JP2000253893A

JP2000253893A - Ｄ−セリンの製造法

Info

Publication number: JP2000253893A
Application number: JP11061199A
Authority: JP
Inventors: Yasuko Matsuba; 松葉　　泰子; Sadao Yoshino; 節生吉野
Original assignee: Mitsui Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Chemicals Inc
Priority date: 1999-03-09
Filing date: 1999-03-09
Publication date: 2000-09-19

Abstract

(57)【要約】【課題】効率的に高収量で高光学純度のＤ−セリンを製
造する方法の提供。【解決手段】トリプトファンシンターゼ活性を有する微
生物菌体あるいはその処理物を、ＤＬ−セリンおよびチ
オフェノールを含む反応液に作用させ、Ｌ−セリンから
Ｓ−フェニル−Ｌ−システインを合成し該反応液中に残
るＤ−セリンを取得するＤ−セリンの製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は酵素法によるＤＬ−
セリンからのＤ−セリンの製造法に関するものである。
本発明により、高効率でＤ−セリンを製造することが可
能であり、かつ反応副生物であるＳ−フェニル−Ｌ−シ
ステインとの分離も容易であることから高収量で、かつ
光学純度の高いＤ−セリンを得ることが可能である。

【０００２】Ｄ−セリンは医薬、食品、農薬等の中間体
原料として、産業上、有用性の高い化合物として期待さ
れているアミノ酸である。一方、副生物として得られる
Ｓ−フェニル−Ｌ−システインもまた、医薬中間体原料
として重要なアミノ酸の一つであり工業的にも高価値な
アミノ酸である。

【０００３】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】Ｄ−セ
リン製法としては、ＤＬ−セリンから光学分割法により
Ｄ−セリンを取得する方法が知られているが、光学分割
の収率などに問題が多く工業的に有利な方法とは言いが
たい。また、酵素法によるＤ−セリン製法については、
チロシナーゼ活性を有する微生物菌体を用いた製造法
（特開平５−９１８９５号公報）及びトリプトファンシ
ンターゼの存在下でＤＬ−セリンからＤ−セリンを分取
する方法（特開昭６２−１９０９８号公報）が知られて
いる。

【０００４】しかし、特開平５−９１８９５号公報の場
合、高収率でＤ−セリンを得るためには、原料となるフ
ェノールをＤＬ−セリン中のＬ−セリンに対し過剰に加
えて反応する必要があり、生産効率が悪い。また特開昭
６２−１９０９８号公報の場合、反応終了後、生成した
Ｌ−システインをＬ−シスチンに酸化、変換してＤ−セ
リンと分離するか、またはアセトンなどのカルボニル化
合物を添加してＬーシステインと複合体を形成させ、こ
の複合体とＤ−セリンを分離させるなどの方法を示して
いる。この方法では、Ｄ−セリンと副生物との分離工程
が煩雑であり、工業的な製法として問題がある。

【０００５】本発明は、医薬、食品、農薬等の中間体原
料として重要なＤ−セリンを、酵素法によるＤＬ−セリ
ンからのＤ−セリン製造法に関し、効率的に高収量で高
光学純度のＤ−セリンを製造することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは上記
課題を解決するために種々検討した結果、トリプトファ
ンシンターゼ活性を有する微生物菌体またはその処理物
をＤＬ−セリン及びチオフェノールを含む反応液に作用
させ、酵素法によりＬ−セリンからＳ−フェニル−Ｌ−
システインを合成した後、該反応液中に残るＤ−セリン
と生成したＳ−フェニル−Ｌ−システインを濾過により
分離し、高収量でかつ高光学純度のＤ−セリンを取得で
きることを見出し、本発明を完成した。

【０００７】即ち、本発明は、以下のものである。１）トリプトファンシンターゼ活性を有する微生物菌体
あるいはその処理物を、ＤＬ−セリンおよびチオフェノ
ールを含む反応液に作用させ、Ｌ−セリンからＳ−フェ
ニル−Ｌ−システインを合成し該反応液中に残るＤ−セ
リンを取得することを特徴とするＤ−セリンの製造法。２）ｐＨ９．０から１０．５の水溶液中において反応さ
せる１）記載の製造法。３）２０〜６０℃で反応させる１）又は２）記載の製造
法。４）チオフェノールの濃度を１０重量％以下とし、ＤＬ
−セリン中のＬ−セリンに対して１．１倍モル以上加え
ることとする１）記載の製造法。５）ＤＬ−セリン濃度を１〜１５重量％として反応させ
る１）記載の製造法。

