IT8148663A1

IT8148663A1 - Linea di cellule derivate da epatoma umano per studi metabolici, coltivazione di virus e preparazione di vaccini e procedimento di preparazione

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Publication number: IT8148663A1
Application number: ITRM1981A048663A
Authority: IT
Original assignee: Wistar Inst
Priority date: 1980-06-12
Filing date: 1981-06-11
Publication date: 1982-12-11
Also published as: GB2089370A; JPS57500768A; US4393133A; IT8148663A0; EP0053165A1; GB2089370B; EP0053165B1; EP0053165A4; DE3152113T1; ATA904881A; JPH0411198B2; CA1193210A; DE3152113C2; WO1981003663A1; IT1171297B; AT391145B; CH657456A5

Description

"Linea di cellule derivate da epatoma umano per studi metabolici, coltivazione di virus e preparazione di vaccini e procedimento di preparazione"

RIASSUNTO G Le linee o discendenze di cellule ("celi O

lines") derivate da epatoma umano utili per studi metabolici come vagliatura d? potenziali agenti carcinogeni e mutageni per la coltivazione di virus e per la preparazione di vaccini, sono ottenute sottoponendo a coltura epato carcinoma umano o epatoblastoma umano su strati di alimentazione di cellule irradia?IBARZ?N&ZOROANARDOA?MSngp.... ti in maniera letale in presenza di un mezzo di coltura. ?

Sono stati fatti molti tentativi per sviluppare sistemi di coltura di cellule per studi metabolici riguardanti prodotti chimici particolarmente per il saggio di breve durata riguardante agenti carcinogeni potenziali e mutageni. Le colture di cellule di uso generale per tali scopi derivano

da roditori e sebbene metabolizzano attivamente i

prodotti chimici ritenuti generalmente carcinogeni

i metaboliti sono diversi da quelli prodotti nelle

normali colture primarie umane. I ceppi di cellule

fibroplastiche umane sono stati esaminati per quanto

riguarda la loro capacit? di trasformare agenti poten-

zialmente carcinogeni e mutageni in carcinogeni at-

tivi, ma la loro capacit? di effettuare tali conver <

? ??

sioni metaboliche ? scarsa. <

5 Vi ? un certo numero di inconvenienti con UJ oOc J? Z nessi allo sviluppo di virus per la produzione di ao o oc < Z

vaccini. In particolare virus fastidiosi come il <

Ni eo virus dell'epatite B (HBV) non si propagano con suc ? Z SJ

M cesso nelle colture di cellule. Cos? si devono tro <

NI OC

<CO vare sistemi di coltura di cellule in grado di rapi ?> c do sviluppo che sostengono la produzione di compo-

nenti virali per la produzione di un vaccino da ta-

li virus fastidiosi.

010G7ROMA Uno scopo principale di questa invenzione

? quello di produrre linee o discendenze di cellule

epatiche stabili utili per gli studi del metabolismo

dei farmaci e particolarmente per vagliare agenti

potenzialmente carcinogeni ed agenti mutageni.

Un altro scopo principale dell'invenzione

? quello di produrre linee o discendenze derivate

da cellule epatiche nella produzione di componenti virali dell'epatite B da cui ai possono ottenere

i vaccini.

Un altro scopo di questa invenzione consiste in un procedimento per otteiffe discendenze o linee di cellule epatiche umane utili nella vaglia 4CL tura di farmaci e particolarmente nella vagliatura vi < di carcinogeni potenziali e mutageni, per la colti UJ ooc vazione di virus e per la preparazione di vaccini. ao O oz Un altro scopo ancora dell'invenzione con z< < 1 N ? siste in un metodo per produrre un vaccino per l'e- od :

