ITMI990061A1

ITMI990061A1 - Macrolidi ad attivita' antiinfiammatoria

Info

Publication number: ITMI990061A1
Application number: IT1999MI000061A
Authority: IT
Inventors: Franco Pellacini; Daniela Botta; Stefano Romagnano; Lorenzo Pradella; Ermanno Moriggi
Original assignee: Zambon Spa
Priority date: 1999-01-15
Filing date: 1999-01-15
Publication date: 2000-07-15
Also published as: ES2251966T3; MXPA01007164A; HU229228B1; DE60023647T2; HUP0105105A3; EP1144427A3; CA2368400C; SK9812001A3; NO318982B1; ZA200105748B; IL144044A0; SK286772B6; RU2243230C2; EP1144427A2; US6455576B1; IT1306205B1; CN1151165C; HUP0105105A2; EP1144427B1; AU769006B2

Description

“Macrolidi ad attività antiinfiammatoria”

Descrizione

La presente invenzione riguarda macrolidi ad attività antiinfiammatoria e, più in particolare, riguarda derivati des-dimetilammino macrolidici ad attività antiinfiammatoria, loro sali farmaceuticamente accettabili e composizioni farmaceutiche che li contengono in qualità di principio attivo.

E’ noto che diversi antibiotici, in particolare la classe dei macrolidi a 14 atomi derivati di eritromicina sono dotati di proprietà antiinfiammatorie in aggiunta all'attività antibatterica [Clin. Immunother., (1996), 6, 454-464], Eritromicina è un macrolide naturale (The Merck Index, XII edizione, n° 3720, pag. 625) che ha avuto un uso clinico molto ampio nel trattamento di infezioni causate da bateri Gram-positivi, da alcuni Gram-negativi o da Micoplasmi.

Recentemente l’interesse della comunità scientifica si è rivolto verso la componente antiinfiammatoria ed immunomodulatrice di eritromicina e derivati [. Journal of Antimìcrobìal Chemotherapy, (1998), 41, Suppl. B, 37-46].

Tale attività è ben documentata sia da studi clinici che da esperimenti in vìvo e in vitro.

Ad esempio, i macrolidi si sono rivelati efficaci nella terapia di patologie infiammatorie quali le panbronchioliti [Thorax, (1997), 52, 915-918], l’asma bronchiale [Chest, (1991), 99, 670-673] e la fibrosi cistica [The Lancet, (1998), 351, 420], sia in modelli animali di infiammazione quali, ad esempio, la peritonite indotta nel topo da zimosan [Journal of Antimìcrobìal Chemotherapy, (1992), 30, 339-348] e l’accumulo di neutrofili indotto da endotossina nella trachea di ratto [Antimìcrobìal Agents and Chemotherapy, (1994), 38, 1641-1643] sia in studi in vitro su cellule del sistema immunitario, quali i neutrofili [The Journal of Immunologi >, (1997), 159, 3395-4005] e i linfociti T [Life Sciences, (1992), 51, PL 231-236] o sulla modulazione di citochine, quali l’interleuchina 8 (IL-8) [Am. J. Respir. Crii. Care Med., (1997), 156, 266-271] o l’interleuchina 5 (IL-5) (domande di brevetto EP 0 775 489 ed EP 0 771 564, a nome Taisho Pharmaceutical Co., Ltd).

La peculiare efficacia terapeutica dei macrolidi in patologie in cui i tradizionali farmaci antiinfiammatori, quali ad esempio i corticosterodi, si sono rivelati inefficaci [ Thorax , (1997), 52, 915-918, già citato] giustifica il notevole interesse nei confronti di questa nuova potenziale classe di antiinfiammatori.

Tuttavia la potente attività antibatterica dei macrolidi classici non ne consente l’uso allargato nel trattamento cronico di processi infiammatori non causati da microrganismi patogeni a causa della rapida insorgenza di ceppi resistenti.

Sarebbe quindi desiderabile disporre di nuove sostanze a struttura macrolidica che presentino attività antiinfiammatorie e che siano al tempo stesso prive di proprietà antibiotiche.

Per maggior chiarezza riportiamo la formula della eritromicina in cui viene indicata la numerazione adottata nella presente domanda di brevetto.

In letteratura sono descritte alcune classi di derivati di eritromicina dotate di spiccata attività antiinfiammatoria.

Ad esempio, nelle già citate domande di brevetto europeo a nome Taisho vengono rivendicati derivati di eritromicina modificati in posizione 3, 9, 11 e 12, come potenti inibitori della sintesi di IL-5.

N-alchilderivati di azitromicina, privi di cladinosio e di desosammina, di formula

R1 è idrogeno, un alchile inferiore o un alcanoile inferiore; R2, R3 ed R4, uguali o diversi tra loro, sono idrogeno o un alcanoile inferiore; vengono descritti come antiinfiammatori nella domanda di brevetto EP 0283 055 (Sour Pliva).

