JP2000214165A

JP2000214165A - 均一系酵素免疫分析方法

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Publication number: JP2000214165A
Application number: JP11014785A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Shinoki; 浩篠木; Osamu Seshimoto; 修瀬志本
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1999-01-22
Filing date: 1999-01-22
Publication date: 2000-08-04
Also published as: US6287785B1

Abstract

(57)【要約】【目的】抗原と酵素標識抗体との間の反応により生じ
た酵素活性の変化を測定することにより抗原量を測定す
る均一系酵素免疫分析方法において、抗原の分子量が中
間範囲のものである場合でも、簡便な操作で高感度な分
析ができる均一系酵素免疫分析方法を提供する。【構成】抗原に、モノクローナル抗体と酵素とを結合
した酵素標識抗体を反応させた後に、このモノクローナ
ル抗体とは異なる抗原エピトープを認識するモノクロー
ナル第２抗体を反応させ、さらに第２抗体を認識して結
合する第３抗体を反応させる。免疫反応後の標識酵素の
酵素活性を、水不溶性基質により測定する。標識酵素の
酵素活性は、水不溶性基質を含有する基質層を備える乾
式分析要素で測定することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は抗原−抗体反応を利用し
て微量成分を測定する免疫分析方法に関するものであ
る。詳しくは、酵素標識抗体を用いて試料中の抗原（リ
ガンド）を測定する均一系酵素免疫方法に関する。

【０００２】

【発明の背景】血液や尿などの体液に含まれる生体成
分、薬物等の分析は、病態の診断や治療経過の判定に非
常に有用であり、臨床検査の分野で重要な役割を果たし
ている。このような微量成分（リガンド）の分析方法と
して、酵素免疫分析方法（エンザイムイムノアッセイ）
がある。酵素免疫分析方法には、Ｂ／Ｆ分離が必要な非
均一系とＢ／Ｆ分離が不要な均一系がある。

【０００３】非均一系は、抗原抗体反応により生じた抗
原・抗体結合物（Ｂ）と、未結合の遊離抗体（及び抗
原）（Ｆ）とを何らかの方法で分離し、抗原・抗体結合
物中の標識酵素活性を測定するものである。この方法は
結合型（Ｂ）と遊離型（Ｆ）とを分離して分析を行うの
で原理的に高感度が期待できるが、Ｂ／Ｆ分離が必要な
ため分析操作が煩雑となり測定時間が長くなるという問
題がある。

【０００４】一方、均一系反応は抗体と抗原（リガン
ド）が結合すると標識酵素の酵素活性が何らかの干渉を
受けることに基づくもので、抗原抗体結合による酵素阻
害作用を利用する。一般には、抗原を酵素標識しておい
て、これに大分子である抗体が結合することにより、酵
素の基質に対する結合が立体障害を受けたり、或いは酵
素の立体構造が変化するために生じる酵素活性の抑制を
検出する（例えば、ＥＭＩＴ(Enzyme Multiplied Immun
oassay Technique) がある）。

【０００５】抗原が高分子である場合には、これとは逆
に抗体に酵素標識しておいても、抗原抗体結合反応によ
る酵素活性の抑制を検出できる。このように均一法はＢ
／Ｆ分離が不要であるため、操作が簡単なものとなる。
しかし、原理的に非均一系よりも感度が低いという欠点
がある。

【０００６】均一系免疫分析方法の感度を上げる方法と
して、特開昭60-108756号、特開平3-295466号、特開平4
-128655号に記載された方法がある。これらは、酵素基
質として水不溶性高分子基質を使用するものである。酵
素反応は巨大分子である基質粒子表面での反応となるた
め、抗原抗体結合反応により標識酵素に対する立体障害
による影響が大きく現れることを利用したものである。

【０００７】特開昭60-108756号記載の方法は、抗体を
抗原（リガンド）と酵素標識抗原に競争反応させ、反応
後の標識酵素の酵素活性を不溶性高分子基質で検出する
ものである。

【０００８】特開平3-295466号記載の方法は、抗原が高
分子量である場合の方法で、高分子量抗原（被検物）を
酵素標識抗体に反応させる。高分子量抗原と結合した標
識酵素は、水不溶性基質に対して酵素活性を示すことが
できない。従って、被検物である抗原が増えるに従っ
て、酵素反応生成物は減少する。

【０００９】特開平4-128655号記載の方法は、抗原が低
分子量である場合の方法である。この場合には、抗原
（リガンド）を高分子量化合物と結合して高分子化抗原
とし、この高分子化抗原と抗原（被検物）と酵素標識抗
体との間で競争反応をさせる。高分子化抗原と結合した
酵素標識抗体の酵素は、立体障害により水不溶性基質に
対する酵素活性が干渉される。検体中の抗原（リガン
ド）が結合した酵素標識抗体の酵素では、水不溶性基質
に対する酵素活性は影響されない。従って、検体中の抗
原量に応じて酵素反応生成物が増大する。

