ES2322752T3 - Cebadores oligonucleotidicos para la deteccion eficiente del vrius de la hepatitis c (vhc) y sus procedimientos de uso. - Google Patents

Cebadores oligonucleotidicos para la deteccion eficiente del vrius de la hepatitis c (vhc) y sus procedimientos de uso. Download PDF

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Abstract

Un procedimiento para detectar la presencia del ARN del Virus de la Hepatitis C (VHC) en una muestra biológica, comprendiendo dicho procedimiento: (A) realizar una reacción de transcripción inversa usando, como molde, ARN derivado de dicha muestra para producir productos de transcripción inversa específicos del VHC; (B) amplificar dichos productos de transcripción inversa utilizando uno o más pares de cebadores oligonucleotídicos específicos para el VHC para producir productos de amplificación específicos del VHC, en el que dichos pares de cebadores oligonucleotídicos comprenden: (a) cebador delantero 5''-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3'' y (b) cebador inverso 5''-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3; y (C) detectar dichos productos de amplificación, en el que la detección de dichos productos de amplificación indica la presencia del ARN del VHC en dicha muestra.

Description

Cebadores oligonucleotídicos para la detección eficiente del virus de la hepatitis C (VHC) y sus procedimientos de uso.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a procedimientos mejorados para detectar secuencias de ácidos nucleicos en muestras biológicas, en particular secuencias derivadas de microorganismos infecciosos.
Antecedentes de la invención
El virus de la Hepatitis C (VHC) es un virus transmitido por vía parenteral responsable de la mayoría de los casos de hepatitis post-transfusión y de una porción sustancial de los casos mundiales de hepatitis esporádica (o adquirida en la comunidad). Se estima que más del 1% de la población mundial está infectada con VHC. La infección con VHC está asociada con hepatitis aguda, hepatitis crónica, cirrosis y carcinoma hepatocelular.
El VHC se clasifica actualmente como género separado, Hepacivirus, en la familia Flaviviridae. Su genoma consiste en una molécula de ARN de cadena positiva de aproximadamente 9.500 nucleótidos con un único marco de lectura abierta (ORF) grande que codifica una poliproteína precursora de aproximadamente 3.000 aminoácidos. El gran ORF está precedido por una región no codificadora 5' (NCR) de aproximadamente 340 nucleótidos, que es la región más altamente conservada del genoma. La región 5' del ORF codifica una proteína de la cápside (en dirección 5' a 3'), dos glicoproteínas de envoltura (E1 y E2) y una pequeña proteína de función desconocida (P7). La porción 3' del ORF codifica proteínas no estructurales que incluyen una proteasa, una proteína bifuncional proteasa/helicasa, ARN polimerasa y péptidos reguladores. La porción 3' también incluye una NCR.
El análisis de las secuencias codificadoras del VHC de todo el mundo ha revelado una variación de secuencia considerable entre aislados virales individuales. Además, los análisis de las secuencias del VHC de pacientes individuales han demostrado que el virus circula como las llamadas "cuasi-especies", que contienen secuencias relacionadas pero no idénticas. Se considera que la variación que existe entre aislados y dentro de los pacientes individuales es el resultado de la baja fidelidad de la ARN polimerasa dependiente de ARN codificada por el virus. El grado de variabilidad genética del VHC tiene importantes implicancias para la prevención, diagnóstico y control de la infección.
El serodiagnóstico de la infección con VHC se determina normalmente mediante inmunoensayos enzimáticos disponibles en el comercio (EIA) que detectan anticuerpos que se unen a proteínas o péptidos recombinante del VHC. Los resultados de EIA positivos pueden ser confirmados por un ensayo de inmunotransferencia recombinante (RIBA), pero ni el ensayo EIA ni el RIBA distinguen infecciones pasadas de presentes. Debido al normalmente bajo título de virus circulante, no se ha desarrollado con éxito un ensayo directo para las proteínas virales. Además, los ensayos basados en anticuerpos no logran detectar infección con VHC durante usualmente 2 a 3 meses después de la exposición.
Roth et al, J. Clin. Microbiol. 34(2): 261-264 (1996) desvelan ensayos de transcriptasa inversa del VHC, que se basan en la transcripción inversa de una sola ronda del ARN del VHC, combinada con la amplificación por PCR usando cebadores derivados de la región 5'-NCR del VHC.
Karachristos et al, J. Med. Microbiol. 42: 367-371 (1995), WO-A-9746719 y Yoshioka et al, Hepatology 16 (2): 293-299 (1992) desvelan procedimientos relacionados para la detección del VHC.
En la técnica aún se necesitan ensayos mejorados para el VHC que sean suficientemente sensibles para detectar la viremia del VHC dentro de unos pocos días posteriores a la exposición inicial de un paciente al VHC.
Sumario de la invención
En consecuencia, en un primer aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para detectar la presencia de ARN del Virus de la Hepatitis C (VHC) en una muestra biológica. El procedimiento comprende:
(A) realizar una reacción de transcripción inversa mediante un ARN molde derivado de la muestra para producir productos de transcripción inversa específicos del VHC;
(B) amplificar los productos de transcripción inversa usando uno o más pares de cebadores oligonucleotídicos específicos para el VHC para producir productos de amplificación específicos del VHC,
en el que dichos pares de cebadores oligonucleotídicos comprenden:
(a) cebador delantero 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' y
(b) cebador inverso 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' y
(C) detectar los productos de amplificación,
en el que la detección de los productos de amplificación indica la presencia del ARN del VHC en la muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para amplificar el ADN del Virus de la Hepatitis C (VHC). El procedimiento comprende:
(A) realizar una reacción en cadena de polimerasa en una muestra de ADN que contiene ADN del VHC usando uno o más pares de cebadores oligonucleotídicos específicos para el VHC para producir productos de amplificación específicos del VHC,
en el que dichos pares de cebadores oligonucleotídicos comprenden:
(a) cebador delantero 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' y
(b) cebador inverso 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' 
\vskip1.000000\baselineskip
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un procedimiento para detectar la presencia del ARN del Virus de la Hepatitis C (VHC) en una muestra biológica. El procedimiento comprende:
(A) realizar una reacción de transcripción inversa usando como molde ARN derivado de la muestra para producir productos de transcripción inversa específicos del VHC;
(B) amplificar los productos de transcripción inversa usando uno o más pares de cebadores oligonucleotídicos de NCR 5' específicos para el VHC y uno o más pares de cebadores oligonucleotídicos de NCR 3' para producir productos de amplificación específicos del VHC, en el que dichos pares de cebadores oligonucleotídicos de NCR 5' comprenden:
(a) cebador delantero 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' y
(b) cebador inverso 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' y
en el que cada uno de los pares de cebadores oligonucleotídicos de NCR 3' comprende un cebador delantero que consiste en el oligonucleótido 5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3' y un cebador inverso que consiste en el oligonucleótido 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3; y
(C) detectar los productos de amplificación,
en el que la detección de los productos de amplificación indica la presencia del ARN del VHC en la muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
En algunas realizaciones del procedimiento, donde se lleva a cabo una reacción de transcripción inversa, la reacción de transcripción inversa se efectúa usando cebadores oligonucleotídicos aleatorios; alternativamente, se pueden usar uno o más cebadores de transcripción inversa específicos del VHC, es decir, oligonucleótidos que tienen secuencias que corresponden a las secuencias del ARN del VHC. Los procedimientos para la detección de la amplificación incluyen, sin limitación, (a) electroforesis y (b) captura de productos de amplificación en un soporte sólido al que se unen sondas especificas del VHC seguido de cuantificación de los productos unidos usando un ensayo
colorimétrico.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un kit para amplificar el ADN del VHC derivado del ARN del VHC. El kit comprende uno o más pares de cebadores oligonucleotídicos de NCR 5', donde dichos pares de cebadores 5' de PCR comprenden:
(a) cebador delantero 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' y
(b) cebador inverso 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3'.