? ? patite B che impieghi linee o discendenze di cellule ?? *'*

N oc epatiche di questa invenzione. m o> Questi ed altri scopi dell'invenzione ? saranno ulteriormente evidenti in base alla seguente descrizione, in base alle rivendicazini allegate ed ai disegni allegati in cui:

la figura I ? un grafico che riporta il tempo di coltura (giorni) in funzione del numero di cellule vitali x10-6 e dei componenti di antigene superficiale di virus di epatite B (HBsAg), albumina umana, e concentrazione alfa-fetoproteica umana (AFP) nel fluido attivo per le cellule, e

la figura II ? un autoradiogramma che mostra HBsAg in un campione di controllo ed in una discendenza di cellule o linea di cellule Hep 3B di questa invenzione, e la relativa assenza in Hep G2 di

detta invenzione. Mediante il procedimento di questa

invenzione si producono nuove linee o discendenze di

cellule, stabili per l'uso negli studi metabolici,

quelli relativi alla carcinogenesi e/o alla mutagenesi,

< e nella produzione di vaccini. Le linee o discendenze ? vi < di cellule sono ottenute coltivando epatocarcinoma

O ?*J OC humano od epatoblastoma su strati di alimentazione di

cgc ~Sr.o cellule irradiati letalmente in presenza di un adat < w oc Z --\ to mezzo di coltura. Sebbene la presente invenzione Ni <r CO ?3 ?" ? o si possa applicare alla produzione di nuove linee Z ?o CN o oc o discendenze di cellule provenienti da qtalsiasi < epatoma umano, l'invenzione viene descritta qui di cn c / seguito con maggior ricchezza di dettagli in parti -colare per quanto riguarda la produzione di due linee

o discendenze di cellule specifiche indicate come

Hep G2 e Hep 3B. Queste lineeo discendenze di cellule sono state depositate presso il The Wistar Institute

of Anatomy and Biology 36th e Spruce Streets, Philadelphia, Pennsylvania 19104 e presso la American Type Culture

Collection (ATCC), Rockfield Maryland (USA) con i numeri di codice HB 8065 ? HB 8064, rispettivamente.

Le linee o discendenze di cellule indicate

come Hep G2 e Hep 3B provengono da risultati di biopsie effettuate durante estese lobectomie di un soggetto

di sesso maschile di razza caucasica dell'et? di 15 anni proveniente dall'Argentina (1975) e di un soggetto di razza negra dell'et? di 8 anni, degli Stati Uniti di America (1976), rispettivamente. Le cellule da cui deriva la linea o discendenza di cellule indicata con Hep 3B contengono il viius di epatite </9)?-< B come si pu? vedere con riferimento alle figure I e 5

OB? ?HJ <I II di cui si parla qui sotto. P?ro questa invenzio-8 5 a:? o ne'prevede anche l'infezione di cellule con HBV per iti z< ?-- ? produrre componenti di HBsAg per uso per vaccino. NJ < co 06 > o Masse di tumori maligni tagliuzzati, cos? ?? - o <NI " ottenute vengono sottoposte a coltura su strati di

03 cellule di topi irradiati in maniera letale designa- jf ti STO in un mezzo di coltura di cellule che consiste di mezzo di Williams E. (Gibco) integrato con il 10# di siero bovino fetale (Beheis, Armour Pharmaceuticals). Con il termine di "irradiato in maniera letale) si intende che le cellule sono state irradiate ad un grado tale che non possono riprodursi. Questo procedimento favorisce lo sviluppo di cellule differenziate che hanno esigenze di sviluppo fastidiose mentre gli impedisce l'eccessivo sviluppo di cellule fibroplastiche contaminanti.

Il periodo iniziale di proliferazione delle cellule pu? aver luogo in un periodo di almeno circa

tre settimane e se lo si desidera pu? continuare per

molte settimane. Normalmente ? abbastanza soddisfacente un periodo iniziale di proliferazione di circa

quattro settimane, dopo di che le colonie di cellule vengono separate e trasferite in nuovi strati di

alimentazione di cellule di topo, irradiate (STO).

Prima del trasferimento le cellule provenienti dai d </5 palloni che contengono singole grandi colonie si pos ?

