JP2000308490A - 反復的選択および組換えにより所望の特徴を有するポリヌクレオチドを作製する方法 - Google Patents

反復的選択および組換えにより所望の特徴を有するポリヌクレオチドを作製する方法

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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等の高度に複雑
な直線配列のインビボ、インビトロにおける直接分子進
化を組換えによって可能にする変異誘発、インビボ組換
え及び選択の反復サイクルの使用の提供。 【解決手段】 シャッフルされるべきポリヌクレオチド
の複数改変体を選択のため複数の遺伝子をコードする工
程；該ポリヌクレオチドの複数選択改変体からの配列を
有する部分的にアニールされたポリヌクレオチド鎖のマ
ルチサイクリック伸長工程で、１つの鎖が組換えポリヌ
クレオチドの集団を生成するように部分的にアニールさ
れる別の鎖の伸長のためのテンプレートとして作用する
条件下で該ポリヌクレオチド鎖が互いに類似領域及び異
種領域を有し該類似領域を通して部分的にアニールされ
る工程、遺伝子又はその発現産物によって付与される所
望の性質について、該複数の遺伝子をコードする組換え
ポリヌクレオチドのスクリーニング又は選択の工程を含
む方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、所望の表現型を与
えるポリヌクレオチドおよび／または選択可能であるか
もしくはスクリーニングされ得る有利な予め決定された
特性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
の生成方法に関する。１つの局面において、この方法
は、変異タンパク質をコードする所望の核酸フラグメン
トを作製および選択またはスクリーニングするために使
用される。
【０００２】
【従来の技術】（関連出願の相互参照）本出願は、１９
９６年３月２５日に出願されたＵＳＳＮ ０８／６２
１，８５９の一部継続出願であり、そして１９９５年１
１月３０日に出願されたＵＳＳＮ０８／５６４，９５５
の一部継続出願である。
【０００３】生体高分子（例えば、タンパク質、ＤＮＡ
など）の活性配列の複雑さは、その情報内容（ｉｎｆｏ
ｒｍａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｅｎｔ）（「ＩＣ」；５−
９）と呼ばれている。タンパク質の情報内容は、アミノ
酸配列変異に対する活性タンパク質の抵抗性として定義
され、同様の機能を有する関連配列のファミリーを記載
するために必要な最少数の不変アミノ酸（ビット）から
算定される（９、１０）。ランダムな変異誘発に感受性
であるタンパク質は、高い情報内容を有する。１９７４
年に、この定義が作製された際、タンパク質の多様性
は、分類上の多様性としてしか存在していなかった。
【０００４】分子ライブラリーのような分子生物学の発
達は、かなり多数の変異しやすい塩基の同定、およびラ
ンダムなライブラリーからの機能配列の選択さえ可能に
してきた。大部分の残基が、典型的に全てが同時にでは
ないにしても、変異され得、配列の前後関係（ｃｏｎｔ
ｅｘｔ）の変化を補うことに依存している。従って、１
００アミノ酸のタンパク質は、２，０００個の異なる変
異しか含まないが、２０100通りの可能な変異の組み合
わせを含む。
【０００５】情報密度は、配列の単位長当たりの情報内
容である。酵素の活性部位は高い情報密度を有する傾向
がある。対照的に、酵素における可変リンカー（ｆｌｅ
ｘｉｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒ）は低い情報密度を有する
（８）。
【０００６】ライブラリー形式で変異タンパク質を作製
するために現在広く用いられている方法は、誤りがちな
（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ポリメラーゼ連鎖反応（１
１、１２、１９）およびカセット変異誘発（８、２０、
２１、２２、４０、４１、４２）であり、これらの方法
では最適化しようとする特定の領域が、合成的に変異誘
発されたオリゴヌクレオチドで置換される。あるいは、
宿主細胞のミューテーター株が、変異頻度を増大するた
めに使用されてきた（ＧｒｅｅｎｅｒおよびＣａｌｌａ
ｈａｎ （１９９５） Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ
Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ７： ３２）。どちらの場合
も、「変異体曇り（ｍｕｔａｎｔ ｃｌｏｕｄ）」
（４）は、元の配列における特定の部位の周囲で生成さ
れる。
【０００７】誤りがちなＰＣＲは、長い配列にわたって
ランダムに低レベルの点変異を導入するために、低適合
性の重合条件を使用する。誤りがちなＰＣＲは、未知の
配列のフラグメントの混合物を変異誘発するために使用
され得る。しかし、コンピューターシュミレーション
は、点変異誘発単独では、しばしばあまりにも緩やか
で、連続した配列進化に必要とされるブロック変化が可
能でない場合もあることを示唆した。公表されている誤
りがちなＰＣＲプロトコルは、一般的に、０．５ｋｂ〜
１．０ｋｂより大きいＤＮＡフラグメントの確実な増幅
に適切ではなく、それらの実際的な適用は限られてい
る。さらに、誤りがちなＰＣＲの反復サイクルは、中立
変異の蓄積を導き、これは例えば、タンパク質を免疫原
性にし得る。
【０００８】オリゴヌクレオチド指定変異誘発では、短
い配列が、合成的に変異誘発されたオリゴヌクレオチド
で置換される。このアプローチは、遠位変異の組み合わ
せを生成せず、従って有意な組み合わせではない。莫大
な配列長に関する制限されたライブラリーサイズは、タ
ンパク質の最適化のために多数回の選択が避けられない
ことを意味する。合成オリゴヌクレオチドを用いる変異
誘発には、各回の選択の後に個々のクローンを配列決定
し、次いでファミリーに分類して、単一のファミリーを
任意に選択し、そしてファミリーをコンセンサスモチー
フに縮小する必要がある。このコンセンサスモチーフは
再合成され、そして単一の遺伝子内へ再挿入された後に
さらに選択される。このプロセスは、統計的なボトルネ
ック（ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｂｏｔｔｌｅｎｅｃ
ｋ）を構成し、多数回の変異誘発のために集中的に労働
力を必要とし、そして実際的でない。
【０００９】従って、誤りがちなＰＣＲおよびオリゴヌ
クレオチド指定変異誘発は、単一サイクルの配列微調整
には有用であるが、多数サイクルに適用する場合、直ち
に制限されるようになる。
【００１０】誤りがちなＰＣＲは未知の配列のフラグメ
ントの混合物を変異誘発するために使用され得る（１
１、１２）。しかし、公表されている誤りがちなＰＣＲ
プロトコル（１１、１２）は、ポリメラーゼの低いプロ
セシビティー（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）を受ける。
従って、このプロトコルは、平均的なサイズの遺伝子の
ランダムな変異誘発のための使用には非常に困難であ
る。このように能力がないことによって、誤りがちなＰ
ＣＲの実際的な適用が制限される。
【００１１】誤りがちなＰＣＲのもう１つの重大な制限
は、配列の情報内容に伴って下流変異率が増すことであ
る。特定の情報内容、ライブラリーのサイズ、および変
異誘発率で、下流変異の上流変異に対するバランスは、
統計的に、さらなる改善の選択を阻害する（統計的最高
限度）。
【００１２】最後に、誤りがちなＰＣＲの反復サイクル
はまた、例えば、免疫原性に影響し得るが、結合親和性
には影響しない中立変異の蓄積を導く。
【００１３】従って、誤りがちなＰＣＲは、あまりにも
緩やかで連続した配列進化に必要とされるブロック変化
が可能でないことが見出された（１、２）。
【００１４】カッセット変異誘発において、単一のテン
プレートの配列ブロックは、代表的に、（部分的に）ラ
ンダム化された配列により置換される。従って、得られ
得る最大情報内容は、ランダムな配列の数（すなわち、
ライブラリーのサイズ）により統計学的に制限される。
このことは統計的なボトルネックを構成し、現在のとこ
ろ最適ではないが、より長期間のポテンシャルを有し得
る他の配列ファミリーを排除する。
【００１５】さらに、合成オリゴヌクレオチドでの変異
誘発は、各回の選択の後に個々のクローンの配列決定を
必要とする（２０）。従って、このアプローチは時間が
かかり、そして多数回の変異誘発には実際的でない。
【００１６】従って、誤りがちなＰＣＲおよびカセット
変異が最も適しており、そして比較的低い情報内容の範
囲を微調整するために広く使用されてきた。１つの例
は、多数回の誤りがちなＰＣＲによる増幅および選択を
用いる、ランダムライブラリーからのＲＮＡリガーゼリ
ボザイムの選択である（１３）。
【００１７】直鎖状の生物学的組換え配列（例えば、タ
ンパク質、ＲＮＡおよびＤＮＡ）の設計のための本発明
者らの科学的な手段は、高分子または生物の多くの所望
の特性を最適化するために必要とされる、必要な配列多
様性を生じるために適切ではないことが、ますます明ら
かになっている。より良い変異体を見出すことは、より
大きなライブラリー内でより多くの配列をサーチするこ
とに依存しており、変異誘発性の増幅および選択のサイ
クルの数を増加することが必要である。しかし、上記の
ように、広く用いられている現在の変異誘発方法には、
反復サイクルのために使用される場合、明らかに制限が
ある。
【００１８】大部分の生物の進化は自然淘汰および有性
生殖により生じる。有性生殖は選択された個体の子孫の
遺伝子を混合および結合することを確実にする。減数分
裂の間、親由来の相同染色体を互いに並べ、そしてそれ
らの長さに沿って交差することによって、遺伝子物質を
交換する（ｓｗａｐ）。このようなＤＮＡの交換または
シャッフリング（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）は、生物がより
迅速に進化することを可能にする（１、２）。有性組換
えにおいて、挿入された配列は同種環境内で有用性が証
明された配列なので、一旦挿入された配列が新しい配列
中へ挿入されても、実質的な情報内容を有するようであ
る。
【００１９】Ｍａｒｔｏｎら（２７）は、直列的に反復
配列を有するプラスミドにおける組換えをモニターする
ための、インビトロにおけるＰＣＲの使用を記載してい
る。Ｍａｒｔｏｎらは、ＤＮＡの切断またはニッキング
（ｎｉｃｋｉｎｇ）の結果として、ＰＣＲの間に組換え
が生じることを開示している。これにより組換え分子が
生じる。Ｍｅｙｅｒｈａｎｓら（２３）もまた、インビ
トロにおけるＰＣＲ中にＤＮＡ組換えが存在することを
開示している。
【００２０】用語、適用された分子進化（「ＡＭＥ」）
は、進化的設計アルゴリズムの特定の有用な目的に対す
る適用を意味する。ＡＭＥのための多くの異なるライブ
ラリー形式が、ポリヌクレオチド（３、１１−１４）、
ペプチドおよびタンパク質（ファージ（１５−１７）、
ｌａｃＩ（１８）およびポリソーム）について報告され
てきたが、これらの形式においは、いずれも、組み合わ
せライブラリーを故意に作製するためのランダムな交差
による組換えを使用していない。
【００２１】理論的には、１００アミノ酸のタンパク質
には２，０００通りの異なる個々の変異体が存在する。
１００個アミノ酸からなるタンパク質は、２０100通り
の可能な変異の組み合わせを有するが、数が多すぎるの
で、従来の方法では徹底的に調査し得ない。これらの可
能な組み合わせ変異（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｍｕｔ
ａｔｉｏｎ）の全てを生成およびスクリーニングするこ
と可能にするようなシステムを開発することは有益であ
る。
【００２２】Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者らは（４
３，４４）は、ファージシステムでの発現のために、イ
ンビボ部位特異的組換えシステムを利用して軽鎖抗体の
遺伝子と重鎖抗体の遺伝子とを結合した。しかし、彼ら
のシステムは組換えの特異的部位に依存しており、それ
ゆえ制限される。Ｈａｙａｓｈｉら（４８）は、重複伸
長およびＰＣＲによる単鎖抗体（ｓｃＦｖ）における抗
体ＣＤＲ領域の同時変異誘発を報告している。
【００２３】Ｃａｒｅｎら（４５）は、ランダムなイン
ビボ組換えを使用する大規模集団の多重変異体を生成す
る方法を記載している。しかし、彼らの方法は、プラス
ミドの２つの異なるライブラリーの組み換えを必要とし
ており、各ライブラリーは異なる選択マーカーを有して
いる。従って、方法は、存在する選択マーカーの数に等
しい限られた数の組換えに制限され、そして選択された
配列に連結するマーカー遺伝子の数を同時に直線的に増
加する。Ｃａｒｅｎらは、複数の選択サイクルの使用を
記載していない；組換えは単に、より大きなライブラリ
ーを構築するために使用される。
【００２４】Ｃａｌｏｇｅｒｏら（４６）およびＧａｌ
ｉｚｚｉら（４７）は、プラスミド上の相同であるが短
縮された（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）２つの昆虫毒素遺伝子
間のインビボ組換えは、ハイブリッド遺伝子を生成し得
ることを報告している。Ｒａｄｍａｎら（４９）は、欠
損型ミスマッチ修復酵素を有する宿主細胞において、実
質的にミスマッチなＤＮＡ配列のインビボ組換えにより
ハイブリッド分子が形成されることを報告している。
【００２５】
【発明が解決しようとする課題】変異タンパク質を生成
する方法を開発することは有益であり、本方法は容易に
サーチされる変異核酸配列の大規模ライブラリーの開発
を可能にした。本明細書に記載の発明は、点変異誘発、
核酸シャッフリングおよび選択の反復サイクルの使用に
関し、タンパク質のような高度に複雑な直線配列のイン
ビトロにおける直接的な分子進化を、ランダム組換えに
よって可能にする。
【００２６】それゆえに、変異ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタ
ンパク質の大規模ライブラリーの生成を可能にする方
法、および所望の目的のために特定の変異体を選択する
ことを可能にする方法を開発することは有益である。本
明細書中に記載の発明は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパ
ク質のような高度に複雑な直線配列のインビボおよびイ
ンビトロにおける直接分子進化を、組換えによって可能
にする変異誘発、インビボ組換えおよび選択の反復サイ
クルの使用に関する。
【００２７】本発明のさらなる利点については、添付の
図面を参考にして、本発明の以下の記載から明らかにな
ろう。
【００２８】
【課題を解決するための手段】本発明の１つの実施態様
において、ポリヌクレオチドをシャッフルする方法であ
って、以下：シャッフルされるべきポリヌクレオチドの
複数の改変体を選択する工程であって、該ポリヌクレオ
チドは複数の遺伝子をコードする、工程；該ポリヌクレ
オチドの複数の選択された改変体からの配列を有する部
分的にアニールされたポリヌクレオチド鎖においてマル
チサイクリックポリヌクレオチド伸長プロセスを行う工
程であって、１つの鎖が、組換えポリヌクレオチドの集
団を生成するように部分的にアニールされている別の鎖
の伸長のためのテンプレートとして作用する条件下で、
該ポリヌクレオチド鎖が互いに類似な領域および異種の
領域を有し、そして該類似な領域を通して部分的にアニ
ールされる、工程、遺伝子またはその発現産物によって
付与される所望の性質について、該複数の遺伝子をコー
ドする組換えポリヌクレオチドをスクリーニングまたは
選択する工程、を包含する、方法が提供される。
【００２９】本発明のさらなる実施態様において、前記
マルチプル遺伝子が、本質的に物理的にクラスター化さ
れる方法が提供される。
【００３０】本発明のさらなる実施態様において、前記
マルチプル遺伝子がマルチ成分経路を形成する方法が提
供される。
【００３１】本発明のなおさらなる実施態様において、
前記マルチ成分経路における遺伝子の発現産物が二次代
謝物を産生する方法が提供される。
【００３２】本発明のなおさらなる局面において、前記
二次代謝物が抗生物質である方法が提供される。
【００３３】本発明のさらなる実施態様において、前記
改変体が天然の改変体を含む方法が提供される。
【００３４】本発明のさらなる実施態様において、前記
改変体が誘導された改変体を含む方法が提供される。
【００３５】本発明のなおさらなる実施態様において、
前記天然に存在する改変体が、前記複数の遺伝子の対立
遺伝子改変体を含む方法が提供される。
【００３６】本発明のなおさらなる実施態様において、
前記天然に存在する改変体が、前記複数の遺伝子の種改
変体を含む方法が提供される。
【００３７】本発明のさらなる実施態様において、前記
増幅プロセスを行う前にポリヌクレオチドの改変体の集
団をランダムにフラグメント化する工程をさらに含む方
法が提供される。
【００３８】本発明のさらなる実施態様において、前記
増幅プロセスの少なくとも１つのサイクルが、前記ポリ
ヌクレオチドの改変体の不完全な伸長を生じる条件下で
行われる方法が提供される。
【００３９】本発明は、選択されたポリヌクレオチド配
列または選択されたポリヌクレオチド配列の集団を、代
表的には増幅されたポリヌクレオチドおよび／またはク
ローニングされたポリヌクレオチドの形態において生成
する方法に関し、それによって選択されたポリヌクレオ
チド配列は、選択され得る所望の表現型の特徴（例え
ば、ポリペプチドをコードする、連結されたポリヌクレ
オチドの転写を促進する、タンパク質に結合するなどの
特徴）を有する。所望の構造または機能的特性（例え
ば、予め決定された生体高分子（例えば、レセプター）
への結合）を有するポリペプチドを同定する１つの方法
は、ポリペプチドの大規模ライブラリーを、ポリペプチ
ドのアミノ酸配列により与えられる所望の構造または機
能的特性を有する個々のライブラリーメンバーについて
スクリーニングすることを包含する。
【００４０】一般的な局面において、本発明は、選択ま
たはスクリーニングされ得る所望の特徴を有する組換え
ポリヌクレオチドのライブラリーを作製するための、
「配列シャッフリング（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）」と呼ば
れる方法を提供する。組換えポリヌクレオチドのライブ
ラリーは、実質的な配列同一性を有し、そしてインビト
ロまたはインビボで相同組換えされ得る配列領域を含
む、関連配列ポリヌクレオチドの集団から作製される。
この方法において、少なくとも２種類の関連配列ポリヌ
クレオチドが、配列組換えポリヌクレオチドを作製する
ために適切な組換えシステムにおいて結合される。ここ
で、上記の配列組換えポリヌクレオチドは、少なくとも
１つの第１の種の関連配列ポリヌクレオチドの部分と、
少なくとも１つの第２の種の関連配列ポリヌクレオチド
の少なくとも１つの隣接した部分とを含む。配列組換え
ポリヌクレオチドを作製するために適切な組換えシステ
ムは、以下のいずれかである：（１）増幅または本明細
書中に記載の他の形式を介する相同組換えまたは配列シ
ャッフリングのためのインビトロシステム、あるいは
（２）相同組換えまたは本明細書中に記載の部位特異的
組換えのためのインビボシステム。配列組換えポリヌク
レオチドの集団は、所望のまたは有利な特徴を有し、そ
して適切な選択方法またはスクリーニング方法によって
選択され得るポリヌクレオチドの部分集団を含む。次い
で、代表的な関連配列ポリヌクレオチドである選択され
た配列組換えポリヌクレオチドは、少なくとも１つの反
復サイクルに供され得る。ここで、少なくとも１つの選
択された配列組換えポリヌクレオチドは、少なくとも１
つの別の種類の関連配列ポリヌクレオチド（それ自身が
選択された配列組換えポリヌクレオチドであり得る）
と、配列組換えポリヌクレオチドを作製するために適切
な組換えシステムにおいて組み合わされる。その結果、
配列組換えポリヌクレオチド配列のさらなる世代は、使
用される選択方法またはスクリーニング方法によって得
られる選択された配列組換えポリヌクレオチドから作製
される。この様式において、反復配列組換えは、所望の
特徴を有する配列組換えポリヌクレオチドである、ライ
ブラリーのメンバーを生じる。このような特徴は、任意
の特性であり得るか、またはスクリーニングシステムに
おいて選択され得るかもしくは検出され得る特性であ
り、そして以下の特性を含み得る：選択可能なまたは検
出可能な特性を付与する任意の特徴のような、コードさ
れるタンパク質、転写エレメント、配列制御性転写、Ｒ
ＮＡプロセシング、ＲＮＡ安定性、クロマチン構造、翻
訳、または遺伝子もしくはトランスジーンの他の発現特
性、複製エレメント、タンパク質結合エレメントなど。
【００４１】本発明は、親和性相互作用スクリーニング
または表現型スクリーニングに適切なディスプレイされ
たポリペプチドまたはディスプレイされた抗体のライブ
ラリーを生成する方法を提供する。本方法は、（１）デ
ィスプレイされたポリペプチドまたはディスプレイされ
た抗体、および上記のディスプレイされたポリペプチド
またはディスプレイされた抗体をコードする関連ポリヌ
クレオチドを含む第１の複数の選択されたライブラリー
メンバーを得、そして上記の関連ポリヌクレオチドまた
はそのコピーを得る工程であって、ここで上記の関連ポ
リヌクレオチドが実質的に同一の配列の領域を含み、必
要に応じて上記のポリヌクレオチドまたはコピーに変異
を導入する工程、および（２）ヌクレアーゼ消化、部分
的伸長ＰＣＲ増幅、ＰＣＲスタッタリング（ｓｔｕｔｔ
ｅｒｉｎｇ）、または他の適切なフラグメント化手段に
よって（代表的には、ランダムフラグメントもしくはフ
ラグメント等価物の作製によって）、ＰＣＲ増幅に適切
な条件下でそのフラグメントを形成するための上記の関
連ポリヌクレオチドまたはコピーを、プールおよびフラ
グメント化する工程、ＰＣＲ増幅および必要に応じて変
異誘発を行う工程、およびそれにより上記フラグメント
を相同組換えして、組換えポリヌクレオチドのシャッフ
ルされたプールを形成する工程であって、それにより上
記シャッフルされたプールの組換えポリヌクレオチドの
実質的画分（例えば、１０％を超える）が、第１の複数
の選択されたライブラリーメンバー中に存在せず、上記
シャッフルされたプールは、親和性相互作用スクリーニ
ングに適切なディスプレイされたポリペプチドまたはデ
ィスプレイされた抗体のライブラリーを構成する工程を
包含する。必要に応じて本方法は、予め決定された高分
子（例えば、タンパク質性レセプター、ペプチド、オリ
ゴ糖、ビリオン、または他の予め決定された化合物もし
くは構造）と結合またはさもなければ相互作用する能力
を有する個々のシャッフルされたライブラリーメンバー
（例えば、触媒性抗体）を同定するために、シャッフル
したプールのライブラリーメンバーをスクリーニングす
るさらなる工程を包含する。このようなライブラリーか
ら同定されるディスプレイされたポリペプチド、抗体、
ペプチド模倣（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）抗体、
および可変領域配列は、治療、診断、研究、および関連
する目的（例えば、触媒、水性溶液の浸透性を増大させ
るための溶質など）のために使用され得、および／また
はシャッフリングおよび／または親和性選択の１回以上
のさらなるサイクルを受け得る。本方法は、選択の工程
が、予め決定された分子に対する結合親和性以外の表現
型の特徴（例えば、触媒活性、安定性、酸化抵抗性、薬
物耐性、または宿主細胞上で与えられる検出可能な表現
型）を対象とするように改変され得る。
【００４２】１つの実施態様において、第１の複数の選
択されたライブラリーのメンバーは、フラグメント化さ
れ、そしてインビトロでのＰＣＲによって相同組換えさ
れる。フラグメントの作製は、本明細書中に記載される
ような、ヌクレアーゼ消化、部分的伸長ＰＣＲ増幅、Ｐ
ＣＲスタッタリング、または他の適切なフラグメント化
手段による。スタッタリングは、テンプレートの不完全
なポリメラーゼ伸長によるフラグメント化である。非常
に短いＰＣＲ伸長回数に基づく組換え形式が、部分的な
ＰＣＲ産物を作製するために使用された。これは次の
（および続く）サイクルにおいて別のテンプレートを伸
長し続ける。
【００４３】１つの実施態様において、第１の複数の選
択されたライブラリーのメンバーは、インビトロにおい
てフラグメント化され、得られるフラグメントを宿主細
胞または生物へ移入し、そして相同組換えされて、イン
ビボにおけるシャッフルされたライブラリーのメンバー
を形成する。
【００４４】１つの実施態様において、第１の複数の選
択されたライブラリーのメンバーは、エピソーム的に複
製可能なベクター上でクローニングまたは増幅され、上
記多様なベクターは細胞へ移入され、そして相同組換え
され、インビボにおけるシャッフルされたライブラリー
のメンバーを形成する。
【００４５】１つの実施態様において、第１の複数の選
択されたライブラリーのメンバーはフラグメント化され
ないが、直列反復または間接（もしくは逆方向）反復と
してエピソーム的に複製可能なベクター上でクローニン
グまたは増幅され、各反復は、選択されたライブラリー
のメンバー配列の異なる種を含み、上記ベクターは細胞
内へ移入され、そしてベクター内またはベクター間の組
換えにより相同組換えされて、インビボにおけるシャッ
フルされたライブラリーのメンバーを形成する。
【００４６】１つの実施態様において、インビトロおよ
びインビボでのシャッフリングの組み合わせが、組み合
わせの多様性を増強するために提供される。
【００４７】本発明は、親和性相互作用スクリーニング
に適切なディスプレイされた抗体のライブラリーを生成
する方法を提供する。この方法は、（１）ディスプレイ
された抗体、および上記のディスプレイされた抗体をコ
ードする関連ポリヌクレオチドを含む、第１の複数の選
択されるライブラリーメンバーを得る工程、および上記
の関連ポリヌクレオチドまたはそのコピーを得る工程で
あって、ここで上記の関連ポリヌクレオチドが、実質的
に同一な可変領域のフレームワーク（ｆｒａｍｅ ｗｏ
ｒｋ）配列の領域を含む工程、および（２）ＰＣＲの増
幅に適する条件下でそのフラグメントを形成するために
上記の関連ポリヌクレオチドまたはコピーをプールおよ
びフラグメント化し、それにより上記フラグメントを相
同組換して、ＣＤＲの新規な組み合わせを含む組換えポ
リヌクレオチドのシャッフルされたプールを形成する工
程であって、それによって上記シャッフルされたプール
の組換えポリヌクレオチドの実質的画分（例えば、１０
％を超える）が、第１の複数の選択されたライブラリー
メンバー中に存在しないＣＤＲの組み合わせを含み、上
記シャッフルされたプールは、ＣＤＲ順列を含み、そし
て親和性相互作用スクリーニングに適切なディスプレイ
された抗体のライブラリーを構成する工程を包含する。
必要に応じて、シャッフルされたプールは、予め決定さ
れたエピトープ（抗原）に結合するシャッフルされたラ
イブラリーメンバーを選択するための、親和性スクリー
ニングを受け、それにより複数の選択されるシャッフル
されたライブラリーのメンバーを選択する。必要に応じ
て、複数の選択されるシャッフルされたライブラリーの
メンバーは、１〜約１０００サイクルまたは所望の結合
親和性を有するライブラリーメンバーが得られるまで所
望により、繰り返してシャッフルおよびスクリーニング
され得る。
【００４８】従って、本発明の１つの局面は、１つ以上
の変異をテンプレート２本鎖ポリヌクレオチド中へ導入
する方法が提供される（ここで、テンプレート２本鎖ポ
リヌクレオチドは、切断されるかまたは（部分的伸長ま
たはスタッタリングにより）所望の大きさのランダムフ
ラグメントにＰＣＲ増幅される）。本方法は、１つ以上
の１本鎖または２本鎖オリゴヌクレオチドを、得られる
２本鎖フラグメントの集団に添加する工程であって、こ
こで上記オリゴヌクレオチドはテンプレートポリヌクレ
オチドに同一な範囲および非相同な範囲含む、工程；２
本鎖のランダムフラグメントおよびオリゴヌクレオチド
の得られる混合物を１本鎖フラグメントに変性する工
程；上記１本鎖フラグメント間の同一の領域で上記１本
鎖フラグメントがアニールし、そして変異誘発された２
本鎖ポリヌクレオチドが形成する条件下で、得られる１
本鎖フラグメントの集団とポリメラーゼとをインキュベ
ートする工程；および所望により上記の工程を反復する
工程によってなされる。
【００４９】別の局面において、本発明は、野生型タン
パク質をコードする２本鎖テンプレートポリヌクレオチ
ドを含有するサンプルを、上記テンプレートポリヌクレ
オチドを所望のサイズのランダムな２本鎖フラグメント
への切断を提供する条件下で処理する工程；１つ以上の
１本鎖または２本鎖オリゴヌクレオチドを、得られるラ
ンダムフラグメントの集団に添加する工程であって、こ
こで上記オリゴヌクレオチドはテンプレートポリヌクレ
オチドに同一な範囲または非相同範囲を含む、工程；２
本鎖のフラグメントおよびオリゴヌクレオチドの得られ
る混合物を１本鎖フラグメントに変性する工程；同一な
範囲で上記１本鎖フラグメントがアニールし、そして変
異誘発された２本鎖ポリヌクレオチドが形成する条件下
で、得られる１本鎖フラグメントの集団とポリメラーゼ
とをインキュベートする工程；所望により上記の工程を
反復する工程；次いで、変異誘発された２本鎖ポリヌク
レオチドから組換えタンパク質を発現する工程により、
生物学的活性を有する組換えタンパク質を生成する方法
に関する。
【００５０】本発明の第３の局面は、異なる２本鎖テン
プレートポリヌクレオチドを含有するサンプルを処理す
ることによってキメラポリヌクレオチドを得る方法に関
する。ここで、上記の異なるテンプレートポリヌクレオ
チドは、上記テンプレートポリヌクレオチドを所望のサ
イズのランダムな２本鎖フラグメントへの切断を提供す
る条件下で、同一の範囲および非相同的な範囲を含む、
工程；処理したサンプル中に含まれる得られるランダム
な２本鎖フラグメントを、１本鎖フラグメントに変性さ
せる工程；同一の範囲で１本鎖フラグメントのアニーリ
ング、およびテンプレートポリヌクレオチド配列を含有
するキメラ２本鎖ポリヌクレオチド配列の形成を提供す
る条件下で、得られる１本鎖フラグメントとポリメラー
ゼとをインキュベートする工程；および所望される場合
は上記の工程を反復する工程を包含する。
【００５１】本発明の第４の局面は、インビトロでの１
本鎖テンプレートポリヌクレオチドと、テンプレートポ
リヌクレオチドを切断および変性することにより得られ
るランダムな１本鎖小フラグメントとを結合することに
よりテンプレートポリヌクレオチドを複製する方法、お
よび２本鎖テンプレートポリヌクレオチドの集団が形成
される条件下で、核酸ポリメラーゼの存在下で上記核酸
フラグメントの混合物をインキュベートする方法に関す
る。
【００５２】本発明はまた、ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドおよび／または転写調節配列を含有す
るポリヌクレオチドをシャッフルするための、インビト
ロおよび／またはインビボのポリヌクレオチドシャッフ
リングの使用を提供する。
【００５３】本発明はまた、ウイルス遺伝子（例えば、
キャプシドタンパク質、スパイク糖タンパク質、ポリメ
ラーゼ、プロテアーゼなど）またはウイルスゲノム（例
えば、パラミクソウイルス科、オルトミキソウイルス
科、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レオウイル
ス、ライノウイルスなど）の集団をシャッフルするため
の、ポリヌクレオチドシャッフリングの使用を提供す
る。１つの実施態様において、本発明は、免疫原ウイル
スタンパク質の全てまたは一部をコードする配列をシャ
ッフルして、新規のエピトープおよび組換えにより作製
される新規のエピトープの組み合わせを生成する方法を
提供する；このようなシャッフルされたウイルスタンパ
ク質は、ウイルス進化の結果として天然の環境において
生じようであるエピトープまたはエピトープの組み合わ
せを含み得る（例えば、インフルエンザウイルス株の組
換えなど）。
【００５４】本発明はまた、有利な新規のポリペプチド
（例えば、触媒、温度プロフィール、安定性、酸化耐
性、または選択され得る他の所望の特徴の改変された特
性を有する酵素）を作製および同定するために、タンパ
ク質変異体（例えば、分類学的に関連する酵素、構造的
に関連する酵素、および／または機能的に関連する酵
素、ならびに／あるいはその変異した改変体）の集団を
シャッフルするための、ポリヌクレオチドシャッフリン
グの使用を提供する。分子進化および指向された分子進
化に適切な方法が提供される。ポリヌクレオチドの特異
的な部分（例えば、コード領域のセグメント）に選択圧
の焦点を合わせるための方法が提供される。
【００５５】本発明はまた、遺伝子治療ベクター、およ
びヒト遺伝子治療のために使用され得るような複製能欠
損の遺伝子治療構築物（ＤＮＡに基づくワクチン接種の
ためのワクチン注射ベクター、および抗新生物遺伝子治
療、ならびに他の遺伝子治療形式を含むが、これらに限
定されない）を生成するためのポリヌクレオチド配列の
シャッフリングに適切な方法を提供する。
【００５６】本発明は、増強された緑色蛍光タンパク質
（ＧＦＰ）およびそれをコードするポリヌクレオチドを
生成するための方法を提供し、この方法は、ＧＦＰをコ
ードする発現ベクター上でのＤＮＡシャッフリングを行
う工程および増強された所望の特性（例えば、増強され
た蛍光）を有する改変体を選択またはスクリーニングす
る工程を包含する。改変において、１つの実施態様は、
誤りがちな増幅もしくは変異誘発性増幅、ミューテータ
ー株（例えば、超変異誘発性表現型を有する宿主細胞；
ｍｕｔLなど；Ｋｌｅｉｎ（１９９５）Ｐｒｏｇｒ．Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．
５１：２１７に記載されるような酵母株（本明細書中で
参考として援用される））における増殖、化学的変異誘
発、または部位指定（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）変
異誘発の工程を包含する。１つの実施態様において、増
強されたＧＦＰタンパク質は、発色団領域（アミノ酸６
４〜６９）の外側に、好ましくはアミノ酸１００〜アミ
ノ酸１７３までの領域に点変異を含み、特定の好ましい
実施態様は、残基１００、１５４、および１６４であ
り；代表的には、変異は置換変異（例えばＦ１００Ｓ、
Ｍ１５４Ｔ、Ｖ１６４Ａ）である。１つの実施態様にお
いて、変異は、親水性残基を疎水性残基に置換する。１
つの実施態様において、多重変異が、増強されたＧＦＰ
タンパク質およびそれをコードするポリヌクレオチド中
に存在する。本発明はまた、そのような増強されたＧＦ
Ｐタンパク質の使用（例えば、アッセイおよび高スルー
プットスクリーニングアッセイなどのための診断用レポ
ーター）を提供する。
【００５７】本発明はまた、インビトロで配列シャッフ
リングを行うための改善された実施態様を提供する。１
つの局面において、改善されたシャッフリング方法は、
関連配列ポリヌクレチドの再アニーリングまたは組換え
の率または程度を増大させる、少なくとも１つの添加剤
の添加を含む。１つの実施態様において、添加剤はポリ
エチレングリコール（ＰＥＧ）であり、代表的には、
０．１〜２５パーセントの最終濃度まで、しばしば２．
５〜１５パーセントの最終濃度まで、約１０パーセント
の最終濃度までシャッフリング反応に添加される。１つ
の実施態様において、添加剤はデキストラン硫酸であ
り、代表的には０．１〜２５パーセントの最終濃度ま
で、しばしば約１０パーセントでシャッフリング反応に
添加される。別の実施態様において、添加剤は、再アニ
ーリングの配列特異性を低下させ、そして無差別なハイ
ブリダイゼーションおよび／またはインビトロでの組換
えを促進する試薬である。１つの実施態様において、添
加剤は、再アニーリングの配列特異性を増大させ、そし
て高度に正確なハイブリダイゼーションおよび／または
インビトロでの組換えを促進する試薬である。反応を妨
げない他の長鎖ポリマー（例えば、ポリビニルピロリド
ンなど）がまた使用され得る。
【００５８】１つの局面において、改善されたシャッフ
リング方法は、カチオン性界面活性剤である、少なくと
も１つの添加剤の添加を含む。適切なカチオン性界面活
性剤の例として、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡ
Ｂ）、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム（ＤＴＡ
Ｂ）、および塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡ
Ｃ）など。
【００５９】１つの局面において、改善されたシャッフ
リング方法は、インビトロでの相同対形成および／また
は鎖交換を触媒するか、あるいは非触媒的に増強する組
換えタンパク質である、少なくとも１つの添加剤の添加
を含む。適切な組換えタンパク質の例として、以下が挙
げられるが、これらに限定されない：Ｅ．ｃｏｌｉｒｅ
ｃＡタンパク質、Ｔ４ ｕｖｓＸタンパク質、Ｕｓｔｉ
ｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ由来のｒｅｃ１タンパク質、他
の種由来の他のｒｅｃＡファミリーリコンビナーゼ、１
本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）、リボヌクレオタンパク
質Ａ１など。シャッフリングは、組換えタンパク質の１
つ以上の特性を改善するために使用され得る；例えば、
ｒｅｃＡをコードする変異配列がシャッフルされ得、そ
して改善された熱安定性改変体が、反復配列組換えによ
って選択される。
【００６０】非特異的（一般的組換え）リコンビナーゼ
（例えば、トポイソメラーゼＩ、トポイソメラーゼＩＩ
（本明細書中で参考として援用される、Ｔｓｅら、（１
９８０）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５５：５５
６０；Ｔｒａｓｋら、（１９８４）Ｅｍｂｏ Ｊ．
３：６７１））などが、本発明の反復法によって複数の
関連配列ポリヌクレオチドをシャッフルするためのイン
ビトロの組換え反応を触媒するために使用され得る。
【００６１】１つの局面において、改善されたシャッフ
リング方法は、非プルーフリーディングポリメラーゼに
よって触媒されるシャッフリング増幅反応において、生
成物ポリヌクレオチドの３’末端に導入された非テンプ
レートヌクレオチドを除去することにおいて活性である
エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素である、少なくと
も１つの添加剤の添加を含む。エキソヌクレアーゼ活性
を有する適切な酵素の例として、Ｐｆｕポリメラーゼが
挙げられるが、これに限定されない。他の適切なポリメ
ラーゼとして、以下が挙げられるが、これらに限定され
ない：Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ ＤＮＡポリメラ
ーゼ（Ｔｆ１）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ）、Ｔｈｅｒｍｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ ＤＮＡポリメラー
ゼ（Ｔｌｉ、Ｖｅｎｔ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ Ｗｏ
ｅｓｅｉ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｗｏ）、Ｔｈｅｒｍ
ｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＤＮＡポリメラーゼ
（ＵｌｔＭａ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋｉａｎｕ
ｓ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｚｙｍｅ）、Ｐ
ｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＮＡポリメ
ラーゼ（Ｐｆｕ）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．
ＤＮＡポリメラーゼ（９°Ｎｍ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｓｐ． ＤＮＡポリメラーゼ（’Ｄｅｅｐ Ｖｅ
ｎｔ’）、Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４ ＤＮＡ
ポリメラーゼ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ７ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラー
ゼＩ（天然の、およびクレノウ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮ
ＡポリメラーゼＩＩＩ。
【００６２】１つの局面において、改善されたシャッフ
リング方法は、再アニーリングしたフラグメント化ライ
ブラリーメンバーであるポリヌクレオチドの少なくとも
１サイクルの増幅（すなわちポリメラーゼを用いた伸
長）が、実質的な画分（代表的には、不完全に伸長され
た増幅産物の少なくとも２０％以上）を生成する条件化
で行われる改変を含み、増幅産物（不完全に伸長した増
幅産物を含む）は変性され、そしてさらに少なくとも１
サイクルの再アニーリングおよび増幅に供される。少な
くとも１サイクルの再アニーリングおよび増幅が、不完
全に伸長された産物の実質的な画分を提供する、この改
変は、「スタッタリング（ｓｔｕｔｔｅｒｉｎｇ）」と
呼ばれ、そして続く増幅回において不完全に伸長された
産物は再アニーリングし、そして別の配列関連テンプレ
ート種において伸長をプライムする。
【００６３】１つの局面において、改善されたシャッフ
リング方法は、少なくとも１サイクルの増幅が、第１の
ポリヌクレオチド種または関連配列ポリヌクレオチド種
のセットに対応する種々の長さの重複する一本鎖ＤＮＡ
フラグメントの回収を用いて行われる改変を含み、ここ
で、各重複するフラグメントはそれぞれ、テンプレート
として作用する第２のポリヌクレオチド種にハイブリダ
イズし、そして第２のポリヌクレオチド種からのポリヌ
クレオチド鎖の伸長をプライムし、従って、配列組み替
えされたポリヌクレオチドを形成し、ここで、上記の配
列組換えポリヌクレオチドは、テンプレートとして作用
する第２のポリヌクレオチド種の隣接部分を有する少な
くとも１つの第１のポリヌクレオチド種の部分を含む。
この改変において、テンプレートとして作用する第２の
ポリヌクレオチド種はウラシルを含み（すなわち、Ｋｕ
ｎｋｅｌ型テンプレート）、そして細胞において実質的
に複製可能でない。本発明のこの局面はまた、この改変
の少なくとも２回の反復サイクルを含み得る。
【００６４】１つの実施態様においてＰＣＲが行われ
得、ここでヌクレオチド混合物は、塩基としてウラシル
を有するヌクレオチド種を含む。次いで、ＰＣＲ産物
は、鎖破壊を生じるＵＤＧ−グリコシラーゼでの消化に
よってフラグメント化され得る。フラグメントサイズ
は、ＰＣＲ混合物中のウラシル含有ＮＴＰの画分によっ
て制御され得る。
【００６５】１つの局面において、改善されたシャッフ
リング方法は、少なくとも１サイクルの増幅が、テンプ
レートのスイッチング（ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）を促進す
る適切な条件下で添加剤またはポリメラーゼを用いて行
われる改変を含む。Ｔａｑポリメラーゼが増幅のために
使用される１つの実施態様において、ｒｅｃＡまたは他
のポリメラーゼ（例えば、ウイルスポリメラーゼ、逆転
写酵素）の添加は、テンプレートのスイッチングを増強
する。テンプレートスイッチングはまた、当業者に公知
の他の手段の中でも、ＤＮＡテンプレート濃度の増大に
よって増大され得る。
【００６６】一般的な方法の１つの実施態様において、
配列組換えポリヌクレオチドのライブラリーが、天然に
存在する遺伝子または遺伝子の対立遺伝子である配列関
連ポリヌクレオチドから作製される。この局面におい
て、少なくとも７０パーセントの配列同一性、好ましく
は、少なくとも９０パーセントの配列同一性を有する、
少なくとも５０の連続するヌクレオチドの領域を含む、
少なくとも２つの天然に存在する遺伝子および／または
対立遺伝子が、例えば、ハイブリッド選択によるか、ま
たはデータベースからの配列データを用いるコンピュー
ターによる配列分析を通じて、遺伝子配列のプールから
選択される。１つの局面において、少なくとも７０パー
セントの配列同一性、好ましくは少なくとも９０パーセ
ントの配列同一性を有する、少なくとも５０の連続する
ヌクレオチドの領域を含む、少なくとも３つの天然に存
在する遺伝子および／または対立遺伝子が、例えば、ハ
イブリッド選択によるか、またはデータベースからの配
列データを用いるコンピューターによる配列分析を通じ
て、遺伝子配列のプールから選択される。選択された配
列は、クローニングによって、またはＤＮＡ合成を通じ
てのいずれかでポリヌクレオチドとして得られ、そして
本発明の任意の種々の実施態様によってシャッフルされ
る。
【００６７】本発明の１つの実施態様において、多重プ
ール（ｍｕｌｔｉ−ｐｏｏｌ）シャッフリングが行われ
る。ポリヌクレオチド配列の多重プールのシャッフリン
グは、それぞれ別のプールが、所望の特性を生じるため
の異なる組換え溶液を生成することを可能にする。この
改変において、親のポリヌクレオチド配列のプール（ま
たは、任意の続いてシャッフルされたライブラリーまた
はライブラリーメンバーの選択されたプール）が、２以
上の別の配列のプールに細分（または分離）され、そし
て１回以上の反復配列組換えおよび選択（またはスクリ
ーニング）に別々に供される。所望される場合は、必要
に応じて、それぞれの別のプールからの選択されたライ
ブラリーのメンバーが、シャッフリングの最後の回にお
いて組換えされ（または、組み込まれ）得る。あるい
は、多重に分離された親のプールが使用され得る。プー
ル内の選択された（またはスクリーニングされた）ライ
ブラリーのメンバーが、本発明の反復配列組換え方法に
よって互いに交差される同系交配（ｉｎｂｒｅｅｄｉｎ
ｇ）は、単独で、または別のプールのライブラリーのメ
ンバーが本発明の反復配列組換え方法によって互いに交
差される異系交配（ｏｕｔｂｒｅｅｄｉｎｇ）と組み合
わせて行われ得る。
【００６８】本発明の実施態様において、この方法は、
任意の開示されたシャッフリング方法によって生成され
た配列組換えポリヌクレオチドから、シャッフルされて
いない産物（例えば、親配列）を取り除くさらなる工程
を含む。シャッフルされていない産物は：（１）第１の
親ポリヌクレオチド種にハイブリダイズするが、第２の
親ポリヌクレオチド種には実質的にハイブリダイズしな
い第１のＰＣＲプライマー、および（２）第２の親ポリ
ヌクレオチド種にハイブリダイズするが、第１の親ポリ
ヌクレオチド種には実質的にハイブリダイズしない第２
のＰＣＲプライマーを用いる増幅を行うことによって、
取り除かれるかまたは発生を避けられ得、その結果、増
幅は、第１のＰＣＲプライマーにハイブリダイズする第
１の親配列の部分を含み、そして第２のＰＣＲプライマ
ーにハイブリダイズする第２の親配列の部分をまた含む
テンプレートから生じ、従って、配列組換えポリヌクレ
オチドのみが増幅される。
【００６９】本発明はまた、インビボでの配列シャッフ
リングを行うための別の実施態様を提供する。１つの局
面において、別のシャッフリング方法は、プラスミド間
（ｉｎｔｅｒ−ｐｌａｓｍｉｄｉｃ）組換えの使用を含
み、ここで、配列組換えポリヌクレオチド配列のライブ
ラリーは、適切な宿主細胞内で、適合性または非適合性
のマルチコピープラスミドのインビボでの遺伝子組換え
によって得られる。非適合性プラスミドが使用される場
合、代表的には、各プラスミド型は別々の選択マーカー
を有し、そして各所望のプラスミド型の維持についての
選択が適用される。組換えされる関連配列ポリヌクレオ
チド配列は、別々に複製可能なマルチコピーベクター
（代表的には、異なる別々に選択可能なマーカー遺伝子
（例えば、薬剤耐性遺伝子）をそれぞれ有する細菌プラ
スミド）に別々に組み込まれる。適切な宿主細胞は、両
方のプラスミド種を用いて形質転換され、両方の選択マ
ーカー遺伝子を発現する細胞が選択され、配列組換えさ
れた配列が回収され、そして本明細書中に記載される任
意の手段によるシャッフリングのさらなる回に供され得
る。
【００７０】１つの局面において、別のシャッフリング
方法は、プラスミド内（ｉｎｔｒａ−ｐｌａｓｍｉｄｉ
ｃ）組換えの使用を含む。ここで、配列組換えされたポ
リヌクレオチド配列のライブラリーは、同じプラスミド
上に位置する直列配列反復または逆方向配列反復のイン
ビボでの遺伝子組換えによって得られる。この改変にお
いて、組換えされる配列は、部位特異的組換え配列に隣
接され、そしてポリヌクレオチドはインテグロン（ｉｎ
ｔｅｇｒｏｎ）（本明細書中で参考として援用される、
ＨａｌｌおよびＣｏｌｌｉｎｓ（１９９５）Ｍｏｌ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １５： ５９３）のような部位
特異的組換えシステムにおいて存在し、そしてトランス
ポゾン（例えば、ＩＳ１）などの挿入配列を含み得る。
イントロンは、低率の天然の移動度を有し、そして原核
生物および真核生物の両方において移動性遺伝的エレメ
ントとして使用され得る。シャッフリングは、移動性遺
伝的エレメントの能力を改善するために使用され得る。
これらの高頻度の組換えビヒクルは、大きな配列ブロッ
クの転移を介する大きな配列の迅速な最適化のために使
用され得る。反復した、散在した、そして分かれたＤＮ
Ａ配列であり、そして「同種（ｈｏｍｅｏｌｏｇｏｕ
ｓ）」配列とも呼ばれる配列間の組換えは、代表的には
通常の細胞において抑制される。しかし、ＭｕｔＬおよ
びＭｕｔＳ細胞において、この抑制は解除されており、
そして染色体内組換えの割合が増大している（本明細書
中で参考として援用される、Ｐｅｔｉｔら（１９９６）
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２９：３２７）。
【００７１】本発明の１つの局面において、宿主細胞の
ミューテーター株は、より高度にミスマッチな配列関連
ポリヌクレオチドの組換えを増大させるために使用され
る。細菌株（例えば、ＭｕｔＬ、ＭｕｔＳ、ＭｕｔＴ、
またはＭｕｔＨ）あるいはＭｕｔタンパク質を発現する
他の細胞（ＸＬ−１ｒｅｄ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓ
ａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）は、インビボでの組換えに
よる配列関連ポリヌクレオチドのシャッフリングのため
の宿主細胞として使用され得る。プルーフリーディング
欠損ポリメラーゼを有するような、他の変異しがちな
（ｍｕｔａｔｉｏｎ−ｐｒｏｎｅ）宿主細胞型がまた使
