DE3152113T1 - Human hepatoma derived cell line,process for preparation thereof,and uses therefor - Google Patents

Human hepatoma derived cell line,process for preparation thereof,and uses therefor

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DE3152113T1 DE813152113T DE3152113T DE3152113T1 DE 3152113 T1 DE3152113 T1 DE 3152113T1 DE 813152113 T DE813152113 T DE 813152113T DE 3152113 T DE3152113 T DE 3152113T DE 3152113 T1 DE3152113 T1 DE 3152113T1
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Description

-Jt-
Beschreibung
Aus menschlichem Hepatom abgeleitete Zeil-Linie, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendungen hierfür
Die hier beschriebene Erfindung wurde im Verlauf einer Arbeit mit Unterstützung oder Anerkennung vom Department of Health, Education and Welfare gemacht.
Hintergrund der Erfindung
Es sind viele Versuche unternommen worden, Zellkultursysteme für Stoffwechselstudien von Chemikalien zu entwickeln, insbesondere für kurzfristige Proben auf mögliche Karzinogene und Mutagene. Die allgemein für solche Zwecke verwendeten Zellkulturen stammen von Nagern, und obgleich sie Chemikalien, die allgemein als Karzinogen angesehen werden, aktiv im Stoff-, wechsel umsetzen, unterscheiden sich die Stoffwechselprodukte von solchen, die in normalen Primärkulturen menschlicher Herkunft entstehen. Human-Fibroblasten-Zellstämme sind auf ihre Fähigkeit getestet worden, potentielle Karzinogene und Mutagene in aktive Karzinogene umzuwandeln, ihre Fähigkeit zu solchen Stoffwechselumwandlungen ist aber gering.
Mit dem Kultivieren von Viren zur Produktion von Vakzinen ist eine Reihe von Problemen verbunden. Insbesondere anspruchsvolle Viren, wie Hepatitis B-Virus (HBV), sind in Zellkulturen nicht erfolgreich vermehrt worden. So müssen zu raschem Wachstum befähigte Zellkultursysteme, die die Produktion von vira-
len Komponenten unterstützen, gefunden werden, damit ein Vakzin von solchen anspruchsvollen, überempfindlichen Viren erzeugt werden kann.
Ziele der Erfindung
Ein Hauptziel dieser Erfindung besteht darin, stabile Leberzell-Linien zu produzieren, die für Wirkstoff-Stoffwechselstudien und besonders zur Auslese potentieller Karzinogene und Mutagene brauchbar sind.
Ein weiteres Hauptziel der Erfindung besteht darin, Leberzeil-Linien zu produzieren, die bei der Erzeugung von Hepatitis B-Viruskomponenten, woraus Vakzine hergestellt werden können, brauchbar sind.
Ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist ein Verfahren zum Ableiten von menschlichen Leberzell-Linien, brauchbar zur Auslese von Wirkstoffen und insbesondere potentiellen Karzinogenen und Mutagenen, zum Züchten von Viren und zum Herstellen von Vakzinen.
Noch ein weiteres Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Erzeugung einer Hepatitis B-Vakzine unter Verwendung der erfindungsgemäßen Leberzell-Linien.
Diese und andere Ziele dieser Erfindung ergeben sich weiter aus der folgenden Beschreibung, den anliegenden Ansprüchen und Figuren, von denen
Fig. 1 ein Diagramm der Zeit in Kultur (Tage) gegen die An-
— fi
zahl lebensfähiger Zellen χ 10 , und die Konzentration von Komponenten von Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigen (HBsAg) , Human-Albumin und Human-cX-Fetoprotein (AFP) im überstand der Kultur, und
Fig. 2 ein Autoradiogramm, das HBsAg in einer Kontrpllprobe und in der Zeil-Linie Hep 3B gemäß der Erfindung und das Fehlen in Hep G2 der Erfindung zeigt, ist.