L’uso di eritromicina come antiinfiammatorio che agisce riducendo il rilascio di interleuchina 1 attraverso l’inibizione della glicoproteina di mammifero mdr-P è rivendicato nella domanda di brevetto WO 92/16226 a nome Smith-KIine Beecham Corporation.

Tra i derivati macrolidici descritti in letteratura pochi sono 3'-desdimetilammino-9-ossimmino derivati. Lo scarso interesse verso questa classe di composti è giustificato dal fatto che è nota l'importanza del gruppo dimetilammino per l'attività di "binding" ribosomiale tipica dei macrolidi [Tetrahedron Letters, (1994), 35, 3837-3840],

Nel brevetto US 3.928.387 (Hoffinann-La Roche Ine.) viene descritta la 3'-desdimetilammino-3',4'-deidroeritromicina A ossima, come intermedio utile per la preparazione dell’antibiotico 1745A/X.

Nella domanda di brevetto EP 0254 534 (Robinson, William S.) viene rivendicata una amplissima classe di macrolidi ad attività antivirale. Tra questi è descritto il composto di formula

il cui nome chimico corretto è 3'-desdimetilammino-3',4'-deidroeritromicina A 9-O-metilossima sebbene nel testo della domanda di brevetto EP 0 254 534 venga erroneamente riportato come des-dimetilamminoeritromicina 9-O-metilossima (pag. 10, riga 46).

Abbiamo ora trovato che rimuovendo il gruppo dimetilammino dalla posizione 3’ della desosammina di 9-ossimmino macrolidi si ottengono composti dotati di attività antiinfiammatoria e sostanzialmente privi di proprietà antibiotiche. Costituiscono pertanto oggetto della presente invenzione i composti di formula

m cui

R è idrogeno o metile;

R1 ed R2 sono entrambi idrogeno oppure insieme formano un legame;

R3 è idrogeno, un gruppo alchilico C1-C5 lineare o ramificato, un gruppo benzile, . eventualmente sostituito con uno o due sostituenti scelti tra gruppi nitro, gruppi ossidrili, gruppi carbossilici, gruppi amminici, gruppi alchilici C1-C5 lineari 0 ramificati, gruppi C1-C4 alcossicarbonilici, gruppi amminocarbonilici o gruppi ciano, oppure una catena di formula

in cui

A è idrogeno oppure un gruppo fenile eventualmente sostituito con uno o due sostituenti scelti tra gruppi nitro, gruppi ossidrili, gruppi carbossilici, gruppi amminici, gruppi alchilici C1-C5 lineari o ramificati, gruppi C1-C4 alcossicarbonilici, gruppi amminocarbonilici 0 gruppi ciano, oppure un eterociclo a 5 o 6 termini, saturo o insaturo, contenente da 1 a 3 eternatomi scelti tra azoto, ossigeno e zolfo, eventualmente sostituito con uno o due sostituenti scelti tra gruppi alchilici C1-Cs, gruppi ossidrili, gruppi osso (=0), gruppi nitro, gruppi C1-C4 alcossicarbonilici, gruppi amminocarbonilici, gruppi mono- o di-C1-C4 alchilamminocarbonilici, gruppi C1-C4 alchilcarbonilici;

X e Y, uguali o diversi tra loro, rappresentano O, S, SO, S02 0 NR4, in cui R4 è idrogeno, un gruppo alchilico C1-C5 lineare o ramificato, un gruppo C1-C5 alcossicarbonile, un gruppo benzilossicarbonile;

r è un numero intero compreso tra 1 e 6;

m è un numero intero compreso tra 1 e 8;

n è un numero intero compreso tra 0 e 2;

e loro sali farmaceuticamente accettabili;

i composti 3'-desdimetilammino-3',4'-deidroeritromicina A ossima (R1 ed R2 = legame, R=H; R3=H) e 3'-desdimetilammino-3',4'-deidroeritromicina A 9-0-metilossima (R1 ed R2 = legame, R=H; R3=CH3) essendo esclusi.

Costituisce un ulteriore oggetto della presente invenzione l'uso dei composti 3'-desdimetilammino-3',4'-deidroeritromicina A ossima e 3'-desdimetilammino-3',4'-deidroeritromicina A 9-0-metilossima come antiinfiammatori.

I composti di formula I sono macrolidi antiinfiammatori privi di attività antibiotica e sono pertanto utili nel trattamento di patologie infiammatorie.

Con il termine gruppi alchilici C1-C5 lineari o ramificati si intende un gruppo scelto tra metile, etile, n-propile, isopropile, π-butile, isobutile, sec-butile, tertbutile, n-pentile ed isopentile.