【０００８】本発明では、Ｓ−フェニル−Ｌ−システイ
ンの溶解度とＤ−セリンの溶解度差を利用することによ
り、濾過により容易に、効率良くＤ−セリンを分離する
ことができる。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明に用いられるトリプトファ
ンシンターゼの生産菌としては、エシェリヒア・コリな
ど原核細胞の微生物あるいは該酵素の生産性を高めたＤ
ＮＡ組み替え技術の応用により創成された形質転換微生
物であってもよい。また、トリプトファンシンターゼが
サッカロミセス・セレヴイシエ、あるいはカビなど真核
細胞の微生物から得られたものであってもよく、それら
真核細胞微生物の該酵素の生産性を高めるためＤＮＡ組
み替え技術の応用により創成された形質転換微生物であ
ってもよい。好ましくは、エシェリヒア・コリＭＴ−
１０２４２（ＦＥＲＭＢＰ−２０）、ノイロスポラ・ク
ラッサＡＴＣＣ１４６９２などが挙げられる。より
好ましくは微生物乾燥菌体１ｇあたり１時間に１ｇ以上
のトリプトファンを合成できるトリプトファンシンター
ゼ活性を有する微生物である。

【００１０】トリプトファンシンターゼ生産菌を培養す
るための培地としては、炭素源、窒素源、無機物および
必要に応じて少量の微量栄養素を含むものであれば、合
成培地または天然培地のいずれも使用可能である。しか
し、一般には微量のトリプトファン、アントラニル酸ま
たはインドールを培地に添加することが好ましい。

【００１１】培地に使用する炭素源および窒素源は使用
菌の利用可能なものならいずれの種類を用いてもよい。

【００１２】炭素源としては、グルコース、フルクトー
ス、グリセロール、シュクロース、マルトース、マンノ
ース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜など種々の炭水化合
物が使用できる。

【００１３】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸ア
ンモニウムなどの各種の無機および有機アンモニウム塩
類、または肉エキス、酵母エキス、コーン・ステイープ
・リカー、カゼイン加水分解物、フィッシュミールある
いはその消化物、脱脂大豆粕あるいはその消化物などの
天然有機窒素源が使用可能である。天然有機窒素源の多
くの場合は窒素源であるとともに炭素源にもなり得る。

【００１４】無機物としては、燐酸一水素カリウム、燐
酸二水素カリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、
塩化ナトリウム、硫酸第一鉄などが必要に応じて使用で
きる。

【００１５】培養は、振とう培養あるいは通気撹拌深部
培養などの好気的条件下で行う。培養温度は好ましくは
２０〜５０℃、特に好ましくは３０〜３７℃の範囲であ
る。培養中の培地のｐＨは中性付近に維持することが望
ましい。培養時間は通常１〜３日間である。

【００１６】エシェリヒア・コリの培養菌体からのトリ
プトファンシンターゼの抽出法は、ザ・ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー（ＴｈｅＪｏｕ
ｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ）（Ｖｏｌ．２５２，Ｎｏ．１９，ｐ．６５
９４〜６５９９（１９７７））、ノイロスポラ・クラッ
サの培養菌体からの抽出法は同誌Ｖｏｌ．２５０，Ｎ
ｏ．８，２９４１〜２９４６（１９７５）に記載されて
いるが、本発明に使用されるトリプトファンシンターゼ
は、必ずしも純粋である必要はない。

【００１７】すなわち、トリプトファンシンターゼ生産
菌の培養物、培養物から遠心分離などの方法によって採
取した生菌体、その乾燥菌体、あるいは菌体を破砕、自
己消化、超音波処理などによって得られた菌体処理物、
さらにはこれらの菌体よりの抽出物ならびに該抽出物よ
り得られる酵素の粗精製物であっても利用可能である。
また、これらの固定化酵素または固定化菌体でもよい。

【００１８】反応液中のＤＬ−セリンの濃度は特に制限
しないが、好ましくは１〜１５重量％である。反応液中
のチオフェノールの濃度は、酵素反応を阻害しない範囲
でなければならず好ましくは１０重量％以下の濃度で使
用される。

【００１９】また、光学純度の高いＤ−セリンを取得す
るためには、添加するチオフェノールはＤＬ−セリン中
のＬ−セリンに対して１．１倍モル以上であることが好
ましい。なお、反応中にチオフェノールを逐次添加して
もよい。また、反応に際して、基質の他に補酵素である
ピリドキサルリン酸を０．１〜１００ｐｐｍの範囲で添
加することが望ましい。