【００１０】特開平3-295466号、特開平4-128655号で
は、これらの免疫反応、酵素反応を乾式分析要素の層内
で行わせると共に、この分析要素に標識酵素による分解
産物をさらに低分子化する低分子化酵素を有する試薬層
を設け、この低分子化生成物を検出することにより感度
のさらなる上昇を図っている。

【００１１】このように抗原（被検物）が高分子量であ
れば特開平3-295466号の方法により、また低分子量であ
れば特開平4-128655号に従って抗原量を感度よく分析す
ることが可能である。

【００１２】しかし、抗原の分子量が、特開平3-295466
号のような高分子量の場合と、特開平4-128655号のよう
な低分子量の場合の中間範囲の分子量である場合には、
いずれの方法でも十分な感度が得られない場合がある。

【００１３】特開平3-295466号では、抗原-抗体-酵素複
合体と、抗体-酵素複合体との間の酵素活性の差を検出
する。従って、抗原（被検物）の分子量には、酵素標識
抗体に結合して酵素活性に対する干渉（抑制）作用を示
す程度の分子量が要求される。抗体としてインタクトな
ＩｇＧ分子（M.W.約16万）を使う場合には、このＩｇＧ
の結合により、標識酵素の活性部位は既にある程度の影
響を受けている。抗原が結合することにより、さらに酵
素活性に対する立体障害を増加させるためには、抗原の
分子量は、既に結合している抗体分子の大きさに見合う
ものである必要がある。抗体としてＦabやＦab'フラグ
メント（M.W.約５万）を使用する場合でも、これに見合
うだけの分子量が抗原（被検物）に要求される。例え
ば、分子量２万ダルトン以上、好ましくは約５万ダルト
ン以上の抗原であれば、抗原-抗体-酵素複合体と、抗体
-酵素複合体との間の酵素活性の差を検出することがで
きるとされいる。しかし、この範囲にある分子量の抗原
でも、分子量が小さくなるにつれて、検出感度は低くな
ってくることは否めない。

【００１４】一方、抗原（被検物）の分子量が小さい場
合には、特開平4-128655号のように、高分子化した抗原
を用いる。この場合には、高分子化抗原−抗体−酵素の
複合体の酵素活性と、抗原(被検物)−抗体−酵素の複合
体の酵素活性の差を検出する。従って、抗原（被検物）
の分子量が大きくなるにつれ、抗原(被検物)−抗体−酵
素の複合体の示す酵素活性も抑制され、高分子化抗原−
抗体−酵素の複合体の示す酵素活性との差が小さくな
る。この分析系では、抗原（被検物）の分子量が約２万
ダルトン以下で測定可能とされているが、抗原の分子量
が小さいほどその検出感度は優れる。抗原の分子量が大
きくなるにつれて、その検出感度は低下する。

【００１５】このように、抗原（被検物）の分子量が中
間の分子量、例えば１万〜７万の範囲にある場合には、
前述のどちらの系でも、十分な検出感度が得られない。

【００１６】

【発明の目的】本発明は以上のような事情に鑑みなされ
たものであり、抗原の分子量が中間範囲のものである場
合でも、簡便な操作で高感度な分析ができる均一系酵素
免疫分析方法を提供することを目的とする。

【００１７】

【発明の構成】このような本発明の目的は、抗原と酵素
標識抗体との間の反応により生じた酵素活性の変化を測
定することにより抗原量を測定する均一系酵素免疫分析
方法において、抗原に、モノクローナル抗体と酵素とを
結合した酵素標識抗体を反応させた後に、前記モノクロ
ーナル抗体とは異なる前記抗原のエピトープを認識する
モノクローナル第２抗体を反応させ、さらに前記第２抗
体を認識して結合する第３抗体を反応させ、反応液中の
標識酵素の酵素活性を水不溶性基質により測定すること
を特徴とする均一系酵素免疫分析方法、により達成する
ことができる。

【００１８】

【作用】すなわち、本発明は、抗原と酵素標識抗体を結
合させた後に、第２抗体、第３抗体を順次結合して、標
識酵素に対する立体障害を大きくしたものである。この
立体障害は、酵素の基質が水不溶性である場合に強く現
れる。後述の実施例からも明らかなように、水溶性基質
を使用した場合には、酵素活性に対する立体障害はほと
んど観察されない。その詳細は不明であるが、おそらく
は以下のような理由によるものと思われる。

【００１９】一般に、酵素標識抗体と抗原とが反応する
と、標識酵素の酵素活性部位が抗原による立体障害を受
ける。しかし、このような立体障害が、酵素活性部位に
対する酵素基質の接近を実際に妨げるためには、基質が
当該抗原によって影響を受ける程度の大きさであること
が必要となる。すなわち、ある程度分子量の大きな基質
の場合であれば、抗原による立体障害を受けることもあ
ろう。そしてこのような場合には、本発明のように第２
抗体、第３抗体を使用すれば、基質の酵素活性部位への
接近に対する立体障害効果はさらに大きくなると考えら
れる。

