HUP0302573A2

HUP0302573A2 - Humanizált anti-LT-béta-R ellenanyagok

Info

Publication number: HUP0302573A2
Application number: HU0302573A
Authority: HU
Inventors: Ellen A. Garber; Paul Lyne; Jose W. Saldanha
Original assignee: Biogen, Inc.
Priority date: 2000-10-13
Filing date: 2001-10-12
Publication date: 2003-10-28
Also published as: TR200300478T2; MXPA03003144A; NO20031642L; SK5672003A3; CZ20031307A3; EA006945B1; BG107802A; JP2004532608A; IL155340A0; BR0114646A; WO2002030986A2; EE200300179A; NO20031642D0; KR20030041164A; TR200602095T2; PL366307A1; AU1174702A; NZ525793A; WO2002030986A3; CN1547590A

Abstract

A találmány tárgyát általánosságban lymphotoxin béta receptor ellenispecifikus humanizált ellenanyagok (anti-LT-b-R) képezik. A találmánytárgyát közelebbről humanizált anti-lymphotoxin béta receptor (LT-b-R)ellenanyagok, valamint a találmány szerinti ellenanyagok daganatosmegbetegedések kezelésére és daganatos megbetegedésekelőrehaladásának, súlyosságának vagy hatásának mérséklésére történőalkalmazása képezi. Ó

Description

KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNY

Humanizált anti-LT-p-R ellenanyagok

A találmány tárgyát általánosságban lymphotoxin béta receptor elleni specifikus humanizált ellenanyagok (anti-LT-P-R) képezik.

A találmány tárgyát közelebbről humanizált anti-lymphotoxin béta receptor (LT-P-R) ellenanyagok, valamint a találmány szerinti ellenanyagok daganatos megbetegedések kezelésére és daganatos megbetegedések előrehaladásának, súlyosságának vagy hatásának mérséklésére történő alkalmazása képezi.

A tumornekrózis faktor családba tartozó lymphotoxin béta receptor (a továbbiakban LT-P-R) jól ismert szerepet játszik az immunrendszer fejlődésében és az immunrendszer egyes sejtjei, pl. a folliculáris dendritikus sejtek és számos kötőszöveti sejt funkcionális fenntartásában [Matsumoto és mtsai.: Immunol. Rév. 156, 137 (1997)]. Az ΕΤ-β-R ismert ligandumai pl. az LTal/p2 és egy LIGHT elnevezésű második ligandum [Mauri és mtsai.: Immunity 8, 21 (1998)]. Az LT-P-R aktiválása in vitro apoptotikus sejthalált idéz elő bizonyos rákos sejt vonalakban (PCT US96/01386 számú szabadalmi bejelentés). Az LT-p-R-agonista aktiváló hatású ágensekkel, pl. specifikus humanizált anti-LT-P-R ellenanyagokkal végzett kezelés ennek megfelelően alkalmas lehet páciensek (pl. emberek) daganatos megbetegedésének kezelésére, vagy daganatos megbetegedésük előrehaladásának, súlyosságának vagy hatásának mérséklésére.

A találmány tárgyát humanizált anti-lymphotoxin béta receptor (LT-p-R) ellenanyagok, valamint ezen ellenanyagok páciensek (pl. emberek) daganatos megbetegedésének kezelésére, vagy daganatos megbetegedésük előrehaladásának, súlyosságának vagy hatásának mérséklése érdekében történő alkalmazását szolgáló eljárások képezik.

Közelebbről, a találmány tárgyát LT-p-R-hez (pl. emberi LT-P-R-hez) specifikusan kötődő humanizált ellenanyag képezi. Az említett ellenanyag az 1. azonosítószámú szekvencia 24-34., 50-56. és 89-97. pozíciójú aminosavainak megfelelő könnyűlánc komplementaritást meghatározó régiókat, és/vagy a 2. azonosítószámú szekvencia 31-35., 50-66. és 99-109. pozíciójú aminosavainak megfelelő nehézlánc komplementaritást meghatározó régiókat tartalmaz, mindemellett könnyüláncában a következő aminosavak közül legalább egyet (pl. 1-et, 2-őt, 3at, 4-et vagy 5-öt) tartalmaz: K3, W41, 146, Q69 és Y71; vagy nehézláncában a következő aminosavak közül legalább egyet (pl. 1-et, 2-őt, 3-at, 4-et vagy 5-öt) tartalmaz: F37, T40, A49, M89 és V93 (Kábát számozási séma).

-2A találmány szerinti humanizált ellenanyag tartalmazhat továbbá a 8. azonosítószámú szekvencia 1-107. pozíciójú aminosavainak megfelelő variábilis könnyűlánc doménszekvenciát és/vagy a 16. azonosítószámú szekvencia 1-120. pozíciójú aminosavainak megfelelő variábilis nehézlánc doménszekvenciát is. A humanizált ellenanyag tartalmazhat továbbá az E46.4 jelzésű sejtvonal (ATCC szabadalmi deponálási szám: PTA-3357), vagy az E77.4 jelzésű sejtvonal (ATCC szabadalmi deponálási szám: 3765) által termelt ellenanyagéval megegyező nehézés/vagy könnyűlánc polipeptid-szekvenciákat is.

A találmány egy további megvalósítási módjában a találmány szerinti humanizált ellenanyag lényegében megtartja az eredeti („parent”) ellenanyag kötődési tulajdonságait. A találmány egy megvalósítási módjában a találmány szerinti humanizált ellenanyag ΕΤ-β-R-hez történő kötődésének a 8. példa szerinti FACS-elemzéssel megállapított funkcionális affinitása pl. kb. 1 pM és kb. 10 pM közötti, alternatív módon kb. 10 pM és kb. 20 pM közötti, alternatív módon kb. 20 pM és kb. 30 pM közötti, alternatív módon kb. 30 pM és kb. 40 pM közötti, alternatív módon kb. 40 pM és kb. 50 pM közötti, alternatív módon kb. 50 pM és kb. 60 pM közötti, alternatív módon kb. 60 pM és kb. 70 pM közötti, alternatív módon kb. 70 pM és kb. 80 pM közötti, vagy alternatív módon kb. 80 pM és kb. 90 pM közötti.

A találmány egy további megvalósítási módjában a találmány szerinti humanizált ellenanyag immunotoxinnal (pl. ricin A-lánccal vagy Pseudomonas toxinnal) kapcsoltan szerepel. A találmány szerinti humanizált ellenanyag kemoterápiás droghoz (pl. adriamicinhez, 5FU-hoz, vinblasztinhoz, aktinomicin-D-hez, etopozidhoz, ciszplatinhoz, metotrexáthöz, doxorubicinhez) vagy radioizotóphoz is köthető. A találmány tárgyát képezi továbbá a pl. immunotoxinhoz kapcsolt találmány szerinti humanizált ellenanyag és kemoterápiás droghoz kapcsolt találmány szerinti humanizált ellenanyag kombinációját alkalmazó kombinációs terápia is. A találmány tárgyát képezi továbbá egy ΕΤ-β-R-t fokozott mértékben expresszáló daganattal rendelkező emlősállatnak (embernek) történő beadásra alkalmas készítmény, amely a) önállóan vagy immunotoxinhoz vagy kemoterápiás droghoz kapcsoltan humanizált anti-LT-P-R ellenanyagot és b) citotoxikus faktort tartalmaz, amelyek mindegyikének mennyisége az emlősállatnak történő beadás esetén külön-külön is hatékonyan csökkenti a daganat méretét. A citotoxikus faktor többek között pl. TNF-a, TNF-β, IL-1, INF-γ vagy IL-2 lehet. A citotoxikus faktor alternatív módon kemoterápiás drog (pl. adriamicin, 5FU, vinblasztin, aktinomicin-D, etopozid, ciszplatin, metotrexát, doxorubicin) is lehet.

-3 A találmány szerinti ellenanyag lehet pl. bármely izotípusba vagy altípusba (pl. IgM, IgD, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgAl vagy IgA2) tartozó teljes (vagyis két teljes hosszúságú könnyűlánccal és két teljes hosszúságú nehézlánccal rendelkező) ellenanyag, vagy alternatív módon, egy teljes ellenanyag antigénkötő fragmense (pl. Fab, F(ab’)₂ vagy Fv). A találmány tárgyát képezi továbbá a gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyagot és a 8. azonosítószámú szekvencián megadott kódoló szekvenciát tartalmazó izolált nukleinsavat; a 16. azonosítószámú szekvencián megadott kódoló szekvenciát tartalmazó izolált nukleinsavat; az E46.4 jelzésű sejtvonal (ATCC szabadalmi deponálási szám: PTA-3357), vagy az E77.4 jelzésű sejtvonal (ATCC szabadalmi deponálási szám: 3765) által termelt ellenanyag könnyűláncának kódoló szekvenciáját tartalmazó izolált nukleinsavat; az E46.4 jelzésű sejtvonal (ATCC szabadalmi deponálási szám: PTA-3357), vagy az E77.4 jelzésű sejtvonal (ATCC szabadalmi deponálási szám: 3765) által termelt ellenanyag nehézláncának kódoló szekvenciáját tartalmazó izolált nukleinsavat; a 8. azonosítószámú szekvencia 1-107. pozíciójú aminosavait kódoló szekvenciát tartalmazó izolált nukleinsavat; valamint a 16. azonosítószámú szekvencia 1-120. pozíciójú aminosavait kódoló szekvenciát tartalmazó izolált nukleinsavat magában foglaló készítmény.

A találmány tárgyát képezik továbbá a humanizált anti-LT-p-R ellenanyagot termelő sejtvonalak, pl. az E46.4 jelzésű sejtvonal (ATCC szabadalmi deponálási szám: PTA-3357) és az E77.4 jelzésű sejtvonal (ATCC szabadalmi deponálási szám: 3765) sejtjei is. A találmány egy megvalósítási módjában a sejtvonal kb. 250 mg/L és kb. 300 mg/L közötti ellenanyagmennyiséget termel, alternatív módon kb. 300 mg/L és kb. 350 mg/L közötti ellenanyagmennyiséget termel, alternatív módon kb. 350 mg/L és kb. 400 mg/L közötti ellenanyagmennyiséget termel, alternatív módon kb. 400 mg/L és kb. 450 mg/L közötti ellenanyagmennyiséget termel, alternatív módon kb. 450 mg/L és kb. 500 mg/L közötti ellenanyagmennyiséget termel, alternatív módon kb. 500 mg/L és kb. 550 mg/L közötti ellenanyagmennyiséget termel, alternatív módon kb. 550 mg/L és kb. 600 mg/L közötti ellenanyagmennyiséget termel. A sejtek által termelt ellenanyag koncentrációja a 10 napos tömegtenyészetből kinyerhető titernek felel meg.

A találmány tárgyát képezi továbbá páciens (pl. ember) daganatos megbetegedésének kezelésére, vagy daganatos megbetegedése előrehaladásának, súlyosságának vagy hatásának mérséklésére szolgáló, a találmány szerinti ellenanyag hatékony mennyiségének a páciensnek történő beadását magában foglaló eljárás. A találmány szerinti készítmény hatékony mennyisége egy vagy több adagban adható be. A találmány egy további megvalósítási módjában a talál-4many tárgyát kepezi továbbá páciens (pl. ember) daganatos megbetegedesenek kezelésére vagy daganatos megbetegedése előrehaladásának, súlyosságának vagy hatásának mérséklésére szolgáló, a találmány szerinti ellenanyag hatékony mennyiségének és egy citotoxikus faktornak a páciensnek történő beadását magában foglaló eljárás. A citotoxikus faktor többek között pl. TNF-ct, TNF-β, IL-1, INF-γ vagy IL-2 lehet. A citotoxikus faktor alternatív módon kemoterápiás drog (pl. adriamicin, 5FU, vinblasztin, aktinomicin-D, etopozid, ciszplatin, metotrexát, doxorubicin) is lehet.