用され得る（本明細書中で参考として援用される、Ｆｏ
ｓｔｅｒら（１９９５）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃ
ａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．） ９２： ７９５
１）。酵母のミューテーター株が使用され得、同様に、
ａｔａｘｉａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ細胞（例
えば、本明細書中で参考として援用される、Ｌｕｏら
（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ ．Ｃｈｅｍ． ２７１：
４４９７に記載される）を含む超変異誘発性哺乳動物細
胞が使用され得る。
【００７２】宿主細胞に化学的変異原または放射性変異
原を投与する工程を包含する、他のインビボおよびイン
ビトロでの変異誘発形式が使用され得る。このような変
異原の例として、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：ＭＮＵ、ＥＮＵ、ＭＮＮＧ、ニトロソ尿素（ｎ
ｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、ＢｕＤＲなど。紫外線がま
た、変異を生成するためおよび／または組換え率を増大
させるために、例えば、インビボでの組換えを増強する
ために使用される細胞の照射によって使用され得る。電
離放射線および染色体異常誘発性（ｃｌａｓｔｏｇｅｎ
ｉｃ）剤がまた、変異頻度を増大するためおよび／また
は組換えを増大させるためおよび／またはポリヌクレオ
チドフラグメント化を効果的にするために使用され得
る。
【００７３】
【発明の実施の形態】本発明は、 ＤＮＡ配列の変異誘
発に対するランダムフラグメント化およびその適用後
に、核酸分子再組立の方法に関する。増強された生物学
的活性を有する変異タンパク質をコードする核酸フラグ
メントを生成する方法もまた記載される。特に、本発明
はまた、増強された生物学的活性を有する変異タンパク
質の作製を可能にする変異誘発、核酸シャッフリングお
よび選択の反復サイクルの方法に関する。
【００７４】本発明はＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク
質変異体の非常に大規模なライブラリーを生成する方法
に関する；代謝酵素または複数の成分からなる経路がシ
ャッフリングに供される実施態様において、ライブラリ
ーは、シャッフルされた酵素のライブラリーに加えて生
じた代謝物を含み得る。この方法は、所望の核酸フラグ
メントが選択され得る関連ＤＮＡフラグメントの生成に
おいて特定の利点を有する。特に本発明はまた、増強さ
れた生物学的活性を有する変異タンパク質の作製を可能
にする変異誘発、相同組換えおよび選択の反復サイクル
の方法に関する。
【００７５】しかし、本発明をさらに詳細に考察する前
に、まず以下の用語が定義される。
【００７６】（定義）本明細書で使用される以下の用語
は、以下の意味を有する：用語「ＤＮＡ再組立」は、同
一の配列の間で組換えが生じる場合に使用される。
【００７７】対照的に、用語「ＤＮＡシャッフリング」
は、実質的に相同であるが同一ではない配列の間の組換
えを示すために本明細書で使用され、いくつかの実施態
様において、ＤＮＡシャッフリングは非相同な組換え
（例えば、ｃｒｅ／ｌｏｘおよび／またはｆｌｐ／ｆｒ
ｔシステムなど）を介する交差を含み得る。従って、組
換えは、実質的に相同なポリヌクレオチド配列を必要と
はしない。相同組換えおよび非相同組換え形式が使用さ
れ得、そしていくつかの実施態様において、実質的に類
似でない配列の分子キメラおよび／または分子ハイブリ
ッドが生成され得る。
【００７８】用語「増幅」は、核酸フラグメントのコピ
ー数が増加することを意味する。
【００７９】用語「同一な」または「同一性」は、２つ
の核酸配列が同じ配列または相補的な配列を有すること
を意味する。従って、「同一の範囲」は、核酸フラグメ
ントまたはポリヌクレオチドの領域または範囲が、別の
ポリヌクレオチドまたは核酸フラグメントに同一または
相補的であることを意味する。
【００８０】用語「対応する」は、ポリヌクレオチド配
列が参照ポリヌクレオチド配列の全てまたは一部分に相
同である（すなわち同一であり、厳密には進化的に関連
しない）こと、またはポリペプチド配列が参照ポリペプ
チド配列に同一であることを意味するために本明細書に
おいて使用される。対照的に、用語「相補する」は、相
補的な配列が参照ポリヌクレオチド配列の全てまたは一
部分に相同であることを意味するために本明細書で使用
される。例えば、核酸配列「ＴＡＴＡＣ」は、参照配列
「ＴＡＴＡＣ」に対応し、そして参照配列「ＧＴＡＴ
Ａ」に相補的である。
【００８１】以下の用語は、２つ以上のポリヌクレオチ
ド間での配列の関係を記載するために使用される：「参
照配列」、「比較領域（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｎ
ｄｏｗ）」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセン
テージ」、および「実質的な同一性」。「参照配列」
は、配列比較のための基本として使用される規定の配列
である；参照配列は、より大きな配列のサブセット（例
えば、配列表に示される全長ｃＤＮＡまたは遺伝子配列
のセグメント（例えば、図１または図２（ｂ）のポリヌ
クレオチド配列））であり得るか、または参照配列は完
全なｃＤＮＡまたは遺伝子配列を含有し得る。一般的
に、参照配列は少なくとも２０ヌクレオチドの長さであ
り、頻繁には少なくとも２５ヌクレオチドの長さであ
り、そしてしばしば少なくとも５０ヌクレオチドの長さ
である。２つのポリヌクレオチドが、それぞれ（１）２
つのポリヌクレオチド間で類似の配列（すなわち、完全
なポリヌクレオチド配列の一部分）を含有し得、そして
（２）２つのポリヌクレオチド間で互いに一致しない配
列をさらに含有し得るので、２つ（またはそれ以上）の
ポリヌクレオチド間の配列比較は、代表的には、「比較
領域」にわたる２つのポリヌクレオチドの配列を比較す
ることにより実施され、配列が類似する局所領域を同定
および比較する。
【００８２】本明細書で使用される「比較領域」は、少
なくとも２０の隣接するヌクレオチドの位置の概念上の
セグメントをいい、ここでポリヌクレオチド配列が少な
くとも２０の隣接するヌクレオチドの参照配列と比較さ
れ得、そしてここでは比較領域におけるポリヌクレオチ
ド配列の部分が、２つの配列の最適アラインメントのた
めに、参照配列（付加または欠失を含まない）に比べて
２０％以下の付加または欠失（すなわちギャップ）を含
み得る。比較領域を並べるための、配列の最適なアライ
ンメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ （１
９８１） Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ． ２：４８２
の局所相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ
およびＷｕｎｓｃｈ （１９７０） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズ
ムにより、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ （１９
８８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
（Ｕ．Ｓ．Ａ．） ８５：２４４４の類似度方法に関す
るサーチにより、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎ
ｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃ
ｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０， Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩにおけるＧ
ＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴ
Ａ）のコンピュータ実行により、または検査により行わ
れ得、そして種々の方法により生成される最も良いアラ
インメント（すなわち、比較領域にわたる最も高い相同
性パーセンテージを与える）が、選択される。
【００８３】用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレ
オチド配列が比較領域にわたって（すなわち、１ヌクレ
オチド対ずつで）同一であることを意味する。用語「配
列同一性のパーセンテージ」は、最適に並べられた２つ
の配列を比較領域にわたって比較し、同一の核酸塩基
（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が両方の配
列において生じる位置の数を測定し、一致した位置の数
を得、一致した位置の数を比較領域における位置の総数
（すなわち、比較サイズ）で割り、そしてこの結果に１
００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ること
により、算定される。本明細書で使用される用語「実質
的同一性」は、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、こ
こではポリヌクレオチドは、少なくとも２０のヌクレオ
チド位置の比較領域にわたり、頻繁には少なくとも２５
〜５０ヌクレオチドの領域にわたり参照配列と比較し
て、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なく
とも８５％の同一性、そしてしばしば９０％〜９５％の
配列同一性、最も通常には少なくとも９９％の配列同一
性を有する配列を包含し、ここでは配列同一性のパーセ
ンテージは、ポリヌクレオチド配列を参照配列と比べる
ことにより算定され、このポリヌクレオチド配列は、比
較領域にわたり、全体で参照配列の２０％以下の欠失ま
たは付加を含み得る。
【００８４】保存的アミノ酸置換は、類似側鎖を有する
残基の互換性をいう。例えば、脂肪族側鎖を有するアミ
ノ酸のグループは、グリシン、アラニン、バリン、ロイ
シン、およびイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル
側鎖を有するアミノ酸のグループはセリンおよびスレオ
ニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグルー
プはアスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖
を有するアミノ酸のグループは、フェニルアラニン、チ
ロシン、およびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有
するアミノ酸のグループは、リジン、アルギニン、およ
びヒスチジンであり；そしてイオウ含有側鎖を有するア
ミノ酸のグループは、システインおよびメチオニンであ
る。好ましい保存的アミノ酸の置換グループは：バリン
−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシ
ン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびア
スパラギン−グルタミンである。
【００８５】用語「相同」または「同種（ｈｏｍｅｏｌ
ｏｇｏｕｓ）」は、ある１本鎖核酸配列が相補的な１本
鎖核酸配列にハイブリダイズし得ることを意味する。ハ
イブリダイゼーションの程度は、配列間の同一性の量お
よびハイブリダイゼーション条件（例えば、後述するよ
うな温度および塩濃度）を包含する多数の要素に依存し
得る。好ましくは同一な領域は約５ｂｐより多くであ
り、より好ましくは同一な領域は１０ｂｐより多くであ
る。
【００８６】用語「非相同」は、ある１本鎖核酸配列が
別の１本鎖核酸配列またはその相補鎖にハイブリダイズ
し得ないことをいう。従って非相同な範囲は、核酸フラ
グメントまたはポリヌクレオチドが、別の核酸またはポ
リヌクレオチドにハイブリダイズし得ない配列中の範囲
または領域を配列中に有することを意味する。このよう
な領域または範囲は、例えば、変異の範囲である。
【００８７】本明細書で使用される用語「同族」は、種
間で進化的におよび機能的に関連付けられる遺伝子配列
をいう。これに限定されないが例えば、ヒトゲノムにお
いては、ヒトＣＤ４遺伝子は、マウスＣＤ４遺伝子の同
族遺伝子である。なぜならこれらの２つの遺伝子の配列
および構造が、それらが高度に相同であることを示し、
そして両方の遺伝子が、ＭＨＣクラスＩＩ−制限抗原認
識を介してＴ細胞活性化をシグナルすることに機能する
タンパク質をコードしているからである。
【００８８】用語「野生型」は、核酸フラグメントがい
かなる変異も含まないことを意味する。「野生型」タン
パク質は、このタンパク質が天然に見られる活性のレベ
ルで活性であり、そして代表的には、天然に見られるア
ミノ酸配列を含有することを意味する。１つの局面にお
いて、用語「野生型」または「親配列」は、本発明の操
作の前に開始配列または参照配列を示し得る。
【００８９】用語「関連ポリヌクレオチド」は、ポリヌ
クレオチドの領域または範囲が同一であり、かつポリヌ
クレオチドの領域または範囲が非相同であることを意味
する。
【００９０】用語「キメラポリヌクレオチド」は、ポリ
ヌクレオチドが野生型である領域および変異を受けた領
域を含むことを意味する。ポリヌクレオチドが、あるポ
リヌクレオチドに由来する野生型領域および別の関連ポ
リヌクレオチドに由来する野生型領域を含むこともまた
意味する。
【００９１】用語「切断」は、ポリヌクレオチドを酵素
で消化すること、もしくはポリヌクレオチドを破壊する
こと、または部分的ＰＣＲ伸長、ＰＣＲスタッタリン
グ、ディファレンシャルフラグメント増幅、もしくは１
つ以上の親配列の部分的な長さのコピーを生成する他の
手段による、親配列の部分的な長さのコピーを生成する
ことを意味する。
【００９２】本明細書で使用される用語「集団」は、ポ
リヌクレオチド、核酸フラグメント、またはタンパク質
のような成分の集合を意味する。「混合集団」は、核酸
またはタンパク質の同じファミリーに属する（すなわち
関連する）が、それらの配列において異なり（すなわち
同一ではない）、それゆえそれらの生物学的活性におい
ても異なる成分の集合を意味する。
【００９３】用語「特定核酸フラグメント」は、特定の
終点を有し、そして特定核酸配列を有する核酸フラグメ
ントを意味する。２つの核酸フラグメント（ここでは１
つの核酸フラグメントが第２の核酸フラグメントの一部
分と同一の配列を有するが、異なる末端を有する）は、
２つの異なる特定核酸フラグメントを包含する。
【００９４】用語「変異」は、野生型核酸配列の配列に
おける変化、またはペプチドの配列における変化を意味
する。このような変異は、トランジションまたはトラン
スバーションのような点変異であり得る。変異は欠失、
挿入、または重複であり得る。
【００９５】本明細書で使用されるポリペプチド表記に
おいて、標準的な慣習および慣用に従って、左側方向が
アミノ末端方向であり、そして右側方向がカルボキシ末
端方向である。同様に、他で特定しないかぎり、１本鎖
ポリヌクレオチド配列の左側の末端は５’末端であり；
２本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は５’方向とい
う。新生ＲＮＡ転写産物の５’から３’付加の方向を、
転写方向といい；ＲＮＡと同じ配列を有し、およびＲＮ
Ａ転写産物の５’末端の５’側にであるＤＮＡ鎖上の配
列領域を「上流配列」といい；ＲＮＡと同じ配列を有
し、そしてコードＲＮＡの転写産物の３’末端の３’側
にあるＤＮＡ鎖上の配列領域を「下流配列」という。
【００９６】本明細書で使用される用語「天然に存在す
る」は、ある物体に適用されるように、ある物体が天然
に見出され得る事実をいう。例えば、供給源から天然に
単離され得、研究室においてヒトにより故意に改変され
ていない生物（ウイルスを含む）に存在するポリペプチ
ドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。一
般的に、用語天然に存在するは、種に代表的であるよう
な非病的（非疾患）個体に存在する物体をいう。
【００９７】本明細書で使用される用語「薬剤」は、化
合物、化合物の混合物、場所的に局在する化合物の配列
（例えば、ＶＬＳＩＰＳペプチド配列、ポリヌクレオチ
ド配列、および／または結合小分子配列）、生体高分
子、バクテリオファージのペプチドディスプレイライブ
ラリー、バクテリオファージ抗体（例えば、ｓｃＦｖ）
ディスプレイライブラリー、ポリソームペプチドディス
プレイライブラリー、または細菌、植物、真菌、または
動物（特に哺乳動物）細胞または組織のような生体物質
から作製される抽出物を示す。薬剤は、本明細書の以下
に記載されるスクリーニングアッセイに含めることによ
り、抗新生物剤、抗炎症剤、またはアポトーシスモジュ
レーターとしての潜在的活性について評価される。薬剤
は、本明細書の以下に記載されるスクリーニングアッセ
イに含めることにより、特定のタンパク質相互作用のイ
ンヒビター（すなわち、２つの予め決定されたポリペプ
チド間の結合相互作用を選択的に阻害するが、細胞の生
存性を実質的に阻害しない薬剤）としての潜在的活性に
ついて評価される。
【００９８】本明細書で使用されるように、「実質的に
純粋な」は、対象種が存在する優勢種であること（すな
わち、モル濃度に基づき、組成において他の任意の個々
の高分子種よりも豊富であること）を意味し、そして好
ましくは実質的に精製された画分は、対象種が、存在す
る全ての高分子種の少なくとも約５０％（モル濃度に基
づき）を含む組成である。一般的には、実質的に純粋な
組成物は、組成物中に存在する全高分子種の約８０％〜
９０％より多くを含有する。最も好ましくは、対象種は
本質的に均質にまで精製され（汚染種が従来の検出方法
により組成物中に検出され得ない）、ここでは組成物は
本質的に単一の高分子種からなる。溶媒種、小分子（＜
５００ダルトン）、および元素イオン種は高分子種とは
見なさない。
【００９９】本明細書で使用される用語「生理学的条
件」は、温度、ｐＨ、イオン強度、粘性率、および同様
の生物学的パラメーターをいい、これらは生存可能な生
物と適合可能であり、そして／または生存可能な酵母培
養細胞または哺乳動物培養細胞において細胞内に代表的
に存在する。例えば、代表的な実験室培養条件下で増殖
される酵母細胞における細胞内条件は、生理学的条件で
ある。インビトロ転写反応混液に適切なインビトロ反応
条件は、一般的に生理学的条件である。一般に、インビ
トロ生理学的条件は５０〜２００ｍＭ ＮａＣｌまたは
ＫＣｌ、ｐＨ６．５〜８．５、２０〜４５℃、および
０．００１〜１０ｍＭ ２価カチオン（例えば、Ｍ
ｇ++、Ｃａ++）；好ましくは約１５０ｍＭ ＮａＣｌま
たはＫＣｌ、ｐＨ７．２〜７．６、５ｍＭ 二価カチオ
ンを含有し、そしてしばしば０．０１〜１．０％の非特
異的タンパク質（例えば、ＢＳＡ）を含有する。非イオ
ン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ、ＮＰ−４０、Ｔｒｉｔｏ
ｎ Ｘ−１００）が、通常約０．００１％〜２％、代表
的には０．０５％〜０．２％（ｖ／ｖ）でしばしば存在
し得る。特定の水性条件は従来の方法に従って当業者に
より選択され得る。一般的な手引きのために、以下の緩
衝化水性条件が適用可能であり得る：１０〜２５０ｍＭ
ＮａＣｌ、５〜５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ５
〜８、二価カチオン（１種類または複数）および／また
は金属キレート剤および／または非イオン性界面活性剤
および／または膜画分および／または消泡剤および／ま
たは発光剤（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）の最適な添加を
有する。
【０１００】本明細書において、特異的ハイブリダイゼ
ーションは、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌク
レオチド（例えば、第１のポリヌクレオチドと区別され
るが実質的には同一の配列を有するポリヌクレオチド）
との間のハイブリッドの形成として定義され、ここで
は、実質的に関連のないポリヌクレオチド配列が混合物
中でハイブリッドを形成しないストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件下で、第１のポリヌクレオチド
は優先して第２のポリヌクレオチド配列にハイブリダイ
ズする。
【０１０１】本明細書で使用される用語「単鎖抗体」
は、ポリペプチド結合においてＶHドメインおよびＶLド
メインを含むポリペプチドをいい、一般的にスペーサー
ペプチド（例えば、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
−Ｓｅｒ］X）を介して連接され、アミノ末端および／
またはカルボキシ末端で付加的なアミノ酸配列を含み得
る。例えば、単鎖抗体はコード化ポリヌクレオチドに結
合するために、つなぎ（ｔｅｔｈｅｒ）セグメントを含
み得る。一例として、ｓｃＦｖは、単鎖抗体である。単
鎖抗体は一般に、免疫グロブリンスーパーファミリーの
遺伝子により実質的にコードされる、少なくとも１０個
の隣接するアミノ酸の１つ以上のポリペプチドセグメン
トからなるタンパク質である（例えば、Ｔｈｅ Ｉｍｍ
ｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅ Ｓｕｐｅｒｆａｍ
ｉｌｙ， Ａ．Ｆ．ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＡ．Ｎ．Ｂ
ａｒｃｌａｙ， Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅ
ｎｅｓ， Ｔ．Ｈｏｎｊｏ， Ｆ．Ｗ． Ａｌｔ，およ
びＴ．Ｈ．Ｒａｂｂｉｔｔｓ編 （１９８９） Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，
３６１−３８７頁（本明細書中に参考として援用され
る）を参照のこと）。最も頻繁には単鎖抗体は、齧歯
類、ヒト以外の霊長類、トリ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤ
ギ、またはヒトの重鎖遺伝子配列または軽鎖遺伝子配列
によりコードされる。一般に、機能的な単鎖抗体は、免
疫グロブリンスーパーファミリー遺伝子産物の十分な部
分を含有しており、特定標的分子（代表的にはレセプタ
ーまたは抗原（エピトープ））に対する結合特性を保有
する。
【０１０２】本明細書で使用されるように、用語「相補
性決定領域」および「ＣＤＲ」は、ＫａｂａｔおよびＣ
ｈｏｔｈｉａにより例証される技術認識用語をいう。一
般に、ＣＤＲの定義は、高頻度可変領域または高頻度可
変ループ（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ （１９８
７） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １９６：９０１；Ｃｈ
ｏｔｈｉａら （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４２：
８７７；Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔら， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉ
ｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈ
ｅｓｄａ， ＭＤ） （１９８７）；およびＴｒａｍｏ
ｎｔａｎｏら （１９９０） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
２１５：１７５）としてもまた知られる。可変領域の
ドメインは、代表的に、天然に存在する免疫グロブリン
鎖のアミノ末端の約１０５〜１１５アミノ酸（例えば、
アミノ酸１〜１１０）を含むが、いくらか短いまたは長
い可変ドメインはもまた、単鎖抗体の形成に適してい
る。
【０１０３】免疫グロブリンの軽鎖可変領域または重鎖
可変領域は、ＣＤＲとも呼ばれる３つの高頻度可変領域
により中断される「フレームワーク」領域からなる。フ
レームワーク領域およびＣＤＲの範囲は正確に定義され
ている（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ
ｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｓ
ｅｔ」 Ｅ．Ｋａｂａｔら， 第４版， Ｕ．Ｓ． Ｄ
ｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕ
ｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍ
Ｄ （１９８７）を参照のこと）。異なる軽鎖または重
鎖のフレームワーク領域の配列は種内で比較的保存され
ている。本明細書で使用される「ヒトフレームワーク領
域」は、天然に存在するヒト免疫グロブリンのフレーム
ワーク領域に実質的に同一（約８５％以上、通常は９０
％〜９５％以上）であるフレームワーク領域である。抗
体のフレームワーク領域（すなわち、構成要素の軽鎖お
よび重鎖の結合フレームワーク領域）は、ＣＤＲの位置
および配列に作用する。ＣＤＲが主に、抗原のエピトー
プへの結合を担う。
【０１０４】本明細書で使用される用語「可変セグメン
ト」は、ランダムな配列、偽似ランダムな配列、または
規定の核配列を含む新生ペプチドの一部分をいう。可変
セグメントは、可変残基位置および不変残基位置の両方
を含み得、そして可変残基位置での残基の変化の程度は
制限され得る；両方の選択とも実施者の判断で選択され
る。代表的に、可変セグメントは約５〜２０アミノ酸残
基長（例えば、８〜１０）であるが、可変セグメントは
より長くあり得、そして抗体部分またはレセプター（例
えば、抗体フラグメント、核酸結合タンパク質、レセプ
タータンパク質など）を含み得る。
【０１０５】本明細書で使用される「ランダムペプチド
配列」は、２つ以上のアミノ酸モノマーからなり、そし
て確率的なプロセスまたはランダムなプロセスにより構
築されるアミノ酸配列をいう。ランダムなペプチドはフ
レームワークモチーフまたは骨組みモチーフを含み得、
不変配列を含み得る。
【０１０６】本明細書で使用される「ランダムペプチド
ライブラリー」は、一セットのランダムペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド配列のセットをいい、そしてこ
れらのポリヌクレオチド配列によりコードされるランダ
ムペプチドのセット、ならびにこれらのランダムペプチ
ドを含む融合タンパク質をいう。
【０１０７】本明細書で使用される用語「疑似ランダ
ム」は、限定された可変性を有する配列のセットをい
い、これにより、例えば、ある位置での残基の可変性の
程度が別の位置の残基の可変性の程度と異なる。しかし
任意の疑似ランダム位置は、ある程度の残基の変化を可
能にするが、制限される。
【０１０８】本明細書で使用される用語「規定の配列フ
レームワーク」は、一般的に実験データまたは構造デー
タを基礎として、非ランダムに選択される規定の配列の
セットをいい；例えば、規定の配列フレームワークは、
βシート構造を形成すると予想されるアミノ酸配列のセ
ットを含み得るか、または他の変化の間にロイシンジッ
パーの７個の反復モチーフ、亜鉛フィンガードメインを
含み得る。「規定の配列核」は、可変性の制限範囲を含
む配列のセットである。（１）２０個の従来のアミノ酸
の完全にランダムな１０マーの配列は、（２０）10個の
配列のいずれかであり得、そして（２）２０個の従来の
アミノ酸の疑似ランダムな１０マーの配列は（２０）10
個の配列のいずれでもあり得るが、特定の位置および／
または全体で特定の残基に偏りが表れ、（３）規定の配
列核は、それぞれの残基位置が可能である２０個の従来
のアミノ酸（および／または可能な比従来型のアミノ酸
／イミノ酸）のいずれでもあることが可能とされた場
合、可能な配列の最大数よりも少なくなる配列のサブセ
ットである。一般に、規定の配列核は、個々の選択され
たライブラリーメンバー配列のセグメントまたは全長の
いずれかに、可変残基位置および不変残基位置を含み、
そして／またはアミノ酸残基の規定のサブセットから選
択される残基を含み得る可変残基位置を包むなどであ
る。規定の配列核は、アミノ酸配列またはポリヌクレオ
チド配列のいずれかをいい得る。これらに限定されない
が例えば、配列（ＮＮＫ）10および（ＮＮＨ）10は、配
列核であると定義される（ここでＮはＡ、Ｔ、Ｇ、また
はＣを表し；Ｋは、ＧまたはＴを表し；そしてＭはＡま
たはＣを表す）。
【０１０９】本明細書で使用される「エピトープ」は、
抗体の可変領域結合ポケットと相互作用する結合相互作
用を形成し得る抗原または他の高分子の一部分をいう。
代表的に、このような結合相互作用はＣＤＲの１つ以上
のアミノ酸残基の分子間接触として示される。
【０１１０】本明細書で使用される「レセプター」は、
所定のリガンドに親和性を有する分子をいう。レセプタ
ーは天然に存在する分子または合成分子であり得る。レ
セプターは不変状態においてまたは他の種とともに集合
体として使用され得る。レセプターは、共有結合的また
は非共有結合的に、直接または特異的な結合物質を介し
てのいずれかで、結合メンバーに付着され得る。レセプ
ターの例は、抗体（特定の抗原決定基（例えば、ウイル
ス、細胞、または他の物質）と反応するモノクロール抗
体および抗血清を包含する）、細胞膜レセプター、炭水
化物および糖タンパク質の複合体、酵素、およびホルモ
ンレセプターを包含するがこれらに限定されない。
【０１１１】本明細書で使用される「リガンド」は、ラ
ンダムペプチド配列または可変セグメント配列のよう
な、特定のレセプターで認識される分子をいう。当業者
の認識するところによれば、分子（または高分子複合
体）は、レセプターおよびリガンドの両方であり得る。
一般的に、小分子量を有する結合対をリガンドといい、
そして大きな分子量を有する結合対をレセプターとい
う。
【０１１２】本明細書で使用される「リンカー」または
「スペーサー」は、２つの分子（例えば、ＤＮＡ結合タ
ンパク質およびランダムペプチド）を結合させる分子ま
たは分子のグループをいい、そして好ましい配置にその
２つの分子を置くように供せられる。これにより、例え
ば、ランダムペプチドは、ＤＮＡ結合タンパク質から最
少の立体障害でレセプターに結合し得る。
【０１１３】本明細書で使用される用語「作動可能に連
結される」は、機能的関係におけるポリヌクレオチドエ
レメントの連結をいう。核酸が、別の核酸配列と機能的
関係に置かれる場合、核酸は「作動可能に連結され
る」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーが、コ
ード配列の転写に影響する場合、これはコード配列に作
動可能に連結される。作動可能に連結されるとは、代表
的に、連結されるＤＮＡ配列が隣接されることを意味
し、２つのタンパク質コード領域を接続することが必要
である場合、隣接されかつリーディングフレーム内にあ
る。
【０１１４】本明細書中で使用される用語「反復配列組
換え」は、ポリヌクレオチド配列の集団が任意の適切な
組換え手段（例えば、有性ＰＣＲ、相同組換え、部位特
異的組換えなど）によって互いに組換えられ、これは配
列組換え種のライブラリーを生成し、次いで所望の特性
を有する配列組換え種を得るためにスクリーニングされ
るかまたは選択に供される方法をいう；次いで、選択さ
れた種は、それ自身および／または他のポリヌクレオチ
ド種との少なくとも１回の組換えのさらなるサイクル、
および続く所望の特性についての選択またはスクリーニ
ングに供される。
【０１１５】一般に、スクリーニングは、その１回目
が、どの細胞がスクリーニングマーカーを発現しそして
どの細胞が発現しないかを決定する工程、そして次に所
望の特性を有する細胞を物理的に分離する工程である、
２工程プロセスである。選択は、同定および物理的分離
が選択マーカーの発現によって同時に達成されるスクリ
ーニングの形態であり、いくつかの遺伝子の状況におい
て、これにより、マーカーを発現する細胞は生存でき、
そして他の細胞は死亡する（または逆）。スクリーニン
グマーカーとして、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダ
ーゼ、および緑色蛍光タンパク質が挙げられる。選択マ
ーカーとして、薬剤および毒素耐性遺伝子が挙げられ
る。自発的な選択が、自然の進化の過程で生じ得、そし
て生じるが、本方法において、選択は人によって行われ
る。
【０１１６】（方法論）核酸シャッフリングは、核酸フ
ラグメントまたはポリヌクレオチドのプールをインビト
ロまたはインビボで反復的に相同組換えする方法であ
る。関連核酸配列またはポリヌクレオチドの混合物を、
ランダムにまたは疑似ランダムにフラグメント化し、そ
して再組立して、組換え核酸分子またはポリヌクレオチ
ドのライブラリーまたは混合集団を生じる。
【０１１７】カセット変異誘発とは対照に、シャッフリ
ングおよび誤りがちなＰＣＲ（または他の変異増強法の
使用；化学的変異誘発、ミューテーター株など）のみ
が、（プライマー以外の配列情報なしで）配列のプール
を盲目的に変異させる。
【０１１８】反復的選択について誤りがちなＰＣＲより
も優れている本発明の変異誘発的シャッフリングの利点
は、抗体工学からの例を用いて最も良く説明され得る。
図１に、本明細書で記載されるＤＮＡシャッフリングの
概略図が示される。開始ライブラリーは、多様な起源の
関連配列（すなわち、天然ｍＲＮＡ由来の抗体）からな
り得るか、または単一抗体遺伝子の任意の型の変異誘発
（シャッフリングを包含する）に由来し得る。選択され
る相補性決定領域（「ＣＤＲ」）の集合は、一回目の親
和性選択後に得られる（図１）。図において、太いＣＤ
Ｒは、抗体分子に抗原に対して増加した親和性を与え
る。シャッフリングは、全てのＣＤＲ１と全てのＣＤＲ
２および全てのＣＤＲ３などとの自由な組み合わせの結
合を可能にする（図１）。
【０１１９】この方法は、逆鎖反応である点でＰＣＲと
は異なる。ＰＣＲでは、分子の数は指数関数的に増加す
る。しかし、シャッフリングにおいては、ポリメラーゼ
開始部位の数および分子の数は本質的に同じでままであ
る。分子をさらに伸長させるために希釈が使用される場
合、シャッフリングプロセスはより少ない分子を生成す
る逆鎖反応となる。
【０１２０】相同な領域で交差が生じるので、組換えは
主に同じ配列ファミリーのメンバー間で生じる。このこ
とは、ひどく不適合性である（例えば、同じ抗原の異な
るエピトープに対する）ＣＤＲの組み合わせを防止す
る。配列の多数のファミリーが同じ反応においてシャッ
フリングされ得ることが意図される。さらに、シャッフ
リングは相対的順位を保存するので、例えば、ＣＤＲ１
は、ＣＤＲ２の位置では見出されない。
【０１２１】まれにシャッフリング体は多数の最良の
（例えば、最高の親和性の）ＣＤＲを含み、そしてこれ
らのシャッフリング体はまれにそれらの優れた親和性に
基づいて選択され得る（図１）。
【０１２２】１００個の異なる選択された抗体配列のプ
ールに由来するＣＤＲは、１００6通りまで順序変えさ
れ得る。この多数の順序変えはＤＮＡ配列の単一のライ
ブラリーでは表し得ない。従って、ＤＮＡシャッフリン
グおよび選択の多数のサイクルが、配列の長さおよび所
望の配列の多様性に依存して必要とされ得ることが意図
される。
【０１２３】反対に、誤りがちなＰＣＲは全ての選択さ
れたＣＤＲを同じ関連配列中に保ち（図１）、生成する
変異曇りはよりずっと小さい。
【０１２４】本発明の方法において使用され得るテンプ
レートポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり
得る。それは、組換えまたは再組立される遺伝子または
ＤＮＡフラグメントの大きさに依存して種々の長さであ
り得る。好ましくは、テンプレートポリヌクレオチドは
５０ｂｐ〜５０ｋｂである。目的のタンパク質をコード
する核酸を含有する完全なベクターが、本発明の方法に
おいて使用され得ることが意図され、そして実際に首尾
良く使用されている。
【０１２５】テンプレートポリヌクレオチドは、ＰＣＲ
反応（米国特許第４，６８３，２０２号および第４，６
８３，１９５号）または他の増幅方法またはクローニン
グ方法を使用する増幅により得られ得る。しかし、フラ
グメント化する前にＰＣＲ産物から遊離プライマーを除
去すると、より効率的な結果が提供される。プライマー
を十分に除去し損なうと、低頻度の交差クローンが導か
れ得る。
【０１２６】テンプレートポリヌクレオチドはしばし
ば、２本鎖であるべきである。２本鎖核酸分子は、得ら
れる１本鎖核酸フラグメントの領域が互いに相補的で、
従って、ハイブリダイズして２本鎖分子を形成し得るこ
とを確実にすることが要求される。
【０１２７】テンプレートポリヌクレオチドに同一な領
域およびテンプレートポリヌクレオチドに非相同な領域
を有する１本鎖または２本鎖核酸フラグメントが、この
工程で、テンプレートポリヌクレオチドに添加され得る
ことが意図される。２つの異なるが関連したポリヌクレ
オチドテンプレートがこの工程で混合され得ることもま
た意図される。
【０１２８】２本鎖ポリヌクレオチドテンプレートおよ
び任意の添加される２本鎖フラグメントまたは１本鎖フ
ラグメントは、約５ｂｐ〜５ｋｂ以上のフラグメントに
ランダムに消化される。好ましくは、ランダムフラグメ
ントの大きさは約１０ｂｐ〜１０００ｂｐであり、より
好ましくはＤＮＡフラグメントの大きさは約２０ｂｐ〜
５００ｂｐである。
【０１２９】あるいは、多数のニックを有する２本鎖核
酸は、本発明の方法において使用され得ることもまた意
図される。ニックは、２本鎖核酸の１本鎖における切れ
目である。このようなニック間の距離は好ましくは５ｂ
ｐ〜５ｋｂであり、より好ましくは１０ｂｐ〜１０００
ｂｐの間である。
【０１３０】核酸フラグメントは多数の異なる方法によ
り消化され得る。核酸フラグメントはヌクレアーゼ（例
えば、ＤＮアーゼＩまたはＲＮアーゼ）を用いて消化さ
れ得る。核酸は、超音波処理方法によりまたは小穴を有
するチューブの通過によりランダムに剪断され得る。
【０１３１】核酸が１つ以上の制限酵素を用いて部分的
に消化され得、これにより特定の交差点が統計的に保持
され得ることもまた意図される。
【０１３２】任意の１つの特定核酸フラグメントの濃度
は、全核酸の１重量％より大きいことはなく、より好ま
しくは、任意の１つの特定核酸フラグメントの濃度は、
全核酸の０．１重量％より大きいことはない。
【０１３３】混合物中の異なる特定核酸フラグメントの
数は少なくとも約１００個であり、好ましくは少なくと
も５００個であり、そしてより好ましくは少なくとも約
１０００個である。
【０１３４】この工程で、１本鎖核酸フラグメントまた
は２本鎖核酸フラグメントは、合成または天然のいずれ
かで、核酸フラグメントの混合物の不均一性を増加する
ために、ランダムな２本鎖核酸フラグメントに添加され
得る。
【０１３５】２本鎖のランダムに切断された、またはニ
ックを入れられた核酸フラグメントの集団が、この工程
で混合され得るか、または組み合わされ得ることがまた
意図される。損傷したＤＮＡは、鎖侵襲、組換え部位の
形成に関連し得るニックの入った部位を介する組換えを
増強するために利用され得、ハイブリッド形成のためな
どの遊離の３’末端として作用し得る。
【０１３６】テンプレートポリヌクレオチドへの変異の
挿入が所望される場合、テンプレートポリヌクレオチド
に同一な領域およびテンプレートポリヌクレオチドに非
相同な領域を有する１本鎖核酸フラグメントまたは２本
鎖核酸ラグメントは、全核酸に比べて２０重量倍過剰
に、より好ましくは１本鎖核酸フラグメントが全核酸に
比べて１０重量倍過剰に添加され得る。
【０１３７】異なるが関連したテンプレートポリヌクレ
オチドの混合物が所望される場合、テンプレートのそれ
ぞれに由来する核酸フラグメントの集団が約１：１００
未満の比率で組み合わされ得、より好ましくは、比率は
約１：４０未満である。例えば、野生型ポリヌクレオチ
ドと変異ポリヌクレオチドの集団との戻し交配が、中立
変異（例えば、選択される表現型の特性において実質の
ない変化を生じる変異）を除去するために所望され得
る。このような例では、ランダム消化変異ポリヌクレオ
チドフラグメントに添加され得るランダム消化野生型ポ
リヌクレオチドフラグメントの比率は、約１：１から約
１００：１であり、そしてより好ましくは１：１から４
０：１である。
【０１３８】ランダムな長さの核酸フラグメントの混合
集団は、変性されて１本鎖核酸フラグメントを形成し、
次いで再びアニールされる。他の１本鎖核酸フラグメン
トに相同な領域を有するこれらの１本鎖核酸フラグメン
トのみが、再びアニールされる。
【０１３９】ランダムな長さの核酸フラグメントは、熱
を加えることにより変性される。当業者は完全に２本鎖
核酸を変性するために必要な条件を決定し得る。好まし
くは、温度は８０℃〜１００℃であり、より好ましくは
温度は９０℃〜９６℃である。核酸フラグメントを変性
するために使用され得る他の方法は、圧力（３６）およ
びｐＨを包含する。
【０１４０】核酸フラグメントは冷却することにより再
びアニールされ得る。好ましくは、温度は２０℃〜７５
℃であり、より好ましくは温度は４０℃〜６５℃であ
る。高頻度の交差が平均して４つだけの連続した相同な
塩基に基づいて必要とされる場合、組換えは低いアニー
ル温度を使用することにより増強され得るが、プロセス
はより困難になる。生じる再生の程度は、１本鎖核酸フ
ラグメントの集団間の相同性の程度に依存する。
【０１４１】再生はポリエチレングリコール（「ＰＥ
Ｇ」）または塩の添加により加速され得る。塩濃度は好
ましくは０ｍＭ〜４００ｍＭであり、より好ましくは塩
濃度は１０ｍＭ〜１００ｍＭである。塩はＫＣｌまたは
ＮａＣｌであり得る。ＰＥＧの濃度は好ましくは０％〜
２０％であり得、より好ましくは５％〜１０％であり得
る。所望される場合は、より高い塩濃度および／または
ＰＥＧが使用され得る。
【０１４２】次に、アニールされた核酸フラグメント
は、核酸ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ（すなわち、ｄＡ
ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）の存在下
でインキュベートされる。核酸ポリメラーゼは、Ｋｌｅ
ｎｏｗフラグメント、Ｔａｑポリメラーゼ、または当該
分野において知られる任意の他のＤＮＡポリメラーゼで
あり得る。
【０１４３】再組立に使用されるアプローチは、それで
もなお交差が生じるような最少の程度の相同性に依存す
る。同一である範囲が広い場合、Ｔａｑポリメラーゼ
が、４５℃〜６５℃の間のアニール温度で使用され得
る。同一である範囲が小さな場合、Ｋｌｅｎｏｗポリメ
ラーゼが、２０℃〜３０℃の間のアニール温度で使用さ
れ得る。当業者は達成される交差の数を増加するために
アニールの温度を変化させ得る。
【０１４４】ポリメラーゼはアニーリングの前、アニー
リングと同時に、またはアニーリングの後に、ランダム
核酸フラグメントに添加され得る。
【０１４５】ポリメラーゼの存在下での変性、再生、お
よびインキュベーションのサイクルは、本明細書では、
核酸のシャッフリングまたは再組立を意味し得る。この
サイクルは所望の回数繰り返される。好ましくは、サイ
クルは２回〜５０回繰り返され、より好ましくは配列は
１０回〜４０回繰り返される。用語「シャッフリング」
は、ＰＣＲ増幅または類似の増幅方法を含むがこれらに
限定されない、広範な反復組換えプロセスを含む；従っ
て、シャッフリングは、選択および／またはスクリーニ
ングを有して反復して（すなわち、１より多いサイクル
の配列組換えについて）使用される限りは、相同組換
え、部位特異的組換え、キメラ形成（例えば、Ｌｅｖｉ
ｃｈｋｉｎら、上記）などを含み得る。非決定論的な組
換え（例えば、一般的な相同組換え）が、決定論的な組
換え（例えば、組換え部位が概知および／または規定さ
れている場合、部位特異的組換え）と組み合わせて、ま
たはその代わりに使用され得る。
【０１４６】得られる核酸は、約５０ｂｐ〜約１００ｋ
ｂのより大きな２本鎖ポリヌクレオチドであり、好まし
くはより大きなポリヌクレオチドは５００ｂｐ〜５０ｋ
ｂである。
【０１４７】このより大きなポリヌクレオチドフラグメ
ントは、テンプレートポリヌクレオチドと同じ大きさを
有する核酸フラグメントの多くのコピーを直列して含有
し得る。次いで、この鎖状フラグメントは、テンプレー
トポリヌクレオチドの単一コピーに消化される。結果
は、テンプレートポリヌクレオチドとほぼ同じ大きさの
核酸フラグメントの集団である。同一な範囲および非相
同な範囲を有する１本鎖核酸フラグメントまたは２本鎖
核酸フラグメントが、シャッフリングの前にテンプレー
トポリヌクレオチドに添加された場合、集団は混合集団
である。あるいは、鎖状体が単量体化されることなく
（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション
などによって）直接導入され得る。大きな配列について
は、大きな配列が、実質的に類似する他の部分とともに
別々にシャッフルされたいくつかのさらなる部分に部分
されることが所望され得、次いで、生じたシャッフルさ
れたさらなる部分のプールが、代表的にはもとの順番で
連結され、次いで宿主細胞の形質転換などに使用され得
るシャッフルされた大きな配列のプールを生じる。
【０１４８】次いで、これらのフラグメントは適切なベ
クターにクローニングされ、そして細菌を形質転換する
ためにライゲーション混合液が使用される。
【０１４９】単一の核酸フラグメントは、鎖状体の消化
よりむしろ、ＰＣＲ（米国特許第４，６８３，１９５号
および４，６８３，２０２号）を含む種々の方法により
クローニングする前に単一の核酸フラグメントを増幅す
ることにより、より大きな鎖状核酸フラグメントから得
られ得ることが意図される。あるいは、鎖状体は単量体
化されることなく（例えば、エレクトロポレーション、
リポフェクションなど）によって直接導入され得る。
【０１５０】クローニングに使用されるベクターは、ベ
クターが所望の大きさのＤＮＡフラグメントを受容する
のであれば決定的なものではない。ＤＮＡフラグメント
の発現が所望される場合、クローニング媒体は、宿主細
胞におけるＤＮＡフラグメントの発現を可能にするよう
に、ＤＮＡフラグメントの挿入部位の隣に転写シグナル
および翻訳シグナルをさらに含有する。好ましいベクタ
ーは、プラスミドのｐＵＣ系列およびｐＢＲ系列を包含
する。
【０１５１】得られる細菌集団は、ランダムな変異を有
する多くの組換えＤＮＡフラグメントを含む。この混合
集団は、所望の組換え核酸フラグメントを同定するため
に試験され得る。選択の方法は所望のＤＮＡフラグメン
トに依存する。
【０１５２】例えば、リガンドへの結合効率が増加した
タンパク質をコードするＤＮＡフラグメントが所望され
る場合、集団またはライブラリーにおいてそれぞれのＤ
ＮＡフラグメントにより発現されるタンパク質は、当該
分野において公知の方法（すなわち、パンニング、親和
性クロマトグラフィー）により、リガンドに結合するそ
れらの能力について試験され得る。薬物耐性が増加して
いるタンパク質をコードするＤＮＡフラグメントが所望
される場合、集団またはライブラリーにおいてそれぞれ
のＤＮＡフラグメントにより発現されるタンパク質は、
宿主生物に薬物耐性を与えるそれらの能力について試験
され得る。当業者は、所望されるタンパク質がわかって
いれば、タンパク質に所望の特性を与えるＤＮＡフラグ
メントを同定するために、集団を容易に試験し得る。
【０１５３】当業者が、タンパク質のフラグメントがフ
ァージ表面上で融合タンパク質として発現されるような
ファージディスプレイシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，
Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ ＷＩ）を使用し得ることが意図
される。組換えＤＮＡ分子は、融合タンパク質（その一
部分は組換えＤＮＡ分子によりコードされる）の転写を
生じるような部位で、ファージＤＮＡへクローニングさ
れる。組換え核酸分子を含有するファージは、細胞内で
複製および転写を受ける。融合タンパク質のリーダー配
列は、融合タンパク質の輸送をファージ粒子の先端部へ
と導く。従って、組換えＤＮＡ分子により部分的にコー
ドされる融合タンパク質は、上記の方法による検出およ
び選択のために、ファージ粒子上にディスプレイされ
る。
【０１５４】核酸シャッフリングの多くのサイクルが、
第１の集団のサブ集団からの核酸フラグメントを用いて
実施され得ることがさらに意図され、このサブ集団は所
望の組換えタンパク質をコードするＤＮＡを含む。この
ようにして、さらに高い結合親和性または酵素活性を有
するタンパク質が達成され得る。
【０１５５】核酸シャッフリングの多くのサイクルが、
サブ集団から任意のサイレント変異を取り除くために、
野生型核酸フラグメントと一回目またはそれに続く回の
核酸シャッフリングに由来する核酸のサブ集団との混合
物を用いて実施され得ることがまた意図される。
【０１５６】核酸の任意の供給源が、精製された形態で
出発核酸として利用される。従って、プロセスはＤＮＡ
またはＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡを含む）を使用し
得、このＤＮＡまたはＲＮＡは、１本鎖または２本鎖で
あり得る。さらに、それぞれの片鎖を含むＤＮＡ−ＲＮ
Ａのハイブリッドが使用され得る。核酸配列は、変異さ
れる核酸配列の大きさに依存して種々の長さであり得
る。好ましくは、特定核酸配列は５０〜５００００塩基
対である。目的のタンパク質をコードする核酸を含有す
る完全なベクターが本発明の方法において使用され得る
ことが意図される。
【０１５７】核酸は任意の供給源、例えば、ｐＢＲ３２
２のようなプラスミドから、クローニングされたＤＮＡ
またはＲＮＡから、または任意の供給源（細菌、酵母、
ウイルスおよび植物または動物のような高等生物を含
む）に由来する天然のＤＮＡまたはＲＮＡから得られ得
る。ＤＮＡまたはＲＮＡは、血液または組織材料から抽
出され得る。テンプレートポリヌクレオチドは、ポリヌ
クレオチド連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４，６８
３，２０２号および４，６８３，１９５号）を使用する
増幅により得られ得る。あるいは、ポリヌクレオチド
は、細胞に存在するベクターに存在し得、そして十分な
核酸が、当該分野で公知の方法により細胞を培養し、そ
して細胞から核酸を抽出することにより得られ得る。
【０１５８】任意の特定核酸配列が、本プロセスにより
変異体の集団を生成するために使用され得る。特定核酸
配列の変異配列の小さな集団が存在することまたは本プ
ロセスの前に作製されることのみが必要とされる。
【０１５９】変異を有する特定核酸配列の初めの小さな
集団が、多くの異なる方法により作製され得る。変異は