【００２０】しかし、水溶性基質は一般に低分子量であ
り、酵素活性部位に容易に接近することができる。高分
子量物質でも水溶性のものは存在する。高分子物質は，
固体状態ではそれを構成している高分子鎖の間の相互作
用が強いが，これを溶媒（水）中に浸すとその高分子鎖
の間に溶媒分子が入り込んでゲル状にふくれあがる。つ
いで溶媒分子にとりかこまれた高分子鎖が1本ずつ離れ
て溶媒の中に分散し、溶解することになる。このよう
に、基質が水溶性である場合には、基質は溶媒中で自由
に分子運動して酵素の活性部位に接近することができ
る。第２抗体、第３抗体を使用した後述の第７実施例に
おいても、酵素活性の抑制が見られなかったのは、この
ように水溶性基質を使用したことがその原因と考えられ
る。

【００２１】これに対し、水不溶性基質は一般に大分子
量である。高分子物質がその高分子鎖間のところどころ
で結合した構造(橋架け構造)をもつ場合には，高分子鎖
どうしは離れえないので，溶媒中では膨潤はするが溶解
はしない。このような不溶性基質では、基質粒子の表面
が酵素と反応することになり、酵素に対する立体障害の
影響が大きく現れる。本発明では、このような立体障害
が現れやすいように、酵素標識抗体に抗原を反応させた
後、第２抗体、第３抗体を反応・結合させ、立体障害が
現れやすいように不溶性基質で酵素活性を測定するよう
にしたものである。

【００２２】好ましい態様では、酵素標識抗体の抗体に
はＦab'またはＦabなどのＩｇＧフラグメントを使用す
る。これらのフラグメントはノイズの原因となるＦc部
分を有さない点で好ましい。特にＦab'フラグメントは
抗体ヒンジ部のＳＨ基を有するので酵素との結合が容易
であり、特に好ましい。また第２抗体はインタクトなＩ
ｇＧとし、第３抗体は、第２抗体のＦc領域と結合する
ものとすることができる。

【００２３】反応液中の標識酵素の酵素活性は、反応液
に不溶性基質を添加して測定することができる。必要に
応じて、酵素反応生成物に発色試薬層生物を加えて、酵
素活性に応じた発色反応をさせ、これを比色分析しても
よい。あるいは、水不溶性基質を含有する基質層を備え
る乾式分析要素で酵素活性を測定するようにしてもよ
い。

【００２４】

【発明の構成の詳細な説明】測定対象本発明の測定対象は検体に含まれる抗原決定基を有する
リガンド、すなわち抗原である。検体の種類は限定され
ないが、例えば血液（全血、血漿、血清）、リンパ液、
尿などがある。リガンドは少なくとも２以上の異なるエ
ピトープ（抗原決定基）を有している抗原であればよ
い。ただし、これらのエピトープはその構造が明らかに
されている必要はなく、互いに識別可能な２以上のモノ
クローナル抗体を用意できるものであればよい。

【００２５】リガンドの分子量は、少なくとも２以上の
エピトープを有するものであれば低分子量のものから大
分子量のものまで、本発明の分析方法で分析することは
可能である。但し、一般に薬物や、その誘導体などの低
分子量のものはエピトープを２以上有することが稀であ
るので、分析対象から除外されよう。また酵素標識抗体
に結合してその酵素活性を十分抑制するだけの大分子量
の抗原では、本発明のようにさらに第２抗体、第３抗体
を使用する意味が乏しい。従って、本発明のよる分析方
法による利益をもっとも甘受できるのは、２以上のエピ
トープを有する程度の大きさを持ち、かつそれが酵素標
識抗体に結合してもその酵素活性を十分抑制することが
できない程度の分子量の抗原である。酵素標識抗体の抗
体（第１抗体）が、ＩｇＧ（MW 約16万）かＦab'又はＦ
ab（いずれもMW 約５万）かによって、好ましい抗原の
分子量範囲は異なってくる。第１抗体がＦab'又はＦab
であれば、抗原の好ましい分子量は約１万〜７万の範囲
であり、分子量約１万〜３万の間が最も好ましい。

【００２６】このような抗原として、ポリペプチド、低
分子量タンパク質、蛋白質のサブユニットなどが挙げら
れる。例えば、ヒトヘモグロビン（MW 約6.4万）、４つ
のサブユニットからなり、１つのサブユニットの分子量
は約1.6万）、ＨＣＧ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン：M.
W. 約3.7万）等は、本発明の分析方法で分析することが
できる。その他の抗原として、ＴＳＨ（甲状腺刺激ホル
モン：MW約28,000、ＬＨ（黄体形成ホルモン：MW 約29,
000）、インスリン（MW 約5,800）、アポ蛋白Ａ−Ｉ（M
W 約28,000）、アポ蛋白Ａ−II（MW 約18,000）、アポ
蛋白Ｃ−II（MW約8,500）、アポ蛋白Ｃ−III（MW 約8,5
00）、アポ蛋白Ｅ（MW 約36,000）、ＡＴIII（アンジオ
テンシンIII：MW 約59,000）、ＡＦＰ（アルファフェト
プロテイン：MW 約68,000）、β₂−マイクログロブリン
（MW 約11,800）などがある。

