IT8467150A1 - Procedimento per la produzione di triptofano - Google Patents

Description

DOCUMENTAZIONE

RILEGATA

''DESCRIZIONE dell ' invenzione industriale dal titolo :

</ -V "Procedimento per la produzione di triptofano" CASE 347-6

di: KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD., nazionalit? giapponese,

6-1, Ohtemachi Itchome, Chiyoda-ku, Tokyo (Giappone).

Inventori designati: Akio OZAKI, Ryoichi KATSUMATA, Tetsuo

OKA .

Depositata ?1 = 1 6 FEB. 1984 67 1 50 A/ 84

* * * * *

RIASSUNTO

V? Viene descritto un procedimento per la produzione di

? fp > ( ? r P

triptofano trasformando un microorganismo ospite appartenente al genere Corynebacterium o Brevibacterium con un DNA

ricombinante di un frammento di DNA contenente un gene coinvolto nella biosintesi del triptofano ed un vettore DNA,

coltivando il trasformante in un mezzo nutritivo, accumulando il triptofano nel mezzo di coltura e ricuperando da questo il triptofano.

*****

Sfondo dell1invenzione

Per la produzione diretta di triptofano mediante fermentazione, sono conosciuti procedimenti impiegando ceppi mutan-? ti che richiedono nutritivi e/oppure resistenti ad analoghi

del triptofano dei batteri appartenenti al genere Corynefi bacterium, Brevibacterium e simili (pubblicazioni di brevetto giapponese N.ri 4505/72 e 19037/76).

?

/HO

CE ? GA/mg

Non ? stato riportato alcun esempio di espressione

di un gene desiderato in un microorganismo ospite appartenen?

te al genere Corynebacterium o Brevibacterium introducendo

in tale microorganismo ospite un DNA ricombinante contenente

tale gene e vettore desiderato, uno dei quali ? esogeno

ad un microorganismo ospite. Nella tecnologia del DNA ricom?

binante impiegando un microorganismo appartenente .al genere

Corynebacterium o Brevibacterium come ospite, ? necessario

costruire vettori autonomamente replicabili in questi micro-

organismi, aventi marcatori selezionabili ed utili per la

? clonazione dei geni desiderati, e stabilire un sistema di

i trasformazione efficiente. Inoltre, risultano necessari i 1 procedimenti per superare le varie barriere contro l'espres?

sione del DNA ricombinante esogeno.

I presenti inventori hanno costruito vettori di plasmi-

di autonomamente replicabili in un microorganismo appartenen?

te al genere Corynebacterium o Brevibacterium ed aventi

marcatori selezionabili ed adeguate posizioni di clonatura,

ed hanno sviluppato un sistema di trasformazione estremamen?

te efficiente (domande di brevetto giapponese pubblicate

non esaminate No. 183799/82, 186492/82, 186489/82 e 105999/

83). Inoltre, i presenti inventori hanno trovato che i vetto?

ri dei plasmidi sono utili per esprimere un gene esogeno

in un microorganismo ospite e per aumentare la- produttivit?

di amminoacidi mediante legamento di un frammento di DNA

contenente un gene esogeno coinvolto nella biosintesi di

amminoacidi, quali acido glutammico e lisina, ai vettori

dei plasmidi secondo i procedimenti nella tecnologia del

DNA ricombinante (brevetto statunitense No. 4.237.224 e

"Methods in Enzymology" 68, Recombinant DNA, edito da Ray

/

Wu, Academic Press, 1979) e per trasformare il Corynebacte-

rium glutamicum L-22 o suoi derivati impiegando i procedimen?

ti di trasformazione descritti nella domanda di brevetto

giapponese pubblicata non esaminata No. 126789/83.

Inoltre, i presenti inventori hanno trovato che un

r microorganismo preparato con lo stesso procedimento ha acqui?

sito una produttivit? accresciuta di triptofano.

Sommario dell'invenzione

La presente invenzione si riferisce ad un procedimento

per la produzione di triptofano mediante un nuovo metodo

di espressione di un gene. Pi? specificamente, la presente

invenzione ? un procedimento per la produzione di triptofa?

no trasformando un microorganismo ospite appartenente al

genere Corynebacterium o Brevibacterium con un DNA ricombi?

nante di un frammento di DNA contenente un gene coinvolto

nella biosintesi del triptofano ed un DNA vettore, coltivan?

do il trasformante in un mezzo nutritivo, accumulando il

triptofano nel mezzo di coltura e ricuperando da questo

il triptofano.

Descrizione dell'invenzione

La presente invenzione provvede un procedimento per

la produzione di triptofano coltivando in un mezzo un trasformante il quale ? ottenuto trasformando un microorganismo

appartenente al genere Corynebacterium o Brevibacterium

con un DNA ricombinante di un frammento di DNA contenente

un gene coinvolto nella biosintesi del triptofano ed un

DNA vettore.

Come frammento di DNA contenente il gene impiegato

nella presente invenzione, si impiega il frammento di DNA ??

;* contenente un gene coinvolto nella biosintesi del triptofano

derivato da eucarioti, procarioti, virus, batteriofagi o

plasmidi Come gene derivato da procarioti, viene preferibilmente impiegato il gene derivato da un batterio appartenen-S

< te al genere Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium,

Bacillus, Staphylococcus o Serratia e responsabile della

biosintesi del triptofano oppure del metabolismo relativo

alla biosintesi.

Il vettore impiegato nella presente invenzione dovrebbe

replicarsi autonomamente in cellule del microorganismo ospite. Preferibilmente, vengono impiegati plasmidi isolati

da microorganismi appartenenti al genere Corynebacterium

dai presenti inventori o loro derivati, quali pCGl (domanda

di brevetto giapponese pubblicata non esaminata No. 134500/

82), pCG2 (domanda di brevetto giapponese pubblicata non

esaminata No. 35197/83), pCG4 (domanda di brevetto giapponese pubblicata non esaminata No. 183799/82), pCE52, pCE53,

pCE54, pCGll e pCBIOI.

Microorganismi recanti i seguenti plasmidi sono stati

depositati presso il "Fermentation Research Institute, Agency

of Industriai Science and Technology Ibaraki, Giappone e"

la. "American Type Culture Collection", Rockville, Maryland,

U.S.A., con i seguenti numeri di iscrizione. I mm Plasmide FERM P- ATCC

\ pCGl 5865 31808

pCG2 5954 31832

pCG4 5939 31830

pCE54 39019 ;i pCGll 39022

pCBIOI 39020

Tra i precedenti plasmidi, sono maggiormente preferiti

pCE52, pCE53. I plasmidi pCE52 e pCE53 possono essere preparati nel modo seguente.

Il plasmide pCGl viene isolato dalle cellule di Corynebacterium glutamicum 225-57 {FERM P-5865, ATCC 31808)

con il metodo descritto nella precedente domanda ed il plasmide pGA22 viene isolato dalle cellule coltivate di Escherichia coli con il metodo di An. Il pCGl con una posizione

n

unica BglII viene linearizzato con enzima di restrizione

BglII e il pGA22 con due posizioni BamHI vengono parzialmen-Z'HO

te digeriti con BamHI. Le estremit? coesive dei due plasmidi

vengono rinvenute e legate con ligasi di DNA di fago T4

(ligasi T4) per formare una molecola composita. La selezione

dei plasmidi ricombinanti dalla miscela di legame viene

/

effettuata mediante trasformanti di isolamento del genere

Corynebacter ium o Brevibacterium sulla base delle resistenze

ai farmaci derivate da pGA22 e analizzando quindi i plasmidi

nei trasformanti.

La trasformazione con la miscela di DNA legata viene

effettuata impiegando protoplasti del genere Corynebacterium a e=-? o Brevibacterium , ed il metodo descritto nella domanda di

3 brevetto giapponese pubblicata non esaminata No. 186492/82 G ? P

e 186489/82. ;

Tra i geni responsabili per la resistenza ai farmaci

derivata da pGA22, vengono impiegati per la selezione quelli

eccetto che il gene di resistenza che ? inattivato per inser?

zione. I trasformanti vengono ricuperati come una colonia

rigenerata su un mezzo di agar ipertonico contenente 0,4 -

1,6/Ug/ml di tetraciclina (Tc), 2,5 - 5^ug/ml di cloramfeni-

colo (Cm) o 100-800/Ug/ml di canamicina (Km) che non permet?

te l'inversione a cellule normali dei protoplasti che non

vengono trattati con la miscela di legame. In alternativa,

i trasformanti vengono rigenerati in modo non selettivo

su un mezzo di rigenerazione, e le cellule risultanti vengo-'

no raschiate e risospese, ci? seguito dall'isolamento delle

celle cresciute su un mezzo di agar contenente un farmaco in

una concentrazione in cui le cellule normali recipienti non

possono crescere , cio? generalmente 0,5 - 4 di Tc ,

/

2 - 15/Ug/ml di Cm 2 - 25/Ug/ml di Km. Alcuni dei trasfor?

R.

manti resistenti alla tetraciclina ( , al cloramfenicolo

R R

(Cm ) od alla canamicina (Km ) sono simultaneamente dotati

di altre resistenze a farmaci derivate dal plasmide pGA22.

I DNA del plasmide in questi trasformanti possono esse-

re isolati da cellule coltivate dei trasformanti e purifica-

ti secondo i metodi descritti nelle domande di brevetto

?r giapponese pubblicate non esaminate N.ri 134500/82 e 186489/

82. Le strutture dei DNA possono essere determinate digeren-

doli con varie endonucleasi di restrizione ed analizzando

i frammenti di DNA mediante elettroforesi in gel di agaro-

sio. I plasmidi isolati dai trasformanti vengono definiti

pCE52 e pCE53.

Il pCE52 ed il pCE53 hanno un peso molecolare di circa

10,9 Kb e posizioni di segmentazione per EcoRI, Sali, Smal

e Xhol. Mentre il pCE52 fornisce i fenotipi di Cm e Km ,

R *H R

il pCE53 fornisce fenotipi di Tc , Cm e Km . Poich? la

posizione di segmentazione per Xhol ? presente nel gene

Km , ? possibile la selezione mediante inattivazione per

inserzione (prevenzione della espressione di un gene median-

te inserzione nel gene di un frammento di DNA). Il ricupero

dei plasmidi dai ceppi viene effettuato secondo i metodi

descritti nelle domande di brevetto giapponese pubblicate

non esaminate No. 134500/82, 1837S9/82 e 35197/83.

La preparazione di un DNA ricombinante di un vettore

DNA con un frammento di DNA contenente un gene viene effettuata con una tecnologia tradizionale di DNA ricombinante

in vitro, ad esempio segmentazione e legame di un DNA donatore contenente un gene desiderato con un vettore DNA (vedere

domanda di brevetto giapponese pubblicata non esaminata No.

126789/83 e brevetto statunitense 4.237.224}.

La reazione di ligasi fornisce ricombinanti contenenti r 7? geni diversi dal gene desiderato. Il DNA ricombinante

desiderato pu? essere ottenuto trasformando direttamente

un microorganismo del genere Corynebacterium o Brevibacterium

con la miscela di DNA legata, selezionando i trasformanti

aventi il fenotipo derivato dal gene desiderato ed isolando

il DNA ricombinante desiderato dalle cellule coltivate dei

trasformanti. Invece di clonare il gene desiderato diretta

mente in un microorganismo del genere Corynebacterium o Brevibacterium, il gene desiderato pu? essere clonato impiegando un altro sistema ospite-vettore, quale Escherichia coli,

Allora, questo viene ridonato in vitro in un vettore del

genere Corynebacterium o Brevibacterium per trasformare

questi microorganismi e vengono selezionati come detto sopra

trasformanti contenenti il plasmide ricombinante desiderato.

I seguenti riferimenti sono utili per la costruzione

del DNA ricombinante:

S. N. Cohen ed al., brevetto statunitense No.4.237.224;

Idenshi Sosa Jikkenho, edito da Yasuyuki Takagi, stampato da Kodansha Scientific (1980);

"Methods in Enzymology", 68, "Recombinant DNA" edito

da Ray Wu, Academic Press, 1979;

domanda di brevetto giapponese pubblicata non esaminata

No. 126789/83.

Microorganismi appartenente al genere Corynebacterium ? o Brevibacterium e che sono competenti per incorporare DNA,

?

* ' possono essere impiegati come microorganismi ospiti nella

presente invenzione. Preferibilmente, vengono impiegati

microorganismi sensibili al lisozima descritti nelle domande

/

di brevetto giapponese pubblicate non esaminate No. 186489/82

e 56678/83. I seguenti sono esempi di un microorganismo

ospite adatto.

Numero di iscrizione

FERM P- ATCC Corynebacterium glutamicum L-15 5946 31834 Corynebacterium glutamicum LA-105 13868 Corynebacterium herculis L-103 5947 31866 Brevibacterium divaricatum L-204 5943 31867 Brevibacterium lactof ermentum L-312 5949 31868

La trasformazione dei microorganismi ospiti con DNA

r? ricombinanti viene effettuata con le operazioni seguenti: I.

1) preparazione dei protoplasti di cellule ospiti; '?,.??>

2) trasformazione dei protoplasti con un DNA ricombinante;

3) rigenerazione dei protoplasti a cellule normali e sele-

zione di un trasformante.

Queste operazioni vengono descritte in dettaglio in

seguito

1. Preparazione di protoplasti di cellule ospiti.

La preparazione di protoplasti viene effettuata colti

vando un microorganismo in condizioni che lo rendano sensibi-

li al lisozima, un enzima litico, e trattando le cellule

coltivate con lisozima in una soluzione ipertonica per elimi-B r 3C nare la parete della cellula. Allo scopo di rendere le cellu-

le microbiche sensibili al lisozima, vengono impiegati rea-

genti che inibiscono la sintesi delle pareti delle cellule

batteriche. Per esempio, vengono ottenute cellule microbiche

sensibili al lisozima aggiungendo, durante la fase di cresci

ta logaritmica, una quantit? di penicillina che non inibisce

o sub-inibisce la crescita e continuando quindi la coltiva-

zione per parecchie generazioni.

