DE3152113C2

DE3152113C2 - Verfahren zum Bestimmen der Stoffwechselumwandlung bestimmter Chemikalien und Wirkstoffe

Info

Publication number: DE3152113C2
Application number: DE3152113T
Authority: DE
Inventors: Geb Bang Knowles; David P Aden
Original assignee: Wistar Institute of Anatomy and Biology
Current assignee: Wistar Institute of Anatomy and Biology
Priority date: 1980-06-12
Filing date: 1981-06-10
Publication date: 1994-06-09
Anticipated expiration: 2001-06-11
Also published as: IT8148663A1; JPS57500768A; EP0053165B1; EP0053165A4; DE3152113T1; EP0053165A1; CH657456A5; AT391145B; IT8148663A0; US4393133A; WO1981003663A1; CA1193210A; IT1171297B; GB2089370B; ATA904881A; GB2089370A; JPH0411198B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen der Stoff wechselumwandlung bestimmter Chemikalien und Wirkstoffe, insbe sondere Karzinogene und Mutagene.

Es sind viele Versuche unternommen worden, Zellkultursysteme für Stoffwechselstudien von Chemikalien zu entwickeln, insbesondere für kurzfristige Proben auf mögliche Karzinogene und Mutagene. Die allgemein für solche Zwecke verwendeten Zellkulturen stam men von Nagern. Obgleich sie Chemikalien, die allgemein als Karzinogene angesehen werden, aktiv im Stoffwechsel umsetzen, unterscheiden sich die Stoffwechselprodukte von solchen, die in normalen Primärkulturen menschlicher Herkunft entstehen.

In Chemical Abstract, 91 : 155286a, 1979, S. 433 wird ein Ver fahren beschrieben, bei welchem es um die kurzzeitige Kultivie rung von Ratten-Hepatocyten geht. Letztere metabolisieren das Leber-Karzinogen 2-(N-acetyl-Amino) Fluoren zu wasserlöslichen Produkten. In dieser Veröffentlichung wird herausgestellt, daß diese Ratten-Hepatocyten auf bestimmten Zellen viele Charakte ristika von Hepatocyten in vivo behielten. Abgesehen von der bereits erwähnten Tatsache, daß sich die unter Verwendung von Ratten-Leberzellen gewonnenen Erkenntnisse nicht ohne weiteres auf den Menschen übertragen lassen, geht es bei diesem Verfah ren nicht darum, die Stoffwechselprodukte von an sich nicht krebserzeugenden Substanzen zu untersuchen. Vielmehr wird be schrieben, daß die Ratten-Hepatocyten eine Leberkrebs erzeu gende Substanz metabolisieren.

Chemical Abstract 86, 1977 : 66587d beschreibt die Wechselwir kung von chemischen Karzinogenen und Enzymen von Wirkstoff-Me taboliten in Leberzell-Kulturen von Ratten. Dabei wird angenom men, daß die Zell-Kultur als Testsystem für das Überprüfen von Karzinogenen in Säugetieren verwendbar ist. Bei den in diesem Verfahren verwendeten Leberzellen handelt es sich nicht um Hu man-Leberzellen. Zudem können die Leberzellen dieses bekannten Verfahrens nur für kurze Zeit, beispielsweise bis zu zehn Ta gen, kultiviert werden. Im übrigen soll diese von Ratten gewon nene Zell-Linie selbst als Testmittel verwendet werden.

DD 109.659 B offenbart ein Verfahren zum Prüfen von Chemikalien auf Mutagenität in Zell-Kulturen, die chinesischen Hamstern entstammen. Da die von Zellen bei Kontakt mit unterschiedlichen Chemikalien und Wirkstoffen erzeugten Stoffwechselprodukte artspezifisch sind, wären die Ergebnisse dieses Verfahrens nicht ohne weiteres auf den Menschen übertragbar.

Die Zielsetzung der Erfindung besteht darin, stabile Leberzell- Linien, die für Wirkstoff-Stoffwechselstudium brauchbar sind, und ein Verfahren zur Auslese von potentiellen Karzinogenen und Mutagenen verfügbar zu machen.

