JPH01281076A - 形質転換体 - Google Patents
形質転換体Info
- Publication number
- JPH01281076A JPH01281076A JP63111828A JP11182888A JPH01281076A JP H01281076 A JPH01281076 A JP H01281076A JP 63111828 A JP63111828 A JP 63111828A JP 11182888 A JP11182888 A JP 11182888A JP H01281076 A JPH01281076 A JP H01281076A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- recombinant plasmid
- transformant
- plasmid
- threonine
- rettgeri
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〈産業上の利用分野〉
本発明は、グロビデンシア属の微生物において、娘細胞
に安定に分配される組換え体プラスミドを含有する形質
転換体に関する。
に安定に分配される組換え体プラスミドを含有する形質
転換体に関する。
〈従来の技術〉
グロビデンシア レットゲリ（Ｐｒｏｗ １ｄｅｎｃ
ｉａｒｅｔｔｇｅｒ；、以下Ｐ、 ｒｅｔｔｇｅｒｉと
略す）はＬ−スレオニン、■、−トリプトファンなどの
有用物質の発酵生産に利用されている。
ｉａｒｅｔｔｇｅｒ；、以下Ｐ、 ｒｅｔｔｇｅｒｉと
略す）はＬ−スレオニン、■、−トリプトファンなどの
有用物質の発酵生産に利用されている。
ｐ、 ｒ６ｔｔｕｒｉに遺伝子操作を適用し、上記有用
物質の生産性を向上させる試みがなされている（特開昭
６２−９１１９２号公報）。
物質の生産性を向上させる試みがなされている（特開昭
６２−９１１９２号公報）。
〈発明が解決しようとする問題点〉
しかしながら、公知の方法では、組換え体プラスミドの
脱落のために、遺伝子操作の効果が満足に発揮されてい
ない０組換え体プラスミドの脱落を防止するなめに、組
換え体プラスミドの持つ薬剤耐性マーカーを利用して、
つまり、薬剤を培地中に添加して培養を行なうことも可
能であるが、製品中に薬剤が混入してくるなどの問題が
あり好ましくない、従って薬剤を添加することなく、組
換え体プラスミドの脱落を抑えることができれば、有用
物質の生産に選伝子操作の有効性を最大限に発揮するこ
とができる。
脱落のために、遺伝子操作の効果が満足に発揮されてい
ない０組換え体プラスミドの脱落を防止するなめに、組
換え体プラスミドの持つ薬剤耐性マーカーを利用して、
つまり、薬剤を培地中に添加して培養を行なうことも可
能であるが、製品中に薬剤が混入してくるなどの問題が
あり好ましくない、従って薬剤を添加することなく、組
換え体プラスミドの脱落を抑えることができれば、有用
物質の生産に選伝子操作の有効性を最大限に発揮するこ
とができる。
本発明者らは、かかる状況に鑑み、創意工夫をなし、Ｐ
、 ｒａｔｔｇｅｒ＋の組換え体プラスミドが安定に娘
ＨＵ砲に分配される形質転換体を製造することに成功し
、かくして本発明を完成させるに至った。
、 ｒａｔｔｇｅｒ＋の組換え体プラスミドが安定に娘
ＨＵ砲に分配される形質転換体を製造することに成功し
、かくして本発明を完成させるに至った。
く問題を解決する手段〉
すなわち本発明は、ｐ、 ｒｅｔｔｇｅｒｉにおいて、
組換え体プラスミドが安定に娘細胞に分配される形質転
換体およびその製造法を提供するものである。