Per la coltura, si pu? impiegare qualsiasi mezzo in

cui il microorganismo possa crescere. Per esempio, vengono

impiegati un mezzo nutritivo NB (pH 7,2) costituito da 20

g/1 di brodo in polvere e 5 g/1 di estratto di lievito,

ed un mezzo semisintetico SSM (pH 7,2) costituito da 10

g/1 di glucosio, 4 g/1 di NH^Cl, 2 g/1 di urea, 1 g/1 di

estratto di lievito, 1 g/1 di KH2P04> 3 g/1 di ^ ???^, 0,4

g/1 di MgCl^.6H^0, 10 mg/1 di FeSO .7H 0, 0,2 mg/1 di MnSO .

(4-6)H 0, 0,9 mg/1 di ZnSO .7H 0, 0,4 mg/1 di CuSO .5H 0,

2 4 2 4 2

0,09 mg/1 di Na B 0 .10H 0, 0,04 mg/1 di (NH ) Mo 0 .4H 0,

247 2 46 7 24 2

30/Ug/l di biotina e 1 mg/1 di cloridrato di tiamina. Le

cellule microbiche vengono inoculate nel mezzo e la coltura

viene effettuata con agitazione. La densit? ottica (OD)

del mezzo di coltura a 660 nm viene controllata con un colo?

rimetro e si aggiunge penicillina, quale penicillina G,

in uno stadio iniziale della fase di crescita logaritmica

(OD: 0,1-0,4) ad una concentrazione di 0,1-2,0 U/ml. La

? r c coltura viene proseguita ad un valore OD di 0,3-0,5, e quindi

le cellule vengono raccolte e lavate con mezzo SSM. Le cellu?

le lavate vengono risospese in un adatto mezzo ipertonie o,

quale mezzo PFM (pH 7,0-8,5) in cui saccarosio 0,4M e MgCl^.

??^? 0,01M vengono aggiunti a mezzo SSM diluito due volte,

e mezzo RCG (pH 7,0-8,?) costituito da 5 g/1 di glucosio,

5 g/1 di idrolizzato di caseina, 2,5 g/1 di estratto di

lievito, 3,5 g/1 di I^HPO^, 1,5 g/1 di KH PO , 0,41 g/1

di MgCI .6H 0, 10 mg/1 di FeSO .7H 0, 2 mg/1 di MnSO .(4-6)-2 2 4 2 4

H O, 0,9 mg/1 di ZnSO .7H 0, 0,4 mg/1 di CuSO .5H 0, 0,09

2 & 4 2 4 2

mg/1 di Na B 0 .10H 0, 0,04 mg/1 di (NH ) Mo 0 ,4H 0, 30

? & 2 4 7 2 4 6 7 24 2

ug/1 di biotina, 2 mg/1 di cloridrato di tiamina e 135

/

g/1 di succinato di sodio o di mezzo RCGP il quale ? costi?

tuito da mezzo RCG e 3% di polivinil-pirrolidone. Alla so?

spensione di cellule, si aggiunge lisozima ad una concentra?

li.

zione finale di 0,2-10 mg/ml, e la miscela viene lasciata

reagire ad una temperatura di 30-37?C. La formazione di

protoplasti procede con il tempo e viene controllata sotto

un microscopio ottico. Il periodo richiesto per la conversio-

ne della maggior parte delle cellule in protoplasti dipende

dalle concentrazioni della penicillina impiegata per la

sensibilizzazione al lisozima e dalla quantit? di lisozima

impiegata. Il periodo ? di 3-24 ore nelle condizioni citate

? sopra.

Poich? i protoplasti formati vengono distrutti in condi? ? fa t? t zioni ipotoniche, l'entit? della formazione di protoplasti

? determinata indirettamente dal numero di cellule normali

che sopravvivono in condizioni ipotoniche. Generalmente, :s

il rapporto di cellule normali sopravvissute viene mantenuto

al disotto di 10 per cellula normale trattata con lisozima.

I protoplasti preparati come sopra hanno la capacit?

di formare colonie (rigenerazione) su un adatto mezzo di

agar ipertonico. Come mezzo di rigenerazione, viene preferi-

bilmente impiegato un mezzo nutritivo, un mezzo semisinteti-

co od un mezzo sintetico contenente vari amminoacidi, il

quale contiene succinato di sodio 0,3-0,8M e 0,5-6% di poli-

vinil-pirrolidone con un peso molecolare da 10.000 a 40.000

Generalmente , si impiega un mezzo di agar RCGP semisintetico

(pH 7,2) in cui al mezzo RCG vengono aggiunti 3% di polivi-

nil-pirrolidone (peso molecolare 10.000} e 1,4% di agar.

La rigenerazione viene effettuata ad una temperatura da

25 a 35?C. Il tempo di coltivazione richiesto per la rigene-

razione di protoplasti dipende dal ceppo impiegato, ma gene-

ralmente in 10-14 giorni si possono prelevare colonie. L'ef-

ficienza della rigenerazione di protoplasti sul mezzo RCGP

dipende pure dal ceppo impiegato, dalle concentrazioni della

penicillina aggiunta durante la coltura e dalla concentrazio-

ne del lisozima impiegato. L'efficienza ? generalmente di

-2 -4

10 - 10 cellule per cellula normale trattata con lisozi n gm?M m*i

ma .

m??> t 2. Trasformazione dei protoplasti con un DNA ricombi-

nante.

?n L 1introduzione di un DNA ricombinante nei protoplast i

viene effettuata mescolando i protoplast i ed il DNA in

una soluzione ipertonica che protegge i protoplasti, e ag?

giungendo alla miscela polietilenglicol (PEG, peso molecola-

re medio: 1.540-6.000) oppure alcool polivinilico (PVA,

grado di polimerizzazione: 500-1.500) ed un catione di metallo divalente il quale stimola il prelievo di DNA. Come agen-

te stabilizzante per le condizioni ipertoniche, vengono

pure impiegati quelli generalmente usati per proteggere

i protoplasti di altri microorganismi, quali saccarosio

e succinato di sodio. PEG e PVA possono essere impiegati wu/

ad una concentrazione finale di 5-60% e 1-20%, rispettivamen-++ + +

te. I cationi di metalli divalenti, quali Ca , Mg , Mn 'osiua

Ba e Sr , vengono efficacemente impiegati da soli oppure

in combinazione ad una concentrazione finale di 1-100 mM.

La trasformazione viene effettuata a 0-25?C.

3. Rigenerazione? dei protoplasti a cellule normali

e selezione di un trasformante.

La rigenerazione dei protoplasti trasformati con un

DNA ricombinante viene effettuata nello stesso modo citato

sopra distribuendo i protoplasti su un mezzo di agar ipertonico, quale mezzo RCGP, contenente succinato di sodio e

polivinil-pirrolidone ed incubando ad una temperatura in

f? 5? cui le cellule normali possono cresere, generalmente da

25 a 35?C. I trasformanti vengono ottenuti selezionando

il fenotipo derivato dai DNA donatori. La selezione pu?

essere effettuata simultaneamente con la rigenerazione di

un mezzo di agar ipertonico oppure pu? essere effettuata

su un mezzo di agar ipotonico dopo reversione non selettiva

in cellule normali su un mezzo di agar ipertonico.

Nel caso dei ceppi sensibili a lisozima descritti come

i microorganismi ospiti preferiti per la clonazione, la

trasformazione pu? essere effettuata mediante le operazioni

descritte in (1) - (3) eccetto che le cellule coltivate

vengono direttamente trattate con lisozima senza precedente

trattamento con penicillina. In tal caso, i trasformanti

-2 -4

vengono ottenuti con una efficienza da 10 a 10 per cellu?

la rigenerata.

L'espressione fenotipica del DNA ricombinante viene

effettuata accrescendo i trasformanti in un mezzo nutritivo

tradizionale. Adatti reagenti possono essere aggiunti al

mezzo a seconda dei fenotipi previsti dai geni sul DNA ricombinante.

' Il trasformante cos? ottenuto viene coltivato in un

modo tradizionale impiegato nella produzione di triptofano

mediante fermentazione. Cio?, il trasformante viene coltivato in un mezzo tradizionale contenente sorgenti di carbonio,

sorgenti di azoto, materiali inorganici, amminoacidi, vitami ?i ? ?? ? ne, ecc., in condizioni aerobiche, con regolazione della ? temperatura e del pH. Cos?, il triptofano accumulato nel

mezzo viene ricuperato.

Come sorgente di carbonio, si possono impiegare vari

carboidrati, quali glucosio, , fruttosio, saccaro-,sortitolo, mannitolo, alcool di zucchero, glicero?o, sio, maltosio, mannosio,/amido, idrolizzato di amido e melasse . vari acidi organici, quali acido piruvico,

acido fumarico, acido lattico , acido acetico,e acido gluconico, e alcool . inferiori, quali etanolo.

Come sorgente di azoto, sono adatti ammoniaca, vari

sali di ammonio inorganici od organici, quali cloruro di

ammonio, solfato di ammonio, carbonato di ammonio e acetato

di ammonio, urea, e sostanze organiche azotate, quali peptone, NZ-ammina, estratto di carne, estratto di lievito, liquore di grano, idrolizzato di caseina, farina di pesce o il

suo prodotto digerito,

s idrolizzato di crisalide.

Come materiali inorganici, si possono impiegare fosfato

di acido monopotassico, fosfato acido dipotassico, solfato

di magnesio, cloruro di sodio, solfato ferroso, solfato

di manganese e carbonato di calcio. Pu? essere possibile

non aggiungere vitamine e amminoacidi richiesti per la crescita dei microorganismi, purch? questi vengano forniti

con altri componenti citati sopra.

?

La coltivazione viene effettuata in condizioni aerobi-< che con agitazione o aerazione-agitazione. La temperatura

?r di coltura ? preferibilmente da 20 a 40?C. Il pH del mezzo

durante la coltura viene mantenuto intorno alla neutralit?.

La coltura viene proseguita sino a che si sia accumulata

una quantit? considerevole di triptofano, generalmente per

2-5 giorni.

Completata la coltura, le cellule vengono estratte

ed il triptofano viene ricuperato dal liquido di coltura

con mezzi tradizionali, quali trattamento con carbone attivo

o con resina scambiatrice di ioni.

Nonostante l'elevata similarit? nelle caratteristiche

microbiologiche, i cosiddetti microorganismi che producono

acido glutammico, i quali producono acido glutammico in

forti quantit?, vengono classificati in varie specie ed

anche in differenti generi, quali Corynebacterium e Brevibacterium, il che ? probabilmente a causa della loro impor

tanza industriale. Tuttavia, ? stato messo in evidenza che

questi microorganismi dovrebbero appartenere ad una specie;

a causa della composizione quasi uguale degli amminoacidi

nella parete della cellula e della composizione di base

nei DNA. Recentemente, ? stato riportato che questi microorganismi hanno il 70-80% o pi? di omologia in DNA, il che

indica che questi microorganismi sono strettamente correlati.

Vedere, ad esempio, Komatsu, Y.: "Report. of th? Fermentation

Research Institute", 55, 1 (1980), e Suzuki K., Kaneko T.

e Komagata K., "Int. J. Syst. Bacteriol 31, 131 (1981).

r Nella presente descrizione, l'utilit? della presente l invenzione viene illustrata impiegando derivati di Corynebacterium glutamicum L-22 come microorganismi ospiti a causa

delle restrizioni sugli esperimenti 'della tecnologia di

DNA ricombinante in Giappone. Tuttavia, in considerazione

dei fatti citati sopra, ? evidente che l'utilit? della presente invenzione ? applicabile a tutti i microorganismi

che producono acido glutammico. Allo scopo di mantenere

stabilmente le molecole di DNA ricombinante ed esprimere

il DNA in questa specie, leggere differenze in propriet?

dei microorganismi ospiti quali omologia nel DNA sono trascurabili ed ? sufficiente che i microorganismi ospiti permettano la replicazione autonoma di plasmidi e l'espressione

di geni su di questi. Che questi microorganismi abbiano

CO^-ff tali, capacit?, ? evidente dal fatto che il plasmide pCG4 ?a

che ? staio isolata dal .Corynebacterium glutamicum 225-250

r\ m

ed ha un. gene Sm /Soec (domanda di brevetto giapponese

pubblicata non esami?.ata :No. 183799/82) pu? replicarsi in

microorganismi appartenermi- al genere Corynebacterium o Brevibacterium e pu? essere espresso il gene responsabile per

la resistenza (domsmia idi brevetto giapponese pubblicata

non esaminata No. 1SE-?-92J-32). Perci?, la presente invenzione

? applicatile a tutine i microorganismi che producono acido

*

glutammico, compresi d miccroorganismi appartenenti al genere

Corynebactarium o Br^rjbgmterium, come pure al Corynebactef * 7 t * rium glutamicum.

Alcune forme ?zi am uazione specifiche della presente

invenzione vengono illisnrats dai seguenti esempi rappresen S tativi.

Esempio 1

Clonandone del gens sintetasi dell ' acido antranilico

di Brevibetrierium flsarm --VITCC 14067 e produzione di triptofano in CorynjeDacteriunr. ;Tmzaraicum .

1 ) Preparazione eri ZDNA cromosomale e di plasmide pCE53.

Il D0?= cromosoraale rii Brevibacterium flavum ATCC 14067

? stato preparato conre segue .

Una coltura di .seme in mezzo NB ? stata inoculata in

400 mi di un mezzo; sennisintetico SSM ( pH 7 , 2) costituito

da 20 g/I ?i glucosio:, HD g/1 di ^ s/l urea ?

1 g/1 di estratto eri liisvito , 1 g/1 di KH^PO^ , 0 , 4 g/1 di

MgCl^.6H^0, 10 mg/1 di FeSO^.7H 0, 0,2 mg/1 di MnSO^.{4-6)H^O^

?0,9 mg/1 di ZnSO^.71^0, 0,4 mg/1 di CuSO^.51^0, 0,09 mg/1

di ?32?40?.10?20, 0,04 mg/1 di (NH^ Mo^ ^ iyi, 30/Ug/l

di biotina e 1 mg/1 di cloridrato di tiamina. La coltura

viene effettuata con agitazione a 30?C. La densit? ottica

(OD) a 660 nm viene controllata con un colorimetro Tokyo

Koden e si aggiunge penicillina G ad un valore OD di 0,2

fino ad una concentrazione di 0,5 unit?/ml. La coltura viene

proseguita ad un valore di OD'di circa 0,6.