Con il termine eterociclo a 5 0 6 termini, saturo 0 insaturo, contenente da 1 a 3 eteroatomi scelti tra azoto, ossigeno e zolfo si intendono eterocicli quali pirrolo, tiofene, furano, imidazolo, pirazolo, tiazolo, isotiazolo, isossazolo, ossazolo, piridina, pirazina, pirimidina, piridazina, triazolo, tiadiazolo e loro forme parzialmente o totalmente sature.

Composti preferiti di formula I sono i composti in cui R, R1 ed R2 sono idrogeno. Nellambito di questa classe sono particolarmente preferiti i composti in cui R3 è una catena di formula

tiazolile.

Esempi di sali farmaceuticamente accettabili dei composti di formula (I) sono sali con acidi organici od inorganici quali acido cloridrico, bromidrico, iodidrico, nitrico, solforico, fosforico, acetico, tartarico, citrico, benzoico, succinico e glutarico.

I composti di formula I, oggetto della presente invenzione, vengono preparati seguendo uno schema di sintesi che prevede (a) la rimozione del gruppo dimetilammino in posizione 3' e (b) l'eventuale funzionalizzazione dell'ossima. La rimozione del gruppo dimetilammino viene effettuata per ossidazione, pirolisi ed eventuale riduzione, secondo metodi noti. Appare chiaro all'esperto del ramo che, per evitare interferenze con gruppi funzionali eventualmente presenti nel sostituente R3, la rimozione del gruppo dimetilammino verrà preferibilmente eseguita a partire da intermedi di formula

in cui

R ha i significati già riportati ed R3' è idrogeno 0 un gruppo alchile C1-C5 lineare 0 ramificato.

Per ossidazione si ottengono i corrispondenti N-ossidi di formula

in cui

R ed R3' hanno i significati già riportati;

che per pirolisi, seguita eventualmente da riduzione, danno rispettivamente i composti di formula

oggetto della presente invenzione (I - R3= idrogeno o alchile C1-C5).

Dai composti di formula I-A ed I-B in cui R3’ è idrogeno possono essere preparati i composti di formula I in cui R3 è diverso da idrogeno per funzionalizzazione dell'ossima, secondo tecniche convenzionali.

Generalmente la funzionalizzazione viene effettuata per reazione con un composto di formula

(IV)

in cui R3" ha tutti i significati di R3 escluso idrogeno e W è un gruppo uscente, preferibilmente un atomo di cloro, bromo o un gruppo mesile.

Una via sintetica alternativa particolarmente indicata per la preparazione dei composti di formula I in cui R3 è una catena di formula

in cui

X, Y, A , r, m e n hanno i significati già riportati;

prevede la reazione di un composto di formula I in cui R3 è idrogeno con un intermedio di formula

in cui

W, X, Y, m e n hanno i significati già riportati e Z rappresenta un gruppo proteggente;

a dare l’intermedio di formula

in cui R, R1, R2, X, Y, Z, r e m hanno i significati già riportati;

che dopo rimozione del gruppo proteggente Z, viene fatto reagire con un derivato di formula

in cui A, W e n hanno i significati già riportati,

a dare i composti di formula I.

I composti di formula I in cui Y è NR4 possono essere preparati secondo la via sintetica sopra riportata anche utilizzando un'aldeide di formula

in cui A ha i significati già riportati;

in sostituzione deH'intermedio di formula VII, previa rimozione del gruppo proteggente Z dall'intermedio di formula VI.

Inoltre, i composti di formula I in cui RI=R2=H possono essere preparati per riduzione dei corrispondenti composti di formula I in cui R1 ed R2 formano un legame.

I composti di formula I, oggetto della presente invenzione, sono dotati di attività antiinfiammatoria e sono privi di attività antibiotica.

L'attività farmacologica dei composti di formula I è stata valutata attraverso test in vitro ed in vivo in confronto a macrolidi noti, quali eritromicina, claritromicina e roxitromicina, dotati sia di attività antiinfiammatoria sia di attività antibiotica. L'attività antiinfiammatoria è stata valutata in vitro come inibizione del rilascio di IL-8 e del rilascio di anioni superossido (esempio 10) ed in vivo come inibizione della necrofilia indotta da LPS dopo somministrazioni ripetute (esempio 11). In tutti gli esperimenti i composti oggetto della presente invenzione sono risultati molto attivi come antiinfiammatori e l'attività antiinfiammatoria è risultata essere pari o superiore a quella dei composti di confronto.

Per l’impiego in terapia i composti di formula I potranno essere usati in una forma farmaceutica adatta alla somministrazione orale o parenterale.

Costituiscono pertanto oggetto della presente invenzione composizioni farmaceutiche contenenti un quantitativo terapeuticamente efficace di un composto di formula I o di un suo sale in miscela con un veicolo farmaceuticamente accettabile.