【００２７】抗体第１抗体及び第２抗体は、被検抗原の異なるエピトープ
を認識する２以上のモノクローナル抗体を使用する。

【００２８】モノクロナール抗体の取得は通常の方法で
行うことができる。すなわち、抗原をアジュバンドとと
もに数回腹腔等に注射して、脾臓細胞を取り出しポリエ
チレングリコール等を用いてマウスミエローマ細胞と融
合させる。そして、この融合細胞の中から抗体産生細胞
をクローニングし、モノクローン細胞として増殖させ
る。増殖細胞をさらにマウス腹腔内注射することによ
り、モノクロナール抗体を含む腹水及び血清を得ること
ができる。抗体の精製は、硫安沈澱、イオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー（プロ
テインＡ−アガロース等）、ゲル濾過法等を組み合わせ
て、容易に精製することができる。抗体のサブクラスは
IgＧ１、IgＧ２ａ、IgＧ２ｂ等が挙げられるが、酵素−
抗体複合体を調製する際に抗体の断片化効率の良いIgＧ
１が特に優れている。得られたIgＧ１は、活性化パパイ
ンやペプシン等のプロテアーゼでＦｃ部位を除去したＦ
(ab')₂として、さらにこれを還元してＦab'フラグメン
トに誘導することができる。

【００２９】認識エピトープの異なるモノクローナル抗
体の選択は、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-linked Immunosorben
t assay)等で行うことができる。例えば、モノクローナ
ル抗体１を被覆・感作したマイクロタイタープレートに
抗原を結合させ、別途調製したビオチン化したモノクロ
ーナル抗体２を反応させる。これをアビジン−ＰＯＤ(P
eroxidase)で検出する。反応が陽性の場合は、抗体１と
抗体２は認識エピトープが異なっていると判断すること
ができる。

【００３０】第１抗体の好ましい態様では、Ｆab'フラ
グメントを使用する。インタクトな抗体（IgＧ）にはＦ
ab（抗原結合部位）とＦc（補体結合部位）が存在す
る。インタクトな抗体を酵素と結合して酵素標識抗体を
使用する場合、試料が血液試料であると、血液中の補体
成分がＦc 部分に結合して立体障害の原因となり酵素活
性を阻害することになる。また血液試料でない場合で
も、Ｆc 部分は反応容器の器壁に非特異的吸着をするた
め、酵素標識抗体の活性が見かけ上低くなり測定時のノ
イズの原因となる。これらのノイズを除去するために
は、Ｆc 部位を含まないＦab'、Ｆ(ab')₂或いはＦabフ
ラグメントを抗体として使用するのが望ましい。この中
では、酵素との結合の便宜から遊離ＳＨ基を有するＦa
b'フラグメントを第１抗体として使用するのがもっとも
好ましい。

【００３１】第２抗体には、上記のような制限はなく、
インタクトな抗体（ＩｇＧ）でも使用できる。むしろ、
ＩｇＧはＦｃ部分を含むので、ＩｇＧを第２抗体とした
方が第３抗体を抗Ｆｃ抗体とすることができるので便宜
である。

【００３２】第３抗体は、第２抗体を認識し結合する抗
体であり、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体
でもよい。第２抗体（モノクローナル抗体）をマウスか
ら調製した場合には、抗マウスＩｇＧ抗体を第３抗体と
して使用できる。このような第３抗体として、第２抗体
をマウス以外の動物（山羊、羊、家兎等）に免疫して得
られるポリクローナル抗体を使用できる。第２抗体がイ
ンタクトなマウスＩｇＧであれば、市販の抗マウスＦｃ
抗体を第３抗体とすることができる。

【００３３】標識酵素酵素・抗体複合体を構成する酵素は、その後の酵素反応
に使用する酵素基質と、酵素反応生成物の検出系との組
合せを考慮して選ぶことができる。本発明では、酵素基
質と反応する酵素に対する反応性を、酵素・抗体・抗原
・第２抗体・第３抗体の複合体形成による立体障害によ
り抑制するものであるから、酵素と基質との組合せはこ
のような立体障害による影響が検出し易い系を選ぶ方が
好ましい。すなわち、酵素基質としては比較的高分子量
のものが感度の点で好ましい。例えば分子量約２万以上
であり、好ましくは分子量約１０万以上の基質を使用す
る。このような基質としては、酵素アミラーゼに対する
基質として澱粉；酵素セルラーゼに対する基質セルロー
ス；プロテアーゼに対するゼラチン、ヘモシアニン等の
蛋白質；リパーゼに対する各種油脂類を挙げることがで
きる。上記の酵素と基質の選択に関する報告は、特開昭
60-108756 、60-171461 、60-171460 に詳しく開示され
ている。この中では、澱粉を基質とするアミラーゼが好
ましい。またこれらの基質は水不溶性の基質である方
が、酵素・抗体・抗原のマトリックス様構造による立体
障害が顕著に現れることになり、これらを使用すること
が特に好ましい。このような酵素としては重合体からな
る非拡散性（水不溶性）基質から拡散性オリゴマーを生
成するような分解酵素があり、例えば、糖質加水分解酵
素を挙げることができる。このような糖質加水分解酵素
として、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、デキストラ
ナーゼ等のエンド活性型加水分解酵素がある。