Le cellule vengono raccolte dal brodo di coltura e r v lavate con tampone TES (pH 8,0) costituito da tris-(idrossimetil)-amminometano-HCl 0,03M (indicato in seguito come

Tris), EDTA 0,005M e NaCl 0,05M. Le cellule vengono sospese

in una soluzione di lisozima (pH 8,0) costituita dal 25%

di saccarosio, NaCl 0,1M, Tris 0,05M e 0,8 mg/ml di lisozima

per dare 10 mi di una sospensione che viene lasciata reagire

a 37?C per 4 ore. 1 DNA cromosomali ad elevato peso molecolare vengono isolati dalle cellule con il metodo di Saito

ed al., "Biochim. Biophys. Acta", 72_, 619 (1963). Il pCE53

impiegato come plasmide vettore viene isolato da Corynebacterium glutamicum L-22 avente pCE53 nel modo seguente.

Il ceppo viene accresciuto con agitazione a 30?C in

400 mi di mezzo NB (pH 7,2) ad un valore di OD di circa

0,7. Le cellule vengono raccolte e lavate con tampone TES.

Le cellule vengono sospese in 10 mi della succitata soluzio

ne di lisozima e lasciate reagire a 37?C per 2 ore. Successivamente, si aggiungono 2,4 mi di NaCl 5M, 0,6 mi di EDTA

0,05M (pH 8,5) e 4,4 mi di una soluzione costituita da 4%

di laurilsolfato di sodio e NaCl 0,7M. La miscela viene

agitata lentamente e lasciata in riposo in un bagno di acqua

ghiacciata per 15 ore. Tutto il lisato viene centrifugato

a 4?C a 69.400 x g per 60 minuti. Il fluido sovrastante

viene ricuperato e s? aggiunge il 10% (in peso) di polietilen?

glicol (PEG) 6.000 (prodotto della Nakarai Kagaku Yakuhin Co.). La miscela viene agitata lentamente per scioglier 5> re completamente e quindi mantenuta in un bagno di acqua * ghiacciata. Dopo 12 ore, la miscela viene centrifugata a

1500 x g per 10 minuti per ricuperare una pastiglia. Dopo

che la pastiglia ? stata ridisciolta gentilmente in 5 mi

di tampone TES, si aggiungono 2,0 mi di bromuro di etidio

1,5 mg/ml. Quindi, si aggiunge cloruro di cesio per regolare la densit? della miscela a 1,580. La soluzione viene

centrifugata a 18?C a 105.000 x g per 48 ore. Dopo centrifugazione a gradiente di densit?, viene individuato un DNA

circolare chiuso covalentemente sotto irradiazione UV come

una banda ad alta densit? disposta nella parte inferiore

del tubo di centrifugazione. La banda viene estratta dal

lato del tubo con un iniettore per ottenere una frazione

contenente DNA di pCGll. Per eliminare il bromuro di etidio,

la frazione viene trattata 5 volte con una quantit? uguale

di soluzione di alcool isopropilico saturata con cloruro

di cesio costituita da 90% in volume di alcool isopropilico

e 10% di soluzione di tampone TES. Successivamente, il residuo viene dializzato contro soluzione tampone TES.

li plasmide pCE53 ? un plasmide ricombinante in cui

il plasmide pCGl (domanda di brevetto giapponese pubblicata

non esaminata No. 134500/82) di Corynebacterium glutamicum

? combinato con il plasmide pGA22 di Escherichia coli descritto da An, G. ed al., "J. Bacteriol. 140, 400 (1979).

Pi? specificamente, il pCE53 viene costruito inserendo pCG1 e

ristretto con BglII nella posizione BamHI vicino al gene

t> R

del pGA22 e ligando;sfruttando le stesse estremit? coesive formate dai due enzimi di restrizione. Il pCE53 ha marca-4 tori selettivi, quali Km derivati da pGA22 ed ha soltanto

una posizione di segmentazione per Sali. t 2) Clonazione del gene sintetasi dell'acido antranilico.

10 unit? di enzima di restrizione Sali (prodotto della

Takara Shuzo Co.) vengono addizionate a 200 ul della soluzione di reazione Sali contenente 3 ug di DNA del plasmide

pCE53 preparato come sopra e 9.ug del DNA cromosomale. La

miscela viene lasciata reagire a 37?C per 60 minuti e riscaldata a 65?C per 10 minuti per arrestare la reazione. Successivamente, si aggiungono al prodotto di digestione 40 ul

del tampone ligasi T4 {pH 7,6) costituito da Tris 660 mM,

co,*/;

MgCl2 66 mM e ditiotreitolo 100 mM, 40^ul di ATP 5 mM, 0,4^ul

di ligasi T4 (prodotto della Takara Shuzo Co., 1 unit?/^ul)

e 120/Ul di H^O. La miscela viene lasciata reagire a 12?C

per 16 ore.

3) Trasformazione con il plasmide ricombinante.

La miscela di legame viene impiegata per trasformare

il ceppo LA 105, che ? un mutante richiedente acido antrani-

lico a causa della mancanza del gene sintetasi di acido

antranilico e derivato da Corynebacterium glutamicum L-22.

Il mutante ? stato ottenuto con una mutagenesi tradizionale ?

come un ceppo che non pu? crescere su mezzo di agar MI (pH

!I 7r 7,2) costituito da 10 g/1 di glucosio, 1 g/1 di ??^?^??^, t?

0,2 g/1 di KCl, 0,2 g/1 di MgSO^ ^ O, 10 mg/1 di FeSO^.TH 0,

0,2 mg/1 di MnSO^ .(4?6)H^O, 0,9 mg/1 di ZnSO^ H 0, 0,4

mg/1 di CuSO .5H 0, 0,09 mg/1 di Na B 0 .10H 0, 0,04 mg/1di

4 2 2 4 7 2

(NH ) Mo 0 .4H 0, 50 ug/1 di biotina, 2,5 mg/1 di acido

4 6 7 24 2 /

p-amminobenzoico , 1 mg/1 di cloridrato di tiamina e 16 g/1

di agar, e possono crescere su mezzo agar MI contenente

30/Ug/ml di acido antranilico. La preparazione dei protopla-

sti di LA 105 e la trasformazione dei protoplasti, vengono

effettuate impiegando cellule LA 105 cresciute su mezzo

NB contenente ug/ml di acido antranilico, nel modo se-/

guente.

La coltura di seme di ceppo LA 105 viene inoculata

in mezzo NB e la coltura viene eseguita con agitazione a

30DC. Le cellule vengono raccolte ad un valore di OD di

0,6. Le cellule vengono sospese a circa 10 cellule/ml in

mezzo RCGP (pH 7,6) costituito da 5 g/1 di glucosio, 5 g/1

di acido casam?nico, 2,5 g/1 di estratto di lievito, 3,5

g/1 di K2HP04, 1,5 g/1 di KH^ O^ 0,41 g/1 di MgCl .6H 0,

10 mg/1 di FeS04>7H20, 2 mg/1 di MnS04.(4-6)H 0, 0,9 mg/1

di ZnSO .7H 0, 0,04 mg/1 di (NH ) Mo 0 .4H 0, 30 ug/1 di

4 2 4 6 7 24 2 /

biotina, 2 mg/1 di cloridrato di tiamina, 135 g/1 di succina?

to di sodio e 30 g/1 di polivinil-pirrolidone con un peso

molecolare di 10.000 e contenente 1 mg/ml di lisozima. La

I

sospensione viene posta in un tubo L e agitata lentamente

r a 30?C per 5 ore per ottenere i protoplasti.

Quindi, 0,5 mi della sospensione di protoplasti vengono

posti in una piccola provetta e centrifugati a 2.500 x g

per 5 minuti. I protoplasti vengono risospesi in 1 mi di

tampone TSMC (pH 7,5) costituito da cloruro di magnesio

10 mM, cloruro di calcio 30 mM, Tris 50 mM e saccarosio

400 mM, e nuovamente sottoposti a centrifugazione e lavaggio.

I protoplasti lavati vengono risospesi in 0,1 mi di soluzio?

ne di tampone TSMC. lOO^ul di una miscela (1:1 in volume)

di soluzione di tampone TSMC concentrata due volte e la

miscela di DNA legata descritta .sopra vengono addizionati

alla sospensione di protoplasti. Successivamente, alla misce?

la si aggiungono 0,8 mi di tampone TSMC contenente 20% di

PEG 6.000. Dopo 3 minuti, si aggiungono 2 mi di mezzo RCGP

(pH 7,2) e la miscela viene centrifugata a 2.500 x g per

5 minuti. Il fluido sovrastante viene tolto ed i protoplasti

vengono sospesi in 1 mi di mezzo RCGP. Quindi, 0,2 mi della

sospensione vengono distribuiti su mezzo di agar RCGP (pH

7,2) contenente 300^ug/ml di canamicina e 1,4% di agar ed

incubati a 30?C per 7 giorni.

Le colonie resistenti alla canamicina cresciute sulla

piastra di selezione vengono raschiate, lavate con soluzione

salina fisiologica e centrifugate due volte. Le cellule vengono distribuite su mezzo di agar minimo MI contenente 20^ug/ml

di canamicina ed incubate a 30?C per 2 giorni. Vengono sele I !? -y zionati i trasformanti che sono resistenti alla canamicina * e non richiedono acido antranilico.

I DNA del plasmide vengono isolati dalle cellule di

questi trasformanti nello stesso modo citato sopra. Il plasmide pTrp 2-3, ricuperato da uno dei trasformanti, viene

analizzato mediante digestione con varie endonucleasi di

restrizione ed elettroforesi in gel di agarosio. Come risultato, si ? trovato che il plasmide pTrp 2 - 3 contiene un

frammento di DNA Sali di circa 7,1 Kb inserito nella unica

posizione Sali di pCE53.

Il ceppo LA 105 viene ritrasformato con pTrp 2-3 nello

stesso modo citato sopra. Le colonie cresciute su mezzo di

agar RCGP contenente,100^ug/ml di triptofano e 400^ug/ml

di canamicina non richiedono acido antranilico per la crescita ed esse hanno lo stesso plasmide del pTrp 2-3 caratteriz

zato dall'andamento di segmentazione con Sali.

Il risultato dimostra che il gene codificante per la

sintetasi dell'acido antranilico o Brevibacterium flavum

ATCC 14067 ? presente nel frammento di DNA clonato Sali di

circa 7,1 Kb ed espresso in Corynebacterium glutamicum LA 105.

Un microorganismo contenente pTrp 2-3, Corynebacterium

glutamicum K-20, ? stato depositato presso la "American Type

Culture Collection", U.S.A. con il numero di iscrizione ATCC

39035.

4) Produzione di triptofano mediante un trasformante.

y t Il plasmide pTrp 4-3 recante il gene sintetasi dell'aci ?

G

do antranilico di Brevibacterium flavum ATCC 14067 ? stato

ottenuto impiegando il plasmide pCE52 con lo stesso metodo

citato precedentemente.

Il plasmide pCE52 ? un plasmide ricombinante nel quale < il plasmide pCGl (domanda di brevetto giapponese pubblicata

non esaminata No. 134500/82) di Corynebacterium glutamicum

? combinato con il plasmide pGA22 di Escherichia coli descritto da An G. ed al., "J. Bacteriol 140, 400 (1979). Esso

? stato costruito inserendo il pCGl ristretto con BglII nella

R

posizione BamHI nel gene Tc del pGA22 e legando utilizzando

le stesse estremit? coesive formate da due enzimi di restri-R

zione. Il pCE52 ha marcatori selettivi quali Km derivati

da pGA22 ed ha soltanto una posizione di segmentazione per

Sali

Il pCE52 ? stato isolato dalla cellule di Corynebacterium

glutamicum L-22 contenenti pCE52 nel modo seguente.

Il ceppo viene accresciuto con agitazione a 30?C in

400 mi di mezzo NB (pH 7,2) ad un valore di OD di circa 0,7.

Le cellule vengono raccolte e lavate con tampone TES. Le

cellule vengono sospese in 10 mi della precedente soluzione

di lisozima e lasciate reagire a 37?C per 2 ore. Quindi,

si aggiungono in successione 2,4 mi di NaCl 5M, 0,6 mi di

EDTA 0,5M (pH 8,5) e 4,4 mi di una soluzione costituita da i;

4% di laurilsolfato di sodio e NaCl 0,7M. La miscela viene

~J agitata lentamente e lasciata in riposo in un bagno di acqua

ghiacciata per 15 ore. Tutto il U sato viene centrifugato

a 4?C a 69.400 x g per 60 minuti. Il fluido sovrastante viene

ricuperato e si aggiunge il 10% (in peso) di polietilenglicol

(PEG) 6.000 (prodotto della Nakarai Kagaku Yakuhin Co.).

La miscela viene agitata lentamente per sciogliersi compieta-

mente e mantenuta quindi in un bagno di acqua ghiacciata.

Dopo 10 ore, la miscela viene centrifugata a 1.500 x g per

ev? ?* 10 minuti per ricuperare una past?glia. Dopo che la pastiglia

? stata ridisciolta gentilmente in 5 mi di tampone TES, si

aggiungono 2,0 mi di bromuro di etidio 1,5 mg/ml. Quindi,

si aggiunge cloruro di cesio per regolare la densit? della

miscela a 1,580. La soluzione viene centrifugata a 18?C a

105.000 x g per 48 ore. Dopo centrifugazione a gradiente

di densit?, si individua un DNA circolare covalentemente

chiuso sotto irradiazione UV come una banda di alta densit?

disposta nella parte inferiore del tubo di centrifugazione.