Beschreibung der Erfindung im einzelnen
Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden neue stabile
Zellen erzeugt, die sich zur Verwendung in Stoffwechselstudien, bei der Karzinogenese und/oder Mutagenese und bei der Herstellung von Vakzinen eignen. Die Zell-Linien werden durch Züchten menschlichen Hepatokarzinoms oder Hepatoblastoms auf letal bestrahlten Zeilernährungsschichten in Gegenwart eines geeigneten Kulturmediums erhalten. Wenngleich die Erfindung auf die Erzeugung neuer Zell-Linien aus irgend einem Human-Hepatom anwendbar ist, wird sie hier nachfolgend ausführlicher insbesondere mit der Erzeugung zweier spezieller Zell-Linien, als Hep G2 und Hep 3B bezeichnet, beschrieben. Diese Zell-Linien sind beim Wistar Institute of Anatomy and
Biology, 36th and Spruce Streets, Philadelphia, Pennsylvania, 19104, und bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, hinterlegt worden. Die Zell-Linien Hep G2 und Hep 3B haben die ATCC-Nummern HB 8065 bzw. HB 8064 erhalten. Diese beiden Kulturen werden während der Laufzeit dieser Patentanmeldung einem vom Commissioner of Patents gemäß 37 CFR §1.14 und 35 USC §122 dazu als berechtigt Bestimmten zugänglich sein, und alle Einschränkungen der Verfügbarkeit für die Öffentlichkeit der so hinterlegten Kulturen werden
nach Erteilung eines Patents unwiderruflich aufgehoben werden.
Mit Hep G2 und Hep 3B bezeichnete Zell-Linien entstammten
Biopsien wahrend ausgedehnter Lobektomien eines 15 Jahre alten kaukasischen Mannes aus Argentinien (1975) bzw. eines
8 Jahre alten schwarzen Jungen aus den Vereinigten Staaten
(1976). Die Zellen, aus denen die mit Hep 3B bezeichnete
Zeil-Linie abgeleitet wurde, enthielten Hepatitis B-Virus,
wie durch die Bezugnahme auf die nachfolgend erörterten Fi-
guren 1 und 2 zu sehen ist. Doch zieht diese Erfindung auch das Infizieren von Zellen mit HBV in Betracht, um HBsAg-Komponenten zur Vakzine-Verwendung zu produzieren.
Scheibchen der so erhaltenen bösartigen Tumore werden auf letal bestrahlten Mäusezellschichten, mit STO bezeichnet, in einem Zellkulturmedium gezüchtet, das aus Williams E-Medium (Gibco), ergänzt durch 10 % fetales Rinderserum (Reheis, Armour Pharmaceuticals), bestand. Mit dem Ausdruck "letal bestrahlt" ist gemeint, daß die Zellen bis zu einem solchen Grad bestrahlt worden sind, daß sie zur Reduplikation nicht mehr befähigt sind. Diese Arbeitsweise fördert das Wachstum differenzierter Zellen mit anspruchsvollen Wachstumsbedürfnissen, während ein übermäßiges Wachstum kontaminierender Fibroblastenzellen verhindert wird.
Die Anfangsperiode des Zellwachstums kann über einen Zeitraum von wenigstens etwa 3 Wochen stattfinden und kann, wenn gewünscht, viele Wochen fortgeführt werden. Gewöhnlich ist eine anfängliche Wachstumsperiode von etwa 4 Wochen ganz zufriedenstellend, worauf Zellkolonien getrennt und auf neue bestrahlte Mäusezellen (STO)-Ernährungsschichten überführt werden. Vor der überführung können Zellen aus Kolben, die einzelne große Kolonien enthalten, durch Trypsiriisieren auseinander gelöst werden (0,25 % Trypsin, 0,1 % Äthylendiamintetraessigsäure in Dulbecco's modifizierter Phosphat-gepufferter Salzlösung ohne Calcium- und Magnesiumsalze). Die Zellkolonien werden anschließend mindestens etwa 60 Reihenpassagen auf STO-Ernährungsschichten unterworfen, was zeigt, daß sie etablierte, routinemäßig wachsende Zell-Linien sind, wobei jede Passage eine Dauer von etwa 1 Woche hat.
Sublinien sowohl von Hep G2 als auch Hep 3B, die die Gegenwart der STO-Ernährungsschicht nicht mehr benötigen, wurden ausgewählt (vier Jahre und zwei Jahre nach Durchführung der Biopsien im Falle von Hep G2 bzw. Hep 3B). Solche Sublinien
vermehren sich, wenn etwa 1 χ 10 Zellen in 12 ml Zellkulturmedium gebracht werden, wie z.B. Eagle's essentielles
Minimalmedium, ergänzt durch 10 % fetales Rinderserum in
2
einem Kolben, der etwa 75cm Wachstumsfläche für die Zellen nach dem Aufbringen auf das Substrat enthält. Wenngleich das oben beschriebene Kulturmedium bevorzugt wird, können andere Kulturmedien-Zusammenstellungen für die Unterstützung des
Wachstums dieser Zell-Linien verwendet werden.