誤りがちなＰＣＲにより作製され得る。誤りがちなＰＣ
Ｒは、長い配列にわたり、ランダムに低レベルで点変異
を導入するために、低忠実度の重合条件を使用する。あ
るいは、オリゴヌクレオチド指定的変異誘発により、変
異はテンプレートポリヌクレオチドに導入され得る。オ
リゴヌクレオチド指定的変異誘発の際に、ポリヌクレオ
チドの短い配列が、制限酵素消化を使用してポリヌクレ
オチドから除去され、そして種々の塩基が元の配列から
変化された合成オリゴヌクレオチドで置き換えられる。
ポリヌクレオチド配列はまた、化学変異誘発により変化
させられ得る。化学変異原は、例えば、重亜硫酸ナトリ
ウム、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、また
はギ酸を包含する。ヌクレオチド前駆体のアナログであ
る他の薬剤は、ニトロソグアニジン、５−ブロモウラシ
ル、２−アミノプリン、またはアクリジンを包含する。
一般的に、これらの薬剤はヌクレオチド前駆体の代わり
にＰＣＲ反応に添加され、それにより配列を変異させ
る。プロフラビン、アクリフラビン、キナクリンなどの
ような挿入剤もまた使用され得る。ポリヌクレオチド配
列のランダム変異誘発は、Ｘ線または紫外線光を用いる
照射によっても達成され得る。一般に、そのように変異
誘発されたプラスミドＤＮＡフラグメントまたはＤＮＡ
フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉへ導入され、そして変異
のプラスミドのプールまたはライブラリーとして増殖さ
せられる。
【０１６０】あるいは、特定核酸の小さな混合集団は、
天然において見出され得る。なぜならそれらが同じ遺伝
子の異なる対立遺伝子、または異なる関連種に由来する
同じ遺伝子（すなわち、同族遺伝子）からなり得るから
である。あるいは、特定核酸配列の小さな混合集団は、
１つの種（例えば、免疫グロブリン遺伝子）内に見出さ
れる関連ＤＮＡ配列であり得る。
【０１６１】一旦特定核酸配列の混合集団が生成された
ら、ポリヌクレオチドは、当業者に周知の技術を使用し
て、直接使用され得るかまたは適切なクローニングベク
ターに挿入され得る。
【０１６２】ベクターの選択はポリヌクレオチド配列の
大きさ、および本発明の方法において使用される宿主細
胞に依存する。本発明のテンプレートは、プラスミド、
ファージ、コスミド、ファージミド、ウイルス（例え
ば、レトロウイルス、パラインフルエンザウイルス、ヘ
ルペスウイルス、レオウイルス、パラミキソウイルスな
ど）、またはその選択部分（例えば、コートタンパク
質、スパイク糖タンパク質、キャプシドタンパク質）で
あり得る。例えば、変異される特定核酸配列がより大き
い場合、コスミド、ファージミド、ＹＡＣ、およびＢＡ
Ｃが好ましい。なぜなら、これらのベクターは大きな核
酸フラグメントを安定に増殖し得るからである。
【０１６３】特定核酸配列の混合集団がベクターにクロ
ーニングされる場合、それぞれのベクターを宿主細胞に
挿入し、そして宿主細胞にベクターを増殖させることに
より、特定核酸配列の混合集団はクローン的に（ｃｌｏ
ｎａｌｌｙ）増幅させられ得る。これはクローン増幅
（ｃｌｏｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）と呼ば
れる。なぜなら、核酸配列の絶対数は増加するが、変異
体の数は増加しないからである。
【０１６４】（平行ＰＣＲ）平行ＰＣＲにおいて、ＰＣ
Ｒ反応の多くの異なる反応が同じ容器内で平行して生
じ、１つの反応の産物は別の反応の産物をプライムす
る。ＰＣＲ産物が互いにプライムするので、平均的な産
物の大きさはＰＣＲサイクル数とともに増大する。
【０１６５】同時に複数のプライマーを用いることによ
って、５０ｋｂより大きい配列が増幅され得る。全ての
遺伝子および全てのプラスミドが、平行ＰＣＲによって
合成オリゴヌクレオチドから一本のチューブ内で組み立
てられ得る。配列は、ランダムなフラグメント化および
相互のプライミングによるフラグメントの再組立によっ
て、種々のレベルでランダムに変異し得る。部位特異的
変異は、テンプレートのランダムなフラグメント化、続
く変異誘発性オリゴヌクレオチドの存在下でのフラグメ
ントの再組立によって長い配列へ導入され得る。平行Ｐ
ＣＲの部分的に有用な適用は、有性ＰＣＲと呼ばれる。
【０１６６】有性ＰＣＲ（ＤＮＡシャッフリングとも呼
ばれる）において、平行ＰＣＲはＤＮＡ配列のプール上
でインビトロの組換えを行うために使用される。関連す
るが同一ではないＤＮＡ配列の混合物（代表的にはＰＣ
Ｒ産物、制限フラグメント、または全プラスミド）が、
例えばＤＮＡｓｅ１処理によってランダムにフラグメン
ト化される。次いで、これらのランダムなフラグメント
は平行ＰＣＲによって再度組立てられる。ランダムなフ
ラグメントおよびそれらのＰＣＲ産物が互いにプライム
するので、平均のフラグメントの大きさはＰＣＲサイク
ル数にともなって増大する。組換えまたは乗換え（ｃｒ
ｏｓｓｏｖｅｒ）は、１つのテンプレート由来のＤＮＡ
フラグメントが関連するが異なるテンプレートの相同部
位上でプライムする場合のような、テンプレートの交換
によって生じる。例えば、有性ＰＣＲは異なる種由来の
遺伝子のキメラのライブラリー（「ズー（ｚｏｏ）ライ
ブラリー」）を構築するために使用され得る。有性ＰＣ
Ｒは、ＤＮＡ配列のインビトロの進化のために有用であ
る。有性ＰＣＲによって得られる新しい変異体組合わせ
のライブラリーが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、また
は低分子レベルで最適な組換え配列について選択され
る。組換え、選択、および増幅のこのプロセスは、所望
の特性または機能を得るために必要なだけ多くのサイク
ル数で繰り返される。
【０１６７】平行ＰＣＲのほとんどの改変はプライマー
を使用しない。ＤＮＡフラグメント（合成、ランダム消
化によって得られた、またはプライマーを用いるＰＣＲ
によるに関わらず）はテンプレートならびにプライマー
として役立つ。再組立反応におけるそれぞれの異なる末
端配列濃度が非常に低いので、プライマーのダイマーの
形成は観察されず、そして誤りがちなＰＣＲが起こる場
合、それは正しくアニーリングされた産物と同じ速度で
のみ成長し得る。平行ＰＣＲは、アニールした対の半分
のみが伸長可能な末端突出を有し、そして３’末端の濃
度が低いので、多くのＰＣＲサイクルを必要とする。
【０１６８】（有用性）本発明のＤＮＡシャッフリング
方法は、未知の配列のプールにおいて盲目的に実施され
得る。再組立の混合オリゴヌクレオチド（再組立される
配列に相同である末端を有する）に添加することによ
り、任意の配列混合物が任意の特定位置で別の配列混合
物中に取り込まれ得る。従って、合成オリゴヌクレオチ
ド、ＰＣＲフラグメント、または全遺伝子さえも混合物
が、規定の位置で別の配列ライブラリーへ混合され得る
ことが意図される。１つの配列（混合物）の挿入は、テ
ンプレートの別の部分での配列の挿入から独立してい
る。従って、組換えの程度、要求される相同性の程度、
およびライブラリーの多様性の程度は、再組立されるＤ
ＮＡの長さに従って独立してまたは同時に変化され得
る。
【０１６９】２つの遺伝子を混合するこのアプローチ
は、マウスハイブリドーマ由来の抗体をヒト化するため
に有用であり得る。２つの遺伝子を混合するアプローチ
または変異配列を遺伝子へ挿入するアプローチは、任意
の治療学的に使用されるタンパク質（例えば、インター
ロイキンＩ、抗体、ｔＰＡ、成長ホルモンなど）のため
に有用であり得る。このアプローチはまた、任意の核酸
（例えば、プロモーター、またはイントロン、または遺
伝子の３’非翻訳領域または５’非翻訳領域）におい
て、発現を増加するためにまたはタンパク質の発現特異
性を変えるためにも有用であり得る。このアプローチは
また、リボザイムまたはアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）
を変異するためにもまた使用され得る。
【０１７０】シャッフリングは、多様な領域を分離する
相同な領域の存在を必要とする。シャッフルされる配列
が実質的に同一ではない場合、イントロンに基づくシャ
ッフリングおよび／または部位特異的組換えを使用する
ことが代表的に好ましい。骨格様タンパク質構造は、特
にシャッフリングに適し得る。保存される骨格は、自己
会合により全体の折り畳みを決定するが、一方、特異的
結合を媒介する相対的に制限されないループをディスプ
レイする。このような骨格の例は、免疫グロブリンβバ
レル、および４へリックス束である（２４）。このシャ
ッフリングは、結合について変異配列の種々の組み合わ
せで骨格様タンパク質を作製するために、使用され得
る。
【０１７１】（インビトロにおけるシャッフリング）同
等のいくつかの標準的な遺伝子交配もまた、インビトロ
におけるシャッフリングにより実施され得る。例えば、
「分子戻し交配」は、目的の変異について選択しなが
ら、変異体の核酸と野生型核酸との混合を反復すること
により実施され得る。従来の育種でのように、このアプ
ローチは、異なる供給源に由来する表現型を選択のバッ
クグランドと組み合わせるために使用され得る。これ
は、例えば、選択されない特徴（すなわち、免疫原性）
に影響する中立変異を除去するために有用である。従っ
て、このアプローチは、タンパク質におけるどの変異が
増強される生物学的活性に関与するか関与しないかを決
定するために有用であり得、これは、誤りがちな変異誘
発方法またはカセット変異誘発方法によっては達成され
得ない利点である。
【０１７２】大きな機能的遺伝子は、小さなランダムフ
ラグメントの混合物から正確に組立され得る。この反応
は、化石の高度にフラグメント化されたＤＮＡから遺伝
子を再組立するために有用であり得る（２５）。さら
に、化石に由来するランダムな核酸フラグメントは、関
連種に由来する類似遺伝子からの核酸フラグメントとと
もに組み合わせられ得る。
【０１７３】本発明の方法は、種々の研究および診断的
適用に必要とされるように、単一の細胞から全ゲノム
を、インビトロにおいて増幅するために使用し得ること
が意図される。ＰＣＲによるＤＮＡ増幅は、実際、約４
０ｋｂの長さに制限される。ＰＣＲによりＥ．ｃｏｌｉ
（５，０００ｋｂ）のような全ゲノムを増幅すること
は、１２５個の４０ｋｂのフラグメントを生じる約２５
０のプライマーを必要とする。このアプローチは、十分
な配列データが利用できないために実用的ではない。一
方で、ＤＮアーゼＩを用いるゲノムのランダムな消化、
それに続く小フラグメントのゲル精製は、多数の可能な
プライマーを提供する。ＰＣＲ反応においてこのランダ
ム小フラグメントのこの混合物をプライマーとして単独
でまたはテンプレートとしての全ゲノムと共に使用する
と、ゲノムの多くのコピーを含む単一の鎖状体の理論上
の終点とともに逆鎖反応が生じるはずである（希釈およ
びさらなるＰＣＲと想定される）。
【０１７４】ランダムフラグメントのみが使用される場
合、コピー数において１００倍の増幅および５０ｋｂよ
り大きい平均フラグメントサイズが得られ得る（実施例
２を参照のこと）。より大きな鎖状体が、多くの小フラ
グメントの重複により生成されると考えられる。合成プ
ライマーを使用して得られる特定ＰＣＲ産物の質は、増
幅されないＤＮＡから得られる産物と区別できない。こ
のアプローチはゲノムのマッピングに有用であると期待
される。
【０１７５】シャッフルされるポリヌクレオチドは、実
施者の判断で、ランダムにまたは非ランダムにフラグメ
ント化され得る。
【０１７６】（インビボにおけるシャッフリング）イン
ビボでのシャッフリングの１つの実施態様において、特
定核酸配列の混合された集団は、各宿主細胞において少
なくとも２つの異なる核酸配列が存在する条件下で、細
菌細胞（例えば、Ａｒｃｈｅａｅｂａｃｔｅｒｉａ）ま
たは真核生物細胞へ導入される。フラグメントは種々の
異なる方法により、宿主細胞へ導入され得る。宿主細胞
は、当業者に公知の方法（例えば、塩化カルシウムでの
処理）を使用してフラグメントで形質転換され得る。フ
ラグメントがファージゲノムに挿入される場合、宿主細
胞は特定核酸配列を有する組換えファージゲノムを用い
てトランスフェクトされ得る。あるいは、核酸配列は、
エレクトロポレーション、本来の能力、形質導入、トラ
ンスフェクション、リポフェクション、バイオリスティ
ック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）、接合など、または細胞へ
ポリヌクレオチド配列を導入する他の適切な方法を用い
て、宿主細胞へ導入され得る。
【０１７７】一般的に、この実施態様において、特定核
酸配列は、宿主細胞において配列を安定に複製し得るベ
クター中に存在する。さらに、ベクターを有する宿主細
胞が選択またはスクリーニングされ得るように、ベクタ
ーがマーカー遺伝子をコードすることが意図される。こ
のことは、変異特定核酸配列が、宿主細胞へ導入された
後に回収され得ることを確実にする。しかし、特定核酸
配列の混合集団全体がベクター配列上に存在する必要が
ないことが意図される。むしろ、宿主細胞へのフラグメ
ントの導入後に、各宿主細胞がそこに存在する関連配列
核酸配列の少なくとも１つを有する２つのベクター種を
含有することを確実にするためには、十分な数だけの配
列がベクターにクローニングされればよい。特定核酸配
列の集団のサブセットをベクターへクローニングさせる
よりも、このサブセットは宿主細胞にすでに安定に組み
込まれているかもしれないこともまた、意図される。
【０１７８】同一の領域を有する２つのフラグメントが
宿主細胞へ挿入される場合、２つのフラグメント間に相
同組換えが生じることが見出されている。２つの変異し
た特定の核酸配列間でのこのような組換えは、変異体の
全てまたはほとんどの、実質的に全ての組合せ組換え体
の産生を生じる（ライブラリーの大きさ、および伝達効
率などによって制限される）。
【０１７９】変異特定核酸配列のいくつかが直鎖上の核
酸分子上に存在する場合、組換えの頻度が増加すること
もまた見出されている。従って、好ましい実施態様で
は、特定核酸配列のいくつかが直鎖状核酸フラグメント
上に存在する。１つの実施態様において、核酸分子は、
非相同配列を含んでいるかもしれないし含んでいないか
もしれない１本鎖ファージゲノムのような、１本鎖また
は実質的に１本鎖である。Ｍ１３ファージは、適切なｓ
ｓＤＮＡテンプレートの一例であり、そしてＭ１３は、
Ｍ１３ウイルスが原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）内でシャッフルされ得、次いで哺乳動物細胞へＤＮ
Ａを転移するために使用され得る利点を有する。
【０１８０】形質転換の後に、宿主細胞形質転換体は、
所望の特質を有する変異特定核酸配列を含有する宿主細
胞形質転換体を同定するための選択下におかれる。例え
ば、特定の薬物に対する耐性の増加が所望される場合、
形質転換された宿主細胞は、特定の薬物の濃度の増加を
受け得、そして薬物耐性を増加させ得る変異タンパク質
を産生する形質転換体が、選択され得る。特定のタンパ
ク質がレセプターに結合する能力の増強が所望される場
合、タンパク質の発現は形質転換体から誘導され得、そ
して得られるタンパク質は当業者に公知の方法によるリ
ガンド結合アッセイにおいてアッセイされ、リガンドに
対する結合の増強を示す変異集団のサブセットを同定す
る。あるいは、タンパク質は、適切なプロセシングを確
実にするように、別のシステムにおいて発現され得る。
【０１８１】一旦、所望の特徴を有する第１の組換え特
定核酸配列（娘配列）のサブセットが同定されると、次
いで、それらは２回目の組換えに供される。
【０１８２】組換えの２回目のサイクルにおいて、組換
え特定核酸配列は、元の変異特定核酸配列（親配列）と
混合され得、そして上記のようにサイクルが反復され得
る。この方法では、特性が増強されているかまたは特性
が増強されているタンパク質をコードする第２の組換え
特定核酸配列のセットが同定され得る。このサイクルは
所望される多数回反復され得る。
【０１８３】第２のまたはそれに続く組換えサイクルに
おいて、戻し交配が実施され得ることもまた意図され
る。分子の戻し交配は、所望の特定核酸配列を多数の野
生型配列と混合することにより実施され得、それにより
少なくとも１つの野生型核酸配列および変異核酸配列
が、形質転換後に、同じ宿主細胞中に存在する。野生型
特定核酸配列を用いる組換えは、免疫原性のような選択
されない特徴に影響し得るが、選択される特徴には影響
し得ないそれらの中立変異または寄与の弱い変異を除去
する。
【０１８４】本発明の別の実施態様において、一回目の
間、宿主細胞へ導入する前に、特定核酸配列のサブセッ
トがフラグメント化され得ることが意図される。フラグ
メントの大きさは、他の配列との相同組換えのために、
他の配列に同一ないくつかの領域を含むのに十分な大き
さでなくてはならない。これらのフラグメント、ｓｓＤ
ＮＡ、またはｄｓＤＮＡは、インビトロでＲｅｃＡでコ
ートされて、宿主ＤＮＡへのハイブリダイゼーションお
よび／または組み込みを促進し得る。フラグメントの大
きさは０．０３ｋｂ〜１００ｋｂの範囲であり、より好
ましくは０．２ｋｂ〜１０ｋｂの範囲である。それに次
の回において、前の回で選択された配列以外の全ての特
定核酸配列は、宿主細胞へ導入する前にフラグメントに
切断され得ることもまた意図される。「切断」は、ヌク
レアーゼ消化、ＰＣＲ増幅（部分的伸長、もしくはスタ
ッタリングによる）、または親配列（単数または複数）
の部分的な長さのポリヌクレオチドを生成するための他
の適切な手段により得る。
【０１８５】配列のフラグメント化は、当該分野におい
て公知の種々の方法により達成され得る。配列は、核酸
配列中で、ランダムにフラグメント化され得るか、また
は特定部位でフラグメント化され得る。ランダムフラグ
メントは、核酸の切断により、または核酸を過酷な物理
的処理（例えば、剪断または放射線照射）または過酷な
化学剤（例えば、遊離ラジカル；金属イオン；脱プリン
および切断のための酸処理による）に核酸を曝露するこ
とにより得られ得る。ＤＮＡの場合、ＤＮａｓｅもしく
は同様のヌクレアーゼを使用することによって、または
本明細書中に考察される他の手段によってもまた、ラン
ダムフラグメントが得られ得る。配列は、制限酵素の使
用により、特定部位で切断され得る。フラグメント化配
列は、１本鎖または２本鎖であり得る。配列がもともと
１本鎖である場合、宿主細胞に挿入する前に、それらは
熱、化学物質、または酵素で変性され得る。核酸の鎖を
分離するのに適切な反応条件は、当該分野において周知
である。さらに、部分的なＰＣＲ伸長、ＰＣＲスタッタ
リング、および親配列の部分的な長さのコピーを産生す
るための他の関連する方法が、「フラグメント化」を効
果的にするために（例えば、異なる親配列由来のセグメ
ントを含むハイブリッド産物を得るために）使用され得
る。
【０１８６】このプロセスの工程は、無限に反復され
得、達成され得る可能な変異体の数によってのみ制限さ
れる。一定の数のサイクル後、全ての可能な変異体が達
成され、そしてさらなるサイクルは余分になる。
【０１８７】１つの実施態様において、同じ変異したテ
ンプレート核酸が繰り返し組換えされて、そして得られ
る組換え体が所望の特徴について選択される。
【０１８８】従って、変異したテンプレート核酸の初め
のプールまたは集団は、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌にお
いて複製可能なベクターへクローニングされる。Ｅ．ｃ
ｏｌｉにおいて自律複製し得るかまたは宿主染色体に組
み込まれ得るかぎり、特定のベクターは必須ではない。
好ましい実施態様において、ベクターは、ベクターに連
結される変異特定核酸によりコードされる任意のタンパ
ク質の発現および生成を可能にするように設計される。
ベクターが選択マーカーをコードする遺伝子を含有する
こともまた、好ましい。
【０１８９】変異核酸配列のプールを含有するベクター
の集団は、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞へ導入される。ベクタ
ーの核酸配列は、形質転換、トランスフェクション、ま
たはファージの場合は感染により導入され得る。細菌を
形質転換するために使用されるベクターの濃度は、多く
のベクターが各細胞へ導入され得る程度である。一旦細
胞中に存在すると、相同組換えの効率は、相同組換えが
種々のベクター間で生じる程度である。このことによ
り、元の親変異配列と異なる変異の組み合わせを有する
変異体（娘）が生成する。
【０１９０】次いで、宿主細胞は代表的にはクローン的
に複製されそして、ベクター上に存在するマーカー遺伝
子について選択される。プラスミドを有するこれらの細
胞のみが、選択下で増殖する。
【０１９１】次いで、ベクターを含む宿主細胞は、好ま
しい変異の存在について試験される。このような試験
は、例えば、選択される遺伝子が改善される薬物耐性遺
伝子である場合、細胞を選択圧下におくことからなり得
る。ベクターが変異核酸配列によりコードされるタンパ
ク質の発現を可能にする場合、このような選択により、
このようにコードされるタンパク質の発現、タンパク質
の単離、および、例えば、効率の増大を伴って目的のリ
ガンドに結合するかどうかを決定するためのタンパク質
の試験を可能にすることを包含し得る。
【０１９２】一旦、所望の特徴を与える娘変異核酸配列
の特定のプールが同定されると、核酸は、すでにベクタ
ーに連結されているかまたはベクターから分離されてい
るかのいずれかで単離される。次いで、この核酸は、そ
れ自身と、または類似の選択されたプールと組み換えら
れ、そしてサイクルが繰り返される；必要に応じて、親
配列は、他の選択される娘種の代わりまたはそれに加え
て、組換えの次の回に使用され得る。
【０１９３】本方法により、所望の特性が増強された核
酸配列が選択され得ることが示されている。
【０１９４】別の実施態様において、変異体の第一世代
は細胞内に保持され、そして変異配列の第一世代が再び
細胞に添加される。従って、実施態様Ｉの一回目のサイ
クルは上記のように実施される。しかし、娘核酸配列が
同定された後、これらの配列を含む宿主細胞が保持され
る。
【０１９５】娘の変異特定核酸集団は、フラグメントと
してまたは同じベクターへクローニングされるかのいず
れかで、既に娘核酸を含む宿主細胞へ導入される。組換
えを細胞において生じさせ、次世代の組換え体、または
孫娘が上記の方法により選択される。
【０１９６】このサイクルは、所望の特徴を有する核酸
またはペプチドが得られるまで、多数回反復され得る。
続くサイクルにおいて、好ましい変異体に添加される変
異配列の集団が、親変異体または任意の次の世代から生
じ得ることが意図される。
【０１９７】別の実施態様において、本発明は、任意の
中立変異を除去するために、得られる組換え特定核酸
（１種または数種のプール）の「分子」戻し交配を実施
する方法を提供する。中立変異は、核酸またはペプチド
に所望の特性を与えない変異である。しかし、このよう
な変異は、核酸またはペプチドに所望でない特徴を与え
るかもしれない。従って、このような中立変異を除去す
ることが望ましい。本発明の方法は、そのように行う手
段を提供する。
【０１９８】この実施態様において、所望の特徴を有す
る変異体核酸が実施態様の方法により得られた後、核
酸、核酸を有するベクター、またはベクターおよび核酸
を含有する宿主細胞、組織、もしくは個々の器官が単離
される。
【０１９９】次いで、核酸またはベクターは、かなり過
剰な野生型核酸とともに宿主細胞へ導入される。変異体
の核酸および野生型配列の核酸を、組換えに供する。得
られる組換え体は、変異体核酸と同じ選択下に置かれ
る。所望の特徴を保持している組換え体のみが選択され
る。所望の特徴を与えない任意のサイレント変異は、野
生型ＤＮＡとの組換えによって失われる。このサイクル
は、全てのサイレント変異が除去されるまで、多数回反
復され得る。
【０２００】従って、本発明の方法は、分子戻し交配に
おいて、不必要な変異、寄与の弱い変異、またはサイレ
ント変異を除去するために使用され得る。
【０２０１】（有用性）本発明のインビボ組換え方法
は、特定核酸フラグメントもしくは配列の未知の変異体
または対立遺伝子のプール、または反復組換えに適切
な、多様であるが関連する配列もしくは１つ以上の組換
え配列（例えば、部位特異的組換え部位、相同組換えの
ために実質的な同一性を有する配列相同性の局在セグメ
ント、相同組換え「ホットスポット」配列、制限部位な
ど）を共有する配列のファミリーについて、盲目的に実
施され得る。しかし、特定核酸フラグメントの実際のＤ
ＮＡまたはＲＮＡ配列を知る必要はない。
【０２０２】遺伝子の混合集団内で組換えを使用するア
プローチは、任意の有用なタンパク質（例えば、インタ
ーロイキンＩ、抗体、ｔＰＡ、成長ホルモンなど）を生
成するために有用であり得る。本アプローチは、特異性
または活性が変えられているタンパク質を生成するため
に使用され得る。本アプローチはまた、変異体核酸配列
（例えば、プロモーター領域、イントロン、エキソン、
エンハンサー配列、遺伝子の３’非翻訳領域または５’
非翻訳領域）を生成するために有用であり得る。従っ
て、本アプローチは、発現率が増加されている遺伝子を
生成するために使用され得る。本アプローチはまた、反
復性ＤＮＡ配列の研究においても有用であり得る。最後
に、本アプローチは、リボザイムまたはアプタマーを変
異させるのに有用であり得る。 タンパク質における多
様性の領域を分離する骨格様領域は、本発明の方法に特
に適切であり得る。保存された骨格は、自己結合により
全体の折り畳みを決定するが、一方、特異的結合を媒介
する比較的制限されていないループをディスプレイす
る。このような骨格の例は、免疫グロブリンβバレル、
および４へリックス束である。本発明の方法は、結合に
ついて変異配列の種々の組み合わせで骨格様タンパク質
を作製するために使用され得る。
【０２０３】いくつかの標準的な遺伝交配の等価物がま
た、本発明の方法により実施され得る。例えば、「分
子」戻し交配は、目的の変異を選択しながら、変異体の
核酸を野生型の核酸と繰り返し混合することにより実施
され得る。従来の育種におけるように、本アプローチは
異なる供給源に由来する表現型をバックグランドの選択
へ組み合わせるために使用され得る。本アプローチで
は、例えば、選択されない特徴（例えば、免疫原性）に
影響する中立変異を除去するために有用である。従っ
て、本アプローチは、タンパク質のどの変異が生物学的
活性の増強に関与するか、およびどの変異が関与しない
かを決定するために有用であり得る。
【０２０４】（ペプチドディスプレイ法）本方法は、開
示された方法のいずれかによるインビトロおよび／また
はインビボ組換えにより、および任意の組み合わせで、
ペプチドディスプレイ法により選択されるポリヌクレオ
チド配列をシャッフリングするために使用され得、ここ
では、会合されたポリヌクレオチドは、表現型について
（例えば、予め決定されたレセプター（リガンド）に対
する親和性について）スクリーニングされるディスプレ
イされたペプチドをコードする。
【０２０５】生物薬剤の開発および分子生物学の増々重
要な局面は、生体高分子と相互作用するペプチドまたは
ペプチド疑似体のペプチド構造（アミノ酸一次配列を包
含する）の同定である。所望の構造または所望の機能的
特性（例えば、予め決定された生体高分子（例えば、レ
セプター）に対する結合）を有するペプチドを同定する
１つの方法は、ペプチドのアミノ酸配列により与えられ
る所望の構造または所望の機能的特性を有する個々のラ
イブラリーメンバーについて、大規模なライブラリーま
たはペプチドをスクリーニングすることを包含する。
【０２０６】ペプチドライブラリーを生成する直接的な
化学合成方法に加えて、いくつかのＤＮＡ組換え方法も
また報告されている。１つの型は、バクテリオファージ
粒子または細胞表面上のペプチド配列、抗体、または他
のタンパク質のディスプレイを包含する。一般に、これ
らの方法において、それぞれのバクテリオファージ粒子
または細胞は、天然のバクテリオファージまたは細胞の
タンパク質配列に加えて、ディスプレイされたペプチド
の単一種をディスプレイする個々のライブラリーメンバ
ーとして役立つ。各バクテリオファージまたは細胞は、
特定のディスプレイされたペプチドの配列をコードする
ヌクレオチド配列情報を含有する；従って、ディスプレ
イされたペプチド配列は、単離されたライブラリーメン
バーのヌクレオチド配列決定により確かめられ得る。
【０２０７】周知のペプチドディスプレイ方法は、フィ
ラメント様バクテリオファージの表面上でのペプチド配
列（代表的には、バクテリオファージコートタンパク質
との融合物として）の提示を包含する。バクテリオファ
ージライブラリーは固定した予め決定された高分子また
は小分子（例えば、レセプター）とともにインキュベー
トされ得、それにより固定高分子に結合するペプチド配
列を提示するバクテリオファージ粒子が、予め決定され
た高分子に結合するペプチド配列を提示しないバクテリ
オファージ粒子と差別的に区分され得る。次いで、固定
高分子に結合するバクテリオファージ粒子（すなわち、
ライブラリーメンバー）は回収され、そして次の回の親
和性増強およびファージ複製のために、複製されて、選
択されたバクテリオファージサブ集団を増幅する。数回
の親和性増強およびファージ複製の後、このように選択
されたバクテリオファージライブラリーメンバーは単離
され、そしてディスプレイされたペプチド配列をコード
するヌクレオチド配列が決定され、これにより予め決定
された高分子（例えば、レセプター）に結合するペプチ
ドの配列（単数または複数）が同定される。このような
方法はＰＣＴ特許公開第９１／１７２７１号、同９１／
１８９８０号、および同９１／１９８１８号、ならびに
９３／０８２７８号においてさらに記載されている。
【０２０８】後者のＰＣＴ公開は、ペプチドリガンドの
ディスプレイのための組換えＤＮＡ方法を記載してい
る。この方法は、融合タンパク質のライブラリーの生成
を包含するが、この融合タンパク質の各々は、予め決定
された高分子に結合する可能性を利用し得る第１のポリ
ペプチド部分（代表的には可変配列を含む）、およびＤ
ＮＡに結合する第２のポリペプチド部分（例えば、個々
の融合タンパク質をコードするＤＮＡベクター）で構成
されている。形質転換された宿主細胞が融合タンパク質
の発現を可能にする条件下で培養される場合、融合タン
パク質はそれをコードするＤＮＡベクターに結合する。
宿主細胞の溶解の際に、融合タンパク質／ベクターＤＮ
Ａ複合体は、バクテリオファージ粒子がファージに基づ
くディスプレイシステムにおいてスクリーニングされる
のとほぼ同様にして、予め決定された高分子に対してス
クリーニングされ得、選択された融合タンパク質／ベク
ターＤＮＡ複合体におけるＤＮＡベクターの複製および
配列決定が、選択されたライブラリーペプチド配列（単
数または複数）の同定のための基礎として役立つ。
【０２０９】ペプチドおよび同様のポリマーのライブラ
リーを生成する他のシステムは、組換え方法およびイン
ビトロ化学合成方法の両方の局面を有する。これらのハ
イブリッド方法において、無細胞酵素機構がライブラリ
ーメンバー（すなわち、ペプチドまたはポリヌクレオチ
ド）のインビトロ合成を達成するために使用される。１
つの型の方法において、予め決定されたタンパク質また
は予め決定された色素分子に結合する能力を有するＲＮ
Ａ分子が、選択およびＰＣＲ増幅を交互に行うことによ
り選択された（ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ （１９９
０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：５０５；Ｅｌｌｉｎｇ
ｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ （１９９０） Ｎａｔｕ
ｒｅ ３４６：８１８）。同様の技術が、予め決定され
たヒト転写因子を結合するＤＮＡ配列を同定するために
使用された（ＴｈｉｅｓｅｎおよびＢａｃｈ （１９９
０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８：
３２０３；ＢｅａｕｄｒｙおよびＪｏｙｃｅ （１９９
２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７；６３５；ＰＣＴ特許公
開第９２／０５２５８号および第９２／１４８４３
号）。同様の様式において、インビトロ翻訳の技術が目
的のタンパク質を合成するために使用され、そしてペプ
チドの大規模なライブラリーを生成するための方法とし
て提案されてきた。一般に安定化されたポリソーム複合
体を含有するインビトロ翻訳に依存するこれらの方法
は、ＰＣＴ特許公開第８８／０８４５３号、第９０／０
５７８５号、第９０／０７００３号、第９１／０２０７
６号、９１／０５０５８号、および９２／０２５３６号
にさらに記載されている。出願人らは、ライブラリーメ
ンバーが、ＤＮＡ結合活性を有する第１のポリペプチド
部分およびライブラリーメンバーの独特のペプチド配列
を有する第２のポリペプチド部分を有する、融合タンパ
ク質を含む方法を記載する；このような方法は、無細胞
インビトロ選択形式における使用に、特に適切である。
【０２１０】この方法の改変は、イントロンに基づく組
換えによって行われる反復配列組換えである。ここで、
組換えられる配列はエキソンとして（例えば、天然に存
在するかまたは人工的であるかに関わらず、エキソンの
形態で）存在し、これは配列同一性をほとんど共有しな
いかまたは共有せず、そしてこれは、イントロン間の相
同組換えを支持するに十分な配列同一性を共有する１つ
以上のイントロン（これは天然に存在するイントロン様
配列であり得るか、またはそうでなくても良い）によっ
て分けられている。例えば、限定されないが、ポリヌク
レオチドの集団は、各ライブラリーのメンバーが、イン
トロンの第一のセットを介してエキソンの第２のセット
（これは、イントロンの第２のセットを介してエキソン
の第３のセットのコピーの１つ以上に連結されている）
のコピーの１つ以上に連結されている、エキソンの第１
のセットのコピーの１つ以上を有するライブラリーのメ
ンバーを含む。エキソンの第１のセットの各メンバー
は、互いに、またはエキソンの第２もしくは第３のセッ
トのメンバーと実質的配列同一性をほとんど共有しない
か、または共有しなくてもよい。同様に、エキソンの第
２のセットの各メンバーは、互いに、またはエキソンの
第１もしくは第３のセットのメンバーと実質的に配列同
一性をほとんど共有しないか、または共有しなくてもよ
い。同様に、エキソンの第３のセットの各メンバーは、
互いに、またはエキソンの第１もしくは第２のセットと
実質的に配列同一性をほとんど共有しないか、または共
有しなくてもよい。イントロンの各セット（第１、第
２、第３など）の各メンバーは、同一のイントロンのセ
ットのメンバー間での組換え（制限部位媒介性組換えを
含む、相同組換えまたは部位特異的組換え）を支持する
ために、セットの他のメンバーと十分な配列同一性を共
有するが、代表的には、他のイントロンのセット（例え
ば、第２または第３のセット）のメンバーとは共有せ
ず、その結果、ライブラリーのメンバーのイントロンの
セット内組換えが生じ、そして組み換えられたライブラ
リーのメンバーのプールが生成され、ここで、エキソン
の第１のセット、エキソンの第２のセット、およびエキ
ソンの第３のセットが互いに効果的にシャッフルされ
る。
【０２１１】ディスプレイされたペプチド配列は、代表
的には３〜５０００アミノ酸以上、頻繁には５〜１００
アミノ酸、そしてしばしば約８〜１５アミノ酸の種々の
長さであり得る。ライブラリーは、ディスプレイされた
ペプチド配列の種々の長さを有するライブラリーメンバ
ーを含有し得るか、またはディスプレイされたペプチド
配列の固定した長さを有するライブラリーメンバーを含
有し得る。ディスプレイされたペプチド配列（１つまた
は複数）の１部分または全ては、ランダムな配列、疑似
ランダムな配列、規定の核セットの配列、固定した配列
などであり得る。本ディスプレイ方法は、ポリソーム上
の新生ｓｃＦｖまたはファージ上に表示されたｓｃＦｖ
のような単鎖抗体のインビトロおよびインビボにおける
ディスプレイの方法を包含し、広い多様性の可変領域配
列および結合特異性を有するｓｃＦｖライブラリーを、
大規模なスケールでのスクリーニングを可能にする。
【０２１２】本発明はまた、ランダムな配列、疑似ラン
ダムな配列、および規定の配列のフレームワークペプチ
ドライブラリーを提供し、そして目的のレセプター分子
またはエピトープ、またはペプチドを改変する遺伝子産
物、またはＲＮＡに所望の様式で結合する有用な化合物
（例えば、単鎖抗体を含むペプチド）を同定するため
に、それらのライブラリーを生成しそしてスクリーニン
グする方法を提供する。ランダムな配列、疑似ランダム
な配列、および規定の配列のフレームワークペプチド
は、ディスプレイされたペプチド、またはディスプレイ
されたペプチドが合成されたポリヌクレオチドのテンプ
レートに付着したディスプレイされた単鎖抗体を含むペ
プチドライブラリーメンバーのライブラリーから生成さ
れる。付着の様式は、選択された本発明の特定の実施態
様に従って変化し得、そしてファージ粒子におけるキャ
プシドの包みこみ、または細胞における取り込みを包含
し得る。
【０２１３】親和性増強方法は、ペプチドおよび単鎖抗
体のかなり大規模なライブラリーがスクリーニングさ
れ、そして所望のペプチド（１つまたは複数）または単
鎖抗体をコードするポリヌクレオチド配列が選択される
ことを可能にする。次いで、ポリヌクレオチドのプール
は単離およびシャッフリングされ得、選択されるペプチ
ド（１つまたは複数）の（またはその予め決定された部
分）または単鎖抗体（または、ちょうどそのＶH、ＶL、
またはＣＤＲ部分）のアミノ酸配列を組み合わせて組換
える。これらの方法を使用して、ペプチドまたは単鎖抗
体を分子について所望の結合親和性を有するとして同定
し得、そして所望の高親和性ペプチドまたはｓｃＦｖに
迅速に集めるためにシャッフリングのプロセスを活用し
得る。次いで、ペプチドまたは抗体は、任意の適切な使
用（例えば、治療剤または診断剤として）のために、従
来の手段により大量に合成され得る。
【０２１４】本発明の有意な利点は、予想されるリガン
ド構造に関する情報が目的のペプチドリガンドまたは抗
体を単離するためには事前に全く要求されないことであ
る。同定されたペプチドは、生物学的活性を有し得、こ
のことは選択されたレセプター分子に対する特異的な結
合親和性を少なくとも含むことを意味し、そして、いく
つかの例において、他の化合物の結合をブロックする能
力、代謝経路を刺激または阻害する能力、シグナルまた
はメッセンジャーとして作用する能力、細胞活性を刺激
または阻害する能力などをさらに包含する。
【０２１５】本発明はまた、予め決定されたレセプター
（例えば、哺乳動物タンパク質性レセプター（例えば、
ペプチド性ホルモンレセプター、細胞表面レセプター、
他のタンパク質（１つまたは複数）に結合してヘテロダ
イマーのような細胞内タンパク質複合体を形成する細胞
内タンパク質など）、またはエピトープ（例えば、固定
タンパク質、糖タンパク質、多糖など）に結合するライ
ブラリーメンバーについて、新生ペプチド（単鎖抗体を
包含する）をディスプレイするポリソームのライブラリ
ーを親和性スクリーニングすることにより選択されたポ
リヌクレオチド配列のプールをシャッフリングする方法
もまた提供する。
【０２１６】これらの方法のいずれかにより、一回目の
選択（代表的には、レセプター（例えば、リガンド）へ
の結合についての親和性選択による）において選択され
たポリヌクレオチド配列は、プールされ、そしてプール
（単数または複数）はインビトロおよび／またはインビ
ボにおける組換えによりシャッフリングされ、選択され
た組換えポリヌクレオチド配列の集団を含むシャッフリ
ングプールを生成する。選択された組換えポリヌクレオ
チド配列は、少なくとも１回の続く選択に供される。次
の回の選択（１回または複数回）において選択されたポ
リヌクレオチド配列（プールまたは個々のクローンで）
は、直接用いられ得、配列決定され得、そして／また
は、１回以上のさらなるシャッフリングおよびそれに続
く選択に供され得る。選択された配列はまた、中立配列
（すなわち、結合に対して非実質的な機能的効果を有す
る）をコードするポリヌクレオチド配列と戻し交配され
（例えば、選択された配列に実質的に同一な野生型また
は天然に存在する配列と戻し交配することによる）、免
疫原性の低い天然様の機能的ペプチドを生成し得る。一
般に、戻し交配の間、続く選択は、予め決定されたレセ
プター（リガンド）への結合の特性を保持するように適
用される。他の特性が、特に、予め決定された結合相互
作用をブロックする（例えば、部分的なまたは完全なア
ンタゴニストまたは競合結合種として作用する）能力、
または触媒機能を示す能力、などによって例示される。
【０２１７】選択配列のシャッフリングの前または同時
に、配列が変異誘発され得る。１つの実施態様におい
て、選択されるライブラリーメンバーは、原核生物ベク
ター（例えば、プラスミド、ファージミド、またはバク
テリオファージ）中にクローニングされ、ここでは、別
個のライブラリーメンバーを提示する個々のコロニー
（またはプラーク）の集合が生成される。次いで、選択
される個々のライブラリーメンバーは操作され（例え
ば、部位特異的変異誘発、カセット変異誘発、化学変異
誘発、ＰＣＲ変異誘発など）、選択されるライブラリー
メンバーの配列に基づいて配列の多様性の核（ｋｅｒｎ
ａｌ）を提示するライブラリーメンバーの集合を生成し
得る。選択される個々のライブラリーメンバーまたはプ
ールの配列は操作され、ランダム変異、疑似ランダムな
変異、規定の核変異（すなわち、可変残基位置および不
変残基位置を含み、そして／またはアミノ酸残基の規定
のサブセットから選択される残基を含み得る可変残基位
置を含む）、コドンに基づく変異などを、選択される個
々のライブラリーメンバー配列にセグメント的にまたは
全長にわたってのいずれかで、組み込み得る。変異誘発
された選択ライブラリーメンバーは、次いで、本明細書
で記載されるインビトロおよび／またはインビボにおけ
る組換えシャッフリングにより、シャッフリングされ
る。
【０２１８】本発明はまた、本発明の複数の個々のライ
ブラリーメンバーを含むペプチドライブラリーを提供
し、ここでは（１）上記複数のうち各個々のライブラリ
ーメンバーが、選択される配列のプールのシャッフリン
グにより生成される配列を含有し、そして（２）各個々
のライブラリーメンバーは、可変ペプチドセグメント配
列または単鎖抗体セグメント配列（これは、上記複数に
おける他の個々のライブラリーメンバーの可変ペプチド
セグメント配列または単鎖抗体配列から区別される）を
含有する（しかし、いくつかのライブラリーメンバー
は、不均一な増幅、推計学的確率などのために、ライブ
ラリー当たり１コピー以上で存在し得る）。
【０２１９】本発明はまた、その方法によって作られる
もの（ｐｒｏｄｕｃｔ−ｂｙ−ｐｒｏｓｅｓｓ）を提供
する。ここでは、予め決定された結合特異性を有する
（または予め決定された結合特異性を有するペプチドを
コードする）選択されたポリヌクレオチド配列が、以下
の工程により形成される：（１）ディスプレイペプチド
またはディスプレイ単鎖抗体のライブラリーを予め決定
されたレセプター（例えば、リガンド）またはエピトー
プ（例えば、抗原高分子）に対してスクリーニングし、
そして予め決定されたレセプターまたはエピトープに結
合するライブラリーメンバーを同定および／または濃縮
し、選択されたライブラリーメンバーのプールを生成す
る工程、（２）予め決定されたエピトープを結合して、
そしてそれによりライブラリーから単離および／または
濃縮されてシャッフリングライブラリーを生成する選択
されたライブラリーメンバー（または増幅またはクロー
ニングされたそのコピー）を、組換えによりシャッフリ
ングする工程、および（３）シャッフリングライブラリ
ーを予め決定されたレセプター（例えば、リガンド）ま
たはエピトープ（例えば、抗原高分子）に対してスクリ
ーニングし、そして予め決定されたレセプターまたはエ
ピトープに結合するシャッフリングライブラリーメンバ
ーを同定および／または濃縮し、選択されたシャッフリ
ングライブラリーメンバーのプールを生成する工程。
【０２２０】（抗体ディスプレイおよびスクリーニング
法）本発明の方法は、開示された方法のいずれかによる
インビトロおよび／またはインビボ組換えおよび任意の
組み合わせにより、抗体ディスプレイ法により選択され
たポリヌクレオチド配列をシャッフリングするために用
いられ得る。ここで会合されたポリヌクレオチドは、表
現型（例えば、予め決定された抗原（リガンド）への結
合についての親和性）についてスクリーニングされたデ
ィスプレイされた抗体をコードする。
【０２２１】種々の分子遺伝学的アプローチが、免疫グ
ロブリン鎖中に存在し得る非常に多数の異なる可変領域
により表される広大な免疫学的レパートリーを捕獲する
ために考案されている。天然に存在する生殖系列免疫グ
ロブリン重鎖座位は、多様性（Ｄ）セグメント遺伝子の
直列の配列の上流に位置する可変性（Ｖ）セグメント遺
伝子の分離した直列の配列からなる。このＤセグメント
自身は、結合（Ｊ）領域遺伝子の直列の配列の上流に位
置し、Ｊ領域は、定常（ＣH）領域遺伝子の上流に位置
する。Ｂリンパ球の発達の間、Ｖ−Ｄ−Ｊ再配列が生
じ、ここで重鎖可変領域遺伝子（ＶH）は、融合したＤ
−Ｊセグメントを形成するための再配列、それに続くＶ
−Ｄ−Ｊ結合産物遺伝子を形成するためのＶセグメント
との再配列により形成され、生産的に再配列される場
合、このＶ−Ｄ−Ｊ結合産物遺伝子は、機能的な重鎖の
可変領域（ＶH）をコードする。同様に、軽鎖座位は、
いくつかのＪセグメントの１つといくつかのＶセグメン
トの１つを再配列し、軽鎖の可変領域（ＶL）をコード
する遺伝子を形成する。
【０２２２】免疫グロブリン中にあり得る可変領域の広
範なレパートリーは、Ｂ細胞発達における再配列の間の
ＶセグメントとＪセグメント（とＤセグメント（重鎖座
位である場合））との結合の多数の組み合わせの可能性
に部分的に由来する。重鎖可変領域における付加的な配
列多様性は、Ｖ−Ｄ−Ｊ結合の間のＤセグメントの不均
一な再配列、およびＮ領域付加から生じる。さらに、特
定のＢ細胞クローンの抗原選択は、重鎖と軽鎖の可変領
域のいずれか１つまたは両方に非生殖系列変異を有する
変異体をより高い親和性に関して選択する；この現象
は、「親和性成熟」または「親和性鋭敏化（ｓｈａｒｐ
ｅｎｉｎｇ）」と呼ばれる。代表的には、これらの「親
和性鋭敏化」変異は、可変領域の特定の範囲に、最も一
般的には相補性決定領域（ＣＤＲ）中にクラスター形成
する。
【０２２３】抗原刺激化Ｂ細胞の発達（すなわち、免疫
化）を通して高親和性免疫グロブリンを産生および同定
することにおける多くの制限を克服するために、特異的
な抗原に対する高親和性抗体についてスクリーニングさ
れ得る組み合わせの抗体ライブラリーを作製するように
操作され得る種々の原核生物の発現システムが開発され
ている。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびバク
テリオファージシステムにおける抗体の発現における最
近の利点（以下の「別のペプチドディスプレイ法」を参
照のこと）は、実際に任意の特異性が、特徴づけられた
ハイブリドーマから抗体遺伝子をクローニングするか、
または抗体遺伝子ライブラリー（例えば、Ｉｇ ｃＤＮ
Ａから）を用いる新規選択のいずれかにより得られ得る
という可能性を増加している。
【０２２４】抗体の組み合わせのライブラリーは、バク
テリオファージプラークまたは溶原菌のコロニーとして
スクリーニングされ得るバクテリオファージλ発現シス
テムにおいて生成されている（Ｈｕｓｅら、（１９８
９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６： １２７５； Ｃａｔ
ｏｎおよびＫｏｐｒｏｗｓｋｉ （１９９０） Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．）
８７： ６４５０；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、（１９９
０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．
Ｓ．Ａ．） ８７： ８０９５； Ｐｅｒｓｓｏｎら、
（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
（Ｕ．Ｓ．Ａ．） ８８：２４３２）。バクテリオフ
ァージ抗体ディスプレイライブラリーおよびλファージ
発現ライブラリーの種々の実施様態が、記載されている
（Ｋａｎｇら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．） ８８： ４３６
３；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、（１９９１） Ｎａｔｕｒｅ
３５２： ６２４；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、（１９
９０） Ｎａｔｕｒｅ ３４８： ５５２；Ｂｕｒｔｏ
ｎら、（１９９１） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．） ８８： １０１３４；Ｈ
ｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、（１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９： ４１３３；Ｃｈａｎ
ｇら、（１９９１） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７：
３６１０；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら、（１９９１） Ｇ
ｅｎｅ １０４： １４７；Ｍａｒｋｓら、（１９９
１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２２２： ５８１；Ｂａ
ｒｂａｓら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．） ８９： ４４５７；
ＨａｗｋｉｎｓおよびＷｉｎｔｅｒ （１９９２）
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２： ８６７； Ｍａｒｋｓ
ら、（１９９２） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １
０： ７７９；Ｍａｒｋｓら、（１９９２） Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７： １６００７； Ｌｏｗｍａ
ｎら、（１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３
０： １０８３２；Ｌｅｒｎｅｒら、（１９９２） Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２５８： １３１３は、参考として本明
細書中に援用される）。代表的には、バクテリオファー
ジ抗体ディスプレイライブラリーは、固定化（例えば、
親和性クロマトグラフィーにより反応性ファージについ
て富化するためのクロマトグラフィー樹脂への共有結合
による）および／または標識（例えば、プラークまたは
コロニーリフトをスクリーニングするために）されてい
るレセプター（例えば、ポリペプチド、炭水化物、糖タ