La banda viene estratta dal lato del tubo con un iniettore

per ottenere una frazione contenente DNA di pCGll. Per elimi-

nare il bromuro di etidio, la frazione viene trattata cinque

volte con una quantit? uguale di soluzione di alcool isopro-

pilico saturata con cloruro di cesio costituita da 90% in

volume di alcool isopropilico e 10% di soluzione di tampone

C TES. Quindi, il residuo viene dializzato contro soluzione

tampone di TES.

nr > Il Corynebacterium glutamicum LAR-1 (FERM P-6908) che

produce triptofano viene trasformato con pTrp 4 - 3 come

detto sopra. Il trasformante cos? ottenuto ? stato depositato

presso la "American Type Culture Collection" come Corynebacte-

rium glutamicum K31, ATCC 39280.

Corynebacterium glutamicum K20, ATCC 39035 contenente

pTrp 2 - 3 e K31, ATCC 39280 contenente pTrp 4?3, vengono

provati per la produzione di L-triptofano nel modo seguente.

Questi ceppi vengono coltivati mediante agitazione a

30?C in mezzo NB per 16 ore e 0,5 mi del brodo di coltura

vengono inoculati in 5 mi del mezzo di produzione P4 (pH

7,2) costituito da 100 g/1 di melasse, 20 g/1 di (NH^)^SO^,

0,5 g/1 di KH PO , 0,5 g/1 di K ??0 , 0,25 g/1 di MgSO^.7H^0

2 4 2 4

e 20 g/1 di CaCO^. La coltura viene effettuata con agitazio-

ne a 30?C per 96 ore.

Dopo coltura, il filtrato della coltura viene sottoposto

a cromatografia su carta. Dopo reazione al colore di ninidrina, si determina con un metodo colorimetrico la quantit?

di L-triptofano prodotto.

Come controllo, ceppi LA-105 e LAR-1 vengono sottoposti

ad un trattamento simile. I risultati sono indicati nella

Tabella'1.

Tabella 1

Quantit? di L-triptofano

Ceppo _ (mg/ml)

LA-105

LA-105/pTrp2-3 {K20, ATCC 39035) 0,34

LAR-1 0,48

LAR-1/pTrp4-3 (K31, ATCC 39280) 1,12

Esempio 2

-<*r Clonazione del gene sintetasi di acido antranilico di

Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 e produzione di triptofano in Corynebacterium glutamicum.

1) Preparazione del DNA cromosomale.

?

Il DNA cromosomale di Corynebacterium glutamicum ATCC

13032 viene preparato con il metodo seguente.

Il DNA cromosomale viene preparato con lo stesso metodo

dell'esempio 1 (1), eccetto che si impiega Corynebacterium

glutamicum ATCC 13032 invece del Brevibacterium flavum ATCC

14067.

2) Clonazione del gene sintetasi di acido antranilico.

Una miscela di legame viene ottenuta con lo stesso meto?

do dell'esempio 1 (2) impiegando 3^ug di DNA del plasmide

pCE52 preparato nell'esempio 1 (4) e 9^ug del DNA cromosomale

preparato sopra.

3) Trasformazione del plasmide ricombinante.

Trasformanti vengono ottenuti con lo stesso metodo del -

l'esempio 1 (3) impiegando la miscela di legame preparata

sopra .

I DNA del plasmide vengono isolati dalle cellule colti-S* 7> vate di questi trasformanti nello stesso modo citato sopra. l? Il plasmide pTrp 9-1, ricuperato da uno dei trasformanti,

r viene analizzato mediante digestione con varie endonuc?easi

di restrizione e elettroforesi su gel di agarosio. Come risul?

tato, si ? trovato che il plasmide pTrp 9-1 contiene un fram?

mento di DNA di Sali di circa 7,3 Kb inserito nella posizione

unica Sali di pCE52.

Il ceppo LA 105 viene ritrasformato con pTrp 9-1 nello

stesso modo citato sopra. Le colonie cresciute su mezzo di

agar RCGP contenente lOO^ug/ml di triptofano e 400^ug/ml

di canamicina non richiedono acido antranilico per la cresci?

ta e hanno lo stesso plasmide del pTrp 9-1, caratterizzato

dall?andamento di segmentazione con Sali.

<9

Il risultato dimostra che il gene codificante per la

sintetasi dell'acido antranilico di Corynebacterium glutamicum

ATCC 13032 ? presente nel frammento clonato di DNA Sali di

circa 7,3 Kb ed espresso in Corynebacterium glutamicum LA

105.

4) Ricupero di plasmide pTrp 13-2 resistente ad un

analogo del triptofano da un ceppo contenente pTrp 9-1

Ceppo LA-105 contenente pTrp 9-1 viene cresciuto in

mezzo NB contenente 10 ug/ml di canamicina ad uno stadio

/

tardo della fase di crescita logaritmica. Cellule vengono ? ricuperate mediante centrifugazione e lavate due volte con

tampone Tris-malato 50 mM (pH 6,0). Le cellule lavate vengono

*? TP

incubate a temperatura ambiente in tampone Tris-malato 50 9>

mM (pH 6,0) contenente 400/Ug/ml di N-metil-N'-nitro-N-nitro-

soguanidina per 30 minuti. Le cellule trattate vengono lavate

con tampone Tris-malato 50 mM (pH 6,0) e centrifugate due

volte. Le cellule lavate vengono coltivate a 30?C in mezze

NB contenente 10 ug/ml di canamicina per 16 ore. I DNA del

/

plasmide vengono isolati con lo stesso metodo dell'esempio

Il ceppo LA-105 viene trasformato impiegando i DNA del

plasmide isolati con lo stesso metodo dell'esempio 1. La

selezione di trasformanti viene effettuata su mezzo di agar

RCGP contenente 0,5 mg/ml di 4-metiltriptofano oppure 0,5

mg/ml di.6-fluorotriptof ano, con o senza 200 mi di canami-/

cina

Vengono selezionate colonie cresciute su mezzo di agar

MI contenente 0,5 mg/ml del corrispondente analogo del triptofano e su mezzo di agar NB contenente 10/Ug/ml di canamicina.

1 trasformanti cos? ottenuti hanno il plasmide che alloggia un gene codificante per la sintetasi dell'acido antranilico insensibile al triptofano. La sintetasi dell'acido antranilico codificata da uno dei plasmidi, pTrp 13-2, viene inibita al 50% con triptofano 0,25 mM, che ? 40 volte superiore

alla concentrazione di triptofano (0,006 mM) necessaria

per inibire al 50% la sintetasi dell'acido antranilico codi e r ficata da pTrp 9-1.

Il Corynebacterium glutamicum LAR-1 ? stato trasformato

con pTrp 13-2 con lo stesso metodo dell'esempio 1. Il trasformante cos? ottenuto ? stato depositato presso la "American

H

Type Culture Collection come Corynebacterium glutamicum K37,

ATCC 39285.

5) Produzione di triptofano mediante il trasformante.

Corynebacterium glutamicum K37, ATCC 39285 contenente

pTrp 13-2 ? stato provato per la produzione di triptofano

nel modo seguente.

Il ceppo ? stato coltivato .con agitazione a 30?C in

mezzo NB per 16 ore e 0,5 mi del brodo di coltura sono stati

inoculati in 5 mi del mezzo di produzione P4 (pH 7,2) costituito da 100 g/1 di melasse, 20 g/1 di (NH^)^SO^, ^,5 g/1

di KH PO , 0,5 g/1 di K ??0 , 0,25 g/1 di MgSO .7H 0, e 20

2 4 2 4 4 2

1

g/1 di CaCO^. La coltura ? stata effettuata con agitazione

a 30?C per 96 ore.

Dopo coltura, il filtrato di coltura ? stato sottoposto

a cromatografia su carta. Dopo reazione con colore di ninidrina, la quantit? di L-triptofano prodotta ? stata determinata

mediante un metodo colorimetrico.

Come ceppi di controllo sono stati impiegati il ceppo

LAR-1 e LAR-l/pTrp 9-1. LAR-l/pTrp 9-1 ? stato preparato

con la stessa trasformazione del ceppo LAR-1 citata sopra.

I risultati sono indicati nella Tabella 2.

vr Tabella 2 ? *

Quantit? di L-triptofano

Ceppo _ (mg/ml)

LAR-1 0,4

LAR-l/pTrp 9-1 0,7

LAR-l/Trp 13-2 1,2

RIVENDICAZIONI

1. - Procedimento per la produzione di triptofano}che

consiste nel trasformare un microorganismo ospite appartenente al genere Corynebacterium o Brevibacterium con un DNA

ricombinante di un frammento di DNA contenente un gene coinvolto nella biosintesi del triptofano ed un DNA vettore,

nel coltivare il trasformante in un mezzo nutritivo, nell'accumulare triptofano nel mezzo di coltura e nel ricuperare

da questo il triptofano.

2. - Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui

il frammento di DNA contenente detto gene viene derivato

da eucarioti, procarioti, virus, batteriofagi o plasmidi.

3. - Procedimento secondo la rivendicazione 2, in cui

il procariote appartiene a batteri.

4. - Procedimento secondo la rivendicazione 3, in cui

il batterio ? scelto da microorganismi appartenenti al genere

Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium , Bacillus, Staphilococcus o Serratia.

5. - Procedimento secondo la rivendicazione 4, in cui

il batterio ? resistente ad un analogo del triptofano , i ? r-6. ? Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui

il frammento di DNA contiene un gene di sintetasi dell'acido

antranilico .

7. - Procedimento secondo la rivendicazione 6, in cui

viene liberata la inibizione della sintetasi di acido antranilico con triptofano o analoghidel triptofano.

8. - Procedimento secondo la rivendicazione 6, in cui

il frammento di DNA pu? conferire ad un microorganismo resistenza ad un analogo del triptofano.

9 Procedimento secondo la rivendicazione 5, 7 o 8,

in cui l'analogo del triptofano ? scelto tra 4-metiltriptofano, 5-metiltriptofano e 6-metiltriptofano

10. - Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui

detto vettore ? scelto da plasmidi, fagi e loro derivati

ottenuti da un microorganismo e replicabili autonomamente

nel batterio appartenente al genere Corynebacterium o Brevi->

bacterium.

11. Procedimento secondo la rivendicazione 10, in

cui detto plasmide e suo derivato viene sc?lto dal gruppo

costituito da plasmidi pCGl, pCG2, pCG4, pCE52, pCE53, pCE54,

pCGll e pCBIOI derivati dal microorganismo appartente al

genere Corynebacterium.

12. - Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui

il microorganismo ospite appartiene al genere Corynebacterium

i r o Brevibacterium e ? sensibile al lisozima.

13. - Procedimento secondo la rivendicazione 12, in

cui il microorganismo ospite ? Corynebacterium glutamicum

L-22 od un suo derivato.

14. - Microorganismo appartenente al genere Corynebacterium o Brevibacterium e contenente un DNA ricombinante di

un frammento di DNA contenente un gene coinvolto nella biosintesi del triptofano derivato da un microorganismo?appartenente al genere Corynebacterium, Brevibacterium o Escherichia

ed un DNA vettore.

15. - Corynebacterium glutamicum K20, ATCC 39035.

16. - Corynebacterium glutamicum K31, ATCC 39280. CO MS

0/.

17. - Corynebacterium glutamicum K37 , ATCC 39285.

PER INCARICO . i

lo o par fali/? hril

Descrizione

1. Titolo dell'Invenzione

Procedimento per la produzione di triptofano 2. Rivendicazioni

(1) Procedimento per la produzione di triptofano, che consiste nel trasformare un microorganismo ospite appartenente al genere Corynebacterium o Brevibacterium con un DNA ricombinante di un frammento di DNA contenente un gene coinvolto nella biosintesi del triptofano ed un DNA vettore, nel coltivare il trasformante in un mezzo nutritivo, nell1accumulare triptofano nel mezzo di coltura e nel ricuperare da questo il triptofano.

(2) Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui il frammento di DNA contenente detto gene viene derivato da eucarioti, procarioti, virus, batteriofagi o plasmidi.

(3) Procedimento secondo la rivendicazione 2, in cui il procariota appartiene ai batteri.

(4) Frocedimento secondo la rivendicazione 3* in cui il batterio viene scelto da un microorganismo appartenente al genere Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Staphylococcus, o Serratia.

(5) Procedimento secondo la rivendicazione 4, o ? in cui il batterio ? resistente ad un analogo ?del triptofano .

(6) Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui il frammento di-DNA contiene un gene di sintetasi dell'acido antranilico.

(7) Procedimento secondo la rivendicazione 6, in cui viene liberata l'inibizione della sintetasi di acido antranilico con triptofano ed analoghi del triptofano .

(8) Procedimento secondo la rivencicazione 6, in cui il frammento di DNA pu? conferire ad un microorganismo resistenza verso un analogo del triptofano .

(9) Procedimento secondo la rivendicazione 5, 7 oppure 8, in cui l'analogo del triptofano viene scelto tra 4-metiltriptofano, 5-metiltriptofano e 6-metiltrip tofane.

(??) Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui il vettore suddetto viene scelto fra plasmidi, fagi e relativi derivato ottenuti da un microorganismo e replicabili autonomamente nel batterio appartenente al genere Corynebacterium o Brevibacterium .

(il) Procedimento secondo la rivendicazione 10, ir: cui il plasmide sudeetto ed il relativo derivato

4.

viene scelto dal gruppo costituito da plasrnidi pCGl, PCG2, pCG4, pCE'52, pCE53, pCE54, pCGll e pCBIOI, derivati dal microorganismo appartenente al genere Corynebacterium .

(12) Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui il microorganismo ospite appartiene al genere Corynebacterium o Brevibacteriun? ed ? sensibile al lisozima.

(13) Procedimento secondo la rivendicazione 12, in cui il microorganismo ospite ? Corynebacterium glutamicum 1-22 oppure un suo derivato.

(14) Microorganismo appartenente al genere Corynebacterium o Brevibacterium e contenente un DNA ricombinante di un frammento di DNA contenente un gene coinvolto nella biosintesi del triptofano derivato da un microorganismo appartenente al genere Corynebacterium, Brevibacterium od Escherichia ed un DNA vettore.

(15) Corynebacterium glutamicum K20, ATCC 39035? (lb) Corynebacterium glutamicum K31, ATCC 39280. (17) Corynebacterium glutamicum K37, ATCC 39285.