Allo scopo di illustrare meglio la presente invenzione vengono ora fomiti i seguenti esempi.

Esempio 1

Preparazione del benzil estere dell’acido [6-(2-idrossi-etilammino>esillcarbammico

Ad una soluzione del benzil estere dell’acido (6-idrossi-esil)-carbammico (25 g; 99,47 mmoli), preparato come descritto nella domanda di brevetto WO 96/18633, in CH2CI2 (350 mi), raffreddata con ghiaccio intorno a 10°C, sono stati aggiunti dapprima una soluzione di KBr (1,18 g; 9,94 mmoli) in acqua (20 mi) e TEMPO (0,155 g; 0,994 mmoli) e poi, per gocciolamento in circa 15-20 minuti mantenendo la temperatura a 10-12°C, una soluzione preparata con NaHC03 (7,5 g; 89,28 mmoli) eNaOCl (soluzione acquosa al 4,5%; 197 mi; 125 mmoli).

Dopo 15 minuti dal temine del gocciolamento, le fasi sono state separate e la fase acquosa è stata estratta una volta con CH2C12 (100 mi). Gli estratti organici riuniti sono stati lavati due volte con acqua salata (NaCl 20%) ed anidrificati su sodio solfato.

Alla soluzione ottenuta (circa 800 mi) sono stati aggiunti setacci molecolari 3À (30 g) e poi, per gocciolamento veloce e raffreddando con acqua e ghiaccio, una soluzione di 2-amminoetanolo (35,9 mi; 0,597 moli) in etanolo (600 mi).

Terminato il gocciolamento la miscela è stata mantenuta sotto agitazione a temperatura ambiente per 2 ore e filtrata.

Alla soluzione ottenuta, sotto agitazione in atmosfera di azoto e raffreddata con acqua e ghiaccio, è stato aggiunto a porzioni NaBH4 (4,54 g; 120 mmoli).

Al termine dell’aggiunta, la miscela di reazione è stata mantenuta sotto agitazione a temperatura ambiente per 2 ore e quindi il solvente è stato evaporato.

Il residuo è stato ripreso con acqua ed etilacetato e le fasi sono state separate, estraendo ancora due volte la fase acquosa con etilacetato.

Gli estratti organici riuniti sono stati lavati con acqua salata (NaCl 20%), anidrificati su sodio solfato e concentrati fino ad ottenere un residuo oleoso che tende a solidificare.

Il residuo è stato sgranato con esano, filtrato e lavato con una miscela di esano ed etere etilico, ottenendo il benzil estere dell’acido [6-(2-idrossi-etilammino)-esil]-carbammico (26,22 g; resa 89%) come solido bianco.

Esempio 2

Preparazione del benzil estere dell’acido 6-fbenzilossicarbonilammìno-esilVÌ2-idrossi-etill-carbammico

Ad una soluzione di benzil estere dell’acido [6-(2-idrossi-etilammino)-esil]-carbammico (31,5 g; 0,107 moli), preparato come descritto nell’esempio 1, in una miscela di acqua (87 mi), NaOH IN (17 mi) ed etilacetato (180 mi), raffreddata a 0-5 °C, sono state aggiunte contemporaneamente per gocciolamento una soluzione di benzilcloroformiato (50% in toluene; 42,5 mi; 0,128 moli) in etilacetato (85,5 mi) ed NaOH 1N (128 mi; 0,128 moli), controllando la temperatura ed il pH (circa 8).

Terminato il gocciolamento, la miscela di reazione è stata mantenuta sotto agitazione per 30 minuti a 0-5°C, poi il raffreddamento è stato tolto ed è stato aggiunto ulteriore NaOH 1N (15 ml), per riportare il pH ad 8, lasciando poi sotto agitazione a temperatura ambiente per una notte.

Le fasi sono state separate e la fase acquosa è stata estratta ancora una volta con etilacetato. Gli estratti organici riuniti sono stati lavati con acqua salata, anidrificati su sodio solfato e concentrati sotto vuoto fino ad ottenere un residuo oleoso.

Per purificazione cromatografica (eluente etilacetato :etere di petrolio da 60:40 a 70:30) è stato ottenuto il benzil estere dellacido 6-(benzilossicarbonilamminoesil)-(2-idrossi-etil)-carbammico come olio (42,5 g; resa 92%).

Esempio 3

Preparazione di estere 2-rbenzilossicarbonil-f6-benzilossicarbonilammino-esillamminol-etilico dell’acido metansolfonico

Ad una soluzione di benzil estere dell’acido 6-(benzilossìcarbonìlammino-esil)-(2-idrossi-etil)-carbammico (13,78 g; 32,15 mmoli), preparato come descritto nell’esempio 2, in CH2CI2 (140 mi) è stata aggiunta trietilammina (8,95 mi; 64,31 mmoli). La miscela è stata raffreddata a 0-5°C e poi è stata aggiunta per gocciolamento una soluzione di metansolfonilcloruro (3,36 mi; 43,41 mmoli) in CH2C12 (20 ml).