5 O Lu sono dissociare mediante tripsinizzazione (0,25# oc f? oo tripsina, 0,1.# acido etilenediammina tetraacetico in e,

< o Z

<f ? N soluzione salina tamponata con fosfato modificata, Ni a, di Dulbecco che ? priva di sale di calcio e magnesio). ? ' t'

Z ?n e Le colonie di cellule sono susseguentemente fatte OS

so i passare in serie almeno circa 60 volte su strati di G01 i1

? 4 alimentazione STO mostrando di essere discendenze o

linee di cellule con sviluppo di routine stabilizzate,

ciascun passaggio avendo una durata di circa una settimana.

Vengono scelte sublinee-o subdiscendenze

di Hep G2 Hep 3B che non richiedono pi? la presenza

dello strato di alimentazione STO (quattro anni e due

anni dopo che ? stata effettuata la biopsia nel caso

di Hep G2 e Hep 3B, rispettivamente). Tali sublinee,

o subdiscendenze proliferanno se si pongono all?incirca 1x10^ cellule in 12 mi di mezzo d? coltura di

cellule come ad esempio mezzo essenziale minimo di Eagle integrato con 10$ di siero bovino fetale in

2

un pallone che contiene all'incirca 75 cm di superficie di sviluppo per le cellule, dopo l'unione al sottostrato. Sebbene il suddetto mezzo di coltura sia preferito, si possono impiegare altre formulazioni

di mezzo di coltura per alimentare lo sviluppo di que-< ste linee o discendenze di cellule d t? < Queste due linee o discendenze specifiche g ^

D; di cellule sono state caratterizzate come segue: ?3

1. Numero di cromosomi < r.

Z ?r., N < c Hep G2 - il numero modale di cromosomi ? o3 :~

? ^ 55 (intervallo 50-56). La linea o discendenza di cel-j^ CN es lule contiene un cromosomo A segnale o di facile i- jg ?> dentificazione che ? un riordinamento del cromoso- -S mo 1.

Hep 3B - il numero modale ? 60 con una moda subtetraploide di 82. Questa linea o discendenza di cellule contiene un cromosomo a segnale che ha un riordinamento del cromosomo umano 1.

2. Proteina del plasma,umano

I prodotti secreti nel fluido di coltura di cellule di ciascuna linea o discendenza di cellule (Hep G2 e Hep 3B) sono stati Caratterizzati dalla analisi per inumino precipitazione a diffusione doppia Ouchterlony (impiegando anti-corpi disponibili in

commercio per le proteine del plasma umano) e sono

stati caratterizzati mediante due elettroforesi con

gelo di poliacrilemmide e sono le seguenti proteine

del plasma umano, normale:

TABELLA I

Proteina umana Linea o discendenza di cell Hep G2 Hep 3B alfa fetoproteina

< albumina ?.

vi < alfa-2-raacroglobuiina 5

O

cc alfa- 1-antitripsina O L?a. alfa- 1-antichimotripsina 2 < transf errina tsi ofl eptoglobina ? 2 ceruloplasmina <ca plasmino geno tx c globulina Gu complemento (C* 3) Complemento (C? 4) _ attivatore C'3 alfa-1-acido glicoproteina fibrinogeno __

alfa-2-HS glicoproteina proteina legante acido retinoico 4_ beta-1ipoproteina 3. Produzione di HBsAg:

La produzione di HBsAg ? stata quantificata nella linea o discendenza di cellule Hep 3B usando il corredo per radio-saggio in fase solida (RIA) AUSRIA II (Abbott Labs.) che confronta i valori positivi con una curva standard usando HBsAg purificato.

Vedere la figura I in cui la curva che ha i punti

sotto forma di quadrati "pieni" rappresenta ng di HBsAg nella parte che galleggia la superficie della colti?

I/O di cellule in funzione del tempo, la curva che ha pun-^

C ? ti a quadrato "pieno" rappresenta n o g d? HBsAg nel ^ ::

O

o lisato di cellule e la curva che ha punti d? forma ? triangolare "piena" rappresentajug di albumina umana,N o <? ? Le curve rimanenti che hanno punti ovali "pieni" e C?0' non "pieni" rappresentano rispettivanente ^ug di alfa^j co fetoproteina ed il numero di cellule vitali che inizi?} g

con 10 cellule Hep 3B in 15 mi di mezzo essenziale minimo di Eagle's integrato con 10$ di siero bovino fetale.