3. Descrizione particolareggiata dell?Invenzione La present? invenzione si riferisce ad un procedimento per la produzione di triptofano mediante un originale metodo di espressione di un gene, Pi?

5.

specificamente, la presente invenzione si riferisce ad un procedimento per la produzione ui triptofano trasformando un microorganismo ospite appartenente al genere Corynebacterium o Brevibacterium con un DNA ricombinante di un frammento di DNA contenente un gene coinvolto nella biosintesi del triptofano ed un DNA vettore, coltivando il trasformante in un mezzo nutritivo, accumulando il triptofano in un mezzo di coltura e ricuperando da questo il triptofano.

Per la produzione diretta di triptofano mediante fermentazione , sono coscosciuti procedimenti che utilizzano ceppi mutanti che richiedono nutritivi e/oppure resistenti ad analoghi del triptofano dei batteri appartenenti al genere Corynebacterium, Brevibacterium , e simili (pubblicazioni ai brevetti giapponesi Nri. 4505/72 e 15037/76).

Non ? stato riportato alcun esempio di espressione di un gene desiderato in un microorganismo ospite appartenente al genere Corynebacterium oppure Brevibacterium introducendo in tale microorganismo ospite un DNA ricombinante contenente tale gene e vettore desiderato, uno dei quali ? esogeno ad un mie J oorganisrno ospite. Nella tecnologia del DNA ricombinante utilizzante un microorganismo ap-6.

partenente al genere Corynebacterium oppure Brevibacterium come ospite, ? necessario costruire vettori autonomamente replicabili in questi microorganismi, aventi marcatori selezionabili ed utili per la clonazione dei geni desiderati, e per stabilire un sistema di trasformazione efficiente. Inoltre, risultano necessari procedimenti per superare le varie barriere contro l'espressione del DNA ricombinante esogeno.

I presenti inventori hanno costruito vettori di piasmidi autonomamente replicabili in un microorganismo appartenente al genere Corynebacterium o Brevibacterium ed avente marcatori selezionabili ed adeguati siti di clonazione ed hanno messo a punto un sistema di trasformazione estremamente efficiente (domande di brevetti giapponesi pubblicate non esaminate Uri. 183799/82, 186492/82 e 186489/82). Inoltre, i presenti inventori hanno trovato che i vettori dei plasinidi sono utili per esprimere un gene esogeno in un microorganismo ospite e per aumentare la produttivit? di amminoacidi mediante legamento di un frammento di DNA contenente un gene esogeno coinvolto nella biosintesi di amminoacidi, quali acino glutammico e lisina, ai vettori dei plasmici secondo la tecnologia del DNA ricombinante

7.

vi~tro (brevetto statunitense No. 4.257.224) e per trasformare il Corynebacterium glutamicum L-22 ovvero i relativi derivati impiegando i procedimenti di trasformazione descritti nella domanda di brevetto giapponese No. 211908/81.

Inoltre, i presenti inventori hanno trovato che un microorganismo preparato con lo stesso procedimento ha acquistato una produttivit? accresciuta di triptofano ed hanno portato a termine la presente invenzione.

La presente invenzione viene spiegata nei particolari in quanto segue.

La presente invenzione propone un procedimento per la produzione di triptofano mediante coltivazione in un mezzo di un trasformante, il quale viene ottenuto trasformando un microorganismo appartenente al genere Corynebacterium o Brevibacterium con un DNA ricombinante di un frammento di DNA contenente un gene coinvolto nella biosintesi del triptofano ed un DNA vettore.

Come frammento di DNA contenente il gene utilizzato nella presente invenzione, si impiega il frammento di DNA contenente un gene coinvolto nella biosintesi del triptofano derivato da eucarioti, procarioti, virus, batteriofagi o plasmidi. Come 8.

gene derivato da procarioti, viene preferibilmente impiegato il gene derivato da un batterio appartenente al genere Escherichia, Corynebacteriun, Brevibacterium , Bacillus, Staphylococcus ovvero Serratia, e responsabile della biosintesi del triptofano oppure del metabolismo relativo alla biosintesi stessa.

Il vettore impiegato nella presente invenzione dovrebbe replicarsi autonomamente in cellule del microorganismo ospite. Preferibilmente, vengono impiegati plasmidi isolati da microorganismi appartenenti al genere Oorynebacterium dai presenti inventori ovvero i relativi derivati, quali pCGl (domanda di brevetto giapponese pubblicata non esaminata No. 134500/82), pCG2 (domanda di brevetto giapponese No. 135557/81), pCG4 (domanda di brevetto giapponese pubblicata non esaminata No. 183799/82), pCE52, pCE53, pCE54, pCG-11 e pCBIOl.

Microorganismi recanti i plasmidi che seguono sono stati depositati presso il "Fermentation Research Institute, Agency of Industriai Science and Technology, Ibaraki, Giappone, e presso la "American Type Culture Collection", Rockv?lle, Maryland, U. S.A., con i seguenti numeri di iscrizione.

9.

Plasmide EBAM P- Al'OC pCGl 5865 51808 pCG2 5954 31832 pCG-4 5939 31830

PCE54 - 59019

pCGll - 39022 pCBIOI - 39020 Tra i precedenti plasmidi, sono maggiormente preferiti pCE52 e pCE53?

I plasmidi pCE52 e pGE53 possono venire preparati nel modo seguente. Il plasmide pCGl viene isolato dalle cellule di Corynebacterium glutamicum 225-57 (FEHM P-5865, ATCG 31808) mediante il procedimento descritto nella suddetta domanda ed il plasmide pGA22 viene isolato dalle cellule coltivate di Escherichia coli con il procedimento convenzionale. Il pCGl con un unico sito BglII viene linearizzato con un enzima di restrizione BglII ed il pGA22 con i due siti BamHI vengono parzialmente digeriti con BamHI. Le estremit? coesive dei due plasmidi vengono rinvenute e legate con ligasi di DNA di fago T4 con la formazione di una molecola composita. La selezione dei plasmidi ricombinanti dalla miscela di legame viene effettuata mediante trasformanti ui isolamento del genere Corynebacterium o

10.

Brevibacterium sulla base delle resistenze ai farmaci derivate da pGA22 ed analizzando quindi i plasmidi trasformanti.

La trasformazione con la miscela di DNA legata *

viene effettuata impiegando protoplasti del genere Corynebacterium o Brevibacterium secondo il procedimento descritto nella domanda di brevetto giapponese pubblicata non esaminata No. 186492/82 e 186489/82.

Vengono impiegati per la selezione i farmaci corrispondenti ai geni, tranne per il caso del gene di resistenza che viene inattivato per inserzione, tra i geni responsabili per la resistenza ai farmaci derivata da pGA22. I trasformanti vengono ricuperati come una colonia rigenerata su un mezzo di agar ipertonico contenente 0,4 - 1,6 ^ug/ml di tetraciclina (Tc), 2,5 - 5 ^ug/ml di d oramienicolo (Cm) ovvero 100 - 800 ^ug/ml di canamicina (km) che non permette l'inversione a cellule normali dei protoplasti ricettivi senza addizione di DNA. In alternativa, i trasformanti vengono rigenerati in modo non selettivo su un mezzo di rigenerazione, e le cellule risultanti vengono raschiate e nuovamente portate in sospensione, facendo seguire dall'isolamento di quelle cellule che si sono svilup-11.

pat? su un me zzo ui agar contenente un farmaco in una concentrazione in cui le cellule normali ricettive non possono svilupparsi, vale a dire, geneTalmente 0,5 - 4 ^ug/ml di Tc, 2 - 15 /Ug/ml di Gm, oppure 2 - 25 ^ug/ml di Km. Alcuni dei trasfor-

Q

manti resistenti alla tetraciclina (Tc ), al ci?ramfenicolo (Cmn) oppure alla canamicina (Km ) risultano solitamente dotati di altre resistenze ai farmaci derivate dal plasmide pGA22.

I DNA del plasmide in questi trasformanti possono essere isolati da cellule coltivate dei trasformanti e purificati secondo i metodi descritti nelle domande di brevetti giapponesi pubblicate non esaminate Nri. 134500/82 e 186489/82. Le strutture dei DNA possono essere determinate sottoponendoli a digestione con varie endonucleasi di restrizione ed analizzando i frammenti di DNA mediante elettroforesi in gel di agarosio. I plasmodi isolati dai trasformanti vengono denominati pCN52 e pC253?

II pCE52 ed il pCE53 hanno un peso molecolare di circa 14,5 Kb e posizioni di segmentazione per EcoRI, Sali, Smal e Xhol. Mentre il pCE52 forni-

R R

sce fenotipi di Cm e Km , pCE55 fornisce i feno-.?. . m R ri R R

uipi Tc , Gm e Km .

12.

Poich? la posizione di segmentazione per Xhol

R ,

e presente nel gene Km , e possibile la selezione meaiante inattivazione pei-inserzione (prevenzione de la espressione di un gene mediante inserzione nel gene di un frammento di DNA). Il ricupero dei plasmidi dai ceppi viene effettuato secondo i metodi descritti nelle domande di brevetti giapponesi pubblicate nonesaminate Nri. 134500/82 e 183799/82, e nella domanda di brevetto giapponese No. 135557/ 81.

La preparazione di un DNA ricombinante di un vettore DNA con un frammento di DNA contenente un gene viene effettuata mediante una tecnologia convenzionale di DNA ricombinante in vitro, La ricombinazione di DNA in vitro viene effettuata mediante segmentazione e legame (la reazione diligasi) fra un DNA donatore contenente un gene desiderato ed un DNA vettore (vedere domanda di brevetto giapponese No.

211.908/81, e domanda di brevetto statunitense No.

4.237.224) ?

La reazione di ligasi fornisce ricombinanti contenenti geni diversi dal gene .desiderato. Il DNA ricombinante desiderato pu? essere ottenuto trasformando cinettamente un microorganismo del genere Corynebacterium o Brevibacterium con la miscele,di

13.

DNA legata, selezionando i traformanti aventi il fenotipo derivato dal gene desiderato ed isolando il DNA ricombinante desiderato dalle cellule coltivate dei trasformanti. Invece di sottoporre a clonazione il gene desiderato direttamente in un microorganismo del genere Corynebacterium o Brevibacterium , il gene desiderato pu? essere sottoposto a clonazione impiegando un altro sistema ospite - vettore, quale Escherichia coli. Allora, questo viene sottoposto nuovamente a clonazione in vitro in un vettore del genere Corynebacterium o Brevibactetium in modo da trasformare questi microorganismi ed i trasformanti contenenti il plasmide ricombinante desiderato vengono scelti secondo quanto precedentemente indicato.

I seguenti riferimenti tornano utili per la costruzione del DNA ricombinante:

S. N. Cohen, et alia, domanda di brevetto statunitense No. 4.237.224;

Idenshi Sosa Jikkenho, edito da Yasuyuki Takagi, stampato da Kodansha Scientific (1980);

"Hethod in Enzymology", 618, "Recombinant DNA?, edito da Ray Wu, Academic Press, 1979;

Domanda ui Brevetto Giapponese No. 211908/81. Microorganismi appartenenti al genere Corynebac-14.

terium o Brevibacterium e che sono competenti per incorporare DNA, possono essere impiegati come microorganismi ospiti nella presente invenzione. Preferibilmente, vengono impiegati microorganismi sensibili al lisozima descritti nella domanda di brevetto giapponese No. 151464/81. I seguenti sono esempi di un microorganismo ospite adatto.

Numero di iscrizione

Fi;hM P- ATCC Corynebacter ium

glutamicum L-15 5946 31854 Corynebacterium

glutamicum LA-105

Corynebacterium

herculis L-103 5947 31866

Brevi bacterium

divaricatum L-204 5948 31867

Brevibacterium

lactofe rmentum L-312

5949 31868

La trasformazione dei microorganismi ospiti con DNA ricombinanti viene effettuata con le operazioni seguenti :

1) preparazione ai protoplasti di cellule ospi-

ti

15.

2) trasformazione dei protoplasticon un DNA ricorri "binante ;

3) rigenerazione dei protoplasti in cellule normali e selezione di un trasformante; Queste operazioni vengono descritte nei particolari nel seguito.

1. Preparazione di protoplasti d? cellule ospiti :

La preparazione di protoplasti viene effettuata coltivando un microorganismo in condizioni che lo rendono sensibili al lisozima, un enzima litico, e trattando le cellule coltivate con lisozima in una soluzione ipertonica per eliminare la parete della cellula. Allo scopo di rendere le cellule microbiche sensibili al lisozima, vengono impiegati reagenti che inibiscono la sintesi delle pareti delle cellule batteriche. Per esempio, vengono ottenute cellule microbiche sensibili al lisozima aggiungendo, durante la fase di crescita logaritmica, una quantit? di penicillina che non inibisca oppure sub-inibisca la crescita e continuando quindi la coltivazione per parecchie generazioni.

Per la coltura, si pu? impiegare qualsiasi mezzo in cui il microorganismo possa svilupparsi.

16.

Per esempio, vengono impiegati un mezzo nutritivo NB (pH 7,2) costituito da 20 g/1 di brodo in polvere e 5 g/1 di estratto di lievito, ed un mezzo semi-sintetico 3SM (pH 7,2) costituito da 10 g/1 di glucosio, 4 g/1 di NH^Cl, 2 g/1 di urea, 1 g/1 di estratto di lievito, 1 g/1 di ??,,??^, 3 g/1 di K2HP04, 0,4 g/1 di MgCl2-6H20, 10 mg/1 di FeSO^? 7H20, 0,2 mg/1 di MnS04*(4 - 6) H20, 0,9 mg/1 di ZnS04*7H20, 0,4 mg/1 di CuS04*5H20, 0,09 mg/1 di Na2B407-10H20, 0,04 mg/1 di (??^ ????^ -^ ?,

30 ug/1 di biotina ed 1 mg/1 di cloridrato di tiamina .

