JPS6067494A - オリゴヌクレオチドを固体支持体上に合成する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固体支持体上にデオキシリボオリゴヌクレオチ
ドおよびリボオリゴヌクレオチドを合成する方法に関す
る。

近年、科学者達は、ＤＮＡおよびＲＮＡを損保して利用
することができる明確に定められたシーケンスを有する
オリゴヌクレオチドの合成方法を開発して米た。たとえ
ば、サイズがＤＮＡの合成片１０から１４ユニツトから
成るものを具体的な酸素的技法によって互いに結合させ
て遺伝子全体を形成するか、あるいは所望のＤＮＡシー
ケンスの同定を補助するグローブとして機能させること
ができる。合成オリゴヌクレオチド鎖はＤＮＡ片を互い
にスプライシングする際、または組換えられたＤＮＡ分
子を構成する際、これらを補助するリンカ−として機能
し得るものである。

Ｋｈｏｒａｎａ他のジエステル合成によって、オリゴヌ
クレオチドは最初に合成された（　Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃ、
　Ｂｉｏｌ。

７２　：　２５１　（１９７２））。Ｎａｒａｎｇらは
、トリエステル合成の開発により、この方法を拡張した
（Ｊ。

Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５０　
：　４５９２（１９’７５））。

これらの初期の方法は困難であり、また非常に時間を浪
費するものであった。ヌクレオチドを互いにうまく結合
して、縮合用の試薬を調製し、生成物を精製した後裔縮
合工程を行い、そしてＲ終ヌク、Ｌ／　オｆドシーケン
スを単離がっ精製するためには多くの時間を要した。

Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ　らは「亜リン酸トリエステル」法
の開示によってオリゴヌクレオチドの合成方法を改良し
た（　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　５ｏｃｉｅｔｙ　９
７　：　３２７８−７９（１９７５））。後からの、こ
の亜リン酸トリエステルへのアプローチがオリゴヌクレ
オチドの固相合成に発展した。固相または「ポリマー支
持体」合成法は、この方法が分離および精製工程を容易
にするという点で砥料である。硬質、非膨潤性シリカゲ
ルコロイドは支持体としてしばしば用いられる。固相法
においては、保護されたヌクレオチドヲ亜すン酸エステ
ル化剤、たとえはメトキンジクロロホスフィンと反応さ
せる。次に有られたヌクレオチド・ホスホモノクロリダ
＜　ト（ｐｂｏ８ｐｈｏｍｏｎ。

ｃｈ１６ｒｆｄｉｔｅ　）を支持体に結合し′ｆｃ第２
の保証ヌクレオチドと反応させる。テトラヒドロフラン
中ニヨウ累を用いる穏やかな酸化に引続いて、ルチジン
と水が亜リン酸エステルをリン酸エステルに転換する。

この方法は先行する方法よりもはるかに速いものでおる
が、反応を一７８℃で行い、そしてヌクレオチド対面リ
ン酸エステル化剤の割合を注意深く制御する場合におい
てすら、かなりの愈の３’−３’異性体が生成される。

他の欠点は、空気による加水分解および酸化に対する反
応性中間体の不安定性である。

Ｃａｒｕｔｈｅｒａらは、ヌクレオチド亜リン酸エステ
ルの「テトラゾリド」誘導体を導入することによってこ
の方法を変更した（　Ｊ、　Ａｍ、Ｃｈｅｍ、　Ｓａｃ
、　ｌ　Ｏ３：３１８５〜３１９１（１９８１））。し
かし、この中間体は非常に安定であるという訳ではなく
、またこの誘導体の調製は一７８℃で行うべき付加的な
工程をもたらすものである。

Ｃａｒｕｔｈｅｒｓらは、史に基本的な方法を、亜リン
酸エステル化剤であるメトキンジクロロホスフィンがＮ
　、　Ｎ’−ジアルキルアミノ誘導体に転換されるよう
に変更し、この場合Ｎ　、　Ｎ’−ジアルキルアミノ誘
導体はヌクレオチドと反応させたとき、かなり安定な「
ヌクレオチド亜リン酸エステル」を生成するものである
（　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２　
、　］−８５９〜６２（１９８１））。次に、この生成
物をテトラゾールの存在下ヌクレオチドを担時するシリ
カゲルと反応させる。この方法は以前のものに比べれば
高い安定性を示す中間体をもたらすものであるが、この
長所は出発材料の時間のかかる調製法によって相殺され
るものである。