T componenti di HBsAg sintetizzato mediante Hep 3B sono stati determinati mediante marcatura af impulsi delle cellule per esposizione per 5 ore

a 5 mi di mezzo essenziale minimo di Eagle' privo

di siero bovino fetale ma contenente .1 mCi di 35S-metionina (New England Nuclear Go.) ed effettuando l'incubazione di 1,5 mi di parte di cellule che galleggiano la superficie marcate con 35S-metionlna con

10 microlitri di anti-HBsAg di porcellino d'india

(ottenuto da National Institute of AEergy and

Infectious Diseases, National Institute of Health,

Bethesda, MD20014), e poi con 20A di antisiero di

coniglio per immuneglobulina G di porcellino d'india.

Dopo una incubazione per l?intera notte, gli Immune

complessi vengono ottenuti per centrifugazione, lavati e sospesi di nuovo in una soluzione che contiene ditiotreitolo 1M, 2$ di sodio dodecilsolfato e Q.

t/j < si sottopongono ad elettroforesi con gelo di polietil- O L-J OC ,??< ammide SDS su un gelo a gradiente lineare 7,5-15$, O aa: O si essiccano e si espongono ad una pellicola Kodak <

2 rv NST2. I risultati ottenuti sono illustrati nell'auto- o? ;

?

radiogramma della figura II con riferimento al quale 2 N o oz si pu? vedere che i componenti p 23 e p 27 di HBsAg <

CQ

ci> sono ottenuti dal campione di Hep 3B (vedere percorso c I 2 su gelo). Questi componenti 3ono anche presenti

nel campione di controllo che contiene ABsAg purificato

(percorso su gelo 1) ma sono assenti da Hep G2 che_

non ? stato infettato con HBV (percorso su gelo 3).,

La produzione di componenti di HBsAg mediante la discendenza o linea di cellule Hep 3B che_

contiene il genoma del virus dell?epatite B mostra

che questi componenti si possono purificare per l'uso nella produzione di vaccino o che infettando discendenze o linee di cellule epatiche prodotte con il procedimento di questa invenzione, si possono ottenere componenti simili per l'uso nel fornire vacci no HBV.

Vengono illustrati i seguenti esempi non limitativi riguardanti le varie realizzazioni di questa invenzione.

< <X ESEMPIO I

< Questo esempio illustra l'impiego di una o UI oc ilinea o discendenza di cellule di questa invenzione aoc o indicata con Hep G2 per studi metabolici in partiZ % < e-N < N? OD

colare per vagliare i possibili agenti carcinogeni '7 *o o -o e mutageni. CN o OC

Si espongono colture confluenti di cellul

?> R di Hep G2 a 4,0 n moli di ?-benzo (a)pirene (BP) in e OMA-

un mezzo per 24 ore; la maggior parte della radioatti, vit? viene recuperata nel mezzo. Una parte notevole ... del BP viene metabolizzata a metaboliti solubili in . acqua che dopo trattamento con beta-glucoronidasi producono EP-chinoni e 3-OH-BP estraibili con cloroformio. Nel materiale estraibile con cloroformio nella coltura di cellule Hep G2 si formano i seguenti

metaboliti.

TABELLA II

Metabolito Percento metabol?ti rispetto a BP totale

BP 9,10 diolo 14

BP 7,8 diolo 7

chinoni 6

Cos? la linea o as cendenza ai cellule Hep 02 metabolizza BP fino aa un numero di derivati ossidanti che includono il metabolito carcinogeno vicino od

immediato BP-7,8 diolo.