Le cellule microbiche vengono inoculate nel mezzo e la coltura viene effettuata sottoponendo ad agitazione. La densit? ottica (OD) del mezzo di coltura a 660 nm viene controllata con un colrimetro e si aggiunge penicillina, quale penicillina G, in uno stadio iniziale della fase di crescita logaritmica (OD: 0,1 - 0,4) ad una concentrazione di 0,1 - 2,0 U/ml. La coltura viene proseguita fino ad un valore OD di 0,3 - 0,5 e quindi le cellule vengono raccolte e lavate con un mezzo costituito da SSM.

Le cellule lavate vengono nuovamente portate in sospensione in un acatto mezzo ipertonico, quale un mezzo costituito da PFM (pH 7,0 - 8,5), in cui sac-17.

carosio 0,4M ed MgCl2*6H20 O.OIM vengono aggiunti aa un mezzo costituito da SSM uiluito due volte, ed un mezzo RCG (pH 7,0 - 8,5) costituito da 5 g/1 di glucosio, 5 g/1 di idrolizzato di caseina, 2,5 g/1 di estratto di lievito, 5,5 g/1 di K^HFO^, 1,5 g/1 di KH2P04, 0,41 g/1 di MgCl2?6H20, 10 mg/1 di FeSO -7H 0, 2 mg/1 di MnSO .(4 - 6)H 0, 0,5 mg/1

4 2 4 2

di ??304?7?20, 0,4 mg/1 di CuS04*5H20, 0,09 mg/1 di NagB^O^'lOHgO, 0,04 mg/1 di (??^)^??^,?^ ?4H20, 50 jig/1 di biotina, 2 mg/1 di cloridrato di tiamina ed 1,35 g/1 di succinato di sodio. Alla sospensione di cellule, si aggiunge lisozima fino ad una concentrazione finale di 0,2 - 10 mg/ml, e la miscela viene lasciata reagire ad una temperatura di 30 -37? C. La formazione di protoplasti procede con il tempo e viene controllata con un microscopio otti? co. Il periodo richiesto per la conversione della maggior parte delle cellule in protoplasti dipende dalle concentrazioni della penicillina impiegata per la sensibilizzazione al lisozima e dalla quantit? di lisozima impiegata. Il periodo ? di 3 - 24 ore nelle condizioni precedentemente indicate.

Poich? i protoplasti formati vengono distrutti in condizioni ipotoniche, l'entit? della formazione di protoplcLsti viene determinata indirettamente dal

18.

numero di cellule normali che sopravvivono in condizioni ipotoniche. Generalmente, il rapporto di cellule normali sopravvissute viene mantenuto al disotto di 10-4 per cellula normale trattata con lisozima .

I protoplasti preparati come sopra hanno la capacit? di formare colonie (rigenerazione) su un adatto mezzo di agar ipertonico. Come mezzo di rigenerazione, viene preferibilmente impiegato un mezzo nutritivo, un mezzo semisintetico od un mezzo sintetico contenente vari amminoacidi, il quale contiene succinato di sodio 0,5 - 0,8 M e da 0,5 a 6 % di polivinil-pirrolidone con un peso molecolare da 10.000 a 40.000. Generalmente, si impiega un mezzo di agar RCGP semisintetico (pH 7?2) in cui al mezzo RCG vengono aggiunti il 3 % di polivinil-pirrolidone (peso molecolare 10.000) e 1' 1,4 % di agar. La rigenerazione viene effettuata ad una temperatura da 25 a 35? C. Il tempo di coltivazione richiesto per la rigenerazione di protoplasti dipende dal ceppo impiegato, ma generalmente in 10 - 14 giorni si possono prelevare colonie. L?efficienza della rigenerazione di protoplasti sul mezzo RCGP dipende pure dal ceppo impiegato, dalle concentrazioni della penicillina aggiunta durante la coltura 1? e dalla concentrazione del lisozima impiegato.

L'efficienza ? generalmente di 10 - 10 cellule per cellula normale trattata con lisozima.

2. Trasformazione dei protoplasti con un DNA ricombinante :

L'introduzione di un DNA ricombinante nei protoplasti viene effettuata mescolando i protoplasti ed il DNA in una soluzione ipertonica che protegge i protoplasti, ed aggiungendo alla miscela polietilenglicol (PEG, peso molecolare medio: 1.540-6.000) oppure alcool polivinilico (PVA, grado di polimerizzazione: 500 - 1.500) ed un catione di metallo bivalente che stimola l'assunzione di DNA. Come agente stabilizzante per le condizioni ipertoniche, vengono pure impiegati quelli generalmente usati per proteggere i protoplasti di altri microorganismi, quali saccarosio e succinato di sodio. PEG e PVA possono essere impiegati ad una concentrazione finale di 5 - 60 % e 1 - 20 %, rispettivamente. Cationi di metalli bivalenti, quali Ca++, + + + +

Mg , Mn , Ba e Sr vengono efficacemente impiegati da soli oppure in combinazione ad una concentrazione finale di 1 - 100 mM. La trasformazione viene effettuata soddisfacentemente a 0 - 25? C.

5 . Rigenerazione dei protoplasti a cellule nor-

2C.

mali e selezione di un trasformante:

La rigenerazione dei protoplasti trasformati con un DNA ricombinante viene effettuata nello stesso modo precedentemente indicato distribuendo i.protoplasti su un mezzo di agar ipertonico, ad esempio un mezzo RCG-P, contenente succinato di sodio e polivinilpirrolidone ed effettando l?incubazione ad una temperatura in cui le cellule normali possono svilupparsi, generalmente da 25 a 35? C. I trasformanti vengono ottenuti selezionando il fenotipo derivato dai DNA donatori. La selezione pu? essere effettuata simultaneamente con la rigenerazione su un mezzo di agar ipertonico oppure pu? essere effettuata su un mezzo di agar ipotonico dopo reversione non selettiva a cellule normali su un mezzo di agar ipertonico .

Nel caso dei ceppi sensibili a lisozima descritti come i microorganismi ospiti preferiti per la clonazione, la trasformazione pu? essere effettuata mediante le operazioni descritte in (l) - (5) tranne per il fatto che le cellule coltivate vengono direttamente trattate con lisozima senza trattamento precedente con penicillina. In tal caso, i trasformanti vengono ottenuti con un rendimento da

_ -2 "4

10 a 10 per cellula rigenerata.

21.

L'?spressione fenotipica del DNA ricombinante viene effettuata accrescendo il trasformante in un mezzo nutritivo tradizionale. Adatti reagenti possono essere aggiunti al mezzo a seconda dei fenotipi previsti aai geni sul DNA ricomtinante.

Il trasformante cos? ottenuto viene coltivato in un modo tradizionale impiegato nella produzione di triptofano mediante fermentazione. Vale a dire, il trasformante viene coltivato in un mezzo tradizionale contenente sorgenti di carbonio, sorgenti di azoto, materiali inorganici, amminoacidi, vitamine, eco., in condizioni aerobiche, con regolazione della temperatura e del pH. In tal modo, viene ricuperato il triptofano accumulato nel mezzo.

In funzione di sorgente di carbonio, si possono impiegare vari carboidrati, quali glucosio, fruttosio, saccarosio, maltosio, mannosio, sorbitolo, marnitelo, alcool di zucchero, glicerolo, amido, idrolizzato di amido e melasse, vari acidi organici, quali acido piruvico, acido lattico, acido acetico, acido fumarico ed acido gluconico, ed alcooli inferiori, quali etanolo.

In funzione di sorgente di azoto, sono adatti 1.'ammoniaca, vari sali di ammonio inorganici od organici, quali cloruro di ammonio, solfato di arnmo-22.

nio, carbonato di ammonio ed acetato di ammonio, l'urea, altri composti contenenti azoto, e sostanze organiche azotate, quali peptone, NZ-ammina, estratto di carne, estratto di lievito, liquore di germe di grano, idrolizzato di caseina, farina di pesce od il suo prodotto digerito, e l'idrolizzato di crisalide.

In funzione di materiali inorganici, si possono impiegare fosfato biacido di potassio, fosfato acido bipotassico, solfato di magnesio, cloruro di sodio, solfato ferroso, solfato di manganese e carbonato di calcio. Possono non venire aggiunti vitamine ed amminoacidi richiesti per la crescita dei microorganismi, purch? questi vengano forniti con altri componenti precedentemente menzionati.

La coltivazione viene effettuata in condizioni aerobiche con scuotimento od agitazione - aerazione. La temperatura di coltivazione ? preferibilmente da 20 a 40? G. Il pH del mezzo durante la coltura viene mantenuto intorno alla neutralit?.

La coltura viene proseguita sino a che non si sia accumulata una quantit? considerevole di triptofano, generalmente per 2 - 5 giorni.

Completata la coltura, le cellule vengono rimosse ed il triptofano viene ricuperato dal liquido di

25.

coltura con mezzi tradizionali, quali il trattamento con carbone attivo ovvero con una resina scambiatrice di ioni.

Nonostante l'elevata similarit? nelle caratteristiche microbiologiche, i cosidetti microorganismi che producono acido glutammico, i quali producono acido glutammico in forti quantit?, vengono classificati in varie specie ed anche in differenti generi, quali Corynebacterium e Brevibacterium, il che ? probabilmente a causa della loro importanza industriale. Tuttavia, ? stato messo in evidenza che questi microorganismi dovrebbero appartenere ad una specie, a causa della composizione quasi uguale degli amminoacidi nella parete della cellula e della composizione di base dei DNA. Recentemente, ? stato riportato che questi microorganismi hanno il 70 - 80 % o pi? di omologia in DNA, il che indica che questi microorganismi sono strettamente correlati. Vedere, ad esempio, Komatsu, Y.: "Report of th? Fermentation Research Institute", No. 55j 1 (ISSO), e Suzuki, K., Kaneko, T., e Komagata, K.: "Int. J. Syst. Bacteriol.", 51, 131 (1S81).

Nella presente descrizione, l'utilit? della presente invenzione viene illustrata impiegando derivati di Corynebacterium glutamicum L-22 come

24.

microorganismi ospiti a causa delle restrizioni sugli esperimenti della tecnologia ai DNA ricombinante in Giappone. Tuttavia, in considerazione dei fatti precedentemente menzionati, ? evidente che l'utilit? della, presente invenzione ? applicabile a tutti i microorganismi che producono acino glutammico. Allo scopo di mantenere stabilmente le molecole di DNA ricombinahte ed esprimere il DNA in queste specie, risultano trascurabili lievi differenze nelle propriet? dei microorganismi ospiti, quali l'omologia nel DNA, ed ? sufficiente che i microorganismi ospiti permettano la replicazione autonoma di plasmidi e l'espressione di geni su di questi. Che questi microorganismi possiedano tali capacit?, ?risulta evidente dal fatto che il plasmide pCG4 che ? stato isolato dal Corynebacterium glutamicum 225-250 ed ha un gene Sm^/Spec^ (domanda di brevetto giapponese pubblicata non esaminata No. 185799/82) pu? replicarsi in microorganismi appartenenti al genere Corynebacterium o Brevibacterium e pu? essere espresso il gene responsabile per la resistenza (domanda di brevetto giapponese pubblicata non esaminata No. 186492/82). Perci?, la presente invenzione ? applicabile a tutti i microrganismi che producono acino glutammico, compresi quei microorganismi

25.

appartenenti al genere Corynebacterium o Brevibactel'ium, come pure al Corynebacterium glutamicum.

Alcune forme di attuazione specifiche della presente invenzione vengono illustrate dai seguenti eserfjpi illustrativi.

Esempio 1

Clonazione del gene sintetasi dell'acido antranilico di Brevibacterium flavum ATCC 14067 e produzione di triptofano in Corynebacterium glutamicum.

1) Preparazione di DNA cromosomale e di plasmide pCB53:

Il DNA cromosomale di Brevibacterium flavum ATCC 14067 ? stato preparato come segue:

Una coltura di inseminazione in mezzo NB ? stata inoculata in 400 mi di un mezzo semi-sintetico SSM (pH 7,2) costituito da 20 g/1 di glucosio, 10 g/1 di (NH^^ SO^, 3 g/1 di urea, 1 g/1 di estratto di lievito, 1 g/1 di KH2P04, 0,4 g/1 di MgCl *6^ 0,

10 mg/1 di FeS04*7H20, 0,2 mg/1 di MnSO^-U - 6)?2_0, 0,9 mg/1 di ZnS04*7H20, 0,4 mg/1 di CuSO^ SHgO, 0,09 mg/1 di Na^ ^O^-lOHgO, 0,04 mg/1 di (NH^J^Mo^O^ ? 4H20, 30 ^ug/l di biotina ed 1 mg/1 di cloridrato ai tiamina. La coltura viene effettuata con scuotimento a 30? C. La den:ita ottica (OD) a 660 nm viene controllata con un colorimetro Tokyo Koden

26.

e si aggiunge penicillina Q ad un valore OD di 0,2 fino ad una concentrazione di 0,5 unit?/ml. La coltura viene proseguita fino ad un valore di OD pari a circa 0,6.

Le celluLe vengono raccolte dal brodo di coltura e lavate con tampone TE3 (pH 8,0) costituito da tris- (idrossimetil)-amminome uano-HCl 0,03 M (indicato nel seguito della presente come Tris), EDTA 0,005 M ed NaCl 0,05 FI. Le cellule vengono portate in sospensione in una soluzione di iisozima (pH 0,8) costituita dal 25 % ?i saccarosio, NaCl 0,1 M, Tris 0,05 M e 0,8 mg/ml di Iisozima con 1'ottenimento di 10 mi di una sospensione che viene lasciata reagire a 37? C. per 4 ore. I DNA cromosomali ad elevato peso molecolare vengono isolati dalle cellule con il metodo di Saito et al., "Biochim. Biophys. Acta" , 72, 619 (1S63). LI pCE53 impiegato come plasmide vettore viene isolato da Corynebacterium glutamicum L-22 avente pCE53 nel modo seguente.