Terminata l’aggiunta, la miscela di reazione è stata mantenuta sotto agitazione a temperatura ambiente per 60 minuti, quindi lavata con acido citrico acquoso al 5%, con acqua salata (NaC1 al 20%), con NaHC03 acquoso al 5% ed infine ancora con acqua salata. Dopo anidrificazione su sodio solfato ed evaporazione sotto vuoto è stato ottenuto l’estere 2-[benzilossicarbonil-(6-benzilossicarbonilamminoesil)-ammino]-etilico dell’acido metansolfonico (16,37 g; resa 100%) come olio bruno.

Operando in maniera analoga ma partendo da benzil estere dell’acido [2-(2-idrossi-etossi)-etil-carbammico è stato ottenuto:

estere 2-r2-(<'>benzilossicarbonil-ammino)-etossil-etilico dell’acido metansolfonico (resa 98%)

Esempio 4

Preparazione di eritromicina A ossima N-ossido

Ad una soluzione di eritromicina A ossima (35,00 g; 0,0467 moli) in metanolo (1400 mi) sotto agitazione meccanica è stata aggiunta per gocciolamento in 1 ora una soluzione di H202 (72,00 g; titolo 34% p/v; 0,72 moli) in acqua (780 mi), mantenendo la temperatura a 20-25°C. Al termine dell'aggiunta la miscela di reazione è stata mantenuta sotto agitazione a temperatura ambiente per 24 ore. Dopo aver aggiunto altra Η202 (8 ml), la miscela è stata mantenuta sotto agitazione per ulteriori 6 ore.

Il metanolo è stato evaporato sotto vuoto ad una temperatura di circa 40°C mantenendo costante il volume di acqua (circa 700 mi).

Eritromicina A ossima N-ossido è stato ottenuto dopo filtrazione, lavaggio con acqua ed essiccamento come solido bianco cristallino (36,3 g; resa 99%).

1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 10,71-10,19 (segnale broad, 2H, H mobili); 5,14-5,08 (m, IH, H-13); 4,72 (d, 1H, JHH=4,4 HZ, Η-1); 4,45 (d, IH, JHH=7,0 HZ, H-1 ').

Esempio 5

Preparazione di 3'-defdimetilammino)3'4'-deidro-eritromicina A ossima (Composto 1)

Una soluzione di eritromicina A ossima N-ossido (30,00 g; 38,3 mmoli), preparato come descritto nell'esempio 4, in dimetilformammide (235 mi) è stata scaldata a 150°C in un bagno ad olio preriscaldato (I75-180°C) e lasciata a tale temperatura sotto agitazione meccanica per 15-20 minuti.

Dopo raffreddamento ed evaporazione della dimetilformammide, il residuo oleoso è stato ripreso con acqua demineralizzata (500 mi), scaldato e raffreddato. Il solido filtrato è stato sgranato e seccato sotto vuoto a 40-45 °C ottenendo un grezzo (25,5 g).

Il grezzo è stato dapprima cristallizzato da acetonitrile (110 mi), filtrato, lavato con acqua ed essiccato sotto vuoto a 50°C ottenendo un prodotto cristallino (20 g) che è stato nuovamente cristallizzato da metanolo/acqua=65/35 (400 mi), filtrato ed essiccato sotto vuoto a 40-50°C.

E' stato così ottenuto il composto 1 come prodotto cristallino (10,3 g; resa 38,2%).

Dalle acque di cristallizzazione è stato poi recuperato ulteriore prodotto (3,7 g) con una resa totale del 51,8%.

Esempio 6

Preparazione di 3'-de(dimetilammino)-eritromicina A ossima (Composto 2) Ad una soluzione di composto 1 (20,00 g; 28,4 mmoli), preparato come descritto nell'esempio 5, in etanolo (850 ml) (la completa dissoluzione è stata ottenuta dopo leggero riscaldamento) è stato aggiunto a temperatura ambiente ossido di platino (0,615 g).

La miscela è stata posta sotto idrogenazione in apparecchio di Parr (1,36 atm) e l'assorbimento è stato immediato.

Dopo filtrazione del catalizzatore ed evaporazione del solvente sotto vuoto, il residuo bianco cristallino è stato sgranato con etere di petrolio, filtrato ed essiccato sotto vuoto a 50°C ottenendo composto 2 (19,8 g; resa 99%).