すなわち、比較的簡単かつ容易に行える固体支持体上の
オリゴヌクレオチドを合成する方法であって、上記の問
題を回避するものの必要性は依然として継続している。

したがって本発明の目的は、容易かつ経済的に行うこと
ができ、また安定な生成物を得ることができるオリゴヌ
クレオチドの同相合成方法を開発することにある。

固体支持体を亜リン酸エステル化剤で処理し、引続いて
ヌクレオチドで処理する工程を伴う方法によシ固体支持
体上にオリゴヌクレオチドを合成することが見出された
。この方法は、亜リン彪エステル化剤でヌクレオチドを
処理し、引続いて支持体で処理する工程を伴う広く行わ
れている方法とは対照的である。

本発明は、主としてシリカゲルである固相支持体上にオ
リゴヌクレオチドを合成する新規な方法に関する。ヌク
レオチドは、その３′−ヒドロキシル基において固相支
持体に結合している。ヌクレオチドの５′−ヒドロキシ
ル基は保護基によって保護されている。このＴｈ＜　ｉ
基は除去され、そして遊離の５′−ヒドロキシルは二官
能性亜リン酸エステル化剤と反応する。次に、支持体を
保護されたヌクレオチドで処理する。亜リン酸エステル
基は酸化されてリン酸エステルとなり、そして５′−ヒ
ドロキシル保感基は第２のヌクレオチドから除去される
。次いで、同一サイクルの反応、すなわち亜リン酸エス
テル化剤による処理、他のヌクレオチドによる処理およ
び酸化によ°つて連釦延長が行われる。合成の最後では
、オリゴヌクレオチドを支持体からはがし、デブロッキ
ング（封鎖解除）し、そして石鯛する。この基本的な方
法は、デオキシリボオリゴヌクレオチドおよびリボオリ
ゴヌクレオチドの両方の合成に引継がせることができる
が、リボオリゴヌクレオチドの合成においては、５′−
および２′−ヒドロキシル基の両方が保護基によって保
護される。

この方法により、オリゴヌクレオチドー、中程度の温度
で合成することが可能でおる。この合成は単一の溶器内
で行うことが可能であり、そしてオートメーションに適
合させることが容易である。

更に大過剰の反応物質を用いることができ、そして反応
後に容易に回収できる。

本発明によれば、オリゴヌクレオチドを固相支持体上に
合成することができる。本明細書中で用いる用語「オリ
ゴヌクレオチド」は、リボオリゴヌクレオチドならびに
デオキシリボオリゴヌクレオチドの両方を含み、そして
「ヌクレオチド」はりボヌクレオチドおよびデオキシリ
ボヌクレオチドの両方を含むものとする。

本発明方法の第１工程においては、ヌクレオチドが固体
支持体に結合される。一般原則として、固体支持体はそ
の中に分子を自由に拡散させるが、試薬を非可逆的には
吸収しないものを本発明方法の支持体として用い得るも
のとする。好ましい支持体はシリカゲルである。この結
合（カンプリング）はヌクレオチドの３７−ヒドロキシ
ル基と支持体との間で有利に起る。この結合がヌクレオ
チドのこの箇所で起るのを確実にするために、ヌクレオ
チドの他のヒドロキシル基（デオキシリボヌクレオチド
の５′−ヒドロキシル基およびリボヌクレオチドの２′
−および５′−ヒドロキシル基）が保護基によって保護
される。５′−ヒドロキシル基の保護のために推奨され
る保護基はモノメトキントリチルまたはジメトキシトリ
チルであシ、ジメトキシトリチルが好ましい。リボヌク
レオチドの２′−ヒドロキシル基のために推奨される保
護基は、テトラヒドロキシルピラン基、０−ニトロベン
ジル基およびｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基である
（Ｏｈｔａｕｋａ、　Ｅ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ａ
ｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、＋　１００　：８２１（１
９７Ｂ　）　；０ｑｉｌｖｉｅ、　Ｋ、、　ａｔ　ａｌ
、、　Ｃａｎ　Ｊ、　Ｃｈｅｍ、　５７：２２３０（１
９７９））。