< Studi riguardanti i prodotti di addizione Q.

vi < BP-DNA formati nelle cellule Hep G2 hanno dato i se-O u-i OS I-guenti risultati. I 4,0 n moli di ?-BP/ml di mezzo <

O ^ a O oc con esposizione di 48 ore, viene metabolizzato pi? J Oo z< S < ? K del 97 percento. Il DNA isolato da queste colture < co ?? T _ ? o contiene 28,2 p moli di BP combinato/mg di DNA . I Z SJ o prodotti di addizione BP-DNA assomigliano a quelli <

CQ

formati nelle colture di organi primari provenienti ai c

?

da tessuto umano. Dato che/generalmente ammesso che

idrocarburi aromatici policiclici e molti altri tipi di agenti carcinogenl richiedono attivazione metabolica per produrre i loro effetti biologici e che le

cellule Hep G2 metabolizzano questi composti fino alla forma attivata, le cellule Hep G2 si possono impiegare come attivatori di carcinogenl in un saggio

di mutadbne mediata od intermedia con altre cellule di mammiferi.

ESEMPIO II

Hep 3B si espone a 0,5 n noli di ?-EP/ml in un mezzo per 24 ore ed il 76$ del ?-BP viene metabolizzato fino a prodotti intermedi solubili in acqua. Della sostanza estratta con cloroformio il

76 percento ? costituito da ?-BP ma sono state rivelate piccole quantit? del BP 9,10 diolo e del BP 7,8 diolo.

Come indicato precedentemente le discendenze .

< o linee di cellule di questa invenzione sarebbero u- ui < tili nella coltivazione di virus particolarmente vi- Q ^ ce irua fastidiosi come HBV. In tal caso le colture a ... ? o monostrato della particolare linea o discendenza di. z ::

< ^ Ni cellule ad esempio Hep G2 si possono esporre od a par-?? r ticelle di Dane provenienti da sieri di pazienti o ^ CN N? OC ad HBV-DNA purificato proveniente da tale fonte. Do- ^ ? po circa un'ora di assorbimento sul monoetrato in piccole quantit? del mezzo di coltura, si pu? aggiungere altro mezzo di coltura di linaio discendenza di cellule ed i palloni che contengono la linea o discendenza di cellule vengono sottoposte ad incubazione per molti gioirai. Il controllo delle colture con tecniche standard per la rivelazione di antigeni virali

come detto precedentemente in relazione alla discendenza o linea di cellula Hep 3B determiner? il tempo

ottimale per il"raccolto " di coltura di cellule e per

la purificazione di antigene virale. GLi antigeni cos? prodotti ad esempio HBsAg si possono usare per la

produzione di vaccini.

Quando 1'epatocarcinoma iniziale usato nel

pr? cedimento di questa invenzione contiene gi? il

genoma HBV come nel caso del materiale fonte od origine da cui si ottiene la linea o discendenza di cellule Hep 3B; HBsAg sintetizzato mediante la linea o discendenza di cellule si pu? impiegare per produrre <

d. vi un vacoino. <

Vantaggiosamente, una linea o discendenza oOc ? di cellule di questa invenzione che contiene HBV ad Qo O CK

< Co? Z

esempio Hep 3B fornisce una fonte "succedanea" di -* IV N co ?? r _ HBsAg per cui la produzione e la qualit? dell'anti O CN o gene possono essere controllate. Esperimenti con Hep 3B

indicano che solamente una parte del genoma virale ? 0?3r ?) c presente, e che le particelle virali infettive non_

vengono prodotte mediante questa linea o discendenza

di cellule per cui si elimina il rischio di infezione di HBV. La purificazione dell'HBsAg proveniente

dal mezzo di coltura di cellule per la produzione di

vaccino si pu? effettuare con un certo numero di me

todi ben noti nella tecnica.

Un altro metodo per la preparazione di HBsAg da linee o discendenza di cellule di questa invenzione comporta l'impiego di "combinant" HBV-plasmide

DNA in un batterio che sintetizza in vitro HBsAg.