Az alábbiakban az ábrák rövid leírását közöljük.

Az 1. ábra WiDr sejtekre kifejtetett citotoxicitást bemutató grafikon. mCBEll (egér) (rombusz), huCBEl 1#2 [a könnyülánc 2. változatát (VL#2) és a nehézlánc 2. változatát (VH#2) tartalmazó humanizált anti-LT-β-Κ ellenanyag] (kör), huCBEl 1 #4 [a könnyűlánc 3. változatát (VL#3) és a nehézlánc 4. változatát (VH#4) tartalmazó humanizált anti-LT-β-Κ ellenanyag] (csillag).

A 2. ábra az IL-8 A375 sejtekre kifejtett agonista hatását mutatja be. mCBEll (rombusz), huCBEl 1 #2 [a könnyűlánc 2. változatát (VL#2) és a nehézlánc 2. változatát (VH#2) tartalmazó humanizált anti-LT-β-Κ ellenanyag] (kör), huCBEl 1#4 [a könnyűlánc 3. változatát (VL#3) és a nehézlánc 4. változatát (VH#4) tartalmazó humanizált anti-LT-β-Κ ellenanyag] (csillag).

A 3. ábra a daganatméret és az adagolás napjainak összefüggését bemutató grafikon. mCBEll (háromszög), huCBEl 1 #4 [a könnyűlánc 3. változatát (VL#3) és a nehézlánc 4. változatát (VH#4) tartalmazó humanizált anti-LT-β-Κ ellenanyag] (kör), kezelés nélkül (négyszög).

A 4. az állatok túlélési százalékát mutatja be a daganatinjektálást követő napok függvényében. mCBEll (háromszög), huCBEll#4 (a könnyűlánc 3. változatát és a nehézlánc 4. változatát tartalmazó humanizált anti-LT-β-Κ ellenanyag) (kör), kezelés nélkül (négyszög).

Az 5. ábra a daganatméret és az injektálás után eltelt napok közötti összefüggést bemutató grafikon. HuCBEl 1 #4 [a könnyűlánc 3. változatát (VL#3) és a nehézlánc 4. változatát (VH#4) tartalmazó humanizált anti-LT-β-Κ ellenanyag] (kör), kezelés nélküli kontroll (négyszög).

A 6. ábra az előzetesen tenyésztett daganat méretét a kezelés után eltelt napok függvényében bemutató grafikon. Kontroll (négyszög); huCBEl 1#4 [a könnyűlánc 3. változatát

-5(VL#3) és a nehézlánc 4. változatát (VH#4) tartalmazó humanizált anti-LT-0-R ellenanyag különböző adagjai: 500 μβ (kör), 100 μg (háromszög), 20 μg (rombusz)]; mCBEl 1 (kereszt).

A 7. ábra az előzetesen tenyésztett daganatot hordozó állatok túlélésének százalékos arányát a kezelést követő napok függvényében bemutató grafikon. Kontroll (négyszög); huCBEl 1#4 [a könnyülánc 3. változatát (VL#3) és a nehézlánc 4. változatát (VH#4) tartalmazó humanizált anti-LT-3-R ellenanyag különböző adagjai: 500 μg (kör), 100 μg (háromszög), 20 μg (rombusz)]; mCBEl 1 (kereszt).

A 8. ábra logaritmikus skálán ábrázolva mutatja be a fluoreszcencia átlagos intenzitása és a huCBEl 1#4 koncentráció összefüggését.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti megoldást.

Szekvencia-azonosítók

A leírásban említett nukleotid- és aminosav-szekvenciákat a következő azonosítószámokkal láttuk el.

1. azonosítószámú szekvencia: az mCBEl 1 variábilis nehézlánc régiójának aminosavszekvenciája.

2. azonosítószámú szekvencia: az mCBEl 1 variábilis könnyűlánc dómén aminosavszekvenciája.

3. azonosítószámú szekvencia: a humanizált CBE11 variábilis könnyűlánc-régió (1. változat - VL#1) nukleinsav-szekvenciája.

4. azonosítószámú szekvencia: a humanizált CBE11 variábilis könnyűlánc-régió (1. változat - VL#1) aminosav-szekvenciája.

5. azonosítószámú szekvencia: a humanizált CBE11 variábilis könnyűlánc-régió (2. változat - VL#2) nukleinsav-szekvenciája.

6. azonosító számú szekvencia: a humanizált CBE11 variábilis könnyűlánc-régió (2. változat - VL#2) aminosav-szekvenciája.

7. azonosítószámú szekvencia: a humanizált CBE11 variábilis könnyűlánc-régió (3. változat - VL#3) nukleinsav-szekvenciája.

8. azonosítószámú szekvencia: a humanizált CBE11 variábilis könnyűlánc-régió (3. változat - VL#3) aminosav-szekvenciája.

9. azonosítószámú szekvencia: a humanizált CBE11 variábilis nehézlánc-régió (1. változat - VL#1) nukleinsav-szekvenciája.

10. azonosítószámú szekvencia: a humanizált CBE11 variábilis könnyűlánc-régió (1. változat - VL#1) aminosav-szekvenciája.

11. azonosítószámú szekvencia: a humanizált CBE11 variábilis nehézlánc-régió (2. változat - VL#2) nukleinsav-szekvenciája.

12. azonosítószámú szekvencia: a humanizált CBE11 variábilis könnyűlánc-régió (2. változat - VL#2) aminosav-szekvenciája.

13. azonosító számú szekvencia: a humanizált CBE11 variábilis nehézlánc-régió (3. változat - VL#3) nukleinsav-szekvenciája.

14. azonosítószámú szekvencia: a humanizált CBE11 variábilis könnyűlánc-régió (3. változat - VL#3) aminosav-szekvenciája.

15. azonosítószámú szekvencia: a humanizált CBE11 variábilis nehézlánc-régió (4 változat - VL#4) nukleinsav-szekvenciája.

16. azonosítószámú szekvencia: a humanizált CBE11 variábilis könnyűlánc-régió (4. változat - VL#4) aminosav-szekvenciája.

17. azonosítószámú szekvencia: Bsu36I hely kialakítására alkalmazott FR1 láncindító.

18. azonosítószámú szekvencia: Ncil és Hpall helyek kialakítására alkalmazott FR2 láncindító.

19. azonosítószámú szekvencia: Bsu36I és PstI helyek kialakítására alkalmazott FR3 láncinditó.

20. azonosítószámú szekvencia: Smal hely kialakítására alkalmazott FR2 láncindító.

21. azonosítószámú szekvencia: Pvul hely kialakítására alkalmazott FR3 láncindító.

22. azonosítószámú szekvencia: Smal és Hhal helyek kialakítására alkalmazott FR2 láncindító.

23. azonosítószámú szekvencia: PvuII és Fspl helyek kialakítására alkalmazott FR3 láncindító.

24. azonosítószámú szekvencia: HinfI és Nsil helyek kialakítására alkalmazott FR1 láncindító.

25. azonosítószámú szekvencia: Haell és HhaT helyek kialakítására alkalmazott FR2 láncindító.

26. azonosítószámú szekvencia: Bsu36I, Ddel és PstI helyek kialakítására alkalmazott FR3 láncindító.

27. azonosítószámú szekvencia: EcoRV hely kialakítására alkalmazott FR1 láncindító.

28. azonosító számú szekvencia: Rsal hely kialakítására alkalmazott FR3 láncindító.

29. azonosítószámú szekvencia: EcoRV hely kialakítására alkalmazott FR1 láncindító.

30. azonosítószámú szekvencia: HindlII hely kialakítására alkalmazott FR2 láncindító.

31. azonosítószámú szekvencia: Rsal hely kialakítására alkalmazott FR3 láncindító.

32. azonosítószámú szekvencia: konstans domént is tartalmazó teljes huCBEll könnyülánc (3. változat).

32. azonosítószámú szekvencia: konstans domént is tartalmazó teljes huCBEll nehézlánc (4. változat).

Meghatározások

Humanizált ellenanyag alatt nem-emberi, jellemzően egér-eredetű ellenanyagból származó ellenanyagot értünk, amely teljesen vagy alapvetően megtartotta az eredeti ellenanyag antigénkötő tulajdonságait, ugyanakkor emberben kevésbé immunogén hatású.

A komplementaritást meghatározó régió („complementarity determining region”, CDR) alatt egy natív immunglobulin kötőhely természetes Fv régiójának kötődési affinitását és specifitását együttesen meghatározó aminosav-szekvenciákat értünk [Id. Kábát (1991)].

A váz-régió („framework region”, FR) megnevezés alatt a CDR-ek közötti aminosavszekvenciákat értjük. Az ellenanyag ezen részei felelősek a CDR-ek megfelelő (az antigénkötést lehetővé tevő) irányultságban tartásáért.

A konstans régió („constant region”, CR) alatt az ellenanyag-molekula effektor funkciókat biztosító részletét értjük. A találmány szerinti megoldásban az egéreredetű konstans régiókat emberi eredetű konstans régiókkal helyettesítettük. A találmány szerinti kiméra vagy humanizált ellenanyagok konstans régiói emberi immunglobulinokból származnak. A nehézlánc konstans régió az alfa, béta, epszilon, gamma vagy mu izotípusok bármelyike lehet. A különböző alosztályok (pl. az IgG alosztályok) nehézláncai eltérő effektor funkcióval rendelkeznek, így a megfelelő nehézlánc konstans régió megválasztásával a kívánt effektor funkcióval rendelkező ellenanyagok állíthatók elő. Előnyös konstans régiók a gamma 1 (IgGl), a gamma 3 (IgG3) és a gamma 4 (IgG4). Még előnyösebbnek számít a gamma 1 (IgGl) izotípus Fc régiója. A könnyűlánc konstans régió kappa vagy lambda típusú lehet, ezek közül az előbbit tekintjük előnyösnek.

A kiméra ellenanyag megnevezés alatt két különböző, jellemzően eltérő állatfajból származó ellenanyagból kinyert szekvenciákat tartalmazó ellenanyagot értünk. A kiméra ellenanyagok leggyakrabban emberi és egéreredetű ellenanyag-fragmenseket, általában emberi konstans és egéreredetű variábilis régiót tartalmaznak.

-8Az immunogenitás kifejezés alatt recipiensbe juttatott protein vagy terápiás gyök (humorális vagy sejtes) immunválaszt kiváltó képességének mértékét értjük. A találmány szerinti megoldás a találmány szerinti humanizált ellenanyagok immunogenitásával foglalkozik.

„Csökkent immunogenitású humanizált ellenanyag” alatt az eredeti, vagyis az egérere5 detű ellenanyaghoz képest csökkent immunogenitású humanizált ellenanyagot értünk.