Esempio 7

Preparazione di 3'-defdimetilammino)-eritromicina A (E<'>)-9-(O-[2-[benzilossicarbonil-(6-benzilossi-carbonilammino-esil)amminol-etill-ossima] (Composto 3) Ad una soluzione di potassio teri-butilato 95% (2,45 g; 19,48 mmoli) in THF anidro (120 mi), sotto agitazione ed in atmosfera di azoto, è stato aggiunto composto 2 (12,51 g; 17,73 mmoli), preparato come descritto nell'esempio 6, mantenendo la temperatura intorno a 25°C.

La miscela di reazione è stata mantenuta sotto agitazione per 30 minuti a temperatura ambiente e sono stati aggiunti etere 18-crown-6 (4,69 g; 17,73 mmoli) e poi una soluzione dell’estere 2-[benzilossicarbonil-(6-benzilossicarbonilammino-esil)-ammino]-etilico dell’acido metansolfonico (8,98 g; 17,73 mmoli), preparato come descritto nell’esempio 3, in THF anidro (60 mi), lasciando sotto agitazione a temperatura ambiente per una notte.

Dopo evaporazione del solvente sotto vuoto, il residuo è stato ripreso con una miscela di etilacetato ed acqua salata (NaCl 20%) e le fasi sono state separate. La fase acquosa è stata estratta ancora con etilacetato. Gli estratti organici riuniti ed anidrificati sono stati concentrati sotto vuoto ottenendo un grezzo (23,4 g).

Per purificazione cromatografica (eluente CH2Cl2:CH30H=97:3) è stato ottenuto composto 3 (15,42 g), ancora leggermente impuro che è stato utilizzato senza ulteriori purificazioni.

1H-NMR (CDC13) δ (ppm): 7,35-7,28 (m, 10H, Ar); 5,14-5,06 (m, IH, H-13); 5,11 e 5,07 (2s, 4H, 2COOCH2); 4,84 (d, IH, JHH=4,4 ΗΖ, Η-Γ); 4,28 (d, IH, JHH=7,4 HZ, H-1').

Operando in maniera analoga sono stati ottenuti i seguenti composti:

3'-de(dimetilamminol-eritromicina A (E)-9-[O-[2-[2-(benzilossicarbonilamminoV etossil-etill -ossima) (Composto 4) da estere 2-[2-(benzilossicarbonil-ammino)-etossi]-etilico dell’acido metansolfonico

(resa 62%)

3'-defdimetilammino)-eritromicina A (E)-9-[O-[2-metossi-etossil-metill-ossimal (Composto 5) da metossi-etossi-metil cloniro

(resa 32,5%)

Esempio 8

Preparazione di 3'-de(dimetilamminoVeritromicina A (E)9-[O)-[2-[(6-amminoesil)amminol-etill-ossima] (Composto 6)

Ad una soluzione di composto 3 (15,42 g; 13,8 mmoli), ottenuto come descritto nell'esempio 7, in etanolo (160 mi) è stato aggiunto Pd/C al 10% (1,6 g).

La miscela è stata idrogenata in apparecchio di Parr (1,02 atm).

Dopo 2 ore il catalizzatore è stato filtrato ed il solvente è stato evaporato.

Il residuo è stato purificato per cromatografia flash (eluente CH2C12:CH30H:NH3=85:15:1,5 poi 80:20:2) ottenendo composto 6 (8,48 g) come solido amorfo bianco.

Operando in maniera analoga ma utilizzando composto 4 è stato ottenuto il seguente composto:

3'-de(dimetilammino)-eritromicina A (E)9-[O-[2-(2-ammino-etossi)-etil]-ossimal (Composto 7)

(resa 85%)

Esempio 9

Preparazione di 3'-deidimetilammino)-eritromicina A (Ε)-9-[Ο-[2-[6-[('tiazol-2-iimetil)-amminol-esil-amminol-etill-ossimal (Composto 8)

Una sospensione di composto 6 (3 g; 3,53 mmoli), preparato come descritto nell’esempio 8, 2-tiazolcarbaldeide 97% (0,412 g; 3,53 mmoli) e setacci molecolari (3À, 6,75 g) in etanolo (60 mi) è stata lasciata sotto agitazione per 3 ore.

Dopo aver filtrato su celite i setacci molecolari è stato aggiunto Pd/C al 10% (0,3 g) e la miscela è stata idrogenata in un idrogenatore Parr (1,02 atm). Dopo 20 ore il catalizzatore è stato filtrato ed il solvente evaporato.

Per purificazione cromatografica del residuo (eluente CHCl3:etere di petrolio:trietilammina=90:10:10) è stato ottenuto Composto 8 (1,66 g; resa 49,8%) come solido amorfo.

118,7 (s, CHS); 104,9 (s, C-1’); 96,3 (s, C-1"); 71,7 (s, N-O-C).