第１のヌクレオチドは、通常の方法にしたがって支持体
に結合させることができる。Ｍａｔｔｅｕｃ　：（１９
８１）；ならびにＣｈｏｗ、　Ｆ、、　ｅｔ　ａｌ、　
Ｔｈｅ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

９　：　２８０７（１９８１）参朋。ヌクレオチドが固
体支持体に結合されたのちに、５′−ヒドロキシル基を
保護している基が除去される。もしヌクレオチドがリボ
ヌクレオチドであれば、２′−ヒドロキシル基を保護し
ている基は、オリゴヌクレオチドの合成が完了したのち
にはじめて除去する方がイｊ利である。保護基は、オリ
ゴヌクレオチドが支持体から剥される工程の前、途中ま
たは後に除去してもよい。ヌクレオチドは、二官能性亜
リン酸エステル化剤で処理され、支持体に結合したヌク
レオチドホスホモノクロリダイトを形成する。いかなる
アルキルまたはアリルホスホジクロリダイトも亜リン酸
エステル化剤として使用できるが、メトキシジクロロホ
スフィンが好ましい。

この二官能性亜リン酸エステル化剤はヌクレオチドに直
接添加することもできるし、あるいはそれを最初にテト
ラゾール誘′棉体に転換することによって変性すること
も可能である。この方法によって亜リン酸エステル化剤
を変性することは２１固のＲ［’するオリゴヌクレオチ
ド銀量に生じ得る５′−５′架４１イｉ結合の生成を阻
止し得るものである。この種の架橋は固体支持体に対す
るヌクレオチドの配合が部長のある少量（約３０μモル
／２）では大きな問題とはならないと思われるが、ヌク
レオチドの配合がより大きくなれば、重大な問題となる
可能性がある。亜リン酸エステル化剤の転換はヌクレオ
チドに添加する以前にそれをテトラゾールと直接反応さ
せるか、またはヌクレオシドを亜リン酸エステル化剤で
処理する以前にテトラゾールをそのヌクレオチドに添加
することによって行うことができる。

ヌクレオチド右前すン酸エステル化剤のモル比は通宮約
ｌ：１０乃至約ｌ：２０、好ましくは約１：１５でるる
。反応混合物は急激に振とりおよび遠心分離して良く、
そして過剰のホスホジクロリダイトを除去する。全長「
６時間は一般に約２乃至約１０分間の範囲にある。

亜すン酸エステル化剤ｆ：戸トラゾールで変性する場合
、亜すン酸ニステール化剤対テトラゾールのモル比は通
常約ｌ：２乃至約Ｊ：１０であり、好ましくは約１：３
である。本発明の実施態様についての反応条件はａ常、
温度約０℃で全反応時間約１５分間である。

亜ＩＪ　ン９エステル化剤による処理に絖いて、支持体
を過剰の第２ヌクレオチドと反応させる。一般にこの反
応は約２７℃で約１０乃至１５分分間性させる。第２の
ヌクレオチドによる反応に引五プ１゜いて、ヌクレオチ
ド亜すン酸エステル間結合（ｉｎ−ｔｅｒｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅ　ｐｈｏｓｐｈｉｔｅ　Ｌ＋ｏｎｄｓ　）は慣
用の技法、たとえばテトラヒドロフランとルチジンの水
溶ｈＭ中のヨウ累によってリン酸エステルに酸化される
。

テトラヒドロフラン対ルチジン対水の割合は約２；］：
１であるのが好ましい。

次いで、第２ヌクレオチドの保護基を除去する。

所望によりダイマーは支持体からはがし、デブロッキン
グし、そして亨官製してもよい。この反応の収率は代表
的には約９５％である。

連頌延長は、上に概略述べた引続く同一サイクルの反応
、すなわち亜リン酸エステル化剤によるヌクレオチドの
処理、他のヌクレオチドによる処理、および亜リン酸エ
ステル基の酸化によって行えばよい。合成の最後では、
オリゴヌクレオチドを支持体からはがし、デブロッキン
グし、そして精製するのが有利である。