Il ceppo viene accresciuto con scuotimento a 30? C. in 400 mi di mezzo NB (pH 7,2) fino ad un valore di OD ai circa 0,7. le cellule vengono raccolte e lavate con tampone TES. Le cellule vengono portate in sospensione in 10 mi della soluzione di Iisozima precedentemente menzionata e lasciate rea-27.

gire a 37? C. per 2 ore. Quindi, si aggiungono successivamente 2,4 mi ai NaCl 5M, 0,6 mi di EDTA 0,5M (pH 8,5) e 4,4 mi di una soluzione costituita da 4 ? di laurilsolfato di sodio e NaCl 0,7 K. La miscela sottoposta lentamente ad agitazione, e lasciata in riposo in un bagno di acqua ghiacciata per 15 ore. Tutto quanto il U sato viene centrifugato a 4? C. e 6S.400 x g per 60 minuti. Il fluido sovrastante viene ricuperato e si aggiunge il 10 % (in peso) di polietilenglicol (PEG) 6.000 (prodotto della Nakarai Kagaku Yakuhin Co.). La miscela viene agitata lentamente in modo da effettuare la completa dissoluzione e quindi mantenuta in un bagno di acqua ghiacciata. Dopo 10 ore, la miscela viene centrifugata a 1.500 x g per IO minuti ottenendosi una pastiglia. Dopo aver nuovamente portato in soluzione la pastiglia con delicatezza in 5 mi di tampone TES, si aggiungono 2,0 mi ai una soluzione contenente 1,5 mg/ml di bromuro di etidio. Quindi, si aggiunge cloruro di cesio per regolare la densit? della miscela a 1,580. La soluzione viene centrifugata a 18? C. a 105.000 x g per 48 ore. Dopo centrifugazione a gradiente di densit?, viene individuato un DNA circolare chiuso covalentemente sotto irradiazione UV come una banda ad alta densit?

28.

disposta nella parte inferiore del tubo di centri-*

fugazione. La banda viene estratta dal lato del tubo con un iniettore in modo da ottenere una frazione contenente DNA ai pCE53. Per eliminare il bromuro di etidio, la frazione viene trattata cinque volte con una quantit? uguale di soluzione di alcool isopropilico saturata con cloruro ai cesio costituita da SO % in volume di alcool isopropilico e 10 % di soluzione tampone TES. Quindi, il residuo viene analizzato contro la soluzione tampone TES.

Il plasmide pCE53 ? un plasmide ricombinante in cui il plasmide pCGl (domanda di brevetto giapponese pubblicata non esaminata No. 134500/82) di Corynebacterium glutarnicum viene combinato con il plasmide pGA22 di Escherichia coli descritto da An, G. et al., "J. Bacteriol , 140? 400 (1979). Pi? specificamente, il pCE53 viene costruito inserendo pCGl ristretto con BglII nella posizione BamHI vicino al gene Tc di pGA22 e ligando, sfruttando le stesse estremit? coesive formate dai due enzimi di restrizione. pCE53 ha marcatori selettivi, quali Km derivati da pGA22 ed ha soltanto una posizione di segmentazione per Sali.

2) Clonazione del gene sintetasi dell?acido antranilico-:

29.

10 unit? di enzima di restrizione Sali si aggiungono a 200 ^ul della soluzione di reazione Sali cont?nente 3 yug di DNA del plasmide pCE55 preparato come sopra e 9 yug del DNA cromosomale. La miscela viene lasciata reagire a 37? C. per 60 minuti e riscaldata a 65? 0. per 10 minuti per arrestare la reazione. Successivamente, al prodotto di digestione si aggiungono 40 yul del tampone ligasi T4 (pH 7,6) costituito da Tris 660 mKf MgC^ 66mM e ditiotreitolo 100 mM, 40 ^ul di ATP 5 mi', 0,4 pii di ligasi T4 (prodotto della Takara Shuzo Co.,

1 unit?/yul) e 120 yal di i^O. La miscela viene lasciata reagire a 12? C. per 16 ore.

3) Trasformazione con il plasmide ricombinante: La miscela di legame viene impiegata per trasformare il ceppo LA 105, che ? un mutante richiedente acido antranilico a causa della mancanza del gene sintetasi di acido antranilico e derivato da Corynebacterium glutamicum L-22. Il mutante viene ottenuto mediante una mutagenesi tradizionale come ceppo che non pu? crescere su mezzo di agar Mi

(pH 7,2) costituito da 10 g/1 di glucosio, 1 g/l di NH H2P0 , 0,2 g/l di KOI, 0,2 g/l di MgSO^ HgO, 10 rpg/'l di PeS04-7H20, 0,2 rng/l ci MnS04-(4 - 6)H20, 0,9 mg/'l di 2nS04*7H2?, 0,4 mg/1 di CuSO4*5H20,

30.

0,09 mg/1 di Na2B40^*10H20, 0,04 mg/1 di (??^)^??^?^ .

4H20, 50 yug/? ci biotina, 2,5 mg/1 di acido p-amminobenzoico , 1 mg/1 di cloridrato di tiamina e

16 g/1 di agar, e possono essere fatti crescere su un mezzo agar MI contenente 50 ug/1 di acido antranilico. La preparazione dei protoplasti di LA 105 e la trasformazione dei protoplasti, vengono effettuate impiegando cellule LA 105 fatre sviluppare su un mezzo NB contenente 100 ^?g/l di acido antranilico nel modo seguente.

La coltura di inseminazione del ceppo LA 105 viene inoculata in mezzo NB e la coltivazione viene effettuata con scuotimento a 50? C. Le cellule vengono raccolte ad un valore di OD di 0,6. Le cellu-9

le vengono portate in sospensione a circa 10 cellule/ml in mezzo RCGP (pH 7,6) costituito da 5 g/1 di glucosio, 5 g/1 di acido casaminico, 2,5 g/1 di estratto di lievito, 3,5 g/1 di ?^???^, 1,5 g/1 di KH2P04, 0,41 g/1 di MgCl2-6H20, 10 mg/1 di FeS04? 7H20, 2 mg/1 di MnSO^ U - 6) HgO, 0,9 mg/1 di ZnS04-7H20, 0,04 mg/1 ci (NH4)6MO?024*4H20, 30 jug/1 di biotina, 2 mg/1 di cloridrato di tiamina, 135 g/1 di succinato di sodio e 30 g/1 di polivinil-pirroiir?one con un peso molecolare di 10.000 e contenente 1 mg/ml di lisozima. La sospensione viene introdot-31.

ta in un tubo L e sottoposta a leggero scuotimento a 50? C. per 5 ore in modo aa ottenere i protoplasti .

Quinci, 0,5 mi della sospensione di pirotoplasti vengono introdotti in una piccola provetta e fatti centrifugare a 2.500 x g per 5 minuti. I protoplasti vengono portati nuovamente in sospensione in 1 mi di tampone TSMC (pH 7,5) costituito da cloruro di magnesio 10 mM, cloruro di calcio 30 mM, Tris 50 mM e saccarosio 400 mM, e nuovamente sottoposti a centrifugazione e lavaggio. I protoplasti lavati vengono nuovamente portati in sospensione in 0,1 mi ci soluzione di tampone TSMC. Alla sospensione di protoplasti si aggiungono 100 ^ul di una miscela (l : 1 in volume) di una soluzione di tampone TSMC concentrata due volte e la miscela di DNA legata precedentemente descritta. Successivamente, alla miscela si aggiungono 0,8 mi ai tampone TSMC contenente 20 ? di PEG 6.000. Dopo 3 minuti, si aggiungono 2 mi di mezzo RCGP (pH 7,2) e la miscela viene sottoposta a centrifugazione a 2.500 x g per 5 minuti. Il fluido sovrastante viene allontanato ed i protoplasti sono portati in sospensione in 1 mi di mezzo RCGP. Quindi, 0,2 mi della sospensione vengono distribuiti su rezzo di agar RCGP (pH 7,2) contenen-52.

te 300 ug/ml di kanamicina e 1' 1,4 % di agar e sono ?

mantenuti in incubazione per 7 giorni a 50? G.

Le colonie resistenti alla kanamicina sviluppatesi sulla piastra di selezione vengono raschiate, lavate con soluzione salina fisiologica e sottoposte a centrifugazione due volte. Le cellule vengono distribuite su mezzo agar minimo MI contenente 20 ^ug/ml di kanamicina e mantenute in incubazione per 2 giorni a 30? C. Vengono selezionati i trasformanti che sono resistenti alla kanamicina e che non richiedono acido antranilico.

I DNA del plasmide vengono isolati dalle cellule di questi trasformanti nello stesso modo precedentemente indicato. Il plasmide pTrp 2 - 3, ricuperato da uno dei trasformanti, viene analizzato mediante digestione con varie endonucleasi di restrizione ed elettroforesi in gel di agarosio. Come risultato, si ? trovato che il plasmide pTrp 2- 3 contiene un frammento di DNA Sali inserito nella unica posizione Sali di pCE53.

II ceppo LA 105 viene ritrasformato con pTrp

2 - 3 nello stesso modo precedentemente indicato. Le colonie sviluppatesi su mezzo di agar RCGP contenente 100 jig/ml di triptofano e 400 yug/ml di kanamicina non richiedono acido antranilico per la

33.

crescita ed esse hanno lo stesso plasmide del [iTrp 2 - 3 caratterizzato dall'andamento ai segmentazione con Sali.

Il risultato dimostra che il gene codificante per la sintetasi dell'acido antranilico o Brevibacterium flavum ATCC 14067 ? presente nel frammento di DNA clonato Sali di circa 7,1 Kb ed espresso in Corynebacterium glutamicum LA 105.

Un microorganismo contenente pTrp 2- 3, Corynebacterium glutamicum K-20, ? stato depositato presso la "American Type Culture Collection", U.S.A. con il numero di iscrizione ATCC 39035.

4) Produzione di triptofano mediante un trasformante:

Il plasmide pTrp 3 - 4 recante il gene sintetasi dell'acido antranilico di Brevibacterium flavum ATCC 14067 ? stato ottenuto impiegando il plasmide pCE52 con lo stesso metodo precedentemente indicato .

Il plasmide pCE52 ? un plasmide ricombinante nel quale il plasmide pCGl (domanda di brevetto giapponese pubblicata non esaminata No. 134500/82) di Corynebacterium glutamicum ? combinato con il plasmide pGA22 di Escherichia coli descritto da Ari, G. ed al.,"J. Bacteriol. ", 140, 400 (1579). Esso ? stato

34.

costruito inserendo il pGGl ristretto con BglII nella posizione 'BamHI nel gene Tc del pGA22 e legando utilizzanuo le stesse estremit? coesive formate dai eue enzimi di restrizione. Il pC?22 ha marcatori selettivi quali Km derivati da pGA22 ed ha soltanto una posizione di segmentazione per Sali.

Il pCE52 ? stato isolato dalle cellule di Corynebacterium glutamicum 1-22 contenente pCE52 nel modo seguente:

Il ceppo viene fatto sviluppare con scuotimento a 30? C. in 400 mi di mezzo NB (pH 7,2) fino ad un valore OD di circa 0,7. Le cellule vengono raccolte e lavate con tampone TES. Le cellule vengono portate in sospensione in 10 mi della soluzione di l?sozima precedentemente menzionata e lasciate reagire a 37? C. per 2 ore. Quindi, si aggiungono in successione 2,4 mi di NaCl 5M, 0,6 mi di EDTA 0,5M (pH 8,5) e 4,4 mi di una soluzione costituita da 4 % di laurilsolfato di sodio ed NaCl 0,7 M. La miscela viene sottoposta a lenta agitazione e lasciata in riposo in un bagno di acqua ghiacciata per 15 ore. Tutto quanto il U sato viene sottoposto a centrifugazione a 4? C. a 65.400 x g per 60 minuti. Il fluido sovrastante viene ricuperato e si aggiunge il 10 % (in peso) di polietilenglicol (FEG)

55.

6.000 (prodotto della Nakarai Kagaku Yakuhin Co.).

La miscela viene sottoposta a lenta agitazione per farla disciogliere completamente e mantenuta quindi in un bagno di ac-..ua ghiacciata. Dopo 10 ore, la miscela viene sottoposta a centrifugazione a 1.500 x g per 10 minuti con 1'ottenimento di una pastiglia.

Dopo che la pastiglia ? stata ridlsciolta delicatamente in 5 mi di tampone TES, si aggiungono 2,0 mi di bromuro di etidio 1,5 mg/rnl. Quinci, si aggiunge cloruro di cesio in modo da regolare la densit? della miscela a 1,580. La soluzione viene sottoposta a centrifugazione a 18? C. a 105.000 x g per

48 ore. Dopo centrifugazione a gradiente di densit?, si individua un DNA circolare covalentemente chiuso sotto irradiazione UV come una banda di alta densit? nella parte inferiore del tubo di centrifugazione. La banda viene estratta dal lato del tubo con un iniettore in modo da ottenere una frazione contenente DNA di pCE52. Per eliminare il bromuro di etidio, la frazione viene trattata cinque volte con una quantit? uguale di soluzione di alcool isopropilico saturata con cloruro di cesio costituita dal 90 % in volume di alcool isopropilico e dal 10 % di soluzione ui tampone TES. quinci, il residuo viene dializzato contro soluzione tampone di TES.

36.

Il Corynebacterium glutamicum LAR-1 (PERM P-6908) che produce triptofano viene trasformato con pTrp 4 - 3 secondo quanto precedentemente indicato. Il trasformante cos? ottenuto ? stato depositato presso la "American Type Culture Collection" come Corynebacterium glutamicum K31, ATCC 39280.

Coryne bacieriutn glutamicum K20, ATCC 39035 contenente pTrp 2 - 3 e K31, ATCC 39280 contenente pTrp 4 - 3, vengono provati per la produzione di L-triptofano, nel modo seguente:

Questi ceppi vengono coltivati mediante scuotimento a 30? C. in mezzo NB per 16 ore e 0,5 mi del brodo di coltura vengono inoculati in 5 mi del mezzo di produzione P4 (pH 7,2) costituito da 100 g/1 di melasse, 20 g/1 di (NH^ SO^ 0,5 g/1 di KHgPO^, 0,5 g/1 di K2HP04, 0,25 g/1 di MgS04*7H20 e 20 g/1 di CaCO^. La coltura viene effettuata con scuotimento a 30? C. per 96 ore.