【００３４】水不溶性基質標識酵素としてα−アミラーゼを使用するときには、カ
ルボキシメチル化澱粉、澱粉、アミロース、アミロペク
チン等を基質として使用できる。特に水不溶性の澱粉等
を使用すれば、酵素反応は基質粒子表面、すなわち固−
液界面での反応となるため、抗体・抗原結合による立体
障害の酵素活性に対する影響が大きく現れることにな
り、感度の点で好ましい。また水不溶性ダイ・スターチ
を使用して、酵素分解産物である可溶性アミロースにつ
いているダイ（色素）を検出するようにしてもよい。こ
のような水不溶性青色澱粉ポリマーにはネオアミラーゼ
テスト「第一」（第一化学薬品製）等の市販のものを使
用することができる。

【００３５】酵素と抗体の結合酵素と抗体との結合方法は、２つの物質の官能基（アミ
ノ基、カルボキシル基、チオール基等）を利用して行う
ことができる。代表的な結合法としては、グルタルアル
デヒド法、過ヨーソ酸法、ピリジル・ジスルフィド法、
マレイイミド−サクシイミド法等が挙げられる。結合方
法はこれらの例に限られるものではなく、この他例えば
「Method in Immunology and Immunochemistry」 Vol.1,
(C.A.Williams, M.W.Chase, Academic Press,1967年)
あるいは石川、河井、宮井編「酵素免疫測定法」（医
学書院、1978年発行）等の成書に記載されている方法の
中から適宜選択して利用することができる。これらの結
合方法の中では、抗体ヒンジ部のチオール基と酵素のア
ミノ基を架橋させるマレイミド−サクシイミド法が反応
効率が良く、又抗体活性を保持できる点で優れている。

【００３６】マレイミド−サクシイミド法では、例えば
以下のようにして酵素とＦab'とを結合させる。まずマ
レイミド−サクシイミド試薬で酵素のアミノ基をマレイ
ミド化する。これをゲル濾過で精製した後、チオール基
を有する抗体（Ｆab'）との複合化に付する。この複合
化反応は酵素１モルの対し、抗体３〜７モルの範囲で行
なうのが好ましい。抗体としてＦab'（分子量約５万）
を、酵素としてα−アミラーゼ（分子量約５万）を使用
する場合には、Ｆab'量に対してα−アミラーゼ重量を1
/3 〜1/7 の範囲で結合反応を行うのが好ましい。この
結合反応は通常４℃〜室温で進行する。

【００３７】生成した酵素−抗体複合体（酵素標識抗
体）はゲル濾過で精製し、必要により凍結乾燥法等によ
り乾燥する。酵素と各抗体との結合比は１：１に限ら
ず、目的に応じて任意の比率とすることができる。通常
の酵素は多数のアミノ基を持っているので、導入される
マレイミド基も複数となり、酵素１分子に導入される抗
体分子は複数となる。検出感度を確実に高めるために
は、モル比４〜５の範囲とすることが好ましい。抗体と
してＦab'（分子量約５万）を、酵素としてα−アミラ
ーゼ（分子量約５万）を使用する場合には、複合体の分
子量は15万ダルトン以上で、好ましくは25〜30万ダルト
ンの物質が検出感度が高い点で好ましい。

【００３８】分析方法まず、検体に含まれる抗原と酵素−抗体複合体との結合
物を溶液中で接触させる。その後、第２抗体（第１抗体
とは異なる抗原エピトープを認識するモノクローナル抗
体），第３抗体（第２抗体を認識して結合する）を順次
添加する。その際、溶液の温度は20〜45℃程度、pHは通
常約4.0 〜約8.5 の範囲内が適当である。pHを一定に保
つために必要により、燐酸緩衝液、酢酸緩衝液などの緩
衝液を用いてもよい。抗原と酵素−抗体複合体との接触
時間は十分に反応しうる程度であればよく、例えば溶液
の温度が37℃の場合には20〜30分が適当である。その後
の第２抗体、第３抗体との反応時間も、それぞれ十分に
反応しうる程度であればよく、例えば溶液の温度が37℃
の場合には５〜１０分が適当である。以上の免疫反応を
行った後、酵素基質を加え、標識酵素の酵素活性を測定
する。検体中に被検抗原が存在すれば酵素活性の抑制と
して検出することができる。予め既知量の被検抗原を含
む溶液で検量線を描いておけば、検体中の被検抗原量を
定量することができる。