過ホ１］の亜リン酸エステル化剤を除去するための中間
の遠心分離工程は水分を反応混合物中に尋人する可能性
がある。そしてシリカおよび亜リン酸エステル化剤を含
有する反応混合物を遠心分離することは必ずしもＰｙｒ
”Ａの最終オリゴヌクレオチドの高収率を保証するもの
ではないことが見出された。従って、操作は遠心分離工
程を省略して、上に略述したように行えばよい。次いで
、オリゴヌクレオチドを慣用の融化技法によって酸化し
た後、支持体を有機溶剤で数回に亘り十分に洗浄すれば
よい。好ましい実施態様において、支持体は５゜トラヒ
ドロフランおよび最後にエーテルで洗浄する。前述のよ
うに、所望のダイマーの収率は約９０乃至１００％であ
る。このような高収率ｔよ、たとえ過剰の亜リン酸エス
テル化剤が存在したとしても、所望の５’−３’結合は
過剰のヌクレオチドを月１いることによって達成し得る
ことを示している。

更に、反応混合部よりの上澄みについての薄ｊ・ｎクロ
マトグラフィー（ＴＬＣ）分析は添加し／こヌクレオチ
ドの少なくとも約８０％がその１．ま残留していること
を示唆しており、従って所望によりこれを（ロ）収し、
かつ再使用することが可能で少る。

また他の態様においては、ヌクレオチドを連鎖が成長し
ているときに添加することによってオリゴヌクレオチド
合成する代りに、適切に保設されたオリゴヌクレオチド
ブロックを便って連鎖の９」Ｌ長を行うこともできる。

上述したように、先行技術によυ数丁された（Ｊ２点か
らすれは、この方法には多くの利点がβる。。

すなわち、この方法は何らの予備成形した出発拐料をも
必要とせず、また従来可能でおったのよすもはるかに穂
やかな温度で行うことができ、更に単一の容器で行うこ
とが可能である。この方法は捷た、オートメーションに
容易に適応させることができる。リボオリゴヌクレオチ
ドおよびデオキシリポオリゴヌクレオチドの両者を、こ
の方法で合成することができる。最後に、過剰のヌクレ
オチドを一度反応を行ってから回収できるので、これに
よって本方法は非附に経済的となる。

下記の実施例は本発明の方法を例示するものであるが、
これを限定しようとするものではない。

〔実施例■〕

Ａ、支持体の合成 シリカゲル（２１、Ｖｙｄａｃ　ＴＰ　−２０）がトリ
エトキシシリルグロビルアミン（３ｍ／りおよびトルエ
ン（１０ｍ）で処理され、この混合物が７時間還流され
た。この反応混合物の冷却後、シリカが濾過され、ピリ
ジン（３Ｘ２０ｍ）で洗滌された。

ついでトリメチルンリシルクロライド（２，２１ｎｅ）
が添加され５１反応が室温で４時間続けられた。シリカ
は濾過され、ピリジン（３Ｘ　１０　ｍｅ　）および工
ｆｋエーテル（３Ｘ　Ｉ　Ｏｍｅ　）で洗滌されたのち
、デシケータ中で乾燥された。このシリカは、下記の方
法で調製さ扛た５′−〇−ジメトキシトリチルー２′−
デオキシヌクレオチド−３’−０−コハク酸との反応の
ために使用された。

Ｂ、’　５’−０−）メトキシトリチル−２′−デオキ
シヌクレオチド−３′−〇−コノ・り酸の調製５′−〇
−ジメトキントリチルー２７−ゾオキシヌクレオチド（
２ｍモル）およびＮ　、　Ｎ’−ジメチルアミノピリジ
ン（２ｍモル）がピリジン（５０ｄ）中に溶解され、室
温で無水コ・・りｐＪ　（２，１ｍモル）が徐々に添加
された。４８時間の反応後、水（３ｍｅ　）が添加され
、ついでトルエンとの注意深い共沸によってピリジンが
除去された。残留物はジクロロメタン（２００ｍｇ）に
溶解され、クエン酸（４ｍモル）の水溶液（１００ｄ）
で抽出された。

