CH657456A5 - Verfahren zum bestimmen der stoffwechselumwandlung von chemikalien und wirkstoffen. - Google Patents

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CH657456A5 CH1000/82A CH100082A CH657456A5 CH 657456 A5 CH657456 A5 CH 657456A5 CH 1000/82 A CH1000/82 A CH 1000/82A CH 100082 A CH100082 A CH 100082A CH 657456 A5 CH657456 A5 CH 657456A5
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Description

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2
PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zum Bestimmen der Stoffwechselumwandlung von Chemikalien und Wirkstoffen, dadurch gekennzeichnet, dass man a) eine Kultur einer Human-Leberzell-Linie in einem Nährmedium hält,
b) diese Zell-Linie der zu testenden Chemikalie oder dem
Wirkstoff aussetzt, und c) die Kultur auf die Gegenwart von Metaboliten der Chemikalie oder des Wirkstoffs analysiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die im Verfahrensschritt c) erhaltenen Metaboliten zur Bestimmung ihrer Mutagenität in Kulturen anderer Säugetierzellen einführt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die Zell-Linie herstellt durch Züchtung einer Biopsie eines menschlichen Lebertumors auf letal in solchem Ausmass bestrahlten Zellernährungsschichten, dass sie zur Reduplikation nicht mehr befähigt sind, in Gegenwart eines Kulturmediums, bis eine Zell-Linie etabliert ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Zellernährungsschichten letal bestrahlte Mäu-sezellschichten verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man den Tumor zunächst auf den letal bestrahlten Zellernährungsschichten während mindestens 3 Wochen züchtet, um Zellwachstum zu verursachen, und die resultierenden Zellkolonien anschliessend mindestens 60 Reihenpassagen auf den Ernährungsschichten unterzieht, um eine Zell-Linie zu etablieren.
6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Zell-Linie Hep G2, ATCC HB 8065, umfasst.
7. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Zell-Linie Hep 3B, ATCC HB 8064, umfasst.
8. Anwendung des Verfahrens nach Anspruch 1 zum Bestimmen der Stoffwechselumwandlung potentieller Karzinogene und Mutagene.
Es sind viele Versuche unternommen worden, Zellkultursysteme für Stoffwechselstudien von Chemikalien zu entwik-keln, insbesondere für kurzfristige Proben auf mögliche Karzinogene und Mutagene. Die allgemein für solche Zwecke verwendeten Zellkulturen stammen von Nagern, und obgleich sie Chemikalien, die allgemein als Karzinogen angesehen werden, aktiv im Stoffwechsel umsetzen, unterscheiden sich die Stoffwechselpodukte von solchen, die in normalen Primärkulturen menschlicher Herkunft entstehen. Human-Fibroblasten-Zellstämme sind auf ihre Fähigkeit getestet worden, potentielle Karzinogene und Mutagene in aktive Karzinogene umzuwandeln, ihre Fähigkeit zu solchen Stoffwechselumwandlungen ist aber gering.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zu schaffen, das durch Anwendung einer Kultur einer Human-Leberzell-Linie die Bestimmung der Stoffwechselumwandlung von Chemikalien und Wirkstoffen, insbesondere von potentiellen Karzinogenen und Mutagenen, ermöglicht.
Diese Aufgabe wird durch das erfindungsgemässe, im Patentanspruch 1 definierte Verfahren gelöst.
Im nachstehenden wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beispielsweise erläutert. In den Zeichnungen zeigen:
Fig. 1 ein Diagramm der Zeit in Kultur (Tage) gegen die Anzahl lebensfähiger Zellen x 10~6, und die Konzentration von Komponenten von Hepatitis B-Virus-Oberflächenanti-genen (HBsAg), Human-Albumin und Human-a-Fetopro-tein (AFP) im Überstand der Kultur, und
Fig. 2 ein Autoradiogramm, das HBsAg in einer Kon-s trollprobe und in der Zell-Linie Hep 3B und das Fehlen in Hep G2 zeigt.