Diese zwei speziellen Zell-Linien wurden wie folgt charakterisiert:
.1 . Chromosomenzahl:
Hep G2 - die modale Zahl der Chromosomen ist 55 (Bereich 50-56). Die Zeil-Linie enthält ein Marker-Chromosom, das eine
Umlagerung des Chromosoms 1 ist.
Hep 3B - die modale Zahl ist 60 mit einer subtetraploiden
Erscheinungsform von 82. Diese Zeil-Linie enthält ein Marker-Chromosom, das eine Umlagerung des menschlichen Chromosoms 1 ist.
2. Menschliche Plasmaproteine:
Die in der Zellkultur-Flüssigkeit einer jeden Zeil-Linie
(Hep G2 und Hep 3B) abgesonderten Produkte sind sowohl durch die Ouchterlony-Doppeldiffusions-Immunfällungsanalyse (unter Verwendung von im Handel erhältlichen Antikörpern zu Human-Plasmaproteinen) und durch zweidimensionale Polyacrylamidgelelektrophorese charakterisiert worden und sind die folgenden normalen Human-Plasmaproteine:
• Tabelle 1
Humanprotein Zeil-Linie
Hep G2 Hep 3B
<rt-Fetoprotein + +
Albumin + +
«tf-2-Makroglobulin + +
oc-1-Antitrypsin + +
oC-1-Antichymotrypsin + +
Transferrin + +
Haptoglobin + +
Ceruloplasmin + +
Plasminogen + +
G Globulin - +
Komplement (C'3) + +
Komplement (C4) + +
C'3-Aktivator +
οί-1-Säure-Glycoprotein + +
Fibrinogen · + +
<X-2-HS-Glycoprotein + +
Retinsäure bindendes Protein ' + +
ß-Lipoprotein -+ +
3. Produktion von HBsAg:
Die Produktion von HBsAg wurde in der Hep 3B-Zell-Linie unter Verwendung des AUSRIA II (Abbott Labs)-Festphasen-Radioassay (RIA)-Satzes, der positive Werte mit einer Standardkurve unter Verwendung von gereinigtem HBsAg vergleicht, quantifiziert. Vgl. Fig. 1, in der die Kurve mit Punkten in Form ausgefüllter Quadrate ng HBsAg in dem Zellkultur-Uberstand gegen die Zeit darstellt, die Kurve mit nicht-ausgefüllten Quadratpunkten ng HBsAg im Zell-Lysat darstellt und die Kurve mit ausgefüllten Dreieckspunkten pg Human-Albumin darstellt. Die übrigen Kurven mit Punkten in Form von ausgefüllten bzw. nicht-ausgefüllten Ovalen bedeuten pg alpha-
Fetoprotein und die Zahl lebender Zellen, beginnend mit 10 Hep 3B-Zellen in 15 ml Eagle's essentiellem Minimalmedium, ergänzt durch 10 % fetales Rinderserum.
Die Komponenten des HBsAG, synthetisiert durch Hep 3B, wurden durch Pulsmarkieren der Zellen bestimmt, indem diese 5 Stunden 5 ml Eagle's essentiellem Minimalmedium frei von fe-
35
talem Rinderserum, aber 1 mCi S-Methionin (New England
35 Nuclear Company) enthaltend ausgesetzt wurden und 1,5 ml S-Methionin-markierter Zell-Uberstand mit 10 pl Meerschweinchen-Anti-HBsAg (erhalten vom National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institute of Health, Bethesda, Maryland, 20014) und dann mit 2OA Kaninchen-Antiserum zu Meerschweinchen-Immunoglobulin G inkubiert wurden. Nach einer Inkubation über Nacht wurden Immunkomplexe durch Zentrifugieren erhalten, gewaschen und erneut in einer Lösung suspendiert, die 1 m an Dithiothreitol, 2 %ig an Natriumdodecylsulfat war, und der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese auf einem 7,5-15 %igen Linear-Gradientengel unterworfen, getrocknet und einem Kodak NST2-Film ausgesetzt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in dem Autoradiogramm der Fig. 2 veranschaulicht, aus der zu ersehen ist, daß die Komponenten ρ 23 und ρ 27 des HBsAg aus der Probe von Hep 3B erhalten werden (s. Gelbahn 2). Diese Komponenten sind auch in der Kontrollprobe vorhanden, die gereinigtes HBsAg enthält (Gelbahn 1), fehlen aber bei Hep G2, das nicht mit HBV infiziert war (Gelbahn 3).