この溶液は硫酸ナトリウム上で乾燥され、＠縮されたの
ち、残留物がジクロロメタン（５０ｒｎ！、）中に溶解
され、ヘキサン（３００ゴ）から沈降された。

Ｃ，５’−０−ジメトキシトリチル−２′−デオキシヌ
クレオチド−３’−０−コハク酸とアミノプロピルシリ
カとの反応 ピリジン（２ｒｎｌ）中のアミノプロピルシリカ（１グ
）がトリエチルアミン（０，１７ｒ）で数時間処理され
、余剰のトリエチルアミンがピリジンとともに蒸発によ
って注意深く除去された。このシリカにピリジン（２０
ｍ）中のチオキンヌクレオチド−３′−〇−コハクｆｌ
ｌ　（１ｍモル）およびジシクロへキシルカルボジイミ
ド（７ｍモル、１，５ｆ）が添加された。この混合物は
室温で２日間振とうされた。ついでシリカが濾過さｎ１
ピリジン（５０ゴ）で洗滌され、８−のピリジン中のシ
アン化ベンソイル（１７ｍモル、２１）と３時間反応さ
れた。このシリカは再び濾過され、ピリジン（３０ｄ）
およびエチルエーテル（４０ｍｌ）で洗滌されたのち乾
燥された。ヌクレオチドの導入は、アセトニトリル中で
既知ＢＬのシリカをベンゼンスルホン酸で処理したのち
、４９８ｎｍでの吸収を測定することによって決定され
た。

この方法は、シリカ支持体に第１のヌクレオチドを結合
させるために、以下の各実施例でも第１工程として適用
された。

〔実施例■〕

−の調製 デオキシチミジン（４μモル）を担持するシリカ（Ｖｙ
ｄａｋＴＰ、　１００ｍ９）を無水ピリジン（０，２ｍ
ｅ　）中のメトキシジクロロホスフィン（６０μモル）
により室温で処理した。反応混合物は急激に振とうし、
かつ遠心分離した（遠心分離を含む全反応時間は室温で
２分間てらった）。上澄みを除去し、そして１０倍過剰
の５７−ジメトキントリチルシテジンをピリジン（０，
２ｍ１）中でシリカＶＣ′ｊＩＪ５加した。室温で１０
分後、反応混合物を、テトラヒドロフラン／ルチジン／
水（２：にｌ）混合物中のヨウ素で酸化した。デプロン
キングした後、トリチル基およびＨＰＬＣの除去によっ
て詐出したこの反応の収率は９５％であることが判明し
た。

〔実Ｍｗｌシリ■　〕

−の訴製 デオキシチミジン（４μモル）を担持するシリカ（Ｖｙ
ｄａｋ　ＴＰ、１００　Ｔｑ）をピリジン（０，２ｍ１
）中のメトキシンクロロホスフィン（６０μモル）で０
℃、１０分間、または室温で１〜２分間処理した。次に
、ピリジン（０，２から０．２５ｍ）中の５′−ジメト
キシトリチルシチジン（２００μモル）を遠心分離なし
で反応混合物に添加した。室温で１０分後に、テトラヒ
ドロフラン／ルチジン／水（２：１：１）中のヨウ素に
よって酸化が行われた。次いで、シリカを５０％テトラ
ヒドロフラン水溶液、テトラヒドロ７ラン、そして最後
にエーテルで十分に洗滌した。収率は４９８μｍにおけ
るトリチルカチオンの吸収によって９５％と算出された
。更に、この収率をダブロンキング後の逆相ＨＰＬＣ分
析によシ確認した。（５０℃で、濃縮水酸化アルミニウ
ムにより、引続き８０％酢酸による処理、１２〜１６時
間。）ダイマーのピークはＩ（ＰＬＣ分析の間に１とめ
られ、またＵＶスペクトルはコンピュータ生成スペクト
ルによって大変良好でめることが認められた。