„Az eredeti ellenanyag kötődési tulajdonságait alapvetően megőrző humanizált ellenanyag” alatt az előállításához felhasznált eredeti ellenanyag által felismert antigénhez történő specifikus kötődésre képes humanizált ellenanyagot értünk. A humanizált ellenanyag előnyösen az eredeti ellenanyagéval megegyező, vagy alapvetően megegyező antigénkötő affinitással és reakciókészséggel („avidity”) rendelkezik. Ideális esetben az ellenanyag affinitása az eredeti ellenanyag affinitásának legalább 10%-a, előnyösebben annak legalább 30%-a, legelőnyösebben pedig annak legalább 50%-a. Az antigénkötési affinitás mértékének megállapítására szolgáló eljárások szakember számára jól ismertek, közéjük tartoznak pl. a fél-maximális kötődésvizsgálati eljárások, a kompetíciós vizsgálati eljárások és a Scatchard-elemzés. Jelen leírásban né15 hány e célra alkalmazható eljárást ismertetünk.

A találmány tárgyát emberi LT-P-R-hez kötődő humanizált monoklonális ellenanyagok és azok terápiás ágensként történő alkalmazása képezi. A találmány tárgyát képezik továbbá a humanizált ellenanyagokat kódoló nukleinsav-szekvenciák, valamint azok rekombináns gazdasejtekben történő expresszálása. Közelebbről, a találmány tárgyát emberi ΕΤ-β-R-hez specifi20 kusan kötődő egéreredetü CBE11-ből származó humanizált ellenanyagok képezik.

Az egéreredetű CBE11 (mCBEll) emberi LT-p-R-Ig fúziós proteinnel immunizált egérből izolált IgGl kappa ellenanyag [Browning és mtsai.: J. Immunoi. 154. 33 (1995)]. Az mCBEll mind in vitro, mind in vivo funkcionálisan aktiválja az ΕΤ-β-R-t (PCT/US96/01386 számú szabadalmi bejelentés), izolálásának módjáról és daganatellenes tulajdonságiról részletes ismertető található a szakirodalomban [Browning és mtsai.: J. Exp. Med. 183, 867 (1996)]. Az mCBEll-et termelő hybridoma sejtvonalat a Budapesti Egyezmény rendelkezéseinek megfelelően HB 11793 deponálási szám alatt letétbe helyeztük az American Type Culture Collection-nél (ATCC) (PCT/US96/01386 számú szabadalmi bejelentés). Kimutattuk továbbá azt is, hogy az LT-β receptor különböző agonista anti-LT^-R ellenanyagokkal történő ke30 resztkötése aktiválja az LT-β receptort, vagyis utánozhatja a természetes ligandumok hatását (PCT/US96/01386 számú szabadalmi bejelentés). A receptor-aktiválásról viszont kimutattuk, hogy számos in vivo daganatmodellben gátolta a LT-β receptor expresszálásával kísért daganat

-9növekedését. Az LT-β receptor számos rákos sejtben expresszálódik pl. nem kissejtes tüdőráksejtekben (NSCLC), colorectalis ráksejtekben (CRC), emlőrák-sejtekben, valamint prosztata-, gyomor-, bőr-, gyomor-, nyelőcső- és húgyhólyagrák-sejtekben. Az agonista ΕΤ-β-R ellenanyagok által gátolt tömött típusú daganatok többek között a HT29 jelű vastagbél adenocarcinoma, a HT3 jelű méhnyak carcinoma, az A375 jelű melanoma, az MDA-231 jelű emlőcarcinoma, valamint az elsődleges vastagbéldaganatok. Mindezek alapján az agonista ΕΤ-β-R ellenanyagok tulajdonságai alkalmassá teszik őket olyan megbetegedések kezelésére, amelyekben ΕΤ-β-R aktiválás és/vagy az LT-3-R/LT-3-R ligandum kölcsönhatás módosítása kívánatos, például egy páciens (pl. ember) daganatos megbetegedésének gyógykezelése, vagy daganatos megbetegedése előrehaladásának, súlyosságának vagy hatásainak csökkentése érdekében.

A következőkben bemutatjuk az mCBEl 1 monoklonális ellenanyag humanizálását, ideértve az mCBEll monoklonális ellenanyagok kötődési tulajdonságinak alapvető megtartásához szükséges modellelemzést és vissz mutációkat („back mutations”).

Az egéreredetü ellenanyag variábilis régióinak modellelemzése.

A CDR-ek az antigén megkötésében legvalószínűbben szerepet játszó és az átalakított ellenanyagban megőrzendő aminosavakat tartalmazzák. A CDR-ek szekvenciáját a Kabat-féle számozással definiáljuk [Kábát és mtsai.: Sequence of Proteins of Immunological Interest, 5. kiadás, The United States Department of Health and Human Services, The United States Government Printing Office (1991)]. A CDR-eket kanonikus osztályokba sorolják [Chothia és mtsai.: Nature 342, 877 (1989)], amelyekben a kulcsfontosságú aminosavak jelentős mértékben meghatározzák a CDR-hurok szerkezeti konformációját. Ezek az aminosavak szinte minden esetben megőrződnek az átalakított ellenanyagban. Az mCBEll könnyűlánc variábilis dómén polipeptid-szekvenciája a következő (a CDR-eket aláhúzással, az aminosav-pozíciókat a Kabat-féle számozási rend szerint jelöltük):

DIKMTQSPSS MYASLGERVT ITCKAGODIK SYLSWYQQKP

WKSPKILIYY ATRLADGVPS RFSGSGSGQD YSLTISSLES

DDTATYYCLO HGESPWTFGG GTKLEIK (1. azonosítószámú szekvencia)

Az mCBEll nehézlánc variábilis dómén polipeptid-szekvenciája a következő (a CDR-eket aláhúzással, az aminosav-pozíciókat a Kabat-féle számozási rend szerint jelöltük):

EVQLVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFTFS DYYMYWFRQT

PEKRLEWVAT ISDGGSYTYY PDSVKGRFTI SRDNAKNNLY

- 1081 LQMSSLKSED TAMYYCVREE NGNFYYFDYW GQGTTVTVSS (2. azonosítószámú szekvencia)

Az mCBEl 1 variábilis könnyű- és nehézlánc régióit FASTA program alkalmazásával egér- és emberi eredetű alcsoportok konszenzus szekvenciáival hasonlítottuk össze [Johnson, G., Wu, T. T.. Kábát Database and its applications: future directions. Nucleic Acid Research 29, 205 (2001), Wu and Kabat: J. Exp. Med. 132, 211 (1970)]. Az V. egér alcsoportba tartozó mCBEll variábilis könnyűlánc 110 aminosavas átfedésben 74%-os azonosságot mutat, míg a Ilid egér alcsoportba tartozó mCBEl 1 variábilis nehézlánc 132 aminosavas átfedésben 79%-os azonosságot mutat. A variábilis könnyűlánc 113 aminosavas átfedésben 66%-os azonosságot mutatva az I. emberi alcsoportnak felel meg. A variábilis nehézlánc 131 aminosavas átfedésben 71%-os azonosságot mutatva a III. emberi alcsoportnak felel meg.

A találmány szerinti CDR-eket kanonikus osztályokba soroltuk. Az L1 hurok a 2. kanonikus osztályba tartozik (11 aminosavas hurok), az L2 az 1. osztályba (7 aminosav), az L3 pedig az 1. osztályba (9 aminosav). A Hl hurok az 1. kanonikus osztályba tartozik (5 aminosav), a H2 pedig az 3. osztályba (17 aminosav). A H3 hurok egyik kanonikus osztályba sem volt besorolható. A variábilis könnyű- és nehézláncok kapcsolódásánál található aminosavakat korábban már meghatározták [Chothia és mtsai.: J. Mól. Bioi. 186, 651 (1985)]. Az átalakított ellenanyagban ezek rendszerint változatlanok maradnak. Az mCBEll kapcsolódási régiójában több szokatlan aminosav található, ilyenek a VL-beli S34, 146, L89, H91, valamint a VH-beli Y35, F37, V93 és E95.

A szokatlan vázbeli aminosavakat a Kabat adatbázis 1999. szeptemberi verziójában (NCBI, NIH) található összes eger- és emberi eredetű variábilis lánc szekvencia elemzésével határoztuk meg. Feltételeztük, hogy a kötődési hely közelében elhelyezkedő mCBEl 1specifíkus különbségek a kötődési aktivitást fokozó szomatikus mutációkat jeleznek. Az átalakított ellenanyagban feltehetően immunogén epitópokat kialakító, a kötődési helytől távolabb található szokatlan egéreredetű aminosavakat és a szokatlan emberi eredetű aminosavakat eltávolítottuk. Az mCBEl 1 könnyűláncában a K3, az Ml 1, az Y12, a W41, a Q69, az S72, a D81 a T83, a nehézláncában az F37, a T40, az E42, az A49 és az N77 voltak szokatlan vázbeli aminosavak. Ezek legtöbbjét ugyan nem tartottuk meg a humanizált CBE11 ellenanyagokban, megőriztünk azonban benne néhány szokatlan vázbeli aminosavat, pl. a nehézlánc F37 és A49 pozíciójú aminosavait.

- 11 A variábilis régiók szerkezetének modellezése

Az mCBEl 1 könnyű- és nehézláncai háromdimenziós modelljeinek megszerkesztéséhez szükséges szerkezeti kertek meghatározásához nem-redundáns adatbázisbeli szekvenciákkal szekvencia-azonosság alapján egymás alá rendeztük a találmány szerinti nehéz- és könnyűláncokat. A BLAST program alkalmazásával a könnyűlánc 93%-os szekvencia-azonosságot mutatott az 5g9 jelű egéreredetű monoklonális ellenanyaggal (1AHW), míg a nehézlánc 81%-os szekvencia-azonosságot mutatott egy egéreredetű IGGA2 FAB fragmenssel (Fab 17/9) (1IFH). A „Sybyl” (Triptos Inc.) molekulamodellezö programcsomag segítségével az 5g9 könnyűláncának és az IGGA2 Fab fragmens nehézláncának felhasználásával elkészítettük a könnyű- és a nehézláncok háromdimenziós szerkezetét. A modellek szerkezeti integritását megvizsgáltuk és elfogadhatónak találtuk.

Az átalakított variábilis régiók tervezése

Az mCBEll CDR-ek befogadására alkalmas emberi akceptor vázakat homológiaillesztés segítségével választottuk ki. A BLAST programmal kereséseket végeztünk a Kabatféle adatbázisban és az NCBI nem-redundáns adatbázisában, az ENTRZ-ben (The National Institutes of Health). Az emberi akceptor vázakat az mCBEll váz és az emberi eredetű váz szekvencia-azonossága alapján választottuk ki (a korábban leírt humanizált ellenanyagok vázait figyelmen kívül hagytuk).

A variábilis könnyűlánc (VL) esetében az emberi alfa tumomekrózis faktor elleni TNFAl’CL ellenanyag [Griffiths és mtsai.: EMBO J. 12, 725 (1993); kábát azonosítószám: 004770; emberi kappa I. alcsoport], a variábilis nehézlánc (VH) esetében az ismeretlen specifitású FLA-IgG’CL ellenanyag [Malisán és mtsai.: Blood 87, 717 (1996); kábát azonosítószám: 040003; emberi III. alcsoport] eredetű vázat választottunk. Az emberi VL és VH vázak az egéreredetű szekvenciákhoz képest 15 és 11 aminosav eltérést tartalmaznak.