Per preparare un vaccino impiegando questa tecnica

il totale di cellule HNA da cui si ottengono le copie cDNA oppure DNA da cui si ottiene la linea o discendenza di cellule che producono HBsAg viene isola-4 to e fatto digerire con enzimi di limitazione che Q-w non digeriscono HBV-DNA ? lasciano il tratto di codi-^

O ^ (X i? ce HBsAg intatto (ad esempio Hind III), e si fa se-OO O aa ?-? o guire da arricchimento dell'HBV-DNA o per ibridiz- < UJ an Z ?? < zazione su filtri che contengono DNA in particelle ^ Dane fissate ed eluizione dai filtri oppure mediante -zO ^~ ?? eluizione da elettrofonogramma dopo localizzazione

su una parte del gelo con DNA derivato da particelle 2* Dane, marcato radioattivamente. Dopo reazione con residui dCMP, usando nucleotidil terminale transferasi, s? pu? ibridizzare DNA a plasmide pBR322, si scinde

con PST?1 e si chiude con residui dGMP, e E. Coli si pu? trasformare con plasmidi ibridi e si pu? variare per le colonie che producono HBsAg con metodi ben noti nella tecnica. Si possono allora scegliere i cloni positivi per HBsA-g, si possono propagare e si pu?

Claims

RIVENDICAZIONI

1. Procedimento per la derivazione di una

linea o discendenza di cellule epatiche umane che

consiste nel sottoporre a coltura una biopsia di un

tumore epatico umano su strati di alimentazione di

cellule irradiati in maniera letale in presenza

d vi di un mezzo di coltura finch? si stabilisce una li < nea o discendenza di cellule. O l OZ ..

2. Procedimento secondo la rivendicazione a? r OC -ci 1 in cui detti strati di alimentazione di cellule z -a: irradiati comprendono strati di cellule di topo.

3. Procedimento secondo la rivendicazione

1 in cui detto tumore ? sottoposto inizialmente a

?? c coltura su strati di alimentazione irradiati in maniera letale per almeno circa tre settimane per provocare la proliferazione delle cellule, e le colonie

di cellule ottenute sono susseguentemente fatte passare in serie almeno 60 volte su detti strati di alimentazione per stabilire una linea o discendenza di

cellule.

4. Procedimento per valutare la conversione metabolica di determinati composti chimici e farmaci particolarmente carcinogeni potenziali e mutageni il quale procedimento consiste:

(a) nel mantenere una coltura di discendenza o linea di cellule epatiche umane in un mezzo nutritivo,

(b) nell'esporre detta linea o discendenza di cellule al composto chimico o farmaco da esaminare,

(c) nell'analizzare detta coltura per quanto riguarda la presenza di metaboliti di detto com < cL posto chimico o farmaco, e

(d) nell'introdurre detti metaboliti in colture di altre cellule di mammiferi per determin le capacit? mutagene relative. _

5. Procedimento secondo la rivendicazione 4 in cui detta linea o discendenza di cellule ? pro-I?BARZANng&ZANARDORO.MA dotta con il procedimento secondo la rivendicazione 1.

6. Procedimento secondo la rivendicazione 5 in cui detta linea o discendenza di cellule comprende Hep G2.

7. Procedimento secondo la rivendicazione 5 in cui detta linea di cellule comprende Hep 3B.

8. Procedimento per la coltivazione di virus "fastidioso" come virus dell?epatite B che consiste: (a) nel mantenere una coltura di linea o discendenza di cellule epatiche umane in un mezzo di coltura nutritivo?

(b) nell'inoculare detto mezzo con un virus "fastidioso"

(c) nel coltivare detto virus in dette cellule di detta linea o discendenza di cellule, e

(d) nel recuperare una raccolta di detti

virus tra detta linea o discendenza di cellule.

y. Procedimento secondo la rivendicazione 8 in cui detta linea o discendenza di cellule ? prodotta con il procedimento secondo la rivendicazione

1.

10. Procedimento secondo la rivendicazione 9 in cui detta linea o discendenza di cellule comprende Hep G2.

?IB?RZANZ&ANARDORnOAgMS?p....