Descripción detallada de la invención
Los presentes inventores han descubierto que la detección del ARN del Virus de la Hepatitis C (VHC) en muestras biológicas es más eficiente cuando los oligonucleótidos que tienen secuencias complementarias con ciertas secuencias presentes en el ARN del VHC se usan como cebadores para la amplificación. La presente invención en consecuencia proporciona un ensayo mejorado de transcripción inversa/amplificación de una sola ronda que detecta bajos niveles de copia del ARN del VHC. Los cebadores oligonucleotídicos se seleccionan sobre la base de consideraciones teóricas de conservación de secuencias, interacciones intra- e intermoleculares y las estructuras secundarias predichas del amplicón y la secuencia circundante. Además, los cebadores y el sistema de ensayo se diseñan para permitir la co-amplificación (y co-detección) de múltiples regiones del genoma del VHC, múltiples especies virales y un ARN de control positivo interno (IPC) (o ADN). La amplificación/detección simultánea de múltiples regiones del genoma del VHC incrementa la sensibilidad del ensayo y la co-amplificación de un IPC disminuye la probabilidad de resultados falsos negativos a causa de la inhibición de la PCR.
Muchas técnicas de biología molecular, microbiología, ADN recombinante y bioquímica de proteínas se usan para practicar la presente invención, tal como las que se explican, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology, Volúmenes I, II y III, 1997 (F.M.. Ausubel ed.); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; ADN Cloning: A Practical Approach, Volúmenes I y II, 1985 (D.N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984, (M.L. Gait ed.); Transcription and Translation, 1984 (Hames y Higgins eds.); A Practical Guide to Molecular Cloning; las series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.) y Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer-Verlag, N.Y.).
"Ácido nucleico" o "polinucleótido", como se usa en la presente, se refiere a polímeros que contienen purina y pirimidina de cualquier longitud, sean polirribonucleótidos o polidesoxirribonucleótidos o polirribo-polidesoxirribonucleótidos mixtos. Esto incluye moléculas monocatenarias y bicatenarias, tales como, por ejemplo, híbridos ADN-ADN, ADN-ARN y ARN-ARN, así como los "ácidos nucleicos proteicos" (PNA) formados por la conjugación de bases a un esqueleto de aminoácidos. Esto también incluye ácidos nucleicos que contienen bases modificadas.
Un "complemento" de una secuencia de ácido nucleico, como se usa en la presente, se refiere a la secuencia antisentido que participa en el apareamiento de bases de Watson-Crick con la secuencia original.
Un "cebador", como se usa en la presente, es un oligonucleótido aislado de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, preferiblemente entre aproximadamente 12 y aproximadamente 25 nucleótidos de longitud y con máxima preferencia entre aproximadamente 12 y aproximadamente 18 nucleótidos de longitud, que forma una doble hebra con una secuencia de ácido nucleico monocatenaria de interés y permite la polimerización de una cadena complementaria usando, por ejemplo, transcriptasa inversa o ADN polimerasa.
Un ácido nucleico "aislado", como se usa en la presente, se refiere a un componente que se extrae de su ambiente original (por ejemplo, su ambiente natural si es natural o una mezcla de reacción si es sintético). Un ácido nucleico aislado normalmente contiene menos de aproximadamente 50%, preferiblemente menos de aproximadamente 75%, y con máxima preferencia menos de aproximadamente 90%, de los componentes con los que estaba originalmente asociado.
Una secuencia de ácido nucleico que "deriva de" una secuencia designada se refiere a una secuencia que corresponde a una región de la secuencia designada. Esta abarca secuencias que son homólogas o complementarias con la secuencia.
Un ácido nucleico blanco como control positivo interno (IPC) se refiere a una secuencia de ácido nucleico sintética clonada en un vector plásmido que posteriormente se linealiza, normalmente por acción de una endonucleasa de restricción. Normalmente un IPC tendrá múltiples secuencias de unión a cebadores que rodean a una región genérica de unión a sondas y actúa como un control genérico contra resultados falsos negativos en reacciones de amplificación de ácidos nucleicos.
La secuencia preferida de un ADN blanco como control positivo interno es:
1
Los ácidos nucleicos que comprenden cualquiera de las secuencias descritas en la presente o subsecuencias de los mismos se pueden preparar por procedimientos convencionales. Por ejemplo, el ADN se puede sintetizar químicamente usando, por ejemplo, el procedimiento del soporte sólido de fosforamidita de Matteucci et al., 1981, J. Am. Chem. Soc. 103:3185, el procedimiento de Yoo et al., 1989, J. Biol. Chem. 764:17078 u otros procedimientos bien conocidos. Los ácidos nucleicos también se pueden modificar por muchos medios conocidos en la técnica. Ejemplos no limitantes de tales modificaciones incluyen metilación, "capuchones", sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales con un análogo y modificaciones inter-nucleótido tales como, por ejemplo, las que tienen enlaces no cargados (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosforoamidatos, carbamatos, etc.) o enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.). Los ácidos nucleicos pueden contener uno o más restos adicionales unidos covalentemente, tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, hierro, metales oxidantes, etc.), y agentes alquilantes. Los PNA también están comprendidos por el término "ácido nucleico". El ácido nucleico se puede derivatizar por formación de un fosfotriéster de metilo o etilo o una unión fosforamidato de alquilo. Además, las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención también se pueden modificar con un marcador capaz de proporcionar una señal detectable, ya sea en forma directa o indirecta. Los ejemplos de marcadores incluyen radioisótopos, moléculas fluorescentes, biotina y similares.
La amplificación, como se usa en la presente, se refiere a un proceso iterativo por el cual se copia un ácido nucleico. Los procedimientos adecuados para la amplificación incluyen, sin limitación, la reacción en cadena de la polimerasa, la reacción en cadena de la ligasa, amplificación por desplazamiento de hebra, amplificación mediada por transcripción y amplificación de base única de ácidos nucleicos.
La presente invención proporciona procedimientos para la detección del VHC en muestras biológicas. Los procedimientos se llevan a cabo
(i) realizando una reacción de transcripción inversa usando como molde ARN contenido en o derivado de la muestra;
(ii) amplificando los productos de transcripción inversa usando pares de cebadores de amplificación que tienen secuencias correspondientes a secuencias dentro de la región no codificadora 5' o 3' del ARN del VHC, para producir productos de amplificación específicos del VHC; y
(iii) detectando los productos de amplificación específicos del VHC. La detección de los productos de amplificación específicos del VHC indica la presencia del ARN del VHC en la muestra.