Zur Lösung dieser Aufgabe schlägt die Erfindung vor, daß

a) eine Kultur einer Zell-Linie Hep G2 (entspricht ATCC-Hinter legungs-No. HB 8065) oder Hep 3B (entspricht ATCC-Hinterle gungs-No. HB 8064) in einem Nährmedium gehalten,
b) die Zell-Linie der zu testenden Chemikalie oder dem Wirk stoff ausgesetzt,
c) die Kultur auf die Gegenwart von Metaboliten der Chemikalie oder des Wirkstoffes analysiert wird,
d) die Metaboliten in Kulturen anderer Säugetierzellen zur Be stimmung ihrer Mutagenität eingeführt werden.

Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung. Es zeigen:

Fig. 1 ein Diagramm der Zeit in Kultur (Tage) gegen die Anzahl lebensfähiger Zellen × 10^-6 und die Konzentration von Komponen ten von Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigen (HBsAg), Humanal bumin und Human-Alpha-Fetoprotein (AFP) im Überstand der Kultur und

Fig. 2 ein Autoradiogramm, das HBsAg in einer Kontrollprobe und in der Zell-Linie Hep 3B gemäß der Erfindung und das Fehlen in Hep G2 gemäß der Erfindung zeigt.

Die Zell-Linien Hep 3B und Hep G2 werden durch Züchten mensch lichen Hepatokarzinoms oder Hepatoblastroms auf letal be strahlten Zellernährungsschichten in Gegenwart eines geeigneten Kulturmediums erhalten. Diese Zell-Linien sind beim American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland/U.S.A. hinterlegt worden.

Mit Hep G2 und Hep 3B bezeichnete Zell-Linien entstammten Biopsien während ausgedehnter Lobektomien eines 15 Jahre al ten kaukasischen Mannes aus Argentinien (1975) bzw. eines 8 Jahre alten schwarzen Jungen aus den Vereinigten Staaten (1976). Die Zellen, aus denen die mit Hep 3B bezeichnete Zell-Linie abgeleitet wurde, enthielten Hepatitis B-Virus, wie durch die Bezugnahme auf die nachfolgend erörterten Fig. 1 und 2 zu sehen ist. Doch zieht diese Erfindung auch das Infizieren von Zellen mit HBV in Betracht, um HBsAg-Kom ponenten zur Vakzine-Verwendung zu produzieren.

Scheibchen der so erhaltenen bösartigen Tumore werden auf letal bestrahlten Mäusezellschichten, mit STO bezeichnet, in einem Zellkulturmedium gezüchtet, das aus Williams E-Medium (Gibco), ergänzt durch 10% fetales Rinderserum (Reheis, Ar mour Pharmaceuticals), bestand. Mit dem Ausdruck "letal be strahlt" ist gemeint, daß die Zellen bis zu einem solchen Grad bestrahlt worden sind, daß sie zur Reduplikation nicht mehr befähigt sind. Diese Arbeitsweise fördert das Wachstum differenzierter Zellen mit anspruchsvollen Wachstumsbedürf nissen, während ein übermäßiges Wachstum kontaminierender Fibroblastenzellen verhindert wird.

Die Anfangsperiode des Zellwachstums kann über einen Zeit raum von wenigstens etwa 3 Wochen stattfinden und kann, wenn gewünscht, viele Wochen fortgeführt werden. Gewöhnlich ist eine anfängliche Wachstumsperiode von etwa 4 Wochen ganz zu friedenstellend, worauf Zellkolonien getrennt und auf neue bestrahlte Mäusezellen (STO)-Ernährungsschichten überführt werden. Vor der Überführung können Zellen aus Kolben, die einzelne große Kolonien enthalten, durch Trypsinisieren aus einander gelöst werden (0,25% Trypsin, 0,1% Äthylendiamin tetraessigsäure in Dulbecco′s modifizierter Phosphat-gepuf ferter Salzlösung ohne Calcium- und Magnesiumsalze). Die Zellkolonien werden anschließend mindestens etwa 60 Reihen passagen auf STO-Ernährungsschichten unterworfen, was zeigt, daß sie etablierte, routinemäßig wachsende Zell-Linien sind, wobei jede Passage eine Dauer von etwa 1 Woche hat.