Operando in maniera analoga sono stati ottenuti:

Esempio 10

Attività farmacologica in vitro

A) Rilascio di interleuchina 8 (IL-8)

Una linea di cellule endoteliali umane immortalata (ECV304) è stata ottenuta da ATTC (Rockville, Md) e cresciuta in Medium 199, mod. Earle's salts (GIBCO, Life Technologies, Grand Island, N.Y.), integrata con 20% Foetal Calf Serum (GIBCO), 100 U/ml di penicillina e 100 μg/ml di streptomicina (SIGMA, St. Louis, MO) in atmosfera umidificata con 5% C02 a 37°C.

Le cellule sono state coltivate in piastre da 96 pozzetti fino ad ottenere un monostrato confluente.

I composti da valutare sono stati sciolti in DMSO a IO<'2 >M e diluiti con mezzo di coltura.

I composti sono stati pre-incubati con le cellule 1 ora prima della stimolazione. Il rilascio di IL-8 è stato indotto aggiungendo 0,66 μg/ml di lipopolisaccaride B (E. coli 055 :B5, Difco, Detroit, Mi) in un volume finale di 200 μl.

Dopo un notte il sumatante è stato raccolto per il saggio dell'IL-8.

La immunoreattività specifica per l'IL-8 nel surnantante di coltura è stata misurata con kit ELISA (Amersham, UK).

I risultati sono stati espressi come massima inibizione ottenibile (efficacia) e, quando possibile, come concentrazione alla quale si ottiene il 50% di tale effetto (ICso).

B) Rilascio di anioni superossido

Neutrofili sono stati separati dal sangue venoso di volontari sani per centrifugazione su Ficoll-Hypaque, seguita da sedimentazione su destrano 6% e lisi osmotica degli eritrociti. I neutrofili sono stati quindi lavati e risospesi in un mezzo costituito da RPMI-1640 integrato con siero fetale di vitello al 5% e 1,34 mmoli/1 di EDTA disodico diidrato. Le cellule sono state mantenute per 24 ore a 4°C e prima del test la sospensione è stata centrifugata e risospesa in HBSS (Hanks' balanced salt solution). La vitalità e la purezza della preparazione di neutrofili è stata verificata mediante colorazione con Trypan blue e Turk blue.

Gli anioni superossido sono stati misurati usando la Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate)-enhanced chemiluminescence technique.

I neutrofili (2 x 10<6 >cellule/ml) sono stati preincubati per 30 minuti a 37°C in 900 μl di HBSS con e senza composto da testare (sistema di lettura).

La produzione di anione superossido è stata misurata con un bio-contatore Lumac/3M dopo aggiunta di 100 μl di una soluzione in HBSS di Lucigenina (2 mmoli/1) ed N-formil-L-metionil-L-leucil-L-fenilalanina (FLMP) come agente stimolante alla concentrazione di 1 x 10<-5 >M al sistema di lettura.

FLMP è stato sciolto in DMSO (1 x 10<-2 >M) ed ulteriormente diluito in HBSS. II composto da saggiare è stato sciolto in DMSO alla concentrazione di 10<-2 >M. Da questa soluzione sono state preparate, in DMSO, concentrazioni inferiori e sono state provate nel test. La quantità di DMSO presente nel sistema di lettura non superava l’1%.

I valori di luminosità ottenuti al picco, per ogni concentrazione del composto saggiata, sono stati trasformati in percentuale di inibizione rispetto al controllo.

Dalla curva "dose-risposta" ottenuta è stata ricavata la concentrazione in grado di inibire il 50% della produzione di anione superossido (IC50).

I risultati ottenuti per alcuni composti di formula I rappresentativi dell'intera classe in confronto ad eritromicina, claritromicina e roxitromicina sono riportati nella seguente tabella.

Tabella 1

Esempio 11

Attività farmacologica in vivo

• Animali

Sono stati usati ratti Sprague-Dawley maschi di peso compreso tra 200 e 300 g. Non c'erano evidenze che i ratti usati negli esperimenti fossero infetti. Gli animali sono stati stabulati in condizioni standard per 7 giorni prima di essere sacrificati. • Somministrazione di endotossina

LPS (E coli lipopolisaccaride) (endotossina; sierotipo 055:B5; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) è stato sciolto in soluzione salina sterile ed è stato somministrato per iniezione intraperitoneale (i.p.) ad una dose di 6 mg/kg (1ml/kg). Agli animali di controllo è stata iniettata la soluzione salina e/o il veicolo (soluzione salina Tween 200,5%) in modo analogo.

• Somministrazione del composto (trattamento profilattico)

Ogni composto è stato somministrato per iniezione i.p. due volte al giorno per 6 giorni, il settimo giorno 1 ora prima e 5 ore dopo la somministrazione di LPS. I composti sono stati sospesi con Tween 200,5% nella soluzione salina.