【００３９】なお、抗原と酵素−抗体複合体との反応、
その後の第２抗体、第３抗体との反応という一連の免疫
反応のみを溶液系で行い、反応後の酵素活性を乾式分析
するようにしてもよい。すなわち、標識酵素の酵素基質
を含有する基質層を備える乾式分析要素を用意し、これ
に免疫反応後の反応液を点着することにより酵素活性を
測定する。その層構成は、特開平3-295466号、特開平4-
128655号等に記載されたものと同様にすることができ
る。

【００４０】例えば、標識酵素がα−アミラーゼである
場合には、カルボキシメチル化澱粉を不溶性基質として
含有する基質層を最上層として、その下の試薬層にカル
ボキシルメチル化澱粉の酵素反応分解物であるオリゴマ
ーをモノマー（グルコース）に分解する低分子化酵素
（例えばグルコアミラーゼ）を含有させ、さらに同試薬
層に含有される検出系試薬よりグルコースを光学的に検
出することができる。このような検出系試薬として、グ
ルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びロイコ色
素の組み合わせを用いることができる。

【００４１】

【実施例１】抗ヒトヘモグロビンIgＧの調製ヒトＨｂ（ヘモグロビン）に対する２種類のモノクロー
ナル抗体IgＧは、何れもマウスに免疫して得られた免疫
細胞（脾臓細胞）をマウスミエローマ細胞と融合し、ク
ローニング後得られた抗体であり、常法により得たもの
である。得られた複数のモノクローナル抗体のうち、認
識エピトープが異なることを確認した２種類の抗体の一
方から、以下のＦab'フラグメント（第１抗体）を調製
した。他方のモノクローナル抗体（ＩｇＧ）は、後記実
施例６，７において第２抗体として使用した。

【００４２】

【実施例２】抗ヒトＨｂ・IgＧＦab'（第１抗体）の調
製第１の抗ヒトＨｂ抗体のIgＧ, 4.4mgを、１mLの0.1M 酢
酸緩衝液(pH5.5) に溶解し、これに活性化パパイン132
μgを加え37℃で２時間撹拌した。この反応液を、予め
0.1M 燐酸緩衝液(pH 6.0; 1mM EDTA-2Na含有）で平衡化
したスーパーデックス−200 ゲルカラムにアプライし、
同燐酸緩衝液で溶出した。分子量10万付近に溶出したピ
ーク部分を分取し、抗ヒトＨｂ・IgＧＦ(ab')₂を得た。
得られた抗ヒトＨｂ・IgＧＦ(ab')₂を2.2mg含む0.1M 燐
酸緩衝液(pH 6.0)５mLに、113 mg/mLの２-メルカプトエ
チルアミン塩酸塩水溶液を100μL 加え、37℃で２時間
撹拌した。この反応液を予め0.1M グリセロ燐酸緩衝液
(pH 7.0; 5mM EDTA-Ca 含有）で平衡化したセファデッ
クスＧ−２５でゲル濾過し素通り分画を分取した。この
抗ヒトＨｂ・IgＧＦab'分画（以下単にＦab'という）
は、標識酵素で標識する第１抗体として使用する。

【００４３】

【実施例３】ＧＭＢ化アミラーゼの調製 α−アミラーゼに以下のようにしてマレイミド基を導入
した。10mg/mLの枯草菌α−アミラーゼ溶液（0.1 M グ
リセロリン酸緩衝，pH 7.0)の１mLに、ＧＭＢＳ（N-(γ
-maleimidobutyryloxy)succinimide; 同仁化学製）の10
0 mg/mL 溶液(DMF) 100 μL を加えて、室温で２時間反
応させた。この反応液をセファデックスＧ−２５のカラ
ムでゲル濾過にかけ、素通り分画を分取、Ｎ−（γ−マ
レイミドブチリロキシ）アミド化アミラーゼ（ＧＭＢ化
アミラーゼ）を得た。得られたＧＭＢ化アミラーゼ溶液
の濃度は1.12 mg/mLであった。

【００４４】

【実施例４】α−アミラーゼ／Ｆab'結合物の調製実施例２で得られた抗ヒトＨｂ・IgＧＦab'（Ｆab'）の
0.1mg/mL 溶液3.65mLに実施例３で調製したＧＭＢ化ア
ミラーゼ54μLを加えて４℃で20時間反応させた。この
反応液を、予め0.1M グリセロ燐酸（pH7.0; 0.5mM EDTA
-Ca 含有）で平衡化したスーパーデックス-200にアプラ
イし、同緩衝液で溶出した。分子量27万付近を分画を分
取し、酵素標識抗体（α−アミラーゼ／Ｆab'結合物）
を得た。