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De acuerdo con la invención, se obtiene una muestra biológica de un paciente por cualquier medio convencional. Las muestras biológicas adecuadas incluyen, sin limitación, sangre, suero, plasma, orina, leche materna y líquido cefalorraquídeo. Preferiblemente, se usa plasma como fuente de ARN del VHC.
La muestra biológica se trata de cualquier manera que proporcione acceso de los reactivos de transcripción inversa al ARN, en forma específica al ARN del VHC, contenido en la muestra. El ARN "derivado de" una muestra biológica es cualquier ARN que estaba originalmente presente en la muestra y al que se logra acceder por el tratamiento de la muestra. Preferiblemente, se extrae ARN de la muestra usando cualquier procedimiento conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, procedimientos que emplean tiocianato de guanidinio o que usan reactivos y procedimientos disponibles en el comercio tales como, por ejemplo, PureScript® de Gentra Systems, Inc. (Minneapolis MN). Se puede usar cualquier procedimiento de extracción que produzca la separación del ARN de las ARNasas, otras proteínas y/o cualquier otro componente que pueda interferir en la transcripción inversa.
La muestra se somete posteriormente a la transcripción inversa usando (a) cebadores aleatorios, tales como cebadores hexaméricos aleatorios que se pueden obtener en Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey y/o (b) cebadores derivados de las NCR 5' o 3' de la secuencia genómica del ARN del VHC. La transcripción inversa se lleva a cabo usando procedimientos convencionales, tales como los descritos en Current Protocols in Molecular Biology, Volúmenes I, II y III, 1997 (F.M.. Ausubel ed.); en la patente estadounidense 5.322.770; en Young, et al., J. Clin. Microbiol. 31(4):882 (1993); Myers et al., Biochemistry 30(3):7661 (1991).
Después de la reacción de transcripción inversa, los productos se amplifican. Se puede usar cualquier procedimiento de amplificación, que incluye, sin limitación, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa, reacción de desplazamiento de hebra, amplificación de base única de ácidos nucleicos y amplificación mediada por transcripción. Preferiblemente, se usa PCR. Normalmente, una mezcla de reacción que contiene todos los componentes necesarios para PCR se agrega directamente a la mezcla de reacción de transcripción inversa. Después se lleva a cabo la amplificación usando las condiciones especificadas por los pares de cebadores que se usan.
Los presentes inventores han descubierto que ciertos pares de cebadores de amplificación específicos del VHC son particularmente ventajosos para detectar ARN del VHC en muestras de pacientes. Ejemplos no limitantes de cebadores útiles derivados de la NCR 5' del genoma del VHC incluyen los enumerados en la siguiente Tabla 1.
2
Se puede usar cualquier combinación de oligonucleótidos homosentido y antisentido como cebadores de amplificación delanteros e inversos, respectivamente. Los pares preferidos de cebadores de NCR 5' para usar en la amplificación incluyen:
(a) 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' 
\hskip0.3cm
y 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3'
y
(b) 5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3' y 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3'.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, el par de cebadores de amplificación consiste en 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATG
GCGTTAGTA-3' y 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3'. En otra realización preferida, el par de cebadores de amplificación consiste en 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' y 5'-CGGGGCACTCGCAAG
CACCCTATCA-3'
Ejemplos no limitantes de cebadores útiles derivados de la NCR 3' del genoma del VHC incluyen un cebador delantero que consiste en 5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3' y un cebador inverso que consiste en
5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (57R27).
La invención también abarca la amplificación múltiple, es decir, la amplificación simultánea de secuencias diferentes usando conjuntos diferentes de cebadores en la misma mezcla de reacción. Un conjunto preferido de pares de cebadores que se pueden usar simultáneamente en una reacción de amplificación múltiple es:
(a) 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAA-3' 
\hskip0.28cm
y 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCA-3' 
\hskip0.37cm
(par 5')
y
(b) 5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3' y 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3' (par 3').
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.900000\baselineskip
Después de la amplificación, se pueden detectar productos amplificados usando cualquier procedimiento conocido en la técnica, que incluye, sin limitación, electroforesis en gel de agarosa o acrilamida; detección colorimétrica no isotópica tal como el sistema SureCell® (véase, por ejemplo, el Ejemplo 1 más adelante); detección de ECi; fluorescencia y quimioluminiscencia. Los reactivos útiles en tales procedimientos de detección están disponibles en, por ejemplo, Molecular Probes, Eugene, Oregon y Ortho Clinical Diagnostics, Rochester, NY.
La detección de productos de amplificación específicos del VHC indica la presencia del ARN del VHC en la muestra. Cuando se usa la electroforesis en gel, los productos de amplificación específicos del VHC se confirman por su tamaño, predicho por la localización del ARN del VHC de las secuencias correspondientes a los cebadores de amplificación usados en la reacción. Las sondas de captura de NCR 5' específicas del VHC útiles para la detección colorimétrica incluyen, sin limitación, 5'-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3',5'-CCTTTCGC
GACCCAACACTACTCGGCT-3' y 5'-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3'. Las sondas de captura de NCR 3' específicas del VHC incluyen, sin limitación, 5'-GCGGCTCACGGACCTTTCACAGCTA-3' y 5'-ATGCGGCT
CACGGACCTTTCACAGC-3'.
Se pueden preparar kits para amplificar el ADN del VHC derivado del ARN del VHC que contienen uno o más pares de cebadores oligonucleotídicos de la NCR 5' delanteros e inversos, donde los cebadores delanteros pueden ser 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' (C69F28), 5'-GGGAGAGCCATAGTGGTCTGCG
GAA-3' (C131F25) o 5'-GTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3 (C143F26) y los cebadores inversos pueden ser 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3' (C133R26), 5'-GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACA-3' (C282R27), 5'-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTA-3' (C287R27) o 5'-CGGGGCACTCGCAAGCACCC
TATCA-3' (C294R25).
También se pueden preparar kits para amplificar el ADN del VHC derivado del ARN del VHC que contienen uno o más pares de cebadores oligonucleotídicos delanteros e inversos de NCR 3', donde el cebador delantero puede ser 5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3' (1F27) y el cebador inverso puede ser el oligonucleótido
5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3 (57R27).
También están comprendidos en el alcance de la invención kits para detectar la presencia del ADN del VHC, que comprenden los cebadores de la NCR 5' y 3' descritos anteriormente para la amplificación del ADN del VHC derivado del ARN del VHC.
Los kits pueden comprender además reactivos e instrucciones para la transcripción inversa, amplificación y detección de productos. Por ejemplo, los kits pueden contener transcriptasa inversa, desoxinucleótidos, polimerasas termoestables adecuadas para las reacciones de amplificación del ADN y reactivos para marcación y detección de ácidos nucleicos.