Az emberi eredetű vázak visszmutációi

A monoklonális ellenanyagok humanizálásának leginkább kiszámíthatatlan eredményű lépése az eredeti ellenanyag kötődési tulajdonságainak alapvető megőrzése és a folyamat eredményeként nyert ellenanyag potenciális immunogén hatásának minimálisra csökkentése érdekében az eredeti ellenanyag vázbeli kritikus, azaz megőrzendő aminosavainak azonosítása (jelen esetben az eredeti ellenanyag egéreredetű). A kanonikus aminosavak, a határfelületi csomagoló aminosavak („interface packing residues”) és a kötődési helyhez közeli szokatlan egéreredetű aminosavak megőrzése különösen fontos. Mindezek mellett a (CDR-ek rögzítésére szolgáló felületet biztosító) Vernier zónában [Foote és Winter: J. Mól. Bioi. 224, 487

- 12 (1992)] lévő és a CDR H3-hoz közeli aminosavakat is figyelembe kell venni. Az eredeti ellenanyagra visszavezető (vagyis az emberi vázbeli aminosav helyett egéreredetű aminosavat eredményező) mutációkat visszmutációnak nevezzük.

Az átalakított variábilis könnyűláncot (hu-CBEll VL) három, míg az átalakított variábilis nehézláncot (hu-CBEll VH) négy változatban állítottuk elő. A hu-CBEll VH negyedik változatát kivéve általában az első változat tartalmazta a legtöbb, a harmadik pedig a legkevesebb visszmutációt (vagyis ez volt a leginkább „humanizált”). A találmány tárgyát mCBEllből származó, variábilis könnyűláncként az alábbiakban bemutatott variábilis könnyűláncok (VL#1, VL#2 vagy VL#3) egyikét, variábilis nehézláncként pedig az alábbiakban bemutatott variábilis nehézláncok (VH#, VH#2, VH#3 vagy VH#4) egyikét tetszőleges kombinációban tartalmazó humanizált ellenanyagok képezik.

(A) Könnyűlánc

Q (glutamin) -> K (lizin). Az első változatban megtartottuk, mert korábbi átalakítási kísérletekben [pl. Kolbinger és mtsai.: Prot. Eng. 6, 971 (1993)] bebizonyosodott, hogy az antigénkötés vagy a CDR konformáció szempontjából fontos lehet.

G (glicin) -> W (triptofán). Az első és a második változatban megtartottuk.

L (leucin) -> I (izoleucin). Az első és a második változatban megtartottuk, mivel határterületi és a Vernier-zónába eső aminosav. Emellett szokatlan aminosav, ami az egéreredetű szekvenciákban kilencszer, az emberi szekvenciákban pedig egy alkalommal fordul elő. Feltehetően befolyásolja a variábilis láncok csomagolását és CDR-ekkel érintkezhet.

T (treonin) -> Q (glutamin). Ennek a Vernier-zónában található aminosavnak CDRkonformációt befolyásoló hatása lehet. A rövid T-ről hosszabb Q-ra történő váltás antigénhez történő kapcsolódást is kiválthat. A Q szokatlan aminosav, amely egérben 58 alkalommal, emberben kétszer fordul elő. Az első változatban megtartottuk.

F (fenilalanin) -> Y (tirozin). Ezt a kanonikus pozícióban lévő aminosavat az összes változatban megőriztük. Emberi szekvenciákban viszonylag szokatlannak számít, csupán 25 alkalommal fordul elő.

(B) Nehézlánc

V (valin) -> F (fenilalanin). Az első, második és a negyedik változatban megtartottuk. Ebben a pozícióban az F szokatlan, egérben csupán 15, emberben pedig 18 alkalommal fordul elő. Mindemellett határterületi aminosavnak is számít.

A (alanin) -> T (treonin). Az R-t az első változatban megtartottuk. Ebben a pozícióban 5 korábbi humanizálási kísérletben is mutációt végeztek, bár az sosem A-ról T-re történt.

- 13 Ennek egyik példája a BrE-3 eltakarása („veneering”) esetében az A-ról S-re változtatás volt [Couto és mtsai.: Hybridoma 13, 215 (1994)], amely a kötődési affinitás fokozódását eredményezte, bár ennek pontos oka sosem derült ki. Az említett esetben a nehézlánc szintén emberi III. alcsoportba tartozó volt.

S (szerin) -> A (alanin). Ezt a CDR alatt és a vernier-zónában található aminosavat mindegyik változatban megtartottuk.

V (valin) -> M (metionin). Az első változatban megtartottuk. Ennél a pozíciónál számos humanizálás! kísérletben visszmutációt végeztek.

A (alanin) -> V (valin). Ezt a határfelületi és vernier-zónában lévő pozíciót az első és a második változatban változatlanul hagytuk.

A variábilis könnyű- és nehézláncok különböző változatainak aminosav- és nukleinsavszekvenciái a következők.

Átalakított variábilis könnyűláncok

Átalakított CBE11 variábilis könnyűlánc - 1. könnyűlánc változat (VL#1) (pAND066 plazmid)

GATATTAAGATGACCCAGTCTCCATCATCCTTGTCTGCATCGGTGGGAGACAGGGTCACT 60 DIKMTQSPSSLSASVGDRVT

3.as

ATC ACTTGC AAGGCGGGTC AGGACATTAAAAGCTATTTAAGCTGGTACC AGCAGAAACCA 120

ITCKAGQDIKSYLSWYQQKP

121 TGGAAAGCGCCTAAGATCCTGATCTATTATGCAACAAGGTTGGCAGATGGGGTCCC ATC A 180

WKAPKILIYYATRLADGVPS

41.as 46.as

181 AGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATACTCTAACCATCAGCAGCCTGCAGCCT 240 RFSGSGSGQDYTLT1SSLQP

69.as 71.as

241 GAGGATTTCGCAACTTATTACTGTCTACAGCATGGTGAGAGCCCGTGGACGTTCGGTGGA 300

EDFATYYCLQHGESPWTFGG

301 GGCACCAAGCTGGAGATCAAA 321

G T K L E I K

A 3. azonosító számú szekvencia az átalakított VL#1 nukleinsav-szekvenciájának felel meg.

- 14 A 4. azonosítószámú szekvencia az átalakított VL#1 aminosav-szekvenciájának felel meg.

Átalakított CSEH variábilis könnyűlánc - 2, könnyűlánc változat (VL#2) (pAND070 plazmid)

GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCATCCTTGTCTGCATCGGTGGGAGACAGGGTCACT 60

DIQMTQSPSSLSASVGDRVT

ATCACTTGCAAGGCGGGTCAGGACATTAAAAGCTATTTAAGCTGGTACCAGCAGAAACCA 120

ITCKAGQDIKSYLSWYQQKP

121 TGGAAAGCGCCTAAGATCCTGATCTATTATGCAACAAGGTTGGCAGATGGGGTCCC ATCA 180

WKAPKILIYYATRLADGVPS

41.as 46.as

181 AGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGGC AAGATTATACTCTAACCATC AGC AGCCTGC AGCCT 240

RFSGSGSGQDYTLTISSLQP

71.as

241 GAGGATTTCGCAACTTATTACTGTCTACAGCATGGTGAGAGCCCGTGGACGTTCGGTGGA 300

EDFATYYCLQHGESPWTFGG

301 GGCACCAAGCTGGAGATCAAA 321

G T K L E I K

Az 5. azonosítószámú szekvencia az átalakított VL#2 nukleinsav-szekvenciájának felel meg.

A 6. azonosító számú szekvencia az átalakított VL#2 aminosav-szekvenciájának felel meg.

Átalakított CBE11 variábilis könnyűlánc - 3, könnyűlánc változat (VL#3) (pAND074 plazmid)

GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCATCCTTGTCTGCATCGGTGGGAGACAGGGTCACT 60 DIQMTQSPSSLSASVGDRVT

ATC ACTTGC AAGGCGGGTCAGGAC ATTA AAAGCTATTTAAGCTGGTACC AGCAGAAACC A 120

ITCKAGQDIKSYLSWYQQKP

121

GGGAAAGCGCCTAAGCCTCTGATCTATTATGCAACAAGGTTGGCAGATGGGGTCCC ATC A 180

GKAPKLLIYYATRLADGVPS

- 15 181 AGATTC AGTGGC AGTGGATCTGGTACAGATTATACTCTAACC ATCAGCAGCCTGC AGCCT 240

RFSGSGSGTDYTLTISSLQP

71.as

241 GAGGATTTCGCAACTTATTACTGTCTACAGCATGGTGAGAGCCCGTGGACGTTCGGTGGA 300

EDFATYYCLQHGESPWTFGG

301 GGCACCAAGCTGGAGATCAAA 321

G T K L E I K

A 7. azonosítószámú szekvencia az átalakított VL#3 nukleinsav-szekvenciájának felel meg.

A 8. azonosítószámú szekvencia az átalakított VL#3 aminosav-szekvenciájának felel meg.

Átalakított variábilis nehézláncok

Átalakított CBE11 variábilis nehézlánc - 1, nehézlánc változat (VH#1) (pAND067 plazmid)

GAGGTACAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGGCTC 60

EVQLVESGGGLVKPGGSLRL

TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGTTTCGCCAGACT 120

SCAASGFTFSDYYMYWFRQT

37.as 4O.as

121 CCGGGAAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTACACCTACTAT 180

PGKGLEWVATISDGGSYTYY

49.as

181 CC AGAC AGTGTGAAGGGGCGATTCACC ATCTCCAGAGACAATGCC AAGAACAGCCTCTAC 240

PDSVKGRFTISRDNAKNSLY

241 CTGCAGATGAGCAGCCTGAGGGCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGTAAGAGAGGAG 300

LQMSSLRAEDTAMYYCVREE

89.as 93.as

301 AATGGTAACTTTTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA 360

NGNFYYFDYWGQGTTVTVSS

A 9. azonosítószámú szekvencia az átalakított VH#1 nukleinsav-szekvenciájának felel meg.

A 10. azonosítószámú szekvencia az átalakított VH#1 aminosav-szekvenciájának felel meg.

- 16Átalakított CBE11 variábilis nehézlánc - 2. nehézlánc változat (VH#2) (pAND071 plazmid)

GAGGTACAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGGCTC 60 EVQLVESGGGLVKPGGSLRL

TCCTGTGC AGCCTCTGG ATTC ACTTTC AGTGACTATT AC ATGTATTGGTTTCGCC AGGCC 120

SCAASGFTFSDYYMYWFRQA

37.as

121 CCGGGAAAGGGGCTGGAGTGGGTCGC AACC ATTAGTGATGGTGGTAGTTAC ACCTACTAT 180

PGKGLEWVATISDGGSYTYY

49. as

181 CCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAGCCTCTAC 240

PDSVKGRFTISRDNAKNSLY

241 CTGCAGATGAGCAGCCTGAGGGCTGAGGACACAGCTGTGTATTACTGTGTAAGAGAGGAG 300

LQMSSLRAEDTAVYYCVREE

93. as

301 AATGGTAACTTTTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA 360

NGNFYYFDYWGQGTTVTVSS

All. azonosítószámú szekvencia az átalakított VH#2 nukleinsav-szekvenciájának felel meg.

A 12. azonosítószámú szekvencia az átalakított VH#2 aminosav-szekvenciájának felel meg.