ンパク質、核酸）でスクリーニングされる。
【０２２５】１つの特に有利なアプローチは、いわゆる
単鎖フラグメント可変（ｓｃＦｖ）ライブラリーの使用
である（Ｍａｒｋｓら、（１９９２） Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ １０： ７７９； Ｗｉｎｔｅｒ Ｇお
よびＭｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ（１９９１） Ｎａｔｕｒｅ
３４９： ２９３；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、（１９９
１） 前出；Ｍａｒｋｓら、（１９９１） Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ． ２２２： ５８１；Ｃｈａｕｄｈａｒ
ｙら、（１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ８７： １０６６；Ｃｈｉｓｗ
ｅｌｌら、（１９９２） ＴＩＢＴＥＣＨ １０： ８
０；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、（１９９０） 前出；お
よびＨｕｓｔｏｎら、（１９８８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ８５： ５８７
９）。バクテリオファージコートタンパク質においてデ
ィスプレイされるｓｃＦｖライブラリーの種々の実施様
態が記載されている。
【０２２６】１９８８年のはじめ、Ｆｖフラグメントの
単鎖アナログおよびそれらの融合タンパク質が、抗体工
学法により確実に生成されている。第１の工程は、一般
に、所望の結合特性を有するＶHおよびＶLドメインをコ
ードする遺伝子を得ることを包含する；これらのＶ遺伝
子は、特定のハイブリドーマ細胞株から単離され得る
か、組み合わせのＶ遺伝子ライブラリーから選択され得
るか、またはＶ遺伝子合成により作製され得る。単鎖Ｆ
ｖは、成分Ｖ遺伝子と適切に設計されたリンカーペプチ
ド（例えば、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅ
ｒ）3または等価のリンカーペプチド（１つまたは複
数））をコードするオリゴヌクレオチドとを結合するこ
とにより形成される。リンカーは、ＶH−リンカー−ＶL
またはＶL−リンカー−ＶHのいずれかの順序で第１のＶ
領域のＣ−末端、および第２のＶ領域のＮ−末端に橋を
架ける。原則として、ｓｃＦｖ結合部位は、その親の抗
体結合部位の親和性および特異性の両方を正確に複製し
得る。
【０２２７】従って、ｓｃＦｖフラグメントは、柔軟な
リンカーペプチドにより単一のポリペプチド鎖に連結さ
れたＶHおよびＶLドメインからなる。ｓｃＦｖ遺伝子が
組立てられた後、それらは、ファージミド中にクローニ
ングされ、そしてバクテリオファージｐＩＩＩ（遺伝子
３）コートタンパク質との融合タンパク質としてＭ１３
ファージ（または類似の繊維状バクテリオファージ）の
先端部で発現される。目的の抗体を発現するファージの
富化は、予め決定されたエピトープ（例えば、標的抗
原、レセプター）への結合についてｓｃＦｖ集団をディ
スプレイする組換えファージをパンニングすることによ
り達成される。
【０２２８】ライブラリーメンバーの連結ポリヌクレオ
チドは、スクリーニング手順または選択手順後のライブ
ラリーメンバーの複製に関する基礎を提供し、そしてヌ
クレオチド配列決定による、ディスプレイされたペプチ
ド配列またはＶHおよびＶLアミノ酸配列の正体の決定の
ための基礎をも提供する。ディスプレイされたペプチド
（１つまたは複数）または単鎖抗体（例えば、ｓｃＦ
ｖ）および／またはそのＶHおよびＶLドメインあるいは
それらのＣＤＲは、適切な発現システムにクローニング
され得、そして発現され得る。しばしば、単離されたＶ
HおよびＶLドメインをコードするポリヌクレオチドは、
定常領域（ＣHおよびＣL）をコードするポリヌクレオチ
ドに連結され、完全な抗体（例えば、キメラ、または完
全なヒトの抗体）、抗体フラグメントなどをコードする
ポリヌクレオチドを形成する。しばしば、単離されたＣ
ＤＲをコードするポリヌクレオチドは、適切な可変領域
フレームワーク（および随意に定常領域）をコードする
ポリヌクレオチドに融合され、完全な抗体（例えば、ヒ
ト化または完全なヒト抗体）、抗体フラグメントなどを
コードするポリヌクレオチドを形成する。抗体は、免疫
親和性クロマトグラフィーにより、調製量の抗原を単離
するために用いられ得る。このような抗体の種々の他の
使用は、疾患（例えば、腫瘍形成）を診断／または段階
づけすること、および治療応用のために、疾患（例え
ば：腫瘍形成、自己免疫疾患、ＡＩＤＳ、心血管性疾
患、感染症など）を処置することである。
【０２２９】種々の方法が、ｓｃＦｖライブラリーの組
み合わせの多様性の増加が、結合種のレパートリー（イ
ディオタイプスペクトル）を広げることについて報告さ
れている。ＰＣＲの使用は、可変領域を、特定のハイブ
リドーマ供給源からか、または非免疫化細胞から遺伝子
ライブラリーとして、迅速にクローニングすることを可
能にし、これは組み合わされ得るＶHおよびＶLカセット
の分類における組み合わせの多様性を供給する。さら
に、ＶHおよびＶLカセットは、例えば、ランダムな変異
誘発、疑似ランダムな変異誘発、または定方向変異誘発
（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によ
り、それ自身多様化させられ得る。代表的には、ＶHお
よびＶLカセットは、相補性決定領域（ＣＤＲ）（しば
しば第３のＣＤＲ、ＣＤＲ３）内またはその近くにおい
て多様化される。酵素的インバースＰＣＲ変異誘発は、
誤りがちなＰＣＲおよび化学的変異誘発がそうであるよ
うに（Ｄｅｎｇら、（１９９４） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ． ２６９：９５３３）、ｓｃＦｖ部位特異的変異
体の比較的大きなライブラリーを構築することに関して
単純かつ信頼し得る方法であることが示されている（Ｓ
ｔｅｍｍｅｒら、（１９９３） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ １４： ２５６）。Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、
（１９９３） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２： ８
８４８は、縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲおよび引き続
いて生じるｓｃＦｖ変異体のファージディスプレイによ
る部位特異的ランダム化を用いる抗体ｓｃＦｖフラグメ
ントの半合理的な設計を示した。Ｂａｒｂａｓら、（１
９９２） 前出は、ヒト破傷風トキソイド結合Ｆａｂの
合成ＣＤＲ領域における配列をランダム化することによ
り、偏った可変領域配列を用いることに起因する制限さ
れたレパートリーサイズの問題を回避することを試み
た。
【０２３０】ＣＤＲランダム化は、重鎖ＣＤＲ３のみに
ついて約１×１０20 ＣＤＲ、そしておおよそ類似した
数の重鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の変異体、ならびに軽
鎖ＣＤＲ１−３変異体を作製する潜在力を有する。個々
にまたは一緒に考慮すると、重鎖および／または軽鎖の
ＣＤＲランダム化の組み合わせは、全ての可能な組み合
わせを提示するクローンライブラリーを作製するため
に、膨大な数のバクテリオファージクローン（それらの
ほとんどは、非結合性である）の生成を必要とする。こ
のような多数の初期形質転換体の生成は、現在の形質転
換技術およびバクテリオファージディスプレイシステム
では、容易ではない。例えば、Ｂａｒｂａｓら、（１９
９２） 前出は、５×１０7の形質転換体のみを生成
し、これは、完全にランダム化されたＣＤＲのライブラ
リーのごく小さな割合の潜在的多様性のみを提示する。
【０２３１】これらの実質的な制限にも関わらず、ｓｃ
Ｆｖのバクテリオファージディスプレイはすでに、種々
の有用な抗体および抗体融合タンパク質を産生してい
る。二特異性の単鎖抗体は、効率的な腫瘍細胞溶解を仲
介することが示されている（Ｇｒｕｂｅｒら、（１９９
４） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２： ５３６８）。
抗Ｒｅｖ ｓｃＦｖの細胞内発現は、インビトロでのＨ
ＩＶ−１ウイルス複製を阻害することが示されており
（Ｄｕａｎら、（１９９４） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ９１： ５０７５）、
そして抗ｐ２１rasｓｃＦｖの細胞内発現は、Ｘｅｎｏ
ｐｕｓ卵母細胞の減数分裂の成熟を阻害することが示さ
れている（Ｂｉｏｃｃａら、（１９９３） Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． １
９７：４２２）。ＨＩＶ感染を診断するために用いら得
る組換えｓｃＦｖもまた、報告されており、ｓｃＦｖの
診断上の利用性が示されている（Ｌｉｌｌｅｙら、（１
９９４） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ． １７１：
２１１）。ｓｃＦｖが第２のポリペプチド（例えば、毒
素または線維素溶解性活性化タンパク質）に連結してい
る融合タンパク質もまた報告されている（Ｈｏｌｖｏｓ
ｔら、（１９９２） Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
２１０： ９４５； Ｎｉｃｈｏｌｌｓら、（１９９
３） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８： ５３０
２）。
【０２３２】広範な抗体多様性を有し、そして潜在的な
配列組み合わせの非常に小さい割合のみをカバーし得る
多くの従来のＣＤＲ変異誘発およびランダム化法の制限
の多くを克服するｓｃＦｖライブラリーを生成し得るな
らば、ｓｃＦｖ抗体の数および質を治療上および診断上
の使用に適切に大幅に改善され得る。これに取り組むた
めに、本発明のインビトロおよびインビボシャッフリン
グ法が、選択されたディスプレイされた抗体から得られ
た核酸から（代表的にＰＣＲ増幅またはクローニングに
より）得られたＣＤＲを組換えるために用いられる。こ
のようなディスプレイされた抗体は、細胞、バクテリオ
ファージ粒子、ポリソーム、または任意の適切な抗体デ
ィスプレイシステムにおいて、ディスプレイされ得る。
ここで抗体が、それをコードする核酸（１つまたは複
数）と会合されている。ある改変例においては、ＣＤＲ
は最初に、抗体産生細胞（例えば、第ＷＯ９２／０３９
１８号、第ＷＯ９３／１２２２７号、および第ＷＯ９４
／２５５８５号に記載のように、免疫化した野生型マウ
ス、ヒト、またはヒト抗体を作製し得るトランスジェニ
ックマウス由来の形質細胞／脾細胞）（これはそれに由
来するハイブリドーマを包含する）由来のｍＲＮＡ（ま
たはｃＤＮＡ）から得られる。
【０２３３】これらの方法のいずれかにより第１の選択
回において選択された（代表的には、ディスプレイされ
た抗体が抗原（例えば、リガンド）に結合することに関
する親和性選択による）ポリヌクレオチド配列は、プー
ルされ、そしてこのプール（１つまたは複数）は、イン
ビトロおよび／またはインビボ組換え、特にＣＤＲのシ
ャッフリングによりシャッフリングされ（代表的には、
重鎖ＣＤＲが他の重鎖ＣＤＲでシャッフリングされ、そ
して軽鎖ＣＤＲが他の軽鎖ＣＤＲでシャッフリングされ
る）、組換えられた選択ポリヌクレオチド配列の集団を
含有するシャッフリングされたプールを作製する。組換
えられた選択ポリヌクレオチド配列は、ディスプレイさ
れた抗体のような選択様式において発現され、そして少
なくとも１回の引き続く選択回にかけられる。引き続く
選択回（１回または複数回）において選択されたポリヌ
クレオチド配列は、直接使用され得、配列決定され得、
そして／または所望の結合親和性を有する抗体が得られ
るまで１回またはそれ以上の更なるシャッフリングおよ
び引き続く選択の回にかけられ得る。選択された配列は
また、中立の抗体フレームワーク配列をコードするポリ
ヌクレオチド配列（すなわち、抗原結合において非実質
的な機能的効果を有する）と戻し交配され（例えば、ヒ
ト可変領域フレームワークとの戻し交配による）、ヒト
様配列抗体を作製し得る。一般に、戻し交配の間、引き
続く選択は、予め決定された抗原への結合の特性を保有
するように適用される。
【０２３４】あるいは、または公知の改変例との組み合
わせにおいて、標的エピトープの結合価は、選択された
ｓｃＦｖライブラリーメンバーの平均結合親和性を調節
するように、改変され得る。標的エピトープは、例え
ば、競合エピトープを含有すること、希釈、または当業
者に公知の他の方法により、種々の密度で表面または基
質に結合され得る。予め決定されたエピトープの高密度
（結合価）は、比較的低い親和性を有するｓｃＦｖライ
ブラリーメンバーについて富化するために用いられ得
る。一方、低密度（結合価）は、より高い親和性につい
てｓｃＦｖライブラリーメンバーを優先的に富化し得
る。
【０２３５】多様な可変セグメントを生成するために、
ペプチド配列のランダム、疑似ランダム、または規定の
配列の核セットをコードする合成オリゴヌクレオチドの
集合は、予め決定された部位（例えば、ＣＤＲ）への連
結により挿入され得る。同様に、単鎖抗体カセット（１
つまたは複数）の１つまたはそれ以上のＣＤＲの配列多
様性は、部位特異的変異誘発、ＣＤＲ置換などを用いて
ＣＤＲ（１つまたは複数）を変異させることにより拡大
され得る。生じるＤＮＡ分子は、シャッフリングの前の
クローニングおよび増幅のために宿主において増殖され
得るか、または直接使用され得（すなわち、宿主細胞に
おける増殖の際に生じ得る多様性の損失を回避し得
る）、そして選択されたライブラリーメンバーは、引き
続いてシャッフルされる。
【０２３６】目的の可変セグメントペプチド配列または
目的の単鎖抗体をコードするディスプレイされたペプチ
ド／ポリヌクレオチド複合体（ライブラリーメンバー）
は、親和性富化技術により、ライブラリーから選択され
る。これは、目的のペプチド配列に特異的な固定化され
た高分子またはエピトープ（例えば、レセプター、他の
高分子、または他のエピトープ種）の手段により達成さ
れる。親和性選択手順を繰り返すことにより、所望の配
列をコードするライブラリーメンバーの富化物が提供さ
れ、次いでこの富化物は、プールおよびシャッフリン
グ、配列決定、および／または更なる増殖および親和性
富化のために単離され得る。
【０２３７】所望の特異性を有しないライブラリーメン
バーは、洗浄により除去される。要求される洗浄の度合
およびストリンジェンシーは、目的のそれぞれのペプチ
ド配列または単鎖抗体、および固定化された予め決定さ
れた高分子またはエピトープに関して決定される。制御
の所定の度合は、結合のインキュベーションおよび引き
続く洗浄の条件を調整することにより、回収された新生
のペプチド／ＤＮＡ複合体の結合特性に影響を及ぼし得
る。温度、ｐＨ、イオン強度、二価カチオン濃度、およ
び洗浄の容量および持続時間は、固定化高分子に対する
親和性の特別な範囲内で、新生のペプチド／ＤＮＡ複合
体について選択される。通常、高親和性の指標となる遅
い解離速度に基づく選択は、しばしば最も実践的な経路
である。これは、飽和量の遊離した予め決定された高分
子の存在下における継続的なインキュベーション、また
は洗浄の容量、回数、および長さを増加させることのい
ずれかにより実施され得る。それぞれの場合において、
解離した新生ペプチド／ＤＮＡまたはペプチド／ＲＮＡ
複合体の組換えは防止され、そして時間の増加ととも
に、徐々に親和性が高くなる新生のペプチド／ＤＮＡま
たはペプチド／ＲＮＡ複合体が回収される。
【０２３８】結合および洗浄の手順のさらなる改変は、
特別な特徴を有するペプチドを見い出すために適用され
得る。いくつかのペプチドの親和性は、イオン強度また
はカチオン濃度に依存する。これは、ペプチドからこの
タンパク質を除去するのに穏やかな条件が要求される場
合の種々のタンパク質の親和性精製において用いられる
ペプチドについて有用な特徴である。
【０２３９】１つの改変は、ｓｃＦｖライブラリーが、
異なる結合特異性を有するｓｃＦｖの多重性について同
時にスクリーニングされ得るような、多重結合標的（多
重エピトープ種、多重レセプター種）の使用を包含す
る。ｓｃＦｖライブラリーのサイズが、しばしば潜在的
なｓｃＦｖ配列の多様性を制限すると仮定すると、代表
的に、可能な限りの大きなサイズのｓｃＦｖライブラリ
ーを使用することが望ましい。多数の非常に大きなポリ
ソームｓｃＦｖ−ディスプレイライブラリーを生成する
ことの時間性および経済性の考慮は、障害になり得る。
この実質的な問題を回避するために、多重性を有する予
め決められたエピトープ種（レセプター種）が、単一の
ライブラリーにおいて同時にスクリーニングされ得る
か、または多数のエピトープ種に対する逐次スクリーニ
ングが用いられ得る。１つの改変において、それぞれ別
個のビーズ（またはビーズのサブセット）にコードされ
る多重標的エピトープ種は、適切な結合条件下でポリソ
ームディスプレイｓｃＦｖライブラリーと混合およびイ
ンキュベートされ得る。次いで多重エピトープ種を含有
するビーズの集合は、親和性選択により、ｓｃＦｖライ
ブラリーメンバーを単離するために用いられ得る。一般
に、引き続く親和性スクリーニング回は、ビーズの同一
の混合物、それのサブセット、または１つのみまたは２
つの個々のエピトープ種を含有するビーズを包含し得
る。このアプローチは、効率的なスクリーニングを提供
し、そして研究自動化法、バッチプロセシング法、およ
び高処理能力スクリーニング法と適合する。
【０２４０】種々の技術は、予め決定された高分子また
はエピトープに対する十分な結合活性を有するように、
ペプチドライブラリーまたは単鎖抗体ライブラリーを多
様化するために、あるいはシャッフリングの前または同
時に、周囲の可変セグメントペプチドまたはＶH、ＶL、
あるいはパンニングの初期の回において見い出されるＣ
ＤＲを多様化するために本発明において用いられ得る。
１つのアプローチにおいて、ポジティブ選択されたペプ
チド／ポリヌクレオチド複合体（親和性富化の初期の回
において同定される複合体）は、活性ペプチドの正体を
決定するために配列決定される。次いでオリゴヌクレオ
チドは、これらの活性ペプチド配列に基づいて合成さ
れ、これはそれぞれの工程で取り込まれる全ての塩基を
低レベルで使用し、一次オリゴヌクレオチド配列の僅か
な改変例を生じる。次いでこの（僅かに）縮重したオリ
ゴヌクレオチドの混合物は、適切な位置で可変セグメン
ト配列中にクローニングされる。この方法は、開始ペプ
チド配列の規則正しい調節された改変例を生じ、次いで
これらはシャッフルされ得る。しかしこの方法は、個々
のポジティブな新生ペプチド／ポリヌクレオチド複合体
が、変異誘発の前に配列決定されることを必要とし、従
って少数の回収された複合体の多様性を拡大し、そして
より高い結合親和性および／またはより高い結合特異性
を有する変異体を選択するために有用である。ポジティ
ブに選択された（特に可変領域配列の）ペプチド／ポリ
ヌクレオチド複合体の変異原性ＰＣＲ増幅である改変に
おいて、その増幅産物は、インビトロおよび／またはイ
ンビボでシャッフルされ、そして１回以上のさらなるス
クリーニングの回が、配列決定の前に実施される。同一
の一般的なアプローチは、多様性を拡大し、そして結合
親和性／特異性を増強するために、代表的には、シャッ
フリングの前または同時にＣＤＲまたは隣接のフレーム
ワーク領域を多様化することにより、単鎖抗体とともに
用いられ得る。所望であれば、シャッフリング反応は、
選択されたライブラリーメンバーとインビトロ組換えし
得る変異原性オリゴヌクレオチドでスパイクされ得る。
従って、合成オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲフラグメ
ント（誤りがちな方法または高度に忠実な方法により合
成された）の混合物がインビトロシャッフリング混合物
に添加され、そして生じるシャッフルされたライブラリ
ーメンバー（シャッフリング体）中に取り込まれ得る。
【０２４１】本発明のシャッフリングは、ＣＤＲ改変体
単鎖抗体の広大なライブラリーの生成を可能にする。こ
のような抗体を生成する１つの方法は、シャッフリング
の前またはシャッフリングと同時に、単鎖抗体および／
またはＣＤＲのランダム化中に合成ＣＤＲを挿入するこ
とである。合成ＣＤＲカセットの配列は、ヒトＣＤＲの
公知の配列データを参照することにより選択され、そし
て以下のガイドラインに従って実施者の判断により選択
される：合成ＣＤＲは、公知のＣＤＲ配列に対して少な
くとも４０％の位置的な配列同一性を有し、そして好ま
しくは、公知のＣＤＲ配列に対して少なくとも５０〜７
０パーセントの位置的な配列同一性を有する。例えば、
合成ＣＤＲ配列の集合は、Ｋａｂａｔら、（１９９１）
前出に列挙された天然に存在するヒトＣＤＲ配列に基
づいてオリゴヌクレオチド配列の集合を合成することに
より生成され得る；合成ＣＤＲ配列のプール（１つまた
は複数）は、少なくとも一つの公知の天然に存在するヒ
トＣＤＲ配列に対して少なくとも４０％の配列同一性を
有するＣＤＲペプチド配列をコードするように計算され
る。あるいは、天然に存在するＣＤＲ配列の集合が比較
され得、ある残基位置に頻繁に（すなわち、公知のＣＤ
Ｒ配列の少なくとも５％において）用いられるアミノ酸
が、対応する位置（１つまたは複数）で合成ＣＤＲ中に
取り込まれるように、コンセンサス配列を生成し得る。
代表的には、いくつか（例えば、３〜約５０）の公知の
ＣＤＲ配列が比較され、そして公知のＣＤＲの間の観測
された天然配列の改変体が表にされ、そして観測された
天然配列の改変体の全てまたはほとんどの順列を包含す
るＣＤＲペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチド
の集合が合成される。限定されないが、例えば、ヒトＶ
H ＣＤＲ配列の集合が、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、また
はＡｓｐのいずれかであるカルボキシ末端アミノ酸を有
する場合、合成ＣＤＲオリゴヌクレオチド配列のプール
（１つまたは複数）は、カルボキシ末端のＣＤＲ残基が
これらのアミノ酸のいずれかであるように設計される。
いくつかの実施様態では、ＣＤＲ配列の集合においてあ
る残基位置に天然に存在する残基以外の残基が取り込ま
れる：保存的なアミノ酸置換は、頻繁に取り込まれ、そ
して公知の天然に存在するＣＤＲ配列と比較して５残基
位置までが、非保存的なアミノ酸置換が取り込まれるよ
うに変更され得る。このようなＣＤＲ配列は、（第１回
のスクリーニングの前の）最初のライブラリーメンバー
において用いられ、そして／または選択されたライブラ
リーメンバー配列のインビトロのシャッフリング反応を
スパイクするために用いられ得る。規定の配列および／
または縮重配列のこのようなプールの構築は、当業者に
より容易に達成される。
【０２４２】合成ＣＤＲ配列の集合は、天然に存在する
ＣＤＲ配列であるとして知られていない、少なくとも１
つのメンバーを含む。重鎖ＣＤＲにおけるＮ領域付加に
対応するランダムまたは疑似ランダムな配列の一部を含
有するかまたは含有しないかは、実施者の判断内にあ
る；Ｎ領域配列は、Ｖ−ＤおよびＤ−Ｊ結合部に存在す
る１ヌクレオチド〜約４ヌクレオチドの範囲である。合
成重鎖ＣＤＲ配列の集合は、少なくとも約１００の独特
のＣＤＲ配列を含み、代表的には少なくとも約１，００
０の独特ＣＤＲ配列を含み、好ましくは、少なくとも約
１０，０００の独特のＣＤＲ配列を含み、しばしば５
０，０００より多い独特のＣＤＲ配列を含む；しかし、
特に、保存的なアミノ酸置換が、保存的なアミノ酸置換
基が天然に存在するヒトＣＤＲにおけるその位置に存在
しないか、またはまれに存在する（すなわち、０．１％
未満）位置において許容される場合、ときには１×１０
7〜１×１０8の独特のＣＤＲ配列が存在することもある
が、通常、せいぜい約１×１０6の独特のＣＤＲ配列が
集合中に含まれる。一般に、ライブラリーに含まれる独
特のＣＤＲ配列の数は、ライブラリー中の最初の形質転
換体の予測される数を１０倍（ａ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ
１０）を超えて超過するべきでない。このような単鎖
抗体は、一般に、少なくとも約１×１０7 Ｍ-1の親和性
で、好ましくは少なくとも約５×１０7 Ｍ-1の親和性
で、より好ましくは少なくとも１×１０8Ｍ-1〜１×１
０9 Ｍ-1またはそれ以上の親和性で、ときには１×１０
10 Ｍ-1またはそれ以上の親和性で、予め決定された抗
原（例えば、免疫原）に結合する。頻繁には、予め決定
された抗原は、例えばヒト細胞表面抗原（例えば、ＣＤ
４、ＣＤ８、ＩＬ−２レセプター、ＥＧＦレセプター、
ＰＤＧＦレセプター）のようなヒトタンパク質、他のヒ
ト生体高分子（例えば、トロンボモジュリン、プロテイ
ンＣ、糖質抗原、シアリルＬｅｗｉｓ抗原、Ｌ−セレク
チン）、または非ヒト疾患関連高分子（例えば、細菌Ｌ
ＰＳ、ビリオンカプシドタンパク質、またはエンベロー
プ糖タンパク質）などである。
【０２４３】所望の特異性を有する高親和性単鎖抗体
は、種々のシステムにおいて操作および発現される。例
えば、ｓｃＦｖは、植物中で産生されており（Ｆｉｒｅ
ｋら、（１９９３） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏ
ｌ． ２３： ８６１）、そして原核生物系において容
易に生成され得る（Ｏｗｅｎｓ ＲＪおよびＹｏｕｎｇ
ＲＪ （１９９４） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．
１６８： １４９；Ｊｏｈｎｓｏｎ ＳおよびＢｉｒ
ｄ ＲＥ （１９９１） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ． ２０３： ８８）。さらに、単鎖抗体は、抗体
全体またはその種々のフラグメントを構築する基礎とし
て用いられ得る（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、（１
９９４） Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４： ９
５２）。可変領域をコードする配列は、単離され得（例
えば、ＰＣＲ増幅またはサブクローニングにより）、そ
して免疫原性が好適に最小化されるヒトの治療的使用に
より適切なヒト配列抗体をコードするように、所望のヒ
ト定常領域をコードする配列にスプライシングされ得
る。生じる完全なヒトコード配列（１つまたは複数）を
有するポリヌクレオチド（１つまたは複数）は、宿主細
胞において発現され（例えば、哺乳動物細胞において発
現ベクターから）、そして薬学的処方物のために精製さ
れ得る。
【０２４４】ＤＮＡ発現構築物は、代表的には、コード
配列に作動可能に連結された発現制御ＤＮＡ配列を含有
し、この配列は、天然に会合したプロモーター領域、ま
たは異種のプロモーター領域を含む。好ましくは、発現
制御配列は、真核生物宿主細胞を形質転換またはトラン
スフェクトし得るベクター中の真核生物プロモーターシ
ステムである。一旦ベクターが適切な宿主中に取り込ま
れると、宿主は、ヌクレオチド配列の高レベルの発現、
ならびに変異「操作された」抗体の収集および精製に適
切な条件下で維持される。
【０２４５】上述のように、ＤＮＡ配列は、配列が発現
制御配列に作動可能に連結された（すなわち、構造遺伝
子の転写および翻訳を確実にするように位置された）後
に、宿主中で発現される。これらの発現ベクターは、代
表的には、エピソームまたは宿主の染色体ＤＮＡの必須
部分として、この宿主生物において複製可能である。一
般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換さ
れたこれらの細胞の検出を可能にするために、選択マー
カー（例えば、テトラサイクリンまたはネオマイシン）
を含有する（例えば、米国特許第４，７０４，３６２号
を参照のこと。これは、参考として本明細書中に援用さ
れる）。
【０２４６】真核の微生物（例えば、酵母）に加えて、
哺乳動物の組織細胞培養物もまた、本発明のポリペプチ
ドを生成するために用いられ得る（Ｗｉｎｎａｃｋｅ
ｒ、「Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ，」
ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎ．Ｙ．， Ｎ．
Ｙ． （１９８７）を参照のこと。これは参考として本
明細書中に援用される）。真核細胞は、実際に好まし
い。なぜなら、無傷の免疫グロブリンを分泌し得る多数
の適切な宿主細胞株が当該分野で開発されており、そし
てこれは、ＣＨＯ細胞株、種々のＣＯＳ細胞株、ＨｅＬ
ａ細胞、ミエローマ細胞株などを含むが、形質転換され
たＢ細胞またはハイブリドーマが好ましい。これらの細
胞のための発現ベクターは、発現制御配列（例えば、複
製起点、プロモーター、エンハンサー）（Ｑｕｅｅｎ
ら、（１９８６） Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ． ８９：
４９）、および必要とされるプロセシング情報部位
（例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング
部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列）を含
有し得る。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺
伝子、サイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイル
ス、ウシパピローマウイルスなどに由来するプロモータ
ーである。
【０２４７】真核生物のＤＮＡ転写は、ベクター中にエ
ンハンサー配列を挿入することにより増加され得る。エ
ンハンサーは、プロモーターによる転写を増加する１０
ｂｐと３００ｂｐとの間のシス作用性配列である。エン
ハンサーは、転写単位に対して５’または３’のいずれ
かにある場合、転写を効率的に増加し得る。それらはま
た、イントロン内、またはコード配列自身の内部に位置
される場合にも効果的である。代表的には、ウイルスの
エンハンサーが使用され、これは、ＳＶ４０エンハンサ
ー、サイトメガロウイルスエンハンサー、ポリオーマエ
ンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが含まれ
る。マウス免疫グロブリン重鎖エンハンサーのような、
哺乳動物系由来のエンハンサー配列もまた、一般に使用
される。
【０２４８】哺乳動物の発現ベクターシステムはまた、
代表的に選択マーカー遺伝子を含有する。適切なマーカ
ーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ＤＨＦ
Ｒ）、チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）、または薬物耐
性を与える原核生物遺伝子を包含する。最初の２つのマ
ーカー遺伝子は、生育培地へのチミジンの添加をともな
わずに生育する能力を欠如する変異体細胞株の使用を好
む。次いで、形質転換された細胞は、非補充培地におけ
るそれらの生育能により同定され得る。マーカーとして
有用な原核生物の薬物耐性遺伝子の例は、Ｇ４１８、ミ
コフェノール酸、およびハイグロマイシンへの耐性を与
える遺伝子を包含する。
【０２４９】目的のＤＮＡセグメントを含有するベクタ
ーは、細胞の宿主タイプに依存して周知の方法により宿
主細胞中に導入され得る。例えば、塩化カルシウムトラ
ンスフェクションが、原核細胞に一般に利用されるが、
リン酸カルシウム処理、リポフェクション、またはエレ
クトロポレーションは、他の細胞の宿主に用いられ得
る。哺乳動物を形質転換するために用いられる他の方法
は、ポリブレン、プロトプラスト融合、リポソーム、エ
レクトロポレーション、およびマイクロインジェクショ
ンの使用を含む（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を
参照のこと）。
【０２５０】一旦発現されると、抗体、個々の変異免疫
グロブリン鎖、変異抗体フラグメント、および本発明の
他の免疫グロブリンポリペプチドは、当該分野の標準的
な手順に従って精製され得る。この手順は、硫酸アンモ
ニウム沈澱、フラクションカラムクロマトグラフィー、
ゲル電気泳動などを包含する（一般に、Ｓｃｏｐｅｓ，
Ｒ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎ．Ｙ．
（１９８２）を参照のこと）。一旦部分的にまたは所望
の均一性まで精製されると、次いでポリペプチドは、治
療的に、またはアッセイ手順、免疫蛍光染色などの開発
および実施において用いられ得る（一般に、Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、ＩおよびＩＩ巻、
ＬｅｆｋｏｖｉｔｓおよびＰｅｒｎｉｓ編、Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．
（１９７９および１９８１）を参照のこと）。
【０２５１】本発明の方法により生成される抗体は、診
断および治療に用いられ得る。限定のためではなく、説
明のために、それらは、ガン、自己免疫疾患、またはウ
イルス感染症を処置するために用いられ得る。ガンの処
置について、抗体は、代表的に癌細胞において優先的に
発現される抗原（例えば、ｅｒｂＢ−２、ＣＥＡ、ＣＤ
３３、および当業者に周知の多数の他の抗原および結合
メンバー）に結合する。
【０２５２】（酵母ツーハイブリッドスクリーニングア
ッセイ）シャッフリングはまたは、予め決定されたポリ
ペプチド配列に結合するライブラリーメンバーを同定す
るためのツーハイブリッドスクリーニングシステムをス
クリーニングすることにより得られた選択されたライブ
ラリーメンバーのプールを組換え的に多様化するために
用いられ得る。選択されたライブラリーメンバーは、プ
ールされ、そしてインビトロおよび／またはインビボ組
換えによりシャッフルされる。次いでシャッフルされた
プールは、上記の予め決定されたポリペプチド配列（例
えば、ＳＨ２ドメイン）に結合するライブラリーメンバ
ー、または別の予め決定されたポリペプチド配列（例え
ば、他のタンパク質の種由来のＳＨ２ドメイン）に結合
するライブラリーメンバーを選択するために、酵母ツー
ハイブリッドシステムにおいてスクリーニングされ得
る。
【０２５３】予め決定されたポリペプチド配列に結合す
るポリペプチド配列を同定するための１つのアプローチ
は、予め決定されたポリペプチド配列が融合タンパク質
中に存在するいわゆる「ツーハイブリッド」システムを
用いている（Ｃｈｉｅｎら、（１９９１） Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ８８：９
５７８）。このアプローチは、転写のアクティベーター
（Ｆｉｅｌｄｓ ＳおよびＳｏｎｇ Ｏ （１９８９）
Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５）、酵母Ｇａ１４転写
タンパク質の再構成を通して、インビボでのタンパク質
−タンパク質相互作用を同定する。代表的には、この方
法は、酵母Ｇａｌ４タンパク質の特性に基づく。このタ
ンパク質は、ＤＮＡ結合および転写の活性化に機能する
分離可能なドメインからなる。２つのハイブリッドタン
パク質（一方は、公知のタンパク質のポリペプチド配列
に融合された酵母Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメインからな
り、他方は、第２のタンパク質のポリペプチド配列に融
合されたＧａｌ４活性化ドメインからなる）をコードす
るポリヌクレオチドが構築され、酵母宿主細胞に導入さ
れる。２つの融合タンパク質間の分子間の結合は、Ｇａ
ｌ４ ＤＮＡ結合ドメインとＧａｌ４活性化ドメインと
を再構成し、これはＧａｌ４結合部位に作動可能に連結
されたレポーター遺伝子（例えば、ｌａｃＺ、ＨＩＳ
３）の転写の活性化を導く。代表的に、ツーハイブリッ
ド法は、公知のタンパク質に相互作用する新規のポリペ
プチド配列を同定するために用いられる（Ｓｉｌｖｅｒ
ＳＣおよびＨｕｎｔ ＳＷ （１９９３） Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ． １７： １５５； Ｄｕｒｆｅｅ
ら、（１９９３） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌ． ７；
５５５； Ｙａｎｇら、（１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ
２５７： ６８０； Ｌｕｂａｎら、（１９９３）
Ｃｅｌｌ ７３：１０６７； Ｈａｒｄｙら、（１９９
２） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌ． ６； ８０１； Ｂ
ａｒｔｅｌら、（１９９３） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ １４： ９２０； およびＶｏｊｔｅｋら、（１
９９３） Ｃｅｌｌ ７４： ２０５）。しかし、ツー
ハイブリッド法の変法が、第２の公知のタンパク質への
結合に影響する公知のタンパク質の変異を同定するため
に用いられている（Ｌｉ ＢおよびＦｉｅｌｄｓ Ｓ
（１９９３） ＦＡＳＥＢ Ｊ． ７： ９５７； Ｌ
ａｌｏら、（１９９３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ９０： ５５２４； Ｊａ
ｃｋｓｏｎら、（１９９３） Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ
ｏｌ． １３； ２８９９；およびＭａｄｕｒａら、
（１９９３） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８：
１２０４６）。ツーハイブリッドシステムはまた、２つ
の公知のタンパク質の相互作用する構造ドメインを同定
するため（Ｂａｒｄｗｅｌｌら、（１９９３） ｍｅ
ｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ８： １１７７； Ｃｈａ
ｋｒａｂｏｒｔｙら、（１９９２） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ． ２６７： １７４９８； Ｓｔａｕｄｉｎｇ
ｅｒら、（１９９３） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２
６８：４６０８； およびＭｉｌｎｅ ＧＴおよびＷｅ
ａｖｅｒ ＤＴ （１９９３）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅ
ｌ． ７； １７５５）、または単一のタンパク質のオ
リゴマー形成に機能するドメインを同定するためにも用
いられている（Ｉｗａｂｕｃｈｉら、（１９９３） Ｏ
ｎｃｏｇｅｎｅ ８； １６９３； Ｂｏｇｅｒｄら、
（１９９３） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６７： ５０３
０）。ツーハイブリッドシステムの改変は、タンパク質
分解酵素のインビボでの活性を研究するために用いられ
ている（Ｄａｓｍａｈａｐａｔｒａら、（１９９２）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． （ＵＳＡ）
８９： ４１５９）。あるいは、Ｅ．ｃｏｌｉ／ＢＣ
ＣＰ 相互作用的スクリーニングシステム（Ｇｅｒｍｉ
ｎｏら、（１９９３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．）９０： ９３３； Ｇ
ｕａｒｅｎｔｅ Ｌ （１９９３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．） ９０：
１６３９）は、相互作用するタンパク質配列（すなわ
ち、ヘテロ二量体化するか、またはより高次のヘテロ多
量体を形成するタンパク質配列）を同定するために用い
られ得る。ツーハイブリッドシステムにより選択された
配列は、プールおよびシャッフルされ、そして予め決定
された結合配列を含有するハイブリッドに結合するポリ
ペプチド配列を同定するためのスクリーニングの１つ以
上の引き続く回のために、ツーハイブリッドシステムに
導入され得る。このようにして同定された配列は、コン
センサス配列（単数または複数）およびコンセンサス配
列核を同定するために比較され得る。
【０２５４】（改善／別のフォーマット） （添加剤）１つの局面において、改善されたシャッフリ
ング法は、関連する配列ポリヌクレオチドの再アニーリ
ングまたは組換えの割合または程度を増大させる少なく
とも１つの添加剤の添加を含む。一般に、ミスマッチ配
列のハイブリッド安定性を増加させる添加剤を使用し
て、実質的に変異したライブラリーメンバーを生じる頻
度を増大させ得る（すなわち、より高い変異密度を有す
る） 。添加剤に加えて、イオン強度（例えば、Ｎａ+
および／またはＫ+イオン濃度） の調節により、ミス
マッチハイブリッドの相対的な安定性を調節し得、その
結果、増加した塩濃度が、ミスマッチハイブリッドの頻
度を増加させ、そして複数の変異を有するライブラリー
メンバーの形成に寄与し得る。
【０２５５】１つの実施態様において、添加剤は、ポリ
エチレングリコール（ＰＥＧ）であり、代表的には、最
終濃度０．１〜２５パーセントまで、しばしば最終濃度
２．５〜１５パーセントまで、最終濃度約１０パーセン
トまで、シャッフリング反応に添加される。１つの実施
態様において、添加剤はデキストラン硫酸であり、代表
的には、最終濃度０．１〜２５パーセントまで、しばし
ば最終濃度約１０パーセントまで、シャッフリング反応
に添加される。１つの実施態様において、添加剤は、イ
ンビトロでの再アニーリングの配列特異性を減少し、そ
して無差別なハイブリダイゼーションおよび／または組
換えを促進する薬剤である。別の実施態様において、添
加剤は、インビトロでの再アニーリングの配列特異性を
増加させ、そして正確なハイブリダイゼーションおよび
／または組換えを促進する薬剤である。この反応に干渉
しない他の長鎖ポリマーもまた、使用され得る（例え
ば、ポリビニルピロリドンなど）。
【０２５６】１つの局面において、改善されたシャッフ
リング法は、カチオン性界面活性剤である少なくとも１
つの添加剤の添加を包含する。適切なカチオン性界面活
性剤の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定
されない：セチルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｃ
ＴＡＢ）、臭化ドデシルトリメチルアンモニウム（ＤＴ
ＡＢ）、および塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡ
Ｃ）など。
【０２５７】１つの局面において、改善されたシャッフ
リング法は、インビトロでの相同対形成および／または
鎖交換を触媒するかまたは非触媒的に増強する組換え形
成性タンパク質である少なくとも１つの添加剤の添加を
包含する。適切な組換え形成性タンパク質の例として、
以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｅ．ｃｏ
ｌｉ ｒｅｃＡタンパク質、Ｔ４ ｕｖｓＸタンパク
質、Ｕｓｔｉｌａｇｏｍａｙｄｉｓ由来のｒｅｃ１タン
パク質、他の種由来の他のｒｅｃＡファミリーリコンビ
ナーゼ、一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）、リボヌクレ
オタンパク質Ａ１など。ヌクレアーゼおよびプルーフリ
ーディングポリメラーゼは、しばしば３’末端の完全性
の維持を改善するために含まれる。これらのタンパク質
添加剤のそれぞれは、複数回の反復的な配列組換えなら
びに選択および／またはスクリーニングによってそれ自
身改善され得る。本発明は、このような改善された添加
剤およびシャッフリングをさらに増強するためのそれら
の使用を包含する。
【０２５８】（リコンビナーゼタンパク質）リコンビナ
ーゼは、外来性標的化ポリヌクレオチドと共に含まれる
場合は、標的化ポリヌクレオチドと外来性の予め決定さ
れたＤＮＡ配列との間の組換え頻度および／または局在
化頻度において測定可能な増加を提供するタンパク質で
ある。本発明では、リコンビナーゼは、全てが特に以下
の同一の機能の全てまたはほとんどを有するＲｅｃＡ様
組換えタンパク質のファミリーをいう：（ｉ）その相同
標的上で標的化ポリヌクレオチドに正確に結合しそして
位置決めする、リコンビナーゼタンパク質の能力、およ
び（ｉｉ）相補的外来配列を効率的に見出しそしてこれ
に結合する、リコンビナーゼタンパク質／標的化ポリヌ
クレオチド複合体の能力。同定されている多くの変異型
ｒｅｃＡ様タンパク質の野生型タンパク質に加えて、最
も良く特徴付けられているｒｅｃＡタンパク質は、Ｅ．
ｃｏｌｉ由来のものである（例えば、ｒｅｃＡ８０
３）。さらに多くの微生物が、鎖転移活性を有するｒｅ
ｃＡ様リコンビナーゼを有する（例えば、Ｆｕｇｉｓａ
ｗａら、（１９８５） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ ｒｅ
ｓ． １３： ７４７３；Ｈｓｉｅｈら、（１９８６）
Ｃｅｌｌ ４４： ８８５； Ｈｓｉｅｈら、（１９
８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４： ５
０８９； Ｆｉｓｈｅｌら、（１９８８） Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：
３６８３； Ｃａｓｓｕｔｏら、（１９８７） Ｍｏ
ｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２０８： １０； Ｇ
ａｎｅａら、（１９８７） Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ． Ｂｉ
ｏｌ． ７： ３１２４； Ｍｏｏｒｅら、（１９９
０）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９： １１１０
８； Ｋｅｅｎｅら、（１９８４） Ｎｕｃｌ． Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ． １２： ３０５７； Ｋｉｍｉｅ
ｃ， （１９８４） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｓｙｍｐ． ４８： ６７５； Ｋｉｍｅｉ
ｃ， （１９８６） Ｃｅｌｌ ４４： ５４５；Ｋｏ
ｌｏｎｄｅｒら、（１９８７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ
ｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４： ５５６
０； Ｓｕｇｉｎｏら、（１９８５） Ｐｒｏｃ． Ｎ
ａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ３
６８３；Ｈａｌｂｒｏｏｋら、（１９８９） Ｊ． Ｂ
ｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４： ２１４０３； Ｅｉ
ｓｅｎら、（１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａ
ｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ７４８１； Ｍ
ｃＣａｒｔｈｙら、（１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ
ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ５８５
４； Ｌｏｗｅｎｈａｕｐｔら、（１９８９） Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２６４： ２０５６８、その全
体が本明細書中で参考として援用される）。このような
リコンビナーゼタンパク質の例として、例えば、以下が
挙げられるが、これらに限定されない：ｒｅｃＡ、ｒｅ
ｃＡ８０３、ｕｖｓＸ、および他のｒｅｃＡ変異体およ
びｒｅｃＡ様リコンビナーゼ（Ｒｏｃａ． Ａ． Ｉ．
（１９９０） Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ．２５： ４１５）、ｓ
ｅｐ１（Ｋｏｌｏｄｎｅｒ ら、（１９８７） Ｐｒｏ
ｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．
Ａ．） ８４： ５５６０； Ｔｉｓｈｋｏｆｆら、Ｍ
ｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１：２５９
３）、ＲｕｖＣ（Ｄｕｎｄｅｒｄａｌｅら、（１９９
１） Ｎａｔｕｒｅ３５４： ５０６）、ＤＳＴ２、Ｋ
ＥＭ１、ＸＲＮ１（Ｄｙｋｓｔｒａら、（１９９１）
Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１： ２５
８３）、ＳＴＰα／ＤＳＴ１（Ｃｌａｒｋら、（１９９
１） Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． １１：
２５７６）、ＨＰＰ−１（Ｍｏｏｒｅら、（１９９１）
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
（Ｕ．Ｓ．Ａ．） ８８：９０６７）、他の真核生物リ
コンビナーゼ（Ｂｉｓｈｏｐら、（１９９２） Ｃｅｌ
ｌ ６９： ４３９； Ｓｈｉｎｏｈａｒａら、（１９
９２） Ｃｅｌｌ ６９： ４５７；本明細書中で参考
として援用される）。ＲｅｃＡは、Ｅ． ｃｏｌｉ株
（例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＣ１２７７２株およびＪ
Ｃ１５３６９株（Ａ． Ｊ． ＣｌａｒｋおよびＭ．
Ｍａｄｉｒａｊｕ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ Ｃａｌ
ｉｆｏｒｎｉａ−Ｂｅｒｋｅｌｅｙから入手可能））か
ら精製され得る。これらの株は、細胞あたり高コピー数
で存在する「ランアウェイ」複製プラスミドベクター上
にｒｅｃＡコード配列を含む。ｒｅｃＡ８０３タンパク
質は、野生型ｒｅｃＡの高活性変異体である。当該分野
は、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、酵母、植物、ヒ
ト、および非ヒト哺乳動物細胞由来の、ｒｅｃＡに類似
する生物学的特性を有するタンパク質（すなわち、ｒｅ
ｃＡ様リコンビナーゼ）を含むリコンビナーゼタンパク
質のいくつかの例を教示する。
【０２５９】ＲｅｃＡタンパク質は、代表的には、この
タンパク質を過剰産生する細菌株から得られる：野生型