Durch das beschriebene Verfahren werden neue stabile Zellen erzeugt, die sich zur Verwendung in Stoffwechselstudien, bei der Karzinogenese und/oder Mutagenese und bei io der Herstellung von Vakzinen eignen. Die Zell-Linien werden durch Züchten menschlichen Hepatokarzinoms oder Hepatoblastoms auf letal bestrahlten Zellernährungsschichten in Gegenwart eines Kulturmediums erhalten. Wenngleich das Verfahren auf die Erzeugung neuer Zell-Linien ls aus irgend einem Human-Hepatom anwendbar ist, wird nachfolgend ausführlicher insbesondere die Erzeugung zweier spezieller Zell-Linien, als Hep G2 und Hep 3B bezeichnet, beschrieben. Diese Zell-Linien sind beim Wistar Institute of Anatomy and Biology, 36th and Spruce Streets, Philadel-20 phia, Pennsylvania, 19104, und am 19. Mai 1981 bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, hinterlegt worden. Die Zell-Linien Hep G2 und Hep 3B haben die ATCC-Nummern HB 8065 bzw. HB 8064 erhalten.
25 Mit Hep G2 und Hep 3B bezeichnete Zell-Linien entstammten Biopsien während ausgedehnter Lobektomien eines 15 Jahre alten kaukasischen Mannes aus Argentinien (1975) bzw. eines 8 Jahre alten schwarzen Jungen aus den Vereinigten Staaten (1976). Die Zellen, aus denen die mit 30 Hep 3B bezeichnete Zell-Linie abgeleitet wurde, enthielten Hepatitis B-Virus, wie durch die Bezugnahme auf die nachfolgend erörterten Figuren 1 und 2 zu sehen ist.
Scheibchen der so erhaltenen bösartigen Tumore werden auf letal bestrahlten Mäusezellschichten, mit STO bezeich-35 net, in einem Zellkulturmedium gezüchtet, das aus Williams E-Medium (Gibco), ergänzt durch 10% fetales Rinderserum (Reheis, Armour Pharmaceuticals), bestand. Mit dem Ausdruck «letal bestrahlt» ist gemeint, dass die Zellen bis zu einem solchen Grad bestrahlt worden sind, dass sie zur Re-40 duplikation nicht mehr befähigt sind. Diese Arbeitsweise fördert das Wachstum differenzierter Zellen mit anspruchsvollen Wachstumsbedürfnissen, während ein übermässiges Wachstum kontaminierender Fibroblastenzellen verhindert wird.
45 Die Anfangsperiode des Zellwachstums kann über einen Zeitraum von wenigstens etwa 3 Wochen stattfinden und kann, wenn gewünscht, viele Wochen fortgeführt werden. Gewöhnlich ist eine anfangliche Wachstumsperiode von etwa 4 Wochen ganz zufriedenstellend, worauf Zellkolonien so getrennt und auf neue bestrahlte Mäusezellen (STO)-Ernäh-rungsschichten überführt werden. Vor der Überführung können Zellen aus Kolben, die einzelne grosse Kolonien enthalten, durch Trypsinisjpren auseinander gelöst werden (0,25% Trypsin, 0,1% Äthylendiamintetraessigsäure in Dul-55 becco's modifizierter Phosphat-gepufferter Salzlösung ohne Calcium- und Magnesiumsalze). Die Zellkolonien werden anschliessend mindestens etwa 60 Reihenpassagen auf STO-Ernährungsschichten unterworfen, was zeigt, dass sie etablierte, routinemässig wachsende Zell-Linien sind, wobei 60 jede Passage eine Dauer von etwa 1 Woche hat.
Sublinien sowohl von Hep G2 als auch Hep 3B, die die Gegenwart der STO-Ernährungsschicht nicht mehr benötigen, wurden ausgewählt (vier Jahre und zwei Jahre nach. Durchführung der Biopsien im Falle von Hep G2 bzw. Hep 65 3B). Solche Sublinien vermehren sich, wenn etwa 1 x 106 Zellen in 12 ml Zellkulturmedium gebracht werden, wie z.B. Eagle's essentielles Minimalmedium, ergänzt durch 10% fetales Rinderserum in einem Kolben, der etwa 75 cm2 Wachs
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tumsfläche für die Zellen nach dem Aufbringen auf das Substrat enthält. Wenngleich das oben beschriebene Kulturmedium bevorzugt wird, können andere Kulturmedien-Zusammenstellungen für die Unterstützung des Wachstums dieser Zell-Linien verwendet werden.