Átalakított CBE11 variábilis nehézlánc - 3, nehézlánc változat (VH#3) (pAND075 plazmid)

GAGGTACAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGGCTC 60

EVQLVESGGGLVKPGGSLRL

TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTGCGCCAGGCC

120

SCAASGFTFSDYYMYWVRQA

121 CCGGGAAAGGGGCTGGAGTGGGTCGC AACC ATT AGTGATGGTGGT AGTT AC ACCTACTAT

180

PGKGLEWVATISDGGSYTYY

49.as

- 17181 CC AGAC AGTGTGAAGGGGCGATTC ACCATCTCC AGAGACAATGCC AAGAAC AGCCTCTAC

240

PDSVKGRFTISRDNAKNSLY

241 CTGCAGATGAGCAGCCTGAGGGCTGAGGACACAGCTGTGTATTACTGCGCAGAGAGGAG

300

LQMSSLRAEDTAVYYCAREE

301 AATGGTAACTTTT ACT ACTTTGACT ACTGGGGCC A AGGGACC ACGGTC ACCGTCTCCTC A

360

NGNFYYFDYWGQGTTVTVSS

A 13. azonosítószámú szekvencia az átalakított VH#3 nukleinsav-szekvenciájának felel meg.

A 14. azonosítószámú szekvencia az átalakított VH#3 aminosav-szekvenciájának felel meg.

Átalakított CBE11 variábilis nehézlánc - 4, nehézlánc változat (VH#4) (pAND090 plazmid)

GAGGTACAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAGGCTC 60

EVQLVESGGGLVKPGGSLRL

TCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGTTTCGCCAGGCC 120

SCAASGFTFSDYYMYWFRQA

37.as

121 CCGGG AA AGGGGCTGGAGTGGGTCGC A ACC ATT AGTGATGGTGGTAGTT ACACCTACT AT 180

PGKGLEWVATISDGGSYTYY

49.as

181 CCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAGCCTCTAC 240

PDSVKGRFTISRDNAKNSLY

241 CTGCAGATGAGCAGCCTGAGGGCTGAGGACACAGCTGTGTATTACTGCGCAGAGAGGAG 300

LQMSSLRAEDTAVYYCAREE

301 AATGGTAACTTTTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA 360

NGNFYYFDYWGQGTTVTVSS

4. ·*

- 18 A 15. azonosító számú szekvencia az átalakított VH#4 nukleinsav-szekvenciájának felel meg.

A 16. azonosítószámú szekvencia az átalakított VH#4 aminosav-szekvenciájának felel meg.

A könnyű- és nehézláncok különböző változatait tartalmazó ellenanyagokat állítottunk elő, majd azokat további vizsgálatainkban alkalmaztuk. így pl. előállítottuk az átalakított huCBEll variábilis könnyűláncának 3. változatát (VL#3) és az átalakított huCBEll variábilis nehézláncának 4. változatát (VH#4) tartalmazó, huCBEll#4 vagy hCBEll elnevezésű ellenanyagot, majd az ezt az ellenanyagot termelő E46.4 és E77.4 jelű sejtvonalakat letétbe helyeztük az ATCC-nél (ATCC szabadalmi deponálási szám PTA-3357 valamint PTA-3765).

A találmány tárgyát képezik továbbá az átalakított VH és VL szekvenciákkal egyenértékű szekvenciák, valamint az átalakított VH és VL szekvenciák változatai, amelyek az LT-βR kötődést lényegileg nem befolyásoló, egy vagy több konzervatív aminosav-helyettesítést tartalmaznak. Az említett humanizált variábilis nehéz- és könnyűlánc-szekvenciákat tartalmazó humanizált ΕΤ-β-R ellenanyagok a példákban bemutatott rekombináns eljárásokkal állíthatók elő.

Alkalmazások

A találmány szerinti humanizált anti-LT^-R ellenanyagok olyan megbetegedések gyógykezelésében nyerhetnek alkalmazást, amelyeknél terápiás szempontból előnyös az LT-βR aktiválás. Ilyen pl. a daganatos kórképek kezelése, megelőzése, vagy előrehaladásuk, súlyosságuk vagy hatásuk csökkentése.

A találmány egyik megvalósítási módját emlős (vagyis ember) nemkívánatos sejtproliferációval kapcsolatos megbetegedésének gyógykezelésére szolgáló, a találmány szerinti humanizált ΕΤ-β-R ellenanyagokat tartalmazó készítmény gyógyászati szempontból hatékony adagja emlősnek történő beadását magában foglaló eljárás képezi.

A találmány egy másik megvalósítási módját emlős (azaz ember) ΕΤ-β-R-t fokozottan expresszáló tömött daganatának (azaz carcinomájának) gyógykezelésére szolgáló, az ΕΤ-β-Rhez kötődő humanizált ΕΤ-β-R ellenanyag daganatméretet hatékonyan csökkentő adagja emlősnek történő beadását magában foglaló eljárás képezi. A daganatszövet könyvtárakban expresszált ΕΤ-β-R és/vagy ΕΤ-β-R ligandum (ΕΤα1β2 vagy LIGHT) mRNS mennyiségének in vitro megállapításával az ΕΤ-β-R által modulált proliferációjú ráksejt-típusok szkrínelhetők. Ilyeneknek tekintjük az ΕΤ-β-R és/vagy ΕΤ-β-R ligandum (ΕΤα1β2 vagy LIGHT) mRNS

- 19nagy mennyiségű expresszióját mutató daganatszövet-könyvtárakat. A találmány tárgyát képező daganatok pl. a tömött típusú daganatok, többek között a nem kis sejtes tüdőrák (NSCLC), a colorectalis carcinoma, az emlőrák, valamint a prosztata-, a gyomor-, a nyelőcső- és a húgyhólyagrák.

A nemkívánatos sejtproliferációval kapcsolatos megbetegedések gyógykezelésére, közelebbről daganat-terápiára alkalmazott találmány szerinti humanizált ellenanyagok előnyösen meggátolják a daganatsejt-növekedést, amire pl. a daganat méretének kb. 10%-ot, 20%-ot, 30%-ot vagy 40%-ot, legelőnyösebben pedig 50%-ot meghaladó mértékű csökkenése utal. A humanizált ellenanyagokhoz szkrínelés alkalmazásával jutunk (Id. pl. a 3. példában megtárgyaltakat). A találmány szerinti megoldásban alkalmazott humanizált ellenanyagok pl. a hatásukra a kezeletlen ráksejtekhez képest (pl. kb. 10%-ot, 20%-ot, 30%-ot, 40%-ot vagy 50%-ot meghaladó mértékben) csökkent daganatméret alapján választhatók ki.

A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti humanizált ellenanyagot és egy gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények. Az e célra megfelelő vivőanyagok és kiszerelésük megtalálható pl. a következő kiadványban: Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16. kiad., szerk.: Oslo és mtsai., kiad.: Mack Publishing Co., (1980). A kiszereléshez annak izotóniássá tétele érdekében jellemzően megfelelő mennyiségű, gyógyászati szempontból elfogadható sót adnak. A vivőanyag lehet puffer, pl. fiziológiás sóoldat, Ringer-oldat vagy dextrózoldat. Az oldat pH-értéke előnyösen kb. 5 és kb. 8 közötti, előnyösebben pedig kb. 7,4 és kb. 7,8 közötti. Vivőanyagok lehetnek továbbá késleltetett kibocsátású készítmények is, ilyenek pl. a szilárd hidrofób polimerek pl. liposzómák, filmek vagy mikrorészecskék alakjában előforduló féligáteresztő mátrixai. Szakember számára nyilvánvaló, hogy pl. a beadási úttól vagy a beadandó gyógyászati készítmény koncentrációjától függően bizonyos vivőanyagok alkalmazása előnyösebb lehet.

A készítmény beadása történhet (pl. intravénás, intraperitoneális, szubkután vagy intramuszkuláris) injekcióval vagy egyéb, a véráramba juttatásra alkalmas hatékony módon, pl. infúzióban.

A találmány szerinti humanizált ellenanyagok a kezelni kívánt klinikai állapot gyógykezelésére alkalmas hatékony dózisban adagolhatok. Egy adott alkalmazás szempontjából előnyös gyógyászati kiszerelés és gyógyászatilag hatékony adagolási elrendezés megállapítása pl. a páciens testtömegének és állapotának, a tervezett kezelés hosszának és a páciens toleráló képességét figyelembe véve szakember számára nem okozhat nehézséget. A készítmény hatékony adagja pl. kb. 0,05 és kb. 100 mg/testtömeg kg/nap közötti. Közelebbről, kb. 0,05 mg, 0,1 mg,

Λ’*·’*· -200,2 mg, 0,3 mg, 0,4 mg, 0,5 mg, 0,6 mg, 0,7 mg, 0,8 mg, 0,9 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg vagy 25 mg/testtömeg kg/nap. Alternatív módon, kb. 0,05 - kb. 100 mg, közelebbről kb. 0,05 mg, 0,1 mg, 0,2 mg, 0,3 mg, 0,4 mg, 0,5 mg, 0,6 mg, 0,7 mg, 0,8 mg, 0,9 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg vagy 25 mg/testtömeg kg/hét. Alternatív módon, kb. 0,05 - kb. 100 mg, közelebbről kb. 0,05 mg, 0,1 mg, 0,2 mg, 0,3 mg, 0,4 mg, 0,5 mg, 0,6 mg, 0,7 mg, 0,8 mg, 0,9 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg vagy 25 mg/testtömeg kg kéthetente. Alternatív módon, kb. 0,05 - kb. 100 mg, közelebbről kb. 0,05 mg, 0,1 mg, 0,2 mg, 0,3 mg, 0,4 mg, 0,5 mg, 0,6 mg, 0,7 mg, 0,8 mg, 0,9 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg vagy 25 mg/testtömeg kg háromhetente. Alternatív módon, kb. 0,05 - kb. 100 mg, közelebbről kb. 0,05 mg, 0,1 mg, 0,2 mg, 0,3 mg, 0,4 mg, 0,5 mg, 0,6 mg, 0,7 mg, 0,8 mg, 0,9 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg vagy 25 mg/testtömeg kg négyhetente.

A találmány szerinti megoldás ellenkező értelmű jelzés hiányában hagyományos, a szakirodalomban közzétett, szakember számára ismert sejtbiológiai, sejttenyésztési, molekuláris biológiai, mikrobiológiai, rekombináns DNS-, proteinkémiai és immunológiai technikákat alkalmaz. Lásd pl. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, szerk.: Sambrook, Fritsch és Maniatis, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); DNA Cloning, I. és IL kötet, szerk.: Glover, D. N. (1985); Oligonucleotide Synthesis, szerk.: Gait, M. J. (1984); 4683195 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat (Mullis és mtsai.); Nucleic Acid Hybridization, szerk.: Hames, B. D. és Higgins, S. J. (1984); Transcription and Translation, szerk.: Hames, B. D. és Higgins, S. J. (1984); Culture of Animal Cells, szerk.: Freshney, R. 1., kiad.: Alan R. Liss, Inc. (1987); Immobilized Cells and Enzymes, kiad.: IRL Press (1986); Perbal, B.: A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Methods in Enzymology, 154. és 155. kötet, szerk.: Wu és mtsai., kiad.: Academic Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, szerk.: Miller, J. H. és Calos, Μ. P., kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory (1987); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, szerk.: Mayer és Walker, kiad.: Academic Press, London (1987); Handbook of Experimental Immunology, I-IV. kötet, szerk.: Weir, D. M. és Blackwell, C. C. (1986); Manipulating the Mouse Embryo, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1986).