組換え体プラスミドが安定に娘細胞に分配される形質転
換体およびその製造法を提供するものである。
以下本発明に関し、逐次詳細に説明する。
組換え体１ラスミドの脱落しやすい形質転換体を、薬剤
添加による選択圧をかけずに長時間培養を続けると、組
換え体プラスミドは菌体増殖中に脱落し、組換え体プラ
スミドを含有しない菌の割合がしだいに上昇する。しか
しこの培養中に、組換え体プラスミドが脱落しにくくな
った自然突然変異株が出現すれば、その後培養を続ける
と、組換え体プラスミドを含有する菌中における組換え
体プラスミドが脱落しにくくなった変異株の割合は増大
する。そのため組換え体プラスミドを含有する菌から、
組換え体プラスミドが脱落しにくくなった変異形質転換
体は容易に選出することができる。
添加による選択圧をかけずに長時間培養を続けると、組
換え体プラスミドは菌体増殖中に脱落し、組換え体プラ
スミドを含有しない菌の割合がしだいに上昇する。しか
しこの培養中に、組換え体プラスミドが脱落しにくくな
った自然突然変異株が出現すれば、その後培養を続ける
と、組換え体プラスミドを含有する菌中における組換え
体プラスミドが脱落しにくくなった変異株の割合は増大
する。そのため組換え体プラスミドを含有する菌から、
組換え体プラスミドが脱落しにくくなった変異形質転換
体は容易に選出することができる。
かくして得られた組換え体プラスミドが脱落しにくくな
った形質転換体には、宿主染色体の変異に起因するもの
および組換え体プラスミドの変異に起因するものが存在
する。
った形質転換体には、宿主染色体の変異に起因するもの
および組換え体プラスミドの変異に起因するものが存在
する。
組換え本プラスミドが脱落しにくくなったグロビデンシ
ア属の微生物の形質転換体としては、たとえば、Ｐ、
ｒｅｔｔｇｅｒｉ ＴＰ６−２８＃８がある０本菌株は
、ベクタ−プラスミドｐＹＵ３００とＰ、 ｒｅｔｔｇ
ｅｒｉ ＴＰ６−２８ ３００の由来＜ＦＲ工研り寄第
１１３５号）のし−スレオニン生産を司る遺伝子を含む
８．７ ｋ ｂのＤＮＡ断片からなった組換え体プラス
ミドｐＹＵ３５０を含有する形質転換ｆ１ｇＰ、 ｒｅ
ｔｔｏｅｒｉ （ｐ ＹＵ ３５０）から作製した組
換え体プラスミドが脱落しにくくなった形質転換体であ
り、微工研菌寄第９５３８号として寄託した。
ア属の微生物の形質転換体としては、たとえば、Ｐ、
ｒｅｔｔｇｅｒｉ ＴＰ６−２８＃８がある０本菌株は
、ベクタ−プラスミドｐＹＵ３００とＰ、 ｒｅｔｔｇ
ｅｒｉ ＴＰ６−２８ ３００の由来＜ＦＲ工研り寄第
１１３５号）のし−スレオニン生産を司る遺伝子を含む
８．７ ｋ ｂのＤＮＡ断片からなった組換え体プラス
ミドｐＹＵ３５０を含有する形質転換ｆ１ｇＰ、 ｒｅ
ｔｔｏｅｒｉ （ｐ ＹＵ ３５０）から作製した組
換え体プラスミドが脱落しにくくなった形質転換体であ
り、微工研菌寄第９５３８号として寄託した。
組換え体プラスミドが脱落しにくくなった形質転換体を
製造するための培養に用いる培地の組成は、形質転換体
が生育できるものであれば何でもよく、たとえば、し培
地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩
化ナトリウム、ｐＨ７，５）がある、培養温度は形質転
換体が生育可能な範囲であればよく、好ましくは３０〜
４０℃で行なう、形質転換体の培養における細胞の分裂
回数も制限はないが、１０〜１００世代が適当である。
製造するための培養に用いる培地の組成は、形質転換体
が生育できるものであれば何でもよく、たとえば、し培