• Lavaggio broncoalveolare

Dopo 24 ore dall'iniezione di LPS i ratti sono stati sacrificati con un sovradosaggio di nembutal (100 mg/kg i.p.). La trachea è stata incannulata e il polmone è stato lavato instillando due aliquote di 5 mi di PBS (phosphate buffer saline) a 37°C ed il fluido è stato immediatamente rimosso. Il fluido è stato iniettato di nuovo e la procedura ripetuta per un totale di tre volte per ogni aliquota.

• Conta delle cellule e differenziazione

200 μΐ di BALF (bronchoalveolar lavage fluid) sono stati diluiti in 1 mi di acqua fredda e 19 mi di Isoton. II numero totale di cellule è stato contato due volte usando Contraves autolyser 800. Quando il numero totale è risultato essere inferiore a 2000, i BALF sono stati centrifugati a 800 rpm per 10 minuti per separare le cellule dal surnatante. I surnatanti sono stati scartati e le cellule risospese in una piccola quantità di PBS. Per l'esame citologico 50 μl della soluzione con le cellule risospese sono stati centrifugati per 1 minuto a 1300 rpm usando una centrifuga Shandon Cytospin. I vetrini sono stati fissati in acetone e colorati con DiffQuick. Le conte differenziali delle cellule sono state effettuate su ogni vetrino contando 200 cellule a caso; i tipi cellulari sono stati classificati come neutrofili, eosinofili e cellule mononucleate secondo criteri morfologici standard. I risultati ottenuti con alcuni composti di formula I rappresentativi dell'intera classe sono riportati nella seguente tabella.

Tabella2

Claims

Rivendicazioni 1 ) Un composto di formula in cui

R è idrogeno o metile; R1 ed R2 sono entrambi idrogeno oppure insieme formano un legame; R3 è idrogeno, un gruppo alchilico C1-C5 lineare o ramificato, un gruppo benzile, eventualmente sostituito con uno o due sostituenti scelti tra gruppi nitro, gruppi ossidrili, gruppi carbossilici, gruppi amminici, gruppi alchilici C1-C5 lineari o ramificati, gruppi C1-C4 alcossicarbonilici, gruppi amminocarbonilici o gruppi ciano, oppure una catena di formula in cui

A è idrogeno oppure un gruppo fenile eventualmente sostituito con uno o due sostituenti scelti tra gruppi nitro, gruppi ossidrili, gruppi carbossilici, gruppi amminici, gruppi alchilici C1-C5 lineari o ramificati, gruppi C1-C4 alcossicarbonilici, gruppi amminocarbonilici 0 gruppi ciano, oppure un eterociclo a 5 o 6 termini, saturo o insaturo, contenente da 1 a 3 eternatomi scelti tra azoto, ossigeno e zolfo, eventualmente sostituito con uno o due sostituenti scelti tra gruppi alchilici C1-C5, gruppi ossidrili, gruppi osso (=0), gruppi nitro, gruppi C1-C4 alcossicarbonilici, gruppi amminocarbonilici, gruppi mono- o di-C1-C4 alchilamminocarbonilici, gruppi C1-C4 alchilcarbonilici; X e Y, uguali o diversi tra loro, rappresentano O, S, SO, S02 o NR^ in cui R4 è idrogeno, un gruppo alchilico C1-C5 lineare o ramificato, un gruppo C1-C5 alcossicarbonile, un gruppo benzilossicarbonile; r è un numero intero compreso tra 1 e 6; m è un numero intero compreso tra 1 e 8; n è un numero intero compreso tra 0 e 2; e suoi sali farmaceuticamente accettabili; i composti 3'-desdimetilammino-3',4'-deidroeritromicina A ossima e 3’-desdimetilammino-3'4'-deidroeritromicina A 9-O-metilossima essendo esclusi.
2) Un composto secondo la rivendicazione 1 in cui R, R1 ed R2 sono idrogeno.
3) Un composto secondo la rivendicazione 2 in cui R3 è una catena di formula in cui

X, Y, A, r, m e n hanno i significati riportati nella rivendicazione 1.
4) Un composto secondo la rivendicazione 2 in cui R3 è una catena di formula

r è 2, m è 2 o 6, n è 1 , Y è NR4, X è O oppure NR4, R4 è idrogeno ed A è fenile o tiazolile.
5) I composti S'-desdimetilammino3'4'-deidroeritromicina A ossima e 3'-desdimetiIammino-3',4'-deidroeritromicina A 9-O-metilossima per uso come antiinfiammatori .
6) Una composizione farmaceutica contenente un quantitativo terapeuticamente efficace di un composto secondo la rivendicazione 1 in miscela con un veicolo farmaceuticamente accettabile.