Dopo coltura, il filtrato della coltura viene sottoposto a cromatografia su carta. Dopo r?azione cromatica con ninidrina, la quantit? di L-triptofano prodotta viene determinata mediante un metodo colorimetrico .

Come controllo, ceppi LA-105 e LART-1 vengono sottoposti ao un analogo trattamento. I risultati sono

57.

inuicati nella Tabella 1.

Tabella 1

Ceppo Quantit? di L-trip-_ tofano (mg/ml) LA-105

LA-105/pTrp 2-3

(K20, ATCC 39035) 0,34

LAR-1 0,48

LAR-l/pTrp 4-3

(K3lf ATCC 39280) 1,12 Esempio 2

Clonazione del gene sintetasi di acido antranilico di Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 e produzione di triptofano in Corynebacterium glutamicum;

1) Preparazione del DNA cromosomale:

Il DNA cromosomale di Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 viene preparato con il metodo seguente .

Il DNA cromosomale viene preparato con lo stesso metodo dell?Esempio 1 (l), eccetto che si impiega il Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 al posto del Erevibacterium flavum ATCC 14067.

2) Clonazione del gene sintetasi di acido antranilico:

Una miscela di legarne viene ottenuta con lo

38.

stesso metodo dell'Esempio 1 (2) impiegando 3 fg di DNA del plasmide pCE52 preparato nell'Esempio 1 (4) e 9 yug del DNA cromosomale preparato in quanto precede .

3) Trasformazione del plasmide ricombinante:

Trasformanti vengono ottenuti con lo stesso metodo dell'Esempio 1 (3) impiegando la miscela di legame preparata in quanto precede.

I DNA del plasmide vengono isolati dalle cellule coltivate di questi trasformanti nello stesso modo precedentemente indicato. Il plasmide pTrp 9 -1, ricuperato da uno dei trasformanti, viene analizzato mediante digestione con varie endonucleasi di restrizione ed elettroforesi su gel di agarosio. Come risultato, si ? trovato che il plasmide Trp 9 -1 contiene un frammento di DNA di Sali di circa 7,3 Kb inserito nella posizione unica Sali di pCE52.

II ceppo LA 105 viene ritrasformato con Trp 9- 1 nello stesso modo precedentemente indicato. Le colonie fatte sviluppare su mezzo di agar RCGP contenente 100 yig/ml di triptofano e 400 yug/ml di kanamicina non richiedono acido antranilico per la crescita ed hanno lo stesso plasmide del pTrp 9- 1, caratterizzato dall'andamento di segmentazione con Sal?.

39.

Il risultato dimostra che il gene codificante per la sintetasi dell?acido antranilico di Corynebacterium glutainicurn ATCC 13032 ? presente nel frammento clonato ai DNA Sali di circa 7,3 Kb ed espresso in Corynebacterium glutamicum LA 105.

4) P?cupero di plasm.ide pTrp 13 - 2 resistente ad un analogo del triptofano da un ceppo contenente pTrp 9-1:

Un ceppo LA-105 contenente pTrp 9 -1 viene fatto sviluppare in mezzo NB contenente 10

di kanamicina ad uno stadio tardo della fase di crescita logaritmica. Le cellule vengono ricuperate mediante centrifugazione e lavate due volte con tampone tris-malato 50 mM (pH 6,0). Le cellule lavate vengono incubate a temperatura ambiente in tampone tris-malato 50 mM (pH 6,0) contenente 400 ug/ml di N-metil-N?-nitro-N-nitrosoguanidina per 30 minuti. Le cellule trattate vengono lavate con tampone tris-malato 50 mM ipH 6,0) e centrifugate due volte. Le cellule lavate vengono coltivate a 30? C. in mezzo NB contenente 10 kanamicina per 16 ore. I DNA del plasmide-vengono isolati con lo stesso metodo dell'Esempio 1.

Il ceppo LA-105 viene trasformato impiegando i UNA del plasmide isolati con lo stesso metodo dell?Esempio 1. La selezione dei trasformanti viene effettuata su mezzo di agar RCGP contenente 0,5 mg/ rnl di 4-metiltriptofano oppure 0,5 mg/ml di 6-fluorotript ofano, con o senza 200 ^ug/ml di kanamicina.

Vengono selezionate le colonie fatte sviluppare su mezzo di agar MI contenente 0,5 mg/ml del corrispondente analogo del triptofano e su mezzo di agar NB contenente 10 ^ug/ml di kanamicina.

I trasformanti cos? ottenuti hanno il plasmide che alloggia un gene codificante per la sintetasi dell'acido antranilico insensibile al triptofano.

La sintetasi dell?acido antranilico codificata da uno dei plasmidi, pTrp 15 - 2, viene inibita al 50 % con triptofano 0,25 mM, che ? 40 volte superiore alla concentrazione di triptofano (0,006 M) necessaria per inibire al 50 % la sintetasi dell'acido antranilico codificata da pTrp 9- 1.

II Corynebacterium glutamicum LAR-1 ? stato trasformato con pTrp 15- 2 con lo stesso metodo dell' Esempio 1. Il trasformante cos? ottenuto ? stato depositato presso la "American Type Culture Collecion" come Corynebacterium glutamicum K57, ATCC 59285.

5) Produzione di triptofano mediante il trasformante :

Il Corynebacterium glutamicum K57, ATCC 59285

41.

contenente-pTrp 13 - 2 ? etato sperimentato per la produzione di triptofa.no nel modo seguente:

Il ceppo e stato coltivato con scuotimento a

30? C. in mezzo NB per 16 ore e 0,5 mi del brodo di coltura sono stati inoculati in 5 mi del mezzo di produzione P4 (pH 7,2) costituito da 100 g/1 di melasse, 20 g/'l di (NH^ SG^, 0,5 g/1 di KH2P0^, 0,5 g/1 di K2HP04, 0,25 g/1 di Hg504*7H20, e 20 g/1 di CaCO.,. La coltura ? stata effettuata con scuo-3

timento a 30? C. per 96 ore.

Dopo coltura, il filtrato di coltura ? stato sottoposto a cromatografia su carta. Dopo reazione cromatica con ninidrina, la quantit? di L-triptofano prodotta ? stata determinata mediante un metodo colorimetrico.

Come ceppi di controllo sono stati impiegati il ceppo LAR-1 ed il ceppo LAR-l/pTrp 9- 1. LAR-1/ pTrp 9 - 1 ? stato preparato con la stessa trasformazione del ceppo LAR-1 precedentemente indicata.

I risultati vengono rappresentati nella Tabella 2.

Tabella 2

Quantit? di L-tripto-Ceppo fano (mg/ml ) _ LAR-1 0,4

LAR-1 / pTrp 9 - 1 0,7

LAR-1 / pTrp 13-2 1,2 Richiedente: (102) ivYuw'A HAKKO K.0GY0 CO., -ul?D.

Lhukuo uinoshita, Direttore rappresentativo.

42.

???,?????? TYP su CuLl'uR? COALDCT?ON

12301 Parklawn Drive , Rockville , Maryland 20582 , U . S.A .

I RAIVATO Di ?JJDAPJ?'S'I SuLliA oUKVjjiNNl OiiF

IN IlivNiwjlOuALN Rjj J_I A ? i V A AD ??'????? Di MIOri-OORCrAiilSMI

Al FJ.N 1 DI 'UuA PROCDDU K? DI EhEVETTO

i'-i ODE nLO IN TEidiA L i 0 A ALF

All' 111. Mr. Nels T. Lippert RICEVUTA NEL CASO DI Fitzpatrick, Cella, Harper & Scinto UN DEPOSITO ORIGINALE 277 Park Avenue rilasciata in conformit? New York, New York 10172 alla Norma 7.3 dall? Nome ed indirizzo del IATERDATIONAL DEPOSITARY depositario e relativo AUTriORITY Procuratore

Riferimento di .identificazione Numero di iscrizione fornito dal DEPOSITARIO: fornito dall'ATCC:

Corynebacterium glutamicum K 17 39032

Corynebac terium glutamicum K 18 39033 Corynebacterium glutamicum K 19 39034

Corynebac terium glutamicum K 20 39035

I microorganismi precedentemente identificati sono accompagnati da:

una descrizione scientifica

XX una designazione tassonomica proposta:

Corynebacterium glutamicum

I mi croorgc nimsi precedentemente identificati sono

43.

stati ricevuti il 21 Dicembre, ISSI da quest

national Depositary Authority e sono stati accettati.

dome della Firma della persona che ha International Depositary Authority: la potest? di rappresentare Ar;ierican Type Culture Collection la American Type Culture Indirizzo: 12301 Parklawn Drive Collection :

Rockville, Md. 20852 F.to Bobbie A. Brandon U. S. A. Data: 2S Dicembre, 1981. cc: Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.

6-1, Ohtemachi 1-chome

Chiyoda-ku, Tokyo, Giappone.

Assistenza: Tadaaki Nomura Sezione Brevetti.

44.

AMERICAN ? ??? CULT U RE SO^LXXT I ON

12301 Parklawn Drive , Ro ckville , Ka ryland 20852 , U . S .A .

T ? LA i.1 J. A I U ^1 .OIJ DAPEOT JUXJL^

i iii x ???L?^??! Ui< ALE I^ATIVA AL Dr#P0?iT0 DI filCllUURGARlBMI

Ai Eli?! DI Dii P'KuGEDuRA DI BREVETTO

jviODf-. i ITI(J IwTiiKi^AiiiODAijL?

Alla Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd. RICEVUTA DDL GASO DI?.

6-1, Ohtemachi 1-chome UN DEPOjITO ORIGINALE Chiyoda-ku, Tokyo, Giappone rilasciata in conformit? Assistenza: Shigetoshi Wakaki alla Norma 7.3 dall' Nome ed Indirizzo del INTERNATIONAL DEPOSITARY depositario e relativo AUTHORITY

Procuratore

Riferimento di identificazione Numero di iscrizione fornito dal DEPOSIT?RIO: fornito dall'ATCC:

Corynebacterium glutarnicum K 31 ATCC 39280 Corynebacterium glutarnicum K 32 ATCC 39281 Corynebacterium herculis K 33 ATCC 39282 Brevibacterium flavum K 34 ?ICC 39283

Brevibacterium lactofermentum K 35 ?TCC 39284

I microorganismi precedentemente identificati

sono accompagnati da:

una descrizione scientifica

XX una designazione tassonomica proposta :

Corynebacterium glutarnicum, Corvn e bacterium

45.

herculis, Brevibacterium flavum e Brevibacten um

lactofermentum .

I microorganismi precedentemente identificati sono stati ricevuti il 28 G-ennaio, 1983 da questa

International Depositary Authority e sono stati accettati .

Nome della Firma della persona che Int?rnational Depositary Authority: ha la potest? di rappresentare Indirizzo : 12301 Parklawn Drive la American Type Culture Rockville , Kd . 20852 Collection :

U . S . A . F.to Bobbie A. Brandon

cc: 111. Mr. Nels T. Lippert, Data : 4 Febbraio , 1983.

Fitzpatrick, Cella, Harper &. Sci nto

277 Park Avenue

New York, New York 10172.

46.

AMERICAN lYPE Cuni'URE GULnECTION

12301 Parklawn Drive, Rockvi?le, Maryland 20852, U.S.A.

rIVA-i. A1? ni nUDAPEal ?iinLA uUnVnntjI0nE

Ini'nRnA^J-O??ALD ituLATIVA AL DEPOSITO DI.MICROORGANISMI

Al Fini JI UnA PRuCnnURA DI DAJCVDTTO

MuDnLLO INTERNA Z I ONALE

?llq Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. RICEVUTA NEL CASO DI 6-1, Ohtemachi 1-chome UN DEPOSITO'ORIGINALE Chiyoda-ku, Tokyo, Giappone rilasciata in conformit? Assistenza: Shigetoshi Wakaki alla Norma 7.3 dall' Nome ed Indirizzo del In1ERNA TIONAL DEPOSITARY depositario e relativo Procuratore AUTHORITY

Riferimento di identificazione Numero di iscrizione fornito dal DEPOSITARIO: fornito dall'ATCC:

Corynebacterium glutamicum K-37 ATCC 39285

Il microorganismo precedentemente identificato ? accompagnato da:

_ una descrizione scientifica

XX una designazione tassonomica proposta:

Corynebacterium glutamicum

Il microorganismo precedentemente identificato ?

stato ricevuto il 31 Gennaio, 1983 da questa International Depositary Authority ed ? stato accettato.

Rome della International Firma della persona che ha Depositary Authority: la potest? di rappresentare

47

American Type Culture Collection

Inc?. i 371 z z o i 1 ^501 rarklawn Drive American TypG Rockvi11 e, Md. 20852 Culture Collection:

U. 3. A, F.to Bobtie A. Brandon cc: 111. Mr. Nels T. Lippert Data: 4 Febbraio, 1983

Fitzpatrick, Cella, Harper & Scinto

277 Park Avenue

New York, New York 10172.

48.

Claims (1)

1. R I U L V ? T A

   Al la !\o . : 164-58

   Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Data : 8 Febbraio , 1 S83. ohukuo Xinoshita Fermentation Research Institute Direttore rappresentativo. ?gen cy of Industriai Science 1 . iriDx'.i li lUnn?UnD DDL and Technology

   nlOKuO ??-??? I S i-iO : Yoshimasa Takahara Riferimento di identifica- Direttore G-enerale > zione fornito dal depositario: Fumer? di iscrizione:

   Corynebacterium g?utamicum X.56 RDRIJp-b?08 IX m D^odx\x iL)A? D/O Dno^Oi^ii^lOnD ?ASSO~

   n Un?J-H. ynoiosiA

   Il microorganismo identificato in I ? accompagnato da:

   una descrizione scientifica

   una designazione tassonomica proposta

   III. RIOii???'A J?D AdUDITAZIuFL:

   Questo Ufficio addetto al deposito iscrive il microorganismo identificato in I, che viene ricevuto

   l 1 S Febbraio , 1985.

   m TRADUZIONE CONFORME

   log. Giuseppe QUINTERNO

   Ilo proprio e per gli eltrlJ

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