地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩
化ナトリウム、ｐＨ７，５）がある、培養温度は形質転
換体が生育可能な範囲であればよく、好ましくは３０〜
４０℃で行なう、形質転換体の培養における細胞の分裂
回数も制限はないが、１０〜１００世代が適当である。
組換え体プラスミドの脱落が低下した形質転換体を得る
ためには、長時間における培養中におこる自然突然変異
だけでなく、人工的な変異処理、タトエハ、Ｎ−ニトロ
−Ｎ″−二トローＮ−二トロングアニジン、エチルメタ
ンスルホン酸などの化学物質による処理、また紫外線、
γ線などの電磁波の照射による処理を行なってから培養
するとさらに効果的である。
ためには、長時間における培養中におこる自然突然変異
だけでなく、人工的な変異処理、タトエハ、Ｎ−ニトロ
−Ｎ″−二トローＮ−二トロングアニジン、エチルメタ
ンスルホン酸などの化学物質による処理、また紫外線、
γ線などの電磁波の照射による処理を行なってから培養
するとさらに効果的である。
培養後、組換え体プラスミドが脱落しにくくなった変異
形質転換体を選出するためには、まず組換え体プラスミ
ドの持つ遺伝マーカー、たとえば薬剤耐性マーカーによ
って組換え体プラスミドを含有する形質転換体を選択し
、次いで、組換え体プラスミドが脱落しにくくなった菌
株を選出すればよい。
形質転換体を選出するためには、まず組換え体プラスミ
ドの持つ遺伝マーカー、たとえば薬剤耐性マーカーによ
って組換え体プラスミドを含有する形質転換体を選択し
、次いで、組換え体プラスミドが脱落しにくくなった菌
株を選出すればよい。
Ｌ−スレオニン生産を司る遺伝子を含む組換え体プラス
ミドを含有する形質転換体、たとえば、Ｐ、 ｒｅｔｔ
ｇｅｒｉ ＴＰ６−２８ （ｐＹＵ３５０）から作製し
た組換え体プラスミドが脱落しにくくなった形質転換体
Ｐ、 ｒｅｔｔｇｅｒｉ ’Ｉ’ Ｐ ６−２８＃８を
利用すれば、遺伝子操作の効果が満足に発揮できる。つ
まり、Ｌ−スレオニン発酵培地中で培養することにより
、好収率でＬ−スレオニンを培養液中に蓄積せしめるこ
とが可能となる。培地としては炭素源、窒素源、無機イ
オン、さらに必要に応じアミノ酸を含む通常のものでよ
い、炭素源としては、グルコース、ショ糖などおよびこ
れらを含有する澱粉加水分解物、糖蜜加水分解物などが
用いられる。窒素源としてはアンモニア水、アンモニウ
ム塩が使用できる。
ミドを含有する形質転換体、たとえば、Ｐ、 ｒｅｔｔ
ｇｅｒｉ ＴＰ６−２８ （ｐＹＵ３５０）から作製し
た組換え体プラスミドが脱落しにくくなった形質転換体
Ｐ、 ｒｅｔｔｇｅｒｉ ’Ｉ’ Ｐ ６−２８＃８を
利用すれば、遺伝子操作の効果が満足に発揮できる。つ
まり、Ｌ−スレオニン発酵培地中で培養することにより
、好収率でＬ−スレオニンを培養液中に蓄積せしめるこ
とが可能となる。培地としては炭素源、窒素源、無機イ
オン、さらに必要に応じアミノ酸を含む通常のものでよ
い、炭素源としては、グルコース、ショ糖などおよびこ
れらを含有する澱粉加水分解物、糖蜜加水分解物などが
用いられる。窒素源としてはアンモニア水、アンモニウ
ム塩が使用できる。
培養は好気条件下で培地のＰＨおよび温度を適宜調節し
つつ行なえばよい。
つつ行なえばよい。
本発明の形質転換体微生物を用いることにより、従来知
られているｐ、 ｒｅｔｔｇｅｒ；のＬ−スレオニン生
産菌を用いる場合に比べ、Ｌ−スレオニンの蓄積濃度が
高いばかりでなく、副生ずる池のアミノ酸を減少させる
ことができる。
られているｐ、 ｒｅｔｔｇｅｒ；のＬ−スレオニン生
産菌を用いる場合に比べ、Ｌ−スレオニンの蓄積濃度が