La presente invención se utiliza para el diagnóstico de la infección con VHC en pacientes; para determinar la eficacia de regímenes terapéuticos anti-VHC; y para analizar el aporte sanguíneo para las muestras infectadas con VHC.
Descripción de las realizaciones preferidas
Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención sin limitación.
Ejemplo 1 Detección del VHC en Muestras Biológicas: Comparación entre cebadores de amplificación del VHC 5' y el ensayo del VHC Roche Amplicor
Los siguientes experimentos se realizaron para comparar el ensayo del VHC de la presente invención con el sistema Roche Amplicor.
A. Procedimientos 1. Preparación de la muestra
Se preparó ARN a partir de muestras de plasma usando reactivos de aislamiento PureScript® ARN (Gentra Systems, Minneapolis MN). Las modificaciones al protocolo del fabricante para los líquidos corporales incluyeron el uso de 40 \mug de glucógeno, en lugar de 20 \mug, como vehículo para ayudar en la precipitación del ARN viral. Además, en la mayoría de los casos, después de la precipitación con alcohol isopropílico del ARN y lavado del pélet de ARN con etanol, el pélet de ARN se resuspendió en la mezcla de tampones TI en lugar de la solución de hidratación del ARN provista por el fabricante.
2. Transcripción Inversa
La síntesis de ADNc a partir de ARN fue catalizada por la adición de 100 U de transcriptasa inversa (TI) del Virus de Leucemia Murina Moloney (M-MLV) (Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland) en 50 \mul de una solución de Tris-HCl 50 mM (pH 8,3), KCl 75 mM, MgCl_{2} 3 mM, DTT 10 mM, 0,4 mM en cada dNTP (Pharmacia Biotech), 4 \muM en hexámeros aleatorios (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) o cebador de transcripción inversa específico, y 20 unidades de RNasina (Promega, Madison, Wisconsin) en agua tratada con pirocarbonato de dietilo (DEPC). Después de la incubación a 42ºC durante 30 min, la reacción de TI se mantuvo a 100ºC durante 5 min para destruir la actividad de TI. Cada reacción se enfrió durante 1 minuto seguido de microcentrifugación a 16000 x g durante 4 segundos.
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3. Amplificación por PCR
Se llevó a cabo PCR en un termociclador PE9600 (Perkin-Elmer) en 100 \mul de solución de Tris-HCl 25 mM, MgCl_{2} 3 mM, EDTA 0,725 mM, KCl 54 mM, NaCl 3,72 mM, DTT 40 \muM, 108 \mug/mL de gelatina (tipo IV), 9,5% de glicerol, 0,02% de Tween 20, 0,02% de NP40, ADN de timo de ternero (2 \mug), 1,2 mM en cada dNTP, 0,4 \muM en cada cebador, 10 copias de ADN plásmido como control positivo interno linealizado (IPC) y 16 U de Taq polimerasa. Se añadieron a la reacción los anticuerpos monoclonales para Taq TP1-12 y TP4-9, cuyas preparaciones se describen en la patente estadounidense 5.338.671, con una relación molar de 50:1 y 5:1, respectivamente, para proporcionar una relación molar 55:1 del anticuerpo para Taq polimerasa. Después de la desnaturalización inicial a 96ºC durante 3 min, se realizaron 40 ciclos de amplificación a 96ºC durante 5 segundos y 68ºC durante 40 segundos. Al final del ciclado, se realizó una etapa de pos-calentamiento durante 5 min a 103ºC para inactivar la Taq polimerasa. Los cebadores usados se muestran en la siguiente Tabla 2.
4 
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Los tamaños de producto predichos se muestran en la siguiente Tabla 3.
6
4. Detección de productos de PCR
Los productos de PCR se biotinilaron mediante el uso de cebadores marcados con biotina en 5' (hebra homosentido) durante la amplificación. El producto se capturó por hibridación con sondas de oligonucleótidos unidas covalentemente a partículas de látex, que se depositaron sobre la superficie de una membrana de flujo continuo (ensayos SureCell®, Ortho Clinical Diagnostics, Rochester, NY). Las sondas fueron: 5'-GGGTCCTGGAGGCTGCACGA
CACTCAT-3' (denominada C96-27-PRB); 5'-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' (denominada C252-27-PRB) y 5'-TTTCGCGACCCAACACTACTCGGCT-3' (denominada C252-25-PRB). El complejo sonda/producto se hizo reaccionar con el conjugado estreptoavidina (SA)-peroxidasa de rábano (HRP), que cataliza la conversión oxidativa de un precursor de colorante a un colorante (color azul). La intensidad del color azul se evaluó en forma visual (0-10) por comparación de la intensidad del color con patrones de color. Se consideró resultados positivos todos los puntajes de color visuales > 3.
5. Ensayo Roche Amplicor
El ensayo Roche Amplicor (Roche Diagnostics, Kaiseraugst, Suiza) se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
B. Resultados
Se ensayó un panel de 42 muestras de pacientes brasileños y egipcios para determinar el VHC como se describió anteriormente. Algunas de las muestras también se analizaron usando el ensayo Chiron B-ADN. Se esperaba que las muestras de Brasil contuvieran una mayor proporción del genotipo 3 del VHC en comparación con las muestras de USA y se esperaba que las muestras de Egipto consistieran en su mayor parte en el genotipo 4 del VHC, un genotipo que rara vez se halla en USA.
Todas las reacciones se realizaron por duplicado. Un puntaje positivo indica que ambos duplicados fueron positivos. Los resultados se muestran en la Tabla 4 siguiente.
7
8 
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Una comparación entre los resultados obtenidos usando los cebadores de la NCR 5' de la presente invención y el sistema de ensayo Roche se sintetiza en las Tablas 5 y 6 siguientes:
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TABLA 5
9
TABLA 6
10
Todos los cebadores de la invención demostraron sensibilidad superior cuando se compararon con el ensayo Roche Amplicor. El uso del par de cebadores 69F/133R proporcionó la mayor sensibilidad. Cinco muestras que fueron negativas mediante el ensayo de Roche fueron positivas usando el par de cebadores C131/C294 de la presente invención, mientras que 11 muestras que resultaron negativas mediante el ensayo de Roche resultaron positivas usando el par de cebadores 69F/133R de la presente invención. Además, todas las muestras con cargas virales detectables por el ensayo Chiron bDNA fueron detectadas usando los cebadores de la presente invención, mientras que tres de estas no fueron detectadas usando el ensayo Roche Amplicor. Ninguno de los controles negativos fue calificado como positivo en el ensayo de acuerdo con la presente invención.
En una segunda serie de experimentos, se analizaron 150 muestras de plasma de Brasil que previamente arrojaron resultado positivo para el anticuerpo del VHC en el ensayo Roche Amplicor y usando los cebadores de la presente invención. Las siguientes Tablas 7 y 8 muestran resultados basados en los puntajes de color SureCell®. Para cada reacción, se examinaron los productos en geles para confirmar los resultados. Se incluyeron para cada conjunto de cebadores controles negativos (intercalados en todas las muestras clínicas) que consistían en muestras de plasma negativas y agua (sin ARN). Todos los controles negativos arrojaron resultado negativo.