Die Produktion von HBsAg-Komponenten durch die Zeil-Linie Hep 3B, die das Hepatitis B-Virus-Genom enthält, zeigt, daß diese Komponenten zur Verwendung bei der Vakzine-Erzeugung gereinigt werden können, oder daß durch Infizieren von nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugten hepatischen Zell-Linien ähnliche Komponenten zur Verwendung bei der Bereitstellung einer HBV-Vakzine erhalten werden könnten.
Die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele veranschaulichen verschiedene Ausführungsformen der Erfindung.
Beispiel I
Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung der mit Hep G2 bezeichneten erfindungsgemäßen Zeil-Linie für Stoffwechselstudien, insbesondere zur Auswahl möglicher Karzinogene und Mutagene.
Ineinanderlaufende Kulturen von Hep G2-Zellen wurden 24 h 4,0 nMol/ml H-Benzo(a)pyren (BP) in Medium ausgesetzt; das meiste der Radioaktivität wurde im Medium rückgewonnen. Ein beträchtlicher Teil des BP wurde zu wasserlöslichen Metaboliten im Stoffwechsel umgesetzt, die nach Behandlung mit ß-Glucuronidase chloroformextrahierbare BP-Chinone und 3-0H-BP . lieferten. Aus dem chloroformextrahierbaren Material in der Hep G2-Zellkultur entstanden die folgenden Metaboliten:
Tabelle II
Metabolit · Prozent Metaboliten bezogen auf Gesamt-BP
BP-9,10-diol 14
BP-7,8-diol 7
Chinone ' 6
So setzt die Hep G2-Zell-Linie BP im Stoffwechsel zu einer Reihe oxidierter Derivate um, darunter den unmittelbaren karzinogenen Metaboliten BP-7,8-diol.
Studien der in den Hep G2-Zellen gebildeten BP-DNA-Addukte lieferten die folgenden Ergebnisse. Von 4,0 nMol H-BP/ml Medium waren nach 48 h über 97 % vom Stoffwechsel verarbeitet. Die aus diesen Kulturen isolierte DNA enthielt 28,2 pMol
— Or*" ι.
an gebundenem BP/mg DNA. Die BP-DNA-Addukte gleichen denen, die in Primärorgankulturen aus menschlichem Gewebe gebildet werden. Da allgemein angenommen ist, daß polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe und viele andere Klassen von Karzinogenen eine Stoffwechsel-Aktivierung zur Hervorrufung ihrer biologischen Wirkungen erfordern, und die Hep G2-Zellen diese Verbindungen in die aktivierte Form im Stoffwechsel umwandeln, können die Hep G2-Zellen als Aktivatoren von Karzinogenen in einem an Zellen gebundenen Mutationstest mit anderen Säugetierzellen verwendet werden.
Beispiel II
Hep 3B wurde 0,5 nMol H-BP/ml 24 h in Medium ausgesetzt, und
3
76 % des H-BP wurden in wasserlösliche Zwischenstufen im Stoffwechsel umgewandelt. Von dem mit Chloroform extrahier-
ten Material waren 76 % unverändertes H-BP, aber kleine Mengen an BP-9,10-diol und dem BP-7,8-diol wurden nachgewiesen.
Wie zuvor angegeben, sollten die erfindungsgemäßen Zell-Linien beim Kultivieren von Viren, insbesondere anspruchsvollen Viren, wie HBV, brauchbar sein. Bei einer solchen Verwendung können Einschichtenkulturen der besonderen Zeil-Linie, z.B. Hep G2, entweder Dane-Teilchen aus Seren infizierter Patienten oder HBV-DNA, aus einer solchen Quelle gereinigt, ausgesetzt werden. Nach etwa einstündiger Absorption an die einlagige Schicht in kleinen Mengen des Kulturmediums kann zusätzliches Zell-Linien-Kulturmedium zugesetzt und die die Zeil-Linie enthaltenden Kolben mehrere Tage inkubiert werden. Die überwachung der Kulturen nach Standard-Techniken zum Nachweis viraler Antigene, wie oben in Verbindung mit der Zeil-Linie Hep 3B beschrieben, bestimmt die optimale Zeit für das Ernten der Zellkulturen und die Virusantigen-Reinigung. Die so erzeugten Antigene, z.B. HBsAg, können zur Produktion von Vakzinen verwendet werden.