〔実施例■〕

他のダイマーを実施例■の方法により調製した。

各ダイマーの個別の収率を下衣に示す。

第　１　表 ｃｉ−ｅｐｃ　９６ ｄ−ＧｐＴ　８７ ｄ−ｃｐ’ｒ　９５ ｄ−ＧｐＧ　９８ ｃｌ−ＣｐＧ　８４ ｄ−ＧｐＡ　８１ 〔実施例Ｖ〕 Ｎ−ベンゾイルデオキシシチジン（４，２μモル）を担
持するノリ力（Ｖｙｄａｋ　ＴＰ、　１００　ｍＷ　）
およびテトラゾール（６３０μモル）をピリジンで共沸
混合させた。このシリカおよびテトラゾールをビＩ７シ
ン（０，３ｍ！り中のメトキシジクロロホスフィン（６
３μモル）によって０℃で１０分間処理した９次に、５
′−ジメトキシトリチルサイミジン（２１０μモル）を
この反応混合物に添加しｆｃ。室温で１５分後、反応混
合物をテトラヒドロ７ラン／ルチジン／水（２：１：１
）中のヨウ素により酸化した。シリカを５０％テトラヒ
ドロフラン水溶液、テトラヒドロフラン、そして最後に
エーテルで十分に洗滌した。収率は、４９８μｍにおけ
るトリチルカチオンの吸収により９８％であることが算
出された。

〔実施例■〕

の合成 Ｎ−ベンゾイルデオキシシチジン（４，２μモル）を担
持するシリカ（Ｖｙｄａｃ　ＴＰ、１００　ｍｇ）およ
び混合させた。次いで、このシリカおよびテトラゾール
をピリジン（０，’３　ｒｒｔ　）中１５倍ｉ１のメト
キシジクロロホスフィン（６３μモル）により０℃で１
０分間処理した。この反応混合物にピリジン（０，３ｄ
）中５０倍量の５７−シメトキシトリチル勺′イミジン
を添加した。室温で１５分後、テトラヒドロ７ラン／ル
チジン／水（２：１：１）Ｉ−１’のヨウ素によって酸
化を行った。次にシリカを実力′１！ＩｆＩｌ■におけ
るように洗なした。トリチル基をクロロホルム９５％ト
リクロロ酢酸で処理することｔξよって除去した。この
シリカをクロロ７Ｉ；ルムで」−分に洗滌した。

このサイクルを反仏して鎖をペンタマーシーケンスＴ−
Ｔ−Ｔ−Ｔ−ＣＶＣ延長サセす。試Ｗｌ　’）　ｌｉ！
１合は、全合成を通じて一定のま１としたが、ビレッジ
の容丸は必要に応じて調整した。

Ｔ　−Ｔ　−１’　−Ｔ　−Ｃペンタマーの合成１力す
る全収率は５３％であった。

〔実施例■〕

ムＩＬυ宏９　Ａ県か東ってオクタマーＣ−Ａ−Ａ−Ｇ
−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｇを実施例Ｖの方法にょシ合成し　／こ
。

〔実施例１１１　］ Ｎ−インブチルデオキシグアノシン（２，９μモル）を
担持するシリカ（Ｖｙｄａｋ　ＴＰ、１００’７１’？
　）　オよび４５倍ｈｔのテトラゾール（１３０μモル
）をピリジンで共沸混合させた。シリカを１５倍量のメ
トキシジクロロホスフィン（４３μモル）によって０℃
で１０分間処理する以前に、シリカ−テトラゾール混合
物に無水ピリジン（０，１，ｍｌ　）を臨加した。

ピリジン０．２ｍｌ中の５７−シメトキシトリテルーＮ
−ベンゾイルデオキシアデノシンを添加した。

室温で１５分後、テトラヒドロ７ラン／ルチジン／水（
２：１：１）中のヨウ素により酸化が行われた。次に、
このノリ力を５０％テトラヒドロフラン水浴液、テトラ
ヒドロフランおよびエーテルで洗滌した。収率は４９８
ｎｍにおけるトリチルカチオンのトリチル吸収に基づい
て約１００％であると４：ｌ−出された。

〔実施例ＩＸ　］ Ｎ−イソブチリルデオキシグアノシン（２，９μモル）
を担持するシリカ（Ｖｙｄａｋ　ＴＰ、　１００　Ｑ　
）をメトキシジクロロホスフィン（４３，５μモル）を
含有するピリジン０．２ｄおよびテトラゾール（１３０
マイクロモル）により０℃で１５分間処理した。この反
応混合物に、ピリジン０．２　ｍｌ中の５′−ジメトキ
シトリチル−Ｎ−ベンゾイルアデノシンを添加した。室
温で１５分後、この反応混合物を、上述の実施例に従っ
て酸化かつ洗滌した。この収率は約１００％であること
が算出１！れた。