Ｅ． ｃｏｌｉ ｒｅｃＡタンパク質および変異型ｒｅ
ｃＡ８０３タンパク質が、このような株から精製され得
る。あるいは、ｒｅｃＡタンパク質はまた、例えば、Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）か
ら購入し得る。
【０２６０】ＲｅｃＡタンパク質は、一本鎖ＤＮＡをコ
ーティングする場合に核タンパク質フィラメントを形成
する。この核タンパク質フィラメントにおいて、ｒｅｃ
Ａタンパク質の１つのモノマーが、約３ヌクレオチドに
結合する。ｒｅｃＡタンパク質の一本鎖ＤＮＡをコーテ
ィングするこの特性は、本質的に配列依存性であるが、
特定の配列は、ポリヌクレオチド（例えば、核形成配
列）上でのｒｅｃＡの最初のロードを好む。核タンパク
質フィラメント（単数または複数）は、本質的に任意の
配列関連ポリペプチド上で形成されてシャッフルされ、
そして細胞（例えば、細菌、酵母、また哺乳動物細胞）
内で形成され、一本鎖ＤＮＡおよび２本鎖ＤＮＡの両方
と複合体を形成し得る。
【０２６１】部位特異的組換えを用いて、反復的な配列
組換えを達成し得る。代表的には、シャッフルされ得る
配列は、１つ以上の部位特異的組換え配列（例えば、し
ばしば２つの逆転１３塩基反復および８ｂｐスペーサー
からなるＦＬＰ組換え標的部位（ＦＲＴ）（Ｏ’Ｇｏｒ
ｍａｎら、（１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１
３５１； Ｐａｒｓｏｎｓら、（１９９０） Ｊ， Ｂ
ｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５： ４５２７； Ａｍｉ
ｎら、（１９９１） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
１１： ４４９７、本明細書中で参考として援用され
る））に隣接される。ＦＲＴ配列が用いられる場合、Ｆ
ＬＰリコンビナーゼはまた、代表的には、インビトロま
たは宿主細胞内で発現されるかのいずれかである。ここ
で、組み換えられるべき配列は、導入されるかまたは既
に存在する。ＦＬＰ／ＦＲＴ系の代替は、以下を含むが
これらに限定されない：ファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘ
系（ＨｏｅｓｓおよびＡｂｒｅｍｓｋｉ （１９８５）
Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８１： ３５１）、
γ／δ分解酵素（Ｓｔｅｉｔｚら、（１９９０） Ｑｕ
ａｒｔｅｒｌｙ Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ２３：
２０５）、λのａｔｔＢ／ａｔｔＰ系（Ｎｕｎｅｓ−
Ｄｕｂｙら、（１９８７） Ｃｅｌｌ５０：７７９）、
およびバクテリオファージλ、φ８０、Ｐ２２、Ｐ２、
Ｐ４、Ｐ１由来の同様の部位特異的組換え系、および実
施者によって選択される他の同様の部位特異的組換え
系。リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーに関す
る手引きは、Ａｒｇｏｓら、（１９８６） ＥＭＢＯ
Ｊ． ５： ４３３（本明細書中で参考として援用され
る）に見出される。
【０２６２】（エキソヌクレアーゼ）１つの局面におい
て、改善されたシャッフリング法は、エキソヌクレアー
ゼ活性を有する酵素である少なくとも１つの添加剤の添
加を包含する。この活性は、非プルーフリーディングポ
リメラーゼによって触媒されるシャッフリング増幅反応
の際に産物のポリヌクレオチドの３’末端に導入された
非鋳型ヌクレオチドを除去することにおいて活性であ
る。エキソヌクレアーゼ活性を有する適切な酵素の例と
しては、Ｐｆｕポリメラーゼが挙げられるが挙げられる
が、これらに限定されない。エキソヌクレアーゼの例
は、以下である： Ｂａ１３１ バクテリオファージλエキソヌクレアーゼ Ｅ． ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩ Ｅ． ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩＩＩ Ｅ． ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＶＩＩ バクテリオファージＴ７遺伝子６。
【０２６３】（スタッタリング（ｓｔｕｔｔｅｒｉｎ
ｇ））１つの局面では、改善されたシャッフリング法
は、再アニーリングされフラグメント化されたライブラ
リーメンバーポリヌクレオチドの増幅（すなわち、ポリ
メラーゼでの伸長）の少なくとも１サイクルが、不完全
に伸長された増幅産物の実質的な（代表的には少なくと
も２０パーセント以上）画分を生じる条件下で行われる
改変を含む。増幅産物（不完全に伸長された増幅産物を
含む）は変性され、そして再アニーリングおよび増幅の
少なくとも１回のさらなるサイクルに供される。この改
変（少なくとも１サイクルの再アニーリングおよび増幅
によって不完全に伸長された産物の実質的な画分が提供
される）は、「スタッタリング」と呼ばれ、そして次の
増幅の回で、不完全に伸長された産物は、異なる配列間
連テンプレート種上で再アニールしそして、伸長をプラ
イムする。
【０２６４】１つの局面では、改善されたシャッフリン
グ法は改変を包含する。ここで、少なくとも１サイクル
の増幅が、第１のポリヌクレオチド種に対応する種々の
長さの重複している一本鎖ＤＮＡフラグメントの収集物
または関連配列ポリヌクレオチド種のセットを使用して
行われ、ここで、各重複フラグメントは、テンプレート
として作用する第２のポリヌクレオチド種をハイブリダ
イズしそしてこのポリヌクレオチド種由来のポリヌクレ
オチド鎖伸長を各々プライムし、これにより配列組換え
ポリヌクレオチドが形成され得る。ここで、この配列組
換えポリヌクレオチドは、テンプレートとして作用する
第２のポリヌクレオチド種の隣接部分と共に、少なくと
も１つの第１のポリヌクレオチド種の一部を含む。１つ
の改変において、テンプレートとして作用する第２のポ
リヌクレオチド種は、ウラシル（すなわち、Ｋｕｎｋｅ
ｌ型テンプレート）を含み、そして実質的に細胞内では
複製不能である。本発明のこの局面はまた、この改変の
少なくとも２回の反復サイクルを包含し得る。１つの実
施態様では、Ｌｅｖｉｔｃｈｋｉｎら、（１９９５）
Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９： ５７２の方法を用いる
シャッフリングの反復サイクル（これによりＰＣＲフラ
グメントの部分的伸長が生じる）は、反復的にシャッフ
ルされる親配列のプールからキメラを生じるために使用
される。
【０２６５】１つの局面では、改善されたシャッフリン
グ法は、増幅の少なくとも１サイクルが、テンプレート
スイッチングを促進する適切な条件下で添加剤またはポ
リメラーゼを用いて行われる改変を包含する。増幅のた
めにＴａｑポリメラーゼが使用される実施態様におい
て、ｒｅｃＡまたは他のポリメラーゼの添加によって、
テンプレートスイッチングが増強される。テンプレート
スイッチングはまた、当業者に公知の他の手段のなか
で、ＤＮＡテンプレート濃度を増加させることによって
増加され得る。
【０２６６】一般的な方法の実施態様において、配列組
換えポリヌクレオチドのライブラリーは、天然に存在す
る遺伝子または遺伝子の対立遺伝子である配列関連ポリ
ヌクレオチドから生成される。この局面において、少な
くとも５０の連続的ヌクレオチド（少なくとも７０パー
セントの配列同一性、好ましくは少なくとも９０パーセ
ントの配列同一性を有する）の領域を含む少なくとも３
つの天然に存在する遺伝子および／または対立遺伝子
が、ハイブリッド選択によるかまたはデータベースから
の配列データを用いるコンピュータ配列分析によって、
遺伝子配列のプールから選択される。選択された配列
は、クローニングによるかまたはＤＮＡ合成を介するか
のいずれかで、ポリヌクレオチドとして得られ、そして
本発明の種々の実施態様のいずれかによってシャッフル
される。
【０２６７】本発明の１つの実施態様において、本方法
は、開示された任意のシャッフリング法によって生成さ
れる配列組換えポリヌクレオチドからシャッフリングさ
れていない産物（例えば、親配列）を除去するさらなる
工程を包含する。シャッフリングされていない産物は、
以下を用いて増幅を行うことによって、除去され得るか
または避けられ得る：（１）第１の親ヌクレオチド配列
種にハイブリダイズするが、第２の親ポリヌクレオチド
配列種に実質的にハイブリダイズしない、第１のＰＣＲ
プライマー、および（２）第２の親ポリヌクレオチド種
にハイブリダイズするが、第１の親ポリヌクレオチド種
に実質的にハイブリダイズしない第２のＰＣＲプライマ
ー。その結果、増幅は、第１のＰＣＲプライマーにハイ
ブリダイズする第１の親配列の一部を含み、かつ第２の
ＰＣＲプライマーにハイブリダイズする第２の親配列の
一部もまた含むテンプレート上から生じ、従って、配列
組換えポリヌクレオチドのみが増幅される。
【０２６８】本発明の１つの実施態様において、「架
橋」遺伝子が合成され得る。２つ以上の親ポリヌクレオ
チド（例えば、遺伝子）が、ＰＣＲ増幅に有効な相同組
換えまたは有効なクロスプライミングに十分な配列類似
性を欠く場合、親配列との十分な配列同一性を共有する
中間（または「架橋」）遺伝子が合成され得る。架橋遺
伝子は、活性である必要も、表現型または選択可能な特
性を付与される必要もなく、親配列のシャッフリングを
達成するのに十分は配列同一性を有するテンプレートを
提供するだけでよい。架橋遺伝子の中間相同性、および
必要な配列（単数または複数）は、コンピュータによっ
て、または手動で決定され得る。
【０２６９】本発明はまた、原核生物細胞または真核生
物細胞のいずれかにおいて、インビボで反復的組換えを
行うためのさらなるフォーマットを提供する。これらの
フォーマットは、プラスミド間の組換え、ウイルス間の
組換え、プラスミドとウイルスとの間の組換え、染色体
とプラスミドまたはウイルスとの間の組換え、および分
子内組換え（例えば、プラスミド上の２つの配列間）を
包含する。反復組換えは、完全にインビボで行われ、こ
れによりインビボ組換えの断続的な回は、選択またはス
クリーニングの回によって散在される。インビボフォー
マットはまた、インビトロフォーマットと組み合わせて
用いられ得る。例えば、１つのフォーマットは、インビ
トロシャッフリングを１回、選択を１回、インビボシャ
ッフリングを１回、選択をさらに一回、インビトロシャ
ッフリングをさらに１回、および選択をさらに１回、行
い得る。種々のインビボフォーマットが、現在順次考え
られている。
【０２７０】（ａ）プラスミド−プラスミド組換え 組換えのための最初の基質は、遺伝子の変異形態を含む
ポリヌクレオチドの収集物である。変異形態は、通常、
基質間での相同組換えを可能にするに十分な互いの実質
的な配列同一性を示す。ポリヌクレオチド間の多様性
は、天然のもの（例えば、対立形質または種改変体）、
誘導されたもの（例えば、誤りがちなＰＣＲ、合成遺伝
子、コドン使用改変配列改変体）、またはインビトロ組
換えの結果である。基質間には、少なくとも、組換えに
よって開始物質よりも多様な産物が生じ得る、十分な多
様性が存在しなければならない。少なくとも２つの部位
で異なる少なくとも２つの基質が存在しなければならな
い。しかし、通常は、１０3〜１０8メンバーの基質のラ
イブラリーが使用される。多様性の程度は、組み換えら
れている基質の長さおよび進化されるべき機能的変化の
範囲に依存する。０．１〜２５％の間の位置での多様性
が、典型的である。
【０２７１】多様な基質が、プラスミドに取り込まれ
る。プラスミドは、しばしば、標準的なクローニングベ
クター（例えば、細菌のマルチコピープラスミド）であ
る。しかし、以下に記載するいくつかの方法において、
プラスミドは、ＭＯＢ機能を含む。基質は、同じまたは
異なるプラスミドに取り込まれ得る。しばしば、異なる
タイプの選択マーカーを有する少なくとも２つの異なる
タイプのプラスミドが、少なくとも２つのタイプのベク
ターを含む細胞の選択を可能にするために用いられる。
また、異なるタイプのプラスミドが用いられる場合、異
なるプラスミドが、２つの別個の不適合な群から得られ
て、細胞内での２つの異なるプラスミドの安定な共存を
可能にし得る。それにもかかわらず、同じ不適合な群由
来のプラスミドが、相同組換えを生じさせるに十分な時
間、同じ細胞内で共存し得る。
【０２７２】多様な基質を含むプラスミドは、任意のト
ランスフェクション法（例えば、化学的な形質転換、天
然の能力、形質導入、エレクトロポレーション、または
ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）によって、最初に細胞へ導入さ
れる。しばしば、プラスミドは、飽和濃度（最大トラン
スフェクション能力に関して） またはその付近で存在
して、同じ細胞への１つ以上のプラスミドが侵入する確
率を増大させる。種々の基質を含むプラスミドは、同時
にまたは複数回、トランスフェクトされ得る。例えば、
後者のアプローチにおいて、細胞はプラスミドの第１の
アリコートでトランスフェクトされて、トランスフェク
タントは選択されそして増殖され、次いでプラスミドの
第２のアリコートで感染され得る。
【０２７３】プラスミドが細胞内へ導入されると、組換
え遺伝子を生成するための基質間の組換えは、単に細胞
を増殖させることによって、複数の異なるプラスミドを
含む細胞内で起こる。しかし、たった１つのプラスミド
しか受容していない細胞は、組換えを行う可能性が低
く、そして進化のためのこのようなプラスミドに対する
基質の潜在的な寄与が、無駄になる。進化の割合は、全
ての基質に組換えを行わせることによって、増加され得
る。これは、トランスフェクトされた細胞をエレクトロ
ポレーションに供することによって達成され得る。エレ
クトロポレーションの条件は、外来ＤＮＡを細胞に導入
するために従来使用されているものと同一である（例え
ば、１，０００〜２，５００ボルト、４００μＦ、およ
び１〜２ｍＭ ｇａｐ）。これらの条件下で、プラスミ
ドは、細胞間で交換され、これにより全ての基質が組み
換えられることが可能になる。さらに、組換えの産物
は、互いまたは元の基質とのさらなる回の組換えを受け
得る。進化の割合はまた、接合性転移（ｃｏｎｊｕｇａ
ｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆａｒ）の使用によって増大され
得る。接合性転移を利用するために、基質を、ＭＯＢ遺
伝子を有するプラスミド中にクローニングし、そしてｔ
ｒａ遺伝子がまた、ＭＯＢ遺伝子に対してシスまたはト
ランスで提供され得る。接合性転移の効果は、プラスミ
ドが細胞間で移動することを可能にし、そして任意の基
質間での組換えを可能にし、そして以前の組換えの産物
が単に培養物を増殖させることによって起こるという点
で、エレクトロポレーションに非常に類似している。こ
れらのベクターにおいて接合性転移がどのように活用さ
れるかの詳細は、以下により詳細に議論される。進化の
割合はまた、ミューテーター宿主細胞（例えば、Ｍｕｔ
Ｌ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｈ；ヒト毛細管拡張性運動失調（ａ
ｔａｘｉａ ｔｅｌｅｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）細胞）の
使用によって増大され得る。
【０２７４】細胞が増殖しそして組み換えられる時間
は、もちろん、細胞タイプに伴って変化し得るが、重大
ではない。なぜなら、わずかな程度の組換えさえ、出発
物質に比較して多様性を増大させるからである。組換え
遺伝子を含むプラスミドを有する細胞が、所望の機能に
ついてのスクリーニングまたは選択に供される。例え
ば、進化している基質が薬物耐性遺伝子を含む場合、細
胞は薬物耐性について選択される。スクリーニングまた
は選択を生き残った細胞は、一回以上のスクリーニング
／選択、続く組換えに供され得るか、またはさらなる回
数の組換えに直接供され得る。
【０２７５】組換えの次の回は、以前の回に依存してい
くつかの異なるフォーマットによって達成され得る。例
えば、組換えのさらなる回が、単に上記のプラスミドの
エレクトロポレーションまたは接合媒介性細胞内転移を
再開することによってなされ得る。あるいは、新鮮な基
質または基質（前の基質と同じまたは異なる）は、選択
／スクリーニングを生き残っている細胞にトランスフェ
クトされ得る。必要に応じて、新しい基質は、異なる選
択マーカーを有するプラスミドベクターおよび／または
もとのプラスミドと異なる不適合なグループからのプラ
スミドベクターに含まれる。さらなる代替として、選択
／スクリーニングを生き残っている細胞が、２つの部分
集団に細分割され得、１方の部分集団からプラスミドＤ
ＮＡが抽出され、そしてもう一方にトランスフェクトさ
れる。ここで、２つの部分集団からのプラスミド由来の
基質はさらなる回の組換えを受ける。後者の２つの選択
肢（ｏｐｔｉｏｎ）のいずれかにおいて、進化の割合
は、上記のように、エレクトロポレーション、接合、ま
たはミューテーター細胞を用いることによって増大され
得る。なおさらなる改変では、スクリーニング／選択を
生き残っている細胞由来のＤＮＡは、抽出され得、そし
てインビトロＤＮＡシャッフリングに供され得る。
【０２７６】第２回目の組換え後、第２回目のスクリー
ニング／選択が、好ましくはストリンジェンシーを増大
させた条件下で行われる。所望であれば、さらなる回の
組換えおよび選択／スクリーニングが、第２回目と同じ
ストラテジーを用いて行われ得る。組換えおよび選択／
スクリーニングの次の回を用いて、生き残っている組換
え基質は、所望の表現型を取得するように進化する。代
表的には、インビボ反復組換えのこの方法および他の方
法において、所望の表現型を獲得した組換えの最終産物
は、開始物質と０．１％〜２５％の位置で異なり、そし
て世代あたり１０-9位置あたり約１つの変異の天然に獲
得される変異の割合より多い大きさの割合の程度（例え
ば、少なくとも１０倍、１００倍、１０００倍または１
０，０００倍） 進化していた（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＆
Ｈｕｇｈｅｓ、 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３， ９０６−９０７（１９９
６）を参照のこと）。
【０２７７】図２６は、プラスミド−プラスミド組換え
の例示的なスキームを示す。図のパネルＡは、プラスミ
ドにクローニングされた改変体遺伝子のライブラリーを
示す。次いで、ライブラリーは、細胞に導入される。パ
ネルＢに示すように、いくつかの細胞は単一のプラスミ
ドを取り込み、そして別の細胞は２つのプラスミドを取
り込む。２つのプラスミドを取り込んだ細胞について
は、プラスミドは、組換わってパネルＣに示す産物を生
じる。次いで、プラスミドは、パネルＤに示すように、
エレクトロポレーションまたは接合によって細胞間で移
され得、そしてさらに組換えが起こってパネルＥに示す
ような産物が生じ得る。次いで、スクリーニング／選択
により、選択／スクリーニングにより同定されるように
設計された特性を獲得するように進化した遺伝子を有す
るプラスミドを単離する。選択の過程において、２つの
プラスミド（この一方だけが選択された表現型に寄与す
る）を有する細胞は、パネルＦに示すように、もう一方
のプラスミドを欠失し得る。
【０２７８】（ｂ）ウイルス−プラスミド組換え プラスミド−プラスミド組換えに用いられるストラテジ
ーはまた、ウイルス−プラスミド組換え（通常は、ファ
ージプラスミド組換え）にも使用され得る。しかし、特
にウイルスの使用に関するいくつかのさらなる注釈が適
切である。組換えのための最初の基質は、プラスミドお
よびウイルスベクターの両方にクローニングされる。基
質がウイルスベクターに挿入され、そしてプラスミドに
挿入されることは、通常重要ではないが、通常ウイルス
ベクターは、プラスミド由来の異なる基質を含むはずで
ある。以前のように、プラスミドは、代表的には、選択
マーカーを含む。プラスミドおよびウイルスベクターは
共に、上記のように、トランスフェクションによって細
胞に導入され得る。しかし、より有効な手順は、プラス
ミドで細胞をトランスフェクションし、トランスフェク
タントを選択し、そしてウイルスでトランスフェクタン
トを感染させることである。多くのウイルスの感染の効
率は、細胞の１００％にほぼ等しいので、この経路でト
ランスフェクションされそして感染されたほとんどの細
胞は、異なる基質を有するプラスミドおよびウイルスの
両方を有する。
【０２７９】相同組換えは、プラスミドとウイルスとの
間で起こり、組換えプラスミドおよび組換えウイルスの
両方を生成する。フィラメント様ファージのようないく
つかのウイルスについては、細胞内ＤＮＡが、２本鎖お
よび一本鎖の形態の両方で存在し、その両方が組み換え
を行い得る。ウイルスが迅速に細胞を殺さなければ、組
換えは、エレクトロポレーションの使用または接合によ
って増大されて、細胞間でプラスミドを移動させる。組
換えはまた、１つの細胞由来の子孫ウイルスが他の細胞
に再感染することを可能にすることによって、ウイルス
のいくつかのタイプを増大させ得る。いくつかのウイル
スのタイプについては、ウイルス感染細胞は、重複感染
に耐性を示す。しかし、このような耐性は、高多重度で
の感染により、および／または重複感染に対する耐性が
低下しているウイルスの変異株を用いて克服され得る。
【０２８０】プラスミド含有細胞をウイルスで感染させ
た結果は、ウイルスの性質に依存する。いくつかのウイ
ルス（例えば、フィラメント様ファージ）は、細胞内で
プラスミドと共に安定に存在し、そしてまた細胞から子
孫ファージを押し出す。他のウイルス（例えば、コスミ
ドゲノムを有するλ）は、プラスミドのように、子孫ビ
リオンを産生することなく細胞中に安定に存在する。他
のウイルス（例えば、Ｔファージおよび溶解性λ）は、
プラスミドとの組換えを受けるが、最終的には宿主細胞
を殺しそしてプラスミドＤＮＡを破壊する。宿主を殺す
ことなく細胞に感染するウイルスについては、組換えプ
ラスミドおよびウイルスを含む細胞が、プラスミド−プ
ラスミド組換えと同様のアプローチを使用して、スクリ
ーニング／選択され得る。選択／スクリーニングを生き
残った細胞によって押し出された子孫ウイルスはまた、
回収されそして組換えの次の回の基質として使用され得
る。宿主細胞を殺すウイルスについては、組換えから得
られた組換え遺伝子は、子孫ウイルスにのみ残る。スク
リーニングまたは選択アッセイが、細胞内での組換え遺
伝子の発現を必要とする場合、組換え遺伝子は、子孫ウ
イルスから他のベクター（例えば、プラスミドベクタ
ー）に移され、そして選択／スクリーニングが行われる
前に、細胞に再トランスフェクトされなければならな
い。
【０２８１】フィラメント様ファージについては、組換
えの産物は、組換えを生き残っている細胞およびこれら
の細胞から押し出されたファージの両方に存在する。組
換え産物の二元的な供給源は、プラスミド−プラスミド
組換えと比較して、いくつかのさらなる選択肢を提供す
る。例えば、ＤＮＡは、インビトロ組換えの回で使用す
るためにファージ粒子から単離され得る。あるいは、子
孫ファージは、前の回のスクリーニング／組換えを生き
残っている細胞、または組換えのために新鮮な基質でト
ランスフェクトされた新鮮な細胞を、トランスフェクト
または感染するために使用され得る。１つの局面におい
て、本発明は、一本鎖バクテリオファージおよび／また
はファージミドのような複数の一本鎖種間での組換えを
用いる。
【０２８２】図２７は、ウイルス−プラスミド組換えに
ついてのスキームを例示する。パネルＡは、プラスミド
またはウイルスベクターにクローニングした遺伝子の変
異形態のライブラリーを示す。次いで、プラスミドを、
パネルＢに示すように、細胞に導入する。ウイルスゲノ
ムは、インビトロでパッケージされ、そしてパネルＢに
示す細胞を感染させるために使用される。ウイルスゲノ
ムは、パネルＣに示すように、細胞内で複製され得る。
ウイルスゲノムは、パネルＤに示すプラスミドおよびウ
イルスの形態を生じるプラスミドゲノムでの組換えを受
ける。プラスミドおよびウイルスゲノムの両方は、パネ
ルＥおよびＦに示す構造を生じるさらなる回の複製およ
び組換えを受け得る。スクリーニング／選択によって、
パネルＧに示すように、スクリーニング／選択プロセス
での細胞の生存を可能にするように最も良く進化した遺
伝子を有するプラスミドおよび／またはウイルスゲノム
を含む細胞が同定される。これらのウイルスゲノムはま
た、この様な細胞に押し出されたウイルス中にも存在す
る。
【０２８３】（ｃ）ウイルス−ウイルス組換え プラスミド−プラスミド組換えおよびプラスミド−ウイ
ルス組換えについて記載した原理は、いくつかの改変を
加えて、ウイルス−ウイルス組換えに適用され得る。組
換えのための最初の基質は、ウイルスベクターにクロー
ニングされる。通常、全ての基質について同じベクター
が使用される。好ましくは、ウイルスは、本来、または
変異の結果、細胞を殺さないウイルスである。挿入後、
ウイルスゲノムは、通常インビトロでパッケージされ
る。パッケージされたウイルスは、高多重度で細胞を感
染するために使用され、従って、細胞が異なる基質を保
有する複数のウイルスを受容する確率は高い。
【０２８４】初回の感染後の、次の工程は、前節で議論
したような感染の性質に依存する。例えば、ウイルス
が、λコスミドまたはＭ１３、Ｆ１またはＦｄファージ
ミドのようなファージミドゲノムを有する場合、ファー
ジミドは、細胞内でプラスミドのように挙動し、そして
単に細胞を増殖させることによって組換えを受ける。組
換えは、細胞内ＤＮＡの一本鎖の形態の間で特に有効で
ある。組換えは、細胞のエレクトロポレーションによっ
て増大され得る。選択／スクリーニングに続いて、組換
え遺伝子を含むコスミドは、生き残っている細胞から
（例えば、ｃｏｓ-溶原性宿主細胞の熱誘導によって）
回収され、インビトロで再パッケージされ、そしてさら
なる回の組換えのために高多重度で新鮮な細胞を感染さ
せるために使用され得る。
【０２８５】ウイルスがフィラメント様ファージである
場合、複製している形態のＤＮＡの組換えは、感染させ
た細胞の培養物を増殖させることによって起こる。選択
／スクリーニングによって、特性が改善された組換え遺
伝子を有するウイルスベクターを、この様な細胞から押
し出されたファージと共に含む細胞のコロニーが同定さ
れる。次の選択肢は、プラスミド−ウイルス組換えと本
質的に同じである。
【０２８６】図２８は、ウイルス−ウイルス組換えの例
を示す。多様な遺伝子のライブラリーは、λコスミドに
クローニングされている。組換えコスミドＤＮＡは、イ
ンビトロでパッケージされ、そして高多重度で宿主を感
染するために用いられ、その結果、異なる挿入片を保有
する多くのコスミドが同じ細胞に入る。選択される細胞
は、ｃｏｓ-λ溶原性であり、これは誘導の際に溶原性
ＤＮＡをパッケージせずにコスミドＤＮＡをパッケージ
する。コスミドは細胞内で組換わる。組換えは、Ｍｕｔ
Ｄ、ＭｕｔＳ、ＭｕｔＬであるか、および／または改変
ｒｅｃＡを発現する宿主細胞の使用によって加速され得
る。溶原性の誘導により、パッケージされたコスミド
（これは、開始物質よりも多様性を有する）の放出が生
じる。
【０２８７】（ｄ）染色体−プラスミド組換え このフォーマットは、染色体およびプラスミドを保有す
る基質の両方を進化させるために使用され得る。このフ
ォーマットは、多くの染色体遺伝子が表現型に寄与する
状況、または進化させるべき染色体遺伝子の正確な位置
が不明である状況で、特に有用である。組換えのための
最初の基質が、プラスミドベクターにクローニングされ
る。進化させる染色体遺伝子が既知である場合、基質
は、高い程度の配列同一性を示すが、染色体遺伝子由来
のいくらかの多様性も示す配列のファミリーを構成す
る。進化させる染色体遺伝子が位置づけされていない場
合、最初の基質は、通常、ごく少数のみしか進化させる
べき遺伝子（単数または複数）に対する配列同一性を示
さないＤＮＡセグメントのライブラリーを構成する。プ
ラスミド保有基質と染色体遺伝子（単数または複数）と
の間の多様性は、変異原誘発によって誘導され得るか、
または染色体を保有する細胞の種とは異なる種から基質
を保有するプラスミドを得ることによって誘導され得
る。
【０２８８】組換えのための基質を保有するプラスミド
は、進化させる染色体遺伝子（単数または複数）を有す
る細胞にトランスフェクトされる。進化は、単に培養物
を増殖させることによって起こり得、そして接合または
エレクトロポレーションによって細胞間でプラスミドを
移動させることによって加速され得る。進化は、ミュー
テーター宿主細胞の使用によって、またはミューテータ
ー性宿主細胞で進化している非ミューテーター宿主細胞
を播種しそしてエレクトロポレーションまたは接合によ
りプラスミドの細胞内転移を誘導することによって、さ
らに加速され得る。好ましくは、播種に用いられるミュ
ーテーター宿主細胞は、進化している非ミューテーター
細胞の純粋な培養物の単離を容易にするために、ネガテ
ィブな選択マーカーを含む。選択／スクリーニングによ
って、所望の機能を獲得するように進化した染色体およ
び／またはプラスミドを保有する細胞が同定される。
【０２８９】組換えおよび選択／スクリーニングの次の
回は、プラスミド−プラスミド組換えについて記載した
様式と同様の様式で進行する。例えば、さらなる組換え
は、プラスミドのエレクトロポレーションまたは接合の
転移と組み合わせて、組換えを生き残っている細胞を増
殖させることによってなされ得る。あるいは、組換えの
ためのさらなる基質を保有するプラスミドが、生き残っ
ている細胞に導入され得る。好ましくは、このようなプ
ラスミドは、異なる不適合な群由来であり、そして元の
プラスミドと異なる選択マーカーを保有し、少なくとも
２つの異なるプラスミドを含む細胞の選択を可能にす
る。さらなる代替として、プラスミドおよび／または染
色体ＤＮＡは、生き残っている細胞の部分集団から単離
され、そして第２の部分集団にトランスフェクトされ得
る。染色体ＤＮＡは、トランスフェクションの前に、プ
ラスミドベクターにクローニングされ得る。
【０２９０】図２９は、プラスミド−染色体シャッフリ
ングのスキームを例示する。パネルＡは、プラスミドベ
クターにクローニングされた遺伝子の変異形態を示す。
プラスミドは、パネルＢに示すように、細胞に導入され
る。細胞中で、プラスミドは、複製し、そしてパネルＣ
に示すように、遺伝子の染色体コピーでの組換えを受け
る。細胞間でのプラスミドの交換は、パネルＤに示すよ
うに、エレクトロポレーションまたは接合によってなさ
れ得る。パネルＤに示す２つの細胞の染色体遺伝子は、
異なる変異形態に進化している。スクリーニング／選択
によって、パネルＥに示すように、細胞がスクリーニン
グ／選択を生き残る所望の特性を獲得するように進化し
た染色体遺伝子を保有する細胞が同定される。
【０２９１】（ｅ）ウイルス−染色体組換え 上記の他の方法におけるように、ウイルスは、通常、細
胞を殺すウイルスではなく、そしてしばしばファージま
たはファージミドである。手順は、実質的にプラスミド
−染色体組換えと同じである。組換えのための基質が、
ベクター中にクローニングされる。次いで、基質を含む
ベクターが、細胞へトランスフェクトされるか、または
インビトロでパッケージされ、そして感染によって細胞
に導入され得る。ウイルスゲノムは、単に培養物を増殖
させることによって、宿主染色体と組換わる。進化は、
エレクトロポレーションによるウイルスゲノムに細胞内
で転移されることによって、または子孫ビリオンによる
細胞の再感染によって、加速され得る。スクリーニング
／選択によって、所望の特性を獲得するように進化した
染色体および／またはウイルスゲノムを有する細胞が同
定される。
【０２９２】組換えの次の回について、いくつかの選択
肢が存在する。例えば、ウイルスゲノムを、エレクトロ
ポレーションによって選択／組換えを生き残っている細
胞間を移動させ得る。あるいは、選択／スクリーニング
を生き残っている細胞から押し出されたウイルスはプー
ルされ、そして高多重度で細胞を重複感染させるために
使用され得る。あるいは、組換えのための新鮮な基質
が、プラスミドまたはウイルスベクターのいずれかで、
細胞内に導入され得る。
【０２９３】ｅ．接合性転移による遺伝子の進化 上記のように、接合により細胞間のプラスミドの転移を
可能にすることによって、プラスミドＤＮＡのインビボ
での進化の割合が加速され得る。接合は、細胞間の接触
の間に起こるＤＮＡの転移である。Ｇｕｉｎｅｙ（１９
９３）： Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｎｊｕｇａｔｉｏｎ
（Ｃｌｅｗｅｌｌ編、ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ， Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ）、７５〜１０４頁；Ｒｅｉｍｍａｎｎ
およびＨａｓｓ、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｏｎｊｕｇａ
ｔｉｏｎ （Ｃｌｅｗｅｌｌ編、Ｐｌｅｕｎｍ Ｐｒｅ
ｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９３）、１３７−１８
８頁（その全体が本明細書中で参考として援用される）
を参照のこと。接合は、多くのタイプのグラム陰性細菌
およびいくつかのタイプのグラム陽性細菌の間で起こ
る。接合性転移はまた、細菌と植物細胞（Ａｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）または酵母
との間でも知られている。同時係属中の出願の代理人番
号１６５２８Ｊ−０１４６１２に議論されるように、接
合性転移を担う遺伝子は、そのような転移が生じ得る間
の細胞型の範囲（例えば、細菌から哺乳動物）に広がる
ように進化され得る。
【０２９４】接合性転移は、転移の起点（ｏｒｉＴ）お
よび隣接する遺伝子（ＭＯＢ Ａ，Ｂ， およびＣ）、
ならびにｔｒａと呼ばれる接合を生じるために必要な構
造および酵素をコードする１５〜２５遺伝子から生じ
る。転移の起点は、ＤＮＡ転移のｃｉｓにおいて必要と
される部位として規定される。ｔｒａ遺伝子は、ｔｒ
ａ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、
Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｕ、Ｖ、Ｗ、Ｘ、
Ｙ、Ｚ、ｖｉｒ ＡＢ（対立形質１〜１１）、Ｃ、Ｄ、
Ｅ、Ｇ、ＩＨＦ、およびＦｉｎＯＰを含む。ｏｒｉＴは
また、時にｔｒａ遺伝子とも呼ばれる。他の細胞性酵素
（ＲｅｃＢＣＤ経路の酵素、ＲｅｃＡ、ＳＳＢタンパク
質、ＤＮＡジャイレース、ＤＮＡｐｏｌＩ、およびＤＮ
Ａリガーゼを含む）もまた、接合性転移に関与する。ｒ
ｅｃＥまたはｒｅｃＦ経路が、ＲｅｃＢＣＤを置換し得
る。
【０２９５】ｔｒａ遺伝子およびＭＯＢ遺伝子は、ｏｒ
ｉＴに対してｃｉｓまたはｔｒａｎｓで発現され得る。
接合を受けているベクターはまた、不適合性群（例え
ば、Ｉｎｃ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、（Ｉ〜ＶＩ）、
Ｈ（Ｉ、Ｙ）、ｉ（１、２、５、α）、Ｊ、Ｋ、Ｌ、
Ｍ、Ｎ、Ｐ（α、β、１α、３、７、１０、１３）Ｑ、
Ｒ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、Ｓ、Ｔ、Ｕ、Ｗ、Ｘ、Ｚ）に
属するとして分類される複製起点を有する。異なる不適
合性群由来のベクターのみが、同じ細胞内で安定に共存
し得る。しかし、同じ不適合性群由来の２つのベクター
が同じ細胞にトランスフェクトされる場合、ベクター
は、このベクター間で組換えが生じ得るに十分な時間、
一過性に共存する。
【０２９６】ｔｒａ遺伝子にコードされる１つの構造タ
ンパク質は６本の繊毛（細胞の表面から突き出ている単
一のポリペプチドの集合で構築されるフィラメント）で
ある。６本の繊毛は、レシピエント細胞上の多糖に結合
し、そして接合性架橋（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ ｂｒ
ｉｄｇｅ）（これを通ってＤＮＡが転移し得る）を形成
する。この過程で、ＭＯＢ遺伝子にコードされる部位特
異的ヌクレアーゼが活性化される。これは、ｏｒｉＴで
転移されるべきＤＮＡを特異的に切断する。次いで、切
断されたＤＮＡは、他のｔｒａ酵素の作用によって接合
性架橋を通る。
【０２９７】ＤＮＡは、可動性ベクターの成分として存
在する場合、細胞間をより有効に移動する。しかし、い
くつかの可動性ベクターは、宿主染色体に組み込み、そ
してそれによって染色体から隣接する遺伝子を移動させ
る。例えば、Ｅ． ｃｏｌｉのＦプラスミドは、高頻度
で染色体に組み込み、そして組み込みの部位から遺伝子
を一方向的に移動させる。他の可動性ベクターは、自発
的に高頻度で宿主染色体に組み込まないが、特定の条件
（例えば、変異原性薬剤での処置、プラスミド複製がで
きない温度での増殖）下での増殖によって、そのように
誘導され得る。ＲｅｉｍａｎｎおよびＨａａｓ、Ｂａｃ
ｔｅｒｉａｌ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ（編Ｃｌｅｗｅ
ｌｌ， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ １９９
３）第６章を参照のこと。
【０２９８】接合は、遺伝子の多様な組換え形態を生成
するためにインビボで遺伝子を組み換える手段を提供す
る。反復組換えの他の方法のように、組換えおよび選択
／スクリーニングの相互作用的サイクルを用いて、新規
のまたは改善された特性を獲得するように遺伝子を進化
させ得る。反復組換えの任意の方法のように、第１の工
程は、進化させるべき遺伝子（単数または複数）の多様
な形態のライブラリーを生成するためのものである。多
様な形態は、天然の多様性、伝統的な変異誘発方法（例
えば、誤りがちなＰＣＲまたはカセット変異誘発）の適
用の結果であり得るか、またはこの適用で議論された任
意の他の組換えフォーマットの結果であり得るか、また
はこれらの任意の組合せであり得る。多様な形態の数
は、約１０〜１００、１０4、１０6、１０8、または１
０10まで、広範に変化し得る。しばしば、目的の遺伝子
（単数または複数）は、別個のユニットとして変異誘発
される。しかし、遺伝子（単数または複数）の位置が未
知である場合または多数の遺伝子が同時に進化する場
合、最初の多様性は、遺伝子（単数または複数）を含む
染色体のインサイチュ変異誘発によって生じ得る。
【０２９９】遺伝子（単数または複数）の多様な形態の
ライブラリーは、通常遺伝子が発現され得るような配置
で、接合性転移に必要な装置を含む細胞（ライブラリー
はまだこのような細胞に含まれていないと仮定する）に
導入される。例えば、遺伝子（単数または複数）がプロ
モーターのような必須の調節配列の非存在下で変異誘発
される場合、これらの配列は、細胞への導入の前に再付
着される。同様に、遺伝子のフラグメントが単離された
状態で変異誘発される場合、変異誘発産物は、通常細胞
へ導入される前に、変化していない隣接配列と再度結合
される。接合性転移に必要な装置は、その発現が接合性
転移を生じるために必要であるｍｏｂおよびｔｒａ遺伝
子と共に転移の起点を有するベクターを含む。これらの
遺伝子は、ベクター、１つ以上の異なるベクター、また
は染色体に含まれ得る。進化させるべき多様な形態の遺
伝子のライブラリーは、通常転移の起点を含むベクター
に挿入される（図３０を参照のこと）。しかし、いくつ
かの状況において、多様な形態の遺伝子のライブラリー
は、染色体または第２のベクター中に存在し得るか、ま
たは転移の起点を含むベクター中の代わりに存在し得
る。多様な形態のライブラリーは、異なる細胞の異なる
位置に挿入され得る。
【０３００】種々の形態のライブラリーを保有するベク
ターは、少なくとも１つの複製起点を含む。異なる細胞
タイプ間の転移が意図される場合、ベクターは、２つの
複製起点（１つは各細胞タイプで機能的である（すなわ
ち、シャトルベクター））。あるいは、転移された遺伝
子がレシピエント細胞の染色体に組み込むことを意図す
る場合は、ベクターは、レシピエント細胞で機能的であ
る複製起点を含まない（すなわち、自殺ベクター）こと
が好ましい。ｏｒｉＴ部位および／またはＭＯＢ遺伝子
は、ＲＫ２／ＲＰ４ ＭＯＢ機能をクローニングまたは
置き換えることによって（Ｇｕｉｎｅｙ， Ｊ． Ｍｏ
ｌ． Ｂｉｏｌ． １６２， ６９９−７０３（１９８
２））、またはＭＯＢ含有プラスミドとの同時組み込み
形成によって、ベクターに導入され得る。大きなプラス
ミドについて便利な方法は、「Ｔｎ５−Ｍｏｂ」の使用
である。Ｔｎ５−Ｍｏｂは、ＲＰ４のｏｒｉＴを含むＴ
ｎ５トランスポゾンである。例えば、ｐＵＣ様可動性ベ
クターｐＫ１８およびｐＫ１９（Ｓｃｈａｆｅｒら、
（１９９５） Ｇｅｎｅ １４５：６９−７３）は、進
化させるべきｔｒａ遺伝子ライブラリーの適切な開始ク
ローニングベクターである。
【０３０１】必要ではないが、組換えは、時に、多様な
遺伝子ライブラリーを、異なる不適合性起点を有する異
なる種類の２つのベクターに挿入することによって容易
にされる。各ベクターはｏｒｉＴを含むはずであり、そ
して細胞は、両方のベクターの可動化に適したＭＯＢお
よびｔｒａ機能を発現するはずである。２つのこのよう
な種のベクターの使用により、同じ細胞内での複数のベ
クターの安定な共存が可能であり、そしてベクター間の
組換えの効率が増大する。
【０３０２】細胞の収集物は、遺伝子を発現させるため
に任意の適切な培地中で増殖される。ｔｒａおよびｍｏ
ｂ遺伝子は発現され、そして細胞間での可動性ベクター
の転移を媒介する。多様なライブラリーが、可動性ベク
ターにクローニングされ、そのメンバーは、ベクターの
成分として転移される。多様なライブラリーまたはライ
ブラリーの特定のエレメントが可動性ベクターに対して
トランスで存在する場合、可動性ベクターがこのエレメ
ントに組み込むかまたはこれに近くなる場合にのみこれ
らは転移される。上記のように、組み込み頻度がＥ．
ｃｏｌｉのＦプラスミドについて自然に起こり、そして
他の可動性ベクターについて誘導され得る。
【０３０３】細胞間の多様なライブラリーのメンバーの
転移の結果として、細胞のいくつかは、多様なライブラ
リーのメンバーの１つ以上を含むようになる。複数のメ
ンバーが、組換え形態のライブラリーにおいてなおさら
なる多様性を生じるこのような細胞内での組換えを受け
る。一般に、細胞がより長く増殖されればされるほど、
組換え形態がより多く生じる。一般に、組換えにより同
じ細胞内に１つ以上の組換え産物が生じる。両方の組換
え産物がベクター上にあり、そしてベクターが同じ不適
合性群由来である場合、ベクターの１つは、細胞が増殖
するにつれて失われる。このプロセスは、組換え産物の
どちらか一方が選択の利点を付与する選択培地上で細胞
が増殖される場合により速く起こる。組換えの適切な期
間（これは細胞タイプおよびその増殖周期時間に依存す
る）後、組換え形態は、スクリーニングまたは選択に供
される。組換え形態がすでに細胞内に存在するので、組
換えのこのフォーマットは、インビボスクリーニングま
たは選択の周期との交替を特に受けやすい。もちろん、
スクリーニングまたは選択の条件は、遺伝子（単数また
は複数）が進化して獲得するかまたはそれにおいて改善
されることが所望される特性に依存する。例えば、特性
が薬物耐性である場合、最も良好な薬物耐性を有する組
換え形態が、薬物への曝露によって選択され得る。ある
いは、遺伝子のクラスターが進化して２次代謝産物とし
ての薬物を産生する場合、遺伝子の組換えクラスターを
保有する細胞は、組換えクラスターを保有する細胞のコ
ロニーを薬物に感受性である細胞の芝生（ｌａｗｎ）で
覆うことによってスクリーニングされ得る。最良の薬物
を産生する組換えクラスターを有するコロニーは芝生の
穴から同定される。遺伝子が増殖特徴の増強を付与する
ように進化している場合、最良の遺伝子を保有する細胞
は、増殖競合によって選択され得る。抗生物質産生は、
細胞が増殖について他の細胞タイプと競合する場合、増
殖速度の利点であり得る。 選択／スクリーニングによ
って、所望の特性を獲得するように進化した遺伝子（単
数または複数）の組換え形態を発現するサブ集団が産生
される。これらの組換え形態は、次いで、任意の順で、
組換えおよびスクリーニング／選択のさらなる回に供さ
れ得る。例えば、２回目のスクリーニング／選択は、一
回目と同様に行われ得、所望の特性を獲得するように進
化した遺伝子をさらに豊富にする。必要に応じて、選択
のストリンジェンシーは、各回の間で増加され得る（例
えば、薬物耐性について選択する場合、培地中の薬物の
濃度が増大され得る）。組換えのさらなる回はまた、一
回目と同様のストラテジーによって行われ得、遺伝子
（単数または複数）のさらなる組換え形態を生成する。
あるいは、組換えのさらなる回は、議論した任意の他の
分子交配（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｅｅｄｉｎｇ）フ
ォーマットによって行われ得る。最終的に、所望の特性
を十分に獲得した遺伝子（単数または複数）の組換え形
態が生成される。
【０３０４】図３０は、薬物耐性遺伝子が接合性転移に
よってどのように進化し得るかの例を提供する。パネル
Ａは、ｏｒｉＴを保有している可動性ベクターにクロー
ニングされた多様な遺伝子のライブラリーを示す。この
ベクターは、ｔｒａ機能を提供する第２のベクターを含
む細胞に存在する。接合性転移によって、細胞間を可動
性ベクターが移動し、その結果、パネルＢに示すよう
に、異なる変異形態の遺伝子を保有する異なるベクター
が同じ細胞を占拠する。遺伝子の異なる形態は組換わっ
てパネルＣに示す産物を生じる。接合および組換えを所
望の期間進行させた後、細胞は、パネルＤに示すよう
に、組み換えられた遺伝子を含む細胞を同定するために
選択される。
【０３０５】１つの局面において、別のシャッフリング
法は、プラスミド内の組換えの使用を包含し、ここで、
配列組換えポリヌクレオチド配列のライブラリーは、同
じプラスミド上に位置する直接配列反復のインビボでの
遺伝子組換えによって得られる。改変において、組み換
えられるべき配列は、部位特異的組換え配列に隣接し、
そしてポリヌクレオチドは部位特異的組換え系（例え
ば、インテグロン（ＨａｌｌおよびＣｏｌｌｉｎｓ（１
９９５） Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １５：
５９３、本明細書中で参考として援用される））に存在
する。
【０３０６】本発明の１つの局面において、宿主細胞の
ミューテーター株を使用して、より高度にミスマッチし
た配列間連ポリヌクレオチドの組換えを増強する。Ｍｕ
ｔＬ、ＭｕｔＳ、またはＭｕｔＨのような細菌株、ある
いはＭｕｔタンパク質を発現する他の細胞（ＸＬ−１ｒ
ｅｄ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，
ＣＡ）が、インビボ組換えによる配列間連ポリヌクレ
オチドのシャッフリングのための宿主細胞として使用さ
れ得る。他の変異傾向の宿主細胞タイプ（例えば、プル
ーフリーディング欠損ポリメラーゼを有する細胞 Ｆｏ
ｓｔｅｒら、（１９９５）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａ
ｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ． Ｓ． Ａ．） ９２：７
９５１、本明細書中で参考として援用される） もま
た、使用され得る）。他のインビボ変異誘発フォーマッ
トが使用され得、宿主細胞に化学的変異原または放射線
学的変異原を投与する工程を包含する。このような変異
原の例として、以下が挙げられるが、これらに限定され
ない：ＥＮＵ、ＭＭＮＧ、ニトロソ尿素、ＢｕＤＲな
ど。
【０３０７】シャッフリングを用いて、ＰＣＲまたはＰ
ＣＲ様増幅反応において塩基のアナログを取り込み得る
ポリメラーゼを進化させ得る。塩基アナログを使用する
ように進化させられるＤＮＡポリメラーゼを用いて、Ｐ
ＣＲによって、質量分析ＤＮＡ配列決定のような質量分
析においてより合理的なフラグメント化パターンをもた
らす化学的形態にＤＮＡをコピーし得る。塩基アナログ
は、より少ないおよび／またはより多い好ましいフラグ
メント部位を有して、質量分析パターンの解釈を増強す
るかまたは容易にし得る。
【０３０８】改変ポリメラーゼはまた、反復的な配列組
換えによって進化させられて、非天然ヌクレオチドまた
はヌクレオチドアナログ（例えば、ホスホロチオエート
ヌクレオチド）を取り込み得る。このような改変ポリメ
ラーゼで作製されたホスホロチオエートヌクレオチド
は、多くの用途（ヌクレアーゼ分解に耐性の裸のＤＮＡ
遺伝子治療ベクターを含む）を提供する。反復配列組換
えを介して改変され得るポリメラーゼの特性の他の例と
して、以下が挙げられるが、これらに限定されない：特
に、処理性（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）、エラー率、
プルーフリーディング、熱安定性、酸化耐性、ヌクレオ
チド優先性、テンプレート特異性など）。
【０３０９】１つの実施態様において、蛍光活性化細胞
ソーティングまたは類似の方法論は、反復して組み換え
られた配列のライブラリーのライブラリーメンバーを含
む宿主細胞（代表的には哺乳動物細胞、昆虫細胞、また
は細菌細胞）をスクリーニングするために使用される。
ここで、所望の表現型を付与するライブラリーメンバー
を有する宿主細胞は、１つ以上の検出波長での蛍光また
は光学的密度に基づいて選択され得る。例えば、１つの
実施態様において、各ライブラリーは、代表的には、酵
素（これは、細胞から分泌され得るかまたは細胞内であ
り得る）をコードし、そしてこの酵素は染色体または蛍
光原性基質（これは、宿主細胞内に分散され得る）の転
換を触媒する（例えば、この酵素が分泌されない場
合）。ライブラリーメンバーを含む宿主細胞は、液体の
滴またはゲルの滴に含まれ、そして検出装置を通過す
る。ここでこの滴は励起波長で照射され、そして検出器
は蛍光放出波長照射を測定するか、および／または１つ
以上の励起的波長での光学密度（吸光度）を測定するか
のいずれかである。滴に懸濁された細胞は、約１個だけ
の個々の細胞が一回にサンプル検出領域に存在するよう
な条件下で、サンプル検出器を通過する。光源は、各細
胞および検出器（代表的には光増幅器または発光ダイオ
ード）を照射し、放出された照射を検出する。検出器
は、検出されるシグナル（単数または複数）に基づい
て、検出領域における細胞の、複数のサンプル収集領域
の１つへ細胞が入るのを制御する。 米国特許第４，１
７２，２２７号；同第４，３４７，９３５号；同第４，
６６１，９１３号；同第４，６６７，８３０号；同第
５，０９３，２３４号；同第５，０９４，９４０号；お
よび同第５，１４４，２２４号に提供されるＦＡＣＳ装
置および方法の一般的な記載は、本明細書中で参考とし
て援用される。従来のＦＡＣＳの適切な代替は、Ｏｎｅ
Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ． Ｃａｍｂｒ
ｉｄｇｅ， ＭＡから入手可能である。上記から認識さ
れ得るように、本発明は、広範な適用を有する。従っ
て、以下実施例は、限定のためでなく、例示のために提