Das vorstehend beschriebene Vorgehen zur Ableitung der Zell-Linien wurde von Aden et al. in «Naturo, 282, vom 6. Dez. 1979, S. 615—616, offenbart. Diese zwei speziellen Zell-Linien wurden wie folgt charakterisiert:
1. Chromosomenzahl:
Hep G2 — die modale Zahl der Chromosomen ist 55 (Bereich 50—56). Die Zell-Linie enthält ein Marker-Chro-mosom, das eine Umlagerung des Chromosoms 1 ist.
Hep 3B — die modale Zahl ist 60 mit einer subtetraploi-den Erscheinungsform von 82. Diese Zell-Linie enthält ein Marker-Chromosom, das eine Umlagerung des menschlichen Chromosoms 1 ist.
2. Menschliche Plasmaproteine:
Die in der Zellkultur-Flüssigkeit einer jeden Zell-Linie (Hep G2 und Hep 3B) abgesonderten Produkte sind sowohl durch die Ouchterlony-Doppeldiffusions-Immunfällungs-analyse (unter Verwendung von im Handel erhältlichen Antikörpern zu Human-Plasmaproteinen) und durch zweidimensionale Polyacrylamidgelelektrophorese charakterisiert worden und sind die folgenden normalen Human-Plasmaprotei-ne:
Tabelle I
Humanprotein
Zell-Linie
Hep G2
Hep 3B
a-Fetoprotein
+
+
Albumin
+
+
a-2-Makroglobulin
+
+
a-1 -Antitrypsin
+
+
a-l-Antichymotrypsin
+
+
Transferrin
+
+
Haptoglobin
+
+
Ceruloplasmin
+
+
Plasminogen
+
+
Gc Globulin
—
+
Komplement (C'3)
+
+
Komplement (C'4)
+
+
C'3-Aktivator
+
—
a-1 -Säure-Glycoprotein
+
+
Fibrinogen
+
+
a-2-HS-Glycoprotein
+
+
Retinsäure bindendes Protein
+
+
ß-Lipoprotein
+
+
Eagle's essentiellem Minimalmedium, ergänzt durch 10% fetales Rinderserum.
Die Komponenten des HbsAG, synthetisiert durch Hep 3B, wurden durch Pulsmarkieren der Zellen bestimmt, in-s dem diese 5 Stunden 5 ml Eagle's essentiellem Minimalmedium frei von fetalem Rinderserum, aber 1 mCi 35S-Methionin (New England Nuclear Company) enthaltend ausgesetzt wurden und 1,5 ml 35S-Methionin-markierter Zell-Überstand mit 10 (j.1 Meerschweinchen-Anti-HBsAg (er-io halten vom National Institute of Allergy and Infections Diseases, National Institute of Health, Bethesda, Maryland, 20014) und dann mit 20X Kaninchen-Antiserum zu Meer-schweinchen-Immunoglobulin G inkubiert wurden. Nach einer Inkubation über Nacht wurden Immunkomplexe durch 15 Zentrifugieren erhalten, gewaschen und erneut in einer Lösung suspendiert, die 1 m an Dithiothreitol, 2%ig an Na-triumdodecylsulfat war, und der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese auf einem 7,5— 15%igen Linear-Gradienten-gel unterworfen, getrocknet und einem Kodak NST2-Film 2o ausgesetzt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in dem Autoradiogramm der Fig. 2 veranschaulicht, aus der zu ersehen ist, dass die Komponenten p 23 und p 27 des HBsAg aus der Probe von Hep 3B erhalten werden (s. Gelbahn 2). Diese Komponenten sind auch in der Kontrollprobe vorhanden, 25 die gereinigtes HBsAg enthält (Gelbahn 1), fehlen aber bei Hep G2, das nicht mit HBV infiziert war (Gelbahn 3).
Die Produktion von HBsAg-Komponenten durch die Zell-Linie Hep 3B, die das Hepatitis B-Virus-Genom enthält, zeigt, dass diese Komponenten zur Verwendung bei der 30 Vakzine-Erzeugung gereinigt werden können, oder dass durch Infizieren von nach dem beschriebenen Verfahren erzeugten hepatischen Zell-Linien ähnliche Komponenten zur Verwendung bei der Bereitstellung einer HBV-Vakzine erhalten werden könnten.