Sublinien sowohl von Hep G2 als auch Hep 3B, die die Gegen wart der STO-Ernährungsschicht nicht mehr benötigen, wurden ausgewählt (vier Jahre und zwei Jahre nach Durchführung der Biopsien im Falle von Hep G2 bzw. Hep 3B). Solche Sublinien vermehren sich, wenn etwa 1 × 10^-6 Zellen in 12 ml Zellkul turmedium gebracht werden, wie z. B. Eagle′s essentielles Minimalmedium, ergänzt durch 10% fetales Rinderserum in einem Kolben, der etwa 75 cm² Wachstumsfläche für die Zellen nach dem Aufbringen auf das Substrat enthält. Wenngleich das oben beschriebene Kulturmedium bevorzugt wird, können andere Kulturmedien-Zusammenstellungen für die Unterstützung des Wachstums dieser Zell-Linien verwendet werden.

Diese zwei speziellen Zell-Linien wurden wie folgt charakte risiert:

1. Chromosomenzahl

Hep G2 - die modale Zahl der Chromosomen ist 55 (Bereich 50-56). Die Zell-Linie enthält ein Marker-Chromosom, das eine Umlagerung des Chromosoms 1 ist.

Hep 3B - die modale Zahl ist 60 mit einer subtetraploiden Erscheinungsform von 82. Diese Zell-Linie enthält ein Marker- Chromosom, das eine Umlagerung des menschlichen Chromosoms 1 ist.

2. Menschliche Plasmaproteine

Die in der Zellkultur-Flüssigkeit einer jeden Zell-Linie (Hep G2 und Hep 3B) abgesonderten Produkte sind sowohl durch die Ouchterlony-Doppeldiffusions-Immunfällungsanalyse (unter Verwendung von im Handel erhältlichen Antikörpern zu Human- Plasmaproteinen) und durch zweidimensionale Polyacrylamidgel elektrophorese charakterisiert worden und sind die folgenden normalen Human-Plasmaproteine:

Tabelle I

3. Produktion von HBsAg

Die Produktion von HBsAg wurde in der Hep 3B-Zell-Linie un ter Verwendung des AUSRIA II (Abbott Labs)-Festphasen-Radio assay (RIA)-Satzes, der positive Werte mit einer Standard kurve unter Verwendung von gereinigtem HBsAg vergleicht, quantifiziert. vgl. Fig. 1, in der die Kurve mit Punkten in Form ausgefüllter Quadrate ng HBsAg in dem Zellkultur-Über stand gegen die Zeit darstellt, die Kurve mit nicht-ausge füllten Quadratpunkten ng HBsAg im Zell-Lysat darstellt und die Kurve mit ausgefüllten Dreieckspunkten µg Human-Albumin darstellt. Die übrigen Kurven mit Punkten in Form von ausge füllten bzw. nicht-ausgefüllten Ovalen bedeuten µg alpha- Fetoprotein und die Zahl lebender Zellen, beginnend mit 10⁶ Hep 3B-Zellen in 15 ml Eagle′s essentiellem Minimalmedium, ergänzt durch 10% fetales Rinderserum.

Die Komponenten des HBsAG, synthetisiert durch Hep 3B, wur den durch Pulsmarkieren der Zellen bestimmt, indem diese 5 Stunden 5 ml Eagle′s essentiellem Minimalmedium frei von fe talem Rinderserum, aber 1 mCi ³⁵S-Methionin (New England Nuclear Company) enthaltend ausgesetzt wurden und 1,5 ml ³⁵S- Methionin-markierter Zell-Überstand mit 10 µl Meerschwein chen-Anti-HBsAg (erhalten vom National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institute of Health, Bethesda, Maryland, 20014) und dann mit 20 λ Kaninchen-Anti serum zu Meerschweinchen-Immunoglobulin G inkubiert wurden. Nach einer Inkubation über Nacht wurden Immunkomplexe durch Zentrifugieren erhalten, gewaschen und erneut in einer Lö sung suspendiert, die 1 m an Dithiothreitol, 2%ig an Na triumdodecylsulfat war, und der SDS-Polyacrylamidgel-Elektro phorese auf einem 7,5-15%igen Linear-Gradientengel unter worfen, getrocknet und einem Kodak NST2-Film ausgesetzt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in dem Autoradiogramm der Fig. 2 veranschaulicht, aus der zu ersehen ist, daß die Komponenten p 23 und p 27 des HBsAg aus der Probe von Hep 3B erhalten werden (s. Gelbahn 2). Diese Komponenten sind auch in der Kontrollprobe vorhanden, die gereinigtes HBsAg enthält (Gel bahn 1), fehlen aber bei Hep G2, das nicht mit HBV infiziert war (Gelbahn 3).

