí lo hace (1,75 a relación inicial baja, 1,26 a relaciones iniciales altas). A [PS] baja, la proporción de relaciones es para la mayor parte más baja, sin embargo ahora el pH afecta más (pH bajo, relación baja = 0,96; pH bajo, relación alta = 0,8; pH alto, relación baja = 1,4; y pH alto, relación alta = 0,92).
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Relación final PS/Proteína
La relación final depende de la relación inicial y de la [PS]. Las relaciones finales más amplias se obtienen con una combinación de relaciones iniciales altas y [PS] altas. El efecto del pH en la relación final no es tan significativo como una [PS] baja.
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Nivel de proteína D libre
Las cantidades menores de proteína D se observan a pH alto y [PS] alta (niveles cercanos a 0,0). El efecto de la [PS] alta se hace especialmente marcado cuando el pH es bajo. La elevación de la relación inicial contribuye un poco al incremento de proteína D libre.
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DMAP residual
La relación inicial no tiene un efecto significativo. En contraste, el nivel de DMAP aumenta con la [PS], y disminuye cuando se eleva el pH.
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Conclusiones
Las condiciones de conjugación lo más preferentemente son por lo tanto las siguientes: pH de acoplamiento = 9,0; [PS] = 3 mg/ml; y relación inicial = 1/1. Con tales condiciones las características del producto final son las siguientes:
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Por lo tanto los conjugados de PRP obtenibles por el proceso mejorado (optimizado) CDAP anterior (sin tener en cuenta la proteína portadora, pero de preferencia es proteína D) es otro aspecto de la invención.
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Ejemplo 11
Proteína D como antígeno - cómo puede mejorarse su eficacia protectora contra H. influenzae no tipificable por medio de la formulación con 3D-MPL
Se inmunizaron ratones Balb/C hembra (10 por grupo) (por vía intramuscular) con la vacuna de conjugado de polisacárido 11 valente de neumococo-proteína D por primera vez a las 20 semanas de vida (D0) y recibieron una segunda inmunización dos semanas más tarde (D14). Se tomaron muestras de sangre 7 días tras la segunda inmunización. Se midieron los títulos de anticuerpos contra proteína D en términos de cantidad de anticuerpos de tipo IgG1, IgG2a e IgG2b.
Se prepararon vacunas undecavalentes liofilizadas (sin APO_{4}) combinando los conjugados con 15,75% de lactosa, agitando durante 15 minutos a temperatura ambiente, ajustando el pH hasta 6,1 \pm 0,1, y liofilizando (el ciclo que comienza usualmente a -69ºC, ajustando gradualmente hasta -24ºC en 3 horas, posteriormente manteniendo esta temperatura durante 18 horas, ajustando posteriormente de forma gradual hasta -16ºC en 1 hora, manteniendo posteriormente esta temperatura durante 6 horas, ajustando posteriormente de forma gradual hasta +34ºC en 3 horas, y finalmente manteniendo esta temperatura durante 9 horas).
Las composiciones de las formulaciones y reconstituyentes para liofilizados se presentan en la Tabla 13.
Se sabe que la medida más característica de si se ha producido una respuesta inmunitaria mediada por células de tipo Th1 está correlacionada con el nivel de anticuerpo IgG2a. Como puede verse a partir de los datos, el resultado es un gran incremento de IgG2a si se liofiliza proteína D con un adyuvante Th1 (en este caso 3D-MPL).
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(Tabla pasa a página siguiente)
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Claims (14)

1. Una composición antigénica liofilizada que comprende un polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae del serotipo 6B conjugado con 3D-MPL y sustancialmente desprovista de adyuvante basado en aluminio.
2. La composición antigénica liofilizada de la reivindicación 1 que comprende adicionalmente los conjugados de polisacáridos de neumococo de:
serotipo 4;
serotipo 18C;
serotipo 19F; y
serotipo 23F.
3. La composición antigénica liofilizada de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que los polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae están conjugados a una proteína seleccionada del grupo constituido por:
toxoide del Tetanos;
OMPC de Neisseria meningitidis;
toxoide de la Difteria;
pneumolisina de Streptococcus pneumoniae, o
CRM197.
4. La composición antigénica de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que los polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae están conjugados a una proteína D de Haemophilus influenzae.
5. La composición antigénica liofilizada de la reivindicación 1 ó 2, que contiene conjugados de polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae de los serotipos 6B, 14, 19F y 23F.
6. La composición antigénica liofilizada de la reivindicación 1, que contiene conjugados de polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae de los serotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F y 23F.
7. La composición antigénica liofilizada de la reivindicación 1, que contiene conjugados de polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F.
8. La composición antigénica liofilizada de la reivindicación 1, que contiene conjugados de polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9V, 12F, 14, 18C, 19F y 23F.
9. La composición antigénica liofilizada de la reivindicación 1, que contiene conjugados de polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F.
10. La composición antigénica liofilizada de la reivindicación 1, que contiene conjugados de polisacáridos capsulares de Streptococcus pneumoniae de los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, y 33F.
11. La composición antigénica liofilizada de las reivindicaciones 1-10, que es una composición de vacuna.
12. Una composición antigénica que comprende la composición antigénica liofilizada de las reivindicaciones 1-11 reconstituida con un diluyente.
13. Un procedimiento de preparación de una composición antigénica que comprende la etapa de reconstitución de la composición antigénica liofilizada de las reivindicaciones 1-11 con un diluyente.
14. Un uso de la composición antigénica de la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para la prevención de una enfermedad por neumococo.
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