TABLA 7
11 
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TABLA 8
12
Ambos pares de cebadores de la NCR 5' de acuerdo con la presente invención exhibieron superior sensibilidad respecto del sistema de ensayo de Roche. La mayor sensibilidad se obtuvo usando el par de cebadores 69F/133R, que detectó la presencia de ARN del VHC en tres muestras adicionales en comparación con el par de cebadores C131/C294.
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Ejemplo 2 Análisis de sensibilidad de los ensayos de la NCR 5' del VHC
Se realizaron los siguientes experimentos para analizar la sensibilidad del ensayo del VHC usando los pares de cebadores de la NCR 5' de la presente invención.
1. Se diluyeron tres muestras de pacientes sobre la base de las cantidades de copias teóricas de ARN del VHC y se determinó el ARN del VHC usando el sistema Roche Amplicor y los pares de cebadores de la presente invención. Los resultados se muestran en la Tabla 9 siguiente.
13
En los tres conjuntos de muestras diluidas de pacientes, el ensayo que emplea los cebadores de la NCR 5' de la presente invención exhibieron mayor sensibilidad que el ensayo de Roche.
2. El plasma conocido como positivo para el VHC se diluyó con plasma negativo para el VHC y se analizó como se describió anteriormente. Se incorporó un plásmido como control positivo interno (IPC) en la mezcla de reacción a razón de 10 copias/reacción. Los resultados (una compilación de cinco experimentos) se muestran en la Tabla 10 siguiente.
15
El par de cebadores de NCR 5' C131F/C294R exhibió excelente sensibilidad y fue capaz de detectar una cantidad tan pequeña como una partícula viral única por reacción de PCR predicha por un análisis de distribución de
Poisson.
3. Dieciocho muestras de pacientes con bajas cargas virales de VHC (intervalo = 316-8080 copias/ml, que corresponde a 16-404 copias/reacción de PCR).
Diecisiete de las dieciocho muestras fueron positivas en el presente ensayo.
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Ejemplo 3 Detección de VHC en Muestras Biológicas: Comparación entre cebadores de amplificación de la NCR 3' del VHC y el Ensayo de VHC de Roche Amplicor
Se analizaron 150 muestras de plasma de Brasil que resultaron previamente positivas para el anticuerpo VHC en el ensayo Roche Amplicor y usando los cebadores de NCR 3' de la presente invención. Se realizaron la transcripción inversa y amplificación como se describió en el Ejemplo 1 anterior. Se realizó transcripción inversa usando un cebador con la secuencia 5'-GTATCAGCACTC-3', y se realizó la amplificación usando el par de cebadores X1F27/57R27. Cada reacción contenía un control positivo interno (IPC) de ADN plásmido. La detección de los productos de amplificación se realizó usando el sistema SureCell®, empleando como sonda de captura 3X30PRB25. En cada reacción, se examinaron los productos en geles para confirmar los resultados. Se incluyeron en cada conjunto de cebadores controles negativos (intercalados en todas las muestras clínicas) que consistían en muestras de plasma negativas y agua (sin ARN) y todos fueron negativos en RT-PCR. Una comparación entre los resultados obtenidos usando los cebadores de la presente invención y el sistema de ensayo de Roche se resume en la Tabla 11.
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TABLA 11
16
Ejemplo 4 Detección del VHC en Muestras Biológicas: Comparación de la Presente Invención con el Ensayo de PCR Anidada de NCR 5' del Hospital General de Rochester (RGH)
El siguiente experimento se realizó para comparar los cebadores de NCR 3' del VHC de la presente invención con el sistema de detección de PCR Anidada del RGH.
Ochenta y tres muestras de plasma se sometieron a transcripción inversa usando el cebador 57R27 y los productos de la transcripción inversa se amplificaron usando el par de cebadores 3X1F27/57R27 utilizando los procedimientos descritos en el Ejemplo 1 anterior. En cada reacción, se examinaron los productos en geles para confirmar los resultados. Se incluyeron controles negativos (intercalados en todas las muestras clínicas) que consistían en muestras de plasma negativas y agua (sin ARN) y todos resultaron negativos en este ensayo.
Una comparación entre los resultados obtenidos usando los cebadores de la presente invención y el sistema de ensayo de Roche se resume en la Tabla 12.
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TABLA 12
17
Estos resultados demuestran que el sistema de detección de la presente invención es a la vez sensible y específico cuando se lo compara con el sistema de PCR anidada del RGH. El ensayo de acuerdo con la invención concordó con el ensayo del RGH en 25 de las 26 muestras negativas. La ventaja de la presente invención es que existe menor probabilidad de arrastre que cuando se realiza la PCR anidada, ya que en esta última, el tubo se debe abrir durante la reacción para agregar nuevos reactivos. La única muestra que indica un resultado falso negativo podría ser un ejemplo de arrastre causado por el protocolo de la PCR anidada.
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Ejemplo 5 Sensibilidad de copia del Ensayo de la NCR 3' del VHC
El siguiente experimento se realizó para determinar la sensibilidad de detección del ensayo de la NCR 3' del VHC de la presente invención.
Se obtuvieron muestras de plasma, que habían sido analizadas para determinar VHC usando los ensayos Roche Monitor y Chiron B-DNA, en Boston Biomedica, Inc. Se preparó el ARN, se diluyó para contener entre 20-1000 copias del ARN del VHC/ml, y se sometió a transcripción inversa y amplificación usando los procedimientos descritos en el Ejemplo 1 anterior. Se realizó la transcripción inversa usando el cebador 66RT (oligómero de 12 monómeros) (Tabla 13) o el cebador 57R27 (oligómero de 27 monómeros) (Tabla 14), y se realizó la PCR usando los cebadores delanteros e inversos 1F27 y 57R27, respectivamente. También se incorporaron los cebadores del control positivo interno (IPC) en este ensayo y originaron puntajes positivos para cada muestra. Los resultados representan el % de muestras que fueron positivas tomando como base las bandas de gel y SureCell® usando 3X-30PRB25 como sonda de captura.
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19
El ensayo de la NCR 3' del VHC detectó 1000 copias virales/ml el 100% del tiempo, y 200 copias/ml el 88-100% del tiempo. El virus se detectó a razón de 100 copias/ml, en aproximadamente 50% de las muestras (cuando se utilizó un cebador de TI de 12 monómeros). Una distribución de Poisson pronosticaría que a razón de 1 copia por reacción (20 partículas virales/ml), la frecuencia de resultados positivos debería ser de aproximadamente 60%. El hallazgo de 20% de detección a este nivel de virus puede deberse a la posibilidad de que la región no codificadora de 3' del VHC no esté presente en cada partícula viral, o que exista una pérdida de sensibilidad intrínseca en este ensayo cuando se usan cebadores de transcripción inversa cortos (de 12 monómeros). Esta última explicación fue avalada por la realización de un ensayo de transcripción inversa/amplificación en las mismas muestras usando los cebadores de NCR 5', que dio como resultado un mayor nivel de detección a 20 copias/ml. Estos resultados indican que se podría aumentar la sensibilidad del ensayo de 3'NC con el uso de cebadores más largos (27 monómeros) para la transcripción inversa (compárese la detección de 10 copias/rxn usando los cebadores de 12 monómeros y 27 monómeros, Tablas 13 y 14, respectivamente).