供される。
【０３１０】以下の実施例において、以下の略語は以下
の意味を有する。以下に定義されない場合、その略語は
当該分野で理解される意味を有する。 ｍｌ ＝ ミリリットル μｌ ＝ マイクロリットル μＭ ＝ マイクロモル濃度 ｎＭ ＝ ナノモル濃度 ＰＢＳ ＝ リン酸緩衝化生理食塩水 ｎｇ ＝ ナノグラム μｇ ＝ マイクログラム ＩＰＴＧ ＝ イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド ｂｐ ＝ 塩基対 ｋｂ ＝ キロ塩基対 ｄＮＴＰ ＝ デオキシヌクレオシド３リン酸 ＰＣＲ ＝ ポリメラーゼ連鎖反応 Ｘ−ｇａｌ ＝ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ− ガラクトシド ＤＮＡｓｅＩ ＝ デオキシリボヌクレアーゼ ＰＢＳ ＝ リン酸緩衝化生理食塩水 ＣＤＲ ＝ 相補性決定領域 ＭＩＣ ＝ 最小阻止濃度 ｓｃＦｖ ＝ 抗体の単鎖Ｆｖフラグメント。
【０３１１】
【実施例】一般に、組換えＤＮＡ工学の標準的な技術
は、種々の出版物（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９
８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ； Ａ
ｕｓｕｂｅｌら、１９８７， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ、１巻および２巻ならびに増補、ならびにＢｅｒｇ
ｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ， １５２巻， Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ （１９８７）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ、それ
ぞれ参考として全体が本明細書中に援用される）に記載
されている。制限酵素およびポリヌクレオチド修飾酵素
を、製造業者の推奨に従って用いた。オリゴヌクレオチ
ドをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．
Ｍｏｄｅｌ ３９４ＤＮＡ合成機で、ＡＢＩの化学製
品を用いて合成した。所望であれば、予め決定されたＤ
ＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲアンプリマー（ａｍｐ
ｌｉｍｅｒ）は、従事者の判断で選択され得る。
【０３１２】（実施例１． ＬａｃＺα遺伝子の再組
立） １）基質の調製 再組立反応のための基質は、ｐＵＣ１８由来の野生型Ｌ
ａｃＺα遺伝子のｄｓＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応
（「ＰＣＲ」）産物であった（図２）（２８； Ｇｅｎ
ｅ Ｂａｎｋ第ＸＯ２５１４号）。プライマー配列は、
５’ＡＡＡＧＣＧＴＣＧＡＴＴＴＴＴＧＴＧＡＴ３’
（配列番号１）および５’ＡＴＧＧＧＧＴＴＣＣＧＣＧ
ＣＡＣＡＴＴＴ３’（配列番号２）であった。遊離した
プライマーを、製造業者の指示に従い、Ｗｉｚａｒｄ
ＰＣＲ ｐｒｅｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ
ＷＩ）によりＰＣＲ産物から除去した。遊離したプライ
マーの除去は、重要であることが見い出された。
【０３１３】２）ＤＮＡｓｅＩ消化 約５μｇのＤＮＡ基質を、１０〜２０分間室温にて、１
００μｌの［５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．
４， １ｍＭ ＭｇＣｌ2］中で、０．１５単位のＤＮ
ＡｓｅＩ（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）
で消化した。消化されたＤＮＡを、２％低融点アガロー
スゲルで泳動した。１０〜７０塩基対（ｂｐ）のフラグ
メントを、ＤＥ８１イオン交換紙（Ｗｈａｔｍａｎ，
Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏｕｇｈ ＯＲ）上への電気泳動によ
り２％低融点アガロースゲルから精製した。ＤＮＡフラ
グメントを、１Ｍ ＮａＣｌを用いてこの紙から溶出し
てエタノール沈澱した。
【０３１４】３）ＤＮＡ再組立 精製されたフラグメントを、ＰＣＲ Ｍｉｘ（０．２ｍ
Ｍ 各ｄＮＴＰ、２．２ｍＭ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ
ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０、
０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．３μｌ Ｔ
ａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、５０μｌの総容量）中に１
０〜３０ｎｇ／μｌの濃度で再懸濁させた。この時点で
は、プライマーを添加しなかった。９４℃６０秒間、
［９４℃３０秒間、５０〜５５℃３０秒間、７２℃３０
秒間］の３０〜４５サイクル、および７２℃５分間の再
組立プログラムを、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｗａｔｅ
ｒｔｏｗｎ ＭＡ）ＰＴＣ−１５０サーマルサイクラー
において用いた。より大きな配列への小さなフラグメン
トのＰＣＲ再組立に続いて、再組立の２５、３０、３
５、４０、および４５サイクル後の反応のサンプルを採
取した（図２）。
【０３１５】１００〜２００ｂｐのフラグメントの再組
立は、正確なサイズの単一のＰＣＲ産物を産生し得る
が、１０〜５０塩基のフラグメントは、代表的に正確な
サイズのいくらかの産物および不均一な分子量の産物を
産生する。制限酵素消化後、正確なサイズの単一のバン
ドが得られるので、このサイズ不均一性のほとんどは、
産物の末端での１本鎖配列に起因すると思われる。
【０３１６】４）プライマーを用いたＰＣＲ それぞれ０．８μＭの上記のプライマー（配列番号１お
よび２）を有するＰＣＲ Ｍｉｘへの再組立産物の希
釈、および約１５サイクルのＰＣＲ（それぞれのサイク
ルは、［９４℃３０秒間、５０℃３０秒間、および７２
℃３０秒間］からなる）の後、正確なサイズの単一の産
物が得られた（図２）。
【０３１７】５）クローニングおよび分析 上記の工程４由来のＰＣＲ産物を、末端の制限酵素Ｂａ
ｍＨＩおよびＥｃｏ０１０９で消化し、そして上記の工
程２に記載のようにゲル精製した。再組立されたフラグ
メントを、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏ０１０９で消化した
ｐＵＣ１８に連結した。Ｅ． ｃｏｌｉを、製造業者
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃ
Ａ）により推奨されるような標準的な条件下で、この連
結混合物を用いて形質転換し、そして１００μｇ／ｍｌ
アンピシリン、０．００４％ Ｘ−ｇａｌおよび２ｍＭ
ＩＰＴＧを有するアガープレートに播いた。＋＋組換
え体と判定されるＨｉｎＤＩＩＩ−ＮｈｅＩフラグメン
トを有する得られたコロニーを、それが青く見えること
により同定した。
【０３１８】この実施例は、ＬａｃＺα遺伝子を保有す
る１．０ｋｂの配列が、１０〜７０ｂｐのフラグメント
に消化され得ること、およびこれらのゲル精製された１
０〜７０ｂｐのフラグメントが、正確なサイズの単一の
産物に再組立され得ることを説明する。ここで、得られ
たコロニーの８４％（Ｎ＝３７７）がＬａｃＺ+である
（シャッフリングなしの場合の９４％に対して；図
２）。
【０３１９】得られたＬａｃＺ-コロニー由来のＬａｃ
Ｚ遺伝子をコードするＤＮＡを、製造業者の指示に従
い、配列決定キット（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ
ＯＨ）で配列決定し、そしてこの遺伝子が、再組立プ
ロセスに起因する点変異を有することを見い出した（表
１）。１１／１２の型の置換が見い出され、そしてフレ
ームシフトは見い出されなかった。
【０３２０】
【表１】
【０３２１】シャッフリングされたｌａｃＺ ＤＮＡの
全体の４，４３７塩基を配列決定した。
【０３２２】１０〜７０ｂｐの切片からのＤＮＡ再組立
の間の点変異誘発率は、ＤＮＡ配列決定から０．７％
（Ｎ＝４，４７３）であると決定された。これは誤りが
ちなＰＣＲと類似している。いかなる理論にも制限され
ることなく、より大きなフラグメントが再組立に用いら
れる場合、または校正ポリメラーゼが添加される場合、
点変異誘発率は、より低くあり得ると考えられている。
【０３２３】１４のこれらの点変異されたＬａｃＺ-コ
ロニー由来のプラスミドＤＮＡを、組合わせ、そして再
び上述の方法により再組立／シャッフリングした場合、
得られたコロニーの３４％（Ｎ＝２９１）がＬａｃＺ+
であり、そしてこれらのコロニーは、おそらく異なるコ
ロニー由来のＤＮＡの組換えにより生じたのであろう。
【０３２４】誤りがちなＰＣＲによる単一の点変異の予
測される回復率は、変異誘発率が０．７％（１０）であ
ると仮定すると、＜１％であると予想される。
【０３２５】このようにして、大きなＤＮＡ配列は、驚
くほど効率的および単純な反応により、小さなフラグメ
ントのランダムな混合物から再組立され得る。この技術
の１つの応用は、相同性に基づいた関連した配列の組換
えまたはシャッフリングである。
【０３２６】（実施例２． ＬａｃＺ遺伝子およびプラ
スミドＤＮＡ全体のシャッフリング） １）ＬａｃＺ遺伝子シャッフリング ２つのＬａｃＺ遺伝子構築物を用いて、７５塩基離れた
２つのマーカー間の交差を計測した。終止コドンを、Ｌ
ａｃＺα遺伝子の２つの離れた範囲に挿入し、ネガティ
ブマーカーとして用いた。それぞれのマーカーは、４つ
の終止コドンを有する２５ｂｐの非相同配列であり、終
止コドンのうち２つは、ＬａｃＺ遺伝子のリーディング
フレーム内にある。２５ｂｐの非相同配列を、大きな四
角により図３に示す。終止コドンは、四角で囲むか、ま
たは下線を付すかした。＋−および−＋型のＬａｃＺα
遺伝子（図３）を含有する２つの１．０ｋｂのＬａｃＺ
テンプレートの１：１混合物を、ＤＮＡｓｅＩで消化
し、そして１００〜２００ｂｐのフラグメントを実施例
１に記載のように精製した。シャッフリングプログラム
を、０．５μｌのポリメラーゼを添加し、そして全容量
が１００μｌであった以外は、実施例１における再組立
について記載された条件と同様の条件下で実施した。
【０３２７】クローニング後、得られた青色のコロニー
の数は、２４％；（Ｎ＝３８６）であった。これは青色
のコロニーの理論的な最大数（すなわち２５％）に近接
しており、２つのマーカー間の組換えが完全であったこ
とを示した。１０の青色のコロニーの全ては、予測され
るＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｈｅＩ制限フラグメントを含有し
た。 ２）プラスミドＤＮＡ全体のシャッフリング ２．７ｋｂプラスミド全体（ｐＵＣ１８−＋およびｐＵ
Ｃ１８＋−）もまた、試験した。＋−および−＋型のＬ
ａｃＺα遺伝子（図３）を含有する２つの２．９ｋｂの
プラスミドの１：１混合物を、ＤＮＡｓｅＩで消化し、
そして１００〜２００ｂｐのフラグメントを実施例１に
記載のように精製した。プログラムが［９４℃３０秒
間、５５℃３０秒間、７２℃３０秒間］の６０サイクル
であった以外は、上記の工程（１）における再組立につ
いて記載された条件と同様の条件下でシャッフリングプ
ログラムを実施した。ゲル分析は，シャッフリングプロ
グラム後、産物のほとんどが２０ｋｂよりも大きいこと
を示した。このようにして、２．７ｋｂのプラスミド全
体（ｐＵＣ１８−＋およびｐＵＣ１８＋−）を、プライ
マーの添加なしにランダムな１００〜２００ｂｐのフラ
グメントから効率的に再組立した。
【０３２８】プラスミド上に唯一の部位を有する制限酵
素（ＥｃｏＯ１０９）での消化後、産物のほとんどは、
予測されるサイズの単一のバンドからなっていた。この
バンドをゲル精製し、再連結し、そしてこのＤＮＡを
Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換に用いた。実施例１に記載のよ
うに、形質転換体を０．００４％ Ｘ−ｇａｌプレート
上に播いた。得られたプラスミドの１１％（Ｎ＝３２
８）は、青色すなわち＋＋組換え体であった。
【０３２９】３）スパイクしたＤＮＡシャッフリング シャッフリング混合物中に混合されるオリゴヌクレオチ
ドは、テンプレートＤＮＡに対するオリゴヌクレオチド
のフランキング配列の相同性に基づき最終産物中に取り
込まれ得る（図４）。上述のＬａｃＺ-終止コドン変異
体（ｐＵＣ１８−＋）をＤＮＡｓｅＩ消化テンプレート
として用いた。両末端に野生型ＬａｃＺ遺伝子に対する
１８塩基の相同性を含有する６６量体のオリゴヌクレオ
チドを、４倍モル濃度過剰量で反応物中に添加し、本来
の遺伝子中に存在する終止コドン変異を補正した。シャ
ッフリング反応を、上記の工程２における条件と同様の
条件下で実施した。得られた産物を消化し、連結し、そ
して上述のようにＥ．ｃｏｌｉに挿入した。
【０３３０】
【表２】
【０３３１】ｓｓＤＮＡは、ｄｓＤＮＡよりも効率的で
あるようであり、おそらくこれは競合的なハイブリダイ
ゼーションに起因すると思われる。取り込みの度合は、
モル濃度過剰量、アニーリング温度、または相同性の長
さを調整することにより、広範な範囲に亘って変化し得
る。
【０３３２】（実施例３． プライマーの完全な非存在
下におけるＤＮＡ再組立）プラスミドｐＵＣ１８を制限
酵素ＥｃｏＲＩ、Ｅｃｏ０１０９、ＸｍｎＩ、およびＡ
ｌｗＮＩで消化し、約３７０、４６０、７７０、および
１０８０ｂｐのフラグメントを産生した。これらのフラ
グメントを電気泳動し、そして２％低融点アガロースゲ
ルから別々に精製した（３７０塩基対のバンドと４６０
塩基対のバンドは、分離され得なかった）。これによ
り、３つの別個のチューブに、大きなフラグメント、中
程度のフラグメント、および２つの小さなフラグメント
の混合物を得た。
【０３３３】それぞれのフラグメントを実施例１に記載
のようにＤＮＡｓｅＩで消化し、そして５０〜１３０ｂ
ｐのフラグメントを、それぞれの本来のフラグメントに
ついて２％低融点アガロースゲルから精製した。
【０３３４】ＰＣＲ混合物（上述の実施例１に記載のよ
うな）を精製した消化フラグメントに添加して、フラグ
メントの最終濃度を１０ｎｇ／μｌとした。プライマー
を添加しなかった。再組立反応を、３つの消化したＤＮ
Ａフラグメント混合物それぞれについて別々に［９４℃
３０秒間、６０℃３０秒間］を７５サイクル実施し、そ
して産物をアガロースゲル電気泳動により分析した。
【０３３５】この結果は、１０８０ｂｐ、７７０ｂｐ、
ならびに３７０ｂｐおよび４６０ｂｐのバンドが、精製
されたフラグメントから効率的に再形成されたことを明
確に示した。これは、シャッフリングがいかなるプライ
マーの使用をも全く必要としないことを示す。
【０３３６】（実施例４． ＩＬ−１β遺伝子シャッフ
リング）この実施例は、１５塩基よりも少ない相同性に
基づいて交差が得られ得ることを説明する。例として、
ヒトおよびマウスのＩＬ−１β遺伝子をシャッフリング
した。
【０３３７】マウスのＩＬ−１β遺伝子（ＢＢＧ４９）
およびＥ． ｃｏｌｉのコドン使用頻度を有するヒトＩ
Ｌ−１β遺伝子（ＢＢＧ２； Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ
Ｉｎｃ．， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ）をシャ
ッフリング反応のテンプレートとして用いた。ヒトＩＬ
−１β配列とマウスＩＬ−１β配列との間の完全に相同
な範囲は、平均してわずか４．１塩基の長さである（図
５、非相同の領域を四角で囲った）。
【０３３８】それぞれの遺伝子のｄｓＤＮＡ ＰＣＲ産
物の調製、プライマーの除去、１０〜５０ｂｐフラグメ
ントのＤＮＡｓｅＩ消化および精製は、実施例１におい
て上述されたものと同様であった。ＰＣＲ反応に用いら
れるプライマーの配列は、５’ＴＴＡＧＧＣＡＣＣＣＣ
ＡＧＧＣＴＴＴ３’（配列番号３）および５’ＡＴＧＴ
ＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴ３’（配列番号４）であ
った。
【０３３９】シャッフリング反応の最初の１５サイクル
は、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント
を用いて、それぞれのサイクル毎に１単位の新たな酵素
を添加しながら、実施した。ＤＮＡを、混合物がポリメ
ラーゼを含まない実施例１のＰＣＲ混合物に添加した。
手動のプログラムは、９４℃１分間、および次いで［９
５℃１分間、ドライアイス／エタノール上に１０秒間
（凍結するまで）、２５℃にて約２０秒間インキュベー
ト、１ＵのＫｌｅｎｏｗフラグメントの添加、および２
５℃にて２分間インキュベート］の１５サイクルであっ
た。変性工程後のそれぞれのサイクルにおいて、チュー
ブをドライアイス／エタノール中で迅速に冷却し、そし
てアニール温度まで再加熱した。次いで、熱不安定性ポ
リメラーゼを添加した。この酵素は、全てのサイクルご
との添加を必要とする。このアプローチを用いることに
より、わずか数塩基の連続した相同性に基づいて、高レ
ベルの交差が得られた（図５、交差の位置を
【０３４０】
【化１】
【０３４１】で示す）。
【０３４２】これらの１５回の手動のサイクルの後、Ｔ
ａｑポリメラーゼを添加し、そしてさらなる２２サイク
ルのシャッフリング反応［９４℃３０秒間、３５℃３０
秒間］をプライマーなしで実施した。
【０３４３】次いで反応物を２０倍に希釈した。以下の
プライマーを、０．８μＭの最終濃度で添加した：５’
ＡＡＣＧＣＣＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＴ
ＴＡＴＴ３’（配列番号５）および５’ＡＡＡＧＣＣＣ
ＴＣＴＡＧＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴ３’
（配列番号６）。そしてＰＣＲ反応を実施例１における
上述のように実施した。第２のプライマーペアは、制限
部位の変化が必要であると考えられるためだけで第１の
ペアと異なった。
【０３４４】ＸｂａＩおよびＳｐｈＩでのＰＣＲ産物の
消化の後、このフラグメントをＸｂａＩ−ＳｐｈＩ消化
ｐＵＣ１８に連結した。いくつかのコロニー由来の挿入
物の配列を、製造業者の指示に従い、ジデオキシＤＮＡ
配列決定キット（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， ＣｌｅｖｅｌａｎｄＯ
Ｈ）により決定した。
【０３４５】全部で１７の交差が、９つのコロニーのＤ
ＮＡ配列決定により見い出された。いくつかの交差は、
わずか１〜２塩基の連続した相同性に基づいていた。
【０３４６】短い相同性に基づく効率的な交差を強いる
ために、非常に低い効率的なアニーリング温度が要求さ
れることが見い出された。任意の熱安定性ポリメラーゼ
を用いて、ＰＣＲ機械の冷却時間（１〜２℃／秒の９４
℃から２５℃への）は、効果的なアニーリング温度を設
定されたアニーリング温度よりも高くする。従って、Ｔ
ａｑポリメラーゼに基づくプロトコルのいずれもが、Ｉ
Ｌ−１β遺伝子の一方の１０倍過剰量を用いても交差を
産生しなかった。対照的に、熱不安定性ポリメラーゼ
（例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグ
メント）は、低いアニーリング温度を正確に得るために
用いられ得る。
【０３４７】（実施例５．ＴＥＭ−１βラクタマーゼ遺
伝子のＤＮＡシャッフリング）直接分子進化のための変
異誘発ＤＮＡシャッフリングの利用性を、βラクタマー
ゼモデルシステムにおいて試験した。ＴＥＭ−１βラク
タマーゼは、非常に効率的な酵素であり、主に拡散によ
りその反応速度は限定される。この実施例は、その反応
特異性を変化すること、および通常加水分解しない薬物
セフォタキシムに対して耐性を得ることが可能であるか
を決定する。
【０３４８】プラスミドを欠く細菌性細胞におけるセフ
ォタキシムの最小阻止濃度（ＭＩＣ）を、Ｅ． ｃｏｌ
ｉ ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，
Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）の一夜細菌培養物の１０-2
希釈の１０μｌ（約１０００ｃｆｕ）を、異なるレベル
のセフォタキシム（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ
ＭＯ）を有するプレートに播き、続いて３７℃で２４
時間インキュベートすることにより決定した。
【０３４９】セフォタキシム上での生育は、細胞の密度
に対して敏感であり、それ故類似の数の細胞がそれぞれ
のプレートに播かれる必要がある（添加物非含有ＬＢプ
レートに播くことにより得られる）。１０００個の細胞
のプレートが一貫して行われた。
【０３５０】１）最初のプラスミド構築 細菌のＴＥＭ−１βラクタマーゼ遺伝子を保有するｐＵ
Ｃ１８誘導体を用いた（２８）。ＴＥＭ−１βラクタマ
ーゼ遺伝子は、細菌に約０．０２μｇ／ｍｌのセフォタ
キシムに対する耐性を与える。２つのプライマー： プライマーＡ（配列番号７）： ５’ＴＴＣＴＡＴＴＧＡＣＧＧＣＣＴＧＴＣＡＧＧＣＣ
ＴＣＡＴＡＴＡＴＡＣＴＴＴＡＧＡＴＴＧＡＴＴＴ３’
およびプライマーＢ（配列番号８）： ５’ＴＴＧＡＣＧＣＡＣＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＧＧＣＣ
ＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＧＣ
ＧＣＡＣＡＴＴＴ３’ を用いるベクター配列のＰＣＲおよび２つの他のプライ
マー： プライマーＣ（配列番号９）： ５’ＡＡＣＴＧＡＣＣＡＣＧＧＣＣＴＧＡＣＡＧＧＣＣ
ＧＧＴＣＴＧＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴ、およ
び プライマーＤ（配列番号１０）： ５’ＡＡＣＣＴＧＴＣＣＴＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣ
ＴＡＡＡＴＡＣＡＴＴＣＡＡＡＴＡＴＧＴＡＴ を用いるβラクタマーゼ遺伝子配列のＰＣＲにより、プ
ロモーターの５’および遺伝子の末端の３’にＳｆｉ１
制限部位を付加した。
【０３５１】２つの反応産物をＳｆｉＩで消化し、混合
し、連結し、そして細菌を形質転換するために用いた。
【０３５２】得られたプラスミドは、ｐＵＣ１８２Ｓｆ
ｉであった。このプラスミドは、ＴＥＭ−１遺伝子およ
びＰ−３プロモーターを保有するＳｆｉ１フラグメント
を含有する。
【０３５３】このプラスミドを保有するＥ． ｃｏｌｉ
ＸＬ１−ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）に関するセフォタキシムの最小阻
止濃度は、３７℃で２４時間後で０．０２μｇ／ｍｌで
あった。
【０３５４】シャッフリングなしに、セフォタキシムに
対するβラクタマーゼ遺伝子の耐性を改変する能力は、
２倍に増加した薬物レベルへの細胞（約１０7ｃｆｕ）
の希釈したプールの段階的な再プレートにより決定し
た。１．２８μｇ／ｍｌまでへの耐性がシャッフリング
なしに得られ得た。これは、耐性の６４倍の増加を表
す。
【０３５５】２）ＤＮＡｓｅＩ消化 第１のシャッフリング反応のための基質は、プライマー
ＣおよびＤ（両方ともＳｆｉＩ部位を含有する）を用い
るｐＵＣ１８２ＳｆｉのＰＣＲにより得られた０．９ｋ
ｂのｄｓＤＮＡであった。
【０３５６】各サイクルごとにＰＣＲ産物から遊離プラ
イマーをＷｉｚａｒｄ ＰＣＲ ｐｒｅｐ（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）により除去した。
【０３５７】約５μｇのＤＮＡ基質を、１０分間室温
で、１００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ
７．４、１ｍＭ ＭｇＣｌ2中で０．１５単位のＤＮＡ
ｓｅＩ（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）で
消化した。１００〜３００ｂｐのフラグメントを、ＤＥ
８１イオン交換紙（Ｗｈａｔｍａｎ， Ｈｉｌｌｓｂｏ
ｒｏｕｇｈ ＯＲ）への電気泳動、１Ｍ ＮａＣｌでの
溶出、およびエタノール沈澱により、実施例１に記載の
方法によって２％低融点アガロースゲルから精製した。
【０３５８】３）遺伝子シャッフリング 精製したフラグメントを、１０〜３０ｎｇ／μｌの濃度
でＰＣＲ混合物（０．２ｍＭ 各ｄＮＴＰ、２．２ｍＭ
ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ ｐＨ ９．０、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００）に再懸濁した。この時点でプライマーを添加し
なかった。９４℃６０秒間、次いで［９４℃３０秒間、
５０〜５５℃３０秒間、７２℃３０秒間］の４０サイク
ル、そして次いで７２℃５分間の再組立プログラムを、
ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）
ＰＴＣ−１５０サーマルサイクラーにおいて使用した。
【０３５９】４）プライマーを用いる再組立産物の増幅 ０．８μＭのそれぞれのプライマー（ＣおよびＤ）を有
するＰＣＲ混合物への再組立産物の希釈、および２０の
ＰＣＲサイクル［９４℃３０秒間、５０℃３０秒間、７
２℃３０秒間］の後、９００ｂｐのサイズの単一の産物
を得た。
【０３６０】５）クローニングおよび分析 末端の制限酵素ＳｆｉＩでの９００ｂｐ産物の消化、お
よびアガロースゲル精製の後、９００ｂｐ産物を、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ
ｇ ＭＤ）を用いて唯一のＳｆｉＩ部位でベクターｐＵ
Ｃ１８２Ｓｆｉに連結した。混合物を、Ｅ． ｃｏｌｉ
ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞にエレクトロポレートし、そし
て０．３２〜０．６４μｇ／ｍｌのセフォタキシム（Ｓ
ｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）を有するＬＢ
プレートに播いた。細胞を、３７℃で２４時間まで増殖
させ、得られたコロニーをプールとしてプレートから掻
き取り、そして次の回のシャッフリングのためのＰＣＲ
テンプレートとして用いた。
【０３６１】６）引き続く再組立回 ３回のシャッフリングのそれぞれの後に得られた形質転
換体を、漸増するレベルのセフォタキシムに播いた。最
も高いレベルのセフォタキシムを有するプレート由来の
コロニー（＞１００、多様性を維持するために）をプー
ルし、次の回のＰＣＲ反応のためのテンプレートとして
用いた。
【０３６２】上記の工程（５）において０．３２〜０．
６４μｇ／ｍｌで得られたセフォタキシム耐性コロニー
の混合物を次の回のシャッフリングのためのテンプレー
トして用いた。ＬＢブロス中の１０μｌの細胞を、上述
のように、９９℃１０分間、次いで［９４℃３０秒間、
５２℃３０秒間、７２℃３０秒間］の３５サイクル、お
よび次いで７２℃５分の再組立プログラムにおいてテン
プレートとして用いた。
【０３６３】再組立産物を消化し、そして上記の工程
（５）に記載のようにｐＵＣ１８２Ｓｆｉに連結した。
混合物をＥ． ｃｏｌｉ ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞にエレ
クトロポレートし、そして５〜１０μｇ／ｍｌのセフォ
タキシムを有するＬＢプレートに播いた。
【０３６４】５〜１０μｇ／ｍｌで得られたコロニー
を、細胞を８０〜１６０μｇ／ｍｌのセフォタキシムを
含有するＬＢプレートに播いた以外は第１および第２の
回と同様である第３の回に用いた。第３の回の後、コロ
ニーを、８０〜１６０μｇ／ｍｌで得、そして漸増する
濃度のセフォタキシムに再プレートした後、コロニー
は、３７℃で２４時間後、３２０μｇ／ｍｌまでで得ら
れ得た（ＭＩＣ＝３２０μｇ／ｍｌ）。
【０３６５】セフォタキシムにおける増殖は、細胞密度
に依存し、全てのＭＩＣが規格化されることを要求する
（本発明者らの場合、プレートあたり約１，０００細胞
まで）。より高い細胞密度で、１２８０μｇ／ｍｌまで
での増殖が得られた。１，２８０μｇ／ｍｌで増殖され
た５つの最も大きいコロニーを、単一コロニーのために
２回プレートし、そしてＳｆｉ１挿入物を、コロニーＰ
ＣＲ産物の制限マッピングにより分析した。
【０３６６】セフォタキシムに対する耐性が１６，００
０倍に増加した（ＭＩＣ＝０．０２μｇ／ｍｌからＭＩ
Ｃ＝３２０μｇ／ｍｌ）１つの変異体が得られた。
【０３６７】選択後、選択されたクローンのプラスミド
を野生型Ｅ． ｃｏｌｉ ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）に戻
し、測定された薬剤耐性の全てが、染色体の変異に起因
しないことを確認した。
【０３６８】シャッフリングおよび選択の３つのサイク
ルは、ＴＥＭ−１βラクタマーゼに関する伸展した幅広
いスペクトラムの抗生物質であるセフォタキシムの最小
阻止濃度における１．６×１０4倍の増加を生じた。対
照的に、シャッフリングなしの繰り返しのプレーティン
グは、耐性のわずか１６倍の増加のみを生じた（誤りが
ちなＰＣＲまたはカセット変異誘発）。
【０３６９】７）配列分析 １，２８０μｇ／ｍｌで生育した５つの最も大きいコロ
ニーの全ては、野生型ＴＥＭ−１酵素と同一な制限地図
を有した。これらのコロニーの内の１つから得られたプ
ラスミドのＳｆｉＩ挿入物を、製造業者の指示に従い、
ジデオキシＤＮＡ配列決定法（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔ
ｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｃｌｅｖｅ
ｌａｎｄ ＯＨ）により配列決定した。全ての塩基番号
は、改訂されたｐＢＲ３２２配列（２９）に対応し、そ
してアミノ酸番号は、ＡＢＬ標準番号付けスキーム（３
０）に対応する。アミノ酸は３文字表記で示され、そし
てヌクレオチドは１文字表記で示される。用語Ｇ４２０
５Ａは、ヌクレトチド４２０５が、グアニジンからアデ
ニンに変化したことを意味する。
【０３７０】９つの１塩基置換が見い出された。Ｇ４２
０５Ａは、βラクタマーゼＰ３プロモーター（３１）の
−３５と−１０部位との間に位置される。Ｃｈｅｎおよ
びＣｌｏｗｅｓ（３１）により観察されたプロモーター
上方変異体（ｕｐ−ｍｕｔａｎｔ）は、本発明で用いら
れたＳｆｉ１フラグメントの外側に位置され、従って検
出され得なかった。４つの変異は、サイレント変異であ
り（Ａ３６８９Ｇ、Ｇ３７１３Ａ、Ｇ３９３４Ａ、およ
びＴ３９５９Ａ）、そして４つがアミノ酸変化を生じた
（Ｇｌｙ２３８Ｓｅｒを生じるＣ３４４８Ｔ、Ｍｅｔ１
８２Ｔｈｒを生じるＡ３６１５Ｇ、Ｇｌｕ１０４Ｌｙｓ
を生じるＣ３８５０Ｔ、およびＡｌａ１８Ｖａｌを生じ
るＧ４１０７Ａ）。
【０３７１】８）分子戻し交配 次いで非必須変異を除去するために、過剰量の野生型Ｄ
ＮＡを用いた分子戻し交配を用いた。
【０３７２】分子戻し交配は、ＤＮＡｓｅＩ消化および
シャッフリング反応を４０倍の過剰量の野生型ＴＥＭ−
１遺伝子フラグメントの存在下で実施した以外は、上述
したような通常のシャッフリングと同一な方法によりＤ
ＮＡシャッフリングの第３の回から選択されたプラスミ
ドに対して実施した。戻し交配をより効率的にするため
に、非常に小さなＤＮＡフラグメント（３０〜１００ｂ
ｐ）をシャッフリング反応に用いた。戻し交配変異体
を、８０〜１６０μｇ／ｍｌのセフォタキシム（Ｓｉｇ
ｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）を有するＬＢプレ
ートで再び選択した。
【０３７３】この戻し交配シャッフリングを、４０倍の
過剰量の野生型ＴＥＭ−１ ＤＮＡの存在下での第１の
戻し交配回からのコロニー由来のＤＮＡを用いて繰り返
した。戻し交配の効率を増加させるために、小さなＤＮ
Ａフラグメント（３０〜１００ｂｐ）を用いた。第２の
回の戻し交配変異体を、８０〜１６０μｇ／ｍｌのセフ
ォタキシムを有するＬＢプレートで再び選択した。
【０３７４】得られた形質転換体を１６０μｇ／ｍｌの
セフォタキシムに播き、そしてコロニーのプールを、
１，２８０μｇ／ｍｌまでの漸増するレベルのセフォタ
キシムに再プレートした。１，２８０μｇ／ｍｌで得ら
れた最も大きなコロニーを、単一コロニーのために再プ
レートした。
【０３７５】この戻し交配変異体は、野生型よりも３
２，０００倍高い耐性を示した（ＭＩＣ＝６４０μｇ／
ｍｌ）。変異体株は、以前に報告された臨床的ＴＥＭ−
１由来株または操作されたＴＥＭ−１由来株よりもセフ
ォタキシムに対して６４倍高い耐性である。従って、Ｄ
ＮＡシャッフリングは、少なくともいくつかのサイクル
の定方向性分子進化のための迅速で強力な手段であるよ
うである。
【０３７６】戻し交配された変異体のＳｆｉＩ挿入物の
ＤＮＡ配列を、製造業者の指示に従いジデオキシＤＮＡ
配列決定キット（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｏ
Ｈ）を用いて決定した（表３）。変異体は、９つの１塩
基対変異を有した。予測されるように、以前に同定した
４つのサイレント変異の全てが消失し、野生型遺伝子の
配列に戻っていた。プロモーター変異（Ｇ４２０５Ａ）
および４つのアミノ酸変異の内の３つ（Ｇｌｕ１０４Ｌ
ｙｓ、Ｍｅｔ１８２Ｔｈｒ、およびＧｌｙ２３８Ｓｅ
ｒ）は、戻し交配されたクローンに残っていた。このこ
とは、それらが高レベルのセフォタキシム耐性のために
必須であることを示唆する。しかし、２つの新規のサイ
レント変異（Ｔ３８４２ＣおよびＡ３７６７Ｇ）ならび
にアミノ酸変化を生じる３つの新規の変異（Ａｒｇ２４
１Ｈｉｓを生じるＣ３４４１Ｔ、Ｇｌｙ９２Ｓｅｒを生
じるＣ３８８６Ｔ、およびＡｌａ４２Ｇｌｙを生じるＧ
４０３５Ｃ）が見い出された。これらの２つのサイレン
ト変異は、タンパク質の１次配列に影響しないが、タン
パク質の発現レベル（例えばｍＲＮＡの構造により）、
およびおそらくタンパク質の折り畳みにさえ影響し得る
（コドン使用頻度を変化すること、およびそれゆえタン
パク質の折り畳みに関係する休止部位を変化することに
よる）。
【０３７７】
【表３】
【０３７８】戻し交配変異体および非戻し交配変異体は
両方とも１つのプロモーター変異（これは、単独または
組み合わせにより発現レベルにおいて２〜３倍の増加を
生じる）および３つの共通したアミノ酸変化（Ｇｌｕ１
０４Ｌｙｓ、Ｍｅｔ１８２Ｔｈｒ、およびＧｌｙ２３８
Ｓｅｒ）を有する。Ｇｌｕ１０４ＬｙｓおよびＧｌｙ２
３８Ｓｅｒは、いくつかのセフォタキシム耐性ＴＥＭ−
１誘導体または他のＴＥＭ−１誘導体（表４）において
存在する変異である。
【０３７９】９）発現レベル比較 野生型プラスミド、非戻し交配変異体、および戻し交配
変異体におけるβラクタマーゼ遺伝子の発現レベルを、
Ｗｉｔｈｏｌｔ， Ｂ． （３２）の方法に従い浸透圧
ショックにより調製された周辺質の抽出物のＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（４〜２０％；Ｎｏｖｅ
ｘ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）により比較した。
【０３８０】精製されたＴＥＭ−１βラクタマーゼ（Ｓ
ｉｇｍａ， Ｓｔ． ＬｏｕｉｓＭＯ）を、分子量基準
として用い、そしてプラスミドを欠くＥ． ｃｏｌｉ
ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞をネガティブコントロールとして
用いた。
【０３８１】変異体および戻し交配された変異体は、野
生型遺伝子と比較して２〜３倍高いレベルのβラクタマ
ーゼタンパク質を産生するようであった。プロモーター
変異は、βラクタマーゼの２〜３倍の増加を生じるよう
であった。
【０３８２】（実施例６． ＴＥＭ−１βラクタマーゼ
遺伝子の変異体組み合わせ体の構築）変異の異なる組み
合わせの耐性を決定するため、そして発表された変異体
と新規の変異体とを比較するために、いくつかの変異体
を、同一のプラスミドバックグ回中に構築した。２つの
変異（Ｇｌｕ１０４ＬｙｓおよびＧｌｙ２３８Ｓｅｒ）
は、セフォタキシム変異体として知られている。構築し
た全ての変異体の組み合わせは、プロモーター変異を有
しており、これは選択された変異体の比較を可能にし
た。結果を図４に示す。
【０３８３】変異の特定の組み合わせは、１変異当たり
２つのオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲにより野生
型ｐＵＣ１８２Ｓｆｉ中に導入された。
【０３８４】以下の変異を得るためのオリゴヌクレオチ
ドは以下のようであった。
【０３８５】
【表４】
【０３８６】これらの個々のＰＣＲフラグメントを、合
成オリゴヌクレオチドからゲル精製した。１０ｎｇのそ
れぞれのフラグメントを組み合わせ、そして再組立反応
を、９４℃１分間、および次いで２５サイクル；［９４
℃３０秒間、５０℃３０秒間、および７２℃４５秒間］
で実施した。ＰＣＲを、ＳｆｉＩ含有外側プライマー
（実施例５のプライマーＣおよびプライマーＤ）の存在
下で２５サイクルにわたって再組立産物に対して実施し
た。ＤＮＡをＳｆｉＩで消化し、そして野生型ｐＵＣ１
８２Ｓｆｉベクターに挿入した。以下の変異体組み合わ
せが得られた（表４）。
【０３８７】
【表５】
【０３８８】保存された変異が、ＭＩＣにおける１５の
倍加（ｄｏｕｂｌｉｎｇ）の内の９つの原因であると結
論づけられた。
【０３８９】Ｇｌｕ１０４Ｌｙｓ単独は、０．０８μｇ
／ｍｌへのＭＩＣの倍加のみを生じることが示され、そ
してＧｌｙ２３８Ｓｅｒ（いくつかの状況において１つ
のさらなるアミノ酸変化を有する）は、０．１６μｇ／
ｍｌのＭＩＣのみを生じた（２６）。２重変異体Ｇｌｕ
１０４Ｌｙｓ／Ｇｌｙ２３８Ｓｅｒは、１０μｇ／ｍｌ
のＭＩＣを有する。この変異体は、ＴＥＭ−１５に相当
する。
【０３９０】これらの同一のＧｌｕ１０４Ｌｙｓ変異お
よびＧｌｙ２３８Ｓｅｒ変異は、Ｇｌｎ３９Ｌｙｓ（Ｔ
ＥＭ−３）またはＴｈｒ２６３Ｍｅｔ（ＴＥＭ−４）と
組み合わせて、高レベルの耐性（ＴＥＭ−３について２
〜３２μｇ／ｍｌおよびＴＥＭ−４について８〜３２μ
ｇ／ｍｌ（３４、３５））を生じる。
【０３９１】戻し交配後に保存された３つのアミノ酸変
化（Ｇｌｕ１０４Ｌｙｓ／Ｍｅｔ１８２Ｔｈｒ／Ｇｌｙ
２３８Ｓｅｒ）を含有する変異体もまた、１０μｇ／ｍ
ｌのＭＩＣを有した。これは、新規の選択された変異体
のそれぞれが、３つの公知の変異に加えて有する変異
が、セフォタキシムに対する遺伝子の耐性のさらなる３
２〜６４倍の増加の原因であることを意味した。
【０３９２】天然に存在する、臨床的ＴＥＭ−１由来酵
素（ＴＥＭ−１〜１９）のそれぞれは、５〜７つのみの
同一の変異の異なる組み合わせを含有する（総説）。こ
れらの変異は、遺伝子において十分に分離した位置に存
在するので、高度なセフォタキシム耐性を有する変異体
は、単一の範囲のカセット変異誘発によっては得られ得
ない。これは、標準的なカセット変異誘発アプローチに
より得られる最大ＭＩＣが、わずか０．６４μｇ／ｍｌ
である理由を説明し得る（２６）。例えば、Ｇｌｕ１０
４Ｌｙｓ変異およびＧｌｙ２３８Ｓｅｒ変異は両方とも
０．１６μｇ／ｍｌ未満のＭＩＣを有することが本研究
において個々に見い出された。ＤＮＡシャッフリングの
使用は、組み合わせを可能にし、それ故１０μｇ／ｍｌ
のＭＩＣを有するＧｌｕ１０４Ｌｙｓ／Ｇｌｙ２３８Ｓ
ｅｒの組み合わせが見い出された。
【０３９３】この実施例の重要な制限は、開始点として
の単一の遺伝子の使用である。多数の関連した天然に存
在する遺伝子がシャッフリングされる場合、より良好な
組み合わせが見い出され得ることが意図される。このよ
うな混合物に存在する多様性は、変異誘発シャッフリン
グにより産生されるランダムな変異よりも有意義であ
る。例えば、単一の種由来の関連した遺伝子のレパート
リー（例えば、免疫系の既存の多様性）、または多くの
異なる種から得られる関連した遺伝子を使用し得ること
が意図される。
【０３９４】（実施例７．６つの変異体ＣＤＲ全てのラ
イブラリーのＤＮＡシャッフリングによる抗体Ａ１０Ｂ
の改善）Ａ１０Ｂ ｓｃＦｖ抗体、マウス抗ウサギＩｇ
Ｇは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ Ｗ
Ｉ）から寄贈された。ｐＣＡＮＴＡＢ５ファージディス
プレイベクターを使用する市販のＰｈａｒｍａｃｉａフ
ァージディスプレイシステムを使用した。
【０３９５】本来のＡ１０Ｂ抗体は、低いアビディティ
のみを再現性よく有した。というのは、（ファージＥＬ
ＩＳＡ （Ｐｈａｒｍａｃｉａアッセイキット）または
ファージタイターにより測定したところ）固定化抗原
（ウサギＩｇＧ）に弱く結合するクローンのみが得られ
たからである。競合アッセイにおいてＡ１０Ｂ抗体結合
の５０％阻害を生じたウサギＩｇＧの濃度は、１３ピコ
モル濃度であった。観察された低いアビディティはま
た、Ａ１０Ｂクローンの不安定さに起因し得る。
【０３９６】Ａ１０Ｂ ｓｃＦｖ ＤＮＡを製造業者の
指示に従い配列決定した（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｃｌｅｖｅｌａ
ｎｄＯＨ）。Ｋａｂａｔ（３３）との比較に基づくと、
この配列は、既存の抗体と同様であった。
【０３９７】１）ファージＤＮＡの調製 Ａ１０Ｂ野生型抗体遺伝子を有するファージＤＮＡ（１
０μｌ）を、９９℃にて１０分間インキュベートし、次
いで７２℃にて２分間インキュベートした。ＰＣＲ混合
物（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
ｐＨ ９．０、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、
２００μＭ 各ｄＮＴＰ、１．９ｍＭＭｇＣｌ）、０．
６μｍのそれぞれのプライマー、および０．５μｌ Ｔ
ａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉ
ｓｏｎ ＷＩ）をファージＤＮＡに添加した。ＰＣＲプ
ログラムを［９４℃３０秒間、４５℃３０秒間、７２℃
４５秒間］の３５サイクルにわたって実施した。用いた
プライマーは：５I ＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴ
ＴＴ ３I（配列番号２６）および５I ＴＴＧＴＣＧＴ
ＣＴＴＴＣＣＡＧＡＣＧＴＴ ３I（配列番号２７）で
あった。
【０３９８】次いで８５０ｂｐのＰＣＲ産物を電気泳動
し、そして２％低融点アガロースゲルから精製した。
【０３９９】２）フラグメント化 ３００ｎｇのゲル精製した８５０ｂｐのバンドを、２０
分間室温にて、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ
７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ中で０．１８単位のＤＮＡ
ｓｅ Ｉ（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）
で消化した。消化したＤＮＡを、２％低融点アガロース
ゲルにおいて分離し、そして５０〜２００ｂｐ間のバン
ドをゲルから精製した。
【０４００】３）試験ライブラリーの構築 本実験の目的は、ＣＤＲの挿入が効果的であるか否かを
試験することである。
【０４０１】内部に制限酵素部位を有する以下のＣＤＲ
配列を合成した。「ＣＤＲ Ｈ」は、抗体の重鎖におけ
るＣＤＲを意味し、「ＣＤＲ Ｌ」は、抗体の軽鎖にお
けるＣＤＲを意味する。
【０４０２】制限部位を有するＣＤＲオリゴ：
【０４０３】
【表６】
【０４０４】上記工程（２）からの５０〜２００ｂｐの
精製Ａ１０Ｂ抗体ＤＮＡフラグメントにＣＤＲオリゴを
過剰な１０倍のモル量で添加した。ＰＣＲ混合物（５０
ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．
０、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１．９ｍＭ
ＭｇＣｌ、２００μｍの各ｄＮＴＰ、０．３μｌＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏ
ｎ ＷＩ）、総容積５０μｌ）を添加し、そして９４℃
で１分間、７２℃で１分間、次いで３５サイクル：９４
℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間の
シャッフリングプログラムを行った。
【０４０５】１μｌのシャッフリング混合液を１００μ
ｌのＰＣＲ混合物（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００、２００μｍの各ｄＮＴＰ、１．９ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ、それぞれ０．６μＭの２つの外側プライマー
（配列番号２６および２７、下記参照のこと）、０．５
μｌ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）に添加し、そして
ＰＣＲプログラムを３０サイクル［９４℃で３０秒間、
４５℃で３０秒間、７２℃で４５秒間］行った。得られ
る８５０塩基対サイズのＤＮＡフラグメントの混合液を
フェノール／クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈
殿させた。
【０４０６】外側プライマーは： 外側プライマー１：配列番号２７ ５’ ＴＴＧＴＣＧＴＣＴＴＴＣＣＡＧＡＣＧＴＴ ３’ 外側プライマー２：配列番号２６ ５’ ＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＴ ３’ ８５０ｂｐのＰＣＲ生成物を制限酵素ＳｆｉＩおよびＮ
ｏｔＩで消化し、低融点アガロースゲルから精製し、そ
してＰｈａｒｍａｃｉａ、ＭｉｌｗａｕｋｅｅＷＩから
得たｐＣＡＮＴＡＢ５発現ベクターに連結した。Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）により
記載される方法に従って、 連結したベクターをＴＧ１
細胞（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ Ｗ
Ｉ）にエレクトロポレートし、そして単一のコロニーに
ついてプレートした。
【０４０７】得られるコロニー由来のＤＮＡを１００μ
ｌのＰＣＲ混合物（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００、２００μｍの各ｄＮＴＰ、１．９ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ、０．６μＭの外側プライマー１（配列番号２
７、下記参照のこと）および６つの内側プライマー（配
列番号４０〜４５；下記参照のこと）、および０．５μ
ｌのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）に添加し、そして３
５サイクル［９４℃で３０秒間、４５℃で３０秒間、７
２℃で４５秒間］でＰＣＲプログラムを行った。ＰＣＲ
生成物のサイズを、アガロースゲル電気泳動により測定
し、そして制限部位を有するどのＣＤＲが挿入されたの
かを決定するために用いた。
【０４０８】ＣＤＲ内側プライマー：
【０４０９】
【表７】
【０４１０】６つの合成ＣＤＲは、野生型Ａ１０Ｂ抗体
ＤＮＡの予想された位置に挿入された（図７）。これら
の研究は、特定のクローン中の６つのＣＤＲはそれぞれ
制限部位を有するＣＤＲになるわずかな機会を有する
が、ほとんどのクローンは少なくとも１つの制限部位を
有するＣＤＲを保有し、そして制限部位を有するＣＤＲ
の可能な任意の組み合わせが生成されたことを示した。
【０４１１】４）変異相補性決定領域（「ＣＤＲ」）の
構築 本発明者らの配列データに基づき、６つのＣＤＲに対応
する６オリゴヌクレオチドを作製した。ＣＤＲ（Ｋａｂ
ａｔ定義）を７０（個の存在塩基）：１０：１０：１０
の比率で合成的に変異を誘発し、そして約２０塩基のフ
ランキング配列により５’末端および３’末端側に隣接
させた。このフランキング配列は、変異を誘発しない抗
体遺伝子フラグメントの混合物に過剰なモル量で混合す
る場合、ＣＤＲの取り込みに対して相同性を提供する。
得られる変異配列を以下に示す。
【０４１２】ＣＤＲライブラリーのオリゴ
【０４１３】
【表８】
【０４１４】太字かつ下線を付した配列は、７０：１
０：１０：１０のヌクレオチド（ここで７０％は野生型
ヌクレオチド）の混合物を用いて合成した変異配列であ
った。
【０４１５】過剰な１０倍のモル量のＣＤＲ変異オリゴ
を、上記工程（２）からの長さ５０〜２００ｂｐの精製
Ａ１０Ｂ抗体ＤＮＡフラグメントに添加した。ＰＣＲ混
合物（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
ｐＨ９．０、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、
１．９ｍＭ ＭｇＣｌ、２００μｍの各ｄＮＴＰ、０．
３μｌのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）、総容積５０μｌ）を添加
し、そして９４℃で１分間、７２℃で１分間、次いで３
５サイクル：［９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２
℃で３０秒］のシャッフリングプログラムを行った。
【０４１６】１μｌのシャッフリングした混合物を１０
０μｌのＰＣＲ混合物（５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００、２００μｍの各ｄＮＴＰ、１．９ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ、それぞれ０．６μＭの２つの外側プライマー
（配列番号２６および２７、下記参照のこと）、０．５
μｌのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）に添加し、そして
３０サイクル［９４℃で３０秒間、４５℃で３０秒間、
７２℃で４５秒間］でＰＣＲプログラムを行った。得ら
れる８５０塩基対サイズのＤＮＡフラグメントの混合物
をフェノール／クロロホルム抽出し、そしてエタノール
沈殿させた。
【０４１７】外側プライマーは： 外側プライマー１：配列番号２７ ５’ ＴＴＧＴＣＧ
ＴＣＴＴＴＣＣＡＧＡＣＧＴＴ ３’ 外側プライマー２：配列番号２６ ５’ ＡＴＧＡＴＴ
ＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＴ ３’。
【０４１８】５） ｓｃＦＶ抗体ＤＮＡのｐＣＡＮＴＡ
Ｂ５へのクローニング ８５０ｂｐのＰＣＲ生成物を制限酵素ＳｆｉＩおよびＮ
ｏｔＩで消化し、低融点アガロースゲルから精製し、そ
してＰｈａｒｍａｃｉａ、ＭｉｌｗａｕｋｅｅＷＩから