〔実施例Ｘ〕

Ｎ−イソブチリルデオキシグアノシン（１４，５μモル
）を担持すルシリカ（Ｖｙｄａｋ　ＴＰ、５００　ｍ？
＞を無水ピリジン（２Ｘ１０ｍｇ）ｈよび無水ジエチル
エーテル（１０ｍｌ）で洗滌することにより乾燥した。

このシリカは更に、使用するまで真窒デシケータ中で乾
燥した。

４５倍世過剰のテトラゾール（６５２μモル）を０℃で
ピリジンｌ　ｍｌ中に溶解した。１５倍量過剰のメトキ
シジクロロホスフィン（２１７μモル）をテトラゾール
−ピリジン溶液に添加し、次いでこの溶液をシリカに添
加した。０℃で１５分後、ピリジン１．０ｍｌ中の、５
０倍量過剰の５’−０−（ジメトキシトリチル）−Ｎ−
ベンゾイルデオキシアデノシンを添加した。反応は室温
で１５分間継続し、次いでその反応混合物を上述の実施
例による方法に従って酸化および洗滌した。シリカはク
ロロホルム中５％トリクロロ酢酸により処理してンメト
キシトリテル基を除去する。クロロホルム、無水ピリジ
ンおよび無水エーテルで洗滌した後、この溶液は次のヌ
クレオチドの添加に対し準備が整ったことになる。

残りの１１個のヌクレオチドを上に示したように厳密に
添加した。全合成を通じて、試薬の量と製置は同一に保
持した。

収率の定性的評価は、各６、ミ加後に５％トリクロロ酢
酸処理により得られるオレンジ色に基づいて行われた。

全ての場合において、収率は仕方であった。

収率の定量的な算出はアセトニトリル中の２％ベンゼン
マルホン酸によって厳密に秤縫した量の７リカを処理し
、セして４９８ｎｍにおけるトリチルカチオンの吸収を
観測することにより行われた。

数段階における縮収率を下に示す。

２　１００ ５　９０ ９　７８〜８３ １３　６０〜７０ ％　許出１粕人シエネソクス・コーポレイション代理人
　弁理士　１）　沖　博　昭 同　四　石　橋　信　椎 間　同　加　藤　公　延