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Ejemplo 6 Análisis de Muestras de Pacientes que Tienen Diferentes Genotipos del VHC
Se realizaron los siguientes experimentos para evaluar la detección del VHC que tiene diferentes genotipos.
1. Integración del genotipo
Se obtuvo plasma de chimpancé, que representa diversos genotipos del VHC, de los National Institutes of Health (NIH). El plasma se preparó y trató como se describió en el Ejemplo 1 anterior. Los cebadores de NCR 5' fueron C131F y C294R (cebadores delantero e inverso, respectivamente) y los cebadores de la NCR 3' fueron 1F27 y 57R27 (cebadores delantero e inverso, respectivamente). Los resultados se obtuvieron por el análisis de los productos de PCR en geles de agarosa 4% teñidos con bromuro de etidio. Los resultados positivos se basaron en muestras replicadas. Los resultados se muestran en la siguiente Tabla 15 (usando cebadores de la NCR 5') y Tabla 16 (usando cebadores de la NCR 3').
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21 
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2. Muestras de pacientes
Se analizaron veintisiete muestras de pacientes no diluidas del genotipo conocido usando los cebadores C131F y C294R como se describió anteriormente. Se usó la detección SureCell® para confirmar los resultados (usando C252-PRB25 y IPC-1P como sonda de captura de los productos de VHC e IPC, respectivamente). El panel incluyó muestras de plasma representativas infectadas con los genotipos de VHC 1 a 4 y 6. Las muestras de los pacientes provenían de diversas regiones geográficas (Escocia, Túnez, Arabia Saudita y Hong Kong). Cada muestra se ensayó por duplicado (por ejemplo, se analizaron 6 muestras del genotipo 1).
El sistema de cebadores de la presente invención logró amplificar todas las muestras del genotipo incluidas en este panel. Los cebadores C131F25/C294R25 identificaron todos los genotipos posibles de VHC hasta la fecha (Genotipos 1-6).
3. Muestras de bajo número de copias
Las muestras que contenían VHC de diferentes genotipos (1-6, obtenidos de USA, Escocia, Túnez, Arabia Saudita y Hong Kong) se cuantificaron usando el ensayo Roche Monitor, se diluyeron a razón de 50 copias virales por reacción de PCR (1000 copias/mL) y se analizaron usando los cebadores C131F y C294R como se describió anteriormente.
Todas las muestras se detectaron usando los cebadores de la presente invención.
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Ejemplo 7 Ensayos Múltiples Utilizando Pares de Cebadores de Amplificación 5' y 3'
Se realizaron los siguientes experimentos para analizar el efecto de la amplificación simultánea de las regiones NCR 5' y NCR 3' del genoma de VHC en una mezcla de reacción única.
A. Comparación con el ensayo Roche Monitor
Se analizaron 73 muestras de pacientes, que contenían el equivalente de entre 45 y 170.000 copias virales por reacción. Las muestras provenían de pacientes que se sabía estaban infectados con VHC y habían sido tratados con interferón. En consecuencia, algunos pacientes tenían poco o nada de virus circulante. Este panel se ensayó en un formato múltiple utilizando el par de cebadores de la NCR 5' 131F/294R y el par de cebadores de la NCR 3' 1F27/57R27, así como los cebadores de IPC. Se colocaron muestras clínicas negativas en todos los ensayos. Todas las muestras negativas dieron resultado negativo por RT-PCR. Los resultados se compararon con los obtenidos utilizando el Ensayo cuantitativo Roche Monitor (Roche Diagnostics, Kaiseraugst, Suiza). Los resultados se sintetizan en la siguiente Tabla 17.
TABLA 17
22
Cuando se usaron los pares de cebadores de la NCR 5' y 3' de la invención, una muestra adicional que fue indetectable de acuerdo con los Resultados del Roche Monitor fue detectada con los ensayos de NCR 5' y NCR 3', lo que indica que los ensayos que utilizan los cebadores de la presente invención muestran mayor sensibilidad que el ensayo Roche cuando se evalúan muestras con bajas cargas virales. Esta muestra positiva, que no fue detectada por el ensayo Roche, fue confirmada mediante los cebadores alternativos de NCR 5' 69F/133R.
B. Comparación con el ensayo Roche Amplicor
Se analizaron dieciséis pacientes que habían arrojado ensayos indeterminados utilizando un ensayo de inmunotransferencia recombinante (RIBA) en un formato múltiple usando el par de cebadores 5' 131F/294R y el par de cebadores 3' 1F27/57R27. Los resultados se compararon con los obtenidos utilizando el ensayo cualitativo Roche Amplicor. Los resultados se resumen en la siguiente Tabla 18.
TABLA 18
23
Hubo un 100% de concordancia entre el ensayo de la invención y el ensayo de Roche. Todas las reacciones de PCR se realizaron por duplicado a partir de una única extracción de ARN. Los negativos se confirmaron por la amplificación mediante un conjunto de cebadores de NC 5' alternativos (69F/133R). Todos los negativos re-ensayados se confirmaron como negativos "verdaderos".
A los expertos en la técnica se les podrán sugerir muchas variaciones de la presente invención a la luz de la anterior descripción detallada.

Claims (25)

1. Un procedimiento para detectar la presencia del ARN del Virus de la Hepatitis C (VHC) en una muestra biológica, comprendiendo dicho procedimiento:
(A) realizar una reacción de transcripción inversa usando, como molde, ARN derivado de dicha muestra para producir productos de transcripción inversa específicos del VHC;
(B) amplificar dichos productos de transcripción inversa utilizando uno o más pares de cebadores oligonucleotídicos específicos para el VHC para producir productos de amplificación específicos del VHC,
en el que dichos pares de cebadores oligonucleotídicos comprenden:
(a) cebador delantero 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' y (b) cebador inverso 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3; y
(C) detectar dichos productos de amplificación,
en el que la detección de dichos productos de amplificación indica la presencia del ARN del VHC en dicha muestra.
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2. Un procedimiento según lo definido en la reivindicación 1, en el que dicha reacción de transcripción inversa se realiza utilizando cebadores oligonucleotídicos aleatorios.
3. Un procedimiento según lo definido en la reivindicación 1, en el que dicha reacción de transcripción inversa se realiza utilizando uno o más cebadores oligonucleotídicos que tienen secuencias correspondientes a las secuencias del ARN del VHC.
4. Un procedimiento según lo definido en la reivindicación 1, en el que dicha amplificación se realiza por un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en reacción en cadena de la polimerasa, reacción en cadena de la ligasa, amplificación por desplazamiento de hebra, sustitución de base única del ácido nucleico y amplificación mediada por transcripción.
5. Un procedimiento según lo definido en la reivindicación 1, en el que dicha detección comprende visualizar dichos productos de amplificación por electroforesis en gel.