Enthält das im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Ausgangs-Hepatokarzinom schon das HBV-Genom, wie es bei dem Quellenmaterial der Fall ist, aus dem die Hep 3B-Zell-Linie erhalten wurde, kann das von der Zeil-Linie synthetisierte HBsAg zur Erzeugung einer Vakzine verwendet werden.
Vorteilhafterweise liefert eine erfindungsgemäße,HBV enthaltende Zeil-Linie, z.B. Hep 3B, eine alternierende Quelle für HBsAg, wodurch die Produktion und die Qualität des Antigens gesteuert werden kann. Experimente mit Hep 3B zeigen, daß nur ein Teil des viralen Genoms zugegen ist und daß infektiöse virale Teilchen von dieser Zeil-Linie nicht produziert werden, wodurch die Gefahr der HBV-Infektion beseitigt ist. Die Reinigung des HBsAg aus dem Zellkulturmedium für die Vakzine-Produktion kann nach einer Reihe von auf dem Fachgebiet gut bekannten Methoden erfolgen.
Eine Alternativmethode zur Herstellung von HBsAg aus den erfindungsgemäßen Zell-Linien umfaßt die Verwendung von rekombinanter HBV-Plasmid-DNA in einem in vitro HBsAg synthetisierenden Bakterium. Zur Herstellung einer diese Technik anwendenden Vakzine wird die gesamte ZeIl-RNA, von der cDNA-Kopien gebildet werden, oder DNA aus der HBsAg-produzierenden Zeil-Linie isoliert und mit Restriktionsenzymen verdaut, die nicht die HBV-DNA verdauen oder das HBsAg kodierende Segment intakt lassen (z.B. Hind III), gefolgt von einer Anreicherung der HBV-DNA, entweder durch Hybridisieren an Filter, die fixierte Dane-Teilchen-DNA enthalten, und Elution von den Filtern, oder durch Elution von Elektrophorogrammen nach Lokalisation an einem Teil des Gels mit radioaktiv markierter, von Dane-Teilchen stammender DNA. Nach Reaktion mit dCMP-Resten unter Verwendung von Nucleotidyl-terminal-Transferase kann die DNA zum Plasmid pB-R322 hybridisiert, mit PST-1 gespalten und mit d GMP-Resten als Schwanz versehen werden, und E. coli kann mit Hybridplasmiden transformiert und auf HBsAg-produzierende Kolonien nach auf dem Fachgebiet gut bekannten Methoden geprüft werden. HBsAg-positive Klone können dann ausgewählt,
vermehrt werden und die Vakzine-Produktion aus diesen Klonen würde weiter gehen (Wu, R., Herausgeber; Methods in Enzymology, Band 68, Academic Press, N.Y., zur rekombinanten DNA-Arbeitsweise insgesamt).

Claims (28)

Ansprüche
1. Verfahren zum Ableiten einer Human-Leberzell-Linie, bei dem eine Biopsie eines menschlichen Lebertumors auf letal bestrahlten Zellernälirunysschichten in Gegenwart eines Kulturmediums gezüchtet wird, bis eine Zeil-Linie etabliert ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die bestrahlten Zellernährungsschichten Mäusezellschichten umfassen.
3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Tumor zunächst auf letal bestrahlten Ernährungsschichten für wenigstens etwa 3 Wochen kultiviert werden, um Zellwachstum zu verursachen, und die resultierenden Zellkolonien anschließend wenigstens 60 Reihenpassagen auf den Ernährungsschichten unterzogen werden, um eine Zeil-Linie zu etablieren.
4. Verfahren zum Bestimmen der Stoffwechselumwandlung bestimmter Chemikalien und Wirkstoffe, insbesondere potentieller Karzinogene und Mutagene, bei dem
a) eine Kultur einer Human-Leberzell-Linie in einem Nährmedium gehalten,
b) die Zeil-Linie der zu testenden Chemikalie oder dem Wirkstoff ausgesetzt,
c) die Kultur auf die Gegenwart von Metaboliten der Chemikalie oder des Wirkstoffs analysiert wird und
d) die Metaboliten in Kulturen anderer Säugetierzellen zur Bestimmung ihrer Mutagenität eingeführt werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die Zeil-Linie nach dem Verfahren des Anspruchs 1 produziert wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die Zeil-Linie Hep G2 umfaßt.
7. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die Zeil-Linie Hep 3B umfaßt.
8. Verfahren zum Kultivieren eines anspruchsvollen Virus, wie des Hepatitis B-Virus, bei dem
a) eine Kultur einer Human-Leberzell-Linie in Nährkulturmedium gehalten,
b) das Medium mit einem anspruchsvollen Virus beimpft,
c) das Virus in den Zellen der Zeil-Linie kultiviert und
d) eine Ernte des Virus aus der Zeil-Linie gewonnen wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die Zeil-Linie nach dem Verfahren des Anspruchs 1 erzeugt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die Zeil-Linie Hep G2 umfaßt.
11. Verfahren nach Anspruch -8, bei dem das anspruchsvolle Virus Hepatitis B-'Virus ist.
12. Verfahren zum Isolieren von Hepatitis B-Virus-, Oberflächenantxgenen zur Verwendung als eine Vakzine, bei dem
a) eine Human-Leberzell-Linie, die das Hepatitis B-Virus-Genom enthält, in Nährkulturmedium gehalten,
b) die überstehende Flüssigkeit von der Kultur gewonnen und
c) das Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigen in der überstehenden Flüssigkeit zur Verwendung als Vakzine gereinigt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die Zeil-Linie nach dem Verfahren des Anspruchs 1 produziert wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem die Zeil-Linie Hep 3B umfaßt.
15. Verfahren zum Erzeugen von Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigenen aus einer Human-Leberzell-Linie zur Verwendung in einer Vakzine, bei dem
a) DNA oder RNA aus einer das Hepatitis B-Virus-Genom enthaltenden Human-Leberzell-Linie erhalten wird,
b) rekombinante DNA-Plasmide, das aus der DNA oder RNA erhaltene Hepatitis B-virale Genom enthaltend, produziert werden,
c) die rekombinanten DNA-Plasmide in einem Wirtsbakterium kultiviert werden und
d) das Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigen zur Verwendung als Vakzine gereinigt und gewonnen wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem die Zeil-Linie nach dem Verfahren des Anspruchs 1 produziert wird.
17. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die Zeil-Linie Hep 3B umfaßt.
18. Verfahren zum Isolieren von Human-Plasmaproteinen zur Verwendung bei der Behandlung von an diesen Proteinen armen Patienten, bei dem
a) eine Human-Leberzell-Linie, die die gewünschten Plasmaproteine synthetisiert, in einem Nährkulturmedium gehalten,
b) die überstehende Flüssigkeit von der Kultur gewonnen und
c) das Plasmaprotein zur Verwendung bei der Behandlung von an dem Protein armen Patienten gereinigt wird.
19. Verfahren nach Anspruch 18, bei dem die Zeil-Linie nach dem Verfahren des Anspruchs 1 produziert wird.
20. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem die Zeil-Linie Hep G2 umfaßt.
21. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem die Zeil-Linie Hep 3B umfaßt.
22. Verfahren zum Produzieren von Human-Plasma-Proteinen zur Verwendung bei der Behandlung von an diesen Proteinen armen Patienten, bei dem
a) DNA und/oder RNA aus einer Human-Leberzell-Linie, die die gewünschten Plasma-Proteine synthetisiert, erhalten wird,
b) rekombinante DNA-Plasmide, die die cDNA für die relevanten Proteine enthalten, produziert.
c) die rekombinanten DNA-Plasmide in einem Wirtsbakterium kultiviert und
d) die gewünschten Human-Proteine zur Verwendung bei der Behandlung von an diesen Proteinen armen Menschen gereinigt und gewonnen werden.
23. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem die Human-Leberzell-Linie nach dem Verfahren des Anspruchs 1 erhalten wird.
24. Verfahren nach Anspruch 23, bei dem die Zeil-Linie Hep G2 umfaßt.
25. Verfahren nach Anspruch 23, bei dem die Zeil-Linie Hep 3B umfaßt.
26. Zeil-Linie, produziert nach dem Verfahren des Anspruchs 1.
27. Zeil-Linie mit den identifizierenden Merkmalen von Hep 3B.
28. Zeil-Linie mit den identifizierenden Merkmalen von Hep G2.
DE3152113T 1980-06-12 1981-06-10 Verfahren zum Bestimmen der Stoffwechselumwandlung bestimmter Chemikalien und Wirkstoffe Expired - Lifetime DE3152113C2 (de)

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