【００４５】

【実施例５】α−アミラーゼ用分析要素の作製ゼラチン下塗層が設けられている厚さ180μｍの無色透
明ポリエチレンテレフタレート（PET）シート（支持
体）上に下記の被覆量になるように架橋剤含有試薬溶液
を塗布し、乾燥して試薬層を設けた。アルカリ処理ゼラチン 14.5 g/m² ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（オキシエチレン単位平均 9〜10含有） 0.2 g/m² グルコースオキシダーゼ 5000 u/m² ペルオキシダーゼ 15000 u/m² グルコアミラーゼ 5000 u/m² 2-(4-ヒドロキシ-3,5-ジメトキシフェニル-4-[4-（ジメチルアミノ）フェニル]-5-フェネチルイミダゾール（ロイコ色素）酢酸塩 0.38 g/m² ビス[(ビニルスルホニルメチルカルボニル）アミノ］メタン 0.1 g/m²

【００４６】この試薬層の表面に下記の被覆量になるよ
うに下記試薬含有水溶液を塗布し、ゼラチン層を膨潤さ
せ、その上に50デニール相当のPET 紡績糸36ゲージ編み
した厚さ約250μｍのトリコット編物布地をほぼ一様に
軽く圧力をかけてラミネートして多孔性展開層を設け
た。ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（オキシエチレン単位平均 9〜10含有） 0.15 g/m² ビス[(ビニルスルホニルメチルカルボニル）アミノ］メタン 0.4 g/m²

【００４７】次に、下記の被覆量になるように基質を塗布、乾燥して基質層を設けてα−アミラーゼ分析用多層分析要素を調製した。カルボキシメチル化澱粉 4 g/m² ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（オキシエチレン単位平均 9〜10含有） 0.15 g/m²

【００４８】次いでこの分析要素を14mm×13mm四方のチ
ップに裁断し、特開昭57-63452に記載のスライドの枠に
収めて、α−アミラーゼ分析用多層乾式スライドとし
た。

【００４９】

【実施例６】ヒトヘモグロビンの測定実施例４で得られた酵素標識抗体を用いて、ヒトヘモグ
ロビンの均一系酵素免疫分析を行なった。

【００５０】実施例４のα−アミラーゼ／Ｆab'結合物
を0.1mg/mL となるように、生理食塩水で希釈し、その5
0μLに、既知量の各濃度のヒトヘモグロビンを含有する
生理食塩水50μLを添加し、37℃で20分間インキュベー
トした。この後、第２抗体（実施例１で得られた他方の
ＩｇＧ）の溶液（70μg/mL, 生理食塩水）を５０μLを
添加し、37℃で５分間インキュベートした。その後、第
３抗体として、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（ジャ
クソンイムノリサーチ製）の溶液（75μg/mL,生理食塩
水）を50μLを添加し、37℃で５分間インキュベートし
た。

【００５１】以上の免疫反応を終えた後、当溶液10μL
を実施例５で作成したα−アミラーゼ分析用スライドに
点着し、37℃に保って、ＰＥＴ支持体側から中心波長65
0nmの反射光学濃度を測定した。点着から３分後および
５分後の反射光学濃度の差（ΔＯＤ_5-3）を求めて、検
量線を作成した。

【００５２】対照として、第２抗体及び第３抗体を添加
しない他は実施例と全く同様に行ったものを比較例１と
した。また、第２抗体までは添加反応させた後、第３抗
体との反応を行わないほかは実施例と同様の操作を行っ
たものを比較例２とした。それぞれα−アミラーゼ分析
用スライドに点着して検量線を作成し対照とした。

【００５３】得られた各検量線を図１に示す。図１に示
すように、抗原（Ｈｂ）に酵素標識抗体（Ab-Ｅ）を反
応させただけでは、抗原添加による、酵素活性の阻害は
ほとんど観察できなかった（図１、−○−）。抗原（Ｈ
ｂ）に酵素標識抗体（Ab-Ｅ）を反応後、第２抗体（A
b₂）を反応させた場合には、抗原量の増加に伴い、酵素
活性の抑制が観察された（図１、−●−）。しかし、そ
の抑制効果は少なく十分なＳ／Ｎ比とはいえなかった。

【００５４】これに対し、抗原（Ｈｂ）に酵素標識抗体
（Ab-Ｅ）を反応後、第２抗体（Ab₂）、さらに第３抗体
（anti-Ab₂）を反応させた場合には、抗原量の増加に伴
い観察される酵素活性の抑制は比較例２（−○−）に比
べ大きかった（−■−）。このように第３抗体を使用す
る本実施例では、抗原添加による酵素活性の抑制が大き
くなり、十分なＳ／Ｎ比が確保できることが確認でき
た。

【００５５】

【実施例７】水溶性基質によるヒトヘモグロビンの測定
（湿式法）標識酵素の基質として水溶性基質を使用した場合に、抗
原添加による酵素活性の抑制が観察できるかどうかを調
べた。水溶性基質として、色素結合オリゴ糖であるベン
ジリデンｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシド（ＢＧ
７-ｐＮＰ）を使用した。