6. Un procedimiento según lo definido en la reivindicación 1, en el que dicha detección comprende capturar dichos productos de amplificación en un soporte sólido que contiene una o más sondas oligonucleotídicas específicas del VHC y cuantificar dichos productos capturados mediante un ensayo colorimétrico.
7. Un procedimiento según lo definido en la reivindicación 6, en el que dichas sondas comprenden 5'-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3'.
8. Un procedimiento según lo definido en la reivindicación 1, en el que dicha muestra se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, orina, saliva y líquido cefalorraquídeo.
9. Un procedimiento para amplificar el ADN del Virus de la Hepatitis C (VHC), comprendiendo dicho procedimiento:
(A) realizar una reacción en cadena de la polimerasa en una muestra de ADN que contiene ADN del VHC usando uno o más pares de cebadores oligonucleotídicos específicos para el VHC para producir productos de amplificación específicos del VHC, en el que dichos pares de cebadores oligonucleotídicos comprenden:
(a) cebador delantero 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' y (b) cebador inverso 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3'. 
\vskip1.000000\baselineskip
10. Un procedimiento según lo definido en la reivindicación 9, que además comprende:
(B) detectar dichos productos de amplificación,
en el que la detección de dichos productos de amplificación indica la presencia de ADN del VHC en dicha muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Un procedimiento según lo definido en la reivindicación 10, en el que dicha detección comprende visualizar dichos productos de amplificación por electroforesis en gel.
12. Un procedimiento según lo definido en la reivindicación 10, en el que dicha detección comprende capturar dichos productos de amplificación en un soporte sólido que contiene una o más sondas oligonucleotídicas específicas del VHC y cuantificar dichos productos capturados mediante un ensayo colorimétrico.
13. Un procedimiento según lo definido en la reivindicación 10, en el que dichas sondas comprenden 5'-GGGTCCT
GGAGGCTGCACGACACTCAT-3'.
14. Un procedimiento para detectar la presencia del ARN del Virus de la Hepatitis C (VHC) en una muestra biológica, comprendiendo dicho procedimiento:
(A) realizar una reacción de transcripción inversa usando como molde ARN derivado de dicha muestra para producir productos de transcripción inversa específicos del VHC;
(B) amplificar dichos productos de transcripción inversa usando uno o más pares de cebadores oligonucleotídicos NCR 5' específicos para el VHC y uno o más pares de cebadores oligonucleotídicos NCR 3' para producir productos de amplificación específicos del VHC,
en el que dichos pares de cebadores oligonucleotídicos NCR 5' comprenden:
(a) cebador delantero 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' y (b) cebador inverso 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3'; y
en el que cada uno de dichos pares de cebadores oligonucleotídicos NCR 3' comprende un cebador delantero que consiste en el oligonucleótido 5'-GGTGGCTCCATCTTAGCCCTAGTCACG-3' y un cebador inverso que consiste en el oligonucleótido 5'-AGGCCAGTATCAGCACTCTCTGCAGTC-3; y
(C) detectar dichos productos de amplificación,
en el que la detección de dichos productos de amplificación indica la presencia del ARN del VHC en dicha muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
15. Un procedimiento según lo definido en la reivindicación 14, en el que dicha reacción de transcripción inversa se realiza usando cebadores oligonucleotídicos aleatorios.
16. Un procedimiento según lo definido en la reivindicación 14, en el que dicha reacción de transcripción inversa se realiza usando uno o más cebadores oligonucleotídicos que tienen secuencias correspondientes a las secuencias del ARN del VHC.
17. Un procedimiento según lo definido en la reivindicación 14, en el que dicha amplificación se realiza por un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en reacción en cadena de la polimerasa, reacción en cadena de la ligasa, amplificación por desplazamiento de hebra, sustitución de base única del ácido nucleico y amplificación mediada por transcripción.
18. Un procedimiento según lo definido en la reivindicación 14, en el que dicha detección comprende visualizar dichos productos de amplificación por electroforesis en gel.
19. Un procedimiento según lo definido en la reivindicación 14, en el que dicha detección comprende capturar dichos productos de amplificación en un soporte sólido que contiene una o más sondas oligonucleotídicas específicas del VHC y cuantificar dichos productos capturados mediante un ensayo colorimétrico.
20. Un procedimiento según lo definido en la reivindicación 19, en el que dichas sondas comprenden
(a) 5'-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3'; y un miembro seleccionado del grupo que consiste en
(b) 5'-GCGGCTCACGGACCTTTCACAGCTA-3' y
(c) 5'-ATGCGGCTCACGGACCTTTCACAGC-3'.
\vskip1.000000\baselineskip
21. Un procedimiento según lo definido en la reivindicación 14, en el que dicha muestra se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, orina, saliva y líquido cefalorraquídeo.
22. Un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en:
5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3'.
5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3'.
5'-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3'.
\vskip1.000000\baselineskip
23. Un oligonucleótido cebador para amplificación específico del VHC seleccionado del grupo que consiste en:
5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3'.
5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3'.
\vskip1.000000\baselineskip
24. Una sonda que comprende el oligonucleótido:
5'-GGGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCAT-3'.