35 Die folgenden Beispiele veranschaulichen verschiedene Ausführungsformen der Erfindung.
Beispiel I
Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung der mit 40 Hep G2 bezeichneten Zell-Linie für Stoffwechselstudien, insbesondere zur Auswahl möglicher Karzinogene und Mutagene.
Ineinanderlaufende Kulturen von Hep G2-Zellen wurden 24 h 4,0 nMol/ml 3H-Benzo(a)pyren (BP) in Medium ausge-45 setzt; das meiste der Radioaktivität wurde im Medium rückgewonnen. Ein beträchtlicher Teil des BP wurde zu wasserlöslichen Metaboliten im Stoffwechsel umgesetzt, die nach Behandlung mit ß-Glucuronidase chloroformextrahierbare BP-Chinone und 3-OH-BP lieferten. Aus dem chloroformex-50 trahierbaren Material in der Hep G2-Zellkultur entstanden die folgenden Metaboliten:
Tabelle!!
3. Produktion von HBsAg:
Die Produktion von HBsAgh wurde in der Hep SB-Zell-Linie unter Verwendung des AUSRIA II (Abbott Labs)-Festphasen-Radioassay (RIA)-Satzes, der positive Werte mit einer Standardkurve unter Verwendung von gereinigtem HBsAg vergleicht, quantifiziert. Vgl. Fig. 1, in der die Kurve mit Punkten in Form ausgefüllter Quadrate ng HBsAg in dem Zellkultur-Überstand gegen die Zeit darstellt, die Kurve mit nicht-ausgefüllten Quadratpunkten ng HBsAg im Zell-Lysat darstellt und die Kurve mit ausgefüllten Dreieckspunkten ng Human-Albumin darstellt. Die übrigen Kurven mit Punkten in Form von ausgefüllten bzw. nicht-ausgefüllten Ovalen bedeuten ng alpha-Fetoprotein und die Zahl lebender Zellen, beginnend mit 106 Hep 3B-Zellen in 15 ml
55 Metabolit Prozent Metaboliten bezogen auf Gesamt-BP
BP-9, 10-diol 14
6Q BP-7, 8-diol 7
Chinone 6
So setzt die Hep G2-Zell-Linie BP im Stoffwechsel zu einer Reihe oxidierter Derivate um, darunter den unmittelba-65 ren karzinogenen Metaboliten BP-7,8-diol.
Studien der in den Hep G2-Zellen gebildeten BP-DNA-Addukte lieferten die folgenden Ergebnisse. Von 4,0 nMol 3H-BP/ml Medium waren nach 48 h über 97% vom Stoff-
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Wechsel verarbeitet. Die aus diesen Kulturen isolierte DNA enthielt 28,2 pMol an gebundenem BP/mg DNA. Die BP-DNA-Addukte gleichen denen, die in Primärorgankulturen aus menschlichem Gewebe gebildet werden. Da allgemein angenommen ist, dass Polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe und viele andere Klassen von Karzinogenen eine Stoffwechsel-Aktivierung zur Hervorrufung ihrer biologischen Wirkungen erfordern, und die Hep G2-Zellen diese Verbindungen in die aktivierte Form im Stoffwechsel umwandeln, können die Hep G2-Zellen als Aktivatoren von
Karzinogenen in einem an Zellen gebundenen Mutationstest mit anderen Säugetierzellen verwendet werden.
Beispiel II
Hep 3B wurde 0,5 nMol 3H-BP/ml 24 h in Medium ausgesetzt, und 76% des 3H-BP wurden in wasserlösliche Zwischenstufen im Stoffwechsel umgewandelt. Von dem mit Chloroform extrahierten Material waren 76% unverändertes 3H-BP, aber kleine Mengen an BP-9,10-diol und dem BP-7,8-diol wurden nachgewiesen.
s io
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1 Blatt Zeichnungen
CH1000/82A 1980-06-12 1981-06-10 Verfahren zum bestimmen der stoffwechselumwandlung von chemikalien und wirkstoffen. CH657456A5 (de)

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