11. Procedimento secondo la rivendicazione 8 in cui detto virus fastidioso ? il virus dell?epatite B.

12. Procedimento per l'isolamento degli antigeni superficiali del virus dell'epatite B per l'uso come vaccino il quale procedimento consiste:

(a) nel mantenere una linea o discendenza di cellule epatiche umane che contiene il genoma del

virus dell'epatite B in un mezzo di coltura nutritivo,

- iy -(b) nel raccogliere il fluido che galleggia la superficie da detta coltura, e

< Q. (c) nel pflrificare l 'antigene superficiale ?/>

< del virus dell'epatite B che si trova in detto fluiO LU OC [? do che galleggia la superficie per l'uso come vaccino. o ? 13. Procedimento secondo la rivendicazione

c_ 12 in cui detta linea o discendenza di cellule ? prodotta con il procedimento secondo la rivendicazione CN 1. <

co ?? H . Procedimento secondo la rivendicazione

13 in cui detta linea o discendenza di cellule comprende Hep 3B.

15. Procedimento per la produzione degli antageni superficiali del virus dell'epatite B da una linea ? discendenza di cellule epatiche umane per l'uso di un vaccino il quale procedimento consiste:

(a) nell'ottenere DNA oppure RNA da una linea o discendenza di cellule epatiche umane che 00187ROM-contiene il genoma del virus dell'epatite B,

(b) nel produrre plasmidi DNA "recombinant " che contengono il genoma virale dell'epatite B ottenuto da detto DNA oppure RNA,

(c) nel far sviluppare detti plasmidi DNA "recombinant" in un ospite batterico,

(d) nel purificare e nel raccogliere l'antigene superficiale del virus dell'epatite B per l'uso come vaccino.

16. Procedimento secondo la rivendicazione

15 in cui detta linea o discendenza di cellule h prodotta mediante il procedimento secondo la rivendicazione 1. cL 17. Procedimento secondo la rivendicazione

16 in cui deite linea di cellule comprende Hep 3B.

18. Procedimento per l'isolamento di proteine del plasma umano per l'uso nel trattamento di pazienti che sono carenti per quanto riguarda dette proteine il quale procedimento consiste:

(a) nel mantenere una linea o discendenza

di cellule epatiche umane che sintetizza le proteine

del plasma desiderate, in un mezzo di coltura nutritivo ,

(b) nel recuperare il fluido che galleggia 'B?AR"Z9AN&ZAN-ARDOROMA la superficie da detta coltura,

(c) nel purificare detta proteina di plasma per l'uso nel trattamento di pazienti carenti per

quanto riguarda detta proteina.

1?. Procedimento secondo la rivendicazi?ne

17 in cui detta linea o discendenza di cellule ? prodotta con il procedimento secondo la rivendicazione

1.

20. Procedimento secondo la rivendicazione

19 in cui detta linea o discendenza di cellule comprende Hep 02.

21. Procedimento secondo la rivendicazione

19 in cui detta linea di cellule comprende Hep 3B.

22. Procedimento per produrre proteine del plasma umano per l?uso nel trattamento di pazienti che presentano carenze per quanto riguarda dette protei< Q. ne, il quale procedimento consiste: W < (a) nell'ottenere DNA e/o ENA da una lineaoOc :^- < o discendenza di cellule epatiche umane che sintetiz-Q < ? O za le proteine di plasma desiderate, < =-'

M < -??$ r (b) nel produrre plasmidi DNA "recombinanV'Q che contengono il cDNA per le proteine pertinenti, S (c) nel far sviluppare detti plasmidi DNA ?

C7> c "recombinant? in un ospite batterico, e

(d) nel purificare e nel recuperare le proteine umane desiderate per l'uso nel trattamento di paziehti carenti per quanto riguarda dette proteine.

23. Procedimento secondo la rivendicazione

22 in cui detta linea o discendenza di cellule epatiche umane ? ottenuta con il procedimento secondo

la rivendicazione ^._ _ _ :

24. Procedimento secondo la rivendicazione 23 in cui detta linea o discendenza di cellule comprende Hep G2

25. Procedimento secondo la rivendicazione 23 in cui detta linea di cellule comprende Hep 3B.

2 6. Linea o discendenza di cellule prodotta mediante il procedimento secondo la rivendicazione 1.

27.' Linea o discendenza di cellule che hanno caratteristiche di identificazione e di Hep 3B.

28. Linea o discendenza di cellule che hanno le caratteristiche di identificazione di Hep G2.