【００５６】実施例４のα−アミラーゼ／Ｆab'結合物
を0.1mg/mL となるように生理食塩水で希釈し、その50
μLに、既知量の各濃度（0, 0.01, 0.1, 1.0μg/mL）の
ヒトヘモグロビンを含有する生理食塩水50μLを添加
し、37℃で20分間インキュベートした。この後、第２抗
体（実施例１で得られた他方のＩｇＧ）の溶液（70μg/
mL, 生理食塩水）を50μLを添加し、37℃で５分間イン
キュベートした。その後、第３抗体として、ヤギ抗マウ
スＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（ジャクソンイムノリサーチ製）
の溶液（75μg/mL, 生理食塩水）を50μLを添加し、37
℃で５分間インキュベートした。

【００５７】一方、アミラーゼ測定試薬「ＢＧ７Ｐオリ
エンタル」（商品名、オリエンタル酵母工業株式会社）
の酵素基質剤を緩衝液に溶解して、以下の組成を有する
反応試薬溶液を調製した。ＢＧ７-ｐＮＰ 1 mM グルコアミラーゼ 18 IU/mL α−グルコシダーゼ 10 IU/mL ＰＩＰＥＳ (pH7.0) 0.1 M

【００５８】この試薬溶液３mLを予め37℃に加温後、上
記免疫反応後の反応液50μLを加えて37℃に保ちなが
ら、中心波長405nmの１分間あたりの吸光度変化を求め
た。この反応では、標識酵素α−アミラーゼは基質ＢＧ
７-ｐＮＰを加水分解し、ベンジリデン基を持たないＧ
ｎ−ｐＮＰ（ｐ−ニトロフェニル基(ｐＮＰ)を持つオリ
ゴ糖：n=1〜5）を生成する。そして、この生成オリゴ糖
からグルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼの共役反応
によりｐ−ニトロフェノール（ｐＮＰ）が遊離する。遊
離したｐ−ニトロフェノールの量を吸光度で測定するも
のである。

【００５９】対照として、第２抗体及び第３抗体を添加
しないで、酵素標識抗体と抗原との免疫反応を行った他
は実施例７と全く同様に行ったものを比較例３とした。
結果を表１に示す。

【００６０】

【表１】実施例７と比較例３における吸光度変化 ─────────────────────────────────── ヘモグロビン濃度 (μg/mL) 0 0.01 0.1 1 ─────────────────────────────────── 比較例３ (Ab-E） 0.352 0.360 0.352 0.362 実施例７（Ab-E + Ab2 + anti-Ab2） 0.359 0.353 0.361 0.350 ───────────────────────────────────

【００６１】表１に示されるように、比較例３（対照）
でも実施例７でも、抗原（Ｈｂ）濃度を上げても、酵素
活性（吸光度変化）の変動は分析誤差（バラツキ）の範
囲内であった。このことは、水溶性基質を使用した場合
には、第２抗体、第３抗体を使用しても、標識酵素に対
する立体障害が測定できないことを示している。

【００６２】

【発明の効果】以上のように本発明では、抗原と酵素標
識抗体を反応させた後に、異なる抗原エピトープを認識
する第２抗体を反応させ、さらに前記第２抗体を認識し
て結合する第３抗体を反応させる。そして、標識酵素の
酵素活性を水不溶性基質により測定する。このため、従
来酵素標識抗体に結合しても立体障害による酵素活性の
抑制を示すことができなかった分子量の抗原であって
も、十分なＳ／Ｎ比を持って感度よく分析することがで
きる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例６の測定における検量線を示す図であ
る。図中シンボル−○−は抗原に酵素標識抗体のみを反
応させた場合（比較例１）を示し、シンボル−●−は、
抗原に酵素標識抗体と第２抗体を反応させた場合（比較
例２）を示す。いずれも対照である。シンボル−■−
は、本発明に従い、抗原に酵素標識抗体、第２抗体、第
３抗体を反応させた場合を示す。

フロントページの続きＦターム(参考） 4B024 BA44 DA02 GA03 GA18 HA15 4B063 QA01 QQ79 QR02 QR03 QR15 QR58 QR84 QS03 QS28 QS33 QX01 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 CE04 CE07 CE12 DA13

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】抗原と酵素標識抗体との間の反応により
生じた酵素活性の変化を測定することにより抗原量を測
定する均一系酵素免疫分析方法において、抗原に、モノクローナル抗体と酵素とを結合した酵素標
識抗体を反応させた後に、前記モノクローナル抗体とは
異なる前記抗原のエピトープを認識するモノクローナル
第２抗体を反応させ、さらに前記第２抗体を認識して結
合する第３抗体を反応させ、反応液中の標識酵素の酵素活性を、水不溶性基質により
測定することを特徴とする均一系酵素免疫分析方法。
【請求項２】前記標識抗体の抗体が、Ｆabフラグメン
ト又はＦab'フラグメントであることを特徴とする請求
項１記載の均一系酵素免疫分析方法。
【請求項３】前記第３抗体が、前記第２抗体のＦｃ領
域と結合するものであることを特徴とする請求項１記載
の均一系酵素免疫分析方法。
【請求項４】反応液中の標識酵素の酵素活性を、前記
水不溶性基質を含有する基質層を備える乾式分析要素で
測定することを特徴とする請求項１記載の均一系酵素免
疫分析方法。