得たｐＣＡＮＴＡＢ５発現ベクターに連結した。Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）により
記載される方法に従って連結したベクターをＴＧ１細胞
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ ＷＩ）に
エレクトロポレートし、そして製造業者により推薦され
るガイドラインに従ってヘルパーファージを用いてファ
ージライブラリーを増殖させた。
【０４１９】この様式で生成したライブラリーを、６サ
イクルの選択を使用して、改善された抗体の存在につい
てスクリーニングした。
【０４２０】６） 高親和性クローンの選択 ９６ウェルのマイクロタイタープレートの１５ウェル
を、ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅ
ｓｅａｒｃｈ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ ＭＥ）で１０μ
ｇ／ウェル、３７℃で１時間コートし、次いでＰＢＳ中
の２％のノンファットドライミルクで３７℃で１時間ブ
ロックした。
【０４２１】１００μｌのファージライブラリー（１×
１０10ｃｆｕ）を１００μｌの２％のミルクで室温で３
０分間ブロックし、次いで１５ウェルのそれぞれに添加
し、３７℃で１時間インキュベートした。
【０４２２】次いで、０．５％のＴｗｅｅｎ−２０を含
有するＰＢＳを用い、３７℃で１回の洗浄あたり１０分
間でウェルを３回洗浄した。結合したファージを１００
μｌの溶出緩衝液（Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ、ｐＨ２．
２）で溶出し、続いて２ＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．４で迅
速に中和し、そしてファージ生産のためにトランスフェ
クションした。この選択サイクルを６回反復した。
【０４２３】６サイクルの後、個々のファージクローン
を拾い、そしてファージＥＬＩＳＡにより相対的な親和
性を比較し、そしてウサギＩｇＧに対する特異性をＰｈ
ａｒｍａｃｉａ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ ＷＩ）製のキッ
トを用いて製造業者により推薦される方法に従ってアッ
セイした。
【０４２４】ウエスタンアッセイにより試験した場合、
最良のクローンは、野生型Ａ１０Ｂと比較して約１００
倍の改善された発現レベルを有した。最良のクローンを
用いる競合アッセイにおいて５０％の阻害を生じたウサ
ギＩｇＧの濃度は１ピコモル濃度であった。最良のクロ
ーンはウサギ抗原に対する特異性に再現性が認められ
た。ファージによりディスプレイされる抗体のコピー数
は増加するようである。
【０４２５】（実施例８．部分的遺伝子の直列反復によ
るインビボでの組換え）プラスミドを２つの部分で構築
した。この２つの部分は、これらの２つの直列反復の共
通範囲間の組換えが完全長の活性組換え遺伝子をもたら
すことを示す同一遺伝子（β−ラクタマーゼ）の不活性
コピーである。
【０４２６】細菌ＴＥＭ−１βラクタマーゼ遺伝子を保
有するｐＵＣ１８誘導体を使用した（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐ
ｅｒｒｏｎら、１９８５、Ｇｅｎｅ ３３：１０３−１
１９）。ＴＥＭ−１βラクタマーゼ遺伝子（「Ｂｌ
ａ」）は、約０．０２μｇ／ｍｌのセフォタキシムに対
する耐性を細菌に与える。以下の２つのプライマーを用
いるベクター配列のＰＣＲにより、Ｓｆｉ１制限部位
を、５’側のプロモーターとβラクタマーゼ遺伝子の
３’末端とに加えた： プライマーＡ（配列番号４６） ５’ ＴＴＣＴＡＴＴ
ＧＡＣＧＧＣＣＴＧＴＣＡＧＧＣＣＴＣＡＴＡＴＡＴＡ
ＣＴＴＴＡＧＡＴＴＧＡＴＴＴ ３’ プライマーＢ（配列番号４７） ５’ ＴＴＧＡＣＧＣ
ＡＣＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＧＧＣＣＡＡＡＡＡＴＡＡＡ
ＣＡＡＡＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＧＣＧＣＡＣＡＴＴＴ
３’ および他の２つのプライマーを用いるβラクタマーゼ遺
伝子配列のＰＣＲによる場合： プライマーＣ（配列番号４８） ５’ ＡＡＣＴＧＡＣ
ＣＡＣＧＧＣＣＴＧＡＣＡＧＧＣＣＧＧＴＣＴＧＡＣＡ
ＧＴＴＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴ ３’ プライマーＤ（配列番号４９） ５’ ＡＡＣＣＴＧＴ
ＣＣＴＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＡＡＡＴＡＣＡＴ
ＴＣＡＡＡＴＡＴＧＴＡＴ ３’。
【０４２７】２つの反応生成物をＳｆｉｌで消化し、混
合し、連結し、そしてこれを用いて以下に記載される手
順によりコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細菌を形質転換し
た。得られたプラスミドをｐＵＣ１８２Ｓｆｉ−Ｂｌａ
−Ｓｆｉとした。このプラスミドはＢｌａ遺伝子および
Ｐ−３プロモーターを保有するＳｆｉｌフラグメントを
含む。
【０４２８】ｐＵＣ１８２Ｓｆｉ−Ｂｌａ−Ｓｆｉを保
有するＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）に対するセフォタ
キシムの最小阻害濃度は、３７℃、２４時間後で０．０
２μｇ／ｍｌであった。
【０４２９】ｐＢＲ３２２のテトラサイクリン遺伝子を
相同性範囲を用いてｐＵＣ１８Ｓｆｉ−Ｂｌａ−Ｓｆｉ
にクローニングし、ｐＢＲ３２２ＴｅｔＳｆｉ−Ｂｌａ
−Ｓｆｉを得た。次いでＳｓｐＩおよびＦｓｐＩを用い
るｐＢＲ３２２ＴｅｔＳｆｉ−Ｂｌａ−Ｓｆｉの制限消
化および平滑末端連結によりＴＥＭ−１遺伝子を欠失さ
せ、ｐＵＣ３２２ＴｅｔＳｆｉ−Ｓｆｉを得た。
【０４３０】ＴＥＭ−１遺伝子の重複領域を標準的なＰ
ＣＲ技術および以下のプライマーを用いて増幅した： プライマー２６５０（配列番号５０） ５’ ＴＴＣＴ
ＴＡＧＡＣＧＴＣＡＧＧＴＧＧＣＡＣＴＴ ３’ プライマー２４９３（配列番号５１） ５’ ＴＴＴ
ＴＡＡ ＡＴＣ ＡＡＴＣＴＡ ＡＡＧ ＴＡＴ ３’ プライマー２６５１（配列番号５２） ５’ ＴＧＣＴ
ＣＡＴＣＣＡＣＧＡＧＴＧＴＧＧＡＧＡＡＧＴＧＧＴＣ
ＣＴＧＣＡＡＣＴＴＴＡＴ ３’、および プライマー２６５２（配列番号５３） ５’ ＡＣＣＡ
ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＣＴＣＧＴＧＧＡＴＧＡＧＣＡＣ
ＴＴＴＴＡＡＡＧＴＴ ３’。
【０４３１】２つの得られるＤＮＡフラグメントをＳｆ
ｉ１およびＢｓｔＸ１で消化し、ｐＢＲ３２２ＴｅｔＳ
ｆｉ−ＳｆｉのＳｆｉ部位に連結した。得られるプラス
ミドをｐＢＲ３２２Ｓｆｉ−ＢＬ−ＬＡ−Ｓｆｉとし
た。プラスミドの地図ならびに機能的β−ラクタマーゼ
のプラスミド内組換えおよび再形成のスキームを図９に
示す。
【０４３２】このプラスミドをＴＧ−１細胞またはＪＣ
８６７９ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のいずれかにエレクトロポ
レートした。Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＣ８６７９はＲｅｃＢＣ
ｓｂｃＡ （Ｏｌｉｎｅｒら、１９９３、ＮＡＲ ２
１：５１９２）である。この細胞をテトラサイクリンを
含有する固体寒天プレート上にプレートした。次いで、
増殖したこれらのコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピ
リシンを含有する固体寒天プレート上にプレートし、そ
して生存するコロニーの数をカウントした。アンピリシ
ン耐性を示したこれらの形質転換体中のβ−ラクタマー
ゼ遺伝子挿入物を、プライマー２６５０（配列番号５
０） ５’ ＴＴＣＴＴＡＧＡＣＧＴＣＡＧＧＴＧＧＣ
ＡＣＴＴ ３’とプライマー２４９３（配列番号５１）
５’ ＴＴＴＴＡＡＡＴＣＡＡＴＣＴＡＡＡＧＴＡＴ
３’とを用いて標準的なＰＣＲ技術により増幅し、そ
して挿入物の長さを測定した。１ｋｂの挿入物の存在
は、図９および表５に示されるように遺伝子がうまく組
換えられたことを示す。
【０４３３】
【表９】
【０４３４】約１７％〜２５％のテトラサイクリン耐性
コロニーはアンピシリン耐性でもあり、そしてすべての
アンピシリン耐性コロニーは、コロニーＰＣＲにより決
定されるように、正確に組換えられた。それゆえ、同じ
プラスミドに位置する部分的遺伝子はうまく組換えられ
て機能的遺伝子を作製する。
【０４３５】（実施例９．完全長遺伝子の直列反復によ
るインビボ組換え）β−ラクタマーゼ遺伝子の異なる対
立遺伝子の２つの完全長コピーを有するプラスミドを構
築した。２つの遺伝子の相同組換えによりこの遺伝子の
１つの組換え完全長コピーを得た。
【０４３６】ｐＢＲ３２２ＴｅｔＳｆｉ−Ｓｆｉおよび
ｐＢＲ３２２ＴｅｔＳｆｉ−Ｂｌａ−Ｓｆｉの構築につ
いては上で述べた。
【０４３７】β−ラクタマーゼ遺伝子の２つの対立遺伝
子を以下のように構築した。２つのＰＣＲ反応をｐＵＣ
１８Ｓｆｉ−Ｂｌａ−Ｓｆｉをテンプレートとして用い
て行った。１つの反応は以下のプライマーを用いて行っ
た。 プライマー２６５０（配列番号５０） ５’ ＴＴＣＴ
ＴＡＧＡＣＧＴＣＡＧＧＴＧＧＣＡＣＴＴ ３’ プライマー２６４９（配列番号５１） ５’ ＡＴＧＧ
ＴＡＧＴＣＣＡＣＧＡＧＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＡＣＡＧ
ＧＣＣＧＧＴＣＴＧＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴ
３’ 第２のＰＣＲ反応を以下のプライマーを用いて行った： プライマー２６４８（配列番号５４） ５’ ＴＧＴＣ
ＡＣＴＡＣＣＡＣＡＣＴＣＧＴＧＧＡＣＴＡＣＣＡＴＧ
ＧＣＣＴＡＡＡＴＡＣＡＴＴＣＡＡＡＴＡＴＧＴＡＴ
３’ プライマー２４９３（配列番号５１） ５ ＴＴＴ Ｔ
ＡＡ ＡＴＣ ＡＡＴＣＴＡ ＡＡＧ ＴＡＴ ３’ これにより２つのＢｌａ遺伝子（一方のＢｌａ遺伝子は
５’末端Ｓｆｉ１部位および３’末端ＢｓｔＸ１部位を
有し、他方のＢｌａ遺伝子は５’末端ＢｓｔＸ１部位お
よび３’末端Ｓｆｉ１部位を有する）を得た。
【０４３８】これらの２つの遺伝子をＢｓｔＸ１および
Ｓｆｉ１での消化およびＳｆｉ１消化プラスミドｐＢＲ
３２２ＴｅｔＳｆｉ−Ｓｆｉへの連結後、Ｂｌａ遺伝子
の縦列反復を有するプラスミド（ｐＢＲ３２２−Ｓｆｉ
−２ＢＬＡ−Ｓｆｉ）を得た（図１０を参照のこと）。
【０４３９】このプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ細胞内にエ
レクトロポレートした。この細胞を１５μｇ／ｍｌのテ
トラサイクリンを含有する固体寒天プレート上にプレー
トした。次いで増殖したこれらのコロニーを１００μｇ
／ｍｌのアンピシリンを含有する固体寒天プレート上に
プレートし、そして生存するコロニーの数をカウントし
た。アンピシンリン耐性を示すこれらの形質転換体中の
Ｂｌａ挿入物を、実施例８に記載される方法およびプラ
イマーを使用する標準的なＰＣＲ技術により増幅した。
１ｋｂの挿入物の存在は、表６に示されるように重複遺
伝子（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ ｇｅｎｅ）が組換えられた
ことを示す。
【０４４０】
【表１０】
【０４４１】コロニーＰＣＲにより、縦列反復が効率的
に組換えられて、単一の組換え遺伝子を形成することを
確認した。
【０４４２】（実施例１０． 多数サイクルのプラス
ミド内の直列反復組換え）さらに迅速に耐性細胞を生産
するために多数サイクルの組換えを用い得るか否かを決
定するために、実施例９に記載される多数サイクルの方
法を行った。
【０４４３】マイナスの組換えコントロールは、β−ラ
クタマーゼ遺伝子の単一のコピーからなり、一方プラス
の組換え実験は、直列反復としてのβ−ラクタマーゼの
２つのコピーを挿入する工程からなった。テトラサイク
リンマーカーを用いて、各回においてセフォタキシム耐
性について選択されたコロニーの数を等しくして連結効
率に対して補正をした。
【０４４４】第１回において、ｐＢＲ３２２ＴｅｔＳｆ
ｉ−Ｂｌａ−ＳｆｉをＥｃｒＩで消化し、誤りがちなＰ
ＣＲのための正常なＰＣＲ混合物とＣａｄｗｅｌｌ Ｐ
ＣＲ混合物（ＣａｄｗｅｌｌおよびＪｏｙｃｅ（１９９
２） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎｓ ２：２８−３３）との１：１の混合物
（１ｍｌ）を用いてＰＣＲにかけた。ＰＣＲプログラム
は、最初に７０℃で２分間、次いで９４℃で３０秒間、
５２℃で３０秒間、および７２℃で３分間ならびに６秒
／１サイクルの３０サイクルであり、続いて７２℃で１
０分間であった。
【０４４５】１つのＢｌａ遺伝子コントロールプラスミ
ドを作製するためのＰＣＲ反応で使用されるプライマー
は、プライマー２６５０（配列番号５０）およびプライ
マー２７１９（配列番号５５）５’ ＴＴＡＡＧＧＧＡ
ＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＡＴＴ ３’であった。こ
れはフラグメント＃５９としてひとまとめに示され、増
幅されたＤＮＡフラグメントの混合された集団を生じ
た。これらのフラグメントは多くの異なる変異を有し
た。
【０４４６】２つのＢｌａ遺伝子プラスミドを作製する
ために２つの異なるＰＣＲ反応で使用されるプライマー
は、第１の遺伝子についてはプライマー２６５０（配列
番号５０）およびプライマー２６４９（配列番号５１）
であり、そして第２の遺伝子についてはプライマー２６
４８（配列番号５４）およびプライマー２７１９（配列
番号５５）であった。これは、２つの増幅したＤＮＡフ
ラグメント：フラグメント＃８９（プライマー２６４８
および２７１９で増幅した）およびフラグメント＃９０
（プライマー２６５０および２６４９で増幅した）それ
ぞれの混合された集団を生じた。それぞれの場合、多く
の異なる変異体がそれぞれのフラグメントの混合された
集団に導入された。
【０４４７】誤りがちなＰＣＲの後、増幅されたＤＮＡ
フラグメント＃５９の集団をＳｆｉ１で消化し、次いで
ｐＢＲ３２２ＴｅｔＳｆｉ−Ｓｆｉ内にクローニングし
てプラスミドｐＢＲ３２２Ｓｆｉ−Ｂｌａ−Ｓｆｉ1の
混合された集団を作製した。
【０４４８】誤りがちなＰＣＲの後、増幅されたＤＮＡ
フラグメント＃９０および＃８９の集団をＳｆｉＩおよ
びＢｓｔＸＩで５０℃で消化し、そしてｐＢＲ３２２Ｔ
ｅｔＳｆｉ−Ｓｆｉに連結してプラスミドｐＢＲ３２２
ＴｅｔＳｆｉ−２Ｂｌａ−Ｓｆｉ1の混合された集団を
作製した（図１０）。
【０４４９】プラスミドｐＢＲ３２２Ｓｆｉ−Ｂｌａ−
Ｓｆｉ1およびｐＢＲ３２２Ｓｆｉ−２Ｂｌａ−Ｓｆｉ1
をＥ．ｃｏｌｉ ＪＣ８６７９内にエレクトロポレート
し、そして異なる濃度のセフォタキシムを有する寒天プ
レートにプレートして耐性株について選択し、そしてテ
トラサイクリンプレートにプレートして力価を測定し
た。
【０４５０】等しい数のコロニーを（テトラサイクリン
上で増殖するコロニーの数に基づく）拾い、ＬＢ−ｔｅ
ｔ中で増殖させ、そしてコロニーからＤＮＡを抽出し
た。これは組換えの１回である。このＤＮＡをＥｃｒＩ
で消化し、そして上記のように第２回の誤りがちなＰＣ
Ｒに用いた。
【０４５１】５回後、１つのフラグメントプラスミドに
対するセフォタキシムのＭＩＣ（最小阻害濃度）は０．
３２であったが、２つのフラグメントプラスミドについ
てのＭＩＣは１．２８であった。結果は、５サイクル後
の組換えにより得られる耐性は、インビボ組換えの存在
下では４倍高かったことを示す。
【０４５２】（実施例１１．フラグメントのエレクトロ
ポレーションを介するインビボ組換え）ｐＵＣ１８Ｓｆ
ｉ−Ｂｌａ−Ｓｆｉを含む適切なＥ．ｃｏｌｉ細胞を記
載のように調製した。プラスミドｐＵＣ１８Ｓｆｉ−Ｂ
ｌａ−Ｓｆｉは、前出に記載のような標準的なＴＥＭ−
１ β−ラクタマーゼ遺伝子を含有する。
【０４５３】ｐＵＣ１８Ｓｆｉ−ｃｅｆ−Ｓｆｉ（クロ
ーンＳＴ２）（Ｓｔｅｍｍｅｒ ＷＰＣ （１９９４）
Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９−９１、本明細書中で
参考として援用される）由来のＴＥＭ−１由来セフォタ
キシム耐性遺伝子を得た。このプラスミドは、このプラ
スミドを有するＥ．ｃｏｌｉにセフォタキシムについて
の６４０μｇ／ｍｌのＭＩＣを与える１つの実験におい
て、完全なプラスミドｐＵＣ１８Ｓｆｉ−ｃｅｆ−Ｓｆ
ｉ ＤＮＡを、プラスミドｐＵＣ１８Ｓｆｉ−Ｂｌａ−
Ｓｆｉを有するＥ．ｃｏｌｉ細胞内にエレクトロポレー
トした。
【０４５４】別の実験において、ｐＵＣ１８Ｓｆｉ−ｃ
ｅｆ−Ｓｆｉ由来のセフォタキシム遺伝子を有するＤＮ
Ａフラグメントを、プライマー２６５０（配列番号５
０）および２７１９（配列番号５５）を用いるＰＣＲに
より増幅した。得られる１ｋｂのＰＣＲ生成物をＤＮａ
ｓｅにより１００ｂｐ未満のＤＮＡフラグメントに消化
し、そしてこれらのフラグメントをすでにｐＵＣ１８Ｓ
ｆｉ−Ｂｌａ−Ｓｆｉを有するコンピテントなＥ．ｃｏ
ｌｉ細胞内にエレクトロポレートした。
【０４５５】次いで、両方の実験からの形質転換された
細胞を、セフォタキシムの種々の濃度を有する寒天プレ
ート上に形質転換された細胞をプレートすることにより
そのセフォタキシムに対する耐性についてアッセイし
た。結果を表７に示す。
【０４５６】
【表１１】
【０４５７】結果から、エレクトロポレーション後、Ｓ
Ｔ−２ Ｃｅｆ遺伝子全体が細菌ゲノムまたはプラスミ
ドのいずれかに挿入されたように思われる。たいていの
挿入物は相同的であるため、この遺伝子がプラスミドに
挿入され、野生型遺伝子を置換したことが予想される。
ＳＴ−２由来のＣｅｆ遺伝子のフラグメントはまた、効
率的にプラスミド中の野生型遺伝子内に挿入された。野
生型遺伝子（全体またはフラグメントで）の導入を伴
い、そしてＤＮＡの導入を伴わない場合は、セフォタキ
シム耐性の急激な増加は観察されなかった。それゆえ、
ＳＴ−２フラグメントが野生型フラグメントよりも極め
て高いセフォタキシム耐性を生じることが示された。耐
性を増加させる遺伝子プールから調製されたフラグメン
トの反復された挿入物が、耐性の増加をもたらすことが
意図された。
【０４５８】従って、ＳＴ−２遺伝子フラグメントによ
りセフォタキシム耐性の増加を生じるこれらのコロニー
を単離し、そしてプラスミドＤＮＡを抽出した。このＤ
ＮＡを上記の方法によるＰＣＲを用いて増幅した。増幅
したＤＮＡをＤＮａｓｅで消化してフラグメント（＜１
００ｂｐ）にし、そして２〜４μｇのフラグメントを上
記のようにすでにｐＵＣ３２２Ｓｆｉ−Ｂｌａ−Ｓｆｉ
を含有するコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞内にエレク
トロポレートした。形質転換された細胞を種々の濃度の
セフォタキシムを含有する寒天上にプレートした。
【０４５９】コントロールとして、プラスミドｐＵＣ１
８Ｓｆｉ−Ｋａｎ−Ｓｆｉを有するコンピテントなＥ．
ｃｏｌｉも使用した。ｐＵＣ１８Ｓｆｉ−ｃｅｆ−Ｓｆ
ｉのＰＣＲ生成物の消化物からのＤＮＡフラグメント
を、これらの細胞内にエレクトロポレートした。カナマ
イシン遺伝子とβ−ラクタマーゼ遺伝子との間には相同
性は存在せず、従って組換えは起こらない。
【０４６０】この実験を２回反復し、そして結果を表８
に示す。
【０４６１】
【表１２】
【０４６２】（実施例１２．組換え形式の決定）本実験
は、どの組換え形式が１サイクルあたり最大の組換え体
を生成するかを決定するために設計された。
【０４６３】第１のアプローチにおいて、ベクターｐＵ
Ｃ１８Ｓｆｉ−Ｂｌａ−ＳｆｉをＰＣＲプライマーで増
幅して、大きなフラグメントおよび小さなフラグメント
を生成した。大きなフラグメントはプラスミドおよびＢ
ｌａ遺伝子部分を有する末端を有し、そして小さなフラ
グメントはＢｌａ遺伝子の中間部分をコードした。完全
なＢｌａ遺伝子を有する第３のフラグメントを、実施例
８の方法によりＰＣＲを使用して作製した。より大きな
プラスミドフラグメントおよび完全なＢｌａ遺伝子を有
するフラグメントを上記の方法により同時にＥ．ｃｏｌ
ｉ ＪＣ８６７９細胞内にエレクトロポレートし、そし
て形質転換体を異なる濃度のセフォタキシム上にプレー
トした。
【０４６４】第２のアプローチにおいて、ベクターｐＵ
Ｃ１８Ｓｆｉ−Ｂｌａ−Ｓｆｉを増幅して、上記第１の
アプローチにおけるように単離された大きなプラスミド
フラグメントを生成した。２つのフラグメントはそれぞ
れ完全なＢｌａ遺伝子の一部を有し、その結果２つのフ
ラグメントが共になって完全なＢｌａ遺伝子にまたがる
２つのフラグメントもまたＰＣＲにより得た。大きなプ
ラスミドフラグメントおよび２つのＢｌａ遺伝子フラグ
メントをすべてコンピテントなＥ．ｃｏｌｉＪＣ８６７
９細胞内にエレクトロポレートし、そして形質転換体を
種々の濃度のセフォタキシム上にプレートした。
【０４６５】第３のアプローチにおいて、ベクターとプ
ラスミドとの両方をＥ．ｃｏｌｉＪＣ８６７９細胞内に
エレクトロポレートし、そして形質転換体を種々の濃度
のセフォタキシム上にプレートした。
【０４６６】第４のアプローチにおいて、完全なＢｌａ
遺伝子を、すでにベクターｐＵＣＳｆｉ−Ｓｆｉを含む
Ｅ．Ｃｏｌｉ ＪＣ８６７９細胞内にエレクトロポレー
トし、そして形質転換体を種々の濃度のセフォタキシム
上にプレートした。コントロールとしてＥ．ｃｏｌｉ
ＪＣ８６７９細胞を、完全なＢｌａ遺伝子またはベクタ
ー単独のいずれかでエレクトロポレートした。
【０４６７】結果を図１１に表す。ベクターへの２つの
フラグメントの挿入の効率は、完全なＢｌａ遺伝子を有
する１つのフラグメントが使用される場合より１００倍
低い。第３のアプローチは、挿入の効率は遊離ＤＮＡ末
端の存在に依存することを示した。なぜなら、このアプ
ローチでは組換え体が得られなかったからである。しか
し、第３のアプローチの結果もまた、ベクターのエレク
トロポレーションの低効率によるものであった。発現ベ
クターがすでにコンピテントな細胞内にある場合、ベク
ターのエレクトロポレーションの効率はもはや要因では
なく、効率的な相同組換えは非切断のベクターを用いて
さえ達成され得る。
【０４６８】（実施例１２．ベクターの性能を最適化す
るカセットシャッフリングのためのキット）最適化され
た表現型（例えば、クローニング遺伝子のような、ベク
ターがコードされる配列の最大の発現）を与え得るベク
ターを提供するために、シャッフリングされ得る種々の
カセットを含むキットが提供され、そして最適化された
シャッフリング体が選択され得る。図１２は、それぞれ
の遺伝子座が複数のカセットを有する１つの実施態様を
概略的に示す。例えば、細菌の発現システムにおいて、
図１３はそれぞれの遺伝子座で使用される例示のカセッ
トを示す。与えられた遺伝子座のそれぞれのカセット
（例えば、本実施例のすべてのプロモーター）は、隣接
する遺伝子座のカセットのフランキング配列に重複し
得、そしてまた、好ましくは相同組換えまたは非相同組
換えに関与し得る（例えば、ｌｏｘ／ｃｒｅまたはｆｌ
ｐ／ｆｒｔ系）実質的に同一な配列と隣接し、遺伝子座
内であるが実質的に遺伝子座間ではないカセットのシャ
ッフリングを提供するようにする。
【０４６９】カセットはＰＣＲフラグメントとしてキッ
トに供給されるが、それぞれのタイプのカセットまたは
個々のカセットの種は個別のチューブにパッケージされ
る。ベクターライブラリーは、それぞれの遺伝子座のカ
セットの重複フランキング配列と隣接する遺伝子座のカ
セットとのハイブリダイゼーションによって、プラスミ
ド全体またはその実質的な部分を組立てるチューブの内
容物を組み合わせることにより作製される。組立てられ
たベクターは目的の予め決定した遺伝子へ連結されてベ
クターライブラリーを形成する。ここで、それぞれのラ
イブラリーのメンバーは目的の予め決定した遺伝子およ
びカセットの結合により決定されるカセットの組み合わ
せを含む。ベクターを適切な宿主細胞内に移し、そして
この細胞を発現に適切な条件下で培養し、そして所望の
表現型を選択する。
【０４７０】（実施例１３．緑色蛍光タンパク質（ＧＦ
Ｐ）の特性を最適化するためのシャッフリング） （背景）緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）は、２３８
アミノ酸残基および約２７，０００の分子量を有するア
ポタンパク質由来のポリペプチドである。ＧＦＰは、ア
ミノ酸残基６５〜６７から形成される発色団を含む。そ
の名前が示すように、ＧＦＰは蛍光を発する；それは、
ルシフェラーゼのように生体発光しない。インビボで
は、ＧＦＰの発色団は、発光タンパク質エクオリンと複
合体化したコエレンテラジン（ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚ
ｉｎｅ）からのエネルギー転移により活性化され、ＧＦ
Ｐは５１０ｎｍでの緑色蛍光を示す。青色光またはＵＶ
光での照射の際には、ＧＦＰは、約５１０ｎｍで緑色蛍
光を示す。
【０４７１】クラゲＡｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉ
ａの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、遺伝子発現およ
び調節の非常に有用なレポーターである（Ｐｒａｓｈｅ
ｒら、（１９９２） Ｇｅｎｅ １１１： ２２９；
Ｐｒａｓｈｅｒら、（１９９５） Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｎ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１： ３２０； Ｃｈａｌｆｉ
ｅら、（１９９４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３： ８０
２、これらは本明細書中に参考として援用される）。Ｗ
Ｏ ９５／２１１９１は、アミノ酸６５〜６７から形成
される発色団を含む、２３８アミノ酸ＧＦＰアポタンパ
ク質をコードするポリヌクレオチド配列を開示してい
る。ＷＯ ９５／２１１９１は、Ａ．ｖｉｃｔｏｒｉａ
ＧＦＰのアポペプチドのｃＤＮＡの改変は、変化した
蛍光特性を有するペプチドの合成をもたらすことを開示
している。励起振幅における４〜６倍改善をもたらす変
異ＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）が報告されている（Ｈｅｉｍら、
（１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．）９１： １２５０１）。
【０４７２】（概要）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）
は、遺伝子調節のレポーターとして急速に幅広く使用さ
れるようになってきている。しかし、多くの生物（特
に、真核生物）において全細胞の蛍光シグナルは低すぎ
ることが見出された。目的は、Ｅ．ｃｏｌｉおよび哺乳
動物細胞に対する遺伝子調節のレポーターとして使用す
るためにＧＦＰの全細胞蛍光を改善することであった。
ＧＦＰの量子収率は既に０．７〜０．８であり（Ｗａｒ
ｄら、（１９８２） Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏ
ｂｉｏｌ． ３５： ８０３）、そして標準的なＥ．ｃ
ｏｌｉ構築物におけるＧＦＰの発現レベルは、既に総タ
ンパク質の７５％であったので、合理的な設計によるＧ
ＦＰの改善は、困難であると思われた。
【０４７３】ＧＦＰの改善は、第１に、改善されたコド
ン使用頻度を有するＧＦＰ遺伝子の合成により行われ
た。次いで、ＧＦＰ遺伝子は、最も明るいクローンの視
覚的な選択と組み合わせた、ＤＮＡシャッフリングの反
復サイクルまたはＧＦＰ遺伝子の有性（ｓｅｘｕａｌ）
ＰＣＲからなる開示された方法により、さらに改善され
た。Ｅ．ｃｏｌｉにおける全細胞蛍光シグナルは最適化
され、そして次いで、選択された変異体は、真核生物細
胞における最良のＧＦＰ変異体の性能を決定するために
アッセイされた。
【０４７４】コドン使用頻度が改善され、そして工業的
に標準なＧＦＰ構築物（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ， ＣＡ）と比較してＥ．ｃｏｌｉ全細胞蛍
光シグナルの２．８倍の改善を有する合成遺伝子が合成
された。標準的構築物を超える４５倍の改善のために、
さらなる１６倍の改善が、有性ＰＣＲの３サイクルおよ
び最も明るいＥ．ｃｏｌｉコロニーについての視覚的な
スクリーニングから得られた。チャイニーズハムスター
卵巣（ＣＨＯ）細胞において発現した、このシャッフリ
ング変異体は、合成構築物を超える４２倍のシグナルの
改善を示した。Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現レベルは、総
タンパク質の約７５％で変化しなかった。ＧＦＰの最大
発光および最大励起もまた変化しなかった。Ｅ．ｃｏｌ
ｉにおいて野生型のＧＦＰの大部分は封入体になり、そ
の発色団を活性化することができないが、変異タンパク
質の大部分は可溶性でありかつ活性である。従って、３
つのアミノ酸変異が、変異タンパク質を、凝集よりむし
ろ天然のフォールディング経路に導く。この結果は、Ｄ
ＮＡ配列シャッフリング（有性ＰＣＲ）により、複雑な
実施上の問題が解決され得、そして有利な変異改変体を
迅速にかつ効率的に作製し得ることを示す。
【０４７５】（材料と方法） （ＧＦＰ遺伝子構築）公開された配列（Ｐｒａｓｈｅｒ
ら、（１９９５）、前出、これは本明細書中に参考とし
て援用される）（２３８ＡＡ、２７ｋＤ）を有する、Ｇ
ＦＰタンパク質をコードする遺伝子を、オリゴヌクレオ
チドから構築した。市販のＧＦＰ構築物（Ｃｌｏｎｔｅ
ｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）とは対照的に、
この配列は、元のｃＤＮＡクローンに見出されるよう
に、ｆＭｅｔの後にＡｌａ残基を含んでいた。５４〜８
５塩基の範囲の１４オリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ伸長
により７対として組み立てた。これらのセグメントを、
制限酵素により消化し、そしてベクターＡｌｐｈａ＋Ｇ
ＦＰ（Ｗｈｉｔｅｈｏｒｎら、（１９９５） Ｂｉｏ／
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３： １２１５、これは本明
細書中に参考として援用される）に別々にクローニング
し、そして配列決定した。次いで、これらのセグメント
を、真核生物発現ベクターＡｌｐｈａ＋に連結して、完
全長ＧＦＰ構築物、Ａｌｐｈａ＋ＧＦＰを形成した（図
１４）。得られたＧＦＰ遺伝子は、アミノ酸７３位（Ｃ
ＧＴ）、８０位（ＣＧＧ）、９６位（ＣＧＣ）、および
１２２位（ＣＧＴ）で変化したアルギニンコドンを含ん
でいた。コドンの偏りを減少させ、そしてＥ．ｃｏｌｉ
における発現を容易にするために、多くの他のサイレン
ト変異を配列に操作して、遺伝子の組立に使用される制
限部位を作製した。これらは、Ｓ２（ＡＧＴからＡＧ
Ｃ；ＮｈｅＩ部位を作製するため）、Ｋ４１（ＡＡＡか
らＡＡＧ；ＨｉｎＤＩＩＩ）、Ｙ７４（ＴＡＣからＴＡ
Ｔ）、およびＰ７５（ＣＣＡからＣＣＧ；ＢｓｐＥ
１）、Ｔ１０８（ＡＧＡからＡＧＧ；ＮｎｕＩ）、Ｌ１
４１（ＣＴＣからＴＴＧ）、およびＥ１４２（ＧＡＡか
らＧＡＧ；ＸｈｏＩ）、Ｓ１７５（ＴＣＣからＡＧＣ；
ＢａｍＨＩ）、ならびにＳ２０２（ＴＣＧからＴＣＣ；
ＳａｌＩ）であった。この遺伝子の５’および３’非翻
訳末端は、それぞれ、ＸｂａＩ部位およびＥｃｏＲＩ部
位を含んでいた。遺伝子の配列を、配列決定により確認
した。
【０４７６】他の適切なＧＦＰベクターおよび配列は、
ＧｅｎＢａｎｋデータベースから、例えば、インターネ
ットワールドワイドウェブを介して、ファイル：ＣＶＵ
３６２０２、ＣＶＵ３６２０１、ＸＸＰ３５ＳＧＦＰ、
ＸＸＵ１９２８２、ＸＸＵ１９２７９、ＸＸＵ１９２７
７、ＸＸＵ１９２７６、ＡＶＧＦＰ２、ＡＶＧＦＰ１、
ＸＸＵ１９２８１、ＸＸＵ１９２８０、ＸＸＵ１９２７
８、ＡＥＶＧＦＰ、およびＸＸＵ１７９９７（これら
は、配列ファイルおよびコメントが本明細書中に印刷お
よび挿入されるのと同程度に、本明細書中に参考として
援用される）として得られ得る。
【０４７７】Ａｌｐｈａ＋ＧＦＰのＸｂａＩ−ＥｃｏＲ
Ｉフラグメント（全ＧＦＰ遺伝子を含む）を、原核生物
発現ベクターｐＢＡＤ１８（Ｇｕｚｍａｎら、（１９９
５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７７： ４１２１）
にサブクローニングし、細菌発現ベクターｐＢＡＤ１８
−ＧＦＰ（図１４）を得た。このベクターにおいて、Ｇ
ＦＰ遺伝子発現は、アラビノースプロモーター／リプレ
ッサー（ａｒａＢＡＤ）の制御下にあり、これはアラビ
ノース（０．２％）で誘導可能である。これは、元のア
ミノ酸配列を有する唯一の構築物であるので、野生型Ｇ
ＦＰ（「ＷＴ」）と呼ばれる。ＧＦＰ発現細菌ベクター
を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ
）から入手したが、これは本明細書中で「Ｃｌｏｎｔ
ｅｃｈ」構築物という。「Ｃｌｏｎｔｅｃｈ」構築物か
らのＧＦＰ発現は、ＩＰＴＧ誘導を必要とする。
【０４７８】（遺伝子シャッフリングおよび選択）全Ｇ
ＦＰ遺伝子を含む約１ｋｂのＤＮＡフラグメントを、プ
ライマー５’ＴＡＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＣＣＴＧＡＣＧ
Ｃ（ＮｈｅＩ付近）および５’ＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴ
ＣＴＣＡＴＣＣＧ（ＥｃｏＲＩ付近）を用いるＰＣＲに
よりＰＢＡＤ−ＧＦＰベクターから得、そしてＷｉｚａ
ｒｄ ＰＣＲ ｐｒｅｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉ
ｓｏｎ， ＷＩ）により精製した。このＰＣＲ産物を、
ＤＮａｓｅ Ｉ（Ｓｉｇｍａ）を用いてランダムフラグ
メントに消化し、そして５０〜３００ｂｐのフラグメン
トを、２％低融点アガロースゲルから精製した。精製し
たフラグメントを、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ）と共にＰＣＲ混合物（Ｐｒｏｍｅｇａ，
Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ； ０．２ｍＭ 各ｄＮＴＰ／
２．２ｍＭ ＭｇＣｌ2／ ５０ｍＭ ＫＣｌ／ １
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０／０．１％ Ｔ
ｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００）に１０〜３０ｎｇ／μｌで再
懸濁し、そしてＳｔｅｍｍｅｒ， ＷＰＣ （１９９
４） Ｎａｔｕｒｅ ３７０： ３８９（本明細書中に
参考として援用される）に記載されたように、９４℃３
０秒、４５℃３０秒、７２℃３０秒の３５サイクルのＰ
ＣＲプログラムを用いて（プライマーを用いずに）組み
立てた。この反応産物を、新しいＰＣＲ混合物に４０倍
に希釈し、そして完全長産物を、９４℃３０秒、５０℃
３０秒、７２℃３０秒、続いて７２℃１０分間の２５サ
イクルのＰＣＲで同じ２つのプライマーを用いて増幅し
た。ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩを用いた再組立産物の消
化の後、点変異させ、そしてインビトロで組換えたＧＦ
Ｐ遺伝子のこのライブラリーを、ＰＢＡＤベクターにク
ローニングし戻し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ）にエレクトロポレーションし、そして１００
μｇ／ｍｌアンピシリンおよび０．２％アラビノースを
含むＬＢプレートにプレーティングして、アラビノース
プロモーターからのＧＦＰ発現を誘導した。
【０４７９】（変異体選択）標準ＵＶ光ボックス（３６
５ｎｍ）の上で、４０の最も明るいコロニーを選択し、
そしてプールした。コロニーのプールをＰＣＲ反応のテ
ンプレートとして使用し、ＧＦＰ遺伝子のプールを得
た。サイクル２および３を、サイクル１と同一に行っ
た。サイクル３の最良の変異体を、マイクロタイタープ
レート中でコロニーを増殖させ、そしてマイクロタイタ
ープレートで、蛍光分光測定することにより同定した。
【０４８０】Ｅ．ｃｏｌｉにおける変異体の特徴付けの
ために、ＤＮＡ配列決定を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ ３９１ ＤＮＡシーケンサーで行った。
【０４８１】（ＧＦＰのＣＨＯ細胞発現）ＧＦＰ遺伝子
の野生型ならびにサイクル２および３変異体バージョン
を、ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントとして、真核生
物発現ベクターＡｌｐｈａ＋（１６）に移入した。プラ
スミドを、４００Ｖおよび２５０μＦで、４０μｇのプ
ラスミドを含む０．８ｍｌ中で１０7細胞のエレクトロ
ポレーションによりＣＨＯ細胞にトランスフェクトし
た。形質転換体を、１０〜１２日間、１ｍｇ／ｍｌＧ４
１８を用いて選択した。
【０４８２】ＦＡＣＳ分析を、４８８ｎｍに調製したア
ルゴンイオンレーザーを用いてＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋ
ｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＴＡＲ Ｐｌｕｓで行った。蛍光
を、５３５／３０ランの帯域通過フィルターを用いて観
察した。
【０４８３】（結果） （コドン使用頻度）コドン使用頻度が改変された合成Ｇ
ＦＰ構築物（「ＷＴ」）を発現するＥ．ｃｏｌｉは、
「Ｃｌｏｎｔｅｃｈ」構築物を発現する細胞よりほぼ３
倍大きな全細胞蛍光シグナルを生じた（図１５Ａ）。こ
の比較を、完全な誘導および等しいＯＤ600で行った。
「ＷＴ」構築物中の乏しいアルギニンコドンの置換およ
び「Ｃｌｏｎｔｅｃｈ」構築物に存在するＮ末端伸長に
加えて、発現ベクターおよびＧＦＰプロモーターは全く
異なる。蛍光シグナルの改善の原因は、発現レベルの増
強でなはく、タンパク質性能の改善である。
【０４８４】（有性（ｓｅｘｕａｌ）ＰＣＲ）合成「Ｗ
Ｔ」ＧＦＰ構築物の蛍光シグナルを、本明細書中および
Ｓｔｅｍｍｅｒ ＷＰＣ （１９９４） Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）
９１： １０７４７およびＳｔｅｍｍｅｒ ＷＰＣ
（１９９４） Ｎａｔｕｒｅ ３７０： ３８９（これ
らは、本明細書中に参考として援用される）に記載され
る有性ＰＣＲ法により、変異体ライブラリーを構築し、
続いてプレーティングし、そして最も明るいコロニーを
選択することにより、さらに改善した。有性ＰＣＲおよ
び選択の２回目のサイクルの後、「ＷＴ」より約８倍、
そして「Ｃｌｏｎｔｅｃｈ」構築物より２３倍改善され
た、変異体（「サイクル２」）を得た。３回目のサイク
ルの後、「ＷＴ」構築物より約１６〜１８倍、そして
「Ｃｌｏｎｔｅｃｈ」より４５倍大きく改善された、変
異体（「サイクル３」）を得た（図１５Ｂ）。変異体の
励起および放出スペクトルのピーク波長は、「ＷＴ」構
築物のそれと同一であった。全細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
分析により、３つ全ての構築物で発現したＧＦＰタンパ
ク質の総レベルは、総タンパク質の約７５％という驚く
べき高い割合で変化しないことが示された（図１６、パ
ネル（ａ）および（ｂ））。超音波処理および遠心分離
による細胞の分画化により、「ＷＴ」構築物は封入体の
形態でほとんど不活性なＧＦＰを含むが、「サイクル
３」変異体ＧＦＰはほとんど可溶性のままであり、そし
てその発色団を活性化し得ることが示された。変異遺伝
子を配列決定し、そして「サイクル１」変異体は、「サ
イクル３」変異体よりも多く変異を含むことが見出され
た（図１７）。「サイクル３」は、「ＷＴ」構築物と比
較して３つのタンパク質変異および３つのサイレント変
異を含んでいた。変異Ｆ１００Ｓ、Ｍ１５４Ｔ、および
Ｖ１６４Ａは、疎水性残基のより親水性残基での置換を
含む（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８
２）。１つのもっともらしい説明は、天然のＧＦＰは、
その表面上に疎水性部位を有し、これによりエクオリン
または別のタンパク質に正常に結合することである。こ
の他のタンパク質がなければ、疎水性部位は凝集を引き
起こし得、そして発色団の自己触媒活性化を妨げ得る。
３つの親水性変異体は、疎水性部位を相殺し得、これは
凝集の低減および発色団活性化の増大をもたらす。３７
℃での全細菌を用いたパルスチェイス実験により、発蛍
光団形成のＴ1/ 2は、「ＷＴ」ＧＦＰおよび「サイクル
３」変異体ＧＦＰの両方について９５分であることが示
された。
【０４８５】（ＣＨＯ細胞）自己フォールディングのよ
うな自立的特性における改善は、異なる細胞環境に移入
可能であり得る（ｔｒａｎｆｅｒａｂｌｅ）。細菌にお
いて選択した後、「サイクル３」変異ＧＦＰを、真核生
物Ａｌｐｈａ＋ベクターに移入し、そしてチャイニーズ
ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）において発現させた。
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて「サイクル３」構築物は、「Ｗ
Ｔ」構築物より１６〜１８倍強いシグナルを与えたが、
「サイクル３」変異体を発現するＣＨＯ細胞の蛍光分光
測定は、同一の条件下で「ＷＴ」構築物より４２倍大き
な全細胞蛍光シグナルを示した（図１８Ａ）。ＦＡＣＳ
分別により、「サイクル３」を発現するＣＨＯ細胞クロ
ーンの平均蛍光シグナルは、「ＷＴ」構築物を発現する
ＣＨＯ細胞より４６倍大きいことが確認された（図１８
Ｂ）。「ＷＴ」構築物に関する限りでは、２ｍＭの酪酸
ナトリウムの添加により、蛍光シグナルが約４〜８倍増
加することが見出された。
【０４８６】（スクリーニング対選択）これらの結果
を、約１０，０００コロニーの視覚的スクリーニングに
より得、そして最も明るい４０のコロニーを各サイクル
で採集した。タンパク質機能における著しい改善を、比
較的少ない数の改変体により得ることができた。この驚
くべき発見を考慮すると、有性ＰＣＲは、多数の商業的
に重要な酵素の最適化（これについては、大規模な変異
体選択は実行可能でも効率的でもない）のために改善さ
れたプロセスとして、高スループットスクリーニング手
順と組合せ得る。
【０４８７】（実施例１４．改善したペプチドディスプ
レイライブラリーを作製するためのシャッフリング） （背景）一旦組換え体がファージディスプレイライブラ
リー、ポリソームディスプレイライブラリーなどから特
徴づけられると、元々ディスプレイされた（ｄｉｓｐｌ
ａｙｅｄ）配列の改変体をディスプレイする第２世代ラ
イブラリーを構築およびスクリーニングすることはしば
しば有用である。しかし、７残基より長いポリペプチド
の組合せの数は非常に多いので、全ての順列は、一般的
に一次ライブラリーには存在しない。さらに、配列を変
異することにより、単離された配列周辺の「配列景観
（ｌａｎｄｓｃａｐｅ）」は、局所的最適（ｌｏｃａｌ
ｏｐｔｉｍａ）を見出すために調べられ得る。
【０４８８】変異誘発の目的のために実験者に利用可能
ないくつかの方法がある。例えば、適切な方法として、
位置指定変異誘発、カセット変異誘発、および誤りがち
なＰＣＲが挙げられる。
【０４８９】（概要）インビトロで変異を作製するため
の開示された方法は、ＤＮＡシャッフリングとして知ら
れている。ＤＮＡシャッフリングの実施態様において、
遺伝子は、ＤＮａｓｅ Ｉで小さなランダムフラグメン
トに破壊され、次いでＰＣＲ様反応において、典型的に
はいずれのプライマーも使用することなく再組立され
る。再組立するプロセスは、プルーフリーディングポリ
メラーゼの非存在下では変異原性であり得、エラー率が
約０．７％まで生じる。これらの変異はトランジション
およびトランスバージョンの両方からなり、これらは、
しばしば再組立されたセグメント長にわたってランダム
に分布する。
【０４９０】一旦、所望の特性を有するファージディス
プレイ組換え体を単離すると、これは、一般的に、ＤＮ
Ａシャッフリングを介する一回の分子進化により結合特
性を改善または改変するのに適する。ディスプレイされ
たペプチドおよび抗体の第２世代ライブラリーを作製
し、そして明らかに結合強度が改善された（すなわち、
３〜１０００倍）単離ファージを生成した。従って、反
復回のライブラリー作製および選択により、配列空間を
通して最適結合まで「ヒルクライム（ｈｉｌｌ−ｃｌｉ
ｍｂ）」することが可能である。
【０４９１】第２世代ライブラリーから、非常にしばし
ば、より強い結合種が単離され得る。このようなファー
ジの選択的な濃縮は、広範囲の洗浄と組合わせてまたは
当該分野で公知の他の手段により、マイクロタイタープ
レート上に固定されたまたは溶液中のより低い標的濃度
でスクリーニングすることにより達成され得る。別の選
択は、ファージ上で低い結合価（ｖａｌｅｎｃｙ）の分
子の変異原化（ｍｕｔａｇｅｎｉｚｅｄ）集団をディス
プレイして、より高い親和性定数を有する分子を選択す
ることである。最終的に、親ファージの効率的な結合を
ブロックする低濃度の結合インヒビター（すなわち、標
的、リガンド）の存在下で、第２世代ライブラリーをス
クリーニングすることは可能である。
【０４９２】（方法） （例示的な変異誘発プロトコル）組換えＤＮＡを基礎と
した変異誘発の形態は、オリゴヌクレオチド媒介部位指
定変異誘発として知られている。オリゴヌクレオチド
は、標的ＤＮＡと塩基対を形成するが、一方このオリゴ
ヌクレオチドの中心部近くで１つ以上の塩基が異なるよ
うに設計される。このオリゴヌクレオチドが一本鎖テン
プレートＤＮＡと塩基対形成した場合、ヘテロ二重鎖
は、インビトロで二本鎖ＤＮＡに変換される；このよう
に、一本鎖の産物は、変異原性オリゴヌクレオチドによ
り、ヌクレオチド配列を特異的にする。次いで、これら
のＤＮＡ分子は、インビボで増殖され、そして所望の組
換え体は、最終的に、形質転換体の集団間で同定され
る。
【０４９３】一本鎖変異誘発のためのプロトコルを、以
下に記載する。
【０４９４】１．Ｍ１３ファージまたはファージミドか
ら一本鎖ＤＮＡを調製する。約２μｇのＤＮＡを単離す
る。ＤＮＡは、ｄｕｔ-ｕｎｇ-細菌宿主（供給源）から
単離し得、その結果、回収されたＤＮＡは、多くのチミ
ン残基の代わりにウラシルを含む。
【０４９５】２．変異される部位に隣接するコーディン
グ領域に対して、少なくとも１５または２０残基の相補
性を有するオリゴヌクレオチドを設計する。このオリゴ
ヌクレオチドにおいて、ランダム化される領域は、縮重
コドンにより表され得る。非相補領域が大きい場合（す
なわち、＞１２ヌクレオチド）、隣接領域は、正確な塩
基対形成を確実にするために伸長されるべきである。オ
リゴヌクレオチドは、変異誘発の手順の効率が改善され
るので、５’ＰＯ4基（この基はまた、Ｔ４ポリヌクレ
オチドキナーゼにより酵素的に付加され得る）を有して
合成されるはずである。（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ
において、５０ｍＭ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2、５ｍＭ ＤＴＴ、およびＯＡ ｍＭ ＡＴＰ中
で、１００ｎｇのオリゴヌクレオチドを２単位のＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼと共に３０分間インキュベート
する。） ３．１μｇの一本鎖ＤＮＡ、１０ｎｇのオリゴヌクレオ
チド、２０ｍＭ Ｔｒ＠Ｃｌ（ｐＨ７．４）、２ｍＭ
ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ ＮａＣｌを含む、５００μｌの
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中でオリゴヌクレオチドと
一本鎖ＤＮＡとをアニーリングする。
【０４９６】４．この溶液を共に混合し、そして２、３
秒間チューブを遠心分離して液体を再回収する。７０℃
に熱した水を含むチューブをフラスコ中で加熱する。５
分後、フラスコをラボベンチ（ｌａｂ ｂｅｎｃｈ）に
移し、そして室温までゆっくりと冷却させる。
【０４９７】５．チューブを水溶から取り出し、そして
それを氷上に置く。以下の試薬（総容量１００μｌ：２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２ｍＭ Ｄ
ＴＴ、０．５ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、お
よびｄＴＴＰ、０．４ｍＭＡＴＰ、１単位のＴ７ ＤＮ
Ａポリメラーゼ、２単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ）をチ
ューブに添加する。
【０４９８】６．１時間後、ＥＤＴＡを１０ｍＭの最終
濃度まで添加する。
【０４９９】７．２０μｌをサンプルから採集し、そし
てアガロースゲル上で流す。一本鎖ＤＮＡの大部分は、
共有結合により閉環したＤＮＡに変換されるはずであ
る。隣接したレーンでいくつかのコントロールを電気泳
動させる（すなわち、テンプレート、オリゴヌクレオチ
ドを含まないテンプレート反応物）。二本鎖環状ＤＮＡ
を閉じるために、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを添加する。
【０５００】８．フェノール抽出によりＤＮＡ（８０μ
ｌ）の残渣を抽出し、そしてエタノール沈澱により回収
する。
【０５０１】９．ｕｎｇ+細菌にエレクトロポレーショ
ンする。 １０．ＰＥＧ沈澱により第２世代ファージを採集する。
【０５０２】（カセット変異誘発）コーディング領域内
の特定の部位で変異を導入する簡便な手段は、カセット
変異誘発によるものである。「カセット」は、いくつか
の異なる方法により作製され得る：Ａ）２つのオリゴヌ
クレオチドを共にアニーリングし、そしてそれらを二本
鎖ＤＮＡに変換することによる；Ｂ）最初に、ランダム
化された配列を有するオリゴヌクレオチドを用いてＤＮ
Ａのセグメントを増幅し、次いでこのＤＮＡを再増幅し
てクローニングのためのカセットを作製するにことによ
る；Ｃ）最初に、ＤＮＡセグメントの各半分を、ランダ
ム化された配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて増
幅し、次いで２つの断片を共に加熱して、クローニング
のためのカセットを作製することによる；およびＤ）誤
りがちなＰＣＲによる。これらの４つの手順により形成
されたカセットは、長さおよびコーディングフレームが
固定されているが、低頻度で不特定なコドンを有する。
従って、カセットのクローニングおよび発現は、カセッ
トの全長に沿って１つ以上の変異残基を有する、複数の
ペプチドまたはタンパク質を生成する。
【０５０３】典型的に、２つの型の変異誘発スキームが