A következő példák pusztán a találmány szerinti megoldás illusztrálását szolgálják és nem jelentik hatókörének korlátozását.

1. példa

A chCBEll szerkesztése és expresszálása

Az egéreredetü CBE11 nehéz- és könnyűláncainak variábilis régióit kódoló cDNS-eket felhasználva a muCBEll variábilis régióit emberi IgGl és kappa konstans régiókhoz kapcsoltan tartalmazó egér-ember kimérák (chCBEl 1) expressziójára szolgáló vektorokat hoztunk létre. A nehézlánc kiméra előállítása során a muCBEll nehézlánc variábilis régióban egéreredetű nehézlánc szignálszekvencia és szplájsz donorhely kialakítása érdekében a pLCB7 jelű 5a8 nehézlánc plazmid foszfatázzal kezelt 2,82 kb-os Ρί/Ι-^ΕΠ vektor fragmensébe a pEAG970 jelű CBE11 nehézlánc szubklónból származó 0,36 kb-os Pstl-BstEII fragmenst szubklónoztunk (az 5a8 a Biogen által korábban leírt molekulárisán klónozott CD4-specifikus monoklonális ellenanyag). Az ennek eredményeként kapott, pEAG979 jelű plazmidban a nehézlánc érett Nterminálisa a PCR alatti láncindító-determináció miatt két helyen különbözött az Edman degradálással előállított tisztított eredeti CBE11 nehézlánc N-terminális szekvenciájától. A nehézlánc N-terminálisának kijavítása érdekében a pEAG979-et Amersham Pharmacia Biotech USE mutagenezis reagenskészletnek a gyártó utasításainak megfelelően történt alkalmazása segítségével egyedi helytörléses („unique site elimination”, USE) mutagenezisnek vetettük alá. A mutáns plazmidokat a bennük kialakított Avail, PsíI és Rsal változások alapján szkríneléssel azonosítottuk. Az így kapott pEAG981 jelű plazmidbeli nehézlánc szekvencia azonosítását DNS-szekvenálással végeztük el. A pEAG981 0,44 kb-os Notl-HindlII nehézlánc variábilis dómén fragmensét és a pEAG964 emberi IgGl konstans régiót tartalmazó 1,21 kb-os HindlIINotl fragmensét a pCEP4 (Invitrogen) EBV expressziósvektor eredetű pCH269-es plazmid Nofl helyébe szubklónozva a pEAG983 jelű plazmidot kaptuk.

A könnyűlánc kiméra előállítása során a létrehozott pEAG978 plazmidbeli egéreredetű könnyűlánc szignálszekvencia és 5’ Nofl hely kialakítása érdekében a pBluescriptIISK+ klónozóvektor (Stratagene) foszfatázzal kezelt 2,94 kb-os Notl-BamHI vektor fragmensébe a pMDR985 jelű plazmidból származó 0,11 kb-os Notl-EcoRN fragmenst és a pEAG967 jelű CBE11 könnyülánc variábilis dómén plazmidból származó 0,37 kb-os EcoRN-BamHI fragmenst szubklónoztunk. Az így kapott plazmidot Amersham Pharmacia Biotech USE mutagenezis reagenskészletnek a gyártó utasításainak megfelelően történt alkalmazásával, az eredeti CBE11 könnyűlánc N-terminálisnak megfelelő V3K helyettesítést kódoló, valamint a könnyülánc variábilis dómén 3’ végén BglII helyet kialakító mutagén láncindítók segítségével USE mutagenezisnek vetettük alá. A mutáns plazmidokat a bennük kialakított BglII, EcoRN és Msei helyváltozások alapján szkríneléssel azonosítottuk. Az így kapott pEAG980 jelű

-22plazmidbeli könnyűlánc szekvencia azonosítását DNS-szekvenálással végeztük el. A pEAG980 0,41 kb-os Notl-Bglll könnyülánc variábilis dómén fragmensét és a pEAG963 emberi kappa könnyülánc konstans domént tartalmazó 0,68 kb-os BcH-Notl fragmensét a pCEP4 (Invitrogen) EBV expressziósvektor eredetű pCH269-es plazmid NotI helyébe szubklónozva a pEAG982 jelű plazmidot kaptuk.

Az expressziósvektorokat (a pEAG983 jelű chCBEl 1 nehézlánc vektort és a pEAG982 jelű chCBEll könnyűlánc vektort) 293-EBNA sejtekbe ko-transzfektáltuk, majd a sejteket ellenanyagtermelés és -specifitás szempontjából vizsgáltuk [kontrollként üres plazmiddal és ch5c8-cal transzfektált sejteket használtunk (utóbbi a Biogen által korábban leírt molekulárisán klónozott CD154-specifikus monoklonális ellenanyag)]. A teljessejt-lizátumok és a kondicionált tápközeg protein-A immun-precipitátumainak (anti-humán nehéz- és könnyülánc ellenanyagok alkalmazásával végzett) westem-blot elemzése kimutatta, hogy a chCBEll-el transzfektált sejtek a ch5c8-cal transzfektált sejtekhez hasonló mennyiségben szintetizáltak és hozzájuk mérhető hatékonysággal szekretáltak nehéz- és könnyűláncokat. A transzfektált sejtek kondicionált tápközegével festett, ΕΤ-β-R-t expresszáló HT-29 sejtek FACS-elemzése alapján a chCBEl 1 ellenanyag a muCBEl 1-hez hasonló festődési mintázatot alakított ki, míg a mockés ch5c8 transzfektált sejtek kondicionált tápközege nem festette meg a HT-29 sejteken az ΕΤβ-R-t. Az átmeneti transzfekcióval előállított, kitisztított kiméra CBE11 az ΕΤ-β-R-t expresszáló A375 jelű melanoma sejtek IL-8 szekrécióját indukálta és csupasz („nude”) egérben meggátolta a WiDRr adenocarcinoma sejtek növekedését.

2. példa

A huCBEll szerkesztése és expresszálása

A humanizált CBE11 (huCBEll) előállításához az átalakított variábilis doméneket a fentiek szerint terveztük meg. Az emberi akceptor vázakat homológia párosítás alapján határoztuk meg, a könnyűlánchoz emberi kappa I. alcsoport TNF-A1 monoklonális ellenanyagot [Griffiths és mtsai. (1993)], a nehézlánchoz emberi III. alcsoport FLA-IgG monoklonális ellenanyagot [Malisán és mtsai. (1996)] választottunk. Az átalakított variábilis könnyűláncot három, míg az átalakított variábilis nehézláncot négy változatban állítottuk elő. Általában az első változat tartalmazta a legtöbb, az utolsó pedig a legkevesebb egéreredetű donorszekvenciára visszavezető mutációt (vagyis utóbbi volt a leginkább „humanizált”).

A huCBEll variábilis régiókat kezdő templátokként chCBEll variábilis dómén plazmidokat alkalmazva Amersham Pharmacia Biotech egyedi helytörléses („unique site

-23 elimination”, USE) mutagenezis reagenskészlet gyártó által javasolt protokoll szerinti felhasználásával állítottuk elő. A vázbeli („framework”, FR) változásokhoz igénybe vett mutagén láncindítókat az alábbiakban mutatjuk be. Az alkalmazott emberi akceptor vázak cDNS szekvenciájában (a könnyűlánc Kábát adatbázis azonosítója #004770, a nehézláncé #040003) a mutáción átesett plazmidok azonosítása érdekében restrikcióshely-változásokat okozó néma mutációkat helyeztünk el. A mutáns plazmidokat a bennük létrejött restrikcióshely-változások alapján szkríneléssel azonosítottuk. A plazmidbeli variábilis régió cDNS-szekvenciákat DNSszekvenálással azonosítottuk.

A VH#1 esetében pEAG981 templátot alkalmaztunk, a következő láncindítókkal. Az FR1 láncindító (5’-GCC TGG AGG GTC CCT GAG GCT CTC CTG TGC AGC CTC-3’; 17. azonosítószámú szekvencia) Bsu36I helyet biztosított, az FR2 láncindító (5’-GTT TCG CCA GAC TCC GGG AAA GGG GCT GGA GTG GGT CGC AAC-3’; 18. azonosítószámú szekvencia) Ncil és ΗραϊΙ helyeket alakított ki, míg az FR3 láncindító (5’-CAG AGA CAA TGC CAA GAA CAG CCT CTA CCT GCA GAT GAG CAG CCT GAG GGC TGA GGA CAC AGC CAT G-3’; 19. azonosítószámú szekvencia) Bsu36I és PstI helyeket biztosított és eltávolított egy Rsal helyet. A fentiek eredményeként kapott VH#1 plazmidot pAND067-nek neveztük el.

A VH#2 esetében pAND067 templátot alkalmaztunk, a következő láncindítókkal. Az FR2 láncindító (5’-CAT GTA TTG GTT TCG CCA GGC CCC GGG AAA GGG GCT GG3’; 20. azonosítószámú szekvencia) Smal helyeket alakított ki, míg az FR3 láncindító (5’-GGG CTG AGG ACA CAG CTG TGT ATT ACT GTG TAA GAG-3’; 21. azonosítószámú szekvencia) PvuII helyet biztosított. A fentiek eredményeként kapott VH#2 plazmidot pAND071nek neveztük el.

A VH#3 esetében pAND067 templátot alkalmaztunk, a következő láncindítókkal. Az FR2 láncindító (5’-GTG ACT ATT ACA TGT ATT GGG TGC GCC AGG CCC CGG GAA AGG GGC TGG AG-3’; 22. azonosítószámú szekvencia) Smal és Hha\. helyeket alakított ki, az FR3 láncindító (5’-GAG GGC TGA GGA CAC AGC TGT GTA TTA CTG CGC AAG AGA GGA GAA TGG TAA C-3’; 23. azonosítószámú szekvencia) PvuVÍ és Fspl helyeket biztosított. A fentiek eredményeként kapott VH#3 plazmidot pAND075-nek neveztük el.

A pAND067-ből, a pAND071-ből vagy a pAND075-ből származó 0,44 kb-os NotlHinAII nehézlánc variábilis dómén fragmenseket, valamint a pEAG964 jelű plazmidból származó, emberi IgGl konstans régiót tartalmazó 1,21 kb-os HindlII-Notl fragmenst a pCH269 jelű, pCEP4 EBV expressziósvektor-eredetű plazmid NotI helyébe szubklónozva a huCBEll

-24PAND069 (VH#1), pAND073 (VH#2) és pAND077 (VH#3) jelű „ehézlánc expresses vektorait hoztuk létre.

A VLSI esetében pEAGSSO templátot alkalmaztunk, a következő láncinditókkal. Az ERI láncindító (5’-CTT GCA AGT GAT AGT GAC CCT GTC TCC CAC CGA TGC AGA 5 CAA GGA TGA TGG AGA CTG GGT CAT C-324. azonosítószámú szekvencia) Hinfl és NsA helyeket távolított el, az FR2 láncindító (5’-CAT AAT AGA TCA GGA TCT TAG GCG CTT TCC ATG GTT TCT OCT G-3’; 25. azonosítószámú szekvencia) Haéü és Hha\ helyeket alakított ki, míg az FR3 láncindító (5’-GTA GAC AGT AAT AAG TTG CGA AAT CCT CAG GCT GCA GGC TGC TGA TGG TTA GAG TAT AAT CTT GCC CAG ATC-3’ 26 10 azonosítószámú szekvencia) Bsu36l, DdA és Pstl helyeket biztosított. Az így kapott VL#1 plazmidot pAND066-nak neveztük el.