Die Produktion von HBsAg-Komponenten durch die Zell-Linie Hep 3B, die das Hepatitis B-Virus-Genom enthält, zeigt, daß diese Komponenten zur Verwendung bei der Vakzine-Erzeugung gereinigt werden können, oder daß durch Infizieren von nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugten hepatischen Zell- Linien ähnliche Komponenten zur Verwendung bei der Bereit stellung einer HBV-Vakzine erhalten werden könnten.

Die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele veranschauli chen verschiedene Ausführungsformen der Erfindung.

Beispiel I

Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung der mit Hep G2 bezeichneten erfindungsgemäßen Zell-Linie für Stoff wechselstudien, insbesondere zur Auswahl möglicher Karzino gene und Mutagene.

Ineinanderlaufende Kulturen von Hep G2-Zellen wurden 24 h 4,0 nMol/ml ³H-Benzo(a)pyren (BP) in Medium ausgesetzt; das meiste der Radioaktivität wurde im Medium rückgewonnen. Ein beträchtlicher Teil des BP wurde zu wasserlöslichen Meta boliten im Stoffwechsel umgesetzt, die nach Behandlung mit β-Glucuronidase chloroformextrahierbare BP-Chinone und 3-OH- BP lieferten. Aus dem chloroformextrahierbaren Material in der Hep G2-Zellkultur entstanden die folgenden Metaboliten:

Metabolit
Prozent Metaboliten bezogen auf Gesamt-BP
BP-9,10-diol
14
BP-7,8-diol	7
Chinone	6

So setzt die Hep G2-Zell-Linie BP im Stoffwechsel zu einer Reihe oxidierter Derivate um, darunter den unmittelbaren karzinogenen Metaboliten BP-7,8-diol.

Studien der in den Hep G2-Zellen gebildeten BP-DNA-Addukte lieferten die folgenden Ergebnisse. Von 4,0 nMol ³H-BP/ml Medium waren nach 48 h über 97% vom Stoffwechsel verarbei tet. Die aus diesen Kulturen isolierte DNA enthielt 28,2 pMol an gebundenem BP/mg DNA. Die BP-DNA-Addukte gleichen denen, die in Primärorgankulturen aus menschlichem Gewebe gebildet werden. Da allgemein angenommen ist, daß polycyclische aro matische Kohlenwasserstoffe und viele andere Klassen von Karzinogenen eine Stoffwechsel-Aktivierung zur Hervorrufung ihrer biologischen Wirkungen erfordern, und die Hep G2-Zellen diese Verbindungen in die aktivierte Form im Stoffwechsel um wandeln, können die Hep G2-Zellen als Aktivatoren von Karzino genen in einem an Zellen gebundenen Mutationstest mit anderen Säugetierzellen verwendet werden.

Beispiel II

Hep 3B wurde 0,5 nMol ³H-BP/ml 24 h in Medium ausgesetzt, und 76% des H-BP wurden in wasserlösliche Zwischenstufen im Stoffwechsel umgewandelt. Von dem mit Chloroform extrahier ten Material waren 76% unverändertes ³H-BP, aber kleine Men gen an BP-9,10-diol und dem BP-7,8-diol wurden nachgewiesen.