高いばかりでなく、副生ずる池のアミノ酸を減少させる
ことができる。
培養液からＬ−スレオニンは、イオン交換樹脂法、活性
炭吸着法など公知の方法によって回収される。
炭吸着法など公知の方法によって回収される。
〈実施例〉
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。
。
実施例１
（１）プラスミド脱落低下株の取得
Ｐ、 ｒｅｔｔｇｅｒｉ ＴＰ６−２８ （ｐＹｔＪ３
５０）をＬ培地中、３７℃で約５０世代培養後１０μ「
７ｍ１のクロラムフェニコールを含むＬ培地寒天平板上
に撒き、３７℃の静置培養で組換え体プラスミド含有菌
株の選択培養を行なった。培養２日日で生じたコロニー
をＬ培地中で約１０世代培養後、クロラムフェニコール
耐性により、組換え体プラスミドを含有する菌の割合を
測定し、Ｐ、 ｒｅｔｔｇｅｒｉ Ｔ Ｐ ６−２８
（ｐＹｔＪ３５０）より組換え体プラスミドが脱落しに
くくなった菌株を得た。この菌株の含有する組換え体プ
ラスミドの挿入ＤＮＡの長さは、ｐＹＵ３５０と同様に
８．７ ｋ ｂであった。この組換え体プラスミドが脱
落しにくくなった菌株をＰ、 ｒｅｔｔｇｅｒｉ Ｔ
Ｐ ６−２８＃８と名づけな。
５０）をＬ培地中、３７℃で約５０世代培養後１０μ「
７ｍ１のクロラムフェニコールを含むＬ培地寒天平板上
に撒き、３７℃の静置培養で組換え体プラスミド含有菌
株の選択培養を行なった。培養２日日で生じたコロニー
をＬ培地中で約１０世代培養後、クロラムフェニコール
耐性により、組換え体プラスミドを含有する菌の割合を
測定し、Ｐ、 ｒｅｔｔｇｅｒｉ Ｔ Ｐ ６−２８
（ｐＹｔＪ３５０）より組換え体プラスミドが脱落しに
くくなった菌株を得た。この菌株の含有する組換え体プ
ラスミドの挿入ＤＮＡの長さは、ｐＹＵ３５０と同様に
８．７ ｋ ｂであった。この組換え体プラスミドが脱
落しにくくなった菌株をＰ、 ｒｅｔｔｇｅｒｉ Ｔ
Ｐ ６−２８＃８と名づけな。
（２）組換え体プラスミドの脱落低下の確認Ｐ、 ｒｅ
ｔｔｇｅｒｉ ＴＰ６−２８ （ｐＹＵ３５０）および
Ｐ、 ｒｅｔｔｇｅｒｉ ＴＰ６−２８＃８をＬ培地中
、３７℃で１０世代培養し、Ｌ培地寒天平板上に撒き、
３７℃の静置培養で出現したコロニーそれぞれ１００個
を１０μｚ ／ ｍｌのクロラムフェニコールを含むし
培地寒天平板上に植菌し、３７℃で１日静置培養した。
ｔｔｇｅｒｉ ＴＰ６−２８ （ｐＹＵ３５０）および
Ｐ、 ｒｅｔｔｇｅｒｉ ＴＰ６−２８＃８をＬ培地中
、３７℃で１０世代培養し、Ｌ培地寒天平板上に撒き、
３７℃の静置培養で出現したコロニーそれぞれ１００個
を１０μｚ ／ ｍｌのクロラムフェニコールを含むし
培地寒天平板上に植菌し、３７℃で１日静置培養した。
生育のあっなコ０ニー数は、Ｐ、 ｒｅｔｔｇｅｒｉ
ＴＰ６−２８ （ｐＹＵ３５０）では０個であったのに
対し、Ｐ、 ｒｅｔｔｇｅｒｉ ＴＰ６−２８＃８では
６０個であった。
ＴＰ６−２８ （ｐＹＵ３５０）では０個であったのに
対し、Ｐ、 ｒｅｔｔｇｅｒｉ ＴＰ６−２８＃８では
６０個であった。
（３）スレオニンの発酵生産
５００ｍ１の坂ロフラスコに培地（８％グルコース、２
％硫酸アンモニウム、０，１％ＫＨ２ＰＯ４，０，０４
％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０，１０ｐｐｍＦｅＳＯ４・７Ｈ
２０，７ｐｐｍＭｎＣ＋２−４Ｈ２０，５０ｐｐｍＬ＝
インロイシン、６００ｐｐｍ Ｌ−ロイシン、４％Ｃ
ａＣｏ３、ｐＨ７，０）５０ｍｌ中、３０°Ｃ７０時間
培養し、培養液中のスレオニン含量をアミノ酸自動分析