A VL#2 eseteben pAND066 templátot alkalmaztunk, a következő láncindítókkal. Az FRl láncinditó (5’-GAT GGA GAC TGG GTC ATC TGG ATA TCA CCT CTG GCA CCT G-3’, 27. azonosítószámú szekvencia) EcoRN helyet alakított ki, az FR3 láncinditó (5’-GAT 15 GGT TAG AGT ATA ATC TGT ACC AGA TCC ACT GCC ACT G-3’; 28. azonosítószámú szekvencia) pedig ΛμΙ helyet biztosított. A fentiek eredményeként kapott VL#2 plazmidot pAND070-nek neveztük el.

A VL#3 eseteben pANDOóő templátot alkalmaztunk, a következő láncindítókkal. Az FRl láncindító (5’-GAT GGA GAC TGG GTC ATC TGG ATA TCA CCT CTG GCA CCT 20 G-3 ; 29. azonosítószámú szekvencia) EcoRV helyet biztosított, az FR2 láncindító (5’-CAA

CCT TGT TGC ATA ATA GAT CAG AAG CTT AGG CGC TTT CCC TGG TTT CTG CTG GTA CC-3’; 30. azonosítószámú szekvencia) Hindii! helyet alakított ki és Ncol valamint Sty! helyeket távolított el, az FR3 láncindító (5’-GAT GGT TAG AGT ATA ATC TGT ACC AGA TCC ACT GCC ACT G-3’; 31. azonosítószámú szekvencia) pedig Rsal helyet biztosí25 tott. Az így kapott VL#3 plazmidot pAND074-nek neveztük el.

A huCBEl 1 pAND068 (VL#1), pAND072 (VL#2) és pAND076 (VL#3) jelű könnyűlánc expressziós vektorait a pAND066-ból, a pAND070-ből vagy a pAND074-ből származó 0,41 kb-os Notl-BgHI könnyűlánc variábilis dómén fragmenseket, valamint a pEAG963 jelű plazmidból származó, emberi kappa könnyűlánc konstans domént tartalmazó 0,68 kb-os BcÜ30 Not! fragmenst a pCH269 jelű, pCEP4 EBV expressziósvektor-eredetű plazmid Not! helyébe szubklónozva hoztuk létre.

Az expressziósvektorokat 293-EBNA sejtekbe ko-transzfektáltuk, majd a transzfektált sejteket ellenanyag szekréció és specifitás szempontjából vizsgáltuk (negatív kontrollként üres

-25 vektorral transzfektált sejteket alkalmaztunk). A teljessejt-lizátumok és a kondicionált tápközeg protein-A immun-precipitátumainak (anti-humán nehéz- és könnyűlánc ellenanyagok alkalmazásával végzett) western-blot elemzése kimutatta, hogy a huCBEll-gyel transzfektált sejtek a chCBEl 1-gyel transzfektált sejtekhez hasonló mennyiségben szintetizáltak és hozzájuk mérhető hatékonysággal szekretáltak nehéz- és könnyűláncokat. A transzfektált sejtek kondicionált tápközegével festett, ΕΤ-β-R-t expresszáló HT-29 sejtek FACS-elemzése alapján a huCBEl 1 #3 monoklonális ellenanyag a chCBE 11-hez képest gyengébben kötődött, mint a huCBEl 1#1 és a huCBEll#2 monoklonális ellenanyagok (1. táblázat; a huCBEl 1#1 összetétele VL#1 + VH#1, a huCBEl 1#2 összetétele VL#2 + VH#2, a huCBEl 1#3 összetétele VL#3 + VH#3. A különböző párosításokban végzett ko-transzfektálások eredményeként kiderült, hogy a jelzett csökkenés a VH#3-nak tudható be, amely az FR2 F37V és az FR3 V93A jelű vázpozíciókban különbözött a VH#2-től. Az említett különbségek külön-külön kifejtett hatásának megállapítása érdekében új nehézlánc expressziós vektorokat hoztunk létre. A pAND089 jelű plazmidot, azaz a VH#2 F37V változatát a pAND075-ből származó 311 bp-os Notl-PstI fragmensnek, a pAND071-ből származó 126 bp-os PslI-HindlU fragmensnek, valamint a pEAG964 plazmid eredetű 1,21 kb-os HindíII-Notl fragmensnek a pCEP4 EBV expressziósvektor-eredetű pCH269 jelű plazmid Noll helyébe történt szubklónozásával hoztuk létre. A pAND090 jelű plazmidot, azaz a VH#2 V93A változatát a pAND071-ből származó 311 bp-os Notl-PstI fragmensnek, a pAND075-ből származó 126 bp-os Pstl-Híndlll fragmensnek, valamint a pEAG964 plazmid eredetű 1,21 kb-os Hindül-Not! fragmensnek a pCEP4 EBV expressziósvektor-eredetű pCH269 jelű plazmid Noll helyébe történt szubklónozásával hoztuk létre. Ezekkel a H2/H3 kiméra nehézláncokkal és VL#2-vel vagy VL#3-mal 293-EBNA sejteket ko-transzfektáltunk. A FACS-elemzés adatai alapján a H2 V93A változata a VL#3-mal együttesen visszaállította az ΕΤ-β-R-kötődést (1. táblázat). A pAND076 és pAND090 párosítást huCBEl l#4-nek neveztük el (1. táblázat).

A chCBE 11 és huCBEl 1 #1-4 változatokkal ko-transzfektált 294-EBNA sejteket elszaporítottuk, majd kinyertük a kondicionált tápközegeket. Az ellenanyagok kitisztítására Aprotein-szefarózt alkalmaztunk, majd meghatároztuk a kitisztított monoklonális ellenanyagok aktivitását.

-261. táblázat: HT-29 sejtek chCBEll-gyel és huCBEll-gyel végzett FACS festésének eredménye

	Könnyűlánc	Nehézlánc	Relatív MFI
ChCBEl 1	pEAG982	pEAG983	1,00
HuCBEll#l	pAND068	pAND069	1,00
HuCBEll#2	pAND072	pAND073	1,00
HuCBEll#3	pAND076	pAND077	0,62
L2/H3	pAND072	pAND077	0,42
L3/H2	pAND076	pAND073	1,00
L2/F37V H2	pAND072	pAND089	0,65
L2/V93A H2	pAND072	pAND090	0,75
L3/F37V H2	pAND076	pAND089	0,80
HuCBEll#4	pAND076	pAND090	1,00

Az átmenetileg transzferált sejtek kondicionált tápközegével HT-29-es sejteket festettünk, amely során a sejteket 30 percig jégen inkubáltuk, két alkalommal FACS-pufferrel (5% FBS-sel és 0,05% nátrium-aziddal kiegészített PBS) mostuk, 30 percig jégen tartva FACS-pufferben lévő PE-konjugált anti-humán IgG-vel (H+L) festettük (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.), ismételten két alkalommal FACS-pufferben mostuk, majd a vizsgálat érdekében FACS-pufferben reszuszpendáltuk. A relatív MFI a chCBEl 1 esetében megfigyelt MFI-re normalizált átlagos MFI-t jelöli. A bemutatott adatok két egymástól független transzfekció eredményének átlagát jelentik.

3. példa

IL-8 agonizmus A375 sejtek esetében

Megvizsgáltuk a kitisztított monoklonális ellenanyagok aktivitását. Az A375 jelű emberi melanoma sejteken elvégzett IL-8 kibocsátási vizsgálati eljárás eredményét az 1. ábra mutatja be. Az említett vizsgálat az A375-ÖS emberi melanoma sejtek felszínén expresszált LT-P-R anti-LT-P-R ellenanyaggal történő kapcsolódása eredményeként kibocsátásra kerülő IL-8 mennyiségét állapítja meg. A375-ÖS sejteket 10⁵/ml koncentrációban vagy oldott ellenanyagokat, vagy kecske anti-humán IgG Fc-vel (Jackson ImmunoResearch Laboratories) bevont üregekben megkötött ellenanyagokat tartalmazó 96 üregű tálcákra vittünk. A tálcákat egy éjsza

-27kán át inkubáltuk. A kinyert kondicionált tápközeg IL-8 mennyiségét ELISA-val állapítottuk meg.

4. példa

WiDr sejtek esetében mutatott citotoxicitás

Az oldott anti-LT-P-R ellenanyagok, anti-humán IgG Fc-vel bevont üregek, valamint WiDr vastagbélrák-sejtek alkalmazásával végzett citotoxicitási vizsgálat eredményét a 2. ábra mutatja be. A vizsgálat eredménye alapján az anti-LT-β-Κ ellenanyagok fokozzák a ráksejtekre kifejtett citotoxicitási. WiDr sejteket 6xl0⁴/ml koncentrációban, 80 egység/ml huINF-gamma 10 jelenlétében, vagy oldott ellenanyagokat, vagy kecske anti-humán IgG Fc-vel (Jackson ImmunoResearch Laboratories) bevont üregekben megkötött ellenanyagokat tartalmazó 96 üregű tálcákra vittünk. A tálcákat öt napon át inkubáltuk. A sejteket négy órán át MTT-vel kezeltük, majd a kapott csapadékot 10% SDS-t tartalmazó 10 mM HCl-ben egy éjszakán át történt inkubálással feloldottuk. A minták OD-értékét mikrotitertálca-olvasó berendezés segítsé15 gével állapítottuk meg.

5.példa

Létrehoztuk az átalakított huCBEl 1 3. változatú variábilis könnyűláncot (VL#3) és az átalakított huCBEl 1 4. változatú, variábilis nehézláncot tartalmazó, huCBEl 1#4 vagy 20 hCBEl 1 elnevezésű ellenanyagot, majd az azt előállító sejtvonalat letétbe helyeztük az ATCCnél (ATCC szabadalmi deponálási szám: PTA-3357). A könnyű- és nehézláncok mindegyikének teljes, a konstans doméneket is magukban foglaló polipeptid-szekvenciái a következők.

Az érett huCBEl 1 3. változatú könnyűlánc szekvenciája (32. azonosítószámú szekvencia):

1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVTITCKAGODIK SYLSWYQQKP GKAPKLLIYY

ATRLADGVPS RFSGSGSGTD YTLTISSLQP EDFATYYCLO HGESPWTFGG

101 GTKLEIK [RTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA S VVCLLNNFY PREAKVQWKV

151 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG

201 LSSPVTKSFN RGEC]

A CDR-eket aláhúzással, az F71Y visszmutációt kivastagítva, a konstans domént zárójelbe téve jelöltük.

-28Az érett huCBEll 4. változatú nehézlánc szekvenciája (33. azonosítószámú szekvencia):

V37F

S49A

EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS DYYMYWFRQA PGKGLEWVAT

ISDGGSYTYY PDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMSSLRAED TAVYYCAREE 101 NGNFYYFDYW GQGTTVTVSS [ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK 151 DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 201 YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP

251 KDTLMISRTP EVTCVWDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN

301 STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ

51 VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 401 LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG]

A CDR-eket aláhúzással, az v37F és az S49A visszmutációkat kivastagítva, a konstans domént zárójelbe téve jelöltük.