使用され得る。第１に、ファージディスプレイタンパク
質またはペプチドにおける特定の残基は、完全にランダ
ム化され得る。これらの位置でのコドンは、ＮＮＮ、Ｎ
ＮＫ、またはＮＮＳであり得、これらは３２コドンを使
用して２０残基全てをコードする。これらはまた、予め
形成されたトリプレットとして、またはスプリットレジ
ン（ｓｐｌｉｔ−ｒｅｓｉｎ）法により合成されるオリ
ゴヌクレオチドを混合することにより合成され得、これ
らはそれぞれの所望の位置で２０コドン全てを覆う。逆
に、コドンのサブセットを使用して、特定のアミノ酸に
有利にし、そして他を排除し得る。第２に、カセットに
おける全てのコドンは、変異されるという可能性はいく
らか低い。これは、別々の３つの塩基で「スパイクされ
た（ｓｐｉｋｅｄ）」ボトルを用いて合成されたオリゴ
ヌクレオチドにより、またはスプリットレジン法により
共に混合されるオリゴヌクレオチドの比率を変えること
により、達成される。
【０５０４】短い領域の変異誘発については、合成オリ
ゴヌクレオチドでのカセット変異誘発が一般的に好まし
い。１より多いカセットは、いくつかの領域を同時に改
変する時に使用され得る。このアプローチは、変異抗体
のライブラリーを作製する場合に好ましく、ここで、６
つ全ての相補性決定領域（ＣＤＲ）が同時に改変され
る。
【０５０５】（ランダムコドン） １．固定位置および変異位置を有するオリゴヌクレオチ
ドを設計する。固定位置は、結合または機能に必須であ
ると推測されるクローニング部位およびそれらのコーデ
ィング領域に対応しなければならない。
【０５０６】２．オリゴヌクレオチドの合成の間、オリ
ゴヌクレオチド合成機に、等モル量の各塩基（Ｎ）、グ
アノシンおよびシトシン（Ｋ）、グアノシンおよびチミ
ジン（Ｓ）を送達させる。
【０５０７】（「スパイク（ｓｐｉｋｅｄ）」コドン） １．固定位置および変異位置を有するオリゴヌクレオチ
ドを設計する。固定位置は、結合または機能に必須であ
ると推測されるクローニング部位およびそれらのコーデ
ィング領域に対応しなければならない。各位置で別々の
３つのヌクレオチドの画分（ｘ）で合成された長さ
（ｍ）のポリヌクレオチドカセットにおいて、誤り
（ｎ）を見出す確率を以下のように表す： Ｐ＝［ｍ！／（ｍ−ｎ）ｎ！］［ｘn］［１−Ｘ］m-n。
【０５０８】２．オリゴヌクレオチドの合成の間、塩基
ボトルを消す。固定位置に対して１００％の各塩基を有
するボトル、ならびに１００−Ｘ％の１つの塩基および
Ｘ／３％の各別々の３つの塩基を有するボトルを用い
る。ドーピング（ｄｏｐｉｎｇ）率はまた、天然の球状
タンパク質における平均アミノ酸使用または他のアルゴ
リズムに基づいて異なり得る。市販のコンピュータープ
ログラムであるＣｙｂｅｒＤｏｐｅが存在し、これは、
特定のドーピングスキームを用いてオリゴヌクレオチド
を合成するための塩基混合物の決定を補助するために、
使用され得る。ＣｙｂｅｒＤｏｐｅプログラムのデモン
ストレーションコピーは、ｃｙｂｅｒｄｏｐｅ＠ａｏ
ｌ．ｃｏｍ．へＥメール請求を送ることにより得られ得
る。
【０５０９】（位置指定コドン） １．固定位置および変異位置を有するオリゴヌクレオチ
ドを設計する。固定位置は、結合または機能に必須であ
ると推測されるクローニング部位結合およびそれらのコ
ーディング領域に対応しなければならない。２０アミノ
酸全てをコードする特定の制限酵素部位でオリゴヌクレ
オチドのセットを挿入するための１つの方法が記載され
ている（Ｋｅｇｌｅｒ−Ｅｂｏら、（１９９４） Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２： １５９３（これ
は本明細書中に参考として援用される））。
【０５１０】２．オリゴヌクレオチドの合成の間に、各
コドンで樹脂を分離させる。
【０５１１】（誤りがちなＰＣＲ）増幅の間に変異のレ
ベルを上昇させるための、標準的なＰＣＲ条件（Ｓａｉ
ｋｉら、（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９： ４
８７（これは、本明細書中に参考として援用される））
に基づいたいくつかのプロトコルが存在する。上昇した
ｄＮＴＰ濃度およびＭｎ+2の添加は、変異速度を著しく
増加させる。変異は理論的にはランダムに導入されるの
で、これは、新規のタンパク質の集団を生成するための
１つの機構である。一方、誤りがちなＰＣＲは、コード
領域が短いので、短いペプチド配列を改変するのにはあ
まり適切ではなく、そして変化の速度が遅すぎて、選択
に適切な数の変異体を生成できない。また、これは、コ
ーディング領域内で多くの変異が存在して解析を複雑に
するので、長いタンパク質についても理想的でない。
【０５１２】１．ファージ内で目的のコーディング領域
に隣接するオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。
それらは、しばしば、約２１ヌクレオチド長であり、そ
して変異誘発される領域に隣接する。増幅されるフラグ
メントは、適切なベクターでのサブクローニングを容易
に可能にするための、その中に制限部位を有し得る。
【０５１３】２．以下の反応を設定する： １ｐｍｏｌｅの各プライマー；１ｐｍｏｌｅのＤＮＡテ
ンプレート；１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｎＣｌ
2、１ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍＭの各ｄＮＮＰ、２単位
のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ。
【０５１４】３．液体をミネラルオイルで覆う。
【０５１５】４．１ｋｂまでのフラグメントを増幅する
ために、９４℃３０秒、４５℃３０秒、および７２℃３
０秒の間に２４回サイクルを行う。より長いフラグメン
トについては、７２℃の工程を、各ｋｂについて約３０
秒延長する。
【０５１６】５．完全長の分子の画分を増大するため
に、７２℃で５〜１０分間ＰＣＲ反応を延長する。これ
は、フラグメント末端が後にサブクローニングに使用さ
れる制限部位を含む場合に、重要である。
【０５１７】６．ＰＣＲ反応を、必要に応じて、ゲル電
気泳動によりモニターする。
【０５１８】７．ＰＣＲ産物を、適切な制限酵素を用い
て消化して付着末端を作製する。制限フラグメントを、
ゲル精製し得る。
【０５１９】８．ＤＮＡセグメントを、連結により適切
なベクターにクローニングし、そして宿主細胞に導入す
る。
【０５２０】（ＤＮＡシャッフリング）ＤＮＡシャッフ
リングにおいて、遺伝子は、ホスホジエステル結合溶解
剤（例えば、ＤＮａｓｅ Ｉ）を用いて小さなランダム
フラグメントに破壊され、次いで、ＰＣＲ様反応（しか
し、いずれのプライマー添加も必要としない）において
再組立される。再組立するプロセスは、プルーフリーデ
ィングポリメラーゼの非存在下では変異原性であり得、
これは１０〜５０ｂｐのフラグメントが使用される場
合、約０．７％までの誤りを生じる。
【０５２１】１．ＰＣＲは、シャッフルされるフラグメ
ントを増幅する。しばしば、細菌コロニーまたはプラー
クからのＰＣＲに簡便である。滅菌爪楊枝でコロニーま
たはプラークに触れ、そしてＰＣＲ反応混合物（緩衝
液、デオキシヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプライ
マー）中でかき回す。爪楊枝を取り出し、そして９９℃
で１０分間反応物を加熱（ｂｅａｔ）する。反応物を７
２℃まで冷却し、１〜２単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラ
ーゼを添加し、そして９４℃３０秒、４５℃３０秒、７
２℃３０秒を３５回、反応をサイクルし、そして最終的
にサンプルを７２℃で５分間加熱する。（所定の条件
は、１ｋｂの遺伝子についてであり、そして記載の配列
の長さに従って改変される。） ２．遊離プライマーを取り除く。プライマーを完全に除
去することが重要である。
【０５２２】３．約２〜４μｇのＤＮＡを、１００μｌ
の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ
ＭｇＣｌ2中で、０．１５単位のＤＮａｓｅ Ｉ（Ｓ
ｉｇｍａ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を用いて、室
温で５〜１０分間フラグメント化する。ドライアイスで
凍結させ、２％低融点アガロースゲルまたは等価物上で
フラグメントの大きさの範囲を調べ、そして溶解して所
望の大きさの範囲が使用されるまで消化を続ける。所望
の大きさの範囲はこの適用に依存する；１ｋｂの遺伝子
のシャッフリングについては、１００〜３００塩基のフ
ラグメントが、通常適切である。
【０５２３】４．所望のＤＮＡフラグメントの大きさの
範囲は、２％低融点アガロースゲルまたは等価物からゲ
ル精製される。好ましい方法は、ＤＮＡの直前にＷｈａ
ｔｍａｎ ＤＥ−８１イオン交換紙の小さな断片を挿入
し、ＤＮＡをこの紙に走らせ、紙を０．５ｍｌの１．２
Ｍ ＮａＣｌを含むＴＥに入れ、３０秒間ボルテックス
し、次いで全ての紙を注意深くスピンアウトし、上清を
移し、そして２容量の１００％エタノールを添加して、
ＤＮＡを沈澱させることである；サンプルの冷却は必要
ではない。次いで、ＤＮＡペレットを７０％エタノール
で洗浄して、微量の塩を取り除く。
【０５２４】５．ＤＮＡペレットを、０．２ｍＭの各ｄ
ＮＴＰ、２．２ｍＭ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ ＫＣｌ、
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を含むＰＣＲ ｍｉｘ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）中で、１μｌの
ＰＣＲ ｍｉｘあたり約１０〜３０ｎｇのフラグメント
の濃度（代表的には、１０〜２０μｌのＰＣＲ反応物あ
たり１００〜６００ｎｇ）で再懸濁する。プライマーに
は、このＰＣＲ反応において何も添加する必要はない。
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａ
ｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のみが、実質的な変異誘発速度（１
０〜５０ｂｐのＤＮＡフラグメントで０．７％まで）が
所望される場合に使用され得る。プルーフリーディング
ポリメラーゼを含有（例えば、ＴａｑおよびＰｆｕ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）の１：３０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）混
合物））すれば、エラー率がより低くなり、そして非常
に長い配列のＰＣＲが可能になると期待される。９４℃
３０秒、４５〜５０℃３０秒、７２℃３０秒の３０〜４
５サイクルの後、４℃で保持されるプログラムを、ＭＪ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＴＣ−１５０ミニサイクラー
（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）において使用する。こ
の組立の進行は、ゲル解析により調べ得る。この時点で
のＰＣＲ産物は、より大きなおよびより小さな大きさの
スメア（ｓｍｅａｒ）において正しい大きさの産物を含
む。
【０５２５】６．正しく再組立されたこの第１のＰＣＲ
産物を、無関係な（ｏｕｔｓｉｄｅ）プライマーを含む
第２のＰＣＲ反応において増幅する。７．５μｌのＰＣ
Ｒ再組立のアリコートを、０．８ｐＭの各プライマーを
含むＰＣＲ ｍｉｘを用いて４０倍に希釈する。９４℃
３０秒、５０℃３０秒、７２℃３０〜４５秒の２０サイ
クルのＰＣＲプログラムを作動し、終了時には７２℃で
５分で作動する。
【０５２６】７．次いで、所望のＰＣＲ産物を、末端制
限酵素で消化し、ゲル精製し、そしてベクターにクロー
ニングし戻す。このベクターは、しばしば、宿主細胞に
導入される。
【０５２７】部位特異的組換えもまた、例えば、抗体分
子の結合親和性および結合特異性を増大させる手段とし
て、感染細菌細胞内で重抗体鎖および軽抗体鎖をシャッ
フリングするために使用され得る。Ｃｒｅ／ｌｏｘ系
（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、（１９９３） Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１： ２２６５； Ｇｒｉｆ
ｆｉｔｈｓら、（１９９４） ＥＭＢＯ Ｊ． １３：
３２４５（これらは、参考として援用される））およ
びｉｎｔ系を使用することが可能である。
【０５２８】異なるＤＮＡ分子上で生じる有利な変異を
組み合わせるために、組換え体を採取し、そしてそれら
を共にシャッフリングすることは可能であり、そしてイ
ンサートをディスプレイされた組換え体を採取し、そし
てＤＮＡシャッフリングにより親配列と「戻し交配（ｂ
ａｃｋｃｒｏｓｓ）」して、所望の形質に寄与しないあ
らゆる変異を取り除くこともまた可能である。
【０５２９】（実施例１５．改善したヒ酸塩解毒細菌を
作製するためのシャッフリング）ヒ素解毒は、金鉱を含
む硫砒鉄鉱の金採掘および他の使用（例えば、環境改
善）に重要である。ヒ酸塩解毒オペロンをコードするオ
ペロンを含むプラスミドｐＧＪ１０３（Ｗａｎｇら、
（１９８９） Ｂａｔｅｒｉｏｌ． １７１： ８３
（これは、本明細書中に参考として援用される））を、
Ｐｒｏｆ． ＳｉｍｏｎＳｉｌｖｅｒ （Ｕ． ｏｆ
Ｉｌｌｉｎｏｉｓ， Ｃｈｉｃａｇｏ， ＩＬ）から入
手した。ｐＧＪ１０３（ｐＵＣ１９にクローニングされ
たｐ１２５８ａｒｓオペロンを含む）を含むＥ．ｃｏｌ
ｉ ＴＧ１は、ＬＢ ａｍｐプレート上で４μｇ／ｍｌ
のＭＩＣ（最小阻害濃度）を有していた。全５．５ｋｂ
のプラスミドを、ＤＮａｓｅ Ｉを用いて１００〜１０
００ｂｐのフラグメントにフラグメント化し、そしてＰ
ｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＸＬ−ＰＣＲ試薬を用いてＰ
ＣＲにより再組立した。組立後、プラスミドを、独特の
制限酵素ＢａｍＨＩを用いて消化した。完全長モノマー
を、アガロースゲルから精製し、連結し、そしてＥ．ｃ
ｏｌｉ ＴＧ１細胞にエレクトロポレーションした。形
質転換細胞を、一定の範囲のヒ酸ナトリウム濃度（１回
目では２、４、８、１６ｍＭ）上にプレーティングし、
そして最高のヒ酸塩レベルを有するプレートから約１０
００コロニーを、プレートをかきとることによりプール
した。細胞を、同濃度のヒ酸塩の存在下で液体中で増殖
させ、そしてプラスミドをこの培養物から調製した。２
回目および３回目は、細胞をより高いヒ酸塩濃度でプレ
ーティングした以外は１回目と同一であった。８、１
６、３２、６４ｍＭを２回目に使用した；そして３２、
６４、１２８、２５６ｍＭを３回目の選択に使用した。
【０５３０】最良の変異体は、１２８ｍＭまでのヒ酸塩
（ＭＩＣ＝２５６）で一晩増殖した（６４倍の改善）。
改善された株のうちの１つは、ＴＧ１（野生型ｐＧＧＪ
１０３）が１０ｍＭまで液体中で増殖するが、シャッフ
ルされたＴＧ１（変異体ｐＧＪ１０３）は、１５０ｍＭ
までのヒ酸塩濃度で増殖することを示した。
【０５３１】この組立のＰＣＲプログラムは、プライマ
ーを用いずに、サーキュラーＰＣＲ形式を用いて９４℃
２０秒、５０×（９４℃１５秒、５０℃１分、７２℃３
０秒＋２秒／サイクル）であった。
【０５３２】４サイクルのプロセスで、シャッフルされ
たヒ酸塩耐性オペロンにより付与されるヒ酸塩に対する
耐性が５０〜１００倍改善された；改善したオペロンを
含む細菌は、５００ｍＭまでのヒ酸塩を含む培地で増殖
した。
【０５３３】図１９は、ヒ酸塩解毒経路オペロンを含む
ｐＧＪ１０３プラスミドのシャッフリングの結果として
のヒ酸塩毒性に対する耐性の増強を示す。
【０５３４】（実施例１６．改善したカドミウム解毒細
菌を作製するためのシャッフリング）水銀解毒のための
オペロンを含むプラスミドｐＹＷ３３３は、水銀解毒の
経路をコードする少なくとも８つの遺伝子を含む１５．
５ｋｂのプラスミドであり（Ｗａｎｇら、（１９８９）
Ｂａｔｅｒｉｏｌ， １７１：８３，（これは、本明
細書中に参考として援用される））、Ｐｒｏｆ．Ｓｉｍ
ｏｎ Ｓｉｌｖｅｒ（Ｕｎｉｖ．Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，
Ｃｈｉｃａｇｏ， ＩＬ）から入手した。４００〜１５
００ｂｐのフラグメントを、上述のように得、そしてＸ
Ｌ−ＰＣＲ試薬を用いて再組立した。組立されたＤＮＡ
のＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１への直接的なエレクトロポレー
ションの後、細胞を、実施例１５でヒ酸塩について記載
されたのと類似のプロトコル下で、一定の範囲レベルの
塩化水銀（Ｓｉｇｍａ）上にプレーティングした。水銀
の最初のＭＩＣは、５０〜７０μＭであった。４サイク
ルの全プラスミドシャッフリングを行い、そして約５０
〜７０μＭから１０００μＭを超えて水銀に対する細菌
耐性として測定された解毒を増大させた（１５〜２０倍
の改善）。
【０５３５】（実施例１７．カチオン性界面活性剤の添
加によるシャッフリング反応の増強）相補的ＤＮＡ鎖の
再生の確率は、シャッフリングする長い複雑な配列を制
限するようになる。この再生の確率は、単純なカチオン
性界面活性剤の添加より１０，０００倍増強され得る
（ＰｏｎｔｉｕｓおよびＢｅｒｇ（１９９１） ＰＮＡ
Ｓ ８８： ８２３７）。再生は特異的であり、そして
１０6倍までの過剰な異種ＤＮＡから独立している。こ
れらの薬剤の存在下で、相補的ＤＮＡ鎖が溶液中でそれ
ぞれの他方に遭遇する確率は限定的になる。
【０５３６】１５ｋｂのプラスミドの組立反応における
ＴＭＡＣの添加、続くＥ．ｃｏｌｉへのエレクトロポレ
ーションにより、以下の結果がもたらされた：
【０５３７】
【表１３】
【０５３８】１５ｋｂのプラスミドの組立反応における
ＣＡＴＢの添加、続くＥ．ｃｏｌｉへのエレクトロポレ
ーションにより、以下の結果がもたらされる：
【０５３９】
【表１４】
【０５４０】（実施例１８．配列シャッフリング対ＰＣ
Ｒスタッタリング（ｓｔｕｔｔｅｒｉｎｇ））スタッタ
リングは、テンプレートの不完全なポリメラーゼ伸長に
よるフラグメント化である。非常に短いＰＣＲ伸長時間
に基づく組換え形式を利用して、部分的なＰＣＲ産物を
作製する。これは、次の（および引き続く）サイクルに
おいて異なるテンプレートから伸長し続ける。非常に類
似したテンプレート間には強い増殖速度の偏りが存在
し、これはこの形式が、複雑なプールにへの適用につい
て著しい制限を有することを示す。エアサイクラーのよ
うな急速なサイクラーと共に使用する場合、この形式
は、より良好に作用し得る。
【０５４１】ＰＣＲスタッタリングに用いられるＰＣＲ
プログラムは、（９４℃１５秒、６０℃１５秒）の１０
０サイクルであった、２つの別々のＰＣＲ反応を作動さ
せて、２つのＧＦＰ−ネガティブの組換えアッセイ基質
（ＧＦＰ ｓｔｏｐ１およびＧＦＰ ｓｔｏｐ２）のそ
れぞれを含む１ｋｂのＰＣＲフラグメントを得た。ＧＦ
Ｐ−ポジティブな組換え体のみが、これらの２つのテン
プレートの組換えによって得ることができる。５’末端
で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、Ｎｈｅ
Ｉ部位を含む５’ＴＡＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＣＣＴＡＣ
ＣＴＧＡＣＧＣであり、３’で使用されるオリゴは、Ｅ
ｃｏＲＩ部位を含む５’ＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣ
ＡＴＣＣである。ＰＣＲ反応を、テンプレートとして１
ｎｇの各ＧＦＰ−ネガティブ遺伝子を用いて設定した。
Ｔａｑ ＰＣＲ試薬を使用し得るが、処理性（ｐｒｏｃ
ｅｓｓｉｖｉｔｙ）を低下させる誤りがちなＰＣＲ条件
（Ｌｅｎｕｇ， １９８９； ＣａｄｗｅｌｌおよびＪ
ｏｙｃｅ， １９９２）の使用は、ＧＦＰ−ポジティブ
の組換え体の割合を増大させ得る。
【０５４２】９４℃１０〜２０秒、６０℃１０〜３０秒
の５０〜１５０サイクルのスタッタリングプログラム
を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒで使
用した。スタッタリングされた（ｓｔｕｔｔｅｒｅｄ）
ＰＣＲ産物を、ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化
し、そしてＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＢＡ
Ｄ１８ベクターにクローニングし戻し、そしてＥ．ｃｏ
ｌｉにエレクトロポレーションし、そしてａｍｐプレー
トにプレーティングした。ＧＦＰ−ポジティブのクロー
ンが２つのＧＦＰ−ネガティブＤＮＡ配列間での組換え
により生じ、そして検出された。スタッタリングにより
得られたＧＦＰ−ポジティブのコロニーの割合は、０．
１〜１０％であり、これは条件に依存する。
【０５４３】合成遺伝子を、天然のアミノ酸配列に基づ
いて同一の（最適Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン使用頻度を用い
て、各タンパク質について設計した。このアプローチ
は、天然に存在する遺伝子に対する合成遺伝子のＤＮＡ
相同性を増大させ、そしてコドン使用頻度の調節を行わ
ずに可能になるよりも離れて、関連する配列をシャッフ
リングすることを可能にする。各４つの遺伝子を、３０
の６０マーオリゴおよび６つの４０マーから組み立て
た。この組立を、Ｓｔｅｍｍｅｒら（１９９５；Ｇｅｎ
ｅ １６４： ４９−５３）により記載される組立（ａ
ｓｓｅｍｂｌｙ）ＰＣＲにより行った。組立後、遺伝子
を、ベクターｐＵＣ３２２ Ｓｆｉ−ＢＬＡ−Ｓｆｉ
（Ｓｔｅｍｍｅｒら（１９９５） Ｇｅｎｅ １６４：
４９−５３）のＳｆｉ部位にクローニングし、そして
選択培地にプレーティングした。種々のベータラクタム
系抗生物質に対するこれらの４つの構築物の最小阻害活
性を確立した。セフォタキシムは、最適化について選択
された抗生物質のうちの１つであった。４つの遺伝子
を、各遺伝子の１μｇのＣＲ産物をプールすることによ
りシャッフリングし、続いてこのプールのＤＮａｓｅ
Ｉ消化およびアガロースゲルからの１００〜３００ｂｐ
フラグメントの精製を行った。精製フラグメントを、最
初に外部からのプライマーを用いることなく有性ＰＣＲ
により再組立し、次いで、完全長産物を外部からのプラ
イマーの存在下で増幅した。Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９
４） Ｎａｔｕｒｅ ３７０： ３８９−３９１により
以前に記載されたように、得られた完全長遺伝子をＳｆ
ｉＩを用いて消化し、そして新鮮なｐＵＣ３２２Ｓｆｉ
−Ｓｆｉベクターに連結し、そして新鮮なＥ．ｃｏｌｉ
細胞にエレクトロポレーションし、そして漸増濃度のい
くつかの抗生物質（セフォタキシムを含む）上にプレー
ティングした。
【０５４４】手動シャッフリングＰＣＲプロトコルは、
相同が８０〜９０％未満の遺伝子の混合に好ましい。手
動ＰＣＲは、熱不安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、
ＤＮＡ ｐｏｌｌ Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）を使用
する。最初のＰＣＲプログラムは、１０〜３０ｎｇ／μ
ｌのＫｌｅｎｏｗ緩衝液中のフラグメントおよびｄＮＴ
Ｐを含む： １−変性９４℃２０秒 ２−迅速な冷却：ドライアイスエタノール５秒、氷１５
秒 ３−Ｋｌｅｎｏｗ酵素添加 ４−アニール／伸長２分２５℃ ５−変性へサイクルし戻す（サイクル１） これを、テンプレートスイッチングを開始するために１
０〜２０サイクル反復し、この後、熱安定性ポリメラー
ゼを用いた通常のＰＣＲを、産物量を増幅するためにさ
らに１０〜２０サイクル続ける。
【０５４５】（実施例１９．抗体ファージディスプレイ
ライブラリーのシャッフリング）安定なかつ良好に発現
するヒト単鎖Ｆｖフレームワーク（ＶH２５１−ＶLＡ２
５）を、ジフテリア毒素に対する結合についての選択に
より、天然のヒトｍＲＮＡから構築されたＡｂファージ
ライブラリーから得た。このｓｃＦｖフレームワークを
用いて、生殖系配列に基づく６つの合成的に変異させた
ＣＤＲを含む天然のＡｂファージライブラリーを構築し
た。各残基の変異誘発の程度は、そのＶ領域ファミリー
内のその天然に存在する変異性に類似していた。
【０５４６】ｓｃＦｖ遺伝子を含むＰＣＲ産物を、ＤＮ
ａｓｅ Ｉ消化によりランダムにフラグメント化し、そ
して５０〜１００ｂｐのフラグメントを精製した。合成
オリゴヌクレオチド（それぞれ、ｓｃＦｖテンプレート
に対して相同な１９ｂｐに隣接した変異ＣＤＲを含む）
を、１０：１モル比でランダムフラグメントに添加し
た。完全長変異ｓｃＦＶ遺伝子のライブラリーを、有性
ＰＣＲによるフラグメントから再組立した。Ｍ１３ファ
ージのｐＩＩＩタンパク質へのクローニングにより、４
×１０7プラーク形成単位のＡｂファージライブラリー
が生じた。変異ＣＤＲと天然ＣＤＲとの組合せを、天然
ＣＤＲに特異的なプライマーを用いたコロニーＰＣＲに
より特徴づけた（図７を参照のこと）。６つ全ての変異
ＣＤＲが、３２〜６５％の効率および広範な種々の組合
せで取り込まれた。変異ＣＤＲの配列決定により、観察
された変異率が予測した率と適合することを示した。
【０５４７】このＡｂファージライブラリーを、１０の
ヒトタンパク質標的への結合について、マイクロタイタ
ープレート内で２回選別し（ｐａｎ）、そしてこれらの
標的のうち７つがＥＬＩＳＡポジティブクローンを生じ
た。ポジティブクローンを生じた１つの標的は、ヒトＧ
−ＣＳＦレセプターであった。Ｇ−ＣＳＦレセプターポ
ジティブクローンを、２回目に供し、そして２回目のフ
ァージクローンの１／４が、Ｇ−ＣＳＦレセプターへの
結合についてＥＬＩＳＡポジティブであった。
【０５４８】この多様なプールを使用して、３つの異な
る配列最適化ストラテジー（従来のＰＣＲ、誤りがちな
ＰＣＲ、およびＤＮＡシャッフリング）の適合性を評価
した。これらの代替物のそれぞれの１サイクルの後、Ｄ
ＮＡシャッフリングは、回収されたＡｂファージの割合
およびＧ−ＣＳＦレセプター特異的ＥＬＩＳＡシグナル
の両方において、７倍の好結果を示した。選別（ｐａｎ
ｎｉｎｇ）をさらに６サイクル続け、各回の後にｓｃＦ
ｖ遺伝子のプールをシャッフリングした。選択のストリ
ンジェンシーを、過剰な可溶性Ｇ−ＣＳＦレセプターの
存在下、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で５０℃で２回の１時間
洗浄により段階的に増加させた。３〜８回目に、ほぼ１
００パーセントのクローンがＥＬＩＳＡポジティブであ
った。異なるサイクル由来のプールを同じストリンジェ
ンシーでアッセイした場合、結合したファージの割合
は、図３１に示すように、サイクル２〜８で４４０倍に
増加した。各回由来の個々のファージクローンは、特異
的なＥＬＩＳＡシグナルにおいて類似の増加を示した。
配列決定は、ｓｃＦｖが平均３４（ｎ＝４）のアミノ酸
変異を含むことを示したが、これらのうち４つのみが評
価された全ての配列に存在した。
【０５４９】潜在的な免疫原性を低減させるために、天
然のまたは寄与の弱い変異を、４０倍過剰の合成的に構
築した生殖系ｓｃＦｖ遺伝子を用いて２サイクル戻し交
配し、続いてストリンジェントな選別することにより取
り除いた。戻し交配されたｓｃＦｖにおけるアミノ酸変
異の平均的な数を、ほぼ半分の１８（ｎ＝３）にした
が、これらのうち４つのみが全ての配列に存在した。戻
し交配されたＡｂファージクローンは、強力にかつ優れ
た特異性でヒトＧ−ＣＳＦレセプターに結合することが
示された。図３２は、いくつかのヒトタンパク質標的の
１０回の選択の効果を示す；６回のシャッフリングおよ
び２回の戻し交配を行った。図３３は、従来のＰＣＲ
（「シャッフルしていない」）、誤りがちなＰＣＲ、ま
たは反復的配列組換え（「シャッフルした」）の後の、
ＢＳＡ、Ａｂ １７９、またはＧ−ＣＳＦレセプターを
用いる選別による、ファージの相対的な回収率を示す。
【０５５０】（実施例２０．哺乳動物細胞におけるＧＦ
Ｐの最適化）プラスミドベクターｐＣＭＶ−ＧＦＰ（こ
れは、ＧＦＰをコードしそしてＣＭＶプロモーターの制
御下でそれを発現させる）を、ＴＧ１細胞内で増殖さ
せ、そしてこれを用いて、一過性発現アッセイのために
ＣＨＯ細胞をトランスフェクトした。
【０５５１】プラスミドを、プロテイナーゼＫ法または
ＰｒｅＴａｑ法（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）により、ＦＡＣ
Ｓ選択された一過性発現ＴＧ１細胞からレスキューし
た。基本的には、ＦＡＣＳ回収細胞を遠心分離によりペ
レット化し、反復的に凍結融解し、プロテイナーゼＫま
たはＰｒｅＴａｑのいずれかとインキュベートし、フェ
ノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈澱させ、こ
れを使用してＥ．ｃｏｌｉを形質転換し、次いでこれを
Ａｍｐプレートにプレーティングした。結果は： プロテイナーゼＫ法：投入量−５×１０4 レスキュー
３×１０4 ＰｒｅＴａｑ法：投入量−５×１０4 レスキュー ２×
１０4。
【０５５２】レスキューされたプラスミドを増殖させ、
そして５μｇをＤＮａｓｅ Ｉを用いて部分的に消化
し、そして５０〜７００ｂｐのフラグメントをゲル精製
し、エタノール沈澱し，そして３３０μｌの３．３×Ｐ
ＣＲ緩衝液、４４μｌ Ｍｇ（ＯＡｃ）２（Ｐｅｒｋｉ
ｎ−Ｅｌｍｅｒ）、１９３μｌ ４０％ＰＥＧ、８０μ
ｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰ、２０μｌ Ｔｔｈポリメラー
ゼ、２μｌ Ｐｆｕポリメラーゼ、７μｌ ＴＭＡＣ
（Ｓｉｇｍａ）、および３６７μｌ Ｈ2Ｏ中に再懸濁
した。ＰＣＲを、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＴＣ−１
５０ミニサイクラーで、３セットのプライマーを用いて
４０サイクル（９４℃、３０秒；５０℃、３０秒；７２
℃、６０秒）行い、これにより３つの末端重複ＰＣＲフ
ラグメントが生じ、消化および連結と共におよびこの後
に、完全なプラスミドを再構築した。ＰＣＲフラグメン
トを、ＡｌｗＮ１を用いて消化し、そしてこのフラグメ
ントをゲル精製し、連結し、そしてＴＧｌ細胞にエレク
トロポレーションした。プラスミドＤＮＡを調製し、そ
してＣＨＯ細胞にエレクトロポレーションした。これ
を、最も明るいＧＦＰシグナルを一過的に発現する細胞
について、ＦＡＣＳによりスクリーニングした。
【０５５３】本発明は、好適な実施態様を考えられるも
のに関して記載されているが、本発明が開示された実施
例に制限されないことが理解されるべきである。反対
に、本発明は、添付された請求の範囲の精神および範囲
内に包含される種々の改変および同等の組立を包含する
ことが意図されている。
【０５５４】（参考文献）以下の参考文献は、本願の関
連部分で本願において引用される。
【０５５５】
【表１５】
【０５５６】
【表１６】
【０５５７】
【表１７】
【０５５８】全ての刊行物、特許、および特許出願は、
それぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願が特別に
かつ個々にその全体が参考として援用されると示される
場合と同じ程度に、本明細書中においてそれらの全体が
参考として援用される。１９９５年２月１７日に出願さ
れ、そしてＷＯ９５／２２６２５として１９９５年８月
２４日に公開されたＰＣＴ／ＵＳ９５／０２１２６は、
本明細書中に参考として援用される。同時係属出願代理
人事件整理番号１６５２８Ａ−０１９６は、本明細書中
に参考として援用される。
【０５５９】本願発明は、ランダムなフラグメント化後
のＤＮＡ再組立の方法、およびインビトロまたはインビ
ボでの組換えによる核酸配列の変異誘発へのその適用が
記載される。詳細には、変異タンパク質をコードする核
酸フラグメントまたはポリヌクレオチドを生成する方法
が記載される。本発明はまた、タンパク質のインビトロ
またはインビボでの指向された分子進化を可能にする、
変異誘発、シャッフリング、および選択のサイクルを繰
り返す方法に関する。
【０５６０】
【発明の効果】変異タンパク質を生成する方法を開発す
ることは有益であり、本方法により、容易にサーチされ
る変異核酸配列の大規模ライブラリーの開発が可能にな
った。本明細書に記載の発明は、点変異誘発、核酸シャ
ッフリングおよび選択の反復サイクルの使用に関し、本
発明によって、タンパク質のような高度に複雑な直線配
列のインビトロにおける直接的な分子進化が、ランダム
組換えによって可能になった。
【０５６１】本発明によって、変異ＤＮＡ、ＲＮＡまた
はタンパク質の大規模ライブラリーの生成を可能にする
方法、および所望の目的のために特定の変異体を選択す
ることが可能になった。本明細書中に記載の発明は、Ｄ
ＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質のような高度に複雑な直
線配列のインビボおよびインビトロにおける直接分子進
化を、組換えによって可能にする変異誘発、インビボ組
換えおよび選択の反復サイクルの使用に関する。
【０５６２】本発明のさらなる利点については、添付の
図面を参考にして、本発明の以下の記載から明らかにな
る。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、変異誘発性シャッフリングと誤りがち
なＰＣＲとを比較する模式図である；（ａ）最初のライ
ブラリー；（ｂ）１回目の親和性選択において選択され
た配列のプール；（ｄ）選択された配列のインビトロに
おける組換え（「シャッフリング」）；（ｆ）シャッフ
リング後の２回目の親和性選択において選択された配列
のプール；（ｃ）誤りがちなＰＣＲ；（ｅ）誤りがちな
ＰＣＲ後の２回目の親和性選択において選択された配列
のプール。
【図２】図２は、１０ｂｐ〜５０ｂｐのランダムフラグ
メントからの１．０ｋｂ ＬａｃＺα遺伝子フラグメン
トの再組立（ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ）を示す写真であ
る。（ａ）ＬａｃＺα遺伝子を有するＰＣＲ増幅したゲ
ルＤＮＡフラグメントの写真。（ｂ）ＤＮＡｓｅＩ消化
後のＤＮＡフラグメントのゲルの写真。（ｃ）消化され
たＬａｃＺα遺伝子ＤＮＡフラグメントから精製した１
０ｂｐ〜５０ｂｐのＤＮＡフラグメントのゲルの写真；
（ｄ）指示された数のサイクルのＤＮＡ再組立後の１０
ｂｐ〜５０ｂｐのＤＮＡフラグメントのゲルの写真；
（ｅ）プライマーを用いたＰＣＲによる増幅後の組換え
混合物のゲルの写真。
【図３Ａ】図３Ａは、ＬａｃＺα遺伝子の終止コドン変
異体およびそれらのＤＮＡ配列の模式図である。四角枠
の領域は非相同範囲であり、マーカーとして働く。終止
コドンはより小さな四角枠内に位置するかまたは下線を
付している。「＋」は、野生型遺伝子を示し、そして
「−」は遺伝子における変異範囲を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＬａｃＺα遺伝子の終止コドン変
異体およびそれらのＤＮＡ配列の模式図である。四角枠
の領域は非相同範囲であり、マーカーとして働く。終止
コドンはより小さな四角枠内に位置するかまたは下線を
付している。「＋」は、野生型遺伝子を示し、そして
「−」は遺伝子における変異範囲を示す。
【図４】図４は、合成オリゴヌクレオチドをＬａｃＺα
遺伝子の再組立プロセスへの導入またはスパイク（ｓｐ
ｉｋｉｎｇ）の模式図である。
【図５Ａ】図５Ａは、 Ｅ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度
を用いて、マウスＩＬ１−Ｂ遺伝子（Ｍ）とヒトＩＬ１
−Ｂ遺伝子（Ｈ）との間の相同な領域を示す模式図であ
る。非相同領域には四角枠を付す。
【化２】 は、２つの遺伝子のシャッフリングの際に得られる交差
を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、 Ｅ．ｃｏｌｉのコドン使用頻度
を用いて、マウスＩＬ１−Ｂ遺伝子（Ｍ）とヒトＩＬ１
−Ｂ遺伝子（Ｈ）との間の相同な領域を示す模式図であ
る。非相同領域には四角枠を付す。
【化３】 は、２つの遺伝子のシャッフリングの際に得られる交差
を示す。
【図６】図６は、抗ウサギＩｇＧ抗体（Ａ１０Ｂ）のｓ
ｃＦｖを使用した抗体ＣＤＲシャッフリングモデルシス
テムの模式図である。
【図７】図７（パネルＡ〜Ｄ）は、ｓｃＦｖのシャッフ
ルしたＤＮＡにおける、観察されたＣＤＲの特定の組み
合わせが生じる頻度を示す模式図である。パネル（Ａ）
は、全６個の合成ＣＤＲの長さおよび変異誘発率を示す
模式図である。パネル（Ｂ）は、全６個のＣＤＲを有す
るｓｃＦｖのシャッフリングによる、ライブラリー構築
物を示す模式図である。パネル（Ｃ）は、天然のＣＤＲ
についてプライマーを用いるＰＣＲにより決定されるＣ
ＤＲ挿入を示す模式図である。パネル（Ｄ）は、合成Ｃ
ＤＲ挿入物の挿入率および分布を示す模式図である。
【図８】図８は、ＤＮＡシャッフリングおよび選択の各
サイクルの後のｓｃＦｖ抗ウサギ抗体の改善された結合
活性を示すグラフである。
【図９】図９は、ｐＢＲ３２２−Ｓｆｉ−ＢＬ−ＬＡ−
Ｓｆｉおよび直列反復を介するインビボでのプラスミド
内の組換え、ならびに機能的なβラクタマーゼ遺伝子を
再構築するプラスミド内の組換えによるアンピシリン耐
性コロニーの発生率を模式的に示す図および表である。
【図１０】図１０は、ｐＢＲ３２２−Ｓｆｉ−２Ｂｌａ
−Ｓｆｉおよび直列反復を介するインビボでのプラスミ
ド内の組換え、ならびに機能的なβラクタマーゼ遺伝子
を再構築するインビボにおけるプラスミド内の組換えに
よるアンピシリン耐性コロニーの発生率を模式的に示す
図および表である。
【図１１】図１１は、組換えタンパク質を生成するため
に、ポリヌクレオチドフラグメントを細胞に導入した
後、複数回の相同組換えの効率を試験するための方法を
示す表である。
【図１２】図１２は、以下の遺伝子座でのカセットのシ
ャッフリングによるベクターのライブラリーの生成を概
略する模式図である：プロモーター、リーダーペプチ
ド、ターミネーター、選択薬物耐性遺伝子、および複製
開始点。各遺伝子座での複数の平行な線はそのカセット
についてカセットの多様性を表す。
【図１３】図１３は、シャッフリングにより原核生物の
ベクターライブラリーを構築するために、種々の遺伝子
座での適切なカセットのいくつかの例を模式的に示す図
である。
【図１４】図１４は、ｐＢＡＤ１８（Ｇｕｚｍａｎら
（１９９５）Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７７：
４１２１）から誘導された原核生物ＧＦＰ発現ベクター
ＰＢＡＤ−ＧＦＰ（５，３７１ｂｐ）を示す図である。
真核生物ＧＦＰ発現ベクターα＋ＧＦＰ（７，５９１ｂ
ｐ）は、ベクターα＋（Ｗｈｉｔｅｈｏｒｎら（１９９
５）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３： １２１
５）から誘導された。
【図１５Ａ】図１５Ａは、全てのＥ．ｃｏｌｉ細胞にお
ける別のＧＦＰ構築物の蛍光の比較を示すグラフであ
る。２４アミノ酸のＮ−末端伸長を含む「Ｃｌｏｎｔｅ
ｃｈ」構築物、Ａｆｆｙｍａｘ野生型構築物（「ｗ
ｔ」、改善されたコドン使用頻度を有する）、ならびに
有性ＰＣＲおよび選択の２および３サイクル後に得られ
た変異体（「サイクル２」、「サイクル３」）が比較さ
れる。「Ｃｌｏｎｔｅｃｈ」構築物はＩＰＴＧを用いて
誘導されたが、他の構築物はアラビノースを用いて誘導
された。全てのサンプルを同じＯＤ６００でアッセイし
た。この図は、蛍光スペクトルを示し、これは、「ｗ
ｔ」構築物からの全細胞の蛍光シグナルが、「Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ」構築物よりも２．８倍大きいことを示す蛍光
スペクトルを示す。「サイクル３」変異体のシグナル
は、Ａｆｆｙｍａｘ「ｗｔ」より１６倍、「Ｃｌｏｎｔ
ｅｃｈ」ｗｔ構築物より４５倍増大する。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、全てのＥ．ｃｏｌｉ細胞にお
ける別のＧＦＰ構築物の蛍光の比較を示すグラフであ
る。２４アミノ酸のＮ−末端伸長を含む「Ｃｌｏｎｔｅ
ｃｈ」構築物、Ａｆｆｙｍａｘ野生型構築物（「ｗ
ｔ」、改善されたコドン使用頻度を有する）、ならびに
有性ＰＣＲおよび選択の２および３サイクル後に得られ
た変異体（「サイクル２」、「サイクル３」）が比較さ
れる。「Ｃｌｏｎｔｅｃｈ」構築物はＩＰＴＧを用いて
誘導されたが、他の構築物はアラビノースを用いて誘導
された。全てのサンプルを同じＯＤ６００でアッセイし
た。この図は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＧＦＰ構築物の励
起スペクトルの比較である。このピーク励起波長は、選
択された変異体によって変化しない。
【図１６】図１６は、相対的なＧＦＰタンパク質発現レ
ベルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す写真である。パネル
（ａ）：野生型、ＧＦＰのサイクル２変異体もしくはサ
イクル３変異体を発現する全Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の等量
（ＯＤ６００）の１２％トリスグリシンＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ分析（Ｎｏｖｅｘ、Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ，ＣＡ）。ク
マシーブルーで染色した。ＧＦＰ（２７ｋＤ）は総タン
パク質の約７５％を示し、そして選択は発現レベルを増
大させなかった。パネル（ｂ）：Ｅ．ｃｏｌｉ画分の等
量（ＯＤ６００）の１２％トリスグリシンＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ分析（Ｎｏｖｅｘ、Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ，ＣＡ）。
レーン１：ｗｔ ＧＦＰを発現する溶解した細胞のペレ
ット；レーン２：ｗｔ ＧＦＰを発現する溶解した細胞
の上清。ｗｔ ＧＦＰのほとんどは封入体中に存在す
る；レーン３：サイクル３変異体ＧＦＰを発現する溶解
した細胞のペレット；レーン４：サイクル３変異体ＧＦ
Ｐを発現する溶解した細胞の上清。ｗｔ ＧＦＰのほと
んどは可溶性である。最後に封入体中にあるＧＦＰは発
色団を含まない。なぜなら、この画分中に検出可能な蛍
光が存在しないからである。
【図１７】図１７は、野生型ＧＦＰに対する、サイクル
２およびサイクル３変異体の変異分析を示す図である。
パネル（Ａ）は、変異がトリペプチド発色団の近くに集
合するよりもむしろ拡散していることを示す。変異Ｆ１
００Ｓ、Ｍ１５４Ｔ、およびＶ１６４Ａは、より多くの
親水性残基での疎水性残基の置換を含む。増大した親水
性は、凝集および封入体形成に向かうよりも、天然の折
り畳み経路へのこのタンパク質の誘導を補助し得る。パ
ネル（Ｂ）は、発色団領域および導入された変異部位を
示す制限マップを示す。
【図１８Ａ】図１８Ａは、別のＧＦＰタンパク質を発現
するＣＨＯ細胞の比較を示すグラフである。別のＧＦＰ
変異体を発現するＣＨＯ細胞のクローンのＦＡＣＳ分析
を示す。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、別のＧＦＰタンパク質を発現
するＣＨＯ細胞の比較を示すグラフである。別のＧＦＰ
変異体を発現するＣＨＯ細胞のクローンの蛍光分光学を
示す。
【図１９】図１９は、ヒ酸塩解毒経路オペロンを含有す
るｐＧＪ１０３プラスミドのシャッフリングの結果とし
てのヒ酸塩の毒性に対する耐性の増大を示すグラフであ
る。
【図２０】図２０は、配列同一性を欠失し得る複数のエ
キソン種（ランダム配列エキソンとして例示される）の
組換えのための基礎として、合成の、または天然に存在
するイントロン配列を用いる組合せライブラリーの生成
を模式的に示す図である。ここで、相同的および／また
は部位特異的組換えは、別のライブラリーのメンバーの
イントロン配列間で生じる。
【図２１】図２１は、エキソンをシャッフリングするた
めの方法の改変を模式的に示す図である。パネル（Ａ）
に示すように、数字はリーディングフレームを示す。パ
ネル（Ｂ）は、それらの個々のスプライシングフレーム
に対するイントロンおよびエキソンの種々のクラスを示
す。パネル（Ｃ）は、シャッフリングに適切な天然に存
在する遺伝子（免疫グロブリンＶ遺伝子）の例を提供す
る。パネルＤ〜Ｆは、複数のエキソンがイントロンセグ
メントにまたがるプライマーを用いるＰＣＲを通じてど
のように鎖状体化され得るかを示し、その結果、所望さ
れる場合は、適切なスプライシングフレームが維持され
る。パネル（Ｇ）は、エキソンのシャッフリングプロセ
スを例示する（ＩＧ：免疫グロブリンエキソン；ＩＦ
Ｎ：インターフェロンエキソン）。
【図２２】図２２は、いくつかのヒト遺伝子に対するエ
キソンスプライシングフレーム図を模式的に示す図であ
る。これはエキソンのシャッフリングに好ましいユニッ
トが同じスプライシングフレームで開始され、そして終
結され、その結果スプライシングモジュール（またはシ
ャッフリングエキソン）が複数の天然に存在するエキソ
ンを含み得るが、代表的には各末端で同じスプライシン
グフレームを有さないことを示す。
【図２３】図２３は、多重交差を示すキメラのライブラ
リーを生じる、反復配列組換え（シャッフリング）を提
供するために、部分的なＰＣＲ伸長（スタッタリング）
がどのように使用され得るかを模式的に示す図である。
【図２４】図２４は、シャッフリングを通じて最適な変
異のセットを生成するために、どのようにスタッタリン
グを用いて多重変異した配列を有する野生型配列をシャ
ッフルし得るかを示す図である。
【図２５】図２５は、複数のプラスミド種を示す細胞集
団のエレクトロポレーションによるプラスミド−プラス
ミド組換えを模式的に示す図である。これは、エレクト
ロポレーションの前に細胞当たり単一のプラスミド種と
して、そして細胞集団のエレクトロポレーションに続く
インビボの組換えに適切な細胞あたり複数のプラスミド
種として最初に存在する複数のプラスミドを示す。
【図２６】図２６は、プラスミド−プラスミド組換えを
示す図である。
【図２７】図２７は、プラスミド−ウイルス組換えを示
す図である。
【図２８】図２８は、ウイルス−ウイルス組換えを示す
図である。
【図２９】図２９は、プラスミド−染色体組換えを示す
図である。
【図３０】図３０は、結合−媒介性組換えを示す図であ
る。
【図３１】図３１は、選択サイクルに対するＡｂ−ファ
ージ回収率を示すグラフである。シャッフリングは、２
〜８回の選択回後に適用された。全ての増大は４４０倍
である。
【図３２】図３２は、２回の戻し交配を含む１０回の選
択回後の結合特異性を示すグラフである。８つのヒトタ
ンパク質標的についての別のＡｂ−ファージクローンの
ＥＬＩＳＡシグナル。
【図３３】図３３は、変異誘発方法に対するＡｂ−ファ
ージの回収を示すグラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１２年５月１７日（２０００．５．１
７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 599133761 3410 Ｃｅｎｔｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｗ ａｙ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， Ｃａ ｌｉｆｏｒｎｉａ 95051 Ｕ．Ｓ．Ａ. (72)発明者 アンドレアス クラメリ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94040, マウンテン ビュー，ドルシラ ドライ ブ 531

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ポリヌクレオチドをシャッフルする方法
    であって、以下：シャッフルされるべきポリヌクレオチ
    ドの複数の改変体を選択する工程であって、該ポリヌク
    レオチドは複数の遺伝子をコードする、工程；該ポリヌ
    クレオチドの複数の選択された改変体からの配列を有す
    る部分的にアニールされたポリヌクレオチド鎖において
    マルチサイクリックポリヌクレオチド伸長プロセスを行
    う工程であって、１つの鎖が、組換えポリヌクレオチド
    の集団を生成するように部分的にアニールされている別
    の鎖の伸長のためのテンプレートとして作用する条件下
    で、該ポリヌクレオチド鎖が互いに類似な領域および異
    種の領域を有し、そして該類似な領域を介して部分的に
    アニールされる、工程、 遺伝子またはその発現産物によって付与される所望の性
    質について、該複数の遺伝子をコードする組換えポリヌ
    クレオチドをスクリーニングまたは選択する工程、を包
    含する、方法。
  2. 【請求項２】 前記マルチプル遺伝子が、本質的に物理
    的にクラスター化される、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記マルチプル遺伝子がマルチ成分経路
    を形成する、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記マルチ成分経路における遺伝子の発
    現産物が二次代謝物を産生する、請求項３に記載の方
    法。
  5. 【請求項５】 前記二次代謝物が抗生物質である、請求
    項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記改変体が天然の改変体を含む、請求
    項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記改変体が誘導された改変体を含む、
    請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記天然に存在する改変体が、複数の遺
    伝子の対立遺伝子改変体を含む、請求項６に記載の方
    法。
  9. 【請求項９】 前記天然に存在する改変体が、複数の遺
    伝子の種改変体を含む、請求項６に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記増幅プロセスを行う前にポリヌク
    レオチドの改変体の集団をランダムにフラグメント化す
    る工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記増幅プロセスの少なくとも１つの
    サイクルが、ポリヌクレオチドの改変体の不完全な伸長
    を生じる条件下で行われる、請求項１に記載の方法。
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