【００２０】反応液に添加するトリプトファンシンター
ゼの量は、前記したような酵素の分離、精製あるいは処
理方法によって異なるが、特に制限はなく、基質濃度、
酵素活性、反応時間、その他の条件によって適時変更し
得る。

【００２１】本発明のＤ−セリン合成酵素反応はｐＨ
９．０〜１０．５のアルカリ性下で行われる。好ましく
はｐＨ９．０〜１０．０の範囲である。用いるアルカリ
としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニ
ア水などが使用可能である。ｐＨが９．０より低いと、
Ｓ−フェニル−Ｌ−システインを合成する酵素反応速度
が極めて小さいため、未反応のＬ−セリンが反応液中に
残存し光学純度の高いＤ−セリンを得ることができな
い。また、ｐＨが１０．５を超えるとＳ−フェニル−Ｌ
−システインを合成する酵素反応速度は再び低下するた
め、未反応のＬ−セリンの残存により光学純度の高いＤ
−セリンを得ることはできない。

【００２２】酵素反応の温度は好ましくは２０〜６０℃
で行われるが、酵素の安定性と反応速度の点で特に好ま
しくは、３０〜４０℃で行う。なお、反応はチオフェノ
ールの酸化を防止するため、窒素雰囲気下で行うことが
好ましい。

【００２３】また、反応は、バッチ法もしくは固定化酵
素を用いた連続法により、静置もしくは撹拌下に行われ
る。５％以上のチオフェノール濃度で反応する場合は、
撹拌はゆるやかに行うほうがよい。５重量％〜１０重量
％のチオフェノール濃度で反応する場合は、反応液の撹
拌動力を、２０ＫＷ／ｍ³以下にて行うことが望まし
い。反応時間は通常５〜４０時間である。

【００２４】Ｓ−フェニル−Ｌ−システインは水に対す
る溶解度が低く、通常、酵素反応の進行にともない、Ｓ
−フェニル−Ｌ−システインが反応液中で結晶となり析
出する。反応終了液のｐＨを塩酸または硫酸などの適当
な酸により酸性に調整し、析出した結晶を溶解後、活性
炭吸着処理などにより微生物細胞もしくは酵素と未反応
のチオフェノールを除去する。その後、適当なアルカリ
で中和すれば、難溶のＳ−フェニル−Ｌ−システインの
結晶が析出するため、濾過操作で容易にＤ−セリンと副
生物であるＳ−フェニル−Ｌ−システインを分離するこ
とができる。

【００２５】Ｓ−フェニル−Ｌ−システイン結晶を酸溶
解させる際、ｐＨは１．５以下に調整することが好まし
い。Ｓ−フェニル−Ｌ−システインは、水溶液のｐＨが
１．５以下でないと１重量％以上の濃度で溶解させるこ
とができず、容積効率が悪くなるためである。

【００２６】また、活性炭吸着処理は、微生物細胞また
は酵素あるいは微生物細胞由来成分を吸着除去させると
ともに、活性炭に吸着されない一部の未反応のチオフェ
ノールを充分に除去するため、同時に溶液に空気あるい
は酸素を通気させることが好ましい。通気により、チオ
フェノールが酸化され不溶性の固体となるので濾過によ
り除去可能となるためである。通気量は、好ましくは
０．０１〜６．０倍容積比／Ｈｒである。また活性炭吸
着処理温度は４０〜９０℃、特に好ましくは４０〜６０
℃で行う。

【００２７】用いる活性炭は特に制限されることはな
く、ＰＭ−ＳＸ、ＰＭ−ＰＡ、ＰＭ−ＫＩ、ＰＭ−Ｋ
Ｓ、ＰＭ−ＡＡ（以上、三井製薬）ＷＰＨ、ＰＣＢ−
Ｇ、ＡＤＰ（以上東洋カルゴン）、白鷺Ａ、白鷺Ｍ、白
鷺Ｃ、カルボラフィン（以上、武田薬品工業）、太閤Ｓ
タイプ、太閤Ｋタイプ（以上、二村化学）などを用いる
ことができる。活性炭の添加量は、通常、溶液の質量に
対して０．５〜６％の量を添加するが、酵素反応のトリ
プトファンシンターゼ源として用いた酵素または微生物
細胞の量および未反応チオフェノールの量によって、活
性炭の添加量は変更し得る。また、活性炭吸着処理時に
濾過助剤としてラジオライトなどを使用することについ
ても、特に制限されることはない。