計で定量した結果を第１表に示した。プラスミドが脱落
しにくくなったＰ、 ｒｅｔｔｇｅｒｉ ＴＰ６−２８
＃８では、Ｌ−スレオニンの蓄積量が増加しただけでは
なく、副生するアラニン、バリンが減少した。
％硫酸アンモニウム、０，１％ＫＨ２ＰＯ４，０，０４
％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０，１０ｐｐｍＦｅＳＯ４・７Ｈ
２０，７ｐｐｍＭｎＣ＋２−４Ｈ２０，５０ｐｐｍＬ＝
インロイシン、６００ｐｐｍ Ｌ−ロイシン、４％Ｃ
ａＣｏ３、ｐＨ７，０）５０ｍｌ中、３０°Ｃ７０時間
培養し、培養液中のスレオニン含量をアミノ酸自動分析
計で定量した結果を第１表に示した。プラスミドが脱落
しにくくなったＰ、 ｒｅｔｔｇｅｒｉ ＴＰ６−２８
＃８では、Ｌ−スレオニンの蓄積量が増加しただけでは
なく、副生するアラニン、バリンが減少した。
第 １ 表
〈発明の効果〉
本発明によれば、グロビデンシアの微生物の形質転換体
の培養においてプラスミドの脱落防止のために薬剤を添
加することなく組換え体プラスミドの極めて脱落しにく
い形質転換体を得ることができる。従ってプロビデンシ
ア属の形質転換体を用いた有用物質の工業的生産に極め
て有利である。
の培養においてプラスミドの脱落防止のために薬剤を添
加することなく組換え体プラスミドの極めて脱落しにく
い形質転換体を得ることができる。従ってプロビデンシ
ア属の形質転換体を用いた有用物質の工業的生産に極め
て有利である。
Claims (2)
- （１）プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属に
属する微生物由来のＬ−スレオニン生産を司る遺伝子を
含むＤＮＡ断片とプロビデンシア属の微生物内で自律増
殖可能なベクタ−プラスミドとの組換え体プラスミドを
含有するプロビデンシア属に属する微生物の形質転換体
であって、細胞分裂時に娘細胞へ９５％以上の割合で組
換え体プラスミドが分配される形質転換体。 - （２）ベクタ−プラスミドがｐＹＵ３００である特許請
求の範囲第１項記載の形質転換体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63111828A JPH01281076A (ja) | 1988-05-09 | 1988-05-09 | 形質転換体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63111828A JPH01281076A (ja) | 1988-05-09 | 1988-05-09 | 形質転換体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01281076A true JPH01281076A (ja) | 1989-11-13 |
Family
ID=14571186
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63111828A Pending JPH01281076A (ja) | 1988-05-09 | 1988-05-09 | 形質転換体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01281076A (ja) |
-
1988
- 1988-05-09 JP JP63111828A patent/JPH01281076A/ja active Pending
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