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　オリゴヌクレオチドを固体支持体上に合成する
   方法であって、 （ａ）　５’−ヒドロキシル基が保護基により保題され
   ている第１のチオキシリボヌクレオチドを、この第１の
   デオキシリボヌクレオチドの３′−ヒドロキシル基を介
   して上記固体支持体に結合させる工程、 （ｂ）前記第１のデオキシリボヌクレオチドの５７−ヒ
   ドロキシル基土の保護基を除去する工程、（ｃ）　ｆ４
   ｉｌ　記５’−ヒドロキシル基を二官能性前リン酸エス
   テル化基と反応させる工程、 （ｄ）　５’−ヒドロキシル基が保護基により一森獲さ
   れている第２のデオキシリボヌクレオチドを、この第２
   のデオキシリボヌクレオチドの３′−ヒドロキシル基を
   前記第１のチオキシリボヌクレオチドにカップリングさ
   せることによって前記支持体に結合させる工程、 （ｅ）前記両デオキシリボヌクレオチド間に形成された
   亜リン酸エステル結合を酸化する工程、および （ｆ）前記工程（ｂ）から（ｅ）を所望数のヌクレオチ
   ドが前記支持体上に添加されるまで繰り返す工程、を備
   えた方法 （２）　リボオリゴヌクレオチドを固体支持体上に合成
   する方法であって、 （ａ）　２’−ヒドロキシル基および５′−ヒドロキシ
   ル基がそれぞれ保護基によって保護されている第１のり
   ボヌクレオチドを、この第１のりボヌクレオチドの３′
   −ヒドロキシル基を介して前記固体支持体に結合させる
   工程、 （ｂ）前記第１のりポヌクレオチドの５′−ヒドロキシ
   ル基土の保護基を除去する工程、 （Ｃ）前記５′−ヒドロキシル基を二官能性前リン酸エ
   ステル化基と反応させる工程、 （ｄ）　２’−ヒドロキシル基および５′−ヒドロキシ
   ル基がそれぞれ保護基により保護されている第２のりボ
   ヌクレオテドを、この第２のりボヌクレオチドの３７−
   ヒドロキシル基を前記第１のりボヌクレオチドの５′−
   ヒドロキシル基にカップリングさせることによって前記
   支持体に結合させる工程、（ｅ）前記両リボヌクレオチ
   ド間に形成された亜リン酸エステル結合を酸化する工程
   、 （ｆ）所望数のりボヌクレオテドが前記支持体に添加さ
   れるまで前記エフ、Ｂ（ｂ）から（ｅ）を繰り返す工程
   、および （ｇ）前ａ己すボオリコ゛ヌクレオチドの２′−ヒドロ
   キシル基から前記保護基を除去する工程、からなる方法
   。 （３）前記工程（Ｃ）の前記二官能性亜リン酸エステル
   化剤が、前記デオキシリボヌクレオチドまたは前記リボ
   ヌクレオチドの前記５′−ヒドロキシル基と反応する前
   に、テトラゾールの訪導体に転換される特許請求の範囲
   第１項または第２項記載の方法。 （４１ＡｉＪ　記デオキシリボヌクレオチドまたは前記
   リボヌクレオチドが、前記二官能性亜リン酸エステル化
   剤と反応する前に、テトラゾールと混合される特許請求
   の範囲第１項または第２項記載の方法。 （５）前記固体支持体がシリカゲルである特許請求の範
   囲第１項または第２項記載の方法。 （６）前記固体支持体がシリカゲルでおる特許請求の範
   囲第３項記載の方法。 （力　前記５′−ヒドロキシル基のための保護基がモノ
   メチルトリチル基またはジメトキシトリチル基である特
   許請求の範囲第１項または第２項記載の方法。 （８）前記２′−ヒドロキシル基のための保勤基が、テ
   トラヒドリルピラン基、０−ニトロベンジル基およびｔ
   ｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基からなる群から選ばれ
   ている特許請求の範囲第２項記載の方法。 （９）前記二官能性亜リン酸エステル化剤がアルキルま
   たはアリールホスホジクロリダイトである特許請求の範
   囲第１項または第２項記載の方法。 （［０）前記二官能性亜リン酸エステル化剤がメトキシ
   ジクロロホスフィンである特許請求の範囲第１項または
   第２項記載の方法。 ａυ　ヌクレオチド右前すン酸エステル化剤のモル比が
   約１：１０から約１：２０の範囲である特許請求の範囲
   第１項または第２項記載の方法。 （１２）　ヌクレオチド右前すン酸エステル化剤のモル
   比が約１：１５である特許請求の範囲第１項または第２
   項記載の方法。 （１３）亜すン酸エステル化剤対テトラゾールのモル比
   が約１：２から約１＝１０の範囲でおる特許請求の範囲
   第３項記載の方法。 圓　亜すン酸エステル化剤対テトラゾールのモル比が約
   ｌ：２から約１：１０の範囲である特許請求の範囲第４
   項記載の方法。 （１５）亜すン酸エステル化剤対テトラゾールのモル比
   が約１：３である特許請求の範囲第３項記載の方法。 （１Ｇ）　亜すン酸エステル化剤対テトラゾールのモル
   比が約１−３である特許請求の範囲第４項記載の方法。 （１７）前記各反応が約０℃から約２７℃で行われる特
   許請求の範囲第１項または第２項記載の方法。 （１８１前記各反応が０℃で行われる特許請求の範囲第
   １項または第２項記載の方法。 α９　過剰のヌクレオチドが抽出法により回収でき、そ
   して再使用できる特許請求の範囲第１項または第２項記
   載の方法。 （社）個々に保護されたデオキシリボヌクレオチドまた
   はりボヌクレオチドに代えて、適切に保護されたオリゴ
   ヌクレオチドのプロッタが使用される特許請求の範囲第
   １項または第２項記載の方法。 圓　前記デオキシリボオリゴヌクレオチドまたは前記リ
   ボオリゴヌクレオチドを前記支持体から剥離し、ついで
   前記デオキシリボオリゴヌクレオチドまたは前記リボオ
   リゴヌクレオチドをデブロッキングおよび精製する工程
   をさらに備えた特許請求の範囲第１項または第２項記載
   の方法。