\vskip1.000000\baselineskip
25. Un kit para amplificar ADN del VHC derivado del ARN del VHC, comprendiendo dicho kit uno o más pares de cebadores oligonucleotídicos NCR 5', en el que dichos pares de cebadores NCR 5' comprenden:
(a) cebador delantero 5'-CAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3' y (b) cebador inverso 5'-CGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTC-3'.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7666588B2 (en) 2001-03-02 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA and characterization of mitochondrial DNA heteroplasmy
US20030027135A1 (en) 2001-03-02 2003-02-06 Ecker David J. Method for rapid detection and identification of bioagents
US20040121309A1 (en) 2002-12-06 2004-06-24 Ecker David J. Methods for rapid detection and identification of bioagents in blood, bodily fluids, and bodily tissues
US7226739B2 (en) 2001-03-02 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc Methods for rapid detection and identification of bioagents in epidemiological and forensic investigations
US7718354B2 (en) 2001-03-02 2010-05-18 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals
WO2004060278A2 (en) 2002-12-06 2004-07-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals
WO2002083948A1 (en) * 2001-04-12 2002-10-24 Biocore Co., Ltd. Oligonucleotide chip composition for analyzing hepatitis c virus (hcv) genotype and detecting method thereof
US8073627B2 (en) 2001-06-26 2011-12-06 Ibis Biosciences, Inc. System for indentification of pathogens
US7217510B2 (en) 2001-06-26 2007-05-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for providing bacterial bioagent characterizing information
US8046171B2 (en) 2003-04-18 2011-10-25 Ibis Biosciences, Inc. Methods and apparatus for genetic evaluation
US8057993B2 (en) 2003-04-26 2011-11-15 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of coronaviruses
US8158354B2 (en) 2003-05-13 2012-04-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
US7964343B2 (en) 2003-05-13 2011-06-21 Ibis Biosciences, Inc. Method for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
US8546082B2 (en) 2003-09-11 2013-10-01 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
US8097416B2 (en) 2003-09-11 2012-01-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
US8242254B2 (en) 2003-09-11 2012-08-14 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of bacteria
US8163895B2 (en) 2003-12-05 2012-04-24 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of orthopoxviruses
JP2007518425A (ja) 2004-01-23 2007-07-12 バイオメリュー・インコーポレイテッド Ｈｃｖ３’非翻訳領域を効率的に増幅および検出するためのプライマーおよびプローブの設計
US7666592B2 (en) 2004-02-18 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for concurrent identification and quantification of an unknown bioagent
US8119336B2 (en) 2004-03-03 2012-02-21 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of alphaviruses
ES2641832T3 (es) 2004-05-24 2017-11-14 Ibis Biosciences, Inc. Espectrometría de masas con filtración de iones selectiva por establecimiento de umbrales digitales
US20050266411A1 (en) 2004-05-25 2005-12-01 Hofstadler Steven A Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA
US7811753B2 (en) 2004-07-14 2010-10-12 Ibis Biosciences, Inc. Methods for repairing degraded DNA
GB0423552D0 (en) * 2004-10-22 2004-11-24 Hepcgen Ltd Methods
US20060205040A1 (en) 2005-03-03 2006-09-14 Rangarajan Sampath Compositions for use in identification of adventitious viruses
US8084207B2 (en) 2005-03-03 2011-12-27 Ibis Bioscience, Inc. Compositions for use in identification of papillomavirus
EP1904655A2 (en) 2005-07-21 2008-04-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for rapid identification and quantitation of nucleic acid variants
AU2007353877B2 (en) 2006-09-14 2012-07-19 Ibis Biosciences, Inc. Targeted whole genome amplification method for identification of pathogens
MD3300G2 (ro) * 2006-09-28 2007-11-30 Институт Генетики, Физиологии И Защиты Растений Академии Наук Молдовы Primer oligonucleotidic pentru depistarea ARN-ului virusului hepatitei C
JP5680304B2 (ja) 2007-02-23 2015-03-04 アイビス バイオサイエンシズ インコーポレイティッド 迅速な法医学的ｄｎａ分析法
WO2008125117A1 (en) * 2007-04-13 2008-10-23 Hvidovre Hospital Cell culture system of a hepatitis c genotype 3a and 2a chimera
US8454974B2 (en) 2007-04-13 2013-06-04 Hvidovre Hospital Adaptive mutations allow establishment of JFH1-based cell culture systems for hepatitis C virus genotype 4A
WO2008134374A1 (en) * 2007-04-27 2008-11-06 Eragen Biosciences, Inc. Materials and methods for detection of hepatitis c virus
US8618275B2 (en) 2007-05-18 2013-12-31 Hvidovre Hospital Efficient cell culture system for hepatitis C virus genotype 5A
US20100291544A1 (en) * 2007-05-25 2010-11-18 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of strains of hepatitis c virus
US9598724B2 (en) 2007-06-01 2017-03-21 Ibis Biosciences, Inc. Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids
US8569472B2 (en) * 2007-12-20 2013-10-29 Hvidovre Hospital Efficient cell culture system for hepatitis C virus genotype 6A
WO2009087685A2 (en) * 2008-01-04 2009-07-16 Premas Biotech Pvt.Ltd Method for detection of hepatitis nucleic acid and uses thereof
WO2010017819A1 (en) 2008-08-15 2010-02-18 Hvidovre Hospital EFFICIENT CELL CULTURE SYSTEM FOR HEPATITIS C VIRUS GENOTYPE 7a
WO2010017818A1 (en) 2008-08-15 2010-02-18 Hvidovre Hospital Efficient cell culture system for hepatitis c virus genotype 2b
EP2349549B1 (en) 2008-09-16 2012-07-18 Ibis Biosciences, Inc. Mixing cartridges, mixing stations, and related kits, and system
WO2010033627A2 (en) 2008-09-16 2010-03-25 Ibis Biosciences, Inc. Sample processing units, systems, and related methods
US8534447B2 (en) 2008-09-16 2013-09-17 Ibis Biosciences, Inc. Microplate handling systems and related computer program products and methods
WO2010037403A1 (en) 2008-10-03 2010-04-08 Hvidovre Hospital Hepatitis c virus expressing reporter tagged ns5a protein
EP2396803A4 (en) 2009-02-12 2016-10-26 Ibis Biosciences Inc IONIZATION PROBE ASSEMBLIES
US8950604B2 (en) 2009-07-17 2015-02-10 Ibis Biosciences, Inc. Lift and mount apparatus
EP2454000A4 (en) 2009-07-17 2016-08-10 Ibis Biosciences Inc SYSTEMS FOR IDENTIFYING BIOLOGICAL SUBSTANCES
EP2957641B1 (en) 2009-10-15 2017-05-17 Ibis Biosciences, Inc. Multiple displacement amplification
KR101503039B1 (ko) * 2010-07-01 2015-04-29 (주)바이오니아 Ｃ형 간염 바이러스 진단용 프라이머, 프로브, 이를 포함하는 키트 및 상기 키트를 이용한 ｃ형 간염 바이러스 진단 방법
WO2012019260A2 (pt) * 2010-08-11 2012-02-16 Universidade Federal Do Rio De Janeiro Molécula de rna sintética do vírus da hepatite c, processo de obtenção e uso como controle interno para quantificação e/ou identificação do vírus da hepatite c
WO2012135975A1 (zh) * 2011-04-06 2012-10-11 瑞基海洋生物科技股份有限公司 聚合酶链式反应用的混合液
AU2013205064B2 (en) 2012-06-04 2015-07-30 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Amplifying and Characterizing HCV Nucleic Acid
CN106929603A (zh) * 2017-01-10 2017-07-07 上海纽思格生物科技有限公司 一种改良型hcv rna检测试剂盒
ES3035799T3 (en) * 2017-10-03 2025-09-09 Abbott Molecular Inc Assay for detecting hepatitis c virus (hcv)

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09107970A (ja) * 1995-10-17 1997-04-28 Soyaku Gijutsu Kenkyusho:Kk Ｃ型肝炎ウイルス由来核酸、該核酸を用いたウイルスの検出方法
US5747244A (en) 1991-12-23 1998-05-05 Chiron Corporation Nucleic acid probes immobilized on polystyrene surfaces
ES2133529T3 (es) * 1992-11-27 1999-09-16 Innogenetics Nv Procedimiento para tipificar aislamientos de hcv.
JPH06153961A (ja) * 1992-11-27 1994-06-03 Imuno Japan:Kk Ｃ型肝炎ウイルス部分遺伝子、ならびにｃ型肝炎ウイルス遺 伝子の高感度検出法
JPH07184695A (ja) 1993-12-27 1995-07-25 Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd Ｃ型肝炎ウイルスの簡易検出法
US5837442A (en) * 1995-11-29 1998-11-17 Roche Molecular Systems, Inc. Oligonucleotide primers for amplifying HCV nucleic acid
IT1284847B1 (it) 1996-06-07 1998-05-22 Sorin Biomedica Diagnostics Sp Procedimento per la rivelazione di acidi nucleici specifici di hcv

Also Published As

Publication number Publication date
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EP1026262B1 (en) 2009-04-08

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