Wie zuvor angegeben, sollten die erfindungsgemäßen Zell-Linien beim Kultivieren von Viren, insbesondere anspruchsvollen Viren, wie HBV, brauchbar sein. Bei einer solchen Verwendung können Einschichtenkulturen der besonderen. Zell-Linie, z. B. Hep G2, entweder Dane-Teilchen aus Seren infizierter Patienten oder HBV-DNA, aus einer solchen Quelle gereinigt, ausgesetzt werden. Nach etwa einstündiger Absorption an die einlagige Schicht in kleinen Mengen des Kulturmediums kann zusätzliches Zell-Linien- Kulturmedium zugesetzt und die die Zell-Linie enthaltenden Kolben mehrere Tage inkubiert werden. Die Überwachung der Kul turen nach Standard-Techniken zum Nachweis viraler Antigene, wie oben in Verbindung mit der Zell-Linie Hep 3B beschrieben, bestimmt die optimale Zeit für das Ernten der Zellkulturen und die Virusantigen-Reinigung. Die so erzeugten Antigene, z. B. HBsAg, können zur Produktion von Vakzinen verwendet werden.

Enthält das im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Aus gangs-Hepatokarzinom schon das HBV-Genom, wie es bei dem Quel lenmaterial der Fall ist, aus dem-die Hep 3B-Zell-Linie erhal ten wurde, kann das von der Zell-Linie synthetisierte HBsAg zur Erzeugung einer Vakzine verwendet werden.

Vorteilhafterweise liefert eine erfindungsgemäße, HBV enthal tende Zell-Linie, z. B. Hep 3B, eine alternierende Quelle für HBsAg, wodurch die Produktion und-die Qualität des Antigens gesteuert werden kann. Experimente mit Hep 3B zeigen, daß nur ein Teil des viralen Genoms zugegen ist und daß infektiöse virale Teilchen von dieser Zell-Linie nicht produziert werden, wodurch die Gefahr der HBV-Infektion beseitigt ist. Die Reini gung des HBsAg aus dem Zellkulturmedium für die Vakzine-Produk tion kann nach einer Reihe von auf dem Fachgebiet gut bekann ten Methoden erfolgen.

Eine Alternativmethode zur Herstellung von HBsAg aus den er findungsgemäßen Zell-Linien umfaßt die Verwendung von rekom binanter HBV-Plasmid-DNA in einem in vitro HBsAg synthetisie renden Bakterium. Zur Herstellung einer diese Technik anwen denden Vakzine wird die gesamte Zell-RNA, von der cDNA-Kopien gebildet werden, oder DNA aus der HBsAg-produzierenden Zell- Linie isoliert und mit Restriktionsenzymen verdaut, die nicht die HBV-DNA verdauen oder das HBsAg kodierende Segment intakt lassen (z. B. Hind III), gefolgt von einer Anreicherung der HBV-DNA, entweder durch Hybridisieren an Filter, die fixierte Dane-Teilchen-DNA enthalten, und Elution von den Filtern, oder durch Elution von Elektrophorogrammen nach Lokalisation an einem Teil des Gels mit radioaktiv markierter, von Dane- Teilchen stammender DNA. Nach Reaktion mit dCMP-Resten unter Verwendung von Nucleotidyl-terminal-Transferase kann die DNA zum Plasmid pBR322 hybridisiert, mit PST-1 gespalten und mit d GMP-Resten als Schwanz versehen werden, und E. coli kann mit Hybridplasmiden transformiert und auf HBsAg-produzierende Kolonien nach auf dem Fachgebiet gut bekannten Methoden ge prüft werden. HBsAg-positive Klone können dann ausgewählt, vermehrt werden und die Vakzine-Produktion aus diesen Klonen würde weiter gehen (Wu, R., Herausgeber; Methods in Enzymology, Band 68, Academic Press, N.Y., zur rekombinanten DNA-Arbeits weise insgesamt).

Claims

Verfahren zum Bestimmen der Stoffwechselumwandlung bestimmter Chemikalien und Wirkstoffe, insbesondere potentieller Karzino gene und Mutagene, dadurch gekennzeichnet, daß
- a) eine Kultur einer Zell-Linie Hep G2 (entspricht ATCC-Hin terlegungs-No. HB 8065) oder Hep 3B (entspricht ATCC-Hinterle gungs-No. HB 8064) in einem Nährmedium gehalten,
- b) die Zell-Linie der zu testenden Chemikalie oder dem Wirk stoff ausgesetzt,
- c) die Kultur auf die Gegenwart von Metaboliten der Chemikalie oder des Wirkstoffes analysiert wird,
- d) die Metaboliten in Kulturen anderer Säugetierzellen zur Be stimmung ihrer Mutagenität eingeführt werden.