Hat hetes „nude” egerekbe intraperitoneálisan 100 pg anti-LFA3 ellenanyagot (1E6), 100 pg anti-LTBR ellenanyagot (huCBEl 1#4) fecskendeztünk, vagy nem kezeltük őket (kontroll csoport). Az állatokba ezután szubkután IxlO⁶ WIDR vastagbél-adenocarcinoma sejtet injektáltunk. A huCBEl l#4-gyel kezelt egereket hetente 100 pg ellenanyaggal ismételten kezeltük, az mCBEll-el kezelt állatokat csupán a 14. napon kezeltük újból. Hetente megmértük a daganatok méretét és kiszámítottuk a térfogatukat (3. ábra). Az állatokat akkor irtottuk ki, amikor daganatuk térfogata elérte a 2,0 cm³-t (16 mm átmérő), ezt feljegyeztük a túlélési grafikonon (4. ábra).

6. példa

Hat hetes „nude” egerekbe intraperitoneálisan 100 pg anti-LTBR ellenanyagot (huCBEl 1 #4) fecskendeztünk, vagy nem kezeltük őket (kontroll csoport). Az állatokba ezután szubkután IxlO⁶ WIDR vastagbél-adenocarcinoma sejtet injektáltunk. A huCBEl l#4-gyel kezelt egereket hetente 100 pg huCBEl l#4-gyel ismételten kezeltük. Hetente megmértük a daganatok méretét és kiszámítottuk a térfogatukat. A bemutatott daganattérfogatok 10 kontroll ·*’· :λ ’'··:

· · · * · 9» *

-29állat és 8 huCBEl l#4-kezelt állat értékeinek átlagát reprezentálják (5. ábra). A huCBEl 1 #4gyel végzett heti kezelés lényeges mértékben gátolta a „nude” egérbe szubkután implantált WIDR daganat növekedési rátáját. A 21 napig ellenanyaggal kezelt állatok mindegyikében a kezelés befejezését követően két héttel még csökkent daganatnövekedési ütemet lehetett megfigyelni.

7. példa

A huCBEl 1#4 lelassítja az előnövesztett WIDR daganatok növekedését és javítja a WIDR daganatot hordozó egerek túlélését „Nude” egerekben szubkután beadva 10 napig 10⁶ WIDR sejtet tenyésztettünk. Az egereket hetente PBS vagy huCBEl 1 #4, vagy kéthetente mCBEll szubkután beadásával kezeltük. Szélességük és hosszúságuk alapján kiszámítottuk a kialakult daganatok tömegét, a 2000 mg feletti tömegű daganatot hordozó egereket kiirtottuk, daganatuk kiirtáskor meghatározott tömegét beszámítottuk a statisztikai átlagolásba. Az ábrán a hibavonalak a standard hibát („standard error”) jelzik. A daganatok tömegét a következő képlet alapján számítottuk ki: (szélesség x szélesség x hosszúság)/2 = daganattömeg mg-ban. A 6. ábrán bemutatott eredmények alapján a huCBl 1#4 képes in vivo lelassítani az előtenyésztett daganatok növekedését.

A daganatok fentiekben leírt tenyésztése és kezelése mellett kiszámítottuk az állatok százalékos túlélési arányát is. A 7. ábrán bemutatott eredmények szerint a huCBEl 1#4 képes az előtenyésztett daganatot hordozó egerek túlélésének in vivo meghosszabbítására.

8. példa

Ellenanyag-affinitás mérés

HT-29 jelű sejteket L-glutaminnal, nem-esszenciális aminosavakkal, piroszőlősavnátriummal és 10% magzati borjúsavóval kiegészített DMEM-ben tenyésztettünk. A sejteket egy alkalommal PBS-sel mostuk, majd 20 rnM EDTA-val kiegészített PBS-sel szobahőmérsékleten 5 percig végzett inkubálással eltávolítottuk őket a tálcáról. A kinyert sejteket 5 percig 1000 fordulat/perc sebességgel (110 x g) centrifugáltuk, majd IxlO⁷ sejt/mL koncentrációban PBS-ben reszuszpendáltuk.

HuCBEl 1#4 anti-LTpR ellenanyagból és negatív kontrollként humanizált anti-CD40L ellenanyagból PBS-sel 12 lépcsős, 1:4 arányú sorozathígítást készítettünk, amely 2,37 pM - 10 pM közötti végső koncentrációskálát eredményezett. V-fenekű, 96 üregű mikrotiter-tálca mindegyik üregéhez 100 pL sejtszuszpenziót és 100 pL hígított ellenanyagot adtunk. A sejteket és

-30az ellenanyagokat 4°C-on két órán át inkubáltuk. Ezután a tálcát 4°C-on 10 percig 1000 fordulat/perc sebességgel (110 x g) centrifugáltuk. A felülúszót elöntöttük, majd a sejtüledéket hideg PBS-sel hat alkalommal mostuk.

Kecske anti-humán IgG-fikoeritrin konjugátumot (Jackson Immunoresearch) 1:100 arányban PBS-ben hígítottunk, majd az így kapott oldatból mindegyik üreghez 200 pl.-t adtunk. A sejteket ezzel a szekunder ellenanyaggal 4°C-on egy órán át inkubáltuk, a fentiekben leírtaknak megfelelően centrifugáltuk, majd hideg PBS-sel egy alkalommal mostuk. Az így kezelt sejteket polisztirol kémcsövekbe vittük át. A fluoreszcencia intenzitását „FACS Calibur” berendezéssel (Beckton Dickinson) állapítottuk meg.

Az anti-CD40L nem-specifikus kötődési kontroll festődésének átlagos fluoreszcenciaintenzitási értékeit az ellenanyag-koncentráció függvényében Delta-Graph program segítségével ábrázoltuk. Az értékek egyenes vonalra illesztése után az elméleti nem-specifikus kötődési értékeket minden egyes ellenanyag-koncentráció esetében kivontuk a huCBEll#4 hígítási sorozat esetében kapott értékekből.

A fentiekben kapott specifikus fluoreszcencia intenzitás értékeket a huCBEll#4 koncentrációk függvényében logaritmikus skálán ábrázoltuk. A kapott görbe szimmetrikus, harang alakú, magas koncentrációk esetén az ellenanyag-kötődés öngátlására utal. Az ellenanyag fünkcionális affinitásának megállapítása érdekében az említett görbe bal oldalát négyparaméteres egyenletbe illesztettük. Az így kapott görbeillesztés alapján a huCBEl 1#4 HT-29 sejtekhez történő kötődésének EC50 értéke 60 pM.

Szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti polipeptidek, készítmények és eljárások a találmányi gondolattól és az igényelt oltalmi körtől való eltérés nélkül is többféleképpen módosíthatók és változtathatók. Ez alapján a találmány szerinti megoldásnak a csatolt igénypontok oltalmi körébe eső módosításai és változtatásai is a találmány tárgyát képezik.

Claims

1. Humanizált anti-limfotoxin-béta receptor (ΕΤ-β-R) ellenanyag, amely az 1. azonosítószámú szekvencia 24-34., 50-56. és 89-97. pozíciójú aminosavainak megfelelő könnyűlánc komplementaritást meghatározó régiókat, és a 2. azonosítószámú szekvencia 31-35., 50-66. és 99-109. pozíciójú aminosavainak megfelelő nehézlánc komplementaritást meghatározó régiókat foglal magában, mindemellett könnyűláncában a K3, W41,146, Q69 vagy Y71 aminosavak közül legalább egyet tartalmaz, vagy nehézláncában a F37, T40, A49, M89 vagy V93 aminosavak közül legalább egyet tartalmaz (a Kabat-féle számozási konvenció szerint).

2 Humanizált anti-limfotoxin-béta receptor (ΕΤ-β-R) ellenanyag, amely az 1. azonosítószámú szekvencia 24-34., 50-56. és 89-97. pozíciójú aminosavainak megfelelő könnyűlánc komplementaritást meghatározó régiókat, és a 2. azonosítószámú szekvencia 31-35., 50-66. és 99-109. pozíciójú aminosavainak megfelelő nehézlánc komplementaritást meghatározó régiókat foglal magában, mindemellett könnyűláncában az Y71 aminosavat tartalmazza (a Kabatféle számozási konvenció szerint).

3. Humanizált anti-limfotoxin-béta receptor (ΕΤ-β-R) ellenanyag, amely az 1. azonosítószámú szekvencia 24-34., 50-56. és 89-97. pozíciójú aminosavainak megfelelő könnyűlánc komplementaritást meghatározó régiókat, és a 2. azonosítószámú szekvencia 31-35., 50-66. és 99-109. pozíciójú aminosavainak megfelelő nehézlánc komplementaritást meghatározó régiókat foglal magában, mindemellett nehézláncában az F37 és A49 aminosavakat tartalmazza (A Kabat-féle számozási konvenció szerint).

4. Az 1. igénypont szerinti ellenanyag, amely a 8. azonosítószámú szekvencia 1-107. aminosavainak megfelelő könnyűlánc variábilis dómén szekvenciát tartalmaz.

5. Az 1. igénypont szerinti ellenanyag, amely a 16. azonosítószámú szekvencia 1-120. aminosavainak megfelelő könnyülánc variábilis dómén szekvenciát tartalmaz.

6. A 4. igénypont szerinti ellenanyag, amely a 16. azonosítószámú szekvencia 1-120. aminosavainak megfelelő könnyülánc variábilis dómén szekvenciát is tartalmaz.

7. Ellenanyag, amely az E46.4 jelzésű sejtvonal (ATCC szabadalmi deponálási szám: PTA-3357), vagy az E77.4 jelzésű sejtvonal (ATCC szabadalmi deponálási szám: 3765) által termelt ellenanyagéval megegyező nehéz- és könnyűlánc polipeptid-szekvenciákat tartalmaz.

8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyag, amely alapvetően megtartotta az eredeti ellenanyag kötődési tulajdonságait.

9. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyag, amely immunotoxinhoz kötött.

10. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyag, amely kemoterápiás droghoz kötött.

11. Készítmény, amely az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyagot és gyógyá5 szati szempontból elfogadható vivőanyagot tartalmaz.

12. A 11. igénypont szerinti készítmény, ember daganatos megbetegedésének kezelésére vagy daganatos megbetegedése előrehaladásának, súlyosságának vagy hatásának csökkentésére történő alkalmazásra.

13. Izolált nukleinsav, amely az E46.4 jelzésű sejtvonal (ATCC szabadalmi deponálási

10 szám: PTA-3357), vagy az E77.4 jelzésű sejtvonal (ATCC szabadalmi deponálási szám: 3765) által termelt ellenanyag könnyűláncának kódoló szekvenciáját tartalmazza.

14. Izolált nukleinsav, amely az E46.4 jelzésű sejtvonal (ATCC szabadalmi deponálási szám: PTA-3357), vagy az E77.4 jelzésű sejtvonal (ATCC szabadalmi deponálási szám: 3765) által termelt ellenanyag nehézláncának kódoló szekvenciáját tartalmazza.

15 15. Izolált nukleinsav, amely a 8. azonosítószámú szekvencia 1-107. aminosavainak kódoló szekvenciáját tartalmazza.

16. Izolált nukleinsav, amely a 16. azonosítószámú szekvencia 1-120. aminosavainak kódoló szekvenciáját tartalmazza.

17. Sejt, amely az E46.4 jelzésű (ATCC szabadalmi deponálási szám: PTA-3357) vagy

20 az E77.4 jelzésű sejtvonalhoz (ATCC szabadalmi deponálási szám: 3765) tartozik.