【００２８】

【実施例】以下、実施例によって本発明の方法を説明す
る。

【００２９】実験例１トリプトファンシンターゼ生産菌であるエシェリヒア・
コリＭＴ−１０２４２（ＦＥＲＭＢＰ−２０）
を、第１表に示す組成の培地１５０ｍｌが入った５０
０ｍｌ容の坂口フラスコに接種し、３０℃で２４時間振
とう培養した。この培養液６００ｍｌ（フラスコ４本
分）を第２表に示す組成の培地１０Ｌを仕込んだ２０Ｌ
のジャーファーメンターに接種し、３０℃、ｐＨ６．８
（濃アンモニア水でコントロール）で、グルコースを逐
次添加しながら４０時間通気培養した。培養終了後、遠
心分離により菌体を集菌し、得られた湿菌体をトリプト
ファンシンターゼ源とした。

【００３０】

【表１】ｐＨ７．０に調整

【００３１】

【表２】

【００３２】実施例１実験例１と同様の方法でエシェリヒア・コリＭＴ−１０
２４２（ＦＥＲＭＢＰ−２０）の湿菌体を得た。ＤＬ
−セリン５４．４ｇ、ピリドキサルリン酸８ｍｇを含む
水溶液３８５ｇを３５℃まで加温し、４５％Ｎａ０Ｈで
ｐＨ９．５に調整した。この水溶液に、上記遠心菌体を
乾燥菌体換算で０．９６％濃度となるように加え総重量
４６８．７ｇになるように蒸留水を加えた後、４０℃
で、２７時間窒素雰囲気下で撹拌することにより反応を
行った。チオフェノールは、仕込み時に１５．７ｇ（反
応液に対し約３．２％濃度）、４時間、７時間後にそれ
ぞれ７．８ｇ（反応液に対し約１．５％濃度）を加え、
反応スケールは５００ｇで行った。反応終了後、反応液
に濃塩酸を加えて、ｐＨを０．５とした後、蒸留水５２
７ｇを加えてＳ−フェニル−Ｌ−システインの析出結晶
を完全に溶解させた。５０℃まで昇温し活性炭２７．４
ｇとラジオライト２２．４ｇを加え、液中に空気を通気
しながら５０℃で３時間、撹拌した。その後、濾過を行
い、濾液を４５％ＮａＯＨでｐＨ３．０に調整し３０℃
で１時間晶析した。晶析液の濾過を行い、Ｓ−フェニル
−Ｌ−システイン結晶とＤ−セリンを分離した。濾液中
のＤ−セリン量は２２．０ｍｇ／ｇであり、光学純度９
８．７％ｅｅであり、収率９５％であった。なお、Ｄ−
セリンの光学純度分析は液体クロマトグラフィーによっ
て行い、その分析条件は以下に示した通りである。

【００３３】Ｄ−セリンの光学純度分析条件カラム；ダイセルＣＲＯＷＮＰＡＫ^TM ＣＲ（＋）移動相；過塩素酸水溶液（ｐＨ１．３）流速；０．４ｍｌ／ｍｉｎ温度；０℃ 検出試薬；ＯＰＡ試薬Ｅｘ＝３６５ｎｍＥｍ＝４
５５ｎｍ

【００３４】

【発明の効果】本発明によればＤＬ−セリン中のＬ−セ
リンをＳ−フェニル−Ｌ−システインに効率良く変換
し、未反応のＤ−セリンを濾過操作で容易にＳ−フェニ
ル−Ｌ−システインと分離することで、光学純度の高い
Ｄ−セリンを高収量で取得することが可能である。本発
明で工業的規模でのＤ−セリン製造法が確立されたこと
で各種中間体として期待のもてる該化合物の取得方法が
明らかになり、本発明の意義は大きい。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】トリプトファンシンターゼ活性を有する微
生物菌体あるいはその処理物を、ＤＬ−セリンおよびチ
オフェノールを含む反応液に作用させ、Ｌ−セリンから
Ｓ−フェニル−Ｌ−システインを合成し該反応液中に残
るＤ−セリンを取得することを特徴とするＤ−セリンの
製造法。
【請求項２】ｐＨ９．０から１０．５の水溶液中におい
て反応させる請求項１記載の製造法。
【請求項３】２０〜６０℃で反応させる請求項１又は２
記載の製造法。
【請求項４】チオフェノールの濃度を１０重量％以下と
し、ＤＬ−セリン中のＬ−セリンに対して１．１倍モル
以上加えることとする請求項１記載の製造法。
【請求項５】ＤＬ−セリン濃度を１〜１５重量％として
反応させる請求項１記載の製造法。